新規蛍光標識ポリペプチドを用いたバレット食道における異形成の標的検出
本発明は、バレット食道における異形成の検出に使用するための組成物および方法を対象とする。また、本開示は、本明細書に開示された組成物をヒトに投与する方法を考察する。したがって、いくつかの態様において、本明細書に開示された組成物および薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物が提供される。いくつかの態様において、組成物とは本明細書において提供される場合、追加部分をさらに含み、様々な態様において、その部分は化学療法剤、治療剤、ポリペプチド、抗体、核酸、小分子またはその組み合わせからなる群から選ばれる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
【０００２】
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下、２００９年４月１８日に出願された米国特許仮出願第６１／１７０，６１４号、および２０１０年２月８日に出願された米国特許仮出願第６１／３０２，３８８号の優先権の利益を主張する。
政府権益の声明
【０００３】
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）により与えられた助成金番号Ｒ０３ ＣＡ０９６７５２、ＣＡ１３６４２９、およびＣＡ０９３９９０の下、政府支援により行われた。政府は本発明における一定の権利を有する。
技術分野
【０００４】
本発明は、バレット食道における異形成の検出に使用するための組成物および方法を対象とする。
【背景技術】
【０００５】
先進諸国において、食道の腺癌は他のいかなる癌よりも早い速度で増大している。この疾患は罹患率および死亡率の大きな原因であり、バレット食道は食道粘膜の内膜の変化に起因する、知られている前駆状態であり、腸上皮化生として組織学的に確認されるサーモン色の粘膜として、内視鏡で識別することができる。バレット粘膜の発症は、中心性肥満に関連する酸および胆汁の逆流に関連しており、通常の食道よりも約３０〜１２５倍高く癌へ進行する相対リスクを有する。バレット粘膜は、一連の分子および細胞変化を通じて正常組織から癌に移行する。組織学分類では、扁平上皮、腸上皮化生、低悪性異形成、高悪性異形成、および腺癌を含む段階を通じて進む。癌はまた、年に患者一人に対して１％の割合で腸上皮化生から直接発症する。
【０００６】
従来の白色光内視鏡検査が、バレット食道の癌検診に使用される最も一般的な方法である［非特許文献１］。この様式は、センチメートル規模の寸法で、素早く粘膜表面の範囲を調べるために非常に広い視界にわたって光を集めるために高度な画像光学を用いる。この機能は、実際の時間枠の中で消化管における管腔臓器の内壁を入念に調べるのに必要である。しかしながら、この方法には大きな制約がある。この手法は、構造（解剖学上）の変化を見せるための組織表面からの白色光の反射に依存しており、バレット食道で発症するような扁平異形成の検出には効果的ではない。現行の検診手法および観察手法は医療用内視鏡を用いて行われ、検出および解明が困難な組織内の構造的および形態的変化を可視化することを基にしている。無作為の４像限生体組織検査は検診手法の基準として認められていたが、異形成変化は空間的に不均一に発生することが多いため、この方法は検出率の低さから限定されている［非特許文献２］。
【０００７】
異形成の存在により切除した食道粘膜の組織学的検査は、定性的、自覚的な方法、および病理専門医の中でも、発生した異形成を選別する際の実質的な観察者内および観察者間の変動、分析における患者および医師の確信を制限して、行われる［非特許文献２］。生体標本の誤った診断は、不必要な食道切除術または明らかに癌に進行する恐れがある。腺癌に進行する危険性のある粘膜の自然歴上の現行の組織病理学の予後値におけるこの不透明性により、病理学的評価の新たな基準の形成が求められる［非特許文献３］。さらに、特定の分子標的を阻害することを目的とする新たな治療が、全身毒性を有さない抗腫瘍薬の創薬への幅広い意欲を引き起こし、遺伝子増幅とタンパク質発現間の理解を深める、および標的療法の効果が必要とされている［非特許文献４］。これらの要素は、末期腺癌に伴う低い生存率と相まって、標的のさらなる発展への主な動機、バレット粘膜の検診を改良するための生体内画像戦略、疾患のリスク分類、および癌の治療選択を提供する。
【０００８】
母集団におけるバレット食道の有病率から判断すると、無作為の生検を用いた白色光の内視鏡検査は、癌検診の容認された方法となっている。しかしながら、この方法は、バレット食道で発症するような扁平異形成の検出には効果的ではない。異形成の存在により切除した食道粘膜の組織学的検査は、定性的、自覚的な方法、ならびに病理専門医の中でも、発生した異形成を選別する際の実質的な観察者内および観察者間の変動、分析において患者および医師の確信を制限し、行われるそのため、白色光を用いた現行の観察方法は非特異的であり、サンプリング誤差により限定されるため、食道腺癌の早期発見および予防のために前癌状態の粘膜を局所化する、改善された画像戦略が必要とされる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ． ２００８；１０３：７８８−９７
【非特許文献２】Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １９９３；１０５：４０−５０
【非特許文献３】Ａｐｐｅｌｍａｎ， Ａｒｃｈ Ｐａｔｈｏｌ Ｌａｂ Ｍｅｄ． ２００５；１２９：１７０−３
【非特許文献４】Ｂｒａｂｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ ２００５；１４：２１１３−７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本明細書には、組成物およびバレット食道における異形成の検出のための組成物および方法が記載されている。したがって、一実施形態において、組成物は配列番号１に示されるポリペプチド配列（ＳＮＦＹＭＰＬ）、リンカー配列および検出可能マーカーからなる、または実質的になり、検出可能マーカーはリンカーを通してポリペプチドに結合し、リンカーは正味の中性電荷を有し、リンカーの存在は、リンカーのない場合のバレット食道組織へのポリペプチド配列の検出可能な結合と比較してバレット食道の組織へのポリペプチド配列の検出可能な結合を増加させる。
【００１１】
いくつかの態様において、リンカーの末端アミノ酸はリジンである。さらなる態様において、リンカーは配列番号２（ＧＧＧＳＫ）で示される配列を含む。
【００１２】
いくつかの態様において、検出可能マーカーはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）である。
【００１３】
また、本開示は、本明細書に開示された組成物をヒトに投与する方法を考察する。したがって、いくつかの態様において、本明細書に開示された組成物および薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物が提供される。
【００１４】
いくつかの態様において、組成物とは本明細書において提供される場合、追加部分をさらに含み、様々な態様において、その部分は化学療法剤、治療剤、ポリペプチド、抗体、核酸、小分子またはその組み合わせからなる群から選ばれる。
【００１５】
本開示により、バレット食道細胞を検出するのに有効な量の本明細書に開示の組成物を投与する方法を含む腺癌の発症を検出する方法をさらに提供し、組成物は非癌性細胞に関係するバレット食道細胞に選択的に結合する特性を有し、それによって腺癌細胞発生の開始を検出する。
【００１６】
本開示の追加態様は、ヒトにおける異形成バレット食道治療の有効性を判断する方法であって、異形成バレット食道を標識するのに有効な量の本開示の組成物をヒトに投与するステップと、本開示の組成物で標識された細胞の第１の量を可視化するステップと、第１の量を、本開示の組成物で標識された細胞の以前に可視化された第２の量と比較するステップとを含み、標識された細胞の以前に可視化された量と比べて、標識された細胞の第１の量の減少は、効果的な治療を示す。
【００１７】
さらなる態様は、本開示の組成物により標識された細胞の生検を得ることを含む方法を提供する。
【００１８】
いくつかの態様において、組成物が異形成バレット食道の臨床的発症後に投与される。
【００１９】
本開示は、本開示の薬学的組成物、組成物の使用のための方法および薬学的組成物を患者に投与するためのデバイスを含む、キットをさらに提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１ａ】結合ファージ集計。「ＳＮＦＹＭＰＬ」−ファージおよび野生型ファージ（挿入無し）はＯＥ３３食道腺癌細胞およびＱ−ｈＴＥＲＴ腸上皮化生細胞で培養され、結合ファージは回収され力価を測定した。ＯＥ３３細胞に結合した「ＳＮＦＹＭＰＬ」−ファージの数は、野生型ファージの６．５×１０３ｐｆｕに比較して約１．６×１０６ｐｆｕであった。一方、Ｑ−ｈＴＥＲＴ細胞に結合したファージの数は、桁が少なくそれぞれ５．８×１０４および１．７×１０４（Ｐ＜０．０１）であった。
【図１ｂ】結合アッセイ用ＥＬＩＳＡ。「ＳＮＦＹＭＰＬ」−ファージのＯＥ３３食道腺癌細胞への結合のためのＥＬＩＳＡ上の光学濃度は、１．２３であり野生型ファージの０．７２およびファージ無し（背景）の０．７３とそれぞれ比較した。Ｑ−ｈＴＥＲＴ細胞が使用された場合、ＥＬＩＳＡ上の光学濃度に違いは観察されていない（Ｐ＜０．０１）。
【００２１】
【図２】競合的阻害研究を表す。「ＳＮＦＹＭＰＬ」−ファージは、ＯＥ３３食道腺癌細胞（１×１０７）で培養され、「ＳＮＦＹＭＰＬ」ペプチドおよびスクランブルペプチド「ＮＬＭＰＹＦＳ」を１００、２００、および４００μＭの濃度で細胞−ファージ混合物に加え、組成物の測定をした。結合ファージは回収され、力価を測定し、「ＳＮＦＹＭＰＬ」は濃度依存的にＯＥ３３細胞に結合するＳＮＦＹＭＰＬ−ファージを大きく阻害することがわかった。一方で、スクランブルペプチド「ＮＬＭＰＹＦＳ」は、標的ペプチド「ＳＮＦＹＭＰＬ」の結合をいかなる濃度（４００μＭ表示）でも阻害しなかった。
【００２２】
【図３】細胞表面標的へのペプチド結合の蛍光画像を示す。蛍光−標識されたペプチド「ＳＮＦＹＭＰＬ」は、ＯＥ３３（食道腺癌）細胞の＞９０％において細胞膜へ結合するのがみられるが、蛍光画像上のＱ−ｈＴＥＲＴ（腸上皮化生）細胞上では見られない。ＯＥ３３の細胞表面への結合に関連する輝度は、Ｑ−ｈＴＥＲＴの輝度２５．７±２．５と比べ、６９±１８であった。ＤＡＰＩ染色法により細胞核の範囲を現し、オーバーレイ画像により細胞表面上に起きた結合が見られる。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
変化した細胞および組織は、全体の形質学的特徴より先に分子変化を十分に発現するため、癌の早期発見をする類のない機会を提供する。食道における疾患検出のためのより高い反応性および特異性は、特有の癌発現分子パターンを標的にした外部からの探針に使用により実現する。次いで、これらの探針は、検出可能マーカーと標識され、癌の早期発見のための組織生検を指針する定期的なスクリーニングの間、内視鏡画像で検出され、粘膜下層浸潤を診断し、治療反応性を観察する。
【００２４】
ポリペプチドは、体内の分子発現を標的にする分子探針として、臨床的使用に大きな可能性を有する。高いクローン多様性、小さいサイズおよび蛍光染料との相互性に加えて、ポリペプチドは速い結合反応速度を示し、スクリーニング手段として臨床的に使用し得る。そればかりでなく、ポリペプチドは、免疫原生のわずかな懸念を有する前悪性（異形成）変化に関わる細胞表面標的に結合するために管腔表面に局所的に投与され得る。
【００２５】
本明細書には、バレット食道における異形成の検出のために使用する組成物および方法が記載されている。この方法は、標識されたポリペプチドを分子探針として、バレット食道癌患者の体内検出用に共焦点蛍光内視鏡検査と組み合わせて利用する。
【００２６】
したがって、一実施形態において、組成物は配列番号１に示されるポリペプチド配列、リンカー配列および検出可能マーカーからなる、または実質的になり、検出可能マーカーはリンカーを通してポリペプチドに結合し、リンカーは正味の中性電荷を有し、リンカーの存在は、リンカーのない場合のバレット食道組織へのポリペプチド配列の検出可能な結合と比較してバレット食道の組織へのポリペプチド配列の検出可能な結合を増加させる。
【００２７】
いくつかの態様において、検出可能な結合は体内で起こる。いくつかの態様において、検出可能な結合は体外で起こる。さらなる態様において、検出可能な結合は体内の原位置で起こる。体内の原位置とは「自然な位置または通常の位置」を意味する。例えば限定されないが、全臓器が無傷のまま潅流下で細胞を検査することは原位置検査である。これは生物から臓器が摘出されているので体内にはならないが、細胞単体を研究していること（体外実験における一般的なシナリオ）と同様ではないだろう。当業者は、例えば限定されないが、前述の各適用において本開示の組成物が有用であることを理解するであろう。
【００２８】
本発明の特定の方法は、ヒトにおける異形成バレット食道治療の有効性を判断する方法であって、異形成バレット食道を標識するのに有効な量の本開示の組成物をヒトに投与するステップと、組成物で標識された細胞の第１の量を可視化するステップと、第１の量を、組成物で標識された細胞の以前に可視化された第２の量と比較するステップと、を含み、標識された細胞の以前に可視化された量と比べて、標識された細胞の第１の量の減少は効果的な治療を示す。これらの態様において、５％の減少は効果的な治療を示す。他の態様において、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、またはそれ以上の減少は効果的な治療を表す。
リンカー
【００２９】
本明細書で用いられている「リンカー」は、本開示のポリペプチドの末端に位置する非荷電アミノ酸配列である。リンカーの存在により、リンカーのない場合のバレット食道組織への検出可能なポリペプチド結合の配列と比較して、バレット食道組織への検出可能なポリペプチド結合の配列を増加させることがわかっている。いくつかの実施形態において、リンカー配列はリジン残基で終端する。様々な態様において、本明細書に記載の検出可能マーカーは、リンカーに結合している。さらなる態様において、リンカー配列はＧＧＧＳＫ（配列番号２）である。さらなる態様において、検出可能マーカーはＦＩＴＣである。本開示により考察される非荷電アミノ酸は、グリシン、セリン、システイン、スレオニン、ヒスチジン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンを含むがこれに限定されない。
【００３０】
いくつかの態様において、リンカーの存在により、リンカーのない場合のバレット食道組織へのポリペプチド配列の検出可能な結合と比較して、バレット食道組織へのポリペプチド配列の検出可能な結合は少なくとも１％増加する。様々な態様において、リンカーのない場合のバレット食道組織へのポリペプチド配列の検出可能な結合と比較して、バレット食道組織へのポリペプチド配列の検出可能な結合の増加は、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、またはそれ以上である。
ポリペプチド
【００３１】
用語「ポリペプチド」は、２〜５０アミノ酸の分子、３〜２０アミノ酸の分子、および６〜１５アミノ酸の分子を意味する。一態様において、本発明により考察されるポリペプチドおよびリンカーは、５アミノ酸長である。様々な態様において、ポリペプチドまたはリンカーは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、またはそれ以上のアミノ酸長である。
