有用部分の生産性が高められた植物及びその作製方法
【課題】有用部分の生産性が高められた植物およびその作製方法を提供することを主な課題とする。
【解決手段】（ａ）イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、（ｂ）５−ホスホメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド、及び、（ｃ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、からなる群より選択される少なくとも１種で形質転換され、且つ、有用部分の生産性が高められた、形質転換植物。有用部分の生産性が高められた植物を作製する方法、並びに、該方法により作製された有用部分の生産性が高められた植物、及び、その有用部分。植物の有用部分の生産性を高める方法。有用部分の生産性が高められた植物を作製するためのキット。
【解決手段】（ａ）イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、（ｂ）５−ホスホメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド、及び、（ｃ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、からなる群より選択される少なくとも１種で形質転換され、且つ、有用部分の生産性が高められた、形質転換植物。有用部分の生産性が高められた植物を作製する方法、並びに、該方法により作製された有用部分の生産性が高められた植物、及び、その有用部分。植物の有用部分の生産性を高める方法。有用部分の生産性が高められた植物を作製するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主に、有用部分の生産性が高められた植物及びその作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イソプレンは、多くの高等植物、特にユーカリやポプラといった落葉広葉樹から多量に放出されている炭素数５のテルペノイドとして知られ、高等植物の細胞においてイソプレンは、クロロプラスト内で非メバロン酸経路を介して、ジメチルアリルピロリン酸からイソプレン合成酵素の働きにより生合成される。地球レベルで見た植物からのイソプレン年間総放出量は莫大で、炭素量換算で５ｘ１０１４ｇｙｒ−１にものぼるが、それにも関わらず、植物にとっての意義は未解明のままである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、有用部分の生産性が高められた植物及びその作製方法を提供することを主な課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、当初、植物におけるイソプレンの生産及び放出の生理学的役割の一部を解明することを主目的として研究を開始したところ、鋭意研究を重ねるうちに、イソプレンの大気放出量が少ないと報告されているシロイヌナズナに、イソプレン生成に至る反応を触媒する酵素の遺伝子を導入することにより得られた形質転換シロイヌナズナの葉の重量、サイズ及び数が、野生型のシロイヌナズナよりも増大していることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
本発明は、主に、以下の事項に関する。
［項１］
（ａ）イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）５−ホスホメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド、及び、
（ｃ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択される少なくとも１種で形質転換され、且つ、有用部分の生産性が高められた、形質転換植物。
［項２］下記（１）〜（３）からなる群より選択される少なくとも１の特徴を有する、項１に記載の形質転換植物：
（１）イソプレン合成酵素、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、及び、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼからなる群より選択される少なくとも１種の発現量が野生型よりも高い、
（２）イソプレン合成酵素、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、及び、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼからなる群より選択される少なくとも１種のｍＲＮＡの発現量が野生型よりも高い、並びに、
（３）イソプレンの放出量が野生型よりも多い。
［項３］イソプレン放出量が、野生型の１５０〜３０００％である、項１又は２に記載の形質転換植物。
［項４］
有用部分が、葉、茎、幹、根、果実、花、種子、樹皮及び地下茎からなる群より選択される少なくとも１種、或いは、その一部である、項１〜３のいずれかに記載の形質転換植物。
［項５］さらに、下記（Ａ）〜（Ｇ）からなる群より選択される少なくとも１の特徴を有する、項１〜４のいずれかに記載の形質転換植物：
（Ａ）農薬耐性が野生型よりも高い、
（Ｂ）重金属耐性が野生型よりも高い、
（Ｃ）病害虫耐性が野生型よりも高い、
（Ｄ）低温耐性が野生型よりも高い、
（Ｅ）塩耐性が野生型よりも高い、
（Ｆ）乾燥耐性が野生型よりも高い、及び、
（Ｇ）弱光耐性が野生型よりも高い。
［項６］食用、食品又は食品組成物製造用、化粧品製造用、医薬品製造用、工業製品製造用、鑑賞用、森林再生用、砂漠再生用及びファイトリメディエーション用からなる群より選択される少なくとも１種の用途に使用される、項１〜５のいずれかに記載の形質転換植物。
［項７］種子、芽生え、稚苗、中苗、成苗、又は、これらの間の成長過程にある植物体である、項１〜６のいずれかに記載の形質転換植物。
［項８］
（ａ）イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）５−ホスホメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド、及び、
（ｃ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択される少なくとも１種がホモ接合型で細胞染色体に組み込まれている、項１〜７のいずれかに記載の形質転換植物。
［項９］
（Ｉ） （ａ）イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）５−ホスホメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド、及び、
（ｃ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択される少なくとも１種を植物細胞に導入することにより、形質転換体を得る工程を包含する、有用部分の生産性が高められた植物を作製する方法。
［項１０］
さらに、（ＩＩ）下記の（ｉ）〜（ｉｖ）からなる群より選択される少なくとも１を実施する工程：
（ｉ） 有用部分の重量、大きさ及び数の少なくとも１について、前記工程（Ｉ）で得られた形質転換体と野生型とを比較し、該有用部分の重量、大きさ及び数の少なくとも１が野生型よりも大きい形質転換体を選択すること、
（ｉｉ）イソプレン合成酵素、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、及び、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼからなる群より選択される少なくとも１種の発現量について、前記工程（Ｉ）で得られた形質転換体と野生型とを比較し、発現量が野生型よりも高い形質転換体を選択すること、
（ｉｉｉ）イソプレン合成酵素、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、及び、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼからなる群より選択される少なくとも１種のｍＲＮＡの発現量について、前記工程（Ｉ）で得られた形質転換体と野生型とを比較し、該ｍＲＮＡの発現量が野生型よりも高い形質転換体を選択すること、並びに、
（ｉｖ）イソプレン放出量について、前記工程（Ｉ）で得られた形質転換体と野生型とを比較し、該イソプレン放出量が野生型よりも多い形質転換体を選択すること、
を包含する、項９に記載の有用部分の生産性が高められた植物を作製する方法。
［項１１］項９又は１０に記載の方法により作製された、有用部分の生産性が高められた植物。
［項１２］項１１に記載の植物の有用部分。
［項１３］
（ａ）イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）５−ホスホメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド、及び、
（ｃ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択される少なくとも１種を植物細胞に導入する工程を包含する、植物の有用部分の生産性を高める方法。
［項１４］
（ａ）イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）５−ホスホメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド、及び、
（ｃ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択される少なくとも１種を有する植物発現用プラスミドを備える、有用部分の生産性が高められた植物を作製するためのキット。
［項１５］さらに、（ｄ）イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼをコードするポリヌクレオチドで形質転換されている、項１〜８のいずれかに記載の形質転換植物。
［項１６］（ｄ）イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼをコードするポリヌクレオチドを植物細胞に導入することにより、形質転換体を得る工程をさらに包含する、項９に記載の有用部分の生産性が高められた植物を作製する方法。
［項１７］項１６に記載の方法により作製された、有用部分の生産性が高められた植物。
［項１８］項１７に記載の植物の有用部分。
［項１９］さらに、（ｄ）イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼをコードするポリヌクレオチドを植物細胞に導入する工程を包含する、項１３に記載の植物の有用部分の生産性を高める方法。
［項２０］さらに、（ｄ）イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼをコードするポリヌクレオチドを有する植物発現用プラスミドを備える、項１４に記載の有用部分の生産性が高められた植物を作製するためのキット。
［項２１］項１４に記載の植物発現用プラスミドが、（ｄ）イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼをコードするポリヌクレオチドをさらに有する、項１４に記載の有用部分の生産性が高められた植物を作製するためのキット。
【０００６】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【０００７】
イソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン）は、多くの植物に存在しているテルペン類（イソプレノイド類）の構成単位であり、構造式ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＨ＝ＣＨ２で表される共役二重結合をもつ炭化水素である。イソプレンは、多くの植物で放出され、特に、ユーカリやポプラといった広葉樹から多量に放出されることが知られている。イソプレンは、針葉樹や草本でも生産されるが、通常、広葉樹と比べて放出量が少ない。イソプレンの放出量が少ない種としては、例えば、マメ科、イネ科、クマツヅラ科の植物が例示される。
【０００８】
イソプレンは、イソプレンの前駆体であるジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）が酸化的に脱リン酸されて生成される。この反応を触媒するのがイソプレン合成酵素である。ＤＭＡＰＰは、イソペンテニル二リン酸Δ-イソメラーゼの作用により、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）が異性化されて生成される。イソペンテニル二リン酸Δ-イソメラーゼによる異性化反応は、ＤＭＡＰＰとＩＰＰとの間で双方向に起こる。すなわち、ＤＭＡＰＰとＩＰＰは、イソペンテニル二リン酸Δ-イソメラーゼにより相互変換されている。ＩＰＰ／ＤＭＡＰＰを生合成する経路には、従来から知られていた「メバロン酸経路」と未解明な「非メバロン酸経路（１−デオキシキシルロース経路）」の２種類の経路があることが最近の研究によりわかった。メバロン酸経路は、ほとんど全ての生物が備えていると考えられる。メバロン酸経路の律速段階は、ヒドロキシメチルグルタミル補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）がメバロン酸に還元される反応であり、これが名称の由来であると考えられる。
【０００９】
一方、ＩＰＰ又はＤＭＡＰＰから、ゲラニルピロリン酸を経てテルペノイド、ステロイド、カロテノイド、天然ゴムなどが生合成される。
【００１０】
即ち、大きく分けて、ＩＰＰからＤＭＡＰＰを経由してイソプレンを合成するパスウエイと、ＩＰＰ又はＤＭＡＰＰからゲラニルピロリン酸に行くパスウエイの２つが存在する。前者が律速の場合はイソプレンが多量合成され、大気放出される。後者が律速の場合はイソプレンが生成されないで、他の２次代謝産物が多量合成される。
【００１１】
メバロン酸経路の反応は、以下の通りである。
【００１２】
【化１】
【００１３】
上記反応７により生成されるＤＭＡＰＰがイソプレン合成酵素により脱リン酸されてイソプレンが生成する。一方、ＩＰＰ又はＤＭＡＰＰは、２次代謝を受けて、テルペノイドなどの複雑な化合物を生成する。
【００１４】
本発明は、（ａ）イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、（ｂ）５−ホスホメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド、及び、（ｃ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、からなる群より選択される少なくとも１種で形質転換され、且つ、有用部分の生産性が高められた、形質転換植物を提供する。
【００１５】
（ａ）イソプレン合成酵素は、ＤＭＡＰＰからイソプレンを合成する反応を触媒する酵素である。
【００１６】
イソプレン合成酵素としては、イソプレン合成酵素を生産するあらゆる種に由来するものが挙げられるが、その中でも、例えば、高等植物又はシダ植物に由来のものが好ましく、特に、広葉樹、シダ類、針葉樹等のイソプレンの放出量が多い種に由来するものが好ましい。特に、イソプレンの放出量が多いヤナギ科（例えば、ポプラ）、フトモモ科（例えば、ユーカリ）、ブナ科（例えば、コナラ属クヌギ、コナラ属ナラガシワ）、オシダ科（例えば、オシダ）等が好ましい。一例として、ヤナギ科のポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ａｌｂａ）のイソプレン合成酵素のアミノ酸配列を配列番号４（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＢＡＤ９８２４３）、及び、マメ科のクズ（Ｐｕｅｒａｒｉａ ｍｏｎｔａｎａ ｖａｒ． ｌｏｂａｔａ）のアミノ酸配列を配列番号１０（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＡＡＱ８４１７０）に示す。イソプレン合成酵素には、例えば、配列番号４又は１０に示されるアミノ酸配列と約８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは約９０％以上、より好ましくは９３％、より好ましくは約９６％以上、さらに好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するイソプレン合成酵素が含まれる。
【００１７】
イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチドとしては、前記イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチドが好適である（ここで、各アミノ酸に対応するコドンは、いかなるものであってもよい）。イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチドの一例として、配列番号３にポプラのイソプレン合成酵素遺伝子の塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＡＢ１９８１８０）及び配列番号９にクズのイソプレン合成酵素遺伝子の塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＡＹ３１６６９１）を示す。イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチドには、配列番号３又は９に示される塩基配列と約８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは約９０％以上、より好ましくは９３％、より好ましくは約９６％以上、さらに好ましくは約９８％以上の同一性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。
【００１８】
（ｂ）５-ホスホメバロン酸キナーゼ(EC 2.7.4.2)は、前記反応５（５−ホスホメバロン酸＋ＡＴＰ → ５−ジホスホメバロン酸＋ＡＤＰ）を触媒する酵素である。
【００１９】
５-ホスホメバロン酸キナーゼとしては、５-ホスホメバロン酸キナーゼを生産するあらゆる種に由来するものが挙げられるが、その中でも、例えば、酵母、細菌、植物、動物由来のもの、特に、酵母、植物、細菌由来のものを好適に用いることができる。一例として、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の５-ホスホメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列を配列番号６（Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号：ＡＡＡ３４５９６）に示す。５-ホスホメバロン酸キナーゼには、例えば、配列番号６に示されるアミノ酸配列と約８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは約９０％以上、より好ましくは９３％、より好ましくは約９６％以上、さらに好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する５-ホスホメバロン酸キナーゼが含まれる。
【００２０】
５−ホスホメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチドとしては、前記５−ホスホメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチドが好適である（ここで、各アミノ酸に対応するコドンは、いかなるものであってもよい）。５−ホスホメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチドの一例として、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の５−ホスホメバロン酸キナーゼ遺伝子の塩基配列を配列番号５（Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号：Ｍ６３６４８）に示す。５−ホスホメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチドには、配列番号５に示される塩基配列と約８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは約９０％以上、より好ましくは９３％、より好ましくは約９６％以上、さらに好ましくは約９８％以上の同一性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。
【００２１】
（ｃ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(EC 4.1.1.33)は、反応６（５−ジホスホメバロン酸＋アデノシン三リン酸 → ＩＰＰ＋二酸化炭素＋リン酸＋ＡＤＰ）を触媒する酵素である。
【００２２】
ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼとしては、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼを生産するあらゆる種に由来するものが挙げられるが、その中でも、例えば、酵母、細菌、植物、動物由来のもの、特に、酵母、細菌、植物、由来のものを好適に用いることができる。一例として、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列を配列番号８（Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号：ＣＡＡ６６１５８）に示す。ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼには、例えば、配列番号８に示されるアミノ酸配列と約８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは約９０％以上、より好ましくは９３％、より好ましくは約９６％以上、さらに好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼが含まれる。
