新規インシュリン誘導体
【発明の詳細な説明】
技術分野 本発明は、改良された性質を有する新規インシュリン誘導体、その製法、並びに該新規インシュリン誘導体を含有する製剤に関する。
発明の背景 糖尿病の治療において、多種類のインシュリン製剤が提案されかつ用いられてきた。改良されたインシュリン製剤は、インシュリン年代の期間中定常的に創案されてきているけれども、未だ改良された性質を有するインシュリン製剤の必要性が存する。
インシュリンの酸性溶液は、作用時間の短い製剤として並びにプロタミンおよび／又は亜鉛と共に持続性製剤としてすでに用いられてきた。しかし、通常の環境のもとでは、pH4.5未満でのインシュリンの化学的安定性は低い。と言うのは、デスアミドインシュリンの形成（サンドバイ、F.,J.Biol.Chem.237（1962）,3406−3411）および共通結合ダイマー（ステイナー等、Diabetes 17（1968）,725−736）が生起する。従って、可溶性の作用時間の短いインシュリン製剤（血流増加剤の添加による）および持続性製剤（プロタミンおよび／又は亜鉛の添加による）を得るために、低pHで安定なインシュリンが望ましい。
本発明の目的は、改善された性質を有するインシュリン誘導体の溶液を供給することにある。
本発明の第二の目的は、改善された安定性を有するインシュリン誘導体の溶液を提供することにある。
本発明の第三の目的は、免疫遺伝学的活性が低いか又はそれを有しないインシュリン誘導体の製剤を得ることにある。
本発明の第四の目的は、pH約2.0〜約8.0、好ましくはpH約2.0〜約4.5およびpH約6.5〜約8.0で安定であるインシュリン製剤を提供することにある。
本発明の第五の目的は、pH約３〜４で改善された安定性を有するインシュリン誘導体の溶液を提供することにある。
本発明の第六の目的は、インシュリン誘導体の持続性溶液を提供することにある。
発明の開示 本発明は、ヒト、豚、家兎およびデス（B30）インシュリンに関し、ここにおいてA21アミノ酸はAla,Gln,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Met,Phe,Ser,Thr,Trp,Try,Val又はhSerによって置換されている。
かかる化合物は次式I:
（式中、INSULはデス（A21）、デス（B30）ヒトインシュリンを表し、A21はINSUL中のCysA20に結合したアミノ酸Ala,Gln,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Met,Phe,Ser,Thr,Trp,Tyr,Val又はhSerの一種を表し、更にB30はINSUL中のLysB29に結合した水素又はアミノ酸Ser,AlaもしくはThrの一種を表す）で表される化合物である。
以下の内容は公知である。すなわち、哺乳動物インシュリンの酸性エタノール抽出中において、多くのダイマーが形成され（シュタイナー）、更にモノデスアミドインシュリンが酸性条件下で形成される（サンドバイ）
今や、驚くべきことに以下の内容が見出だされた。すなわち、そのような好ましくないダイマーの形成は、用いたインシュリンが上記インシュリン誘導体（この誘導体中、AsnA21は上記アミノ酸の一種によって交換されている）の一種である場合に実質的に減少又は殆ど除去される。この置換は、またはモノデスアミドインシュリンの形成をも排除する。
新規インシュリン誘導体は、次の利点を有する：１） 免疫学的ダイマー、すなわち、２個のＡ鎖を介して（AAダイマー）又は１個のＡ鎖を１個のＢ鎖（ABダイマー）のいずれかに結合した共有結合インシュリン分子（ヘルビック、H.J.,Deutsche Wollforschungsinstitut,dissertation,1976）の形成は、実質的に除去される（粗製豚インシュリンのクロマトグラフィー分画、ダイマー含有ｂ−成分は家兎において免疫原性である（Schlichtkrull等、Horm.Metab.Res.Suppl.5（1974）,134−143）。
２） 新規インシュリン誘導体の安定性は、非常に高く、従ってこれらの新規インシュリン誘導体を含有する製剤を室温で長時間保存することは恐らく可能である。これは患者にとって主な利点である。
３） pH約２〜８、好ましくはpH約２〜約4.5の範囲内で更に6.5超でのpH値で新規インシュリン誘導体を含有する溶解製剤を調製することが可能である。
４） pH約３で、実質的に改善された化学安定性を有する、新規インシュリン誘導体を含む製剤を調製することが可能である。
５） 化学的不安定性のため、哺乳動物インシュリンに対し不適当であるpH約３〜４の範囲において、インシュリン誘導体の有用な溶液が約0.05M〜0.5Mの濃度のマグネシウムイオンの存在中で調製である。
６） 吸収を高める化合物を添加することにより、新規インシュリン誘導体を含有する可溶性の速効性製剤を調製することが可能である。
