架橋分岐型重合体の製造方法及び遺伝子導入剤
【課題】遺伝子導入効率が高い遺伝子導入剤として利用可な分岐型重合体の製造方法を提供する。
【解決手段】分岐鎖を有する１次分岐型重合体を架橋させた架橋分岐型重合体を製造する方法であって、ジチオカルバミル基を複数個有するイニファターに対しモノマーを光照射リビング重合させて１次分岐型重合体を製造する工程と、１次分岐型重合体を重合させる工程とを有する架橋分岐型重合体の製造方法において、該分岐鎖は、カチオン性ポリマーブロックと疎水性ポリマーブロックとを有しており、前記イニファターに対しカチオン性モノマーを光照射リビング重合させた後、疎水性モノマーを光照射リビング重合させて１次分岐型重合体とし、その後、得られた１次分岐型重合体を極性溶媒中で光照射して架橋させる方法。この分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤。
【解決手段】分岐鎖を有する１次分岐型重合体を架橋させた架橋分岐型重合体を製造する方法であって、ジチオカルバミル基を複数個有するイニファターに対しモノマーを光照射リビング重合させて１次分岐型重合体を製造する工程と、１次分岐型重合体を重合させる工程とを有する架橋分岐型重合体の製造方法において、該分岐鎖は、カチオン性ポリマーブロックと疎水性ポリマーブロックとを有しており、前記イニファターに対しカチオン性モノマーを光照射リビング重合させた後、疎水性モノマーを光照射リビング重合させて１次分岐型重合体とし、その後、得られた１次分岐型重合体を極性溶媒中で光照射して架橋させる方法。この分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分岐型重合体同士を架橋させた架橋分岐型重合体の製造方法及びこの方法により製造された架橋分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒト疾患の分子遺伝学的要因が明らかになるにつれ、遺伝子治療研究がますます重要視されている。遺伝子治療法は標的とする部位でのＤＮＡの発現を目的としており、いかにＤＮＡを標的部位に到達させるか、いかにＤＮＡを標的部位に効率的に導入し、当該部位で機能的に発現させるかということが重要となる。外来ＤＮＡの導入のためのベクターとして、レトロウイルス、アデノウイルス又はヘルペスウイルスを含む多くのウイルスが、治療用遺伝子を運搬するように改変されて、遺伝子治療のヒトの臨床試験に使用されている。しかし感染及び免疫反応の危険性は依然として残されている。
【０００３】
本出願人らは、合成高分子ベクターとしてベンゼンなど芳香族環を核としてカチオン性ポリマー鎖が放射状に伸延する分岐構造のベクターがＤＮＡを高密度で凝縮させて小さな核酸複合体微粒子を形成させ、効率良く細胞へ遺伝子導入できることを発明した（下記特許文献１，２）。この複合体微粒子が細胞膜を透過するメカニズムとしては、カチオン性ポリマー鎖による陽電荷が細胞膜表面の陰電荷と静電的に結合しエンドサイトーシスにより細胞内へ取り込まれる作用に大きく依存していると考えられる。
【特許文献１】ＷＯ２００４／０９２３８８
【特許文献２】特開２００７−７０５７９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、遺伝子導入効率の向上を期待できる遺伝子導入剤と、この遺伝子導入剤に好適な架橋分岐型重合体の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明（請求項１）の架橋分岐型重合体の製造方法は、分岐鎖を有する１次分岐型重合体を架橋させた架橋分岐型重合体を製造する方法であって、ジチオカルバミル基を複数個有するイニファターに対しモノマーを光照射リビング重合させて１次分岐型重合体を製造する工程と、１次分岐型重合体を重合させる工程とを有する架橋分岐型重合体の製造方法において、該分岐鎖は、カチオン性ポリマーブロックと疎水性ポリマーブロックとを有しており、前記イニファターに対しカチオン性モノマーを光照射リビング重合させた後、疎水性モノマーを光照射リビング重合させて１次分岐型重合体とし、その後、得られた１次分岐型重合体を極性溶媒中で光照射して架橋させることを特徴とするものである。
【０００６】
請求項２の分岐型重合体の製造方法は、請求項１において、前記イニファターは、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物であることを特徴とするものである。
【０００７】
請求項３の分岐型重合体の製造方法は、請求項２において、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が結合していることを特徴とするものである。
【０００８】
請求項４の分岐型重合体の製造方法は、請求項１ないし３のいずれか１項において、カチオン性モノマーがアクリル系モノマーであることを特徴とするものである。
【０００９】
請求項５の遺伝子導入剤は、請求項４において、アクリル系モノマーが３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドであることを特徴とするものである。
【００１０】
請求項６の分岐型重合体の製造方法は、請求項１ないし５のいずれか１項において、前記疎水性モノマーは疎水性基を有するビニル系モノマーであることを特徴とするものである。
【００１１】
請求項７の分岐型重合体の製造方法は、請求項６において、該疎水性基がアミノ基、アルコール性水酸基、フェノール性水酸基及びカルボキシル基からなる群から選択される極性官能基をアセチル化したものの少なくとも１種であることを特徴とするものである。
【００１２】
請求項８の分岐型重合体の製造方法は、請求項６又は７において、疎水性モノマーがスチレン系モノマーであることを特徴とするものである。
【００１３】
請求項９の分岐型重合体の製造方法は、請求項１ないし８のいずれか１項において、極性溶媒が水であることを特徴とするものである。
【００１４】
本発明（請求項１０）の遺伝子導入剤は、請求項１ないし９のいずれか１項の方法により製造された架橋分岐型重合体よりなるものである。
【００１５】
請求項１１の遺伝子導入剤は、請求項１０において、カチオン性ポリマーブロックの重合度が５０〜１，０００であり、疎水性ポリマーブロックの重合度が１〜３０であり、カチオン性ポリマーブロックの重合度が疎水性ポリマーブロックの重合度の２〜１，０００倍であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の方法によって製造される架橋分岐型重合体は、カチオン性ポリマーブロックと疎水性ポリマーブロックとを有する分岐鎖が放射状に伸延する分岐型重合体同士を架橋させた架橋体よりなる。
この架橋分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤は、その構造上の利点により、ＤＮＡなどの核酸を高密度に凝縮することができる。この遺伝子導入剤は、分岐型重合体が複数個架橋したものであるため、１個の分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤に比べてＤＮＡなどの核酸をより広いネットワークで包蔵することができ、優れた遺伝子導入活性を示すようになる。
【００１７】
なお、細胞の細胞膜やエンドソーム膜は二重リン脂質を主成分に形成されており、疎水性物質は細胞膜を溶解するようにして膜を透過する性質がある。本発明の遺伝子導入剤は、疎水性ポリマーブロックを有しているので、細胞の細胞膜と融合するようにして細胞膜を透過し、細胞内へ遺伝子を運搬する効果が期待できる。
【００１８】
本発明の架橋分岐型重合体の製造方法では、１次分岐型重合体同士の架橋に際し１次分岐型重合体を極性溶媒中で光照射するので、均質な架橋分岐型重合体を製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下に本発明の架橋分岐型重合体の製造方法及び遺伝子導入剤の実施の形態を詳細に説明する。
【００２０】
本発明の架橋分岐型重合体の製造方法は、分岐鎖を有する１次分岐型重合体を架橋させた架橋分岐型重合体を製造する方法であって、ジチオカルバミル基を複数個有するイニファターに対しモノマーを光照射リビング重合させて１次分岐型重合体を製造する工程と、該１次分岐型重合体を重合させる工程とを有する架橋分岐型重合体の製造方法において、該分岐鎖は、カチオン性ポリマーブロックと疎水性ポリマーブロックとを有しており、前記イニファターに対しカチオン性モノマーを光照射リビング重合させた後、疎水性モノマーを光照射リビング重合させて１次分岐型重合体とし、その後、得られた１次分岐型重合体を極性溶媒中で光照射して架橋させることを特徴とするものである。
【００２１】