【００２３】
ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドとしては、前記ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドが好適である（ここで、各アミノ酸に対応するコドンは、いかなるものであってもよい）。ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドの一例として、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ遺伝子の塩基配列を配列番号７（Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号：Ｘ９７５５７）に示す。ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドには、配列番号７に示される塩基配列と約８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは約９０％以上、より好ましくは９３％、より好ましくは約９６％以上、さらに好ましくは約９８％以上の同一性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。
【００２４】
本発明の形質転換植物は、前記（ａ）イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、（ｂ）５−ホスホメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド、及び、（ｃ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも１種（以下、（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドと称する場合もある）を植物細胞に導入することにより得ることができる。
【００２５】
本発明の１つの実施形態に従って、前記（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドに加え、（ｄ）イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼをコードするポリヌクレオチドを植物細胞に導入してもよい。（ｄ）イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼ（ＥＣ ５．３．３．２）は、ＩＰＰとＤＭＡＰＰとの間の異性化反応を双方向に触媒する酵素である。
【００２６】
例えば、（ａ）イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチドと共に、（ｄ）イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼをコードするポリヌクレオチドを導入することにより、ＩＰＰ→ＤＭＡＰＰ→イソプレンという一連のパスウエイを促進させることができ、結果的に有用部分の生産性を効率的に高めることができると考えられる。また、例えば、（ｂ）５−ホスホメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド及び／又は（ｃ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドと共に、（ｄ）イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼをコードするポリヌクレオチドを導入することにより、前記反応５及び／又は反応６→ＩＰＰ→ＤＭＡＰＰという一連のパスウエイを促進させることができ、延いてはＤＭＡＰＰ→イソプレンの反応を促進させることができ、結果的に有用部分の生産性を効率的に高めることができると考えられる。
【００２７】
イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼとしては、イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼを生産するあらゆる種に由来するものが挙げられるが、その中でも、例えば、酵母、細菌、植物、動物由来のもの、特に、酵母、細菌、植物由来のものを好適に用いることができる。一例として、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のイソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼのアミノ酸配列を配列番号１２（Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号：ＡＡＡ３４７０８）に示す。イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼには、例えば、配列番号１２に示されるアミノ酸配列と約８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは約９０％以上、より好ましくは９３％、より好ましくは約９６％以上、さらに好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するイソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼが含まれる。
【００２８】
イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼをコードするポリヌクレオチドとしては、前記イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼをコードするポリヌクレオチドが好適である（ここで、各アミノ酸に対応するコドンは、いかなるものであってもよい）。イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼをコードするポリヌクレオチドの一例として、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のイソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼ遺伝子の塩基配列を配列番号１１（Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号：Ｊ０５０９０）に示す。イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼをコードするポリヌクレオチドには、配列番号１１に示される塩基配列と約８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは約９０％以上、より好ましくは９３％、より好ましくは約９６％以上、さらに好ましくは約９８％以上の同一性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。
【００２９】
なお、（ｄ）のポリヌクレオチドの形質転換、スクリーニング等の各種操作は、以下に記載する（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドと同様の方法により行なうことができる。また、形質転換において、（ｄ）のポリヌクレオチドは、（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドと一緒に発現プラスミドに挿入されて植物細胞に導入されてもよいし、（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドとは別に発現プラスミドに挿入されて植物細胞に導入されてもよい。また、（ｄ）のポリヌクレオチドの導入と（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドの導入の順序は問わない。
【００３０】
（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドは、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＥＭＳＡ法、自動合成等の常法により入手することができる。
【００３１】
例えば、ＰＣＲ法は、基本的に、鋳型となり得るポリヌクレオチド、フォワードプライマー及びリバースプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ（デオキシヌクレオシド三リン酸の混合物）、及びＰＣＲバッファーを含む一反応液を、温度変化を伴う（１）変性（２）アニーリング（３）伸長の３つのステップに繰り返し供することにより、フォワードプライマー及びリバースプライマーの間に挟まれた特定のポリヌクレオチドを増幅する方法である。例えば、イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチドを増幅する場合、鋳型となり得るポリヌクレオチドとしては、例えば、イソプレン合成酵素遺伝子を発現する生物から作製されたゲノムＤＮＡ、ゲノムライブラリー、ｃＤＮＡライブラリー等を用いることができる。フォワードプライマー及びリバースプライマーは、例えば、イソプレン合成酵素遺伝子の５’末端又はその周辺、及び、３’末端又はその周辺に位置する任意の約１０〜３０ｂｐのヌクレオチド配列に基づき設計され得、自動合成等の常法により合成することができる。増幅される配列が開始コドンを含んでいない場合、開始コドンをｉｎ−ｆｒａｍｅで含むようフォワードプライマーを設計するか、後述の発現ベクターにｉｎ−ｆｒａｍｅで開始コドンを導入しておく。ＤＮＡポリメラーゼとしては、市販の耐熱性ポリメラーゼ、例えば、Ｐｆｕ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、Ｔａｑ（ＴＯＹＯＢＯ社製）、ＫＯＤ（ＴＯＹＯＢＯ社製）、Ｖｅｎｔ（ＮＥＢ社製）、ＥｘＴａｑ（ＴａＫａＲａ社製）、ＰｌａｔｉｎｕｍＰｆｘ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等を好適に用いることができる。ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅとしては、市販されているｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの混合物を好適に用いることができる。ＰＣＲバッファーは、使用するＤＮＡポリメラーゼ等に応じて適宜選択され、市販品又はＤＮＡポリメラーゼの添付品を好適に用いることができる。ＰＣＲ反応は、慣用的な手順に従って又はＤＮＡポリメラーゼの指示書に従って行なうことができる。また、当業者であれば、温度、時間、サイクル数、反応組成等のＰＣＲ反応条件を適宜変更することができる。
【００３２】
前記（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドは、発現ベクターへ連結された発現プラスミドとして植物細胞に導入されることが望ましい。
【００３３】
発現ベクターとしては、宿主において自律複製可能又は染色体中への組み込みが可能で、ポリヌクレオチドの転写を可能にする位置にプロモーターを含有しているものが好適に用いられる。ＰＣＲによって増幅されたポリヌクレオチドの５’末端は、直接又は適当な配列（例えば、制限酵素認識部位）を介してｉｎ−ｆｒａｍｅでプロモーターの３’末端へ連結される。発現ベクターは、さらに、植物細胞用エンハンサー（例えば、ＥＬ２エンハンサー、ＣａＭＶ３５Ｓエンハンサー等）、選択マーカー遺伝子、標識タグ等を含有してもよい。終止コドンは、必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に配置されることが好ましい。また、アミノ酸配列を参考にして、ポリヌクレオチドをｉｎ−ｆｒａｍｅで発現プロモーター、エンハンサー、開始コドン等と連結することができる。各種塩基配列及びアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬ等の検索システムから入手できる。また、アミノ酸配列は、塩基配列に基づきアミノ酸配列を推定するシステム、Ｎ末端分析、Ｃ末端分析等の常法によっても決定することができる。
【００３４】
プロモーターとしては、宿主の細胞中でイソプレン合成酵素、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、及び／又はジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの発現を促進する限りにおいて特に限定されない。高等植物における高発現には、構成的発現プロモーターであるＥＬ２プロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、Ｃａｂプロモーター、ＲｕＢｉｓＣｏプロモーター、ＰＲ１プロモーター、ユビキチンプロモーター等を用いることができる。また、イソプレン合成酵素、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、及び／又はジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼが植物の特定の器官（例えば、葉、茎、幹、根、果実、花、種子、樹皮及び地下茎からなる群より選択される少なくとも１種）で特異的に発現するプロモーターが用いられてもよい。このようなプロモーターとしては、例えば、葯特異的プロモーターＲＡ８（特表２００２−５２８１２５号）、花器特異的プロモーターＲＰＣ２１３（国際公開ＷＯ９９／４３８１８）、葉肉細胞特異的プロモーターｒｂｃＳ（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １０２，９９１−１０００（１９９３））等を用いることができるが、これらに限定されない。
【００３５】
植物細胞（宿主）は、目的や用途等に応じて適宜選択されるため特に限定されないが、好ましくは高等植物の細胞である。高等植物としては、特に限定されないが、イネ科、マメ科、イモ科、アブラナ科、ラン科、ユリ科、アヤメ科、キク科、ツツジ科、バラ科、マツ科、クスノキ科、クルミ科、ヤナギ科、クマツヅラ科等の植物が挙げられる。高等植物の具体例としては、イネ、アワ、ヒエ、キビ、サトウキビ、モロコシ、トウモロコシ、ソバ、コムギ、オオムギ、ライムギ、ライコムギ、カラスムギ、ハトムギ、ダッタンソバ、コウリャン等の穀類；ダイズ、アズキ、エンドウマメ、ソラマメ、インゲンマメ、アルファルファ、ラッカセイ、クルミ、アーモンド、ケシ、コーヒー、ピスタチオ、マカデミア等の豆類又はナッツ類；サツマイモ、ジャガイモ、ヤマイモ、サトイモ、キャッサバ、ナガイモ、タロイモ等のイモ類；ゴマ、ナタネ、ベニバナ、ヒマワリ、ココナッツ、ヤシ、オリーブ、綿実、カカオ、サフラワー、アボガド等の油脂植物；ニンジン、ダイコン、カブ、ラディッシュ、レンコン、ゴボウ、タマネギ、ネギ、セロリ、ニラ、ミツバ、シュンギク、チンゲンサイ、ハクサイ、ホウレンソウ、ミズナ、パセリ、レタス、キャベツ、ブロッコリー、アスパラガス、カリフラワー、ピーマン、シシトウ、キュウリ、ウリ、ゴーヤ、ズッキーニ、スイカ、トマト、カボチャ、ナス、ショウガ、ミョウガ、ニンニク、ラッキョウ、コマツナ等の野菜類；オレンジ、グレープフルーツ、レモン、ブドウ、マスカット、モモ、スモモ、アンズ、リンゴ、ナシ、カキ、ウメ、イチジク、ザクロ、イチゴ、メロン、パイナップル、マンゴー、マンゴスチン、パパイヤ、アセロラ、キウイ、ブルーベリー、ラズベリー、クランベリー、サクランボ等の果実類；スギ、ヒノキ、マツ、ヤナギ、キリ、カエデ、ポプラ、オーク、ニレ、ペカン、チーク、サクラ、ウメ、モミジ等の樹木類；シロイヌナズナ、バラ、カーネーション、チューリップ、トルコギキョウ、リンドウ、ペチュニア、カスミソウ、ナデシコ、ユリ、スミレ、パンジー、ラベンダー、ガーベラ、コスモス、キク、ゼラニウム、ツルウリクサ、ベゴニア、シクラメン、ニーレンベルギア、ニチニチソウ、テンジクアオイ、ラン、ヒマワリ、アイビー、アジアンタム、アレカヤシ、インドゴム、オリヅルラン、サンセベリア、シェフレラ、スパティフィラム、ドラセナ、ネオレゲリア、パキラ、ベンジャミン、ポトス、モンステラ、ポインセチア、アネモネ、キキョウ等の草木類が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
植物細胞は、もともと、イソプレン合成酵素遺伝子、５−ホスホメバロン酸キナーゼ遺伝子、及び／又は、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を有していなくてもよいし、有していてもよい。これらの遺伝子の存在量がもともと少ない又は無い種を、本発明に従って前記（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドで形質転換することによって、有用部分の生産性の顕著な増大を達成し得る。イソプレン合成酵素遺伝子、５−ホスホメバロン酸キナーゼ遺伝子、及び／又は、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ遺伝子の存在量がもともと少ない又は無い種としては、例えば、マメ科、イネ科、クマツヅラ科、アブラナ科、クワ科、キク科、モクセイ科等が考えられる。
【００３７】
植物細胞は、前記（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドを導入された植物細胞、交雑により改変された植物細胞等の改変された植物細胞であってもよい。このように改変された植物細胞を用いることにより、本発明の形質転換植物にさらに有利な性質を付与することができる。
【００３８】
植物細胞への前記（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチド又はそれを含む発現プラスミドの導入方法としては、常法、例えば、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、遺伝子銃（パーティクルガン）法、リン酸カルシウム法、プロトプラスト法、又は、Ｇｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．， Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｖｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ １９８９）、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｓｔａｎｔｏｎ Ｂ． Ｇｅｌｖｉｎ ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔ Ａ． Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ． Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ １９８８）等の文献（これらは、本書においてその全体が援用される）に記載の方法を好適に用いることができる。さらに、通常、発現プラスミドが導入されている個体を選択する。発現プラスミドが導入されている個体の選択は、常法、例えば、薬物含有培地による選択、ホルモン含有培地による選択、栄養要求性による選択により行なうことができる。さらに、ゲノムＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ノザンハイブリダイゼーション、ウェスタン解析等の常法を用いて、植物細胞染色体への上記（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドの組み込み、イソプレン合成酵素、５−ホスホメバロン酸キナーゼ又はジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼのｍＲＮＡ又はタンパク質の発現等を確認することができる。このようにして、前記（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドが導入された形質転換細胞を得ることができる。
【００３９】
さらに、必要に応じて、前記（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドが導入された形質転換細胞を分化・生長させることにより、形質転換植物を得ることができる。例えば、植物ホルモンを含有した培地に植物細胞を移すことで、植物細胞から植物に分化・生長させることができる。分化・生長の方法については、本書においてその全体が援用される「Ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｐ．Ｆ．Ｗａｒｅｉｎｇ ＆ Ｉ．Ｄ．Ｊ．Ｐｈｉｌｌｉｐｓ， １９８１，ＩＳＢＮ ４−７６２２−６３６５−６ ［８３．５刊］（植物の成長と分化（上）Ｐ．Ｆ．ウェアリング・Ｉ．Ｄ．Ｊ．フィリップス 著／古谷雅樹 監訳）」及び「Ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｐ．Ｆ．Ｗａｒｅｉｎｇ ＆ Ｉ．Ｄ．Ｊ．Ｐｈｉｌｌｉｐｓ， １９８１，ＩＳＢＮ ４−７６２２−７３６６−Ｘ ［８３．１１刊］（植物の成長と分化（下）、Ｐ．Ｆ．ウェアリング・Ｉ．Ｄ．Ｊ．フィリップス 著／古谷雅樹 監訳）」を参考にすることができる。
【００４０】
さらに、このようにして得られた形質転換体について、スクリーニングを行なってもよい。
【００４１】
スクリーニングは、例えば、下記（ｉ）〜（ｉｖ）からなる群より選択される少なくとも１を実施することにより行なわれる：
（ｉ） 有用部分の重量、大きさ及び数の少なくとも１について、得られた形質転換体と野生型とを比較し、該有用部分の重量、大きさ及び数の少なくとも１が野生型よりも大きい形質転換体を選択すること、