【００３２】
典型的なポリペプチドは、当技術分野において既知の方法により無作為に生成され、ポリペプチドライブラリー（例えば限定されないが、ファージディスプレイライブラリー）中で運ばれ、タンパク質の消化または化学的合成により得られる可能性がある。本開示のポリペプチドは、細胞表面標的への優先的結合による選択用のポリペプチドの複合ライブラリーを生成するための組み換えＤＮＡ技術を使用する強力なコンビナトリアル手法である、ファージディスプレイの手法を用いて開発された［Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９０；２４９：３８６−９０．］。フィラメントＭ１３または正２０面体Ｔ７といったバクテリオファージのタンパク膜は、親和結合を達成するために特異的な配列をもつ異なる非常に多数（＞１０９）のポリペプチドを発現するように遺伝子改変される［Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ １９９０；８７：６３７８−８２］。次いで、標的の発現を通して培養された細胞および組織に対するファージライブラリーをバイオパニングすることにより選択が行われる。次いで、これらの候補ファージのＤＮＡ配列が回収され、ポリペプチドの合成に使用される［Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ １９９６；３８０：３６４−６］。
【００３３】
ポリペプチドは、Ｄ型およびＬ型を含み、２つの型の精製したものか混合したもののいずれかである。また本開示により、バレット食道細胞への結合に関する本開示のポリペプチドと競合したポリペプチドも考察される。
【００３４】
特定の態様において、本開示は、培養液中のＯＥ３３ヒト食道腺癌培養細胞株に対するバイオプランニングによるファージディスプレイの手法を使用して特定された２つの７残基ポリペプチド（７−ｍｅｒ）および１つの１２残基ポリペプチド（１２−ｍｅｒ）を提供する。これらのポリペプチド配列は、１）ＳＮＦＹＭＰＬ（配列番号１）、２）ＶＡＴＱＡＹＬ（配列番号３）、および３）ＧＬＫＩＷＳＬＰＰＨＨＧ（配列番号４）である。他の態様において、本明細書に開示のポリペプチドに少なくとも８０％同一であるポリペプチドが提供されている。さらなる態様において、本明細書に開示されたポリペプチドに少なくとも８５％、９０％、９５％、または少なくとも９９％同一のポリペプチドが提供されている。追加のポリペプチドはファージディスプレイを使用して特定され、組成物および本開示の方法において利用され得るということを、当業者であれば理解および認識されるであろう。
【００３５】
一態様において、ポリペプチド配列ＡＳＹＮＹＤＡ（配列番号５）が、本開示により考察される。
【００３６】
本発明のポリペプチドおよびリンカーは、当該技術分野で知られる修正を取り入れることができ、そうした修正の位置および数は、最適な効果を実現するために異なってもよいことが理解されるであろう。
検出可能マーカー
【００３７】
本明細書で用いられている「検出可能マーカー」とは、食道組織への本開示の組成物の結合を特定するために使用できる任意の標識である。検出可能マーカーの例には、限定するものではないが、ポリペプチドの可視化を可能にする蛍光体、化学タグまたはタンパク質タグがある。可視化は、裸眼または装置（例えば限定されないが、内視鏡）で行われてもよいし、代替光またはエネルギー源を要してもよい。
【００３８】
本発明の方法において使用すると考察されている化学タグおよびタンパク質タグである発光体には、これらに限定されないが、ＦＩＴＣ、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｌｉ−Ｃｏｒ、放射性同位元素識別、ビオチン、ルシフェラーゼ、１，８−ＡＮＳ（１−アニリノナフタレン−８−スルホン酸）、１−アニリノナフタレン−８−スルホン酸（１，８−ＡＮＳ）、５−（および−６）−カルボキシ−２´、７´−ジクロロフルオレセインｐＨ９．０、５−ＦＡＭ、ｐＨ９．０、５−ＲＯＸ（５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、トリエチルアンモニウム塩）、５−ＲＯＸ ｐＨ７．０、５−ＴＡＭＲＡ、５−ＴＡＭＲＡ ｐＨ、０，５−ＴＡＭＲＡ−ＭｅＯＨ、６ ＪＯＥ、６，８−ジフルオロ−７−ヒドロキシ−４−メチルクマリンｐＨ９．０、６−カルボキシローダミン６Ｇ ｐＨ７．０、６−カルボキシローダミン６Ｇ、塩酸塩、６−ＨＥＸ、ＳＥ ｐＨ９．０、６−ＴＥＴ、ＳＥ ｐＨ９．０、７−アミノ−４−メチルクマリンｐＨ７．０、７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン、７−ヒドロキシ−４−メチルクマリンｐＨ９．０、アレクサ３５０、アレクサ４０５、アレクサ４３０、アレクサ４８８、アレクサ５３２、アレクサ５４６、アレクサ５５５、アレクサ５６８、アレクサ５９４、アレクサ６４７、アレクサ６６０、アレクサ６８０、アレクサ７００、アレクサフルオル４３０抗体複合体ｐＨ７．２、アレクサフルオル４８８抗体複合体ｐＨ８．０、アレクサフルオル４８８ヒドラジド水、アレクサフルオル５３２抗体複合体ｐＨ７．２、アレクサフルオル５５５抗体複合体ｐＨ７．２、アレクサフルオル５６８抗体複合体ｐＨ７．２、アレクサフルオル６１０Ｒ−フィコエリトリンストレプトアビジンｐＨ７．２、アレクサフルオル６４７抗体複合体ｐＨ７．２、アレクサフルオル６４７Ｒ−フィコエリトリンストレプトアビジンｐＨ７．２、アレクサフルオル６６０抗体複合体ｐＨ７．２、アレクサフルオル６８０抗体複合体ｐＨ７．２、アレクサフルオル７００抗体複合体ｐＨ７．２、アロフィコシアシンｐＨ７．５、ＡＭＣＡ複合体、アミノクマリン、ＡＰＣ（アロフィコシアシン）、Ａｔｔｏ６４７、ＢＣＥＣＦ ｐＨ５．５、ＢＣＥＣＦ ｐＨ９．０、ＢＦＰ（青色蛍光タンパク質）、カルセイン、カルセインｐＨ９．０、カルシウムクリムゾン、カルシウムクリムゾンＣａ２＋、カルシウムグリーン、カルシウムグリーン−１Ｃａ２＋、カルシウムオレンジ、カルシウムオレンジＣａ２＋、カルボキシナフトフルオレセインｐＨ１０．０、カスケードブルー、カスケードブルーＢＳＡｐＨ７．０、カスケードイエロー、カスケードイエロー抗体複合体ｐＨ８．０、ＣＦＤＡ、ＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）、ＣＩ−ＮＥＲＦ ｐＨ６．０、シトリン、クマリン、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、ＣｙＱＵＡＮＴ ＧＲ−ＤＮＡ、ダンシルカダベリン、ダンシルカダベリン、ＭｅＯＨ、ＤＡＰＩ−ＤＮＡ、ダポキシル（２−アミノエチル）スルホンアミド、ＤＤＡＯ ｐＨ９．０、Ｄｉ−８−ＡＮＥＰＰＳ−リピド、ＤｉＩ、ＤｉＯ、ＤＭ−ＮＥＲＦ ｐＨ４．０、ＤＭ−ＮＥＲＦ ｐＨ７．０、ＤｓＲｅｄ、ＤＴＡＦ、ｄトマト、ｅＣＦＰ（強化シアン蛍光タンパク質）、ｅＧＦＰ（強化グリーン蛍光タンパク質）、エオシン、エオシン抗体複合体ｐＨ８．０、エリスロシン−５−イソチオシアネートｐＨ９．０、ｅＹＦＰ（強化イエロー蛍光タンパク質）、ＦＤＡ、ＦＩＴＣ抗体複合体ｐＨ８．０、ＦｌＡｓＨ、フルオ−３、フルオ−３Ｃａ２＋、フルオ−４、フルオロ−ルビー、フルオレセイン、フルオレセイン０．１Ｍ ＮａＯｈ、フルオレセイン抗体複合体ｐＨ８．０、フルオレセインデキストランｐＨ８．０、フルオレセインｐＨ９．０、フルオロ−エメラルド、ＦＭ１−４３、ＦＭ１−４３リピド、ＦＭ４−６４、ＦＭ４−６４、２％ＣＨＡＰＳ、フラレッドＣａ２＋、フラレッド、高Ｃａ、フラレッド、低Ｃａ、フラ−２Ｃａ２＋、フラ−２、フラ−２、ＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）、Ｈｃレッド、インド−１Ｃａ２＋、インド−１、Ｃａ無し、インド−１、Ｃａ飽和、ＪＣ−１、ＪＣ−１ｐＨ８．２、リサミンローダミン、ルシフェルイエロー、ＣＨ、マグネシウムグリーン、マグネシウムグリーンＭｇ２＋、マグネシウムオレンジ、マリーナブルー、ｍＢバナナ、ｍチェリー、ｍハネデュー、ｍプラム、ｍＲＦＰ、ｍストロベリー、ｍタンジェリン、ＮＢＤ−Ｘ、ＮＢＤ−Ｘ、ＭｅＯＨ、ニューロトレース５００／５２５、グリーン蛍光ニッスルステイン−ＲＮＡ、ナイルブルー、ナイルレッド、ナイルレッド−リピド、ニッスル、オレンジグリーン４８８、オレンジグリーン４８８抗体複合体ｐＨ８．０、オレンジグリーン５１４、オレンジグリーン５１４抗体複合体ｐＨ８．０、パシフィックブルー、パシフィックブルー抗体複合体ｐＨ８．０、フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリンｐＨ７．５、ＲｅＡｓＨ、レゾルフィン、レゾルフィンｐＨ９．０、ロード−２、ロード−２Ｃａ２＋、ローダミン、ローダミン１１０、ローダミン１１０ｐＨ７．０、ローダミン１２３、ＭｅＯＨ、ローダミングリーン、ローダミンファロイジンｐＨ７．０、ローダミンレッド−Ｘ抗体複合体ｐＨ８．０、ローダミングリーンｐＨ７．０、ローダミングリーン抗体複合体ｐＨ８．０、サファイア、ＳＢＦＩ−Ｎａ＋、ナトリウムグリーンＮａ＋、スルホローダミン１０１、テトラメチルローダミン抗体複合体ｐＨ８．０、テトラメチルローダミンデキストランｐＨ７．０、およびテキサスレッド−Ｘ抗体複合体ｐＨ７．２、が挙げられる。
【００３９】
本開示により考察される化学タグの例には、限定するものではないが、放射性同位元素識別がある。例えば限定されないが、組成物および本開示の方法に使用されてもよい放射性同位元素識別には、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、３２Ｐ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９５Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１０３Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４０Ｌａ、１４９Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５４−１５９Ｇｄ、１６５Ｄｙ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ、１７５Ｌｕ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１９２Ｉｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、および２１２Ｂｉがある。
【００４０】
体内または体外のいずれかで、本開示の組成物を可視化するために使用できるそうした検出可能マーカーが多くあるということを、当業者は認識するであろう。
追加部分
【００４１】
別の実施形態において、追加部分をさらに含む組成物が提供され、前記組成物は腺癌細胞を検出する特性を有する。様々な態様において、限定されないが、追加部分はポリペプチド、低分子、治療剤、化学療法剤またはそれらの組み合わせである。
【００４２】
本明細書で使用されている「低分子」という用語は、例えば、任意に誘導体化されてもよいペプチドメティックもしくはオリゴヌクレオチド、または天然もしくは合成のいずれかの任意の他の低分子量の有機化合物等の化学化合物を意味する。
【００４３】
「低分子量」とは、分子量が１０００ダルトン未満、主に３００から７００ダルトンを有する化合物を意味する。様々な態様において、低分子量化合物は、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００、約６５０、約７００、約７５０、約８００、約８５０、約９００、約１０００ダルトン、またはそれ以上である。
【００４４】
いくつかの態様において、追加部分はタンパク質治療剤である。タンパク質治療剤は、細胞タンパク質または血中タンパク質ならびにその断片および誘導体を含むがこれに限定されるものではない。さらに他の治療剤は、タンパク質コードポリヌクレオチド、調節ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、および／またはそれ自体調節性であるポリヌクレオチドを含むがこれに限定されるものではない、ポリヌクレオチドを含む。任意で、組成物は、本明細書に記載の化合物の組み合わせを含んでもよい。
【００４５】
様々な態様において、タンパク質治療剤はサイトカインまたは造血因子を含み、ＩＬ−アルファ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ＥＰＯ、インターフェロン−アルファ（ＩＦＮ−アルファ）、コンセンサスインターフェロン、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、アンジオポエチン、例えば、Ａｎｇ−１、Ａｎｇ−２、Ａｎｇ−４、Ａｎｇ−Ｙ、ヒトアンジオポエチン様ポリペプチド、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオゲニン、骨形態形成タンパク質−１、骨形態形成タンパク質−２、骨形態形成タンパク質−３、骨形態形成タンパク質−４、骨形態形成タンパク質−５、骨形態形成タンパク質−６、骨形態形成タンパク質−７、骨形態形成タンパク質−８、骨形態形成タンパク質−９、骨形態形成タンパク質−１０、骨形態形成タンパク質−１１、骨形態形成タンパク質−１２、骨形態形成タンパク質−１３、骨形態形成タンパク質−１４、骨形態形成タンパク質−１５、骨形態形成タンパク質受容体ＩＡ、タンパク質受容体ＩＢ、脳由来神経栄養因子、繊毛神経栄養因子、繊毛神経栄養因子受容体、サイトカイン誘導好中球化学走化因子１、サイトカイン誘導好中球、化学走化因子２α、サイトカイン誘導好中球化学走化因子２β、β内皮細胞成長因子、エンドセリン１、上皮細胞増殖因子、上皮由来好中球誘引剤、線維芽細胞成長因子４、線維芽細胞成長因子５、線維芽細胞成長因子６、線維芽細胞成長因子７、線維芽細胞成長因子８、線維芽細胞成長因子８ｂ、線維芽細胞成長因子８ｃ、線維芽細胞成長因子９、線維芽細胞成長因子１０、線維芽細胞成長因子酸、グリア細胞株由来神経栄養因子受容体α１、細胞株由来神経栄養因子受容体α２、増殖関連タンパク質、増殖関連タンパク質α、増殖関連タンパク質β、増殖関連タンパク質γ、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、インスリン様増殖因子Ｉ、インスリン様増殖因子受容体、インスリン様増殖因子ＩＩ、インスリン様増殖因子結合タンパク質、ケラチン生成細胞増殖因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受容体α、神経成長因子神経成長因子受容体、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、胎盤成長因子、胎盤成長因子２、血小板由来内皮細胞成長因子、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子Ａ鎖、血小板由来増殖因子ＡＡ、血小板由来増殖因子ＡＢ、血小板由来増殖因子Ｂ鎖、血小板由来増殖因子ＢＢ、血小板由来増殖因子受容体α、血小板由来増殖因子受容体β、プレＢ細胞成長刺激因子、幹細胞因子受容体、ＴＮＦ、ＴＮＦ０込み、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、形質転換増殖因子α、形質転換増殖因子β、形質転換増殖因子β１、形質転換増殖因子β１．２、形質転換増殖因子β２、形質転換増殖因子β３、形質転換増殖因子β５、潜在型形質転換増殖因子β１、形質転換増殖因子β結合タンパク質Ｉ、形質転換増殖因子β結合タンパク質ＩＩ、形質転換増殖因子β結合タンパク質ＩＩＩ、腫瘍壊死因子受容体型Ｉ、腫瘍壊死因子受容体型ＩＩ、虚キナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体、血管内皮増殖因子、ならびにキメラタンパク質および生物学的にまたは免疫学的に活性なその断片、を含むがこれに限定されるものではない。