上記の１次分岐型重合体を合成するには、ジチオカルバミル基を複数個有する化合物、特にＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これにカチオン性モノマーを光照射リビング重合させてカチオン性ポリマーを得、次いでこれに疎水性モノマーを光照射リビング重合させるのが好ましい。
【００２２】
なお、本明細書において、イニファターとは、光照射によりラジカルを発生させる重合開始剤、連鎖移動剤としての機能と共に、成長末端と結合して成長を停止する機能、さらに光照射が停止すると重合を停止させる重合開始・重合停止剤として機能する分子のことである。
【００２３】
イニファターとなるＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物としては、ベンゼン環に該Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が３個以上分岐鎖として結合しているものが好適であり、具体的には次が例示される。即ち、３分岐鎖化合物としては、１，３，５−トリ（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，３，５−トリ（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、４分岐鎖化合物としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖化合物としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンが挙げられる。なお、ここで、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基に含まれるジアルキル部分のアルキル基としては、エチル基等の炭素数２〜１８個のアルキル基が好ましいが、フェニル基など芳香族系の炭化水素基であっても構わない。
【００２４】
なお、以下においては、イニファターとして上述のような分岐鎖を有するものを用いて光照射リビング重合を行う場合を例示して、本発明の架橋分岐型重合体の製造方法を説明するが、本発明は何らこの方法に限定されるものではない。
【００２５】
上記のイニファターは、アルコール等の極性溶媒に対しては殆ど不溶であるが、非極性溶媒には易溶である。この非極性溶媒としては炭化水素、ハロゲン化炭化水素が好適であり、特に、ベンゼン、トルエン、クロロホルム又は塩化メチレン、中でも特にトルエンが好適である。
【００２６】
このイニファターに重合させるカチオン性モノマーとしては、アクリル酸誘導体、スチレン誘導体等のビニル系モノマーが好適であり、特に、耐加水分解性に優れることから、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２が好ましい。
【００２７】
疎水性モノマーとしては、疎水性基を有するビニル系モノマー又はスチレン系モノマーが好適である。スチレン系モノマーはそれ単体で疎水性であるが、スチレンよりも若干親水性である４−アミノスチレンなどをアセチル化したものが特に好適である。他にもアミノ基やフェノール性水酸基などを有するモノマーの親水性の極性基をアセチル化することで疎水性モノマーと誘導したものが使用可能である。このような極性基としてはアミノ基、アルコール性水酸基、フェノール性水酸基及びカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１種が例示可能である。
【００２８】
イニファターと上記カチオン性モノマーとを反応させるには、イニファター及びカチオン性モノマーを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射することによって、イニファターに対しカチオン性モノマーが結合した反応生成物を生成させる。この溶液の溶媒としては、アルカン、アルケン、アロマチック、ハロゲン化炭化水素が好適であり、具体的にはベンゼン、トルエン、クロロホルム、四塩化炭素又は塩化メチレンが挙げられ、中でもトルエン又はクロロホルムが好適である。
【００２９】
カチオン性モノマーの該原料溶液中の濃度は０．５Ｍ以上、例えば０．５〜２．５Ｍが好適である。イニファターの濃度は０．１〜１００ｍＭ程度が好適である。
【００３０】
照射する光の波長は３００〜４００ｎｍが好適であり、例えば低圧水銀灯や高圧水銀灯などを用いることができる。光の照射時間は照射強度にも依存するが、１〜６０分程度が好適であり、１μＷ／ｃｍ２〜１０ｍＷ／ｃｍ２程度の低い照射強度で１分〜３０分程度が特に好適である。
【００３１】
この光照射により、反応液中に目的とする分岐型重合体の中間体（以下、カチオン性ホモポリマーということがある。）が生成するので、必要に応じ精製してカチオン性ホモポリマーを得る。
【００３２】
このカチオン性ホモポリマーの分子量は分岐鎖の鎖数にもよるが、２，０００〜５００，０００、特に２，０００〜１５０，０００、とりわけ２，０００〜１００，０００程度が好ましい。
【００３３】
このようにして生成したカチオン性ホモポリマーに対し、疎水性モノマーをブロック共重合させて目的とする１次分岐型重合体とする。
【００３４】
カチオン性ホモポリマーに疎水性モノマーをブロック共重合させるには、上記のようにして合成したカチオン性ホモポリマーをメタノール等の溶媒に溶解させ、これに疎水性モノマーを混合し、光を照射して重合させればよい。この重合反応を開始する際の溶液中におけるカチオン性ホモポリマーの濃度は０．０１〜１０重量％程度が好適であり、疎水性モノマーの濃度は０．３〜３０重量％程度が好適である。光の照射条件は、光波長２５０〜４００ｎｍ、照射時間１〜１５０分、照射強度１００〜１０，０００μＷ／ｃｍ２程度が好適である。
【００３５】
このようにして得られる１次分岐型重合体の分子量は分岐鎖の鎖数にもよるが、３，０００〜６００，０００、特に３，０００〜１５０，０００であることが好ましい。
【００３６】
次に、このようにして得られた１次分岐型重合体同士を架橋させることにより、目的とする架橋分岐型重合体が合成される。この１次分岐型重合体の架橋を行うには、１次分岐型重合体を水、メタノールなどの極性溶媒、好ましくは水に溶解させ、光を照射する。この架橋反応を開始させる際の溶液中の１次分岐型重合体の濃度は０．０１〜１０重量％程度が好適である。
【００３７】
光の照射条件は、光波長１８０〜７００ｎｍ、照射時間１分〜３０，０００時間、照射強度０．００１〜１０，０００μＷ／ｃｍ２程度が好適である。
【００３８】
この架橋反応により、１次分岐型重合体が２〜１０個、特に２〜５個程度架橋して架橋分岐型重合体を構成する。この架橋反応では、１次分岐型重合体の分岐鎖のＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基のチオ基が開いて分岐鎖同士が架橋するものと推察される。
【００３９】
このようにして生成したカチオン性ポリマーブロックと疎水性ポリマーブロックとを有した１次分岐型重合体を架橋させた架橋分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤（ベクター）が核酸を核酸含有複合体として包囲することによって、生体内の酵素による核酸の失活、分解を抑制することができる。
【００４０】
なお、このようにして製造される架橋分岐型重合体を遺伝子導入剤（ベクター）として有効に機能させるには、架橋分岐型重合体を構成する１次分岐型重合体のカチオン性ポリマーブロックの重合度が５０〜１，０００であり、疎水性ポリマーブロックの重合度が１〜３０であり、カチオン性ポリマーブロックの重合度が疎水性ポリマーブロックの重合度の２〜１，０００倍であることが好ましい。このように、カチオン性ポリマーブロックの重合度が疎水性ポリマーブロックの重合度よりも大きいことによって、核酸保持部であり同時に親水性で水系溶媒へ良好に溶解させるためのカチオン性ポリマーブロックと、ポリマー末端に存在する光反応性ラジカル活性種を疎水結合性に凝集させ極性溶媒溶液中で、均質に光架橋を効率良く進行させるための疎水性ポリマーブロックとを有効に機能させることができるようになる。
【００４１】
このような架橋分岐型重合体よりなる本発明のベクター（遺伝子導入剤）と核酸とを複合させるには、このベクターの濃度１〜１０００μｇ／ｍＬ程度の分散液に対し、常温にて核酸を添加し、混合すればよい。核酸に対してベクターを過剰量添加し、ベクターを核酸に対し飽和状態に核酸含有複合体として複合化させるのが好ましい。
【００４２】
核酸の好ましい例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子），ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子，ＩＬ−２遺伝子，ＩＬ−４遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子，ＩＬ−７遺伝子，ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子，ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００，ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。
