新規のＨＣＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３設計、ならびに新規のＬＣＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３設計を含む、遺伝子パッケージのライブラリ
特定の実施形態において、炭水化物部分または酵素の活性部位に結合できる、非常に短いものから非常に長いものまで、配列および長さにおいて変化するＣＤＲ３を有する抗体を調製および特定するための組成物および方法を提供する。ＣＤＲ３を有する抗体をコードするライブラリも提供する。このライブラリは、既存の核酸ライブラリを改変することによって提供できる。一つの実施形態において、約３アミノ酸長から約３５アミノ酸長の間の重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３を含むヒト抗体の多様なファミリーのメンバーをコードするベクターまたはパッケージのライブラリが提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２００８年４月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／０４７，５２９号の優先権を主張する。この米国仮特許出願の開示は、本願の開示の一部と考えられる（かつ、本願の開示に参考として援用される）。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを個別に提示し、提示および発現し、または含み、ファミリーのアミノ酸の多様性の少なくとも一部を集合的に提示し、提示および発現し、または含む遺伝子パッケージのライブラリの調製は、現在当分野において一般的に行われている。多くの一般的なライブラリにおいて、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、抗体（例えば、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、Ｆａｂ、全抗体またはミニボディ（すなわち、ＶＬに連結したＶＨからなる二量体））に関連する。多くの場合、それらはヒト抗体の重鎖および軽鎖の、１種または複数種のＣＤＲおよびフレームワーク領域を含む。
【０００３】
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のライブラリは、いくつかの方法で作製されている。例えば、参照により本明細書に組み込まれる非特許文献１を参照されたい。一方法は、ナイーブなまたは免疫化されたかどちらかの、ネイティブなドナーの多様性を獲得することである。別の方法は、合成多様性を有するライブラリを生成することである。第３の方法は、最初の２つの方法の組合せである。通常、これらの方法により作製された多様性は、配列多様性に限定される、すなわち、ライブラリの個々のメンバーは同じ長さを有するが、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質鎖の所与の位置に異なるアミノ酸または多彩性を有することがファミリーの他のメンバーとは異なる。しかし、天然に多様なペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、それらのアミノ酸配列だけに多様性が限定されるわけではない。例えば、ヒト抗体は、それらのアミノ酸の配列多様性は限定されず、ヒト抗体は、それらのアミノ酸鎖の長さにおいてもまた多様である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｋｎａｐｐｉｋ ら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２９６巻、５７〜８６頁（２０００年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（要旨）
抗体では、例えば、可変領域の再構成の間に重鎖の長さの多様性が発生する。例えば、Ｃｏｒｂｅｔｔら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２７０巻、５８７〜９７頁（１９９７年）を参照されたい。Ｖ遺伝子とＪ遺伝子との接合は、例えば重鎖抗体配列の約半分のＣＤＲ３中の認識可能なＤセグメントの包含をもたらし、したがって、さまざまな長さのアミノ酸をコードする領域を創製する。Ｄセグメントは、長いＨＣ ＣＤＲ３を有する抗体においてより一般的である。以下もまた、抗体の遺伝子セグメントの接合の間に発生し得る：（ｉ）Ｖ遺伝子の末端が、欠失または変化した０から数個の塩基を有し得る；（ｉｉ）Ｄセグメントの末端が、除去されたまたは変化した０から多くの塩基を有し得る；（ｉｉｉ）多数のほぼランダムな塩基が、ＶおよびＤの間またはＤおよびＪの間に挿入され得る；ならびに（ｉｖ）Ｊの５’末端が、いくつかの塩基を除去または変化させるように編集され得る。これらの再構成は、アミノ酸配列および長さの双方において多様な抗体をもたらす。異なる長さのＨＣ ＣＤＲ３は、異なる形状に折り畳まれ、抗原と結合する新規な形状を抗体にもたらすことができる。立体配座は、ＣＤＲ３の長さおよび配列の双方に依存する。例えば長さ８で任意の配列のＨＣ ＣＤＲ３は、例えば長さ２２のＣＤＲ３の挙動を、適切に模倣できないことを記憶に留めるべきである。
【０００６】
したがって、アミノ酸の配列多様性のみを含有するライブラリは、それらが、ライブラリが模倣しようとするペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の天然の多様性を反映しないという点で不利である。さらに、長さの多様性は、タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドの最終的な機能性にとって重要であり得る。例えば、抗体領域を含むライブラリに関して、ライブラリの遺伝子パッケージにより提示される、提示および発現される、または含まれるペプチド、ポリペプチド、タンパク質の多くは、配列および長さ双方における多様性がライブラリに示されない場合、適切に折り畳むことができない、または抗原とのそれらの結合が不利であり得る。
【０００７】
ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質を提示する、提示および発現するまたは含む遺伝子パッケージのこのようなライブラリのさらなる不利な点は、天然発生の多様性に基づくそれらのメンバー、したがって、機能的である可能性が最も高く、免疫原性である可能性が最も低いメンバーに集中していないことである。どちらかと言えば、通常ライブラリは個々のＣＤＲ位置に可能な限りすべての多様性または多彩性を含むように試みる。このことは、ライブラリ構築の時間を消費し、効率を必要より下げる。完全な多様性を獲得しようとする試みにより作製された多数のメンバーもまた、スクリーニングを必要以上に手間のかかるものにする。このことは、ライブラリの多くのメンバーが機能的でなくなり、または非特異的に付着性になる場合に特にあてはまる。
【０００８】
さらに、合成ライブラリの構築の苦労は免疫原性の問題である。例えば、すべてのＣＤＲ残基がＴｙｒ（Ｙ）またはＳｅｒ（Ｓ）のどちらかであるライブラリがある。これらのライブラリから選択された抗体（Ａｂ）は、高い親和性および特異性を示すが、それらの非常にまれな組成はそれらを免疫原性にすることができる。本発明は、ヒト免疫系に十分由来することができ、したがって免疫原性である可能性の低いＡｂの作製を対象とする。本発明のライブラリは、Ｖ−Ｄ−ＪまたはＶ−Ｊの融合に由来する残基を可能な限り多く保有する。免疫原性の危険性を減少するために、フレームワークおよびＣＤＲの双方の中の個々の非生殖系列アミノ酸の変化を、生殖系列アミノ酸に戻し、結合親和性を保有するために生殖系列からの変化が必要かどうかを決定することが賢明であり得る。したがって、生殖系列に対する個々の変異位置にバイアスのかかったライブラリは、必要のない非生殖系列アミノ酸を有するＡｂの単離の可能性を減少させる。
【０００９】
Ａｂは高分子タンパク質であり、さまざまな分解形態に供される。分解の一形態は、ＡｓｎおよびＧｌｎ残基（特にＡｓｎ−ＧｌｙまたはＧｌｎ−Ｇｌｙ）の脱アミドおよびＡｓｐ残基の異性化である。分解の別の形態は、メチオニン、トリプトファンおよびシステインの酸化である。分解の別の形態は、Ａｓｐ−Ｐｒｏジペプチドの切断である。分解の別の形態は、Ｎ末端のＧｌｕまたはＧｌｎからのピログルタミン酸の形成である。問題のある配列の発生を最小にしたライブラリを提供することが有利である。
【００１０】
約３アミノ酸長から約３５アミノ酸長の間の重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３を含むヒト抗体の多様なファミリーのメンバーをコードするベクターまたはパッケージのライブラリを提供する。特定の実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ３もまた、Ｔｙｒ（Ｙ）とＳｅｒ（Ｓ）とに富み、かつ／または多様化されたＤ領域を含み、かつ／または伸長されたＪＨ領域を含むことができる。例えば、ＨＣ ＣＤＲ３は、例えば本明細書中の実施例において提供するように、約４０％を超える（例えば、約４３％および約８０％の間；例えば、約４０％を超えるが約１００％未満）Ｙおよび／またはＳ残基を含有することができる。さらに、このようなＨＣ ＣＤＲ３を含む集中的なライブラリも提供する。さらに、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２の設計およびＣＤＲに多様性のあるＶＫＩＩＩ Ａ２７のライブラリも提供する。本明細書に記載のＨＣ ＣＤＲ３を含むヒト抗体の多様なファミリーのメンバーをコードするベクターまたはパッケージのライブラリは、さらにＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３の１つまたは複数（例えば、１つ、２つまたは３つにおいて）に多様性を有することができる。例えば、ライブラリは、本明細書に記載のように、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３の１つまたは複数（例えば、１つ、２つまたは３つにおいて）に多様性を有することができる。
【００１１】
多様化されたＤ領域は、１つまたは複数のアミノ酸の変化が導入されているＤ領域である（例えば、天然発生のＤ領域の配列と比較して、例えば、終止コドンをＴｙｒ残基に変化できる）。
【００１２】
伸長されたＪＨ領域は、ＪＨ領域のフレームワーク配列のアミノ末端に存在する、１つまたは複数のアミノ酸残基を有するＪＨ領域である（例えば、ＦＲ４配列のアミノ末端、例えば、ＷＧＱで始まる）。例えば、ＪＨ１は伸長されたＪＨ領域である。他の例としては、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ５，およびＪＨ６が伸長されたＪＨ領域である。
【００１３】
さらに、上記のライブラリを作製し、スクリーニングする方法およびこのようなスクリーニングにおいて得られたＨＣ ＣＤＲ３および抗体を提供する。これらの方法を実践する組成物およびキットもまた、本明細書に記載する。
【００１４】
一部の態様において、本開示は、ヒト抗体関連ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質の多様なファミリー（例えば、抗体の多様なファミリー）のメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージの集中的ライブラリを特徴とし、ベクターまたは遺伝子パッケージは、
（ａ）約３または約４または約５アミノ酸長であるＨＣ ＣＤＲ３；
（ｂ）約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４または約３５アミノ酸長のＨＣ ＣＤＲ３（例えば、約２３から約３５アミノ酸長）；および
ｃ）約６から約２０アミノ酸長であるＨＣ ＣＤＲ３（例えば、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９または約２０アミノ酸長）
からなる群から選択される重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多彩化されたＤＮＡ配列を含み、ＨＣ ＣＤＲ３は、Ｄ領域（例えば、多様化されたＤ領域）（またはそれらの断片（例えば、３アミノ酸以上のＤ領域、例えば多様化されたＤ領域））あるいはＪＨ領域（例えば、伸長されたＪＨ領域）由来のアミノ酸を含む。
【００１５】
一部の実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ３は、Ｔｙｒ（Ｙ）およびＳｅｒ（Ｓ）に富んでいる（例えば、ＨＣ ＣＤＲ３の残基の４０％超がＹおよび／またはＳである）。
【００１６】
一部の実施形態において、ライブラリ（例えば、それらのベクターまたは遺伝子パッケージ）は、Ｄ領域またはＤ領域の断片（例えば、ＪＨ領域に隣接するＤ領域）を含む。
【００１７】
一部の実施形態において、ライブラリは、ＪＨ領域、例えば伸長されたＪＨ領域を含む。
【００１８】
一部の実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ３は、Ｄ領域またはＤ領域の断片（例えば、ＪＨ領域に隣接するＤ領域）由来のアミノ酸を含む。
【００１９】
一部の実施形態において、Ｄ領域は、Ｄ２−２（ＲＦ２）、Ｄ２−８（ＲＦ２）、Ｄ２−１５（ＲＦ２）、Ｄ２−２１（ＲＦ２）、Ｄ３−１６（ＲＦ２）、Ｄ３−２２（ＲＦ２）、Ｄ３−３（ＲＦ−２）、Ｄ３−９（ＲＦ２）、Ｄ３−１０（ＲＦ２）、Ｄ１−２６（ＲＦ３）、Ｄ４−１１（ＲＦ２）、Ｄ４−４（ＲＦ２）、Ｄ５−５（ＲＦ３）、Ｄ５−１２（ＲＦ３）、Ｄ５−１８（ＲＦ３）、Ｄ６−６（ＲＦ１）、Ｄ６−１３（ＲＦ１）およびＤ６−１９（ＲＦ１）からなる群から選択される。
【００２０】
一部の実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ３は、ＪＨ領域由来のアミノ酸を含む。ＪＨ領域は、伸長されたＪＨ領域であってよい。一部の実施形態において、伸長されたＪＨ領域は、ＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ５およびＪＨ６からなる群から選択される。一部の実施形態において、ＪＨ領域は、Ｙおよび／またはＳ残基に富んでいてよく、例えば、約４０％を超える（例えば、約４３％および約８０％の間；例えば、約４０％を超えるが約１００％未満）Ｙおよび／またはＳ残基を含有することができる。
【００２１】
一部の実施形態において、Ｄ領域は１つまたは複数のシステイン（Ｃｙｓ）残基を含み、一部の実施形態において、１つまたは複数のＣｙｓ残基は一定に保たれている（例えば変化しない）。
【００２２】
一部の実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ３（例えば、ＨＣ ＣＤＲ３をコードするＤＮＡ）は、ＦＲ３とＤ領域との間の、１つまたは複数のフィラー（ｆｉｌｌｅｒ）コドンを含み、個々のフィラーコドンは、個別にＮＮＫ、ＴＭＹ、ＴＭＴまたはＴＭＣ（ＴＭＹ、ＴＭＴまたはＴＭＣはＳまたはＹをコードする）である。
【００２３】
一部の実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ３（例えば、ＨＣ ＣＤＲ３をコードするＤＮＡ）は、Ｄ領域とＪＨとの間の、１つまたは複数のフィラーコドンを含み、個々のフィラーコドンは、個別にＮＮＫ、ＴＭＹ、ＴＭＴまたはＴＭＣである。
【００２４】
一部の実施形態において、ライブラリ（例えば、ライブラリのベクターまたは遺伝子パッケージ）は、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、および／または軽鎖をさらに含み、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２に多様性もまた含み、あるいは軽鎖はＨＣ ＣＤＲ１および／またはＨＣ ＣＤＲ２および／または軽鎖（例えば、κまたはλ軽鎖）において多様性（それぞれ）を含む。例えば、ＨＣ ＣＤＲ３の多様性は、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２および／または軽鎖中の多様性のバックグラウンドに構築できる。例えば、軽鎖の多様性は、ＨＣの多様性と同じＤＮＡ分子中にコードでき、あるいはＬＣおよびＨＣの多様性は、別々のＤＮＡ分子中にコードできる。
【００２５】
一部の態様において、本開示は、３、４または５アミノ酸長であるＨＣ ＣＤＲ３を含むライブラリを特徴とし、ＣＤＲ３は、ＪＨ領域（例えば、伸長されたＪＨ領域）由来、またはＪＨ領域のＦＲ４部分に接合したＤ領域（例えば、多様化されたＤ領域）（またはそれらの断片（例えば３アミノ酸以上のＤ領域、例えば多様化されたＤ領域））由来のアミノ酸を含む。
【００２６】
一部の実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ３は、ＪＨ領域のＦＲ４部分に接合したＤ領域に由来し、三量体、四量体または五量体を含み、この三量体、四量体または五量体はシステイン残基を含まない。
【００２７】
一部の実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ３は、ＪＨ領域のＦＲ４部分に接合したＤ領域に由来し、三量体、四量体または五量体を含み、この三量体、四量体または五量体は終止コドンを含まない。
【００２８】
一部の実施形態において、Ｄ領域（例えば、Ｄ領域をコードするＤＮＡ）は、ＴＡＧコドンを含み、ＴＡＧコドンはＴＣＧ、ＴＴＧ、ＴＧＧ、ＣＡＧ、ＡＡＧ、ＴＡＴおよびＧＡＧからなる群から選択されるコドンによって置き換えられる。
【００２９】
一部の実施形態において、Ｄ領域（例えば、Ｄ領域をコードするＤＮＡ）は、ＴＡＡコドンを含み、ＴＡＡコドンはＴＣＡ、ＴＴＡ、ＣＡＡ、ＡＡＡ、ＴＡＴおよびＧＡＡからなる群から選択されるコドンによって置き換えられる。
【００３０】
一部の実施形態において、Ｄ領域（例えば、Ｄ領域をコードするＤＮＡ）は、ＴＧＡコドンを含み、ＴＧＡコドンはＴＧＧ、ＴＣＡ、ＴＴＡ、ＡＧＡ，およびＧＧＡからなる群から選択されるコドンによって置き換えられる。
【００３１】
一部の実施形態において、ライブラリは、ＨＣ ＣＤＲ１および／またはＨＣ ＣＤＲ２および／または軽鎖（例えば、κまたはλ軽鎖）において多様性をさらに含む。例えば、ＨＣ ＣＤＲ３の多様性は、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２および／または軽鎖中の多様性のバックグラウンドに構築できる。例えば、軽鎖の多様性は、ＨＣの多様性と同じＤＮＡ分子中にコードでき、あるいはＬＣおよびＨＣの多様性は、別々のＤＮＡ分子中にコードできる。
【００３２】
一部の態様において、本開示は、ライブラリを多様化する方法を提供し、この方法は本明細書に記載のライブラリを突然変異化するステップを含む。
【００３３】
一部の実施形態において、突然変異化はエラープローンＰＣＲを含む。
【００３４】
一部の実施形態において、突然変異化はｗｏｂｂｌｉｎｇを含む。
【００３５】
一部の実施形態において、突然変異化はｄｏｂｂｌｉｎｇを含む。
【００３６】
一部の実施形態において、突然変異化は、平均約１から約１０の突然変異（例えば、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０の突然変異、例えば塩基変化）／ＨＣ ＣＤＲ３を導入する。
【００３７】
「ｗｏｂｂｌｉｎｇ」は、元の配列が好ましいように、多彩化されたＤＮＡを作製する方法である。例えば元の配列が、ＧＣＴによりコードされ得るＡｌａを有する場合、混合物（０．７Ｇ、０．１Ａ、０．１Ｔ、０．１Ｃ）を１番目の位置に、（０．７Ｃ、０．１Ａ、０．１Ｔ、０．１Ｇ）を２番目の位置に、（０．７Ｔ、０．１Ａ、０．１Ｇ、０．１Ｃ）を３番目の位置に使用できる。「ドーピング」の他の比率も使用できる。このことは、Ａｌａを約５０％の確率で出現させることができ、一方Ｖ、Ｄ、Ｇ、Ｔ、ＰおよびＳは約７％の確率で生じる。他のＡＡ型はさらに低い頻度で生じる。
【００３８】
一部の態様において、本開示は、例えば、（精製された）ＨＣ ＣＤＲ１〜２のレパートリーを維持し、合成ＨＣ ＣＤＲ３およびＬＣの多様性を構築するために描かれる。
【００３９】
一部の実施形態において、本開示は、ｗｏｂｂｌｉｎｇされた重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３を提示するためのカセットを提供し、例えばこのカセットは、表４００に示すカセットを含む。
【００４０】
一部の態様において、本開示は、ＨＣ ＣＤＲ３においてＴｙｒのレベルが調節されたライブラリを特徴とする。一部の実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ３領域は、約１５％またはそれを超える（例えば、約１６％、約１８％、約２０％またはそれを超える）Ｔｙｒ残基を含有する。一部の実施形態において、高レベル（例えば、約２０％より多い）のＴｙｒが、例えば、Ｔｙｒを含有するＤ領域およびＪ ｓｔｕｍｐ（またはそれらに相当する合成配列）において、ライブラリメンバーのＨＣ ＣＤＲ３に挿入される。一部の実施形態において、リードイン位置またはＤＪフィラー位置（またはそれらに相当する合成配列）において、Ｔｙｒが許容されるが、２０％以下である。一部の実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ３領域は、約１５％未満（例えば、約１４％、約１２％、約１０％、約８％、約６％またはそれより少ない）のＴｙｒ残基を含有する。一部の実施形態において、ＨＣリードイン位置またはＤＪフィラー位置（またはそれらに相当する合成配列）は、約１５％未満（例えば、約１４％、約１２％、約１０％、約８％、約６％またはそれより少ない）のＴｙｒ残基を含有する。
【００４１】
一部の態様において、本開示は、ヒト抗体重鎖をコードする遺伝子パッケージのライブラリを特徴とし、このライブラリにおいて、親アミノ酸配列は、ＶＨ配列、続いて（Ｙ、Ｓ、Ｄ、Ｌ、Ｒ）からなる群から選択される０から１０個のアミノ酸、続いてヒトＤ領域またはＤ領域の断片、続いて（Ｙ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、Ｌ）からなる群から選択される０から１０個のアミノ酸、続いて少なくともＷ１０３を前方に含むＪＨセグメントを含み、この配列をコードする可変ＤＮＡが、親アミノ酸配列が最も可能性の高い配列となるように（例えばｗｏｂｂｌｉｎｇにより）合成される。
【００４２】
一部の態様において、本開示は、生殖系列フレームワーク領域を有する軽鎖のライブラリを特徴とし、ＣＤＲは、残基が結合部位から離れるように、または一定に保たれる埋もれた側基を有するように変化する。一部の実施形態において、可変ＤＮＡ合成の方法は、生殖系列配列が最も可能性のある配列となるように（例えばｗｏｂｂｌｉｎｇにより）使用される。
【００４３】
一部の態様において、本開示は、本明細書に開示されるような抗原結合可変領域をコードする多様なメンバーのライブラリを特徴とする。
【００４４】
一部の態様において、本開示は、本明細書に開示されるようなＨＣ ＣＤＲ３領域をコードする多様なメンバーのライブラリを特徴とする。一部の実施形態において、このライブラリは表１０９７のライブラリである。
【００４５】
一部の態様において、本開示は多様なメンバーのライブラリを特徴とし、個々のメンバーはＨＣ ＣＤＲ３をコードし、
ＨＤＣＲ３中の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、または８位は、ライブラリにおいて、それぞれＧ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、Ｌ，およびＹによって、［１．０Ｇ、．５７Ｓ、．４６Ｒ、．４２Ｄ、．３６Ｌ、．３５Ｙ］の割合で占められ、場合によって、
ＨＣ ＣＤＲ３の最後の４位は以下のように示される：
親アミノ酸は、他のアミノ酸型より３、４、５、６、７、８、１０倍の確率で存在し、他のアミノ酸型はＹ、Ｓ、Ｄ、Ｒ、Ｇを含む。
【００４６】
一部の態様において、本開示は多様なメンバーのライブラリを特徴とし、個々のメンバーはＨＣ ＣＤＲ３をコードし、
ＨＣ ＣＤＲ３の最初の１、２、３、４、５、６、７または８位の少なくとも１つ、好ましくはすべてが、ライブラリにおいて、［１．０Ｇ、．５７Ｓ、．４６Ｒ、．４２Ｄ、．３６Ｌ、．３５Ｙ］の割合でＧ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、ＬおよびＹに占められ、場合によって
ＨＣＤＲ３の最後の４位は、以下のように示される：
親アミノ酸は、他のアミノ酸型より３、４、５、６、７、８、１０倍の確率で存在し、他のアミノ酸型はＹ、Ｓ、Ｄ、Ｒ、Ｇを含む。
【００４７】
一部の態様において、本開示は多様なメンバーのライブラリを特徴とし、個々のメンバーはＨＣ ＣＤＲ３をコードし、
ＨＣ ＣＤＲ３の長さは１０、１１または１２位であり、
ＨＣ ＣＤＲ３の最初の６、７または８位はそれぞれ、ライブラリにおいて、［１．０Ｇ、．５７Ｓ、．４６Ｒ、．４２Ｄ、．３６Ｌ、．３５Ｙ］の割合で、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、ＬおよびＹで占められ、
ＨＣＤＲ３の最後の４位は以下のように示される：
親アミノ酸は、他のアミノ酸型より３、４、５、６、７、８、１０倍の確率で存在し、他のアミノ酸型はＹ、Ｓ、Ｄ、Ｒ、Ｇを含む。
【００４８】
一部の実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ３の最後の４位は個々に、ライブラリにおいて、７／１２が親、ならびにＹ、Ｓ、Ｄ、ＲおよびＧが個々に１／１２で示される。
【００４９】
一部の実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ３の最後の４位は個々に、ライブラリにおいて、Ａ６＝７／１２ＡならびにＹ、Ｓ、Ｄ、ＲおよびＧが個々に１／１２；Ｆ７＝７／１２ＦならびにＹ、Ｓ、Ｄ、ＲおよびＧが個々に１／１２；Ｄ８＝７／１１ＤならびにＹ、Ｓ、ＲおよびＧが個々に１／１１；Ｉ９＝７／１２ＩならびにＹ、Ｓ、Ｒ、ＤおよびＧが個々に１／１２で示される。
【００５０】
一部の実施形態において、メンバーはＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２をさらにコードする。
【００５１】
一部の実施形態において、メンバーは、Ｆフレームワーク（ＦＲ）領域１〜４をさらにコードする。
【００５２】
一部の実施形態において、メンバーは、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＦＲ領域１〜４をコードする。
【００５３】
一部の実施形態において、メンバーは、３−２３のＨＣフレームワークを含む。
【００５４】
一部の実施形態において、ライブラリは、ＬＣ可変領域をさらに含む。
【００５５】
一部の実施形態において、ライブラリは、多様なＬＣ可変領域をコードするメンバーを含む。
【００５６】
一部の実施形態において、ＬＣ可変領域を含むメンバーは、Ａ２７ ＬＣフレームワークを含む。
【００５７】
一部の実施形態において、ライブラリは、ディスプレイライブラリ、例えば、ファージディスプレイライブラリである。
【００５８】
一部の実施形態において、ライブラリは、少なくとも１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１の多様なメンバーを有する。
【００５９】
一部の態様において、本開示は、本明細書に記載のライブラリと標的を接触させるステップ、メンバーと前記標的とを結合させるステップ、および標的を結合したメンバーを回収するステップを含む、ライブラリメンバーを選択する方法を特徴とする。
【００６０】
本発明のこれらの実施形態、他の実施形態およびそれらの特徴および特性は、以下の説明、図面および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
（詳細な説明）
抗体（「Ａｂ」）は、それらの多様性を、特定の標的に対するＡｂの親和性および特異性の決定に関与する領域に集中する。これらの領域は、配列および長さにおいて多様であってよい。一般的に、それらは双方の点において多様である。しかし、ヒト抗体のファミリーにおいて、配列および長さ双方における多様性は、真にランダムではない。むしろ、一部のアミノ酸残基は、ＣＤＲの特定の位置において好ましく、一部のＣＤＲの長さが好ましい。これらの好ましい多様性は、抗体ファミリーの天然の多様性に相当する。
【００６２】
本発明によれば、また以下でさらに十分に説明するように、約３から約３５の間のアミノ酸長である重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３を含むヒト抗体の多様なファミリーのメンバーをコードする、ベクターおよび遺伝子パッケージのライブラリを調製し使用できる。特定の実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ３はさらに、ＹとＳとに富んでいてよく、かつ／または多様化されたＤ領域を含んでよい。このようなＨＣ ＣＤＲ３を含む集中的ライブラリをさらに提供する。
【００６３】
免疫細胞が抗体重鎖を構築する場合、免疫細胞は、ＶセグメントをＤセグメントに接続し、それをＪセグメントに接続する。Ｄセグメントは任意選択であり、ヒトＡｂの約５０％は認識可能なＤを有する。この細胞は、ジャンクション部位（ＶとＤ、ＤとＪまたはＶとＪ）において、塩基の除去および付加双方の多数の編集を実施できるが、必ずしもランダムではない。最初に再構成された抗体は、細胞の表面に提示され、抗原（Ａｇ）と結合する場合、細胞は刺激され、親和性を改善するために体細胞突然変異を実施する。免疫グロブリン生殖系列遺伝子中にコードされるホットスポットがあり、その結果Ａｂ遺伝子の特定の場所が、持続性Ａｇに対する優れたバインダーを探し求めて特定のセットの突然変異を起こす可能性が非常に高い。実際には、突然変異の一部はフレームワーク位置にあるが、大部分は相補性決定領域（ＣＤＲ）にある。高度な配列多様性を占めすだけでなく、長さの多様性も示すので、重鎖（ＨＣ）のＣＤＲ３が特に興味がある。ＣＤＲがランダムなＤＮＡで置き換えられた抗体（Ａｂ）ライブラリが構築されており、有用なＡｂが得られている。しかし、一部の治療用Ａｂは有意な程度の抗原性を示す。ヒト生殖系列に近いＡｂが低抗原性であり得る。
【００６４】
定義
便宜上、本発明のさらなる説明の前に、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲に用いた特定の用語をここで定義する。
【００６５】
単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないと指示しない限り、複数に対する言及を含む。
【００６６】
「親和性」または「結合親和性」という用語は、見かけ上の結合定数すなわちＫａを指す。Ｋａは、解離定数（Ｋｄ）の逆数である。結合タンパク質は、例えば、特定の標的分子に対して、少なくとも１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０および１０１１Ｍ−１の結合親和性を有することができる。第２の標的と比較して第１の標的に対する結合タンパク質の結合親和性がより高いことは、第２の標的への結合に関するＫＡ（または数値ＫＤ）より第１の標的への結合に関するＫＡ（または数値ＫＤがより小さい）がより高いことにより示すことができる。このような場合、結合タンパク質は、第２の標的（例えば、第２の立体配座中の同じタンパク質またはそれらの模倣体あるいは第２のタンパク質）と比較して、第１の標的（例えば、第１の立体配座のタンパク質またはそれらの模倣体）に関して特異性を有する。結合親和性の差（例えば、特異性または他の比較に関して）は、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、１５、２０、３７．５、５０、７０、８０、９１、１００、５００、１０００または１０５倍であり得る。
【００６７】
結合親和性は、平衡透析、平衡結合、ゲルろ過、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴または分光法（例えば、蛍光測定を使用して）を含むさまざまな方法により決定できる。結合親和性を評価するための例示的な条件は、ＴＲＩＳ緩液（５０ｍＭのＴＲＩＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）中である。これらの技術は、結合タンパク質（または標的）の濃度の関数として、結合しているタンパク質および遊離の結合タンパク質の濃度を測定するために使用できる。結合された結合タンパク質（［Ｂｏｕｎｄ］）の濃度は、遊離の結合タンパク質（［Ｆｒｅｅ］）の濃度および標的上の結合タンパク質の結合部位の濃度に関連し、以下の方程式：
［Ｂｏｕｎｄ］＝Ｎ・［Ｆｒｅｅ］／（（１／ＫＡ）＋［Ｆｒｅｅ］）
において、（Ｎ）は結合部位の数／標的分子である。
【００６８】
必ずしもＫＡを正確に決定する必要はないが、これは、時として、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ分析などの方法を使用して決定される、親和性の定量的測定値を得ることで十分であるからであり、その測定値はＫＡに比例し、したがって比較、例えば、より高い親和性が例えば２倍高いかどうかの決定に使用して、例えば、機能アッセイ、例えばインビトロまたはインビボアッセイにおける活性により、親和性の定性的測定値を得、または親和性の推定値を得ることができる。
【００６９】
「抗体」という用語は、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメインまたは免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質を指す。例えば、抗体は、重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略記する）および軽（Ｌ）鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略記する）を含むことができる。別の実施例において、抗体は、２つの重（Ｈ）鎖可変領域および２つの軽（Ｌ）鎖可変領域を含む。重鎖および軽鎖は、それぞれさらにＨＣおよびＬＣと略記してもよい。「抗体」という用語は、抗体の抗原結合断片（例えば、一本鎖抗体、ＦａｂおよびｓＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖおよびドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（ｄｅ Ｗｉｌｄｔ ら、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９６年；２６巻（３号）：６２９〜３９頁））および完全抗体を包含する。抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ（およびそれらのサブタイプ）の構造的特徴を有することができる。抗体は任意の供給源由来でよいが、霊長類（ヒトおよび非ヒト霊長類）および霊長類化されたものが好ましい。
【００７０】
ＶＨおよびＶＬ領域は、「フレームワーク領域」（「ＦＲ」）と呼ばれる、より保存された領域に散在する、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細かく分けることができる。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は、厳密に定義されている（Ｋａｂａｔ， Ｅ．Ａ．， ら、（１９９１年）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１巻３２４２頁およびＣｈｏｔｈｉａ， Ｃ． ら、（１９８７年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６巻：９０１〜９１７頁を、さらに ｗｗｗ．ｈｇｍｐ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋを参照されたい）。Ｋａｂａｔの定義を本明細書において使用する。ＶＨおよびＶＬは個々に、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲにより通常構成され、以下の順でアミノ末端からカルボキシ末端に配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
【００７１】
抗体のＶＨまたはＶＬ鎖は、重鎖または軽鎖の定常領域のすべてまたは一部をさらに含むことができ、その結果免疫グロブリンの重鎖または軽鎖をそれぞれ形成する。一実施形態において、抗体は、２つの免疫グロブリン重鎖および２つの免疫グロブリン軽鎖の四量体であり、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖は、例えばジスルフィド結合により相互接続している。ＩｇＧにおいて、重鎖定常領域は３つの免疫グロブリンドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。軽鎖定常領域は、ＣＬドメインを含む。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、通常抗体と、宿主組織または免疫系のさまざまな細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ）を含む因子との結合を媒介する。免疫グロブリンの軽鎖は、κまたはλ型であり得る。一実施形態において、抗体はグリコシル化される。抗体は、抗体依存性細胞障害作用および／または補体媒介性細胞障害作用に対して機能性であり得る。
【００７２】
抗体の１つまたは複数の領域は、ヒトまたは有効にヒトであり得る。例えば、可変領域の１つまたは複数は、ヒトまたは有効にヒトであり得る。例えば、ＣＤＲ、例えばＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＨＣ ＣＤＲ３、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３の１つまたは複数は、ヒトであり得る。個々の軽鎖ＣＤＲは、ヒトであり得る。ＨＣ ＣＤＲ３はヒトであり得る。フレームワーク領域、例えばＨＣまたはＬＣのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４の１つまたは複数は、ヒトであり得る。例えば、Ｆｃ領域はヒトであり得る。一実施形態において、すべてのフレームワーク領域は、ヒト、例えばヒト体細胞、例えば、免疫グロブリンを産生する造血細胞または非造血細胞に由来する。一実施形態において、ヒト配列は、例えば生殖系列核酸によりコードされる生殖系列配列である。一実施形態において、選択されたＦａｂのフレームワーク（ＦＲ）残基は、最も類似した霊長類生殖系列遺伝子、特にヒト生殖系列遺伝子中の対応する残基のアミノ酸型に変換され得る。定常領域の１つまたは複数は、ヒトまたは有効にヒトであり得る。例えば、免疫グロブリン可変ドメイン、定常領域、定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＬ）あるいは完全抗体の少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９８または１００％、は、ヒトまたは有効にヒトであり得る。
【００７３】
抗体のすべてまたは一部は、免疫グロブリン遺伝子またはそれらのセグメントによりコードされ得る。例示的なヒト免疫グロブリン遺伝子は、κ、λおよびα（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、γ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、Δ、εおよびμの定常領域遺伝子ならびに多くの免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。完全長免疫グロブリンの「軽鎖」（約２５ＫＤａまたは約２１４アミノ酸）は、ＮＨ２末端において可変領域遺伝子（約１１０アミノ酸）により、ＣＯＯＨ末端においてκまたはλ定常領域遺伝子によりコードされる。完全長免疫グロブリンの「重鎖」（約５０ＫＤａまたは約４４６アミノ酸）は、可変領域遺伝子（約１１６アミノ酸）および他の前述の定常領域遺伝子の１つ、例えばγ（約３３０アミノ酸をコードする）により、同様にコードされる。ヒトＨＣの長さは、ＨＣ ＣＤＲ３が約３アミノ酸残基から３５アミノ酸残基超にわたって変化するので、大幅に変化する。
【００７４】
本明細書において、「Ｄセグメント」および「Ｄ領域」という用語は、交換可能に用いられ、同一である。これらの要素は、ＤＮＡおよびアミノ酸の双方の表現を有し、その意味するところは文脈から明らかであることは理解されるべきである。
【００７５】
「ライブラリ」または「ディスプレイライブラリ」は、ヌクレオチド、例えばＤＮＡ、クローン内の配列のコレクション、または個別のポリペプチドまたはポリペプチドの混合集団を提供するために選択またはスクリーニングできる、複製可能なディスプレイパッケージに提示されたポリペプチドの遺伝子的に多様なコレクションを指す。
【００７６】
本明細書において使用する「パッケージ」という用語は、粒子がその表面にポリペプチドを提示している、複製可能な遺伝子ディスプレイパッケージを指す。このパッケージは、その表面に抗原結合ドメインを提示するバクテリオファージであってよい。この型のパッケージは、ファージ抗体（ｐＡｂ）と呼ばれている。
【００７７】
「所定の標的」は、任意の開示された方法において、その使用に先だって同一性が既に公知である標的分子を指す。
【００７８】
本明細書において使用する「複製可能なディスプレイパッケージ」という用語は、複製能力を有する粒子を提供する遺伝子情報を有する生物学的粒子を指す。この粒子はその表面にポリペプチドの少なくとも一部を提示できる。このポリペプチドは、この粒子にネイティブな遺伝子情報および／または粒子内に人工的に配置された遺伝子情報あるいはその原型によりコードされ得る。提示されたポリペプチドは、特異的結合対、例えば、免疫グロブリン分子、酵素または受容体などに基づく重鎖または軽鎖ドメインの任意のメンバーであってよい。この粒子は、例えば、ウィルス、例えば、ｆｄまたはＭ１３などのバクテリオファージであってよい。
【００７９】
「ベクター」という用語は、遺伝子が挿入され、組み換えＤＮＡ分子を構築する、宿主生命体中で複製可能なＤＮＡ分子を指す。「ファージベクター」は、バクテリオファージに関する複製起点を含有するが、プラスミドに関する複製起点を含有しない、ファージゲノムの改変に由来するベクターである。「ファージミドベクター」は、バクテリオファージに関する複製起点およびプラスミドの複製起点を含有する、プラスミドゲノムの改変に由来するベクターである。
【００８０】
オリゴヌクレオチドの議論において、「［ＲＣ］」の表記は、示したオリゴヌクレオチドの逆相補体が、使用したオリゴヌクレオチドであることを示す。
【００８１】
ヒト抗体重鎖ＣＤＲ３