（ｉｉ）イソプレン合成酵素、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、及び、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼからなる群より選択される少なくとも１種の発現量について、得られた形質転換体と野生型とを比較し、該発現量が野生型よりも高い形質転換体を選択すること、
（ｉｉｉ）イソプレン合成酵素、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、及び、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼからなる群より選択される少なくとも１種のｍＲＮＡの発現量について、得られた形質転換体と野生型とを比較し、該ｍＲＮＡの発現量が野生型よりも高い形質転換体を選択すること、並びに、
（ｉｖ）イソプレン放出量について、得られた形質転換体と野生型とを比較し、該イソプレン放出量が野生型よりも多い形質転換体を選択すること。
【００４２】
「形質転換」とは、一般的に、ある細胞から単離したＤＮＡが他の細胞に取り込まれ、細胞染色体と組換えを起こす遺伝現象をいうが（東京化学同人 生化学辞典 第２版、４１６〜４１７ページ）、現在では、プラスミドやそれに結合した遺伝子なども含めてＤＮＡ分子を直接細胞に導入することを意味する（岩波 生物学辞典 第４版、３８０ページ〜３８１ページ）。本書において、形質転換とは、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ）を細胞に導入することを意味し、このときポリヌクレオチドが細胞染色体との組換えを起こしてもよいし起こさなくてもよい。表現型及び遺伝型を安定して発現させるには、オリゴヌクレオチドが細胞染色体との組換えを起こすことが望ましく、さらに、その細胞染色体との組換えがホモ接合型であることが望ましい。
【００４３】
「植物」には、あらゆる生長過程の植物体が含まれ、例えば、種子、芽生え、稚苗、中苗、成苗、結実、又は、これらの間の成長過程にある植物体が含まれる。また「植物」には、特に言及されない限り、植物体の部分も含まれ、例えば、根、シュート、葉、茎、幹、果実、花、種子、樹皮及び地下茎も含まれる。「細胞」には、細胞（例えば、培養細胞）、細胞の集合体（例えば、カルス、組織切片、不定胚）、植物体における個々の細胞が含まれる。
【００４４】
「形質転換体」には、形質転換細胞及び形質転換植物が含まれる。「形質転換体」には、前記（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドを植物細胞に導入することにより得られたＴ０世代の形質転換体だけでなく、その子孫（Ｔ１世代、Ｔ２世代、及び、それ以降の世代）も含まれる。形質転換体は、その子孫が表現型及び遺伝型を安定して発現できるよう、ホモ接合型で細胞染色体に前記（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドを有することが望ましい。
【００４５】
このように得られた本発明の形質転換植物は、有用部分の生産性が高められている。
【００４６】
有用部分とは、目的や用途等に応じて異なるため特に限定されず、植物のあらゆる器官が含まれるが、例えば、葉、茎、幹、根、果実、花、種子、樹皮及び地下茎からなる群より選択される少なくとも１種、或いは、その一部である。植物の種類によって器官の名称が異なる場合があるが、このような異なる名称の器官は、葉、茎、幹、根、果実、花、種子、樹皮及び地下茎等の一般的な名称で称される器官に相当すると理解されるべきである。例えば、イネ科の場合、穎果や穀果が果実に相当し、マメ科の場合、豆果が果実に相当すると理解される。
【００４７】
茎には、地上茎、地下茎、根茎、塊茎、花軸等が含まれる。
【００４８】
根には、多肉根、毛状根、支柱根等が含まれる。
【００４９】
果実には、果実を構成している花部器官の発生的由来を問わず、子房が発達した真果、及び、子房以外の器官から発達した組織を含む偽果も果実に含まれる。
【００５０】
果実の一部には、子房、果托、がく、総包、子房壁、外果皮、中果皮、内果皮、ナシ状果及びウリ状果等が含まれる。また、果実には果穎も含まれる。
【００５１】
花の一部には、花被、花冠、花弁、がく、総包、花柄、おしべ、めしべ、花粉、胚珠及び副冠等が含まれる。
【００５２】
植物の器官の名称については、例えば、原色牧野日本植物図鑑Ｉ（平成１１年９月６日発行、発行所 株式会社北隆館、著者 牧野富太郎）及び原色牧野日本植物図鑑ＩＩ（平成１２年５月１０日発行、発行所 株式会社北隆館、著者 牧野富太郎）を参照することができる。
【００５３】
有用部分の生産性が高められるとは、有用部分又はその一部の重量（フレッシュ重量、乾燥重量）、表面積、体積、数、大きさ、長さ、幅等が増大することを意味する。有用部分の生産性が高まるとは、例えば、下記の群より選択される少なくとも１の事項を意味する：（１）全体の重量が増大する、（２）地上部の重量が増大する、（３）葉の重量が増大する、（４）葉の数が増大する、（５）葉の大きさ（長さ又は幅）が増大する、（６）葉の肉厚が増大する、（７）茎又は幹の重量が増大する、（８）茎又は幹の太さが増大する、（９）茎又は幹の丈が増大する、（１０）根の重量が増大する、（１１）根の長さが増大する、（１２）果実の重量が増大する、（１３）果実の数が増大する、（１４）果肉の重量が増大する（１５）花の重量が増大する、（１６）花の数が増大する、（１７）花弁の重量が増大する、（１８）花弁の数が増大する、（１９）花弁の大きさが増大する、（２０）花弁の肉厚が増大する、（２１）種子の重量が増大する、（２２）種子の数が増大する、（２３）樹皮の重量が増大する、（２４）樹皮の厚みが増大する。
【００５４】
本発明のイソプレン合成酵素形質転換植物は、例えば、下記の群より選択される少なくとも１の特徴を有する：（１）全体の重量が野生型の２００％以上、好ましくは２５０％以上である、（２）地上部の重量が野生型の２００％以上、好ましくは２５０％以上である、（３）葉の重量が野生型の２００％以上、好ましくは２５０％以上である、（４）葉の数が野生型の１３０％以上、好ましくは１５０％以上である、（５）葉の大きさ（長さ又は幅）が野生型の１３０％以上、好ましくは１５０％以上である、（６）葉の肉厚が野生型の１３０％以上、好ましくは１５０％以上である、（７）茎又は幹の重量が野生型の２００％以上、好ましくは３００％以上である、（８）茎又は幹の太さ（直径又は周径）が野生型の１５０％以上、好ましくは２００％以上である、（９）茎又は幹の丈が野生型の１５０％以上、好ましくは２００％以上である、（１０）根の重量が野生型の２００％以上、好ましくは３００％以上である、（１１）根の長さが野生型の１５０％以上、好ましくは２００％以上である、（１２）果実の重量が野生型の２００％以上、好ましくは３００％以上である、（１３）果実の数が野生型の２００％以上、好ましくは３００％以上である、（１４）果肉の重量が野生型の２００％以上、好ましくは３００％以上である、（１５）花の重量が野生型の２００％以上、好ましくは３００％以上である、（１６）花の数が野生型の２００％以上、好ましくは３００％以上である、（１７）花弁の重量が野生型の２００％以上、好ましくは３００％以上である、（１８）花弁の数が野生型の２００％以上、好ましくは３００％以上である、（１９）花弁の大きさ（周径）が野生型の２００％以上、好ましくは３００％以上である、（２０）花弁の肉厚が野生型の２００％以上、好ましくは３００％以上である、（２１）種子の重量が野生型の２００％以上、好ましくは３００％以上である、（２１）種子の数が野生型の２００％以上、好ましくは３００％以上である。
【００５５】
ここで、本書において野生型とは、（ａ）イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、（ｂ）５−ホスホメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド、及び、（ｃ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも１種で形質転換されていない植物体又は植物細胞を意味する。
【００５６】
有用部分の生産性の増大には、細胞数の増大又は細胞サイズの増大のいずれか、或いは、細胞数の増大及び細胞サイズの増大の両方が寄与している。それゆえ、本発明の形質転換植物における細胞数は、例えば、野生型の１３０％、好ましくは２００％以上、より好ましくは３００％以上となり得る、或いは／並びに、本発明の形質転換植物における個々の細胞の大きさは、例えば、野生型の１３０％、好ましくは２００％以上、より好ましくは３００％以上となり得る。
【００５７】
本発明の形質転換植物は、そのイソプレン放出量が、例えば、野生型の約１５０〜３０００％、好ましくは約２００〜２０００％、好ましくは約３００〜１５００％、より好ましくは約５００〜１０００％であり得る。このような量のイソプレンを放出する形質転換植物は、有用部分の生産性が高く、各種用途に好適に用いることができる。
【００５８】
本発明の形質転換植物は、さらに、下記（Ａ）〜（Ｇ）の群より選択される少なくとも１の特徴を有し得る：
（Ａ）農薬耐性が野生型よりも高い、
（Ｂ）重金属耐性が野生型よりも高い、
（Ｃ）病害虫耐性が野生型よりも高い、
（Ｄ）低温耐性が野生型よりも高い、
（Ｅ）塩耐性が野生型よりも高い、
（Ｆ）乾燥耐性が野生型よりも高い、及び、
（Ｇ）弱光耐性が野生型よりも高い。
【００５９】
例えば、有用部分の生産性の増大に伴い植物の樹皮や果皮が厚くなることにより、あるいは、イソプレン合成に至る経路におけるホルモン等の様々な物質の量が変化することにより、上記（Ａ）〜（Ｇ）の耐性が付与されることが考えられる。
【００６０】
（Ａ）農薬耐性が野生型よりも高い植物又は（Ｂ）重金属耐性が野生型よりも高い形質転換植物は、例えば、農薬又は重金属汚染土壌のファイトリメディエーション用植物として適している。（Ｃ）病害虫耐性が野生型よりも高い形質転換植物は、例えば、熱帯又は温帯地域での栽培用植物として適している。（Ｄ）低温耐性が野生型よりも高い形質転換植物は、例えば、寒冷地域での栽培用植物として適している。（Ｅ）塩耐性が野生型よりも高い形質転換植物は、例えば、塩害地域又は海岸周辺地域での栽培用植物、塩水栽培用植物として適している。（Ｆ）乾燥耐性が野生型よりも高い形質転換植物は、例えば、砂漠再生用植物、乾燥地域での栽培用植物、観葉植物として適している。（Ｇ）弱光耐性が野生型よりも高い形質転換植物は、例えば、日照時間が少ない地域での栽培用植物、観葉植物として適している。
【００６１】
もちろん、上記（Ａ）〜（Ｇ）の耐性を有さない形質転換植物も、本発明の形質転換植物に含まれる。
【００６２】
本発明の形質転換植物は、食用、食品又は食品組成物製造用、化粧品製造用、医薬品製造用、工業製品製造用、鑑賞用、森林再生用、砂漠再生用及びファイトリメディエ−ション用からなる群より選択される少なくとも１種の用途に使用され得る。
【００６３】
食用の形質転換植物は、通常、そのまま又は加工され、ヒトを含む動物に摂取される。植物の種類は、摂食可能な部分を含む食用種である限りにおいて特に限定されない。
【００６４】
食品又は食品組成物製造用の形質転換植物は、通常、そのまま又は加工され、或いは、特定の成分だけ抽出され、食品又は食品組成物に添加される。植物の種類は、摂食可能な部分を含む食用種である限りにおいて特に限定されない。また食品又は食品組成物には、ペットフード、家畜用飼料等のヒト以外の動物の食物も含まれる。
【００６５】
化粧品製造用の形質転換植物は、通常、特定の成分又はエキスだけを抽出され、化粧品に添加される。化粧品には、スキンケア製品、ネイルケア製品、ヘアケア製品等が含まれる。特定の成分又はエキスとしては、美白成分、保湿成分、抗酸化成分、鎮静成分等として、ビタミン類、アミノ酸、ヒアルロン酸、コラーゲン、イソフラボン、ハーブエキス等が例示されるが、これらに限定されない。植物の種類としては、所望の成分又はエキスに応じて異なり、特に限定されない。
【００６６】
医薬品製造用の形質転換植物は、通常、特定の成分又はエキスだけを抽出され、医薬品に添加される。医薬品の有効成分のみならず、清涼剤、結合剤、甘味料、崩壊剤、滑沢剤、着色料、香料、安定化剤、防腐剤、徐放調整剤、界面活性剤、溶解剤、湿潤剤、栄養補助成分等として添加されてもよい。植物の種類としては、特定の成分又はエキスに応じて異なり、特に限定されない。
【００６７】
工業製品製造用の形質転換植物は、通常、そのまま又は加工され、或いは、特定の成分だけ抽出され、工業製品の原料又は部材として使用される。例えば、樹木を加工し、建築物、家具、工芸品、割り箸等の原料又は部材として使用することができる。例えば、ジャガイモ、サツマイモ、キャッサバ等のイモ類、又は、イネ、コムギ、トウモロコシ等の穀類からデンプンを抽出し、各種工業製品の原料として使用することができる。また、例えば、樹木又は草本から、セルロース、ゴム、樹脂等を抽出し、輸送用機器、電気製品、繊維製品等の原料として使用することができる。サトウキビ、カンショ、オオムギ、トウモロコシ等の穀類、又は、ジャガイモ、サツマイモ等のイモ類のグルコース等を発酵させてエタノールを製造し、化学薬品の原料、消毒薬、燃料等として使用することができる。植物の種類は、目的や用途等に応じて異なるため、特に限定されない。
【００６８】
鑑賞用の形質転換植物は、通常、そのまま又は鑑賞に適した形状にアレンジされて流通され、主に、家庭、店舗、オフィス等で鑑賞に供される。植物の種類としては、例えば、熱帯、亜熱帯又は乾燥帯原産の観葉植物、花又は果実を実らせる植物等が好ましいが、これらに限定されない。観葉植物としては、前述の草本類を好適に例示できる。
【００６９】
森林再生用の形質転換植物は、通常、種子〜中苗の成長段階で森林再生が所望される土地に植林される。植物の種類としては、森林再生が所望される土地の気象条件で生育可能な種類が望ましく、特に限定されない。また、農地開拓等の行為により森林が破壊された場合には、元の森林に戻すよう、森林が破壊される以前と同種の種類を選択することが望ましいが、酸性雨等の環境の変化により森林が破壊された場合には、変化した後の環境でも生育可能な種類を選択することが望ましい。
【００７０】
本発明は、また、工程（Ｉ）（ａ）イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、（ｂ）５−ホスホメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド、及び、（ｃ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、からなる群より選択される少なくとも１種を植物細胞に導入することにより、形質転換体を得る工程を包含する、有用部分の生産性が高められた植物を作製する方法を提供する。該方法は、さらに、（ｄ）イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼをコードするポリヌクレオチドを植物細胞に導入することにより、形質転換体を得る工程を包含してもよい。該方法は、必要に応じて、所望の生長段階の植物体に生長させる工程をさらに包含してもよい。生長の方法は、前述の通りである。また、該方法は、更に、（ＩＩ）下記の（ｉ）〜（ｉｖ）からなる群より選択される少なくとも１を実施する工程を含んでもよい：
（ｉ） 有用部分の重量、大きさ及び数の少なくとも１について、前記工程（Ｉ）で得られた形質転換体と野生型とを比較し、該有用部分の重量、大きさ及び数の少なくとも１が野生型よりも大きい形質転換体を選択すること、
（ｉｉ）イソプレン合成酵素、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、及び、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼからなる群より選択される少なくとも１種の発現量について、前記工程（Ｉ）で得られた形質転換体と野生型とを比較し、発現量が野生型よりも高い形質転換体を選択すること、
（ｉｉｉ）イソプレン合成酵素、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、及び、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼからなる群より選択される少なくとも１種のｍＲＮＡの発現量について、前記工程（Ｉ）で得られた形質転換体と野生型とを比較し、該ｍＲＮＡの発現量が野生型よりも高い形質転換体を選択すること、並びに、
（ｉｖ）イソプレン放出量について、前記工程（Ｉ）で得られた形質転換体と野生型とを比較し、該イソプレン放出量が野生型よりも多い形質転換体を選択すること。
【００７１】
（ｉ）は、直接的に有用部分の生産性を比較しているため、確実性が高い方法である。後述の実施例において、イソプレン合成酵素ｍＲＮＡの発現量又はタンパク量が野生型よりも高く、イソプレン放出量が野生型よりも高い形質転換植物体で有用部分の生産性の顕著な増大が確認されたことから、（ｉｉ）〜（ｉｖ）も、有用部分の生産性が高められた個体の選択の方法として好適である。（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）は、慣例的な方法によって実施できる点、形質転換体が有用部分を生じる段階まで成長していなくても実施できる点などにおいても有利である。
【００７２】
本発明は、前記有用部分の生産性が高められた植物を作製する方法により得られた有用部分の生産性が高められた植物、及び、その有用部分も提供する。有用部分の生産性が高められた植物及びその有用部分については、前述の通りである。
【００７３】
本発明は、また、（Ｉ）（ａ）イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、（ｂ）５−ホスホメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド、及び、（ｃ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、からなる群より選択される少なくとも１種を植物細胞に導入する工程を包含する、植物の有用部分の生産性を高める方法を提供する。該方法は、さらに、（ｄ）イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼをコードするポリヌクレオチドを植物細胞に導入する工程を包含してもよい。
【００７４】
本発明は、また、（ａ）イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、（ｂ）５−ホスホメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド、及び、（ｃ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、からなる群より選択される少なくとも１種を有する植物発現用プラスミドを備える、有用部分の生産性が高められた植物を作製するためのキットを提供する。植物用発現プラスミドとしては、前述のものを使用することができる。ここで、植物発現用プラスミドとは、植物においてイソプレン合成酵素を発現できる限りにおいて特に限定されず、植物以外の生物（例えば、微生物、動物）においてイソプレン合成酵素を発現するか否かは問わない。該キットにおける植物発現プラスミドは、さらに、（ｄ）イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼをコードするポリヌクレオチドを有してもよい。あるいは、前記キットは、さらに、（ｄ）イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼをコードするポリヌクレオチドを有する植物発現用プラスミドを備えてもよい。
【００７５】
本書における各操作については、本書においてその全体が援用されるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ．，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ．，１９８９）を参照することができる。各操作は、適宜、改変又は省略されてもよいし、必要な操作が追加されてもよい。
【００７６】
本書において、種々の反応、現象、代謝経路等に関する説明がなされているが、これらの説明は他の可能性を排除するものではない。本発明は、理論に拘束されるものではない。
【００７７】
また、当業者は、本発明の精神を逸脱しない範囲で種々の改変をなし得るであろう。
【発明の効果】
【００７８】
本発明によって、有用部分の生産性が高められた形質転換植物、及び、その作製方法が提供された。さらに、本発明によって、有用部分の生産性が高められた植物を作製する方法、該方法により有用部分の生産性が高められた植物、及び、該植物の有用部分も提供された。さらに、本発明によって、植物の有用部分の生産性を高める方法、及び、有用部分の生産性が高められた植物を作製するためのキットも提供された。
【００７９】
本発明によって、（ａ）イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、（ｂ）５−ホスホメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド、及び、（ｃ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、からなる群より選択される少なくとも１種で形質転換することにより得られた形質転換体は、その有用部分の生産性が野生型と比べて有意に高められている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８０】
以下、本発明の実施例を示す。これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明を何ら限定するものではない。
【実施例１】
【００８１】
植物材料及び生育条件
ポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ａｌｂａ）は、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）（ｓｕｃｒｏｓｅ３％，イノシトール０．０１％，インドール酪酸 終濃度４μＭ，ｐＨ５．６−５．８）１％寒天培地で継代培養を行い、約２ヶ月に一度、植え継ぎを行った。培養条件は２５℃、長日条件（１６時間明期（１２０μｍｏｌｍ−２ｓ−１）、８時間暗期）であった。培地の量は、カルチャーフラスコ（９００ｍｌ）１個につき１００ｍｌとした。植え継ぎの際には、側芽を２、３個含むように切り取った茎部分を新しい培地に移植した。