【００４６】
一特定実施形態として、治療剤はまた化学療法剤も含む。本発明の組成物に使用するために考察される化学療法剤には、限定されないが、メクロル−エタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファビランおよびクロラムブシルといったナイトロジェンマスタード類を含むアルキル化剤、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）といったニトロン尿素化合物、トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、トリエチレン、チオホスホラミド（チオテパ）、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ、アルトレタミン）といったエチレンイミン／メチルメラミン、ブスルファンといったスルホン酸アルキル、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）といったトリアジン類、メトトレキサートおよびトリメトレキサートといった葉酸類似物を含む代謝抵抗物質、５−フルオロウラシル、フルオロデオキシウリジン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ、シタラビン）、５−アザシチジン、２，２´−ジフルオロデオキシシチジンといったピリミジン類似体、６−メルカトプリン、６−チオグニアン、アザチオプリン、２´−デオキシコホルマイシン（ベントスタチン）、エリスロヒドロキシノニルアデニン（ＥＨＮＡ）、リン酸フルダラビン、および２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン、２−ＣｄＡ）といったプリン類似体、パクリタキセルといった細胞分裂抑制薬、ビンブラスチン（ＶＬＢ）、ビンクリスチンおよびビノレルビンを含むビンカアルカロイド、タキソテール、エストラムスチンおよびリン酸エストラムスチン、を含む天然品、エトポシドおよびテニポシド、といったエピポドフィロトキシン、アクチノマイシンＤ、ダウノマイシン（ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ミトキサントロン、イダルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、ミトマイシンＣ、およびアクチノマイシン、といった抗生物質、Ｌ−アスパラギナーゼといった酵素、インターフェロン−アルファ、ＩＬ−２、ＣＦＳおよびＧＭ−ＣＳＦといった生物学的修飾物質、シスプラチンおよびカルボプラチンといったプラチナ配位錯体、ミトキサントロンといったアントラセンジオン、ヒドロキシ尿素といった置換尿素、Ｎ−メチルヒドラジン（ＭＩＨ）およびプロカルバジンを含むメチルヒドラジン誘導体、ミトタン（ｏ，ｐ´−ＤＤＤ）およびアミノグルテチミドといった副腎皮質抑制剤、を含む多様な薬剤、プレドニゾンおよび相当物、デキサメタゾンおよびアミノグルテチミドといった副腎皮質ステロイド拮抗物質を含むホルモンおよび拮抗物質、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロンおよび酢酸メゲストロールといったプロゲスチン、ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオール相当物といったエストロゲン、タモキシフェンといった抗エストロゲン、プロピオン酸テストステロンおよびフルオキシメステロン／相当物を含むアンドロゲン、フルタミド、ゴナドトロピン放出ホルモン類似体およびロイプロリドといった抗アンドロゲン物質、ならびにフルタミドといった非ステロイド性抗アンドロゲン物質、が挙げられる。
【００４７】
治療の投与量はｍｇ／ｋｇで計測される量で投与され得る。開示された治療の予定ｍｇ／ｋｇ投与量は、約１ｍｇ／ｋｇ〜約６０ｍｇ／ｋｇである。投与量の特定範囲はｍｇ／ｋｇで、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、および約３０ｍｇ／ｋｇ〜約６０ｍｇ／ｋｇである。対象者への的確な有効量は、その対象者の体重、背格好および健康状態、病態の性質および程度、ならびに投与することを選択した治療、または治療の組み合わせによる。ある状態に治療上有効な量は、臨床医の技術および判断内での定期的な実験により判断可能である。
【００４８】
本明細書で使用される「有効量」とは、特定した疾患または症状を可視化するのに十分で、検出可能に標識されたポリペプチドの量、あるいは検出可能治療または阻害効果を示すことを意味する。例えば、効果は病態の改善または症状の緩和により検出可能である。対象者への的確な有効量は、その対象者の体重、背格好および健康状態、病態の性質および程度、ならびに投与することを選択した治療、または治療の組み合わせによる。ある状態に治療上有効な量は、臨床医の技術および判断内での定期的な実験により判断可能である。
組成物の可視化
【００４９】
標的バレット食道組織への結合の可視化は、当業者に既知の任意の手段によって実行できる。本明細書で述べられているように、例えば限定されないが、可視化は、体内、体外または原位置の可視化が可能である。本明細書において「可視化」および「検出」は同意で使用されている。
【００５０】
一実施形態において、可視化は画像を通じて行われており、巨視的規模（ミリメートルからセンチメートル）上の大きな粘膜表面上を高空間分解能で蛍光画像を集めるように特殊設計された広域の内視鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）を使用してもよい。この性能は、内視鏡検査中に疾患の疑いのある領域を突き止めた食道下部に見つかった、というような場合に大きな表面を迅速に検査するのに必要とされる［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｅｎｄｏｓｃｏｐｙ １９９９； ４９：４４７−５５］。この手法は蛍光検出に適応されており、染色標識探針に対応しているこの機器は、白色光（ＷＬ）、狭帯域画像（ＮＢＩ）および蛍光画像を含む３つの異なるモードで画像化することができる。狭帯域画像は、波長を制限する、または波長の範囲を絞り込む光学フィルターのあるスペクトルに変えることにより従来の白色光照射の変化を示す新たな技術である。
【００５１】
この方法は、腸上皮化生領域の血管構造に含まれるヘモグロビンの吸収を最大にするための光を向けることにより、食道粘膜のさらなる視覚の詳細を提供する内視鏡画像における対照を強化する。ＷＬおよびＮＢＩ画像は、中心の対物レンズにより収集され、蛍光画像は周辺に近い第２の対物レンズにより収集される。白色光の中心と蛍光対物レンズ間に約３ｍｍの距離があることにより、２つの画像にわずかな位置のずれが生じる。さらに、対照レンズからの破片を取り除く空気／水ノズル、および生検鉗子を届けるために使用できる８ｍｍの用具経路がある。対物レンズは前方視であり、視野（ＦＯＶ）を有し、１４０°の照射の最高角度により範囲が定まる。ＷＬ／ＮＢＩ画像モードは、被写界深度（ＤＯＦ）を有し、画像の焦点の合う内視鏡の遠心端から粘膜表面への距離、７〜１００ｍｍと蛍光用の距離５〜１００ｍｍ間の距離範囲により範囲が定まる。ＷＬ／ＮＢＩ用の粘膜から１０ｍｍの距離で測定された横断分析は１５μｍであり、蛍光用は２０μｍであった。キセノン光源は３つのモードに照射を提供し、そのことは画像処理プロセッサにあるフィルターホイールにより決められる。画像の３モード全てへの照射は２つのファイバー光ガイドを通じて届けられる。ＷＬモードでは、全可視スペクトル（４００〜７００ｎｍ）が提供され、一方ＮＢＩモードでは、フィルターホイールが赤、緑および青の枠にスペクトル帯を絞り込んでいる。蛍光モードでは、第２のフィルターホイールが照射路に入り、３９５〜４７５ｎｍスペクトル帯における蛍光励起を提供する。さらに、５２５〜５７５ｎｍからの照射は、５５０ｎｍで中心である緑スペクトル枠において反射光を提供する。蛍光画像は、励起光をブロックするための４９０〜６２５ｎｍ帯通過フィルターを有する周辺に位置するＣＣＤ検出器により収集される。正常な粘膜は明るい自己蛍光を発するため、画像の色は明るい緑が現れる。腫瘍性粘膜における血管系の増加により自己発光を吸収するため、低光度で現れる。
【００５２】
この医療用内視鏡は、ポリペプチド投与後および１）白色光、２）狭帯域、および蛍光で既知の異形成変化をしたバレット食道からの培養後の画像を集めるために使用可能である。食道下部に入った後、５秒間のビデオが収集され、白色光および狭帯画像モードで電子化される。このモードにおける画像は、ポリペプチド結合の総合評価用腸上皮化生の空間広がりを診断するのに使用される。次いで、約３ｍｌの蛍光標識されたポリペプチドが１０μＭの濃度で、化生性粘膜の全ての範囲を注意深くカバーするミスト散布カテーテルを用いて腸上皮化生に局所的に投与される。蛍光標識されたポリペプチド量は、当業者によって決定され得る。
【００５３】
次いで、胃洞、基底部、噴門および切痕、ならびに十二指腸の第１および第２部分を含む胃の定期的な内視鏡検査が行われ、ポリペプチドを計５分間培養した。次いで、内視鏡を食道下部に戻らせ、非結合ポリペプチド水でやさしく洗い、ポリペプチド標的蛍光画像の別の１０秒間のビデオを集めた。次いで、内視鏡的粘膜切除術（ＥＭＲ）の手法により食道下部の粘膜をひとまとめにして取り除き、組織検査に送った。
【００５４】
いくつかの実施形態において、検出可能標識は検出された放射性同位元素識別であり、いくつかの態様において放射性画像である。放射性画像は、放射性トレーサー物質を投与した後、身体の別部分から放射能を検出することにより画像を作成する方法であると当技術分野では理解されている。画像はコンピュータ上またはフィルム上に記録される。
【００５５】
本発明の他の方法は、患者から組織サンプルを得ることが必要である。この組織サンプルは、前記患者の組織または器官からなる群から選択される。
配合
【００５６】
１つの実施形態において、薬学的組成物は、特定の投与方法および剤形によって、担体、溶剤、安定剤、補助剤、希釈剤など、といった薬学的に許容される賦形剤で配合されていてもよい。薬学的組成物は通常、配合および投与の経路により、生理的に適合したｐＨ、約３〜約１１のｐＨ、約３〜約７のｐＨの範囲を達成する配合である。代替の実施形態において、ｐＨは約５．０〜約８の範囲に調節される。様々な態様において、薬学的組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と共に、本明細書に記載の少なくとも１つの化合物の治療効果のある量を含む。任意に、薬学的組成物は、本明細書に記載の化合物の組み合わせを含む、あるいは治療または細菌繁殖防止（例えば限定されないが、抗生物質または抗菌剤）において有用な第２の活性成分を含んでいてもよく、あるいは本発明のポリペプチドの組み合わせを含んでいてもよい。
【００５７】
適切な賦形剤は、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および不活性ウイルス粒子といった大きく、代謝の遅い高分子を含む担体分子でもよい。他の典型的な賦形剤には、抗酸化物質（例えば限定されないが、アスコルビン酸）、キレート剤（例えば限定されないが、ＥＤＴＡ）、炭水化物（例えば限定されないが、デキストリン、ヒドロキシアルキルセルロースおよびヒドロキシアルキルメチルセルロース）、ステアリン酸、液体（例えば限定されないが、油、水、生理食塩水、グリセリン、およびエタノール）湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質、等が挙げられる。
【００５８】
本発明は、本発明の例示的実施形態を詳述する以下の実施例を参照することにさらに十分に理解されよう。しかしながら、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本開示中の全ての参考文献は参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【実施例】
【００５９】
実施例１
【００６０】
ペプチド選択。ペプチド選択はファージ提示法（Ｐｈ．Ｄ．−７， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）の手法を使用して行われた。食道腺癌細胞株ＯＥ３３は、ＲＰＭＩ−１６４０培地に１０％ＦＢＳが補充され保存された。バレット食道（腸上皮化生）細胞株−ＫＲ４２４２１（Ｑ−ｈＴＥＲＴ、非異形成）は、無ケラチン細胞血清培地にウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ）およびヒト表皮成長因子（ｒＥＧＦ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）が補充され保存された。全細胞株は３７℃で５％ＣＯ２において培養された。
【００６１】
バイオパニングは減全細胞手法を用いて行われた。対数期増殖におけるＱ−ｈＴＥＲＴ細胞は、細胞分離緩衝剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）を使って切り離され、遮断緩衝剤（ウシ血清アルブミン１％のＰＢＳ）を使って４５分間、氷上でブロックされた。Ｐｈ．Ｄ．−７無作為ファージライブラリー（１．５×１０１１ プラーク形成単位）１０μｌを５ｍｌのＰＢＳに懸濁させ、１．０×１０７Ｑ−ｈＴＥＲＴ細胞で３０分間室温（ＲＴ）でバイオパニングした。細胞は、１０００ｒｐｍで６分間、遠心分離機の中で沈降させ、非結合ファージを含んだ上澄みを２回目の除去のために別の１．０×１０７Ｑ−ｈＴＥＲＴ細胞に移送した。次いで、得られた上澄みを増幅し、ＰＥＧ−ＮａＣｌで析出させ、製造業者の指示にしたがって力価を測定した。
【００６２】
ＯＥ３３食道腺癌細胞に結合するファージを強化するために、前のステップから１×１０１１ｐｆｕファージを、上述の通りに切り離されブロックされた１．０×１０６ＯＥ３３細胞に加えた。室温で穏やかに攪拌した後約３０分、細胞が沈降し、非結合ファージをもつ上澄みが捨てられた。細胞をＰＢＳ／０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０で計１０回洗浄した。次いで結合ファージを８分間、０．２Ｍグリシン１ｍ、ｐＨ２．２／０．１％ＢＳＡで溶出した。ファージを含んだ溶液は、１Ｍトリス１５０μＬ、ｐＨ９．５で速やかに中和された。増幅後、同量のファージを、溶出前の２分の溶出バッファー（０．２Ｍグリシン、ｐＨ２．２／０．１％ＢＳＡ）の洗浄以外は、同じ手順をもう一度行うためＯＥ３３細胞にパニングした。同じ手順の後にさらに２回、計４回のパニングが行われた。
【００６３】
最後のパニングから６０個のファージプラークが無作為に選択され、個別に増幅され、配列決定された（ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｒｅ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｈｉｇａｎ， ＭＩ）。得られたペプチド配列は、国立バイオテクノロジー情報センターＢＬＡＳＴ調査により、短くほぼ一致した選択肢を使用して相同配列をもつヒトタンパク質を特定するために分析された。
【００６４】
このファージのプールの配列を決定した後、４９のクローンが同じペプチド配列「ＳＮＦＹＭＰＬ」を有することがわかった。他の１１クローンが、それぞれ１つだけ現れた異なるペプチド配列を発現させた。