７） 酸性溶液、すなわちpH約2.5〜約４の範囲内のpH値を有する溶液に、亜鉛および／又はプロタミンを添加することによって新規インシュリン誘導体を含有する可溶性遅延製剤を調製することが可能である。
８） 異なったプロフィルを有する新規インシュリン誘導体を含有する製剤を調製することが可能である。
前記式Ｉの化合物は、ペプチド転位反応によって調製することができ、この反応において次式II:
（式中、A21は先に定義した意味であり、Ｘは結合、アミノ酸残基又はGlyA1のアミノ基に対しLysB29のカルボキシル基を架橋するペプチド残基である）で表される生合成前駆体化合物を、米国特許第4,343,898号明細書に記載されると同様に、水および有機溶剤の混合物中触媒としてトリプシン又はトリプシン様酵素を用いて次式III:Ｚ−OR （III）
（式中、ＺはThr,Ala又はSerであり、ここにおいてヒドロキシル基は保護されてることができ、更にＲはカルボキシ保護基（例えばメチル又は第三ブチル）である）
で表されるアミノ化合物と反応させ、しかる後、カルボキシ保護基およびヒドロキシ保護基を除去する。
Ｘは例えば次式IV:−（Qq−Ｋ）ｒ（式中、Ｑはｑ個のアミノ酸を有するペプチド鎖を表し、ｑは０〜33の整数であり、ＫはLys又はArgであり、更にｒは０又は１である）
で表される部分である。
式IIの化合物は、ヨーロッパ特許出願163,529および214,826に記載された方法と類似の方法で調製できる。この方法により、式IIを有する化合物をコードするDNA−配列が適当な発現ベクターに挿入され、該ベクターは適当な酵母株に移送されると、正しく位置決めされたジスルフィド架橋を有する所望化合物を発現しうる。発現された生成物は、次いで細胞から分泌されているか否かに応じて細胞又は培養ブロスから単離される。
中性pHで、式Ｉの化合物はヒトインシュリンと同じ電荷を有する。溶液中、式Ｉの化合物はヘキサマーとして存在する。
本発明による特異的な好ましい化合物の例は、次の通りである:GlyA21ヒトインシュリン、AlaA21ヒトインシュリン、SerA21ヒトインシュリン、ThrA21ヒトインシュリン、hSerA21ヒトインシュリン、GlyA21豚インシュリン、AlaA21豚インシュリン、SerA21豚インシュリンおよびThrA21豚インシュリンである。
本発明のインシュリン製剤は、わずかに酸性条件での水性媒質中に式Ｉの化合物を、例えば約240〜約60nモル／■の濃度に溶解することにより調製できる。
水性媒質は、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム又はグリセロールを添加して等張にすることができる。
もし接続性製剤が要求される場合、上記等張化剤を、亜鉛塩又は亜鉛塩の混合物により式Ｉの化合物のｎモル当たり約５μｇまでのZn2+濃度で一部又は完全に置換できる。
更に、以下の内容が見出だされた。すなわち、多くのマグネシウム塩はpH約４〜約6.2でインシュリンに対する可溶化作用並びにインシュリンの吸収に対する増強作用を有する。マグネシウム塩の種々の混合物が同様の効果を有する。従って、次のように結論づけられる。一定濃度のマグネシウムイオンの存在は、約４〜約6.2のpH値でインシュリンの溶解性並びに吸収速度に対する臨界的パラメターである。適用可能なマグネシウムイオン濃度の範囲は、約0.005M〜約0.5M、好ましくは約0.05M超である。上限はある場合において（例えば腹腔内浸剤に対し）等張を幾分超えることがもしも許容できると仮定することから幾分任意に選択される。
本発明の好ましい態様によれば、製剤は約0.08M〜約0.3Mの濃度のマグネシウムイオンを有する。
更に以下の内容が見出だされた。すなわち、本発明のインシュリン誘導体の持続性（又は更に持続性）製剤は、プロタミンを上述の製剤、すなわち、亜鉛イオンおよびマグネシウムイオンを有しない製剤、亜鉛イオンおよびマグネシウムイオンを有する製剤に添加すると、得られる。用いるプロタミンの量はインシュリン基準（重量／重量）で約５％〜約50％、好ましくは約８％〜約40％、更に好ましくは約10％〜約30％である。
吸収性を増加したインシュリン製剤はまたは、インシュリンの水溶液にアルギニン又はリシンを添加することにより得ることもできる。アミノ酸の好ましい濃度は、約0.01M〜約0.2Mである。
インシュリン製剤は、更に例えばアセテートおよびシトレート並びに保存剤、例えばフェノール、ｍ−クレゾールおよびメチルパラベンを含有できる。溶液のpHは所望の値に調節され、インシュリン製剤は、殺菌ろかにより殺菌される。
pH3〜6.2を有する本発明をインシュリン溶液はまた、ポンプによる注入の目的に対し特に有用である。と言うのは、カテーチルを介しての二酸化炭素拡散によるインシュリンの沈殿がないからである。このような沈殿は、中性注入溶液では時おり観察され、そして二酸化炭素によって引きおこされるpH値の低下に寄因するものと信じられている。