重鎖（「ＨＣ」）生殖系列遺伝子（ＧＬＧ）３−２３（ＶＰ−４７としても公知）は、全ヒトＡｂの約１２％を占め、本発明の好ましい実施形態においてフレームワークとして好ましい。しかし、他の周知のフレームワーク、例えば４−３４、３−３０、３−３０．３および４−３０．１も、本発明の集中的多様性の原理から逸脱することなく使用できることを理解するべきである。
【００８２】
加えて、
【００８３】
【化１】
は、ネイティブ抗体中のＪＨ３より頻繁に現れる。したがって、ＪＨ４は本発明の集中的ライブラリにとって好ましい。しかし、
【００８４】
【化２】
、ＪＨ１、ＪＨ２またはＪＨ５も同様に使用できる。ＪＨ２は、すべての他のヒトＪＨにおいてＱＧの代わりに１０５−１０６にＲＧを有する有利性を有する。ＪＨ３は、Ｍ１０８の不利を有する。少なくとも１つの標的に対してＥＬＩＳＡ陽性であった１４１９のＡｂのコレクションにおいて、本発明者らは、１７のＪＨ１、３１のＪＨ２、４５２のＪＨ３、６３６のＪＨ４、３２のＪＨ５および２５１のＪＨ６を見出した。存在するのであれば、ＪＨの二重下線部分は、ＣＤＲ３の一部であると考えられる。表３において、ＪＨのＦＲ４部分は、下線を引いてある。
【００８５】
これらの１４１９のＡｂのＨＣ ＣＤＲ３に出現する個々のアミノ酸の頻度を、表７５に一覧にし、記録した。最も一般的なアミノ酸は、順番にＴｙｒとＧｌｙ、Ａｓｐ、ＳｅｒおよびＡｒｇであったことに留意されたい。Ｒｅｌ．Ｕｐは、最もまれなＣｙｓと比較した個々の型の相対存在量である。Ｒｅｌ．Ｄｏｗｎは、最も一般的なＴｙｒと比較した個々の型の存在量である。したがって、ＨＣ ＣＤＲ３内に置換する好ましいアミノ酸型は、Ｙ、Ｇ、Ｄ、ＳおよびＲである。
【００８６】
必然的に、ＨＣ ＣＤＲ３は長さが変わる。ヒトＨＣの約半分は、成分：Ｖ：：ｎｚ：：Ｄ：：ｎｙ：：ＪＨｎからなり、ＶはＶ遺伝子であり、ｎｚは、本質的にランダムな一連の塩基であり、Ｄは、多くの場合双方の末端で大量の編集があるＤセグメントであり、ｎｙは、本質的にランダムな一連の塩基であり、ＪＨｎは、多くの場合、５’末端で大量の編集がある６つのＪＨセグメントの１つである。Ｄセグメントは、ＩｇＧを折り畳ませるスペーサーセグメントを提供するために出現する。最も大きい多様性は、ＶとＤおよびＤとＪＨのジャンクションにおいてある。
【００８７】
Ｃｏｒｂｅｔｔ ら、（Ｃｏｒｂｅｔｔ ＳＪ、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ＩＭ、Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ ＥＬ、Ｂｕｃｋ Ｄ、Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． １９９７年Ｖ２７０巻：５８７〜９７頁）は、ヒト免疫系は、複数のＤセグメントおよび組み換えられたＤセグメントを挿入しないことを示した。それにもかかわらず、Ｄセグメントは、ＨＣ ＣＤＲ３の優れた成分として選択されており、本発明は、複数のＤセグメントを含有するＨＣ ＣＤＲ３を含む。
【００８８】
ヒトＤセグメントは、いくつかの非常に強いバイアスを有する。ヒトＤセグメントにおける５２２のアミノ酸の集計は、Ｙが７０（１３．４％）、Ｌが６３（１２．１％）、Ｖが５２（１０％）、Ｇが４９（９．４％）、Ｉが４１（７．９％）、Ｔが４０（７．７％）、Ｓが３３（６．３％）、Ｗが２７（５．２％）、Ｄが２１（４％）、Ａが１９（３．６％）、Ｒが１６（３．１％）、ＴＡＧが１５（２．９％）、Ｎが１４（２．７％）、Ｑが１１（２．１％）、Ｃが９（１．７％）、Ｅが９（１．７％）、Ｆが８（１．５％）、Ｍが８（１．５％）、ＴＧＡが８（１．５％）、ＴＡＡが７（１．３％）、Ｐが１（０．２％）、Ｈが１（０．２％），およびＫが０（０％）である。不対のＣｙｓを有し、さらにＴＧＡ終止コドンを有する、１つのＤ（２−８ ＲＦ１）があり、あまり使用されない。したがって、Ｄセグメントは、主に疎水性である。ヒトＨＣ ＣＤＲ３におけるアミノ酸の頻度を、表７５に示す。頻度には、類似点および相違点の双方がある。ＨＣ ＣＤＲ３全体において、Ｔｙｒは最も一般的であり、Ｇｌｙだけがそれに近い（Ｔｙｒの９６％一般的）。Ａｓｐ（Ｔｙｒの７５％一般的）、Ｓｅｒ（Ｔｙｒの５３％一般的）、Ｌｅｕ、ＶａｌおよびＩｌｅは、すべてのＤセグメントが等しいとして数えた場合、Ｄセグメントにおいて比較的一般的である。免疫系は、Ｄセグメントを同じ頻度で使用しない。表７７は、Ｄセグメントの利用頻度を示す。しばしば使用されるＤセグメントは、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、ＳｅｒおよびＡｓｐに非常に富んでいる。Ａｒｇは、最も多く使用されるＤセグメントには見出されず、Ａｒｇは、ＪＨセグメントの任意のＣＤＲ部分にもコードされない。Ａｒｇは、Ｖ、ＤおよびＪの突然変異により、またはＶおよびＤ、ＤおよびＪまたはＶおよびＪの間のフィラー領域においてのどちらかで優勢になる。このサンプルにおいて、全アミノ酸の５０％は、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、ＳｅｒまたはＡｒｇである。本発明の一実施形態において、「親」ＨＣ ＣＤＲ３配列の置換は、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＡｓｐおよびＡｒｇからなるアミノ酸のセットに限定される。本発明の一実施形態において、Ａｒｇは、ＶおよびＤの間、ＤおよびＪの間またはＶおよびＪの間のフィラー領域において一般的である。
【００８９】
本発明の好ましいライブラリにおいて、両方の型のＨＣ ＣＤＲ３を使用する。特定可能なＤセグメントを有さないＨＣ ＣＤＲ３において、構造は、Ｖ：：ｎｚ：：ＪＨｎ（ｎ＝１，６）であり、ＪＨは５’末端において通常編集されている。特定可能なＤセグメントを有するＨＣ ＣＤＲ３において、構造はＶ：：ｎｚ：：Ｄ：：ｎｙ：：ＪＨｎである。
【００９０】
本明細書において、約３から約３５アミノ酸長の間のＨＣ ＣＤＲ３を提供する。特定の実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ３は、ＹとＳとに富んでいる、および／またはＤ領域が存在する場合、多様化されたＤ領域を含むことができる。例えば、ＨＣ ＣＤＲ３は約４３％および約８０％間の、例えば、約４３％、約４８％、約６９％、約６３％、約７１％、約６２％、約５８％、約６８％、約８０％、約７７％のＹおよび／またはＳ残基を含むことができ、あるいは残基の約４０％より多く、または約４０％から約１００％未満はＹおよび／またはＳである。例えば、ＣＤＲ３中のすべての残基がＹおよび／またはＳではない。特定の実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ３は、伸長されたＪＨ領域を含むことができる。本発明の好ましいライブラリの例示的なＨＣ ＣＤＲ３成分設計を、実施例１、２および３に示し、説明する。
【００９１】
一部の実施形態において、（例えばＣＤＲ例えばＨＣ ＣＤＲ３またはフレームワーク領域（例えばＣＤＲ、例えばＣＤＲ３、例えばＨＣ ＣＤＲ３に近いまたは隣接するフレームワーク領域）における）多様性は、平均して約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０，または約１から約１０の突然変異（例えば塩基の変化）／例えばＣＤＲ（例えばＨＣ ＣＤＲ３）またはフレームワーク領域（ＣＤＲ、例えばＣＤＲ３、例えばＨＣ ＣＤＲ３に近いまたは隣接するフレームワーク領域）を創製するために生成される。いくつかの実践形態において、突然変異誘発は、公知の領域または結合界面において可能性の高い領域を標的にする。さらに、突然変異誘発は、ＣＤＲに近いまたは隣接するフレームワーク領域を対象とできる。抗体の場合、突然変異誘発は、例えば、精密な段階的な改善を起こすためにＣＤＲの１つまたはいくつかにも限定され得る。同様に、特定されたリガンドが酵素である場合、突然変異誘発は、活性部位および周辺に結合できる抗体を提供できる。特定の実施形態において、ＣＤＲまたはフレームワーク領域（例えば、本明細書に記載のＨＣ ＣＤＲ３）を、エラープローンＰＣＲに供し、多様性を生成することができる。この手法は、「スロッピー（ｓｌｏｐｐｙ）」型のＰＣＲを使用し、「スロッピー（ｓｌｏｐｐｙ）」型のＰＣＲにおいて、ポリメラーゼは非常に高いエラー率（最大２％）を有し、野生型配列を増幅し、Ｐｒｉｔｃｈａｒｄら、（２００５年） Ｊ． Ｔｈｅｏｒ． Ｂｉｏｌ．２３４巻：４９７〜５０９頁およびＬｅｕｎｇ ら、（１９８９年）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ１巻：１１〜１５頁に一般的に記載されている。他の例示的な突然変異誘発技術は、ランダムな切断を使用するＤＮＡシャッフリング（Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４年）Ｎａｔｕｒｅ ３８９〜３９１頁；「核酸シャッフリング」と呼ばれる）、ＲＡＣＨＩＴＴ（商標）（Ｃｏｃｏら、（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９巻：３５４頁）、部位特異性突然変異誘発（Ｚｏｌｌｅｒら、（１９８７年）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １０巻：６４８７〜６５０４頁）、カセット突然変異誘発 （Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ（１９９１年）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２０８巻：５６４〜５８６頁）および縮重オリゴヌクレオチドの組み込み （Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ら、（１９９４年）ＥＭＢＯ Ｊ． １３巻：３２４５頁）を含む。
【００９２】
本発明の一部の実施形態において、残基の大部分がＳｅｒまたはＴｙｒのどちらかであるＤセグメントを選択する。一部の実施形態において、Ｄ領域をコードするＤＮＡを合成する場合、個々のＳｅｒまたはＴｙｒ残基は、コードされたアミノ酸がＳｅｒまたはＴｙｒのどちらかであるように、ＴＭＴ、ＴＭＣまたはＴＭＹにより、コードされる。
【００９３】
一部の実施形態において、本明細書に記載のＨＣ ＣＤＲ３配列を、対象となるＨＣ ＣＤＲ３をインフレームでコードする配列と、抗生物質耐性遺伝子、例えばＫａｎＲ遺伝子とを融合するステップおよびカナマイシン耐性に関して選択するステップにより、オープンリーディングフレームに関する選択に供することができる。ＣＤＲ３が終止コドンまたはフレームシフトを有する可能性のある細胞は、抗生物質耐性を有さず、その配列は除去される。
【００９４】
ヒト抗体重鎖ＣＤＲ３を含むライブラリの構築方法およびヒト抗体重鎖ＣＤＲ３を含むライブラリ。
【００９５】
抗体ライブラリは、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を有するタンパク質を含む、タンパク質のコレクションである。例えば、ラクダ化（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ）可変ドメイン（例えば、ＶＨドメイン）は、唯一の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質のライブラリのための足場として使用できる。別の実施例において、タンパク質は、対になり得る２つの可変ドメイン配列、例えばＶＨおよびＶＬドメインを含む。抗体ライブラリは、抗体コーディング配列を含む、例えば、本明細書において提供されるＨＣ ＣＤＲ３をコードする配列を含む核酸ライブラリから調製できる（抗体コーディングライブラリ）。
【００９６】
ディスプレイライブラリを使用する場合、抗体コーディングライブラリの個々のメンバーは、コードする抗体を伴うことができる。ファージディスプレイの場合、抗体タンパク質は、ファージでコートされたタンパク質を（直接的または間接的に）物理的に伴う。代表的な抗体ディスプレイライブラリのメンバーは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含むポリペプチドを提示する。ディスプレイライブラリのメンバーは、Ｆａｂ断片（例えば、２つのポリペプチド鎖を使用する）または一本鎖Ｆｖ（例えば、一本鎖ポリペプチドを使用する）として抗体を提示できる。他のフォーマットもまた使用できる。
【００９７】
Ｆａｂおよび他のフォーマットの場合のように、提示された抗体は、１つまたは複数の定常領域を、軽鎖および／または重鎖の一部として含むことができる。一実施形態において、個々の鎖は、例えばＦａｂの場合のように１つの定常領域を含む。他の実施形態において、さらなる定常領域が含まれる。有用な抗原結合部位を有すると特定された後で、１つまたは複数の定常領域を分子に加えることもまた可能である。例えば米国特許出願第２００３−０２２４４０８号を参照されたい。
【００９８】
抗体ライブラリは多くの方法により構築できる（例えば、ｄｅ Ｈａａｒｄら、（１９９９年）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ２７４巻：１８２１８〜３０頁；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ら、（１９９８年）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ４巻：１〜２０頁、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、（２０００年）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ２１巻：３７１〜８頁およびＨｏｅｔら、（２００５年）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２３巻（３号）：３４４〜８頁を参照されたい。
【００９９】
ライブラリの構築のための特定の実施形態において、本明細書に記載のＣＤＲ３を含む重鎖ならびにκおよびλ軽鎖が、個別のベクターにおいて最も良く構築される。第１に、合成遺伝子を設計し、個々の合成可変ドメインを統合する。軽鎖は、ＡｐａＬＩ（シグナル配列の最末端に位置する）およびＡｓｃＩ（終止コドンの後ろに位置する）のための制限部位に結合できる。重鎖は、ＳｆｉＩ（Ｐｅ１Ｂシグナル配列内に位置する）およびＮｏｔＩ（ＣＨ１およびアンカータンパク質の間のリンカーに位置する）に結合できる。Ｐｅ１Ｂ以外のシグナル配列、例えばＭ１３ｐＩＩＩシグナル配列もまた使用できる。
【０１００】
最初の遺伝子は、所望のＣＤＲの代わりに「スタッファー」配列を用いて作製できる。「スタッファー」は切り取られ、多様なＤＮＡに置き換えられるが、機能性の抗体遺伝子を発現できない配列である。例えば、スタッファーは、いくつかの終止コドンおよび正確な完成ライブラリベクターには発生しないであろう制限部位を含有し得る。スタッファーは、高度に示されたＣＤＲ配列の任意の１つを有することを避けるために使用される。
【０１０１】
本発明の別の実施形態において、重鎖およびκまたはλ軽鎖は、これらの鎖のクローニングを可能にする適切な制限部位を有する、（例えば、提示する、または提示および発現するための）単一のベクターまたは遺伝子パッケージにおいて構築される。このようなベクターを構築するための方法は周知であり、当分野において広く使用される。好ましくは、重鎖およびκ軽鎖ライブラリならびに重鎖およびλ軽鎖ライブラリは別々に調製されるであろう。
【０１０２】
最も好ましくは、提示は、Ｍ１３ファージの誘導体の表面上である。最も好ましいベクターは、Ｍ１３の全遺伝子、抗生物質耐性遺伝子およびディスプレイカセットを含有する。カセットとして、遺伝子の多様なファミリーのメンバーの導入および除去を可能にする制限部位を有する好ましいベクターが提供される。好ましいベクターは、ファージの増幅に使用される成長条件下で、再構成に対して安定である。
【０１０３】
本発明の別の実施形態において、本発明の方法により獲得された多様性は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を提示および／または発現するファージミドベクター（例えば、ｐＭＩＤ２１（表３５に示したＤＮＡ配列））において提示および／または発現され得る。このようなベクターを使用し、他のベクターまたはファージを使用する、その後の提示および／または発現のために多様性を保存することもできる。
【０１０４】
さらに他の実施形態において、２００８年２月１３日出願のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ６１／０２８，２６５、２００８年４月１０日出願のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６１／０４３，９３８および２００９年２月１３日出願のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１２／３７１，０００に記載の、軽鎖の高速最適化または「ＲＯＬＩＣ」と呼ばれる方法では、ＬＣの大型の集団が、それらをファージ上に提示するファージベクター中に配置される。ＨＣの小型の集団（例えば、３、１０または２５）は、ＨＣ、例えば本明細書に記載のＣＤＲ３を有するＨＣがペリプラズム中に分泌されるように、Ｅ．ｃｏｌｉ中にクローン化される。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉを、ＬＣの大型の集団をコードするファージベクターに感染させ、ファージ上にＨＣ／ＬＣタンパク質の対合を作製する。ファージ粒子は、ＬＣ遺伝子のみを担持する。
【０１０５】
別の態様において、２００８年２月１３日出願のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ６１／０２８，２６５、２００８年４月１０日出願のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６１／０４３，９３８および２００９年２月１３日出願のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１２／３７１，０００にさらに記載の、重鎖の経済的選択または「ＥＳＣＨ」と呼ばれる方法において、ＬＣの小型の集団が、それらの分泌を起こすベクター中に配置され得る。ＣＤＲ３を含む本明細書において提供されるＨＣのライブラリのような、ＨＣの新しいライブラリがファージ中に構築される。次いでＬＣおよびＨＣは、感染のさらにもっと有効な方法により組み合わせることができる。有効なＨＣの小型のセットが選択されたら、これらを使用して、ＲＯＬＩＣに供し、最適なＨＣ／ＬＣの対合を得る、または古典的選択のためのＬＣのＦａｂライブラリにクローン化されるように使用できる。
【０１０６】
本発明の別の実施形態において、本発明の方法により獲得される多様性は、真核細胞、例えば酵母ベクターにおける発現、例えば酵母細胞における発現に適したベクターを使用して提示および／または発現され得る 。
【０１０７】
タンパク質ディスプレイの他の型は、細胞ベースの提示（例えばＷＯ０３／０２９，４５６を参照されたい）；リボソームディスプレイ（例えば、Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ ら、（１９９４年） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１巻：９０２２頁およびＨａｎｅｓ ら、（２０００年）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １８巻：１２８７〜９２頁を参照されたい）；タンパク質−核酸融合（例えば、米国特許第６，２０７，４４６号を参照されたい）；および非生物学的タグの固定（米国特許第５，８７４，２１４号を参照されたい）を含む。
【０１０８】
本開示のライブラリから単離された抗体を分析し、ＬＣの型および最も近い生殖系列遺伝子を決定できる。好ましい実施形態において、非生殖系列フレームワーク残基は、結合親和性および特異性が許容不可能な程度に悪影響を与えない限り、生殖系列アミノ酸に戻される。置換は、群として、または１つずつ実施され得る。ヒト生殖系列配列は、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ， Ｉ．Ａ．ら、１９９２年、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２７巻：７７６〜７９８頁；Ｃｏｏｋ， Ｇ． Ｐ．ら、１９９５年、Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １６巻（５号）：２３７〜２４２頁；Ｃｈｏｔｈｉａ， Ｄ． ら、１９９２年、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏ．２２７巻：７９９〜８１７頁に開示されている。Ｖ ＢＡＳＥの要覧は、ヒト免疫グロブリン可変領域配列の包括的な総覧を提供する（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ， Ｉ．Ａ． らにより編纂、 ＭＲＣ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）。抗体は、結合特性が実質的に保有される限り、フレームワーク領域中の１つまたは複数の非生殖系列アミノ酸を抗体の対応する生殖系列アミノ酸に戻すことによって「生殖系列化」される。類似の方法は、定常領域、例えば免疫グロブリン定常ドメインにおいてもまた使用できる。
【０１０９】
例えば、抗体は、例えばフレームワーク、ＣＤＲまたは定常領域において、１つ、２つ、３つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含み、より参照生殖系列配列に近づけることができる。１つの例示的な生殖系列化の方法は、単離抗体の配列に類似する（例えば、特定のデータベースにおいて最も類似の）、１つまたは複数の生殖系列配列を特定するステップを含む。次いで、（アミノ酸レベルにおいて）突然変異を、増加的に、または他の突然変異と組み合わせて、単離抗体中に作製する。例えば、一部またはすべての生殖系列の突然変異候補をコードする配列を含む核酸ライブラリを作製する。次いで、突然変異を起こした抗体を評価し、例えば、単離抗体に対して１つまたは複数のさらなる生殖系列残基を有し、未だ有用である（例えば、機能活性を有する）抗体を特定する。一実施形態において、可能な限り多くの生殖系列残基を単離抗体に導入する。
【０１１０】
一実施形態において、突然変異誘発を使用し、１つまたは複数の生殖系列残基を、フレームワークおよび／または定常領域に置換または挿入する。例えば、生殖系列のフレームワークおよび／または定常領域残基は、改変された非可変領域と類似（例えば、最も類似）の生殖系列配列に由来することができる。突然変異誘発後、生殖系列残基または残基が許容される（すなわち、活性を無効にしない）場合、抗体の活性（例えば、結合活性または他の機能活性）を評価し、決定できる。類似の突然変異誘発は、フレームワーク領域において実施できる。
【０１１１】
生殖系列配列の選択は、さまざまな方法で実施できる。例えば、選択性または類似性に関する所定の基準、例えば、少なくとも特定のパーセントの同一性、例えば、少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または９９．５％の同一性を満たす場合、生殖系列配列は選択され得る。この選択は、少なくとも２、３、５または１０種の生殖系列配列を使用して実施できる。ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の場合、類似の生殖系列配列の特定は、１つのこのような配列の選択を含むことができる。ＣＤＲ３の場合、類似の生殖系列配列の特定は、１つのこのような配列の選択を含むことができるが、アミノ末端部分およびカルボキシ末端部分に別々に寄与する２つの生殖系列配列の使用を含んでもよい。他の実践形態において、１つを超えるまたは２つの生殖系列配列を使用し、例えば、コンセンサス配列を形成する。
【０１１２】
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および軽鎖多様性
ＨＣ ＣＤＲ３のライブラリは、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２および軽鎖における多様性のバックグラウンドに構築されると理解するべきである。軽鎖の多様性は、ＨＣの多様性として同じＤＮＡ分子中にコードされ得、またはＬＣおよびＨＣの多様性は、別々のＤＮＡ分子にコードされ得る。表２２において、シグナル配列の融合は、：：ＶＨ：：ＣＨ１：：Ｈｉｓ６：：Ｍｙｃ：：ＩＩＩｓｔｕｍｐである。ＣＤＲ１は残基３１〜３５を含み、残基３１、３３および３５に多様性がある。一実施形態において、残基３１、３３および３５は、システインを除く任意のアミノ酸型であってよい。ＣＤＲ２は、残基５０から６５を含む。５０、５２、５２ａ、５６および５８の位置に多様性がある。一実施形態において、残基５０および５２は、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｔｙｒの任意の型であってよく、残基５２ａはＰｒｏまたはＳｅｒであってよく、残基５６および５８は、Ｃｙｓを除く任意のアミノ酸型であってよい。ＨＣ ＣＤＲ３の多様性は、少なくとも１．Ｅ４、１．Ｅ５、１．Ｅ６、１．Ｅ７、５．Ｅ７または１．Ｅ８であるＨＣ ＣＤＲ１および２の多様性にクローン化される。
【０１１３】
一実施形態において、残基３１、３３、３５、５０、５２、５６および５８は、ＣｙｓまたはＭｅｔを除く任意のアミノ酸型であってよく、残基５２ａは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＰｒｏまたはＴｙｒであってよい。ＨＣ ＣＤＲ３の多様性は、少なくとも１．Ｅ４、１．Ｅ５、１．Ｅ６、１．Ｅ７、５．Ｅ７または１．Ｅ８であるＨＣ ＣＤＲ１および２の多様性にクローン化される。
【０１１４】
一実施形態において、ＨＣの多様性は、軽鎖の多様性を含有するベクター（ファージまたはファージミド）にクローン化される。この多様性は、少なくとも２５、５０、１００、５００、１．Ｅ３、１．Ｅ４、１．Ｅ５、１．Ｅ６、または１．Ｅ７である。ＨＣ ＣＤＲ３の多様性は、少なくとも２２１、２７２、５００、１０００、１．Ｅ４、１．Ｅ５、１．Ｅ６、１．Ｅ７、１．Ｅ８または１．Ｅ９である。
【０１１５】
一実施形態において、ＨＣの多様性は、ファージタンパク質、例えばＩＩＩ、ＶＩＩＩ、ＶＩＩ、ＶＩもしくはＩＸまたは提示を起こすために十分なこれらの１つの断片上にＨＣを提示するファージベクターにクローン化され、軽鎖は、個々の細胞が軽鎖を分泌する細胞コレクションに感染することによってＨＣに組み込まれる。細胞中の軽鎖の多様性は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５または１００である。ＨＣ ＣＤＲ３の多様性は、少なくとも２２１、２７２、５００、１０００、１．Ｅ４、１．Ｅ５、１．Ｅ６、１．Ｅ７、１．Ｅ８または１．Ｅ９である。
【０１１６】
表３０は、Ｐｌａｃプロモーターの調節下で重鎖に関するディスプレイカセットである、ｂｌａ遺伝子を担持するファージベクターＤＹ３ＦＨＣ８７（配列番号：８９４）の配列を示す。ＤＹ３ＦＨＣ８７は、同様にＭ１３の全遺伝子を含有する。ベクター、例えばｐＬＣＳＫ２３（表４０の配列）（配列番号：８９６）における軽鎖の多様性を持つＦ＋Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を感染させる。ベクターｐＬＣＳＫ２３はＫａｎＲ遺伝子を担持する。Ｐｌａｃプロモーターの調節下で、シグナル配列を有する、塩基２２１５で始まる遺伝子（塩基２２１５〜２２７７）、ＶＬ（この配列において、ＶＬは塩基２２７８から塩基２５９８の（配列番号：８９７）に示される配列をコードする）、塩基２５９９から２９２２のＣκ、２９２３から２９３１のＮｏｔＩ部位を許容するリンカーおよびＶ５タグ（塩基２９３２〜２９７３）がある。２２５９〜２２７１にＳｆｉＩ部位および２６０２〜２６０５にＫｐｎＩ部位があり、Ｖκの置き換えを容易にさせる。（配列番号：８９７）は、分泌されるタンパク質の例である。ＣκおよびＶ５タグは一定であることを理解すべきである。表１９に示されるすべてのタンパク質（ＶＫ１Ｏ２ｇｌ−ＪＫ３、ＶＫ１Ｏ２ｖａｒ１、ＶＫ１Ｏ２ｖａｒ２、ＶＫ１Ｏ２ｖａｒ３、ＶＫ１Ｏ２ｖａｒ４、ＶＫ１Ｏ２ｖａｒ５、ＶＫ３Ｌ６ｇｌ−ＪＫ４、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ１、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ２、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ３、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ４、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ５、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ６、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ７、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ８、ＶＫ３Ａ２７ｇｌ−ＪＫ３、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ１、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ２、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ３、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ４、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ５、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ６、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ７、ＶＫ３Ｌ２ｇｌ−ＪＫ３、およびＶＫ１ｇｌＬ８−ＪＫ５）は、カルボキシ末端に結合したこれらの配列を有するであろう。
【０１１７】
軽鎖の多様性
表８００は、３−２３と十分に対合することが公知であり、５つのＣＤＲの突然変異を有し、３−２３に基づく１つのＨＣを有するκＬＣ（軽鎖）を示し、ＬＣ Ｋ１（Ｏ１２）：：ＪＫ１は、タンパク質標的に対して高親和性のＡｂを作製する。Ｏ１２は、頻繁に使用されるＶＫＩである。個々のＣＤＲを変化した集団と置き換えることができるように、この遺伝子は、シグナル配列の（ＡｐａＬＩ）、ＦＲ１（ＸｈｏＩ、ＳｇｆＩ）、ＦＲ２（ＫｐｎＩ）、ＦＲ３（ＸｂａＩ）およびＦｒ４：：Ｃκ（ＢｓｉＷＩ）において、有用で、異なる制限部位を有するように設計されている。
【０１１８】
ヒトＬＣにおいて、ＣＤＲ３は最も重要であり、ＣＤＲ１が次に重要である。ＣＤＲ２は、ほとんどＡｇと接触しない。多様性を、表９００および表１０００（ＣＤＲ１）、表１１００および表１２００（ＣＤＲ２）、表１３００、１４００および１５００（ＣＤＲ３）に示すようにＣＤＲに導入する。重鎖の経済的選択（ＥＳＨＣ）のために、少数の、例えば表１２００のようにＣＤＲ３に多様性を有する５０のＬＣを、ペリプラズムへの分泌のためにｐＬＣＳＫ２４における発現に関して選別した。個々の細胞系が、例えば５０またはそれより少ないＬＣを含有するように、いくつかの細胞系を維持する場合、より多くのＬＣを使用できる。
【０１１９】
表９００は、ＬＣ ＣＤＲ１に関する多様性を示す。このライブラリは、「許容」として示されるＡＡ型の追加の多様性を有する、Ｏ１２残基を含有することができ、表９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００において、「許容」は「さらなる許容型」と解釈する。Ｏ１２は、Ｒ２４ＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ３４を有する。他のＶＫ１遺伝子座は、２４にＱを有する。他の遺伝子座は、２５にＭを有する。Ｓ２６およびＱ２７は、ＶＫＩにおいて不変である。他のＶＫＩ遺伝子座は、２８にＤまたはＧを有する。Ｉ２９およびＬ３３は、ＶＫＩにおいて不変であり、側基は内側を向いている。他のＶＫＩ遺伝子座は、３０、３１、３２、および３４において、表９００に示す多様性を許容する。表９００において、１１の位置のうち７つだけが変化し、総多様性は５７６である。
【０１２０】
表１０００は、ＬＣ ＣＤＲ１に関する高レベルの多様性を示す。ここでは１１の位置のうち８位が変化している。一定であるものは組み込み部位から離れているか、または埋もれた側基を有する。
【０１２１】
表１１００は、ＣＤＲ２に関する低レベルの多彩性を示す。ＣＤＲ２は、抗原結合部位から離れており、ここでは多様性はあまり有用ではないと思われる。実際に、ＧＬの多様性は非常に限定される。表１１００は、ＧＬの多様性を含む。表１２００は、高レベルの多様性を含有し、１９２０の配列を許容する。
【０１２２】
表１３００は、ＬＣ ＣＤＲ３に関する低レベルの多様性、２１６０の配列を示す。表１４００は、１０５，８４０配列を許容する高レベルを示す。
【０１２３】
ＲＯＬＩＣのために、表９００、１１００および１３００に示した多様性を有する、約３×１０７のＬＣを作製した。
【０１２４】
重鎖の多様性
Ａｂ ＨＣ（重鎖）は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３において多様性を有する。配列および長さ双方の多様性があるので、ＣＤＲ３における多様性は特に複雑である。配列多様性はランダムではない。Ａｂ遺伝子を作る細胞は、ＶセグメントとＤセグメントとＪＨセグメントを接合する。Ｄセグメントは任意選択であり、認識可能なＤを有する、天然のヒトＡｂの約半分である。０から多数の塩基が付加または除去される、Ｖ−Ｄ、Ｄ−ＪまたはＶ−Ｊの境界において広範囲に編集され得る。生殖系列Ｖ：：Ｄ：：ＪＨを有するＡｂは、生殖系列Ａｂと見なすことができる。
【０１２５】
ヒトＤセグメントを、表２１に示す。個々の生殖系列（ＧＬ）Ｄセグメントは、３つのフォワードリーディングフレームのいずれかにおいて、Ａｂ遺伝子中に出現する。いくつかのリーディングフレームにおいて、いくつかのＤセグメントは終止コドンをコードする。これらのＤセグメントは、改変された終止コドンをほとんど生じない。表６００は、個々のＤセグメントの頻度を、観察された全Ｄセグメントのパーセントとして示す。Ｄセグメントを含有する、本明細書の例の大部分は、非常に一般的なＤ（観察された全Ｄセグメントの２％より大きい）を使用する。
【０１２６】
一態様において、本発明は、３−２３（または別のＶＨ、例えば４−３４）と、ａ）（Ｓ、Ｙ、Ｄ、Ｒ、Ｎ）を含むセットから選別された多数のアミノ酸、ｂ）Ｄ領域、ｃ）ＪＨ領域およびｄ）ＪＨ領域のＦＲ４部分、の１つとの融合による、ＡｂＨＣ遺伝子の構成に関する。これらの融合は、ＧＬ３−２３あるいはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２に合成多様性を有する３−２３であってよい。ＨＣ ＣＤＲ３の長さは約３から約２４までの任意の数であってよい。好ましくは、ライブラリは、６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０の長さのＨＣ ＣＤＲ３を有するメンバーを含有するであろう。あるいは、長さは５、８、１１、１４、１７および２０または任意の他の組合せであってよい。
【０１２７】
表２１は、長さ６から２０の適切なＣＤＲ３の設計の多くの例を示す。２列に大文字で明記したコドンは、ｗｏｂｂｌｉｎｇを用いて合成される。３列は、ドーピングのレベルを示す。表１００は、さまざまな長さのＨＣ ＣＤＲ３を組み合わせ、ほぼすべてのタンパク質標的と結合するＡｂを含有することが期待されるライブラリの形成が可能である比率を示す。
【０１２８】
【表１】
長さ６に関して、表２１は４つの例を示す。例えば、６ａは、ｗｏｂｂｌｉｎｇされた最初の６つのＡＡを有するＪＨ１と直接接合されたＶＨ（３−２３）を有し、６ｂは、ＪＨ１のＦＲ４ ＡＡと接合された、第２のリーディングフレーム中のＤ４−１７と接合されたＴｙｒを有し、および６ｃは、ＪＨ１のＦＲ残基に接合されたＤ５−５（３）を有する。これらは異なる種類の多様性をもたらすので、すべてを含むことが好ましいが、これらの１つだけを含有するライブラリも有用なＡｂをもたらすはずである。
【０１２９】
長さ８に関して、表２１は３つの例を示す。８ａはＪＨ１のすべてに融合されたＹＹを有し、一方、８ｂは、ＪＨ１のＦＲ領域に融合されたＤ６−１３（１）に融合された１つのＹを有する。長さ１０、１２、１４、１６および２０もまた、表２１に示す。ＨＣ ＣＤＲ３の多様性は、生殖系列３−２３または合成多様性を含有する３−２３において構築できる。あるいは、異なるＶＨ、例えば４−３４を使用できる。
【０１３０】
ＲＯＬＩＣは、ＨＣの小型の集団が、Ｆ＋Ｅ．ｃｏｌｉにおいて可溶性タンパク質として発現される方法である。この集団を、ＬＣ：：ＩＩＩｓｔｕｍｐの融合を担持するファージに感染させる。作製されたファージは、それらを作製する細胞のペリプラズムに由来するＨＣを得る。これらのファージは固定された標的に結合でき、バインダーは、非バインダーから分離される。回収されたファージが増殖した場合、ファージはＬＣおよびＨＣの間の関連性を継続するためにもたらされるので回収されたファージは同じ型の細胞を探すはずであり、したがって集団のサイズは重要である。したがって、個々の細胞系におけるＨＣの数は小さいことが望ましい。したがって、個々の細胞系において、最大１０、２０、３０，または４０の異なるＨＣを有する、多数の細胞系を維持することが望ましいと思われる。したがって、１、２、４、６、８、１０、２４、４８または９６の細胞系を有することができ、同じ数の平行したファージの産生、選択および増幅を実施する。１または２ラウンド後、ＥＬＩＳＡアッセイにより、標的に結合したファージの産生に関してコロニーを試験する。個々のＥＬＩＳＡ＋コロニーは、有用なＬＣおよび有用なＨＣを含有するが、それらはＤＮＡの同じ破片ではない。にもかかわらず、本発明者らは、個々のＬＣおよび個々のＨＣの始まりおよび末端を知っており、したがって、コロニーにＰＣＲを使用し、ディスプレイファージもしくはファージミドまたはＦａｂ産生プラスミドに送り込むことができるＦａｂディスプレイまたはＦａｂ分泌カセットを作製できる。
【０１３１】
ＨＣの効率的選択（ＥＳＨＣ）において、ＲＯＬＩＣにおけるＬＣおよびＨＣの役割を逆転させ、それらがＦ＋Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズム中に可溶性タンパク質として作製されるように、プラスミド中にＬＣを有する。ＬＣ遺伝子を全く有さないファージベクターにおいてＨＣの多様性を作製する。ＬＣ作製Ｆ＋Ｅ．ｃｏｌｉを、ＨＣ担持ファージに感染させる。ＨＣ遺伝子ならびにＨＣおよびＬＣタンパク質の双方を担持するファージを得る。これらのファージを標的への結合のために選択する。多くのＡｂにおいて、ＬＣは許容状態であり、結合親和性に対してあまり寄与していない。最も優れたＬＣの選別は、親和性を非常に増加できるが、ＬＣの非常に限定されたレパートリーを有するＦａｂの選択が通常可能である。したがって、ＬＣ作製Ｆ＋Ｅ．ｃｏｌｉ中のフレームワーク領域にＬＣ、好ましい生殖系列の小さいセットを配置する。例えば、ＬＣ細胞系に２５のＬＣが存在する場合、作製する必要のある形質転換細胞の数を２５倍減少させる。
【０１３２】
記載したライブラリは、さまざまな長さのＨＣ ＣＤＲ３を有する。適切な折り畳みを指示するために、ＨＣ ＣＤＲ３は、ＪＨセグメントの大部分、すべて、もしくはフレームワーク部分と接合されるＤセグメントを有するか、または有さない。この配列は、ｗｏｂｂｌｉｎｇしたＤＮＡ合成を使用して多様化される。このことは、任意の位置の任意のアミノ酸型を理論上許容するが、実践において、実際の配列は、親配列および遺伝子コード表において近いＡＡ型に対して強くバイアスがかかっている。
【０１３３】
ＥＳＨＣを使用することによって、合成ＨＣ ＣＤＲ３の多様性の新規な設計をサンプリングすることができる。所与の実施例において、例えば５０ＬＣのプールを使用する。５×１０８のＨＣのライブラリは、２．５×１０１０の旧式のライブラリと同様に機能し、必要な労力は非常に少ないはずである。
【０１３４】
配列をｗｏｂｂｌｉｎｇする場合、最初のコドンの選別は、ライブラリ中に見られるＡＡの実際の混合物に影響を与える。表３００は、アミノ酸置換が、個々の開始親コドンから１、２または３つの塩基変化を要求することを示す。例えば、本発明者らが、Ａｌａのためにｇｃｔまたはｇｃｃで開始した場合、３種すべての終止コドンは３つの塩基変化を要求し、それはまれである。７６：８：８：８混合物を使用する場合、Ａｌａは、事例の５７％（０．７６×０．７６）で出現するであろう。Ｖ、Ｇ、Ｔ、Ｐ、Ｓは、個々に約６％で出現し、Ｄは約３％で出現する。Ｅ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、ＣおよびＲは、約１０倍下がるであろう。Ｍ、Ｗ、Ｑ、Ｋ、Ａｍ、ＯｃおよびＯｐは、さらによりまれであろう。本発明者らがｇｃａで開始した場合、その後一塩基変化だけを必要としてＥはＤに置き換えられるが、オパールおよびオーカーの終止は二塩基変化だけを要求し、このことは望ましくない。好ましいコドンに、星印（＊）で印をつけてある。セリンの選択は、高い頻度でＹをＳに置換するという本発明者らの要望を困難にする。このことは、たった２つの塩基が親と異なる群にＯｐおよびＯｃをもたらす。この問題は、ＨＣ ＣＤＲ３レパートリーを、抗生物質耐性遺伝子、例えばＫａｎＲまたはＡｍｐＲの前にクローン化し、耐性を選択すること、したがって終止コドンを含有するメンバーを除去することによって克服することができる。さらに、このライブラリは、終止の代わりにＱを挿入するｓｕｐＥ Ｅ．ｃｏｌｉにおいて作製できる。
【０１３５】
【表２】
【０１３６】
【表３】
【０１３７】
【表４】
ライブラリの使用方法
オフレート選択（Ｏｆｆ−Ｒａｔｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）。解離速度が遅いことは、特にポリペプチドとそれらの標的との間の相互作用に対して高親和性の予測であり得るので、本明細書に記載の方法は、標的に対する結合相互作用に関する、所望の（すなわち低下した）動力学的解離速度を有するリガンドの単離に使用できる。
【０１３８】
ディスプレイライブラリ由来の、ゆっくり解離する抗体を選択するために、ライブラリを、固定された標的に接触させる。固定された標的を、次いで非特異的に結合された抗体または弱く結合された抗体を取り除く第１の溶液を用いて洗浄する。次いで、結合された抗体を、飽和量の遊離の標的を含む第２の溶液を用いて溶出する、すなわち、粒子に結合していない標的の再現。遊離の標的は、標的から解離する抗体に結合する。溶出された抗体の再結合は、かなり低い濃度の固定された標的に対して、飽和量の遊離の標的により有効に阻止される。
【０１３９】
