染色体上のｌｙｓＲ遺伝子が不活性化されたＬ−トレオニン生成微生物、これを製造する方法、及び該微生物を利用したＬ−トレオニンの製造方法
本発明は、Ｌ−トレオニンを生産でき、染色体上のｌｙｓＲ遺伝子が不活性化された微生物、これを製造する方法、及び該微生物を利用してＬ−トレオニンを製造する方法を提供する。本発明の微生物は、Ｌ−トレオニンを高収率で生産する方法に使われうる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、染色体上のｌｙｓＲ遺伝子が不活性化された微生物、これを製造する方法、及び該微生物を利用したＬ−トレオニンを生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−トレオニンは、必須アミノ酸の一種であり、飼料及び食品添加剤として広く使われており、医薬用として輸液剤、医薬品の合成原料にも使われる。Ｌ−トレオニンは、発酵法で製造するが、一般的に、大腸菌、コリネ型細菌、セラチア属細菌及びプロビデンシア属菌株の野生株から誘導された人工変異株を使用している。例えば、日本特許公告第１００３７／８１号（特許文献１）には、エシェリキア属に属し、ジアミノピメリン酸及びメチオニンを要求し、その生合成系がトレオニンのフィードバック抑制作用を阻止する微生物を利用する方法が記述されている。日本特許公開第２２４６８４／８３号（特許文献２）には、ブレビバクテリウム属に属し、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン及びα−アミノ−β−ヒドロキシバレリアン酸に対する耐性を有し、Ｌ−イソロイシン及びＬ−リシン栄養要求性微生物を利用する方法が記述されている。大韓民国特許公開第８０２２／８７号（特許文献３）には、エシェリキア属に属し、ジアミノピメリン酸、メチオニン要求性、α−アミノ−β−ヒドロキシバレリアン酸耐性を有し、リファンピシン、リシン、メチオニン、アスパラギン酸、及びホモセリンのうち、少なくとも１つの物質に対する耐性を有するか、または低下したＬ−トレオニン分解能を持つ微生物を利用した方法が記述されている。日本特許公開第２１９５８２／９０号（特許文献４）には、プロビデンシア属に属し、α−アミノ−β−ヒドロキシバレリアン酸、Ｌ−エチオニン、チアイソロイシン、オキシチアミン、及びスルファグアニジン耐性を有し、Ｌ−ロイシン要求性、Ｌ−イソロイシン漏出（ｌｅａｋｙ）型要求性微生物を利用する方法が記述されている。
【０００３】
しかし、前記公知の方法は、Ｌ−トレオニン生産性が高くないか、またはジアミノピメリン酸要求性またはイソロイシン要求性のような高価の物質を添加しなければならないという短所がある。すなわち、ジアミノピメリン酸要求性菌株を使用する場合、ジアミノピメリン酸を副発酵しなければならないので、コスト負担の要因が大きく、イソロイシン要求性菌株を使用する場合にも、イソロイシンを発酵培地に添加する必要があるが、この場合、イソロイシンが高価であるため、コスト上昇の要因となる。
【０００４】
このような問題点を克服するために本発明者らは、イソロイシン漏出型要求性菌株を使用して、発酵培地内にイソロイシンを添加する必要がなく、リシン合成の中間媒体であるジアミノピメリン酸要求性菌株を使用せずとも、従来の菌株より発酵法によって高濃度のＬ−トレオニンを生成できる菌株として、Ｌ−メチオニン類似体に対する耐性を有し、メチオニン栄養要求性、Ｌ−トレオニン類似体に対する耐性、イソロイシン漏出型要求性、Ｌ−リシン類似体に対する耐性、及びα−アミノ酪酸耐性を有し、Ｌ−トレオニンを生産できるエシェリキアコリ（大腸菌）に属する微生物を開発し、この微生物及びこれを利用したＬ−トレオニンの製造方法を特許されている（韓国特許公告第９２−８３６５号（特許文献５））。
【０００５】
従来ｌｙｓＲ遺伝子によってコーディングされるＬｙｓＲ蛋白質は、細胞内のリシン濃度が高い場合に、ｌｙｓＣ及びｌｙｓＡ遺伝子の発現を抑制し、リシン濃度が低い場合に、ｌｙｓＣ及びｌｙｓＡ遺伝子の発現を増加させると知られている（Ｂｅａｃｈａｍ， Ｉ． Ｒ．， Ｄ． Ｈａｓｓ， ａｎｄ Ｅ． Ｙａｇｉｌ． １９７７． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １２９：１０３４−１０４４（非特許文献１））。ｌｙｓＣは、大腸菌Ｋ−１２でアスパラギン酸をアスパルチルリン酸に転換するリシン−敏感性アスパルトキナーゼＩＩＩ（ａｓｐａｒｔａｔｅｋｉｎａｓｅ ＩＩＩ）[ＥＣ：２．７．２．４]をコーディングすると知られている。
【０００６】
本発明者らは、前記のような従来技術に基づいて、Ｌ−トレオニンの生産能が向上した菌株を選別する研究を集中的に行っていた中、ｌｙｓＣ遺伝子の発現が増加すれば、クエン酸回路を通じて得られたオキサロ酢酸が、アスパラギン酸を経てリシン、トレオニン、及びメチオニンなどの中間代謝産物であるβ−アスパルチルリン酸に転換される比率が高くなって、トレオニン生産収率が増加すると予測し、前記ｌｙｓＲ遺伝子を不活性化させることにより、Ｌ−トレオニンの生合成が促進できるという事実を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
【特許文献１】日本特許公告第１００３７／８１号
【特許文献２】日本特許公開第２２４６８４／８３号
【特許文献３】大韓民国特許公開第８０２２／８７号
【特許文献４】日本特許公開第２１９５８２／９０号
【特許文献５】韓国特許公告第９２−８３６５号
【非特許文献１】Ｂｅａｃｈａｍ， Ｉ． Ｒ．， Ｄ． Ｈａｓｓ， ａｎｄ Ｅ． Ｙａｇｉｌ． １９７７． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １２９：１０３４−１０４４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、Ｌ−トレオニンの生合成能が向上した微生物菌株を提供することである。
【０００９】
本発明の他の目的は、前記微生物を製造する方法を提供することである。
【００１０】
本発明のさらに他の目的は、前記微生物を利用してＬ−トレオニンを効率的に生産できる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、Ｌ−トレオニンを生産できる微生物として、染色体上のｌｙｓＲ遺伝子が不活性化された微生物を提供する。
【００１２】