アミノ酸残基に対し本発明で用られる略記号は、J.Biol.Chem.243（1968）,3558頁で記載されたものである。本発明で述べられているアミノ酸は、Ｌ配置である。本発明に関する限り、語句「インシュリン」は複数の又は一般的意味で用いられる場合、天然のインシュリンおよびインシュリン誘導体の双方をも含むものと意図されている。GlyA21ヒトインシュリンは、AsnA21がGlyによって交換されているとヒトインシュリンでありかつ同様の名称に対し同様である。
本発明のインシュリン製剤は、糖尿病の治療に用いることができる。本発明の用量は、注射用の公知のインシュリン製剤の用量の選択にするのと同様に医者により選択されることが望まれる。
本発明で述べる特徴の組み合わせ又は新規特徴は、本発明に対し必須と考えられる。
例１GlyA21ヒトインシュリンの調製 GlyA21ヒトインシュリンを、次式：
（式中、架橋ペプチドの末端AlaはLysB29のカルボキシル基に結合しており、さらにLysはGlyA21のアミノ基に結合している）
として表すことのできる式IIに係る化合物を、Thr−OMe（レートレオニンメチルエステル）を用いてペプチド転位反応させ、次いでエステル基を水性水酸化ナトリウムで加水分解することにより調製した。すなわち、100mgの式Ｖの化合物を10Mの酢酸0.5mlに溶解し、次いでN,N−ジメチルアセトアミドに溶解した2MのThr−OMe 1mlを添加した。混合物を、12℃に冷却した。0.05Mの酢酸カルシウム0.2mlに溶解した10mgのトリプシンを添加した。12℃で48時間後、20mlのアセトンを添加してタンパク質を沈殿させた。出発物質のGlyA21−（Thr−OMe）B30への変換は、HPLCにより88％であった。
250mgのGlyA21−（Thr−OMe）B30ヒトインシュリンを、25mlの水に懸濁させ、次いでpH10.0に1Nの水酸化ナトリウム溶液を添加して溶解した。pH値を25℃で24時間10.0に保持する。得られたインシュリン誘導体を、2gの塩化ナトリウム、350mgの酢酸ナトリウム三水和物および2.5mgの酢酸亜鉛二水和物を添加して結晶化させ、次いで1N塩酸を添加してpH5.52を得た。４℃で24時間後、結晶物質を遠心分離により単離し、3mlの水で洗い、遠心分離により単離し、真空下で乾燥する。収率:GlyA21ヒトインシュリン210mg。
式Ｖの化合物は、ヨーロッパ特許出願214,826の例２と同様の方法で調製した。
例２式Ｉの化合物の注射用溶液の調製 0.5％の亜鉛を含有するGlyA21ヒトインシュリン10μmolを、塩酸（1Nの80μｌ）を含有する水（5ml）に溶解し、次いでフェノール（65mg）およびグリセロール（400mg）を含有する水溶液（10ml）を添加する。溶液のpH値を、水酸化ナトリウム溶液により、3.0に調節し、全量を水で25mlに調節する。得られた溶液を減菌ろ過し、引き続き無菌的にバイアル（5ml）に移す。
例３持続作用を有するGlyA21ヒトインシュリンの可溶性製剤 10μmolのGlyA21ヒトインシュリン（亜鉛なし）を水（5ml）に溶解する。この溶液に、塩酸（1Nの80μｌ）および塩化亜鉛（0.6Mの100μｌ）を添加し、次いで硫酸プロタミン（37mg）、ｍ−クレゾール（50mg）および塩化ナトリウム（200mg）を含有する水溶液（15ml）を添加する。pHを水酸化ナトリウム溶液で3.5に調節し、全量を水で25mlに調節する。最後に、溶液を■過して滅菌し、滅菌バイアルに無菌的に移す。
豚に皮下投与後の吸収状態は、周知のインシュリン懸濁液プロタファン（商標）HR 100IU/mlのそれに匹敵することが判明した。
例４ 速効性を有するGlyA21ヒトインシュリンの可溶性製剤 15μmolのGlyA21ヒトインシュリン（亜鉛なし）を水（10ml）に溶解する。この溶液に、塩酸（1Nの40μｌ）および塩化マグネシウム（1Mの2.6ml）を添加し、次いでベンジルアルコール（0.3Mの8ml）を添加する。pHを水酸化ナトリウム溶液で5.7に調節し、全量を水で2.5mlに調節する。最後に、溶液を■過して滅菌し、滅菌バイアルに無菌的に移す。
例５製剤中のGlyA21ヒトインシュリンの化学的安定性 0.24mMのGlyA21ヒトインシュリン（亜鉛なし）、0.26％（w/v）のフェノールおよび1.6％（w/v）のグリセロールを含有する三種の製剤を調製し、それらのpH値をそれぞれ3.0,4.0、および5.0に調節した。
対照として同じ組成を有するヒトインシュリン製剤を用い45℃で２週間保存後サンプルを分析した。
第１表は、HPSEC（高性能サイズ排除クロマトグラフィー）によって測定されるようなインシュリン二量化および重合生成物の含量を示す。
第２表は、DISC PAGE（ポリアクリルアミドゲルエレクロトフォレシス）によって測定したインシュリン酸アミド加水分解の含量を示す。