【００４３】
また、ＶＥＧＦ遺伝子，ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス，ｃ−ｍｙｂアンチセンス，ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス，ＰＣＮＡアンチセンス，Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が血管治療に利用できる。また、上記のようなＤＮＡの導入、遺伝子発現のみならず、細胞内のｍＲＮＡを破壊するＲＮＡ干渉をｓｉＲＮＡの導入で行うことも可能である。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。
【００４４】
核酸含有複合体の粒径は５０〜４００ｎｍ程度が好適である。これよりも小さいと、核酸含有複合体内部の核酸にまで酵素の作用が及ぶおそれ、あるいは腎臓にて濾過排出されるおそれがある。また、これよりも大きいと、細胞に導入されにくくなるおそれがある。
【００４５】
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。
【００４６】
所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。
【００４７】
本発明において、核酸を導入する対象として望ましい「細胞」としては、当該核酸の機能発現が求められるものであり、このような細胞としては、例えば使用する核酸（すなわちその機能）に応じて種々選択され、例えば心筋細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、骨髄細胞、骨細胞、血球幹細胞、血球細胞等が挙げられる。また、単球、樹状細胞、マクロファージ、組織球、クッパー細胞、破骨細胞、滑膜Ａ細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、類上皮細胞、多核巨細胞等、消化管上皮細胞・尿細管上皮細胞などである。
【００４８】
本発明のベクターを用いた核酸含有複合体は任意の方法で生体に投与することができる。
【００４９】
当該投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与の他に病変組織内に直接投与することも可能である。
【００５０】
この核酸含有複合体を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（浸透圧調整剤，安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。
【００５１】
また、この核酸含有複合体を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸含有複合体を含めたものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。
【００５２】
投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。
【００５３】
この核酸含有複合体は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の病変を生じる循環器領域での疾患に加え、癌（悪性黒色腫、脳腫瘍、転移性悪性腫瘍、乳癌等）、感染症（ＨＩＶ等）、単一遺伝病（嚢胞性線維症、慢性肉芽腫、α１−アンチトリプシン欠損症、Gaucher病等）等が挙げられる。
【００５４】
また、この核酸を複合した遺伝子導入剤の水溶液を基材に塗布などにより付着させ、必要に応じ乾燥させることにより、核酸を担持したポリマーのコーティング等が形成される。
【００５５】
上記の核酸複合遺伝子導入剤を基材に付着させる場合、基材としてはシート状のものが好適である。このシート状基材の厚さは０．０５〜１０ｍｍ程度であることが好ましく、シート面の大きさは、方形の場合、一辺が１〜２０ｍｍであり他辺が１〜２０ｍｍであり、円形又は楕円形の場合、径は１〜２０ｍｍ程度が好ましい。基材の材料としては、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリエステル、ポリアミド、ポリウレタン、シリコン樹脂、フッ素樹脂などの合成樹脂が好適である。この基材は多孔質であってもよい。
【００５６】
この基材に対する核酸複合遺伝子導入剤の付着量は、基材表面１ｃｍ２当り０．００１〜１０ｍｇ程度が好ましい。
【００５７】
核酸複合遺伝子導入剤を担持させた基材よりなる遺伝子導入材料は、皮下組織、心筋組織、病変組織、病変血管を包囲するようにシート状基材を配置したり、カバードステントのフィルムへ塗布することによって生体内に配置したり、生体外面に粘着テープを用いて貼り付けたりするようにして用いられる。
【実施例】
【００５８】
以下に実施例及び比較例を挙げて本発明をより具体的に説明する。
【００５９】
＜実施例１＞
ｉ）イニファターの合成
下記反応式に従って、１，２，４，５−テトラキス（Ｎ−Ｎジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを次のようにして合成した。
【００６０】
イニファターとしての１，２，４，５−テトラキス（Ｎ−Ｎジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを次のようにして合成した。
１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチルベンゼン）５．０ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム３４．０ｇをエタノール１００ｍＬ中へ加え、遮光下で室温で４日間攪拌した。沈殿物を濾過し、３リットルのメタノールへ投入して３０分間攪拌して濾過した。この操作を繰り返して合計４回行った。沈殿物をトルエン２００ｍＬへ溶解した後、１００ｍＬのメタノールを加えて５０℃に加温し、冷蔵庫中で１５時間保管して再結晶させ、結晶を濾別後に大量のメタノールで洗浄した。結晶を室温で減圧乾燥して、白色の１，２，４，５−テトラサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの針状結晶を得た（収率９０％）。高速液体クロマトグラフィーにより、原料ピークが消失し、精製物が単一物質であることを確認した。
【００６１】
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）の測定結果はδ１．２６−１．３１ｐｐｍ（ｔ，２４Ｈ，ＣＨ２ＣＨ３），δ３．６９−３．７７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ３．９９−４．０７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ４．５７ｐｐｍ（ｓ，８Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２），δ７．４９ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）となった。
【００６２】
【化１】
【００６３】
ii)カチオン性ホモポリマー（１次分岐型重合体の中間体）の合成
下記反応式に従い、次のようにして、１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼン（以下、ｐＤＭＡＰＡＡｍと記載することがある。）よりなるカチオン性ホモポリマーの合成を行った。
【００６４】
即ち、上記ｉ)により合成した１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン４５．６ｍｇを２０ｍＬのトルエンへ溶解し、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（３−Ｎ，Ｎ−ＤＭＡＰＡＡｍ）３．９ｇを加えて混合し、全量をトルエンで５０ｍＬに調整した。３ｍｍ厚軟質ガラスセル中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガスで５分間パージした後に、３００Ｗショートアークキセノンランプ（朝日分光社製、ＭＡＸ−３０１）で２５０ｎｍ−４００ｎｍの混合紫外線を３０分間（７．９グラム混合の場合は４０分間）照射した。照射強度はウシオ電機社のＵＩＴ−１５０にＵＶＤ−Ｃ４０５（検出波長範囲３２０ｎｍ〜４７０ｎｍ）を装着して２．５Ｗ／ｃｍ２に調整した。重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルで重合物を再沈殿させ、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿を繰り返して精製し、エーテルを蒸散させた後に少量の水へ溶解し、０．２μｍフィルターで濾過してから凍結乾燥させて４分岐型スター型ホモポリマーｐＤＭＡＰＡＡｍよりなるカチオン性ホモポリマーを得た（重合率４０％）。このものの分子量はＧＰＣにより３２，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．３７）と測定された。
