新規の選択的免疫ダウンレギュレーション（ＳＩＤＲ）媒介性移植プロセス、被験体における疾患を予防または処置するためのプロセス、およびＳＩＤＲを確立するために有用である、馴化またはプログラミングされた細胞、組織または器官を含む組成物
【課題】移植プロセス、および移植片対宿主拒絶に関する疾患への介在および予防における独特な免疫調節の適用、ならびに免疫およびワクチン接種から生じる所望されない免疫学的効果を除去することを提供すること。
【解決手段】本発明は、移植プロセス、および移植片対宿主拒絶に関する疾患への介在および予防における独特な免疫調節の適用、ならびに免疫およびワクチン接種から生じる所望されない免疫学的効果を除去することを提供する。クローン病、原発性硬化性胆管炎疾患、原発性胆管性肝硬変、粥状動脈硬化などを含む他の疾患の処置もまた提供される。本発明はまた、そのようなプロセスを実施するための独特な組成物を提供する。
【解決手段】本発明は、移植プロセス、および移植片対宿主拒絶に関する疾患への介在および予防における独特な免疫調節の適用、ならびに免疫およびワクチン接種から生じる所望されない免疫学的効果を除去することを提供する。クローン病、原発性硬化性胆管炎疾患、原発性胆管性肝硬変、粥状動脈硬化などを含む他の疾患の処置もまた提供される。本発明はまた、そのようなプロセスを実施するための独特な組成物を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学的調節の分野に関し、より詳細には、選択的免疫ダウンレギュレーションに関し、そして移植、疾患の予防および処置、ならびにそれらにおいて使用される組成物に適用可能である。
【０００２】
本願において引用または記される全ての特許、特許出願、特許公開、科学論文などは、本発明が関する分野の技術水準をより詳細に記載するために、本明細書において参考としてその全体が援用される。
【背景技術】
【０００３】
免疫手順は、疾患の拡散の進行を抑制するにおいて顕著な成功を収めており、そして天然痘の場合においては、それを完全に根絶させたことは周知であるが、免疫プロセス自体に問題がないわけではない。そうでなければ健康な個体において疾患を誘発し得る、免疫手順に対する有害反応についての関心は高まっている。これは実際、免疫の副作用について注意を集中させたこれらの手順の成功自体である。広汎な免疫プログラムは、以前に主要な健康問題であった、多数の病原体に曝露される確率を顕著に低減し、その結果、現在では、疾患を発症する危険因子よりも、その疾患を予防することによって発生する危険因子の方が重要となっている。実際、免疫手順を辞退した大きな人口集団が存在する。これは、そのこと自体において、これまで制御していたこれらの疾患の萌芽を可能にし得る。粗違って、免疫プロセスの有利な効果を可能にし得るが、免疫プロセスの潜在的な有害効果を改善し得る手順に対する必要性が存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、免疫およびワクチン接種、移植、ならびに多くの免疫疾患および障害に関連する問題を含む、所望されない免疫学的反応および状態に関して予防的および治癒的手段を提供することによって、上記の問題および関心事に取り組む。本発明はまた、免疫調節のための独特な組成物、試薬、薬物およびプロセスを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、以下を提供する。
【０００６】
１．レシピエントにおける選択的な免疫ダウンレギュレーションを確立する工程であって、
該レシピエントが、ドナー由来の免疫細胞、免疫組織、免疫器官またはその成分を含み、
ここで、ＳＩＤＲが該レシピエントまたはその免疫学的等価物のネイティブまたは非ネイティブな抗原に対して、または該レシピエントまたはその免疫学等価物における該ドナーのネイティブまたは非ネイティブ抗原に対してあるいはその両方に対して確立されている、工程、
を包含する、移植プロセス。
【０００７】
２．前記免疫細胞、免疫組織、免疫器官またはその成分が、Ｔ細胞、樹状細胞、リンパ球、末梢血細胞、ＮＫ細胞、造血幹細胞、骨髄およびそれらの組合せからなる群より選択される、項目１に記載の移植プロセス。
【０００８】
３．前記選択的免疫ダウンレギュレーションが、前記ネイティブまたは非ネイティブ抗原を投与することにより前記レシピエントを経口的に寛容化することによって確立され、該ネイティブまたは非ネイティブ抗原は、（ａ）該レシピエント由来の細胞、組織またはそのフラグメント、（ｂ）該ドナー由来の細胞、組織またはそのフラグメント、（ｃ）該レシピエント由来の抗体と複合体化された細胞、組織またはそのフラグメント、（ｄ）該ドナー由来の抗体と複合体化された細胞、組織またはそのフラグメント、あるいは、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）のいずれかの部分消化物由来、任意の免疫学的に等価な成分、および上記のいずれかの任意の組合せからなる群より選択されるか、または由来する、１以上の成分を含む、項目１に記載の移植プロセス。
【０００９】
４．項目１の移植プロセスを使用して、レシピエントにおける移植片対宿主拒絶を予防または処置をするプロセス。
【００１０】
５．前記ネイティブまたは非ネイティブな抗原が、前記レシピエント由来である、項目４に記載のプロセス。
【００１１】
６．前記ネイティブまたは非ネイティブな抗原が、前記レシピエント由来であり、そして該レシピエントおよび前記ドナー由来のネイティブまたは非ネイティブ抗原を含む、項目４に記載のプロセス。
【００１２】
７．前記ネイティブまたは非ネイティブ抗原が、Ｔ細胞、樹状細胞、リンパ球、末梢血細胞、ＮＫ細胞、造血幹細胞、骨髄およびそれらの組合せからなる群に由来する、項目４に記載の移植プロセス。
【００１３】
８．前記ネイティブまたは非ネイティブ抗原が末梢血球を含む、項目７に記載のプロセス。
【００１４】
９．被験体においてワクチン接種または免疫の所望されない免疫学的結果を処置または予防するためのプロセスであって、以下の工程：
ワクチン、免疫剤、アジュバントまたは免疫学的に等価な化合物、およびそれらのいずれかの任意の組合せとして使用された任意または全ての抗原に対して、該被験体において選択的免疫ダウンレギュレーションを確立する工程、
を包含する、プロセス。
【００１５】
１０．レシピエントに導入した場合に、該レシピエントにおいて選択的な免疫ダウンレギュレーションを提示または確立する、馴化またはプログラミングした細胞、組織または器官を含有する、組成物。
【００１６】
１１．前記馴化またはプログラミングした細胞、組織または器官が予め寛容化されている被験体に由来する、項目１０に記載の組成物。
【００１７】
１２．前記馴化またはプログラミングした細胞、組織または器官が前記レシピエントに対して同種異系である被験体に由来する、項目１０に記載の組成物。
【００１８】
１３．前記馴化またはプログラミングした細胞、組織または器官が前記レシピエントに対して異種である被験体に由来する、項目１０に記載の組成物。
【００１９】
１４．前記馴化またはプログラミングした細胞、組織または器官が前記被験体に導入される前に前記レシピエントの外側でインビトロで寛容化されている、項目１０に記載の組成物。
【００２０】
１５．前記レシピエントに導入された場合、該レシピエントにおいて特定の抗原に対する寛容を提示または確立する細胞、組織または器官を含む、項目１０に記載の組成物。
【００２１】
１６．被験体においてクローン病を処置するプロセスであって、以下の工程：
該被験体における罹患した細胞、組織または器官のネイティブまたは非ネイティブ抗原に対して該被験体において選択的免疫ダウンレギュレーションを確立する工程であって、該レギュレーションは、クローン病に罹患した細胞、組織、器官もしくはその成分に由来する材料か、またはその正常の標的を含むネイティブまたは非ネイティブ抗原を投与することによって確立され、該ネイティブまたは非ネイティブ抗原は、同種異系供給源、異種供給源、自己供給源および該供給源の組合せ、および免疫学的に等価な化合物、ならびにそれらのいずれかの組合せに由来する工程、を包含する、プロセス。
【００２２】
１７．前記クローン病に罹患した細胞、組織、器官もしくはその成分、またはその正常の標的が腸細胞を含む、項目１６に記載のプロセス。
【００２３】
１８．被験体における原発性硬化性胆管炎疾患を処置するプロセスであって、以下の工程：
該被験体における罹患した細胞、組織または器官のネイティブまたは非ネイティブ抗原に対して該被験体において選択的免疫ダウンレギュレーションを確立する工程であって、該レギュレーションは、原発性硬化性胆管炎疾患に罹患した細胞、組織、器官もしくはその成分に由来する材料か、またはその正常の標的を含むネイティブまたは非ネイティブ抗原を投与することによって確立され、該ネイティブまたは非ネイティブ抗原は、同種異系供給源、異種供給源、自己供給源および該供給源の組合せ、および免疫学的に等価な化合物、ならびにそれらのいずれかの組合せに由来する、工程を包含する、プロセス。
【００２４】
１９．被験体における原発性胆管性肝硬変を処置するプロセスであって、以下の工程：
該被験体における罹患した細胞、組織または器官のネイティブまたは非ネイティブ抗原に対して該被験体において選択的免疫ダウンレギュレーションを確立する工程であって、該レギュレーションは、原発性胆管性肝硬変に罹患した細胞、組織、器官もしくはその成分に由来する材料か、またはその正常の標的を含むネイティブまたは非ネイティブ抗原を投与することによって確立され、該ネイティブまたは非ネイティブ抗原は、同種異系供給源、異種供給源、自己供給源および該供給源の組合せ、および免疫学的に等価な化合物、ならびにそれらのいずれかの組合せに由来する、工程を包含する、プロセス。
【００２５】
２０．被験体における原発性胆管性肝硬変を処置するプロセスであって、以下の工程：
該被験体における罹患した細胞、組織または器官のネイティブまたは非ネイティブ抗原に対して該被験体において選択的免疫ダウンレギュレーションを確立する工程であって、該レギュレーションは、原発性胆管性肝硬変に罹患した細胞、組織、器官もしくはその成分に由来する材料か、またはその正常の標的を含むネイティブまたは非ネイティブ抗原を投与することによって確立され、該ネイティブまたは非ネイティブ抗原は、同種異系供給源、異種供給源、自己供給源および該供給源の組合せ、および免疫学的に等価な化合物、ならびにそれらのいずれかの組合せに由来する、工程を包含する、プロセス。
【００２６】
２１．被験体における原発性セリアック病（Ｃｅｌｌｉａｃ'ｓ ｄｉｓｅａａｓｅ）を処置するプロセスであって、以下の工程：
該被験体における罹患した細胞、組織または器官のネイティブまたは非ネイティブ抗原に対して該被験体において選択的免疫ダウンレギュレーションを確立する工程であって、該レギュレーションは、セリアック病に罹患した細胞、組織、器官もしくはその成分に由来する材料か、またはその正常の標的を含むネイティブまたは非ネイティブ抗原を投与することによって確立され、該ネイティブまたは非ネイティブ抗原は、同種異系供給源、異種供給源、自己供給源および該供給源の組合せ、および免疫学的に等価な化合物、ならびにそれらのいずれかの組合せに由来する、工程を包含する、プロセス。
【００２７】
２２．被験体における原発性自己免疫活動性慢性肝炎を処置するプロセスであって、以下の工程：
該被験体における罹患した細胞、組織または器官のネイティブまたは非ネイティブ抗原に対して該被験体において選択的免疫ダウンレギュレーションを確立する工程であって、該レギュレーションは、原発性自己免疫活動性慢性肝炎に罹患した細胞、組織、器官もしくはその成分に由来する材料か、またはその正常の標的を含むネイティブまたは非ネイティブ抗原を投与することによって確立され、該ネイティブまたは非ネイティブ抗原は、同種異系供給源、異種供給源、自己供給源および該供給源の組合せ、および免疫学的に等価な化合物、ならびにそれらのいずれかの組合せに由来する、工程を包含する、プロセス。
【００２８】
２３．被験体における慢性肝臓拒絶疾患を処置するプロセスであって、以下の工程：
該被験体における罹患した細胞、組織または器官のネイティブまたは非ネイティブ抗原に対して該被験体において選択的免疫ダウンレギュレーションを確立する工程であって、該レギュレーションは、慢性肝臓拒絶疾患に罹患した細胞、組織、器官もしくはその成分に由来する材料か、またはその正常の標的を含むネイティブまたは非ネイティブ抗原を投与することによって確立され、該ネイティブまたは非ネイティブ抗原は、同種異系供給源、異種供給源、自己供給源および該供給源の組合せ、および免疫学的に等価な化合物、ならびにそれらのいずれかの組合せに由来する、工程を包含する、プロセス。
【００２９】
２４．被験体における免疫媒介性肝臓線維症疾患を処置するプロセスであって、以下の工程：
該被験体における罹患した細胞、組織または器官のネイティブまたは非ネイティブ抗原に対して該被験体において選択的免疫ダウンレギュレーションを確立する工程であって、該レギュレーションは、免疫媒介性肝臓線維症疾患に罹患した細胞、組織、器官もしくはその成分に由来する材料か、またはその正常の標的を含むネイティブまたは非ネイティブ抗原を投与することによって確立され、該ネイティブまたは非ネイティブ抗原は、同種異系供給源、異種供給源、自己供給源および該供給源の組合せ、および免疫学的に等価な化合物、ならびにそれらのいずれかの組合せに由来する、工程を包含する、プロセス。
【００３０】
２５．被験体における免疫媒介性血管障害を処置するプロセスであって、以下の工程：
該被験体における罹患した細胞、組織または器官のネイティブまたは非ネイティブ抗原に対して該被験体において選択的免疫ダウンレギュレーションを確立する工程であって、該レギュレーションは、免疫媒介性血管障害に罹患した細胞、組織、器官もしくはその成分に由来する材料か、またはその正常の標的を含むネイティブまたは非ネイティブ抗原を投与することによって確立され、該ネイティブまたは非ネイティブ抗原は、同種異系供給源、異種供給源、自己供給源および該供給源の組合せ、および免疫学的に等価な化合物、ならびにそれらのいずれかの組合せに由来する、工程を包含する、プロセス。
【００３１】
２６．被験体における免疫媒介性筋肉障害を処置するプロセスであって、以下の工程：
該被験体における罹患した細胞、組織または器官のネイティブまたは非ネイティブ抗原に対して該被験体において選択的免疫ダウンレギュレーションを確立する工程であって、該レギュレーションは、免疫媒介性筋肉障害に罹患した細胞、組織、器官もしくはその成分に由来する材料か、またはその正常の標的を含むネイティブまたは非ネイティブ抗原を投与することによって確立され、該ネイティブまたは非ネイティブ抗原は、同種異系供給源、異種供給源、自己供給源および該供給源の組合せ、および免疫学的に等価な化合物、ならびにそれらのいずれかの組合せに由来する、工程を包含する、プロセス。
【００３２】
２７．前記免疫媒介性筋肉障害が、平滑筋、黄紋筋、血管筋、およびそれらのいずれかの組合せからなる群より選択される、筋肉メンバーに影響する、項目２６に記載のプロセス。
【００３３】
本発明は、移植プロセスを提供し、この移植プロセスは、レシピエントにおける選択的な免疫ダウンレギュレーションを確立する工程であって、このレシピエントが、ドナー由来の免疫細胞、免疫組織、免疫器官またはその成分を含み、ここで、ＳＩＤＲがそのレシピエントもしくはその免疫学的等価物のネイティブもしくは非ネイティブな抗原に対して、または上記レシピエントもしくはその免疫学等価物における上記ドナーのネイティブもしくは非ネイティブ抗原に対して、あるいはその両方に対して確立されている工程、を包含する。本発明によってまた、上記の移植プロセスを使用して、レシピエントにおける移植片対宿主拒絶を予防または処置するプロセスが提供される。
【００３４】
本発明はさらに、被験体においてワクチン接種または免疫の所望されない免疫学的結果を処置または予防するためのプロセスを提供し、このプロセスは、ワクチン、免疫剤、アジュバントまたは免疫学的に等価な化合物、およびそれらのいずれかの任意の組合せとして使用された任意または全ての抗原に対して、この被験体において選択的免疫ダウンレギュレーションを確立する工程、を包含する。
本発明はまた、レシピエントに導入された場合に、このレシピエントにおいて選択的な免疫ダウンレギュレーションを提示または確立する、馴化またはプログラムされた細胞、組織または器官を含有する、組成物を提供する。
本発明によってまた、被験体においてクローン病を処置するプロセスが提供される。このプロセスは、この被験体における罹患した細胞、組織または器官のネイティブまたは非ネイティブ抗原に対してこの被験体において選択的免疫ダウンレギュレーションを確立する工程であって、このレギュレーションは、クローン病に罹患した細胞、組織、器官もしくはその成分に由来する材料か、またはクローン病の正常の標的を含むネイティブまたは非ネイティブ抗原を投与することによって確立され、このネイティブまたは非ネイティブ抗原は、同種異系供給源、異種供給源、自己供給源、およびこのような供給源の組合せ、および免疫学的に等価な化合物、ならびにそれらのいずれかの組合せに由来する工程、を包含する。
【発明の効果】
【００３５】
結論として、本発明は、以下を提供する：
本発明は、移植過程ならびに対宿主性移植片拒絶に指向される疾患の介入および予防、その上免疫化およびワクチン接種から生じる所望されない免疫学的効果の除去における独特の免疫調節の適用を提供する。他の疾患（クローン病、原発性硬化性胆管炎、原発性胆汁性肝硬変、アテローム硬化症（ａｔｈｅｒｏｓｃｈｌｅｒｏｓｉｓ）などを含む）についての処置もまた提供される。本発明はまた、このような過程を実行するための独特な組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、レシピエントの脾細胞に対する、経口寛容の誘導を通じて移植片ドナーにおけるＭＬＲ応答の減少を示す。
【図２】図２は、レシピエントのリンパ球に対する、ＢＭドナーにおける経口寛容の誘導が皮膚コラーゲンの生成を減少させたことを示す。皮膚の生検におけるコラーゲンα１（Ｉ）遺伝子発現（移植６２日後に行い、そしてジゴキシゲニン標識化マウスコラーゲンα１（Ｉ）プローブとハイブリダイズした）を示す。
【図３】図３は、脾細胞移植後６２日目の移植レシピエントにおける小腸の組織学的評価に対するドナーの寛容化の効果を示す。
【図４】図４は、脾細胞ドナーにおける、レシピエントのリンパ球に対する経口寛容誘導が、サイトカインプロフィールの逆転（Ｔｈ１〜Ｔｈ２の応答型）を誘導することを示す。
【図５】図５は、大腸炎および正常な結腸抽出タンパク質に対する寛容誘導の、実験的大腸炎を有するマウスの体重に対する効果を示す。
【図６】図６は、大腸炎の肉眼的類別に対する寛容化の効果を示す。
【図７】図７は、実験的大腸炎における腸粘膜の組織学的評価に対する寛容化の効果を示す。
【図８】図８は、実験的大腸炎の肉眼的類別に対する寛容化の効果を示す。
【図９】図９は、血清ＩＬ４（黒い棒）およびＩＦＮγ（白抜きの棒）の血清レベルに対する経口寛容の効果を示す。寛容化マウスは、Ｔｈ１からＴｈ２の免疫応答サイトカイン分泌のシフトを示した。
【図１０】図１０は、末梢性免疫寛容誘導がＮＫ１．１＋ＬＡＬ細胞傷害性機能を顕著に増強することを示す。
【図１１】図１１は、組換えＢｉｏＨｅｐＢワクチンの３つの異なる用量のｉ．ｐ．接種３０日後の抗ＨＢｓＡｇ抗体の血清レベルを示す。
【図１２】図１２は、ウイルス抗原に対する寛容誘導に対するＨＢＶタンパク質の経口投与の効果を示す。
【図１３】図１３は、ＨＢＶに関する既存の免疫性を有するマウスにおけるＢ型肝炎に対する経口寛容誘導の効果を示す。
【図１４】図１４は、既存の抗ＨＢＶ二次免疫応答に対する経口寛容誘導の効果を示す。
【図１５】図１５は、ＨＢＶ接種後のＴｕｐａｉａにおけるＡＬＴレベルの時間経過を示す。
【図１６】図１６は、正常なＴｕｐａｉａおよびＨＢＶ感染Ｔｕｐａｉａの肝臓の組織形態を例証する顕微鏡写真である。
【図１７】図１７は、インサイチュＰＣＲ増幅後およびＨＢＶ ＲＮＡの検出後のＴｕｐａｉａの肝臓切片を撮影した顕微鏡写真である。
【図１８】図１８は、ＨＢＶ抗原に対する抗体のレベルにおける感染後の経口寛容化の効果を示す時間経過である。
【図１９】図１９は、ＨＢＶ再チャレンジ後のＨＢＶ抗原に対する抗体のレベルにおける経口寛容化の効果を例証する。
【図２０】図２０は、ＨＢＶ抗原に対する抗体のレベルに対する経口寛容化の前感染の誘導の効果を示す。
【図２１】図２１は、血清ＡＬＴレベルによって決定されるようなＨＢＶ誘導肝臓損傷に対する経口寛容化の前感染の誘導の効果を示す。
【図２２】図２２は、ＨＢＶ再チャレンジ後のＨＢＶ誘導肝臓損傷に対する経口寛容化の効果を示す。
【図２３】図２３は、レチクリンで染色されたＴｕｐａｉａ肝臓生検標本の顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、所望でない免疫学的反応および状態（免疫およびワクチン接種に関連する免疫学的反応および状態、移植、ならびに多数の免疫学的疾患および障害を含む）に関する予防的および治癒的な手段を提供する。本発明はまた、免疫調節のための独特の組成物、試薬、薬物およびプロセスを提供する。予防に関して、本発明は、不適切な応答を誘導し得る免疫手順の任意の成分に対する経口寛容の誘導を可能にする。これらは、抗原とともに含まれる、アジュバントおよび化合物を含み得るがこれらに限定されない。治療的プロセスに関して、免疫手順からの不適切な応答の喚起は、ＳＩＤＲ、ＧＩＳ、またはそれらの組合せにより処置され得る。ＳＩＤＲは、免疫試薬中に所望の抗原成分とともに存在する成分に対する経口寛容化の誘導により達成され得るか、または所望の抗原自体もしくはその免疫学的等価物を含み得るかもしくはそれらからなり得る。前者の場合、所望の抗原以外の成分に対する免疫応答の低減が存在するが、所望の抗原に対する免疫応答の誘導が依然として可能である。後者の場合、免疫プロセス自体の一般的な排除または低減が存在する。ＧＩＳは、物理的プロセスまたは試薬の投与のいずれかにより達成され得る。ＧＩＳを誘導するために使用され得る物理的プロセスの１例は、放射線処置である。ＧＩＳの誘導において有用である試薬は、免疫抑制剤であり得る。免疫抑制剤の例は、コルチコステロイド、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６、またはリファンピンのような化学物質であり得る。免疫抑制剤の例はまた、タンパク質性試薬（例えば、サイトカイン、リンホカイン、インターフェロン、インターロイキン、リガンド、リガンドレセプター、および上記のいずれかに対する抗体、ならびに二次疾患の症状発現に関与するかまたは関連する任意の細胞（Ｔ細胞を含む）に対する抗体）であり得る。
【００３８】
免疫系のダウンレギュレーションを用いてヒトの多数の疾患の症状が低減されているが、本発明の前には適切な候補であるとは認識されていなかった他の疾患が存在する。本発明の１つの局面では、ＳＩＤＲ、ＧＩＳ、またはその任意の組合せが適用されて、以下の疾患の自己免疫性症状発現を軽減する：原発性硬化性胆管炎、原発性胆汁性肝硬変、セリアック（Ｃｉｌｉａｃ）病、自己免疫性慢性活動性肝炎、慢性肝臓拒絶、免疫媒介肝臓線維症、免疫媒介性脈管障害、免疫媒介性脈管閉塞、免疫媒介筋障害（平滑筋および横紋筋ならびに血管筋を含む）。
【００３９】
本発明は、病原体による感染の所望でない免疫の結果の関連性および処置を開示した。本発明の使用のさらなる例は、病原体の存在により媒介され得るかまたは関連し得る、ヒトにおける冠状動脈疾患を処置するための適用である。Ｍｅｈｔａ，Ｊ．Ｌ．ら，「Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ａｎｄ ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．５（６）：１２１７−２５（１９９８）；およびＯｓｓｅｉ−Ｇｅｒｎｉｎｇ，Ｎ．ら，「Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ａｔｈｅｒｏｍａ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｎｇｉｏｇｒａｐｈｙ」，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５（１）：１２０−１２４（１９９７）を参照のこと。
【００４０】
さらに詳述するために、経口寛容化が、この適用において同系の実験動物に養子移入される場合、同じ抗原に対する免疫化を誘導する、少なくとも末梢血単核細胞画分（ＰＢＭＣ）において存在するあるクラスの細胞の産生を導くことがここで実証されている。このことは、本発明者らがＴｓ細胞と呼ぶ、あるクラスの細胞を同定する。このような細胞集団は、寛容化抗原の経口提示を用いて達成される寛容化を含む、寛容化の誘導によって、免疫能力のある動物（ヒトを含む）内で産生される。
【００４１】
一般に、本発明はさらに、免疫細胞を、寛容化した免疫細胞を有するように以前にプログラムしたかまたは馴化したドナー由来のレシピエントに移入することにより、これらの細胞をレシピエント（ＤＩＤＲ）に移入することにより、レシピエントにおけるＳＩＤＲを、上記特異的抗原に対して付与し得ることを実証する。後者は、１９９７年２月２８日出願の米国出願第０８／８０８，６２９号に記載されている。レシピエントに対する移入によってＳＩＤＲを付与する細胞、組織、または器官（免疫成分）は、異種の、同種異系の、同系の、または自己の宿主またはドナーから得られ得る。ドナーが、レシピエントの免疫成分と免疫学的に適合性でなく、そしてレシピエントの免疫成分を宿主に運ぶかまたは免疫成分に対する宿主（代理ドナー（ｄｏｎｅｏｒ））である必要がある場合の例では、レシピエントの免疫成分に対する代理ドナーの免疫応答を最少化するように、好ましくは、上記代理ドナーへのレシピエントの免疫成分の導入前に、代理ドナーが、免疫不全である、免疫抑制される、またはレシピエントの免疫成分に対して寛容化されることが所望される。代理ドナーにおけるレシピエントの免疫成分は、特定の抗原に対するＳＩＤＲを（例えば、経口寛容化によって）発達させるように馴化またはプログラムされる。この免疫成分は後に、レシピエントに移入され得、従って、上記レシピエントにＳＩＤＲを付与し得る。
【００４２】
免疫レシピエントにおいてＳＩＤＲを付与し得る、免疫細胞、組織または器官（免疫成分）は、ＰＢＭＣ、造血幹細胞、肝臓細胞、Ｔ細胞、Ｔ細胞のいくつかのサブクラス、骨髄細胞、腸細胞、胸腺細胞、脾臓細胞、リンパ節由来の細胞、または上記の任意の組合せに由来し得る。このような細胞、組織、または器官は、特定の抗原に対する確立されたＳＩＤＲを既に有する、ドナーまたは代理ドナーのいずれかに由来し得る。ＳＩＤＲプログラムされた細胞、組織、または器官を得るために代替的なアプローチは、このようなプログラムされた免疫細胞、組織、または器官（免疫成分）をインビトロまたはエキソビボで発達、増殖、および／または単離することである。このようなプロセスの１例では、既に寛容化されたドナーまたは代理ドナーの免疫成分は、取り出され、そして培養系に導入される。特異的な寛容化成分は、単離、分画、選択され得、そして／または特異的な寛容化成分を有する画分のみをレシピエントへの導入のために選択するように特異的な寛容化活性について富化される。この様式では、任意の所望されていないエピトープに対する寛容化免疫成分の反応または活性が、（所望の場合には）レシピエントへの導入前に回避され得る。
【００４３】
免疫成分は、寛容化されていないレシピエントから入手または誘導され、次いでさらに、インビトロまたはエキソビボの系に供され、それを介して、この免疫成分は、特定の抗原に対するＳＩＤＲをレシピエントにおいて付与するためにさらに馴化またはプログラムされる。これらの成分は、レシピエントへ導入し戻す前にさらに増殖され得るか、または選択的に単離もしくは富化され得る。
【００４４】
このような系における免疫応答細胞、組織、または器官の供給源は、このような抗原についての特異性を有する、抗体産生細胞、癌細胞もしくは細胞株、または免疫細胞であり得る。上記の抗体産生細胞は、モノクローナル抗体を提供するために単一の供給源に由来し得るか、またはポリクローナル抗体を提供するためにいくつかの供給源に由来し得る。
【００４５】
インビトロまたは培養系は、合成の特徴付けられた培地、または特徴付けられていない天然成分（例えば、自己血清もしくは非自己血清）を含有する複雑な培地を含有し得る。インビトロまたは培養系はさらに、このような系における寛容化免疫成分の発達を容易にし得るおよび／またはこのような免疫成分の増殖を支持し得る、細胞または組織または器官またはそのフラグメントを含み得る。これらは、肝臓、腸、胸腺、脾臓、骨髄、または他のマトリックスに由来し得る。このようなインビトロ系はさらに、必要とされ得る場合、適切なリンホカインおよびサイトカインを含み得る。
【００４６】
経口寛容化が、サプレッサーＴ細胞（Ｔｓ）と呼ばれる移入するクラスのＴ細胞、もしくは他のサブタイプのＴ細胞、または他のサブタイプのリンパ球（ＮＫ１．１ Ｔ細胞を含む）の産生を誘導することは可能である。同系実験マウスの例では、本発明は、マウス間で末梢血単核細胞を移入することにより、マウスからマウスへの寛容化の移入を記載する。この基準の意味は、特定のクラスの細胞が、適切な細胞、基質、および細胞因子の存在下で前駆体Ｔ細胞（ナイーブＴ細胞）から産生され得ること、および特定の抗原に対して寛容性を付与するのはこのクラスの細胞であることである。肝臓は、経口寛容化の誘導において役割を有すると示唆されているので、肝臓に関連するリンパ球のサブタイプ（例えば、ＮＫ１．１ Ｔ細胞）または肝臓内細胞の他のサブタイプは、寛容化プロセスに関連付けられている。免疫細胞のサブタイプが、他のサブタイプの免疫調節細胞または他の細胞への直接的または間接的な関連を介して、肝臓の環境におけるプログラミングに関与し得ることもまた示唆する。従って、これらの細胞が、寛容化が求められる被験体の身体外で処置され得るならば、次いでこれらの細胞は、有害な効果は最少にして、寛容性を誘導するために被験体の身体に注入して戻され得る（おそらく、精製後）。特定のＴｓ細胞、またはさらにより一般的なＴｓ細胞の亜集団のこの「馴化」は、インビトロで培養において行われ得るか、またはこの馴化は、適切な宿主生物の身体中で行われ得る。特定のまたはさらに一般的なＴｓ細胞を馴化するために、抗原特異的寛容化細胞の選択的誘導および増殖のためにインビボで存在する環境に匹敵する、インビトロでの環境を確立することが必要である。馴化は、抗原特異的様式または抗原非特異的様式で免疫細胞の低減をもたらす、特定のサブタイプの細胞および／またはサイトカインを含み得る。例えば、インビトロで馴化される場合、これらは、リンパ節由来の、または骨髄由来の、または胸腺由来の、肝臓、あるいはこれらの３つの供給源の組み合わせまたは他の供給源由来の支質細胞の存在下または非存在下で、混合型リンパ球反応において馴化され得る。これらのＴｓ細胞が動物において馴化または産生される場合、これらは、調製されたＳＣＩＤマウスまたは他の動物（これらは、マウスにおいて寛容化の誘導に必須であることが示されているので、おそらく、ヒト肝臓細胞を有する）において馴化され得る。これらは、細胞機能は維持するが細胞増殖を維持しないように免疫切除された動物において馴化され得る。この動物は、遺伝的に、または誘導されるかのいずれかでＳＣＩＤ状態を有し、そして必要な場合にはヒト肝臓細胞を受け入れ得る、齧歯動物または任意の動物であり得る。例えば、２つ挙げると（しかし、このリストに限定されない）、馴化は、全身が照射されたＲＡＧ２マウスまたはラットにおいて行われ得る。これらが馴化され、そしておそらくインビトロまたはインビボのいずれかで増幅された後、細胞は、自己に注入し戻され得るか、または同種異系のもしくは異種の宿主もしくはレシピエントへ注入し戻され得る。これらのいずれかの手順（インビトロまたはインビボにおける特異的または一般的なＴｓ細胞の馴化または再教育）は、多数の自己免疫的性質の状態を管理し得る非侵襲性および無毒性のプロトコルの開発を導く。これらの細胞は、治療試薬として用いられて、免疫媒介病因を管理し得る。この手順は、自己免疫状態、および免疫応答（天然の体液性免疫、アレルギー応答、および細胞性免疫を含む）の影響を最少にすることが求められる他の状態の管理に適切である。