第２の溶液は、実質的に生理学的な溶液条件、またはストリンジェントである溶液条件（例えば、低ｐＨ、高ｐＨまたは高塩濃度）を有することができる。通常、第２の溶液の溶液条件は、第１の溶液条件と同一である。第２の溶液の分画を時間的順序で収集し、早期から後期の分画に識別する。後期分画は、早期分画中の生体分子より、遅い速度で標的から解離する抗体を含む。さらに、延長してインキュベートした後もまだ標的に結合されたままの抗体を回収することも可能である。これらは、カオトロピック条件を使用して解離する、または標的に結合したまま増幅することのどちらかが可能である。例えば、標的に結合したファージを、細菌細胞に接触させることができる。
【０１４０】
特異性に関する選択またはスクリーニング。本明細書に記載のディスプレイライブラリのスクリーニング方法は、非標的分子に結合する抗体を廃棄する、選択またはスクリーニング方法を含むことができる。非標的分子の例は、例えば、標的分子と構造的に異なる炭水化物分子、例えば、標的分子と異なる生物学的特性を有する炭水化物分子を含む。硫酸化炭水化物の場合は、非標的は、硫酸塩を有さない、または異なる位置に硫酸塩を有する同じ炭水化物であり得る。リン酸化ペプチドの場合は、非標的は、リン酸塩を有さない同じペプチド、または異なるリン酸化ペプチドであり得る。
【０１４１】
一実践形態において、所謂「陰性選択」ステップを使用し、標的と、関連する非標的分子および関連するが異なる非標的分子とを区別する。ディスプレイライブラリまたはそれらのプールを、非標的分子に接触させる。非標的分子に結合しないメンバーを収集し、続く、標的分子に対する結合に関する選択または続く陰性選択にも使用する。陰性選択ステップは、標的分子に結合するライブラリメンバーを選択する前または後であってよい。
【０１４２】
別の実践形態において、スクリーニングステップを使用する。ディスプレイライブラリメンバーを標的分子に対する結合に関して単離した後で、個々の単離ライブラリメンバーを、非標的分子（例えば、上記の非標的）に結合するその能力に関して試験する。例えば、ハイスループットＥＬＩＳＡスクリーニングを使用してこのデータを得ることができる。ＥＬＩＳＡスクリーニングを使用して、標的に対する個々のライブラリメンバーの結合に関する定量的データを得ることもできる。非標的および標的の結合データを（例えば、コンピュータおよびソフトウェアを使用して）比較し、標的に特異的に結合するライブラリメンバーを特定する。
【０１４３】
特定の実施形態において、本発明のＣＤＲ３を含む抗体は、炭水化物に結合できる。炭水化物の結合に関して抗体を評価する方法は、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、免疫ブロッティングおよび蛍光活性化細胞分類を含む。これらの方法を使用して、閾値を超える、例えば、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭおよび１０ｐＭを超えるＫＤを有する抗体を特定できる。
【０１４４】
ＥＬＩＳＡ。ディスプレイライブラリによりコードされるタンパク質は、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して結合特性に関してスクリーニングすることもできる。例えば、個々のタンパク質を、底表面を標的、例えば限定量の標的でコーティングしてあるマイクロタイタープレートに接触させる。プレートを緩衝液で洗浄し、非特異的に結合されたポリペプチドを取り除く。次いで、プレートに結合されたタンパク質の量を、プレートをポリペプチド、例えば、ポリペプチドのタグまたは一定部分を認識できる抗体を用いてプローブすることによって決定する。抗体を酵素、例えばアルカリフォスファターゼに連結すると、適切な基質が提供された場合、熱量が発生する。タンパク質は、細胞から精製でき、または例えば繊維状バクテリオファージコートとの融合として、ディスプレイライブラリのフォーマットにおいて分析できる。あるいは、標的分子、例えば炭水化物部分を含有する標的を発現する細胞（生細胞または固定細胞）を、マイクロタイタープレートに播種し、ディスプレイライブラリに存在する、またはディスプレイライブラリからの選択により得られるペプチド／抗体の親和性を試験するために使用できる。
【０１４５】
ＥＬＩＳＡアッセイの別の型において、多様性ストランドライブラリの個々のポリペプチドを使用して、マイクロタイタープレートの異なるウェルをコートできる。その後、一定の標的分子を使用してＥＬＩＳＡを進行し、個々のウェルを照会する。
【０１４６】
細胞結合アッセイ。抗体を、１つまたは複数の細胞型、例えば造血細胞と相互作用するそれらの能力に関して評価することができる。蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）は、タンパク質と細胞との相互作用を試験するための、例示的な方法の１つである。抗体を、細胞に結合する前または後に、蛍光色素分子を用いて直接または間接的に標識し、その後細胞を、ＦＡＣＳ分類装置において数える。
【０１４７】
他の細胞型は、当分野において公知の方法によりＦＡＣＳ用に調製できる。
【０１４８】
均一結合アッセイ。候補ポリペプチドと標的との結合相互作用を、均一アッセイを使用して分析できる、すなわち、例えばアッセイの全成分を加えた後に追加の液体操作を必要としない。例えば蛍光共鳴エネルギー転位（ＦＲＥＴ）を、均一アッセイとして使用できる（例えば， Ｌａｋｏｗｉｃｚら、米国特許第５，６３１，１６９号；Ｓｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓら、米国特許第４，８６８，１０３号を参照されたい）。第１の分子の蛍光色素分子標識（例えば、分画中の特定された分子）は、第２の分子が第１の分子に近接している場合、その放出蛍光エネルギーが第２の分子（例えば標的）上の蛍光標識により吸収され得るように選択される。第２の分子上の蛍光標識は、それが転移エネルギーを吸収する場合、蛍光を発する。標識間のエネルギー転位の効率は、分子を分離する距離に関係するので、分子間の空間的関係が評価され得る。分子間において結合が起こる状況において、アッセイにおいて「受容体」分子の標識の蛍光発光は、最大であるはずである。ＦＲＥＴによるモニター用に構成される結合事象は、当分野において周知の標準的蛍光検出手段（例えば、蛍光光度計を使用して）を介して簡便に測定できる。第１または第２の結合分子の量を滴定することによって、結合曲線を作製し、平衡結合定数を推定することができる。
【０１４９】
均一アッセイの別の例は、アルファスクリーン（Ａｌｐｈａ Ｓｃｒｅｅｎ）（Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｍｅｒｉｄｅｎ Ｃｏｎｎ．）である。アルファスクリーンは、２種の標識されたビーズを使用する。一方のビーズは、レーザーで励起された場合、一重項酸素を発生する。他方のビーズは、第１のビーズから一重項酸素が拡散された場合、光のシグナルを発生し、一重項酸素と衝突する。シグナルは、２種のビーズが近接する場合にだけ発生する。一方のビーズは、ディスプレイライブラリのメンバーに結合させることができ、他方のビーズを標的に結合させることができる。シグナルを測定し、結合の程度を決定する。
【０１５０】
均一アッセイは、候補ポリペプチドを、ディスプレイライブラリのビヒクル、例えばバクテリオファージに結合させたまま実施できる。
【０１５１】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）。ディスプレイライブラリから単離された分子と標的との結合相互作用は、ＳＰＲを使用して分析できる。ＳＰＲまたは生体分子相互作用分析（Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＢＩＡ）は、反応体のいずれも標識せずに、生体特異性相互作用をリアルタイムで検出する。ＢＩＡチップの結合表面の質量の変化（結合事象の表示）は、表面近くの光の屈折率の変更（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学現象）をもたらす。屈折度の変化は検出可能なシグナルを発生し、これを生体分子間のリアルタイム反応の指標として測定する。ＳＰＲを使用するための方法は、例えば、米国特許第５，６４１，６４０号；Ｒａｅｔｈｅｒ （１９８８年）Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎｓ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ； Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ および Ｕｒｂａｎｉｃｚｋｙ（１９９１年） Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ６３巻：２３３８〜２３４５頁；Ｓｚａｂｏら、（１９９５年）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ５巻：６９９〜７０５頁ならびにＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＢ （Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）により提供されるオンライン供給源に記載されている。
【０１５２】
ＳＰＲからの情報を使用し、生体分子と標的との結合に関する平衡解離定数（ＫＤ）ならびにｋｏｎおよびｋｏｆｆを含む動力学的パラメーターの正確かつ定量的測定を提供できる。このようなデータを使用し、さまざまな生体分子を比較できる。例えば、多様性ストランドのライブラリから選択された核酸によりコードされるタンパク質を比較し、標的に関する高い親和性を有する、または遅いｋｏｆｆを有する個体を特定できる。さらに、この情報を使用し、構造活性相関（ＳＡＲ）を明らかにすることも可能である。例えば、親タンパク質の成熟型の動力学的パラメーターおよび平衡結合パラメーターを、親タンパク質のパラメーターと比較することもできる。所与の位置の変異体アミノ酸が、特定の結合パラメーター、例えば、高親和性および遅いｋｏｆｆと相関することを特定できる。この情報は、（例えば、ホモロジーモデリング、エネルギー最小化または結晶学もしくはＮＭＲによる構造決定を使用する）構造モデリングと組み合わせることができる。結果として、タンパク質とその標的との物理的相互作用の理解を系統立てて説明でき、他の設計方法を導くために使用できる。
【０１５３】
タンパク質アレイ。ディスプレイライブラリから特定されたタンパク質は、固体支持体、例えば、ビーズまたはアレイに固定できる。タンパク質アレイでは、個々のポリペプチドを、支持体の唯一のアドレスに固定する。通常、アドレスは、２次元のアドレスである。ポリペプチドアレイを作製する方法は、例えば、Ｄｅ Ｗｉｌｄｔら、（２０００年）Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １８巻：９８９〜９９４頁；Ｌｕｅｋｉｎｇら、（１９９９年） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２７０巻：１０３〜１１１頁； Ｇｅ（２０００年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８巻、ｅ３、Ｉ〜ＶＩＩ；ＭａｃＢｅａｔｈ および Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ （２０００年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９巻：１７６０〜１７６３頁；ＷＯ０１／４０８０３ならびにＷＯ９９／５１７７３Ａ１に記載されている。アレイのためのポリペプチドは、例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃ ＭｉｃｒｏＳｙｓｔｅｍｓ またはＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓによる市販のロボット装置を使用して高速でスポットできる。アレイの基板は、例えばニトロセルロース、プラスチック、ガラス、例えば表面改質ガラスであってよい。アレイは、多孔質のマトリックス、例えばアクリルアミド、アガロースまたは別のポリマーを含むこともできる。
【０１５４】
キット
本発明の任意の態様に従った方法の実践に使用するキットをさらに提供する。このキットは、必要なベクターを含むことができる。このようなベクターの１つは、通常一本鎖バクテリオファージの複製起点を有し、ｓｂｐメンバーの核酸を含有するか、またはファージカプシドタンパク質の成熟コード配列５’末端領域に、その挿入のための制限部位を有するかのどちらかであり、カプシドタンパク質外来性ポリペプチドと細胞膜周辺腔との融合を対象とする、前記部位の上流の分泌リーダーコード配列を有する。
【０１５５】
上記のＨＣ ＣＤＲ３をコードするパッケージならびに上記の方法のいずれかの使用により得ることができる、ＨＣ ＣＤＲ３およびそれらの断片および誘導体を含むポリペプチドを、さらに提供する。この誘導体は、別の分子、例えば酵素またはＦｃ尾部に融合したポリペプチドを含んでいてもよい。
【０１５６】
このキットは、遊離の形態のコードされたポリペプチドの発現のために、ＨＣ ＣＤＲ３の挿入用部位を有するファージベクター（例えば、ＤＹ３Ｆ８７ＨＣ）を含むことができる。このキットは、可溶性軽鎖、例えばｐＬＣＳＫ２３の発現用プラスミドベクターもまた含むことができる。このキットは、適切な細胞系（例えばＴＧ１）もまた含むことができる。ｐＬＣＳＫ２３によりコードされる軽鎖の多様性は、１０、１５、２０、２５、３０または５０であってよい。多様性においてＬＣは、フレームワーク領域中の生殖系列であること、およびＣＤＲ３および／またはＣＤＲ１に多様性を有することなど特定の望ましい特性を有するように構築または選別され得る。生殖系列は、高度に利用される生殖系列、例えば、κにはＶＫ１＿２−Ｏ２、ＶＫ３＿Ｉ−Ａ２７、ＶＫ３＿５−Ｌ６、ＶＫ３＿３−Ｌ２およびλにはＶＬ２＿２ａ２、ＶＬ１＿１ｃ、ＶＬ１＿１ｇ、ＶＬ３＿３ｒであってよい。
【０１５７】
例えば、生殖系列は、
ＶＫ１Ｏ２ｇｌ−ＪＫ３、ＶＫ１Ｏ２ｖａｒ１、ＶＫ１Ｏ２ｖａｒ２、ＶＫ１Ｏ２ｖａｒ３、ＶＫ１Ｏ２ｖａｒ４、ＶＫ１Ｏ２ｖａｒ５、ＶＫ３Ｌ６ｇｌ−ＪＫ４、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ１、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ２、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ３、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ４、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ５、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ６、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ７、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ８、ＶＫ３Ａ２７ｇｌ−ＪＫ３、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ１、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ２、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ３、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ４、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ５、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ６、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ７、ＶＫ３Ｌ２ｇｌ−ＪＫ３、ＶＫ１ｇｌＬ８−ＪＫ５およびＶＫ１ＧＬＯ１２−ＪＫ３（表１９に示すアミノ酸配列）に関する遺伝子をｐＬＣＳＫ２３にクローン化できる。
【０１５８】
【表５】
【０１５９】
【表６】
【０１６０】
【表７】
このキットは、本方法の実施に必要な補助成分を含むことができ、このような成分の特質は、当然ながら用いる具体的な方法に依存する。有用な補助成分は、ヘルパーファージ、ＰＣＲプライマー、緩衝液および／またはさまざまな種類の酵素を含むことができる。緩衝液および酵素は、本明細書に記載の戦略に従った、再構成された、または再構成されない免疫グロブリン遺伝子に由来する、Ｆｖ、ｓｃＦｖまたはＦａｂ断片をコードするヌクレオチド配列の調製を可能にするために、通常使用される。
【０１６１】
多様性を導入する方法
可変であるＤＮＡを作製する多くの方法がある。１つの方法は、混合ヌクレオチド合成（ＭＮＳ）の使用である。ＭＮＳの１つの型は、表５に示すようなヌクレオチドの等モル混合物を使用する。例えば、ＮＮＫコドンの使用により、２０種すべてのアミノ酸および１種のＴＡＧ終止コドンがもたらされる。分布は、３（Ｒ／Ｓ／Ｌ）：２（Ａ／Ｇ／Ｖ／Ｔ／Ｐ）：１（Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｗ／Ｙ）（例えば、Ａｒｇ、ＳｅｒおよびＬｅｕ各々３など）である。本明細書において「ｗｏｂｂｌｉｎｇ」と呼ばれる代替方法は混合ヌクレオチドを使用するが、等モル量ではない。例えば、親コドンがＴＴＣ（Ｐｈｅをコードする）であった場合、本発明者らは、Ｔの場所に（０．０８２ Ｔ、０．０６ Ｃ、０．０６ Ａおよび０．０６ Ｇ）の混合物およびＣの場所に（０．０８２ Ｃ、０．０６ Ｔ、０．０６ Ａおよび０．０６ Ｇ）の混合物を使用することができた。これにより、５９％の確率でＴＴＣまたはＴＴＴ（Ｐｈｅをコードする）、１３％のＬｅｕ、約５％のＳ／Ｖ／Ｉ／Ｃ／Ｙおよびさらに低い頻度で他のアミノ酸型がもたらされるであろう。
【０１６２】
Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｒｕｌｌｅら、（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ４５巻：３４０〜３頁（２００８年））は、ＩＩ型制限酵素を使用して、所謂「ｓｐｌｉｎｋｅｒ」に固定されているヘアピンオリゴヌクレオチド（ＰＨＯＮ）からトリヌクレオチドに変換する、可変ＤＮＡの合成方法を記載している。さらに、欧州特許ＥＰ第１１８１３９５号、ＥＰ第１４１１１２２号、ＥＰ第１３１４７８３号および欧州特許出願ＥＰ第０１１２７８６４．５号、ＥＰ第０４００１４６２．３号、ＥＰ第０８００６４７２．８号を参照されたい。固定されたＰＨＯＮおよびｓｐｌｉｎｋｅｒの混合物を使用することによって、所望のアミノ酸型が設計者の決定した比率を許容するライブラリを構築できる。したがって、１つのアミノ酸型が例えば８２％の確率で存在し、１８の他のアミノ酸型（Ｃｙｓを除く、すべての非親アミノ酸型）は、それぞれ２％で存在することを対象とできる。本明細書において、本発明者らは、このような合成を「ｄｏｂｂｌｉｎｇ」（ｄｉｇｉｔａｌ ｗｏｂｂｌｉｎｇ）と称することにする。一部の態様において、ｄｏｂｂｌｉｎｇがｗｏｂｂｌｉｎｇより好ましいが、部分的には、遺伝子コード表の構造はｗｏｂｂｌｉｎｇを起こし、大部分が保存的置換を起こすので、ｗｏｂｂｌｉｎｇは、有用な実施形態を提供する。ｄｏｂｂｌｉｎｇは、望まれないアミノ酸型を排除する可能性を提供する。ＣＤＲにおいて、不対システインは、治療用として承認されたＡｂにおいてさえ公知であるが、一部の実施形態では、それらを避けようとする。一部の実施形態において、ジスルフィドに近いループは重要な構造要素であり、不対システインは望ましくないため、システインの対を含有するＤ領域を多様化する場合、システインは変化させられない。
【０１６３】
加えて、親アミノ酸配列をコードするＤＮＡ分子を合成でき、フレームワーク領域において突然変異を避けるように、フレームワーク領域を含むプライマーを使用して、ＤＮＡをエラープローンＰＣＲに供することができる。
【０１６４】
【表８】
【実施例】
【０１６５】
本発明を、以下の実施例によりさらに例示するが、以下の実施例は決して限定として解釈されるべきではない。本出願を通して引用されたすべての参考文献、係属中の特許出願および公開された特許の内容は、参照により明確に本明細書に組み込まれる。
【０１６６】
（机上の実施例１）
非常に短いＨＣ ＣＤＲ３を有するライブラリ
非常に短いＨＣ ＣＤＲ３が当分野において記載されている。Ｋａｄｉｒｖｅｌｒａｊら、（２００６年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０３巻：８１４９〜５４頁はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ Ｂ ＩＩＩ型Ａｇ（ＧＢＳ−Ａｇ）に結合するが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの夾膜Ａｇには結合しない抗体中の４個のアミノ酸のＨＣ ＣＤＲ３配列を記載している。ＧＢＳ−Ａｇは、定期的にシアル化される。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの夾膜Ａｇ（ＳＰＣ−Ａｇ）は非常に似ているが、シアル酸基を欠いている。このような短いＨＣ ＣＤＲ３は、その中に炭水化物が結合できる広い溝を創製し、このようなＡｂは、既存の抗体ライブラリにおいて、非常にとてもまれである。したがって、現行ライブラリは、炭水化物に対する多種多様な潜在的バインダーをもたらさない。
【０１６７】
Ａｂ １Ｂ１は、ＧＢＳ−Ａｇに結合するネズミｍＡｂである；Ａｂ １ＱＦＵは、公知の３Ｄ構造および最も近い配列を有するｍＡｂである；１ＮＳＮは、長さ４のＨＣ ＣＤＲ３を有する、公知の３Ｄ構造の抗体である。３−２３ＨＣ構造の検査により、Ｒ９４（ＦＲ３の終了）のＣαからＷ１０４（ＦＲ４の開始）のＣαまでの、約１０Åの距離が得られた。１Ｂ１（ＮＷＤＹ（配列番号：２９））のＣＤＲ３は、ＡＡは、小型の側基だけを有する必要はなく、またはグリシンの大部分である必要もないことを示す。３個のアミノ酸（ＡＡ）は、ＰＰＰは機能しないが１０Åを架橋できる。実際に、本発明者らは、３個のＡＡと同じくらい短いＣＤＲ３を有するいくつかのＦａｂを得ているが、非常にまれである。
【０１６８】
短いおよび非常に短いＨＣ ＣＤＲ３が記載されているが、短いＨＣ ＣＤＲ３（例えば、３から５個のアミノ酸のＨＣ ＣＤＲ３）を有する、多くの（例えば、メンバーの約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約９５％を超える）メンバーを有するＡｂライブラリの作製を提案した人はいない。有効なライブラリを構築するための１つの手法は、Ｖ−ＪまたはＶ−Ｄ−Ｊのカップリングから生じ得るアミノ酸配列を最初に設計することである。長さ３、４または５のＣＤＲ３のために、本発明者らは、表７に示すアミノ酸配列から出発する。例えば、配列Ｖ−３ＪＨ１は、３−２３のＦＲ３（ＴＡＶＹＹＣＡＫ（配列番号：３０））のＣ末端、続くＮ末端から、ＦＲ４を開始するＴｒｐ−Ｇｌｙのアミノ酸３個前までを切り取ったＪＨ１を示す。Ｖ−３ＪＨ２は、ＦＲ３の末端、続く切り取られたＪＨ２を示す。Ｖ−３ＪＨ６の後ろの配列は、ＦＲ４を、ヒトＤセグメントから採取した三量体、続くヒトＪＨセグメントのＦＲ４領域に接合することによって構築される。３Ｄ３−３．３．２は、セグメントＤ３−３由来の三量体、第２のアミノ酸から出発する第３のリーディングフレームである。５Ｄ５−１２．２．３は、アミノ酸３から出発するリーディングフレーム２中のＤ５−１２由来の五量体である。生殖系列Ｄセグメントのいくつかは終止コドンを含有し、終止コドンが編集され離れる場合、それにもかかわらず終止コドンは天然抗体中に出現する。ここで本発明者らはＴＡＡおよびＴＡＧコドンのＴｙｒ（Ｙ）への変化の可能性が最も高く、ＴＧＡ終止はＴｒｐ（Ｗ）に突然変異する可能性が最も高いと仮定する。表２０は、ヒトＤセグメントのアミノ酸配列を示し、終止コドンの型は、ＴＡＧに関しては＊、ＴＡＡに関しては＠、ＴＧＡに関しては＄の使用により示される。表１１にあるのは、ヒトＤセグメントから構築できる２６６の異なる三量体である。ＴＡＡおよびＴＡＧ終止は、「ｙ」（すなわち小文字）として示されたＴｙｒに変化している。これらは、単一の塩基変化により、さらにＳｅｒ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、またはＧｌｕに変化し得る。ＴＡＧは、単一の塩基変化により、ＴｒｐならびにＴｙｒ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、ＳｅｒおよびＬｅｕに変化し得る。表１２は、ヒトＤセグメントを切り取ることによって得ることができる、２６６の異なる四量体である。表１３は、ヒトＤセグメントを切り取ることから得ることができる、２１５の異なる五量体を示す。表１４は、ヒトＤセグメントを切り取ることにより得ることができる、１５５の異なる六量体を示す。構築されるライブラリは、ＨＣ ＣＤＲ１およびＨＣ ＣＤＲ２に実質的な多様性を有する。ＨＣ ＣＤＲ３の配列多様性は、短いが許容できる配列を有することほど重要ではない可能性がある。ＪＨセグメントまたはＤセグメントの断片（例えば、３個またはそれ以上のアミノ酸）の多様性は、ヒト免疫系により構築でき、免疫原性である可能性が低い配列を提供する。
【０１６９】
一実施形態において、Ｃｙｓを含有する三量体、四量体および五量体は除外する。
【０１７０】
一実施形態において、Ｃｙｓを含有する、または終止を含有するＤ断片に由来する三量体、四量体および五量体は除外する。
【０１７１】
表１１の三量体、表１２の四量体、表１３の五量体を使用して構築される短いライブラリは、実質的多様性をそれぞれ２６６、２６６および２１５有する。このことを、これらの長さをペプチドの数と比較すると、それぞれ８０００、１６００００および３２０００００である。
【０１７２】
Ｖ−３Ｄ１−１．１．１−ＪＨ１は、ＦＲ３の最終部分、続くＤ１−１（ＲＦ１）からの３個のアミノ酸、すなわちＧＴＴ（配列番号：２５７）を含有する。Ｖ−３Ｄ１−１．２−ＪＨ１は、Ｄ１−１（ＲＦ１）のアミノ酸２〜４個を親ＣＤＲ３として使用する。Ｖ−３Ｄ３−３．３．３−ＪＨ２は、ＦＲ３の末端、続くＤ３−３（ＲＦ３）のアミノ酸３〜５個を示す。本発明は、ＦＲ３：：（ヒトＤセグメントの３、４、５個の終止を含まないＡＡ）：：ヒトＪＨ由来のＦＲ４を含む、任意のアミノ酸配列を含む。不対Ｃｙｓ残基を含有するＤ領域の断片は、不対Ｃｙｓ残基を含まないＤ領域の断片ほど好ましくない。Ｖ−５ＪＨ３において、ＪＨ３は、ＦＲ４の開始を規定するＴｒｐ−Ｇｌｙに対するコドンの前に４個だけコドンを有するため、「ｙ」で示されるＴｙｒが存在する。Ｖ−５ＪＨ４は、同じ理由で「ｓ」で示されるＳｅｒを有する。ｗｏｂｂｌｉｎｇを使用する場合、純度の好ましいレベルは、０．７５と０．９０との間である。本発明は、配列Ｖ−３ＪＨ１からＶ−３ＪＨ６、Ｖ−４ＪＨ１からＶ−４ＪＨ６およびＶ−５ＪＨ１からＶ−５ＪＨ６およびそれらを含有するライブラリを含む。本発明は、ＣＤＲ領域がヒトＤ領域由来の３、４または５個のアミノ酸セグメントにより置き換えられた配列およびそれらを含有するライブラリもまた含む。本発明は、親配列がＣＤＲ３領域において突然変異を起こしているＤＮＡおよびそれらを含有するライブラリを、さらに含む。好ましい実施形態は、ＣＤＲ３当たり塩基変化の平均数が１，２または３である実施形態である。突然変異誘発の方法は、エラープローンＰＣＲ、ｗｏｂｂｌｉｎｇおよびｄｏｂｂｌｉｎｇである。
【０１７３】
【表９】
【０１７４】
【表１０】
あるいは、領域ＸｂａＩからＢｓｔＥＩＩまでに対応し、ＫまたはＲである残基９４、続いて３、４または５つのＮＮＫコドン、続いてＦＲ４のＷＧ．．．を有するＤＮＡの３つの断片を合成できる。許容される変形は、２０３＋２０４＋２０５＝３，３６８，０００である。増幅後、これらのＤＮＡ分子を（より短い配列が、相対的にオーバーサンプリングされるように）１：１０：１００の比率で混合し、ＨＣ ＣＤＲ１／２の多様性を有するκライブラリをコードするファージミド内にクローン化する。１×１０９のライブラリは、有意な多様性をもたらし、小型から中程度の突出を有する標的に結合する抗体の単離を可能にするであろう。例えば、さまざまな炭水化物、さほど秩序だっていないタンパク質のループ（例えば、ＧＰＣＲ）は、非常に短いＨＣ ＣＤＲ３を有することにより創造される抗体中の溝から利益を得ることができる。λライブラリもまた構築できる。ＡＡ配列の比率は１：２０：４００であり、この比率は、より短い配列をより高密度にサンプリングするためには重要である可能性がある。Ａｂ中に大きくて広い溝を得ることは、厳密に１つの３ＡＡ ＣＤＲ３を要求するが、４ＡＡ ＣＤＲ３ではおそらくもう少し自由な余地があり、５ＡＡでは、さらにもっと自由な余地がある。この実施例において、前方のＷＧモチーフからＦＲ４のＪＨ６型を使用する。
【０１７５】
本発明者らの現行のκライブラリから、例えば、ａ）フレームワーク領域中の生殖系列、ｂ）ＣＤＲにおいて適切な多様性を示す、およびｃ）十分作製され、３−２３と良く対合する型である、２５のκ軽鎖のコレクションを選択できる。これらのＬＣは、ＫａｎＲを担持するベクターおよびファージをパッケージングしないシグナルから、Ｅ．ｃｏｌｉ内に作製される。次いで、ＬＣを有さないファージベクター中に本発明者らのＨＣライブラリを構築した。ＨＣおよびＬＣは、ＬＣ作製細胞をＨＣファージに感染させることにより交雑される。選択されたＨＣファージは、ＥＬＩＳＡ＋ファージを作製する細胞のＬＣを組み合わせることができ、またはＨＣは、全ＬＣの多様性を有するｐＭＩＤ２１内にクローン化できる。あるいは、選択されたＨＣはｐＨＣＳＫ８５に移動でき、ＲＯＬＩＣに使用して本発明者らのコレクションの全ＬＣと組み合わせることができる。λＬＣもまた使用できた。したがって、ファージ中の１×１０９ＨＣのライブラリは、１．２×１０１１（１．×１０９×１１７）のＦａｂライブラリに拡大できる。１×１０７のＣＤＲ１〜２と１０６のＨＣ ＣＤＲ３とを組み合わせた場合、個々のＣＤＲ３が５０のＣＤＲ１〜２と結びついた、５×１０７のライブラリを作ることができる。ファージ中の５×１０７のＨＣのライブラリは、６×１０９の旧式のライブラリと同様の結果ともたらすことができた。
【０１７６】
【表１１】
【０１７７】
【表１２】
または、現行のＨＣの多様性を、ＤＹ３Ｆ８７ＨＣ内にクローン化でき、上記のＣＤＲ３の多様性を、ＸｂａＩ−ＢｓｔＥＩＩ断片としてその多様性内にクローン化する。例えば、２５のＬＣのライブラリをｐＬＣＳＫ２３内にクローン化し、ＴＧ１ Ｅ．ｃｏｌｉ中に細胞系を創製するために使用する。これらの細胞を、新規なＨＣ ＣＤＲ３（およびＣＤＲ１〜２）の多様性を持つＤＹ３Ｆ８７ＨＣファージに感染させる。この感染から得られたファージを、所望の標的に対する結合に関して選択する。２から４ラウンドの選択の後で、選択されたＨＣをｐＨＣＳＫ２２に移し、ＲＯＬＩＣに使用して、選択されたＨＣとＲＯＬＩＣ ＬＣライブラリ中の全ＬＣと組み合わせることができる細胞系を創造する。この方法において、１．Ｅ９のライブラリは、通常なら１．Ｅ１６の（１．Ｅ７のＬＣの多様性を推測する）ライブラリの構築が必要と思われるＡｂを得ることができる。
【０１７８】
（机上の実施例２）：非常に長いＨＣ ＣＤＲ３を有するライブラリ
Ｓｉｄｈｕら、（Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２００４年３３８巻：２９９〜３１０頁および米国特許出願第２００５０１１９４５５Ａ１号）は、長さが２０アミノ酸までに制限されたＣＤＲにおいて、ＹおよびＳだけが許容されるライブラリから選択される、高親和性Ａｂを報告している。ａ）ＹまたはＳを許容されるいくつかの（しかしすべてではない）部位、ｂ）４〜６のＮＮＫコドンを含む、ｃ）（Ｄにおいて多様化を有するまたは有さない）Ｄセグメントを導入する、および／またはｄ）エラープローンＰＣＲを使用する、のうち１つまたは複数の多様性の形態を有するＨＣ ＣＤＲ３を有するライブラリから、高親和性Ａｂを作製することができる。本発明者らは、ＨＣ ＣＤＲ３が約８から約２２の範囲で、長さの中央値が１３であるＡｂの空間を既にサンプリングしている。したがって、ＨＣ ＣＤＲ３が約２３ＡＡまたは約３５ＡＡのどちらかであるライブラリが可能であり、標的の特定の型に対して有利性を有することができる。例えば、ＧＰＣＲは、多重状態を有すると思われる細胞の脂質二分子層を横断する、７つのらせん形セグメントを有する内在性膜タンパク質である。非常に長いＨＣ ＣＤＲ３を有する抗体は、７つのストランドにより形成されるチャネルに適合する隆起を形成できる。ＧＰＣＲに結合するＡｂを見つけることは困難であり、すべてのメンバーが非常に長いＨＣ ＣＤＲ３を有するライブラリを意図的に構築することにより、この問題は改善され得る。長さは、いくらか可変にでき、１つのライブラリにおいて、約２３、２４，または２５、第２のライブラリにおいて３３、３４または３５である。
【０１７９】
下記は、多くの代表的な設計である。ＣＤＲ３は分解され、さまざまな部分が、Ｘの値に依存して異なる関係を有するようにされた多様性を作製した。完全長ＪＨ１を使用して、いくつかの設計において、多様性は、ＪＨ１のＣＤＲ３における多様性を許容した。他のＪＨも使用できる。設計において、Ｄセグメントは、Ｙに富むか、またはＳに富んだジスルフィドループを有するかのどちらかである。ヒトＤセグメントのアミノ酸配列を表３に示す。Ｄ領域がＳもしくはＹのどちらかを有する、または他の組合せが許容される場所は、特に変化している。表４は、ヒトＪ領域のアミノ酸配列を示す。
【０１８０】
個々のライブラリは、少なくとも４つの方法で構築できる：１）特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡをまず合成し、エラープローンＰＣＲに供する、２）ライブラリは、ｗｏｂｂｌｉｎｇによって、またはヌクレオチドの混合物を用いて合成され得る、３）ライブラリは、ｄｏｂｂｌｉｎｇを使用して構築され得る、４）（２）または（３）の手段に続いてエラープローンＰＣＲを行うことができる。（１）の手段の例として、設計１２において、配列番号９０８をコードする、配列番号：９１１に示すようなＤＮＡが合成できる。このＤＮＡを、配列番号：９０９および配列番号：９１０に示すプライマーを使用して、エラープローンＰＣＲに供することができる。これらのプライマーは、フレームワーク領域を含むので、エラーはＣＤＲ３だけで発生する。
【０１８１】
例えば２×１０９のメンバーの、長さ２３のＣＤＲ３を有するＨＣのライブラリおよび同様に２×１０９のメンバーの、長さ約３５のＨＣ ＣＤＲ３を有する第２のライブラリが構築できる。あるいはＤＮＡを混合し、４×１０９の１つのライブラリを構築できる。
【０１８２】
【表１３】
以下の個々の設計において、アミノ酸配列はＦＲ３の末端であるＹＹＣＡ（Ｋ／Ｒ）で始まる。ＦＲ４はＷＧで出発し、太字で示してある。
【０１８３】
設計１
配列番号：８９８は、ＦＲ３の末端と、それに接合された、免疫系がＶとＤとの間に位置するフィラー配列に頻繁に見出される型の２つの残基（ＤＹ）を含む。Ｄ２−２．２はジスルフィドループを有し、ＳｅｒおよびＴｙｒ残基に富んでいるので、後にはＤ２−２．２が続くことが好ましい。この後に、ＴｙｒおよびＳｅｒ残基に富んだＹＧＹＳＹが続き、その後に完全長ＪＨ１が続く。
【０１８４】
【表１４】
【０１８５】
【表１５】
【０１８６】
【表１６】
【０１８７】
【表１７】
【０１８８】
【表１８】
【０１８９】
【表１９】
【０１９０】
【表２０】
【０１９１】
【表２１】
【０１９２】
【表２２】
【０１９３】
【表２３】
【０１９４】
【表２４】
【０１９５】
【表２５】
【０１９６】
【表２６】
【０１９７】
【表２７】
終止コドンに対する選択：
これらのライブラリのいくつかはＮＮＫコドンを有するので、それらはいくつかのＴＡＧ終止コドンを有するであろう。ｂｌａ遺伝子に対するシグナル配列と、実際のｂｌａタンパク質との間のＸｂａＩ−ＢｓｔＥＩＩ部位内に増幅されたＤＮＡをクローン化し、Ｓｕｐ０細胞において発現させることによって、ＴＡＧを有するクローンを取り除くことができる。ＢｌａＲのコロニーはＴＡＧ終止を含有しない。あるいは、カナマイシン耐性遺伝子の前方のＸｂａＩ−ＢｓｔＥＩＩ断片をクローン化し、ＫａｎＲに関して選択することができる。次いで、ＸｂａＩ−ＢｓｔＥＩＩカセットをファージライブラリに移動する。
【０１９８】
さらに、ｗｏｂｂｌｉｎｇは、いくつかの終止コドンを許容するので、ｂｌａ遺伝子に対するシグナル配列と、実際のｂｌａタンパク質との間のＸｂａＩ−ＢｓｔＥＩＩ部位内に増幅されたＤＮＡをクローン化し、Ｓｕｐ０細胞において発現させることによって、終止を有するクローンを取り除くことにより、ライブラリを改善することができる。ＢｌａＲコロニーは終止を含有しない。あるいは、カナマイシン耐性遺伝子の前方のＸｂａＩ−ＢｓｔＥＩＩ断片をクローン化し、ＫａｎＲに関して選択することができる。次いでＸｂａＩ−ＢｓｔＥＩＩカセットをファージライブラリに移動することができる。
【０１９９】
【表２８】
【０２００】
【表２９】
【０２０１】
【表３０】
【０２０２】
【表３１】
【０２０３】
【表３２】
【０２０４】
【表３３】
【０２０５】
【表３４】
【０２０６】
【表３５】
【０２０７】
【表３６】
【０２０８】
【表３７】
【０２０９】
【表３８】
【０２１０】
【表３９】
【０２１１】
【表４０】
【０２１２】
【表４１】
【０２１３】
【表４２】
【０２１４】
【表４３】
【０２１５】
【表４４】
【０２１６】
【表４５】
【０２１７】
【表４６】
（実施例３）
長さ６〜２０のＣＤＲ３
Ｄセグメントの合成ＨＣ ＣＤＲ３への挿入は、より高い安定性およびより低い免疫原性をもたらし得る。ライブラリは、ＶＨを、Ｄセグメントに接合された、ある長さの任意選択のフィラー、任意選択の第２のフィラーおよびＪＨに接合することによって、アミノ酸レベルで設計される。長さ６または８のライブラリのために、完全長ＪＨが、ＶＨおよび短いフィラーに続いてもよい。表７７は、ＦＡＢ−３１０またはＦＡＢ−４１０から、１つの標的または別の標的への結合に関して選択された、１４１９のＡｂのサンプリングにおけるＤセグメントの頻度を示す。サンプルにおいて、１０９９のＡｂは、検出可能なＤセグメントを有さなかった（すなわち、７０％未満の一致）。Ｄセグメントを使用する場合、ＤセグメントのＤ１−１．３、Ｄ１−２６．３、Ｄ２−２．２、Ｄ２−８．２、Ｄ２−１５．２、Ｄ２−２１．２、Ｄ３−１６．２、Ｄ３−２２．２、Ｄ３−３．２、Ｄ３−９．１、Ｄ３−９．２、Ｄ３−１０．２、Ｄ３−１６．２、Ｄ４−４．２、Ｄ４−４．３、Ｄ４−１１．２、Ｄ４−４．２、Ｄ４−１７．２、Ｄ４−２３．２、Ｄ５−５．３、Ｄ５−１２．３、Ｄ５−１８．３、Ｄ６−６．１、Ｄ６−６．２、Ｄ６−１３．１、Ｄ６−１３．２、Ｄ６−１９．１、Ｄ６−１９．２およびＤ７−２７．１が好ましい。
【０２１８】
親アミノ酸配列が設計されたら、それを、いくつかの方法：エラープローンＰＣＲ、ｗｏｂｂｌｉｎｇおよびｄｏｂｂｌｉｎｇで多様化できる。表１４は、ヒトＤ領域に由来できる多数の六量体を示す。一実施形態において、システイン残基を含有する六量体は除外する。一実施形態において、終止を含有するＤ領域の断片は除外する。一実施形態において、Ｄ領域に見出される任意のＴＡＧコドンを、ＴＣＧ、ＴＴＧ、ＴＧＧ、ＣＡＧ、ＡＡＧ、ＴＡＴおよびＧＡＧを含むセットから選別されたコドンで置き換える。一実施形態において、Ｄ領域に見出される任意のＴＡＡコドンを、ＴＣＡ、ＴＴＡ、ＣＡＡ、ＡＡＡ、ＴＡＴおよびＧＡＡを含むセットから選別されたコドンで置き換える。一実施形態において、Ｄ領域の任意のＴＧＡを、ＴＧＧ、ＴＣＡ、ＴＴＡ、ＡＧＡおよびＧＧＡを含むセットから選別されたコドンで置き換える。
【０２１９】
表２１は、６から２０アミノ酸のＣＤＲ３に対する、例示的な親アミノ酸配列を示す。これらの親配列は、ＨＣ ＣＤＲ１およびＣＤＲ２における多様性と組み合わせ、ライブラリを形成することができる。ＣＤＲ３領域が、例えば、ＣＤＲ３のｗｏｂｂｌｉｎｇ、ｄｏｂｂｌｉｎｇまたはエラープローンＰＣＲにより多様化された場合、有用性が改善される可能性が高い。表２１において、配列６ａは、全ＪＨ１と接合する３−２３由来のＶＨ末端を含む。配列６ｂは、３−２３の末端と接合し、Ｙと接合し、Ｄ４−１７（ＲＦ２）と接合するＪＨ１のＦＲ４領域を含有する。配列６ｃは、３−２３の末端、続いてＤ５−５（ＲＦ３）、続いてＪＨ１のＦＲ４部分を含有する。配列６ｄは、３−２３の末端と接合し、ＳＹと接合する全ＪＨ４を含有する。表２１は、ＣＤＲ３のｗｏｂｂｌｉｎｇに適切と思われるドーピングのレベルを示し、他のレベルも同様に許容される。他のＤ領域またはＤ領域の断片も許容される。他のＪＨ配列も許容される。
【０２２０】
【表４７】
【０２２１】
【表４８】
【０２２２】
【表４９】
【０２２３】
【表５０】
【０２２４】
【表５１】
【０２２５】
【表５２】
【０２２６】
【表５３】
【０２２７】
【表５４】
【０２２８】
【表５５】
【０２２９】
【表５６】
【０２３０】
【表５７】
【０２３１】
【表５８】
【０２３２】
【表５９】
【０２３３】
【表６０】
【０２３４】
【表６１】
（実施例４）
ＣＤＲのＤｏｂｂｌｉｎｇ
以下の実施例は、合成ライブラリの構築におけるｄｏｂｂｌｉｎｇの使用を例示する。親３−２３重鎖（ＨＣ）は、ＣＤＲ１、２および３において多様化される。この多様性は、合成的に多様化されたＡ２７軽鎖（ＬＣ）と組み合わされる。この多様性は下記の通りである：
（実施例４．１）
ＨＣ ＣＤＲ１
以下のｄｏｂｂｌｉｎｇの多様性は、５，８３２の変異体を許容する。表５０を参照されたい。３１位において、Ｓｅｒは生殖系列（ＧＬ）アミノ酸型である。したがって、本発明者らは、他の型より３倍可能性が高いＳｅｒを作製した。１８の型が許容されるので、Ｓｅｒは、１５％の確率で使用可能となり、他は５％で使用可能であろう。したがって、３１位においてＡＡ型の選択がない場合、Ｓｅｒを有するＡｂを単離する確率がより高い。同様に、３３位においてＧＬ ＡＡ型はＡｌａであり、本発明者らは、他のすべて（５％）より３倍可能性が高いＡｌａ（１５％）を作製した。３５位において、ＳｅｒはＧＬ ＡＡ型であり、本発明者らは、それを他の３倍可能性が高く作製した。３つすべての位置において、本発明者らはＣｙｓおよびＭｅｔを除外した。本発明者らは、無償性ジスルフィドまたはＡｂの溶解度および反応性に悪影響を与え得る、露出された不対システインを望まないので、Ｃｙｓを除外する。露出されたメチオニンの側基は、結合特性および保存期間を変更し得る酸化に供されるので、Ｍｅｔを除外する。他のＡＡ型より２、３、４、５、６、８または１０倍可能性が高い生殖系列アミノ酸型を作製できる。
【０２３５】
【表６２】
この開示を通して、示された「許容される」アミノ酸は、所与の位置で使用できるアミノ酸である。例えば、表５０において、３１位において、許容されるアミノ酸「ＡＤＥＦＧＨＫＬＮＰＱＲＳＴＶＷＹ」を示す。このことは、アミノ酸Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹのすべてが、３１位において許容されることを示している。
【０２３６】
（実施例４．２）
ＨＣ ＣＤＲ２