実施例２
【００６５】
ファージ結合アッセイ。ＯＥ３３細胞およびＱ−ｈＴＥＲＴ細胞は、上述の通りに切り離されブロックされた候補の「ＳＮＦＹＭＰＬ」−ファージまたは対照ファージ（無作為に挿入）が、ＯＥ３３細胞（１×１０７）またはＱ−ｈＴＥＲＴ細胞（１×１０７）で３０分、緩やかに攪拌し、室温で培養された。ＰＢＳ／０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０で１０回、０．２Ｍグリシン、ｐＨ２．２／０．１％ＢＳＡで２０分間１回洗浄した後、結合ファージは回収され標識された。各サンプルは３重に実行された。各サンプル中の結合ファージ量を、スチューデントのｔ検定を用いて算出した。
【００６６】
ファージ結合用細胞ＥＬＩＳＡアッセイ。ＯＥ３３細胞およびＱ−ｈＴＥＲＴ細胞は、９６−ウェルプレートにおいて１００％コンフルエンスになるように増殖され、２×１０７ｐｆｕ ＳＮＦＹＭＰＬ−ファージまたは対照ファージで連続して１０分間、３重に、室温で培養し、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで６回洗浄し、ＨＲＰ−標識した拮抗Ｍ１３抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ， Ｃｏｎｃｏｒｄ， ＭＡ）で培養し、ＴＭＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）で現像させ、吸光度６５０ｎｍが測定された（Ｅｍａｘ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）。
【００６７】
ペプチド検証。結合ファージ量の結果から、ＯＥ３３細胞を試験に使用した場合、ＳＮＦＹＭＰＬ−ファージ数は、対照ファージ（無作為に挿入）より約２５０倍多かった。この比率は、ファージがＱ−ｈＴＥＲＴ細胞に適用された時、３まで劇的に低下した（ｐ＜０．０１）（図１ａ）。ＥＬＩＳＡアッセイ上、ＳＮＦＹＭＰＬ−ファージのＯＥ３３細胞への結合の光学密度が２つのうちの１つの要素と言ってもよく、野生型ファージおよびファージ無し（背景対照）と比較したものより大きい。Ｑ−ｈＴＥＲＴ細胞への結合にはるかに低いＯＤが観察された（図１ｂ）。
【００６８】
ペプチド合成。ファージ結合アッセイにより特定された標的ペプチド配列「ＳＮＦＹＭＰＬ」は、標準フルオレニル−メトキシ−カルボニル（ＦＭＯＣ）化学構造を使用して合成され、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して最小の純度９０％に精製され、逆相ＨＰＬＣおよび質量分析法により分析された。蛍光染料ＦＩＴＣを、フレキシブルな５−アミノ酸リンカー（ＳＮＦＹＭＰＬ−ＧＧＧＳＫ−ＦＩＴＣ；配列番号６）を介してペプチドのＣ末端で共役させた。ＧＧＧＳＫは、このペプチドがＭ１３の外被タンパク質ｐＩＩＩに結合したものと同じリンカーである。標的ペプチドは、配列「ＮＬＭＰＹＦＳ−ＧＧＧＳＫ」（配列番号７）を形成するようにスクランブル化され、上述したように対照として使用するために合成された。
【００６９】
競合阻害アッセイ。ＯＥ３３細胞およびＱ−ｈＴＥＲＴ細胞は切り離され、ブロックされた。ＳＮＦＹＭＰＬファージ２×１０１１ｐｆｕは、ＯＥ３３細胞（１×１０７）またはＱ−ｈＴＥＲＴ細胞（１×１０７）と共に培養され、ファージと競合するために、「ＳＮＬＭＰＹＦＳ−ＧＧＧＳＫ」ペプチドまたはスクランブルペプチド「ＮＬＭＰＹＦＳ−ＧＧＧＳＫ」が細胞ファージ混合物中に濃度１００、２００および４００μｍで加えられた。ＰＢＳ／０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０で３回、０．２Ｍグリシン、ｐＨ２．２／０．１％ＢＳＡで２分間１回洗浄した後、この結合ファージを回収し標識した。各サンプルは３重に行われた。各サンプル中の結合ファージ量はスチューデントのｔ検定を用いて算出された。
【００７０】
ＦＩＴＣ標識ペプチドと非標識ペプチドとの間の競合阻害は、ＦＩＴＣ標識ペプチド（１００μｍ）を３種類の異なる濃度１００、５００および１０００μｍに加える前に、非標識ペプチドをＯＥ３３細胞で１５分間培養することにより行われた。３つの蛍光画像が、同じ獲得時間および曝露時間を使用したチャンバースライドの各ウェルから２００倍で収集さられた。分析用に選択された画像は以下の条件に合致していた。１）７０〜９０％細胞コンフルエンス、２）各ウェルの端から離れている、３）スライドの細胞のない場所での低い背景結合、４）細胞形質変化が無い。３つの２００倍表示下での平均細胞数がペプチド結合細胞の割合を算出するために記録された。蛍光輝度の定量化が、ＮＩＨ画像Ｊソフトウェアにより同じしきい値の下、各グループ間のピクセル値を算出して行われた。平均蛍光輝度における違いは、スチューデントのｔ検定を用いて端を比較した。
【００７１】
ＳＮＦＹＭＰＬファージＯＥ３３細胞の結合能力が挿入ペプチドに依存するが、他のファージ被膜タンパク質吸収には依存しないことをさらに証明するために、「ＳＮＦＹＭＰＬ−ＧＧＧＳＫ」ペプチドが、ＯＥ３３細胞上ＳＮＦＹＭＰＬ−ファージと競合させるために使用された。スクランブルペプチド「ＮＬＭＰＹＦＳ−ＧＧＧＳＫ」が対照として使用された。「ＳＮＦＹＭＰＬ−ＧＧＧＳＫ」は、ＳＮＦＹＭＰＬ−ファージがＯＥ３３細胞と結合するのを明らかに阻害でき、この能力は濃度依存であった。スクランブルペプチドである「ＮＬＭＰＹＦＳ−ＧＧＧＳＫ」は、ＳＮＦＹＭＰＬ−ファージに対して阻害能力を有してはいなかった（図２）、このことはＳＮＦＹＭＰＬ−ファージ結合能力が挿入ペプチドに由来すること、およびこれは特異的結合であることを示した。
実施例３
【００７２】
培養細胞上のペプチド結合の蛍光画像。ＯＥ３３細胞およびＱ−ｈＴＥＲＴ細胞を、チャンバースライドの中で８０％コンフルエンスに増殖した。これらの細胞への非特異的結合のブロックを、３０分間ＰＢＳ中に希釈した２００μｌの１％ＢＳＡを加えることにより行った。次いでこれらの細胞を、候補のＦＩＴＣ−標識されたペプチド１００μｍｏｌで、無血清培地において、１０分間、室温で培養した。これらの細胞を、３回、２００μＬのＰＢＳ／０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０を使用して室温で洗浄した。これらの細胞を氷冷の４％パラホルムアルデヒド中で５分間固定した。次いでこれらの細胞を、ＤＡＰＩを含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤で染色した。蛍光画像が、共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ １０００）を使用して２００倍で収集された。３画像におけるこれらの細胞からの蛍光輝度は、ＮＩＨ画像Ｊソフトウェアを使用してペプチド結合を判断するために平均化された。
【００７３】
蛍光顕微鏡下で、ＳＮＦＹＭＰＬ−ＧＧＧＳＫ−ＦＩＴＣは９０％超のＯＥ３３細胞の細胞膜に結合するが、Ｑ−ｈＴＥＲＴ（正常バレットの）細胞には結合しなかった（図３）。ＯＥ３３の細胞表面への結合に関わる輝度は、ＮＩＨ画像Ｊソフトウェア分析を使用して、Ｑ−ｈＴＥＲＴの６９．０３３±１８．００７（平均濃淡値）と比較して、２５．７３８±２．５０４（平均濃淡値）であった。
【００７４】
本明細書において、ＳＮＦＹＭＰＬペプチドが疾患組織に対して高親和性および特異性を有していること、顕微鏡画像上で検出可能であり、組織生検を指針し、前癌状態の粘膜の検出率を高めることが示された。
実施例４
【００７５】
「ＡＳＹＮＤＡ」（配列番号５）に親和結合する腺癌細胞上の細胞膜標的の特定。標的ペプチドのカルボキシル末端は、ＥＤＣ作用を使用した親和性カラムビーズに連結した。Ｓｅｇ−１の細胞は、増殖して密集し、超音波処理により溶解し、遠心分離により分別された。得られた膜画分はカラムを標識した標的ペプチドに適用され、特定の結合タンパク質が溶出した。これらのタンパク質は分離し、Ｂｅｃｋｍａｎ ＰＦ ２Ｄ液体クロマトグラフィー装置を使用した逆相カラムにより画分で回収された。タンパク質画分を、ニトロセルロース被覆マイクロアレイプリンタースライド上にスポットし、ＦＩＴＣ−標識した標的ペプチドで検査した。各スポットの蛍光輝度はＡｘｏｎ Ｉｍａｇｅｒで数値化された。高輝度のタンパク質画分は、トリプシン処理され、Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＬＴＱ線形イオントラップ質量分析計を使用してプロテオーム解析が行われた。タンパク質同一性がＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｄｅｘ（ＩＰＩ）のデータベース検索を使用して、ＳＥＱＵＥＳＴプログラム、オープンソースであるＸｔａｎｄｅｍならびにペプチドおよびタンパク質プロフェットソフトウェアを利用して確認された。標的ペプチド「ＡＳＹＮＤＹＡ」（１００μＭ）（配列番号５）は、ＳＥＧ１（腺癌）上の細胞表面の標的への優先結合を示し、ＯＥ−２１（扁平上皮）およびＱ−ｈＴＥＲＴ（腸上皮化生）細胞には結合しないことを示した。細胞表面の標的には、Ａｎｎｅｘｉｎ Ａ２、肝細胞癌由来の増殖因子、ヒストンＨ２Ｂ、ヒストンＨ２ＡおよびＪｕｎｃｔｉｏｎプラコグロブリンが含まれた。特定した標的のリストである下記の表１を参照のこと。特定されたタンパク質全てが、完全に一致したか、または＞０．９９であった。タンパク質のいくつかは通常核中で発見されるが、これらのタンパク質が癌細胞において、中でもヒストン、が細胞膜に移動することを示す形跡がある。
【表１】
実施例５
蛍光認識されたＳＮＦポリペプチドの食道粘膜表面上のバレット異形成への優先結合の確認。
【００７６】
ヒト内視鏡的粘膜切除述（ＥＭＲ）の標本を異形成粘膜の疑いのある領域から新たに採取した。各標本は、配列番号１のＦＩＴＣ−標識したポリペプチドで、濃度１００μｍで５分間培養された。方向づけに１２時の位置をマークするためにインクが使用された。白色光の立体顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＳＺＸ１６）画像が、オーバーレイする２０×２０ｍｍグリッドで得られ、組織像を記録した。蛍光画像が１２ミリ秒の曝露において得られた。次いで組織をホルマリンに入れた。蛍光画像では見えないが、ＧＩ病理学の専門家が標本を縦方向に断面約２ｍｍ区間に沿って区分し、病理組織を解釈した。各１ｍｍ区間における蛍光画像平均輝度は、ＮＩＨ画像Ｊ処理ソフトウェアを使用して測定され、組織像を比較した。
【００７７】
蛍光輝度は、ｎ＝９対象から集めたｎ＝９ＥＭＲ標本からの計２７７位置から測定された。これらの区間は、組織画像上の扁平上皮（ｎ＝１０７）、腸上皮化生（ｎ＝６６）、異形成（ｎ＝６９）、および正常胃粘膜（ｎ＝３５）で見られた。異形成、腸上皮化生、扁平上皮、および胃粘膜の平均輝度値は、階調レベルがそれぞれ５６．５±、４２．１±、２７．１±、および２４．１±であった。分散統計は、１３．２（ｐ＝＜０．０００１）のＦ−統計を示した。ｔ検定の２サンプルは、異形成の平均輝度値が、腸上皮化生（ｔ＝２．２、ｐ＜０．０５）、扁平上皮（ｔ＝５．２、ｐ＜０．０１）および胃粘膜（ｔ＝５．０１、ｐ＜０．０１）の平均輝度値よりも高いことを示した。腸上皮化生の平均輝度が、扁平上皮（ｔ＝３．０６、ｐ＜０．０１）および胃粘膜（ｔ＝３．０４、ｐ＜０．０１）の平均輝度よりも高かった。扁平上皮と胃粘膜間の平均輝度値においては統計的に大きな違いはなかった（ｔ＝０．３８、ｐ＝０．７１）。
【００７８】
そのため、バレット異形成への新規蛍光−標識されたＳＮＦペプチドの選択的結合は、センチメートル規模の粘膜表面上で実証された。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
【０００２】
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下、２００９年４月１８日に出願された米国特許仮出願第６１／１７０，６１４号、および２０１０年２月８日に出願された米国特許仮出願第６１／３０２，３８８号の優先権の利益を主張する。
政府権益の声明
【０００３】
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）により与えられた助成金番号Ｒ０３ ＣＡ０９６７５２、ＣＡ１３６４２９、およびＣＡ０９３９９０の下、政府支援により行われた。政府は本発明における一定の権利を有する。
技術分野
【０００４】
本発明は、バレット食道における異形成の検出に使用するための組成物および方法を対象とする。
【背景技術】
【０００５】
先進諸国において、食道の腺癌は他のいかなる癌よりも早い速度で増大している。この疾患は罹患率および死亡率の大きな原因であり、バレット食道は食道粘膜の内膜の変化に起因する、知られている前駆状態であり、腸上皮化生として組織学的に確認されるサーモン色の粘膜として、内視鏡で識別することができる。バレット粘膜の発症は、中心性肥満に関連する酸および胆汁の逆流に関連しており、通常の食道よりも約３０〜１２５倍高く癌へ進行する相対リスクを有する。バレット粘膜は、一連の分子および細胞変化を通じて正常組織から癌に移行する。組織学分類では、扁平上皮、腸上皮化生、低悪性異形成、高悪性異形成、および腺癌を含む段階を通じて進む。癌はまた、年に患者一人に対して１％の割合で腸上皮化生から直接発症する。
【０００６】
従来の白色光内視鏡検査が、バレット食道の癌検診に使用される最も一般的な方法である［非特許文献１］。この様式は、センチメートル規模の寸法で、素早く粘膜表面の範囲を調べるために非常に広い視界にわたって光を集めるために高度な画像光学を用いる。この機能は、実際の時間枠の中で消化管における管腔臓器の内壁を入念に調べるのに必要である。しかしながら、この方法には大きな制約がある。この手法は、構造（解剖学上）の変化を見せるための組織表面からの白色光の反射に依存しており、バレット食道で発症するような扁平異形成の検出には効果的ではない。現行の検診手法および観察手法は医療用内視鏡を用いて行われ、検出および解明が困難な組織内の構造的および形態的変化を可視化することを基にしている。無作為の４像限生体組織検査は検診手法の基準として認められていたが、異形成変化は空間的に不均一に発生することが多いため、この方法は検出率の低さから限定されている［非特許文献２］。
【０００７】
異形成の存在により切除した食道粘膜の組織学的検査は、定性的、自覚的な方法、および病理専門医の中でも、発生した異形成を選別する際の実質的な観察者内および観察者間の変動、分析における患者および医師の確信を制限して、行われる［非特許文献２］。生体標本の誤った診断は、不必要な食道切除術または明らかに癌に進行する恐れがある。腺癌に進行する危険性のある粘膜の自然歴上の現行の組織病理学の予後値におけるこの不透明性により、病理学的評価の新たな基準の形成が求められる［非特許文献３］。さらに、特定の分子標的を阻害することを目的とする新たな治療が、全身毒性を有さない抗腫瘍薬の創薬への幅広い意欲を引き起こし、遺伝子増幅とタンパク質発現間の理解を深める、および標的療法の効果が必要とされている［非特許文献４］。これらの要素は、末期腺癌に伴う低い生存率と相まって、標的のさらなる発展への主な動機、バレット粘膜の検診を改良するための生体内画像戦略、疾患のリスク分類、および癌の治療選択を提供する。
【０００８】