【００４７】
本発明の新規な産物および手順を開発するために用いられた材料および方法ならびにプロトコルのさらなる説明については、Ｓｔｉｔｅｓ，Ｄ．Ｐ．およびＴｅｒｒ，Ａ．Ｉ．（編），Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ第７版の第１〜２４章，Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ， Ａ Ｄｉｖ．ｏｆ Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（１９９１）が参照される。
【００４８】
例えば、適切な細胞、組織または器官は、重篤な複合免疫不全を有するマウスまたは他の動物（Ｒａｇ２マウスまたはＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスなど）に注入または移植され得、次いで代理動物が、上記のように寛容化抗原の経口提示を通して、または経口寛容化に等価なレジメを通して寛容化される。寛容化は、マウスに、２０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清中の５０ｎｇの寛容化抗原を与えることにより、達成され得る。寛容化レジメの終了後、これらの細胞を白血球搬出により取り出し得、そして必要な場合は従来の分離手順（例えば、Ｆｉｃｏｌ勾配）を用いて、代理動物から単離する。例えば、ヒトＰＢＭＣが、ＳＣＩＤマウス内の機能的な特異的Ｔｃ細胞を含むように変更されること求められるならば、これらは、循環から単離され得、そしてヒト細胞特異的抗体パニング手順またはこのような手順の何らかの変法を用いて分離され得る。これらの寛容化細胞は、ＳＤＩＲまたは選択的免疫調節を誘導するためにヒト被験体に注入し戻され得る。
【００４９】
さらなる例として、１９９７年６月１６日出願のＢｒｏｗｎらの同時係属中の特許出願である米国特許出願第０８／８７６，６３５号に記載されるようなヒト−マウスキメラ肝臓を含むＲａｇ２マウスには、寛容化されるべきヒト由来のＰＢＭＣが（またはＣＤ４５＋でさえも）注入され得る。このマウスには、ＨＣＶ抗原が与えられて、Ｔｓ細胞の複製を誘導し得る。ヒトＴ細胞は、取り出され、増殖され、そして上記の通りに被験体に注入し戻され得る。特異的Ｔｓ細胞の存在について試験するために、このマウスに、寛容化に続いてＨＣＶをチャレンジし得る。肝臓内のヒト細胞におけるＨＣＶの増殖の証拠の存在下ではヒト細胞病状が存在しないという観察は、寛容化の誘導の証拠である。
【００５０】
さらなる例として、ラットのような動物は、優勢な造血細胞は複製しないが、それらの分化した表現型に従って機能する条件下で、全身照射により、または免疫消失化学物質（ｉｍｍｕｎｏａｂｌａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いることにより、いずれかにより切除され得る。ＰＢＭＣは、これらの切除した動物に注入または導入され得、そしてこの動物は、続いての、寛容化抗原の経口提示を通して、または上記の通りの経口寛容化に等価なレジメを通して寛容化され得る。さらに、寛容化レジメの完了後、これらの細胞を、切除した実験動物およびこの動物由来の免疫細胞から取り出し、そして必要に応じて精製し得る。
【００５１】
選択的誘導および抗原特異的寛容化細胞の増殖に関してインビボに存在する環境に匹敵し得るインビトロ環境からなるなお別の例が作製される。Ｔｓ細胞は、インビトロでまたはドナーまたはレシピエントの身体外で産生される。これらの細胞は、抗原提示細胞の存在下で、ならびにリンパ節由来の、もしくは骨髄由来の、もしくは胸腺由来の、または肝臓、もしくはこれらの３つの供給源の組み合わせ、もしくは他の供給源由来の支質細胞の存在下または非存在下で混合型リンパ球反応において馴化される。
【００５２】
Ｔｓ細胞の存在または非存在は、以下を含むいくつかのアッセイ方法を用いて決定される。
【００５３】
（アッセイ１：51Ｃｒ放出細胞傷害性アッセイ）
これらの研究において用いられる標的細胞は、ＹＡＣ−１細胞、１０％ ＦＣＳを有する補充したＲＰＭＩを用いて組織培養における連続増殖に適応させたリンパ腫細胞株、または任意の他の型の特化した（ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ）標的細胞、または抗原特異的感作Ｂリンパ球もしくはＴリンパ球であり得る。ＹＡＣ−１細胞は、これらを、２×１０5細胞／ｍｌの密度で、ＲＰＭＩ １０％ ＦＣＳを有する２５ｍフラスコ中に播種し、そしてそれらを２４時間後に収集することにより調製され得る。細胞を、５０ｍｌチューブに懸濁し、そして収集し、そして１２５０ｒｐｍにて１０分間、培地を用いて２回洗浄する。この手順は、エフェクター細胞による溶解の51Ｃｒでの効率的な標識および高い感度を保証する。標的細胞を、51Ｃｒで標識し、そして３７℃にて９０分間インキュベートする（３００μｌ ＲＰＭＩ培地中、２００ｍＣｉ／２×１０6細胞）。細胞を、１０分ごとに手で混合する。インキュベーション後、３ｍｌの２０％ ＦＣＳ ＲＰＭＩを添加し、そして３７℃にて３０分間、再度インキュベートする。細胞を、ＲＰＭＩ １０％ ＦＣＳ中で３回洗浄し、そして計数する。標識効率の程度の決定のために、１００μｌの細胞を計数する。エフェクター細胞は、試験されるべきリンパ球の亜集団である。51Ｃｒ放出アッセイは、Ｃｏｓｔａｒ ９６ウェルプレート中で行われ得る。１００μｌ中の計数された数のエフェクター細胞を、１００μｌ中の５，０００個の標識された標的細胞と混合する。エフェクターと標的との比（Ｅ：Ｔ比）は、５０：１；２５：１；および１２．５：１である。各ウェルは、計２００μｌの容量で標的細胞およびエフェクター細胞を含む。５つのウェルを、各サンプルからの各比について試験し得る。自然放出の決定のために、６個のウェルの類似の数の標的細胞を、１００μｌのＲＰＭＩ １０％ ＦＣＳにプレーティングする。最大放出の決定のために、６ウェルの１００μｌの培地中の標的細胞を、１００μｌのＴｒｉｔｏｎＸと混合する。このプレートを５００ｒｐｍにて２分間遠心分離し、続いて３７℃にて５％ ＣＯ2中で４時間、インキュベートする。次いで、このプレートを再度５００ｒｐｍにて２分間遠心分離し、そして上清を回収し、そしてガンマカウンターを用いて計数する。結果は、以下の式を用いることにより算出される標的細胞の比溶解パーセントとして表される：細胞傷害性％＝アッセイの平均ｃｐｍ−自然放出からのｃｐｍ／ＴｒｉｔｏｎＸで溶解させた標的からのｃｐｍ−自然放出からのｃｐｍ×１００。
【００５４】
（アッセイ２：抗原特異的サイトカイン放出細胞傷害性アッセイ）
血清由来の抗原特異的感作Ｂリンパ球もしくはＴリンパ球、または器官特異的Ｔ細胞は、標的細胞として役立ち得る。血清由来の抗原特異的寛容化Ｂリンパ球もしくはＴリンパ球、または器官特異的Ｔ細胞は、エフェクター細胞として役立ち得る。これらの２つのＴリンパ球の亜集団を、専門抗原提示細胞（樹状細胞またはマクロファージ）とともに、および標的抗原とともにインキュベートする。ＴｈＩ（例えば、ＩＦＮγ）またはＴｈ２（例えば、ＩＬ４、ＩＬ１０）のサイトカイン放出を、ＲＴ−ＰＣＲにより、またはＥＬＩＳＡ試験により、上清において測定する。サイトカインを介するＴ細胞誘導を用いて、サイトカイン放出を増大させ得る。
【００５５】
（アッセイ３：寛容化活性の存在の尺度としての免疫細胞により産生される特異的抗体の量の低減の測定）
これらの細胞は、免疫媒介病因を管理するための治療試薬として用いられ得る。これらの抗原特異的Ｔｓ細胞は、寛容の逆養子移入（ｒｅｖｅｒｓｅ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｒａｎｓｆｅｒ）のために用いられ得る。これらの手順は、自己免疫の性質の多数の状態を管理するための非侵襲性および無毒性のプロトコルの開発を導き得る。
【００５６】
これらの手順は、自己免疫に基づく種々の疾患または状態（いくつか挙げると、Ｂ型肝炎感染、Ｃ型肝炎感染、クローン病、および移植片対宿主病を含む）を管理するための新たな治療様式を作製し得る。この協力から開発された薬学的材料は、経口薬物として製造され得る。寛容化細胞の免疫プログラミングの場合、この材料は、特異的Ｔｓ細胞またはさらに特異的Ｔｓ細胞を含む同種異系もしくは異種の細胞（ｃｅｆｌ）を含む自己細胞の注入として送達され得る。
【００５７】
このクラスの細胞は、寛容化するように試みられる被検体の身体の外部において産生され得、そして悪影響を最小限にしながら、寛容を誘導するために被検体の身体に戻して注入（おそらく精製の後）され得る。Ｔｓ細胞の特定の（またはより一般的でさえある）サブ集団の「訓練」は、代用の動物中でインビボで、または培養物中でインビトロの両方で行われ得る。これらのＴｓ細胞が動物中で訓練または産生される場合、これらＴｓ細胞は、適切なＳＣＩＤマウスか、または他の動物（おそらくは、マウスにおいて寛容の誘導に必須であることが示されているヒト肝臓細胞を用いて）において訓練され得る。これらＴｓ細胞は、免疫切除された動物中で訓練され得、そしてその細胞は、細胞機能を維持するが、分裂しない。代理宿主動物は、齧歯類、あるいは遺伝的にか、または誘導されたかのＳＣＩＤ状態を有し、そして必要に応じてヒト肝臓細胞を受容し得るいずれかの動物であり得る。例えば、訓練は、ＲＡＧ２マウスか、または全身照射されたラット中で行われ得る（２つに言及するが、これらに限定されない）。特定のＴｓ細胞が訓練され、そしておそらくインビトロまたはインビボにおいて増幅された後、この細胞は、自系に、あるいは、同種異系または異種の宿主もしくはレシピエントに戻して注入され得る。抗原特異的寛容化細胞（Ｔｓ）の選択的誘導および拡大のためにインビボに存在する環境に匹敵するインビトロ環境において、特異的なまたはより一般的なＴｓ細胞を訓練するために、訓練される細胞、細胞を含有する組織または器官は、Ｔｓ細胞の産生を促進する条件下で抗原提示細胞と混合されなければならない。例えば、インビトロにおいて訓練する場合、これらは、リンパ節由来、または骨髄由来、または胸腺・肝臓由来、あるいはこれら３つの供給源または他の供給源の組み合わせ由来の支質細胞の存在下あるいは非存在下で、混合されたリンパ球反応において、訓練され得る。
【００５８】
これら手順のいずれか（インビトロまたはインビボにおける特異的Ｔｓ細胞または一般的なＴｓ細胞の訓練または再教育）は、自己免疫の性質の大多数の状態を管理する、非侵襲性および非毒性のプロトコールの開発をもたらす。これらの細胞は、免疫媒介性病因の管理のための治療的試薬として使用される。この手順は、天然における体液性免疫を含む免疫応答、アレルギー性応答、および細胞性免疫を含む免疫応答の所望されない効果を最小化することが求められる、自己免疫状態および他の状態の管理に適切である。
【００５９】
本発明の他の実施態様および局面は、移殖に関連した以下の記載を含む。
【００６０】
レシピエント被検体中に細胞、組織、器官またはその成分を移植する工程；および１つ以上のネイティブまたは非ネイティブの抗原あるいはネイティブ抗原または非ネイティブ抗原の混合物に対して、レシピエント移殖被検体において、選択的な免疫のダウンレギュレーションを確立する工程を包含する、レシピエント被検体中の免疫拒絶を予防するか減少するための移殖プロセス。そのようなネイティブまたは非ネイティブ抗原は、造血細胞を含み得る。そのような造血細胞は、幹細胞、Ｔ細胞、リンパ球、骨髄細胞、ＣＤ３４＋およびＣＤ４５＋、またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。上記のＴ細胞は、ＮＫ細胞またはＮＫ．１抗原を発現する細胞を含み得る。
【００６１】
ネイティブまたは非ネイティブ抗原は、上記のレシピエント移殖被検体またはドナー、あるいはその両方に由来し得る。非ネイティブ抗原は、異種または同種異系であり得る。ネイティブの抗原は、レシピエント移殖被検体の幹細胞、Ｔ細胞、およびレシピエント抗原を発現する組織、またはこれらの任意の組み合わせから選択されるメンバーを含み得る。非ネイティブ抗原に関して、これらはドナー由来の幹細胞またはＴ細胞を含み得る。
【００６２】
移殖プロセスにおいて、移殖工程は、骨髄移植を包含し得る。レシピエント移殖被検体中におけるＳＩＤＲの確立は、骨髄移殖または固形器官移殖の結果であり得る対宿主性移植片（ＧＶＨ）拒絶を予防または減少し得る。
【００６３】
レシピエント移殖被検体、あるいは細胞、組織もしくは器官またはそれらの組み合わせがそこから移殖されるドナー、あるいはその両者は、さらに１つ以上の免疫調節処置に供され得る。そのような免疫調節処置は、放射、化学剤、および生物学的因子、またはそれらの任意の組み合わせからからなる群から選択される手段によって行われ得る除去を含み得る。ＳＩＤＲ確立工程は、除去前、除去後、または除去の間に行われ得る。
【００６４】
上記の生物学的因子は、サイトカインおよび抗体、またはその両者からなる群から選択される。免疫調節処置は、単回投与量、または反復する単回投与量として行われ得る。
【００６５】
ネイティブまたは非ネイティブの抗原は、天然抗原、合成抗原、改変抗原、非改変抗原、全体としての抗原、および抗原フラグメントまたはこれらの組み合わせからなる群から選択され得る。ネイティブ抗原または非ネイティブ抗原の群は、組織適合性決定基を含み得る。そのような組織適合性決定基は、順にＭＨＣ決定基ＩまたはＩＩ、あるいは両方を含み得る。ネイティブまたは非ネイティブ抗原はまた、タンパク質、糖タンパク質、酵素、抗体、組織適合性決定基、リガンド、レセプター、ホルモン、サイトカイン、細胞膜、細胞成分、ウイルス、ウイルス成分、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、細胞全体、組織および器官からなる群から選択される。組織適合性決定基は、上記のＭＨＣ決定基ＩまたはＩＩあるいはその両方である。
【００６６】
また、看過されるべきでないものとして、被検体における感染性因子に対する所望されない免疫学的効果を予防または減少するためのプロセスにおける、本発明の使用がある。これは、感染因子またはネイティブ抗原、あるいはその両方の、成分または複数の成分またはフラグメントのいずれかに対する被検体における免疫調節の選択的ダウンレギュレーションの確立を包含する。所望されない免疫学的効果は、所望されない抗体の産生、細胞媒介性免疫反応、自己免疫、炎症性反応、リガンドレセプター結合、サイトカイン産生およびアポトーシス、またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択され得る。所望されない免疫効果は、肝炎およびＨＩＶからなる群から選択されるメンバーによって生じ得る。さらに、所望されない免疫学的効果は、ＨＣＶ−およびＨＢＶ−関連クリオグロブリン血症、ＨＣＶ−、ＨＢＶ−およびＨＩＶ−関連自己免疫障害、ＨＢＶ−およびＨＣＶ−関連非肝臓標的器官損傷からなる群から選択され得る。
【００６７】
上記の成分または複数の成分またはフラグメントは、天然、合成、または免疫学的等価物であり得る。上記の移殖プロセスはさらに、サイトカイン、サイトカインに対する抗体、アポトーシス因子、抗感染因子、またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される任意のメンバーを用いて被検体を処置する工程を包含し得る。
【００６８】
ただいま上記に記載した移殖プロセスにおいて、被検体レシピエントは、１つ以上の特異的抗原に対して確立されたＳＩＤＲの結果として、バイスタンダー効果を示し得る。そのようなバイスタンダー効果は、場合によって、所望されてもされなくてもよい。
【００６９】
以下の実施例は、本発明の種々の局面を説明するために提供される。この包含は、いかなる意味においても、いかなる方法によっても、特許請求の範囲によってより具体的に規定される本発明の範囲を限定することを意図しない。
【実施例】
【００７０】
（好ましい実施態様の説明）
以下の実施例は、本発明の種々の局面、および本発明の価値の指標である。
【００７１】
（実施例１；対宿主性移植片病での経口寛容誘導の効果）
レシピエント抗原または免疫学的等価物を用いるドナーの経口寛容化は、レシピエント中に移殖された場合に、ドナー免疫細胞からの慢性対宿主性移植片病（ｃＧＶＨＤ）応答を妨げ得る。
【００７２】
（材料および方法）
動物：ドナーマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から得た１２週齢の雌Ｂ１０．Ｄ２マウス（Ｈ−２d、ｍｉｓ−ｂ）であった。レシピエントは、ＢＡＬＢ／ｃマウス（同様にＨ−２d、ｍｉｓ−ｂ）であった。マウスを、Ｈａｄａｓｓａｈ−Ｈｅｂｒｅｗ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ ＳｃｈｏｏｌのＡｎｉｍａｌ Ｃｏｒｅにおいて、１２時間の明／暗サイクルで飼育した。全ての動物実験は、Ｈｅｂｒｅｗ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ−Ｈａｄａｓｓａｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓの認証を得た。照射および脾細胞移殖に続き、マウスを層流アイソレーターに維持した。全ての動物に、定期的な実験固形飼料および適宜の飲料水を与えた。
【００７３】
レシピエントの脾細胞の調製およびドナーへの投与：脾臓をＢＡＬＢ／ｃおよびＢ１０．Ｄ２マウスから摘出し、そして脾細胞を機械的にホモジナイズした。４０μｍナイロン細胞ろ過器を通して濾過した後、残りのインタクトな細胞を遠心沈殿して、除去した。タンパク質をＢｉｏｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎアッセイ試薬を使用して測定した。ドナーＢ１０．Ｄ２マウスに、一日おきに（計５用量）、給餌カニューレを用いて５０μｇのタンパク質を含有するホモジネートした脾細胞タンパク質の給餌をした。使用した脾細胞の用量を、他者および本発明者らによって行われた初期の投与実験によって決定した（Ｉｌａｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９７；９９：１０８〜１１０６、Ｓａｙｅｇｈら、１９９２；５３：１６３〜１６６、Ｓａｙｅｇｈら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９９６；８９：７７６２〜７７６８）。５０μｇの用量が、低用量経口寛容範囲内であることが見出された。
【００７４】
脾細胞ドナーおよびレシピエント群：各１０匹の動物からなるマウスの２つの群を脾細胞ドナーとして使用した。経口寛容化群（群Ａ’）において、Ｂ１０．Ｄ２ドナーマウスを、レシピエント系統ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾細胞のホモジネートで給餌した。これらのマウス由来の脾臓細胞を群Ａ ＢＡＬＢ／ｃレシピエントマウス（ｎ＝１０）中に移殖した。コントロール群（群Ｂ’）は、同系Ｂ１０．Ｄ２マウス脾細胞から調製されたホモジネートを給餌したドナーＢ１０．Ｄ２マウスからなり、そして群Ｂ ＢＡＬＢ／ｃレシピエント（ｎ＝１０）についての脾臓細胞ドナーとして役立てた。
【００７５】
脾細胞移殖：慢性対宿主性移植片病（ｃＧＶＨＤ）を誘導するために、Ｂ１０．Ｄ２マウス由来の２．５×１０7の脾臓細胞を、移殖前に60Ｃｏの全身照射（６Ｇｙ）を受けた１０匹のＢＡＬＢ／ｃレシピエントマウスの静脈内に注入した（Ｊａｆｆｅ Ｂ．Ｄ．およびＣｌａｍａｎ Ｈ．Ｎ．、Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８５；９４：７３〜８４）。
【００７６】
一方向混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイによるドナーマウス中に誘導された寛容の評価：ドナーＢ１０．Ｄ２マウスにおける、レシピエントマウスの副組織適合性抗原に対する寛容の誘導を、一方向混合リンパ球反応（ＭＬＲ）試験（Ｄｅｖａｎｄｅｒら：Ｒｏｓｅ ＮＲ、Ｆｒｉｅｄｍａｎ Ｈ、Ｆａｈｅｙ ＪＬ、編、Ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、３版、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １９８８：８４７〜８５２、Ｂｉｓｈａｒａら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ １９９４；５７：１４７４〜１４７９）によって評価した。一方向ＭＬＲ試験を、Ｂ１０．Ｄ２脾細胞対ＢＡＬＢ／ｃ脾細胞において行った。Ｂ１０．Ｄ２に応答して、脾細胞（１×１０6）を平底マイクロウェルプレート（Ｓｔｅｒｌｌｉｎ、カタログ番号、Ｍ２９ＡＲＴＬ）中で、照射（３０Ｇｙ）したＢＡＬＢ／ｃ脾臓細胞（１×１０6）と共に、１００μｇ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ−グルタミンを補充し、５×１０-5 ２Ｍ−ＭＥおよびマウス脾細胞に吸着させた１０％熱非働化ヒトＡＢ血清を有する総容量０．２ｍｌのＲＰＭＩ １６４０培養培地中で培養した。この血清の組み合わせは、強力な一次および二次同種異系応答を生じ、そして低い非特異的なバックグラウンドを生じる。３７℃加湿５％ＣＯ2インキュベーター中での７２時間の後、１ｍＣｉの3Ｈ ＴｄＲ（５ Ｃｉ／ｎｍｏｌ、Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｎｅｇａｖ、Ｉｓｒａｅｌ）を各ウェルに添加した。細胞を、マルチプルサンプルハーベスター（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ Ｃｅｌｌ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ ５３０；Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＭｃＣｌｅａｎ、ＶＡ、２２１０２）を使用して、１６〜１８時間後に紙のろ紙上に回収し、そして放射活性を液体シンチレーションカウンター中で決定した。寛容および非寛容Ｂ１０．Ｄ２脾細胞のそれら自身に対して生じるバックグラウウンドを、差し引いた。
【００７７】
慢性対宿主性移植片病（ｃＧＶＨＤ）の評価：慢性対宿主性移植片病の評価を、以下のパラメーターを使用して脾細胞の移植の６２日後に行った：全体重および脾臓重量、α１（Ｉ）型コラーゲンの遺伝子発現、ならびに肝臓および小腸の炎症応答。
【００７８】
体重および脾臓重量：体重を、研究を通じて、毎週記録した。脾臓を、研究の終了時に、計量した。
【００７９】
コラーゲンｍＲＮＡの皮膚含量のインサイチュハイブリダイゼーション：両方の群のマウスを脾細胞移殖の６２日後に屠殺した。皮膚生検を、耳より得て、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に採集した。生検の標本をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド中で、４℃で、一晩固定化した。連続する５μｍ切片を、等級エタノール中でサンプルを脱水した後に調製し、クロロホルム中で明澄化し、Ｐａｒａｐｌａｓｔ中に包埋した。ハイブリダイゼーションのために、切片をキシレン中で脱パラフィン化し、等級エタノール中で再水和し、５分間蒸留水でリンスし、そして２×ＳＳＣ中で７０℃、３０分間インキュベートした。切片を再度蒸留水中でリンスし、そしてプロテイナーゼＫ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ エチレンジアミン四酢酸、ｐＨ ７．５中に１０μｇ／ｍｌ）で１０分間処理した。消化の後、切片を０．２％グリシンでブロックし、蒸留水でリンスし、等級エタノールで迅速に脱水し、数時間風乾し、そしてＰＢＳ中の１０％ホルマリンで後の固定（ｐｏｓｔ−ｆｉｘ）をした。皮膚切片を、プラスミド（ｐＵＣ１８）から１６００ｂｐの挿入物を切り出し、ｐＳａｆｙｒｅ（Ｂ．Ｅ．Ｋｒｅａｍ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｎｎｅｔｉｃｕｔ、ＣＴ、ＵＳＡからの寛大な贈与物）中に挿入することにより生成した、ジゴキシゲニン標識したα１（Ｉ）型コラーゲンのプローブとハイブリダイズさせた。Ｇａｒｓｃｏｎ−Ｂａｒｒｅら、Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、１９８９；３７：３７７〜８１、Ｐｉｎｅｓら、Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ．１９９８；１４：７６５〜８１、Ｐｉｎｅｓら、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ １９９７；２７：３９１〜３９８）。
【００８０】
慢性対宿主性移植片病（ｃＧＶＨＤ）の組織学的変化の等級付け：マウスを、脾細胞移植の６２日後に屠殺した。肝臓および腸の炎症の程度の評価のために、組織を両群の全てのマウスから取り出し、１０％ホルムアルデヒド中に維持した。各マウスからの５つの組織切片を、パラフィンに包埋し、切片化し、そして標準的な手順によって、ヘマトキシリン−エオシンを用いて染色した。以前に記載されたように、肝臓と小腸のコード化された顕微鏡切片の炎症の程度を、実験条件を知らない２人の経験のある病理学者によって、半定量的に０から４に等級付けした。
【００８１】
（ａ）肝臓切片を、Ｈｏｗｅｌｌら（Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ １９９５；１６：１３９〜１４５）およびＨｏｗｅｌｌら（Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９２；１４０：５４〜６６）に記載される標準的なスコア付け判定基準に従って、等級付けした。手短には；等級０：正常または３０％未満の門脈炎症（炎症性細胞によって拡張される門脈道の割合に基づく）および正常の胆管上皮；等級１：３０〜４０％の門脈炎症および正常の胆管上皮；等級２：４０〜６０％の門脈炎症および異常な胆管上皮形態；等級３：６０〜８０％の門脈炎症および胆管のリンパ球浸潤；および等級４：８０〜１００％の門脈炎症、および胆管細胞の死滅または胆管の破損。
【００８２】
（ｂ）小腸の標本を、以下の尺度で等級付けした；等級０：正常の小腸粘膜；等級１：正常な量の粘膜細胞を有する絨毛細胞構築の中程度の変形、陰窩過形成の証拠をともなう陰窩の基底中の時折のアポトーシス細胞；等級２：絨毛細胞構築の部分的消失または平滑化、粘膜細胞枯渇、管腔内の上皮細胞の脱落、著しいアポトーシスおよび陰窩過形成および固有層内への単核細胞の浸潤および腺窩炎；等級３：等級２に加えて斑状かまたは全体的な粘膜の壊死または潰瘍化（Ｗｏｏｄｒｕｆｆら、Ｔｒａｎｓ Ｐｒｏｃ．１９７６；８：６７５〜６８４、Ｈｏｗｅｌｌら、１９９５、前掲）。
【００８３】
血清サイトカインレベル：プロ炎症性および抗炎症性サイトカインのバランスに対する経口寛容の効果の評価のために、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ２、およびＩＬ１０血清レベルを、以前に記載されたように（Ｂａｒａｋら、１９９５；１７：１６９〜１７３、Ｎａｇｌｅｒら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ １９９５；６０：９４３〜９４８）製造業者の指示に従い、高感度ＲＩＡまたは酵素免疫アッセイ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、ＵＳＡ）によって測定した。これらのキットは、アルカリホスファターゼ反応産物が発色レポーター系の形成の補酵素として役立つ増幅系を使用する。第２の酵素系は、アルコールデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼ（増幅剤）からなる。血清サイトカインレベルを、脾細胞移植の１４日後、各群からの５匹のマウスにおいて測定した。
【００８４】
統計学的分析：結果を、サイトカインアッセイについてスチューデントｔ検定により、そして組織学的等級付けについてＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙランク合計試験により、分析した。
【００８５】
（結果）
レシピエント脾細胞に対するドナー脾細胞のＭＬＲ応答：レシピエントＢＡＬＢ／ｃ脾細胞抗原に対するドナーＢ１０．Ｄ２マウスにおける寛容の誘導を、一方向ＭＬＲ試験によって測定した。図１に示すように、寛容化されたＢ１０．Ｄ２マウス由来の脾細胞への応答は、非寛容化Ｂ１０．Ｄ２マウス由来の脾細胞への応答（２３，７３２＋２３７６ｃｐｍ、ｎ＝３、ｐ＜０．００５）と比較して、ＢＡＬＢ／ｃ標的脾細胞に対するＭＬＲ応答における顕著な減少を示した（８６４８＋１１４２ｃｐｍ、ｎ＝３）。
【００８６】
脾細胞ドナーの経口寛容化による慢性対宿主性移植片病（ｃＧＶＨＤ）の予防：
ａ．体重および脾臓重量：脾細胞移殖の２１日後に、総体重は、群Ｂレシピエント（非寛容化コントロール由来の細胞を受容）におけるよりも、群Ａマウス（寛容化ドナー由来の脾細胞を受容）において有意に重かった（１８．３５＋１．１１対１５．６８＋０．９８ｇ、ｎ＝１０、ｐ＜０．０５）。しかし、６２日目の研究の終了時において、いずれの群においても、体重の有意な差異はなかった（データをしめさず）。脾臓重量もまた、研究の終了時において、統計学的に差異がなかった（０．０５８＋０．００９９対０．４５６＋０．０１４ｇ、それぞれ、寛容化および非寛容化脾細胞のレシピエントにおいて、ｎ＝１０）。
【００８７】
ｂ．脾細胞レシピエントにおけるα１（Ｉ）型コラーゲン遺伝子発現：レシピエント脾細胞ホモジネートに対して経口寛容化されたドナー由来の脾細胞のレシピエント（群Ａ）は、非寛容化コントロールドナー由来の脾細胞のマウスレシピエント（群Ｂ）よりも少ない、肉眼で見える皮膚の肥厚化を維持した。皮膚のα１（Ｉ）型コラーゲンｍＲＮＡ含量を、皮膚の切片とマウスのα１（Ｉ）型コラーゲンプローブとのインサイチュハイブリダイゼーションによって測定した（脾細胞移殖の６２日後）。寛容化ドナー由来の脾細胞を移殖されたマウスは、非寛容ドナー由来の細胞を受容したマウスよりも、非常に少ないα１（Ｉ）型コラーゲン遺伝子発現を示した（図２、パネルＡおよびＢ）。
【００８８】
ｃ．脾細胞ドナーの経口寛容化による慢性対宿主性移植片病（ｃＧＶＨＤ）関連肝疾患の予防：非寛容化ドナー由来の脾細胞の移殖の６２日後に行ったレシピエントの肝臓生検（群Ｂ）は、重篤な門脈炎症および胆管の破壊を示した。対照的に、寛容化ドナー由来の脾細胞のレシピエント（群Ａ）は、４／１０のマウスにおいて正常な肝臓組織学を示した。群Ａの他の６匹のマウスは、軽度〜中程度の門脈炎症、リンパ球浸潤および／または肝臓内胆管の破損を示した。ｃＧＶＨＤにおける肝臓および胆管の関与についての標準的なスコアの等級付けを用いて、コントロール群Ｂにおける２．２５＋０．５と比較して、群Ａレシピエントは、合計スコア０．２＋０．０５を達成した（ｎ＝１０、ｐ＜０．００５）。
【００８９】
ｄ．ドナーの経口寛容化による小腸ｃＧＶＨＤの軽減：非寛容化ドナー由来の脾細胞のレシピエントにおける研究の終了時に行った小腸生検は（群Ｂ）、粘膜損傷、絨毛細胞構築の変形、粘膜細胞数の減少および陰窩過形成、固有層内への単核細胞の浸潤および腺窩炎の証拠を示した（図３Ｂ）。全ての特徴は、寛容化ドナー由来の脾細胞のマウスレシピエントにおいて、有意に寛解していた（群Ａ、図３Ａ）。ｃＧＶＨＤにおける小腸の関与についての標準的なスコアの等級付けを用いて、群Ａおよび群Ｂにおける小腸の関与の合計スコアは、それぞれ０．６＋０．０５対２．４＋０．８（ｎ＝１０、ｐ＜０．００５）であった。
【００９０】