ＣＤＲ２において、本発明者らは、５０、５２、５２ａ、５６および５８位において多様性を許容する。５０、５２、５６，および５８位において、本発明者らはＣｙｓおよびＭｅｔを除くすべてのアミノ酸型を許容し、本発明者らはＧＬ ＡＡ型を３倍高い可能性で作製する。本発明者らは、ＧＬ ＡＡ型を、他のＡＡ型より２、３、４、５、６、８または１０倍高い可能性で作製できる。
【０２３７】
【表６３】
組み合わせたＣＤＲ１およびＣＤＲ２の多様性＝２．４５Ｅ９
（実施例４．３）
ＨＣ ＣＤＲ３、長さ３、４、５
非常に短いＣＤＲ３は、ｄｏｂｂｌｉｎｇにより作製できる。表７は、長さ３のＣＤＲ３に対するいくつかの親配列を示す。９４位において、多くのＶＨ３はＡｒｇを有し、本発明者らはこの変化を許容したが、Ｌｙｓは３倍可能性がある。９５位において、ＦはＪＨ１中のこの位置において見出される。本発明者らはＳｅｒ、Ｔｙｒ、ＡｓｐおよびＡｒｇもまた許容して、小型、大型、正の電荷および負の電荷を許容する。９６位において、ＪＨ１はＱを有する。ＱはＧｌｕに非常に似ているので、本発明者らは、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ，およびＬｅｕに加えて、Ｇｌｕを酸性代替物として許容する。９７位において、ＨｉｓはＪＨ１に由来する生殖系列ＡＡである。本発明者らは、負の電荷（Ｄ）、正の電荷（Ｒ）、低極性（Ｓ）、高疎水性（Ｙ）および脂肪族化合物（Ｌ）を許容する。親配列は、ライブラリの最大４．５％をなすが、これは、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２における大きい多様性を組み合わせている。ｄｏｂｂｌｉｎｇは、全部で３６０の配列を許容する。最も可能性の低い配列は、１７９２分の１で生じる。最も可能性の高い（親）配列は、約２２分の１で生じる。
【０２３８】
【表６４】
表６１は、ｄｏｂｂｌｉｎｇされた長さ３のＨＣ ＣＤＲ３を示す。ここで、Ｋ９４はＷ１０３のように固定されている。本発明者らは、「親」Ｄセグメントアミノ酸を、他の許容されたＡＡ型より５倍の可能性で作製した。
【０２３９】
【表６５】
この実施例において（表６２、表８のＶ−４ＪＨ２を使用する）、９４はＬｙｓとして固定されている。９５位において、ＪＨ２はＴｙｒを有し、本発明者らは、許容されるＳｅｒ、Ａｓｐ、ＡｒｇおよびＬｅｕを有し、その結果、抗原に適合するためにサイズ、電荷および疎水性を変更できる。ＪＨ２は９６位にＰｈｅを有し、本発明者らは、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ａｒｇ，およびＬｅｕを許容した。９７位において、ＪＨ２はＡｓｐを有し、本発明者らは、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、およびＬｅｕを許容した。９８位において、ＪＨ２はＬｅｕを有し、本発明者らは、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、ＡｓｐおよびＡｒｇを許容した。このパターンは、７５０の異なる配列を許容し、親が最も可能性（１／１８）が高い。最も可能性が低い配列は、４６０８分の１で生じ、または最も可能性が高い配列より可能性が２５６倍低い。
【０２４０】
【表６６】
表６３において、表８のＶ−４Ｄ３−１０．１ａ−ＪＨ２のｄｏｂｂｌｉｎｇがあった。９４位において、本発明者らはＬｙｓおよびＡｒｇを許容し、Ｌｙｓ（親）はＡｒｇの４倍の可能性があった。９５位において、Ｄ３−１０．１ａ（すなわち、第１のリーディングフレーム中のＤ３−１０であり、ＡＡ１から出発する）はＬｅｕを有し、本発明者らは、同様にＳＹＤＲを許容した。Ｌｅｕは他のＡＡ型個々の４倍の可能性である。９６位において、Ｄ３−１０．１ａは同様にＬｅｕを有し、本発明者らは、同じメニューを許容した。９７位において、Ｄ３−１０．１ａはＴｒｐを有し、本発明者らは、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、ＡｓｐおよびＡｒｇを許容する。Ｔｒｐは４倍の可能性である。９８位において、Ｄ３−１０．１ａはＰｈｅを有し、本発明者らは、同様にＳｅｒ、Ｔｙｒ、ＡｓｐおよびＡｒｇを許容とする。
【０２４１】
【表６７】
（実施例４．４）
長さ１０から２０のＨＣ ＣＤＲ３
ＨＣ ＣＤＲ３
２つのサブライブラリ、双方とも長さ１６のＣＤＲ３を有する。
【０２４２】
【表６８】
【０２４３】
【表６９】
表６５は、配列番号：８９８のｄｏｂｂｌｉｎｇによる多彩化を示す。許容されたすべての多様性は２．１Ｅ１３である。１．Ｅ８、３．Ｅ８、５．Ｅ８、１．Ｅ９または５．Ｅ９を作製する合成は、多様性を適切にサンプリングするであろう。配列番号：８９８の設計は上で述べた。配列番号：８９８のｄｏｂｂｌｉｎｇにおいて、ｄｏｂｂｌｉｎｇは、大部分の位置で他のＡＡ型を３倍上回る親ＡＡ型を許容することである。親がＴｙｒである位置で、その場合、本発明者らは、ＴｙｒおよびＳｅｒを等量で使用し、Ｌｅｕはその頻度の１／２で使用する。Ｃｙｓ残基は固定されている。個々の親ＡＡ型は許容され、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、ＴｙｒまたはＬｅｕ（親が疎水性、例えばＰｈｅである場合、Ｌｅｕは除かれることがある）の１つに進む。親配列は、１／１．Ｅ８のメンバーで生じる。最も可能性が低い配列は、１／９．５Ｅ１６で生じる。ライブラリが実際に親配列を含有することは重要ではなく、親に似た配列を多数含有することだけが重要である。したがって、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３の多様性を組み合わせる場合、１．Ｅ７、５．Ｅ７、１．Ｅ８、３．Ｅ８、１．Ｅ９または５．Ｅ９を含有するライブラリは、多くの可変Ａｂを含有するライブラリを提供する。
【０２４４】
【表７０】
（実施例４．５）
ｙｙｃａｋＧＳＧＹＣＳＧＧＳＣＹＳＦＤＹｗｇｑｇｔｌｖｔｖｓｓ（配列番号：９３１）のｄｏｂｂｌｉｎｇ
表８０は、長さ１５のＨＣ ＣＤＲ３の例である、配列番号：９３１のｄｏｂｂｌｉｎｇを示す。９４位はＦＲ３の一部であり、一定に保たれる。９５位および９６位は高度に使用される（ＹＧＤＲＳ）のセットから選別される「親」アミノ酸型を有し、Ｇ９５およびＳ９６である。次の１０の位置は、Ｄ２−１５．２（ジスルフィド閉ループを含有する、中程度に良く使用されるＤセグメント）から選別される。最後の３つの位置は、表３に示すように、ＪＨ４の１００位、１０１位および１０２位に由来する。個々の位置において、本発明者らは、親アミノ酸型を他の許容される型より３倍多く作製する。Ｃｙｓ残基は固定されている。１０２ｅにおいて、ＰｈｅはＹＧＳＲＤより３倍可能性が高い（すなわち、Ｐｈｅは、アミノ酸Ｙ、Ｇ、Ｓ、ＲまたはＤのいずれより３倍可能性が高い）。許容される多様性は、１．４６Ｅ９である。親配列は、１／６．９Ｅ４で期待される。個々の１つずつ置換された配列はおそらく約１／３であり、二重に置換された配列は、おそらく１／９でありそのように続く。完全に他のＡＡ型で構成された配列は、わずか１／１．１Ｅ１１で発生する。
【０２４５】
表２１の個々の他の配列は、同じ方法でｄｏｂｂｌｉｎｇできる。
【０２４６】
【表７１】
（実施例５）
合成軽鎖の多様性
全抗体を作るために、重鎖のライブラリと軽鎖（ＬＣ）のライブラリとを組み合わせる必要がある。天然Ａｂにおいて、ＨＣが結合の大部分を行っており、多くのライブラリはＬＣにほとんど注目していない、またはＬＣの多様性をヒトドナーから得ていることは、しばしば観察されることである。十分な多様性を有し、ほとんどすべての標的に対する優れたバインダーを得るために、本発明者らは、ヒト免疫系が通常に提供する多様化プログラムを超える多様化プログラムを設計した。にもかかわらず、このプログラムは、天然Ａｂに見られるのと同様の変化を有する、完全に機能性のＬＣを若干多く得るためだけに設計された。Ｖκ ＩＩＩ Ａ２７を、ＬＣとして選別した。
【０２４７】
提供されたκおよびλＬＣを含むライブラリから、１２６６のＡｂのコレクションを打ち込んだ。ＶＫＩＩＩの中で、Ａ２７は最も多くみられ（表６６）、ＨＣ ３−２３と良く対合する。
【０２４８】
Ａ２７のＣＤＲは１２、７，および９個のアミノ酸を含有する。これらの位置すべてに多様性を加えることは、うまく機能しない恐れがあり、：ａ）多くの不安定または非機能性のメンバーが存在する恐れがある、およびｂ）いくつかの位置において、多様性が結合を改善する助けにならない恐れがある。本発明者らは、可変位置の数を２８から１６に減らした。
【０２４９】
本発明者らは、Ａ２７ ＬＣを有する１ＱＬＲの３Ｄ構造を研究した。１ＧＬＲの構造は、ＲＣＤＢタンパク質データベースにおいて公的に利用可能である。このことから、表６８に示された残基は、変化させるのに有効と思われる。Ｔ５６は、ＨＣ ＣＤＲ３においてＨｉｓから約１０Åである。５６での変化は有用であり得る。Ｇ２４は、ＨＣ ＣＤＲ３において原子からわずか約７Åである。生殖系列はＲ２４であり、したがって２４での変化は有用であり得る。
【０２５０】
表６９は、本発明者らがｐＭＩＤ２１において使用するために設計したディスプレイカセットを示す。したがって、選別された制限酵素はｐＭＩＤ２１に他の部位を有さない。ＳｐｅＩはｉｉｉシグナル配列中にあり、全ＬＣの挿入および除去を可能にする。ＸｍａＩ、ＰｐｕＭＩ、ＥｃｏＯ１０９ＩおよびＢｌｐＩは、ＣＤＲ１の前方にある。ＳａｃＩＩはＦＲ２中にあり、ＣＤＲ１とＣＤＲ２とを隔てている。あるいは、ＡｖｒＩＩ部位は同じ位置に挿入可能である。ＢｓｐＥＩおよびＸｈｏＩ部位はＦＲ３中にあり、ＫｐｎＩ部位はＦＲ４中にある。
【０２５１】
本発明者らは１５５のＡ２７配列を収集し、ＣＤＲにおいて起こっていることを分析した。表７０は分析結果を示す。表７０において、本発明者らのライブラリ由来のＡｂ中に発見されたもの、および本発明者らが個々の位置に置いたと思われるものを示す。
【０２５２】
【表７２】
【０２５３】
【表７３】
ＣＤＲ１
Ｒ２４、Ａ２５およびＳ２６は結合部位から遠すぎて役に立たず、一定に保たれた。Ｖ２９の側基は埋もれており、この位置はＶａｌとして一定に保たれていた。他の位置において、ＹまたはＳおよび帯電したフリップフロップ（ＲＥまたはＲＤ、問題の位置においてサンプルがより多くのＥまたはＤを有する場所に依存する）ならびに頻繁に見られた他の型を許容した。Ｅｘｃｅｌのスプレッドシートを使用して、多彩化のこのパターンは、「他の」ＡＡが５％置換された場合、親配列は０．８％、「他の」ＡＡが６．５％置換された場合、親配列は０．１％、「他の」ＡＡが９％置換された場合、親配列は０．０２％得られることを決定した。１５５のサンプルのうち、１７が、欠失されたＡＡ（１ＱＬＲを含む）を１つ有し、したがって、メンバーの約８％においてＳ３０ａが欠失されるように構成できる。
【０２５４】
ＣＤＲ２
１ＱＬＲの調査により、ＣＤＲ２が結合部位から若干離れていることが分かった。それでも、このＣＤＲ中の残基を一定に保つという提案がなされてきた。３Ｄ構造の研究により、Ｇ５０、Ｓ５３およびＴ５６における多彩化が有用であり得ることが示唆される。Ｓ５３は、１５５のサンプルの中で最も可変であるが、このことは、これらの変化が有用であることの証明にはならない、１ＱＬＲにおいて、Ｇ５０はＲ５０に突然変異している。Ｔ５６のこの側基は、ＨＣ ＣＤＲ３の方を向いており、ＨＣ ＣＤＲ３中の原子から約１１Åである。
【０２５５】
ＣＤＲ３
Ｑ８９およびＱ９０は埋もれており、それらの性質はあまり変化せず、これらの残基は変化しない。Ｙ９１は、ＨＣ ＣＤＲ３に対して包まれており、この場所の変化は結合部位を変更することになり、実際結合部位は変更される。Ｇ９２において、φ＝−８０およびψ＝−１５であり、それ故Ｇｌｙ以外への配置が実行可能であり、４７／１５５例で自然に起こる。Ｓ９３は非常に頻繁に変化し、欠失する。Ｓ９４は高度に露出されており、高度に変化する。Ｐ９５は露出されており、変化する。Ｌ９６は、ＨＣ ＣＤＲ３に対して包まれており、この場所の変化は結合部位に影響を与えることになり、実際に影響が起こる。Ｔ９７は埋もれており、一定に保たれておりアミノ酸は変化しない。
【０２５６】
親配列は、０．０００２４６または１／４．０６Ｅ３で出現する。許容される多様性は、約２．１Ｅ１２である。２つに関しては８％が欠失しており、メンバーの８４．６％が完全長であり、７．４％が短いＣＤＲ１および完全長ＣＤＲ３を有し、７．４％が完全長ＣＤＲ１および短いＣＤＲ３を有し、０．６％が双方を欠失しているであろう。
【０２５７】
他の生殖系列はサンプル中に存在しなかった。
【０２５８】
【表７４】
【０２５９】
【表７５】
【０２６０】
【表７６】
【０２６１】
【表７７】
【０２６２】
【表７８】
親配列は、５．３２Ｅ−５または１／１．８８Ｅ４で出現する。
【０２６３】
単一置換の配列は、１．１Ｅ−５から７．５Ｅ−６の確率である。
【０２６４】
親ＡＡを１つも有さない配列は、１／６．７Ｅ１６で起こる。
【０２６５】
許容される多様性は、約２．３５Ｅ１２である。
【０２６６】
【表７９】
【０２６７】
【表８０】
【０２６８】
【表８１】
【０２６９】
【表８２】
（実施例６）
ＨＣ ＣＤＲ３ １６ｄのためのＷｏｂｂｌｉｎｇされたＤＮＡ
表４００は、ＦＲ３中のＸｂａＩ部位からＦＲ４中のＢｓｔＥＩＩ部位までのＤＮＡのセグメントを示す。ＨＣ ＣＤＲ３は、ＳＹＳＹ：：Ｄ２−２（２）：：ＱＨ、続いてＪＨ１のＦＲ４領域からなる。ＱＨは、ＪＨ１の生殖系列において見出される。Ｖ−Ｄ−Ｊ接合において、免疫細胞はＶ、ＤおよびＪの末端を頻繁に編集する。したがって、構成は、実際の免疫グロブリン遺伝子の構成および成熟において非常に可能性が高いものに対応する。ｗｏｂｂｌｉｎｇによる合成により、本発明者らは、３−２３と、Ｄ領域またはほとんど編集されていないＪＨ１との接合、続くいくつかの突然変異に由来するものに似ている、遺伝子の大きなコレクションを得る。ライブラリ１６ｄにおいて、推定上ジスルフィドを形成する２つのシステインが存在し、これらはｗｏｂｂｌｉｎｇされない。
【０２７０】
表５００は、１６ｄライブラリにおける、個々の位置でのアミノ酸型の期待分布を示す。ｗｏｂｂｌｉｎｇのドーピングは７３：９：９：９に設定された。最も可能性のある配列は表２１に示す配列であり、頻度が４．８Ｅ−５で存在するはずである。５５％の配列だけが終止を含まず、７４％がオーカーまたはオペルを含まない。ライブラリがｓｕｐＥ細胞において発現する場合、これは重要な数である。終止コドンを有する配列を取り除くことは、本明細書の他の場所で述べたように、価値のあることである。Ｓで始まるそれらの位置が、５４％の確率でＳを、５．４％の確率でＹを有すると予測され、一方、Ｙで始まるものは、４４％の確率でＹを、７．２％の確率でＳを有することが見て取れる。個々の位置において、１％を超えて出現する７〜９のＡＡ型が存在する。１４の多彩化された位置が存在する。最も有効であると思われる配列は、約８１４＝４．３Ｅ１２の数をサンプリングした。
【０２７１】
【表８３】
【０２７２】
【表８４】
【０２７３】
【表８５】
【０２７４】
【表８６】
【０２７５】
【表８７】
【０２７６】
【表８８】
（実施例７）
合成ＨＣ ＣＤＲ３のさらなる例
ＦＡＢ−３１０またはＦＡＢ−４１０のライブラリから選択された異なるＣＤＲ３を有し、少なくとも１種の抗原に対してＥＬＩＳＡであった、２２，０６３のＦａｂのコレクションを検査した。ＪＨ鎖の利用を、表１００１に示す；個々のＪＨのＦＲ４部分を太字で示す。表１０１０は、ＨＣ ＣＤＲ３におけるアミノ酸の利用を示す。表１０２０は、ＣＤＲ３の長さの分布を示す。長さの中央値は１１．５である。
【０２７７】
表１０３０は、ＣＤＲ３におけるＤセグメントの利用を示す。特定されたＤセグメントは、一致したアミノ酸の７０％であった。；５，６５４例（２５．６％）が存在した。最も使用されたＤは、３−３．２（７４３、配列：ＹＹＤＦＷＳＧＹＹＴ）、３−２２．２（６１７、配列：ＹＹＹＤＳＳＧＹＹＹ）、６−１９．１（４４１、配列：ＧＹＳＳＧＷＹ）、６−１３．１（３９９、配列：ＧＹＳＳＳＷＹ）および４−１７．２（３９２、配列：ＤＹＧＤＹ）であった。対合したＣｙｓ残基を含有するＤのうち、２−１５．２（配列：ＧＹＣＳＧＧＳＣＹＳ）が最も使用された；コレクションの０．６％である１３９の例が存在した。
【０２７８】
ＶまたはＶ：：ＤがＪに接合される場合、ＶまたはＶ：：Ｄの３’末端およびＪの５’末端が多くの場合編集されている。多数のＣＤＲ３−ＦＲ４配列の調査により、多くの場合、ＣＤＲ３の一部を構成するＪＨの一部が存在することが示される。多くの場合、ＪＨ残基１〜９に対応するＣＤＲ３残基において、突然変異が存在する。本明細書において、ＪＨに由来すると思われるＣＤＲ３の一部は、「Ｊｓｔｕｍｐ」と呼ばれる。重鎖に使用されるＪＨは、６から２０位の６つのＪＨ鎖の個々の残基と、ＣＤＲ３の最後の４個のアミノ酸とＦＲ４との融合を比較することによって決定される。不一致が最も少ないＪＨを選択する。ＣＤＲ３配列を、Ｊｓｔｕｍｐに関して、９位からＣＤＲ３と比較した選択されたＪＨの第１の位置へ、検索が、ａ）ＪＨの末端、ｂ）ＣＤＲ３の末端またはｃ）２つの連続する不一致により終了するまで、選択されたＪＨにおいて逆に働くことによって検査した。鎖の末端の１つと、最後の比較位置が一致する場合、その場合Ｊｓｔｕｍｐに含まれる。一致しない場合は、Ｊｓｔｕｍｐに含まれない。表１０７０は、いくつかの例を示す。ＣＤＲは上に記載し、ＪＨは下であり、Ｊｓｔｕｍｐは下線を引いてある。１０７０Ａにおいて、本発明者らは、９位から始め、ＶはＶに一致し、本発明者らは、一致する６位へと続けた。検索は、二重の不一致のため、４位で停止する。ＧＭＤＶはＪｓｔｕｍｐの蓄積内となり、ＧＬは「リードイン」の蓄積内となる。１０７０Ｂにおいて、検索はＪＨ６の末端で停止する。下線の残基は、Ｊｓｔｕｍｐの蓄積内となり、ＥＰＩＷＧはリードインの蓄積内となる。１０７０Ｅにおいて、検索はＪＨ４の末端のため終了するが、被験最終残基（ＣＤＲ中のＤ対ＪＨ４中のＹ）は不一致であり、それ故、ＪｓｔｕｍｐはＦＤＳであり、ＤＳＧＶＶＡＡＡＤはリードインの蓄積内となる。
【０２７９】
表１０１５は、Ｊｓｔｕｍｐを取り除いてあるＤセグメントを有さないＣＤＲ３のアミノ酸分布を示す。Ｔｙｒの頻度は、全ＣＤＲ３がコンパイルされた場合よりさらに低いことに留意されたい。このことは、ＤセグメントおよびＪｓｔｕｍｐの組み込みを介して、ＴｙｒがＣＤＲ３に大量に入ってくることを示す。これらのＴｙｒはランダムには挿入されないが、哺乳類の進化を通して選択されてきた配列において生じる。高レベル（２０％を超える）のＴｙｒが、ＤおよびＴｙｒを含有するＪｓｔｕｍｐの組み込みを介してライブラリに挿入されるはずであることが、本発明の特徴である。リードイン位置またはＤＪフィラー位置において、Ｔｙｒは許容されるが、２０％以下である。
【０２８０】
【表８９】
表１０８２は、個々のＪＨのＪｓｔｕｍｐにおけるアミノ酸の使用分布を示す。最も一般的なＪＨはＪＨ３、ＪＨ４およびＪＨ６であるので、これらはライブラリ構築にとって好ましいＪＨである。表１０８２は、ＣＤＲ３においてテトラペプチド配列ＡＦＤＩを保有するＪＨ３の例が最も多いことを示す。ＪＨ４では、多数がＤＹを保有し、大型の分画がＣＤＲ３において配列ＦＤＹを保有する。ＪＨ６では、大多数が配列ＤＶを保有し、多数が配列ＭＤＶを保有し、かなりの分画が配列ＧＭＤＶを保有する。配列ＹＧＭＤＶ、ＹＹＧＭＤＶまたはＹＹＹＧＭＤＶを保有する分画も少なくない。
【０２８１】
５．００１（表１０９７）などのライブラリが、本発明のライブラリに含まれる。ライブラリ５．００１は、本出願の他所に記載のように、ＬＣおよびＨＣ ＣＤＲ１〜２を含有する。このライブラリは、ＨＣ ＶＨ（例えば、３−２３）、続いて表１０９７に示される割合で［ＧＳＲＤＬＹ］を許容する６、７または８個のアミノ酸を含有する。Ｊｓｔｕｍｐにおいて、親アミノ酸は、「他の」アミノ酸型の３、４、５、６、７、８、１０倍で存在する。「他の」アミノ酸型は、Ｙ、Ｓ、Ｄ、Ｒ、Ｇを含む。したがって、Ａ６において、本発明者らは、７／１２のＡならびに個々に１／１２のＹ、Ｓ、Ｄ、Ｒ、およびＧを許容する。Ｆ７において、本発明者らは、７／１２のＦならびに個々に１／１２のＹ、Ｓ、Ｄ、ＲおよびＧを許容する。Ｄ８において、本発明者らは、７／１１のＤならびに１／１１のＹ、Ｓ、Ｒ、およびＧを許容する。Ｉ９において、本発明者らは、７／１２のＩならびに１／１２のＹ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、Ｇを許容する。親アミノ酸は、他のアミノ酸型より５、６、７、８、１０倍可能性が高い。
【０２８２】
表１０９７のライブラリ５．００２が、本発明のライブラリに含まれる。このライブラリは、長さ１３、１４および１５のＣＤＲ３を含み、Ｄセグメントは含まない。Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、Ｌ，またはＹを１：０．５７：０．４６：０．４２：０．３６：０．３５の比率で、またはそれらに対して合理的な近似で許容する６、７、８個のリードイン残基が存在する。ＣＤＲ３は、ＪＨ６の一部分：ＹＹＹＧＭＤＶで完了する。親配列ＹＹＹＧＭＤＶをコードするＤＮＡは、親アミノ酸を用いて他より５、６、７、８または１０倍高い可能性で合成される。
【０２８３】
表１０９７のライブラリ５．００３は、本発明のライブラリに含まれる。ＦＲ３の後に、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、Ｌ、Ｙを１．０：０．５７：０．４６：０．４２：０．３６：０．３５の比率で許容する４、５、または６個のリードイン残基が続く。次に来るのは、Ｄセグメント３−３．２；親アミノ酸を５倍好み、他のアミノ酸としてＹ、Ｇ、Ｄ、Ｒ、Ｓを許容するこの領域をコードするＤＮＡである。ＤＪフィラーは存在せず、最終の４個のアミノ酸は、ＪＨ３のＪｓｔｕｍｐに由来する。ＪｓｔｕｍｐをコードするＤＮＡは、他より可能性が５倍高い親アミノ酸：ＹＳＧＲＤを用いて合成される。
【０２８４】
表１０９７のライブラリ５．００４は本発明の一部である。示した比率でＧＳＲＤＬＹを許容する２、３または４個のリードイン残基が存在する。配列ＧＹＳＳＧＷＹをコードするＤＮＡは、親アミノ酸が他より６倍であるように合成され、２つのＤＪ−フィラー残基は、１．０：０．５７：０．４６：０．４２：０．３６：０．３５の比率で許容されるＧＳＲＤＬＹにより許容される。ＡＦＤＩをコードするＤＮＡは、他より６倍の親アミノ酸を用いて合成される。
【０２８５】
ライブラリ５．００５は本発明の一部である。ライブラリ５．００５は、長さ１１〜１４のＣＤＲ３を有するメンバーを含む。ＦＲ３の後に、示した比率でＧＳＲＤＬＹを許容する０、１、または２個のリードイン残基が存在し、親アミノ酸が、他の許容された型より６倍であるようにＹＧＳＲＤを許容する変動性のある親配列ＧＹＳＳＧＷＹをコードするＤＮＡが後に続く。Ｄ領域の後に、ＧＳＲＤＬＹを示した比率で許容する０または１個のＤＪフィラー残基がある。最後に、他の許容された型より６倍可能性が高い親アミノ酸によりＹＧＳＲＤを許容する、Ｊｓｔｕｍｐ（配列：ＹＦＤＹ）に変動性を有するＪＨ３がある。
【０２８６】
表１０９７のライブラリ５．００６は、本発明の一部である。ＣＤＲ３は長さ１９〜２５であってよい。示した比率でＧＳＲＤＬＹを許容する０から３個のリードイン残基がある。リードインの後にＤ領域２−２．２がある。２−２．２をコードするＤＮＡは、２つのＣｙｓ残基が固定されていることを除いて、親アミノ酸が、他（つまりＹＧＳＲＤ）より６倍可能性が高いように合成される。２−２．２の後に、ＧＳＲＤＬＹを示した比率で許容する０から３個のＤＪフィラー残基がある。ＪＨ６の最初の９個の残基をコードするＤＮＡは、親アミノ酸ならびにＹＳＧＤＲを許容し、親の型は他より６倍可能性が高い。
【０２８７】
【表９０】
【０２８８】
【表９１】
【０２８９】
【表９２】
【０２９０】
【表９３】
【０２９１】
【表９４】
【０２９２】
【表９５】
【０２９３】
【表９６】
【０２９４】
【表９７】
【０２９５】
【表９８】
【０２９６】
【表９９】
【０２９７】
【表１００】
【０２９８】
【表１０１】
【０２９９】
【表１０２】
【０３００】
【表１０３】
【０３０１】
【表１０４】
【０３０２】
【表１０５】
【０３０３】
【表１０６】
参照文献
本出願を通して引用された、参考文献、発行された特許、公開または非公開の特許出願を含むすべての参照文献の内容ならびに以下に載せた参照文献は、参照によりその全体が明確に本明細書に組み込まれる。抵触の場合、本出願が、本明細書における任意の定義を含めて、支配するものとする。
【０３０４】
【数１】
同等物
本発明の多数の実施形態を記載した。にもかかわらず、さまざまな変形が、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく可能であることは理解されるべきであろう。したがって、他の実施形態も、以下の特許請求の範囲内である。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２００８年４月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／０４７，５２９号の優先権を主張する。この米国仮特許出願の開示は、本願の開示の一部と考えられる（かつ、本願の開示に参考として援用される）。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを個別に提示し、提示および発現し、または含み、ファミリーのアミノ酸の多様性の少なくとも一部を集合的に提示し、提示および発現し、または含む遺伝子パッケージのライブラリの調製は、現在当分野において一般的に行われている。多くの一般的なライブラリにおいて、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、抗体（例えば、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、Ｆａｂ、全抗体またはミニボディ（すなわち、ＶＬに連結したＶＨからなる二量体））に関連する。多くの場合、それらはヒト抗体の重鎖および軽鎖の、１種または複数種のＣＤＲおよびフレームワーク領域を含む。
【０００３】
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のライブラリは、いくつかの方法で作製されている。例えば、参照により本明細書に組み込まれる非特許文献１を参照されたい。一方法は、ナイーブなまたは免疫化されたかどちらかの、ネイティブなドナーの多様性を獲得することである。別の方法は、合成多様性を有するライブラリを生成することである。第３の方法は、最初の２つの方法の組合せである。通常、これらの方法により作製された多様性は、配列多様性に限定される、すなわち、ライブラリの個々のメンバーは同じ長さを有するが、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質鎖の所与の位置に異なるアミノ酸または多彩性を有することがファミリーの他のメンバーとは異なる。しかし、天然に多様なペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、それらのアミノ酸配列だけに多様性が限定されるわけではない。例えば、ヒト抗体は、それらのアミノ酸の配列多様性は限定されず、ヒト抗体は、それらのアミノ酸鎖の長さにおいてもまた多様である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｋｎａｐｐｉｋ ら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２９６巻、５７〜８６頁（２０００年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（要旨）
抗体では、例えば、可変領域の再構成の間に重鎖の長さの多様性が発生する。例えば、Ｃｏｒｂｅｔｔら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２７０巻、５８７〜９７頁（１９９７年）を参照されたい。Ｖ遺伝子とＪ遺伝子との接合は、例えば重鎖抗体配列の約半分のＣＤＲ３中の認識可能なＤセグメントの包含をもたらし、したがって、さまざまな長さのアミノ酸をコードする領域を創製する。Ｄセグメントは、長いＨＣ ＣＤＲ３を有する抗体においてより一般的である。以下もまた、抗体の遺伝子セグメントの接合の間に発生し得る：（ｉ）Ｖ遺伝子の末端が、欠失または変化した０から数個の塩基を有し得る；（ｉｉ）Ｄセグメントの末端が、除去されたまたは変化した０から多くの塩基を有し得る；（ｉｉｉ）多数のほぼランダムな塩基が、ＶおよびＤの間またはＤおよびＪの間に挿入され得る；ならびに（ｉｖ）Ｊの５’末端が、いくつかの塩基を除去または変化させるように編集され得る。これらの再構成は、アミノ酸配列および長さの双方において多様な抗体をもたらす。異なる長さのＨＣ ＣＤＲ３は、異なる形状に折り畳まれ、抗原と結合する新規な形状を抗体にもたらすことができる。立体配座は、ＣＤＲ３の長さおよび配列の双方に依存する。例えば長さ８で任意の配列のＨＣ ＣＤＲ３は、例えば長さ２２のＣＤＲ３の挙動を、適切に模倣できないことを記憶に留めるべきである。
【０００６】
したがって、アミノ酸の配列多様性のみを含有するライブラリは、それらが、ライブラリが模倣しようとするペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の天然の多様性を反映しないという点で不利である。さらに、長さの多様性は、タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドの最終的な機能性にとって重要であり得る。例えば、抗体領域を含むライブラリに関して、ライブラリの遺伝子パッケージにより提示される、提示および発現される、または含まれるペプチド、ポリペプチド、タンパク質の多くは、配列および長さ双方における多様性がライブラリに示されない場合、適切に折り畳むことができない、または抗原とのそれらの結合が不利であり得る。
【０００７】
ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質を提示する、提示および発現するまたは含む遺伝子パッケージのこのようなライブラリのさらなる不利な点は、天然発生の多様性に基づくそれらのメンバー、したがって、機能的である可能性が最も高く、免疫原性である可能性が最も低いメンバーに集中していないことである。どちらかと言えば、通常ライブラリは個々のＣＤＲ位置に可能な限りすべての多様性または多彩性を含むように試みる。このことは、ライブラリ構築の時間を消費し、効率を必要より下げる。完全な多様性を獲得しようとする試みにより作製された多数のメンバーもまた、スクリーニングを必要以上に手間のかかるものにする。このことは、ライブラリの多くのメンバーが機能的でなくなり、または非特異的に付着性になる場合に特にあてはまる。
【０００８】
さらに、合成ライブラリの構築の苦労は免疫原性の問題である。例えば、すべてのＣＤＲ残基がＴｙｒ（Ｙ）またはＳｅｒ（Ｓ）のどちらかであるライブラリがある。これらのライブラリから選択された抗体（Ａｂ）は、高い親和性および特異性を示すが、それらの非常にまれな組成はそれらを免疫原性にすることができる。本発明は、ヒト免疫系に十分由来することができ、したがって免疫原性である可能性の低いＡｂの作製を対象とする。本発明のライブラリは、Ｖ−Ｄ−ＪまたはＶ−Ｊの融合に由来する残基を可能な限り多く保有する。免疫原性の危険性を減少するために、フレームワークおよびＣＤＲの双方の中の個々の非生殖系列アミノ酸の変化を、生殖系列アミノ酸に戻し、結合親和性を保有するために生殖系列からの変化が必要かどうかを決定することが賢明であり得る。したがって、生殖系列に対する個々の変異位置にバイアスのかかったライブラリは、必要のない非生殖系列アミノ酸を有するＡｂの単離の可能性を減少させる。
【０００９】
Ａｂは高分子タンパク質であり、さまざまな分解形態に供される。分解の一形態は、ＡｓｎおよびＧｌｎ残基（特にＡｓｎ−ＧｌｙまたはＧｌｎ−Ｇｌｙ）の脱アミドおよびＡｓｐ残基の異性化である。分解の別の形態は、メチオニン、トリプトファンおよびシステインの酸化である。分解の別の形態は、Ａｓｐ−Ｐｒｏジペプチドの切断である。分解の別の形態は、Ｎ末端のＧｌｕまたはＧｌｎからのピログルタミン酸の形成である。問題のある配列の発生を最小にしたライブラリを提供することが有利である。
【００１０】
約３アミノ酸長から約３５アミノ酸長の間の重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３を含むヒト抗体の多様なファミリーのメンバーをコードするベクターまたはパッケージのライブラリを提供する。特定の実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ３もまた、Ｔｙｒ（Ｙ）とＳｅｒ（Ｓ）とに富み、かつ／または多様化されたＤ領域を含み、かつ／または伸長されたＪＨ領域を含むことができる。例えば、ＨＣ ＣＤＲ３は、例えば本明細書中の実施例において提供するように、約４０％を超える（例えば、約４３％および約８０％の間；例えば、約４０％を超えるが約１００％未満）Ｙおよび／またはＳ残基を含有することができる。さらに、このようなＨＣ ＣＤＲ３を含む集中的なライブラリも提供する。さらに、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２の設計およびＣＤＲに多様性のあるＶＫＩＩＩ Ａ２７のライブラリも提供する。本明細書に記載のＨＣ ＣＤＲ３を含むヒト抗体の多様なファミリーのメンバーをコードするベクターまたはパッケージのライブラリは、さらにＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３の１つまたは複数（例えば、１つ、２つまたは３つにおいて）に多様性を有することができる。例えば、ライブラリは、本明細書に記載のように、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３の１つまたは複数（例えば、１つ、２つまたは３つにおいて）に多様性を有することができる。
【００１１】
多様化されたＤ領域は、１つまたは複数のアミノ酸の変化が導入されているＤ領域である（例えば、天然発生のＤ領域の配列と比較して、例えば、終止コドンをＴｙｒ残基に変化できる）。
【００１２】
伸長されたＪＨ領域は、ＪＨ領域のフレームワーク配列のアミノ末端に存在する、１つまたは複数のアミノ酸残基を有するＪＨ領域である（例えば、ＦＲ４配列のアミノ末端、例えば、ＷＧＱで始まる）。例えば、ＪＨ１は伸長されたＪＨ領域である。他の例としては、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ５，およびＪＨ６が伸長されたＪＨ領域である。
【００１３】
さらに、上記のライブラリを作製し、スクリーニングする方法およびこのようなスクリーニングにおいて得られたＨＣ ＣＤＲ３および抗体を提供する。これらの方法を実践する組成物およびキットもまた、本明細書に記載する。
【００１４】
一部の態様において、本開示は、ヒト抗体関連ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質の多様なファミリー（例えば、抗体の多様なファミリー）のメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージの集中的ライブラリを特徴とし、ベクターまたは遺伝子パッケージは、
（ａ）約３または約４または約５アミノ酸長であるＨＣ ＣＤＲ３；
（ｂ）約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４または約３５アミノ酸長のＨＣ ＣＤＲ３（例えば、約２３から約３５アミノ酸長）；および
ｃ）約６から約２０アミノ酸長であるＨＣ ＣＤＲ３（例えば、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９または約２０アミノ酸長）
からなる群から選択される重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多彩化されたＤＮＡ配列を含み、ＨＣ ＣＤＲ３は、Ｄ領域（例えば、多様化されたＤ領域）（またはそれらの断片（例えば、３アミノ酸以上のＤ領域、例えば多様化されたＤ領域））あるいはＪＨ領域（例えば、伸長されたＪＨ領域）由来のアミノ酸を含む。
【００１５】
一部の実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ３は、Ｔｙｒ（Ｙ）およびＳｅｒ（Ｓ）に富んでいる（例えば、ＨＣ ＣＤＲ３の残基の４０％超がＹおよび／またはＳである）。
【００１６】
一部の実施形態において、ライブラリ（例えば、それらのベクターまたは遺伝子パッケージ）は、Ｄ領域またはＤ領域の断片（例えば、ＪＨ領域に隣接するＤ領域）を含む。
【００１７】
一部の実施形態において、ライブラリは、ＪＨ領域、例えば伸長されたＪＨ領域を含む。
【００１８】
一部の実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ３は、Ｄ領域またはＤ領域の断片（例えば、ＪＨ領域に隣接するＤ領域）由来のアミノ酸を含む。
【００１９】
一部の実施形態において、Ｄ領域は、Ｄ２−２（ＲＦ２）、Ｄ２−８（ＲＦ２）、Ｄ２−１５（ＲＦ２）、Ｄ２−２１（ＲＦ２）、Ｄ３−１６（ＲＦ２）、Ｄ３−２２（ＲＦ２）、Ｄ３−３（ＲＦ−２）、Ｄ３−９（ＲＦ２）、Ｄ３−１０（ＲＦ２）、Ｄ１−２６（ＲＦ３）、Ｄ４−１１（ＲＦ２）、Ｄ４−４（ＲＦ２）、Ｄ５−５（ＲＦ３）、Ｄ５−１２（ＲＦ３）、Ｄ５−１８（ＲＦ３）、Ｄ６−６（ＲＦ１）、Ｄ６−１３（ＲＦ１）およびＤ６−１９（ＲＦ１）からなる群から選択される。
【００２０】
一部の実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ３は、ＪＨ領域由来のアミノ酸を含む。ＪＨ領域は、伸長されたＪＨ領域であってよい。一部の実施形態において、伸長されたＪＨ領域は、ＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ５およびＪＨ６からなる群から選択される。一部の実施形態において、ＪＨ領域は、Ｙおよび／またはＳ残基に富んでいてよく、例えば、約４０％を超える（例えば、約４３％および約８０％の間；例えば、約４０％を超えるが約１００％未満）Ｙおよび／またはＳ残基を含有することができる。
【００２１】
一部の実施形態において、Ｄ領域は１つまたは複数のシステイン（Ｃｙｓ）残基を含み、一部の実施形態において、１つまたは複数のＣｙｓ残基は一定に保たれている（例えば変化しない）。
【００２２】
一部の実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ３（例えば、ＨＣ ＣＤＲ３をコードするＤＮＡ）は、ＦＲ３とＤ領域との間の、１つまたは複数のフィラー（ｆｉｌｌｅｒ）コドンを含み、個々のフィラーコドンは、個別にＮＮＫ、ＴＭＹ、ＴＭＴまたはＴＭＣ（ＴＭＹ、ＴＭＴまたはＴＭＣはＳまたはＹをコードする）である。
【００２３】
一部の実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ３（例えば、ＨＣ ＣＤＲ３をコードするＤＮＡ）は、Ｄ領域とＪＨとの間の、１つまたは複数のフィラーコドンを含み、個々のフィラーコドンは、個別にＮＮＫ、ＴＭＹ、ＴＭＴまたはＴＭＣである。
【００２４】
一部の実施形態において、ライブラリ（例えば、ライブラリのベクターまたは遺伝子パッケージ）は、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、および／または軽鎖をさらに含み、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２に多様性もまた含み、あるいは軽鎖はＨＣ ＣＤＲ１および／またはＨＣ ＣＤＲ２および／または軽鎖（例えば、κまたはλ軽鎖）において多様性（それぞれ）を含む。例えば、ＨＣ ＣＤＲ３の多様性は、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２および／または軽鎖中の多様性のバックグラウンドに構築できる。例えば、軽鎖の多様性は、ＨＣの多様性と同じＤＮＡ分子中にコードでき、あるいはＬＣおよびＨＣの多様性は、別々のＤＮＡ分子中にコードできる。
【００２５】
一部の態様において、本開示は、３、４または５アミノ酸長であるＨＣ ＣＤＲ３を含むライブラリを特徴とし、ＣＤＲ３は、ＪＨ領域（例えば、伸長されたＪＨ領域）由来、またはＪＨ領域のＦＲ４部分に接合したＤ領域（例えば、多様化されたＤ領域）（またはそれらの断片（例えば３アミノ酸以上のＤ領域、例えば多様化されたＤ領域））由来のアミノ酸を含む。
【００２６】
一部の実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ３は、ＪＨ領域のＦＲ４部分に接合したＤ領域に由来し、三量体、四量体または五量体を含み、この三量体、四量体または五量体はシステイン残基を含まない。
【００２７】
一部の実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ３は、ＪＨ領域のＦＲ４部分に接合したＤ領域に由来し、三量体、四量体または五量体を含み、この三量体、四量体または五量体は終止コドンを含まない。
【００２８】
一部の実施形態において、Ｄ領域（例えば、Ｄ領域をコードするＤＮＡ）は、ＴＡＧコドンを含み、ＴＡＧコドンはＴＣＧ、ＴＴＧ、ＴＧＧ、ＣＡＧ、ＡＡＧ、ＴＡＴおよびＧＡＧからなる群から選択されるコドンによって置き換えられる。
【００２９】
一部の実施形態において、Ｄ領域（例えば、Ｄ領域をコードするＤＮＡ）は、ＴＡＡコドンを含み、ＴＡＡコドンはＴＣＡ、ＴＴＡ、ＣＡＡ、ＡＡＡ、ＴＡＴおよびＧＡＡからなる群から選択されるコドンによって置き換えられる。
【００３０】
一部の実施形態において、Ｄ領域（例えば、Ｄ領域をコードするＤＮＡ）は、ＴＧＡコドンを含み、ＴＧＡコドンはＴＧＧ、ＴＣＡ、ＴＴＡ、ＡＧＡ，およびＧＧＡからなる群から選択されるコドンによって置き換えられる。
【００３１】
一部の実施形態において、ライブラリは、ＨＣ ＣＤＲ１および／またはＨＣ ＣＤＲ２および／または軽鎖（例えば、κまたはλ軽鎖）において多様性をさらに含む。例えば、ＨＣ ＣＤＲ３の多様性は、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２および／または軽鎖中の多様性のバックグラウンドに構築できる。例えば、軽鎖の多様性は、ＨＣの多様性と同じＤＮＡ分子中にコードでき、あるいはＬＣおよびＨＣの多様性は、別々のＤＮＡ分子中にコードできる。
【００３２】
一部の態様において、本開示は、ライブラリを多様化する方法を提供し、この方法は本明細書に記載のライブラリを突然変異化するステップを含む。
【００３３】
一部の実施形態において、突然変異化はエラープローンＰＣＲを含む。
【００３４】
一部の実施形態において、突然変異化はｗｏｂｂｌｉｎｇを含む。
【００３５】
一部の実施形態において、突然変異化はｄｏｂｂｌｉｎｇを含む。
【００３６】
一部の実施形態において、突然変異化は、平均約１から約１０の突然変異（例えば、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０の突然変異、例えば塩基変化）／ＨＣ ＣＤＲ３を導入する。
【００３７】