本発明において、前記微生物は、Ｌ−トレオニンを生産でき、染色体上のｌｙｓＲ遺伝子が不活性化された微生物であれば、原核微生物及び真核微生物のいずれも含まれる。例えば、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、及びブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物菌株が含まれうる。望ましくは、腸内細菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）科に属する微生物であり、さらに望ましくは、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する微生物である。最も望ましくは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＦＴＲ４０１４（ＫＣＣＭ−１０６３４）である。
【００１３】
また、ｌｙｓＲ遺伝子が不活性化される微生物には、天然微生物だけでなく、Ｌ−トレオニン生産用変移微生物も含みうる。このような変移微生物の例には、Ｌ−メチオニン類似体に対する耐性を有し、メチオニン栄養要求性、Ｌ−トレオニン類似体に対する耐性、イソロイシン漏出型要求性、Ｌ−リシン類似体に対する耐性、及びα−アミノ酪酸耐性を有し、Ｌ−トレオニンを生産できる大腸菌に属する微生物；内在的ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）遺伝子とトレオニンオペロンに含まれている遺伝子の他に、追加で１コピー以上のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）遺伝子とトレオニンオペロンに含まれている遺伝子ｔｈｒＡ、ｔｈｒＢ及びｔｈｒＣが染色体ＤＮＡ中に挿入された変異微生物が含まれる。前記Ｌ−メチオニン類似体は、例えば、Ｄ，Ｌ−エチオニン、ノルロイシン、α−メチルメチオニン、及びＬ−メチオニン−Ｄ，Ｌ−スルホキシミンから選択される一つ以上の化合物でありうる。また、前記Ｌ−トレオニン類似体は、例えば、α−アミノ−β−ヒドロキシバレリアン酸及びＤ，Ｌ−トレオニンヒドロキサメートからなる群から選択される一つ以上の化合物でありうる。また、Ｌ−リシン類似体は、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン及びδ−メチル−Ｌ−リシンからなる群から選択される一つ以上の化合物でありうる。さらに他の変移微生物の例には、Ｌ−トレオニン生合成中間体であるオキサロ酢酸（ＯＡＡ）をポスホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）に転換するのに関与するｐｃｋＡ遺伝子が不活性化された微生物、またはオキサロ酢酸アスパラギン酸に転換するｌｙｓＣ遺伝子を抑制するｔｙｒＲ遺伝子が不活性化された微生物、または ブドウ糖流入に関与するｇａｌＰ遺伝子の発現を抑制するｇａｌＲ遺伝子が不活性化された微生物が含まれうる。
【００１４】
本発明において、前記ｌｙｓＲ遺伝子は、アスパルトキナーゼ活性をコーディングするｌｙｓＣを転写レベルで調節する蛋白質をコーディングする。大腸菌において、前記ｌｙｓＲ遺伝子は、公知されており、Ｂｌａｔｔｎｅｒら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：１４５３−１４６２（１９９７））によって公開された大腸菌のゲノム配列からも得られる（例、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ：ＥＧ１０５５１）。前記遺伝子配列は、米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）及び日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）などのデータベースから得られる。また、本発明のｌｙｓＲ遺伝子には、遺伝コードの縮退または機能的に中性である突然変異によって発生する対立遺伝子も含む。本発明において、“不活性化”とは、活性のあるｌｙｓＲ産物が発現されないようになっていることを意味する。不活性化の例としては、ｌｙｓＲ遺伝子自体のの置換、欠失及び逆位などによる不活性化だけでなく、ｌｓｙＲ遺伝子の発現調節領域での突然変異によって、ｌｙｓＲが発現されないことも含まれる。ｌｙｓＲが不活性化されれば、ｌｙｓＣ遺伝子の発現は増加する。
【００１５】
本発明において、不活性化されるｌｙｓＲ遺伝子の例は、大腸菌K−１２のｌｙｓＲ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．Ｅｇ１０５５１）、大腸菌Ｗ３１１０のｌｙｓＲ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．１０５５１）及び大腸菌ＫＣＣＭ−１０５４１のｌｙｓＲ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．１０５５１）が含まれるが、これらの例に限定されるものではない。
【００１６】
本発明の微生物は、Ｌ−トレオニンを生産できる微生物の染色体に存在するｌｙｓＲ遺伝子を不活性化させることで製造できる。このような不活性化方法には、紫外線のような光または化学物質を利用して突然変異を誘発し、得られた突然変異体からｌｙｓＲ遺伝子が不活性化された菌株を選別できる。また、前記不活性化方法にはＤ、ＮＡ再組合技術による方法が含まれる。前記ＤＮＡ再組合技術は、例えば、前記ｌｙｓＲ遺伝子と相同性のあるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列またはベクターを前記微生物に注入して、相同再組合を発生させることで行われうる。また、前記注入されるヌクレオチド配列またはベクターには、優性選別マーカーを含むことができる。
【００１７】
本発明はまた、不活性化されたｌｙｓＲ遺伝子またはそのＤＮＡ断片を製造し、Ｌ−トレオニンを生産できる微生物に導入させて、前記微生物の染色体上に存在するｌｙｓＲ遺伝子と再組合させ、ｌｙｓＲ遺伝子が不活性化された微生物を選別することを特徴とするＬ−トレオニンの生産用微生物を製造する方法を提供する。
【００１８】
本発明の方法において、前記不活性化されたｌｙｓＲ遺伝子またはそのＤＮＡ断片とは、宿主内のｌｙｓＲ遺伝子と配列相同性を有するポリヌクレオチド配列を含むが、欠失、置換、切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）及び逆位のような突然変異が導入されて、活性のがあるｌｙｓＲ産物を発現できないポリヌクレオチド配列を意味する。前記不活性化されたｌｙｓＲ遺伝子またはその断片を宿主細胞内に導入する過程は、例えば、形質転換、接合、形質導入または電気せん孔によって行われうるが、これらの例に限定されるものではない。
【００１９】