（血清サイトカインレベル）：レシピエント系統のリンパ球への脾細胞ドナーにおいて経口寛容を誘導することにより、サイトカイン分泌パターンに顕著な変化がもたらされた。血清ＴＮＦαレベル、血清ＩＦＮγレベル、および血清ＩＬ２レベルが、寛容化されたドナーから採取された脾細胞を移植されたマウス（群Ａ）中では、寛容化されていないドナー由来の脾細胞を得た群Ｂのコントロールマウスと比較して減少した（ＴＮＦα、ＩＦＮγ、およびＩＬ２について、それぞれ、２．５＋０．８６ｐｇ／ｍｌ対１６．５＋４．８４ｐｇ／ｍｌ；１０．１＋２．６ｐｇ／ｍｌ対７５．３＋１１．３ｐｇ／ｍｌ；および２．１＋０．９ｐｇ／ｍｌ対２２．１＋５．５５ｐｇ／ｍｌ、ｐ＜０．００５、図４）。対照的に、血清ＩＬ−１０レベルが、経口寛容化されたドナー由来の脾細胞を移植されたマウスにおいて、群Ｂ由来の脾細胞のレシピエントと比較して増加した（それぞれ、１０８．５＋７．０９ｐｇ／ｍｌ対４６．５＋４．９ｐｇ／ｍｌ、ｎ＝５、ｐ＜０．００５、図４）。
【００９１】
（まとめ）
レシピエントの同種異系抗原に対するドナーの経口寛容化により、ｃＧＶＨＤの発現と関連する多数の異なるマーカーおよび症状によって示されるように、病理学的病変が改善された。レシピエントの同種異系抗原は同じ遺伝子型を共有するレシピエントとは異なる被験体由来であったが、レシピエントの同種異系抗原（ａｌｌｏｇｅｎ）をレシピエント自身から調製し得たか、または任意の免疫学的に等価な抗原を使用し得たことが理解されるべきである。寛容化が、脾細胞のみのホモジネートを摂食することにより誘導されたが、移植されたリンパ球による、ｃＧＨＶＤの３つの主要な標的器官（すなわち、皮膚、肝臓および小腸）に対する免疫攻撃は予防された。本実施例は、寛容化剤が、その寛容化剤の供給源と同一原であるかまたは同一原でないかのいずれかである細胞および器官に寛容を提供し得ることを示す。
【００９２】
（実施例２ ＧｖＨ疾患に対する経口寛容の移植後誘導）
本実施例は、すでにドナーの免疫細胞を含むレシピエントにおける、経口寛容誘導の実証に関する。レシピエントの抗原または免疫学的等価物の経口投与は、そのレシピエントへ移植されたドナーの免疫細胞における経口寛容化を誘導し得る。本発明のこの局面は、ｃＧＶＨＤを改善するための経口寛容化の使用に関して、安全性の改善および有利な生存能力を提供する。本実施例において示される手段によって、ドナーの安全性は、免疫抑制されることによって必ずしも損われない。さらに、ドナーは、移植の必要性の原因であったレシピエント中のいかなる疾患因子にもさらされない。ドナーは、意図されるレシピエントにまた偶然存在し得る疾患または病原因子にさらされない。本発明の局面は、これにより、このような疾患または病原因子がドナーへ伝染する可能性、および／あるいはこのような疾患または病原因子に対してドナー中で経口寛容を誘導することを回避する。
【００９３】
本実施例は、実施例１に前述されたように実行された。ただし、実施例１の例外として、Ｂ１０．Ｄ２ドナー脾細胞の移植後、レシピエントＢＡＬＢ／ｃマウスにＢＡＬＢ／ｃ脾細胞から抽出されたタンパク質（マウス１匹当たり５０μｇ／日）を１１日間摂食させて経口寛容を誘導した。ドナー免疫細胞における移植後寛容誘導の効果の評価を、前の実施例において記載したように実行した。Ｂ１０．Ｄ２脾細胞を移植された寛容化ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のエフェクター脾細胞の、ＢＡＬＢ／ｃ標的脾細胞（３２ｃｐｍ）に対する混合リンパ球応答において、寛容化されていないコントロール（５４６ｃｐｍ）と比較して有意な減少が存在した。経口寛容化は、ｃＧＶＨＤの肝臓の炎症および胆肝破壊および炎症性腸変化を改善した。寛容化されたレシピエントは、体重および皮下脂肪の減少を示し、そしてはるかにより少ない皮膚の肥厚およびコラーゲン沈着物を有した。コラーゲンα１（Ｉ）遺伝子発現の減少が、コラーゲンα１（Ｉ）プローブを用いたインサイチュハイブリダイゼーションにより示された。血清ＩＬ−１０レベルは、コントロールにおけるよりも寛容化されたマウスにおいて有意に高かったが、レベルは有意に減少した。
【００９４】
（実施例３ 相互寛容化）
本発明のさらなる局面は、相互寛容化を実行し得ることである。本局面において、ドナー免疫細胞をレシピエント細胞およびレシピエント器官により提示される抗原に対して寛容化することによるｃＧＶＨＤの排除に加えて、ドナー細胞またはドナー器官の存在に対するレシピエント免疫系の反応を下方調節する経口寛容の誘導が存在し得る。本発明において開示されるように、このことを、移植手順の間または前のいずれかに実行し得る。また、本発明において記載されるように、寛容化剤は、ドナー、レシピエント、ドナー細胞を有するレシピエント、前述のもののいずれかの免疫学的等価物、およびそれらの組合せに由来し得る。このことは、切除の必要性を排除するため、切除の量を減少させるため、または切断処置を誤って回避したレシピエント免疫細胞において引き起こされる、ドナー細胞に対する免疫反応を排除するために、役立ち得る。
【００９５】
（実施例４ 実験的結腸炎に対する経口寛容化の誘導効果）
本実施例は、経口寛容化を、結腸炎が誘導されると同時に使用し得るというさらなる実証である。本実施例はまた、正常なドナーならびに結腸炎のドナー由来の結腸抽出タンパク質を使用して経口寛容化を誘導し得るという実証としても役立つ。本実施例はまた、１つの種由来の結腸抽出タンパク質を使用して別の種において経口寛容を誘導し、そして結腸炎を緩和し得るという実証でもある。代替アレルゲンで経口寛容化の誘導することによって実験的結腸炎を緩和する能力は、ヒトの治療において有用である実行可能な方法論を生み出す。例えば、寛容供給源として罹患した組織を使用する必要性は、疾患誘導物質ならびに寛容化因子の転移の可能性を増加し得る。本発明における開示（寛容化タンパク質は必ずしも疾患を示すドナー由来である必要はない）により、この問題および他の潜在的問題が回避される。ヒトにおいて、寛容化剤として使用される物質の供給源として使用される種の性質もまた、倫理上の問題および道徳上の問題を持ち出すことになる。寛容化剤の供給源として異なる種を使用し得ることにより、ドナーが異種であり、それによりこのような問題を回避することが可能になる。同種異系由来の寛容化剤もまた、その薬剤中に存在する病原体または病原体のエピトープが存在し得、経口寛容化剤の投与もまたこの病原体の存在に対する寛容を導くという、内在的危険を有する。このことは、この寛容化剤中に生存可能な病原体が存在する場合、またはレシピエント中に生存可能な病原体が存在する場合に、寛容化時に疾患状態を誘発し得る。寛容化誘導時に生存可能な病原体が存在しない場合に、なお以下のような可能性が存在する。それは、病原体に対する誤った寛容化が、レシピエントが後の時点で病原体にさらされる場合に、疾患過程の誘導を可能にし得ることである。異種供給源または免疫学的に等価な供給源のいずれかを寛容化剤として使用し得ることにより、この事象の可能性を減少させるかまたは排除するかのいずれかが可能である。これらの考察が本発明の他の局面に対して同等に適用可能であることも理解される。
【００９６】
（材料および方法）
（動物）：正常な近交系ＢＡＬＢ／ｃ雄性マウス（２〜４ヶ月）をＨａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手し、そしてＨａｄａｓｓａｈ−Ｈｅｂｒｅｗ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ ＳｃｈｏｏｌのＡｎｉｍａｌ Ｃｏｒｅにて養った。マウスを、標準的実験室食で養い、そして１２時間の明／暗サイクル中に保った。全ての動物実験を、Ｈｅｂｒｅｗ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ−Ｈａｄａｓｓａｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの実験動物の保護および使用に関する指針に従って、同委員会の承認を得て実行した。
【００９７】
（結腸炎の誘導）：ＴＮＢＳ結腸炎を、Ｎｅｕｒａｔｈら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９５；１８２：１２８１〜１２９０に記載のように、１００μｌの５０％エタノール中に溶解した２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）（１ｍｇ／マウス）の直腸滴注によって誘導した。
【００９８】
（経口抗原およびバイスタンダー抗原の調製および投与）
結腸を、正常なマウス、ラット、ウサギおよびヒト検体から、またはマウス、ラット、ウサギおよびヒト検体のＴＮＢＳ誘導性結腸炎の結腸から取り出して小さな細片とし、そして機械によりホモジナイズした。４０μｍのナイロン細胞濾過器を通して濾過した後、インタクトな細胞をスピンダウンして除去した。タンパク質を、タンパク質アッセイキット（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して定量した。正常結腸抽出タンパク質（ＮＣＥＰ）および結腸炎抽出タンパク質（ＣＥＰ）を、下記の実験群に、無外傷性給餌針を使用して１日おきに１０日間（計６用量）経口投与した。ヒト結腸検体の調製のために、結腸サンプルを以前に記載されたように（Ｎｅｕｒａｔｈら、１９９５；前出）ＴＮＢＳにインビトロで曝露した。
【００９９】
（実験群）：９群のマウス（各々１０匹の動物からなる）を以下の表１に示すように研究した。
【０１００】
【表１】
全てのマウスを、研究１日目にＴＮＢＳで直腸にチャレンジした。全ての群のマウスに、結腸炎誘導日に開始して１０日間、１日おきに給餌（５０μｇ／マウス）した。群Ａ〜Ｄは、結腸炎抽出タンパク質（ＣＥＰ）を給餌されたマウスを含んだ。群Ａのマウスには、マウス由来ＣＥＰを給餌した；群Ｂのマウスには、ラットＣＥＰを給餌した；群Ｃのマウスには、ウサギＣＥＰを給餌した；そして群Ｄのマウスには、ヒトＣＥＰを給餌した。群Ｅ〜Ｈのマウスには、正常結腸抽出タンパク質（ＮＣＥＰ）を給餌した；群Ｅのマウスには、マウス由来ＮＣＥＰを給餌した；群Ｆのマウスには、ラットＮＣＥＰを給餌した；群Ｇのマウスには、ウサギＮＣＥＰを給餌した；そして群Ｈのマウスには、ヒトＮＣＥＰを給餌した。群Ｉのコントロールマウスには、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を給餌した。全ての群のマウスを、結腸炎誘導後１２日で屠殺した。
【０１０１】
（実験的結腸炎モデルにおける寛容誘導に対する代替抗原の効果の評価）：寛容誘導における代替抗原の役割を、結腸炎についての以下のパラメーターをモニタリングすることにより評価した：
（ａ）結腸炎の臨床的評価：この研究を通じて、毎日下痢を追跡した。
（ｂ）結腸炎の肉眼検査スコア：結腸炎の評価を、結腸炎誘導後１２日に標準的パラメーターを使用して１２日間行った（Ｎｅｕｒａｔｈら、１９９５前出）。４つの肉眼検査パラメーターを決定した。すなわち、結腸の潰瘍形成の程度；腸管および腹膜の癒着；壁の肥厚；および粘膜の水腫の程度。各パラメーターを、０（完全に正常）〜４（最も重篤）の尺度に、２人の老練で実験条件を知らない試験者により等級付けした。
（ｃ）組織学的病変の等級付け：炎症の組織学評価のために、遠位の結腸組織（最後の１０ｃｍ）を取り出し、そして１０％ホルムアルデヒドに固定した。次に、各マウス由来の５つのパラフィン切片を標準的技術を使用してヘマトキシリンーエオシンで染色した。結腸の顕微鏡検査用切片上の炎症の程度を０〜４（Ｎｅｕｒａｔｈら、１９９５、前出）に半定量的に等級付けした。等級０：炎症の徴候がなく正常；等級１：非常に低いレベルの白血球浸潤；等級２：低いレベルの白血球浸潤；および等級３：高い血管密度かつ腸壁肥厚を伴う高レベルの浸潤；等級４：杯細胞の損失、高い血管密度、壁肥厚、および正常な腸構造の破壊を伴う経壁浸潤。この等級付けは、２人の老練で実験条件を知らない病理学者が行った。
【０１０２】
（免疫寛容の誘導に関連する可能な指標の評価）：血清ＩＬ４レベルおよび血清ＩＦＮγレベルを、Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓキット（Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）を製造者の指示に従って使用して、「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡにより測定した。全ての実験群およびコントロール群由来の全てのマウスの血清レベルを、結腸炎誘導の１０日後に測定した。
【０１０３】
（ＮＫ１．１肝臓関連リンパ球に対する寛容誘導の効果の評価）
（ａ）肝臓リンパ球の単離：下大静脈を横隔膜の上で切断し、そして肝臓を、青白くなるまで５ｍｌの冷たいＰＢＳでフラッシュした。結合組織および胆嚢を除去し、そして肝臓を冷たい滅菌ＰＢＳ中の１０ｍｌディッシュに配置した。肝臓をステンレスのメッシュ（サイズ６０、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を通して破砕した。細胞懸濁液を５０ｍｌチューブ中に３分間入れ、そして冷たいＰＢＳで２回洗浄し（１２５０ｒｐｍで１０分間）、そして破片を除去した。そして細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、その懸濁液をＰＢＳに浸しておいたナイロンメッシュに通した。結合しなかった細胞を回収した。細胞を４５ｍｌのＰＢＳで２回洗浄した（室温で１２５０ｒｐｍ）。肝臓リンパ球の単離のために、２０ｍｌのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ １０７７（Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を細胞の下にゆっくり注ぎ、そして５０ｍｌチューブ中で７ｍｌのＰＢＳに懸濁した。このチューブを室温で遠心分離（１６４０ｒｐｍ、１５分間）した。界面の細胞を収集し、５０ｍｌチューブ中で希釈し、そして氷冷ＰＢＳで２回洗浄した（１２５０ｒｐｍで１０分間）。約１×１０6細胞／マウス肝臓を回収した。トリパンブルー染色による生存能力は、９５％より高かった。
（ｂ）ＮＫ１．１細胞除去の決定のためのフローサイトメトリー分析：リンパ球単離直後に、２連の２〜５×１０4細胞／５００μｌ ＰＢＳを、４ｍｌの１％ ＢＳＡとともに１０分間インキュベートされたＦａｌｃｏｎ ２０５２チューブに入れ、そして１４００ｒｐｍで５分間遠心した。細胞を１：２０のＦＩＴＣ−抗マウスＮＫ１．１抗体（ＮＫＲ−Ｐ１Ｃ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ＵＳＡ）を含む１０μｌのＦＣＳ中に再懸濁し、３０分間のうち１０分ごとに混合した。細胞を１％ＢＳＡで２回洗浄し、０．５ｍｌの１％パラホルムアルデヒドを添加し、そして読み取りまで４℃に保った。コントロール群については、１％ＢＳＡを５μｌだけ添加した。分析的細胞ソーティングを、各群由来の１×１０4の細胞に対して、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳＴＡＲ ｐｌｕｓ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて実行した。生細胞のみを計数し、そして抗体処理していないリンパ球からのバックグラウンド蛍光を、得られたレベルから減じた。
（ｃ）肝臓リンパ球細胞傷害アッセイ：これらの研究で使用された標的細胞はＹＡＣ−１細胞であった。これは、補充された、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩを使用して組織培養中で連続増殖するように適合化されたリンパ腫細胞株である。ＹＡＣ−１細胞を、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩが存在する２５ｍｌフラスコ中に密度２×１０5細胞／ｍｌで播種し、そして２４時間後に収集することによって、ＮＫアッセイ用に調製した。細胞を５０ｍｌチューブ中で懸濁および収集し、そして培地で２回洗浄（１２５０ｒｐｍで１０分間）した。この手順により、51Ｃｒでの効率的な標識およびＮＫ細胞による溶解の高感受性を確実にした。標的細胞を51Ｃｒ（Ｎｅｗ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｏｓｔｏｎ ＭＡ、Ｇａｍｉｄｏｒ、Ｉｓｒａｅｌ）で標識し、そして３７℃で９０分間インキュベートした（３００μｌのＲＰＭＩ培地中２００ｍＣｉ／２×１０6細胞）。細胞を１０分ごとに手動で混合した。インキュベーション後、３ｍｌの２０％ＦＣＳ ＲＰＭＩを添加し、そして３７℃で３０分間再びインキュベートした。細胞を１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩで３回洗浄し、そして計数した。標識効率の程度を決定するため、１００μｌの細胞を計数し、そして最低で０．８ｃｐｍ／細胞を測定した。エフェクター細胞は、上記の群Ａ〜Ｈ由来の肝臓から単離された肝臓リンパ球であった。51Ｃｒ放出アッセイを、Ｃｏｓｔｅｒ ９６ウェルプレートにて実行した。段階的に数を変化させたエフェクター細胞（１００μｌ中）を、５０００の標識された標的細胞（１００μｌ中）と、エフェクター対標的比（Ｅ：Ｔ比）が２５：１で混合した。各ウェルは、総容量２００μｌ中に標的細胞およびエフェクター細胞を含んだ。各サンプル由来の５つのウェルを、各比について試験した。自然発生的放出を決定するために、同様の標的細胞数である６つのウェルを、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩとともにプレーティングした。最大の放出を決定するために、１００μｌ培地中の６ウェルの標的細胞を１００μｌのＴｒｉｔｏｎＸと混合した。このプレートを２分間遠心分離（５００ｒｐｍ）し、次いで、３７℃の５％ＣＯ2中で４時間インキュベートした。次いで、このプレートを再び２分間遠心分離し（５００ｒｐｍ）、そして上清を採取し、そしてγカウンターを使用して計測した。結果を、標的細胞の特異的溶解パーセントとして表した。これは、以下の等式を使用して算出した：細胞傷害パーセント＝（アッセイの平均ｃｐｍ−自然発生的放出由来のｃｐｍ）／（ＴｒｉｔｏｎＸで溶解された標的由来のｃｐｍ−自然発生的放出由来のｃｐｍ）×１００。
【０１０４】
（結果）
（結腸炎の臨床的評価）：下痢の顕著な減少が、マウスＣＥＰを給餌された群Ａの寛容化されたマウスで観察された。同様の有益な効果が、群Ｅのマウス由来ＮＣＥＰで処置されたマウスで観察された。対照的に、ウサギＣＥＰまたはラット結腸由来のＮＣＥＰ、ウサギ結腸由来のＮＣＥＰ、もしくはヒト結腸由来のＮＣＥＰを給餌された、それぞれ群Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈのマウス、ならびにＢＳＡを給餌されたコントロール群Ｉのマウスは、重篤な下痢に罹患した。マウスの体重の追跡調査により、群Ｉのコントロールマウスと比較して群Ａの寛容化されたマウスのうちで、統計的に有意な体重の増加が示された（それぞれ、１１．７％対５．９％、Ｐ＜０．００５、図５）。同様な有益な効果が、マウス由来ＮＣＥＰで処置された群Ｅのマウスで観察され、そしてそれらの体重は１０．６％増加した（ｐ＜０．００５）。有利な効果はまた、ラットＣＥＰおよびヒトＣＥＰを給餌されたマウスでも観察された（群ＢおよびＤについての体重の増加は、それぞれ、８．５％および８．９％）。対照的に、ウサギＣＥＰまたはラットＮＣＥＰ、ウサギＮＣＥＰ、もしくはヒトＮＣＥＰで処置された群Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈのマウスでは、全く有意な体重の増加は見られず、そしてそれらの体重は、それぞれ、５．３％、６．１％、６．０５％、および６．９％増加していた（図５）。
【０１０５】
（結腸炎の肉眼検査による等級付け）：マウス抽出の結腸炎由来タンパク質の摂食による経口寛容の誘導（群Ａ）、またはマウスの正常結腸抽出タンパク質による経口寛容の誘導（群Ｅ）は、顕著に結腸炎の肉眼検査による等級付けを軽減した。試験された結腸炎の肉眼検査用パラメーターのスコアは以下であった：結腸の潰瘍形成の程度、腸管および腹膜の癒着、壁肥厚、および粘膜の水腫の程度。肉眼検査の総スコアは、非処置のコントロール群Ｉの３．３と比べて、群ＡおよびＥのマウスで、それぞれ０．４および０．５６であった（ｐ＜０．００５、図６）。有利な効果はまた、ラット由来ＣＥＰおよびヒト由来ＣＥＰを給餌されたマウス（群ＢおよびＤ）でも観察された。それらの肉眼検査の総スコアは、それぞれ、０．８および０．７と測定された。対照的に、ウサギＣＥＰ、またはラット由来ＮＣＥＰ、ウサギ由来ＮＣＥＰ、もしくはヒト由来ＮＣＥＰを給餌された、非寛容化マウス（それぞれ、群Ｃ、Ｆ、Ｇ、およびＨ）は、重篤な結腸炎に罹患し、そしてそれらの肉眼検査の総スコアは、それぞれ、１．９、２．７５、１．８５、３．２５であった。非処置のコントロールマウスの総スコアは、３．３であった（群Ｉ、図６）。
【０１０６】
（組織学的病変の等級付け）：腸組織の組織学的評価により、非寛容化マウス（群Ｃ、Ｆ、Ｇ、およびＨ）と比較して、そしてコントロールマウス（群Ｉ）と比較して、寛容化マウス（群ＡおよびＥ）における炎症応答および粘膜の潰瘍形成の顕著な減少が示された。群ＡおよびＥのマウスにおいて、ほとんど正常な切片、すなわち最小のリンパ球浸潤のみが検出された（図７、パネルＡおよびＥ）。対照的に、重篤な炎症反応（３〜４等級）が、非寛容化マウスから採取された腸検体で観察された（図７、パネルＦ）。部分的効果が、ラット由来ＣＥＰを給餌されたマウス（群Ｂ）およびヒト由来ＣＥＰを給餌されたマウス（群Ｄ）で観察された（図７、パネルＢ）。寛容化マウス（群ＡおよびＥ）における標準的病理学的試験の結果により、スコア０．４および０．８が得られた。対して、非寛容化マウス（群Ｃ、Ｆ、Ｇ、およびＨ）については、それぞれ２．２、３．２５、２．２５、および２．７５であった（図８）。群Ｉのコントロールの非処置マウスは、肉眼検査により重篤な結腸炎を示し、病理学的スコアは３．１であった（示さず）。
【０１０７】
（血清ＩＬ４レベルおよび血清ＩＦＮγレベル）：寛容化マウスは、Ｔｈ１からＴｈ２への免疫応答サイトカイン分泌のシフトを示した。マウス由来ＣＥＰの摂食により、結腸炎誘導の１０日後に、ＩＬ４レベルの増加およびＩＦＮγ血清レベルの減少が誘導され、それぞれ、２２．４±５ｐｇ／ｍｌおよび１．２±０．７ｐｇ／ｍｌになった（コントロール群Ｉと比較した群Ａ、ｐ＜０．００５）。同様に、マウス由来ＮＣＥＰの摂食により、Ｔｈ１からＴｈ２への免疫シフトが誘導され、ＩＬ４血清レベルおよびＩＦＮγ血清レベルは、それぞれ２５．４±５．７および３．５±０．９であった（群Ｅ、ｐ＜０．００５、図９）。対照的に、非寛容化群Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈおよびコントロール群Ｉ由来のマウスは、高いＩＦＮγ血清レベルおよび低いＩＬ４血清レベルを示した（それぞれ、１７．４±３．７および３．１±０．９；２２．１±４および４．３±１．１；１８．４±３．８および２．１±０．８；１６．３±２．９および２．７±０．７；１９．５±４．２および１．９±０．４、図９）。
【０１０８】
（寛容誘導によりＮＫ１．１＋ＬＡＬ細胞傷害機能が増強された）：肝臓内リンパ球を、全ての群の処置マウスおよびコントロールマウスから単離した。分析的セルソーティングを、リンパ球単離後の各群由来の細胞に対して、ＦＩＴＣ−抗マウスＮＫ１．１抗体を使用して行った。マウス由来ＣＥＰの摂食およびマウス由来ＮＣＥＰの摂食による寛容の誘導によって、ＮＫ１．１＋ＬＡＬ細胞傷害機能が顕著に増強された（特異的溶解アッセイにより測定）。ＹＡＣ−１細胞を、これらの研究で標的細胞として、Ｅ：Ｔ比が２５：１で使用した。群ＡおよびＥの寛容化マウスから単離された肝臓リンパ球は、群Ｉの非寛容化コントロールマウスと比較して細胞傷害性の増加を示した（群ＡおよびＥ対群Ｉが、それぞれ３５．６％および４８．６％対１０．７％、ｐ＜０．００５、図１０）。同様の効果が、群ＢおよびＤ由来のマウスで観察され、ここで、細胞傷害率が、それぞれ２９．１％および２６．９％と測定された。対照的に、群Ｃ、Ｆ、Ｇ、およびＨ由来の非寛容化マウスは、有意により低いＮＫ１．１＋ＬＡＬ細胞傷害率を示した（それぞれ、１７．６％、１８．８％、２２．１％、および１１．９％、図１０）。直腸へのＴＮＢＳ滴注は、細胞傷害アッセイに対して何の効果を有さなかった（群Ｉ、１０．７％）。
【０１０９】
（実施例５：経口寛容の大腸炎後の誘導）
経口寛容化が、大腸炎が被験体において確立された後でさえも、大腸炎の症状を制御するために使用され得ることをさらに実証した。本実施例を、以下を除いて、先の実施例に記載された同じ手順を使用して行った。
【０１１０】
実験群：各々１０の動物からなる、マウスの６つの群を研究した（表１）。全てのマウスを、本研究の第１日目に直腸のＴＮＢＳでチャレンジした。Ａ、Ｂ、およびＥ群のマウスに、大腸炎を誘導した日から始めの１０日間、隔日で給餌させた。確立された実験的大腸炎に対する寛容誘導の効果の評価のために、Ｃ、Ｄ、およびＦ群のマウスに対する、類似の用量での給餌を、大腸炎の誘導後７日目に開始した。ＡおよびＣ群のマウスに、大腸炎抽出タンパク質（ＣＥＰ）を給餌した。寛容誘導に対する代理の抗原の効果を評価するために、ＢおよびＤ群のマウスに、正常結腸抽出タンパク質（ＮＣＥＰ）を給餌した。コントロールのＥおよびＦ群のマウスに、類似の用量のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を給餌した。全ての群のマウスを、大腸炎誘導後２１日目に屠殺した。
【０１１１】
経口寛容誘導の効果の評価を、先の実施例に記載のように行った。
【０１１２】
（結果）
大腸炎の臨床評価：マウスＣＥＰを給餌させたＡ群由来の寛容化マウスにおいて、顕著な下痢の減少が観察された。同様の有利な効果が、Ｂ群のマウス由来ＮＣＥＰで処置したマウス（それらは、１日目に給餌を開始した）において観察された。部分的に有利な効果が、寛容を確立された大腸炎の存在下で誘導したマウス（ＣおよびＤ群）において観察された。対照的に、ＢＳＡを給餌させたコントロールのＥおよびＦ群のマウスは、重篤な下痢を罹患した。マウス体重の経過観察により、Ｅ群のコントロールマウスと比較して、Ａ群の寛容化マウスの間で、体重の統計的に有意な増加が明らかになった（それぞれ、４．２％ 対 １１．７％、ｐ＜０．００５）。同様の有利な効果が、マウス由来ＮＣＥＰで処置したＢ群由来のマウスにおいて観察され、そしてそれらの体重は、８．９％増加した（ｐ＜０．００５）。有利な効果はまた、大腸炎の誘導後７日目に、ＣＥＰおよびＮＣＥＰでの給餌を開始させたマウスにおいても観察された（ＣおよびＤ群についての体重において、それぞれ９．３％および７．２％の増加）。対照的に、ＢＳＡで処置したマウスにおいては、体重の有意な増加が示されなかった。それらの体重は、ＥおよびＦ群のマウスについて、それぞれ４．２％および４．１％増加した。
【０１１３】
大腸炎の肉眼的分類：マウスから抽出された大腸炎由来タンパク質の給餌による経口寛容の誘導（Ａ群）、またはマウス正常結腸から抽出されたタンパク質での経口寛容の誘導（Ｂ群）は、大腸炎の肉眼的分類を顕著に緩和した。試験した大腸炎の肉眼的パラメーターについてのスコアは：結腸の潰瘍化の程度、腸と腹膜の癒着、壁の厚さ、および粘膜水腫の程度であった。全肉眼的スコアは、ＡおよびＢ群のマウスでそれぞれ、０．４および０．７を測定したのに対して、ＥおよびＦ群の非処置のコントロールにおいては、３．３および３．１であった（ｐ＜０．００５）。有利な効果はまた、大腸炎の誘導後７日目に、ＣＥＰでの給餌を開始したマウス（Ｃ群）においても観察された。それらの全肉眼的スコアは、１．２を測定した。部分的に有利な効果は、大腸炎の誘導後７日目に、ＮＣＥＰでの給餌を開始したマウスにおいて示され、そしてそれらのスコアは１．９であった。
【０１１４】
組織学的病変の分類：腸組織の組織学的評価により、ＥおよびＦ群の非寛容化コントロールマウスと比較して、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ群の寛容化マウスにおける炎症性応答および粘膜潰瘍化の顕著な減少が示された。ＡおよびＢ群のマウスにおいて、ほとんど正常な切片が検出されるか、またはごくわずかなリンパ球の浸潤が検出されるだけであった。対照的に、重篤な炎症性反応（グレード３〜４）が、非寛容化コントロールマウスから採取された腸の試料において観察された。部分的な効果が、大腸炎の誘導後７日目に、ＣＥＰまたはＮＣＥＰでの給餌を開始した、ＣおよびＤ群のマウスにおいて観察された。Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ群由来の寛容化マウスにおける標準的な病理学的試験の結果は、それぞれ、０．４、１．２、１．４および１．９５のスコアを示した。ＥおよびＦ群におけるコントロールの非処置マウスは、重篤な肉眼的な大腸炎を示し、病理学的スコアはそれぞれ、３．１および３．２５であった。
【０１１５】
血清ＩＬ４、およびＩＦＮγレベル：寛容化マウスは、Ｔｈ１からＴｈ２免疫応答サイトカイン分泌への変化を示した。マウス由来ＣＥＰの給餌は、大腸炎誘導後１０日で、ＩＬ４レベルの増加およびＩＦＮγの血清レベルの減少を誘導した（それぞれ、２２．４±５ｐｇ／ｍｌへおよび１．２±０．７ｐｇ／ｍｌへ）（Ａ群、コントロールのＥ群と比較して、ｐ＜０．００５）。同様に、マウス由来ＮＣＥＰの給餌は、Ｔｈ１からＴｈ２への免疫変化を誘導し、ＩＬ４およびＩＦＮγの血清レベルは、それぞれ、１８．４±１．９および２．４±０．９であった（Ｂ群、ｐ＜０．００５）。ＣＥＰまたはＮＣＥＰを給餌した、既存の疾患の存在下で寛容化された初回刺激を受けたマウスは、同様のサイトカイン系列を示し、そしてそれらのＩＬ４レベルは、１６．４±２．９および１０．３±１．１に増加したが、ＩＦＮγ血清レベルは、６．３±０．９および７．３±１．１を測定した（それぞれ、ＣおよびＤ群）、対照的に、非寛容化コントロールのＥおよびＦ群由来のマウスは、高いＩＦＮγおよび低いＩＬ４の血清レベルを示した（それぞれ、１８．４±２．７および１．９±０．３；ならびに２２．１±１および２．１±０．５）
（実施例６ マウスにおけるＨＢＶ抗原に対する経口寛容化の誘導）
本発明の局面の１つは、病原体による感染に関連する二次的発症の誘導を抑止するための、ＳＩＤＲおよび／またはＧＩＳの適用である。これらの発症は、病原体の複製プロセスに直接的に関係しないという点で、その感染に対して二次的であると定義される。このような二次的発症の例示的な例は、細胞傷害性、誘導性自己免疫およびアポトーシスのような病理学的プロセスである。二次的発症がすでに存在している被験体において、本発明は、疾患症状のさらなる進行の防止または低減を導く。
【０１１６】
本発明の１つの局面において、ＳＩＤＲまたはＧＩＤＳ、あるいはそれらの任意の組み合わせを、病原体による感染の結果である所望しない免疫応答を軽減するために被験体に使用する。本開示は、本発明がＨＢＶ感染に関連する肝臓の損傷の予防および／または処置のための治療的アプローチとして有する、有用性を記載する。他の病原体の例としては、ＨＣＶ、ＣＭＶ、レトロウイルス（例えば、ＨＩＶ）および細菌（例えば、Ｓｔｒｅｐｏｔｏｍｙｃｅｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、およびＣｈｌａｍｙｄｉａ）が挙げられる。これらの病原体による感染は、自己免疫機能障害に由来し得る疾患に関与する。これらの疾患としては、肝炎、ＡＩＤＳ、アテローム性動脈硬化症、アテローム、血栓症、冠状動脈疾患および心筋梗塞が挙げられ得る（Ｍａｈｔａら、Ｊ．Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ １９９８；３１：１２１７−１２２５、ＧｕｒｆｉｎｋａｌおよびＢｏｚｏｖｉｃｈ、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １９９８；１４０ Ｓｕｐｐｌ １：５３１−３５、Ｏｓｓｅｌ−Ｇｅｒｎｉｎｇら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ １９９７；３５：１２０−１２４、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ １９９８；３２：３５−４１、Ｂｉａｓｕｃｃｌら、１９９９；９９：８５５−８６０）。