【００６５】
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ Ｄ２Ｏ）の測定結果は、δ１．５−１．８ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−），δ２．１−２．２ｐｐｍ(ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ３)，δ２．２−２．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｎ），δ３．０−３．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２），δ７．４−７．８ｐｐｍ（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ−）となった。
【００６６】
【化２】
【００６７】
iii)カチオン性ホモポリマーへの疎水性モノマーのブロック共重合による１次分岐型重合体の合成
１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ,Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）−ポリ（４−アセチルアミノスチレン）−ブロック−ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼン（以下、ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｂ−ｐＡＡＳｔと記すことがある。）の合成を行った。即ち、上記ii）で合成した分子量３２，０００の４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍホモポリマー１．０ｇ及び４−アセチルアミノスチレン１．０グラムを約３０ｍＬのメタノールへ溶解した。ガラス容器中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガスで５分間パージした後に、光照射時間を１０分とした以外はii)と同様の手法で光照射重合を行い、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿処理を行い、テトラキス｛Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル−ポリ（４−アセチルアミノスチレン）−ブロック−ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル｝ベンゼン（４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｐＡＡＳｔブロックポリマー）を得た（重合率３８％）。
このものの分子量はＧＰＣにより３５，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．５）と測定された。
【００６８】
以上より、４分岐型ポリマーのポリマー鎖に５０個モノマー単位からなる３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドのポリマーブロックと、５個モノマー単位からなる４−アセチルアミノスチレンのポリマーブロックが導入された４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｐＡＡＳｔブロックポリマーが合成されたことが確認された。
【００６９】
【化３】
【００７０】
iv)極性溶媒中での１次分岐型重合体の光架橋による架橋分岐型重合体の合成
iii)で合成した１次分岐型重合体の凍結乾燥品を水へ溶解し、濃度１ｍｇ/ｍＬ〜１００ｍｇ/ｍＬの水溶液を調製した。この水溶液を軟質ガラス製の５０ｍＬバイアル瓶（厚み２ｍｍ）へ移し、ここへ２．５ｍＷ/ｃｍ２の近紫外線を３０分間照射した。光照射終了後、各水溶液を０．２μｍシリンジフィルターで濾過し、液体窒素で凍結させ、そのまま凍結乾燥を行った。得られた粉末の分子量を測定し、このときの水溶液中の１次分岐型重合体の濃度と分子量との関係を図１に示した。図１より、濃度が高くなるに従って分子量の増大が確認され、架橋分岐型重合体が形成されていると判定された。
【００７１】
＜比較例１＞
実施例１のii）において、光照射時間を３５分としたこと以外は同様にして、分子量３８，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．３８）のカチオン性ホモポリマーを合成した。このカチオン性ホモポリマーも、実施例１で合成したカチオン性ホモポリマーと同様の１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ Ｄ２Ｏ）の測定結果を示した。
この分子量３８，０００のカチオン性ホモポリマーを用いて、実施例１のiv)と同様に水溶液にて光架橋を行うと、濃度１ｍｇ/ｍＬ〜１０ｍｇ/ｍＬの範囲内で分子量に変化は確認されなかった。しかしながら、水溶液濃度を５０ｍｇ/ｍＬまで上げると一気に架橋反応が起こり、あらゆる溶媒に不溶性のゲルが形成された。反応が爆発的に起こった結果であると考えられる。このときの水溶液中のカチオン性ホモポリマーの濃度と分子量との関係を図２に示す。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】実施例１の結果を示すグラフである。
【図２】比較例１の結果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分岐型重合体同士を架橋させた架橋分岐型重合体の製造方法及びこの方法により製造された架橋分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒト疾患の分子遺伝学的要因が明らかになるにつれ、遺伝子治療研究がますます重要視されている。遺伝子治療法は標的とする部位でのＤＮＡの発現を目的としており、いかにＤＮＡを標的部位に到達させるか、いかにＤＮＡを標的部位に効率的に導入し、当該部位で機能的に発現させるかということが重要となる。外来ＤＮＡの導入のためのベクターとして、レトロウイルス、アデノウイルス又はヘルペスウイルスを含む多くのウイルスが、治療用遺伝子を運搬するように改変されて、遺伝子治療のヒトの臨床試験に使用されている。しかし感染及び免疫反応の危険性は依然として残されている。
【０００３】
本出願人らは、合成高分子ベクターとしてベンゼンなど芳香族環を核としてカチオン性ポリマー鎖が放射状に伸延する分岐構造のベクターがＤＮＡを高密度で凝縮させて小さな核酸複合体微粒子を形成させ、効率良く細胞へ遺伝子導入できることを発明した（下記特許文献１，２）。この複合体微粒子が細胞膜を透過するメカニズムとしては、カチオン性ポリマー鎖による陽電荷が細胞膜表面の陰電荷と静電的に結合しエンドサイトーシスにより細胞内へ取り込まれる作用に大きく依存していると考えられる。
【特許文献１】ＷＯ２００４／０９２３８８
【特許文献２】特開２００７−７０５７９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、遺伝子導入効率の向上を期待できる遺伝子導入剤と、この遺伝子導入剤に好適な架橋分岐型重合体の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明（請求項１）の架橋分岐型重合体の製造方法は、分岐鎖を有する１次分岐型重合体を架橋させた架橋分岐型重合体を製造する方法であって、ジチオカルバミル基を複数個有するイニファターに対しモノマーを光照射リビング重合させて１次分岐型重合体を製造する工程と、１次分岐型重合体を重合させる工程とを有する架橋分岐型重合体の製造方法において、該分岐鎖は、カチオン性ポリマーブロックと疎水性ポリマーブロックとを有しており、前記イニファターに対しカチオン性モノマーを光照射リビング重合させた後、疎水性モノマーを光照射リビング重合させて１次分岐型重合体とし、その後、得られた１次分岐型重合体を極性溶媒中で光照射して架橋させることを特徴とするものである。
【０００６】
請求項２の分岐型重合体の製造方法は、請求項１において、前記イニファターは、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物であることを特徴とするものである。