「ｗｏｂｂｌｉｎｇ」は、元の配列が好ましいように、多彩化されたＤＮＡを作製する方法である。例えば元の配列が、ＧＣＴによりコードされ得るＡｌａを有する場合、混合物（０．７Ｇ、０．１Ａ、０．１Ｔ、０．１Ｃ）を１番目の位置に、（０．７Ｃ、０．１Ａ、０．１Ｔ、０．１Ｇ）を２番目の位置に、（０．７Ｔ、０．１Ａ、０．１Ｇ、０．１Ｃ）を３番目の位置に使用できる。「ドーピング」の他の比率も使用できる。このことは、Ａｌａを約５０％の確率で出現させることができ、一方Ｖ、Ｄ、Ｇ、Ｔ、ＰおよびＳは約７％の確率で生じる。他のＡＡ型はさらに低い頻度で生じる。
【００３８】
一部の態様において、本開示は、例えば、（精製された）ＨＣ ＣＤＲ１〜２のレパートリーを維持し、合成ＨＣ ＣＤＲ３およびＬＣの多様性を構築するために描かれる。
【００３９】
一部の実施形態において、本開示は、ｗｏｂｂｌｉｎｇされた重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３を提示するためのカセットを提供し、例えばこのカセットは、表４００に示すカセットを含む。
【００４０】
一部の態様において、本開示は、ＨＣ ＣＤＲ３においてＴｙｒのレベルが調節されたライブラリを特徴とする。一部の実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ３領域は、約１５％またはそれを超える（例えば、約１６％、約１８％、約２０％またはそれを超える）Ｔｙｒ残基を含有する。一部の実施形態において、高レベル（例えば、約２０％より多い）のＴｙｒが、例えば、Ｔｙｒを含有するＤ領域およびＪ ｓｔｕｍｐ（またはそれらに相当する合成配列）において、ライブラリメンバーのＨＣ ＣＤＲ３に挿入される。一部の実施形態において、リードイン位置またはＤＪフィラー位置（またはそれらに相当する合成配列）において、Ｔｙｒが許容されるが、２０％以下である。一部の実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ３領域は、約１５％未満（例えば、約１４％、約１２％、約１０％、約８％、約６％またはそれより少ない）のＴｙｒ残基を含有する。一部の実施形態において、ＨＣリードイン位置またはＤＪフィラー位置（またはそれらに相当する合成配列）は、約１５％未満（例えば、約１４％、約１２％、約１０％、約８％、約６％またはそれより少ない）のＴｙｒ残基を含有する。
【００４１】
一部の態様において、本開示は、ヒト抗体重鎖をコードする遺伝子パッケージのライブラリを特徴とし、このライブラリにおいて、親アミノ酸配列は、ＶＨ配列、続いて（Ｙ、Ｓ、Ｄ、Ｌ、Ｒ）からなる群から選択される０から１０個のアミノ酸、続いてヒトＤ領域またはＤ領域の断片、続いて（Ｙ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、Ｌ）からなる群から選択される０から１０個のアミノ酸、続いて少なくともＷ１０３を前方に含むＪＨセグメントを含み、この配列をコードする可変ＤＮＡが、親アミノ酸配列が最も可能性の高い配列となるように（例えばｗｏｂｂｌｉｎｇにより）合成される。
【００４２】
一部の態様において、本開示は、生殖系列フレームワーク領域を有する軽鎖のライブラリを特徴とし、ＣＤＲは、残基が結合部位から離れるように、または一定に保たれる埋もれた側基を有するように変化する。一部の実施形態において、可変ＤＮＡ合成の方法は、生殖系列配列が最も可能性のある配列となるように（例えばｗｏｂｂｌｉｎｇにより）使用される。
【００４３】
一部の態様において、本開示は、本明細書に開示されるような抗原結合可変領域をコードする多様なメンバーのライブラリを特徴とする。
【００４４】
一部の態様において、本開示は、本明細書に開示されるようなＨＣ ＣＤＲ３領域をコードする多様なメンバーのライブラリを特徴とする。一部の実施形態において、このライブラリは表１０９７のライブラリである。
【００４５】
一部の態様において、本開示は多様なメンバーのライブラリを特徴とし、個々のメンバーはＨＣ ＣＤＲ３をコードし、
ＨＤＣＲ３中の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、または８位は、ライブラリにおいて、それぞれＧ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、Ｌ，およびＹによって、［１．０Ｇ、．５７Ｓ、．４６Ｒ、．４２Ｄ、．３６Ｌ、．３５Ｙ］の割合で占められ、場合によって、
ＨＣ ＣＤＲ３の最後の４位は以下のように示される：
親アミノ酸は、他のアミノ酸型より３、４、５、６、７、８、１０倍の確率で存在し、他のアミノ酸型はＹ、Ｓ、Ｄ、Ｒ、Ｇを含む。
【００４６】
一部の態様において、本開示は多様なメンバーのライブラリを特徴とし、個々のメンバーはＨＣ ＣＤＲ３をコードし、
ＨＣ ＣＤＲ３の最初の１、２、３、４、５、６、７または８位の少なくとも１つ、好ましくはすべてが、ライブラリにおいて、［１．０Ｇ、．５７Ｓ、．４６Ｒ、．４２Ｄ、．３６Ｌ、．３５Ｙ］の割合でＧ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、ＬおよびＹに占められ、場合によって
ＨＣＤＲ３の最後の４位は、以下のように示される：
親アミノ酸は、他のアミノ酸型より３、４、５、６、７、８、１０倍の確率で存在し、他のアミノ酸型はＹ、Ｓ、Ｄ、Ｒ、Ｇを含む。
【００４７】
一部の態様において、本開示は多様なメンバーのライブラリを特徴とし、個々のメンバーはＨＣ ＣＤＲ３をコードし、
ＨＣ ＣＤＲ３の長さは１０、１１または１２位であり、
ＨＣ ＣＤＲ３の最初の６、７または８位はそれぞれ、ライブラリにおいて、［１．０Ｇ、．５７Ｓ、．４６Ｒ、．４２Ｄ、．３６Ｌ、．３５Ｙ］の割合で、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、ＬおよびＹで占められ、
ＨＣＤＲ３の最後の４位は以下のように示される：
親アミノ酸は、他のアミノ酸型より３、４、５、６、７、８、１０倍の確率で存在し、他のアミノ酸型はＹ、Ｓ、Ｄ、Ｒ、Ｇを含む。
【００４８】
一部の実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ３の最後の４位は個々に、ライブラリにおいて、７／１２が親、ならびにＹ、Ｓ、Ｄ、ＲおよびＧが個々に１／１２で示される。
【００４９】
一部の実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ３の最後の４位は個々に、ライブラリにおいて、Ａ６＝７／１２ＡならびにＹ、Ｓ、Ｄ、ＲおよびＧが個々に１／１２；Ｆ７＝７／１２ＦならびにＹ、Ｓ、Ｄ、ＲおよびＧが個々に１／１２；Ｄ８＝７／１１ＤならびにＹ、Ｓ、ＲおよびＧが個々に１／１１；Ｉ９＝７／１２ＩならびにＹ、Ｓ、Ｒ、ＤおよびＧが個々に１／１２で示される。
【００５０】
一部の実施形態において、メンバーはＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２をさらにコードする。
【００５１】
一部の実施形態において、メンバーは、Ｆフレームワーク（ＦＲ）領域１〜４をさらにコードする。
【００５２】
一部の実施形態において、メンバーは、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＦＲ領域１〜４をコードする。
【００５３】
一部の実施形態において、メンバーは、３−２３のＨＣフレームワークを含む。
【００５４】
一部の実施形態において、ライブラリは、ＬＣ可変領域をさらに含む。
【００５５】
一部の実施形態において、ライブラリは、多様なＬＣ可変領域をコードするメンバーを含む。
【００５６】
一部の実施形態において、ＬＣ可変領域を含むメンバーは、Ａ２７ ＬＣフレームワークを含む。
【００５７】
一部の実施形態において、ライブラリは、ディスプレイライブラリ、例えば、ファージディスプレイライブラリである。
【００５８】
一部の実施形態において、ライブラリは、少なくとも１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１の多様なメンバーを有する。
【００５９】
一部の態様において、本開示は、本明細書に記載のライブラリと標的を接触させるステップ、メンバーと前記標的とを結合させるステップ、および標的を結合したメンバーを回収するステップを含む、ライブラリメンバーを選択する方法を特徴とする。
【００６０】
本発明のこれらの実施形態、他の実施形態およびそれらの特徴および特性は、以下の説明、図面および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
（詳細な説明）
抗体（「Ａｂ」）は、それらの多様性を、特定の標的に対するＡｂの親和性および特異性の決定に関与する領域に集中する。これらの領域は、配列および長さにおいて多様であってよい。一般的に、それらは双方の点において多様である。しかし、ヒト抗体のファミリーにおいて、配列および長さ双方における多様性は、真にランダムではない。むしろ、一部のアミノ酸残基は、ＣＤＲの特定の位置において好ましく、一部のＣＤＲの長さが好ましい。これらの好ましい多様性は、抗体ファミリーの天然の多様性に相当する。
【００６２】
本発明によれば、また以下でさらに十分に説明するように、約３から約３５の間のアミノ酸長である重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３を含むヒト抗体の多様なファミリーのメンバーをコードする、ベクターおよび遺伝子パッケージのライブラリを調製し使用できる。特定の実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ３はさらに、ＹとＳとに富んでいてよく、かつ／または多様化されたＤ領域を含んでよい。このようなＨＣ ＣＤＲ３を含む集中的ライブラリをさらに提供する。
【００６３】
免疫細胞が抗体重鎖を構築する場合、免疫細胞は、ＶセグメントをＤセグメントに接続し、それをＪセグメントに接続する。Ｄセグメントは任意選択であり、ヒトＡｂの約５０％は認識可能なＤを有する。この細胞は、ジャンクション部位（ＶとＤ、ＤとＪまたはＶとＪ）において、塩基の除去および付加双方の多数の編集を実施できるが、必ずしもランダムではない。最初に再構成された抗体は、細胞の表面に提示され、抗原（Ａｇ）と結合する場合、細胞は刺激され、親和性を改善するために体細胞突然変異を実施する。免疫グロブリン生殖系列遺伝子中にコードされるホットスポットがあり、その結果Ａｂ遺伝子の特定の場所が、持続性Ａｇに対する優れたバインダーを探し求めて特定のセットの突然変異を起こす可能性が非常に高い。実際には、突然変異の一部はフレームワーク位置にあるが、大部分は相補性決定領域（ＣＤＲ）にある。高度な配列多様性を占めすだけでなく、長さの多様性も示すので、重鎖（ＨＣ）のＣＤＲ３が特に興味がある。ＣＤＲがランダムなＤＮＡで置き換えられた抗体（Ａｂ）ライブラリが構築されており、有用なＡｂが得られている。しかし、一部の治療用Ａｂは有意な程度の抗原性を示す。ヒト生殖系列に近いＡｂが低抗原性であり得る。
【００６４】
定義
便宜上、本発明のさらなる説明の前に、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲に用いた特定の用語をここで定義する。
【００６５】
単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないと指示しない限り、複数に対する言及を含む。
【００６６】
「親和性」または「結合親和性」という用語は、見かけ上の結合定数すなわちＫａを指す。Ｋａは、解離定数（Ｋｄ）の逆数である。結合タンパク質は、例えば、特定の標的分子に対して、少なくとも１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０および１０１１Ｍ−１の結合親和性を有することができる。第２の標的と比較して第１の標的に対する結合タンパク質の結合親和性がより高いことは、第２の標的への結合に関するＫＡ（または数値ＫＤ）より第１の標的への結合に関するＫＡ（または数値ＫＤがより小さい）がより高いことにより示すことができる。このような場合、結合タンパク質は、第２の標的（例えば、第２の立体配座中の同じタンパク質またはそれらの模倣体あるいは第２のタンパク質）と比較して、第１の標的（例えば、第１の立体配座のタンパク質またはそれらの模倣体）に関して特異性を有する。結合親和性の差（例えば、特異性または他の比較に関して）は、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、１５、２０、３７．５、５０、７０、８０、９１、１００、５００、１０００または１０５倍であり得る。
【００６７】
結合親和性は、平衡透析、平衡結合、ゲルろ過、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴または分光法（例えば、蛍光測定を使用して）を含むさまざまな方法により決定できる。結合親和性を評価するための例示的な条件は、ＴＲＩＳ緩液（５０ｍＭのＴＲＩＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）中である。これらの技術は、結合タンパク質（または標的）の濃度の関数として、結合しているタンパク質および遊離の結合タンパク質の濃度を測定するために使用できる。結合された結合タンパク質（［Ｂｏｕｎｄ］）の濃度は、遊離の結合タンパク質（［Ｆｒｅｅ］）の濃度および標的上の結合タンパク質の結合部位の濃度に関連し、以下の方程式：
［Ｂｏｕｎｄ］＝Ｎ・［Ｆｒｅｅ］／（（１／ＫＡ）＋［Ｆｒｅｅ］）
において、（Ｎ）は結合部位の数／標的分子である。
【００６８】
必ずしもＫＡを正確に決定する必要はないが、これは、時として、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ分析などの方法を使用して決定される、親和性の定量的測定値を得ることで十分であるからであり、その測定値はＫＡに比例し、したがって比較、例えば、より高い親和性が例えば２倍高いかどうかの決定に使用して、例えば、機能アッセイ、例えばインビトロまたはインビボアッセイにおける活性により、親和性の定性的測定値を得、または親和性の推定値を得ることができる。
【００６９】
「抗体」という用語は、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメインまたは免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質を指す。例えば、抗体は、重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略記する）および軽（Ｌ）鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略記する）を含むことができる。別の実施例において、抗体は、２つの重（Ｈ）鎖可変領域および２つの軽（Ｌ）鎖可変領域を含む。重鎖および軽鎖は、それぞれさらにＨＣおよびＬＣと略記してもよい。「抗体」という用語は、抗体の抗原結合断片（例えば、一本鎖抗体、ＦａｂおよびｓＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖおよびドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（ｄｅ Ｗｉｌｄｔ ら、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９６年；２６巻（３号）：６２９〜３９頁））および完全抗体を包含する。抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ（およびそれらのサブタイプ）の構造的特徴を有することができる。抗体は任意の供給源由来でよいが、霊長類（ヒトおよび非ヒト霊長類）および霊長類化されたものが好ましい。
【００７０】
ＶＨおよびＶＬ領域は、「フレームワーク領域」（「ＦＲ」）と呼ばれる、より保存された領域に散在する、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細かく分けることができる。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は、厳密に定義されている（Ｋａｂａｔ， Ｅ．Ａ．， ら、（１９９１年）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１巻３２４２頁およびＣｈｏｔｈｉａ， Ｃ． ら、（１９８７年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６巻：９０１〜９１７頁を、さらに ｗｗｗ．ｈｇｍｐ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋを参照されたい）。Ｋａｂａｔの定義を本明細書において使用する。ＶＨおよびＶＬは個々に、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲにより通常構成され、以下の順でアミノ末端からカルボキシ末端に配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
【００７１】
抗体のＶＨまたはＶＬ鎖は、重鎖または軽鎖の定常領域のすべてまたは一部をさらに含むことができ、その結果免疫グロブリンの重鎖または軽鎖をそれぞれ形成する。一実施形態において、抗体は、２つの免疫グロブリン重鎖および２つの免疫グロブリン軽鎖の四量体であり、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖は、例えばジスルフィド結合により相互接続している。ＩｇＧにおいて、重鎖定常領域は３つの免疫グロブリンドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。軽鎖定常領域は、ＣＬドメインを含む。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、通常抗体と、宿主組織または免疫系のさまざまな細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ）を含む因子との結合を媒介する。免疫グロブリンの軽鎖は、κまたはλ型であり得る。一実施形態において、抗体はグリコシル化される。抗体は、抗体依存性細胞障害作用および／または補体媒介性細胞障害作用に対して機能性であり得る。
【００７２】
抗体の１つまたは複数の領域は、ヒトまたは有効にヒトであり得る。例えば、可変領域の１つまたは複数は、ヒトまたは有効にヒトであり得る。例えば、ＣＤＲ、例えばＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＨＣ ＣＤＲ３、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３の１つまたは複数は、ヒトであり得る。個々の軽鎖ＣＤＲは、ヒトであり得る。ＨＣ ＣＤＲ３はヒトであり得る。フレームワーク領域、例えばＨＣまたはＬＣのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４の１つまたは複数は、ヒトであり得る。例えば、Ｆｃ領域はヒトであり得る。一実施形態において、すべてのフレームワーク領域は、ヒト、例えばヒト体細胞、例えば、免疫グロブリンを産生する造血細胞または非造血細胞に由来する。一実施形態において、ヒト配列は、例えば生殖系列核酸によりコードされる生殖系列配列である。一実施形態において、選択されたＦａｂのフレームワーク（ＦＲ）残基は、最も類似した霊長類生殖系列遺伝子、特にヒト生殖系列遺伝子中の対応する残基のアミノ酸型に変換され得る。定常領域の１つまたは複数は、ヒトまたは有効にヒトであり得る。例えば、免疫グロブリン可変ドメイン、定常領域、定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＬ）あるいは完全抗体の少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９８または１００％、は、ヒトまたは有効にヒトであり得る。
【００７３】
抗体のすべてまたは一部は、免疫グロブリン遺伝子またはそれらのセグメントによりコードされ得る。例示的なヒト免疫グロブリン遺伝子は、κ、λおよびα（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、γ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、Δ、εおよびμの定常領域遺伝子ならびに多くの免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。完全長免疫グロブリンの「軽鎖」（約２５ＫＤａまたは約２１４アミノ酸）は、ＮＨ２末端において可変領域遺伝子（約１１０アミノ酸）により、ＣＯＯＨ末端においてκまたはλ定常領域遺伝子によりコードされる。完全長免疫グロブリンの「重鎖」（約５０ＫＤａまたは約４４６アミノ酸）は、可変領域遺伝子（約１１６アミノ酸）および他の前述の定常領域遺伝子の１つ、例えばγ（約３３０アミノ酸をコードする）により、同様にコードされる。ヒトＨＣの長さは、ＨＣ ＣＤＲ３が約３アミノ酸残基から３５アミノ酸残基超にわたって変化するので、大幅に変化する。
【００７４】
本明細書において、「Ｄセグメント」および「Ｄ領域」という用語は、交換可能に用いられ、同一である。これらの要素は、ＤＮＡおよびアミノ酸の双方の表現を有し、その意味するところは文脈から明らかであることは理解されるべきである。
【００７５】
「ライブラリ」または「ディスプレイライブラリ」は、ヌクレオチド、例えばＤＮＡ、クローン内の配列のコレクション、または個別のポリペプチドまたはポリペプチドの混合集団を提供するために選択またはスクリーニングできる、複製可能なディスプレイパッケージに提示されたポリペプチドの遺伝子的に多様なコレクションを指す。
【００７６】
本明細書において使用する「パッケージ」という用語は、粒子がその表面にポリペプチドを提示している、複製可能な遺伝子ディスプレイパッケージを指す。このパッケージは、その表面に抗原結合ドメインを提示するバクテリオファージであってよい。この型のパッケージは、ファージ抗体（ｐＡｂ）と呼ばれている。
【００７７】
「所定の標的」は、任意の開示された方法において、その使用に先だって同一性が既に公知である標的分子を指す。
【００７８】
本明細書において使用する「複製可能なディスプレイパッケージ」という用語は、複製能力を有する粒子を提供する遺伝子情報を有する生物学的粒子を指す。この粒子はその表面にポリペプチドの少なくとも一部を提示できる。このポリペプチドは、この粒子にネイティブな遺伝子情報および／または粒子内に人工的に配置された遺伝子情報あるいはその原型によりコードされ得る。提示されたポリペプチドは、特異的結合対、例えば、免疫グロブリン分子、酵素または受容体などに基づく重鎖または軽鎖ドメインの任意のメンバーであってよい。この粒子は、例えば、ウィルス、例えば、ｆｄまたはＭ１３などのバクテリオファージであってよい。
【００７９】
「ベクター」という用語は、遺伝子が挿入され、組み換えＤＮＡ分子を構築する、宿主生命体中で複製可能なＤＮＡ分子を指す。「ファージベクター」は、バクテリオファージに関する複製起点を含有するが、プラスミドに関する複製起点を含有しない、ファージゲノムの改変に由来するベクターである。「ファージミドベクター」は、バクテリオファージに関する複製起点およびプラスミドの複製起点を含有する、プラスミドゲノムの改変に由来するベクターである。
【００８０】
オリゴヌクレオチドの議論において、「［ＲＣ］」の表記は、示したオリゴヌクレオチドの逆相補体が、使用したオリゴヌクレオチドであることを示す。
【００８１】
ヒト抗体重鎖ＣＤＲ３
重鎖（「ＨＣ」）生殖系列遺伝子（ＧＬＧ）３−２３（ＶＰ−４７としても公知）は、全ヒトＡｂの約１２％を占め、本発明の好ましい実施形態においてフレームワークとして好ましい。しかし、他の周知のフレームワーク、例えば４−３４、３−３０、３−３０．３および４−３０．１も、本発明の集中的多様性の原理から逸脱することなく使用できることを理解するべきである。
【００８２】
加えて、
【００８３】
【化１】
は、ネイティブ抗体中のＪＨ３より頻繁に現れる。したがって、ＪＨ４は本発明の集中的ライブラリにとって好ましい。しかし、
【００８４】
【化２】
、ＪＨ１、ＪＨ２またはＪＨ５も同様に使用できる。ＪＨ２は、すべての他のヒトＪＨにおいてＱＧの代わりに１０５−１０６にＲＧを有する有利性を有する。ＪＨ３は、Ｍ１０８の不利を有する。少なくとも１つの標的に対してＥＬＩＳＡ陽性であった１４１９のＡｂのコレクションにおいて、本発明者らは、１７のＪＨ１、３１のＪＨ２、４５２のＪＨ３、６３６のＪＨ４、３２のＪＨ５および２５１のＪＨ６を見出した。存在するのであれば、ＪＨの二重下線部分は、ＣＤＲ３の一部であると考えられる。表３において、ＪＨのＦＲ４部分は、下線を引いてある。
【００８５】
これらの１４１９のＡｂのＨＣ ＣＤＲ３に出現する個々のアミノ酸の頻度を、表７５に一覧にし、記録した。最も一般的なアミノ酸は、順番にＴｙｒとＧｌｙ、Ａｓｐ、ＳｅｒおよびＡｒｇであったことに留意されたい。Ｒｅｌ．Ｕｐは、最もまれなＣｙｓと比較した個々の型の相対存在量である。Ｒｅｌ．Ｄｏｗｎは、最も一般的なＴｙｒと比較した個々の型の存在量である。したがって、ＨＣ ＣＤＲ３内に置換する好ましいアミノ酸型は、Ｙ、Ｇ、Ｄ、ＳおよびＲである。
【００８６】
必然的に、ＨＣ ＣＤＲ３は長さが変わる。ヒトＨＣの約半分は、成分：Ｖ：：ｎｚ：：Ｄ：：ｎｙ：：ＪＨｎからなり、ＶはＶ遺伝子であり、ｎｚは、本質的にランダムな一連の塩基であり、Ｄは、多くの場合双方の末端で大量の編集があるＤセグメントであり、ｎｙは、本質的にランダムな一連の塩基であり、ＪＨｎは、多くの場合、５’末端で大量の編集がある６つのＪＨセグメントの１つである。Ｄセグメントは、ＩｇＧを折り畳ませるスペーサーセグメントを提供するために出現する。最も大きい多様性は、ＶとＤおよびＤとＪＨのジャンクションにおいてある。
【００８７】
Ｃｏｒｂｅｔｔ ら、（Ｃｏｒｂｅｔｔ ＳＪ、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ＩＭ、Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ ＥＬ、Ｂｕｃｋ Ｄ、Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． １９９７年Ｖ２７０巻：５８７〜９７頁）は、ヒト免疫系は、複数のＤセグメントおよび組み換えられたＤセグメントを挿入しないことを示した。それにもかかわらず、Ｄセグメントは、ＨＣ ＣＤＲ３の優れた成分として選択されており、本発明は、複数のＤセグメントを含有するＨＣ ＣＤＲ３を含む。
【００８８】
ヒトＤセグメントは、いくつかの非常に強いバイアスを有する。ヒトＤセグメントにおける５２２のアミノ酸の集計は、Ｙが７０（１３．４％）、Ｌが６３（１２．１％）、Ｖが５２（１０％）、Ｇが４９（９．４％）、Ｉが４１（７．９％）、Ｔが４０（７．７％）、Ｓが３３（６．３％）、Ｗが２７（５．２％）、Ｄが２１（４％）、Ａが１９（３．６％）、Ｒが１６（３．１％）、ＴＡＧが１５（２．９％）、Ｎが１４（２．７％）、Ｑが１１（２．１％）、Ｃが９（１．７％）、Ｅが９（１．７％）、Ｆが８（１．５％）、Ｍが８（１．５％）、ＴＧＡが８（１．５％）、ＴＡＡが７（１．３％）、Ｐが１（０．２％）、Ｈが１（０．２％），およびＫが０（０％）である。不対のＣｙｓを有し、さらにＴＧＡ終止コドンを有する、１つのＤ（２−８ ＲＦ１）があり、あまり使用されない。したがって、Ｄセグメントは、主に疎水性である。ヒトＨＣ ＣＤＲ３におけるアミノ酸の頻度を、表７５に示す。頻度には、類似点および相違点の双方がある。ＨＣ ＣＤＲ３全体において、Ｔｙｒは最も一般的であり、Ｇｌｙだけがそれに近い（Ｔｙｒの９６％一般的）。Ａｓｐ（Ｔｙｒの７５％一般的）、Ｓｅｒ（Ｔｙｒの５３％一般的）、Ｌｅｕ、ＶａｌおよびＩｌｅは、すべてのＤセグメントが等しいとして数えた場合、Ｄセグメントにおいて比較的一般的である。免疫系は、Ｄセグメントを同じ頻度で使用しない。表７７は、Ｄセグメントの利用頻度を示す。しばしば使用されるＤセグメントは、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、ＳｅｒおよびＡｓｐに非常に富んでいる。Ａｒｇは、最も多く使用されるＤセグメントには見出されず、Ａｒｇは、ＪＨセグメントの任意のＣＤＲ部分にもコードされない。Ａｒｇは、Ｖ、ＤおよびＪの突然変異により、またはＶおよびＤ、ＤおよびＪまたはＶおよびＪの間のフィラー領域においてのどちらかで優勢になる。このサンプルにおいて、全アミノ酸の５０％は、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、ＳｅｒまたはＡｒｇである。本発明の一実施形態において、「親」ＨＣ ＣＤＲ３配列の置換は、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＡｓｐおよびＡｒｇからなるアミノ酸のセットに限定される。本発明の一実施形態において、Ａｒｇは、ＶおよびＤの間、ＤおよびＪの間またはＶおよびＪの間のフィラー領域において一般的である。
【００８９】
本発明の好ましいライブラリにおいて、両方の型のＨＣ ＣＤＲ３を使用する。特定可能なＤセグメントを有さないＨＣ ＣＤＲ３において、構造は、Ｖ：：ｎｚ：：ＪＨｎ（ｎ＝１，６）であり、ＪＨは５’末端において通常編集されている。特定可能なＤセグメントを有するＨＣ ＣＤＲ３において、構造はＶ：：ｎｚ：：Ｄ：：ｎｙ：：ＪＨｎである。
【００９０】
本明細書において、約３から約３５アミノ酸長の間のＨＣ ＣＤＲ３を提供する。特定の実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ３は、ＹとＳとに富んでいる、および／またはＤ領域が存在する場合、多様化されたＤ領域を含むことができる。例えば、ＨＣ ＣＤＲ３は約４３％および約８０％間の、例えば、約４３％、約４８％、約６９％、約６３％、約７１％、約６２％、約５８％、約６８％、約８０％、約７７％のＹおよび／またはＳ残基を含むことができ、あるいは残基の約４０％より多く、または約４０％から約１００％未満はＹおよび／またはＳである。例えば、ＣＤＲ３中のすべての残基がＹおよび／またはＳではない。特定の実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ３は、伸長されたＪＨ領域を含むことができる。本発明の好ましいライブラリの例示的なＨＣ ＣＤＲ３成分設計を、実施例１、２および３に示し、説明する。
【００９１】
一部の実施形態において、（例えばＣＤＲ例えばＨＣ ＣＤＲ３またはフレームワーク領域（例えばＣＤＲ、例えばＣＤＲ３、例えばＨＣ ＣＤＲ３に近いまたは隣接するフレームワーク領域）における）多様性は、平均して約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０，または約１から約１０の突然変異（例えば塩基の変化）／例えばＣＤＲ（例えばＨＣ ＣＤＲ３）またはフレームワーク領域（ＣＤＲ、例えばＣＤＲ３、例えばＨＣ ＣＤＲ３に近いまたは隣接するフレームワーク領域）を創製するために生成される。いくつかの実践形態において、突然変異誘発は、公知の領域または結合界面において可能性の高い領域を標的にする。さらに、突然変異誘発は、ＣＤＲに近いまたは隣接するフレームワーク領域を対象とできる。抗体の場合、突然変異誘発は、例えば、精密な段階的な改善を起こすためにＣＤＲの１つまたはいくつかにも限定され得る。同様に、特定されたリガンドが酵素である場合、突然変異誘発は、活性部位および周辺に結合できる抗体を提供できる。特定の実施形態において、ＣＤＲまたはフレームワーク領域（例えば、本明細書に記載のＨＣ ＣＤＲ３）を、エラープローンＰＣＲに供し、多様性を生成することができる。この手法は、「スロッピー（ｓｌｏｐｐｙ）」型のＰＣＲを使用し、「スロッピー（ｓｌｏｐｐｙ）」型のＰＣＲにおいて、ポリメラーゼは非常に高いエラー率（最大２％）を有し、野生型配列を増幅し、Ｐｒｉｔｃｈａｒｄら、（２００５年） Ｊ． Ｔｈｅｏｒ． Ｂｉｏｌ．２３４巻：４９７〜５０９頁およびＬｅｕｎｇ ら、（１９８９年）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ１巻：１１〜１５頁に一般的に記載されている。他の例示的な突然変異誘発技術は、ランダムな切断を使用するＤＮＡシャッフリング（Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４年）Ｎａｔｕｒｅ ３８９〜３９１頁；「核酸シャッフリング」と呼ばれる）、ＲＡＣＨＩＴＴ（商標）（Ｃｏｃｏら、（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９巻：３５４頁）、部位特異性突然変異誘発（Ｚｏｌｌｅｒら、（１９８７年）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １０巻：６４８７〜６５０４頁）、カセット突然変異誘発 （Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ（１９９１年）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２０８巻：５６４〜５８６頁）および縮重オリゴヌクレオチドの組み込み （Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ら、（１９９４年）ＥＭＢＯ Ｊ． １３巻：３２４５頁）を含む。
【００９２】
本発明の一部の実施形態において、残基の大部分がＳｅｒまたはＴｙｒのどちらかであるＤセグメントを選択する。一部の実施形態において、Ｄ領域をコードするＤＮＡを合成する場合、個々のＳｅｒまたはＴｙｒ残基は、コードされたアミノ酸がＳｅｒまたはＴｙｒのどちらかであるように、ＴＭＴ、ＴＭＣまたはＴＭＹにより、コードされる。
【００９３】
一部の実施形態において、本明細書に記載のＨＣ ＣＤＲ３配列を、対象となるＨＣ ＣＤＲ３をインフレームでコードする配列と、抗生物質耐性遺伝子、例えばＫａｎＲ遺伝子とを融合するステップおよびカナマイシン耐性に関して選択するステップにより、オープンリーディングフレームに関する選択に供することができる。ＣＤＲ３が終止コドンまたはフレームシフトを有する可能性のある細胞は、抗生物質耐性を有さず、その配列は除去される。
【００９４】
ヒト抗体重鎖ＣＤＲ３を含むライブラリの構築方法およびヒト抗体重鎖ＣＤＲ３を含むライブラリ。
【００９５】
抗体ライブラリは、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を有するタンパク質を含む、タンパク質のコレクションである。例えば、ラクダ化（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ）可変ドメイン（例えば、ＶＨドメイン）は、唯一の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質のライブラリのための足場として使用できる。別の実施例において、タンパク質は、対になり得る２つの可変ドメイン配列、例えばＶＨおよびＶＬドメインを含む。抗体ライブラリは、抗体コーディング配列を含む、例えば、本明細書において提供されるＨＣ ＣＤＲ３をコードする配列を含む核酸ライブラリから調製できる（抗体コーディングライブラリ）。
【００９６】
ディスプレイライブラリを使用する場合、抗体コーディングライブラリの個々のメンバーは、コードする抗体を伴うことができる。ファージディスプレイの場合、抗体タンパク質は、ファージでコートされたタンパク質を（直接的または間接的に）物理的に伴う。代表的な抗体ディスプレイライブラリのメンバーは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含むポリペプチドを提示する。ディスプレイライブラリのメンバーは、Ｆａｂ断片（例えば、２つのポリペプチド鎖を使用する）または一本鎖Ｆｖ（例えば、一本鎖ポリペプチドを使用する）として抗体を提示できる。他のフォーマットもまた使用できる。
【００９７】
Ｆａｂおよび他のフォーマットの場合のように、提示された抗体は、１つまたは複数の定常領域を、軽鎖および／または重鎖の一部として含むことができる。一実施形態において、個々の鎖は、例えばＦａｂの場合のように１つの定常領域を含む。他の実施形態において、さらなる定常領域が含まれる。有用な抗原結合部位を有すると特定された後で、１つまたは複数の定常領域を分子に加えることもまた可能である。例えば米国特許出願第２００３−０２２４４０８号を参照されたい。
【００９８】
抗体ライブラリは多くの方法により構築できる（例えば、ｄｅ Ｈａａｒｄら、（１９９９年）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ２７４巻：１８２１８〜３０頁；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ら、（１９９８年）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ４巻：１〜２０頁、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、（２０００年）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ２１巻：３７１〜８頁およびＨｏｅｔら、（２００５年）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２３巻（３号）：３４４〜８頁を参照されたい。
【００９９】
ライブラリの構築のための特定の実施形態において、本明細書に記載のＣＤＲ３を含む重鎖ならびにκおよびλ軽鎖が、個別のベクターにおいて最も良く構築される。第１に、合成遺伝子を設計し、個々の合成可変ドメインを統合する。軽鎖は、ＡｐａＬＩ（シグナル配列の最末端に位置する）およびＡｓｃＩ（終止コドンの後ろに位置する）のための制限部位に結合できる。重鎖は、ＳｆｉＩ（Ｐｅ１Ｂシグナル配列内に位置する）およびＮｏｔＩ（ＣＨ１およびアンカータンパク質の間のリンカーに位置する）に結合できる。Ｐｅ１Ｂ以外のシグナル配列、例えばＭ１３ｐＩＩＩシグナル配列もまた使用できる。
【０１００】
最初の遺伝子は、所望のＣＤＲの代わりに「スタッファー」配列を用いて作製できる。「スタッファー」は切り取られ、多様なＤＮＡに置き換えられるが、機能性の抗体遺伝子を発現できない配列である。例えば、スタッファーは、いくつかの終止コドンおよび正確な完成ライブラリベクターには発生しないであろう制限部位を含有し得る。スタッファーは、高度に示されたＣＤＲ配列の任意の１つを有することを避けるために使用される。
【０１０１】
本発明の別の実施形態において、重鎖およびκまたはλ軽鎖は、これらの鎖のクローニングを可能にする適切な制限部位を有する、（例えば、提示する、または提示および発現するための）単一のベクターまたは遺伝子パッケージにおいて構築される。このようなベクターを構築するための方法は周知であり、当分野において広く使用される。好ましくは、重鎖およびκ軽鎖ライブラリならびに重鎖およびλ軽鎖ライブラリは別々に調製されるであろう。
【０１０２】
最も好ましくは、提示は、Ｍ１３ファージの誘導体の表面上である。最も好ましいベクターは、Ｍ１３の全遺伝子、抗生物質耐性遺伝子およびディスプレイカセットを含有する。カセットとして、遺伝子の多様なファミリーのメンバーの導入および除去を可能にする制限部位を有する好ましいベクターが提供される。好ましいベクターは、ファージの増幅に使用される成長条件下で、再構成に対して安定である。
【０１０３】
本発明の別の実施形態において、本発明の方法により獲得された多様性は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を提示および／または発現するファージミドベクター（例えば、ｐＭＩＤ２１（表３５に示したＤＮＡ配列））において提示および／または発現され得る。このようなベクターを使用し、他のベクターまたはファージを使用する、その後の提示および／または発現のために多様性を保存することもできる。
【０１０４】
さらに他の実施形態において、２００８年２月１３日出願のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ６１／０２８，２６５、２００８年４月１０日出願のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６１／０４３，９３８および２００９年２月１３日出願のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１２／３７１，０００に記載の、軽鎖の高速最適化または「ＲＯＬＩＣ」と呼ばれる方法では、ＬＣの大型の集団が、それらをファージ上に提示するファージベクター中に配置される。ＨＣの小型の集団（例えば、３、１０または２５）は、ＨＣ、例えば本明細書に記載のＣＤＲ３を有するＨＣがペリプラズム中に分泌されるように、Ｅ．ｃｏｌｉ中にクローン化される。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉを、ＬＣの大型の集団をコードするファージベクターに感染させ、ファージ上にＨＣ／ＬＣタンパク質の対合を作製する。ファージ粒子は、ＬＣ遺伝子のみを担持する。
【０１０５】
別の態様において、２００８年２月１３日出願のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ６１／０２８，２６５、２００８年４月１０日出願のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６１／０４３，９３８および２００９年２月１３日出願のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１２／３７１，０００にさらに記載の、重鎖の経済的選択または「ＥＳＣＨ」と呼ばれる方法において、ＬＣの小型の集団が、それらの分泌を起こすベクター中に配置され得る。ＣＤＲ３を含む本明細書において提供されるＨＣのライブラリのような、ＨＣの新しいライブラリがファージ中に構築される。次いでＬＣおよびＨＣは、感染のさらにもっと有効な方法により組み合わせることができる。有効なＨＣの小型のセットが選択されたら、これらを使用して、ＲＯＬＩＣに供し、最適なＨＣ／ＬＣの対合を得る、または古典的選択のためのＬＣのＦａｂライブラリにクローン化されるように使用できる。
【０１０６】
本発明の別の実施形態において、本発明の方法により獲得される多様性は、真核細胞、例えば酵母ベクターにおける発現、例えば酵母細胞における発現に適したベクターを使用して提示および／または発現され得る 。
【０１０７】
タンパク質ディスプレイの他の型は、細胞ベースの提示（例えばＷＯ０３／０２９，４５６を参照されたい）；リボソームディスプレイ（例えば、Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ ら、（１９９４年） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１巻：９０２２頁およびＨａｎｅｓ ら、（２０００年）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １８巻：１２８７〜９２頁を参照されたい）；タンパク質−核酸融合（例えば、米国特許第６，２０７，４４６号を参照されたい）；および非生物学的タグの固定（米国特許第５，８７４，２１４号を参照されたい）を含む。