【０１１７】
以下の実施例は、ＨＢＶ抗原に対する免疫寛容を誘導することが可能であること、および経口寛容が、ＨＢＶ抗原に対する既存の免疫応答のダウンレギュレーションに使用され得ることの実証である。
【０１１８】
（材料および方法）
動物：正常な同系の、雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（２５〜３０グラム）を、Ｈａｄａｓｓａｈ−Ｈｅｂｒａｗ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ ＳｃｈｏｏｌのＡｎｉｍａｌ Ｃｏｒｅから得た。マウスを標準的な実験用固形飼料上で維持し、１２時間の明／暗のサイクルで飼育した。全ての動物実験は、Ｈｅｂｒａｗ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ−Ｈａｄａｓｓａｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｅｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓのガイドラインに従って、委員会の承諾を得て行った。
【０１１９】
抗ＨＢＶ免疫応答の誘導：ＢｉｏＨｅｐＢ組換えＢ型肝炎ワクチン（ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｅｎｅｒａｌ ＬＴＤ、Ｉｓｒａｅｌ）（Ｂ型肝炎ウイルスの３つの表面抗原：ＨＢｓＡｇ、ＰｒｅＳ１、およびｐｒｅＳ２を含む）を、抗ＨＢＶ免疫応答の誘導のために使用した（Ｓｈｏｕｖａｌら、Ｖａｃｃｉｎｅ １９９４；１２：１４５３−１４５９）。このワクチンは、他のワクチンに比べて免疫原性を改善することが以前に示されており、そして高いセロコンバージョンレベルおよび高い抗体力価（同書）を誘導することから、このワクチンを選択した。本発明者らは、効果的な抗ウイルス免疫応答の誘導のために必要とされる、最適なワクチン用量を試験した。それぞれ１０匹の動物からなるマウスの３つの群を研究した。それぞれの群のマウスに、３つの用量のＢｉｏＨｓｐＢワクチン：０．２、０．４、または０．８ｍｃｇのうちの１つを、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。ワクチン接種後３０日に、血清抗ＨＢｓ抗体の力価についてマウスを追跡した。
【０１２０】
ＨＢＶ抗原に対する経口寛容の誘導：組換え調製したＨＢｓＡｇ、およびＰｒｅＳ１、およびＰｒｅＳ２抗原（ＢｉｏＨｅｐＢ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｅｎｅｒａｌ ＬＴＤ、Ｉｓｒａｅｌ）を、本発明の末梢免疫寛容の誘導のための標的抗原として使用した。末梢寛容を、１ｍｃｇ／給餌の低用量のＨＢＶ抗原（ＢｉｏＨｅｐＢ）を、給餌用の非外傷性の針を使用して、１０日間の隔日での経口投与（計５用量）により誘導した。コントロールの群に、同用量のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を給餌させた。
【０１２１】
実験群：それぞれ１０匹の動物からなるマウスの８つの群を、以下の表２に示されるように研究した。
【０１２２】
【表２】
実験群Ａ〜ＧをＢｉｏＨｅｐＢワクチン（０．０４ｍｃｇ）を用いて、１ヶ月間隔で２回腹腔内（ｉ．ｐ．）接種した。コントロールＡ群のマウスを１日目および３０日目に経口給餌を伴わないでワクチン接種した。そして３０日目および６０日目の各注射の３０日後に、血清抗ＨＢｓ抗体力価について追跡した。天然の動物における体液性抗ＨＢＶ免疫応答に対する経口寛容誘導の効果を決定するために、Ｂ群およびＣ群のマウスを、それぞれ、ＨＢＶエンベロープタンパク質（ＢｉｏＨｅｐＢ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を給餌した。次いで、１０日目および４０日目にＢｉｏＨｅｐＢワクチンを用いて２回の腹腔内接種を行った。各免疫後３０日、すなわち４０日目および７０日目で、マウスを抗血清ＨＢ力価について追跡した。既存の抗ＨＢＶ免疫応答に対する経口寛容誘導の効果を決定するために、Ｄ群およびＥ群のマウスをＢｉｏＨｅｐＢワクチンを用いて腹腔内接種し、次いで、ワクチン接種日から実験Ｄ群のマウスにＨＢＶエンベロープタンパク質（ＢｉｏＨｅｐＢ）を経口投与するか、またはコントロールＥ群にＢＳＡを経口投与した。両群のマウスを３０日目にＢｉｏＨｅｐＢワクチンを用いて再度免疫し、そして２回目の注射の３０日後、６０日目に、抗ＨＢｓ抗体力価を測定した。経口寛容誘導の抗ＨＢＶ免疫に対する効果のさらなる決定のために、Ｆ群およびＧ群のマウスを、１日目および３０日目にＢｉｏＨｅｐＢワクチンを用いて２回の腹腔内接種を行い、次いで、実験Ｅ群のマウスにＨＢＶエンベロープタンパク質（ＢｉｏＨｅｐＢ）を経口投与するか、またはコントロールＧ群にＢＳＡを経口投与した。マウスを３０日目の経口寛容誘導の前に抗ＨＢ力価について追跡し、次いで、６０日目に寛容誘導を行った。ＨＢＶエンベロープタンパク質（ＢｉｏＨｅｐＢ）経口投与の抗ＨＢｓ力価に対する効果を決定するために、Ｈ群のマウスは、ワクチン接種を伴わないで５経口用量のＨＢＶ抗原を受けた。マウスを抗ＨＢ血清レベルの発現について３０日後に追跡した。
【０１２３】
抗ＨＢｓ体液性免疫応答の評価：ＨＢｓＡｇに対する抗体を、市販の固相ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ，Ａｕａａｂ，Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｏｒｔｈ Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）により検出した。世界保健機関の参考血清をＲＩＡによる抗ＨＢｓの定量的なアッセイのために使用した。これは、ホリンガー公式を利用し、そしてｍＩＵ／ｍｌ／ｍｌで表される。全ての実験群およびコントロール群のマウスを、本研究を通して、ＢｉｏＨｅｐＢワクチンの各接種の３０日後に抗ＨＢｓ抗体力価について追跡した。
【０１２４】
統計学的分析：標準的なスチューデントｔ検定を使用して分析した。
【０１２５】
（結果）
抗ＨＢＶ免疫応答の誘導：３つの群のマウスを、異なる３用量のＢｉｏＨｅｐＢワクチンを用いた接種後に抗ＨＢｓ抗体力価について追跡した。０．４ｍｃｇ用量および０．８ｍｃｇ用量と比較した場合０．２ｍｃｇ用量との間で有意な差違が観察された。０．２ｍｃｇを用いたワクチン接種は、それぞれ０．４および０．８ｍｃｇを用いた接種後の５７．０５±３５．８５および７８．２０±８２．３１ｍＩＵ／ｍｌと比較した場合１２．６６±７．２８ｍＩＵ／ｍｌの抗ＨＢ力価を誘導した（０．４および０．８対０．２については、それぞれｐ＜０．０５およびｐ＜０．０３、ならびに０．４ｍｃｇと０．８ｍｃｇとの間の差違についてはＰ＝０．２；図１１）。その結果、本研究において、腹腔内に投与するワクチン接種用量は０．４ｍｃｇを使用した。
【０１２６】
寛容誘導の抗ウイルス体液性免疫応答に対する効果の評価：抗ＨＢＶ末梢免疫寛容の誘導を、ＨＢＶワクチン接種より前に給餌されたマウスにおいて、抗ＨＢｓ Ａｇ抗体産生を月間隔で測定することによって評価した。ＢｉｏＨｅｐＢワクチン接種より前のＨＢＶタンパク質の投与は、抗ウイルス体液性免疫応答を著しく下方制御した。ワクチンの初回接種の３０日後の抗ＨＢｓ抗体血清レベルは、非寛容化非給餌コントロール群（Ａ群）、およびＢＳＡ給餌群（Ｃ群）のコントロールと比較した場合、寛容化ＨＢＶエンベロープタンパク質給餌群（Ｂ群）において、それぞれ、７０９±３９０および７７７±３４８対３８５±１５４ｍＩＵ／ｍｌであった（ｐ＜０．０１３、図１２Ａ）。さらに、ＢｉｏＨｅｐＢワクチンを用いた２回目の接種３０日後の抗ＨＢｓ抗体力価は、寛容化コントロール群対非寛容化コントロール群において、６６４９５±４４００７ｍＩＵ／ｍｌ対９５２５７±７８３２０および１２３８０７±７８１３０ｍＩＵ／ｍｌであった（Ａ群およびＣ群、ｐ＜０．０５、図１２Ｂ）。
【０１２７】
経口寛容誘導の既存の抗ＨＢＶ免疫応答に対する効果の評価：既存の抗ＨＢＶ免疫応答に対するＨＢＶタンパク質側への寛容誘導の効果を、ＢｉｏＨｅｐＢ抗原またはＢＳＡを経口投与された抗ＨＢＶ免疫化マウスにおける抗ＨＢｓ抗体力価を測定することにより評価した。ＨＢＶワクチン接種への曝露直後のＨＢＶ抗原の給餌は、ＢｉｏＨｅｐＢ接種６０日後、抗ＨＢｓ力価を、非寛容化（Ｅ群）コントロールの２１４７７６±１４８８９７ｍＩＵ／ｍｌと比較した場合、寛容化（Ｄ群）において１１４０２４±９４０９７ｍＩＵ／ｍｌまで減少させた（ｐ＝０．１５、図１３）。さらに、ワクチンでの２回の免疫化の３０日後のＨＢＶ抗原の給餌は、抗ＨＢｓ抗体力価を、６０日目（２回目の免疫の３０日後）に測定した場合、寛容化ＨＢＶエンベロープタンパク質給餌対非寛容化ＢＳＡ給餌コントロールにおいて５７３５４±３７８７３対９８１９５±５７２５６ｍＩＵ／ｍｌまで有意に減少した。（それぞれ、Ｆ群およびＧ群、ｐ＜０．０１、図１４）。免疫化を伴わないＨＢＶエンベロープタンパク質の経口投与は、抗ＨＢ抗体力価に対して効果を有さず、そしてこれらの抗ＨＢ血清レベルは検出不可能であった（Ｈ群、未掲載）。
【０１２８】
（まとめ）
この実施例は、エンベロープタンパク質の経口投与が、ＨＢＶエピトープへの寛容を誘導し得ることを実証する。ＨＢＶエンベロープタンパク質のＰｒｅＳ１およびｐｒｅＳ２およびＨＢｓＡｇ組換え複合体の天然の動物への給餌は、ワクチン接種に際し抗ＨＢＶ免疫応答を下方制御した（Ｂ群およびＣ群）。さらに、この実施例は、予め免疫したマウスへのＨＢＶタンパク質の経口投与が、ＨＢＶエンベロープペプチド側への寛容を誘導したことを実証する（実験群ＤおよびＥ）。さらに、寛容誘導は、抗ウイルス体液性二次免疫応答を著しく下方制御した。２回のワクチン接種後の抗ＨＢＶ免疫寛容の誘導は、抗ＨＢＳ抗体産生を効果的に阻害した（実験群ＦおよびＧ）。
【０１２９】
（実施例７ ＴｕｐａｉａのＨＢＶ感染）
本実施例は、小動物モデルとしてＴｕｐａｉａ ｂｅｌａｎｇｅｒｉを使用する。これは、同時係属出願の主題である（Ｂｒｏｗｎら、１９９７年６月１６日出願の米国特許出願番号０８／８７６，６３６）。本実施例は、Ｔｕｐａｉａ ｂｅｌａｎｇｅｒｉにおいて、ＨＢＶによる感染の後に誘導される疾患症状の実証に関する。これを使用して治療的なレジメの有効性を測定し得る。
【０１３０】
（材料および方法）
（被験体）Ｔｕｐａｉａ ｂｅｌａｎｇｅｒｉをＤｕｋａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｖｉｖａｒｉｕｍ，Ｄｕｒｈａｍ ＮＣから入手し、そしてＡｌｂｅｒｔ Ｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ａｎｉｍａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにて飼育した。Ｔｕｐａｉａを７０℃にて１２時間の明期／暗期周期で、ネコのケージまたはリスザルのケージあたり２匹のトガリネズミの１匹または交配ペアで飼育し、そして新鮮な果物（ブドウ、バナナ、りんご、およびオレンジ）の食餌、乾燥したキャットフード、および水を与えた。各ケージはまた小さな巣箱を含んだ。
【０１３１】
（ＴｕｐａｉａのＨＢＶ感染）Ｔｕｐａｉａを、９４：１のケタミン：キシラジン（Ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ，Ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅ，ＩｏｗａからのＫｅｔａｓｅｔ（１００ｍｇ／ｍｌ）およびＢａｙｅｒ，Ｓｈａｗｎｅｅ Ｍｉｓｓｉｏｎ，ＫａｎｓａｓからのＲｏｍｐｕｓ（２０ｍｇ／ｍｌ））を使用して麻酔した。体重１グラムあたり０．００１ｍｌの用量で大腿へ筋内注射により投与した。ＨＢＶ接種物は、１０のＨＢＶ血清陽性（ｓｅｒｐｏｓｉｔｉｖｅ）の臨床試料のプールに由来した。感染のためにＴｕｐａｉａの尾の毛を剃り、消毒し、次いで０．１ｍｌのＨＢＶプールを、２７ゲージの蝶形針を使用して尾静脈に静脈注射した。
【０１３２】
（血清学）尾の裏面の毛を剃り、消毒した後、麻酔したＴｕｐａｉａの尾静脈から、０．５〜１．０ｍｌの血液サンプルを２７ゲージの蝶形針を使用して収集した。Ｔｕｐａｉａからの血液サンプルをＨＢＶ接種前に収集し、そしてその後、毎週収集する。ポリクローナルＨＢｓＡｇ試験を使用する長期感染由来の一連のサンプル（Ａｕｓｔｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を除いて、ＨＢＶの血清学的な全ての試験をＥＮＺＯ Ｃｌｉｎｉｃａｌ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）にて、臨床試料について使用されるものと同じ手順で行った。ＰＢＳ中の血漿の連続希釈物を、Ｔｕｐａｉａ抗体レベルを試験の有益な範囲に対して滴定するために作製した。ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）レベルをＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した市販のキットにより長期間測定する場合、製造業者の指導書を使用する。
【０１３３】
（組織学）肝臓の経皮的なバイオプシーを、全身麻酔下で滅菌技術を使用して行った。腹部の垂直正中線小切開術（ｓｍａｌｌ ｖｅｒｔｉｃａｌ ｍｉｄｌｉｎｅ ｉｎｃｉｓｉｏｎ）を使用して肝臓を曝露し、パースライン縫合（テーパーニードルおよび絹を使用する）で肝臓部分を結紮した後、小さな楔形の肝臓バイオプシーを取り出した。バイオプシー組織を分割した：一部分を中性ホルマリン中に保存し、そして他の部分を−８０°で凍結させた。ホルマリン固定組織をパラフィン包埋し、切片にし、そして組織学的検査のためにヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ染料）、コラーゲンのためにトリクローム染料、またはＴｕｐａｉａコラーゲンを染色するレチクリン染料を用いて染色した。
【０１３４】
（ＨＢＶ ＲＮＡのためのインサイチュＰＣＲ）プライマーおよびプローブ用にＨＢＶ特異的配列を使用したことを除いて、Ｌｉｕら（１９９７；Ｊ．Ｖｉｒ．７１：４０７９）に記載されるプロトコルに従って反応を行った。これらの配列は以下の通りである：
ＨＢＶ Ａ： ５’−ＴＧＣＣＴＧＡＧＴＧＣ（Ｔ／Ａ）ＧＴＡＴＧ−３’
ＨＢＶ Ｂ： ５’−ＴＡＧＧＡＧＧＣＴＧＴＡＧＧＣＡＴ−３’
ＨＢプローブ： ５’−ＴＴＴＡＴＡＡＧＧＧＴＣＧＡＴＧＴＣＣＡＴ−３’
（結果）
（ＴｕｐａｉａのＨＢＶ感染）ＨＢＶ保有者血清を用いて接種されたＴｕｐａｉａのＨＢＶ感染の証拠を以下の表３に示す。
【０１３５】
【表３】
ＨＢＶ感染したＴｕｐａｉａにおいて、ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）は、接種後２時間に検出され始め、２４〜４８時間でピークに達し、そして全ての処置されたＴｕｐａｉａにおいて４〜６日間持続した（表３ａ）。より長い時点からのＨＢｓＡｇの産生は、モノクローナルアッセイに対してネガティブであった。しかし、ポリクローナル抗体キットを代用した場合、ＨｂｓＡｇは、研究の経過時間を通じて検出され続けた（１０ヶ月）。Ｅ−抗原（ＨＢｅＡｇとしてもまた知られる）は、ウイルスコアタンパク質の血清可溶性の改変であり、ヒトにおいて、活性ウイルスの複製についてのマーカーである。ＨＢｅＡｇは、ＨＢＶ接種後に試験された、３匹全てのＴｕｐａｉａからの血液サンプルにおいて検出された（表３ｂ）。ＨＢｅＡｇ分泌の検出は、継続的血液サンプルにおいて９〜２４日に延長した。コントロールの未処置Ｔｕｐａｉａにおいて、ＨＢＶウイルス抗原は血液中で検出されなかった。同様に、ＨＢＶ接種ｔｕｐａｉａ由来の前処理の血液サンプルにおいて、ＨＢＶは検出されなかった。このことは、用いられたＴｕｐａｉａが以前にヒトＨＢＶに曝露されていなかったことを示す。この血清学的データより、本発明者らは、ＨＢＶキャリア血清を接種されたＴｕｐａｉａは感染し、そしてそれらはウイルスを複製すると結論づけた。
【０１３６】
ＨＢＶ抗原に対するＴｕｐａｉａの免疫学的応答。ＨＢＶに対する宿主免疫応答は、感染されたヒト肝臓における壊死炎症性反応において重要な構成要素であるため、ＨＢＶ抗原がＴｕｐａｉａにおける免疫応答を起こす能力を試験した。ＨＢＶウイルスタンパク質に対する血漿抗体レベルを、Ｔｕｐａｉａの感染後、ＨＢＶに対する体液性免疫応答を基準として測定した。ＨＢｓＡｇに対する抗体が未処置のＴｕｐａｉａにおいて検出されず、ＨＢＶを接種する前のＴｕｐａｉａから採取した血液サンプルにおいても検出されなかった。下の表４に示すように、抗体の検出を、各被験体について異なる時点で行った。
【０１３７】
【表４】
１匹の動物は、たった４週間後で検出可能なレベルを生じた。第２の被験体は、感染７週間後に検出可能なレベルを生じた。３匹全ての被験体に、２回目のＨＢＶを接種した。試験したとき３匹全ての被験体は、抗体に対してポジティブであり、力価は二次免疫応答後、ＨＢＶが感染した個々のＴｕｐａｉａについて２×１０3〜２×１０5の間で変化した。これらの結果は、ＨＢＶ感染後に、Ｔｕｐａｉａが、このウイルスに対する体液性免疫応答を生じ得ることを示す。抗体産生のタイミングおよび規模における変化は、ヒト患者の間に見られるものと類似している。
【０１３８】
（ＨＢＶが感染したＴｕｐａｉａにおける肝細胞死）ＨＢＶが感染したヒト肝臓組織において、ウイルス感染肝細胞に対する宿主の細胞性免疫応答は、肝細胞の死を引き起こすと考えられる。肝細胞の死の１つのマーカーは、溶解性肝細胞から血漿へのアミノトランスフェラーゼの放出である。血漿中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルは、ウイルス肝炎における肝細胞の死および肝臓の損傷の標準的基準である。Ｔｕｐａｉａ血漿におけるＡＴＬレベルを、ＴｕｐａｉａへのＨＢＶの接種前および後に測定した。正常で、未処置のＴｕｐａｉａＡＬＴレベルは、１３〜４０単位／ｍｌの範囲で、そして平均２５単位／ｍｌであり、正常なヒトＡＬＴレベルに類似していた。しかし、ＨＢＶ接種後では、ＴｕｐａｉａにおけるＡＬＴのレベルは、図１５に示されるように正常なレベルの２〜５倍に上昇した。この上昇は、ヒトにおいて見られるように、肝細胞の死を導くＨＢＶに対する細胞性免疫応答が存在したことを示すと見なされ得る。ＡＬＴの上昇の持続期間は、個々のＴｕｐａｉａ間で変化した（最大１０ヶ月の持続期間）。６ヶ月以上の期間にわたる持続的または周期的なＡＬＴの上昇は、感染および破壊される肝細胞の連続的サイクルが存在するヒトにおける、慢性的な肝炎の特徴である。
【０１３９】
（肝炎およびＨＢＶ複製の組織学的証拠）
感染されたおよび非感染のＴｕｐａｉａ由来の生検の例証的な写真を図１６に示す。
【０１４０】
パネルＡ：ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した未処置の正常なＴｕｐａｉａの肝臓切片（５０×）は、門脈に隣接する単一の胆管、および予備リンパ球とともに、平凡な形態を示す。肝臓の構造は、正常なヒトの肝臓に匹敵する。
【０１４１】
パネルＢ：ＨＢＶ感染２ヶ月後に得た生検由来のＨＢＶ感染Ｔｕｐａｉａの肝臓切片。Ｈ／Ｅ染色は、胆管の増殖を示す（５０×）。示される視野は、この視野および肝臓組織の隣接切片に見られる多くの視野の代表である。
【０１４２】
パネルＣ：ＨＢＶ感染２ヶ月後に得、そしてＨ／Ｅで染色した生検由来のＨＢＶ感染Ｔｕｐａｉａの肝臓切片（２５０×）は、変化した肝細胞形態を示す。いくつかの細胞の大きさを拡大した（バルーンニング（ｂａｌｏｏｎｉｎｇ））。門脈の炎症および門脈の周りに単核細胞が見られる。
【０１４３】
パネルＤ：ＨＢＶ感染Ｔｕｐａｉａ（１０ヶ月後の生検）のＨ／Ｅで染色した肝臓切片（５０×）は、門脈周囲および小葉のリンパ球浸潤を示す。
【０１４４】
パネルＥ：ＨＢＶ感染Ｔｕｐａｉａ（６ヶ月後生検）のトリクロームで染色した肝臓切片（５０×）。肝臓の構造は、この視野においてはコラーゲンの鎖によって歪められる。ブルー染色コラーゲンの鎖が見られ、このコラーゲンの鎖は、少なくとも３つの門脈領域で連結する。完全に形成された硬変性小節は見られない。
【０１４５】
パネルＦ：ＨＢＶ感染Ｔｕｐａｉａ、パネルＤと同じ動物、Ｈ／Ｅで染色した１０ヶ月後の肝臓生検（２５０×）。リンパ球が門脈三管構造から拡がり、そして断片的な壊死パターンにおける変性肝細胞を囲む。
【０１４６】
パネルＧ：レチクリンで染色された未処理のＴｕｐａｉａ肝臓切片は、正常なヒトの肝臓に匹敵する正常な構造、網様構造を示す。
【０１４７】
パネルＨ：ＨＢＶ感染Ｔｕｐａｉａ、（パネルＥと同じ動物、ＨＢＶ感染６ヶ月後、レチクリンで染色された）は、再生を示すレチクリンによって個々に囲まれていない肝細胞の群ならびにコラーゲンの沈着および肝細胞の崩壊を示す細胞外マトリクスの太い鎖を示す。
【０１４８】
ＨＢＶ ＲＮＡのインサイチュＰＣＲ検出を図１７に示す。上方左のパネルは、ＨＢＶ感染６ヶ月後のＴｕｐａｉａの肝臓におけるＢ型肝炎のＲＮＡの分布を示す。より高い拡大率で、（上方右のパネル）感染された肝細胞および予備クップファー細胞を示し得る。ウイルスＲＮＡは、図１７の下方左のパネルに見られるように、非感染のコントロール動物において検出されなかった。対応するウイルス感染した肝臓のレチクリン染色は、中心静脈の領域まで拡張する門脈路の領域において、レチクリン線維の広汎性の増加を示す（図１７の下方右パネル）。
【０１４９】
３匹のＴｕｐａｉａの場合のまとめを、より詳細に以下に示す；１匹の感染されていないコントロールＴｕｐａｉａならびにＨＢＶ接種６ヶ月後および１０ヶ月後に試験した２匹のＴｕｐａｉａ。各標本由来の肝臓切片を染色し、次いで２つの臨床的病状によって個々に分析した。
【０１５０】
（Ｔｕｐａｉａ＃１）未処置の成体Ｔｕｐａｉａ。ＨおよびＥ染色は、正常な肝臓構造を示す。門脈路における炎症の形跡は存在せず、そして洞様毛細血管空間において単核細胞がまれに存在する。肝細胞および胆管は、平凡である。レチクリン染色（コラーゲン沈着について染色する）は、レチクリンの増加を全く示さない。それ故、この肝臓組織は、正常の範囲内にある。インサイチュＰＣＲ反応後のＨＢＶ ＲＮＡの存在についての形跡は見られなかった。
【０１５１】
（Ｔｕｐａｉａ＃２）ＨＢＶ接種６ヶ月後に得られた標本。ＨおよびＥ染色は、正常な肝臓の構造を示す。門脈路における中程度の、慢性的な炎症（門脈肝炎）の広範な形跡が存在する。これらの炎症性細胞の大部分は、リンパ球およびプラズマ細胞である。時折、炎症は境界板（ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｐｌａｔｅ）を通り越す（小葉の肝炎）が、肝細胞壊死／断片的壊死は、明らかでない。洞様毛細血管空間において散乱した単核細胞が存在する。肝細胞は、拡散性および重篤な脂肪変性（脂肪変化）を示す。これは、ＨＣＶ感染したヒト肝臓において共通に見出される。血清学的試験は、ＨＣＶに対し、ネガティブな結果を与えた。このことは、このＴｕｐａｉａにおいて、脂肪変性が、混入にも先のＨＣＶ感染にも起因しないことを示す。まれな石灰沈着細胞（ｇｒｏｕｎｄ ｇｌａｓｓ ｃｅｌｌ）が、明らかであり、これは、ＨＢＶに感染されたヒト肝臓に共通して見出され、そして肝細胞内でのＨＢｓＡｇの蓄積から生じる。コラーゲン沈着についてのレチクリン染色は、レチクリン線維の拡散性および中程度の増加を示し、このレチクリン線維は門脈路に集中し、そしてまれに中心静脈の領域まで拡がる。これらの組織学的知見は、中程度に重篤な慢性的ウイルス肝炎と一致する。隣接する組織切片におけるＨＢＶ複製についての試験の結果、ウイルス性ＲＮＡが、ＲＴインサイチュＰＣＲ技術を用いて予備的な肝細胞において検出された。ウイルス核酸は、核膜の領域に局在した。このことは、生検時の肝臓における活性なＨＢＶ複製を示す。
【０１５２】
（Ｔｕｐａｉａ＃３）ＨＢＶ接種１０ヶ月後に得られた標本。ＨおよびＥ染色は、正常な肝臓の構造を示す。門脈路における慢性的な炎症（門脈肝炎）の最小の形跡が存在する。まれな単核細胞が洞様毛細血管空間に存在し、そして肝細胞は、平凡である。コラーゲンについてのレチクリン染色は、門脈路に集中するレチクリン線維の、限局的かつ穏やかな増加を示す。このことは、結合組織の細かい線維の沈着（門脈周囲線維症）を示す。これらの組織学的知見は、温和で、慢性的な肝炎と一致する。ウイルス性ＲＮＡは、生検時（接種１０ヶ月後）には検出されなかった。
【０１５３】
（まとめ）
原始的で下等な霊長類、Ｔｕｐａｉａ ｂｅｌａｎｇｅｒｉは、ＨＢＶを感染され得、その結果、ヒトの疾患に類似する多くの特徴が観察され得る。これらの疾患症状は、治療的過程の有効性を決定するための有用なマーカーである。これらのマーカーのいくつか（例えば、ＨＢｓＡｇの存在）を使用して、進行中のウイルス複製の存在をモニターし得る。他のマーカー（例えば、ＡＬＴレベル）および炎症性応答についての組織学的試験は、感染の二次発現の程度の決定について用いられ得る。
【０１５４】
（実施例８ ＴｕｐａｉａにおけるＨＢＶ抗原に対する経口寛容化の誘導）
この実施例は、ＳＩＤＲを使用して、ウイルス感染に関連する疾患の症状を緩和し得ることを実証する。この実施例において、経口寛容の誘導により、Ｔｕｐａｉａ ｂｅｌａｎｇｅｒｉのＨＢＶ感染後、先の実施例において記載された有害な免疫発現を緩和し得る。この実施例はまた、経口寛容の誘導が、病原体の抗原に対する抗体反応を選択的にダウンレギュレートするために使用され得ることのさらなる実証として役立つ。
【０１５５】
（材料および方法）
被験体、血清学および組織学は、先の実施例において記載されるとおりである。 経口寛容化の誘導。成体のｔｕｐａｉａに３０ｎｇのＨＢｓＡｇを、ＨＢＶ感染ヒト血清での感染前または感染後に、１ｍｇのウシ胎仔血清キャリアを含む溶液で与えた（１０容量、隔日に与えた）。寛容体（ｔｏｌｅｒａｎｔ）として使用されるＨＢｓＡｇは、ヒト肝細胞株ＩＨＢＶ６．７から採取した細胞培養物の上清由来である。この細胞株の誘導および特徴付けは、同時係属中の特許出願（Ｂｒｏｗｎら、米国特許出願第０８／８７６／６３５号、１９９７年６月１６日出願）に記載される。コンフルエントであるとき、ＩＨＢＶ６．７定常細胞は、９０ｎｇ／ｍｌのＨＢｓＡｇを生成する。未処理のコントロールについては、成体のｔｕｐａｉａに、１ｍｇのＢＳＡを、ＨＢｓＡｇなしで与えた。
【０１５６】
（結果）
（抗体のレベル）対のＴｕｐａｉａにＨＢＶを感染させた場合、表面抗原に対する、高いレベルの抗体を検出した（図１８）。感染されたＴｕｐａｉａの１匹に、感染６週間後にＨＢｓＡｇを経口投与した場合、少なくとも２桁の規模で抗体レベルが減少したが、コントロールは、高いレベルの抗体を産生し続けた。これら２匹の動物に第２の接種を行った場合、コントロール被験体は、第２のコントロール動物が示したような二次免疫応答を示した（図１９）。しかし、先に記載されるように経口寛容された被験体は、ＨＢＶチャレンジに対するいずれの応答も実証しなかった。ＨＢＶ抗体の検出可能なレベルが、１２週間にわたって検出されなかった。
【０１５７】
Ｔｕｐａｉａをまた、ＨＢＶ感染の前に寛容化した。この実験の結果を図２０に示す。ＨＢｓＡｇの経口投与によって処置された被験体は、コントロールより１０倍低い初期応答を示した。感染８週間後に試験した場合、寛容化動物における抗体のレベルは、検出可能ではなく、そして再チャレンジが感染２１週間後に投与されるまで、そのままであった。再チャレンジの後、抗体の応答レベルは、コントロールと比較して寛容化動物において４００倍低かった。これはまた、すぐに検出可能でないレベルに戻った。
【０１５８】
（ＡＬＴレベル）図２０に示される被験体をまた、血清ＡＬＴレベルの測定によって肝臓の損傷について試験した。これらのアッセイの結果を図２１に示す。寛容化ＴｕｐａｉａおよびコントロールＴｕｐａｉａの両方について、接種２日後に見られる初期ＡＬＴピークは、１０日以内に正常なレベルまで戻る。コントロール動物において、ＡＬＴは、接種後２４日目から６０日目までに再び上昇しはじめる。このことは、継続する肝臓の損傷の診断法である。対照的に、寛容化被験体は、研究中、ＡＬＴの正常なレベルを維持した。
【０１５９】
図１９に示される、二次免疫ＨＢＶ注射した被験体をまた、肝臓の損傷について血清ＡＬＴレベルを測定することによって試験した。これらのアッセイの結果を図２２に示す。コントロールのＨＢＶ感染Ｔｕｐａｉａは、第２の接種に対して高いＡＬＴ応答を示すが、一方経口寛容化で処置した被験体は、ほとんど応答を示さない。
【０１６０】
（組織学）３匹のＨＢＶ感染し、ＢＳＡを与えられたコントロール由来の肝臓生検は、炎症および線維損場の程度の変化を示した（先の実施例からの図１６）。対照的に、２匹のＨＢｓＡｇを与えて感染したＴｕｐａｉａおよび３匹の非感染のＴｕｐａｉａは、炎症または線維症の形跡が欠けていた。この例を図２３に示す（上のパネルが非感染Ｔｕｐａｉａ由来の正常な肝臓標本を示す）。対照的に中央のパネルは、ＨＢＶ感染したＴｕｐａｉａ由来の標本にみられる非健常組織を示す。中央のパネルにおける矢印は、感染１０ヶ月後に存在する広範な線維症を示す。下のパネルは、感染後経口寛容誘導を行ったＴｕｐａｉａにおいて、感染１０ヶ月後に、疾患過程のいずれの徴候も存在しないことを示す。
【０１６１】
（まとめ）
これらのさらなる結果は、ＨＢＶ抗原に対する経口寛容の治療が、肝臓の病状についてのこの動物モデルにおいて、ＨＢＶ肝炎の肝性炎症を改善したことを示す。期待され得ることに反して、ＨＢＶ表面抗原に対する免疫応答の抑止は、劇症性のウイルス血症の提示を導かなかった。ｔｕｐａｉａを感染の前にＨＢＶの表面抗原に対して寛容化した場合、その表面抗原に対する抗体のレベルの劇的な減少が存在した。さらに、治療的効果が、非寛容化動物の肝臓において観察されるＨＢＶ感染に対する炎症性応答の損失の点において注目された。この効果は、自己の免疫応答を生じる、選択された抗原またはエピトープに関して、他の抗原またはエピトープに対する免疫応答を維持しながら、経口寛容化が実行され得るこの病原系および他の病原系における治療様式を可能にする。このことは、被験体による感染の天然的制御を可能にする。
【０１６２】
上記の本発明の発明の詳細な説明および実施例を鑑みて、多くの明らかな改変が当業者に示唆される。全てのこのような改変は、以下の特許請求の範囲によってより詳細に規定されるように、本発明の範囲および思想に十分に含まれる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学的調節の分野に関し、より詳細には、選択的免疫ダウンレギュレーションに関し、そして移植、疾患の予防および処置、ならびにそれらにおいて使用される組成物に適用可能である。
【０００２】
本願において引用または記される全ての特許、特許出願、特許公開、科学論文などは、本発明が関する分野の技術水準をより詳細に記載するために、本明細書において参考としてその全体が援用される。
【背景技術】
【０００３】
免疫手順は、疾患の拡散の進行を抑制するにおいて顕著な成功を収めており、そして天然痘の場合においては、それを完全に根絶させたことは周知であるが、免疫プロセス自体に問題がないわけではない。そうでなければ健康な個体において疾患を誘発し得る、免疫手順に対する有害反応についての関心は高まっている。これは実際、免疫の副作用について注意を集中させたこれらの手順の成功自体である。広汎な免疫プログラムは、以前に主要な健康問題であった、多数の病原体に曝露される確率を顕著に低減し、その結果、現在では、疾患を発症する危険因子よりも、その疾患を予防することによって発生する危険因子の方が重要となっている。実際、免疫手順を辞退した大きな人口集団が存在する。これは、そのこと自体において、これまで制御していたこれらの疾患の萌芽を可能にし得る。粗違って、免疫プロセスの有利な効果を可能にし得るが、免疫プロセスの潜在的な有害効果を改善し得る手順に対する必要性が存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、免疫およびワクチン接種、移植、ならびに多くの免疫疾患および障害に関連する問題を含む、所望されない免疫学的反応および状態に関して予防的および治癒的手段を提供することによって、上記の問題および関心事に取り組む。本発明はまた、免疫調節のための独特な組成物、試薬、薬物およびプロセスを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、以下を提供する。