【０００７】
請求項３の分岐型重合体の製造方法は、請求項２において、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が結合していることを特徴とするものである。
【０００８】
請求項４の分岐型重合体の製造方法は、請求項１ないし３のいずれか１項において、カチオン性モノマーがアクリル系モノマーであることを特徴とするものである。
【０００９】
請求項５の遺伝子導入剤は、請求項４において、アクリル系モノマーが３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドであることを特徴とするものである。
【００１０】
請求項６の分岐型重合体の製造方法は、請求項１ないし５のいずれか１項において、前記疎水性モノマーは疎水性基を有するビニル系モノマーであることを特徴とするものである。
【００１１】
請求項７の分岐型重合体の製造方法は、請求項６において、該疎水性基がアミノ基、アルコール性水酸基、フェノール性水酸基及びカルボキシル基からなる群から選択される極性官能基をアセチル化したものの少なくとも１種であることを特徴とするものである。
【００１２】
請求項８の分岐型重合体の製造方法は、請求項６又は７において、疎水性モノマーがスチレン系モノマーであることを特徴とするものである。
【００１３】
請求項９の分岐型重合体の製造方法は、請求項１ないし８のいずれか１項において、極性溶媒が水であることを特徴とするものである。
【００１４】
本発明（請求項１０）の遺伝子導入剤は、請求項１ないし９のいずれか１項の方法により製造された架橋分岐型重合体よりなるものである。
【００１５】
請求項１１の遺伝子導入剤は、請求項１０において、カチオン性ポリマーブロックの重合度が５０〜１，０００であり、疎水性ポリマーブロックの重合度が１〜３０であり、カチオン性ポリマーブロックの重合度が疎水性ポリマーブロックの重合度の２〜１，０００倍であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の方法によって製造される架橋分岐型重合体は、カチオン性ポリマーブロックと疎水性ポリマーブロックとを有する分岐鎖が放射状に伸延する分岐型重合体同士を架橋させた架橋体よりなる。
この架橋分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤は、その構造上の利点により、ＤＮＡなどの核酸を高密度に凝縮することができる。この遺伝子導入剤は、分岐型重合体が複数個架橋したものであるため、１個の分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤に比べてＤＮＡなどの核酸をより広いネットワークで包蔵することができ、優れた遺伝子導入活性を示すようになる。
【００１７】
なお、細胞の細胞膜やエンドソーム膜は二重リン脂質を主成分に形成されており、疎水性物質は細胞膜を溶解するようにして膜を透過する性質がある。本発明の遺伝子導入剤は、疎水性ポリマーブロックを有しているので、細胞の細胞膜と融合するようにして細胞膜を透過し、細胞内へ遺伝子を運搬する効果が期待できる。
【００１８】
本発明の架橋分岐型重合体の製造方法では、１次分岐型重合体同士の架橋に際し１次分岐型重合体を極性溶媒中で光照射するので、均質な架橋分岐型重合体を製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下に本発明の架橋分岐型重合体の製造方法及び遺伝子導入剤の実施の形態を詳細に説明する。
【００２０】
本発明の架橋分岐型重合体の製造方法は、分岐鎖を有する１次分岐型重合体を架橋させた架橋分岐型重合体を製造する方法であって、ジチオカルバミル基を複数個有するイニファターに対しモノマーを光照射リビング重合させて１次分岐型重合体を製造する工程と、該１次分岐型重合体を重合させる工程とを有する架橋分岐型重合体の製造方法において、該分岐鎖は、カチオン性ポリマーブロックと疎水性ポリマーブロックとを有しており、前記イニファターに対しカチオン性モノマーを光照射リビング重合させた後、疎水性モノマーを光照射リビング重合させて１次分岐型重合体とし、その後、得られた１次分岐型重合体を極性溶媒中で光照射して架橋させることを特徴とするものである。
【００２１】
上記の１次分岐型重合体を合成するには、ジチオカルバミル基を複数個有する化合物、特にＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これにカチオン性モノマーを光照射リビング重合させてカチオン性ポリマーを得、次いでこれに疎水性モノマーを光照射リビング重合させるのが好ましい。
【００２２】
なお、本明細書において、イニファターとは、光照射によりラジカルを発生させる重合開始剤、連鎖移動剤としての機能と共に、成長末端と結合して成長を停止する機能、さらに光照射が停止すると重合を停止させる重合開始・重合停止剤として機能する分子のことである。
【００２３】
イニファターとなるＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物としては、ベンゼン環に該Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が３個以上分岐鎖として結合しているものが好適であり、具体的には次が例示される。即ち、３分岐鎖化合物としては、１，３，５−トリ（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，３，５−トリ（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、４分岐鎖化合物としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖化合物としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンが挙げられる。なお、ここで、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基に含まれるジアルキル部分のアルキル基としては、エチル基等の炭素数２〜１８個のアルキル基が好ましいが、フェニル基など芳香族系の炭化水素基であっても構わない。
【００２４】
なお、以下においては、イニファターとして上述のような分岐鎖を有するものを用いて光照射リビング重合を行う場合を例示して、本発明の架橋分岐型重合体の製造方法を説明するが、本発明は何らこの方法に限定されるものではない。
【００２５】
上記のイニファターは、アルコール等の極性溶媒に対しては殆ど不溶であるが、非極性溶媒には易溶である。この非極性溶媒としては炭化水素、ハロゲン化炭化水素が好適であり、特に、ベンゼン、トルエン、クロロホルム又は塩化メチレン、中でも特にトルエンが好適である。
【００２６】
このイニファターに重合させるカチオン性モノマーとしては、アクリル酸誘導体、スチレン誘導体等のビニル系モノマーが好適であり、特に、耐加水分解性に優れることから、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２が好ましい。
【００２７】
疎水性モノマーとしては、疎水性基を有するビニル系モノマー又はスチレン系モノマーが好適である。スチレン系モノマーはそれ単体で疎水性であるが、スチレンよりも若干親水性である４−アミノスチレンなどをアセチル化したものが特に好適である。他にもアミノ基やフェノール性水酸基などを有するモノマーの親水性の極性基をアセチル化することで疎水性モノマーと誘導したものが使用可能である。このような極性基としてはアミノ基、アルコール性水酸基、フェノール性水酸基及びカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１種が例示可能である。
【００２８】
イニファターと上記カチオン性モノマーとを反応させるには、イニファター及びカチオン性モノマーを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射することによって、イニファターに対しカチオン性モノマーが結合した反応生成物を生成させる。この溶液の溶媒としては、アルカン、アルケン、アロマチック、ハロゲン化炭化水素が好適であり、具体的にはベンゼン、トルエン、クロロホルム、四塩化炭素又は塩化メチレンが挙げられ、中でもトルエン又はクロロホルムが好適である。
【００２９】
カチオン性モノマーの該原料溶液中の濃度は０．５Ｍ以上、例えば０．５〜２．５Ｍが好適である。イニファターの濃度は０．１〜１００ｍＭ程度が好適である。
【００３０】
照射する光の波長は３００〜４００ｎｍが好適であり、例えば低圧水銀灯や高圧水銀灯などを用いることができる。光の照射時間は照射強度にも依存するが、１〜６０分程度が好適であり、１μＷ／ｃｍ２〜１０ｍＷ／ｃｍ２程度の低い照射強度で１分〜３０分程度が特に好適である。