例６GlyA21ヒトインシュリンの生物学的効力 GlyA21ヒトインシュリンの効力に関し、英国ファルマコピア（1980版）による研究では、これはヒトインシュリンの効力の約85％であった。治療目的に関する用量範囲内で、毒性の発現は観察されなかった。
例７更に持続作用を有するGlyA21ヒトインシュリンの可溶性製剤 15μmolのGlyA21ヒトインシュリン（亜鉛なし）を水（5ml）に溶解する。この溶液に、塩酸（1Nの80μｌ）および塩化亜塩（0.6Mの100μｌ）を添加し、次いで硫酸プロタミン（37mg）、ｍ−クレゾール（50mg）および塩化マグネシウム（200mg）を含有する水性溶液（15ml）を添加する。pHを3.5に調節し、全量を水で25mlに調節する。
豚に皮下投与後のこの製剤の吸収は、周知のインシュリン懸濁液プロタファン（商標）HM 100IU/mlのそれよりも実質的により遅いことが判明した。
技術分野 本発明は、改良された性質を有する新規インシュリン誘導体、その製法、並びに該新規インシュリン誘導体を含有する製剤に関する。
発明の背景 糖尿病の治療において、多種類のインシュリン製剤が提案されかつ用いられてきた。改良されたインシュリン製剤は、インシュリン年代の期間中定常的に創案されてきているけれども、未だ改良された性質を有するインシュリン製剤の必要性が存する。
インシュリンの酸性溶液は、作用時間の短い製剤として並びにプロタミンおよび／又は亜鉛と共に持続性製剤としてすでに用いられてきた。しかし、通常の環境のもとでは、pH4.5未満でのインシュリンの化学的安定性は低い。と言うのは、デスアミドインシュリンの形成（サンドバイ、F.,J.Biol.Chem.237（1962）,3406−3411）および共通結合ダイマー（ステイナー等、Diabetes 17（1968）,725−736）が生起する。従って、可溶性の作用時間の短いインシュリン製剤（血流増加剤の添加による）および持続性製剤（プロタミンおよび／又は亜鉛の添加による）を得るために、低pHで安定なインシュリンが望ましい。
本発明の目的は、改善された性質を有するインシュリン誘導体の溶液を供給することにある。
本発明の第二の目的は、改善された安定性を有するインシュリン誘導体の溶液を提供することにある。
本発明の第三の目的は、免疫遺伝学的活性が低いか又はそれを有しないインシュリン誘導体の製剤を得ることにある。
本発明の第四の目的は、pH約2.0〜約8.0、好ましくはpH約2.0〜約4.5およびpH約6.5〜約8.0で安定であるインシュリン製剤を提供することにある。
本発明の第五の目的は、pH約３〜４で改善された安定性を有するインシュリン誘導体の溶液を提供することにある。
本発明の第六の目的は、インシュリン誘導体の持続性溶液を提供することにある。
発明の開示 本発明は、ヒト、豚、家兎およびデス（B30）インシュリンに関し、ここにおいてA21アミノ酸はAla,Gln,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Met,Phe,Ser,Thr,Trp,Try,Val又はhSerによって置換されている。
かかる化合物は次式I:
（式中、INSULはデス（A21）、デス（B30）ヒトインシュリンを表し、A21はINSUL中のCysA20に結合したアミノ酸Ala,Gln,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Met,Phe,Ser,Thr,Trp,Tyr,Val又はhSerの一種を表し、更にB30はINSUL中のLysB29に結合した水素又はアミノ酸Ser,AlaもしくはThrの一種を表す）で表される化合物である。
以下の内容は公知である。すなわち、哺乳動物インシュリンの酸性エタノール抽出中において、多くのダイマーが形成され（シュタイナー）、更にモノデスアミドインシュリンが酸性条件下で形成される（サンドバイ）
今や、驚くべきことに以下の内容が見出だされた。すなわち、そのような好ましくないダイマーの形成は、用いたインシュリンが上記インシュリン誘導体（この誘導体中、AsnA21は上記アミノ酸の一種によって交換されている）の一種である場合に実質的に減少又は殆ど除去される。この置換は、またはモノデスアミドインシュリンの形成をも排除する。
新規インシュリン誘導体は、次の利点を有する：１） 免疫学的ダイマー、すなわち、２個のＡ鎖を介して（AAダイマー）又は１個のＡ鎖を１個のＢ鎖（ABダイマー）のいずれかに結合した共有結合インシュリン分子（ヘルビック、H.J.,Deutsche Wollforschungsinstitut,dissertation,1976）の形成は、実質的に除去される（粗製豚インシュリンのクロマトグラフィー分画、ダイマー含有ｂ−成分は家兎において免疫原性である（Schlichtkrull等、Horm.Metab.Res.Suppl.5（1974）,134−143）。