【００８２】
シロイヌナズナ（ｅｃｏｔｙｐｅ Ｃｏｌ−０）の植物体は、土壌条件の場合、２１℃、長日条件下（１６時間明期（１２０μｍｏｌｍ−２ｓ−１）、８時間暗期）に設定した人工気象器内で生育させた。無菌条件で生育させる場合には、種子の表面を種子滅菌液（３０％［ｖ／ｖ］ｓｏｄｉｕｍ ｈｙｐｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，０．０２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）で２０分間滅菌した後、滅菌水で４回洗浄し、その種子を１／２ＭＳ（０．５％ｓｕｃｒｏｓｅ，ｐＨ５．８，０．８％ａｇａｒ）培地に播種した。
【００８３】
Ｐｏｐｕｌｕｓ ａｌｂａからのｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出
Ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出は、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）のプロトコールに従って行った。試料はＰ．ａｌｂａ（約５ｃｍ草丈）緑葉１３０ｍｇをサンプリングし、液体窒素で凍結したものを用いた。
【００８４】
Ｐ．ａｌｂａ ｔｏｔａｌ ＲＮＡを用いた逆転写反応
Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ２．４μｇをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＮａｓｅ Ｈ−ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて逆転写反応に供した。
【００８５】
Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（２．４μｇ）１２μｌ（ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ水でメスアップ）
５０μＭ ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０ １μｌ
１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ １μｌ
１４μｌ
上記の反応液を６５℃で５分間加熱後、氷上に移し、５ ｘ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ ４μｌ，０．１Ｍ ＤＴＴ１μｌ，ＲＮａｓｅＯＵＴＴＭ ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １μｌ，ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ ＩＩＩ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ １μｌを加え５０℃で６０分間インキュベートして逆転写反応を行った。その際、反応液をまず湯浴にて一気に温め、反応液の蒸発を防ぐためにエアインキュベーターに移し、反応を行った。その後ヒートブロック（７０℃）で１５分間加熱し酵素を失活させた。室温に戻した後、反応液にＲＮａｓｅ Ｈ １μｌを加え、３７℃で２０分間インキュベートしてテンプレートのＲＮＡを分解した。この逆転写反応産物をテンプレートとしてポジティブコントロールであるβ−ａｃｔｉｎ（ベータ−アクチン）が増幅することを確認した。
【００８６】
ＲＴ−ＰＣＲによるＰ．ａｌｂａ イソプレン合成酵素（ＰａＩｓｐＳ）遺伝子の単離
Ｈｙｂｒｉｄ ｐｏｐｌａｒ（Ｐ．ｔｒｅｍｕｌａ ｘ Ｐ．ａｌｂａ）イソプレン合成酵素遺伝子の配列を基に設計したプライマーペア（Ｆｗ．１，Ｒｖ．１）を用いて、上記逆転写産物をテンプレートとして、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）によりＲＴ−ＰＣＲを行った。
【００８７】
Fw.1: 5’- ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcatggcaactgaattattgtgcttgc -3’
（配列番号１）
Rv.1: 5’- ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcttatctctcaaagggtagaataggctctg -3’
（配列番号２）
（アンダーラインの配列はサブクローニングのためのＧＡＴＥＷＡＹ ｓｙｓｔｅｍのａｔｔＢサイトの配列）
１０ ｘ ＫＯＤ ｐｌｕｓ ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ
２ｍＭ ｄＮＴＰ ５μｌ
２５ｍＭ ＭｇＳＯ４ ２μｌ
５０μＭ プライマー（Ｆｗ．１、Ｒｖ．１） 各１μｌずつ
ＲＴｐｒｏｄｕｃｔ １μｌ
１Ｕ／μｌＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １μｌ
Ｈ２Ｏで５０μｌまでメスアップ
ＰＣＲ ｐｒｏｇｒａｍ
＃１：９５℃ ４ｍｉｎ
＃２：９５℃ １ｍｉｎ
５３℃ ３０ｓｅｃ
６８℃ ２ｍｉｎ
（３０ｃｙｃｌｅｓ）
＃３：６８℃ ５ｍｉｎ
＃４：４℃ ∞
アガロース電気泳動により目的の大きさのバンドが増幅したことを確認した後、ＧＡＴＥＷＡＹＴＭｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＢＰｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎにより、ｐＤＯＮＲ２２１にサブクローニングした後、シーケンスにより配列を確認した。得られたコンストラクトをｐＤＯＮＲ２２１−ＰａＩｓｐＳとした。
【００８８】
ＰａＩｓｐＳ構成的発現用コンストラクトの作製
ｐＤＯＮＲ２２１−ＰａＩｓｐＳをｅｎｔｒｙ ｖｅｃｔｏｒとし、植物における構成的発現用のｂｉｎａｒｙ ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒであるｐＧＷＢ２にＧＡＴＥＷＡＹＴＭｓｙｓｔｅｍを用いて、ＰａＩｓｐＳ全長ｃＤＮＡを移しかえた。得られたコンストラクトをｐＧＷＢ２−ＰａＩｓｐＳとした。このコンストラクトをエレクトロポレーション（ＧＩＢＣＯ（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ），Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）によりＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＧＶ３１０１（ｐＭＰ９０）に導入した。
【００８９】
花序浸透法によるシロイヌナズナの形質転換
（１）植物体の準備
播種から約１ヶ月後、一次花序が数ｃｍになった個体の一次花序を切り取り、二次花序を誘導した。一次花序を切り取ってから、約１週間後の個体を形質転換に用いた。
（２）アグロバクテリウム懸濁液の調製
ｐＧＷＢ２−ＰａＩｓｐＳを有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＧＶ３１０１（ｐＭＰ９０）を抗生物質を含むＬＢ培地に植菌し、２５℃、２００ｒｐｍでＯＤ６００が１．２から１．５になるまで培養した。培養液を４８００ｒｐｍで２０分間遠心し、上清を取り除き、ＯＤ６００が０．８程度になるように５％ｓｕｃｒｏｓｅ水溶液を加え、菌体を懸濁し、この溶液にｓｉｌｗｅｔ Ｌ−７７（日本ユニカー）を終濃度０．０５％となるように加えた。
（３）形質転換
植物体を逆さにして、アグロバクテリウム懸濁液に約１０秒間浸けた後、シロイヌナズナ野生株（Ｃｏｌ−０）を横向きに倒し、１０分間程乾燥させた。この植物体を２Ｌのコニカルビーカーに入れラップでふたをして湿度の高い状態に保ち、人工気象器に移して１日置いた。植物体を容器から出し、水を与えて２週間ほど生育させた後、乾燥させて、種を収穫した。
【００９０】
形質転換体の選抜
（１）Ｔ１種子の選抜
形質転換により得られた種子を１／２ＭＳ（０．５％ｓｕｃｒｏｓｅ，ｐＨ５．８，０．８％ａｇａｒ，５０μｇ／ｍｌカナマイシン，０．０５％ＰＰＭ）プレートに約２０００個播種し、２晩低温処理後、人工気象器で生育させた。カナマイシン耐性の２９個体を土に移植し、ロゼット葉が８枚以上になったらそのうち１枚をサンプリングし、ゲノムＰＣＲによりＴ−ＤＮＡの確認を行った。
（２）Ｔ２個体の選抜
導入したＰａＩｓｐＳ遺伝子の発現を確認するため、Ｔ２世代のｓｅｅｄｌｉｎｇを用いてｎｏｒｔｈｅｒｎ解析を行うこととした。サンプルには播種後２週間のＴ２世代ｓｅｅｄｌｉｎｇを用いた。ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、７．５μｇ相当のｔｏｔａｌ ＲＮＡサンプルをＨｙｂｏｎｄＮ＋にトランスファーし、ハイブリダイゼーションを行った。メンブレンを２ ｘ ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で室温１５分間振とうさせた。洗浄液を捨て、あらかじめ６０℃に温めた２ ｘ ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で、６０℃で１５分振とうさせた。さらに洗浄液を捨て、０．２ ｘ ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で、６０℃で２０分間振とうさせた。この洗浄後、ラップに包んだメンブレンをＢＡＳイメージングプレート及びＸ線フィルムに感光させて（２時間及び２４時間）、シグナルを検出した。
【００９１】
上記のように、Ｐｏｐｕｌｕｓ ａｌｂａの実生からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲによりＰａＩｓｐＳ候補遺伝子の全長ｃＤＮＡを得た。このｃＤＮＡを大腸菌発現系を用いて発現させ、種々のプレニル二リン酸を基質として酵素活性を測定した。ここで、酵素活性の測定は、種々のプレニル二リン酸を含有した大腸菌用培地に、ＰａＩｓｐＳ候補遺伝子の全長ｃＤＮＡを導入した大腸菌を加えて培養し、この培養液のヘッドスペースを試料としてＧＣによりイソプレンの濃度を測定した。得られた生成物をイソプレンと同定し、本ｃＤＮＡがイソプレン合成酵素をコードすることを確認した（ｃＤＮＡの１次スクリーニング）。
【００９２】
大腸菌を使って１次スクリーニングを行ったｃＤＮＡを、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ法でシロイヌナズナに導入し、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ解析によるＰａＩｓｐＳ遺伝子の発現及びイソプレン放出の確認（Ｆｉｇ．１ａ，ｂ）により２次スクリーニングを行った。
【００９３】
播種後約４週間のシロイヌナズナにおいて、通常生育条件下での表現型解析を行った。その結果、高発現植物体の方が野生株と比較して葉の大きさや数が増大している傾向が見られた（Ｆｉｇ．２ａ）。実際に測定した結果、イソプレン合成酵素高発現植物体のロゼット葉の数は、野生株よりも平均で１．３〜１．５倍増大していた（Ｆｉｇ．２ｂ）。さらに葉の大きさも長さ、幅ともに高発現植物体の方が野生株よりも１．３〜１．４倍増大していた（Ｆｉｇ．２ｃ，ｄ）。その結果、植物体のロゼット葉の新鮮重の総量は、高発現植物体の方が１．９〜２．２倍増大していた（Ｆｉｇ．２ｅ）。花茎の出る時期に差は見られなかった。
【００９４】
ロゼット葉の数や大きさには、細胞数の増大又は細胞サイズの増大のいずれか、或いは、細胞数の増大と細胞サイズの増大の両方が寄与していると考えられる。
【００９５】
そこで、高発現植物体でロゼット葉の大きさや数が増大している原因を調べるために、ロゼット葉の表皮細胞の大きさを検定した。検定には、発芽後直後のロゼット葉と、播種後約４週間のロゼット葉を用いた。
【００９６】
発芽後直後のロゼット葉の表皮細胞の大きさを検定した。同じ大きさの葉を比較した場合、高発現植物体の方が野生株よりも細胞のサイズは小さく、数が多いことが分かった。このことから、同じ大きさの葉の中にある細胞数は高発現植物体の方が多いことがわかり、この細胞数の増大が最終的にはロゼット葉の大きさや数の増大に繋がっている可能性が示唆された。細胞数が増大していることに対しては、細胞分裂の速度が高まっている可能性も示唆される。
【００９７】
一方、播種後約４週間のロゼット葉の表皮細胞の大きさを検定した。同じ面積の葉を比較した場合、高発現植物体の方が野生株よりも細胞のサイズは大きく、数が少ないことが分かった。このことから、同じ面積の葉の中にある細胞数は高発現植物体の方が少ないことがわかり、この細胞サイズの増大が最終的にはロゼット葉の大きさや数の増大に繋がっている可能性が示唆された。細胞サイズが増大していることに対しては、細胞の肥大化が高まっている可能性も示唆される。
【００９８】
このように発芽後直後のロゼット葉では細胞数の増大が確認されたのに対し、播種後約４週間のロゼット葉では細胞サイズの増大が確認された。
【００９９】
このような現象が起こる理由としては、イソプレンがＩＰＰやＤＭＡＰＰから生合成されることに関係している可能性が考えられる。すなわち、ＤＭＡＰＰやＩＰＰから生合成される様々な植物ホルモン、例えばジベレリンやサイトカイニン、ブラシノステロイド等のバランスが改変され、細胞分裂、肥大化等に影響を及ぼしたという可能性がある。つまり、イソプレン自身が細胞数や細胞サイズに直接影響を及ぼしたのではなく、間接的な原因であるという可能性である。また、今までに報告はないがイソプレン自身が何かのシグナルとなり、細胞分裂や肥大化を促進したりする可能性も考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
近年、農業人口の減少、農地の減少、人口増加等による食糧不足の問題が深刻化している。本発明によれば、植物の食用部分の収量を高めることができ、食糧を効率的に生産することができるため、食糧不足の問題を改善することができる。
【０１０１】
また、近年、天然資源の枯渇の問題が深刻化している。本発明によれば、工業製品や燃料の原料を多量に含む有用部分の収量を高めることができ、工業製品や燃料（例えば、石油代替燃料として利用可能なバイオマスエタノール）を植物から効率的に製造することができるため、天然資源の枯渇の問題を改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】図１ａは、ＰａｌｓＰｓｍＲＮＡの発現量を示したものである。ノザン解析により＊印が高発現株であると判断出来る。図１ｂは、ＰａｌｓＰｓ高発現シロイヌナズナのイソプレン放出量を示したものである。ＰａｌｓＰｓ高発現シロイヌナズナのイソプレン放出量は、個体によって異なるが、いずれも野生型よりも多い傾向を示した。イソプレン放出量は、約２００〜１０００％であった。
【図２】図２ａはロゼット葉の写真である。明らかにＰａｌｓＰｓ高発現シロイヌナズナ株で野生株より葉の数・長さ・面積が増大していることがわかる。図２ｂはロゼット葉の枚数を示したものである。ＰａｌｓＰｓ高発現シロイヌナズナ株で野生株より葉の枚数が増大していることがわかる。図２ｃはロゼット葉の長さを示したものである。ＰａｌｓＰｓ高発現シロイヌナズナ株で野生株より葉の長さが増大していることがわかる。図２ｄはロゼット葉の幅を示したものである。ＰａｌｓＰｓ高発現シロイヌナズナ株で野生株より葉の大きさが増大していることがわかる。図２ｅはロゼット葉の新鮮重量を示したものである。ＰａｌｓＰｓ高発現シロイヌナズナ株で野生株より葉の新鮮重量が増大していることがわかる。
【配列表フリーテキスト】
【０１０３】
配列番号１はプライマーである。
配列番号２はプライマーである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主に、有用部分の生産性が高められた植物及びその作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イソプレンは、多くの高等植物、特にユーカリやポプラといった落葉広葉樹から多量に放出されている炭素数５のテルペノイドとして知られ、高等植物の細胞においてイソプレンは、クロロプラスト内で非メバロン酸経路を介して、ジメチルアリルピロリン酸からイソプレン合成酵素の働きにより生合成される。地球レベルで見た植物からのイソプレン年間総放出量は莫大で、炭素量換算で５ｘ１０１４ｇｙｒ−１にものぼるが、それにも関わらず、植物にとっての意義は未解明のままである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、有用部分の生産性が高められた植物及びその作製方法を提供することを主な課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、当初、植物におけるイソプレンの生産及び放出の生理学的役割の一部を解明することを主目的として研究を開始したところ、鋭意研究を重ねるうちに、イソプレンの大気放出量が少ないと報告されているシロイヌナズナに、イソプレン生成に至る反応を触媒する酵素の遺伝子を導入することにより得られた形質転換シロイヌナズナの葉の重量、サイズ及び数が、野生型のシロイヌナズナよりも増大していることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
本発明は、主に、以下の事項に関する。
［項１］
（ａ）イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）５−ホスホメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド、及び、
（ｃ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択される少なくとも１種で形質転換され、且つ、有用部分の生産性が高められた、形質転換植物。
［項２］下記（１）〜（３）からなる群より選択される少なくとも１の特徴を有する、項１に記載の形質転換植物：
（１）イソプレン合成酵素、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、及び、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼからなる群より選択される少なくとも１種の発現量が野生型よりも高い、
（２）イソプレン合成酵素、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、及び、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼからなる群より選択される少なくとも１種のｍＲＮＡの発現量が野生型よりも高い、並びに、
（３）イソプレンの放出量が野生型よりも多い。
［項３］イソプレン放出量が、野生型の１５０〜３０００％である、項１又は２に記載の形質転換植物。
［項４］
有用部分が、葉、茎、幹、根、果実、花、種子、樹皮及び地下茎からなる群より選択される少なくとも１種、或いは、その一部である、項１〜３のいずれかに記載の形質転換植物。
［項５］さらに、下記（Ａ）〜（Ｇ）からなる群より選択される少なくとも１の特徴を有する、項１〜４のいずれかに記載の形質転換植物：
（Ａ）農薬耐性が野生型よりも高い、
（Ｂ）重金属耐性が野生型よりも高い、
（Ｃ）病害虫耐性が野生型よりも高い、
（Ｄ）低温耐性が野生型よりも高い、
（Ｅ）塩耐性が野生型よりも高い、
（Ｆ）乾燥耐性が野生型よりも高い、及び、
（Ｇ）弱光耐性が野生型よりも高い。
［項６］食用、食品又は食品組成物製造用、化粧品製造用、医薬品製造用、工業製品製造用、鑑賞用、森林再生用、砂漠再生用及びファイトリメディエーション用からなる群より選択される少なくとも１種の用途に使用される、項１〜５のいずれかに記載の形質転換植物。
［項７］種子、芽生え、稚苗、中苗、成苗、又は、これらの間の成長過程にある植物体である、項１〜６のいずれかに記載の形質転換植物。
［項８］
（ａ）イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）５−ホスホメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド、及び、
（ｃ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択される少なくとも１種がホモ接合型で細胞染色体に組み込まれている、項１〜７のいずれかに記載の形質転換植物。
［項９］
（Ｉ） （ａ）イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）５−ホスホメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド、及び、
（ｃ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択される少なくとも１種を植物細胞に導入することにより、形質転換体を得る工程を包含する、有用部分の生産性が高められた植物を作製する方法。
［項１０］
さらに、（ＩＩ）下記の（ｉ）〜（ｉｖ）からなる群より選択される少なくとも１を実施する工程：
（ｉ） 有用部分の重量、大きさ及び数の少なくとも１について、前記工程（Ｉ）で得られた形質転換体と野生型とを比較し、該有用部分の重量、大きさ及び数の少なくとも１が野生型よりも大きい形質転換体を選択すること、
（ｉｉ）イソプレン合成酵素、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、及び、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼからなる群より選択される少なくとも１種の発現量について、前記工程（Ｉ）で得られた形質転換体と野生型とを比較し、発現量が野生型よりも高い形質転換体を選択すること、