前記不活性化されたｌｙｓＲ遺伝子またはそのＤＮＡ断片が、形質転換によって宿主細胞内に導入される場合、不活性化の手順は、前記ポリヌクレオチド配列を菌株の培養物と混合して行われうる。この場合、菌株は、天然的にＤＮＡ流入に対して コンピテントに形質転換できるが、予め菌株を適切な方法によってＤＮＡ流入のためにコンピテントにすることが望ましい（ＬｅＢｌａｎｃら， Ｐｌａｓｍｉｄ ２８， １３０−１４５， １９９２；Ｐｏｚｚｉら， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７８， ６０８７−６０９０， １９９６参照）。前記不活性化されたｌｙｓＲ遺伝子またはそのＤＮＡ断片は、ゲノムＤＮＡの切片内に外来ＤＮＡ切片を導入し、この配列の野生型染色体コピーを不活性化状態に置換させる。一具体例において、前記不活性化ポリヌクレオチド配列は、標的部位ＤＮＡの一部分を含む“テール（ｔａｉｌ）”を５'及び３'末端に含むことである。テールは、少なくとも５０塩基対からなり、望ましくは、効率的な再組合及び／または遺伝子転換のために、２００ないし５００塩基対でなければならない。前記不活性化ポリヌクレオチド配列には、便宜上選別マーカー、例えば、抗生剤耐性遺伝子を含みうる。標的ＤＮＡが抗生剤耐性遺伝子によって不活性化される場合、形質転換体の選別は、適切な抗生物質が含まれている寒天平板上で実施する。形質転換によって宿主細胞に導入された前記不活性化ポリヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡ中のテール配列との相同再組合によって野生型ゲノム配列を不活性化させることができる。不活性化再組合が起こったか否かは、例えばサザンブロット法によって容易に確認でき、さらに便利にはＰＣＴによって検証できる。
【００２０】
本発明の方法の一具体例において、本発明のＬ−トレオニンの生産用微生物を製造する方法は、次の過程を含む。まず、Ｌ−トレオニンを生産できる菌株からゲノムＤＮＡを分離し、これを鋳型として一般的な技術を利用した重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）によってｌｙｓＲ遺伝子を増幅する。次に、得られたｌｙｓＲ遺伝子を適したプラスミドまたはベクター内にクローニングし、形成された再組合ベクターを形質転換によって大腸菌のような宿主細胞内に導入する。形質転換体を培養して細胞を分離した後、これらからｌｙｓＲ遺伝子を持つ再組合ベクターを分離する。分離された再組合ベクター内のｌｙｓＲ遺伝子に抗生剤耐性遺伝子切片を挿入して、ｌｙｓＲ遺伝子が不活性化された再組合ベクターを製作する。前記のように製作された再組合ベクターを再び形質転換によって宿主細胞内に導入して培養する。得た形質転換体から増殖された再組合ベクターを分離し、適切な制限酵素の処理によって不活性化されたｌｙｓＲ遺伝子を含む遺伝子カセットを得る。前記遺伝子カセットを、Ｌ−トレオニンを生産できる菌株に電気せん孔法などの通常の技術によって導入させた後、抗生剤耐性を持つ菌株を選別することによって、ｌｙｓＲ遺伝子が不活性化された菌株を分離する。
【００２１】
当業者ならば、本発明の不活性化ポリヌクレオチド配列を一般的なクローニング法によって製造できるということが容易に分かる。前記製造法には、例えば、ｌｙｓＲ遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドプライマーを使用したＰＣＲ増幅法が含まれる。
【００２２】
本発明の一具体例において、本発明者らは、再組合プラスミドｐＧｅｍＴ／ｌｙｓＲ及びｐＧｅｍ／ｌｙｓＲ：：ｌｏｘｐＣＡＴを製作し、これから不活性化された遺伝子カセットΔｌｙｓＲ：：ｌｏｘｐＣＡＴを収得し、前記遺伝子カセットをＬ−メチオニン類似体に対する耐性を有し、メチオニン栄養要求性、Ｌ−トレオニン類似体に対する耐性、イソロイシン漏出型要求性、Ｌ−リシン類似体に対する耐性、ｐｃｋＡ、ｇａｌＲ、ｔｙｒＲ遺伝子が同時に不活性化された、大腸菌ＫＣＣＭ−１０５４１（ＦＴＲ２５３３）に電気せん孔法で流入させた。その結果、野生ｌｙｓＲ遺伝子が不活性化されて、各親株に比べて高濃度のＬ−トレオニンを生成する新菌株１種を開発した。この新菌株は、大腸菌ＦＴＲ４０１４と命名し、ブダペスト条約下の国際機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に２００４年１１月３０日に寄託した（受託番号ＫＣＣＭ−１０６３４）。
【００２３】
本発明の大腸菌ＦＴＲ４０１４は、親株である大腸菌ＫＣＣＭ １０５４１から誘導されたものであり、大腸菌ＫＣＣＭ １０５４１は、大腸菌１０２３６から誘導されたものである。また、大腸菌ＫＣＣＭ １０２３６は、大腸菌ＫＦＣＣ １０７１８（韓国特許公告第９２−８３６５号）から誘導された。Ｌ−トレオニン生産菌株である大腸菌ＫＦＣＣ １０７１８は、メチオニン要求性、トレオニン類似体（例、α−アミノ−β−ヒドロキシバレリアン酸、ＡＨＶ）に対する耐性、リシン類似体（例、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン、ＡＥＣ）に対する耐性、イソロイシン類似体（例、α−アミノ酪酸）に対する耐性、メチオニンの類似体（例、エチオニン）に対する耐性などの特性を有する。前記韓国特許の全体内容は、援用によって本明細書に含まれる。Ｌ−トレオニンを生産するに当たって、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）は、トレオニンの代謝経路の中間体であるオキサロ酢酸の前駆体である。ＫＣＣＭ １０２３６菌株は、Ｌ−トレオニンの生産菌株である前記大腸菌ＫＦＣＣ １０７１８の染色体から重合酵素連鎖反応を通じて得た、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ｐｐｃ遺伝子）とトレオニンオペロン（ｔｈｒ ｏｐｅｒｏｎ、ｔｈｒＡＢＣ）をさらに親株である大腸菌ＫＦＣＣ １０７１８の染色体に挿入させることによって、大腸菌ＫＦＣＣ １０７１８の染色体ＤＮＡ中にｐｐｃ遺伝子とトレオニンオペロンの数を２個に増加させた。したがって、ＫＣＣＭ １０２３６菌株は、ＰＥＰからトレオニン生合成の中間体であるオキサロ酢酸に転換させる酵素であるｐｐｃ遺伝子の発現量と、アスパラギン酸からトレオニンを合成する経路関連遺伝子（ｔｈｒＡ：ａｓｐａｒｔｏｋｉｎａｓｅ Ｉ−ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ｔｈｒＢ：ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ、ｔｈｒＣ：ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）の発現量とを増加させた。本発明の大腸菌ＦＴＲ４０１４は、親株ＫＣＣＭ−１０５４１から誘導されたものであって、ＫＣＣＭ−１０５４１菌株は、ＫＣＣＭ−１０２３６菌株の染色体内部に存在するｐｃｋＡ、ｇａｌＲ遺伝子を特異的に不活性化させることによって、細胞内のオキサロ酢酸の濃度を上げ、ブドウ糖流入速度を増加させて、Ｌ−トレオニンの生産量を向上させ、高速発酵が可能であることを特徴とする。また、染色体内部に存在するｔｙｒＲ遺伝子を特異的に不活性化させることによって、ｔｙｒＢ遺伝子の発現を増加させて、Ｌ−トレオニンの生産量を向上させることを特徴とする。