２） 新規インシュリン誘導体の安定性は、非常に高く、従ってこれらの新規インシュリン誘導体を含有する製剤を室温で長時間保存することは恐らく可能である。これは患者にとって主な利点である。
３） pH約２〜８、好ましくはpH約２〜約4.5の範囲内で更に6.5超でのpH値で新規インシュリン誘導体を含有する溶解製剤を調製することが可能である。
４） pH約３で、実質的に改善された化学安定性を有する、新規インシュリン誘導体を含む製剤を調製することが可能である。
５） 化学的不安定性のため、哺乳動物インシュリンに対し不適当であるpH約３〜４の範囲において、インシュリン誘導体の有用な溶液が約0.05M〜0.5Mの濃度のマグネシウムイオンの存在中で調製である。
６） 吸収を高める化合物を添加することにより、新規インシュリン誘導体を含有する可溶性の速効性製剤を調製することが可能である。
７） 酸性溶液、すなわちpH約2.5〜約４の範囲内のpH値を有する溶液に、亜鉛および／又はプロタミンを添加することによって新規インシュリン誘導体を含有する可溶性遅延製剤を調製することが可能である。
８） 異なったプロフィルを有する新規インシュリン誘導体を含有する製剤を調製することが可能である。
前記式Ｉの化合物は、ペプチド転位反応によって調製することができ、この反応において次式II:
（式中、A21は先に定義した意味であり、Ｘは結合、アミノ酸残基又はGlyA1のアミノ基に対しLysB29のカルボキシル基を架橋するペプチド残基である）で表される生合成前駆体化合物を、米国特許第4,343,898号明細書に記載されると同様に、水および有機溶剤の混合物中触媒としてトリプシン又はトリプシン様酵素を用いて次式III:Ｚ−OR （III）
（式中、ＺはThr,Ala又はSerであり、ここにおいてヒドロキシル基は保護されてることができ、更にＲはカルボキシ保護基（例えばメチル又は第三ブチル）である）
で表されるアミノ化合物と反応させ、しかる後、カルボキシ保護基およびヒドロキシ保護基を除去する。
Ｘは例えば次式IV:−（Qq−Ｋ）ｒ（式中、Ｑはｑ個のアミノ酸を有するペプチド鎖を表し、ｑは０〜33の整数であり、ＫはLys又はArgであり、更にｒは０又は１である）
で表される部分である。
式IIの化合物は、ヨーロッパ特許出願163,529および214,826に記載された方法と類似の方法で調製できる。この方法により、式IIを有する化合物をコードするDNA−配列が適当な発現ベクターに挿入され、該ベクターは適当な酵母株に移送されると、正しく位置決めされたジスルフィド架橋を有する所望化合物を発現しうる。発現された生成物は、次いで細胞から分泌されているか否かに応じて細胞又は培養ブロスから単離される。
中性pHで、式Ｉの化合物はヒトインシュリンと同じ電荷を有する。溶液中、式Ｉの化合物はヘキサマーとして存在する。
本発明による特異的な好ましい化合物の例は、次の通りである:GlyA21ヒトインシュリン、AlaA21ヒトインシュリン、SerA21ヒトインシュリン、ThrA21ヒトインシュリン、hSerA21ヒトインシュリン、GlyA21豚インシュリン、AlaA21豚インシュリン、SerA21豚インシュリンおよびThrA21豚インシュリンである。
本発明のインシュリン製剤は、わずかに酸性条件での水性媒質中に式Ｉの化合物を、例えば約240〜約60nモル／
水性媒質は、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム又はグリセロールを添加して等張にすることができる。
もし接続性製剤が要求される場合、上記等張化剤を、亜鉛塩又は亜鉛塩の混合物により式Ｉの化合物のｎモル当たり約５μｇまでのZn2+濃度で一部又は完全に置換できる。
更に、以下の内容が見出だされた。すなわち、多くのマグネシウム塩はpH約４〜約6.2でインシュリンに対する可溶化作用並びにインシュリンの吸収に対する増強作用を有する。マグネシウム塩の種々の混合物が同様の効果を有する。従って、次のように結論づけられる。一定濃度のマグネシウムイオンの存在は、約４〜約6.2のpH値でインシュリンの溶解性並びに吸収速度に対する臨界的パラメターである。適用可能なマグネシウムイオン濃度の範囲は、約0.005M〜約0.5M、好ましくは約0.05M超である。上限はある場合において（例えば腹腔内浸剤に対し）等張を幾分超えることがもしも許容できると仮定することから幾分任意に選択される。
本発明の好ましい態様によれば、製剤は約0.08M〜約0.3Mの濃度のマグネシウムイオンを有する。
更に以下の内容が見出だされた。すなわち、本発明のインシュリン誘導体の持続性（又は更に持続性）製剤は、プロタミンを上述の製剤、すなわち、亜鉛イオンおよびマグネシウムイオンを有しない製剤、亜鉛イオンおよびマグネシウムイオンを有する製剤に添加すると、得られる。用いるプロタミンの量はインシュリン基準（重量／重量）で約５％〜約50％、好ましくは約８％〜約40％、更に好ましくは約10％〜約30％である。