母集団におけるバレット食道の有病率から判断すると、無作為の生検を用いた白色光の内視鏡検査は、癌検診の容認された方法となっている。しかしながら、この方法は、バレット食道で発症するような扁平異形成の検出には効果的ではない。異形成の存在により切除した食道粘膜の組織学的検査は、定性的、自覚的な方法、ならびに病理専門医の中でも、発生した異形成を選別する際の実質的な観察者内および観察者間の変動、分析において患者および医師の確信を制限し、行われるそのため、白色光を用いた現行の観察方法は非特異的であり、サンプリング誤差により限定されるため、食道腺癌の早期発見および予防のために前癌状態の粘膜を局所化する、改善された画像戦略が必要とされる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ． ２００８；１０３：７８８−９７
【非特許文献２】Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １９９３；１０５：４０−５０
【非特許文献３】Ａｐｐｅｌｍａｎ， Ａｒｃｈ Ｐａｔｈｏｌ Ｌａｂ Ｍｅｄ． ２００５；１２９：１７０−３
【非特許文献４】Ｂｒａｂｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ ２００５；１４：２１１３−７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本明細書には、組成物およびバレット食道における異形成の検出のための組成物および方法が記載されている。したがって、一実施形態において、組成物は配列番号１に示されるポリペプチド配列（ＳＮＦＹＭＰＬ）、リンカー配列および検出可能マーカーからなる、または実質的になり、検出可能マーカーはリンカーを通してポリペプチドに結合し、リンカーは正味の中性電荷を有し、リンカーの存在は、リンカーのない場合のバレット食道組織へのポリペプチド配列の検出可能な結合と比較してバレット食道の組織へのポリペプチド配列の検出可能な結合を増加させる。
【００１１】
いくつかの態様において、リンカーの末端アミノ酸はリジンである。さらなる態様において、リンカーは配列番号２（ＧＧＧＳＫ）で示される配列を含む。
【００１２】
いくつかの態様において、検出可能マーカーはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）である。
【００１３】
また、本開示は、本明細書に開示された組成物をヒトに投与する方法を考察する。したがって、いくつかの態様において、本明細書に開示された組成物および薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物が提供される。
【００１４】
いくつかの態様において、組成物とは本明細書において提供される場合、追加部分をさらに含み、様々な態様において、その部分は化学療法剤、治療剤、ポリペプチド、抗体、核酸、小分子またはその組み合わせからなる群から選ばれる。
【００１５】
本開示により、バレット食道細胞を検出するのに有効な量の本明細書に開示の組成物を投与する方法を含む腺癌の発症を検出する方法をさらに提供し、組成物は非癌性細胞に関係するバレット食道細胞に選択的に結合する特性を有し、それによって腺癌細胞発生の開始を検出する。
【００１６】
本開示の追加態様は、ヒトにおける異形成バレット食道治療の有効性を判断する方法であって、異形成バレット食道を標識するのに有効な量の本開示の組成物をヒトに投与するステップと、本開示の組成物で標識された細胞の第１の量を可視化するステップと、第１の量を、本開示の組成物で標識された細胞の以前に可視化された第２の量と比較するステップとを含み、標識された細胞の以前に可視化された量と比べて、標識された細胞の第１の量の減少は、効果的な治療を示す。
【００１７】
さらなる態様は、本開示の組成物により標識された細胞の生検を得ることを含む方法を提供する。
【００１８】
いくつかの態様において、組成物が異形成バレット食道の臨床的発症後に投与される。
【００１９】
本開示は、本開示の薬学的組成物、組成物の使用のための方法および薬学的組成物を患者に投与するためのデバイスを含む、キットをさらに提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１ａ】結合ファージ集計。「ＳＮＦＹＭＰＬ」−ファージおよび野生型ファージ（挿入無し）はＯＥ３３食道腺癌細胞およびＱ−ｈＴＥＲＴ腸上皮化生細胞で培養され、結合ファージは回収され力価を測定した。ＯＥ３３細胞に結合した「ＳＮＦＹＭＰＬ」−ファージの数は、野生型ファージの６．５×１０３ｐｆｕに比較して約１．６×１０６ｐｆｕであった。一方、Ｑ−ｈＴＥＲＴ細胞に結合したファージの数は、桁が少なくそれぞれ５．８×１０４および１．７×１０４（Ｐ＜０．０１）であった。
【図１ｂ】結合アッセイ用ＥＬＩＳＡ。「ＳＮＦＹＭＰＬ」−ファージのＯＥ３３食道腺癌細胞への結合のためのＥＬＩＳＡ上の光学濃度は、１．２３であり野生型ファージの０．７２およびファージ無し（背景）の０．７３とそれぞれ比較した。Ｑ−ｈＴＥＲＴ細胞が使用された場合、ＥＬＩＳＡ上の光学濃度に違いは観察されていない（Ｐ＜０．０１）。
【００２１】
【図２】競合的阻害研究を表す。「ＳＮＦＹＭＰＬ」−ファージは、ＯＥ３３食道腺癌細胞（１×１０７）で培養され、「ＳＮＦＹＭＰＬ」ペプチドおよびスクランブルペプチド「ＮＬＭＰＹＦＳ」を１００、２００、および４００μＭの濃度で細胞−ファージ混合物に加え、組成物の測定をした。結合ファージは回収され、力価を測定し、「ＳＮＦＹＭＰＬ」は濃度依存的にＯＥ３３細胞に結合するＳＮＦＹＭＰＬ−ファージを大きく阻害することがわかった。一方で、スクランブルペプチド「ＮＬＭＰＹＦＳ」は、標的ペプチド「ＳＮＦＹＭＰＬ」の結合をいかなる濃度（４００μＭ表示）でも阻害しなかった。
【００２２】
【図３】細胞表面標的へのペプチド結合の蛍光画像を示す。蛍光−標識されたペプチド「ＳＮＦＹＭＰＬ」は、ＯＥ３３（食道腺癌）細胞の＞９０％において細胞膜へ結合するのがみられるが、蛍光画像上のＱ−ｈＴＥＲＴ（腸上皮化生）細胞上では見られない。ＯＥ３３の細胞表面への結合に関連する輝度は、Ｑ−ｈＴＥＲＴの輝度２５．７±２．５と比べ、６９±１８であった。ＤＡＰＩ染色法により細胞核の範囲を現し、オーバーレイ画像により細胞表面上に起きた結合が見られる。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
変化した細胞および組織は、全体の形質学的特徴より先に分子変化を十分に発現するため、癌の早期発見をする類のない機会を提供する。食道における疾患検出のためのより高い反応性および特異性は、特有の癌発現分子パターンを標的にした外部からの探針に使用により実現する。次いで、これらの探針は、検出可能マーカーと標識され、癌の早期発見のための組織生検を指針する定期的なスクリーニングの間、内視鏡画像で検出され、粘膜下層浸潤を診断し、治療反応性を観察する。
【００２４】
ポリペプチドは、体内の分子発現を標的にする分子探針として、臨床的使用に大きな可能性を有する。高いクローン多様性、小さいサイズおよび蛍光染料との相互性に加えて、ポリペプチドは速い結合反応速度を示し、スクリーニング手段として臨床的に使用し得る。そればかりでなく、ポリペプチドは、免疫原生のわずかな懸念を有する前悪性（異形成）変化に関わる細胞表面標的に結合するために管腔表面に局所的に投与され得る。
【００２５】
本明細書には、バレット食道における異形成の検出のために使用する組成物および方法が記載されている。この方法は、標識されたポリペプチドを分子探針として、バレット食道癌患者の体内検出用に共焦点蛍光内視鏡検査と組み合わせて利用する。
【００２６】
したがって、一実施形態において、組成物は配列番号１に示されるポリペプチド配列、リンカー配列および検出可能マーカーからなる、または実質的になり、検出可能マーカーはリンカーを通してポリペプチドに結合し、リンカーは正味の中性電荷を有し、リンカーの存在は、リンカーのない場合のバレット食道組織へのポリペプチド配列の検出可能な結合と比較してバレット食道の組織へのポリペプチド配列の検出可能な結合を増加させる。
【００２７】
いくつかの態様において、検出可能な結合は体内で起こる。いくつかの態様において、検出可能な結合は体外で起こる。さらなる態様において、検出可能な結合は体内の原位置で起こる。体内の原位置とは「自然な位置または通常の位置」を意味する。例えば限定されないが、全臓器が無傷のまま潅流下で細胞を検査することは原位置検査である。これは生物から臓器が摘出されているので体内にはならないが、細胞単体を研究していること（体外実験における一般的なシナリオ）と同様ではないだろう。当業者は、例えば限定されないが、前述の各適用において本開示の組成物が有用であることを理解するであろう。
【００２８】
本発明の特定の方法は、ヒトにおける異形成バレット食道治療の有効性を判断する方法であって、異形成バレット食道を標識するのに有効な量の本開示の組成物をヒトに投与するステップと、組成物で標識された細胞の第１の量を可視化するステップと、第１の量を、組成物で標識された細胞の以前に可視化された第２の量と比較するステップと、を含み、標識された細胞の以前に可視化された量と比べて、標識された細胞の第１の量の減少は効果的な治療を示す。これらの態様において、５％の減少は効果的な治療を示す。他の態様において、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、またはそれ以上の減少は効果的な治療を表す。
リンカー
【００２９】
本明細書で用いられている「リンカー」は、本開示のポリペプチドの末端に位置する非荷電アミノ酸配列である。リンカーの存在により、リンカーのない場合のバレット食道組織への検出可能なポリペプチド結合の配列と比較して、バレット食道組織への検出可能なポリペプチド結合の配列を増加させることがわかっている。いくつかの実施形態において、リンカー配列はリジン残基で終端する。様々な態様において、本明細書に記載の検出可能マーカーは、リンカーに結合している。さらなる態様において、リンカー配列はＧＧＧＳＫ（配列番号２）である。さらなる態様において、検出可能マーカーはＦＩＴＣである。本開示により考察される非荷電アミノ酸は、グリシン、セリン、システイン、スレオニン、ヒスチジン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンを含むがこれに限定されない。
【００３０】
いくつかの態様において、リンカーの存在により、リンカーのない場合のバレット食道組織へのポリペプチド配列の検出可能な結合と比較して、バレット食道組織へのポリペプチド配列の検出可能な結合は少なくとも１％増加する。様々な態様において、リンカーのない場合のバレット食道組織へのポリペプチド配列の検出可能な結合と比較して、バレット食道組織へのポリペプチド配列の検出可能な結合の増加は、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、またはそれ以上である。
ポリペプチド
【００３１】
用語「ポリペプチド」は、２〜５０アミノ酸の分子、３〜２０アミノ酸の分子、および６〜１５アミノ酸の分子を意味する。一態様において、本発明により考察されるポリペプチドおよびリンカーは、５アミノ酸長である。様々な態様において、ポリペプチドまたはリンカーは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、またはそれ以上のアミノ酸長である。
【００３２】
典型的なポリペプチドは、当技術分野において既知の方法により無作為に生成され、ポリペプチドライブラリー（例えば限定されないが、ファージディスプレイライブラリー）中で運ばれ、タンパク質の消化または化学的合成により得られる可能性がある。本開示のポリペプチドは、細胞表面標的への優先的結合による選択用のポリペプチドの複合ライブラリーを生成するための組み換えＤＮＡ技術を使用する強力なコンビナトリアル手法である、ファージディスプレイの手法を用いて開発された［Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９０；２４９：３８６−９０．］。フィラメントＭ１３または正２０面体Ｔ７といったバクテリオファージのタンパク膜は、親和結合を達成するために特異的な配列をもつ異なる非常に多数（＞１０９）のポリペプチドを発現するように遺伝子改変される［Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ １９９０；８７：６３７８−８２］。次いで、標的の発現を通して培養された細胞および組織に対するファージライブラリーをバイオパニングすることにより選択が行われる。次いで、これらの候補ファージのＤＮＡ配列が回収され、ポリペプチドの合成に使用される［Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ １９９６；３８０：３６４−６］。
【００３３】
ポリペプチドは、Ｄ型およびＬ型を含み、２つの型の精製したものか混合したもののいずれかである。また本開示により、バレット食道細胞への結合に関する本開示のポリペプチドと競合したポリペプチドも考察される。
【００３４】
特定の態様において、本開示は、培養液中のＯＥ３３ヒト食道腺癌培養細胞株に対するバイオプランニングによるファージディスプレイの手法を使用して特定された２つの７残基ポリペプチド（７−ｍｅｒ）および１つの１２残基ポリペプチド（１２−ｍｅｒ）を提供する。これらのポリペプチド配列は、１）ＳＮＦＹＭＰＬ（配列番号１）、２）ＶＡＴＱＡＹＬ（配列番号３）、および３）ＧＬＫＩＷＳＬＰＰＨＨＧ（配列番号４）である。他の態様において、本明細書に開示のポリペプチドに少なくとも８０％同一であるポリペプチドが提供されている。さらなる態様において、本明細書に開示されたポリペプチドに少なくとも８５％、９０％、９５％、または少なくとも９９％同一のポリペプチドが提供されている。追加のポリペプチドはファージディスプレイを使用して特定され、組成物および本開示の方法において利用され得るということを、当業者であれば理解および認識されるであろう。
【００３５】
一態様において、ポリペプチド配列ＡＳＹＮＹＤＡ（配列番号５）が、本開示により考察される。
【００３６】
本発明のポリペプチドおよびリンカーは、当該技術分野で知られる修正を取り入れることができ、そうした修正の位置および数は、最適な効果を実現するために異なってもよいことが理解されるであろう。
検出可能マーカー
【００３７】
本明細書で用いられている「検出可能マーカー」とは、食道組織への本開示の組成物の結合を特定するために使用できる任意の標識である。検出可能マーカーの例には、限定するものではないが、ポリペプチドの可視化を可能にする蛍光体、化学タグまたはタンパク質タグがある。可視化は、裸眼または装置（例えば限定されないが、内視鏡）で行われてもよいし、代替光またはエネルギー源を要してもよい。
【００３８】