【００２４】
本発明はまた、本発明のＬ−トレオニンを生産でき、染色体上のｌｙｓＲ遺伝子が不活性化された微生物を培養し、その培養物からＬ−トレオニンを分離する段階を含むＬ−トレオニンを生産する方法を提供する。
【００２５】
本発明のＬ−トレオニンを生産する方法において、前記微生物の培養過程は、当業界に周知の適した培地及び培養条件によって行われうる。このような培養過程は、当業者ならば、選択される菌株によって容易に調整して使用できる。前記培養方法の例としては、回分式、連続式、及び流加式培養が含まれるが、これに限定されるものではない。
【００２６】
また、培養物からのＬ−トレオニンの分離は、当業界に知られた一般的な方法によって分離できる。このような分離方法には、遠心分離、ろ過、イオン交換クロマトグラフィー及び結晶化などの方法が利用できる。例えば、培養物を低速遠心分離してバイオマスを除去して得られた上澄液を、イオン交換クロマトグラフィーを通じて分離できるが、これらの例に限定されるものではない。
【発明の効果】
【００２７】
本発明のｌｙｓＲ遺伝子が不活性化された微生物は、Ｌ−トレオニンを微生物発酵によって生産する方法に利用されて、Ｌ−トレオニンを高収率で生産できる。
【００２８】
本発明のＬ−トレオニン生産方法によれば、Ｌ−トレオニンを高収率で生産できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下、本発明を実施例を通じてさらに詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３０】
実施例１：再組合プラスミド製作とこれを利用したｌｙｓＲ遺伝子の不活性化（ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）
本実施例では、大腸菌染色体内のｌｙｓＲ遺伝子を相同再組合によって不活性化した。このために、前記ｌｙｓＲ遺伝子の一部分を含むベクターを製造し、これを大腸菌宿主細胞に形質転換した後、ｌｙｓＲ遺伝子が不活性化された菌株を選別した。
【００３１】
まず、ゲノミック−チップシステム（Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ ｓｙｓｔｅｍ）（キアゲン社製）を利用して、野生型大腸菌Ｗ３１１０菌株からゲノムＤＮＡを分離した。このゲノムＤＮＡを鋳型とした重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を行って、ｌｙｓＲ及びｌｙｓＡ遺伝子のコーディング配列を含むＤＮＡ切片、約４ｋｂを得た。ｌｙｓＡ遺伝子のコーディング配列の一部をＰＣＲによって増幅させることによって、以後の再組合過程で再組合確率を高めるようにした。使われたプライマーとして配列番号１と配列番号２のオールオリゴヌクレオチドを使用し、変性段階は９４℃で３０秒、アニーリング段階は６０℃で３０秒、延長段階は７２℃で４分間実施し、これを３０回繰り返した。
【００３２】
その結果得られたＰＣＲ産物を０．８％のアガロースゲルで電気泳動した後、４０７８ｂｐサイズのバンドからＤＮＡを精製した。精製されたＤＮＡをｐＧｅｍＴクローニングベクター（プロメガ社製）のＴＡ部位に１６℃で一晩連結させた（図１）。その結果得られた再組合プラスミドｐＧｅｍＴ／ｌｙｓＲを大腸菌ＤＨ５αに形質転換させ、カルベニシリン（５０ｍｇ／Ｌ）が含む固体培地に塗抹して３７℃で一晩培養した。
【００３３】
コロニーを白金耳にて取り、カルベニシリンを含む液体ＬＢ培地３ｍＬに接種して一晩培養した後、ミニプレップキット（ＱＩＡＧＥＮ ｍｉｎｉ ｐｒｅｐ ｋｉｔ）（キアゲン社製）を利用して、プラスミドＤＮＡを分離した。プラスミドＤＮＡを制限酵素Ｈｐａ Ｉで処理した後、ｌｙｓＲ遺伝子のクローニングされたか否かを確認した。確認されたプラスミドｐＧｅｍＴ／ｌｙｓＲを制限酵素Ｈｐａ Ｉで処理した後、０．８％のアガロースゲルで約７．０ＫｂサイズのバンドからＤＮＡを精製した。また、プラスミドｐＬｏｘＣＡＴ２（Ｐａｌｍｅｒｏｓ，Ｂ．ｅｔ ａｌ、Ｇｅｎｅ ２４７（１−２），２５５−２６４，２０００）を制限酵素Ｈｉｎｃ ＩＩで処理して得た、ｌｏｘｐ部分を含むクロラムフェニコール耐性遺伝子切片（約１．５ｋｂ）を作った。次に、得られたプラスミドｐＧｅｍＴ／ｌｙｓＲのＨｐａ Ｉ切片とｐＬｏｘＣＡＴ２のＨｉｎｃ ＩＩ切片とを連結させて、再組合プラスミドｐＧｅｍＴΔｌｙｓＲ：：ｌｏｘｐＣＡＴ（約５．５ｋｂ）を得た（図２）。
【００３４】
このプラスミドＤＮＡを鋳型として使用して、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を行ってｌｙｓＲ遺伝子のＯＲＦ（Ｏｐｅｎ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ）とｌｏｘｐＣＡＴ部位とを含むＤＮＡ切片、約４．６ｋｂ（ΔｌｙｓＲ：：ｌｏｘｐＣＡＴ）を増幅した。使われたプライマーは、配列番号３と配列番号４のオリゴヌクレオチドであり、変性段階は９４℃で３０秒、アニーリング段階は６０℃で３０秒、延長段階は７２℃で４分間実施し、３０回繰り返した。
【００３５】
実施例２：大腸菌ＫＣＣＭ１０４５１のｌｙｓＲ遺伝子の不活性化及びＰＣＲを利用したｌｙｓＲ遺伝子の不活性化の確認
実施例１で製造されたＤＮＡ切片ΔｌｙｓＲ：：ｌｏｘｐＣＡＴを、トレオニン生産菌株ＫＣＣＭ−１０５４１（ＦＴＲ２５３３）に電気せん孔法で流入して、クロラムフェニコールが含まれた固体培地に塗抹して成長したコロニーを得ており、該当候補菌株のｌｙｓＲ遺伝子が特異的に再組合されたか否かを確認するために、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。親株であるＫＣＣＭ−１０５４１菌株と上で得られた候補菌株を３ｍｌの液体培地で一晩培養した後、ゲノムキット（ＱＩＡＧＥＮ ｇｅｎｏｍｉｃ ｋｉｔ ２０）を利用してゲノムＤＮＡを分離した。
【００３６】
該ゲノムＤＮＡを鋳型として使用して、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を通じてｌｙｓＲ遺伝子のＯＲＦまたはｌｙｓＲ遺伝子のＯＲＦとｌｏｘｐＣＡＴ部位とを含む、ＤＮＡ切片、約４ｋｂまたは５．５ｋｂを増幅した。使われたプライマーは、配列番号１及び配列番号２のオールオリゴヌクレオチドである。ＰＣＲは、変性段階は９４℃で３０秒、アニーリング段階は６０℃で３０秒、延長段階は７２℃で４分間実施し、３０回繰り返した。親株（ＫＣＣＭ−１０５４１）のゲノムＤＮＡを鋳型として使用して重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を行った場合、４ｋｂのＤＮＡ切片が合成され、候補菌株のゲノムＤＮＡを鋳型として使用して重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を行った場合、ｌｏｘｐＣＡＴ部位を含むＤＮＡ切片、５．５ｋｂが得られた。