【０１０８】
本開示のライブラリから単離された抗体を分析し、ＬＣの型および最も近い生殖系列遺伝子を決定できる。好ましい実施形態において、非生殖系列フレームワーク残基は、結合親和性および特異性が許容不可能な程度に悪影響を与えない限り、生殖系列アミノ酸に戻される。置換は、群として、または１つずつ実施され得る。ヒト生殖系列配列は、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ， Ｉ．Ａ．ら、１９９２年、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２７巻：７７６〜７９８頁；Ｃｏｏｋ， Ｇ． Ｐ．ら、１９９５年、Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １６巻（５号）：２３７〜２４２頁；Ｃｈｏｔｈｉａ， Ｄ． ら、１９９２年、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏ．２２７巻：７９９〜８１７頁に開示されている。Ｖ ＢＡＳＥの要覧は、ヒト免疫グロブリン可変領域配列の包括的な総覧を提供する（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ， Ｉ．Ａ． らにより編纂、 ＭＲＣ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）。抗体は、結合特性が実質的に保有される限り、フレームワーク領域中の１つまたは複数の非生殖系列アミノ酸を抗体の対応する生殖系列アミノ酸に戻すことによって「生殖系列化」される。類似の方法は、定常領域、例えば免疫グロブリン定常ドメインにおいてもまた使用できる。
【０１０９】
例えば、抗体は、例えばフレームワーク、ＣＤＲまたは定常領域において、１つ、２つ、３つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含み、より参照生殖系列配列に近づけることができる。１つの例示的な生殖系列化の方法は、単離抗体の配列に類似する（例えば、特定のデータベースにおいて最も類似の）、１つまたは複数の生殖系列配列を特定するステップを含む。次いで、（アミノ酸レベルにおいて）突然変異を、増加的に、または他の突然変異と組み合わせて、単離抗体中に作製する。例えば、一部またはすべての生殖系列の突然変異候補をコードする配列を含む核酸ライブラリを作製する。次いで、突然変異を起こした抗体を評価し、例えば、単離抗体に対して１つまたは複数のさらなる生殖系列残基を有し、未だ有用である（例えば、機能活性を有する）抗体を特定する。一実施形態において、可能な限り多くの生殖系列残基を単離抗体に導入する。
【０１１０】
一実施形態において、突然変異誘発を使用し、１つまたは複数の生殖系列残基を、フレームワークおよび／または定常領域に置換または挿入する。例えば、生殖系列のフレームワークおよび／または定常領域残基は、改変された非可変領域と類似（例えば、最も類似）の生殖系列配列に由来することができる。突然変異誘発後、生殖系列残基または残基が許容される（すなわち、活性を無効にしない）場合、抗体の活性（例えば、結合活性または他の機能活性）を評価し、決定できる。類似の突然変異誘発は、フレームワーク領域において実施できる。
【０１１１】
生殖系列配列の選択は、さまざまな方法で実施できる。例えば、選択性または類似性に関する所定の基準、例えば、少なくとも特定のパーセントの同一性、例えば、少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または９９．５％の同一性を満たす場合、生殖系列配列は選択され得る。この選択は、少なくとも２、３、５または１０種の生殖系列配列を使用して実施できる。ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の場合、類似の生殖系列配列の特定は、１つのこのような配列の選択を含むことができる。ＣＤＲ３の場合、類似の生殖系列配列の特定は、１つのこのような配列の選択を含むことができるが、アミノ末端部分およびカルボキシ末端部分に別々に寄与する２つの生殖系列配列の使用を含んでもよい。他の実践形態において、１つを超えるまたは２つの生殖系列配列を使用し、例えば、コンセンサス配列を形成する。
【０１１２】
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および軽鎖多様性
ＨＣ ＣＤＲ３のライブラリは、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２および軽鎖における多様性のバックグラウンドに構築されると理解するべきである。軽鎖の多様性は、ＨＣの多様性として同じＤＮＡ分子中にコードされ得、またはＬＣおよびＨＣの多様性は、別々のＤＮＡ分子にコードされ得る。表２２において、シグナル配列の融合は、：：ＶＨ：：ＣＨ１：：Ｈｉｓ６：：Ｍｙｃ：：ＩＩＩｓｔｕｍｐである。ＣＤＲ１は残基３１〜３５を含み、残基３１、３３および３５に多様性がある。一実施形態において、残基３１、３３および３５は、システインを除く任意のアミノ酸型であってよい。ＣＤＲ２は、残基５０から６５を含む。５０、５２、５２ａ、５６および５８の位置に多様性がある。一実施形態において、残基５０および５２は、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｔｙｒの任意の型であってよく、残基５２ａはＰｒｏまたはＳｅｒであってよく、残基５６および５８は、Ｃｙｓを除く任意のアミノ酸型であってよい。ＨＣ ＣＤＲ３の多様性は、少なくとも１．Ｅ４、１．Ｅ５、１．Ｅ６、１．Ｅ７、５．Ｅ７または１．Ｅ８であるＨＣ ＣＤＲ１および２の多様性にクローン化される。
【０１１３】
一実施形態において、残基３１、３３、３５、５０、５２、５６および５８は、ＣｙｓまたはＭｅｔを除く任意のアミノ酸型であってよく、残基５２ａは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＰｒｏまたはＴｙｒであってよい。ＨＣ ＣＤＲ３の多様性は、少なくとも１．Ｅ４、１．Ｅ５、１．Ｅ６、１．Ｅ７、５．Ｅ７または１．Ｅ８であるＨＣ ＣＤＲ１および２の多様性にクローン化される。
【０１１４】
一実施形態において、ＨＣの多様性は、軽鎖の多様性を含有するベクター（ファージまたはファージミド）にクローン化される。この多様性は、少なくとも２５、５０、１００、５００、１．Ｅ３、１．Ｅ４、１．Ｅ５、１．Ｅ６、または１．Ｅ７である。ＨＣ ＣＤＲ３の多様性は、少なくとも２２１、２７２、５００、１０００、１．Ｅ４、１．Ｅ５、１．Ｅ６、１．Ｅ７、１．Ｅ８または１．Ｅ９である。
【０１１５】
一実施形態において、ＨＣの多様性は、ファージタンパク質、例えばＩＩＩ、ＶＩＩＩ、ＶＩＩ、ＶＩもしくはＩＸまたは提示を起こすために十分なこれらの１つの断片上にＨＣを提示するファージベクターにクローン化され、軽鎖は、個々の細胞が軽鎖を分泌する細胞コレクションに感染することによってＨＣに組み込まれる。細胞中の軽鎖の多様性は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５または１００である。ＨＣ ＣＤＲ３の多様性は、少なくとも２２１、２７２、５００、１０００、１．Ｅ４、１．Ｅ５、１．Ｅ６、１．Ｅ７、１．Ｅ８または１．Ｅ９である。
【０１１６】
表３０は、Ｐｌａｃプロモーターの調節下で重鎖に関するディスプレイカセットである、ｂｌａ遺伝子を担持するファージベクターＤＹ３ＦＨＣ８７（配列番号：８９４）の配列を示す。ＤＹ３ＦＨＣ８７は、同様にＭ１３の全遺伝子を含有する。ベクター、例えばｐＬＣＳＫ２３（表４０の配列）（配列番号：８９６）における軽鎖の多様性を持つＦ＋Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を感染させる。ベクターｐＬＣＳＫ２３はＫａｎＲ遺伝子を担持する。Ｐｌａｃプロモーターの調節下で、シグナル配列を有する、塩基２２１５で始まる遺伝子（塩基２２１５〜２２７７）、ＶＬ（この配列において、ＶＬは塩基２２７８から塩基２５９８の（配列番号：８９７）に示される配列をコードする）、塩基２５９９から２９２２のＣκ、２９２３から２９３１のＮｏｔＩ部位を許容するリンカーおよびＶ５タグ（塩基２９３２〜２９７３）がある。２２５９〜２２７１にＳｆｉＩ部位および２６０２〜２６０５にＫｐｎＩ部位があり、Ｖκの置き換えを容易にさせる。（配列番号：８９７）は、分泌されるタンパク質の例である。ＣκおよびＶ５タグは一定であることを理解すべきである。表１９に示されるすべてのタンパク質（ＶＫ１Ｏ２ｇｌ−ＪＫ３、ＶＫ１Ｏ２ｖａｒ１、ＶＫ１Ｏ２ｖａｒ２、ＶＫ１Ｏ２ｖａｒ３、ＶＫ１Ｏ２ｖａｒ４、ＶＫ１Ｏ２ｖａｒ５、ＶＫ３Ｌ６ｇｌ−ＪＫ４、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ１、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ２、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ３、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ４、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ５、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ６、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ７、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ８、ＶＫ３Ａ２７ｇｌ−ＪＫ３、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ１、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ２、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ３、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ４、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ５、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ６、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ７、ＶＫ３Ｌ２ｇｌ−ＪＫ３、およびＶＫ１ｇｌＬ８−ＪＫ５）は、カルボキシ末端に結合したこれらの配列を有するであろう。
【０１１７】
軽鎖の多様性
表８００は、３−２３と十分に対合することが公知であり、５つのＣＤＲの突然変異を有し、３−２３に基づく１つのＨＣを有するκＬＣ（軽鎖）を示し、ＬＣ Ｋ１（Ｏ１２）：：ＪＫ１は、タンパク質標的に対して高親和性のＡｂを作製する。Ｏ１２は、頻繁に使用されるＶＫＩである。個々のＣＤＲを変化した集団と置き換えることができるように、この遺伝子は、シグナル配列の（ＡｐａＬＩ）、ＦＲ１（ＸｈｏＩ、ＳｇｆＩ）、ＦＲ２（ＫｐｎＩ）、ＦＲ３（ＸｂａＩ）およびＦｒ４：：Ｃκ（ＢｓｉＷＩ）において、有用で、異なる制限部位を有するように設計されている。
【０１１８】
ヒトＬＣにおいて、ＣＤＲ３は最も重要であり、ＣＤＲ１が次に重要である。ＣＤＲ２は、ほとんどＡｇと接触しない。多様性を、表９００および表１０００（ＣＤＲ１）、表１１００および表１２００（ＣＤＲ２）、表１３００、１４００および１５００（ＣＤＲ３）に示すようにＣＤＲに導入する。重鎖の経済的選択（ＥＳＨＣ）のために、少数の、例えば表１２００のようにＣＤＲ３に多様性を有する５０のＬＣを、ペリプラズムへの分泌のためにｐＬＣＳＫ２４における発現に関して選別した。個々の細胞系が、例えば５０またはそれより少ないＬＣを含有するように、いくつかの細胞系を維持する場合、より多くのＬＣを使用できる。
【０１１９】
表９００は、ＬＣ ＣＤＲ１に関する多様性を示す。このライブラリは、「許容」として示されるＡＡ型の追加の多様性を有する、Ｏ１２残基を含有することができ、表９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００において、「許容」は「さらなる許容型」と解釈する。Ｏ１２は、Ｒ２４ＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ３４を有する。他のＶＫ１遺伝子座は、２４にＱを有する。他の遺伝子座は、２５にＭを有する。Ｓ２６およびＱ２７は、ＶＫＩにおいて不変である。他のＶＫＩ遺伝子座は、２８にＤまたはＧを有する。Ｉ２９およびＬ３３は、ＶＫＩにおいて不変であり、側基は内側を向いている。他のＶＫＩ遺伝子座は、３０、３１、３２、および３４において、表９００に示す多様性を許容する。表９００において、１１の位置のうち７つだけが変化し、総多様性は５７６である。
【０１２０】
表１０００は、ＬＣ ＣＤＲ１に関する高レベルの多様性を示す。ここでは１１の位置のうち８位が変化している。一定であるものは組み込み部位から離れているか、または埋もれた側基を有する。
【０１２１】
表１１００は、ＣＤＲ２に関する低レベルの多彩性を示す。ＣＤＲ２は、抗原結合部位から離れており、ここでは多様性はあまり有用ではないと思われる。実際に、ＧＬの多様性は非常に限定される。表１１００は、ＧＬの多様性を含む。表１２００は、高レベルの多様性を含有し、１９２０の配列を許容する。
【０１２２】
表１３００は、ＬＣ ＣＤＲ３に関する低レベルの多様性、２１６０の配列を示す。表１４００は、１０５，８４０配列を許容する高レベルを示す。
【０１２３】
ＲＯＬＩＣのために、表９００、１１００および１３００に示した多様性を有する、約３×１０７のＬＣを作製した。
【０１２４】
重鎖の多様性
Ａｂ ＨＣ（重鎖）は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３において多様性を有する。配列および長さ双方の多様性があるので、ＣＤＲ３における多様性は特に複雑である。配列多様性はランダムではない。Ａｂ遺伝子を作る細胞は、ＶセグメントとＤセグメントとＪＨセグメントを接合する。Ｄセグメントは任意選択であり、認識可能なＤを有する、天然のヒトＡｂの約半分である。０から多数の塩基が付加または除去される、Ｖ−Ｄ、Ｄ−ＪまたはＶ−Ｊの境界において広範囲に編集され得る。生殖系列Ｖ：：Ｄ：：ＪＨを有するＡｂは、生殖系列Ａｂと見なすことができる。
【０１２５】
ヒトＤセグメントを、表２１に示す。個々の生殖系列（ＧＬ）Ｄセグメントは、３つのフォワードリーディングフレームのいずれかにおいて、Ａｂ遺伝子中に出現する。いくつかのリーディングフレームにおいて、いくつかのＤセグメントは終止コドンをコードする。これらのＤセグメントは、改変された終止コドンをほとんど生じない。表６００は、個々のＤセグメントの頻度を、観察された全Ｄセグメントのパーセントとして示す。Ｄセグメントを含有する、本明細書の例の大部分は、非常に一般的なＤ（観察された全Ｄセグメントの２％より大きい）を使用する。
【０１２６】
一態様において、本発明は、３−２３（または別のＶＨ、例えば４−３４）と、ａ）（Ｓ、Ｙ、Ｄ、Ｒ、Ｎ）を含むセットから選別された多数のアミノ酸、ｂ）Ｄ領域、ｃ）ＪＨ領域およびｄ）ＪＨ領域のＦＲ４部分、の１つとの融合による、ＡｂＨＣ遺伝子の構成に関する。これらの融合は、ＧＬ３−２３あるいはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２に合成多様性を有する３−２３であってよい。ＨＣ ＣＤＲ３の長さは約３から約２４までの任意の数であってよい。好ましくは、ライブラリは、６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０の長さのＨＣ ＣＤＲ３を有するメンバーを含有するであろう。あるいは、長さは５、８、１１、１４、１７および２０または任意の他の組合せであってよい。
【０１２７】
表２１は、長さ６から２０の適切なＣＤＲ３の設計の多くの例を示す。２列に大文字で明記したコドンは、ｗｏｂｂｌｉｎｇを用いて合成される。３列は、ドーピングのレベルを示す。表１００は、さまざまな長さのＨＣ ＣＤＲ３を組み合わせ、ほぼすべてのタンパク質標的と結合するＡｂを含有することが期待されるライブラリの形成が可能である比率を示す。
【０１２８】
【表１】
長さ６に関して、表２１は４つの例を示す。例えば、６ａは、ｗｏｂｂｌｉｎｇされた最初の６つのＡＡを有するＪＨ１と直接接合されたＶＨ（３−２３）を有し、６ｂは、ＪＨ１のＦＲ４ ＡＡと接合された、第２のリーディングフレーム中のＤ４−１７と接合されたＴｙｒを有し、および６ｃは、ＪＨ１のＦＲ残基に接合されたＤ５−５（３）を有する。これらは異なる種類の多様性をもたらすので、すべてを含むことが好ましいが、これらの１つだけを含有するライブラリも有用なＡｂをもたらすはずである。
【０１２９】
長さ８に関して、表２１は３つの例を示す。８ａはＪＨ１のすべてに融合されたＹＹを有し、一方、８ｂは、ＪＨ１のＦＲ領域に融合されたＤ６−１３（１）に融合された１つのＹを有する。長さ１０、１２、１４、１６および２０もまた、表２１に示す。ＨＣ ＣＤＲ３の多様性は、生殖系列３−２３または合成多様性を含有する３−２３において構築できる。あるいは、異なるＶＨ、例えば４−３４を使用できる。
【０１３０】
ＲＯＬＩＣは、ＨＣの小型の集団が、Ｆ＋Ｅ．ｃｏｌｉにおいて可溶性タンパク質として発現される方法である。この集団を、ＬＣ：：ＩＩＩｓｔｕｍｐの融合を担持するファージに感染させる。作製されたファージは、それらを作製する細胞のペリプラズムに由来するＨＣを得る。これらのファージは固定された標的に結合でき、バインダーは、非バインダーから分離される。回収されたファージが増殖した場合、ファージはＬＣおよびＨＣの間の関連性を継続するためにもたらされるので回収されたファージは同じ型の細胞を探すはずであり、したがって集団のサイズは重要である。したがって、個々の細胞系におけるＨＣの数は小さいことが望ましい。したがって、個々の細胞系において、最大１０、２０、３０，または４０の異なるＨＣを有する、多数の細胞系を維持することが望ましいと思われる。したがって、１、２、４、６、８、１０、２４、４８または９６の細胞系を有することができ、同じ数の平行したファージの産生、選択および増幅を実施する。１または２ラウンド後、ＥＬＩＳＡアッセイにより、標的に結合したファージの産生に関してコロニーを試験する。個々のＥＬＩＳＡ＋コロニーは、有用なＬＣおよび有用なＨＣを含有するが、それらはＤＮＡの同じ破片ではない。にもかかわらず、本発明者らは、個々のＬＣおよび個々のＨＣの始まりおよび末端を知っており、したがって、コロニーにＰＣＲを使用し、ディスプレイファージもしくはファージミドまたはＦａｂ産生プラスミドに送り込むことができるＦａｂディスプレイまたはＦａｂ分泌カセットを作製できる。
【０１３１】
ＨＣの効率的選択（ＥＳＨＣ）において、ＲＯＬＩＣにおけるＬＣおよびＨＣの役割を逆転させ、それらがＦ＋Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズム中に可溶性タンパク質として作製されるように、プラスミド中にＬＣを有する。ＬＣ遺伝子を全く有さないファージベクターにおいてＨＣの多様性を作製する。ＬＣ作製Ｆ＋Ｅ．ｃｏｌｉを、ＨＣ担持ファージに感染させる。ＨＣ遺伝子ならびにＨＣおよびＬＣタンパク質の双方を担持するファージを得る。これらのファージを標的への結合のために選択する。多くのＡｂにおいて、ＬＣは許容状態であり、結合親和性に対してあまり寄与していない。最も優れたＬＣの選別は、親和性を非常に増加できるが、ＬＣの非常に限定されたレパートリーを有するＦａｂの選択が通常可能である。したがって、ＬＣ作製Ｆ＋Ｅ．ｃｏｌｉ中のフレームワーク領域にＬＣ、好ましい生殖系列の小さいセットを配置する。例えば、ＬＣ細胞系に２５のＬＣが存在する場合、作製する必要のある形質転換細胞の数を２５倍減少させる。
【０１３２】
記載したライブラリは、さまざまな長さのＨＣ ＣＤＲ３を有する。適切な折り畳みを指示するために、ＨＣ ＣＤＲ３は、ＪＨセグメントの大部分、すべて、もしくはフレームワーク部分と接合されるＤセグメントを有するか、または有さない。この配列は、ｗｏｂｂｌｉｎｇしたＤＮＡ合成を使用して多様化される。このことは、任意の位置の任意のアミノ酸型を理論上許容するが、実践において、実際の配列は、親配列および遺伝子コード表において近いＡＡ型に対して強くバイアスがかかっている。
【０１３３】
ＥＳＨＣを使用することによって、合成ＨＣ ＣＤＲ３の多様性の新規な設計をサンプリングすることができる。所与の実施例において、例えば５０ＬＣのプールを使用する。５×１０８のＨＣのライブラリは、２．５×１０１０の旧式のライブラリと同様に機能し、必要な労力は非常に少ないはずである。
【０１３４】
配列をｗｏｂｂｌｉｎｇする場合、最初のコドンの選別は、ライブラリ中に見られるＡＡの実際の混合物に影響を与える。表３００は、アミノ酸置換が、個々の開始親コドンから１、２または３つの塩基変化を要求することを示す。例えば、本発明者らが、Ａｌａのためにｇｃｔまたはｇｃｃで開始した場合、３種すべての終止コドンは３つの塩基変化を要求し、それはまれである。７６：８：８：８混合物を使用する場合、Ａｌａは、事例の５７％（０．７６×０．７６）で出現するであろう。Ｖ、Ｇ、Ｔ、Ｐ、Ｓは、個々に約６％で出現し、Ｄは約３％で出現する。Ｅ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｎ、ＣおよびＲは、約１０倍下がるであろう。Ｍ、Ｗ、Ｑ、Ｋ、Ａｍ、ＯｃおよびＯｐは、さらによりまれであろう。本発明者らがｇｃａで開始した場合、その後一塩基変化だけを必要としてＥはＤに置き換えられるが、オパールおよびオーカーの終止は二塩基変化だけを要求し、このことは望ましくない。好ましいコドンに、星印（＊）で印をつけてある。セリンの選択は、高い頻度でＹをＳに置換するという本発明者らの要望を困難にする。このことは、たった２つの塩基が親と異なる群にＯｐおよびＯｃをもたらす。この問題は、ＨＣ ＣＤＲ３レパートリーを、抗生物質耐性遺伝子、例えばＫａｎＲまたはＡｍｐＲの前にクローン化し、耐性を選択すること、したがって終止コドンを含有するメンバーを除去することによって克服することができる。さらに、このライブラリは、終止の代わりにＱを挿入するｓｕｐＥ Ｅ．ｃｏｌｉにおいて作製できる。
【０１３５】
【表２】
【０１３６】
【表３】
【０１３７】
【表４】
ライブラリの使用方法
オフレート選択（Ｏｆｆ−Ｒａｔｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）。解離速度が遅いことは、特にポリペプチドとそれらの標的との間の相互作用に対して高親和性の予測であり得るので、本明細書に記載の方法は、標的に対する結合相互作用に関する、所望の（すなわち低下した）動力学的解離速度を有するリガンドの単離に使用できる。
【０１３８】
ディスプレイライブラリ由来の、ゆっくり解離する抗体を選択するために、ライブラリを、固定された標的に接触させる。固定された標的を、次いで非特異的に結合された抗体または弱く結合された抗体を取り除く第１の溶液を用いて洗浄する。次いで、結合された抗体を、飽和量の遊離の標的を含む第２の溶液を用いて溶出する、すなわち、粒子に結合していない標的の再現。遊離の標的は、標的から解離する抗体に結合する。溶出された抗体の再結合は、かなり低い濃度の固定された標的に対して、飽和量の遊離の標的により有効に阻止される。
【０１３９】
第２の溶液は、実質的に生理学的な溶液条件、またはストリンジェントである溶液条件（例えば、低ｐＨ、高ｐＨまたは高塩濃度）を有することができる。通常、第２の溶液の溶液条件は、第１の溶液条件と同一である。第２の溶液の分画を時間的順序で収集し、早期から後期の分画に識別する。後期分画は、早期分画中の生体分子より、遅い速度で標的から解離する抗体を含む。さらに、延長してインキュベートした後もまだ標的に結合されたままの抗体を回収することも可能である。これらは、カオトロピック条件を使用して解離する、または標的に結合したまま増幅することのどちらかが可能である。例えば、標的に結合したファージを、細菌細胞に接触させることができる。
【０１４０】
特異性に関する選択またはスクリーニング。本明細書に記載のディスプレイライブラリのスクリーニング方法は、非標的分子に結合する抗体を廃棄する、選択またはスクリーニング方法を含むことができる。非標的分子の例は、例えば、標的分子と構造的に異なる炭水化物分子、例えば、標的分子と異なる生物学的特性を有する炭水化物分子を含む。硫酸化炭水化物の場合は、非標的は、硫酸塩を有さない、または異なる位置に硫酸塩を有する同じ炭水化物であり得る。リン酸化ペプチドの場合は、非標的は、リン酸塩を有さない同じペプチド、または異なるリン酸化ペプチドであり得る。
【０１４１】
一実践形態において、所謂「陰性選択」ステップを使用し、標的と、関連する非標的分子および関連するが異なる非標的分子とを区別する。ディスプレイライブラリまたはそれらのプールを、非標的分子に接触させる。非標的分子に結合しないメンバーを収集し、続く、標的分子に対する結合に関する選択または続く陰性選択にも使用する。陰性選択ステップは、標的分子に結合するライブラリメンバーを選択する前または後であってよい。
【０１４２】
別の実践形態において、スクリーニングステップを使用する。ディスプレイライブラリメンバーを標的分子に対する結合に関して単離した後で、個々の単離ライブラリメンバーを、非標的分子（例えば、上記の非標的）に結合するその能力に関して試験する。例えば、ハイスループットＥＬＩＳＡスクリーニングを使用してこのデータを得ることができる。ＥＬＩＳＡスクリーニングを使用して、標的に対する個々のライブラリメンバーの結合に関する定量的データを得ることもできる。非標的および標的の結合データを（例えば、コンピュータおよびソフトウェアを使用して）比較し、標的に特異的に結合するライブラリメンバーを特定する。
【０１４３】
特定の実施形態において、本発明のＣＤＲ３を含む抗体は、炭水化物に結合できる。炭水化物の結合に関して抗体を評価する方法は、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、免疫ブロッティングおよび蛍光活性化細胞分類を含む。これらの方法を使用して、閾値を超える、例えば、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭおよび１０ｐＭを超えるＫＤを有する抗体を特定できる。
【０１４４】
ＥＬＩＳＡ。ディスプレイライブラリによりコードされるタンパク質は、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して結合特性に関してスクリーニングすることもできる。例えば、個々のタンパク質を、底表面を標的、例えば限定量の標的でコーティングしてあるマイクロタイタープレートに接触させる。プレートを緩衝液で洗浄し、非特異的に結合されたポリペプチドを取り除く。次いで、プレートに結合されたタンパク質の量を、プレートをポリペプチド、例えば、ポリペプチドのタグまたは一定部分を認識できる抗体を用いてプローブすることによって決定する。抗体を酵素、例えばアルカリフォスファターゼに連結すると、適切な基質が提供された場合、熱量が発生する。タンパク質は、細胞から精製でき、または例えば繊維状バクテリオファージコートとの融合として、ディスプレイライブラリのフォーマットにおいて分析できる。あるいは、標的分子、例えば炭水化物部分を含有する標的を発現する細胞（生細胞または固定細胞）を、マイクロタイタープレートに播種し、ディスプレイライブラリに存在する、またはディスプレイライブラリからの選択により得られるペプチド／抗体の親和性を試験するために使用できる。
【０１４５】
ＥＬＩＳＡアッセイの別の型において、多様性ストランドライブラリの個々のポリペプチドを使用して、マイクロタイタープレートの異なるウェルをコートできる。その後、一定の標的分子を使用してＥＬＩＳＡを進行し、個々のウェルを照会する。
【０１４６】
細胞結合アッセイ。抗体を、１つまたは複数の細胞型、例えば造血細胞と相互作用するそれらの能力に関して評価することができる。蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）は、タンパク質と細胞との相互作用を試験するための、例示的な方法の１つである。抗体を、細胞に結合する前または後に、蛍光色素分子を用いて直接または間接的に標識し、その後細胞を、ＦＡＣＳ分類装置において数える。
【０１４７】
他の細胞型は、当分野において公知の方法によりＦＡＣＳ用に調製できる。
【０１４８】
均一結合アッセイ。候補ポリペプチドと標的との結合相互作用を、均一アッセイを使用して分析できる、すなわち、例えばアッセイの全成分を加えた後に追加の液体操作を必要としない。例えば蛍光共鳴エネルギー転位（ＦＲＥＴ）を、均一アッセイとして使用できる（例えば， Ｌａｋｏｗｉｃｚら、米国特許第５，６３１，１６９号；Ｓｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓら、米国特許第４，８６８，１０３号を参照されたい）。第１の分子の蛍光色素分子標識（例えば、分画中の特定された分子）は、第２の分子が第１の分子に近接している場合、その放出蛍光エネルギーが第２の分子（例えば標的）上の蛍光標識により吸収され得るように選択される。第２の分子上の蛍光標識は、それが転移エネルギーを吸収する場合、蛍光を発する。標識間のエネルギー転位の効率は、分子を分離する距離に関係するので、分子間の空間的関係が評価され得る。分子間において結合が起こる状況において、アッセイにおいて「受容体」分子の標識の蛍光発光は、最大であるはずである。ＦＲＥＴによるモニター用に構成される結合事象は、当分野において周知の標準的蛍光検出手段（例えば、蛍光光度計を使用して）を介して簡便に測定できる。第１または第２の結合分子の量を滴定することによって、結合曲線を作製し、平衡結合定数を推定することができる。
【０１４９】
均一アッセイの別の例は、アルファスクリーン（Ａｌｐｈａ Ｓｃｒｅｅｎ）（Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｍｅｒｉｄｅｎ Ｃｏｎｎ．）である。アルファスクリーンは、２種の標識されたビーズを使用する。一方のビーズは、レーザーで励起された場合、一重項酸素を発生する。他方のビーズは、第１のビーズから一重項酸素が拡散された場合、光のシグナルを発生し、一重項酸素と衝突する。シグナルは、２種のビーズが近接する場合にだけ発生する。一方のビーズは、ディスプレイライブラリのメンバーに結合させることができ、他方のビーズを標的に結合させることができる。シグナルを測定し、結合の程度を決定する。
【０１５０】
均一アッセイは、候補ポリペプチドを、ディスプレイライブラリのビヒクル、例えばバクテリオファージに結合させたまま実施できる。
【０１５１】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）。ディスプレイライブラリから単離された分子と標的との結合相互作用は、ＳＰＲを使用して分析できる。ＳＰＲまたは生体分子相互作用分析（Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＢＩＡ）は、反応体のいずれも標識せずに、生体特異性相互作用をリアルタイムで検出する。ＢＩＡチップの結合表面の質量の変化（結合事象の表示）は、表面近くの光の屈折率の変更（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学現象）をもたらす。屈折度の変化は検出可能なシグナルを発生し、これを生体分子間のリアルタイム反応の指標として測定する。ＳＰＲを使用するための方法は、例えば、米国特許第５，６４１，６４０号；Ｒａｅｔｈｅｒ （１９８８年）Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎｓ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ； Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ および Ｕｒｂａｎｉｃｚｋｙ（１９９１年） Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ６３巻：２３３８〜２３４５頁；Ｓｚａｂｏら、（１９９５年）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ５巻：６９９〜７０５頁ならびにＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＢ （Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）により提供されるオンライン供給源に記載されている。
【０１５２】
ＳＰＲからの情報を使用し、生体分子と標的との結合に関する平衡解離定数（ＫＤ）ならびにｋｏｎおよびｋｏｆｆを含む動力学的パラメーターの正確かつ定量的測定を提供できる。このようなデータを使用し、さまざまな生体分子を比較できる。例えば、多様性ストランドのライブラリから選択された核酸によりコードされるタンパク質を比較し、標的に関する高い親和性を有する、または遅いｋｏｆｆを有する個体を特定できる。さらに、この情報を使用し、構造活性相関（ＳＡＲ）を明らかにすることも可能である。例えば、親タンパク質の成熟型の動力学的パラメーターおよび平衡結合パラメーターを、親タンパク質のパラメーターと比較することもできる。所与の位置の変異体アミノ酸が、特定の結合パラメーター、例えば、高親和性および遅いｋｏｆｆと相関することを特定できる。この情報は、（例えば、ホモロジーモデリング、エネルギー最小化または結晶学もしくはＮＭＲによる構造決定を使用する）構造モデリングと組み合わせることができる。結果として、タンパク質とその標的との物理的相互作用の理解を系統立てて説明でき、他の設計方法を導くために使用できる。
【０１５３】
タンパク質アレイ。ディスプレイライブラリから特定されたタンパク質は、固体支持体、例えば、ビーズまたはアレイに固定できる。タンパク質アレイでは、個々のポリペプチドを、支持体の唯一のアドレスに固定する。通常、アドレスは、２次元のアドレスである。ポリペプチドアレイを作製する方法は、例えば、Ｄｅ Ｗｉｌｄｔら、（２０００年）Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １８巻：９８９〜９９４頁；Ｌｕｅｋｉｎｇら、（１９９９年） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２７０巻：１０３〜１１１頁； Ｇｅ（２０００年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８巻、ｅ３、Ｉ〜ＶＩＩ；ＭａｃＢｅａｔｈ および Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ （２０００年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９巻：１７６０〜１７６３頁；ＷＯ０１／４０８０３ならびにＷＯ９９／５１７７３Ａ１に記載されている。アレイのためのポリペプチドは、例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃ ＭｉｃｒｏＳｙｓｔｅｍｓ またはＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓによる市販のロボット装置を使用して高速でスポットできる。アレイの基板は、例えばニトロセルロース、プラスチック、ガラス、例えば表面改質ガラスであってよい。アレイは、多孔質のマトリックス、例えばアクリルアミド、アガロースまたは別のポリマーを含むこともできる。
【０１５４】
キット
本発明の任意の態様に従った方法の実践に使用するキットをさらに提供する。このキットは、必要なベクターを含むことができる。このようなベクターの１つは、通常一本鎖バクテリオファージの複製起点を有し、ｓｂｐメンバーの核酸を含有するか、またはファージカプシドタンパク質の成熟コード配列５’末端領域に、その挿入のための制限部位を有するかのどちらかであり、カプシドタンパク質外来性ポリペプチドと細胞膜周辺腔との融合を対象とする、前記部位の上流の分泌リーダーコード配列を有する。
【０１５５】
上記のＨＣ ＣＤＲ３をコードするパッケージならびに上記の方法のいずれかの使用により得ることができる、ＨＣ ＣＤＲ３およびそれらの断片および誘導体を含むポリペプチドを、さらに提供する。この誘導体は、別の分子、例えば酵素またはＦｃ尾部に融合したポリペプチドを含んでいてもよい。
【０１５６】
このキットは、遊離の形態のコードされたポリペプチドの発現のために、ＨＣ ＣＤＲ３の挿入用部位を有するファージベクター（例えば、ＤＹ３Ｆ８７ＨＣ）を含むことができる。このキットは、可溶性軽鎖、例えばｐＬＣＳＫ２３の発現用プラスミドベクターもまた含むことができる。このキットは、適切な細胞系（例えばＴＧ１）もまた含むことができる。ｐＬＣＳＫ２３によりコードされる軽鎖の多様性は、１０、１５、２０、２５、３０または５０であってよい。多様性においてＬＣは、フレームワーク領域中の生殖系列であること、およびＣＤＲ３および／またはＣＤＲ１に多様性を有することなど特定の望ましい特性を有するように構築または選別され得る。生殖系列は、高度に利用される生殖系列、例えば、κにはＶＫ１＿２−Ｏ２、ＶＫ３＿Ｉ−Ａ２７、ＶＫ３＿５−Ｌ６、ＶＫ３＿３−Ｌ２およびλにはＶＬ２＿２ａ２、ＶＬ１＿１ｃ、ＶＬ１＿１ｇ、ＶＬ３＿３ｒであってよい。
【０１５７】
例えば、生殖系列は、
ＶＫ１Ｏ２ｇｌ−ＪＫ３、ＶＫ１Ｏ２ｖａｒ１、ＶＫ１Ｏ２ｖａｒ２、ＶＫ１Ｏ２ｖａｒ３、ＶＫ１Ｏ２ｖａｒ４、ＶＫ１Ｏ２ｖａｒ５、ＶＫ３Ｌ６ｇｌ−ＪＫ４、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ１、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ２、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ３、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ４、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ５、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ６、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ７、ＶＫ３Ｌ６ｖａｒ８、ＶＫ３Ａ２７ｇｌ−ＪＫ３、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ１、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ２、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ３、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ４、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ５、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ６、ＶＫ３Ａ２７ｖａｒ７、ＶＫ３Ｌ２ｇｌ−ＪＫ３、ＶＫ１ｇｌＬ８−ＪＫ５およびＶＫ１ＧＬＯ１２−ＪＫ３（表１９に示すアミノ酸配列）に関する遺伝子をｐＬＣＳＫ２３にクローン化できる。
【０１５８】
【表５】
【０１５９】
【表６】
【０１６０】
【表７】
このキットは、本方法の実施に必要な補助成分を含むことができ、このような成分の特質は、当然ながら用いる具体的な方法に依存する。有用な補助成分は、ヘルパーファージ、ＰＣＲプライマー、緩衝液および／またはさまざまな種類の酵素を含むことができる。緩衝液および酵素は、本明細書に記載の戦略に従った、再構成された、または再構成されない免疫グロブリン遺伝子に由来する、Ｆｖ、ｓｃＦｖまたはＦａｂ断片をコードするヌクレオチド配列の調製を可能にするために、通常使用される。
【０１６１】
多様性を導入する方法
可変であるＤＮＡを作製する多くの方法がある。１つの方法は、混合ヌクレオチド合成（ＭＮＳ）の使用である。ＭＮＳの１つの型は、表５に示すようなヌクレオチドの等モル混合物を使用する。例えば、ＮＮＫコドンの使用により、２０種すべてのアミノ酸および１種のＴＡＧ終止コドンがもたらされる。分布は、３（Ｒ／Ｓ／Ｌ）：２（Ａ／Ｇ／Ｖ／Ｔ／Ｐ）：１（Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｗ／Ｙ）（例えば、Ａｒｇ、ＳｅｒおよびＬｅｕ各々３など）である。本明細書において「ｗｏｂｂｌｉｎｇ」と呼ばれる代替方法は混合ヌクレオチドを使用するが、等モル量ではない。例えば、親コドンがＴＴＣ（Ｐｈｅをコードする）であった場合、本発明者らは、Ｔの場所に（０．０８２ Ｔ、０．０６ Ｃ、０．０６ Ａおよび０．０６ Ｇ）の混合物およびＣの場所に（０．０８２ Ｃ、０．０６ Ｔ、０．０６ Ａおよび０．０６ Ｇ）の混合物を使用することができた。これにより、５９％の確率でＴＴＣまたはＴＴＴ（Ｐｈｅをコードする）、１３％のＬｅｕ、約５％のＳ／Ｖ／Ｉ／Ｃ／Ｙおよびさらに低い頻度で他のアミノ酸型がもたらされるであろう。
【０１６２】
Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｒｕｌｌｅら、（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ４５巻：３４０〜３頁（２００８年））は、ＩＩ型制限酵素を使用して、所謂「ｓｐｌｉｎｋｅｒ」に固定されているヘアピンオリゴヌクレオチド（ＰＨＯＮ）からトリヌクレオチドに変換する、可変ＤＮＡの合成方法を記載している。さらに、欧州特許ＥＰ第１１８１３９５号、ＥＰ第１４１１１２２号、ＥＰ第１３１４７８３号および欧州特許出願ＥＰ第０１１２７８６４．５号、ＥＰ第０４００１４６２．３号、ＥＰ第０８００６４７２．８号を参照されたい。固定されたＰＨＯＮおよびｓｐｌｉｎｋｅｒの混合物を使用することによって、所望のアミノ酸型が設計者の決定した比率を許容するライブラリを構築できる。したがって、１つのアミノ酸型が例えば８２％の確率で存在し、１８の他のアミノ酸型（Ｃｙｓを除く、すべての非親アミノ酸型）は、それぞれ２％で存在することを対象とできる。本明細書において、本発明者らは、このような合成を「ｄｏｂｂｌｉｎｇ」（ｄｉｇｉｔａｌ ｗｏｂｂｌｉｎｇ）と称することにする。一部の態様において、ｄｏｂｂｌｉｎｇがｗｏｂｂｌｉｎｇより好ましいが、部分的には、遺伝子コード表の構造はｗｏｂｂｌｉｎｇを起こし、大部分が保存的置換を起こすので、ｗｏｂｂｌｉｎｇは、有用な実施形態を提供する。ｄｏｂｂｌｉｎｇは、望まれないアミノ酸型を排除する可能性を提供する。ＣＤＲにおいて、不対システインは、治療用として承認されたＡｂにおいてさえ公知であるが、一部の実施形態では、それらを避けようとする。一部の実施形態において、ジスルフィドに近いループは重要な構造要素であり、不対システインは望ましくないため、システインの対を含有するＤ領域を多様化する場合、システインは変化させられない。