本発明の方法において使用すると考察されている化学タグおよびタンパク質タグである発光体には、これらに限定されないが、ＦＩＴＣ、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｌｉ−Ｃｏｒ、放射性同位元素識別、ビオチン、ルシフェラーゼ、１，８−ＡＮＳ（１−アニリノナフタレン−８−スルホン酸）、１−アニリノナフタレン−８−スルホン酸（１，８−ＡＮＳ）、５−（および−６）−カルボキシ−２´、７´−ジクロロフルオレセインｐＨ９．０、５−ＦＡＭ、ｐＨ９．０、５−ＲＯＸ（５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、トリエチルアンモニウム塩）、５−ＲＯＸ ｐＨ７．０、５−ＴＡＭＲＡ、５−ＴＡＭＲＡ ｐＨ、０，５−ＴＡＭＲＡ−ＭｅＯＨ、６ ＪＯＥ、６，８−ジフルオロ−７−ヒドロキシ−４−メチルクマリンｐＨ９．０、６−カルボキシローダミン６Ｇ ｐＨ７．０、６−カルボキシローダミン６Ｇ、塩酸塩、６−ＨＥＸ、ＳＥ ｐＨ９．０、６−ＴＥＴ、ＳＥ ｐＨ９．０、７−アミノ−４−メチルクマリンｐＨ７．０、７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン、７−ヒドロキシ−４−メチルクマリンｐＨ９．０、アレクサ３５０、アレクサ４０５、アレクサ４３０、アレクサ４８８、アレクサ５３２、アレクサ５４６、アレクサ５５５、アレクサ５６８、アレクサ５９４、アレクサ６４７、アレクサ６６０、アレクサ６８０、アレクサ７００、アレクサフルオル４３０抗体複合体ｐＨ７．２、アレクサフルオル４８８抗体複合体ｐＨ８．０、アレクサフルオル４８８ヒドラジド水、アレクサフルオル５３２抗体複合体ｐＨ７．２、アレクサフルオル５５５抗体複合体ｐＨ７．２、アレクサフルオル５６８抗体複合体ｐＨ７．２、アレクサフルオル６１０Ｒ−フィコエリトリンストレプトアビジンｐＨ７．２、アレクサフルオル６４７抗体複合体ｐＨ７．２、アレクサフルオル６４７Ｒ−フィコエリトリンストレプトアビジンｐＨ７．２、アレクサフルオル６６０抗体複合体ｐＨ７．２、アレクサフルオル６８０抗体複合体ｐＨ７．２、アレクサフルオル７００抗体複合体ｐＨ７．２、アロフィコシアシンｐＨ７．５、ＡＭＣＡ複合体、アミノクマリン、ＡＰＣ（アロフィコシアシン）、Ａｔｔｏ６４７、ＢＣＥＣＦ ｐＨ５．５、ＢＣＥＣＦ ｐＨ９．０、ＢＦＰ（青色蛍光タンパク質）、カルセイン、カルセインｐＨ９．０、カルシウムクリムゾン、カルシウムクリムゾンＣａ２＋、カルシウムグリーン、カルシウムグリーン−１Ｃａ２＋、カルシウムオレンジ、カルシウムオレンジＣａ２＋、カルボキシナフトフルオレセインｐＨ１０．０、カスケードブルー、カスケードブルーＢＳＡｐＨ７．０、カスケードイエロー、カスケードイエロー抗体複合体ｐＨ８．０、ＣＦＤＡ、ＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）、ＣＩ−ＮＥＲＦ ｐＨ６．０、シトリン、クマリン、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、ＣｙＱＵＡＮＴ ＧＲ−ＤＮＡ、ダンシルカダベリン、ダンシルカダベリン、ＭｅＯＨ、ＤＡＰＩ−ＤＮＡ、ダポキシル（２−アミノエチル）スルホンアミド、ＤＤＡＯ ｐＨ９．０、Ｄｉ−８−ＡＮＥＰＰＳ−リピド、ＤｉＩ、ＤｉＯ、ＤＭ−ＮＥＲＦ ｐＨ４．０、ＤＭ−ＮＥＲＦ ｐＨ７．０、ＤｓＲｅｄ、ＤＴＡＦ、ｄトマト、ｅＣＦＰ（強化シアン蛍光タンパク質）、ｅＧＦＰ（強化グリーン蛍光タンパク質）、エオシン、エオシン抗体複合体ｐＨ８．０、エリスロシン−５−イソチオシアネートｐＨ９．０、ｅＹＦＰ（強化イエロー蛍光タンパク質）、ＦＤＡ、ＦＩＴＣ抗体複合体ｐＨ８．０、ＦｌＡｓＨ、フルオ−３、フルオ−３Ｃａ２＋、フルオ−４、フルオロ−ルビー、フルオレセイン、フルオレセイン０．１Ｍ ＮａＯｈ、フルオレセイン抗体複合体ｐＨ８．０、フルオレセインデキストランｐＨ８．０、フルオレセインｐＨ９．０、フルオロ−エメラルド、ＦＭ１−４３、ＦＭ１−４３リピド、ＦＭ４−６４、ＦＭ４−６４、２％ＣＨＡＰＳ、フラレッドＣａ２＋、フラレッド、高Ｃａ、フラレッド、低Ｃａ、フラ−２Ｃａ２＋、フラ−２、フラ−２、ＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）、Ｈｃレッド、インド−１Ｃａ２＋、インド−１、Ｃａ無し、インド−１、Ｃａ飽和、ＪＣ−１、ＪＣ−１ｐＨ８．２、リサミンローダミン、ルシフェルイエロー、ＣＨ、マグネシウムグリーン、マグネシウムグリーンＭｇ２＋、マグネシウムオレンジ、マリーナブルー、ｍＢバナナ、ｍチェリー、ｍハネデュー、ｍプラム、ｍＲＦＰ、ｍストロベリー、ｍタンジェリン、ＮＢＤ−Ｘ、ＮＢＤ−Ｘ、ＭｅＯＨ、ニューロトレース５００／５２５、グリーン蛍光ニッスルステイン−ＲＮＡ、ナイルブルー、ナイルレッド、ナイルレッド−リピド、ニッスル、オレンジグリーン４８８、オレンジグリーン４８８抗体複合体ｐＨ８．０、オレンジグリーン５１４、オレンジグリーン５１４抗体複合体ｐＨ８．０、パシフィックブルー、パシフィックブルー抗体複合体ｐＨ８．０、フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリンｐＨ７．５、ＲｅＡｓＨ、レゾルフィン、レゾルフィンｐＨ９．０、ロード−２、ロード−２Ｃａ２＋、ローダミン、ローダミン１１０、ローダミン１１０ｐＨ７．０、ローダミン１２３、ＭｅＯＨ、ローダミングリーン、ローダミンファロイジンｐＨ７．０、ローダミンレッド−Ｘ抗体複合体ｐＨ８．０、ローダミングリーンｐＨ７．０、ローダミングリーン抗体複合体ｐＨ８．０、サファイア、ＳＢＦＩ−Ｎａ＋、ナトリウムグリーンＮａ＋、スルホローダミン１０１、テトラメチルローダミン抗体複合体ｐＨ８．０、テトラメチルローダミンデキストランｐＨ７．０、およびテキサスレッド−Ｘ抗体複合体ｐＨ７．２、が挙げられる。
【００３９】
本開示により考察される化学タグの例には、限定するものではないが、放射性同位元素識別がある。例えば限定されないが、組成物および本開示の方法に使用されてもよい放射性同位元素識別には、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、３２Ｐ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９５Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１０３Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４０Ｌａ、１４９Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５４−１５９Ｇｄ、１６５Ｄｙ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ、１７５Ｌｕ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１９２Ｉｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、および２１２Ｂｉがある。
【００４０】
体内または体外のいずれかで、本開示の組成物を可視化するために使用できるそうした検出可能マーカーが多くあるということを、当業者は認識するであろう。
追加部分
【００４１】
別の実施形態において、追加部分をさらに含む組成物が提供され、前記組成物は腺癌細胞を検出する特性を有する。様々な態様において、限定されないが、追加部分はポリペプチド、低分子、治療剤、化学療法剤またはそれらの組み合わせである。
【００４２】
本明細書で使用されている「低分子」という用語は、例えば、任意に誘導体化されてもよいペプチドメティックもしくはオリゴヌクレオチド、または天然もしくは合成のいずれかの任意の他の低分子量の有機化合物等の化学化合物を意味する。
【００４３】
「低分子量」とは、分子量が１０００ダルトン未満、主に３００から７００ダルトンを有する化合物を意味する。様々な態様において、低分子量化合物は、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００、約６５０、約７００、約７５０、約８００、約８５０、約９００、約１０００ダルトン、またはそれ以上である。
【００４４】
いくつかの態様において、追加部分はタンパク質治療剤である。タンパク質治療剤は、細胞タンパク質または血中タンパク質ならびにその断片および誘導体を含むがこれに限定されるものではない。さらに他の治療剤は、タンパク質コードポリヌクレオチド、調節ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、および／またはそれ自体調節性であるポリヌクレオチドを含むがこれに限定されるものではない、ポリヌクレオチドを含む。任意で、組成物は、本明細書に記載の化合物の組み合わせを含んでもよい。
【００４５】
様々な態様において、タンパク質治療剤はサイトカインまたは造血因子を含み、ＩＬ−アルファ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ＥＰＯ、インターフェロン−アルファ（ＩＦＮ−アルファ）、コンセンサスインターフェロン、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、アンジオポエチン、例えば、Ａｎｇ−１、Ａｎｇ−２、Ａｎｇ−４、Ａｎｇ−Ｙ、ヒトアンジオポエチン様ポリペプチド、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオゲニン、骨形態形成タンパク質−１、骨形態形成タンパク質−２、骨形態形成タンパク質−３、骨形態形成タンパク質−４、骨形態形成タンパク質−５、骨形態形成タンパク質−６、骨形態形成タンパク質−７、骨形態形成タンパク質−８、骨形態形成タンパク質−９、骨形態形成タンパク質−１０、骨形態形成タンパク質−１１、骨形態形成タンパク質−１２、骨形態形成タンパク質−１３、骨形態形成タンパク質−１４、骨形態形成タンパク質−１５、骨形態形成タンパク質受容体ＩＡ、タンパク質受容体ＩＢ、脳由来神経栄養因子、繊毛神経栄養因子、繊毛神経栄養因子受容体、サイトカイン誘導好中球化学走化因子１、サイトカイン誘導好中球、化学走化因子２α、サイトカイン誘導好中球化学走化因子２β、β内皮細胞成長因子、エンドセリン１、上皮細胞増殖因子、上皮由来好中球誘引剤、線維芽細胞成長因子４、線維芽細胞成長因子５、線維芽細胞成長因子６、線維芽細胞成長因子７、線維芽細胞成長因子８、線維芽細胞成長因子８ｂ、線維芽細胞成長因子８ｃ、線維芽細胞成長因子９、線維芽細胞成長因子１０、線維芽細胞成長因子酸、グリア細胞株由来神経栄養因子受容体α１、細胞株由来神経栄養因子受容体α２、増殖関連タンパク質、増殖関連タンパク質α、増殖関連タンパク質β、増殖関連タンパク質γ、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、インスリン様増殖因子Ｉ、インスリン様増殖因子受容体、インスリン様増殖因子ＩＩ、インスリン様増殖因子結合タンパク質、ケラチン生成細胞増殖因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受容体α、神経成長因子神経成長因子受容体、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、胎盤成長因子、胎盤成長因子２、血小板由来内皮細胞成長因子、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子Ａ鎖、血小板由来増殖因子ＡＡ、血小板由来増殖因子ＡＢ、血小板由来増殖因子Ｂ鎖、血小板由来増殖因子ＢＢ、血小板由来増殖因子受容体α、血小板由来増殖因子受容体β、プレＢ細胞成長刺激因子、幹細胞因子受容体、ＴＮＦ、ＴＮＦ０込み、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、形質転換増殖因子α、形質転換増殖因子β、形質転換増殖因子β１、形質転換増殖因子β１．２、形質転換増殖因子β２、形質転換増殖因子β３、形質転換増殖因子β５、潜在型形質転換増殖因子β１、形質転換増殖因子β結合タンパク質Ｉ、形質転換増殖因子β結合タンパク質ＩＩ、形質転換増殖因子β結合タンパク質ＩＩＩ、腫瘍壊死因子受容体型Ｉ、腫瘍壊死因子受容体型ＩＩ、虚キナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体、血管内皮増殖因子、ならびにキメラタンパク質および生物学的にまたは免疫学的に活性なその断片、を含むがこれに限定されるものではない。
【００４６】
一特定実施形態として、治療剤はまた化学療法剤も含む。本発明の組成物に使用するために考察される化学療法剤には、限定されないが、メクロル−エタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファビランおよびクロラムブシルといったナイトロジェンマスタード類を含むアルキル化剤、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）といったニトロン尿素化合物、トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、トリエチレン、チオホスホラミド（チオテパ）、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ、アルトレタミン）といったエチレンイミン／メチルメラミン、ブスルファンといったスルホン酸アルキル、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）といったトリアジン類、メトトレキサートおよびトリメトレキサートといった葉酸類似物を含む代謝抵抗物質、５−フルオロウラシル、フルオロデオキシウリジン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ、シタラビン）、５−アザシチジン、２，２´−ジフルオロデオキシシチジンといったピリミジン類似体、６−メルカトプリン、６−チオグニアン、アザチオプリン、２´−デオキシコホルマイシン（ベントスタチン）、エリスロヒドロキシノニルアデニン（ＥＨＮＡ）、リン酸フルダラビン、および２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン、２−ＣｄＡ）といったプリン類似体、パクリタキセルといった細胞分裂抑制薬、ビンブラスチン（ＶＬＢ）、ビンクリスチンおよびビノレルビンを含むビンカアルカロイド、タキソテール、エストラムスチンおよびリン酸エストラムスチン、を含む天然品、エトポシドおよびテニポシド、といったエピポドフィロトキシン、アクチノマイシンＤ、ダウノマイシン（ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ミトキサントロン、イダルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、ミトマイシンＣ、およびアクチノマイシン、といった抗生物質、Ｌ−アスパラギナーゼといった酵素、インターフェロン−アルファ、ＩＬ−２、ＣＦＳおよびＧＭ−ＣＳＦといった生物学的修飾物質、シスプラチンおよびカルボプラチンといったプラチナ配位錯体、ミトキサントロンといったアントラセンジオン、ヒドロキシ尿素といった置換尿素、Ｎ−メチルヒドラジン（ＭＩＨ）およびプロカルバジンを含むメチルヒドラジン誘導体、ミトタン（ｏ，ｐ´−ＤＤＤ）およびアミノグルテチミドといった副腎皮質抑制剤、を含む多様な薬剤、プレドニゾンおよび相当物、デキサメタゾンおよびアミノグルテチミドといった副腎皮質ステロイド拮抗物質を含むホルモンおよび拮抗物質、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロンおよび酢酸メゲストロールといったプロゲスチン、ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオール相当物といったエストロゲン、タモキシフェンといった抗エストロゲン、プロピオン酸テストステロンおよびフルオキシメステロン／相当物を含むアンドロゲン、フルタミド、ゴナドトロピン放出ホルモン類似体およびロイプロリドといった抗アンドロゲン物質、ならびにフルタミドといった非ステロイド性抗アンドロゲン物質、が挙げられる。
【００４７】
治療の投与量はｍｇ／ｋｇで計測される量で投与され得る。開示された治療の予定ｍｇ／ｋｇ投与量は、約１ｍｇ／ｋｇ〜約６０ｍｇ／ｋｇである。投与量の特定範囲はｍｇ／ｋｇで、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、および約３０ｍｇ／ｋｇ〜約６０ｍｇ／ｋｇである。対象者への的確な有効量は、その対象者の体重、背格好および健康状態、病態の性質および程度、ならびに投与することを選択した治療、または治療の組み合わせによる。ある状態に治療上有効な量は、臨床医の技術および判断内での定期的な実験により判断可能である。
【００４８】