（ｉｉｉ）イソプレン合成酵素、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、及び、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼからなる群より選択される少なくとも１種のｍＲＮＡの発現量について、前記工程（Ｉ）で得られた形質転換体と野生型とを比較し、該ｍＲＮＡの発現量が野生型よりも高い形質転換体を選択すること、並びに、
（ｉｖ）イソプレン放出量について、前記工程（Ｉ）で得られた形質転換体と野生型とを比較し、該イソプレン放出量が野生型よりも多い形質転換体を選択すること、
を包含する、項９に記載の有用部分の生産性が高められた植物を作製する方法。
［項１１］項９又は１０に記載の方法により作製された、有用部分の生産性が高められた植物。
［項１２］項１１に記載の植物の有用部分。
［項１３］
（ａ）イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）５−ホスホメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド、及び、
（ｃ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択される少なくとも１種を植物細胞に導入する工程を包含する、植物の有用部分の生産性を高める方法。
［項１４］
（ａ）イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）５−ホスホメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド、及び、
（ｃ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択される少なくとも１種を有する植物発現用プラスミドを備える、有用部分の生産性が高められた植物を作製するためのキット。
［項１５］さらに、（ｄ）イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼをコードするポリヌクレオチドで形質転換されている、項１〜８のいずれかに記載の形質転換植物。
［項１６］（ｄ）イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼをコードするポリヌクレオチドを植物細胞に導入することにより、形質転換体を得る工程をさらに包含する、項９に記載の有用部分の生産性が高められた植物を作製する方法。
［項１７］項１６に記載の方法により作製された、有用部分の生産性が高められた植物。
［項１８］項１７に記載の植物の有用部分。
［項１９］さらに、（ｄ）イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼをコードするポリヌクレオチドを植物細胞に導入する工程を包含する、項１３に記載の植物の有用部分の生産性を高める方法。
［項２０］さらに、（ｄ）イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼをコードするポリヌクレオチドを有する植物発現用プラスミドを備える、項１４に記載の有用部分の生産性が高められた植物を作製するためのキット。
［項２１］項１４に記載の植物発現用プラスミドが、（ｄ）イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼをコードするポリヌクレオチドをさらに有する、項１４に記載の有用部分の生産性が高められた植物を作製するためのキット。
【０００６】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【０００７】
イソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン）は、多くの植物に存在しているテルペン類（イソプレノイド類）の構成単位であり、構造式ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＨ＝ＣＨ２で表される共役二重結合をもつ炭化水素である。イソプレンは、多くの植物で放出され、特に、ユーカリやポプラといった広葉樹から多量に放出されることが知られている。イソプレンは、針葉樹や草本でも生産されるが、通常、広葉樹と比べて放出量が少ない。イソプレンの放出量が少ない種としては、例えば、マメ科、イネ科、クマツヅラ科の植物が例示される。
【０００８】
イソプレンは、イソプレンの前駆体であるジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）が酸化的に脱リン酸されて生成される。この反応を触媒するのがイソプレン合成酵素である。ＤＭＡＰＰは、イソペンテニル二リン酸Δ-イソメラーゼの作用により、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）が異性化されて生成される。イソペンテニル二リン酸Δ-イソメラーゼによる異性化反応は、ＤＭＡＰＰとＩＰＰとの間で双方向に起こる。すなわち、ＤＭＡＰＰとＩＰＰは、イソペンテニル二リン酸Δ-イソメラーゼにより相互変換されている。ＩＰＰ／ＤＭＡＰＰを生合成する経路には、従来から知られていた「メバロン酸経路」と未解明な「非メバロン酸経路（１−デオキシキシルロース経路）」の２種類の経路があることが最近の研究によりわかった。メバロン酸経路は、ほとんど全ての生物が備えていると考えられる。メバロン酸経路の律速段階は、ヒドロキシメチルグルタミル補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）がメバロン酸に還元される反応であり、これが名称の由来であると考えられる。
【０００９】
一方、ＩＰＰ又はＤＭＡＰＰから、ゲラニルピロリン酸を経てテルペノイド、ステロイド、カロテノイド、天然ゴムなどが生合成される。
【００１０】
即ち、大きく分けて、ＩＰＰからＤＭＡＰＰを経由してイソプレンを合成するパスウエイと、ＩＰＰ又はＤＭＡＰＰからゲラニルピロリン酸に行くパスウエイの２つが存在する。前者が律速の場合はイソプレンが多量合成され、大気放出される。後者が律速の場合はイソプレンが生成されないで、他の２次代謝産物が多量合成される。
【００１１】
メバロン酸経路の反応は、以下の通りである。
【００１２】
【化１】
【００１３】
上記反応７により生成されるＤＭＡＰＰがイソプレン合成酵素により脱リン酸されてイソプレンが生成する。一方、ＩＰＰ又はＤＭＡＰＰは、２次代謝を受けて、テルペノイドなどの複雑な化合物を生成する。
【００１４】
本発明は、（ａ）イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、（ｂ）５−ホスホメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド、及び、（ｃ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、からなる群より選択される少なくとも１種で形質転換され、且つ、有用部分の生産性が高められた、形質転換植物を提供する。
【００１５】
（ａ）イソプレン合成酵素は、ＤＭＡＰＰからイソプレンを合成する反応を触媒する酵素である。
【００１６】
イソプレン合成酵素としては、イソプレン合成酵素を生産するあらゆる種に由来するものが挙げられるが、その中でも、例えば、高等植物又はシダ植物に由来のものが好ましく、特に、広葉樹、シダ類、針葉樹等のイソプレンの放出量が多い種に由来するものが好ましい。特に、イソプレンの放出量が多いヤナギ科（例えば、ポプラ）、フトモモ科（例えば、ユーカリ）、ブナ科（例えば、コナラ属クヌギ、コナラ属ナラガシワ）、オシダ科（例えば、オシダ）等が好ましい。一例として、ヤナギ科のポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ａｌｂａ）のイソプレン合成酵素のアミノ酸配列を配列番号４（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＢＡＤ９８２４３）、及び、マメ科のクズ（Ｐｕｅｒａｒｉａ ｍｏｎｔａｎａ ｖａｒ． ｌｏｂａｔａ）のアミノ酸配列を配列番号１０（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＡＡＱ８４１７０）に示す。イソプレン合成酵素には、例えば、配列番号４又は１０に示されるアミノ酸配列と約８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは約９０％以上、より好ましくは９３％、より好ましくは約９６％以上、さらに好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するイソプレン合成酵素が含まれる。
【００１７】
イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチドとしては、前記イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチドが好適である（ここで、各アミノ酸に対応するコドンは、いかなるものであってもよい）。イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチドの一例として、配列番号３にポプラのイソプレン合成酵素遺伝子の塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＡＢ１９８１８０）及び配列番号９にクズのイソプレン合成酵素遺伝子の塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＡＹ３１６６９１）を示す。イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチドには、配列番号３又は９に示される塩基配列と約８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは約９０％以上、より好ましくは９３％、より好ましくは約９６％以上、さらに好ましくは約９８％以上の同一性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。
【００１８】
（ｂ）５-ホスホメバロン酸キナーゼ(EC 2.7.4.2)は、前記反応５（５−ホスホメバロン酸＋ＡＴＰ → ５−ジホスホメバロン酸＋ＡＤＰ）を触媒する酵素である。
【００１９】
５-ホスホメバロン酸キナーゼとしては、５-ホスホメバロン酸キナーゼを生産するあらゆる種に由来するものが挙げられるが、その中でも、例えば、酵母、細菌、植物、動物由来のもの、特に、酵母、植物、細菌由来のものを好適に用いることができる。一例として、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の５-ホスホメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列を配列番号６（Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号：ＡＡＡ３４５９６）に示す。５-ホスホメバロン酸キナーゼには、例えば、配列番号６に示されるアミノ酸配列と約８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは約９０％以上、より好ましくは９３％、より好ましくは約９６％以上、さらに好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する５-ホスホメバロン酸キナーゼが含まれる。
【００２０】
５−ホスホメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチドとしては、前記５−ホスホメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチドが好適である（ここで、各アミノ酸に対応するコドンは、いかなるものであってもよい）。５−ホスホメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチドの一例として、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の５−ホスホメバロン酸キナーゼ遺伝子の塩基配列を配列番号５（Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号：Ｍ６３６４８）に示す。５−ホスホメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチドには、配列番号５に示される塩基配列と約８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは約９０％以上、より好ましくは９３％、より好ましくは約９６％以上、さらに好ましくは約９８％以上の同一性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。
【００２１】
（ｃ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(EC 4.1.1.33)は、反応６（５−ジホスホメバロン酸＋アデノシン三リン酸 → ＩＰＰ＋二酸化炭素＋リン酸＋ＡＤＰ）を触媒する酵素である。
【００２２】
ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼとしては、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼを生産するあらゆる種に由来するものが挙げられるが、その中でも、例えば、酵母、細菌、植物、動物由来のもの、特に、酵母、細菌、植物、由来のものを好適に用いることができる。一例として、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列を配列番号８（Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号：ＣＡＡ６６１５８）に示す。ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼには、例えば、配列番号８に示されるアミノ酸配列と約８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは約９０％以上、より好ましくは９３％、より好ましくは約９６％以上、さらに好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼが含まれる。
【００２３】
ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドとしては、前記ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドが好適である（ここで、各アミノ酸に対応するコドンは、いかなるものであってもよい）。ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドの一例として、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ遺伝子の塩基配列を配列番号７（Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号：Ｘ９７５５７）に示す。ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドには、配列番号７に示される塩基配列と約８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは約９０％以上、より好ましくは９３％、より好ましくは約９６％以上、さらに好ましくは約９８％以上の同一性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。
【００２４】
本発明の形質転換植物は、前記（ａ）イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、（ｂ）５−ホスホメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド、及び、（ｃ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも１種（以下、（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドと称する場合もある）を植物細胞に導入することにより得ることができる。
【００２５】
本発明の１つの実施形態に従って、前記（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドに加え、（ｄ）イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼをコードするポリヌクレオチドを植物細胞に導入してもよい。（ｄ）イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼ（ＥＣ ５．３．３．２）は、ＩＰＰとＤＭＡＰＰとの間の異性化反応を双方向に触媒する酵素である。
【００２６】
例えば、（ａ）イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチドと共に、（ｄ）イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼをコードするポリヌクレオチドを導入することにより、ＩＰＰ→ＤＭＡＰＰ→イソプレンという一連のパスウエイを促進させることができ、結果的に有用部分の生産性を効率的に高めることができると考えられる。また、例えば、（ｂ）５−ホスホメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド及び／又は（ｃ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドと共に、（ｄ）イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼをコードするポリヌクレオチドを導入することにより、前記反応５及び／又は反応６→ＩＰＰ→ＤＭＡＰＰという一連のパスウエイを促進させることができ、延いてはＤＭＡＰＰ→イソプレンの反応を促進させることができ、結果的に有用部分の生産性を効率的に高めることができると考えられる。
【００２７】
イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼとしては、イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼを生産するあらゆる種に由来するものが挙げられるが、その中でも、例えば、酵母、細菌、植物、動物由来のもの、特に、酵母、細菌、植物由来のものを好適に用いることができる。一例として、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のイソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼのアミノ酸配列を配列番号１２（Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号：ＡＡＡ３４７０８）に示す。イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼには、例えば、配列番号１２に示されるアミノ酸配列と約８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは約９０％以上、より好ましくは９３％、より好ましくは約９６％以上、さらに好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するイソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼが含まれる。
【００２８】
イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼをコードするポリヌクレオチドとしては、前記イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼをコードするポリヌクレオチドが好適である（ここで、各アミノ酸に対応するコドンは、いかなるものであってもよい）。イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼをコードするポリヌクレオチドの一例として、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のイソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼ遺伝子の塩基配列を配列番号１１（Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号：Ｊ０５０９０）に示す。イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼをコードするポリヌクレオチドには、配列番号１１に示される塩基配列と約８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは約９０％以上、より好ましくは９３％、より好ましくは約９６％以上、さらに好ましくは約９８％以上の同一性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。
【００２９】
なお、（ｄ）のポリヌクレオチドの形質転換、スクリーニング等の各種操作は、以下に記載する（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドと同様の方法により行なうことができる。また、形質転換において、（ｄ）のポリヌクレオチドは、（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドと一緒に発現プラスミドに挿入されて植物細胞に導入されてもよいし、（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドとは別に発現プラスミドに挿入されて植物細胞に導入されてもよい。また、（ｄ）のポリヌクレオチドの導入と（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドの導入の順序は問わない。