【００３１】
この光照射により、反応液中に目的とする分岐型重合体の中間体（以下、カチオン性ホモポリマーということがある。）が生成するので、必要に応じ精製してカチオン性ホモポリマーを得る。
【００３２】
このカチオン性ホモポリマーの分子量は分岐鎖の鎖数にもよるが、２，０００〜５００，０００、特に２，０００〜１５０，０００、とりわけ２，０００〜１００，０００程度が好ましい。
【００３３】
このようにして生成したカチオン性ホモポリマーに対し、疎水性モノマーをブロック共重合させて目的とする１次分岐型重合体とする。
【００３４】
カチオン性ホモポリマーに疎水性モノマーをブロック共重合させるには、上記のようにして合成したカチオン性ホモポリマーをメタノール等の溶媒に溶解させ、これに疎水性モノマーを混合し、光を照射して重合させればよい。この重合反応を開始する際の溶液中におけるカチオン性ホモポリマーの濃度は０．０１〜１０重量％程度が好適であり、疎水性モノマーの濃度は０．３〜３０重量％程度が好適である。光の照射条件は、光波長２５０〜４００ｎｍ、照射時間１〜１５０分、照射強度１００〜１０，０００μＷ／ｃｍ２程度が好適である。
【００３５】
このようにして得られる１次分岐型重合体の分子量は分岐鎖の鎖数にもよるが、３，０００〜６００，０００、特に３，０００〜１５０，０００であることが好ましい。
【００３６】
次に、このようにして得られた１次分岐型重合体同士を架橋させることにより、目的とする架橋分岐型重合体が合成される。この１次分岐型重合体の架橋を行うには、１次分岐型重合体を水、メタノールなどの極性溶媒、好ましくは水に溶解させ、光を照射する。この架橋反応を開始させる際の溶液中の１次分岐型重合体の濃度は０．０１〜１０重量％程度が好適である。
【００３７】
光の照射条件は、光波長１８０〜７００ｎｍ、照射時間１分〜３０，０００時間、照射強度０．００１〜１０，０００μＷ／ｃｍ２程度が好適である。
【００３８】
この架橋反応により、１次分岐型重合体が２〜１０個、特に２〜５個程度架橋して架橋分岐型重合体を構成する。この架橋反応では、１次分岐型重合体の分岐鎖のＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基のチオ基が開いて分岐鎖同士が架橋するものと推察される。
【００３９】
このようにして生成したカチオン性ポリマーブロックと疎水性ポリマーブロックとを有した１次分岐型重合体を架橋させた架橋分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤（ベクター）が核酸を核酸含有複合体として包囲することによって、生体内の酵素による核酸の失活、分解を抑制することができる。
【００４０】
なお、このようにして製造される架橋分岐型重合体を遺伝子導入剤（ベクター）として有効に機能させるには、架橋分岐型重合体を構成する１次分岐型重合体のカチオン性ポリマーブロックの重合度が５０〜１，０００であり、疎水性ポリマーブロックの重合度が１〜３０であり、カチオン性ポリマーブロックの重合度が疎水性ポリマーブロックの重合度の２〜１，０００倍であることが好ましい。このように、カチオン性ポリマーブロックの重合度が疎水性ポリマーブロックの重合度よりも大きいことによって、核酸保持部であり同時に親水性で水系溶媒へ良好に溶解させるためのカチオン性ポリマーブロックと、ポリマー末端に存在する光反応性ラジカル活性種を疎水結合性に凝集させ極性溶媒溶液中で、均質に光架橋を効率良く進行させるための疎水性ポリマーブロックとを有効に機能させることができるようになる。
【００４１】
このような架橋分岐型重合体よりなる本発明のベクター（遺伝子導入剤）と核酸とを複合させるには、このベクターの濃度１〜１０００μｇ／ｍＬ程度の分散液に対し、常温にて核酸を添加し、混合すればよい。核酸に対してベクターを過剰量添加し、ベクターを核酸に対し飽和状態に核酸含有複合体として複合化させるのが好ましい。
【００４２】
核酸の好ましい例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子），ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子，ＩＬ−２遺伝子，ＩＬ−４遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子，ＩＬ−７遺伝子，ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子，ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００，ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。
【００４３】
また、ＶＥＧＦ遺伝子，ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス，ｃ−ｍｙｂアンチセンス，ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス，ＰＣＮＡアンチセンス，Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が血管治療に利用できる。また、上記のようなＤＮＡの導入、遺伝子発現のみならず、細胞内のｍＲＮＡを破壊するＲＮＡ干渉をｓｉＲＮＡの導入で行うことも可能である。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。
【００４４】
核酸含有複合体の粒径は５０〜４００ｎｍ程度が好適である。これよりも小さいと、核酸含有複合体内部の核酸にまで酵素の作用が及ぶおそれ、あるいは腎臓にて濾過排出されるおそれがある。また、これよりも大きいと、細胞に導入されにくくなるおそれがある。
【００４５】
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。
【００４６】
所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。
【００４７】
本発明において、核酸を導入する対象として望ましい「細胞」としては、当該核酸の機能発現が求められるものであり、このような細胞としては、例えば使用する核酸（すなわちその機能）に応じて種々選択され、例えば心筋細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、骨髄細胞、骨細胞、血球幹細胞、血球細胞等が挙げられる。また、単球、樹状細胞、マクロファージ、組織球、クッパー細胞、破骨細胞、滑膜Ａ細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、類上皮細胞、多核巨細胞等、消化管上皮細胞・尿細管上皮細胞などである。
【００４８】
本発明のベクターを用いた核酸含有複合体は任意の方法で生体に投与することができる。
【００４９】
当該投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与の他に病変組織内に直接投与することも可能である。
【００５０】
この核酸含有複合体を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（浸透圧調整剤，安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。
【００５１】
また、この核酸含有複合体を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸含有複合体を含めたものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。
【００５２】
投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。
【００５３】
この核酸含有複合体は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の病変を生じる循環器領域での疾患に加え、癌（悪性黒色腫、脳腫瘍、転移性悪性腫瘍、乳癌等）、感染症（ＨＩＶ等）、単一遺伝病（嚢胞性線維症、慢性肉芽腫、α１−アンチトリプシン欠損症、Gaucher病等）等が挙げられる。
【００５４】
また、この核酸を複合した遺伝子導入剤の水溶液を基材に塗布などにより付着させ、必要に応じ乾燥させることにより、核酸を担持したポリマーのコーティング等が形成される。
【００５５】
上記の核酸複合遺伝子導入剤を基材に付着させる場合、基材としてはシート状のものが好適である。このシート状基材の厚さは０．０５〜１０ｍｍ程度であることが好ましく、シート面の大きさは、方形の場合、一辺が１〜２０ｍｍであり他辺が１〜２０ｍｍであり、円形又は楕円形の場合、径は１〜２０ｍｍ程度が好ましい。基材の材料としては、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリエステル、ポリアミド、ポリウレタン、シリコン樹脂、フッ素樹脂などの合成樹脂が好適である。この基材は多孔質であってもよい。