【０００６】
１．レシピエントにおける選択的な免疫ダウンレギュレーションを確立する工程であって、
該レシピエントが、ドナー由来の免疫細胞、免疫組織、免疫器官またはその成分を含み、
ここで、ＳＩＤＲが該レシピエントまたはその免疫学的等価物のネイティブまたは非ネイティブな抗原に対して、または該レシピエントまたはその免疫学等価物における該ドナーのネイティブまたは非ネイティブ抗原に対してあるいはその両方に対して確立されている、工程、
を包含する、移植プロセス。
【０００７】
２．前記免疫細胞、免疫組織、免疫器官またはその成分が、Ｔ細胞、樹状細胞、リンパ球、末梢血細胞、ＮＫ細胞、造血幹細胞、骨髄およびそれらの組合せからなる群より選択される、項目１に記載の移植プロセス。
【０００８】
３．前記選択的免疫ダウンレギュレーションが、前記ネイティブまたは非ネイティブ抗原を投与することにより前記レシピエントを経口的に寛容化することによって確立され、該ネイティブまたは非ネイティブ抗原は、（ａ）該レシピエント由来の細胞、組織またはそのフラグメント、（ｂ）該ドナー由来の細胞、組織またはそのフラグメント、（ｃ）該レシピエント由来の抗体と複合体化された細胞、組織またはそのフラグメント、（ｄ）該ドナー由来の抗体と複合体化された細胞、組織またはそのフラグメント、あるいは、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）のいずれかの部分消化物由来、任意の免疫学的に等価な成分、および上記のいずれかの任意の組合せからなる群より選択されるか、または由来する、１以上の成分を含む、項目１に記載の移植プロセス。
【０００９】
４．項目１の移植プロセスを使用して、レシピエントにおける移植片対宿主拒絶を予防または処置をするプロセス。
【００１０】
５．前記ネイティブまたは非ネイティブな抗原が、前記レシピエント由来である、項目４に記載のプロセス。
【００１１】
６．前記ネイティブまたは非ネイティブな抗原が、前記レシピエント由来であり、そして該レシピエントおよび前記ドナー由来のネイティブまたは非ネイティブ抗原を含む、項目４に記載のプロセス。
【００１２】
７．前記ネイティブまたは非ネイティブ抗原が、Ｔ細胞、樹状細胞、リンパ球、末梢血細胞、ＮＫ細胞、造血幹細胞、骨髄およびそれらの組合せからなる群に由来する、項目４に記載の移植プロセス。
【００１３】
８．前記ネイティブまたは非ネイティブ抗原が末梢血球を含む、項目７に記載のプロセス。
【００１４】
９．被験体においてワクチン接種または免疫の所望されない免疫学的結果を処置または予防するためのプロセスであって、以下の工程：
ワクチン、免疫剤、アジュバントまたは免疫学的に等価な化合物、およびそれらのいずれかの任意の組合せとして使用された任意または全ての抗原に対して、該被験体において選択的免疫ダウンレギュレーションを確立する工程、
を包含する、プロセス。
【００１５】
１０．レシピエントに導入した場合に、該レシピエントにおいて選択的な免疫ダウンレギュレーションを提示または確立する、馴化またはプログラミングした細胞、組織または器官を含有する、組成物。
【００１６】
１１．前記馴化またはプログラミングした細胞、組織または器官が予め寛容化されている被験体に由来する、項目１０に記載の組成物。
【００１７】
１２．前記馴化またはプログラミングした細胞、組織または器官が前記レシピエントに対して同種異系である被験体に由来する、項目１０に記載の組成物。
【００１８】
１３．前記馴化またはプログラミングした細胞、組織または器官が前記レシピエントに対して異種である被験体に由来する、項目１０に記載の組成物。
【００１９】
１４．前記馴化またはプログラミングした細胞、組織または器官が前記被験体に導入される前に前記レシピエントの外側でインビトロで寛容化されている、項目１０に記載の組成物。
【００２０】
１５．前記レシピエントに導入された場合、該レシピエントにおいて特定の抗原に対する寛容を提示または確立する細胞、組織または器官を含む、項目１０に記載の組成物。
【００２１】
１６．被験体においてクローン病を処置するプロセスであって、以下の工程：
該被験体における罹患した細胞、組織または器官のネイティブまたは非ネイティブ抗原に対して該被験体において選択的免疫ダウンレギュレーションを確立する工程であって、該レギュレーションは、クローン病に罹患した細胞、組織、器官もしくはその成分に由来する材料か、またはその正常の標的を含むネイティブまたは非ネイティブ抗原を投与することによって確立され、該ネイティブまたは非ネイティブ抗原は、同種異系供給源、異種供給源、自己供給源および該供給源の組合せ、および免疫学的に等価な化合物、ならびにそれらのいずれかの組合せに由来する工程、を包含する、プロセス。
【００２２】
１７．前記クローン病に罹患した細胞、組織、器官もしくはその成分、またはその正常の標的が腸細胞を含む、項目１６に記載のプロセス。
【００２３】
１８．被験体における原発性硬化性胆管炎疾患を処置するプロセスであって、以下の工程：
該被験体における罹患した細胞、組織または器官のネイティブまたは非ネイティブ抗原に対して該被験体において選択的免疫ダウンレギュレーションを確立する工程であって、該レギュレーションは、原発性硬化性胆管炎疾患に罹患した細胞、組織、器官もしくはその成分に由来する材料か、またはその正常の標的を含むネイティブまたは非ネイティブ抗原を投与することによって確立され、該ネイティブまたは非ネイティブ抗原は、同種異系供給源、異種供給源、自己供給源および該供給源の組合せ、および免疫学的に等価な化合物、ならびにそれらのいずれかの組合せに由来する、工程を包含する、プロセス。
【００２４】
１９．被験体における原発性胆管性肝硬変を処置するプロセスであって、以下の工程：
該被験体における罹患した細胞、組織または器官のネイティブまたは非ネイティブ抗原に対して該被験体において選択的免疫ダウンレギュレーションを確立する工程であって、該レギュレーションは、原発性胆管性肝硬変に罹患した細胞、組織、器官もしくはその成分に由来する材料か、またはその正常の標的を含むネイティブまたは非ネイティブ抗原を投与することによって確立され、該ネイティブまたは非ネイティブ抗原は、同種異系供給源、異種供給源、自己供給源および該供給源の組合せ、および免疫学的に等価な化合物、ならびにそれらのいずれかの組合せに由来する、工程を包含する、プロセス。
【００２５】
２０．被験体における原発性胆管性肝硬変を処置するプロセスであって、以下の工程：
該被験体における罹患した細胞、組織または器官のネイティブまたは非ネイティブ抗原に対して該被験体において選択的免疫ダウンレギュレーションを確立する工程であって、該レギュレーションは、原発性胆管性肝硬変に罹患した細胞、組織、器官もしくはその成分に由来する材料か、またはその正常の標的を含むネイティブまたは非ネイティブ抗原を投与することによって確立され、該ネイティブまたは非ネイティブ抗原は、同種異系供給源、異種供給源、自己供給源および該供給源の組合せ、および免疫学的に等価な化合物、ならびにそれらのいずれかの組合せに由来する、工程を包含する、プロセス。
【００２６】
２１．被験体における原発性セリアック病（Ｃｅｌｌｉａｃ'ｓ ｄｉｓｅａａｓｅ）を処置するプロセスであって、以下の工程：
該被験体における罹患した細胞、組織または器官のネイティブまたは非ネイティブ抗原に対して該被験体において選択的免疫ダウンレギュレーションを確立する工程であって、該レギュレーションは、セリアック病に罹患した細胞、組織、器官もしくはその成分に由来する材料か、またはその正常の標的を含むネイティブまたは非ネイティブ抗原を投与することによって確立され、該ネイティブまたは非ネイティブ抗原は、同種異系供給源、異種供給源、自己供給源および該供給源の組合せ、および免疫学的に等価な化合物、ならびにそれらのいずれかの組合せに由来する、工程を包含する、プロセス。
【００２７】
２２．被験体における原発性自己免疫活動性慢性肝炎を処置するプロセスであって、以下の工程：
該被験体における罹患した細胞、組織または器官のネイティブまたは非ネイティブ抗原に対して該被験体において選択的免疫ダウンレギュレーションを確立する工程であって、該レギュレーションは、原発性自己免疫活動性慢性肝炎に罹患した細胞、組織、器官もしくはその成分に由来する材料か、またはその正常の標的を含むネイティブまたは非ネイティブ抗原を投与することによって確立され、該ネイティブまたは非ネイティブ抗原は、同種異系供給源、異種供給源、自己供給源および該供給源の組合せ、および免疫学的に等価な化合物、ならびにそれらのいずれかの組合せに由来する、工程を包含する、プロセス。
【００２８】
２３．被験体における慢性肝臓拒絶疾患を処置するプロセスであって、以下の工程：
該被験体における罹患した細胞、組織または器官のネイティブまたは非ネイティブ抗原に対して該被験体において選択的免疫ダウンレギュレーションを確立する工程であって、該レギュレーションは、慢性肝臓拒絶疾患に罹患した細胞、組織、器官もしくはその成分に由来する材料か、またはその正常の標的を含むネイティブまたは非ネイティブ抗原を投与することによって確立され、該ネイティブまたは非ネイティブ抗原は、同種異系供給源、異種供給源、自己供給源および該供給源の組合せ、および免疫学的に等価な化合物、ならびにそれらのいずれかの組合せに由来する、工程を包含する、プロセス。
【００２９】
２４．被験体における免疫媒介性肝臓線維症疾患を処置するプロセスであって、以下の工程：
該被験体における罹患した細胞、組織または器官のネイティブまたは非ネイティブ抗原に対して該被験体において選択的免疫ダウンレギュレーションを確立する工程であって、該レギュレーションは、免疫媒介性肝臓線維症疾患に罹患した細胞、組織、器官もしくはその成分に由来する材料か、またはその正常の標的を含むネイティブまたは非ネイティブ抗原を投与することによって確立され、該ネイティブまたは非ネイティブ抗原は、同種異系供給源、異種供給源、自己供給源および該供給源の組合せ、および免疫学的に等価な化合物、ならびにそれらのいずれかの組合せに由来する、工程を包含する、プロセス。
【００３０】
２５．被験体における免疫媒介性血管障害を処置するプロセスであって、以下の工程：
該被験体における罹患した細胞、組織または器官のネイティブまたは非ネイティブ抗原に対して該被験体において選択的免疫ダウンレギュレーションを確立する工程であって、該レギュレーションは、免疫媒介性血管障害に罹患した細胞、組織、器官もしくはその成分に由来する材料か、またはその正常の標的を含むネイティブまたは非ネイティブ抗原を投与することによって確立され、該ネイティブまたは非ネイティブ抗原は、同種異系供給源、異種供給源、自己供給源および該供給源の組合せ、および免疫学的に等価な化合物、ならびにそれらのいずれかの組合せに由来する、工程を包含する、プロセス。
【００３１】
２６．被験体における免疫媒介性筋肉障害を処置するプロセスであって、以下の工程：
該被験体における罹患した細胞、組織または器官のネイティブまたは非ネイティブ抗原に対して該被験体において選択的免疫ダウンレギュレーションを確立する工程であって、該レギュレーションは、免疫媒介性筋肉障害に罹患した細胞、組織、器官もしくはその成分に由来する材料か、またはその正常の標的を含むネイティブまたは非ネイティブ抗原を投与することによって確立され、該ネイティブまたは非ネイティブ抗原は、同種異系供給源、異種供給源、自己供給源および該供給源の組合せ、および免疫学的に等価な化合物、ならびにそれらのいずれかの組合せに由来する、工程を包含する、プロセス。
【００３２】
２７．前記免疫媒介性筋肉障害が、平滑筋、黄紋筋、血管筋、およびそれらのいずれかの組合せからなる群より選択される、筋肉メンバーに影響する、項目２６に記載のプロセス。
【００３３】
本発明は、移植プロセスを提供し、この移植プロセスは、レシピエントにおける選択的な免疫ダウンレギュレーションを確立する工程であって、このレシピエントが、ドナー由来の免疫細胞、免疫組織、免疫器官またはその成分を含み、ここで、ＳＩＤＲがそのレシピエントもしくはその免疫学的等価物のネイティブもしくは非ネイティブな抗原に対して、または上記レシピエントもしくはその免疫学等価物における上記ドナーのネイティブもしくは非ネイティブ抗原に対して、あるいはその両方に対して確立されている工程、を包含する。本発明によってまた、上記の移植プロセスを使用して、レシピエントにおける移植片対宿主拒絶を予防または処置するプロセスが提供される。
【００３４】
本発明はさらに、被験体においてワクチン接種または免疫の所望されない免疫学的結果を処置または予防するためのプロセスを提供し、このプロセスは、ワクチン、免疫剤、アジュバントまたは免疫学的に等価な化合物、およびそれらのいずれかの任意の組合せとして使用された任意または全ての抗原に対して、この被験体において選択的免疫ダウンレギュレーションを確立する工程、を包含する。
本発明はまた、レシピエントに導入された場合に、このレシピエントにおいて選択的な免疫ダウンレギュレーションを提示または確立する、馴化またはプログラムされた細胞、組織または器官を含有する、組成物を提供する。
本発明によってまた、被験体においてクローン病を処置するプロセスが提供される。このプロセスは、この被験体における罹患した細胞、組織または器官のネイティブまたは非ネイティブ抗原に対してこの被験体において選択的免疫ダウンレギュレーションを確立する工程であって、このレギュレーションは、クローン病に罹患した細胞、組織、器官もしくはその成分に由来する材料か、またはクローン病の正常の標的を含むネイティブまたは非ネイティブ抗原を投与することによって確立され、このネイティブまたは非ネイティブ抗原は、同種異系供給源、異種供給源、自己供給源、およびこのような供給源の組合せ、および免疫学的に等価な化合物、ならびにそれらのいずれかの組合せに由来する工程、を包含する。
【発明の効果】
【００３５】
結論として、本発明は、以下を提供する：
本発明は、移植過程ならびに対宿主性移植片拒絶に指向される疾患の介入および予防、その上免疫化およびワクチン接種から生じる所望されない免疫学的効果の除去における独特の免疫調節の適用を提供する。他の疾患（クローン病、原発性硬化性胆管炎、原発性胆汁性肝硬変、アテローム硬化症（ａｔｈｅｒｏｓｃｈｌｅｒｏｓｉｓ）などを含む）についての処置もまた提供される。本発明はまた、このような過程を実行するための独特な組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、レシピエントの脾細胞に対する、経口寛容の誘導を通じて移植片ドナーにおけるＭＬＲ応答の減少を示す。
【図２】図２は、レシピエントのリンパ球に対する、ＢＭドナーにおける経口寛容の誘導が皮膚コラーゲンの生成を減少させたことを示す。皮膚の生検におけるコラーゲンα１（Ｉ）遺伝子発現（移植６２日後に行い、そしてジゴキシゲニン標識化マウスコラーゲンα１（Ｉ）プローブとハイブリダイズした）を示す。
【図３】図３は、脾細胞移植後６２日目の移植レシピエントにおける小腸の組織学的評価に対するドナーの寛容化の効果を示す。
【図４】図４は、脾細胞ドナーにおける、レシピエントのリンパ球に対する経口寛容誘導が、サイトカインプロフィールの逆転（Ｔｈ１〜Ｔｈ２の応答型）を誘導することを示す。
【図５】図５は、大腸炎および正常な結腸抽出タンパク質に対する寛容誘導の、実験的大腸炎を有するマウスの体重に対する効果を示す。
【図６】図６は、大腸炎の肉眼的類別に対する寛容化の効果を示す。
【図７】図７は、実験的大腸炎における腸粘膜の組織学的評価に対する寛容化の効果を示す。
【図８】図８は、実験的大腸炎の肉眼的類別に対する寛容化の効果を示す。
【図９】図９は、血清ＩＬ４（黒い棒）およびＩＦＮγ（白抜きの棒）の血清レベルに対する経口寛容の効果を示す。寛容化マウスは、Ｔｈ１からＴｈ２の免疫応答サイトカイン分泌のシフトを示した。
【図１０】図１０は、末梢性免疫寛容誘導がＮＫ１．１＋ＬＡＬ細胞傷害性機能を顕著に増強することを示す。
【図１１】図１１は、組換えＢｉｏＨｅｐＢワクチンの３つの異なる用量のｉ．ｐ．接種３０日後の抗ＨＢｓＡｇ抗体の血清レベルを示す。
【図１２】図１２は、ウイルス抗原に対する寛容誘導に対するＨＢＶタンパク質の経口投与の効果を示す。
【図１３】図１３は、ＨＢＶに関する既存の免疫性を有するマウスにおけるＢ型肝炎に対する経口寛容誘導の効果を示す。
【図１４】図１４は、既存の抗ＨＢＶ二次免疫応答に対する経口寛容誘導の効果を示す。
【図１５】図１５は、ＨＢＶ接種後のＴｕｐａｉａにおけるＡＬＴレベルの時間経過を示す。
【図１６】図１６は、正常なＴｕｐａｉａおよびＨＢＶ感染Ｔｕｐａｉａの肝臓の組織形態を例証する顕微鏡写真である。
【図１７】図１７は、インサイチュＰＣＲ増幅後およびＨＢＶ ＲＮＡの検出後のＴｕｐａｉａの肝臓切片を撮影した顕微鏡写真である。
【図１８】図１８は、ＨＢＶ抗原に対する抗体のレベルにおける感染後の経口寛容化の効果を示す時間経過である。
【図１９】図１９は、ＨＢＶ再チャレンジ後のＨＢＶ抗原に対する抗体のレベルにおける経口寛容化の効果を例証する。
【図２０】図２０は、ＨＢＶ抗原に対する抗体のレベルに対する経口寛容化の前感染の誘導の効果を示す。
【図２１】図２１は、血清ＡＬＴレベルによって決定されるようなＨＢＶ誘導肝臓損傷に対する経口寛容化の前感染の誘導の効果を示す。
【図２２】図２２は、ＨＢＶ再チャレンジ後のＨＢＶ誘導肝臓損傷に対する経口寛容化の効果を示す。
【図２３】図２３は、レチクリンで染色されたＴｕｐａｉａ肝臓生検標本の顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、所望でない免疫学的反応および状態（免疫およびワクチン接種に関連する免疫学的反応および状態、移植、ならびに多数の免疫学的疾患および障害を含む）に関する予防的および治癒的な手段を提供する。本発明はまた、免疫調節のための独特の組成物、試薬、薬物およびプロセスを提供する。予防に関して、本発明は、不適切な応答を誘導し得る免疫手順の任意の成分に対する経口寛容の誘導を可能にする。これらは、抗原とともに含まれる、アジュバントおよび化合物を含み得るがこれらに限定されない。治療的プロセスに関して、免疫手順からの不適切な応答の喚起は、ＳＩＤＲ、ＧＩＳ、またはそれらの組合せにより処置され得る。ＳＩＤＲは、免疫試薬中に所望の抗原成分とともに存在する成分に対する経口寛容化の誘導により達成され得るか、または所望の抗原自体もしくはその免疫学的等価物を含み得るかもしくはそれらからなり得る。前者の場合、所望の抗原以外の成分に対する免疫応答の低減が存在するが、所望の抗原に対する免疫応答の誘導が依然として可能である。後者の場合、免疫プロセス自体の一般的な排除または低減が存在する。ＧＩＳは、物理的プロセスまたは試薬の投与のいずれかにより達成され得る。ＧＩＳを誘導するために使用され得る物理的プロセスの１例は、放射線処置である。ＧＩＳの誘導において有用である試薬は、免疫抑制剤であり得る。免疫抑制剤の例は、コルチコステロイド、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６、またはリファンピンのような化学物質であり得る。免疫抑制剤の例はまた、タンパク質性試薬（例えば、サイトカイン、リンホカイン、インターフェロン、インターロイキン、リガンド、リガンドレセプター、および上記のいずれかに対する抗体、ならびに二次疾患の症状発現に関与するかまたは関連する任意の細胞（Ｔ細胞を含む）に対する抗体）であり得る。
【００３８】
免疫系のダウンレギュレーションを用いてヒトの多数の疾患の症状が低減されているが、本発明の前には適切な候補であるとは認識されていなかった他の疾患が存在する。本発明の１つの局面では、ＳＩＤＲ、ＧＩＳ、またはその任意の組合せが適用されて、以下の疾患の自己免疫性症状発現を軽減する：原発性硬化性胆管炎、原発性胆汁性肝硬変、セリアック（Ｃｉｌｉａｃ）病、自己免疫性慢性活動性肝炎、慢性肝臓拒絶、免疫媒介肝臓線維症、免疫媒介性脈管障害、免疫媒介性脈管閉塞、免疫媒介筋障害（平滑筋および横紋筋ならびに血管筋を含む）。
【００３９】
本発明は、病原体による感染の所望でない免疫の結果の関連性および処置を開示した。本発明の使用のさらなる例は、病原体の存在により媒介され得るかまたは関連し得る、ヒトにおける冠状動脈疾患を処置するための適用である。Ｍｅｈｔａ，Ｊ．Ｌ．ら，「Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ａｎｄ ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．５（６）：１２１７−２５（１９９８）；およびＯｓｓｅｉ−Ｇｅｒｎｉｎｇ，Ｎ．ら，「Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ａｔｈｅｒｏｍａ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｎｇｉｏｇｒａｐｈｙ」，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５（１）：１２０−１２４（１９９７）を参照のこと。
【００４０】
さらに詳述するために、経口寛容化が、この適用において同系の実験動物に養子移入される場合、同じ抗原に対する免疫化を誘導する、少なくとも末梢血単核細胞画分（ＰＢＭＣ）において存在するあるクラスの細胞の産生を導くことがここで実証されている。このことは、本発明者らがＴｓ細胞と呼ぶ、あるクラスの細胞を同定する。このような細胞集団は、寛容化抗原の経口提示を用いて達成される寛容化を含む、寛容化の誘導によって、免疫能力のある動物（ヒトを含む）内で産生される。
【００４１】
一般に、本発明はさらに、免疫細胞を、寛容化した免疫細胞を有するように以前にプログラムしたかまたは馴化したドナー由来のレシピエントに移入することにより、これらの細胞をレシピエント（ＤＩＤＲ）に移入することにより、レシピエントにおけるＳＩＤＲを、上記特異的抗原に対して付与し得ることを実証する。後者は、１９９７年２月２８日出願の米国出願第０８／８０８，６２９号に記載されている。レシピエントに対する移入によってＳＩＤＲを付与する細胞、組織、または器官（免疫成分）は、異種の、同種異系の、同系の、または自己の宿主またはドナーから得られ得る。ドナーが、レシピエントの免疫成分と免疫学的に適合性でなく、そしてレシピエントの免疫成分を宿主に運ぶかまたは免疫成分に対する宿主（代理ドナー（ｄｏｎｅｏｒ））である必要がある場合の例では、レシピエントの免疫成分に対する代理ドナーの免疫応答を最少化するように、好ましくは、上記代理ドナーへのレシピエントの免疫成分の導入前に、代理ドナーが、免疫不全である、免疫抑制される、またはレシピエントの免疫成分に対して寛容化されることが所望される。代理ドナーにおけるレシピエントの免疫成分は、特定の抗原に対するＳＩＤＲを（例えば、経口寛容化によって）発達させるように馴化またはプログラムされる。この免疫成分は後に、レシピエントに移入され得、従って、上記レシピエントにＳＩＤＲを付与し得る。
【００４２】
免疫レシピエントにおいてＳＩＤＲを付与し得る、免疫細胞、組織または器官（免疫成分）は、ＰＢＭＣ、造血幹細胞、肝臓細胞、Ｔ細胞、Ｔ細胞のいくつかのサブクラス、骨髄細胞、腸細胞、胸腺細胞、脾臓細胞、リンパ節由来の細胞、または上記の任意の組合せに由来し得る。このような細胞、組織、または器官は、特定の抗原に対する確立されたＳＩＤＲを既に有する、ドナーまたは代理ドナーのいずれかに由来し得る。ＳＩＤＲプログラムされた細胞、組織、または器官を得るために代替的なアプローチは、このようなプログラムされた免疫細胞、組織、または器官（免疫成分）をインビトロまたはエキソビボで発達、増殖、および／または単離することである。このようなプロセスの１例では、既に寛容化されたドナーまたは代理ドナーの免疫成分は、取り出され、そして培養系に導入される。特異的な寛容化成分は、単離、分画、選択され得、そして／または特異的な寛容化成分を有する画分のみをレシピエントへの導入のために選択するように特異的な寛容化活性について富化される。この様式では、任意の所望されていないエピトープに対する寛容化免疫成分の反応または活性が、（所望の場合には）レシピエントへの導入前に回避され得る。
【００４３】
免疫成分は、寛容化されていないレシピエントから入手または誘導され、次いでさらに、インビトロまたはエキソビボの系に供され、それを介して、この免疫成分は、特定の抗原に対するＳＩＤＲをレシピエントにおいて付与するためにさらに馴化またはプログラムされる。これらの成分は、レシピエントへ導入し戻す前にさらに増殖され得るか、または選択的に単離もしくは富化され得る。
【００４４】
このような系における免疫応答細胞、組織、または器官の供給源は、このような抗原についての特異性を有する、抗体産生細胞、癌細胞もしくは細胞株、または免疫細胞であり得る。上記の抗体産生細胞は、モノクローナル抗体を提供するために単一の供給源に由来し得るか、またはポリクローナル抗体を提供するためにいくつかの供給源に由来し得る。
【００４５】
インビトロまたは培養系は、合成の特徴付けられた培地、または特徴付けられていない天然成分（例えば、自己血清もしくは非自己血清）を含有する複雑な培地を含有し得る。インビトロまたは培養系はさらに、このような系における寛容化免疫成分の発達を容易にし得るおよび／またはこのような免疫成分の増殖を支持し得る、細胞または組織または器官またはそのフラグメントを含み得る。これらは、肝臓、腸、胸腺、脾臓、骨髄、または他のマトリックスに由来し得る。このようなインビトロ系はさらに、必要とされ得る場合、適切なリンホカインおよびサイトカインを含み得る。
【００４６】
経口寛容化が、サプレッサーＴ細胞（Ｔｓ）と呼ばれる移入するクラスのＴ細胞、もしくは他のサブタイプのＴ細胞、または他のサブタイプのリンパ球（ＮＫ１．１ Ｔ細胞を含む）の産生を誘導することは可能である。同系実験マウスの例では、本発明は、マウス間で末梢血単核細胞を移入することにより、マウスからマウスへの寛容化の移入を記載する。この基準の意味は、特定のクラスの細胞が、適切な細胞、基質、および細胞因子の存在下で前駆体Ｔ細胞（ナイーブＴ細胞）から産生され得ること、および特定の抗原に対して寛容性を付与するのはこのクラスの細胞であることである。肝臓は、経口寛容化の誘導において役割を有すると示唆されているので、肝臓に関連するリンパ球のサブタイプ（例えば、ＮＫ１．１ Ｔ細胞）または肝臓内細胞の他のサブタイプは、寛容化プロセスに関連付けられている。免疫細胞のサブタイプが、他のサブタイプの免疫調節細胞または他の細胞への直接的または間接的な関連を介して、肝臓の環境におけるプログラミングに関与し得ることもまた示唆する。従って、これらの細胞が、寛容化が求められる被験体の身体外で処置され得るならば、次いでこれらの細胞は、有害な効果は最少にして、寛容性を誘導するために被験体の身体に注入して戻され得る（おそらく、精製後）。特定のＴｓ細胞、またはさらにより一般的なＴｓ細胞の亜集団のこの「馴化」は、インビトロで培養において行われ得るか、またはこの馴化は、適切な宿主生物の身体中で行われ得る。特定のまたはさらに一般的なＴｓ細胞を馴化するために、抗原特異的寛容化細胞の選択的誘導および増殖のためにインビボで存在する環境に匹敵する、インビトロでの環境を確立することが必要である。馴化は、抗原特異的様式または抗原非特異的様式で免疫細胞の低減をもたらす、特定のサブタイプの細胞および／またはサイトカインを含み得る。例えば、インビトロで馴化される場合、これらは、リンパ節由来の、または骨髄由来の、または胸腺由来の、肝臓、あるいはこれらの３つの供給源の組み合わせまたは他の供給源由来の支質細胞の存在下または非存在下で、混合型リンパ球反応において馴化され得る。これらのＴｓ細胞が動物において馴化または産生される場合、これらは、調製されたＳＣＩＤマウスまたは他の動物（これらは、マウスにおいて寛容化の誘導に必須であることが示されているので、おそらく、ヒト肝臓細胞を有する）において馴化され得る。これらは、細胞機能は維持するが細胞増殖を維持しないように免疫切除された動物において馴化され得る。この動物は、遺伝的に、または誘導されるかのいずれかでＳＣＩＤ状態を有し、そして必要な場合にはヒト肝臓細胞を受け入れ得る、齧歯動物または任意の動物であり得る。例えば、２つ挙げると（しかし、このリストに限定されない）、馴化は、全身が照射されたＲＡＧ２マウスまたはラットにおいて行われ得る。これらが馴化され、そしておそらくインビトロまたはインビボのいずれかで増幅された後、細胞は、自己に注入し戻され得るか、または同種異系のもしくは異種の宿主もしくはレシピエントへ注入し戻され得る。これらのいずれかの手順（インビトロまたはインビボにおける特異的または一般的なＴｓ細胞の馴化または再教育）は、多数の自己免疫的性質の状態を管理し得る非侵襲性および無毒性のプロトコルの開発を導く。これらの細胞は、治療試薬として用いられて、免疫媒介病因を管理し得る。この手順は、自己免疫状態、および免疫応答（天然の体液性免疫、アレルギー応答、および細胞性免疫を含む）の影響を最少にすることが求められる他の状態の管理に適切である。
【００４７】
本発明の新規な産物および手順を開発するために用いられた材料および方法ならびにプロトコルのさらなる説明については、Ｓｔｉｔｅｓ，Ｄ．Ｐ．およびＴｅｒｒ，Ａ．Ｉ．（編），Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ第７版の第１〜２４章，Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ， Ａ Ｄｉｖ．ｏｆ Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（１９９１）が参照される。
【００４８】
例えば、適切な細胞、組織または器官は、重篤な複合免疫不全を有するマウスまたは他の動物（Ｒａｇ２マウスまたはＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスなど）に注入または移植され得、次いで代理動物が、上記のように寛容化抗原の経口提示を通して、または経口寛容化に等価なレジメを通して寛容化される。寛容化は、マウスに、２０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清中の５０ｎｇの寛容化抗原を与えることにより、達成され得る。寛容化レジメの終了後、これらの細胞を白血球搬出により取り出し得、そして必要な場合は従来の分離手順（例えば、Ｆｉｃｏｌ勾配）を用いて、代理動物から単離する。例えば、ヒトＰＢＭＣが、ＳＣＩＤマウス内の機能的な特異的Ｔｃ細胞を含むように変更されること求められるならば、これらは、循環から単離され得、そしてヒト細胞特異的抗体パニング手順またはこのような手順の何らかの変法を用いて分離され得る。これらの寛容化細胞は、ＳＤＩＲまたは選択的免疫調節を誘導するためにヒト被験体に注入し戻され得る。
【００４９】
さらなる例として、１９９７年６月１６日出願のＢｒｏｗｎらの同時係属中の特許出願である米国特許出願第０８／８７６，６３５号に記載されるようなヒト−マウスキメラ肝臓を含むＲａｇ２マウスには、寛容化されるべきヒト由来のＰＢＭＣが（またはＣＤ４５＋でさえも）注入され得る。このマウスには、ＨＣＶ抗原が与えられて、Ｔｓ細胞の複製を誘導し得る。ヒトＴ細胞は、取り出され、増殖され、そして上記の通りに被験体に注入し戻され得る。特異的Ｔｓ細胞の存在について試験するために、このマウスに、寛容化に続いてＨＣＶをチャレンジし得る。肝臓内のヒト細胞におけるＨＣＶの増殖の証拠の存在下ではヒト細胞病状が存在しないという観察は、寛容化の誘導の証拠である。
【００５０】
さらなる例として、ラットのような動物は、優勢な造血細胞は複製しないが、それらの分化した表現型に従って機能する条件下で、全身照射により、または免疫消失化学物質（ｉｍｍｕｎｏａｂｌａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いることにより、いずれかにより切除され得る。ＰＢＭＣは、これらの切除した動物に注入または導入され得、そしてこの動物は、続いての、寛容化抗原の経口提示を通して、または上記の通りの経口寛容化に等価なレジメを通して寛容化され得る。さらに、寛容化レジメの完了後、これらの細胞を、切除した実験動物およびこの動物由来の免疫細胞から取り出し、そして必要に応じて精製し得る。