本明細書で使用される「有効量」とは、特定した疾患または症状を可視化するのに十分で、検出可能に標識されたポリペプチドの量、あるいは検出可能治療または阻害効果を示すことを意味する。例えば、効果は病態の改善または症状の緩和により検出可能である。対象者への的確な有効量は、その対象者の体重、背格好および健康状態、病態の性質および程度、ならびに投与することを選択した治療、または治療の組み合わせによる。ある状態に治療上有効な量は、臨床医の技術および判断内での定期的な実験により判断可能である。
組成物の可視化
【００４９】
標的バレット食道組織への結合の可視化は、当業者に既知の任意の手段によって実行できる。本明細書で述べられているように、例えば限定されないが、可視化は、体内、体外または原位置の可視化が可能である。本明細書において「可視化」および「検出」は同意で使用されている。
【００５０】
一実施形態において、可視化は画像を通じて行われており、巨視的規模（ミリメートルからセンチメートル）上の大きな粘膜表面上を高空間分解能で蛍光画像を集めるように特殊設計された広域の内視鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）を使用してもよい。この性能は、内視鏡検査中に疾患の疑いのある領域を突き止めた食道下部に見つかった、というような場合に大きな表面を迅速に検査するのに必要とされる［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｅｎｄｏｓｃｏｐｙ １９９９； ４９：４４７−５５］。この手法は蛍光検出に適応されており、染色標識探針に対応しているこの機器は、白色光（ＷＬ）、狭帯域画像（ＮＢＩ）および蛍光画像を含む３つの異なるモードで画像化することができる。狭帯域画像は、波長を制限する、または波長の範囲を絞り込む光学フィルターのあるスペクトルに変えることにより従来の白色光照射の変化を示す新たな技術である。
【００５１】
この方法は、腸上皮化生領域の血管構造に含まれるヘモグロビンの吸収を最大にするための光を向けることにより、食道粘膜のさらなる視覚の詳細を提供する内視鏡画像における対照を強化する。ＷＬおよびＮＢＩ画像は、中心の対物レンズにより収集され、蛍光画像は周辺に近い第２の対物レンズにより収集される。白色光の中心と蛍光対物レンズ間に約３ｍｍの距離があることにより、２つの画像にわずかな位置のずれが生じる。さらに、対照レンズからの破片を取り除く空気／水ノズル、および生検鉗子を届けるために使用できる８ｍｍの用具経路がある。対物レンズは前方視であり、視野（ＦＯＶ）を有し、１４０°の照射の最高角度により範囲が定まる。ＷＬ／ＮＢＩ画像モードは、被写界深度（ＤＯＦ）を有し、画像の焦点の合う内視鏡の遠心端から粘膜表面への距離、７〜１００ｍｍと蛍光用の距離５〜１００ｍｍ間の距離範囲により範囲が定まる。ＷＬ／ＮＢＩ用の粘膜から１０ｍｍの距離で測定された横断分析は１５μｍであり、蛍光用は２０μｍであった。キセノン光源は３つのモードに照射を提供し、そのことは画像処理プロセッサにあるフィルターホイールにより決められる。画像の３モード全てへの照射は２つのファイバー光ガイドを通じて届けられる。ＷＬモードでは、全可視スペクトル（４００〜７００ｎｍ）が提供され、一方ＮＢＩモードでは、フィルターホイールが赤、緑および青の枠にスペクトル帯を絞り込んでいる。蛍光モードでは、第２のフィルターホイールが照射路に入り、３９５〜４７５ｎｍスペクトル帯における蛍光励起を提供する。さらに、５２５〜５７５ｎｍからの照射は、５５０ｎｍで中心である緑スペクトル枠において反射光を提供する。蛍光画像は、励起光をブロックするための４９０〜６２５ｎｍ帯通過フィルターを有する周辺に位置するＣＣＤ検出器により収集される。正常な粘膜は明るい自己蛍光を発するため、画像の色は明るい緑が現れる。腫瘍性粘膜における血管系の増加により自己発光を吸収するため、低光度で現れる。
【００５２】
この医療用内視鏡は、ポリペプチド投与後および１）白色光、２）狭帯域、および蛍光で既知の異形成変化をしたバレット食道からの培養後の画像を集めるために使用可能である。食道下部に入った後、５秒間のビデオが収集され、白色光および狭帯画像モードで電子化される。このモードにおける画像は、ポリペプチド結合の総合評価用腸上皮化生の空間広がりを診断するのに使用される。次いで、約３ｍｌの蛍光標識されたポリペプチドが１０μＭの濃度で、化生性粘膜の全ての範囲を注意深くカバーするミスト散布カテーテルを用いて腸上皮化生に局所的に投与される。蛍光標識されたポリペプチド量は、当業者によって決定され得る。
【００５３】
次いで、胃洞、基底部、噴門および切痕、ならびに十二指腸の第１および第２部分を含む胃の定期的な内視鏡検査が行われ、ポリペプチドを計５分間培養した。次いで、内視鏡を食道下部に戻らせ、非結合ポリペプチド水でやさしく洗い、ポリペプチド標的蛍光画像の別の１０秒間のビデオを集めた。次いで、内視鏡的粘膜切除術（ＥＭＲ）の手法により食道下部の粘膜をひとまとめにして取り除き、組織検査に送った。
【００５４】
いくつかの実施形態において、検出可能標識は検出された放射性同位元素識別であり、いくつかの態様において放射性画像である。放射性画像は、放射性トレーサー物質を投与した後、身体の別部分から放射能を検出することにより画像を作成する方法であると当技術分野では理解されている。画像はコンピュータ上またはフィルム上に記録される。
【００５５】
本発明の他の方法は、患者から組織サンプルを得ることが必要である。この組織サンプルは、前記患者の組織または器官からなる群から選択される。
配合
【００５６】
１つの実施形態において、薬学的組成物は、特定の投与方法および剤形によって、担体、溶剤、安定剤、補助剤、希釈剤など、といった薬学的に許容される賦形剤で配合されていてもよい。薬学的組成物は通常、配合および投与の経路により、生理的に適合したｐＨ、約３〜約１１のｐＨ、約３〜約７のｐＨの範囲を達成する配合である。代替の実施形態において、ｐＨは約５．０〜約８の範囲に調節される。様々な態様において、薬学的組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と共に、本明細書に記載の少なくとも１つの化合物の治療効果のある量を含む。任意に、薬学的組成物は、本明細書に記載の化合物の組み合わせを含む、あるいは治療または細菌繁殖防止（例えば限定されないが、抗生物質または抗菌剤）において有用な第２の活性成分を含んでいてもよく、あるいは本発明のポリペプチドの組み合わせを含んでいてもよい。
【００５７】
適切な賦形剤は、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および不活性ウイルス粒子といった大きく、代謝の遅い高分子を含む担体分子でもよい。他の典型的な賦形剤には、抗酸化物質（例えば限定されないが、アスコルビン酸）、キレート剤（例えば限定されないが、ＥＤＴＡ）、炭水化物（例えば限定されないが、デキストリン、ヒドロキシアルキルセルロースおよびヒドロキシアルキルメチルセルロース）、ステアリン酸、液体（例えば限定されないが、油、水、生理食塩水、グリセリン、およびエタノール）湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質、等が挙げられる。
【００５８】
本発明は、本発明の例示的実施形態を詳述する以下の実施例を参照することにさらに十分に理解されよう。しかしながら、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本開示中の全ての参考文献は参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【実施例】
【００５９】
実施例１
【００６０】
ペプチド選択。ペプチド選択はファージ提示法（Ｐｈ．Ｄ．−７， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）の手法を使用して行われた。食道腺癌細胞株ＯＥ３３は、ＲＰＭＩ−１６４０培地に１０％ＦＢＳが補充され保存された。バレット食道（腸上皮化生）細胞株−ＫＲ４２４２１（Ｑ−ｈＴＥＲＴ、非異形成）は、無ケラチン細胞血清培地にウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ）およびヒト表皮成長因子（ｒＥＧＦ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）が補充され保存された。全細胞株は３７℃で５％ＣＯ２において培養された。
【００６１】
バイオパニングは減全細胞手法を用いて行われた。対数期増殖におけるＱ−ｈＴＥＲＴ細胞は、細胞分離緩衝剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）を使って切り離され、遮断緩衝剤（ウシ血清アルブミン１％のＰＢＳ）を使って４５分間、氷上でブロックされた。Ｐｈ．Ｄ．−７無作為ファージライブラリー（１．５×１０１１ プラーク形成単位）１０μｌを５ｍｌのＰＢＳに懸濁させ、１．０×１０７Ｑ−ｈＴＥＲＴ細胞で３０分間室温（ＲＴ）でバイオパニングした。細胞は、１０００ｒｐｍで６分間、遠心分離機の中で沈降させ、非結合ファージを含んだ上澄みを２回目の除去のために別の１．０×１０７Ｑ−ｈＴＥＲＴ細胞に移送した。次いで、得られた上澄みを増幅し、ＰＥＧ−ＮａＣｌで析出させ、製造業者の指示にしたがって力価を測定した。
【００６２】
ＯＥ３３食道腺癌細胞に結合するファージを強化するために、前のステップから１×１０１１ｐｆｕファージを、上述の通りに切り離されブロックされた１．０×１０６ＯＥ３３細胞に加えた。室温で穏やかに攪拌した後約３０分、細胞が沈降し、非結合ファージをもつ上澄みが捨てられた。細胞をＰＢＳ／０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０で計１０回洗浄した。次いで結合ファージを８分間、０．２Ｍグリシン１ｍ、ｐＨ２．２／０．１％ＢＳＡで溶出した。ファージを含んだ溶液は、１Ｍトリス１５０μＬ、ｐＨ９．５で速やかに中和された。増幅後、同量のファージを、溶出前の２分の溶出バッファー（０．２Ｍグリシン、ｐＨ２．２／０．１％ＢＳＡ）の洗浄以外は、同じ手順をもう一度行うためＯＥ３３細胞にパニングした。同じ手順の後にさらに２回、計４回のパニングが行われた。
【００６３】
最後のパニングから６０個のファージプラークが無作為に選択され、個別に増幅され、配列決定された（ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｒｅ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｈｉｇａｎ， ＭＩ）。得られたペプチド配列は、国立バイオテクノロジー情報センターＢＬＡＳＴ調査により、短くほぼ一致した選択肢を使用して相同配列をもつヒトタンパク質を特定するために分析された。
【００６４】
このファージのプールの配列を決定した後、４９のクローンが同じペプチド配列「ＳＮＦＹＭＰＬ」を有することがわかった。他の１１クローンが、それぞれ１つだけ現れた異なるペプチド配列を発現させた。
実施例２
【００６５】
ファージ結合アッセイ。ＯＥ３３細胞およびＱ−ｈＴＥＲＴ細胞は、上述の通りに切り離されブロックされた候補の「ＳＮＦＹＭＰＬ」−ファージまたは対照ファージ（無作為に挿入）が、ＯＥ３３細胞（１×１０７）またはＱ−ｈＴＥＲＴ細胞（１×１０７）で３０分、緩やかに攪拌し、室温で培養された。ＰＢＳ／０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０で１０回、０．２Ｍグリシン、ｐＨ２．２／０．１％ＢＳＡで２０分間１回洗浄した後、結合ファージは回収され標識された。各サンプルは３重に実行された。各サンプル中の結合ファージ量を、スチューデントのｔ検定を用いて算出した。
【００６６】
ファージ結合用細胞ＥＬＩＳＡアッセイ。ＯＥ３３細胞およびＱ−ｈＴＥＲＴ細胞は、９６−ウェルプレートにおいて１００％コンフルエンスになるように増殖され、２×１０７ｐｆｕ ＳＮＦＹＭＰＬ−ファージまたは対照ファージで連続して１０分間、３重に、室温で培養し、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで６回洗浄し、ＨＲＰ−標識した拮抗Ｍ１３抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ， Ｃｏｎｃｏｒｄ， ＭＡ）で培養し、ＴＭＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）で現像させ、吸光度６５０ｎｍが測定された（Ｅｍａｘ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）。
【００６７】
ペプチド検証。結合ファージ量の結果から、ＯＥ３３細胞を試験に使用した場合、ＳＮＦＹＭＰＬ−ファージ数は、対照ファージ（無作為に挿入）より約２５０倍多かった。この比率は、ファージがＱ−ｈＴＥＲＴ細胞に適用された時、３まで劇的に低下した（ｐ＜０．０１）（図１ａ）。ＥＬＩＳＡアッセイ上、ＳＮＦＹＭＰＬ−ファージのＯＥ３３細胞への結合の光学密度が２つのうちの１つの要素と言ってもよく、野生型ファージおよびファージ無し（背景対照）と比較したものより大きい。Ｑ−ｈＴＥＲＴ細胞への結合にはるかに低いＯＤが観察された（図１ｂ）。
【００６８】
ペプチド合成。ファージ結合アッセイにより特定された標的ペプチド配列「ＳＮＦＹＭＰＬ」は、標準フルオレニル−メトキシ−カルボニル（ＦＭＯＣ）化学構造を使用して合成され、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して最小の純度９０％に精製され、逆相ＨＰＬＣおよび質量分析法により分析された。蛍光染料ＦＩＴＣを、フレキシブルな５−アミノ酸リンカー（ＳＮＦＹＭＰＬ−ＧＧＧＳＫ−ＦＩＴＣ；配列番号６）を介してペプチドのＣ末端で共役させた。ＧＧＧＳＫは、このペプチドがＭ１３の外被タンパク質ｐＩＩＩに結合したものと同じリンカーである。標的ペプチドは、配列「ＮＬＭＰＹＦＳ−ＧＧＧＳＫ」（配列番号７）を形成するようにスクランブル化され、上述したように対照として使用するために合成された。
【００６９】
競合阻害アッセイ。ＯＥ３３細胞およびＱ−ｈＴＥＲＴ細胞は切り離され、ブロックされた。ＳＮＦＹＭＰＬファージ２×１０１１ｐｆｕは、ＯＥ３３細胞（１×１０７）またはＱ−ｈＴＥＲＴ細胞（１×１０７）と共に培養され、ファージと競合するために、「ＳＮＬＭＰＹＦＳ−ＧＧＧＳＫ」ペプチドまたはスクランブルペプチド「ＮＬＭＰＹＦＳ−ＧＧＧＳＫ」が細胞ファージ混合物中に濃度１００、２００および４００μｍで加えられた。ＰＢＳ／０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０で３回、０．２Ｍグリシン、ｐＨ２．２／０．１％ＢＳＡで２分間１回洗浄した後、この結合ファージを回収し標識した。各サンプルは３重に行われた。各サンプル中の結合ファージ量はスチューデントのｔ検定を用いて算出された。
【００７０】
ＦＩＴＣ標識ペプチドと非標識ペプチドとの間の競合阻害は、ＦＩＴＣ標識ペプチド（１００μｍ）を３種類の異なる濃度１００、５００および１０００μｍに加える前に、非標識ペプチドをＯＥ３３細胞で１５分間培養することにより行われた。３つの蛍光画像が、同じ獲得時間および曝露時間を使用したチャンバースライドの各ウェルから２００倍で収集さられた。分析用に選択された画像は以下の条件に合致していた。１）７０〜９０％細胞コンフルエンス、２）各ウェルの端から離れている、３）スライドの細胞のない場所での低い背景結合、４）細胞形質変化が無い。３つの２００倍表示下での平均細胞数がペプチド結合細胞の割合を算出するために記録された。蛍光輝度の定量化が、ＮＩＨ画像Ｊソフトウェアにより同じしきい値の下、各グループ間のピクセル値を算出して行われた。平均蛍光輝度における違いは、スチューデントのｔ検定を用いて端を比較した。