【００３７】
このような過程を通じて、候補菌株のｌｙｓＲ遺伝子がｌｏｘｐＣＡＴ遺伝子により不活性化されたことを確認し、大腸菌ＦＴＲ４０１４と命名した。
【００３８】
実施例３：ｌｙｓＲ遺伝子不活性化菌株のトレオニン生産性確認
実施例２で得られた菌株ＦＴＲ４０１４を、表１に示すトレオニン力価培地を含有する三角フラスコで下記方法のように培養して、トレオニン生産性を比較した。
【００３９】
（表１）トレオニン力価培地
【００４０】
３２℃の培養器でＬＢ固体培地中に一晩培養したＦＴＲ４０１４を２５ｍｌの力価培地に１白金耳ずつ接種して、３２℃で２５０ｒｐｍで４８時間培養し、その分析結果を下記表２に示す。表２に示すように、Ｌ−トレオニン生産量は、親株であるＫＣＣＭ−１０５４１菌株は２３ｇ／Ｌである一方、ｌｙｓＲ遺伝子が破壊された再組合菌株ＦＴＲ４０１４は２５ｇ／Ｌに向上した結果を示す。この結果に基づいて、濃度が親株対比８．６％程度向上したことを観察した。
【００４１】
（表２）再組合菌株のフラスコ力価試験結果
【００４２】
本実施例の大腸菌ＦＴＲ４０１４菌株をブダペスト条約下の国際機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に２００４年１１月３０日に寄託した（受託番号ＫＣＣＭ−１０６３４）。
【００４３】
以上、本発明についてその望ましい実施形態を参照して説明したが、当業者は、本発明がその技術的思想や必須特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施できるということを理解できるであろう。なお、以上で記述した実施例は、例示的なものであり、限定的なものではないと考慮しなければならない。したがって、本発明の範囲は、前記詳細な説明よりは特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導き出される全ての変更または変形された形態が、本発明の範囲に含まれると解釈されなければならない。
【００４４】
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】ｌｙｓＲ遺伝子を含む再組合プラスミドｐＧｅｍＴ／ｌｙｓＲの作製図である。
【図２】再組合プラスミドｐＧｅｍＴ：ｌｙｓＲ：：ｌｏｘｐＣＡＴからＤＮＡ切片ΔｌｙｓＲ：：ｌｏｘｐＣＡＴを得る作製図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、染色体上のｌｙｓＲ遺伝子が不活性化された微生物、これを製造する方法、及び該微生物を利用したＬ−トレオニンを生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−トレオニンは、必須アミノ酸の一種であり、飼料及び食品添加剤として広く使われており、医薬用として輸液剤、医薬品の合成原料にも使われる。Ｌ−トレオニンは、発酵法で製造するが、一般的に、大腸菌、コリネ型細菌、セラチア属細菌及びプロビデンシア属菌株の野生株から誘導された人工変異株を使用している。例えば、日本特許公告第１００３７／８１号（特許文献１）には、エシェリキア属に属し、ジアミノピメリン酸及びメチオニンを要求し、その生合成系がトレオニンのフィードバック抑制作用を阻止する微生物を利用する方法が記述されている。日本特許公開第２２４６８４／８３号（特許文献２）には、ブレビバクテリウム属に属し、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン及びα−アミノ−β−ヒドロキシバレリアン酸に対する耐性を有し、Ｌ−イソロイシン及びＬ−リシン栄養要求性微生物を利用する方法が記述されている。大韓民国特許公開第８０２２／８７号（特許文献３）には、エシェリキア属に属し、ジアミノピメリン酸、メチオニン要求性、α−アミノ−β−ヒドロキシバレリアン酸耐性を有し、リファンピシン、リシン、メチオニン、アスパラギン酸、及びホモセリンのうち、少なくとも１つの物質に対する耐性を有するか、または低下したＬ−トレオニン分解能を持つ微生物を利用した方法が記述されている。日本特許公開第２１９５８２／９０号（特許文献４）には、プロビデンシア属に属し、α−アミノ−β−ヒドロキシバレリアン酸、Ｌ−エチオニン、チアイソロイシン、オキシチアミン、及びスルファグアニジン耐性を有し、Ｌ−ロイシン要求性、Ｌ−イソロイシン漏出（ｌｅａｋｙ）型要求性微生物を利用する方法が記述されている。
【０００３】
しかし、前記公知の方法は、Ｌ−トレオニン生産性が高くないか、またはジアミノピメリン酸要求性またはイソロイシン要求性のような高価の物質を添加しなければならないという短所がある。すなわち、ジアミノピメリン酸要求性菌株を使用する場合、ジアミノピメリン酸を副発酵しなければならないので、コスト負担の要因が大きく、イソロイシン要求性菌株を使用する場合にも、イソロイシンを発酵培地に添加する必要があるが、この場合、イソロイシンが高価であるため、コスト上昇の要因となる。
【０００４】
このような問題点を克服するために本発明者らは、イソロイシン漏出型要求性菌株を使用して、発酵培地内にイソロイシンを添加する必要がなく、リシン合成の中間媒体であるジアミノピメリン酸要求性菌株を使用せずとも、従来の菌株より発酵法によって高濃度のＬ−トレオニンを生成できる菌株として、Ｌ−メチオニン類似体に対する耐性を有し、メチオニン栄養要求性、Ｌ−トレオニン類似体に対する耐性、イソロイシン漏出型要求性、Ｌ−リシン類似体に対する耐性、及びα−アミノ酪酸耐性を有し、Ｌ−トレオニンを生産できるエシェリキアコリ（大腸菌）に属する微生物を開発し、この微生物及びこれを利用したＬ−トレオニンの製造方法を特許されている（韓国特許公告第９２−８３６５号（特許文献５））。
【０００５】
従来ｌｙｓＲ遺伝子によってコーディングされるＬｙｓＲ蛋白質は、細胞内のリシン濃度が高い場合に、ｌｙｓＣ及びｌｙｓＡ遺伝子の発現を抑制し、リシン濃度が低い場合に、ｌｙｓＣ及びｌｙｓＡ遺伝子の発現を増加させると知られている（Ｂｅａｃｈａｍ， Ｉ． Ｒ．， Ｄ． Ｈａｓｓ， ａｎｄ Ｅ． Ｙａｇｉｌ． １９７７． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １２９：１０３４−１０４４（非特許文献１））。ｌｙｓＣは、大腸菌Ｋ−１２でアスパラギン酸をアスパルチルリン酸に転換するリシン−敏感性アスパルトキナーゼＩＩＩ（ａｓｐａｒｔａｔｅｋｉｎａｓｅ ＩＩＩ）[ＥＣ：２．７．２．４]をコーディングすると知られている。