吸収性を増加したインシュリン製剤はまたは、インシュリンの水溶液にアルギニン又はリシンを添加することにより得ることもできる。アミノ酸の好ましい濃度は、約0.01M〜約0.2Mである。
インシュリン製剤は、更に例えばアセテートおよびシトレート並びに保存剤、例えばフェノール、ｍ−クレゾールおよびメチルパラベンを含有できる。溶液のpHは所望の値に調節され、インシュリン製剤は、殺菌ろかにより殺菌される。
pH3〜6.2を有する本発明をインシュリン溶液はまた、ポンプによる注入の目的に対し特に有用である。と言うのは、カテーチルを介しての二酸化炭素拡散によるインシュリンの沈殿がないからである。このような沈殿は、中性注入溶液では時おり観察され、そして二酸化炭素によって引きおこされるpH値の低下に寄因するものと信じられている。
アミノ酸残基に対し本発明で用られる略記号は、J.Biol.Chem.243（1968）,3558頁で記載されたものである。本発明で述べられているアミノ酸は、Ｌ配置である。本発明に関する限り、語句「インシュリン」は複数の又は一般的意味で用いられる場合、天然のインシュリンおよびインシュリン誘導体の双方をも含むものと意図されている。GlyA21ヒトインシュリンは、AsnA21がGlyによって交換されているとヒトインシュリンでありかつ同様の名称に対し同様である。
本発明のインシュリン製剤は、糖尿病の治療に用いることができる。本発明の用量は、注射用の公知のインシュリン製剤の用量の選択にするのと同様に医者により選択されることが望まれる。
本発明で述べる特徴の組み合わせ又は新規特徴は、本発明に対し必須と考えられる。
例１GlyA21ヒトインシュリンの調製 GlyA21ヒトインシュリンを、次式：
（式中、架橋ペプチドの末端AlaはLysB29のカルボキシル基に結合しており、さらにLysはGlyA21のアミノ基に結合している）
として表すことのできる式IIに係る化合物を、Thr−OMe（レートレオニンメチルエステル）を用いてペプチド転位反応させ、次いでエステル基を水性水酸化ナトリウムで加水分解することにより調製した。すなわち、100mgの式Ｖの化合物を10Mの酢酸0.5mlに溶解し、次いでN,N−ジメチルアセトアミドに溶解した2MのThr−OMe 1mlを添加した。混合物を、12℃に冷却した。0.05Mの酢酸カルシウム0.2mlに溶解した10mgのトリプシンを添加した。12℃で48時間後、20mlのアセトンを添加してタンパク質を沈殿させた。出発物質のGlyA21−（Thr−OMe）B30への変換は、HPLCにより88％であった。
250mgのGlyA21−（Thr−OMe）B30ヒトインシュリンを、25mlの水に懸濁させ、次いでpH10.0に1Nの水酸化ナトリウム溶液を添加して溶解した。pH値を25℃で24時間10.0に保持する。得られたインシュリン誘導体を、2gの塩化ナトリウム、350mgの酢酸ナトリウム三水和物および2.5mgの酢酸亜鉛二水和物を添加して結晶化させ、次いで1N塩酸を添加してpH5.52を得た。４℃で24時間後、結晶物質を遠心分離により単離し、3mlの水で洗い、遠心分離により単離し、真空下で乾燥する。収率:GlyA21ヒトインシュリン210mg。
式Ｖの化合物は、ヨーロッパ特許出願214,826の例２と同様の方法で調製した。
例２式Ｉの化合物の注射用溶液の調製 0.5％の亜鉛を含有するGlyA21ヒトインシュリン10μmolを、塩酸（1Nの80μｌ）を含有する水（5ml）に溶解し、次いでフェノール（65mg）およびグリセロール（400mg）を含有する水溶液（10ml）を添加する。溶液のpH値を、水酸化ナトリウム溶液により、3.0に調節し、全量を水で25mlに調節する。得られた溶液を減菌ろ過し、引き続き無菌的にバイアル（5ml）に移す。
例３持続作用を有するGlyA21ヒトインシュリンの可溶性製剤 10μmolのGlyA21ヒトインシュリン（亜鉛なし）を水（5ml）に溶解する。この溶液に、塩酸（1Nの80μｌ）および塩化亜鉛（0.6Mの100μｌ）を添加し、次いで硫酸プロタミン（37mg）、ｍ−クレゾール（50mg）および塩化ナトリウム（200mg）を含有する水溶液（15ml）を添加する。pHを水酸化ナトリウム溶液で3.5に調節し、全量を水で25mlに調節する。最後に、溶液を
豚に皮下投与後の吸収状態は、周知のインシュリン懸濁液プロタファン（商標）HR 100IU/mlのそれに匹敵することが判明した。
例４ 速効性を有するGlyA21ヒトインシュリンの可溶性製剤 15μmolのGlyA21ヒトインシュリン（亜鉛なし）を水（10ml）に溶解する。この溶液に、塩酸（1Nの40μｌ）および塩化マグネシウム（1Mの2.6ml）を添加し、次いでベンジルアルコール（0.3Mの8ml）を添加する。pHを水酸化ナトリウム溶液で5.7に調節し、全量を水で2.5mlに調節する。最後に、溶液を