【００７１】
ＳＮＦＹＭＰＬファージＯＥ３３細胞の結合能力が挿入ペプチドに依存するが、他のファージ被膜タンパク質吸収には依存しないことをさらに証明するために、「ＳＮＦＹＭＰＬ−ＧＧＧＳＫ」ペプチドが、ＯＥ３３細胞上ＳＮＦＹＭＰＬ−ファージと競合させるために使用された。スクランブルペプチド「ＮＬＭＰＹＦＳ−ＧＧＧＳＫ」が対照として使用された。「ＳＮＦＹＭＰＬ−ＧＧＧＳＫ」は、ＳＮＦＹＭＰＬ−ファージがＯＥ３３細胞と結合するのを明らかに阻害でき、この能力は濃度依存であった。スクランブルペプチドである「ＮＬＭＰＹＦＳ−ＧＧＧＳＫ」は、ＳＮＦＹＭＰＬ−ファージに対して阻害能力を有してはいなかった（図２）、このことはＳＮＦＹＭＰＬ−ファージ結合能力が挿入ペプチドに由来すること、およびこれは特異的結合であることを示した。
実施例３
【００７２】
培養細胞上のペプチド結合の蛍光画像。ＯＥ３３細胞およびＱ−ｈＴＥＲＴ細胞を、チャンバースライドの中で８０％コンフルエンスに増殖した。これらの細胞への非特異的結合のブロックを、３０分間ＰＢＳ中に希釈した２００μｌの１％ＢＳＡを加えることにより行った。次いでこれらの細胞を、候補のＦＩＴＣ−標識されたペプチド１００μｍｏｌで、無血清培地において、１０分間、室温で培養した。これらの細胞を、３回、２００μＬのＰＢＳ／０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０を使用して室温で洗浄した。これらの細胞を氷冷の４％パラホルムアルデヒド中で５分間固定した。次いでこれらの細胞を、ＤＡＰＩを含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤で染色した。蛍光画像が、共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ １０００）を使用して２００倍で収集された。３画像におけるこれらの細胞からの蛍光輝度は、ＮＩＨ画像Ｊソフトウェアを使用してペプチド結合を判断するために平均化された。
【００７３】
蛍光顕微鏡下で、ＳＮＦＹＭＰＬ−ＧＧＧＳＫ−ＦＩＴＣは９０％超のＯＥ３３細胞の細胞膜に結合するが、Ｑ−ｈＴＥＲＴ（正常バレットの）細胞には結合しなかった（図３）。ＯＥ３３の細胞表面への結合に関わる輝度は、ＮＩＨ画像Ｊソフトウェア分析を使用して、Ｑ−ｈＴＥＲＴの６９．０３３±１８．００７（平均濃淡値）と比較して、２５．７３８±２．５０４（平均濃淡値）であった。
【００７４】
本明細書において、ＳＮＦＹＭＰＬペプチドが疾患組織に対して高親和性および特異性を有していること、顕微鏡画像上で検出可能であり、組織生検を指針し、前癌状態の粘膜の検出率を高めることが示された。
実施例４
【００７５】
「ＡＳＹＮＤＡ」（配列番号５）に親和結合する腺癌細胞上の細胞膜標的の特定。標的ペプチドのカルボキシル末端は、ＥＤＣ作用を使用した親和性カラムビーズに連結した。Ｓｅｇ−１の細胞は、増殖して密集し、超音波処理により溶解し、遠心分離により分別された。得られた膜画分はカラムを標識した標的ペプチドに適用され、特定の結合タンパク質が溶出した。これらのタンパク質は分離し、Ｂｅｃｋｍａｎ ＰＦ ２Ｄ液体クロマトグラフィー装置を使用した逆相カラムにより画分で回収された。タンパク質画分を、ニトロセルロース被覆マイクロアレイプリンタースライド上にスポットし、ＦＩＴＣ−標識した標的ペプチドで検査した。各スポットの蛍光輝度はＡｘｏｎ Ｉｍａｇｅｒで数値化された。高輝度のタンパク質画分は、トリプシン処理され、Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＬＴＱ線形イオントラップ質量分析計を使用してプロテオーム解析が行われた。タンパク質同一性がＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｄｅｘ（ＩＰＩ）のデータベース検索を使用して、ＳＥＱＵＥＳＴプログラム、オープンソースであるＸｔａｎｄｅｍならびにペプチドおよびタンパク質プロフェットソフトウェアを利用して確認された。標的ペプチド「ＡＳＹＮＤＹＡ」（１００μＭ）（配列番号５）は、ＳＥＧ１（腺癌）上の細胞表面の標的への優先結合を示し、ＯＥ−２１（扁平上皮）およびＱ−ｈＴＥＲＴ（腸上皮化生）細胞には結合しないことを示した。細胞表面の標的には、Ａｎｎｅｘｉｎ Ａ２、肝細胞癌由来の増殖因子、ヒストンＨ２Ｂ、ヒストンＨ２ＡおよびＪｕｎｃｔｉｏｎプラコグロブリンが含まれた。特定した標的のリストである下記の表１を参照のこと。特定されたタンパク質全てが、完全に一致したか、または＞０．９９であった。タンパク質のいくつかは通常核中で発見されるが、これらのタンパク質が癌細胞において、中でもヒストン、が細胞膜に移動することを示す形跡がある。
【表１】
実施例５
蛍光認識されたＳＮＦポリペプチドの食道粘膜表面上のバレット異形成への優先結合の確認。
【００７６】
ヒト内視鏡的粘膜切除述（ＥＭＲ）の標本を異形成粘膜の疑いのある領域から新たに採取した。各標本は、配列番号１のＦＩＴＣ−標識したポリペプチドで、濃度１００μｍで５分間培養された。方向づけに１２時の位置をマークするためにインクが使用された。白色光の立体顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＳＺＸ１６）画像が、オーバーレイする２０×２０ｍｍグリッドで得られ、組織像を記録した。蛍光画像が１２ミリ秒の曝露において得られた。次いで組織をホルマリンに入れた。蛍光画像では見えないが、ＧＩ病理学の専門家が標本を縦方向に断面約２ｍｍ区間に沿って区分し、病理組織を解釈した。各１ｍｍ区間における蛍光画像平均輝度は、ＮＩＨ画像Ｊ処理ソフトウェアを使用して測定され、組織像を比較した。
【００７７】
蛍光輝度は、ｎ＝９対象から集めたｎ＝９ＥＭＲ標本からの計２７７位置から測定された。これらの区間は、組織画像上の扁平上皮（ｎ＝１０７）、腸上皮化生（ｎ＝６６）、異形成（ｎ＝６９）、および正常胃粘膜（ｎ＝３５）で見られた。異形成、腸上皮化生、扁平上皮、および胃粘膜の平均輝度値は、階調レベルがそれぞれ５６．５±、４２．１±、２７．１±、および２４．１±であった。分散統計は、１３．２（ｐ＝＜０．０００１）のＦ−統計を示した。ｔ検定の２サンプルは、異形成の平均輝度値が、腸上皮化生（ｔ＝２．２、ｐ＜０．０５）、扁平上皮（ｔ＝５．２、ｐ＜０．０１）および胃粘膜（ｔ＝５．０１、ｐ＜０．０１）の平均輝度値よりも高いことを示した。腸上皮化生の平均輝度が、扁平上皮（ｔ＝３．０６、ｐ＜０．０１）および胃粘膜（ｔ＝３．０４、ｐ＜０．０１）の平均輝度よりも高かった。扁平上皮と胃粘膜間の平均輝度値においては統計的に大きな違いはなかった（ｔ＝０．３８、ｐ＝０．７１）。
【００７８】
そのため、バレット異形成への新規蛍光−標識されたＳＮＦペプチドの選択的結合は、センチメートル規模の粘膜表面上で実証された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列（ＳＮＦＹＭＰＬ）、リンカー配列、および検出可能マーカーから本質的になるポリペプチドを含む組成物であって、前記検出可能マーカーは前記リンカーを通じて前記ポリペプチドに結合し、前記リンカーは正味の中性電荷を有し、前記リンカーの存在は、前記リンカーのない場合のバレット食道組織への前記ポリペプチド配列の検出可能な結合と比較して、バレット食道組織への前記ポリペプチド配列の検出可能な結合を増加させる、組成物。
【請求項２】
前記ポリペプチドが配列番号１に示される前記アミノ酸配列からなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記リンカーの末端アミノ酸がリジンである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記リンカーが配列番号２で示される配列（ＧＧＧＳＫ）を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記検出可能マーカーがフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的組成物。
【請求項７】
追加部分をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項かに記載の組成物。
【請求項８】
前記部分が、化学療法剤、治療剤、ポリペプチド、抗体、核酸、低分子、またはそれらの組み合わせからなる群から選ばれる、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
腺癌細胞を検出する方法であって、前記腺癌細胞を検出するのに有効な量の請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物を、バレット食道組織に投与するステップを含み、前記組成物が非癌性細胞と比べて前記腺癌細胞に優先的に結合する特性を有する、方法。
【請求項１０】
ヒトにおける異形成バレット食道治療の有効性を判断する方法であって、異形成バレット食道を標識するのに有効な量の請求項１〜８のいずれかに記載の組成物を、前記ヒトに投与するステップと、請求項１〜８のいずれかに記載の組成物で標識された細胞の第１の量を可視化するステップと、前記第１の量を、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物で標識された細胞の以前に可視化された第２の量と比較するステップと、を含み、標識された細胞の前記以前に可視化された量と比べて、標識された細胞の前記第１の量の減少は、効果的な治療を示す、方法。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれかに記載の組成物により標識された前記細胞の生検を得ることをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物が、異形成バレット食道の臨床的発症後に投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
請求項６に記載の薬学的組成物、前記組成物の使用のための説明書、および前記医薬薬学的組成物を患者に投与するためのデバイスを含む、キット。
【請求項１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列（ＳＮＦＹＭＰＬ）、リンカー配列、および検出可能マーカーから本質的になるポリペプチドを含む組成物であって、前記検出可能マーカーは前記リンカーを通じて前記ポリペプチドに結合し、前記リンカーは正味の中性電荷を有し、前記リンカーの存在は、前記リンカーのない場合のバレット食道組織への前記ポリペプチド配列の検出可能な結合と比較して、バレット食道組織への前記ポリペプチド配列の検出可能な結合を増加させる、組成物。
【請求項２】
前記ポリペプチドが配列番号１に示される前記アミノ酸配列からなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記リンカーの末端アミノ酸がリジンである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記リンカーが配列番号２で示される配列（ＧＧＧＳＫ）を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記検出可能マーカーがフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的組成物。
【請求項７】
追加部分をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項かに記載の組成物。
【請求項８】
前記部分が、化学療法剤、治療剤、ポリペプチド、抗体、核酸、低分子、またはそれらの組み合わせからなる群から選ばれる、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
腺癌細胞を検出する方法であって、前記腺癌細胞を検出するのに有効な量の請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物を、バレット食道組織に投与するステップを含み、前記組成物が非癌性細胞と比べて前記腺癌細胞に優先的に結合する特性を有する、方法。
【請求項１０】
ヒトにおける異形成バレット食道治療の有効性を判断する方法であって、異形成バレット食道を標識するのに有効な量の請求項１〜８のいずれかに記載の組成物を、前記ヒトに投与するステップと、請求項１〜８のいずれかに記載の組成物で標識された細胞の第１の量を可視化するステップと、前記第１の量を、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物で標識された細胞の以前に可視化された第２の量と比較するステップと、を含み、標識された細胞の前記以前に可視化された量と比べて、標識された細胞の前記第１の量の減少は、効果的な治療を示す、方法。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれかに記載の組成物により標識された前記細胞の生検を得ることをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物が、異形成バレット食道の臨床的発症後に投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
請求項６に記載の薬学的組成物、前記組成物の使用のための説明書、および前記医薬薬学的組成物を患者に投与するためのデバイスを含む、キット。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図２】
【図３】
【図１ｂ】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２０１２−５２４０７９（Ｐ２０１２−５２４０７９Ａ）
【公表日】平成２４年１０月１１日（２０１２．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０５９９９（Ｐ２０１２−５０５９９９）
【出願日】平成２２年４月１９日（２０１０．４．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３１６３８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２１２６６
【国際公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【出願人】（５０３２４９４１８）ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン (8)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１０月１１日（２０１２．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月１９日（２０１０．４．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３１６３８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２１２６６
【国際公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【出願人】（５０３２４９４１８）ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン (8)
【Ｆターム（参考）】
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