【００３０】
（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドは、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＥＭＳＡ法、自動合成等の常法により入手することができる。
【００３１】
例えば、ＰＣＲ法は、基本的に、鋳型となり得るポリヌクレオチド、フォワードプライマー及びリバースプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ（デオキシヌクレオシド三リン酸の混合物）、及びＰＣＲバッファーを含む一反応液を、温度変化を伴う（１）変性（２）アニーリング（３）伸長の３つのステップに繰り返し供することにより、フォワードプライマー及びリバースプライマーの間に挟まれた特定のポリヌクレオチドを増幅する方法である。例えば、イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチドを増幅する場合、鋳型となり得るポリヌクレオチドとしては、例えば、イソプレン合成酵素遺伝子を発現する生物から作製されたゲノムＤＮＡ、ゲノムライブラリー、ｃＤＮＡライブラリー等を用いることができる。フォワードプライマー及びリバースプライマーは、例えば、イソプレン合成酵素遺伝子の５’末端又はその周辺、及び、３’末端又はその周辺に位置する任意の約１０〜３０ｂｐのヌクレオチド配列に基づき設計され得、自動合成等の常法により合成することができる。増幅される配列が開始コドンを含んでいない場合、開始コドンをｉｎ−ｆｒａｍｅで含むようフォワードプライマーを設計するか、後述の発現ベクターにｉｎ−ｆｒａｍｅで開始コドンを導入しておく。ＤＮＡポリメラーゼとしては、市販の耐熱性ポリメラーゼ、例えば、Ｐｆｕ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、Ｔａｑ（ＴＯＹＯＢＯ社製）、ＫＯＤ（ＴＯＹＯＢＯ社製）、Ｖｅｎｔ（ＮＥＢ社製）、ＥｘＴａｑ（ＴａＫａＲａ社製）、ＰｌａｔｉｎｕｍＰｆｘ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等を好適に用いることができる。ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅとしては、市販されているｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの混合物を好適に用いることができる。ＰＣＲバッファーは、使用するＤＮＡポリメラーゼ等に応じて適宜選択され、市販品又はＤＮＡポリメラーゼの添付品を好適に用いることができる。ＰＣＲ反応は、慣用的な手順に従って又はＤＮＡポリメラーゼの指示書に従って行なうことができる。また、当業者であれば、温度、時間、サイクル数、反応組成等のＰＣＲ反応条件を適宜変更することができる。
【００３２】
前記（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドは、発現ベクターへ連結された発現プラスミドとして植物細胞に導入されることが望ましい。
【００３３】
発現ベクターとしては、宿主において自律複製可能又は染色体中への組み込みが可能で、ポリヌクレオチドの転写を可能にする位置にプロモーターを含有しているものが好適に用いられる。ＰＣＲによって増幅されたポリヌクレオチドの５’末端は、直接又は適当な配列（例えば、制限酵素認識部位）を介してｉｎ−ｆｒａｍｅでプロモーターの３’末端へ連結される。発現ベクターは、さらに、植物細胞用エンハンサー（例えば、ＥＬ２エンハンサー、ＣａＭＶ３５Ｓエンハンサー等）、選択マーカー遺伝子、標識タグ等を含有してもよい。終止コドンは、必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に配置されることが好ましい。また、アミノ酸配列を参考にして、ポリヌクレオチドをｉｎ−ｆｒａｍｅで発現プロモーター、エンハンサー、開始コドン等と連結することができる。各種塩基配列及びアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬ等の検索システムから入手できる。また、アミノ酸配列は、塩基配列に基づきアミノ酸配列を推定するシステム、Ｎ末端分析、Ｃ末端分析等の常法によっても決定することができる。
【００３４】
プロモーターとしては、宿主の細胞中でイソプレン合成酵素、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、及び／又はジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの発現を促進する限りにおいて特に限定されない。高等植物における高発現には、構成的発現プロモーターであるＥＬ２プロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、Ｃａｂプロモーター、ＲｕＢｉｓＣｏプロモーター、ＰＲ１プロモーター、ユビキチンプロモーター等を用いることができる。また、イソプレン合成酵素、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、及び／又はジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼが植物の特定の器官（例えば、葉、茎、幹、根、果実、花、種子、樹皮及び地下茎からなる群より選択される少なくとも１種）で特異的に発現するプロモーターが用いられてもよい。このようなプロモーターとしては、例えば、葯特異的プロモーターＲＡ８（特表２００２−５２８１２５号）、花器特異的プロモーターＲＰＣ２１３（国際公開ＷＯ９９／４３８１８）、葉肉細胞特異的プロモーターｒｂｃＳ（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １０２，９９１−１０００（１９９３））等を用いることができるが、これらに限定されない。
【００３５】
植物細胞（宿主）は、目的や用途等に応じて適宜選択されるため特に限定されないが、好ましくは高等植物の細胞である。高等植物としては、特に限定されないが、イネ科、マメ科、イモ科、アブラナ科、ラン科、ユリ科、アヤメ科、キク科、ツツジ科、バラ科、マツ科、クスノキ科、クルミ科、ヤナギ科、クマツヅラ科等の植物が挙げられる。高等植物の具体例としては、イネ、アワ、ヒエ、キビ、サトウキビ、モロコシ、トウモロコシ、ソバ、コムギ、オオムギ、ライムギ、ライコムギ、カラスムギ、ハトムギ、ダッタンソバ、コウリャン等の穀類；ダイズ、アズキ、エンドウマメ、ソラマメ、インゲンマメ、アルファルファ、ラッカセイ、クルミ、アーモンド、ケシ、コーヒー、ピスタチオ、マカデミア等の豆類又はナッツ類；サツマイモ、ジャガイモ、ヤマイモ、サトイモ、キャッサバ、ナガイモ、タロイモ等のイモ類；ゴマ、ナタネ、ベニバナ、ヒマワリ、ココナッツ、ヤシ、オリーブ、綿実、カカオ、サフラワー、アボガド等の油脂植物；ニンジン、ダイコン、カブ、ラディッシュ、レンコン、ゴボウ、タマネギ、ネギ、セロリ、ニラ、ミツバ、シュンギク、チンゲンサイ、ハクサイ、ホウレンソウ、ミズナ、パセリ、レタス、キャベツ、ブロッコリー、アスパラガス、カリフラワー、ピーマン、シシトウ、キュウリ、ウリ、ゴーヤ、ズッキーニ、スイカ、トマト、カボチャ、ナス、ショウガ、ミョウガ、ニンニク、ラッキョウ、コマツナ等の野菜類；オレンジ、グレープフルーツ、レモン、ブドウ、マスカット、モモ、スモモ、アンズ、リンゴ、ナシ、カキ、ウメ、イチジク、ザクロ、イチゴ、メロン、パイナップル、マンゴー、マンゴスチン、パパイヤ、アセロラ、キウイ、ブルーベリー、ラズベリー、クランベリー、サクランボ等の果実類；スギ、ヒノキ、マツ、ヤナギ、キリ、カエデ、ポプラ、オーク、ニレ、ペカン、チーク、サクラ、ウメ、モミジ等の樹木類；シロイヌナズナ、バラ、カーネーション、チューリップ、トルコギキョウ、リンドウ、ペチュニア、カスミソウ、ナデシコ、ユリ、スミレ、パンジー、ラベンダー、ガーベラ、コスモス、キク、ゼラニウム、ツルウリクサ、ベゴニア、シクラメン、ニーレンベルギア、ニチニチソウ、テンジクアオイ、ラン、ヒマワリ、アイビー、アジアンタム、アレカヤシ、インドゴム、オリヅルラン、サンセベリア、シェフレラ、スパティフィラム、ドラセナ、ネオレゲリア、パキラ、ベンジャミン、ポトス、モンステラ、ポインセチア、アネモネ、キキョウ等の草木類が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
植物細胞は、もともと、イソプレン合成酵素遺伝子、５−ホスホメバロン酸キナーゼ遺伝子、及び／又は、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を有していなくてもよいし、有していてもよい。これらの遺伝子の存在量がもともと少ない又は無い種を、本発明に従って前記（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドで形質転換することによって、有用部分の生産性の顕著な増大を達成し得る。イソプレン合成酵素遺伝子、５−ホスホメバロン酸キナーゼ遺伝子、及び／又は、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ遺伝子の存在量がもともと少ない又は無い種としては、例えば、マメ科、イネ科、クマツヅラ科、アブラナ科、クワ科、キク科、モクセイ科等が考えられる。
【００３７】
植物細胞は、前記（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドを導入された植物細胞、交雑により改変された植物細胞等の改変された植物細胞であってもよい。このように改変された植物細胞を用いることにより、本発明の形質転換植物にさらに有利な性質を付与することができる。
【００３８】
植物細胞への前記（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチド又はそれを含む発現プラスミドの導入方法としては、常法、例えば、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、遺伝子銃（パーティクルガン）法、リン酸カルシウム法、プロトプラスト法、又は、Ｇｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．， Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｖｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ １９８９）、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｓｔａｎｔｏｎ Ｂ． Ｇｅｌｖｉｎ ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔ Ａ． Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ． Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ １９８８）等の文献（これらは、本書においてその全体が援用される）に記載の方法を好適に用いることができる。さらに、通常、発現プラスミドが導入されている個体を選択する。発現プラスミドが導入されている個体の選択は、常法、例えば、薬物含有培地による選択、ホルモン含有培地による選択、栄養要求性による選択により行なうことができる。さらに、ゲノムＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ノザンハイブリダイゼーション、ウェスタン解析等の常法を用いて、植物細胞染色体への上記（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドの組み込み、イソプレン合成酵素、５−ホスホメバロン酸キナーゼ又はジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼのｍＲＮＡ又はタンパク質の発現等を確認することができる。このようにして、前記（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドが導入された形質転換細胞を得ることができる。
【００３９】
さらに、必要に応じて、前記（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドが導入された形質転換細胞を分化・生長させることにより、形質転換植物を得ることができる。例えば、植物ホルモンを含有した培地に植物細胞を移すことで、植物細胞から植物に分化・生長させることができる。分化・生長の方法については、本書においてその全体が援用される「Ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｐ．Ｆ．Ｗａｒｅｉｎｇ ＆ Ｉ．Ｄ．Ｊ．Ｐｈｉｌｌｉｐｓ， １９８１，ＩＳＢＮ ４−７６２２−６３６５−６ ［８３．５刊］（植物の成長と分化（上）Ｐ．Ｆ．ウェアリング・Ｉ．Ｄ．Ｊ．フィリップス 著／古谷雅樹 監訳）」及び「Ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｐ．Ｆ．Ｗａｒｅｉｎｇ ＆ Ｉ．Ｄ．Ｊ．Ｐｈｉｌｌｉｐｓ， １９８１，ＩＳＢＮ ４−７６２２−７３６６−Ｘ ［８３．１１刊］（植物の成長と分化（下）、Ｐ．Ｆ．ウェアリング・Ｉ．Ｄ．Ｊ．フィリップス 著／古谷雅樹 監訳）」を参考にすることができる。
【００４０】
さらに、このようにして得られた形質転換体について、スクリーニングを行なってもよい。
【００４１】
スクリーニングは、例えば、下記（ｉ）〜（ｉｖ）からなる群より選択される少なくとも１を実施することにより行なわれる：
（ｉ） 有用部分の重量、大きさ及び数の少なくとも１について、得られた形質転換体と野生型とを比較し、該有用部分の重量、大きさ及び数の少なくとも１が野生型よりも大きい形質転換体を選択すること、
（ｉｉ）イソプレン合成酵素、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、及び、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼからなる群より選択される少なくとも１種の発現量について、得られた形質転換体と野生型とを比較し、該発現量が野生型よりも高い形質転換体を選択すること、
（ｉｉｉ）イソプレン合成酵素、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、及び、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼからなる群より選択される少なくとも１種のｍＲＮＡの発現量について、得られた形質転換体と野生型とを比較し、該ｍＲＮＡの発現量が野生型よりも高い形質転換体を選択すること、並びに、
（ｉｖ）イソプレン放出量について、得られた形質転換体と野生型とを比較し、該イソプレン放出量が野生型よりも多い形質転換体を選択すること。
【００４２】
「形質転換」とは、一般的に、ある細胞から単離したＤＮＡが他の細胞に取り込まれ、細胞染色体と組換えを起こす遺伝現象をいうが（東京化学同人 生化学辞典 第２版、４１６〜４１７ページ）、現在では、プラスミドやそれに結合した遺伝子なども含めてＤＮＡ分子を直接細胞に導入することを意味する（岩波 生物学辞典 第４版、３８０ページ〜３８１ページ）。本書において、形質転換とは、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ）を細胞に導入することを意味し、このときポリヌクレオチドが細胞染色体との組換えを起こしてもよいし起こさなくてもよい。表現型及び遺伝型を安定して発現させるには、オリゴヌクレオチドが細胞染色体との組換えを起こすことが望ましく、さらに、その細胞染色体との組換えがホモ接合型であることが望ましい。
【００４３】
「植物」には、あらゆる生長過程の植物体が含まれ、例えば、種子、芽生え、稚苗、中苗、成苗、結実、又は、これらの間の成長過程にある植物体が含まれる。また「植物」には、特に言及されない限り、植物体の部分も含まれ、例えば、根、シュート、葉、茎、幹、果実、花、種子、樹皮及び地下茎も含まれる。「細胞」には、細胞（例えば、培養細胞）、細胞の集合体（例えば、カルス、組織切片、不定胚）、植物体における個々の細胞が含まれる。
【００４４】
「形質転換体」には、形質転換細胞及び形質転換植物が含まれる。「形質転換体」には、前記（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドを植物細胞に導入することにより得られたＴ０世代の形質転換体だけでなく、その子孫（Ｔ１世代、Ｔ２世代、及び、それ以降の世代）も含まれる。形質転換体は、その子孫が表現型及び遺伝型を安定して発現できるよう、ホモ接合型で細胞染色体に前記（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドを有することが望ましい。
【００４５】
このように得られた本発明の形質転換植物は、有用部分の生産性が高められている。
【００４６】
有用部分とは、目的や用途等に応じて異なるため特に限定されず、植物のあらゆる器官が含まれるが、例えば、葉、茎、幹、根、果実、花、種子、樹皮及び地下茎からなる群より選択される少なくとも１種、或いは、その一部である。植物の種類によって器官の名称が異なる場合があるが、このような異なる名称の器官は、葉、茎、幹、根、果実、花、種子、樹皮及び地下茎等の一般的な名称で称される器官に相当すると理解されるべきである。例えば、イネ科の場合、穎果や穀果が果実に相当し、マメ科の場合、豆果が果実に相当すると理解される。
【００４７】
茎には、地上茎、地下茎、根茎、塊茎、花軸等が含まれる。
【００４８】
根には、多肉根、毛状根、支柱根等が含まれる。
【００４９】
果実には、果実を構成している花部器官の発生的由来を問わず、子房が発達した真果、及び、子房以外の器官から発達した組織を含む偽果も果実に含まれる。
【００５０】
果実の一部には、子房、果托、がく、総包、子房壁、外果皮、中果皮、内果皮、ナシ状果及びウリ状果等が含まれる。また、果実には果穎も含まれる。
【００５１】
花の一部には、花被、花冠、花弁、がく、総包、花柄、おしべ、めしべ、花粉、胚珠及び副冠等が含まれる。
【００５２】
植物の器官の名称については、例えば、原色牧野日本植物図鑑Ｉ（平成１１年９月６日発行、発行所 株式会社北隆館、著者 牧野富太郎）及び原色牧野日本植物図鑑ＩＩ（平成１２年５月１０日発行、発行所 株式会社北隆館、著者 牧野富太郎）を参照することができる。
【００５３】
有用部分の生産性が高められるとは、有用部分又はその一部の重量（フレッシュ重量、乾燥重量）、表面積、体積、数、大きさ、長さ、幅等が増大することを意味する。有用部分の生産性が高まるとは、例えば、下記の群より選択される少なくとも１の事項を意味する：（１）全体の重量が増大する、（２）地上部の重量が増大する、（３）葉の重量が増大する、（４）葉の数が増大する、（５）葉の大きさ（長さ又は幅）が増大する、（６）葉の肉厚が増大する、（７）茎又は幹の重量が増大する、（８）茎又は幹の太さが増大する、（９）茎又は幹の丈が増大する、（１０）根の重量が増大する、（１１）根の長さが増大する、（１２）果実の重量が増大する、（１３）果実の数が増大する、（１４）果肉の重量が増大する（１５）花の重量が増大する、（１６）花の数が増大する、（１７）花弁の重量が増大する、（１８）花弁の数が増大する、（１９）花弁の大きさが増大する、（２０）花弁の肉厚が増大する、（２１）種子の重量が増大する、（２２）種子の数が増大する、（２３）樹皮の重量が増大する、（２４）樹皮の厚みが増大する。
【００５４】
本発明のイソプレン合成酵素形質転換植物は、例えば、下記の群より選択される少なくとも１の特徴を有する：（１）全体の重量が野生型の２００％以上、好ましくは２５０％以上である、（２）地上部の重量が野生型の２００％以上、好ましくは２５０％以上である、（３）葉の重量が野生型の２００％以上、好ましくは２５０％以上である、（４）葉の数が野生型の１３０％以上、好ましくは１５０％以上である、（５）葉の大きさ（長さ又は幅）が野生型の１３０％以上、好ましくは１５０％以上である、（６）葉の肉厚が野生型の１３０％以上、好ましくは１５０％以上である、（７）茎又は幹の重量が野生型の２００％以上、好ましくは３００％以上である、（８）茎又は幹の太さ（直径又は周径）が野生型の１５０％以上、好ましくは２００％以上である、（９）茎又は幹の丈が野生型の１５０％以上、好ましくは２００％以上である、（１０）根の重量が野生型の２００％以上、好ましくは３００％以上である、（１１）根の長さが野生型の１５０％以上、好ましくは２００％以上である、（１２）果実の重量が野生型の２００％以上、好ましくは３００％以上である、（１３）果実の数が野生型の２００％以上、好ましくは３００％以上である、（１４）果肉の重量が野生型の２００％以上、好ましくは３００％以上である、（１５）花の重量が野生型の２００％以上、好ましくは３００％以上である、（１６）花の数が野生型の２００％以上、好ましくは３００％以上である、（１７）花弁の重量が野生型の２００％以上、好ましくは３００％以上である、（１８）花弁の数が野生型の２００％以上、好ましくは３００％以上である、（１９）花弁の大きさ（周径）が野生型の２００％以上、好ましくは３００％以上である、（２０）花弁の肉厚が野生型の２００％以上、好ましくは３００％以上である、（２１）種子の重量が野生型の２００％以上、好ましくは３００％以上である、（２１）種子の数が野生型の２００％以上、好ましくは３００％以上である。
【００５５】
ここで、本書において野生型とは、（ａ）イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、（ｂ）５−ホスホメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド、及び、（ｃ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも１種で形質転換されていない植物体又は植物細胞を意味する。
【００５６】