【０１６３】
加えて、親アミノ酸配列をコードするＤＮＡ分子を合成でき、フレームワーク領域において突然変異を避けるように、フレームワーク領域を含むプライマーを使用して、ＤＮＡをエラープローンＰＣＲに供することができる。
【０１６４】
【表８】
【実施例】
【０１６５】
本発明を、以下の実施例によりさらに例示するが、以下の実施例は決して限定として解釈されるべきではない。本出願を通して引用されたすべての参考文献、係属中の特許出願および公開された特許の内容は、参照により明確に本明細書に組み込まれる。
【０１６６】
（机上の実施例１）
非常に短いＨＣ ＣＤＲ３を有するライブラリ
非常に短いＨＣ ＣＤＲ３が当分野において記載されている。Ｋａｄｉｒｖｅｌｒａｊら、（２００６年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０３巻：８１４９〜５４頁はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ Ｂ ＩＩＩ型Ａｇ（ＧＢＳ−Ａｇ）に結合するが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの夾膜Ａｇには結合しない抗体中の４個のアミノ酸のＨＣ ＣＤＲ３配列を記載している。ＧＢＳ−Ａｇは、定期的にシアル化される。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの夾膜Ａｇ（ＳＰＣ−Ａｇ）は非常に似ているが、シアル酸基を欠いている。このような短いＨＣ ＣＤＲ３は、その中に炭水化物が結合できる広い溝を創製し、このようなＡｂは、既存の抗体ライブラリにおいて、非常にとてもまれである。したがって、現行ライブラリは、炭水化物に対する多種多様な潜在的バインダーをもたらさない。
【０１６７】
Ａｂ １Ｂ１は、ＧＢＳ−Ａｇに結合するネズミｍＡｂである；Ａｂ １ＱＦＵは、公知の３Ｄ構造および最も近い配列を有するｍＡｂである；１ＮＳＮは、長さ４のＨＣ ＣＤＲ３を有する、公知の３Ｄ構造の抗体である。３−２３ＨＣ構造の検査により、Ｒ９４（ＦＲ３の終了）のＣαからＷ１０４（ＦＲ４の開始）のＣαまでの、約１０Åの距離が得られた。１Ｂ１（ＮＷＤＹ（配列番号：２９））のＣＤＲ３は、ＡＡは、小型の側基だけを有する必要はなく、またはグリシンの大部分である必要もないことを示す。３個のアミノ酸（ＡＡ）は、ＰＰＰは機能しないが１０Åを架橋できる。実際に、本発明者らは、３個のＡＡと同じくらい短いＣＤＲ３を有するいくつかのＦａｂを得ているが、非常にまれである。
【０１６８】
短いおよび非常に短いＨＣ ＣＤＲ３が記載されているが、短いＨＣ ＣＤＲ３（例えば、３から５個のアミノ酸のＨＣ ＣＤＲ３）を有する、多くの（例えば、メンバーの約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約９５％を超える）メンバーを有するＡｂライブラリの作製を提案した人はいない。有効なライブラリを構築するための１つの手法は、Ｖ−ＪまたはＶ−Ｄ−Ｊのカップリングから生じ得るアミノ酸配列を最初に設計することである。長さ３、４または５のＣＤＲ３のために、本発明者らは、表７に示すアミノ酸配列から出発する。例えば、配列Ｖ−３ＪＨ１は、３−２３のＦＲ３（ＴＡＶＹＹＣＡＫ（配列番号：３０））のＣ末端、続くＮ末端から、ＦＲ４を開始するＴｒｐ−Ｇｌｙのアミノ酸３個前までを切り取ったＪＨ１を示す。Ｖ−３ＪＨ２は、ＦＲ３の末端、続く切り取られたＪＨ２を示す。Ｖ−３ＪＨ６の後ろの配列は、ＦＲ４を、ヒトＤセグメントから採取した三量体、続くヒトＪＨセグメントのＦＲ４領域に接合することによって構築される。３Ｄ３−３．３．２は、セグメントＤ３−３由来の三量体、第２のアミノ酸から出発する第３のリーディングフレームである。５Ｄ５−１２．２．３は、アミノ酸３から出発するリーディングフレーム２中のＤ５−１２由来の五量体である。生殖系列Ｄセグメントのいくつかは終止コドンを含有し、終止コドンが編集され離れる場合、それにもかかわらず終止コドンは天然抗体中に出現する。ここで本発明者らはＴＡＡおよびＴＡＧコドンのＴｙｒ（Ｙ）への変化の可能性が最も高く、ＴＧＡ終止はＴｒｐ（Ｗ）に突然変異する可能性が最も高いと仮定する。表２０は、ヒトＤセグメントのアミノ酸配列を示し、終止コドンの型は、ＴＡＧに関しては＊、ＴＡＡに関しては＠、ＴＧＡに関しては＄の使用により示される。表１１にあるのは、ヒトＤセグメントから構築できる２６６の異なる三量体である。ＴＡＡおよびＴＡＧ終止は、「ｙ」（すなわち小文字）として示されたＴｙｒに変化している。これらは、単一の塩基変化により、さらにＳｅｒ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、またはＧｌｕに変化し得る。ＴＡＧは、単一の塩基変化により、ＴｒｐならびにＴｙｒ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、ＳｅｒおよびＬｅｕに変化し得る。表１２は、ヒトＤセグメントを切り取ることによって得ることができる、２６６の異なる四量体である。表１３は、ヒトＤセグメントを切り取ることから得ることができる、２１５の異なる五量体を示す。表１４は、ヒトＤセグメントを切り取ることにより得ることができる、１５５の異なる六量体を示す。構築されるライブラリは、ＨＣ ＣＤＲ１およびＨＣ ＣＤＲ２に実質的な多様性を有する。ＨＣ ＣＤＲ３の配列多様性は、短いが許容できる配列を有することほど重要ではない可能性がある。ＪＨセグメントまたはＤセグメントの断片（例えば、３個またはそれ以上のアミノ酸）の多様性は、ヒト免疫系により構築でき、免疫原性である可能性が低い配列を提供する。
【０１６９】
一実施形態において、Ｃｙｓを含有する三量体、四量体および五量体は除外する。
【０１７０】
一実施形態において、Ｃｙｓを含有する、または終止を含有するＤ断片に由来する三量体、四量体および五量体は除外する。
【０１７１】
表１１の三量体、表１２の四量体、表１３の五量体を使用して構築される短いライブラリは、実質的多様性をそれぞれ２６６、２６６および２１５有する。このことを、これらの長さをペプチドの数と比較すると、それぞれ８０００、１６００００および３２０００００である。
【０１７２】
Ｖ−３Ｄ１−１．１．１−ＪＨ１は、ＦＲ３の最終部分、続くＤ１−１（ＲＦ１）からの３個のアミノ酸、すなわちＧＴＴ（配列番号：２５７）を含有する。Ｖ−３Ｄ１−１．２−ＪＨ１は、Ｄ１−１（ＲＦ１）のアミノ酸２〜４個を親ＣＤＲ３として使用する。Ｖ−３Ｄ３−３．３．３−ＪＨ２は、ＦＲ３の末端、続くＤ３−３（ＲＦ３）のアミノ酸３〜５個を示す。本発明は、ＦＲ３：：（ヒトＤセグメントの３、４、５個の終止を含まないＡＡ）：：ヒトＪＨ由来のＦＲ４を含む、任意のアミノ酸配列を含む。不対Ｃｙｓ残基を含有するＤ領域の断片は、不対Ｃｙｓ残基を含まないＤ領域の断片ほど好ましくない。Ｖ−５ＪＨ３において、ＪＨ３は、ＦＲ４の開始を規定するＴｒｐ−Ｇｌｙに対するコドンの前に４個だけコドンを有するため、「ｙ」で示されるＴｙｒが存在する。Ｖ−５ＪＨ４は、同じ理由で「ｓ」で示されるＳｅｒを有する。ｗｏｂｂｌｉｎｇを使用する場合、純度の好ましいレベルは、０．７５と０．９０との間である。本発明は、配列Ｖ−３ＪＨ１からＶ−３ＪＨ６、Ｖ−４ＪＨ１からＶ−４ＪＨ６およびＶ−５ＪＨ１からＶ−５ＪＨ６およびそれらを含有するライブラリを含む。本発明は、ＣＤＲ領域がヒトＤ領域由来の３、４または５個のアミノ酸セグメントにより置き換えられた配列およびそれらを含有するライブラリもまた含む。本発明は、親配列がＣＤＲ３領域において突然変異を起こしているＤＮＡおよびそれらを含有するライブラリを、さらに含む。好ましい実施形態は、ＣＤＲ３当たり塩基変化の平均数が１，２または３である実施形態である。突然変異誘発の方法は、エラープローンＰＣＲ、ｗｏｂｂｌｉｎｇおよびｄｏｂｂｌｉｎｇである。
【０１７３】
【表９】
【０１７４】
【表１０】
あるいは、領域ＸｂａＩからＢｓｔＥＩＩまでに対応し、ＫまたはＲである残基９４、続いて３、４または５つのＮＮＫコドン、続いてＦＲ４のＷＧ．．．を有するＤＮＡの３つの断片を合成できる。許容される変形は、２０３＋２０４＋２０５＝３，３６８，０００である。増幅後、これらのＤＮＡ分子を（より短い配列が、相対的にオーバーサンプリングされるように）１：１０：１００の比率で混合し、ＨＣ ＣＤＲ１／２の多様性を有するκライブラリをコードするファージミド内にクローン化する。１×１０９のライブラリは、有意な多様性をもたらし、小型から中程度の突出を有する標的に結合する抗体の単離を可能にするであろう。例えば、さまざまな炭水化物、さほど秩序だっていないタンパク質のループ（例えば、ＧＰＣＲ）は、非常に短いＨＣ ＣＤＲ３を有することにより創造される抗体中の溝から利益を得ることができる。λライブラリもまた構築できる。ＡＡ配列の比率は１：２０：４００であり、この比率は、より短い配列をより高密度にサンプリングするためには重要である可能性がある。Ａｂ中に大きくて広い溝を得ることは、厳密に１つの３ＡＡ ＣＤＲ３を要求するが、４ＡＡ ＣＤＲ３ではおそらくもう少し自由な余地があり、５ＡＡでは、さらにもっと自由な余地がある。この実施例において、前方のＷＧモチーフからＦＲ４のＪＨ６型を使用する。
【０１７５】
本発明者らの現行のκライブラリから、例えば、ａ）フレームワーク領域中の生殖系列、ｂ）ＣＤＲにおいて適切な多様性を示す、およびｃ）十分作製され、３−２３と良く対合する型である、２５のκ軽鎖のコレクションを選択できる。これらのＬＣは、ＫａｎＲを担持するベクターおよびファージをパッケージングしないシグナルから、Ｅ．ｃｏｌｉ内に作製される。次いで、ＬＣを有さないファージベクター中に本発明者らのＨＣライブラリを構築した。ＨＣおよびＬＣは、ＬＣ作製細胞をＨＣファージに感染させることにより交雑される。選択されたＨＣファージは、ＥＬＩＳＡ＋ファージを作製する細胞のＬＣを組み合わせることができ、またはＨＣは、全ＬＣの多様性を有するｐＭＩＤ２１内にクローン化できる。あるいは、選択されたＨＣはｐＨＣＳＫ８５に移動でき、ＲＯＬＩＣに使用して本発明者らのコレクションの全ＬＣと組み合わせることができる。λＬＣもまた使用できた。したがって、ファージ中の１×１０９ＨＣのライブラリは、１．２×１０１１（１．×１０９×１１７）のＦａｂライブラリに拡大できる。１×１０７のＣＤＲ１〜２と１０６のＨＣ ＣＤＲ３とを組み合わせた場合、個々のＣＤＲ３が５０のＣＤＲ１〜２と結びついた、５×１０７のライブラリを作ることができる。ファージ中の５×１０７のＨＣのライブラリは、６×１０９の旧式のライブラリと同様の結果ともたらすことができた。
【０１７６】
【表１１】
【０１７７】
【表１２】
または、現行のＨＣの多様性を、ＤＹ３Ｆ８７ＨＣ内にクローン化でき、上記のＣＤＲ３の多様性を、ＸｂａＩ−ＢｓｔＥＩＩ断片としてその多様性内にクローン化する。例えば、２５のＬＣのライブラリをｐＬＣＳＫ２３内にクローン化し、ＴＧ１ Ｅ．ｃｏｌｉ中に細胞系を創製するために使用する。これらの細胞を、新規なＨＣ ＣＤＲ３（およびＣＤＲ１〜２）の多様性を持つＤＹ３Ｆ８７ＨＣファージに感染させる。この感染から得られたファージを、所望の標的に対する結合に関して選択する。２から４ラウンドの選択の後で、選択されたＨＣをｐＨＣＳＫ２２に移し、ＲＯＬＩＣに使用して、選択されたＨＣとＲＯＬＩＣ ＬＣライブラリ中の全ＬＣと組み合わせることができる細胞系を創造する。この方法において、１．Ｅ９のライブラリは、通常なら１．Ｅ１６の（１．Ｅ７のＬＣの多様性を推測する）ライブラリの構築が必要と思われるＡｂを得ることができる。
【０１７８】
（机上の実施例２）：非常に長いＨＣ ＣＤＲ３を有するライブラリ
Ｓｉｄｈｕら、（Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２００４年３３８巻：２９９〜３１０頁および米国特許出願第２００５０１１９４５５Ａ１号）は、長さが２０アミノ酸までに制限されたＣＤＲにおいて、ＹおよびＳだけが許容されるライブラリから選択される、高親和性Ａｂを報告している。ａ）ＹまたはＳを許容されるいくつかの（しかしすべてではない）部位、ｂ）４〜６のＮＮＫコドンを含む、ｃ）（Ｄにおいて多様化を有するまたは有さない）Ｄセグメントを導入する、および／またはｄ）エラープローンＰＣＲを使用する、のうち１つまたは複数の多様性の形態を有するＨＣ ＣＤＲ３を有するライブラリから、高親和性Ａｂを作製することができる。本発明者らは、ＨＣ ＣＤＲ３が約８から約２２の範囲で、長さの中央値が１３であるＡｂの空間を既にサンプリングしている。したがって、ＨＣ ＣＤＲ３が約２３ＡＡまたは約３５ＡＡのどちらかであるライブラリが可能であり、標的の特定の型に対して有利性を有することができる。例えば、ＧＰＣＲは、多重状態を有すると思われる細胞の脂質二分子層を横断する、７つのらせん形セグメントを有する内在性膜タンパク質である。非常に長いＨＣ ＣＤＲ３を有する抗体は、７つのストランドにより形成されるチャネルに適合する隆起を形成できる。ＧＰＣＲに結合するＡｂを見つけることは困難であり、すべてのメンバーが非常に長いＨＣ ＣＤＲ３を有するライブラリを意図的に構築することにより、この問題は改善され得る。長さは、いくらか可変にでき、１つのライブラリにおいて、約２３、２４，または２５、第２のライブラリにおいて３３、３４または３５である。
【０１７９】
下記は、多くの代表的な設計である。ＣＤＲ３は分解され、さまざまな部分が、Ｘの値に依存して異なる関係を有するようにされた多様性を作製した。完全長ＪＨ１を使用して、いくつかの設計において、多様性は、ＪＨ１のＣＤＲ３における多様性を許容した。他のＪＨも使用できる。設計において、Ｄセグメントは、Ｙに富むか、またはＳに富んだジスルフィドループを有するかのどちらかである。ヒトＤセグメントのアミノ酸配列を表３に示す。Ｄ領域がＳもしくはＹのどちらかを有する、または他の組合せが許容される場所は、特に変化している。表４は、ヒトＪ領域のアミノ酸配列を示す。
【０１８０】
個々のライブラリは、少なくとも４つの方法で構築できる：１）特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡをまず合成し、エラープローンＰＣＲに供する、２）ライブラリは、ｗｏｂｂｌｉｎｇによって、またはヌクレオチドの混合物を用いて合成され得る、３）ライブラリは、ｄｏｂｂｌｉｎｇを使用して構築され得る、４）（２）または（３）の手段に続いてエラープローンＰＣＲを行うことができる。（１）の手段の例として、設計１２において、配列番号９０８をコードする、配列番号：９１１に示すようなＤＮＡが合成できる。このＤＮＡを、配列番号：９０９および配列番号：９１０に示すプライマーを使用して、エラープローンＰＣＲに供することができる。これらのプライマーは、フレームワーク領域を含むので、エラーはＣＤＲ３だけで発生する。
【０１８１】
例えば２×１０９のメンバーの、長さ２３のＣＤＲ３を有するＨＣのライブラリおよび同様に２×１０９のメンバーの、長さ約３５のＨＣ ＣＤＲ３を有する第２のライブラリが構築できる。あるいはＤＮＡを混合し、４×１０９の１つのライブラリを構築できる。
【０１８２】
【表１３】
以下の個々の設計において、アミノ酸配列はＦＲ３の末端であるＹＹＣＡ（Ｋ／Ｒ）で始まる。ＦＲ４はＷＧで出発し、太字で示してある。
【０１８３】
設計１
配列番号：８９８は、ＦＲ３の末端と、それに接合された、免疫系がＶとＤとの間に位置するフィラー配列に頻繁に見出される型の２つの残基（ＤＹ）を含む。Ｄ２−２．２はジスルフィドループを有し、ＳｅｒおよびＴｙｒ残基に富んでいるので、後にはＤ２−２．２が続くことが好ましい。この後に、ＴｙｒおよびＳｅｒ残基に富んだＹＧＹＳＹが続き、その後に完全長ＪＨ１が続く。
【０１８４】
【表１４】
【０１８５】
【表１５】
【０１８６】
【表１６】
【０１８７】
【表１７】
【０１８８】
【表１８】
【０１８９】
【表１９】
【０１９０】
【表２０】
【０１９１】
【表２１】
【０１９２】
【表２２】
【０１９３】
【表２３】
【０１９４】
【表２４】
【０１９５】
【表２５】
【０１９６】
【表２６】
【０１９７】
【表２７】
終止コドンに対する選択：
これらのライブラリのいくつかはＮＮＫコドンを有するので、それらはいくつかのＴＡＧ終止コドンを有するであろう。ｂｌａ遺伝子に対するシグナル配列と、実際のｂｌａタンパク質との間のＸｂａＩ−ＢｓｔＥＩＩ部位内に増幅されたＤＮＡをクローン化し、Ｓｕｐ０細胞において発現させることによって、ＴＡＧを有するクローンを取り除くことができる。ＢｌａＲのコロニーはＴＡＧ終止を含有しない。あるいは、カナマイシン耐性遺伝子の前方のＸｂａＩ−ＢｓｔＥＩＩ断片をクローン化し、ＫａｎＲに関して選択することができる。次いで、ＸｂａＩ−ＢｓｔＥＩＩカセットをファージライブラリに移動する。
【０１９８】
さらに、ｗｏｂｂｌｉｎｇは、いくつかの終止コドンを許容するので、ｂｌａ遺伝子に対するシグナル配列と、実際のｂｌａタンパク質との間のＸｂａＩ−ＢｓｔＥＩＩ部位内に増幅されたＤＮＡをクローン化し、Ｓｕｐ０細胞において発現させることによって、終止を有するクローンを取り除くことにより、ライブラリを改善することができる。ＢｌａＲコロニーは終止を含有しない。あるいは、カナマイシン耐性遺伝子の前方のＸｂａＩ−ＢｓｔＥＩＩ断片をクローン化し、ＫａｎＲに関して選択することができる。次いでＸｂａＩ−ＢｓｔＥＩＩカセットをファージライブラリに移動することができる。
【０１９９】
【表２８】
【０２００】
【表２９】
【０２０１】
【表３０】
【０２０２】
【表３１】
【０２０３】
【表３２】
【０２０４】
【表３３】
【０２０５】
【表３４】
【０２０６】
【表３５】
【０２０７】
【表３６】
【０２０８】
【表３７】
【０２０９】
【表３８】
【０２１０】
【表３９】
【０２１１】
【表４０】
【０２１２】
【表４１】
【０２１３】
【表４２】
【０２１４】
【表４３】
【０２１５】
【表４４】
【０２１６】
【表４５】
【０２１７】
【表４６】
（実施例３）
長さ６〜２０のＣＤＲ３
Ｄセグメントの合成ＨＣ ＣＤＲ３への挿入は、より高い安定性およびより低い免疫原性をもたらし得る。ライブラリは、ＶＨを、Ｄセグメントに接合された、ある長さの任意選択のフィラー、任意選択の第２のフィラーおよびＪＨに接合することによって、アミノ酸レベルで設計される。長さ６または８のライブラリのために、完全長ＪＨが、ＶＨおよび短いフィラーに続いてもよい。表７７は、ＦＡＢ−３１０またはＦＡＢ−４１０から、１つの標的または別の標的への結合に関して選択された、１４１９のＡｂのサンプリングにおけるＤセグメントの頻度を示す。サンプルにおいて、１０９９のＡｂは、検出可能なＤセグメントを有さなかった（すなわち、７０％未満の一致）。Ｄセグメントを使用する場合、ＤセグメントのＤ１−１．３、Ｄ１−２６．３、Ｄ２−２．２、Ｄ２−８．２、Ｄ２−１５．２、Ｄ２−２１．２、Ｄ３−１６．２、Ｄ３−２２．２、Ｄ３−３．２、Ｄ３−９．１、Ｄ３−９．２、Ｄ３−１０．２、Ｄ３−１６．２、Ｄ４−４．２、Ｄ４−４．３、Ｄ４−１１．２、Ｄ４−４．２、Ｄ４−１７．２、Ｄ４−２３．２、Ｄ５−５．３、Ｄ５−１２．３、Ｄ５−１８．３、Ｄ６−６．１、Ｄ６−６．２、Ｄ６−１３．１、Ｄ６−１３．２、Ｄ６−１９．１、Ｄ６−１９．２およびＤ７−２７．１が好ましい。
【０２１８】
親アミノ酸配列が設計されたら、それを、いくつかの方法：エラープローンＰＣＲ、ｗｏｂｂｌｉｎｇおよびｄｏｂｂｌｉｎｇで多様化できる。表１４は、ヒトＤ領域に由来できる多数の六量体を示す。一実施形態において、システイン残基を含有する六量体は除外する。一実施形態において、終止を含有するＤ領域の断片は除外する。一実施形態において、Ｄ領域に見出される任意のＴＡＧコドンを、ＴＣＧ、ＴＴＧ、ＴＧＧ、ＣＡＧ、ＡＡＧ、ＴＡＴおよびＧＡＧを含むセットから選別されたコドンで置き換える。一実施形態において、Ｄ領域に見出される任意のＴＡＡコドンを、ＴＣＡ、ＴＴＡ、ＣＡＡ、ＡＡＡ、ＴＡＴおよびＧＡＡを含むセットから選別されたコドンで置き換える。一実施形態において、Ｄ領域の任意のＴＧＡを、ＴＧＧ、ＴＣＡ、ＴＴＡ、ＡＧＡおよびＧＧＡを含むセットから選別されたコドンで置き換える。
【０２１９】
表２１は、６から２０アミノ酸のＣＤＲ３に対する、例示的な親アミノ酸配列を示す。これらの親配列は、ＨＣ ＣＤＲ１およびＣＤＲ２における多様性と組み合わせ、ライブラリを形成することができる。ＣＤＲ３領域が、例えば、ＣＤＲ３のｗｏｂｂｌｉｎｇ、ｄｏｂｂｌｉｎｇまたはエラープローンＰＣＲにより多様化された場合、有用性が改善される可能性が高い。表２１において、配列６ａは、全ＪＨ１と接合する３−２３由来のＶＨ末端を含む。配列６ｂは、３−２３の末端と接合し、Ｙと接合し、Ｄ４−１７（ＲＦ２）と接合するＪＨ１のＦＲ４領域を含有する。配列６ｃは、３−２３の末端、続いてＤ５−５（ＲＦ３）、続いてＪＨ１のＦＲ４部分を含有する。配列６ｄは、３−２３の末端と接合し、ＳＹと接合する全ＪＨ４を含有する。表２１は、ＣＤＲ３のｗｏｂｂｌｉｎｇに適切と思われるドーピングのレベルを示し、他のレベルも同様に許容される。他のＤ領域またはＤ領域の断片も許容される。他のＪＨ配列も許容される。
【０２２０】
【表４７】
【０２２１】
【表４８】
【０２２２】
【表４９】
【０２２３】
【表５０】
【０２２４】
【表５１】
【０２２５】
【表５２】
【０２２６】
【表５３】
【０２２７】
【表５４】
【０２２８】
【表５５】
【０２２９】
【表５６】
【０２３０】
【表５７】
【０２３１】
【表５８】
【０２３２】
【表５９】
【０２３３】
【表６０】
【０２３４】
【表６１】
（実施例４）
ＣＤＲのＤｏｂｂｌｉｎｇ
以下の実施例は、合成ライブラリの構築におけるｄｏｂｂｌｉｎｇの使用を例示する。親３−２３重鎖（ＨＣ）は、ＣＤＲ１、２および３において多様化される。この多様性は、合成的に多様化されたＡ２７軽鎖（ＬＣ）と組み合わされる。この多様性は下記の通りである：
（実施例４．１）
ＨＣ ＣＤＲ１
以下のｄｏｂｂｌｉｎｇの多様性は、５，８３２の変異体を許容する。表５０を参照されたい。３１位において、Ｓｅｒは生殖系列（ＧＬ）アミノ酸型である。したがって、本発明者らは、他の型より３倍可能性が高いＳｅｒを作製した。１８の型が許容されるので、Ｓｅｒは、１５％の確率で使用可能となり、他は５％で使用可能であろう。したがって、３１位においてＡＡ型の選択がない場合、Ｓｅｒを有するＡｂを単離する確率がより高い。同様に、３３位においてＧＬ ＡＡ型はＡｌａであり、本発明者らは、他のすべて（５％）より３倍可能性が高いＡｌａ（１５％）を作製した。３５位において、ＳｅｒはＧＬ ＡＡ型であり、本発明者らは、それを他の３倍可能性が高く作製した。３つすべての位置において、本発明者らはＣｙｓおよびＭｅｔを除外した。本発明者らは、無償性ジスルフィドまたはＡｂの溶解度および反応性に悪影響を与え得る、露出された不対システインを望まないので、Ｃｙｓを除外する。露出されたメチオニンの側基は、結合特性および保存期間を変更し得る酸化に供されるので、Ｍｅｔを除外する。他のＡＡ型より２、３、４、５、６、８または１０倍可能性が高い生殖系列アミノ酸型を作製できる。
【０２３５】
【表６２】
この開示を通して、示された「許容される」アミノ酸は、所与の位置で使用できるアミノ酸である。例えば、表５０において、３１位において、許容されるアミノ酸「ＡＤＥＦＧＨＫＬＮＰＱＲＳＴＶＷＹ」を示す。このことは、アミノ酸Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹのすべてが、３１位において許容されることを示している。
【０２３６】
（実施例４．２）
ＨＣ ＣＤＲ２
ＣＤＲ２において、本発明者らは、５０、５２、５２ａ、５６および５８位において多様性を許容する。５０、５２、５６，および５８位において、本発明者らはＣｙｓおよびＭｅｔを除くすべてのアミノ酸型を許容し、本発明者らはＧＬ ＡＡ型を３倍高い可能性で作製する。本発明者らは、ＧＬ ＡＡ型を、他のＡＡ型より２、３、４、５、６、８または１０倍高い可能性で作製できる。
【０２３７】
【表６３】
組み合わせたＣＤＲ１およびＣＤＲ２の多様性＝２．４５Ｅ９
（実施例４．３）
ＨＣ ＣＤＲ３、長さ３、４、５
非常に短いＣＤＲ３は、ｄｏｂｂｌｉｎｇにより作製できる。表７は、長さ３のＣＤＲ３に対するいくつかの親配列を示す。９４位において、多くのＶＨ３はＡｒｇを有し、本発明者らはこの変化を許容したが、Ｌｙｓは３倍可能性がある。９５位において、ＦはＪＨ１中のこの位置において見出される。本発明者らはＳｅｒ、Ｔｙｒ、ＡｓｐおよびＡｒｇもまた許容して、小型、大型、正の電荷および負の電荷を許容する。９６位において、ＪＨ１はＱを有する。ＱはＧｌｕに非常に似ているので、本発明者らは、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ，およびＬｅｕに加えて、Ｇｌｕを酸性代替物として許容する。９７位において、ＨｉｓはＪＨ１に由来する生殖系列ＡＡである。本発明者らは、負の電荷（Ｄ）、正の電荷（Ｒ）、低極性（Ｓ）、高疎水性（Ｙ）および脂肪族化合物（Ｌ）を許容する。親配列は、ライブラリの最大４．５％をなすが、これは、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２における大きい多様性を組み合わせている。ｄｏｂｂｌｉｎｇは、全部で３６０の配列を許容する。最も可能性の低い配列は、１７９２分の１で生じる。最も可能性の高い（親）配列は、約２２分の１で生じる。
【０２３８】
【表６４】
表６１は、ｄｏｂｂｌｉｎｇされた長さ３のＨＣ ＣＤＲ３を示す。ここで、Ｋ９４はＷ１０３のように固定されている。本発明者らは、「親」Ｄセグメントアミノ酸を、他の許容されたＡＡ型より５倍の可能性で作製した。
【０２３９】
【表６５】
この実施例において（表６２、表８のＶ−４ＪＨ２を使用する）、９４はＬｙｓとして固定されている。９５位において、ＪＨ２はＴｙｒを有し、本発明者らは、許容されるＳｅｒ、Ａｓｐ、ＡｒｇおよびＬｅｕを有し、その結果、抗原に適合するためにサイズ、電荷および疎水性を変更できる。ＪＨ２は９６位にＰｈｅを有し、本発明者らは、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ａｒｇ，およびＬｅｕを許容した。９７位において、ＪＨ２はＡｓｐを有し、本発明者らは、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、およびＬｅｕを許容した。９８位において、ＪＨ２はＬｅｕを有し、本発明者らは、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、ＡｓｐおよびＡｒｇを許容した。このパターンは、７５０の異なる配列を許容し、親が最も可能性（１／１８）が高い。最も可能性が低い配列は、４６０８分の１で生じ、または最も可能性が高い配列より可能性が２５６倍低い。
【０２４０】
【表６６】
表６３において、表８のＶ−４Ｄ３−１０．１ａ−ＪＨ２のｄｏｂｂｌｉｎｇがあった。９４位において、本発明者らはＬｙｓおよびＡｒｇを許容し、Ｌｙｓ（親）はＡｒｇの４倍の可能性があった。９５位において、Ｄ３−１０．１ａ（すなわち、第１のリーディングフレーム中のＤ３−１０であり、ＡＡ１から出発する）はＬｅｕを有し、本発明者らは、同様にＳＹＤＲを許容した。Ｌｅｕは他のＡＡ型個々の４倍の可能性である。９６位において、Ｄ３−１０．１ａは同様にＬｅｕを有し、本発明者らは、同じメニューを許容した。９７位において、Ｄ３−１０．１ａはＴｒｐを有し、本発明者らは、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、ＡｓｐおよびＡｒｇを許容する。Ｔｒｐは４倍の可能性である。９８位において、Ｄ３−１０．１ａはＰｈｅを有し、本発明者らは、同様にＳｅｒ、Ｔｙｒ、ＡｓｐおよびＡｒｇを許容とする。
【０２４１】
【表６７】
（実施例４．４）
長さ１０から２０のＨＣ ＣＤＲ３
ＨＣ ＣＤＲ３
２つのサブライブラリ、双方とも長さ１６のＣＤＲ３を有する。
【０２４２】
【表６８】
【０２４３】
【表６９】
表６５は、配列番号：８９８のｄｏｂｂｌｉｎｇによる多彩化を示す。許容されたすべての多様性は２．１Ｅ１３である。１．Ｅ８、３．Ｅ８、５．Ｅ８、１．Ｅ９または５．Ｅ９を作製する合成は、多様性を適切にサンプリングするであろう。配列番号：８９８の設計は上で述べた。配列番号：８９８のｄｏｂｂｌｉｎｇにおいて、ｄｏｂｂｌｉｎｇは、大部分の位置で他のＡＡ型を３倍上回る親ＡＡ型を許容することである。親がＴｙｒである位置で、その場合、本発明者らは、ＴｙｒおよびＳｅｒを等量で使用し、Ｌｅｕはその頻度の１／２で使用する。Ｃｙｓ残基は固定されている。個々の親ＡＡ型は許容され、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、ＴｙｒまたはＬｅｕ（親が疎水性、例えばＰｈｅである場合、Ｌｅｕは除かれることがある）の１つに進む。親配列は、１／１．Ｅ８のメンバーで生じる。最も可能性が低い配列は、１／９．５Ｅ１６で生じる。ライブラリが実際に親配列を含有することは重要ではなく、親に似た配列を多数含有することだけが重要である。したがって、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３の多様性を組み合わせる場合、１．Ｅ７、５．Ｅ７、１．Ｅ８、３．Ｅ８、１．Ｅ９または５．Ｅ９を含有するライブラリは、多くの可変Ａｂを含有するライブラリを提供する。
【０２４４】
【表７０】
（実施例４．５）
ｙｙｃａｋＧＳＧＹＣＳＧＧＳＣＹＳＦＤＹｗｇｑｇｔｌｖｔｖｓｓ（配列番号：９３１）のｄｏｂｂｌｉｎｇ
表８０は、長さ１５のＨＣ ＣＤＲ３の例である、配列番号：９３１のｄｏｂｂｌｉｎｇを示す。９４位はＦＲ３の一部であり、一定に保たれる。９５位および９６位は高度に使用される（ＹＧＤＲＳ）のセットから選別される「親」アミノ酸型を有し、Ｇ９５およびＳ９６である。次の１０の位置は、Ｄ２−１５．２（ジスルフィド閉ループを含有する、中程度に良く使用されるＤセグメント）から選別される。最後の３つの位置は、表３に示すように、ＪＨ４の１００位、１０１位および１０２位に由来する。個々の位置において、本発明者らは、親アミノ酸型を他の許容される型より３倍多く作製する。Ｃｙｓ残基は固定されている。１０２ｅにおいて、ＰｈｅはＹＧＳＲＤより３倍可能性が高い（すなわち、Ｐｈｅは、アミノ酸Ｙ、Ｇ、Ｓ、ＲまたはＤのいずれより３倍可能性が高い）。許容される多様性は、１．４６Ｅ９である。親配列は、１／６．９Ｅ４で期待される。個々の１つずつ置換された配列はおそらく約１／３であり、二重に置換された配列は、おそらく１／９でありそのように続く。完全に他のＡＡ型で構成された配列は、わずか１／１．１Ｅ１１で発生する。
【０２４５】
表２１の個々の他の配列は、同じ方法でｄｏｂｂｌｉｎｇできる。
【０２４６】
【表７１】
（実施例５）
合成軽鎖の多様性
全抗体を作るために、重鎖のライブラリと軽鎖（ＬＣ）のライブラリとを組み合わせる必要がある。天然Ａｂにおいて、ＨＣが結合の大部分を行っており、多くのライブラリはＬＣにほとんど注目していない、またはＬＣの多様性をヒトドナーから得ていることは、しばしば観察されることである。十分な多様性を有し、ほとんどすべての標的に対する優れたバインダーを得るために、本発明者らは、ヒト免疫系が通常に提供する多様化プログラムを超える多様化プログラムを設計した。にもかかわらず、このプログラムは、天然Ａｂに見られるのと同様の変化を有する、完全に機能性のＬＣを若干多く得るためだけに設計された。Ｖκ ＩＩＩ Ａ２７を、ＬＣとして選別した。
【０２４７】
提供されたκおよびλＬＣを含むライブラリから、１２６６のＡｂのコレクションを打ち込んだ。ＶＫＩＩＩの中で、Ａ２７は最も多くみられ（表６６）、ＨＣ ３−２３と良く対合する。
【０２４８】
Ａ２７のＣＤＲは１２、７，および９個のアミノ酸を含有する。これらの位置すべてに多様性を加えることは、うまく機能しない恐れがあり、：ａ）多くの不安定または非機能性のメンバーが存在する恐れがある、およびｂ）いくつかの位置において、多様性が結合を改善する助けにならない恐れがある。本発明者らは、可変位置の数を２８から１６に減らした。
【０２４９】
本発明者らは、Ａ２７ ＬＣを有する１ＱＬＲの３Ｄ構造を研究した。１ＧＬＲの構造は、ＲＣＤＢタンパク質データベースにおいて公的に利用可能である。このことから、表６８に示された残基は、変化させるのに有効と思われる。Ｔ５６は、ＨＣ ＣＤＲ３においてＨｉｓから約１０Åである。５６での変化は有用であり得る。Ｇ２４は、ＨＣ ＣＤＲ３において原子からわずか約７Åである。生殖系列はＲ２４であり、したがって２４での変化は有用であり得る。
【０２５０】
表６９は、本発明者らがｐＭＩＤ２１において使用するために設計したディスプレイカセットを示す。したがって、選別された制限酵素はｐＭＩＤ２１に他の部位を有さない。ＳｐｅＩはｉｉｉシグナル配列中にあり、全ＬＣの挿入および除去を可能にする。ＸｍａＩ、ＰｐｕＭＩ、ＥｃｏＯ１０９ＩおよびＢｌｐＩは、ＣＤＲ１の前方にある。ＳａｃＩＩはＦＲ２中にあり、ＣＤＲ１とＣＤＲ２とを隔てている。あるいは、ＡｖｒＩＩ部位は同じ位置に挿入可能である。ＢｓｐＥＩおよびＸｈｏＩ部位はＦＲ３中にあり、ＫｐｎＩ部位はＦＲ４中にある。
【０２５１】
本発明者らは１５５のＡ２７配列を収集し、ＣＤＲにおいて起こっていることを分析した。表７０は分析結果を示す。表７０において、本発明者らのライブラリ由来のＡｂ中に発見されたもの、および本発明者らが個々の位置に置いたと思われるものを示す。
【０２５２】
【表７２】
【０２５３】
【表７３】
ＣＤＲ１
Ｒ２４、Ａ２５およびＳ２６は結合部位から遠すぎて役に立たず、一定に保たれた。Ｖ２９の側基は埋もれており、この位置はＶａｌとして一定に保たれていた。他の位置において、ＹまたはＳおよび帯電したフリップフロップ（ＲＥまたはＲＤ、問題の位置においてサンプルがより多くのＥまたはＤを有する場所に依存する）ならびに頻繁に見られた他の型を許容した。Ｅｘｃｅｌのスプレッドシートを使用して、多彩化のこのパターンは、「他の」ＡＡが５％置換された場合、親配列は０．８％、「他の」ＡＡが６．５％置換された場合、親配列は０．１％、「他の」ＡＡが９％置換された場合、親配列は０．０２％得られることを決定した。１５５のサンプルのうち、１７が、欠失されたＡＡ（１ＱＬＲを含む）を１つ有し、したがって、メンバーの約８％においてＳ３０ａが欠失されるように構成できる。
【０２５４】
ＣＤＲ２
１ＱＬＲの調査により、ＣＤＲ２が結合部位から若干離れていることが分かった。それでも、このＣＤＲ中の残基を一定に保つという提案がなされてきた。３Ｄ構造の研究により、Ｇ５０、Ｓ５３およびＴ５６における多彩化が有用であり得ることが示唆される。Ｓ５３は、１５５のサンプルの中で最も可変であるが、このことは、これらの変化が有用であることの証明にはならない、１ＱＬＲにおいて、Ｇ５０はＲ５０に突然変異している。Ｔ５６のこの側基は、ＨＣ ＣＤＲ３の方を向いており、ＨＣ ＣＤＲ３中の原子から約１１Åである。
【０２５５】
ＣＤＲ３
Ｑ８９およびＱ９０は埋もれており、それらの性質はあまり変化せず、これらの残基は変化しない。Ｙ９１は、ＨＣ ＣＤＲ３に対して包まれており、この場所の変化は結合部位を変更することになり、実際結合部位は変更される。Ｇ９２において、φ＝−８０およびψ＝−１５であり、それ故Ｇｌｙ以外への配置が実行可能であり、４７／１５５例で自然に起こる。Ｓ９３は非常に頻繁に変化し、欠失する。Ｓ９４は高度に露出されており、高度に変化する。Ｐ９５は露出されており、変化する。Ｌ９６は、ＨＣ ＣＤＲ３に対して包まれており、この場所の変化は結合部位に影響を与えることになり、実際に影響が起こる。Ｔ９７は埋もれており、一定に保たれておりアミノ酸は変化しない。
【０２５６】
親配列は、０．０００２４６または１／４．０６Ｅ３で出現する。許容される多様性は、約２．１Ｅ１２である。２つに関しては８％が欠失しており、メンバーの８４．６％が完全長であり、７．４％が短いＣＤＲ１および完全長ＣＤＲ３を有し、７．４％が完全長ＣＤＲ１および短いＣＤＲ３を有し、０．６％が双方を欠失しているであろう。
【０２５７】
他の生殖系列はサンプル中に存在しなかった。
【０２５８】
【表７４】
【０２５９】
【表７５】
【０２６０】
【表７６】
【０２６１】
【表７７】
【０２６２】
【表７８】
親配列は、５．３２Ｅ−５または１／１．８８Ｅ４で出現する。
【０２６３】
単一置換の配列は、１．１Ｅ−５から７．５Ｅ−６の確率である。
【０２６４】
親ＡＡを１つも有さない配列は、１／６．７Ｅ１６で起こる。
【０２６５】
許容される多様性は、約２．３５Ｅ１２である。
【０２６６】
【表７９】
【０２６７】
【表８０】
【０２６８】
【表８１】
【０２６９】
【表８２】
（実施例６）
ＨＣ ＣＤＲ３ １６ｄのためのＷｏｂｂｌｉｎｇされたＤＮＡ
表４００は、ＦＲ３中のＸｂａＩ部位からＦＲ４中のＢｓｔＥＩＩ部位までのＤＮＡのセグメントを示す。ＨＣ ＣＤＲ３は、ＳＹＳＹ：：Ｄ２−２（２）：：ＱＨ、続いてＪＨ１のＦＲ４領域からなる。ＱＨは、ＪＨ１の生殖系列において見出される。Ｖ−Ｄ−Ｊ接合において、免疫細胞はＶ、ＤおよびＪの末端を頻繁に編集する。したがって、構成は、実際の免疫グロブリン遺伝子の構成および成熟において非常に可能性が高いものに対応する。ｗｏｂｂｌｉｎｇによる合成により、本発明者らは、３−２３と、Ｄ領域またはほとんど編集されていないＪＨ１との接合、続くいくつかの突然変異に由来するものに似ている、遺伝子の大きなコレクションを得る。ライブラリ１６ｄにおいて、推定上ジスルフィドを形成する２つのシステインが存在し、これらはｗｏｂｂｌｉｎｇされない。
【０２７０】
表５００は、１６ｄライブラリにおける、個々の位置でのアミノ酸型の期待分布を示す。ｗｏｂｂｌｉｎｇのドーピングは７３：９：９：９に設定された。最も可能性のある配列は表２１に示す配列であり、頻度が４．８Ｅ−５で存在するはずである。５５％の配列だけが終止を含まず、７４％がオーカーまたはオペルを含まない。ライブラリがｓｕｐＥ細胞において発現する場合、これは重要な数である。終止コドンを有する配列を取り除くことは、本明細書の他の場所で述べたように、価値のあることである。Ｓで始まるそれらの位置が、５４％の確率でＳを、５．４％の確率でＹを有すると予測され、一方、Ｙで始まるものは、４４％の確率でＹを、７．２％の確率でＳを有することが見て取れる。個々の位置において、１％を超えて出現する７〜９のＡＡ型が存在する。１４の多彩化された位置が存在する。最も有効であると思われる配列は、約８１４＝４．３Ｅ１２の数をサンプリングした。
【０２７１】
【表８３】
【０２７２】
【表８４】
【０２７３】
【表８５】
【０２７４】
【表８６】
【０２７５】
【表８７】
【０２７６】
【表８８】
（実施例７）
合成ＨＣ ＣＤＲ３のさらなる例
ＦＡＢ−３１０またはＦＡＢ−４１０のライブラリから選択された異なるＣＤＲ３を有し、少なくとも１種の抗原に対してＥＬＩＳＡであった、２２，０６３のＦａｂのコレクションを検査した。ＪＨ鎖の利用を、表１００１に示す；個々のＪＨのＦＲ４部分を太字で示す。表１０１０は、ＨＣ ＣＤＲ３におけるアミノ酸の利用を示す。表１０２０は、ＣＤＲ３の長さの分布を示す。長さの中央値は１１．５である。
【０２７７】
表１０３０は、ＣＤＲ３におけるＤセグメントの利用を示す。特定されたＤセグメントは、一致したアミノ酸の７０％であった。；５，６５４例（２５．６％）が存在した。最も使用されたＤは、３−３．２（７４３、配列：ＹＹＤＦＷＳＧＹＹＴ）、３−２２．２（６１７、配列：ＹＹＹＤＳＳＧＹＹＹ）、６−１９．１（４４１、配列：ＧＹＳＳＧＷＹ）、６−１３．１（３９９、配列：ＧＹＳＳＳＷＹ）および４−１７．２（３９２、配列：ＤＹＧＤＹ）であった。対合したＣｙｓ残基を含有するＤのうち、２−１５．２（配列：ＧＹＣＳＧＧＳＣＹＳ）が最も使用された；コレクションの０．６％である１３９の例が存在した。
【０２７８】
ＶまたはＶ：：ＤがＪに接合される場合、ＶまたはＶ：：Ｄの３’末端およびＪの５’末端が多くの場合編集されている。多数のＣＤＲ３−ＦＲ４配列の調査により、多くの場合、ＣＤＲ３の一部を構成するＪＨの一部が存在することが示される。多くの場合、ＪＨ残基１〜９に対応するＣＤＲ３残基において、突然変異が存在する。本明細書において、ＪＨに由来すると思われるＣＤＲ３の一部は、「Ｊｓｔｕｍｐ」と呼ばれる。重鎖に使用されるＪＨは、６から２０位の６つのＪＨ鎖の個々の残基と、ＣＤＲ３の最後の４個のアミノ酸とＦＲ４との融合を比較することによって決定される。不一致が最も少ないＪＨを選択する。ＣＤＲ３配列を、Ｊｓｔｕｍｐに関して、９位からＣＤＲ３と比較した選択されたＪＨの第１の位置へ、検索が、ａ）ＪＨの末端、ｂ）ＣＤＲ３の末端またはｃ）２つの連続する不一致により終了するまで、選択されたＪＨにおいて逆に働くことによって検査した。鎖の末端の１つと、最後の比較位置が一致する場合、その場合Ｊｓｔｕｍｐに含まれる。一致しない場合は、Ｊｓｔｕｍｐに含まれない。表１０７０は、いくつかの例を示す。ＣＤＲは上に記載し、ＪＨは下であり、Ｊｓｔｕｍｐは下線を引いてある。１０７０Ａにおいて、本発明者らは、９位から始め、ＶはＶに一致し、本発明者らは、一致する６位へと続けた。検索は、二重の不一致のため、４位で停止する。ＧＭＤＶはＪｓｔｕｍｐの蓄積内となり、ＧＬは「リードイン」の蓄積内となる。１０７０Ｂにおいて、検索はＪＨ６の末端で停止する。下線の残基は、Ｊｓｔｕｍｐの蓄積内となり、ＥＰＩＷＧはリードインの蓄積内となる。１０７０Ｅにおいて、検索はＪＨ４の末端のため終了するが、被験最終残基（ＣＤＲ中のＤ対ＪＨ４中のＹ）は不一致であり、それ故、ＪｓｔｕｍｐはＦＤＳであり、ＤＳＧＶＶＡＡＡＤはリードインの蓄積内となる。
【０２７９】
表１０１５は、Ｊｓｔｕｍｐを取り除いてあるＤセグメントを有さないＣＤＲ３のアミノ酸分布を示す。Ｔｙｒの頻度は、全ＣＤＲ３がコンパイルされた場合よりさらに低いことに留意されたい。このことは、ＤセグメントおよびＪｓｔｕｍｐの組み込みを介して、ＴｙｒがＣＤＲ３に大量に入ってくることを示す。これらのＴｙｒはランダムには挿入されないが、哺乳類の進化を通して選択されてきた配列において生じる。高レベル（２０％を超える）のＴｙｒが、ＤおよびＴｙｒを含有するＪｓｔｕｍｐの組み込みを介してライブラリに挿入されるはずであることが、本発明の特徴である。リードイン位置またはＤＪフィラー位置において、Ｔｙｒは許容されるが、２０％以下である。
【０２８０】
【表８９】
表１０８２は、個々のＪＨのＪｓｔｕｍｐにおけるアミノ酸の使用分布を示す。最も一般的なＪＨはＪＨ３、ＪＨ４およびＪＨ６であるので、これらはライブラリ構築にとって好ましいＪＨである。表１０８２は、ＣＤＲ３においてテトラペプチド配列ＡＦＤＩを保有するＪＨ３の例が最も多いことを示す。ＪＨ４では、多数がＤＹを保有し、大型の分画がＣＤＲ３において配列ＦＤＹを保有する。ＪＨ６では、大多数が配列ＤＶを保有し、多数が配列ＭＤＶを保有し、かなりの分画が配列ＧＭＤＶを保有する。配列ＹＧＭＤＶ、ＹＹＧＭＤＶまたはＹＹＹＧＭＤＶを保有する分画も少なくない。
【０２８１】
５．００１（表１０９７）などのライブラリが、本発明のライブラリに含まれる。ライブラリ５．００１は、本出願の他所に記載のように、ＬＣおよびＨＣ ＣＤＲ１〜２を含有する。このライブラリは、ＨＣ ＶＨ（例えば、３−２３）、続いて表１０９７に示される割合で［ＧＳＲＤＬＹ］を許容する６、７または８個のアミノ酸を含有する。Ｊｓｔｕｍｐにおいて、親アミノ酸は、「他の」アミノ酸型の３、４、５、６、７、８、１０倍で存在する。「他の」アミノ酸型は、Ｙ、Ｓ、Ｄ、Ｒ、Ｇを含む。したがって、Ａ６において、本発明者らは、７／１２のＡならびに個々に１／１２のＹ、Ｓ、Ｄ、Ｒ、およびＧを許容する。Ｆ７において、本発明者らは、７／１２のＦならびに個々に１／１２のＹ、Ｓ、Ｄ、ＲおよびＧを許容する。Ｄ８において、本発明者らは、７／１１のＤならびに１／１１のＹ、Ｓ、Ｒ、およびＧを許容する。Ｉ９において、本発明者らは、７／１２のＩならびに１／１２のＹ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、Ｇを許容する。親アミノ酸は、他のアミノ酸型より５、６、７、８、１０倍可能性が高い。