【００５１】
選択的誘導および抗原特異的寛容化細胞の増殖に関してインビボに存在する環境に匹敵し得るインビトロ環境からなるなお別の例が作製される。Ｔｓ細胞は、インビトロでまたはドナーまたはレシピエントの身体外で産生される。これらの細胞は、抗原提示細胞の存在下で、ならびにリンパ節由来の、もしくは骨髄由来の、もしくは胸腺由来の、または肝臓、もしくはこれらの３つの供給源の組み合わせ、もしくは他の供給源由来の支質細胞の存在下または非存在下で混合型リンパ球反応において馴化される。
【００５２】
Ｔｓ細胞の存在または非存在は、以下を含むいくつかのアッセイ方法を用いて決定される。
【００５３】
（アッセイ１：51Ｃｒ放出細胞傷害性アッセイ）
これらの研究において用いられる標的細胞は、ＹＡＣ−１細胞、１０％ ＦＣＳを有する補充したＲＰＭＩを用いて組織培養における連続増殖に適応させたリンパ腫細胞株、または任意の他の型の特化した（ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ）標的細胞、または抗原特異的感作Ｂリンパ球もしくはＴリンパ球であり得る。ＹＡＣ−１細胞は、これらを、２×１０5細胞／ｍｌの密度で、ＲＰＭＩ １０％ ＦＣＳを有する２５ｍフラスコ中に播種し、そしてそれらを２４時間後に収集することにより調製され得る。細胞を、５０ｍｌチューブに懸濁し、そして収集し、そして１２５０ｒｐｍにて１０分間、培地を用いて２回洗浄する。この手順は、エフェクター細胞による溶解の51Ｃｒでの効率的な標識および高い感度を保証する。標的細胞を、51Ｃｒで標識し、そして３７℃にて９０分間インキュベートする（３００μｌ ＲＰＭＩ培地中、２００ｍＣｉ／２×１０6細胞）。細胞を、１０分ごとに手で混合する。インキュベーション後、３ｍｌの２０％ ＦＣＳ ＲＰＭＩを添加し、そして３７℃にて３０分間、再度インキュベートする。細胞を、ＲＰＭＩ １０％ ＦＣＳ中で３回洗浄し、そして計数する。標識効率の程度の決定のために、１００μｌの細胞を計数する。エフェクター細胞は、試験されるべきリンパ球の亜集団である。51Ｃｒ放出アッセイは、Ｃｏｓｔａｒ ９６ウェルプレート中で行われ得る。１００μｌ中の計数された数のエフェクター細胞を、１００μｌ中の５，０００個の標識された標的細胞と混合する。エフェクターと標的との比（Ｅ：Ｔ比）は、５０：１；２５：１；および１２．５：１である。各ウェルは、計２００μｌの容量で標的細胞およびエフェクター細胞を含む。５つのウェルを、各サンプルからの各比について試験し得る。自然放出の決定のために、６個のウェルの類似の数の標的細胞を、１００μｌのＲＰＭＩ １０％ ＦＣＳにプレーティングする。最大放出の決定のために、６ウェルの１００μｌの培地中の標的細胞を、１００μｌのＴｒｉｔｏｎＸと混合する。このプレートを５００ｒｐｍにて２分間遠心分離し、続いて３７℃にて５％ ＣＯ2中で４時間、インキュベートする。次いで、このプレートを再度５００ｒｐｍにて２分間遠心分離し、そして上清を回収し、そしてガンマカウンターを用いて計数する。結果は、以下の式を用いることにより算出される標的細胞の比溶解パーセントとして表される：細胞傷害性％＝アッセイの平均ｃｐｍ−自然放出からのｃｐｍ／ＴｒｉｔｏｎＸで溶解させた標的からのｃｐｍ−自然放出からのｃｐｍ×１００。
【００５４】
（アッセイ２：抗原特異的サイトカイン放出細胞傷害性アッセイ）
血清由来の抗原特異的感作Ｂリンパ球もしくはＴリンパ球、または器官特異的Ｔ細胞は、標的細胞として役立ち得る。血清由来の抗原特異的寛容化Ｂリンパ球もしくはＴリンパ球、または器官特異的Ｔ細胞は、エフェクター細胞として役立ち得る。これらの２つのＴリンパ球の亜集団を、専門抗原提示細胞（樹状細胞またはマクロファージ）とともに、および標的抗原とともにインキュベートする。ＴｈＩ（例えば、ＩＦＮγ）またはＴｈ２（例えば、ＩＬ４、ＩＬ１０）のサイトカイン放出を、ＲＴ−ＰＣＲにより、またはＥＬＩＳＡ試験により、上清において測定する。サイトカインを介するＴ細胞誘導を用いて、サイトカイン放出を増大させ得る。
【００５５】
（アッセイ３：寛容化活性の存在の尺度としての免疫細胞により産生される特異的抗体の量の低減の測定）
これらの細胞は、免疫媒介病因を管理するための治療試薬として用いられ得る。これらの抗原特異的Ｔｓ細胞は、寛容の逆養子移入（ｒｅｖｅｒｓｅ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｒａｎｓｆｅｒ）のために用いられ得る。これらの手順は、自己免疫の性質の多数の状態を管理するための非侵襲性および無毒性のプロトコルの開発を導き得る。
【００５６】
これらの手順は、自己免疫に基づく種々の疾患または状態（いくつか挙げると、Ｂ型肝炎感染、Ｃ型肝炎感染、クローン病、および移植片対宿主病を含む）を管理するための新たな治療様式を作製し得る。この協力から開発された薬学的材料は、経口薬物として製造され得る。寛容化細胞の免疫プログラミングの場合、この材料は、特異的Ｔｓ細胞またはさらに特異的Ｔｓ細胞を含む同種異系もしくは異種の細胞（ｃｅｆｌ）を含む自己細胞の注入として送達され得る。
【００５７】
このクラスの細胞は、寛容化するように試みられる被検体の身体の外部において産生され得、そして悪影響を最小限にしながら、寛容を誘導するために被検体の身体に戻して注入（おそらく精製の後）され得る。Ｔｓ細胞の特定の（またはより一般的でさえある）サブ集団の「訓練」は、代用の動物中でインビボで、または培養物中でインビトロの両方で行われ得る。これらのＴｓ細胞が動物中で訓練または産生される場合、これらＴｓ細胞は、適切なＳＣＩＤマウスか、または他の動物（おそらくは、マウスにおいて寛容の誘導に必須であることが示されているヒト肝臓細胞を用いて）において訓練され得る。これらＴｓ細胞は、免疫切除された動物中で訓練され得、そしてその細胞は、細胞機能を維持するが、分裂しない。代理宿主動物は、齧歯類、あるいは遺伝的にか、または誘導されたかのＳＣＩＤ状態を有し、そして必要に応じてヒト肝臓細胞を受容し得るいずれかの動物であり得る。例えば、訓練は、ＲＡＧ２マウスか、または全身照射されたラット中で行われ得る（２つに言及するが、これらに限定されない）。特定のＴｓ細胞が訓練され、そしておそらくインビトロまたはインビボにおいて増幅された後、この細胞は、自系に、あるいは、同種異系または異種の宿主もしくはレシピエントに戻して注入され得る。抗原特異的寛容化細胞（Ｔｓ）の選択的誘導および拡大のためにインビボに存在する環境に匹敵するインビトロ環境において、特異的なまたはより一般的なＴｓ細胞を訓練するために、訓練される細胞、細胞を含有する組織または器官は、Ｔｓ細胞の産生を促進する条件下で抗原提示細胞と混合されなければならない。例えば、インビトロにおいて訓練する場合、これらは、リンパ節由来、または骨髄由来、または胸腺・肝臓由来、あるいはこれら３つの供給源または他の供給源の組み合わせ由来の支質細胞の存在下あるいは非存在下で、混合されたリンパ球反応において、訓練され得る。
【００５８】
これら手順のいずれか（インビトロまたはインビボにおける特異的Ｔｓ細胞または一般的なＴｓ細胞の訓練または再教育）は、自己免疫の性質の大多数の状態を管理する、非侵襲性および非毒性のプロトコールの開発をもたらす。これらの細胞は、免疫媒介性病因の管理のための治療的試薬として使用される。この手順は、天然における体液性免疫を含む免疫応答、アレルギー性応答、および細胞性免疫を含む免疫応答の所望されない効果を最小化することが求められる、自己免疫状態および他の状態の管理に適切である。
【００５９】
本発明の他の実施態様および局面は、移殖に関連した以下の記載を含む。
【００６０】
レシピエント被検体中に細胞、組織、器官またはその成分を移植する工程；および１つ以上のネイティブまたは非ネイティブの抗原あるいはネイティブ抗原または非ネイティブ抗原の混合物に対して、レシピエント移殖被検体において、選択的な免疫のダウンレギュレーションを確立する工程を包含する、レシピエント被検体中の免疫拒絶を予防するか減少するための移殖プロセス。そのようなネイティブまたは非ネイティブ抗原は、造血細胞を含み得る。そのような造血細胞は、幹細胞、Ｔ細胞、リンパ球、骨髄細胞、ＣＤ３４＋およびＣＤ４５＋、またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。上記のＴ細胞は、ＮＫ細胞またはＮＫ．１抗原を発現する細胞を含み得る。
【００６１】
ネイティブまたは非ネイティブ抗原は、上記のレシピエント移殖被検体またはドナー、あるいはその両方に由来し得る。非ネイティブ抗原は、異種または同種異系であり得る。ネイティブの抗原は、レシピエント移殖被検体の幹細胞、Ｔ細胞、およびレシピエント抗原を発現する組織、またはこれらの任意の組み合わせから選択されるメンバーを含み得る。非ネイティブ抗原に関して、これらはドナー由来の幹細胞またはＴ細胞を含み得る。
【００６２】
移殖プロセスにおいて、移殖工程は、骨髄移植を包含し得る。レシピエント移殖被検体中におけるＳＩＤＲの確立は、骨髄移殖または固形器官移殖の結果であり得る対宿主性移植片（ＧＶＨ）拒絶を予防または減少し得る。
【００６３】
レシピエント移殖被検体、あるいは細胞、組織もしくは器官またはそれらの組み合わせがそこから移殖されるドナー、あるいはその両者は、さらに１つ以上の免疫調節処置に供され得る。そのような免疫調節処置は、放射、化学剤、および生物学的因子、またはそれらの任意の組み合わせからからなる群から選択される手段によって行われ得る除去を含み得る。ＳＩＤＲ確立工程は、除去前、除去後、または除去の間に行われ得る。
【００６４】
上記の生物学的因子は、サイトカインおよび抗体、またはその両者からなる群から選択される。免疫調節処置は、単回投与量、または反復する単回投与量として行われ得る。
【００６５】
ネイティブまたは非ネイティブの抗原は、天然抗原、合成抗原、改変抗原、非改変抗原、全体としての抗原、および抗原フラグメントまたはこれらの組み合わせからなる群から選択され得る。ネイティブ抗原または非ネイティブ抗原の群は、組織適合性決定基を含み得る。そのような組織適合性決定基は、順にＭＨＣ決定基ＩまたはＩＩ、あるいは両方を含み得る。ネイティブまたは非ネイティブ抗原はまた、タンパク質、糖タンパク質、酵素、抗体、組織適合性決定基、リガンド、レセプター、ホルモン、サイトカイン、細胞膜、細胞成分、ウイルス、ウイルス成分、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、細胞全体、組織および器官からなる群から選択される。組織適合性決定基は、上記のＭＨＣ決定基ＩまたはＩＩあるいはその両方である。
【００６６】
また、看過されるべきでないものとして、被検体における感染性因子に対する所望されない免疫学的効果を予防または減少するためのプロセスにおける、本発明の使用がある。これは、感染因子またはネイティブ抗原、あるいはその両方の、成分または複数の成分またはフラグメントのいずれかに対する被検体における免疫調節の選択的ダウンレギュレーションの確立を包含する。所望されない免疫学的効果は、所望されない抗体の産生、細胞媒介性免疫反応、自己免疫、炎症性反応、リガンドレセプター結合、サイトカイン産生およびアポトーシス、またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択され得る。所望されない免疫効果は、肝炎およびＨＩＶからなる群から選択されるメンバーによって生じ得る。さらに、所望されない免疫学的効果は、ＨＣＶ−およびＨＢＶ−関連クリオグロブリン血症、ＨＣＶ−、ＨＢＶ−およびＨＩＶ−関連自己免疫障害、ＨＢＶ−およびＨＣＶ−関連非肝臓標的器官損傷からなる群から選択され得る。
【００６７】
上記の成分または複数の成分またはフラグメントは、天然、合成、または免疫学的等価物であり得る。上記の移殖プロセスはさらに、サイトカイン、サイトカインに対する抗体、アポトーシス因子、抗感染因子、またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される任意のメンバーを用いて被検体を処置する工程を包含し得る。
【００６８】
ただいま上記に記載した移殖プロセスにおいて、被検体レシピエントは、１つ以上の特異的抗原に対して確立されたＳＩＤＲの結果として、バイスタンダー効果を示し得る。そのようなバイスタンダー効果は、場合によって、所望されてもされなくてもよい。
【００６９】
以下の実施例は、本発明の種々の局面を説明するために提供される。この包含は、いかなる意味においても、いかなる方法によっても、特許請求の範囲によってより具体的に規定される本発明の範囲を限定することを意図しない。
【実施例】
【００７０】
（好ましい実施態様の説明）
以下の実施例は、本発明の種々の局面、および本発明の価値の指標である。
【００７１】
（実施例１；対宿主性移植片病での経口寛容誘導の効果）
レシピエント抗原または免疫学的等価物を用いるドナーの経口寛容化は、レシピエント中に移殖された場合に、ドナー免疫細胞からの慢性対宿主性移植片病（ｃＧＶＨＤ）応答を妨げ得る。
【００７２】
（材料および方法）
動物：ドナーマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から得た１２週齢の雌Ｂ１０．Ｄ２マウス（Ｈ−２d、ｍｉｓ−ｂ）であった。レシピエントは、ＢＡＬＢ／ｃマウス（同様にＨ−２d、ｍｉｓ−ｂ）であった。マウスを、Ｈａｄａｓｓａｈ−Ｈｅｂｒｅｗ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ ＳｃｈｏｏｌのＡｎｉｍａｌ Ｃｏｒｅにおいて、１２時間の明／暗サイクルで飼育した。全ての動物実験は、Ｈｅｂｒｅｗ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ−Ｈａｄａｓｓａｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓの認証を得た。照射および脾細胞移殖に続き、マウスを層流アイソレーターに維持した。全ての動物に、定期的な実験固形飼料および適宜の飲料水を与えた。
【００７３】
レシピエントの脾細胞の調製およびドナーへの投与：脾臓をＢＡＬＢ／ｃおよびＢ１０．Ｄ２マウスから摘出し、そして脾細胞を機械的にホモジナイズした。４０μｍナイロン細胞ろ過器を通して濾過した後、残りのインタクトな細胞を遠心沈殿して、除去した。タンパク質をＢｉｏｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎアッセイ試薬を使用して測定した。ドナーＢ１０．Ｄ２マウスに、一日おきに（計５用量）、給餌カニューレを用いて５０μｇのタンパク質を含有するホモジネートした脾細胞タンパク質の給餌をした。使用した脾細胞の用量を、他者および本発明者らによって行われた初期の投与実験によって決定した（Ｉｌａｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９７；９９：１０８〜１１０６、Ｓａｙｅｇｈら、１９９２；５３：１６３〜１６６、Ｓａｙｅｇｈら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９９６；８９：７７６２〜７７６８）。５０μｇの用量が、低用量経口寛容範囲内であることが見出された。
【００７４】
脾細胞ドナーおよびレシピエント群：各１０匹の動物からなるマウスの２つの群を脾細胞ドナーとして使用した。経口寛容化群（群Ａ’）において、Ｂ１０．Ｄ２ドナーマウスを、レシピエント系統ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾細胞のホモジネートで給餌した。これらのマウス由来の脾臓細胞を群Ａ ＢＡＬＢ／ｃレシピエントマウス（ｎ＝１０）中に移殖した。コントロール群（群Ｂ’）は、同系Ｂ１０．Ｄ２マウス脾細胞から調製されたホモジネートを給餌したドナーＢ１０．Ｄ２マウスからなり、そして群Ｂ ＢＡＬＢ／ｃレシピエント（ｎ＝１０）についての脾臓細胞ドナーとして役立てた。
【００７５】
脾細胞移殖：慢性対宿主性移植片病（ｃＧＶＨＤ）を誘導するために、Ｂ１０．Ｄ２マウス由来の２．５×１０7の脾臓細胞を、移殖前に60Ｃｏの全身照射（６Ｇｙ）を受けた１０匹のＢＡＬＢ／ｃレシピエントマウスの静脈内に注入した（Ｊａｆｆｅ Ｂ．Ｄ．およびＣｌａｍａｎ Ｈ．Ｎ．、Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８５；９４：７３〜８４）。
【００７６】
一方向混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイによるドナーマウス中に誘導された寛容の評価：ドナーＢ１０．Ｄ２マウスにおける、レシピエントマウスの副組織適合性抗原に対する寛容の誘導を、一方向混合リンパ球反応（ＭＬＲ）試験（Ｄｅｖａｎｄｅｒら：Ｒｏｓｅ ＮＲ、Ｆｒｉｅｄｍａｎ Ｈ、Ｆａｈｅｙ ＪＬ、編、Ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、３版、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １９８８：８４７〜８５２、Ｂｉｓｈａｒａら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ １９９４；５７：１４７４〜１４７９）によって評価した。一方向ＭＬＲ試験を、Ｂ１０．Ｄ２脾細胞対ＢＡＬＢ／ｃ脾細胞において行った。Ｂ１０．Ｄ２に応答して、脾細胞（１×１０6）を平底マイクロウェルプレート（Ｓｔｅｒｌｌｉｎ、カタログ番号、Ｍ２９ＡＲＴＬ）中で、照射（３０Ｇｙ）したＢＡＬＢ／ｃ脾臓細胞（１×１０6）と共に、１００μｇ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ−グルタミンを補充し、５×１０-5 ２Ｍ−ＭＥおよびマウス脾細胞に吸着させた１０％熱非働化ヒトＡＢ血清を有する総容量０．２ｍｌのＲＰＭＩ １６４０培養培地中で培養した。この血清の組み合わせは、強力な一次および二次同種異系応答を生じ、そして低い非特異的なバックグラウンドを生じる。３７℃加湿５％ＣＯ2インキュベーター中での７２時間の後、１ｍＣｉの3Ｈ ＴｄＲ（５ Ｃｉ／ｎｍｏｌ、Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｎｅｇａｖ、Ｉｓｒａｅｌ）を各ウェルに添加した。細胞を、マルチプルサンプルハーベスター（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ Ｃｅｌｌ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ ５３０；Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＭｃＣｌｅａｎ、ＶＡ、２２１０２）を使用して、１６〜１８時間後に紙のろ紙上に回収し、そして放射活性を液体シンチレーションカウンター中で決定した。寛容および非寛容Ｂ１０．Ｄ２脾細胞のそれら自身に対して生じるバックグラウウンドを、差し引いた。
【００７７】
慢性対宿主性移植片病（ｃＧＶＨＤ）の評価：慢性対宿主性移植片病の評価を、以下のパラメーターを使用して脾細胞の移植の６２日後に行った：全体重および脾臓重量、α１（Ｉ）型コラーゲンの遺伝子発現、ならびに肝臓および小腸の炎症応答。
【００７８】
体重および脾臓重量：体重を、研究を通じて、毎週記録した。脾臓を、研究の終了時に、計量した。
【００７９】
コラーゲンｍＲＮＡの皮膚含量のインサイチュハイブリダイゼーション：両方の群のマウスを脾細胞移殖の６２日後に屠殺した。皮膚生検を、耳より得て、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に採集した。生検の標本をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド中で、４℃で、一晩固定化した。連続する５μｍ切片を、等級エタノール中でサンプルを脱水した後に調製し、クロロホルム中で明澄化し、Ｐａｒａｐｌａｓｔ中に包埋した。ハイブリダイゼーションのために、切片をキシレン中で脱パラフィン化し、等級エタノール中で再水和し、５分間蒸留水でリンスし、そして２×ＳＳＣ中で７０℃、３０分間インキュベートした。切片を再度蒸留水中でリンスし、そしてプロテイナーゼＫ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ エチレンジアミン四酢酸、ｐＨ ７．５中に１０μｇ／ｍｌ）で１０分間処理した。消化の後、切片を０．２％グリシンでブロックし、蒸留水でリンスし、等級エタノールで迅速に脱水し、数時間風乾し、そしてＰＢＳ中の１０％ホルマリンで後の固定（ｐｏｓｔ−ｆｉｘ）をした。皮膚切片を、プラスミド（ｐＵＣ１８）から１６００ｂｐの挿入物を切り出し、ｐＳａｆｙｒｅ（Ｂ．Ｅ．Ｋｒｅａｍ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｎｎｅｔｉｃｕｔ、ＣＴ、ＵＳＡからの寛大な贈与物）中に挿入することにより生成した、ジゴキシゲニン標識したα１（Ｉ）型コラーゲンのプローブとハイブリダイズさせた。Ｇａｒｓｃｏｎ−Ｂａｒｒｅら、Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、１９８９；３７：３７７〜８１、Ｐｉｎｅｓら、Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ．１９９８；１４：７６５〜８１、Ｐｉｎｅｓら、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ １９９７；２７：３９１〜３９８）。
【００８０】
慢性対宿主性移植片病（ｃＧＶＨＤ）の組織学的変化の等級付け：マウスを、脾細胞移植の６２日後に屠殺した。肝臓および腸の炎症の程度の評価のために、組織を両群の全てのマウスから取り出し、１０％ホルムアルデヒド中に維持した。各マウスからの５つの組織切片を、パラフィンに包埋し、切片化し、そして標準的な手順によって、ヘマトキシリン−エオシンを用いて染色した。以前に記載されたように、肝臓と小腸のコード化された顕微鏡切片の炎症の程度を、実験条件を知らない２人の経験のある病理学者によって、半定量的に０から４に等級付けした。
【００８１】
（ａ）肝臓切片を、Ｈｏｗｅｌｌら（Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ １９９５；１６：１３９〜１４５）およびＨｏｗｅｌｌら（Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９２；１４０：５４〜６６）に記載される標準的なスコア付け判定基準に従って、等級付けした。手短には；等級０：正常または３０％未満の門脈炎症（炎症性細胞によって拡張される門脈道の割合に基づく）および正常の胆管上皮；等級１：３０〜４０％の門脈炎症および正常の胆管上皮；等級２：４０〜６０％の門脈炎症および異常な胆管上皮形態；等級３：６０〜８０％の門脈炎症および胆管のリンパ球浸潤；および等級４：８０〜１００％の門脈炎症、および胆管細胞の死滅または胆管の破損。
【００８２】
（ｂ）小腸の標本を、以下の尺度で等級付けした；等級０：正常の小腸粘膜；等級１：正常な量の粘膜細胞を有する絨毛細胞構築の中程度の変形、陰窩過形成の証拠をともなう陰窩の基底中の時折のアポトーシス細胞；等級２：絨毛細胞構築の部分的消失または平滑化、粘膜細胞枯渇、管腔内の上皮細胞の脱落、著しいアポトーシスおよび陰窩過形成および固有層内への単核細胞の浸潤および腺窩炎；等級３：等級２に加えて斑状かまたは全体的な粘膜の壊死または潰瘍化（Ｗｏｏｄｒｕｆｆら、Ｔｒａｎｓ Ｐｒｏｃ．１９７６；８：６７５〜６８４、Ｈｏｗｅｌｌら、１９９５、前掲）。
【００８３】
血清サイトカインレベル：プロ炎症性および抗炎症性サイトカインのバランスに対する経口寛容の効果の評価のために、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ２、およびＩＬ１０血清レベルを、以前に記載されたように（Ｂａｒａｋら、１９９５；１７：１６９〜１７３、Ｎａｇｌｅｒら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ １９９５；６０：９４３〜９４８）製造業者の指示に従い、高感度ＲＩＡまたは酵素免疫アッセイ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、ＵＳＡ）によって測定した。これらのキットは、アルカリホスファターゼ反応産物が発色レポーター系の形成の補酵素として役立つ増幅系を使用する。第２の酵素系は、アルコールデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼ（増幅剤）からなる。血清サイトカインレベルを、脾細胞移植の１４日後、各群からの５匹のマウスにおいて測定した。
【００８４】
統計学的分析：結果を、サイトカインアッセイについてスチューデントｔ検定により、そして組織学的等級付けについてＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙランク合計試験により、分析した。
【００８５】
（結果）
レシピエント脾細胞に対するドナー脾細胞のＭＬＲ応答：レシピエントＢＡＬＢ／ｃ脾細胞抗原に対するドナーＢ１０．Ｄ２マウスにおける寛容の誘導を、一方向ＭＬＲ試験によって測定した。図１に示すように、寛容化されたＢ１０．Ｄ２マウス由来の脾細胞への応答は、非寛容化Ｂ１０．Ｄ２マウス由来の脾細胞への応答（２３，７３２＋２３７６ｃｐｍ、ｎ＝３、ｐ＜０．００５）と比較して、ＢＡＬＢ／ｃ標的脾細胞に対するＭＬＲ応答における顕著な減少を示した（８６４８＋１１４２ｃｐｍ、ｎ＝３）。
【００８６】
脾細胞ドナーの経口寛容化による慢性対宿主性移植片病（ｃＧＶＨＤ）の予防：
ａ．体重および脾臓重量：脾細胞移殖の２１日後に、総体重は、群Ｂレシピエント（非寛容化コントロール由来の細胞を受容）におけるよりも、群Ａマウス（寛容化ドナー由来の脾細胞を受容）において有意に重かった（１８．３５＋１．１１対１５．６８＋０．９８ｇ、ｎ＝１０、ｐ＜０．０５）。しかし、６２日目の研究の終了時において、いずれの群においても、体重の有意な差異はなかった（データをしめさず）。脾臓重量もまた、研究の終了時において、統計学的に差異がなかった（０．０５８＋０．００９９対０．４５６＋０．０１４ｇ、それぞれ、寛容化および非寛容化脾細胞のレシピエントにおいて、ｎ＝１０）。
【００８７】
ｂ．脾細胞レシピエントにおけるα１（Ｉ）型コラーゲン遺伝子発現：レシピエント脾細胞ホモジネートに対して経口寛容化されたドナー由来の脾細胞のレシピエント（群Ａ）は、非寛容化コントロールドナー由来の脾細胞のマウスレシピエント（群Ｂ）よりも少ない、肉眼で見える皮膚の肥厚化を維持した。皮膚のα１（Ｉ）型コラーゲンｍＲＮＡ含量を、皮膚の切片とマウスのα１（Ｉ）型コラーゲンプローブとのインサイチュハイブリダイゼーションによって測定した（脾細胞移殖の６２日後）。寛容化ドナー由来の脾細胞を移殖されたマウスは、非寛容ドナー由来の細胞を受容したマウスよりも、非常に少ないα１（Ｉ）型コラーゲン遺伝子発現を示した（図２、パネルＡおよびＢ）。
【００８８】
ｃ．脾細胞ドナーの経口寛容化による慢性対宿主性移植片病（ｃＧＶＨＤ）関連肝疾患の予防：非寛容化ドナー由来の脾細胞の移殖の６２日後に行ったレシピエントの肝臓生検（群Ｂ）は、重篤な門脈炎症および胆管の破壊を示した。対照的に、寛容化ドナー由来の脾細胞のレシピエント（群Ａ）は、４／１０のマウスにおいて正常な肝臓組織学を示した。群Ａの他の６匹のマウスは、軽度〜中程度の門脈炎症、リンパ球浸潤および／または肝臓内胆管の破損を示した。ｃＧＶＨＤにおける肝臓および胆管の関与についての標準的なスコアの等級付けを用いて、コントロール群Ｂにおける２．２５＋０．５と比較して、群Ａレシピエントは、合計スコア０．２＋０．０５を達成した（ｎ＝１０、ｐ＜０．００５）。
【００８９】
ｄ．ドナーの経口寛容化による小腸ｃＧＶＨＤの軽減：非寛容化ドナー由来の脾細胞のレシピエントにおける研究の終了時に行った小腸生検は（群Ｂ）、粘膜損傷、絨毛細胞構築の変形、粘膜細胞数の減少および陰窩過形成、固有層内への単核細胞の浸潤および腺窩炎の証拠を示した（図３Ｂ）。全ての特徴は、寛容化ドナー由来の脾細胞のマウスレシピエントにおいて、有意に寛解していた（群Ａ、図３Ａ）。ｃＧＶＨＤにおける小腸の関与についての標準的なスコアの等級付けを用いて、群Ａおよび群Ｂにおける小腸の関与の合計スコアは、それぞれ０．６＋０．０５対２．４＋０．８（ｎ＝１０、ｐ＜０．００５）であった。
【００９０】
（血清サイトカインレベル）：レシピエント系統のリンパ球への脾細胞ドナーにおいて経口寛容を誘導することにより、サイトカイン分泌パターンに顕著な変化がもたらされた。血清ＴＮＦαレベル、血清ＩＦＮγレベル、および血清ＩＬ２レベルが、寛容化されたドナーから採取された脾細胞を移植されたマウス（群Ａ）中では、寛容化されていないドナー由来の脾細胞を得た群Ｂのコントロールマウスと比較して減少した（ＴＮＦα、ＩＦＮγ、およびＩＬ２について、それぞれ、２．５＋０．８６ｐｇ／ｍｌ対１６．５＋４．８４ｐｇ／ｍｌ；１０．１＋２．６ｐｇ／ｍｌ対７５．３＋１１．３ｐｇ／ｍｌ；および２．１＋０．９ｐｇ／ｍｌ対２２．１＋５．５５ｐｇ／ｍｌ、ｐ＜０．００５、図４）。対照的に、血清ＩＬ−１０レベルが、経口寛容化されたドナー由来の脾細胞を移植されたマウスにおいて、群Ｂ由来の脾細胞のレシピエントと比較して増加した（それぞれ、１０８．５＋７．０９ｐｇ／ｍｌ対４６．５＋４．９ｐｇ／ｍｌ、ｎ＝５、ｐ＜０．００５、図４）。
【００９１】
（まとめ）
レシピエントの同種異系抗原に対するドナーの経口寛容化により、ｃＧＶＨＤの発現と関連する多数の異なるマーカーおよび症状によって示されるように、病理学的病変が改善された。レシピエントの同種異系抗原は同じ遺伝子型を共有するレシピエントとは異なる被験体由来であったが、レシピエントの同種異系抗原（ａｌｌｏｇｅｎ）をレシピエント自身から調製し得たか、または任意の免疫学的に等価な抗原を使用し得たことが理解されるべきである。寛容化が、脾細胞のみのホモジネートを摂食することにより誘導されたが、移植されたリンパ球による、ｃＧＨＶＤの３つの主要な標的器官（すなわち、皮膚、肝臓および小腸）に対する免疫攻撃は予防された。本実施例は、寛容化剤が、その寛容化剤の供給源と同一原であるかまたは同一原でないかのいずれかである細胞および器官に寛容を提供し得ることを示す。
【００９２】
（実施例２ ＧｖＨ疾患に対する経口寛容の移植後誘導）
本実施例は、すでにドナーの免疫細胞を含むレシピエントにおける、経口寛容誘導の実証に関する。レシピエントの抗原または免疫学的等価物の経口投与は、そのレシピエントへ移植されたドナーの免疫細胞における経口寛容化を誘導し得る。本発明のこの局面は、ｃＧＶＨＤを改善するための経口寛容化の使用に関して、安全性の改善および有利な生存能力を提供する。本実施例において示される手段によって、ドナーの安全性は、免疫抑制されることによって必ずしも損われない。さらに、ドナーは、移植の必要性の原因であったレシピエント中のいかなる疾患因子にもさらされない。ドナーは、意図されるレシピエントにまた偶然存在し得る疾患または病原因子にさらされない。本発明の局面は、これにより、このような疾患または病原因子がドナーへ伝染する可能性、および／あるいはこのような疾患または病原因子に対してドナー中で経口寛容を誘導することを回避する。
【００９３】