有用部分の生産性の増大には、細胞数の増大又は細胞サイズの増大のいずれか、或いは、細胞数の増大及び細胞サイズの増大の両方が寄与している。それゆえ、本発明の形質転換植物における細胞数は、例えば、野生型の１３０％、好ましくは２００％以上、より好ましくは３００％以上となり得る、或いは／並びに、本発明の形質転換植物における個々の細胞の大きさは、例えば、野生型の１３０％、好ましくは２００％以上、より好ましくは３００％以上となり得る。
【００５７】
本発明の形質転換植物は、そのイソプレン放出量が、例えば、野生型の約１５０〜３０００％、好ましくは約２００〜２０００％、好ましくは約３００〜１５００％、より好ましくは約５００〜１０００％であり得る。このような量のイソプレンを放出する形質転換植物は、有用部分の生産性が高く、各種用途に好適に用いることができる。
【００５８】
本発明の形質転換植物は、さらに、下記（Ａ）〜（Ｇ）の群より選択される少なくとも１の特徴を有し得る：
（Ａ）農薬耐性が野生型よりも高い、
（Ｂ）重金属耐性が野生型よりも高い、
（Ｃ）病害虫耐性が野生型よりも高い、
（Ｄ）低温耐性が野生型よりも高い、
（Ｅ）塩耐性が野生型よりも高い、
（Ｆ）乾燥耐性が野生型よりも高い、及び、
（Ｇ）弱光耐性が野生型よりも高い。
【００５９】
例えば、有用部分の生産性の増大に伴い植物の樹皮や果皮が厚くなることにより、あるいは、イソプレン合成に至る経路におけるホルモン等の様々な物質の量が変化することにより、上記（Ａ）〜（Ｇ）の耐性が付与されることが考えられる。
【００６０】
（Ａ）農薬耐性が野生型よりも高い植物又は（Ｂ）重金属耐性が野生型よりも高い形質転換植物は、例えば、農薬又は重金属汚染土壌のファイトリメディエーション用植物として適している。（Ｃ）病害虫耐性が野生型よりも高い形質転換植物は、例えば、熱帯又は温帯地域での栽培用植物として適している。（Ｄ）低温耐性が野生型よりも高い形質転換植物は、例えば、寒冷地域での栽培用植物として適している。（Ｅ）塩耐性が野生型よりも高い形質転換植物は、例えば、塩害地域又は海岸周辺地域での栽培用植物、塩水栽培用植物として適している。（Ｆ）乾燥耐性が野生型よりも高い形質転換植物は、例えば、砂漠再生用植物、乾燥地域での栽培用植物、観葉植物として適している。（Ｇ）弱光耐性が野生型よりも高い形質転換植物は、例えば、日照時間が少ない地域での栽培用植物、観葉植物として適している。
【００６１】
もちろん、上記（Ａ）〜（Ｇ）の耐性を有さない形質転換植物も、本発明の形質転換植物に含まれる。
【００６２】
本発明の形質転換植物は、食用、食品又は食品組成物製造用、化粧品製造用、医薬品製造用、工業製品製造用、鑑賞用、森林再生用、砂漠再生用及びファイトリメディエ−ション用からなる群より選択される少なくとも１種の用途に使用され得る。
【００６３】
食用の形質転換植物は、通常、そのまま又は加工され、ヒトを含む動物に摂取される。植物の種類は、摂食可能な部分を含む食用種である限りにおいて特に限定されない。
【００６４】
食品又は食品組成物製造用の形質転換植物は、通常、そのまま又は加工され、或いは、特定の成分だけ抽出され、食品又は食品組成物に添加される。植物の種類は、摂食可能な部分を含む食用種である限りにおいて特に限定されない。また食品又は食品組成物には、ペットフード、家畜用飼料等のヒト以外の動物の食物も含まれる。
【００６５】
化粧品製造用の形質転換植物は、通常、特定の成分又はエキスだけを抽出され、化粧品に添加される。化粧品には、スキンケア製品、ネイルケア製品、ヘアケア製品等が含まれる。特定の成分又はエキスとしては、美白成分、保湿成分、抗酸化成分、鎮静成分等として、ビタミン類、アミノ酸、ヒアルロン酸、コラーゲン、イソフラボン、ハーブエキス等が例示されるが、これらに限定されない。植物の種類としては、所望の成分又はエキスに応じて異なり、特に限定されない。
【００６６】
医薬品製造用の形質転換植物は、通常、特定の成分又はエキスだけを抽出され、医薬品に添加される。医薬品の有効成分のみならず、清涼剤、結合剤、甘味料、崩壊剤、滑沢剤、着色料、香料、安定化剤、防腐剤、徐放調整剤、界面活性剤、溶解剤、湿潤剤、栄養補助成分等として添加されてもよい。植物の種類としては、特定の成分又はエキスに応じて異なり、特に限定されない。
【００６７】
工業製品製造用の形質転換植物は、通常、そのまま又は加工され、或いは、特定の成分だけ抽出され、工業製品の原料又は部材として使用される。例えば、樹木を加工し、建築物、家具、工芸品、割り箸等の原料又は部材として使用することができる。例えば、ジャガイモ、サツマイモ、キャッサバ等のイモ類、又は、イネ、コムギ、トウモロコシ等の穀類からデンプンを抽出し、各種工業製品の原料として使用することができる。また、例えば、樹木又は草本から、セルロース、ゴム、樹脂等を抽出し、輸送用機器、電気製品、繊維製品等の原料として使用することができる。サトウキビ、カンショ、オオムギ、トウモロコシ等の穀類、又は、ジャガイモ、サツマイモ等のイモ類のグルコース等を発酵させてエタノールを製造し、化学薬品の原料、消毒薬、燃料等として使用することができる。植物の種類は、目的や用途等に応じて異なるため、特に限定されない。
【００６８】
鑑賞用の形質転換植物は、通常、そのまま又は鑑賞に適した形状にアレンジされて流通され、主に、家庭、店舗、オフィス等で鑑賞に供される。植物の種類としては、例えば、熱帯、亜熱帯又は乾燥帯原産の観葉植物、花又は果実を実らせる植物等が好ましいが、これらに限定されない。観葉植物としては、前述の草本類を好適に例示できる。
【００６９】
森林再生用の形質転換植物は、通常、種子〜中苗の成長段階で森林再生が所望される土地に植林される。植物の種類としては、森林再生が所望される土地の気象条件で生育可能な種類が望ましく、特に限定されない。また、農地開拓等の行為により森林が破壊された場合には、元の森林に戻すよう、森林が破壊される以前と同種の種類を選択することが望ましいが、酸性雨等の環境の変化により森林が破壊された場合には、変化した後の環境でも生育可能な種類を選択することが望ましい。
【００７０】
本発明は、また、工程（Ｉ）（ａ）イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、（ｂ）５−ホスホメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド、及び、（ｃ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、からなる群より選択される少なくとも１種を植物細胞に導入することにより、形質転換体を得る工程を包含する、有用部分の生産性が高められた植物を作製する方法を提供する。該方法は、さらに、（ｄ）イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼをコードするポリヌクレオチドを植物細胞に導入することにより、形質転換体を得る工程を包含してもよい。該方法は、必要に応じて、所望の生長段階の植物体に生長させる工程をさらに包含してもよい。生長の方法は、前述の通りである。また、該方法は、更に、（ＩＩ）下記の（ｉ）〜（ｉｖ）からなる群より選択される少なくとも１を実施する工程を含んでもよい：
（ｉ） 有用部分の重量、大きさ及び数の少なくとも１について、前記工程（Ｉ）で得られた形質転換体と野生型とを比較し、該有用部分の重量、大きさ及び数の少なくとも１が野生型よりも大きい形質転換体を選択すること、
（ｉｉ）イソプレン合成酵素、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、及び、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼからなる群より選択される少なくとも１種の発現量について、前記工程（Ｉ）で得られた形質転換体と野生型とを比較し、発現量が野生型よりも高い形質転換体を選択すること、
（ｉｉｉ）イソプレン合成酵素、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、及び、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼからなる群より選択される少なくとも１種のｍＲＮＡの発現量について、前記工程（Ｉ）で得られた形質転換体と野生型とを比較し、該ｍＲＮＡの発現量が野生型よりも高い形質転換体を選択すること、並びに、
（ｉｖ）イソプレン放出量について、前記工程（Ｉ）で得られた形質転換体と野生型とを比較し、該イソプレン放出量が野生型よりも多い形質転換体を選択すること。
【００７１】
（ｉ）は、直接的に有用部分の生産性を比較しているため、確実性が高い方法である。後述の実施例において、イソプレン合成酵素ｍＲＮＡの発現量又はタンパク量が野生型よりも高く、イソプレン放出量が野生型よりも高い形質転換植物体で有用部分の生産性の顕著な増大が確認されたことから、（ｉｉ）〜（ｉｖ）も、有用部分の生産性が高められた個体の選択の方法として好適である。（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）は、慣例的な方法によって実施できる点、形質転換体が有用部分を生じる段階まで成長していなくても実施できる点などにおいても有利である。
【００７２】
本発明は、前記有用部分の生産性が高められた植物を作製する方法により得られた有用部分の生産性が高められた植物、及び、その有用部分も提供する。有用部分の生産性が高められた植物及びその有用部分については、前述の通りである。
【００７３】
本発明は、また、（Ｉ）（ａ）イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、（ｂ）５−ホスホメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド、及び、（ｃ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、からなる群より選択される少なくとも１種を植物細胞に導入する工程を包含する、植物の有用部分の生産性を高める方法を提供する。該方法は、さらに、（ｄ）イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼをコードするポリヌクレオチドを植物細胞に導入する工程を包含してもよい。
【００７４】
本発明は、また、（ａ）イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、（ｂ）５−ホスホメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド、及び、（ｃ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、からなる群より選択される少なくとも１種を有する植物発現用プラスミドを備える、有用部分の生産性が高められた植物を作製するためのキットを提供する。植物用発現プラスミドとしては、前述のものを使用することができる。ここで、植物発現用プラスミドとは、植物においてイソプレン合成酵素を発現できる限りにおいて特に限定されず、植物以外の生物（例えば、微生物、動物）においてイソプレン合成酵素を発現するか否かは問わない。該キットにおける植物発現プラスミドは、さらに、（ｄ）イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼをコードするポリヌクレオチドを有してもよい。あるいは、前記キットは、さらに、（ｄ）イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼをコードするポリヌクレオチドを有する植物発現用プラスミドを備えてもよい。
【００７５】
本書における各操作については、本書においてその全体が援用されるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ．，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ．，１９８９）を参照することができる。各操作は、適宜、改変又は省略されてもよいし、必要な操作が追加されてもよい。
【００７６】
本書において、種々の反応、現象、代謝経路等に関する説明がなされているが、これらの説明は他の可能性を排除するものではない。本発明は、理論に拘束されるものではない。
【００７７】
また、当業者は、本発明の精神を逸脱しない範囲で種々の改変をなし得るであろう。
【発明の効果】
【００７８】
本発明によって、有用部分の生産性が高められた形質転換植物、及び、その作製方法が提供された。さらに、本発明によって、有用部分の生産性が高められた植物を作製する方法、該方法により有用部分の生産性が高められた植物、及び、該植物の有用部分も提供された。さらに、本発明によって、植物の有用部分の生産性を高める方法、及び、有用部分の生産性が高められた植物を作製するためのキットも提供された。
【００７９】
本発明によって、（ａ）イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、（ｂ）５−ホスホメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド、及び、（ｃ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、からなる群より選択される少なくとも１種で形質転換することにより得られた形質転換体は、その有用部分の生産性が野生型と比べて有意に高められている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８０】
以下、本発明の実施例を示す。これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明を何ら限定するものではない。
【実施例１】
【００８１】
植物材料及び生育条件
ポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ａｌｂａ）は、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）（ｓｕｃｒｏｓｅ３％，イノシトール０．０１％，インドール酪酸 終濃度４μＭ，ｐＨ５．６−５．８）１％寒天培地で継代培養を行い、約２ヶ月に一度、植え継ぎを行った。培養条件は２５℃、長日条件（１６時間明期（１２０μｍｏｌｍ−２ｓ−１）、８時間暗期）であった。培地の量は、カルチャーフラスコ（９００ｍｌ）１個につき１００ｍｌとした。植え継ぎの際には、側芽を２、３個含むように切り取った茎部分を新しい培地に移植した。
【００８２】
シロイヌナズナ（ｅｃｏｔｙｐｅ Ｃｏｌ−０）の植物体は、土壌条件の場合、２１℃、長日条件下（１６時間明期（１２０μｍｏｌｍ−２ｓ−１）、８時間暗期）に設定した人工気象器内で生育させた。無菌条件で生育させる場合には、種子の表面を種子滅菌液（３０％［ｖ／ｖ］ｓｏｄｉｕｍ ｈｙｐｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，０．０２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）で２０分間滅菌した後、滅菌水で４回洗浄し、その種子を１／２ＭＳ（０．５％ｓｕｃｒｏｓｅ，ｐＨ５．８，０．８％ａｇａｒ）培地に播種した。
【００８３】
Ｐｏｐｕｌｕｓ ａｌｂａからのｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出
Ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出は、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）のプロトコールに従って行った。試料はＰ．ａｌｂａ（約５ｃｍ草丈）緑葉１３０ｍｇをサンプリングし、液体窒素で凍結したものを用いた。
【００８４】
Ｐ．ａｌｂａ ｔｏｔａｌ ＲＮＡを用いた逆転写反応
Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ２．４μｇをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＮａｓｅ Ｈ−ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて逆転写反応に供した。
【００８５】
Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（２．４μｇ）１２μｌ（ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ水でメスアップ）
５０μＭ ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０ １μｌ
１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ １μｌ
１４μｌ
上記の反応液を６５℃で５分間加熱後、氷上に移し、５ ｘ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ ４μｌ，０．１Ｍ ＤＴＴ１μｌ，ＲＮａｓｅＯＵＴＴＭ ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １μｌ，ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ ＩＩＩ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ １μｌを加え５０℃で６０分間インキュベートして逆転写反応を行った。その際、反応液をまず湯浴にて一気に温め、反応液の蒸発を防ぐためにエアインキュベーターに移し、反応を行った。その後ヒートブロック（７０℃）で１５分間加熱し酵素を失活させた。室温に戻した後、反応液にＲＮａｓｅ Ｈ １μｌを加え、３７℃で２０分間インキュベートしてテンプレートのＲＮＡを分解した。この逆転写反応産物をテンプレートとしてポジティブコントロールであるβ−ａｃｔｉｎ（ベータ−アクチン）が増幅することを確認した。
【００８６】
ＲＴ−ＰＣＲによるＰ．ａｌｂａ イソプレン合成酵素（ＰａＩｓｐＳ）遺伝子の単離
Ｈｙｂｒｉｄ ｐｏｐｌａｒ（Ｐ．ｔｒｅｍｕｌａ ｘ Ｐ．ａｌｂａ）イソプレン合成酵素遺伝子の配列を基に設計したプライマーペア（Ｆｗ．１，Ｒｖ．１）を用いて、上記逆転写産物をテンプレートとして、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）によりＲＴ−ＰＣＲを行った。
【００８７】
Fw.1: 5’- ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcatggcaactgaattattgtgcttgc -3’
（配列番号１）
Rv.1: 5’- ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcttatctctcaaagggtagaataggctctg -3’
（配列番号２）
（アンダーラインの配列はサブクローニングのためのＧＡＴＥＷＡＹ ｓｙｓｔｅｍのａｔｔＢサイトの配列）
１０ ｘ ＫＯＤ ｐｌｕｓ ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ
２ｍＭ ｄＮＴＰ ５μｌ
２５ｍＭ ＭｇＳＯ４ ２μｌ
５０μＭ プライマー（Ｆｗ．１、Ｒｖ．１） 各１μｌずつ
ＲＴｐｒｏｄｕｃｔ １μｌ
１Ｕ／μｌＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １μｌ
Ｈ２Ｏで５０μｌまでメスアップ
ＰＣＲ ｐｒｏｇｒａｍ
＃１：９５℃ ４ｍｉｎ
＃２：９５℃ １ｍｉｎ
５３℃ ３０ｓｅｃ
６８℃ ２ｍｉｎ
（３０ｃｙｃｌｅｓ）
＃３：６８℃ ５ｍｉｎ
＃４：４℃ ∞
アガロース電気泳動により目的の大きさのバンドが増幅したことを確認した後、ＧＡＴＥＷＡＹＴＭｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＢＰｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎにより、ｐＤＯＮＲ２２１にサブクローニングした後、シーケンスにより配列を確認した。得られたコンストラクトをｐＤＯＮＲ２２１−ＰａＩｓｐＳとした。
【００８８】
ＰａＩｓｐＳ構成的発現用コンストラクトの作製
ｐＤＯＮＲ２２１−ＰａＩｓｐＳをｅｎｔｒｙ ｖｅｃｔｏｒとし、植物における構成的発現用のｂｉｎａｒｙ ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒであるｐＧＷＢ２にＧＡＴＥＷＡＹＴＭｓｙｓｔｅｍを用いて、ＰａＩｓｐＳ全長ｃＤＮＡを移しかえた。得られたコンストラクトをｐＧＷＢ２−ＰａＩｓｐＳとした。このコンストラクトをエレクトロポレーション（ＧＩＢＣＯ（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ），Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）によりＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＧＶ３１０１（ｐＭＰ９０）に導入した。
【００８９】
花序浸透法によるシロイヌナズナの形質転換
（１）植物体の準備
播種から約１ヶ月後、一次花序が数ｃｍになった個体の一次花序を切り取り、二次花序を誘導した。一次花序を切り取ってから、約１週間後の個体を形質転換に用いた。
（２）アグロバクテリウム懸濁液の調製
ｐＧＷＢ２−ＰａＩｓｐＳを有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＧＶ３１０１（ｐＭＰ９０）を抗生物質を含むＬＢ培地に植菌し、２５℃、２００ｒｐｍでＯＤ６００が１．２から１．５になるまで培養した。培養液を４８００ｒｐｍで２０分間遠心し、上清を取り除き、ＯＤ６００が０．８程度になるように５％ｓｕｃｒｏｓｅ水溶液を加え、菌体を懸濁し、この溶液にｓｉｌｗｅｔ Ｌ−７７（日本ユニカー）を終濃度０．０５％となるように加えた。
（３）形質転換
植物体を逆さにして、アグロバクテリウム懸濁液に約１０秒間浸けた後、シロイヌナズナ野生株（Ｃｏｌ−０）を横向きに倒し、１０分間程乾燥させた。この植物体を２Ｌのコニカルビーカーに入れラップでふたをして湿度の高い状態に保ち、人工気象器に移して１日置いた。植物体を容器から出し、水を与えて２週間ほど生育させた後、乾燥させて、種を収穫した。