【０００６】
本発明者らは、前記のような従来技術に基づいて、Ｌ−トレオニンの生産能が向上した菌株を選別する研究を集中的に行っていた中、ｌｙｓＣ遺伝子の発現が増加すれば、クエン酸回路を通じて得られたオキサロ酢酸が、アスパラギン酸を経てリシン、トレオニン、及びメチオニンなどの中間代謝産物であるβ−アスパルチルリン酸に転換される比率が高くなって、トレオニン生産収率が増加すると予測し、前記ｌｙｓＲ遺伝子を不活性化させることにより、Ｌ−トレオニンの生合成が促進できるという事実を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
【特許文献１】日本特許公告第１００３７／８１号
【特許文献２】日本特許公開第２２４６８４／８３号
【特許文献３】大韓民国特許公開第８０２２／８７号
【特許文献４】日本特許公開第２１９５８２／９０号
【特許文献５】韓国特許公告第９２−８３６５号
【非特許文献１】Ｂｅａｃｈａｍ， Ｉ． Ｒ．， Ｄ． Ｈａｓｓ， ａｎｄ Ｅ． Ｙａｇｉｌ． １９７７． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １２９：１０３４−１０４４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、Ｌ−トレオニンの生合成能が向上した微生物菌株を提供することである。
【０００９】
本発明の他の目的は、前記微生物を製造する方法を提供することである。
【００１０】
本発明のさらに他の目的は、前記微生物を利用してＬ−トレオニンを効率的に生産できる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、Ｌ−トレオニンを生産できる微生物として、染色体上のｌｙｓＲ遺伝子が不活性化された微生物を提供する。
【００１２】
本発明において、前記微生物は、Ｌ−トレオニンを生産でき、染色体上のｌｙｓＲ遺伝子が不活性化された微生物であれば、原核微生物及び真核微生物のいずれも含まれる。例えば、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、及びブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物菌株が含まれうる。望ましくは、腸内細菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）科に属する微生物であり、さらに望ましくは、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する微生物である。最も望ましくは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＦＴＲ４０１４（ＫＣＣＭ−１０６３４）である。
【００１３】
また、ｌｙｓＲ遺伝子が不活性化される微生物には、天然微生物だけでなく、Ｌ−トレオニン生産用変移微生物も含みうる。このような変移微生物の例には、Ｌ−メチオニン類似体に対する耐性を有し、メチオニン栄養要求性、Ｌ−トレオニン類似体に対する耐性、イソロイシン漏出型要求性、Ｌ−リシン類似体に対する耐性、及びα−アミノ酪酸耐性を有し、Ｌ−トレオニンを生産できる大腸菌に属する微生物；内在的ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）遺伝子とトレオニンオペロンに含まれている遺伝子の他に、追加で１コピー以上のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）遺伝子とトレオニンオペロンに含まれている遺伝子ｔｈｒＡ、ｔｈｒＢ及びｔｈｒＣが染色体ＤＮＡ中に挿入された変異微生物が含まれる。前記Ｌ−メチオニン類似体は、例えば、Ｄ，Ｌ−エチオニン、ノルロイシン、α−メチルメチオニン、及びＬ−メチオニン−Ｄ，Ｌ−スルホキシミンから選択される一つ以上の化合物でありうる。また、前記Ｌ−トレオニン類似体は、例えば、α−アミノ−β−ヒドロキシバレリアン酸及びＤ，Ｌ−トレオニンヒドロキサメートからなる群から選択される一つ以上の化合物でありうる。また、Ｌ−リシン類似体は、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン及びδ−メチル−Ｌ−リシンからなる群から選択される一つ以上の化合物でありうる。さらに他の変移微生物の例には、Ｌ−トレオニン生合成中間体であるオキサロ酢酸（ＯＡＡ）をポスホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）に転換するのに関与するｐｃｋＡ遺伝子が不活性化された微生物、またはオキサロ酢酸アスパラギン酸に転換するｌｙｓＣ遺伝子を抑制するｔｙｒＲ遺伝子が不活性化された微生物、または ブドウ糖流入に関与するｇａｌＰ遺伝子の発現を抑制するｇａｌＲ遺伝子が不活性化された微生物が含まれうる。
【００１４】
本発明において、前記ｌｙｓＲ遺伝子は、アスパルトキナーゼ活性をコーディングするｌｙｓＣを転写レベルで調節する蛋白質をコーディングする。大腸菌において、前記ｌｙｓＲ遺伝子は、公知されており、Ｂｌａｔｔｎｅｒら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：１４５３−１４６２（１９９７））によって公開された大腸菌のゲノム配列からも得られる（例、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ：ＥＧ１０５５１）。前記遺伝子配列は、米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）及び日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）などのデータベースから得られる。また、本発明のｌｙｓＲ遺伝子には、遺伝コードの縮退または機能的に中性である突然変異によって発生する対立遺伝子も含む。本発明において、“不活性化”とは、活性のあるｌｙｓＲ産物が発現されないようになっていることを意味する。不活性化の例としては、ｌｙｓＲ遺伝子自体のの置換、欠失及び逆位などによる不活性化だけでなく、ｌｓｙＲ遺伝子の発現調節領域での突然変異によって、ｌｙｓＲが発現されないことも含まれる。ｌｙｓＲが不活性化されれば、ｌｙｓＣ遺伝子の発現は増加する。
【００１５】
本発明において、不活性化されるｌｙｓＲ遺伝子の例は、大腸菌K−１２のｌｙｓＲ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．Ｅｇ１０５５１）、大腸菌Ｗ３１１０のｌｙｓＲ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．１０５５１）及び大腸菌ＫＣＣＭ−１０５４１のｌｙｓＲ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．１０５５１）が含まれるが、これらの例に限定されるものではない。