本実施例は、実施例１に前述されたように実行された。ただし、実施例１の例外として、Ｂ１０．Ｄ２ドナー脾細胞の移植後、レシピエントＢＡＬＢ／ｃマウスにＢＡＬＢ／ｃ脾細胞から抽出されたタンパク質（マウス１匹当たり５０μｇ／日）を１１日間摂食させて経口寛容を誘導した。ドナー免疫細胞における移植後寛容誘導の効果の評価を、前の実施例において記載したように実行した。Ｂ１０．Ｄ２脾細胞を移植された寛容化ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のエフェクター脾細胞の、ＢＡＬＢ／ｃ標的脾細胞（３２ｃｐｍ）に対する混合リンパ球応答において、寛容化されていないコントロール（５４６ｃｐｍ）と比較して有意な減少が存在した。経口寛容化は、ｃＧＶＨＤの肝臓の炎症および胆肝破壊および炎症性腸変化を改善した。寛容化されたレシピエントは、体重および皮下脂肪の減少を示し、そしてはるかにより少ない皮膚の肥厚およびコラーゲン沈着物を有した。コラーゲンα１（Ｉ）遺伝子発現の減少が、コラーゲンα１（Ｉ）プローブを用いたインサイチュハイブリダイゼーションにより示された。血清ＩＬ−１０レベルは、コントロールにおけるよりも寛容化されたマウスにおいて有意に高かったが、レベルは有意に減少した。
【００９４】
（実施例３ 相互寛容化）
本発明のさらなる局面は、相互寛容化を実行し得ることである。本局面において、ドナー免疫細胞をレシピエント細胞およびレシピエント器官により提示される抗原に対して寛容化することによるｃＧＶＨＤの排除に加えて、ドナー細胞またはドナー器官の存在に対するレシピエント免疫系の反応を下方調節する経口寛容の誘導が存在し得る。本発明において開示されるように、このことを、移植手順の間または前のいずれかに実行し得る。また、本発明において記載されるように、寛容化剤は、ドナー、レシピエント、ドナー細胞を有するレシピエント、前述のもののいずれかの免疫学的等価物、およびそれらの組合せに由来し得る。このことは、切除の必要性を排除するため、切除の量を減少させるため、または切断処置を誤って回避したレシピエント免疫細胞において引き起こされる、ドナー細胞に対する免疫反応を排除するために、役立ち得る。
【００９５】
（実施例４ 実験的結腸炎に対する経口寛容化の誘導効果）
本実施例は、経口寛容化を、結腸炎が誘導されると同時に使用し得るというさらなる実証である。本実施例はまた、正常なドナーならびに結腸炎のドナー由来の結腸抽出タンパク質を使用して経口寛容化を誘導し得るという実証としても役立つ。本実施例はまた、１つの種由来の結腸抽出タンパク質を使用して別の種において経口寛容を誘導し、そして結腸炎を緩和し得るという実証でもある。代替アレルゲンで経口寛容化の誘導することによって実験的結腸炎を緩和する能力は、ヒトの治療において有用である実行可能な方法論を生み出す。例えば、寛容供給源として罹患した組織を使用する必要性は、疾患誘導物質ならびに寛容化因子の転移の可能性を増加し得る。本発明における開示（寛容化タンパク質は必ずしも疾患を示すドナー由来である必要はない）により、この問題および他の潜在的問題が回避される。ヒトにおいて、寛容化剤として使用される物質の供給源として使用される種の性質もまた、倫理上の問題および道徳上の問題を持ち出すことになる。寛容化剤の供給源として異なる種を使用し得ることにより、ドナーが異種であり、それによりこのような問題を回避することが可能になる。同種異系由来の寛容化剤もまた、その薬剤中に存在する病原体または病原体のエピトープが存在し得、経口寛容化剤の投与もまたこの病原体の存在に対する寛容を導くという、内在的危険を有する。このことは、この寛容化剤中に生存可能な病原体が存在する場合、またはレシピエント中に生存可能な病原体が存在する場合に、寛容化時に疾患状態を誘発し得る。寛容化誘導時に生存可能な病原体が存在しない場合に、なお以下のような可能性が存在する。それは、病原体に対する誤った寛容化が、レシピエントが後の時点で病原体にさらされる場合に、疾患過程の誘導を可能にし得ることである。異種供給源または免疫学的に等価な供給源のいずれかを寛容化剤として使用し得ることにより、この事象の可能性を減少させるかまたは排除するかのいずれかが可能である。これらの考察が本発明の他の局面に対して同等に適用可能であることも理解される。
【００９６】
（材料および方法）
（動物）：正常な近交系ＢＡＬＢ／ｃ雄性マウス（２〜４ヶ月）をＨａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手し、そしてＨａｄａｓｓａｈ−Ｈｅｂｒｅｗ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ ＳｃｈｏｏｌのＡｎｉｍａｌ Ｃｏｒｅにて養った。マウスを、標準的実験室食で養い、そして１２時間の明／暗サイクル中に保った。全ての動物実験を、Ｈｅｂｒｅｗ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ−Ｈａｄａｓｓａｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの実験動物の保護および使用に関する指針に従って、同委員会の承認を得て実行した。
【００９７】
（結腸炎の誘導）：ＴＮＢＳ結腸炎を、Ｎｅｕｒａｔｈら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９５；１８２：１２８１〜１２９０に記載のように、１００μｌの５０％エタノール中に溶解した２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）（１ｍｇ／マウス）の直腸滴注によって誘導した。
【００９８】
（経口抗原およびバイスタンダー抗原の調製および投与）
結腸を、正常なマウス、ラット、ウサギおよびヒト検体から、またはマウス、ラット、ウサギおよびヒト検体のＴＮＢＳ誘導性結腸炎の結腸から取り出して小さな細片とし、そして機械によりホモジナイズした。４０μｍのナイロン細胞濾過器を通して濾過した後、インタクトな細胞をスピンダウンして除去した。タンパク質を、タンパク質アッセイキット（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して定量した。正常結腸抽出タンパク質（ＮＣＥＰ）および結腸炎抽出タンパク質（ＣＥＰ）を、下記の実験群に、無外傷性給餌針を使用して１日おきに１０日間（計６用量）経口投与した。ヒト結腸検体の調製のために、結腸サンプルを以前に記載されたように（Ｎｅｕｒａｔｈら、１９９５；前出）ＴＮＢＳにインビトロで曝露した。
【００９９】
（実験群）：９群のマウス（各々１０匹の動物からなる）を以下の表１に示すように研究した。
【０１００】
【表１】
全てのマウスを、研究１日目にＴＮＢＳで直腸にチャレンジした。全ての群のマウスに、結腸炎誘導日に開始して１０日間、１日おきに給餌（５０μｇ／マウス）した。群Ａ〜Ｄは、結腸炎抽出タンパク質（ＣＥＰ）を給餌されたマウスを含んだ。群Ａのマウスには、マウス由来ＣＥＰを給餌した；群Ｂのマウスには、ラットＣＥＰを給餌した；群Ｃのマウスには、ウサギＣＥＰを給餌した；そして群Ｄのマウスには、ヒトＣＥＰを給餌した。群Ｅ〜Ｈのマウスには、正常結腸抽出タンパク質（ＮＣＥＰ）を給餌した；群Ｅのマウスには、マウス由来ＮＣＥＰを給餌した；群Ｆのマウスには、ラットＮＣＥＰを給餌した；群Ｇのマウスには、ウサギＮＣＥＰを給餌した；そして群Ｈのマウスには、ヒトＮＣＥＰを給餌した。群Ｉのコントロールマウスには、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を給餌した。全ての群のマウスを、結腸炎誘導後１２日で屠殺した。
【０１０１】
（実験的結腸炎モデルにおける寛容誘導に対する代替抗原の効果の評価）：寛容誘導における代替抗原の役割を、結腸炎についての以下のパラメーターをモニタリングすることにより評価した：
（ａ）結腸炎の臨床的評価：この研究を通じて、毎日下痢を追跡した。
（ｂ）結腸炎の肉眼検査スコア：結腸炎の評価を、結腸炎誘導後１２日に標準的パラメーターを使用して１２日間行った（Ｎｅｕｒａｔｈら、１９９５前出）。４つの肉眼検査パラメーターを決定した。すなわち、結腸の潰瘍形成の程度；腸管および腹膜の癒着；壁の肥厚；および粘膜の水腫の程度。各パラメーターを、０（完全に正常）〜４（最も重篤）の尺度に、２人の老練で実験条件を知らない試験者により等級付けした。
（ｃ）組織学的病変の等級付け：炎症の組織学評価のために、遠位の結腸組織（最後の１０ｃｍ）を取り出し、そして１０％ホルムアルデヒドに固定した。次に、各マウス由来の５つのパラフィン切片を標準的技術を使用してヘマトキシリンーエオシンで染色した。結腸の顕微鏡検査用切片上の炎症の程度を０〜４（Ｎｅｕｒａｔｈら、１９９５、前出）に半定量的に等級付けした。等級０：炎症の徴候がなく正常；等級１：非常に低いレベルの白血球浸潤；等級２：低いレベルの白血球浸潤；および等級３：高い血管密度かつ腸壁肥厚を伴う高レベルの浸潤；等級４：杯細胞の損失、高い血管密度、壁肥厚、および正常な腸構造の破壊を伴う経壁浸潤。この等級付けは、２人の老練で実験条件を知らない病理学者が行った。
【０１０２】
（免疫寛容の誘導に関連する可能な指標の評価）：血清ＩＬ４レベルおよび血清ＩＦＮγレベルを、Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓキット（Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）を製造者の指示に従って使用して、「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡにより測定した。全ての実験群およびコントロール群由来の全てのマウスの血清レベルを、結腸炎誘導の１０日後に測定した。
【０１０３】
（ＮＫ１．１肝臓関連リンパ球に対する寛容誘導の効果の評価）
（ａ）肝臓リンパ球の単離：下大静脈を横隔膜の上で切断し、そして肝臓を、青白くなるまで５ｍｌの冷たいＰＢＳでフラッシュした。結合組織および胆嚢を除去し、そして肝臓を冷たい滅菌ＰＢＳ中の１０ｍｌディッシュに配置した。肝臓をステンレスのメッシュ（サイズ６０、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を通して破砕した。細胞懸濁液を５０ｍｌチューブ中に３分間入れ、そして冷たいＰＢＳで２回洗浄し（１２５０ｒｐｍで１０分間）、そして破片を除去した。そして細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、その懸濁液をＰＢＳに浸しておいたナイロンメッシュに通した。結合しなかった細胞を回収した。細胞を４５ｍｌのＰＢＳで２回洗浄した（室温で１２５０ｒｐｍ）。肝臓リンパ球の単離のために、２０ｍｌのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ １０７７（Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を細胞の下にゆっくり注ぎ、そして５０ｍｌチューブ中で７ｍｌのＰＢＳに懸濁した。このチューブを室温で遠心分離（１６４０ｒｐｍ、１５分間）した。界面の細胞を収集し、５０ｍｌチューブ中で希釈し、そして氷冷ＰＢＳで２回洗浄した（１２５０ｒｐｍで１０分間）。約１×１０6細胞／マウス肝臓を回収した。トリパンブルー染色による生存能力は、９５％より高かった。
（ｂ）ＮＫ１．１細胞除去の決定のためのフローサイトメトリー分析：リンパ球単離直後に、２連の２〜５×１０4細胞／５００μｌ ＰＢＳを、４ｍｌの１％ ＢＳＡとともに１０分間インキュベートされたＦａｌｃｏｎ ２０５２チューブに入れ、そして１４００ｒｐｍで５分間遠心した。細胞を１：２０のＦＩＴＣ−抗マウスＮＫ１．１抗体（ＮＫＲ−Ｐ１Ｃ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ＵＳＡ）を含む１０μｌのＦＣＳ中に再懸濁し、３０分間のうち１０分ごとに混合した。細胞を１％ＢＳＡで２回洗浄し、０．５ｍｌの１％パラホルムアルデヒドを添加し、そして読み取りまで４℃に保った。コントロール群については、１％ＢＳＡを５μｌだけ添加した。分析的細胞ソーティングを、各群由来の１×１０4の細胞に対して、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳＴＡＲ ｐｌｕｓ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて実行した。生細胞のみを計数し、そして抗体処理していないリンパ球からのバックグラウンド蛍光を、得られたレベルから減じた。
（ｃ）肝臓リンパ球細胞傷害アッセイ：これらの研究で使用された標的細胞はＹＡＣ−１細胞であった。これは、補充された、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩを使用して組織培養中で連続増殖するように適合化されたリンパ腫細胞株である。ＹＡＣ−１細胞を、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩが存在する２５ｍｌフラスコ中に密度２×１０5細胞／ｍｌで播種し、そして２４時間後に収集することによって、ＮＫアッセイ用に調製した。細胞を５０ｍｌチューブ中で懸濁および収集し、そして培地で２回洗浄（１２５０ｒｐｍで１０分間）した。この手順により、51Ｃｒでの効率的な標識およびＮＫ細胞による溶解の高感受性を確実にした。標的細胞を51Ｃｒ（Ｎｅｗ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｏｓｔｏｎ ＭＡ、Ｇａｍｉｄｏｒ、Ｉｓｒａｅｌ）で標識し、そして３７℃で９０分間インキュベートした（３００μｌのＲＰＭＩ培地中２００ｍＣｉ／２×１０6細胞）。細胞を１０分ごとに手動で混合した。インキュベーション後、３ｍｌの２０％ＦＣＳ ＲＰＭＩを添加し、そして３７℃で３０分間再びインキュベートした。細胞を１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩで３回洗浄し、そして計数した。標識効率の程度を決定するため、１００μｌの細胞を計数し、そして最低で０．８ｃｐｍ／細胞を測定した。エフェクター細胞は、上記の群Ａ〜Ｈ由来の肝臓から単離された肝臓リンパ球であった。51Ｃｒ放出アッセイを、Ｃｏｓｔｅｒ ９６ウェルプレートにて実行した。段階的に数を変化させたエフェクター細胞（１００μｌ中）を、５０００の標識された標的細胞（１００μｌ中）と、エフェクター対標的比（Ｅ：Ｔ比）が２５：１で混合した。各ウェルは、総容量２００μｌ中に標的細胞およびエフェクター細胞を含んだ。各サンプル由来の５つのウェルを、各比について試験した。自然発生的放出を決定するために、同様の標的細胞数である６つのウェルを、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩとともにプレーティングした。最大の放出を決定するために、１００μｌ培地中の６ウェルの標的細胞を１００μｌのＴｒｉｔｏｎＸと混合した。このプレートを２分間遠心分離（５００ｒｐｍ）し、次いで、３７℃の５％ＣＯ2中で４時間インキュベートした。次いで、このプレートを再び２分間遠心分離し（５００ｒｐｍ）、そして上清を採取し、そしてγカウンターを使用して計測した。結果を、標的細胞の特異的溶解パーセントとして表した。これは、以下の等式を使用して算出した：細胞傷害パーセント＝（アッセイの平均ｃｐｍ−自然発生的放出由来のｃｐｍ）／（ＴｒｉｔｏｎＸで溶解された標的由来のｃｐｍ−自然発生的放出由来のｃｐｍ）×１００。
【０１０４】
（結果）
（結腸炎の臨床的評価）：下痢の顕著な減少が、マウスＣＥＰを給餌された群Ａの寛容化されたマウスで観察された。同様の有益な効果が、群Ｅのマウス由来ＮＣＥＰで処置されたマウスで観察された。対照的に、ウサギＣＥＰまたはラット結腸由来のＮＣＥＰ、ウサギ結腸由来のＮＣＥＰ、もしくはヒト結腸由来のＮＣＥＰを給餌された、それぞれ群Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈのマウス、ならびにＢＳＡを給餌されたコントロール群Ｉのマウスは、重篤な下痢に罹患した。マウスの体重の追跡調査により、群Ｉのコントロールマウスと比較して群Ａの寛容化されたマウスのうちで、統計的に有意な体重の増加が示された（それぞれ、１１．７％対５．９％、Ｐ＜０．００５、図５）。同様な有益な効果が、マウス由来ＮＣＥＰで処置された群Ｅのマウスで観察され、そしてそれらの体重は１０．６％増加した（ｐ＜０．００５）。有利な効果はまた、ラットＣＥＰおよびヒトＣＥＰを給餌されたマウスでも観察された（群ＢおよびＤについての体重の増加は、それぞれ、８．５％および８．９％）。対照的に、ウサギＣＥＰまたはラットＮＣＥＰ、ウサギＮＣＥＰ、もしくはヒトＮＣＥＰで処置された群Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈのマウスでは、全く有意な体重の増加は見られず、そしてそれらの体重は、それぞれ、５．３％、６．１％、６．０５％、および６．９％増加していた（図５）。
【０１０５】
（結腸炎の肉眼検査による等級付け）：マウス抽出の結腸炎由来タンパク質の摂食による経口寛容の誘導（群Ａ）、またはマウスの正常結腸抽出タンパク質による経口寛容の誘導（群Ｅ）は、顕著に結腸炎の肉眼検査による等級付けを軽減した。試験された結腸炎の肉眼検査用パラメーターのスコアは以下であった：結腸の潰瘍形成の程度、腸管および腹膜の癒着、壁肥厚、および粘膜の水腫の程度。肉眼検査の総スコアは、非処置のコントロール群Ｉの３．３と比べて、群ＡおよびＥのマウスで、それぞれ０．４および０．５６であった（ｐ＜０．００５、図６）。有利な効果はまた、ラット由来ＣＥＰおよびヒト由来ＣＥＰを給餌されたマウス（群ＢおよびＤ）でも観察された。それらの肉眼検査の総スコアは、それぞれ、０．８および０．７と測定された。対照的に、ウサギＣＥＰ、またはラット由来ＮＣＥＰ、ウサギ由来ＮＣＥＰ、もしくはヒト由来ＮＣＥＰを給餌された、非寛容化マウス（それぞれ、群Ｃ、Ｆ、Ｇ、およびＨ）は、重篤な結腸炎に罹患し、そしてそれらの肉眼検査の総スコアは、それぞれ、１．９、２．７５、１．８５、３．２５であった。非処置のコントロールマウスの総スコアは、３．３であった（群Ｉ、図６）。
【０１０６】
（組織学的病変の等級付け）：腸組織の組織学的評価により、非寛容化マウス（群Ｃ、Ｆ、Ｇ、およびＨ）と比較して、そしてコントロールマウス（群Ｉ）と比較して、寛容化マウス（群ＡおよびＥ）における炎症応答および粘膜の潰瘍形成の顕著な減少が示された。群ＡおよびＥのマウスにおいて、ほとんど正常な切片、すなわち最小のリンパ球浸潤のみが検出された（図７、パネルＡおよびＥ）。対照的に、重篤な炎症反応（３〜４等級）が、非寛容化マウスから採取された腸検体で観察された（図７、パネルＦ）。部分的効果が、ラット由来ＣＥＰを給餌されたマウス（群Ｂ）およびヒト由来ＣＥＰを給餌されたマウス（群Ｄ）で観察された（図７、パネルＢ）。寛容化マウス（群ＡおよびＥ）における標準的病理学的試験の結果により、スコア０．４および０．８が得られた。対して、非寛容化マウス（群Ｃ、Ｆ、Ｇ、およびＨ）については、それぞれ２．２、３．２５、２．２５、および２．７５であった（図８）。群Ｉのコントロールの非処置マウスは、肉眼検査により重篤な結腸炎を示し、病理学的スコアは３．１であった（示さず）。
【０１０７】
（血清ＩＬ４レベルおよび血清ＩＦＮγレベル）：寛容化マウスは、Ｔｈ１からＴｈ２への免疫応答サイトカイン分泌のシフトを示した。マウス由来ＣＥＰの摂食により、結腸炎誘導の１０日後に、ＩＬ４レベルの増加およびＩＦＮγ血清レベルの減少が誘導され、それぞれ、２２．４±５ｐｇ／ｍｌおよび１．２±０．７ｐｇ／ｍｌになった（コントロール群Ｉと比較した群Ａ、ｐ＜０．００５）。同様に、マウス由来ＮＣＥＰの摂食により、Ｔｈ１からＴｈ２への免疫シフトが誘導され、ＩＬ４血清レベルおよびＩＦＮγ血清レベルは、それぞれ２５．４±５．７および３．５±０．９であった（群Ｅ、ｐ＜０．００５、図９）。対照的に、非寛容化群Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈおよびコントロール群Ｉ由来のマウスは、高いＩＦＮγ血清レベルおよび低いＩＬ４血清レベルを示した（それぞれ、１７．４±３．７および３．１±０．９；２２．１±４および４．３±１．１；１８．４±３．８および２．１±０．８；１６．３±２．９および２．７±０．７；１９．５±４．２および１．９±０．４、図９）。
【０１０８】
（寛容誘導によりＮＫ１．１＋ＬＡＬ細胞傷害機能が増強された）：肝臓内リンパ球を、全ての群の処置マウスおよびコントロールマウスから単離した。分析的セルソーティングを、リンパ球単離後の各群由来の細胞に対して、ＦＩＴＣ−抗マウスＮＫ１．１抗体を使用して行った。マウス由来ＣＥＰの摂食およびマウス由来ＮＣＥＰの摂食による寛容の誘導によって、ＮＫ１．１＋ＬＡＬ細胞傷害機能が顕著に増強された（特異的溶解アッセイにより測定）。ＹＡＣ−１細胞を、これらの研究で標的細胞として、Ｅ：Ｔ比が２５：１で使用した。群ＡおよびＥの寛容化マウスから単離された肝臓リンパ球は、群Ｉの非寛容化コントロールマウスと比較して細胞傷害性の増加を示した（群ＡおよびＥ対群Ｉが、それぞれ３５．６％および４８．６％対１０．７％、ｐ＜０．００５、図１０）。同様の効果が、群ＢおよびＤ由来のマウスで観察され、ここで、細胞傷害率が、それぞれ２９．１％および２６．９％と測定された。対照的に、群Ｃ、Ｆ、Ｇ、およびＨ由来の非寛容化マウスは、有意により低いＮＫ１．１＋ＬＡＬ細胞傷害率を示した（それぞれ、１７．６％、１８．８％、２２．１％、および１１．９％、図１０）。直腸へのＴＮＢＳ滴注は、細胞傷害アッセイに対して何の効果を有さなかった（群Ｉ、１０．７％）。
【０１０９】
（実施例５：経口寛容の大腸炎後の誘導）
経口寛容化が、大腸炎が被験体において確立された後でさえも、大腸炎の症状を制御するために使用され得ることをさらに実証した。本実施例を、以下を除いて、先の実施例に記載された同じ手順を使用して行った。
【０１１０】
実験群：各々１０の動物からなる、マウスの６つの群を研究した（表１）。全てのマウスを、本研究の第１日目に直腸のＴＮＢＳでチャレンジした。Ａ、Ｂ、およびＥ群のマウスに、大腸炎を誘導した日から始めの１０日間、隔日で給餌させた。確立された実験的大腸炎に対する寛容誘導の効果の評価のために、Ｃ、Ｄ、およびＦ群のマウスに対する、類似の用量での給餌を、大腸炎の誘導後７日目に開始した。ＡおよびＣ群のマウスに、大腸炎抽出タンパク質（ＣＥＰ）を給餌した。寛容誘導に対する代理の抗原の効果を評価するために、ＢおよびＤ群のマウスに、正常結腸抽出タンパク質（ＮＣＥＰ）を給餌した。コントロールのＥおよびＦ群のマウスに、類似の用量のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を給餌した。全ての群のマウスを、大腸炎誘導後２１日目に屠殺した。
【０１１１】
経口寛容誘導の効果の評価を、先の実施例に記載のように行った。
【０１１２】
（結果）
大腸炎の臨床評価：マウスＣＥＰを給餌させたＡ群由来の寛容化マウスにおいて、顕著な下痢の減少が観察された。同様の有利な効果が、Ｂ群のマウス由来ＮＣＥＰで処置したマウス（それらは、１日目に給餌を開始した）において観察された。部分的に有利な効果が、寛容を確立された大腸炎の存在下で誘導したマウス（ＣおよびＤ群）において観察された。対照的に、ＢＳＡを給餌させたコントロールのＥおよびＦ群のマウスは、重篤な下痢を罹患した。マウス体重の経過観察により、Ｅ群のコントロールマウスと比較して、Ａ群の寛容化マウスの間で、体重の統計的に有意な増加が明らかになった（それぞれ、４．２％ 対 １１．７％、ｐ＜０．００５）。同様の有利な効果が、マウス由来ＮＣＥＰで処置したＢ群由来のマウスにおいて観察され、そしてそれらの体重は、８．９％増加した（ｐ＜０．００５）。有利な効果はまた、大腸炎の誘導後７日目に、ＣＥＰおよびＮＣＥＰでの給餌を開始させたマウスにおいても観察された（ＣおよびＤ群についての体重において、それぞれ９．３％および７．２％の増加）。対照的に、ＢＳＡで処置したマウスにおいては、体重の有意な増加が示されなかった。それらの体重は、ＥおよびＦ群のマウスについて、それぞれ４．２％および４．１％増加した。
【０１１３】
大腸炎の肉眼的分類：マウスから抽出された大腸炎由来タンパク質の給餌による経口寛容の誘導（Ａ群）、またはマウス正常結腸から抽出されたタンパク質での経口寛容の誘導（Ｂ群）は、大腸炎の肉眼的分類を顕著に緩和した。試験した大腸炎の肉眼的パラメーターについてのスコアは：結腸の潰瘍化の程度、腸と腹膜の癒着、壁の厚さ、および粘膜水腫の程度であった。全肉眼的スコアは、ＡおよびＢ群のマウスでそれぞれ、０．４および０．７を測定したのに対して、ＥおよびＦ群の非処置のコントロールにおいては、３．３および３．１であった（ｐ＜０．００５）。有利な効果はまた、大腸炎の誘導後７日目に、ＣＥＰでの給餌を開始したマウス（Ｃ群）においても観察された。それらの全肉眼的スコアは、１．２を測定した。部分的に有利な効果は、大腸炎の誘導後７日目に、ＮＣＥＰでの給餌を開始したマウスにおいて示され、そしてそれらのスコアは１．９であった。
【０１１４】
組織学的病変の分類：腸組織の組織学的評価により、ＥおよびＦ群の非寛容化コントロールマウスと比較して、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ群の寛容化マウスにおける炎症性応答および粘膜潰瘍化の顕著な減少が示された。ＡおよびＢ群のマウスにおいて、ほとんど正常な切片が検出されるか、またはごくわずかなリンパ球の浸潤が検出されるだけであった。対照的に、重篤な炎症性反応（グレード３〜４）が、非寛容化コントロールマウスから採取された腸の試料において観察された。部分的な効果が、大腸炎の誘導後７日目に、ＣＥＰまたはＮＣＥＰでの給餌を開始した、ＣおよびＤ群のマウスにおいて観察された。Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ群由来の寛容化マウスにおける標準的な病理学的試験の結果は、それぞれ、０．４、１．２、１．４および１．９５のスコアを示した。ＥおよびＦ群におけるコントロールの非処置マウスは、重篤な肉眼的な大腸炎を示し、病理学的スコアはそれぞれ、３．１および３．２５であった。
【０１１５】
血清ＩＬ４、およびＩＦＮγレベル：寛容化マウスは、Ｔｈ１からＴｈ２免疫応答サイトカイン分泌への変化を示した。マウス由来ＣＥＰの給餌は、大腸炎誘導後１０日で、ＩＬ４レベルの増加およびＩＦＮγの血清レベルの減少を誘導した（それぞれ、２２．４±５ｐｇ／ｍｌへおよび１．２±０．７ｐｇ／ｍｌへ）（Ａ群、コントロールのＥ群と比較して、ｐ＜０．００５）。同様に、マウス由来ＮＣＥＰの給餌は、Ｔｈ１からＴｈ２への免疫変化を誘導し、ＩＬ４およびＩＦＮγの血清レベルは、それぞれ、１８．４±１．９および２．４±０．９であった（Ｂ群、ｐ＜０．００５）。ＣＥＰまたはＮＣＥＰを給餌した、既存の疾患の存在下で寛容化された初回刺激を受けたマウスは、同様のサイトカイン系列を示し、そしてそれらのＩＬ４レベルは、１６．４±２．９および１０．３±１．１に増加したが、ＩＦＮγ血清レベルは、６．３±０．９および７．３±１．１を測定した（それぞれ、ＣおよびＤ群）、対照的に、非寛容化コントロールのＥおよびＦ群由来のマウスは、高いＩＦＮγおよび低いＩＬ４の血清レベルを示した（それぞれ、１８．４±２．７および１．９±０．３；ならびに２２．１±１および２．１±０．５）
（実施例６ マウスにおけるＨＢＶ抗原に対する経口寛容化の誘導）
本発明の局面の１つは、病原体による感染に関連する二次的発症の誘導を抑止するための、ＳＩＤＲおよび／またはＧＩＳの適用である。これらの発症は、病原体の複製プロセスに直接的に関係しないという点で、その感染に対して二次的であると定義される。このような二次的発症の例示的な例は、細胞傷害性、誘導性自己免疫およびアポトーシスのような病理学的プロセスである。二次的発症がすでに存在している被験体において、本発明は、疾患症状のさらなる進行の防止または低減を導く。
【０１１６】
本発明の１つの局面において、ＳＩＤＲまたはＧＩＤＳ、あるいはそれらの任意の組み合わせを、病原体による感染の結果である所望しない免疫応答を軽減するために被験体に使用する。本開示は、本発明がＨＢＶ感染に関連する肝臓の損傷の予防および／または処置のための治療的アプローチとして有する、有用性を記載する。他の病原体の例としては、ＨＣＶ、ＣＭＶ、レトロウイルス（例えば、ＨＩＶ）および細菌（例えば、Ｓｔｒｅｐｏｔｏｍｙｃｅｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、およびＣｈｌａｍｙｄｉａ）が挙げられる。これらの病原体による感染は、自己免疫機能障害に由来し得る疾患に関与する。これらの疾患としては、肝炎、ＡＩＤＳ、アテローム性動脈硬化症、アテローム、血栓症、冠状動脈疾患および心筋梗塞が挙げられ得る（Ｍａｈｔａら、Ｊ．Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ １９９８；３１：１２１７−１２２５、ＧｕｒｆｉｎｋａｌおよびＢｏｚｏｖｉｃｈ、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １９９８；１４０ Ｓｕｐｐｌ １：５３１−３５、Ｏｓｓｅｌ−Ｇｅｒｎｉｎｇら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ １９９７；３５：１２０−１２４、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ １９９８；３２：３５−４１、Ｂｉａｓｕｃｃｌら、１９９９；９９：８５５−８６０）。
【０１１７】
以下の実施例は、ＨＢＶ抗原に対する免疫寛容を誘導することが可能であること、および経口寛容が、ＨＢＶ抗原に対する既存の免疫応答のダウンレギュレーションに使用され得ることの実証である。
【０１１８】
（材料および方法）
動物：正常な同系の、雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（２５〜３０グラム）を、Ｈａｄａｓｓａｈ−Ｈｅｂｒａｗ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ ＳｃｈｏｏｌのＡｎｉｍａｌ Ｃｏｒｅから得た。マウスを標準的な実験用固形飼料上で維持し、１２時間の明／暗のサイクルで飼育した。全ての動物実験は、Ｈｅｂｒａｗ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ−Ｈａｄａｓｓａｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｅｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓのガイドラインに従って、委員会の承諾を得て行った。
【０１１９】
抗ＨＢＶ免疫応答の誘導：ＢｉｏＨｅｐＢ組換えＢ型肝炎ワクチン（ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｅｎｅｒａｌ ＬＴＤ、Ｉｓｒａｅｌ）（Ｂ型肝炎ウイルスの３つの表面抗原：ＨＢｓＡｇ、ＰｒｅＳ１、およびｐｒｅＳ２を含む）を、抗ＨＢＶ免疫応答の誘導のために使用した（Ｓｈｏｕｖａｌら、Ｖａｃｃｉｎｅ １９９４；１２：１４５３−１４５９）。このワクチンは、他のワクチンに比べて免疫原性を改善することが以前に示されており、そして高いセロコンバージョンレベルおよび高い抗体力価（同書）を誘導することから、このワクチンを選択した。本発明者らは、効果的な抗ウイルス免疫応答の誘導のために必要とされる、最適なワクチン用量を試験した。それぞれ１０匹の動物からなるマウスの３つの群を研究した。それぞれの群のマウスに、３つの用量のＢｉｏＨｓｐＢワクチン：０．２、０．４、または０．８ｍｃｇのうちの１つを、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。ワクチン接種後３０日に、血清抗ＨＢｓ抗体の力価についてマウスを追跡した。
【０１２０】
ＨＢＶ抗原に対する経口寛容の誘導：組換え調製したＨＢｓＡｇ、およびＰｒｅＳ１、およびＰｒｅＳ２抗原（ＢｉｏＨｅｐＢ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｅｎｅｒａｌ ＬＴＤ、Ｉｓｒａｅｌ）を、本発明の末梢免疫寛容の誘導のための標的抗原として使用した。末梢寛容を、１ｍｃｇ／給餌の低用量のＨＢＶ抗原（ＢｉｏＨｅｐＢ）を、給餌用の非外傷性の針を使用して、１０日間の隔日での経口投与（計５用量）により誘導した。コントロールの群に、同用量のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を給餌させた。