【００９０】
形質転換体の選抜
（１）Ｔ１種子の選抜
形質転換により得られた種子を１／２ＭＳ（０．５％ｓｕｃｒｏｓｅ，ｐＨ５．８，０．８％ａｇａｒ，５０μｇ／ｍｌカナマイシン，０．０５％ＰＰＭ）プレートに約２０００個播種し、２晩低温処理後、人工気象器で生育させた。カナマイシン耐性の２９個体を土に移植し、ロゼット葉が８枚以上になったらそのうち１枚をサンプリングし、ゲノムＰＣＲによりＴ−ＤＮＡの確認を行った。
（２）Ｔ２個体の選抜
導入したＰａＩｓｐＳ遺伝子の発現を確認するため、Ｔ２世代のｓｅｅｄｌｉｎｇを用いてｎｏｒｔｈｅｒｎ解析を行うこととした。サンプルには播種後２週間のＴ２世代ｓｅｅｄｌｉｎｇを用いた。ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、７．５μｇ相当のｔｏｔａｌ ＲＮＡサンプルをＨｙｂｏｎｄＮ＋にトランスファーし、ハイブリダイゼーションを行った。メンブレンを２ ｘ ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で室温１５分間振とうさせた。洗浄液を捨て、あらかじめ６０℃に温めた２ ｘ ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で、６０℃で１５分振とうさせた。さらに洗浄液を捨て、０．２ ｘ ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で、６０℃で２０分間振とうさせた。この洗浄後、ラップに包んだメンブレンをＢＡＳイメージングプレート及びＸ線フィルムに感光させて（２時間及び２４時間）、シグナルを検出した。
【００９１】
上記のように、Ｐｏｐｕｌｕｓ ａｌｂａの実生からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲによりＰａＩｓｐＳ候補遺伝子の全長ｃＤＮＡを得た。このｃＤＮＡを大腸菌発現系を用いて発現させ、種々のプレニル二リン酸を基質として酵素活性を測定した。ここで、酵素活性の測定は、種々のプレニル二リン酸を含有した大腸菌用培地に、ＰａＩｓｐＳ候補遺伝子の全長ｃＤＮＡを導入した大腸菌を加えて培養し、この培養液のヘッドスペースを試料としてＧＣによりイソプレンの濃度を測定した。得られた生成物をイソプレンと同定し、本ｃＤＮＡがイソプレン合成酵素をコードすることを確認した（ｃＤＮＡの１次スクリーニング）。
【００９２】
大腸菌を使って１次スクリーニングを行ったｃＤＮＡを、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ法でシロイヌナズナに導入し、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ解析によるＰａＩｓｐＳ遺伝子の発現及びイソプレン放出の確認（Ｆｉｇ．１ａ，ｂ）により２次スクリーニングを行った。
【００９３】
播種後約４週間のシロイヌナズナにおいて、通常生育条件下での表現型解析を行った。その結果、高発現植物体の方が野生株と比較して葉の大きさや数が増大している傾向が見られた（Ｆｉｇ．２ａ）。実際に測定した結果、イソプレン合成酵素高発現植物体のロゼット葉の数は、野生株よりも平均で１．３〜１．５倍増大していた（Ｆｉｇ．２ｂ）。さらに葉の大きさも長さ、幅ともに高発現植物体の方が野生株よりも１．３〜１．４倍増大していた（Ｆｉｇ．２ｃ，ｄ）。その結果、植物体のロゼット葉の新鮮重の総量は、高発現植物体の方が１．９〜２．２倍増大していた（Ｆｉｇ．２ｅ）。花茎の出る時期に差は見られなかった。
【００９４】
ロゼット葉の数や大きさには、細胞数の増大又は細胞サイズの増大のいずれか、或いは、細胞数の増大と細胞サイズの増大の両方が寄与していると考えられる。
【００９５】
そこで、高発現植物体でロゼット葉の大きさや数が増大している原因を調べるために、ロゼット葉の表皮細胞の大きさを検定した。検定には、発芽後直後のロゼット葉と、播種後約４週間のロゼット葉を用いた。
【００９６】
発芽後直後のロゼット葉の表皮細胞の大きさを検定した。同じ大きさの葉を比較した場合、高発現植物体の方が野生株よりも細胞のサイズは小さく、数が多いことが分かった。このことから、同じ大きさの葉の中にある細胞数は高発現植物体の方が多いことがわかり、この細胞数の増大が最終的にはロゼット葉の大きさや数の増大に繋がっている可能性が示唆された。細胞数が増大していることに対しては、細胞分裂の速度が高まっている可能性も示唆される。
【００９７】
一方、播種後約４週間のロゼット葉の表皮細胞の大きさを検定した。同じ面積の葉を比較した場合、高発現植物体の方が野生株よりも細胞のサイズは大きく、数が少ないことが分かった。このことから、同じ面積の葉の中にある細胞数は高発現植物体の方が少ないことがわかり、この細胞サイズの増大が最終的にはロゼット葉の大きさや数の増大に繋がっている可能性が示唆された。細胞サイズが増大していることに対しては、細胞の肥大化が高まっている可能性も示唆される。
【００９８】
このように発芽後直後のロゼット葉では細胞数の増大が確認されたのに対し、播種後約４週間のロゼット葉では細胞サイズの増大が確認された。
【００９９】
このような現象が起こる理由としては、イソプレンがＩＰＰやＤＭＡＰＰから生合成されることに関係している可能性が考えられる。すなわち、ＤＭＡＰＰやＩＰＰから生合成される様々な植物ホルモン、例えばジベレリンやサイトカイニン、ブラシノステロイド等のバランスが改変され、細胞分裂、肥大化等に影響を及ぼしたという可能性がある。つまり、イソプレン自身が細胞数や細胞サイズに直接影響を及ぼしたのではなく、間接的な原因であるという可能性である。また、今までに報告はないがイソプレン自身が何かのシグナルとなり、細胞分裂や肥大化を促進したりする可能性も考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
近年、農業人口の減少、農地の減少、人口増加等による食糧不足の問題が深刻化している。本発明によれば、植物の食用部分の収量を高めることができ、食糧を効率的に生産することができるため、食糧不足の問題を改善することができる。
【０１０１】
また、近年、天然資源の枯渇の問題が深刻化している。本発明によれば、工業製品や燃料の原料を多量に含む有用部分の収量を高めることができ、工業製品や燃料（例えば、石油代替燃料として利用可能なバイオマスエタノール）を植物から効率的に製造することができるため、天然資源の枯渇の問題を改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】図１ａは、ＰａｌｓＰｓｍＲＮＡの発現量を示したものである。ノザン解析により＊印が高発現株であると判断出来る。図１ｂは、ＰａｌｓＰｓ高発現シロイヌナズナのイソプレン放出量を示したものである。ＰａｌｓＰｓ高発現シロイヌナズナのイソプレン放出量は、個体によって異なるが、いずれも野生型よりも多い傾向を示した。イソプレン放出量は、約２００〜１０００％であった。
【図２】図２ａはロゼット葉の写真である。明らかにＰａｌｓＰｓ高発現シロイヌナズナ株で野生株より葉の数・長さ・面積が増大していることがわかる。図２ｂはロゼット葉の枚数を示したものである。ＰａｌｓＰｓ高発現シロイヌナズナ株で野生株より葉の枚数が増大していることがわかる。図２ｃはロゼット葉の長さを示したものである。ＰａｌｓＰｓ高発現シロイヌナズナ株で野生株より葉の長さが増大していることがわかる。図２ｄはロゼット葉の幅を示したものである。ＰａｌｓＰｓ高発現シロイヌナズナ株で野生株より葉の大きさが増大していることがわかる。図２ｅはロゼット葉の新鮮重量を示したものである。ＰａｌｓＰｓ高発現シロイヌナズナ株で野生株より葉の新鮮重量が増大していることがわかる。
【配列表フリーテキスト】
【０１０３】
配列番号１はプライマーである。
配列番号２はプライマーである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）５−ホスホメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド、及び、
（ｃ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択される少なくとも１種で形質転換され、且つ、有用部分の生産性が高められた、形質転換植物。
【請求項２】
下記（１）〜（３）からなる群より選択される少なくとも１の特徴を有する、請求項１に記載の形質転換植物：
（１）イソプレン合成酵素、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、及び、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼからなる群より選択される少なくとも１種の発現量が野生型よりも高い、
（２）イソプレン合成酵素、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、及び、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼからなる群より選択される少なくとも１種のｍＲＮＡの発現量が野生型よりも高い、並びに、
（３）イソプレンの放出量が野生型よりも多い。
【請求項３】
イソプレン放出量が、野生型の１５０〜３０００％である、請求項１又は２に記載の形質転換植物。
【請求項４】
有用部分が、葉、茎、幹、根、果実、花、種子、樹皮及び地下茎からなる群より選択される少なくとも１種、或いは、その一部である、請求項１〜３のいずれかに記載の形質転換植物。
【請求項５】
さらに、下記（Ａ）〜（Ｇ）からなる群より選択される少なくとも１の特徴を有する、請求項１〜４のいずれかに記載の形質転換植物：
（Ａ）農薬耐性が野生型よりも高い、
（Ｂ）重金属耐性が野生型よりも高い、
（Ｃ）病害虫耐性が野生型よりも高い、
（Ｄ）低温耐性が野生型よりも高い、
（Ｅ）塩耐性が野生型よりも高い、
（Ｆ）乾燥耐性が野生型よりも高い、及び、
（Ｇ）弱光耐性が野生型よりも高い。
【請求項６】
食用、食品又は食品組成物製造用、化粧品製造用、医薬品製造用、工業製品製造用、鑑賞用、森林再生用、砂漠再生用及びファイトリメディエーション用からなる群より選択される少なくとも１種の用途に使用される、請求項１〜５のいずれかに記載の形質転換植物。
【請求項７】
種子、芽生え、稚苗、中苗、成苗、又は、これらの間の成長過程にある植物体である、請求項１〜６のいずれかに記載の形質転換植物。
【請求項８】
（ａ）イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）５−ホスホメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド、及び、
（ｃ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択される少なくとも１種がホモ接合型で細胞染色体に組み込まれている、請求項１〜７のいずれかに記載の形質転換植物。
【請求項９】
（Ｉ） （ａ）イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）５−ホスホメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド、及び、
（ｃ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択される少なくとも１種を植物細胞に導入することにより、形質転換体を得る工程を包含する、有用部分の生産性が高められた植物を作製する方法。
【請求項１０】
さらに、（ＩＩ）下記の（ｉ）〜（ｉｖ）からなる群より選択される少なくとも１を実施する工程：
（ｉ） 有用部分の重量、大きさ及び数の少なくとも１について、前記工程（Ｉ）で得られた形質転換体と野生型とを比較し、該有用部分の重量、大きさ及び数の少なくとも１が野生型よりも大きい形質転換体を選択すること、
（ｉｉ）イソプレン合成酵素、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、及び、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼからなる群より選択される少なくとも１種の発現量について、前記工程（Ｉ）で得られた形質転換体と野生型とを比較し、発現量が野生型よりも高い形質転換体を選択すること、
（ｉｉｉ）イソプレン合成酵素、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、及び、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼからなる群より選択される少なくとも１種のｍＲＮＡの発現量について、前記工程（Ｉ）で得られた形質転換体と野生型とを比較し、該ｍＲＮＡの発現量が野生型よりも高い形質転換体を選択すること、並びに、
（ｉｖ）イソプレン放出量について、前記工程（Ｉ）で得られた形質転換体と野生型とを比較し、該イソプレン放出量が野生型よりも多い形質転換体を選択すること、
を包含する、請求項９に記載の有用部分の生産性が高められた植物を作製する方法。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載の方法により作製された、有用部分の生産性が高められた植物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の植物の有用部分。
【請求項１３】
（ａ）イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）５−ホスホメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド、及び、
（ｃ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択される少なくとも１種を植物細胞に導入する工程を包含する、植物の有用部分の生産性を高める方法。
【請求項１４】
（ａ）イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）５−ホスホメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド、及び、
（ｃ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択される少なくとも１種を有する植物発現用プラスミドを備える、有用部分の生産性が高められた植物を作製するためのキット。
【請求項１】
（ａ）イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）５−ホスホメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド、及び、
（ｃ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択される少なくとも１種で形質転換され、且つ、有用部分の生産性が高められた、形質転換植物。
【請求項２】
下記（１）〜（３）からなる群より選択される少なくとも１の特徴を有する、請求項１に記載の形質転換植物：
（１）イソプレン合成酵素、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、及び、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼからなる群より選択される少なくとも１種の発現量が野生型よりも高い、
（２）イソプレン合成酵素、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、及び、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼからなる群より選択される少なくとも１種のｍＲＮＡの発現量が野生型よりも高い、並びに、
（３）イソプレンの放出量が野生型よりも多い。
【請求項３】
イソプレン放出量が、野生型の１５０〜３０００％である、請求項１又は２に記載の形質転換植物。
【請求項４】
有用部分が、葉、茎、幹、根、果実、花、種子、樹皮及び地下茎からなる群より選択される少なくとも１種、或いは、その一部である、請求項１〜３のいずれかに記載の形質転換植物。
【請求項５】
さらに、下記（Ａ）〜（Ｇ）からなる群より選択される少なくとも１の特徴を有する、請求項１〜４のいずれかに記載の形質転換植物：
（Ａ）農薬耐性が野生型よりも高い、
（Ｂ）重金属耐性が野生型よりも高い、
（Ｃ）病害虫耐性が野生型よりも高い、
（Ｄ）低温耐性が野生型よりも高い、
（Ｅ）塩耐性が野生型よりも高い、
（Ｆ）乾燥耐性が野生型よりも高い、及び、
（Ｇ）弱光耐性が野生型よりも高い。
【請求項６】
食用、食品又は食品組成物製造用、化粧品製造用、医薬品製造用、工業製品製造用、鑑賞用、森林再生用、砂漠再生用及びファイトリメディエーション用からなる群より選択される少なくとも１種の用途に使用される、請求項１〜５のいずれかに記載の形質転換植物。
【請求項７】
種子、芽生え、稚苗、中苗、成苗、又は、これらの間の成長過程にある植物体である、請求項１〜６のいずれかに記載の形質転換植物。
【請求項８】
（ａ）イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）５−ホスホメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド、及び、
（ｃ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択される少なくとも１種がホモ接合型で細胞染色体に組み込まれている、請求項１〜７のいずれかに記載の形質転換植物。
【請求項９】
（Ｉ） （ａ）イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）５−ホスホメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド、及び、
（ｃ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択される少なくとも１種を植物細胞に導入することにより、形質転換体を得る工程を包含する、有用部分の生産性が高められた植物を作製する方法。
【請求項１０】
さらに、（ＩＩ）下記の（ｉ）〜（ｉｖ）からなる群より選択される少なくとも１を実施する工程：
（ｉ） 有用部分の重量、大きさ及び数の少なくとも１について、前記工程（Ｉ）で得られた形質転換体と野生型とを比較し、該有用部分の重量、大きさ及び数の少なくとも１が野生型よりも大きい形質転換体を選択すること、
（ｉｉ）イソプレン合成酵素、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、及び、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼからなる群より選択される少なくとも１種の発現量について、前記工程（Ｉ）で得られた形質転換体と野生型とを比較し、発現量が野生型よりも高い形質転換体を選択すること、
（ｉｉｉ）イソプレン合成酵素、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、及び、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼからなる群より選択される少なくとも１種のｍＲＮＡの発現量について、前記工程（Ｉ）で得られた形質転換体と野生型とを比較し、該ｍＲＮＡの発現量が野生型よりも高い形質転換体を選択すること、並びに、
（ｉｖ）イソプレン放出量について、前記工程（Ｉ）で得られた形質転換体と野生型とを比較し、該イソプレン放出量が野生型よりも多い形質転換体を選択すること、
を包含する、請求項９に記載の有用部分の生産性が高められた植物を作製する方法。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載の方法により作製された、有用部分の生産性が高められた植物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の植物の有用部分。
【請求項１３】
（ａ）イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）５−ホスホメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド、及び、
（ｃ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択される少なくとも１種を植物細胞に導入する工程を包含する、植物の有用部分の生産性を高める方法。
【請求項１４】
（ａ）イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）５−ホスホメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド、及び、
（ｃ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択される少なくとも１種を有する植物発現用プラスミドを備える、有用部分の生産性が高められた植物を作製するためのキット。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００８−３５８３１（Ｐ２００８−３５８３１Ａ）
【公開日】平成２０年２月２１日（２００８．２．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２１７４７４（Ｐ２００６−２１７４７４）
【出願日】平成１８年８月９日（２００６．８．９）
【出願人】（０００１１１０８５）ニッタ株式会社 (588)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年２月２１日（２００８．２．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年８月９日（２００６．８．９）
【出願人】（０００１１１０８５）ニッタ株式会社 (588)
【Ｆターム（参考）】
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