【００１６】
本発明の微生物は、Ｌ−トレオニンを生産できる微生物の染色体に存在するｌｙｓＲ遺伝子を不活性化させることで製造できる。このような不活性化方法には、紫外線のような光または化学物質を利用して突然変異を誘発し、得られた突然変異体からｌｙｓＲ遺伝子が不活性化された菌株を選別できる。また、前記不活性化方法にはＤ、ＮＡ再組合技術による方法が含まれる。前記ＤＮＡ再組合技術は、例えば、前記ｌｙｓＲ遺伝子と相同性のあるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列またはベクターを前記微生物に注入して、相同再組合を発生させることで行われうる。また、前記注入されるヌクレオチド配列またはベクターには、優性選別マーカーを含むことができる。
【００１７】
本発明はまた、不活性化されたｌｙｓＲ遺伝子またはそのＤＮＡ断片を製造し、Ｌ−トレオニンを生産できる微生物に導入させて、前記微生物の染色体上に存在するｌｙｓＲ遺伝子と再組合させ、ｌｙｓＲ遺伝子が不活性化された微生物を選別することを特徴とするＬ−トレオニンの生産用微生物を製造する方法を提供する。
【００１８】
本発明の方法において、前記不活性化されたｌｙｓＲ遺伝子またはそのＤＮＡ断片とは、宿主内のｌｙｓＲ遺伝子と配列相同性を有するポリヌクレオチド配列を含むが、欠失、置換、切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）及び逆位のような突然変異が導入されて、活性のがあるｌｙｓＲ産物を発現できないポリヌクレオチド配列を意味する。前記不活性化されたｌｙｓＲ遺伝子またはその断片を宿主細胞内に導入する過程は、例えば、形質転換、接合、形質導入または電気せん孔によって行われうるが、これらの例に限定されるものではない。
【００１９】
前記不活性化されたｌｙｓＲ遺伝子またはそのＤＮＡ断片が、形質転換によって宿主細胞内に導入される場合、不活性化の手順は、前記ポリヌクレオチド配列を菌株の培養物と混合して行われうる。この場合、菌株は、天然的にＤＮＡ流入に対して コンピテントに形質転換できるが、予め菌株を適切な方法によってＤＮＡ流入のためにコンピテントにすることが望ましい（ＬｅＢｌａｎｃら， Ｐｌａｓｍｉｄ ２８， １３０−１４５， １９９２；Ｐｏｚｚｉら， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７８， ６０８７−６０９０， １９９６参照）。前記不活性化されたｌｙｓＲ遺伝子またはそのＤＮＡ断片は、ゲノムＤＮＡの切片内に外来ＤＮＡ切片を導入し、この配列の野生型染色体コピーを不活性化状態に置換させる。一具体例において、前記不活性化ポリヌクレオチド配列は、標的部位ＤＮＡの一部分を含む“テール（ｔａｉｌ）”を５'及び３'末端に含むことである。テールは、少なくとも５０塩基対からなり、望ましくは、効率的な再組合及び／または遺伝子転換のために、２００ないし５００塩基対でなければならない。前記不活性化ポリヌクレオチド配列には、便宜上選別マーカー、例えば、抗生剤耐性遺伝子を含みうる。標的ＤＮＡが抗生剤耐性遺伝子によって不活性化される場合、形質転換体の選別は、適切な抗生物質が含まれている寒天平板上で実施する。形質転換によって宿主細胞に導入された前記不活性化ポリヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡ中のテール配列との相同再組合によって野生型ゲノム配列を不活性化させることができる。不活性化再組合が起こったか否かは、例えばサザンブロット法によって容易に確認でき、さらに便利にはＰＣＴによって検証できる。
【００２０】
本発明の方法の一具体例において、本発明のＬ−トレオニンの生産用微生物を製造する方法は、次の過程を含む。まず、Ｌ−トレオニンを生産できる菌株からゲノムＤＮＡを分離し、これを鋳型として一般的な技術を利用した重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）によってｌｙｓＲ遺伝子を増幅する。次に、得られたｌｙｓＲ遺伝子を適したプラスミドまたはベクター内にクローニングし、形成された再組合ベクターを形質転換によって大腸菌のような宿主細胞内に導入する。形質転換体を培養して細胞を分離した後、これらからｌｙｓＲ遺伝子を持つ再組合ベクターを分離する。分離された再組合ベクター内のｌｙｓＲ遺伝子に抗生剤耐性遺伝子切片を挿入して、ｌｙｓＲ遺伝子が不活性化された再組合ベクターを製作する。前記のように製作された再組合ベクターを再び形質転換によって宿主細胞内に導入して培養する。得た形質転換体から増殖された再組合ベクターを分離し、適切な制限酵素の処理によって不活性化されたｌｙｓＲ遺伝子を含む遺伝子カセットを得る。前記遺伝子カセットを、Ｌ−トレオニンを生産できる菌株に電気せん孔法などの通常の技術によって導入させた後、抗生剤耐性を持つ菌株を選別することによって、ｌｙｓＲ遺伝子が不活性化された菌株を分離する。
【００２１】
当業者ならば、本発明の不活性化ポリヌクレオチド配列を一般的なクローニング法によって製造できるということが容易に分かる。前記製造法には、例えば、ｌｙｓＲ遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドプライマーを使用したＰＣＲ増幅法が含まれる。
【００２２】
本発明の一具体例において、本発明者らは、再組合プラスミドｐＧｅｍＴ／ｌｙｓＲ及びｐＧｅｍ／ｌｙｓＲ：：ｌｏｘｐＣＡＴを製作し、これから不活性化された遺伝子カセットΔｌｙｓＲ：：ｌｏｘｐＣＡＴを収得し、前記遺伝子カセットをＬ−メチオニン類似体に対する耐性を有し、メチオニン栄養要求性、Ｌ−トレオニン類似体に対する耐性、イソロイシン漏出型要求性、Ｌ−リシン類似体に対する耐性、ｐｃｋＡ、ｇａｌＲ、ｔｙｒＲ遺伝子が同時に不活性化された、大腸菌ＫＣＣＭ−１０５４１（ＦＴＲ２５３３）に電気せん孔法で流入させた。その結果、野生ｌｙｓＲ遺伝子が不活性化されて、各親株に比べて高濃度のＬ−トレオニンを生成する新菌株１種を開発した。この新菌株は、大腸菌ＦＴＲ４０１４と命名し、ブダペスト条約下の国際機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に２００４年１１月３０日に寄託した（受託番号ＫＣＣＭ−１０６３４）。
【００２３】