【０２８２】
表１０９７のライブラリ５．００２が、本発明のライブラリに含まれる。このライブラリは、長さ１３、１４および１５のＣＤＲ３を含み、Ｄセグメントは含まない。Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、Ｌ，またはＹを１：０．５７：０．４６：０．４２：０．３６：０．３５の比率で、またはそれらに対して合理的な近似で許容する６、７、８個のリードイン残基が存在する。ＣＤＲ３は、ＪＨ６の一部分：ＹＹＹＧＭＤＶで完了する。親配列ＹＹＹＧＭＤＶをコードするＤＮＡは、親アミノ酸を用いて他より５、６、７、８または１０倍高い可能性で合成される。
【０２８３】
表１０９７のライブラリ５．００３は、本発明のライブラリに含まれる。ＦＲ３の後に、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、Ｌ、Ｙを１．０：０．５７：０．４６：０．４２：０．３６：０．３５の比率で許容する４、５、または６個のリードイン残基が続く。次に来るのは、Ｄセグメント３−３．２；親アミノ酸を５倍好み、他のアミノ酸としてＹ、Ｇ、Ｄ、Ｒ、Ｓを許容するこの領域をコードするＤＮＡである。ＤＪフィラーは存在せず、最終の４個のアミノ酸は、ＪＨ３のＪｓｔｕｍｐに由来する。ＪｓｔｕｍｐをコードするＤＮＡは、他より可能性が５倍高い親アミノ酸：ＹＳＧＲＤを用いて合成される。
【０２８４】
表１０９７のライブラリ５．００４は本発明の一部である。示した比率でＧＳＲＤＬＹを許容する２、３または４個のリードイン残基が存在する。配列ＧＹＳＳＧＷＹをコードするＤＮＡは、親アミノ酸が他より６倍であるように合成され、２つのＤＪ−フィラー残基は、１．０：０．５７：０．４６：０．４２：０．３６：０．３５の比率で許容されるＧＳＲＤＬＹにより許容される。ＡＦＤＩをコードするＤＮＡは、他より６倍の親アミノ酸を用いて合成される。
【０２８５】
ライブラリ５．００５は本発明の一部である。ライブラリ５．００５は、長さ１１〜１４のＣＤＲ３を有するメンバーを含む。ＦＲ３の後に、示した比率でＧＳＲＤＬＹを許容する０、１、または２個のリードイン残基が存在し、親アミノ酸が、他の許容された型より６倍であるようにＹＧＳＲＤを許容する変動性のある親配列ＧＹＳＳＧＷＹをコードするＤＮＡが後に続く。Ｄ領域の後に、ＧＳＲＤＬＹを示した比率で許容する０または１個のＤＪフィラー残基がある。最後に、他の許容された型より６倍可能性が高い親アミノ酸によりＹＧＳＲＤを許容する、Ｊｓｔｕｍｐ（配列：ＹＦＤＹ）に変動性を有するＪＨ３がある。
【０２８６】
表１０９７のライブラリ５．００６は、本発明の一部である。ＣＤＲ３は長さ１９〜２５であってよい。示した比率でＧＳＲＤＬＹを許容する０から３個のリードイン残基がある。リードインの後にＤ領域２−２．２がある。２−２．２をコードするＤＮＡは、２つのＣｙｓ残基が固定されていることを除いて、親アミノ酸が、他（つまりＹＧＳＲＤ）より６倍可能性が高いように合成される。２−２．２の後に、ＧＳＲＤＬＹを示した比率で許容する０から３個のＤＪフィラー残基がある。ＪＨ６の最初の９個の残基をコードするＤＮＡは、親アミノ酸ならびにＹＳＧＤＲを許容し、親の型は他より６倍可能性が高い。
【０２８７】
【表９０】
【０２８８】
【表９１】
【０２８９】
【表９２】
【０２９０】
【表９３】
【０２９１】
【表９４】
【０２９２】
【表９５】
【０２９３】
【表９６】
【０２９４】
【表９７】
【０２９５】
【表９８】
【０２９６】
【表９９】
【０２９７】
【表１００】
【０２９８】
【表１０１】
【０２９９】
【表１０２】
【０３００】
【表１０３】
【０３０１】
【表１０４】
【０３０２】
【表１０５】
【０３０３】
【表１０６】
参照文献
本出願を通して引用された、参考文献、発行された特許、公開または非公開の特許出願を含むすべての参照文献の内容ならびに以下に載せた参照文献は、参照によりその全体が明確に本明細書に組み込まれる。抵触の場合、本出願が、本明細書における任意の定義を含めて、支配するものとする。
【０３０４】
【数１】
同等物
本発明の多数の実施形態を記載した。にもかかわらず、さまざまな変形が、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく可能であることは理解されるべきであろう。したがって、他の実施形態も、以下の特許請求の範囲内である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト抗体関連ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリであって、該ベクターまたは遺伝子パッケージが、重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多彩化されたＤＮＡ配列を含み、該ファミリーの該ＨＣ ＣＤＲ３において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５の位置が、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、ＳｅｒおよびＡｒｇ残基の間で変化するライブラリ。
【請求項２】
前記ＨＣ ＣＤＲ３の全位置の約５０％がＴｙｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、ＳｅｒまたはＡｒｇである、請求項１に記載のライブラリ。
【請求項３】
Ａｒｇ残基が、ＶおよびＤの間、ＤおよびＪの間またはＶおよびＪの間のフィラー領域に存在する、請求項１に記載のライブラリ。
【請求項４】
ヒト抗体関連ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリであって、該ベクターまたは遺伝子パッケージが、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５の残基からなる重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多彩化されたＤＮＡ配列を含み、個々の残基は独立してＴｙｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、ＳｅｒおよびＡｒｇ残基の間で変化し、フレームワーク領域（ＦＲ）３が該ＣＤＲ３のアミノ末端に位置し、ＪＨ領域のＦＲ４部分が該ＣＤＲ３のカルボキシ末端に位置するライブラリ。
【請求項５】
前記ＦＲ３が３−２３ＶＨ ＦＲ３である、請求項４に記載のライブラリ。
【請求項６】
ヒト抗体関連ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリであって、該ベクターまたは遺伝子パッケージが、重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多彩化されたＤＮＡ配列を含み、該ＨＣ ＣＤＲ３配列の約２０％超がＴｙｒ残基からなるライブラリ。
【請求項７】
前記ＨＣ ＣＤＲ３のＤ領域およびＪｓｔｕｍｐが、約２０％超のＴｙｒ残基からなる、請求項６に記載のライブラリ。
【請求項８】
ヒト抗体関連ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリであって、該ベクターまたは遺伝子パッケージが、重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多彩化されたＤＮＡ配列を含み、該ＨＣ ＣＤＲ３配列の約２０％未満がＴｙｒ残基からなるライブラリ。
【請求項９】
前記ＨＣ ＣＤＲ３のリードインまたはＤＪフィラー位置が、約２０％未満のＴｙｒ残基からなる、請求項８に記載のライブラリ。
【請求項１０】
ヒト抗体関連ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリであって、該ベクターまたは遺伝子パッケージが、重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多彩化されたＤＮＡ配列を含み、該ＨＣ ＣＤＲ３が３アミノ酸長であり、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第１の残基が、Ｆ、Ｓ、Ｙ、ＤおよびＲの間で、３：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第２の残基が、Ｑ、Ｅ、Ｒ、Ｓ、ＹおよびＬの間で３：１：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第３の残基が、Ｈ、Ｄ、Ｒ、Ｓ、ＹおよびＬの間で３：１：１：１：１：１の比率で変化するライブラリ。
【請求項１１】
ＦＲ３が前記ＣＤＲ３のアミノ末端に位置し、該ＦＲ３の最後の残基が、ＫおよびＲの間で、３：１の比率で変化する、請求項１０に記載のライブラリ。
【請求項１２】
ヒト抗体関連ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリであって、該ベクターまたは遺伝子パッケージが、重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多彩化されたＤＮＡ配列を含み、該ＨＣ ＣＤＲ３が３アミノ酸長であり、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第１の残基が、Ｔ、Ｙ、Ｒ、ＤおよびＬの間で、５：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第２の残基が、Ｔ、Ｙ、Ｒ、ＤおよびＬの間で、５：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第３の残基が、Ｇ、Ｓ、Ｙ、Ｒ、ＤおよびＬの間で５：１：１：１：１：１の比率で変化するライブラリ。
【請求項１３】
ヒト抗体関連ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリであって、該ベクターまたは遺伝子パッケージが、重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多彩化されたＤＮＡ配列を含み、該ＨＣ ＣＤＲ３が４アミノ酸長であり、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第１の残基が、Ｙ、Ｓ、Ｄ、ＲおよびＬの間で、４：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第２の残基が、Ｆ、Ｓ、Ｙ、Ｄ、ＲおよびＬの間で、４：１：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第３の残基が、Ｄ、Ｒ、Ｓ、ＹおよびＬの間で、４：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第４の残基が、Ｌ、Ｓ、Ｙ、ＤおよびＲの間で、４：１：１：１：１の比率で変化するライブラリ。
【請求項１４】
ヒト抗体関連ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリであって、該ベクターまたは遺伝子パッケージが、重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多彩化されたＤＮＡ配列を含み、該ＨＣ ＣＤＲ３が４アミノ酸長であり、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第１の残基が、Ｌ、Ｓ、Ｙ、ＤおよびＲの間で、４：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第２の残基が、Ｌ、Ｓ、Ｙ、ＤおよびＲの間で、４：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第３の残基が、Ｗ、Ｓ、Ｙ、ＤおよびＲの間で、４：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第４の残基が、Ｆ、Ｓ、Ｙ、ＤおよびＲの間で、４：１：１：１：１の比率で変化するライブラリ。
【請求項１５】
ＦＲ３が前記ＣＤＲ３のアミノ末端に位置し、該ＦＲ３の最後の残基が、ＫおよびＲの間で、４：１の比率で変化する、請求項１４に記載のライブラリ。
【請求項１６】
ヒト抗体関連ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリであって、該ベクターまたは遺伝子パッケージが、重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多彩化されたＤＮＡ配列を含み、該ＨＣ ＣＤＲ３が１６アミノ酸長であり、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第１の残基が、Ｙ、Ｓ、Ｒ、ＤおよびＬの間で、３：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第２の残基が、Ｙ、Ｓ、Ｒ、ＤおよびＬの間で、３：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第３の残基が、Ｙ、Ｓ、Ｒ、ＤおよびＬの間で、３：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第４の残基が、Ｄ、Ｙ、Ｓ、ＲおよびＬの間で、３：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第５の残基が、Ｓ、Ｙ、Ｒ、ＤおよびＬの間で、３：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第６の残基が、Ｓ、Ｙ、Ｒ、ＤおよびＬの間で、３：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第７の残基が、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｙ、Ｒ、ＤおよびＬの間で、３：１：１：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第８の残基が、Ｙ、Ｓ、Ｒ、ＤおよびＬの間で、３：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第９の残基が、Ｙ、Ｓ、Ｒ、ＤおよびＬの間で、３：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第１０の残基が、Ｙ、Ｓ、Ｒ、ＤおよびＬの間で、３：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第１１の残基が、Ａ、Ｓ、Ｙ、ＲおよびＤの間で、３：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第１２の残基が、Ｅ、Ｒ、Ｓ、ＹおよびＬの間で、３：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第１３の残基が、Ｙ、Ｓ、Ｒ、ＤおよびＬの間で、３：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第１４の残基が、Ｆ、Ｙ、Ｓ、ＲおよびＤの間で、３：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第１５の残基が、Ｑ、Ｅ、Ｒ、ＳおよびＹの間で、３：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第１６の残基が、Ｈ、Ｅ、Ｒ、Ｓ、ＹおよびＬの間で、３：１：１：１：１：１の比率で変化するライブラリ。
【請求項１７】
ＦＲ３が前記ＣＤＲ３のアミノ末端に位置し、該ＦＲ３の最後の残基が、ＫおよびＲの間で、３：１の比率で変化する、請求項１６に記載のライブラリ。
【請求項１８】
ヒト抗体関連ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリであって、該ベクターまたは遺伝子パッケージが、重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多彩化されたＤＮＡ配列を含み、該ＨＣ ＣＤＲ３が１６アミノ酸長であり、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第１の残基が、Ｇ、Ｓ、Ｙ、Ｄ、ＲおよびＬの間で、３：１：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第２の残基が、Ｙ、Ｓ、Ｄ、Ｒ，およびＬの間で、３：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第３の残基がＣであり、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第４の残基が、Ｓ、Ｙ、Ｒ、ＤおよびＬの間で、３：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第５の残基が、Ｓ、Ｙ、Ｒ、ＤおよびＬの間で、３：１：１：１：１：の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第６の残基が、Ｔ、Ｙ、Ｒ、ＤおよびＬの間で、３：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第７の残基が、Ｓ、Ｙ、Ｒ、ＤおよびＬの間で、３：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第８の残基が、Ｃであり、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第９の残基が、Ｙ、Ｓ、Ｄ、ＲおよびＬの間で、３：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第１０の残基が、Ｔ、Ｙ、Ｒ、ＤおよびＬの間で、３：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第１１の残基が、Ａ、Ｓ、Ｙ、Ｄ、Ｒ、およびＬの間で、３：１：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第１２の残基が、Ｅ、Ｒ、Ｓ、ＹおよびＬの間で、３：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第１３の残基が、Ｙ、Ｓ、Ｄ、ＲおよびＬの間で、３：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第１４の残基が、Ｆ、Ｙ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、およびＬの間で、３：１：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第１５の残基が、Ｑ、Ｅ、Ｒ、Ｓ、Ｙ、およびＬの間で、３：１：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第１６の残基が、Ｈ、Ｄ、Ｒ、Ｓ、ＹおよびＬの間で、３：１：１：１：１：１の比率で変化するライブラリ。
【請求項１９】
ＦＲ３が前記ＣＤＲ３のアミノ末端に位置し、該ＦＲ３の最後の残基が、ＫおよびＲの間で、３：１の比率で変化する、請求項１９に記載のライブラリ。
【請求項２０】
ヒト抗体関連ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリであって、該ベクターまたは遺伝子パッケージが、Ａ２７軽鎖（ＬＣ）をコードする多彩化されたＤＮＡ配列を含み、該ＬＣのＣＤＲ１が多様化され、
２７位は、約５５％がＱ、それぞれ約９％がＥ、Ｒ、Ｙ、ＳおよびＬであり、
２８位は、約４６％がＳ、それぞれ約９％がＮ、Ｔ、Ｙ、Ｅ、Ｒ、およびＬであり、
３０位は、約５５％がＳ、それぞれ約９％がＤ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、およびＹであり、
３０ａ位は、約４６％がＳ、それぞれ約９％がＧ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｙ、およびＤであり、約８％はアミノ酸を含まず、
３１位は、約４４％がＳ、それぞれ約８％がＤ、Ｆ、Ｇ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、およびＹであり、
３２位は、約４４％がＹ、それぞれ約７％がＦ、Ｄ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、およびＹであり、
３４位は、約７０％がＡ、それぞれ約１５％がＳおよびＹであるライブラリ。
【請求項２１】
ヒト抗体関連ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリであって、該ベクターまたは遺伝子パッケージが、Ａ２７軽鎖（ＬＣ）をコードする多彩化されたＤＮＡ配列を含み、該ＬＣのＣＤＲ２が多様化され、
５０位は、約５５％がＧ、それぞれ約９％がＤ、Ｒ、Ｓ、ＹおよびＬであり、
５３位は、約５２％がＳ、それぞれ約８％がＮ、Ｔ、Ｓ、Ｙ、ＥおよびＲであり、
５６位は、約６４％がＴ、それぞれ約９％がＥ、Ｒ、ＳおよびＹであるライブラリ。
【請求項２２】
ヒト抗体関連ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリであって、該ベクターまたは遺伝子パッケージが、Ａ２７軽鎖（ＬＣ）をコードする多彩化されたＤＮＡ配列を含み、該ＬＣのＣＤＲ３が多様化され、
９１位は、約６４％がＹ、それぞれ約９％がＦ、Ｅ、ＲおよびＳであり、
９２位は、約５２％がＧ、それぞれ約８％がＡ、Ｄ、Ｒ、Ｓ、ＴおよびＹであり、
９３位は、約５２％がＳ、それぞれ約８％がＤ、Ｆ、Ｎ、Ｒ、ＴおよびＹであり、
９４位は、約５５％がＳ、それぞれ約９％がＷ、Ｅ、Ｒ、ＹおよびＳであり、
９５位は、約６４％がＰ、それぞれ約９％がＥ、Ｒ、ＹおよびＳであり、約８％はアミノ酸を含まず、
９６位は、約５５％がＬ、それぞれ約９％がＥ、Ｒ、Ｐ、ＹおよびＳであるライブラリ。
【請求項２３】
請求項２１に記載のＬＣ ＣＤＲ２の多様性をさらに含む、請求項２０に記載のライブラリ。
【請求項２４】
請求項２２に記載のＬＣ ＣＤＲ３の多様性をさらに含む、請求項２０に記載のライブラリ。
【請求項２５】
請求項２２に記載のＬＣ ＣＤＲ３の多様性をさらに含む、請求項２１に記載のライブラリ。
【請求項２６】
ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３の１つまたは複数において多様性を有する軽鎖をさらに含む、請求項１〜１９のいずれかに記載のライブラリ。
【請求項２７】
請求項２０、２１または２２に記載のＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２またはＬＣ ＣＤＲ３をそれぞれ、またはそれらの組合せを含む、請求項２６に記載のライブラリ。
【請求項２８】
ｄｏｂｂｌｉｎｇを含む、請求項１から２７のいずれか一項に記載のライブラリを調製する方法。
【請求項１】
ヒト抗体関連ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリであって、該ベクターまたは遺伝子パッケージが、重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多彩化されたＤＮＡ配列を含み、該ファミリーの該ＨＣ ＣＤＲ３において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５の位置が、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、ＳｅｒおよびＡｒｇ残基の間で変化するライブラリ。
【請求項２】
前記ＨＣ ＣＤＲ３の全位置の約５０％がＴｙｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、ＳｅｒまたはＡｒｇである、請求項１に記載のライブラリ。
【請求項３】
Ａｒｇ残基が、ＶおよびＤの間、ＤおよびＪの間またはＶおよびＪの間のフィラー領域に存在する、請求項１に記載のライブラリ。
【請求項４】
ヒト抗体関連ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリであって、該ベクターまたは遺伝子パッケージが、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５の残基からなる重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多彩化されたＤＮＡ配列を含み、個々の残基は独立してＴｙｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、ＳｅｒおよびＡｒｇ残基の間で変化し、フレームワーク領域（ＦＲ）３が該ＣＤＲ３のアミノ末端に位置し、ＪＨ領域のＦＲ４部分が該ＣＤＲ３のカルボキシ末端に位置するライブラリ。
【請求項５】
前記ＦＲ３が３−２３ＶＨ ＦＲ３である、請求項４に記載のライブラリ。
【請求項６】
ヒト抗体関連ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリであって、該ベクターまたは遺伝子パッケージが、重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多彩化されたＤＮＡ配列を含み、該ＨＣ ＣＤＲ３配列の約２０％超がＴｙｒ残基からなるライブラリ。
【請求項７】
前記ＨＣ ＣＤＲ３のＤ領域およびＪｓｔｕｍｐが、約２０％超のＴｙｒ残基からなる、請求項６に記載のライブラリ。
【請求項８】
ヒト抗体関連ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリであって、該ベクターまたは遺伝子パッケージが、重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多彩化されたＤＮＡ配列を含み、該ＨＣ ＣＤＲ３配列の約２０％未満がＴｙｒ残基からなるライブラリ。
【請求項９】
前記ＨＣ ＣＤＲ３のリードインまたはＤＪフィラー位置が、約２０％未満のＴｙｒ残基からなる、請求項８に記載のライブラリ。
【請求項１０】
ヒト抗体関連ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリであって、該ベクターまたは遺伝子パッケージが、重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多彩化されたＤＮＡ配列を含み、該ＨＣ ＣＤＲ３が３アミノ酸長であり、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第１の残基が、Ｆ、Ｓ、Ｙ、ＤおよびＲの間で、３：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第２の残基が、Ｑ、Ｅ、Ｒ、Ｓ、ＹおよびＬの間で３：１：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第３の残基が、Ｈ、Ｄ、Ｒ、Ｓ、ＹおよびＬの間で３：１：１：１：１：１の比率で変化するライブラリ。
【請求項１１】
ＦＲ３が前記ＣＤＲ３のアミノ末端に位置し、該ＦＲ３の最後の残基が、ＫおよびＲの間で、３：１の比率で変化する、請求項１０に記載のライブラリ。
【請求項１２】
ヒト抗体関連ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリであって、該ベクターまたは遺伝子パッケージが、重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多彩化されたＤＮＡ配列を含み、該ＨＣ ＣＤＲ３が３アミノ酸長であり、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第１の残基が、Ｔ、Ｙ、Ｒ、ＤおよびＬの間で、５：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第２の残基が、Ｔ、Ｙ、Ｒ、ＤおよびＬの間で、５：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第３の残基が、Ｇ、Ｓ、Ｙ、Ｒ、ＤおよびＬの間で５：１：１：１：１：１の比率で変化するライブラリ。
【請求項１３】
ヒト抗体関連ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリであって、該ベクターまたは遺伝子パッケージが、重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多彩化されたＤＮＡ配列を含み、該ＨＣ ＣＤＲ３が４アミノ酸長であり、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第１の残基が、Ｙ、Ｓ、Ｄ、ＲおよびＬの間で、４：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第２の残基が、Ｆ、Ｓ、Ｙ、Ｄ、ＲおよびＬの間で、４：１：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第３の残基が、Ｄ、Ｒ、Ｓ、ＹおよびＬの間で、４：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第４の残基が、Ｌ、Ｓ、Ｙ、ＤおよびＲの間で、４：１：１：１：１の比率で変化するライブラリ。
【請求項１４】
ヒト抗体関連ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリであって、該ベクターまたは遺伝子パッケージが、重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多彩化されたＤＮＡ配列を含み、該ＨＣ ＣＤＲ３が４アミノ酸長であり、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第１の残基が、Ｌ、Ｓ、Ｙ、ＤおよびＲの間で、４：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第２の残基が、Ｌ、Ｓ、Ｙ、ＤおよびＲの間で、４：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第３の残基が、Ｗ、Ｓ、Ｙ、ＤおよびＲの間で、４：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第４の残基が、Ｆ、Ｓ、Ｙ、ＤおよびＲの間で、４：１：１：１：１の比率で変化するライブラリ。
【請求項１５】
ＦＲ３が前記ＣＤＲ３のアミノ末端に位置し、該ＦＲ３の最後の残基が、ＫおよびＲの間で、４：１の比率で変化する、請求項１４に記載のライブラリ。
【請求項１６】
ヒト抗体関連ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリであって、該ベクターまたは遺伝子パッケージが、重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多彩化されたＤＮＡ配列を含み、該ＨＣ ＣＤＲ３が１６アミノ酸長であり、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第１の残基が、Ｙ、Ｓ、Ｒ、ＤおよびＬの間で、３：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第２の残基が、Ｙ、Ｓ、Ｒ、ＤおよびＬの間で、３：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第３の残基が、Ｙ、Ｓ、Ｒ、ＤおよびＬの間で、３：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第４の残基が、Ｄ、Ｙ、Ｓ、ＲおよびＬの間で、３：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第５の残基が、Ｓ、Ｙ、Ｒ、ＤおよびＬの間で、３：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第６の残基が、Ｓ、Ｙ、Ｒ、ＤおよびＬの間で、３：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第７の残基が、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｙ、Ｒ、ＤおよびＬの間で、３：１：１：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第８の残基が、Ｙ、Ｓ、Ｒ、ＤおよびＬの間で、３：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第９の残基が、Ｙ、Ｓ、Ｒ、ＤおよびＬの間で、３：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第１０の残基が、Ｙ、Ｓ、Ｒ、ＤおよびＬの間で、３：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第１１の残基が、Ａ、Ｓ、Ｙ、ＲおよびＤの間で、３：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第１２の残基が、Ｅ、Ｒ、Ｓ、ＹおよびＬの間で、３：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第１３の残基が、Ｙ、Ｓ、Ｒ、ＤおよびＬの間で、３：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第１４の残基が、Ｆ、Ｙ、Ｓ、ＲおよびＤの間で、３：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第１５の残基が、Ｑ、Ｅ、Ｒ、ＳおよびＹの間で、３：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第１６の残基が、Ｈ、Ｅ、Ｒ、Ｓ、ＹおよびＬの間で、３：１：１：１：１：１の比率で変化するライブラリ。
【請求項１７】
ＦＲ３が前記ＣＤＲ３のアミノ末端に位置し、該ＦＲ３の最後の残基が、ＫおよびＲの間で、３：１の比率で変化する、請求項１６に記載のライブラリ。
【請求項１８】
ヒト抗体関連ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリであって、該ベクターまたは遺伝子パッケージが、重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ３をコードする多彩化されたＤＮＡ配列を含み、該ＨＣ ＣＤＲ３が１６アミノ酸長であり、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第１の残基が、Ｇ、Ｓ、Ｙ、Ｄ、ＲおよびＬの間で、３：１：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第２の残基が、Ｙ、Ｓ、Ｄ、Ｒ，およびＬの間で、３：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第３の残基がＣであり、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第４の残基が、Ｓ、Ｙ、Ｒ、ＤおよびＬの間で、３：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第５の残基が、Ｓ、Ｙ、Ｒ、ＤおよびＬの間で、３：１：１：１：１：の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第６の残基が、Ｔ、Ｙ、Ｒ、ＤおよびＬの間で、３：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第７の残基が、Ｓ、Ｙ、Ｒ、ＤおよびＬの間で、３：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第８の残基が、Ｃであり、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第９の残基が、Ｙ、Ｓ、Ｄ、ＲおよびＬの間で、３：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第１０の残基が、Ｔ、Ｙ、Ｒ、ＤおよびＬの間で、３：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第１１の残基が、Ａ、Ｓ、Ｙ、Ｄ、Ｒ、およびＬの間で、３：１：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第１２の残基が、Ｅ、Ｒ、Ｓ、ＹおよびＬの間で、３：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第１３の残基が、Ｙ、Ｓ、Ｄ、ＲおよびＬの間で、３：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第１４の残基が、Ｆ、Ｙ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、およびＬの間で、３：１：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第１５の残基が、Ｑ、Ｅ、Ｒ、Ｓ、Ｙ、およびＬの間で、３：１：１：１：１：１の比率で変化し、
該ＨＣ ＣＤＲ３の第１６の残基が、Ｈ、Ｄ、Ｒ、Ｓ、ＹおよびＬの間で、３：１：１：１：１：１の比率で変化するライブラリ。
【請求項１９】
ＦＲ３が前記ＣＤＲ３のアミノ末端に位置し、該ＦＲ３の最後の残基が、ＫおよびＲの間で、３：１の比率で変化する、請求項１９に記載のライブラリ。
【請求項２０】
ヒト抗体関連ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリであって、該ベクターまたは遺伝子パッケージが、Ａ２７軽鎖（ＬＣ）をコードする多彩化されたＤＮＡ配列を含み、該ＬＣのＣＤＲ１が多様化され、
２７位は、約５５％がＱ、それぞれ約９％がＥ、Ｒ、Ｙ、ＳおよびＬであり、
２８位は、約４６％がＳ、それぞれ約９％がＮ、Ｔ、Ｙ、Ｅ、Ｒ、およびＬであり、
３０位は、約５５％がＳ、それぞれ約９％がＤ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、およびＹであり、
３０ａ位は、約４６％がＳ、それぞれ約９％がＧ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｙ、およびＤであり、約８％はアミノ酸を含まず、
３１位は、約４４％がＳ、それぞれ約８％がＤ、Ｆ、Ｇ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、およびＹであり、
３２位は、約４４％がＹ、それぞれ約７％がＦ、Ｄ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、およびＹであり、
３４位は、約７０％がＡ、それぞれ約１５％がＳおよびＹであるライブラリ。
【請求項２１】
ヒト抗体関連ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリであって、該ベクターまたは遺伝子パッケージが、Ａ２７軽鎖（ＬＣ）をコードする多彩化されたＤＮＡ配列を含み、該ＬＣのＣＤＲ２が多様化され、
５０位は、約５５％がＧ、それぞれ約９％がＤ、Ｒ、Ｓ、ＹおよびＬであり、
５３位は、約５２％がＳ、それぞれ約８％がＮ、Ｔ、Ｓ、Ｙ、ＥおよびＲであり、
５６位は、約６４％がＴ、それぞれ約９％がＥ、Ｒ、ＳおよびＹであるライブラリ。
【請求項２２】
ヒト抗体関連ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、提示および発現し、または含み、抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示し、提示および発現し、または含むベクターまたは遺伝子パッケージのライブラリであって、該ベクターまたは遺伝子パッケージが、Ａ２７軽鎖（ＬＣ）をコードする多彩化されたＤＮＡ配列を含み、該ＬＣのＣＤＲ３が多様化され、
９１位は、約６４％がＹ、それぞれ約９％がＦ、Ｅ、ＲおよびＳであり、
９２位は、約５２％がＧ、それぞれ約８％がＡ、Ｄ、Ｒ、Ｓ、ＴおよびＹであり、
９３位は、約５２％がＳ、それぞれ約８％がＤ、Ｆ、Ｎ、Ｒ、ＴおよびＹであり、
９４位は、約５５％がＳ、それぞれ約９％がＷ、Ｅ、Ｒ、ＹおよびＳであり、
９５位は、約６４％がＰ、それぞれ約９％がＥ、Ｒ、ＹおよびＳであり、約８％はアミノ酸を含まず、
９６位は、約５５％がＬ、それぞれ約９％がＥ、Ｒ、Ｐ、ＹおよびＳであるライブラリ。
【請求項２３】
請求項２１に記載のＬＣ ＣＤＲ２の多様性をさらに含む、請求項２０に記載のライブラリ。
【請求項２４】
請求項２２に記載のＬＣ ＣＤＲ３の多様性をさらに含む、請求項２０に記載のライブラリ。
【請求項２５】
請求項２２に記載のＬＣ ＣＤＲ３の多様性をさらに含む、請求項２１に記載のライブラリ。
【請求項２６】
ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３の１つまたは複数において多様性を有する軽鎖をさらに含む、請求項１〜１９のいずれかに記載のライブラリ。
【請求項２７】
請求項２０、２１または２２に記載のＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２またはＬＣ ＣＤＲ３をそれぞれ、またはそれらの組合せを含む、請求項２６に記載のライブラリ。
【請求項２８】
ｄｏｂｂｌｉｎｇを含む、請求項１から２７のいずれか一項に記載のライブラリを調製する方法。
【公表番号】特表２０１１−５１８５６５（Ｐ２０１１−５１８５６５Ａ）
【公表日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０６４８３（Ｐ２０１１−５０６４８３）
【出願日】平成２１年４月２４日（２００９．４．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４１６８８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１３２２８７
【国際公開日】平成２１年１０月２９日（２００９．１０．２９）
【出願人】（５０６０６５９８７）ダイアックス コーポレーション (26)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月２４日（２００９．４．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４１６８８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１３２２８７
【国際公開日】平成２１年１０月２９日（２００９．１０．２９）
【出願人】（５０６０６５９８７）ダイアックス コーポレーション (26)
【Ｆターム（参考）】
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