【００５６】
この基材に対する核酸複合遺伝子導入剤の付着量は、基材表面１ｃｍ２当り０．００１〜１０ｍｇ程度が好ましい。
【００５７】
核酸複合遺伝子導入剤を担持させた基材よりなる遺伝子導入材料は、皮下組織、心筋組織、病変組織、病変血管を包囲するようにシート状基材を配置したり、カバードステントのフィルムへ塗布することによって生体内に配置したり、生体外面に粘着テープを用いて貼り付けたりするようにして用いられる。
【実施例】
【００５８】
以下に実施例及び比較例を挙げて本発明をより具体的に説明する。
【００５９】
＜実施例１＞
ｉ）イニファターの合成
下記反応式に従って、１，２，４，５−テトラキス（Ｎ−Ｎジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを次のようにして合成した。
【００６０】
イニファターとしての１，２，４，５−テトラキス（Ｎ−Ｎジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを次のようにして合成した。
１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチルベンゼン）５．０ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム３４．０ｇをエタノール１００ｍＬ中へ加え、遮光下で室温で４日間攪拌した。沈殿物を濾過し、３リットルのメタノールへ投入して３０分間攪拌して濾過した。この操作を繰り返して合計４回行った。沈殿物をトルエン２００ｍＬへ溶解した後、１００ｍＬのメタノールを加えて５０℃に加温し、冷蔵庫中で１５時間保管して再結晶させ、結晶を濾別後に大量のメタノールで洗浄した。結晶を室温で減圧乾燥して、白色の１，２，４，５−テトラサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの針状結晶を得た（収率９０％）。高速液体クロマトグラフィーにより、原料ピークが消失し、精製物が単一物質であることを確認した。
【００６１】
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）の測定結果はδ１．２６−１．３１ｐｐｍ（ｔ，２４Ｈ，ＣＨ２ＣＨ３），δ３．６９−３．７７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ３．９９−４．０７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ４．５７ｐｐｍ（ｓ，８Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２），δ７．４９ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）となった。
【００６２】
【化１】
【００６３】
ii)カチオン性ホモポリマー（１次分岐型重合体の中間体）の合成
下記反応式に従い、次のようにして、１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼン（以下、ｐＤＭＡＰＡＡｍと記載することがある。）よりなるカチオン性ホモポリマーの合成を行った。
【００６４】
即ち、上記ｉ)により合成した１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン４５．６ｍｇを２０ｍＬのトルエンへ溶解し、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（３−Ｎ，Ｎ−ＤＭＡＰＡＡｍ）３．９ｇを加えて混合し、全量をトルエンで５０ｍＬに調整した。３ｍｍ厚軟質ガラスセル中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガスで５分間パージした後に、３００Ｗショートアークキセノンランプ（朝日分光社製、ＭＡＸ−３０１）で２５０ｎｍ−４００ｎｍの混合紫外線を３０分間（７．９グラム混合の場合は４０分間）照射した。照射強度はウシオ電機社のＵＩＴ−１５０にＵＶＤ−Ｃ４０５（検出波長範囲３２０ｎｍ〜４７０ｎｍ）を装着して２．５Ｗ／ｃｍ２に調整した。重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルで重合物を再沈殿させ、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿を繰り返して精製し、エーテルを蒸散させた後に少量の水へ溶解し、０．２μｍフィルターで濾過してから凍結乾燥させて４分岐型スター型ホモポリマーｐＤＭＡＰＡＡｍよりなるカチオン性ホモポリマーを得た（重合率４０％）。このものの分子量はＧＰＣにより３２，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．３７）と測定された。
【００６５】
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ Ｄ２Ｏ）の測定結果は、δ１．５−１．８ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−），δ２．１−２．２ｐｐｍ(ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ３)，δ２．２−２．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｎ），δ３．０−３．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２），δ７．４−７．８ｐｐｍ（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ−）となった。
【００６６】
【化２】
【００６７】
iii)カチオン性ホモポリマーへの疎水性モノマーのブロック共重合による１次分岐型重合体の合成
１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ,Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）−ポリ（４−アセチルアミノスチレン）−ブロック−ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼン（以下、ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｂ−ｐＡＡＳｔと記すことがある。）の合成を行った。即ち、上記ii）で合成した分子量３２，０００の４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍホモポリマー１．０ｇ及び４−アセチルアミノスチレン１．０グラムを約３０ｍＬのメタノールへ溶解した。ガラス容器中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガスで５分間パージした後に、光照射時間を１０分とした以外はii)と同様の手法で光照射重合を行い、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿処理を行い、テトラキス｛Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル−ポリ（４−アセチルアミノスチレン）−ブロック−ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル｝ベンゼン（４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｐＡＡＳｔブロックポリマー）を得た（重合率３８％）。
このものの分子量はＧＰＣにより３５，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．５）と測定された。
【００６８】
以上より、４分岐型ポリマーのポリマー鎖に５０個モノマー単位からなる３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドのポリマーブロックと、５個モノマー単位からなる４−アセチルアミノスチレンのポリマーブロックが導入された４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｐＡＡＳｔブロックポリマーが合成されたことが確認された。
【００６９】
【化３】
【００７０】
iv)極性溶媒中での１次分岐型重合体の光架橋による架橋分岐型重合体の合成