例５製剤中のGlyA21ヒトインシュリンの化学的安定性 0.24mMのGlyA21ヒトインシュリン（亜鉛なし）、0.26％（w/v）のフェノールおよび1.6％（w/v）のグリセロールを含有する三種の製剤を調製し、それらのpH値をそれぞれ3.0,4.0、および5.0に調節した。
対照として同じ組成を有するヒトインシュリン製剤を用い45℃で２週間保存後サンプルを分析した。
第１表は、HPSEC（高性能サイズ排除クロマトグラフィー）によって測定されるようなインシュリン二量化および重合生成物の含量を示す。
第２表は、DISC PAGE（ポリアクリルアミドゲルエレクロトフォレシス）によって測定したインシュリン酸アミド加水分解の含量を示す。
例６GlyA21ヒトインシュリンの生物学的効力 GlyA21ヒトインシュリンの効力に関し、英国ファルマコピア（1980版）による研究では、これはヒトインシュリンの効力の約85％であった。治療目的に関する用量範囲内で、毒性の発現は観察されなかった。
例７更に持続作用を有するGlyA21ヒトインシュリンの可溶性製剤 15μmolのGlyA21ヒトインシュリン（亜鉛なし）を水（5ml）に溶解する。この溶液に、塩酸（1Nの80μｌ）および塩化亜塩（0.6Mの100μｌ）を添加し、次いで硫酸プロタミン（37mg）、ｍ−クレゾール（50mg）および塩化マグネシウム（200mg）を含有する水性溶液（15ml）を添加する。pHを3.5に調節し、全量を水で25mlに調節する。
豚に皮下投与後のこの製剤の吸収は、周知のインシュリン懸濁液プロタファン（商標）HM 100IU/mlのそれよりも実質的により遅いことが判明した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】次式I:
（式中、INSULはデス（A21）、デス（B30）ヒトインシュリンを表わす）
で表されるインシュリン誘導体であって、A21がINSUL中のCysA20に結合したアミノ酸Ala,Gln,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Met,Phe,Ser,Thr,Trp,Tyr,Val又はhSerの一種を表し、更にB30はINSUL中のLysB29に結合した水素又はアミノ酸Ser,AlaもしくはThrの一種を表す、前記インシュリン誘導体。
【請求項２】A21がPheとは異なっている、請求の範囲第１項記載のインシュリン誘導体。
【請求項３】A21がGly,Ala,Ser,Thr、又はhSerを表し、B30がAla、又はThrを表す、請求の範囲第１項記載のインシュリン誘導体。
【請求項４】請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項で定義した意味を有する請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項記載の式Ｉの化合物を含有することを特徴とする、製剤。
【請求項５】可溶性である、請求の範囲第４項記載の製剤。
【請求項６】吸収を促進する化合物を含有する、請求の範囲第５項記載の製剤。
【請求項７】前記化合物がマグネシウム塩である、請求の範囲第６項記載の製剤。
【請求項８】３〜４の範囲内のpH値で溶液であり、更に0.005M〜0.5Mの濃度でマグネシウムイオンを含有し、更に該製剤が式Ｉ（式中、A21はGlnとは異なる）の化合物を含有する、請求の範囲第７項記載の製剤。
【請求項９】前記化合物が、アルギニン又はリシンである、請求の範囲第６項記載の製剤。
【請求項１０】亜鉛イオンおよび／又はプロタミンを含有する、請求の範囲第4,5,7,8又は９項のいずれかに記載の製剤。
【請求項１１】2.0〜８の範囲内のpH値を有する、請求の範囲第４〜第10項のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１２】2.5〜4.5又は6.5〜8.0の範囲内のpH値を有する、請求の範囲第11項記載の製剤。
【請求項１３】請求の範囲第１項記載のインシュリン誘導体の調整方法であって、次式II:
（式中、A21は請求の範囲第１項で定義した意味であり、更にＸは結合、アミノ酸残基又はGlyA1のアミノ基に対しLysB29のカルボキシル基を架橋するペプチド残基である）
で表される生合成前駆体化合物を、水および有機溶剤の混合物中触媒としてトリプシン又はトリプシン様酵素を用いて次式III:Ｚ−OR （III） （式中、ＺはThr,Ala又はSerであり、ここにおいてヒドロキシル基は保護されることができ、更にＲはカルボキシ保護基である）で表されるアミノ化合物と反応させ、しかる後、カルボキシ保護基およびヒドロキシ保護を除去する、前記方法。