【０１２１】
実験群：それぞれ１０匹の動物からなるマウスの８つの群を、以下の表２に示されるように研究した。
【０１２２】
【表２】
実験群Ａ〜ＧをＢｉｏＨｅｐＢワクチン（０．０４ｍｃｇ）を用いて、１ヶ月間隔で２回腹腔内（ｉ．ｐ．）接種した。コントロールＡ群のマウスを１日目および３０日目に経口給餌を伴わないでワクチン接種した。そして３０日目および６０日目の各注射の３０日後に、血清抗ＨＢｓ抗体力価について追跡した。天然の動物における体液性抗ＨＢＶ免疫応答に対する経口寛容誘導の効果を決定するために、Ｂ群およびＣ群のマウスを、それぞれ、ＨＢＶエンベロープタンパク質（ＢｉｏＨｅｐＢ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を給餌した。次いで、１０日目および４０日目にＢｉｏＨｅｐＢワクチンを用いて２回の腹腔内接種を行った。各免疫後３０日、すなわち４０日目および７０日目で、マウスを抗血清ＨＢ力価について追跡した。既存の抗ＨＢＶ免疫応答に対する経口寛容誘導の効果を決定するために、Ｄ群およびＥ群のマウスをＢｉｏＨｅｐＢワクチンを用いて腹腔内接種し、次いで、ワクチン接種日から実験Ｄ群のマウスにＨＢＶエンベロープタンパク質（ＢｉｏＨｅｐＢ）を経口投与するか、またはコントロールＥ群にＢＳＡを経口投与した。両群のマウスを３０日目にＢｉｏＨｅｐＢワクチンを用いて再度免疫し、そして２回目の注射の３０日後、６０日目に、抗ＨＢｓ抗体力価を測定した。経口寛容誘導の抗ＨＢＶ免疫に対する効果のさらなる決定のために、Ｆ群およびＧ群のマウスを、１日目および３０日目にＢｉｏＨｅｐＢワクチンを用いて２回の腹腔内接種を行い、次いで、実験Ｅ群のマウスにＨＢＶエンベロープタンパク質（ＢｉｏＨｅｐＢ）を経口投与するか、またはコントロールＧ群にＢＳＡを経口投与した。マウスを３０日目の経口寛容誘導の前に抗ＨＢ力価について追跡し、次いで、６０日目に寛容誘導を行った。ＨＢＶエンベロープタンパク質（ＢｉｏＨｅｐＢ）経口投与の抗ＨＢｓ力価に対する効果を決定するために、Ｈ群のマウスは、ワクチン接種を伴わないで５経口用量のＨＢＶ抗原を受けた。マウスを抗ＨＢ血清レベルの発現について３０日後に追跡した。
【０１２３】
抗ＨＢｓ体液性免疫応答の評価：ＨＢｓＡｇに対する抗体を、市販の固相ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ，Ａｕａａｂ，Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｏｒｔｈ Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）により検出した。世界保健機関の参考血清をＲＩＡによる抗ＨＢｓの定量的なアッセイのために使用した。これは、ホリンガー公式を利用し、そしてｍＩＵ／ｍｌ／ｍｌで表される。全ての実験群およびコントロール群のマウスを、本研究を通して、ＢｉｏＨｅｐＢワクチンの各接種の３０日後に抗ＨＢｓ抗体力価について追跡した。
【０１２４】
統計学的分析：標準的なスチューデントｔ検定を使用して分析した。
【０１２５】
（結果）
抗ＨＢＶ免疫応答の誘導：３つの群のマウスを、異なる３用量のＢｉｏＨｅｐＢワクチンを用いた接種後に抗ＨＢｓ抗体力価について追跡した。０．４ｍｃｇ用量および０．８ｍｃｇ用量と比較した場合０．２ｍｃｇ用量との間で有意な差違が観察された。０．２ｍｃｇを用いたワクチン接種は、それぞれ０．４および０．８ｍｃｇを用いた接種後の５７．０５±３５．８５および７８．２０±８２．３１ｍＩＵ／ｍｌと比較した場合１２．６６±７．２８ｍＩＵ／ｍｌの抗ＨＢ力価を誘導した（０．４および０．８対０．２については、それぞれｐ＜０．０５およびｐ＜０．０３、ならびに０．４ｍｃｇと０．８ｍｃｇとの間の差違についてはＰ＝０．２；図１１）。その結果、本研究において、腹腔内に投与するワクチン接種用量は０．４ｍｃｇを使用した。
【０１２６】
寛容誘導の抗ウイルス体液性免疫応答に対する効果の評価：抗ＨＢＶ末梢免疫寛容の誘導を、ＨＢＶワクチン接種より前に給餌されたマウスにおいて、抗ＨＢｓ Ａｇ抗体産生を月間隔で測定することによって評価した。ＢｉｏＨｅｐＢワクチン接種より前のＨＢＶタンパク質の投与は、抗ウイルス体液性免疫応答を著しく下方制御した。ワクチンの初回接種の３０日後の抗ＨＢｓ抗体血清レベルは、非寛容化非給餌コントロール群（Ａ群）、およびＢＳＡ給餌群（Ｃ群）のコントロールと比較した場合、寛容化ＨＢＶエンベロープタンパク質給餌群（Ｂ群）において、それぞれ、７０９±３９０および７７７±３４８対３８５±１５４ｍＩＵ／ｍｌであった（ｐ＜０．０１３、図１２Ａ）。さらに、ＢｉｏＨｅｐＢワクチンを用いた２回目の接種３０日後の抗ＨＢｓ抗体力価は、寛容化コントロール群対非寛容化コントロール群において、６６４９５±４４００７ｍＩＵ／ｍｌ対９５２５７±７８３２０および１２３８０７±７８１３０ｍＩＵ／ｍｌであった（Ａ群およびＣ群、ｐ＜０．０５、図１２Ｂ）。
【０１２７】
経口寛容誘導の既存の抗ＨＢＶ免疫応答に対する効果の評価：既存の抗ＨＢＶ免疫応答に対するＨＢＶタンパク質側への寛容誘導の効果を、ＢｉｏＨｅｐＢ抗原またはＢＳＡを経口投与された抗ＨＢＶ免疫化マウスにおける抗ＨＢｓ抗体力価を測定することにより評価した。ＨＢＶワクチン接種への曝露直後のＨＢＶ抗原の給餌は、ＢｉｏＨｅｐＢ接種６０日後、抗ＨＢｓ力価を、非寛容化（Ｅ群）コントロールの２１４７７６±１４８８９７ｍＩＵ／ｍｌと比較した場合、寛容化（Ｄ群）において１１４０２４±９４０９７ｍＩＵ／ｍｌまで減少させた（ｐ＝０．１５、図１３）。さらに、ワクチンでの２回の免疫化の３０日後のＨＢＶ抗原の給餌は、抗ＨＢｓ抗体力価を、６０日目（２回目の免疫の３０日後）に測定した場合、寛容化ＨＢＶエンベロープタンパク質給餌対非寛容化ＢＳＡ給餌コントロールにおいて５７３５４±３７８７３対９８１９５±５７２５６ｍＩＵ／ｍｌまで有意に減少した。（それぞれ、Ｆ群およびＧ群、ｐ＜０．０１、図１４）。免疫化を伴わないＨＢＶエンベロープタンパク質の経口投与は、抗ＨＢ抗体力価に対して効果を有さず、そしてこれらの抗ＨＢ血清レベルは検出不可能であった（Ｈ群、未掲載）。
【０１２８】
（まとめ）
この実施例は、エンベロープタンパク質の経口投与が、ＨＢＶエピトープへの寛容を誘導し得ることを実証する。ＨＢＶエンベロープタンパク質のＰｒｅＳ１およびｐｒｅＳ２およびＨＢｓＡｇ組換え複合体の天然の動物への給餌は、ワクチン接種に際し抗ＨＢＶ免疫応答を下方制御した（Ｂ群およびＣ群）。さらに、この実施例は、予め免疫したマウスへのＨＢＶタンパク質の経口投与が、ＨＢＶエンベロープペプチド側への寛容を誘導したことを実証する（実験群ＤおよびＥ）。さらに、寛容誘導は、抗ウイルス体液性二次免疫応答を著しく下方制御した。２回のワクチン接種後の抗ＨＢＶ免疫寛容の誘導は、抗ＨＢＳ抗体産生を効果的に阻害した（実験群ＦおよびＧ）。
【０１２９】
（実施例７ ＴｕｐａｉａのＨＢＶ感染）
本実施例は、小動物モデルとしてＴｕｐａｉａ ｂｅｌａｎｇｅｒｉを使用する。これは、同時係属出願の主題である（Ｂｒｏｗｎら、１９９７年６月１６日出願の米国特許出願番号０８／８７６，６３６）。本実施例は、Ｔｕｐａｉａ ｂｅｌａｎｇｅｒｉにおいて、ＨＢＶによる感染の後に誘導される疾患症状の実証に関する。これを使用して治療的なレジメの有効性を測定し得る。
【０１３０】
（材料および方法）
（被験体）Ｔｕｐａｉａ ｂｅｌａｎｇｅｒｉをＤｕｋａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｖｉｖａｒｉｕｍ，Ｄｕｒｈａｍ ＮＣから入手し、そしてＡｌｂｅｒｔ Ｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ａｎｉｍａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにて飼育した。Ｔｕｐａｉａを７０℃にて１２時間の明期／暗期周期で、ネコのケージまたはリスザルのケージあたり２匹のトガリネズミの１匹または交配ペアで飼育し、そして新鮮な果物（ブドウ、バナナ、りんご、およびオレンジ）の食餌、乾燥したキャットフード、および水を与えた。各ケージはまた小さな巣箱を含んだ。
【０１３１】
（ＴｕｐａｉａのＨＢＶ感染）Ｔｕｐａｉａを、９４：１のケタミン：キシラジン（Ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ，Ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅ，ＩｏｗａからのＫｅｔａｓｅｔ（１００ｍｇ／ｍｌ）およびＢａｙｅｒ，Ｓｈａｗｎｅｅ Ｍｉｓｓｉｏｎ，ＫａｎｓａｓからのＲｏｍｐｕｓ（２０ｍｇ／ｍｌ））を使用して麻酔した。体重１グラムあたり０．００１ｍｌの用量で大腿へ筋内注射により投与した。ＨＢＶ接種物は、１０のＨＢＶ血清陽性（ｓｅｒｐｏｓｉｔｉｖｅ）の臨床試料のプールに由来した。感染のためにＴｕｐａｉａの尾の毛を剃り、消毒し、次いで０．１ｍｌのＨＢＶプールを、２７ゲージの蝶形針を使用して尾静脈に静脈注射した。
【０１３２】
（血清学）尾の裏面の毛を剃り、消毒した後、麻酔したＴｕｐａｉａの尾静脈から、０．５〜１．０ｍｌの血液サンプルを２７ゲージの蝶形針を使用して収集した。Ｔｕｐａｉａからの血液サンプルをＨＢＶ接種前に収集し、そしてその後、毎週収集する。ポリクローナルＨＢｓＡｇ試験を使用する長期感染由来の一連のサンプル（Ａｕｓｔｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を除いて、ＨＢＶの血清学的な全ての試験をＥＮＺＯ Ｃｌｉｎｉｃａｌ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）にて、臨床試料について使用されるものと同じ手順で行った。ＰＢＳ中の血漿の連続希釈物を、Ｔｕｐａｉａ抗体レベルを試験の有益な範囲に対して滴定するために作製した。ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）レベルをＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した市販のキットにより長期間測定する場合、製造業者の指導書を使用する。
【０１３３】
（組織学）肝臓の経皮的なバイオプシーを、全身麻酔下で滅菌技術を使用して行った。腹部の垂直正中線小切開術（ｓｍａｌｌ ｖｅｒｔｉｃａｌ ｍｉｄｌｉｎｅ ｉｎｃｉｓｉｏｎ）を使用して肝臓を曝露し、パースライン縫合（テーパーニードルおよび絹を使用する）で肝臓部分を結紮した後、小さな楔形の肝臓バイオプシーを取り出した。バイオプシー組織を分割した：一部分を中性ホルマリン中に保存し、そして他の部分を−８０°で凍結させた。ホルマリン固定組織をパラフィン包埋し、切片にし、そして組織学的検査のためにヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ染料）、コラーゲンのためにトリクローム染料、またはＴｕｐａｉａコラーゲンを染色するレチクリン染料を用いて染色した。
【０１３４】
（ＨＢＶ ＲＮＡのためのインサイチュＰＣＲ）プライマーおよびプローブ用にＨＢＶ特異的配列を使用したことを除いて、Ｌｉｕら（１９９７；Ｊ．Ｖｉｒ．７１：４０７９）に記載されるプロトコルに従って反応を行った。これらの配列は以下の通りである：
ＨＢＶ Ａ： ５’−ＴＧＣＣＴＧＡＧＴＧＣ（Ｔ／Ａ）ＧＴＡＴＧ−３’
ＨＢＶ Ｂ： ５’−ＴＡＧＧＡＧＧＣＴＧＴＡＧＧＣＡＴ−３’
ＨＢプローブ： ５’−ＴＴＴＡＴＡＡＧＧＧＴＣＧＡＴＧＴＣＣＡＴ−３’
（結果）
（ＴｕｐａｉａのＨＢＶ感染）ＨＢＶ保有者血清を用いて接種されたＴｕｐａｉａのＨＢＶ感染の証拠を以下の表３に示す。
【０１３５】
【表３】
ＨＢＶ感染したＴｕｐａｉａにおいて、ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）は、接種後２時間に検出され始め、２４〜４８時間でピークに達し、そして全ての処置されたＴｕｐａｉａにおいて４〜６日間持続した（表３ａ）。より長い時点からのＨＢｓＡｇの産生は、モノクローナルアッセイに対してネガティブであった。しかし、ポリクローナル抗体キットを代用した場合、ＨｂｓＡｇは、研究の経過時間を通じて検出され続けた（１０ヶ月）。Ｅ−抗原（ＨＢｅＡｇとしてもまた知られる）は、ウイルスコアタンパク質の血清可溶性の改変であり、ヒトにおいて、活性ウイルスの複製についてのマーカーである。ＨＢｅＡｇは、ＨＢＶ接種後に試験された、３匹全てのＴｕｐａｉａからの血液サンプルにおいて検出された（表３ｂ）。ＨＢｅＡｇ分泌の検出は、継続的血液サンプルにおいて９〜２４日に延長した。コントロールの未処置Ｔｕｐａｉａにおいて、ＨＢＶウイルス抗原は血液中で検出されなかった。同様に、ＨＢＶ接種ｔｕｐａｉａ由来の前処理の血液サンプルにおいて、ＨＢＶは検出されなかった。このことは、用いられたＴｕｐａｉａが以前にヒトＨＢＶに曝露されていなかったことを示す。この血清学的データより、本発明者らは、ＨＢＶキャリア血清を接種されたＴｕｐａｉａは感染し、そしてそれらはウイルスを複製すると結論づけた。
【０１３６】
ＨＢＶ抗原に対するＴｕｐａｉａの免疫学的応答。ＨＢＶに対する宿主免疫応答は、感染されたヒト肝臓における壊死炎症性反応において重要な構成要素であるため、ＨＢＶ抗原がＴｕｐａｉａにおける免疫応答を起こす能力を試験した。ＨＢＶウイルスタンパク質に対する血漿抗体レベルを、Ｔｕｐａｉａの感染後、ＨＢＶに対する体液性免疫応答を基準として測定した。ＨＢｓＡｇに対する抗体が未処置のＴｕｐａｉａにおいて検出されず、ＨＢＶを接種する前のＴｕｐａｉａから採取した血液サンプルにおいても検出されなかった。下の表４に示すように、抗体の検出を、各被験体について異なる時点で行った。
【０１３７】
【表４】
１匹の動物は、たった４週間後で検出可能なレベルを生じた。第２の被験体は、感染７週間後に検出可能なレベルを生じた。３匹全ての被験体に、２回目のＨＢＶを接種した。試験したとき３匹全ての被験体は、抗体に対してポジティブであり、力価は二次免疫応答後、ＨＢＶが感染した個々のＴｕｐａｉａについて２×１０3〜２×１０5の間で変化した。これらの結果は、ＨＢＶ感染後に、Ｔｕｐａｉａが、このウイルスに対する体液性免疫応答を生じ得ることを示す。抗体産生のタイミングおよび規模における変化は、ヒト患者の間に見られるものと類似している。
【０１３８】
（ＨＢＶが感染したＴｕｐａｉａにおける肝細胞死）ＨＢＶが感染したヒト肝臓組織において、ウイルス感染肝細胞に対する宿主の細胞性免疫応答は、肝細胞の死を引き起こすと考えられる。肝細胞の死の１つのマーカーは、溶解性肝細胞から血漿へのアミノトランスフェラーゼの放出である。血漿中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルは、ウイルス肝炎における肝細胞の死および肝臓の損傷の標準的基準である。Ｔｕｐａｉａ血漿におけるＡＴＬレベルを、ＴｕｐａｉａへのＨＢＶの接種前および後に測定した。正常で、未処置のＴｕｐａｉａＡＬＴレベルは、１３〜４０単位／ｍｌの範囲で、そして平均２５単位／ｍｌであり、正常なヒトＡＬＴレベルに類似していた。しかし、ＨＢＶ接種後では、ＴｕｐａｉａにおけるＡＬＴのレベルは、図１５に示されるように正常なレベルの２〜５倍に上昇した。この上昇は、ヒトにおいて見られるように、肝細胞の死を導くＨＢＶに対する細胞性免疫応答が存在したことを示すと見なされ得る。ＡＬＴの上昇の持続期間は、個々のＴｕｐａｉａ間で変化した（最大１０ヶ月の持続期間）。６ヶ月以上の期間にわたる持続的または周期的なＡＬＴの上昇は、感染および破壊される肝細胞の連続的サイクルが存在するヒトにおける、慢性的な肝炎の特徴である。
【０１３９】
（肝炎およびＨＢＶ複製の組織学的証拠）
感染されたおよび非感染のＴｕｐａｉａ由来の生検の例証的な写真を図１６に示す。
【０１４０】
パネルＡ：ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した未処置の正常なＴｕｐａｉａの肝臓切片（５０×）は、門脈に隣接する単一の胆管、および予備リンパ球とともに、平凡な形態を示す。肝臓の構造は、正常なヒトの肝臓に匹敵する。
【０１４１】
パネルＢ：ＨＢＶ感染２ヶ月後に得た生検由来のＨＢＶ感染Ｔｕｐａｉａの肝臓切片。Ｈ／Ｅ染色は、胆管の増殖を示す（５０×）。示される視野は、この視野および肝臓組織の隣接切片に見られる多くの視野の代表である。
【０１４２】
パネルＣ：ＨＢＶ感染２ヶ月後に得、そしてＨ／Ｅで染色した生検由来のＨＢＶ感染Ｔｕｐａｉａの肝臓切片（２５０×）は、変化した肝細胞形態を示す。いくつかの細胞の大きさを拡大した（バルーンニング（ｂａｌｏｏｎｉｎｇ））。門脈の炎症および門脈の周りに単核細胞が見られる。
【０１４３】
パネルＤ：ＨＢＶ感染Ｔｕｐａｉａ（１０ヶ月後の生検）のＨ／Ｅで染色した肝臓切片（５０×）は、門脈周囲および小葉のリンパ球浸潤を示す。
【０１４４】
パネルＥ：ＨＢＶ感染Ｔｕｐａｉａ（６ヶ月後生検）のトリクロームで染色した肝臓切片（５０×）。肝臓の構造は、この視野においてはコラーゲンの鎖によって歪められる。ブルー染色コラーゲンの鎖が見られ、このコラーゲンの鎖は、少なくとも３つの門脈領域で連結する。完全に形成された硬変性小節は見られない。
【０１４５】
パネルＦ：ＨＢＶ感染Ｔｕｐａｉａ、パネルＤと同じ動物、Ｈ／Ｅで染色した１０ヶ月後の肝臓生検（２５０×）。リンパ球が門脈三管構造から拡がり、そして断片的な壊死パターンにおける変性肝細胞を囲む。
【０１４６】
パネルＧ：レチクリンで染色された未処理のＴｕｐａｉａ肝臓切片は、正常なヒトの肝臓に匹敵する正常な構造、網様構造を示す。
【０１４７】
パネルＨ：ＨＢＶ感染Ｔｕｐａｉａ、（パネルＥと同じ動物、ＨＢＶ感染６ヶ月後、レチクリンで染色された）は、再生を示すレチクリンによって個々に囲まれていない肝細胞の群ならびにコラーゲンの沈着および肝細胞の崩壊を示す細胞外マトリクスの太い鎖を示す。
【０１４８】
ＨＢＶ ＲＮＡのインサイチュＰＣＲ検出を図１７に示す。上方左のパネルは、ＨＢＶ感染６ヶ月後のＴｕｐａｉａの肝臓におけるＢ型肝炎のＲＮＡの分布を示す。より高い拡大率で、（上方右のパネル）感染された肝細胞および予備クップファー細胞を示し得る。ウイルスＲＮＡは、図１７の下方左のパネルに見られるように、非感染のコントロール動物において検出されなかった。対応するウイルス感染した肝臓のレチクリン染色は、中心静脈の領域まで拡張する門脈路の領域において、レチクリン線維の広汎性の増加を示す（図１７の下方右パネル）。
【０１４９】
３匹のＴｕｐａｉａの場合のまとめを、より詳細に以下に示す；１匹の感染されていないコントロールＴｕｐａｉａならびにＨＢＶ接種６ヶ月後および１０ヶ月後に試験した２匹のＴｕｐａｉａ。各標本由来の肝臓切片を染色し、次いで２つの臨床的病状によって個々に分析した。
【０１５０】
（Ｔｕｐａｉａ＃１）未処置の成体Ｔｕｐａｉａ。ＨおよびＥ染色は、正常な肝臓構造を示す。門脈路における炎症の形跡は存在せず、そして洞様毛細血管空間において単核細胞がまれに存在する。肝細胞および胆管は、平凡である。レチクリン染色（コラーゲン沈着について染色する）は、レチクリンの増加を全く示さない。それ故、この肝臓組織は、正常の範囲内にある。インサイチュＰＣＲ反応後のＨＢＶ ＲＮＡの存在についての形跡は見られなかった。
【０１５１】
（Ｔｕｐａｉａ＃２）ＨＢＶ接種６ヶ月後に得られた標本。ＨおよびＥ染色は、正常な肝臓の構造を示す。門脈路における中程度の、慢性的な炎症（門脈肝炎）の広範な形跡が存在する。これらの炎症性細胞の大部分は、リンパ球およびプラズマ細胞である。時折、炎症は境界板（ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｐｌａｔｅ）を通り越す（小葉の肝炎）が、肝細胞壊死／断片的壊死は、明らかでない。洞様毛細血管空間において散乱した単核細胞が存在する。肝細胞は、拡散性および重篤な脂肪変性（脂肪変化）を示す。これは、ＨＣＶ感染したヒト肝臓において共通に見出される。血清学的試験は、ＨＣＶに対し、ネガティブな結果を与えた。このことは、このＴｕｐａｉａにおいて、脂肪変性が、混入にも先のＨＣＶ感染にも起因しないことを示す。まれな石灰沈着細胞（ｇｒｏｕｎｄ ｇｌａｓｓ ｃｅｌｌ）が、明らかであり、これは、ＨＢＶに感染されたヒト肝臓に共通して見出され、そして肝細胞内でのＨＢｓＡｇの蓄積から生じる。コラーゲン沈着についてのレチクリン染色は、レチクリン線維の拡散性および中程度の増加を示し、このレチクリン線維は門脈路に集中し、そしてまれに中心静脈の領域まで拡がる。これらの組織学的知見は、中程度に重篤な慢性的ウイルス肝炎と一致する。隣接する組織切片におけるＨＢＶ複製についての試験の結果、ウイルス性ＲＮＡが、ＲＴインサイチュＰＣＲ技術を用いて予備的な肝細胞において検出された。ウイルス核酸は、核膜の領域に局在した。このことは、生検時の肝臓における活性なＨＢＶ複製を示す。
【０１５２】
（Ｔｕｐａｉａ＃３）ＨＢＶ接種１０ヶ月後に得られた標本。ＨおよびＥ染色は、正常な肝臓の構造を示す。門脈路における慢性的な炎症（門脈肝炎）の最小の形跡が存在する。まれな単核細胞が洞様毛細血管空間に存在し、そして肝細胞は、平凡である。コラーゲンについてのレチクリン染色は、門脈路に集中するレチクリン線維の、限局的かつ穏やかな増加を示す。このことは、結合組織の細かい線維の沈着（門脈周囲線維症）を示す。これらの組織学的知見は、温和で、慢性的な肝炎と一致する。ウイルス性ＲＮＡは、生検時（接種１０ヶ月後）には検出されなかった。
【０１５３】
（まとめ）
原始的で下等な霊長類、Ｔｕｐａｉａ ｂｅｌａｎｇｅｒｉは、ＨＢＶを感染され得、その結果、ヒトの疾患に類似する多くの特徴が観察され得る。これらの疾患症状は、治療的過程の有効性を決定するための有用なマーカーである。これらのマーカーのいくつか（例えば、ＨＢｓＡｇの存在）を使用して、進行中のウイルス複製の存在をモニターし得る。他のマーカー（例えば、ＡＬＴレベル）および炎症性応答についての組織学的試験は、感染の二次発現の程度の決定について用いられ得る。
【０１５４】
（実施例８ ＴｕｐａｉａにおけるＨＢＶ抗原に対する経口寛容化の誘導）
この実施例は、ＳＩＤＲを使用して、ウイルス感染に関連する疾患の症状を緩和し得ることを実証する。この実施例において、経口寛容の誘導により、Ｔｕｐａｉａ ｂｅｌａｎｇｅｒｉのＨＢＶ感染後、先の実施例において記載された有害な免疫発現を緩和し得る。この実施例はまた、経口寛容の誘導が、病原体の抗原に対する抗体反応を選択的にダウンレギュレートするために使用され得ることのさらなる実証として役立つ。
【０１５５】
（材料および方法）
被験体、血清学および組織学は、先の実施例において記載されるとおりである。 経口寛容化の誘導。成体のｔｕｐａｉａに３０ｎｇのＨＢｓＡｇを、ＨＢＶ感染ヒト血清での感染前または感染後に、１ｍｇのウシ胎仔血清キャリアを含む溶液で与えた（１０容量、隔日に与えた）。寛容体（ｔｏｌｅｒａｎｔ）として使用されるＨＢｓＡｇは、ヒト肝細胞株ＩＨＢＶ６．７から採取した細胞培養物の上清由来である。この細胞株の誘導および特徴付けは、同時係属中の特許出願（Ｂｒｏｗｎら、米国特許出願第０８／８７６／６３５号、１９９７年６月１６日出願）に記載される。コンフルエントであるとき、ＩＨＢＶ６．７定常細胞は、９０ｎｇ／ｍｌのＨＢｓＡｇを生成する。未処理のコントロールについては、成体のｔｕｐａｉａに、１ｍｇのＢＳＡを、ＨＢｓＡｇなしで与えた。
【０１５６】
（結果）
（抗体のレベル）対のＴｕｐａｉａにＨＢＶを感染させた場合、表面抗原に対する、高いレベルの抗体を検出した（図１８）。感染されたＴｕｐａｉａの１匹に、感染６週間後にＨＢｓＡｇを経口投与した場合、少なくとも２桁の規模で抗体レベルが減少したが、コントロールは、高いレベルの抗体を産生し続けた。これら２匹の動物に第２の接種を行った場合、コントロール被験体は、第２のコントロール動物が示したような二次免疫応答を示した（図１９）。しかし、先に記載されるように経口寛容された被験体は、ＨＢＶチャレンジに対するいずれの応答も実証しなかった。ＨＢＶ抗体の検出可能なレベルが、１２週間にわたって検出されなかった。
【０１５７】
Ｔｕｐａｉａをまた、ＨＢＶ感染の前に寛容化した。この実験の結果を図２０に示す。ＨＢｓＡｇの経口投与によって処置された被験体は、コントロールより１０倍低い初期応答を示した。感染８週間後に試験した場合、寛容化動物における抗体のレベルは、検出可能ではなく、そして再チャレンジが感染２１週間後に投与されるまで、そのままであった。再チャレンジの後、抗体の応答レベルは、コントロールと比較して寛容化動物において４００倍低かった。これはまた、すぐに検出可能でないレベルに戻った。
【０１５８】
（ＡＬＴレベル）図２０に示される被験体をまた、血清ＡＬＴレベルの測定によって肝臓の損傷について試験した。これらのアッセイの結果を図２１に示す。寛容化ＴｕｐａｉａおよびコントロールＴｕｐａｉａの両方について、接種２日後に見られる初期ＡＬＴピークは、１０日以内に正常なレベルまで戻る。コントロール動物において、ＡＬＴは、接種後２４日目から６０日目までに再び上昇しはじめる。このことは、継続する肝臓の損傷の診断法である。対照的に、寛容化被験体は、研究中、ＡＬＴの正常なレベルを維持した。
【０１５９】
図１９に示される、二次免疫ＨＢＶ注射した被験体をまた、肝臓の損傷について血清ＡＬＴレベルを測定することによって試験した。これらのアッセイの結果を図２２に示す。コントロールのＨＢＶ感染Ｔｕｐａｉａは、第２の接種に対して高いＡＬＴ応答を示すが、一方経口寛容化で処置した被験体は、ほとんど応答を示さない。
【０１６０】
（組織学）３匹のＨＢＶ感染し、ＢＳＡを与えられたコントロール由来の肝臓生検は、炎症および線維損場の程度の変化を示した（先の実施例からの図１６）。対照的に、２匹のＨＢｓＡｇを与えて感染したＴｕｐａｉａおよび３匹の非感染のＴｕｐａｉａは、炎症または線維症の形跡が欠けていた。この例を図２３に示す（上のパネルが非感染Ｔｕｐａｉａ由来の正常な肝臓標本を示す）。対照的に中央のパネルは、ＨＢＶ感染したＴｕｐａｉａ由来の標本にみられる非健常組織を示す。中央のパネルにおける矢印は、感染１０ヶ月後に存在する広範な線維症を示す。下のパネルは、感染後経口寛容誘導を行ったＴｕｐａｉａにおいて、感染１０ヶ月後に、疾患過程のいずれの徴候も存在しないことを示す。
【０１６１】
（まとめ）
これらのさらなる結果は、ＨＢＶ抗原に対する経口寛容の治療が、肝臓の病状についてのこの動物モデルにおいて、ＨＢＶ肝炎の肝性炎症を改善したことを示す。期待され得ることに反して、ＨＢＶ表面抗原に対する免疫応答の抑止は、劇症性のウイルス血症の提示を導かなかった。ｔｕｐａｉａを感染の前にＨＢＶの表面抗原に対して寛容化した場合、その表面抗原に対する抗体のレベルの劇的な減少が存在した。さらに、治療的効果が、非寛容化動物の肝臓において観察されるＨＢＶ感染に対する炎症性応答の損失の点において注目された。この効果は、自己の免疫応答を生じる、選択された抗原またはエピトープに関して、他の抗原またはエピトープに対する免疫応答を維持しながら、経口寛容化が実行され得るこの病原系および他の病原系における治療様式を可能にする。このことは、被験体による感染の天然的制御を可能にする。
【０１６２】
上記の本発明の発明の詳細な説明および実施例を鑑みて、多くの明らかな改変が当業者に示唆される。全てのこのような改変は、以下の特許請求の範囲によってより詳細に規定されるように、本発明の範囲および思想に十分に含まれる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レシピエントにおける結腸炎を処置するための組成物であって、結腸抽出タンパク質を含み、該組成物は経口投与されることを特徴とする、組成物。
【請求項２】
前記結腸抽出タンパク質が結腸炎を有する被験体に由来する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記結腸抽出タンパク質が正常の被験体に由来する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記結腸抽出タンパク質が前記レシピエントに対して異種である被験体に由来する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記レシピエントに導入された場合、該レシピエントにおいて特定の抗原に対する寛容化を提示または確立する結腸抽出タンパク質を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
レシピエントにおけるウイルス感染を処置するための組成物であって、ウイルス抗原を含み、該組成物は経口投与されることを特徴とする、組成物。
【請求項７】
前記ウイルス抗原はＢ型肝炎ウイルス抗原である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記レシピエントに導入された場合、該レシピエントにおいて特定の抗原に対する寛容化を提示または確立するウイルス抗原を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項１】
レシピエントにおける結腸炎を処置するための組成物であって、結腸抽出タンパク質を含み、該組成物は経口投与されることを特徴とする、組成物。
【請求項２】
前記結腸抽出タンパク質が結腸炎を有する被験体に由来する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記結腸抽出タンパク質が正常の被験体に由来する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記結腸抽出タンパク質が前記レシピエントに対して異種である被験体に由来する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記レシピエントに導入された場合、該レシピエントにおいて特定の抗原に対する寛容化を提示または確立する結腸抽出タンパク質を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
レシピエントにおけるウイルス感染を処置するための組成物であって、ウイルス抗原を含み、該組成物は経口投与されることを特徴とする、組成物。
【請求項７】
前記ウイルス抗原はＢ型肝炎ウイルス抗原である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記レシピエントに導入された場合、該レシピエントにおいて特定の抗原に対する寛容化を提示または確立するウイルス抗原を含む、請求項６に記載の組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【公開番号】特開２０１０−２５４７１６（Ｐ２０１０−２５４７１６Ａ）
【公開日】平成２２年１１月１１日（２０１０．１１．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１８０６３３（Ｐ２０１０−１８０６３３）
【出願日】平成２２年８月１１日（２０１０．８．１１）
【分割の表示】特願２０００−２１５２２８（Ｐ２０００−２１５２２８）の分割
【原出願日】平成１２年７月１４日（２０００．７．１４）
【出願人】（５００３３４０７０）エンゾー セラピューティクス， インコーポレイテッド (7)
【氏名又は名称原語表記】Ｅｎｚｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１１月１１日（２０１０．１１．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月１１日（２０１０．８．１１）
【分割の表示】特願２０００−２１５２２８（Ｐ２０００−２１５２２８）の分割
【原出願日】平成１２年７月１４日（２０００．７．１４）
【出願人】（５００３３４０７０）エンゾー セラピューティクス， インコーポレイテッド (7)
【氏名又は名称原語表記】Ｅｎｚｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．
【Ｆターム（参考）】
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