iii)で合成した１次分岐型重合体の凍結乾燥品を水へ溶解し、濃度１ｍｇ/ｍＬ〜１００ｍｇ/ｍＬの水溶液を調製した。この水溶液を軟質ガラス製の５０ｍＬバイアル瓶（厚み２ｍｍ）へ移し、ここへ２．５ｍＷ/ｃｍ２の近紫外線を３０分間照射した。光照射終了後、各水溶液を０．２μｍシリンジフィルターで濾過し、液体窒素で凍結させ、そのまま凍結乾燥を行った。得られた粉末の分子量を測定し、このときの水溶液中の１次分岐型重合体の濃度と分子量との関係を図１に示した。図１より、濃度が高くなるに従って分子量の増大が確認され、架橋分岐型重合体が形成されていると判定された。
【００７１】
＜比較例１＞
実施例１のii）において、光照射時間を３５分としたこと以外は同様にして、分子量３８，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．３８）のカチオン性ホモポリマーを合成した。このカチオン性ホモポリマーも、実施例１で合成したカチオン性ホモポリマーと同様の１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ Ｄ２Ｏ）の測定結果を示した。
この分子量３８，０００のカチオン性ホモポリマーを用いて、実施例１のiv)と同様に水溶液にて光架橋を行うと、濃度１ｍｇ/ｍＬ〜１０ｍｇ/ｍＬの範囲内で分子量に変化は確認されなかった。しかしながら、水溶液濃度を５０ｍｇ/ｍＬまで上げると一気に架橋反応が起こり、あらゆる溶媒に不溶性のゲルが形成された。反応が爆発的に起こった結果であると考えられる。このときの水溶液中のカチオン性ホモポリマーの濃度と分子量との関係を図２に示す。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】実施例１の結果を示すグラフである。
【図２】比較例１の結果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分岐鎖を有する１次分岐型重合体を架橋させた架橋分岐型重合体を製造する方法であって、
ジチオカルバミル基を複数個有するイニファターに対しモノマーを光照射リビング重合させて１次分岐型重合体を製造する工程と、該１次分岐型重合体を重合させる工程とを有する架橋分岐型重合体の製造方法において、
該分岐鎖は、カチオン性ポリマーブロックと疎水性ポリマーブロックとを有しており、
前記イニファターに対しカチオン性モノマーを光照射リビング重合させた後、疎水性モノマーを光照射リビング重合させて１次分岐型重合体とし、
その後、得られた１次分岐型重合体を極性溶媒中で光照射して架橋させることを特徴とする架橋分岐型重合体の製造方法。
【請求項２】
請求項１において、前記イニファターは、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物であることを特徴とする分岐型重合体の製造方法。
【請求項３】
請求項２において、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が結合していることを特徴とする分岐型重合体の製造方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項において、カチオン性モノマーがアクリル系モノマーであることを特徴とする分岐型重合体の製造方法。
【請求項５】
請求項４において、アクリル系モノマーが３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドであることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項において、前記疎水性モノマーは疎水性基を有するビニル系モノマーであることを特徴とする分岐型重合体の製造方法。
【請求項７】
請求項６において、該疎水性基がアミノ基、アルコール性水酸基、フェノール性水酸基及びカルボキシル基からなる群から選択される極性官能基をアセチル化したものの少なくとも１種であることを特徴とする分岐型重合体の製造方法。
【請求項８】
請求項６又は７において、疎水性モノマーがスチレン系モノマーであることを特徴とする分岐型重合体の製造方法。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項において、極性溶媒が水又はメタノールであることを特徴とする分岐型重合体の製造方法。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか１項の方法により製造された架橋分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤。
【請求項１１】
請求項１０において、カチオン性ポリマーブロックの重合度が５０〜１，０００であり、疎水性ポリマーブロックの重合度が１〜３０であり、カチオン性ポリマーブロックの重合度が疎水性ポリマーブロックの重合度の２〜１，０００倍であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項１】
分岐鎖を有する１次分岐型重合体を架橋させた架橋分岐型重合体を製造する方法であって、
ジチオカルバミル基を複数個有するイニファターに対しモノマーを光照射リビング重合させて１次分岐型重合体を製造する工程と、該１次分岐型重合体を重合させる工程とを有する架橋分岐型重合体の製造方法において、
該分岐鎖は、カチオン性ポリマーブロックと疎水性ポリマーブロックとを有しており、
前記イニファターに対しカチオン性モノマーを光照射リビング重合させた後、疎水性モノマーを光照射リビング重合させて１次分岐型重合体とし、
その後、得られた１次分岐型重合体を極性溶媒中で光照射して架橋させることを特徴とする架橋分岐型重合体の製造方法。
【請求項２】
請求項１において、前記イニファターは、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物であることを特徴とする分岐型重合体の製造方法。
【請求項３】
請求項２において、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が結合していることを特徴とする分岐型重合体の製造方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項において、カチオン性モノマーがアクリル系モノマーであることを特徴とする分岐型重合体の製造方法。
【請求項５】
請求項４において、アクリル系モノマーが３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドであることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項において、前記疎水性モノマーは疎水性基を有するビニル系モノマーであることを特徴とする分岐型重合体の製造方法。
【請求項７】
請求項６において、該疎水性基がアミノ基、アルコール性水酸基、フェノール性水酸基及びカルボキシル基からなる群から選択される極性官能基をアセチル化したものの少なくとも１種であることを特徴とする分岐型重合体の製造方法。
【請求項８】
請求項６又は７において、疎水性モノマーがスチレン系モノマーであることを特徴とする分岐型重合体の製造方法。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項において、極性溶媒が水又はメタノールであることを特徴とする分岐型重合体の製造方法。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか１項の方法により製造された架橋分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤。
【請求項１１】
請求項１０において、カチオン性ポリマーブロックの重合度が５０〜１，０００であり、疎水性ポリマーブロックの重合度が１〜３０であり、カチオン性ポリマーブロックの重合度が疎水性ポリマーブロックの重合度の２〜１，０００倍であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００９−１４４０９９（Ｐ２００９−１４４０９９Ａ）
【公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３２４８４７（Ｐ２００７−３２４８４７）
【出願日】平成１９年１２月１７日（２００７．１２．１７）
【出願人】（５９１１０８８８０）国立循環器病センター総長 (159)
【出願人】（０００００５２７８）株式会社ブリヂストン (11,469)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月１７日（２００７．１２．１７）
【出願人】（５９１１０８８８０）国立循環器病センター総長 (159)
【出願人】（０００００５２７８）株式会社ブリヂストン (11,469)
【Ｆターム（参考）】
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