【請求項１４】前記Ｘが次式IV:−（Qq−Ｋ）ｒ−（式中、Ｑはｑ個のアミノ酸を有するペプチド鎖を表し、ｑは０〜33の整数であり、ＫはLys又はArgであり、更にｒは０又は１である）
で表される部分である請求の範囲第13項記載の方法。
【請求項１】次式I:
（式中、INSULはデス（A21）、デス（B30）ヒトインシュリンを表わす）
で表されるインシュリン誘導体であって、A21がINSUL中のCysA20に結合したアミノ酸Ala,Gln,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Met,Phe,Ser,Thr,Trp,Tyr,Val又はhSerの一種を表し、更にB30はINSUL中のLysB29に結合した水素又はアミノ酸Ser,AlaもしくはThrの一種を表す、前記インシュリン誘導体。
【請求項２】A21がPheとは異なっている、請求の範囲第１項記載のインシュリン誘導体。
【請求項３】A21がGly,Ala,Ser,Thr、又はhSerを表し、B30がAla、又はThrを表す、請求の範囲第１項記載のインシュリン誘導体。
【請求項４】請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項で定義した意味を有する請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項記載の式Ｉの化合物を含有することを特徴とする、製剤。
【請求項５】可溶性である、請求の範囲第４項記載の製剤。
【請求項６】吸収を促進する化合物を含有する、請求の範囲第５項記載の製剤。
【請求項７】前記化合物がマグネシウム塩である、請求の範囲第６項記載の製剤。
【請求項８】３〜４の範囲内のpH値で溶液であり、更に0.005M〜0.5Mの濃度でマグネシウムイオンを含有し、更に該製剤が式Ｉ（式中、A21はGlnとは異なる）の化合物を含有する、請求の範囲第７項記載の製剤。
【請求項９】前記化合物が、アルギニン又はリシンである、請求の範囲第６項記載の製剤。
【請求項１０】亜鉛イオンおよび／又はプロタミンを含有する、請求の範囲第4,5,7,8又は９項のいずれかに記載の製剤。
【請求項１１】2.0〜８の範囲内のpH値を有する、請求の範囲第４〜第10項のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１２】2.5〜4.5又は6.5〜8.0の範囲内のpH値を有する、請求の範囲第11項記載の製剤。
【請求項１３】請求の範囲第１項記載のインシュリン誘導体の調整方法であって、次式II:
（式中、A21は請求の範囲第１項で定義した意味であり、更にＸは結合、アミノ酸残基又はGlyA1のアミノ基に対しLysB29のカルボキシル基を架橋するペプチド残基である）
で表される生合成前駆体化合物を、水および有機溶剤の混合物中触媒としてトリプシン又はトリプシン様酵素を用いて次式III:Ｚ−OR （III） （式中、ＺはThr,Ala又はSerであり、ここにおいてヒドロキシル基は保護されることができ、更にＲはカルボキシ保護基である）で表されるアミノ化合物と反応させ、しかる後、カルボキシ保護基およびヒドロキシ保護を除去する、前記方法。
【請求項１４】前記Ｘが次式IV:−（Qq−Ｋ）ｒ−（式中、Ｑはｑ個のアミノ酸を有するペプチド鎖を表し、ｑは０〜33の整数であり、ＫはLys又はArgであり、更にｒは０又は１である）
で表される部分である請求の範囲第13項記載の方法。
【特許番号】第２６０６９１５号
【登録日】平成９年（１９９７）２月１３日
【発行日】平成９年（１９９７）５月７日
【国際特許分類】
【出願番号】特願昭６３−５０２３２５
【出願日】昭和６３年（１９８８）２月２４日
【公表番号】特表平１−５０２４３４
【公表日】平成１年（１９８９）８月２４日
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＤＫ８８／０００３３
【国際公開番号】ＷＯ８８／０６５９９
【国際公開日】昭和６３年（１９８８）９月７日
【出願人】（９９９９９９９９９）ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ
【登録日】平成９年（１９９７）２月１３日
【発行日】平成９年（１９９７）５月７日
【国際特許分類】
【出願日】昭和６３年（１９８８）２月２４日
【公表番号】特表平１−５０２４３４
【公表日】平成１年（１９８９）８月２４日
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＤＫ８８／０００３３
【国際公開番号】ＷＯ８８／０６５９９
【国際公開日】昭和６３年（１９８８）９月７日
【出願人】（９９９９９９９９９）ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ
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