本発明の大腸菌ＦＴＲ４０１４は、親株である大腸菌ＫＣＣＭ １０５４１から誘導されたものであり、大腸菌ＫＣＣＭ １０５４１は、大腸菌１０２３６から誘導されたものである。また、大腸菌ＫＣＣＭ １０２３６は、大腸菌ＫＦＣＣ １０７１８（韓国特許公告第９２−８３６５号）から誘導された。Ｌ−トレオニン生産菌株である大腸菌ＫＦＣＣ １０７１８は、メチオニン要求性、トレオニン類似体（例、α−アミノ−β−ヒドロキシバレリアン酸、ＡＨＶ）に対する耐性、リシン類似体（例、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン、ＡＥＣ）に対する耐性、イソロイシン類似体（例、α−アミノ酪酸）に対する耐性、メチオニンの類似体（例、エチオニン）に対する耐性などの特性を有する。前記韓国特許の全体内容は、援用によって本明細書に含まれる。Ｌ−トレオニンを生産するに当たって、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）は、トレオニンの代謝経路の中間体であるオキサロ酢酸の前駆体である。ＫＣＣＭ １０２３６菌株は、Ｌ−トレオニンの生産菌株である前記大腸菌ＫＦＣＣ １０７１８の染色体から重合酵素連鎖反応を通じて得た、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ｐｐｃ遺伝子）とトレオニンオペロン（ｔｈｒ ｏｐｅｒｏｎ、ｔｈｒＡＢＣ）をさらに親株である大腸菌ＫＦＣＣ １０７１８の染色体に挿入させることによって、大腸菌ＫＦＣＣ １０７１８の染色体ＤＮＡ中にｐｐｃ遺伝子とトレオニンオペロンの数を２個に増加させた。したがって、ＫＣＣＭ １０２３６菌株は、ＰＥＰからトレオニン生合成の中間体であるオキサロ酢酸に転換させる酵素であるｐｐｃ遺伝子の発現量と、アスパラギン酸からトレオニンを合成する経路関連遺伝子（ｔｈｒＡ：ａｓｐａｒｔｏｋｉｎａｓｅ Ｉ−ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ｔｈｒＢ：ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ、ｔｈｒＣ：ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）の発現量とを増加させた。本発明の大腸菌ＦＴＲ４０１４は、親株ＫＣＣＭ−１０５４１から誘導されたものであって、ＫＣＣＭ−１０５４１菌株は、ＫＣＣＭ−１０２３６菌株の染色体内部に存在するｐｃｋＡ、ｇａｌＲ遺伝子を特異的に不活性化させることによって、細胞内のオキサロ酢酸の濃度を上げ、ブドウ糖流入速度を増加させて、Ｌ−トレオニンの生産量を向上させ、高速発酵が可能であることを特徴とする。また、染色体内部に存在するｔｙｒＲ遺伝子を特異的に不活性化させることによって、ｔｙｒＢ遺伝子の発現を増加させて、Ｌ−トレオニンの生産量を向上させることを特徴とする。
【００２４】
本発明はまた、本発明のＬ−トレオニンを生産でき、染色体上のｌｙｓＲ遺伝子が不活性化された微生物を培養し、その培養物からＬ−トレオニンを分離する段階を含むＬ−トレオニンを生産する方法を提供する。
【００２５】
本発明のＬ−トレオニンを生産する方法において、前記微生物の培養過程は、当業界に周知の適した培地及び培養条件によって行われうる。このような培養過程は、当業者ならば、選択される菌株によって容易に調整して使用できる。前記培養方法の例としては、回分式、連続式、及び流加式培養が含まれるが、これに限定されるものではない。
【００２６】
また、培養物からのＬ−トレオニンの分離は、当業界に知られた一般的な方法によって分離できる。このような分離方法には、遠心分離、ろ過、イオン交換クロマトグラフィー及び結晶化などの方法が利用できる。例えば、培養物を低速遠心分離してバイオマスを除去して得られた上澄液を、イオン交換クロマトグラフィーを通じて分離できるが、これらの例に限定されるものではない。
【発明の効果】
【００２７】
本発明のｌｙｓＲ遺伝子が不活性化された微生物は、Ｌ−トレオニンを微生物発酵によって生産する方法に利用されて、Ｌ−トレオニンを高収率で生産できる。
【００２８】
本発明のＬ−トレオニン生産方法によれば、Ｌ−トレオニンを高収率で生産できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下、本発明を実施例を通じてさらに詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３０】
実施例１：再組合プラスミド製作とこれを利用したｌｙｓＲ遺伝子の不活性化（ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）
本実施例では、大腸菌染色体内のｌｙｓＲ遺伝子を相同再組合によって不活性化した。このために、前記ｌｙｓＲ遺伝子の一部分を含むベクターを製造し、これを大腸菌宿主細胞に形質転換した後、ｌｙｓＲ遺伝子が不活性化された菌株を選別した。
【００３１】
まず、ゲノミック−チップシステム（Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ ｓｙｓｔｅｍ）（キアゲン社製）を利用して、野生型大腸菌Ｗ３１１０菌株からゲノムＤＮＡを分離した。このゲノムＤＮＡを鋳型とした重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を行って、ｌｙｓＲ及びｌｙｓＡ遺伝子のコーディング配列を含むＤＮＡ切片、約４ｋｂを得た。ｌｙｓＡ遺伝子のコーディング配列の一部をＰＣＲによって増幅させることによって、以後の再組合過程で再組合確率を高めるようにした。使われたプライマーとして配列番号１と配列番号２のオールオリゴヌクレオチドを使用し、変性段階は９４℃で３０秒、アニーリング段階は６０℃で３０秒、延長段階は７２℃で４分間実施し、これを３０回繰り返した。
【００３２】
その結果得られたＰＣＲ産物を０．８％のアガロースゲルで電気泳動した後、４０７８ｂｐサイズのバンドからＤＮＡを精製した。精製されたＤＮＡをｐＧｅｍＴクローニングベクター（プロメガ社製）のＴＡ部位に１６℃で一晩連結させた（図１）。その結果得られた再組合プラスミドｐＧｅｍＴ／ｌｙｓＲを大腸菌ＤＨ５αに形質転換させ、カルベニシリン（５０ｍｇ／Ｌ）が含む固体培地に塗抹して３７℃で一晩培養した。
【００３３】
コロニーを白金耳にて取り、カルベニシリンを含む液体ＬＢ培地３ｍＬに接種して一晩培養した後、ミニプレップキット（ＱＩＡＧＥＮ ｍｉｎｉ ｐｒｅｐ ｋｉｔ）（キアゲン社製）を利用して、プラスミドＤＮＡを分離した。プラスミドＤＮＡを制限酵素Ｈｐａ Ｉで処理した後、ｌｙｓＲ遺伝子のクローニングされたか否かを確認した。確認されたプラスミドｐＧｅｍＴ／ｌｙｓＲを制限酵素Ｈｐａ Ｉで処理した後、０．８％のアガロースゲルで約７．０ＫｂサイズのバンドからＤＮＡを精製した。また、プラスミドｐＬｏｘＣＡＴ２（Ｐａｌｍｅｒｏｓ，Ｂ．ｅｔ ａｌ、Ｇｅｎｅ ２４７（１−２），２５５−２６４，２０００）を制限酵素Ｈｉｎｃ ＩＩで処理して得た、ｌｏｘｐ部分を含むクロラムフェニコール耐性遺伝子切片（約１．５ｋｂ）を作った。次に、得られたプラスミドｐＧｅｍＴ／ｌｙｓＲのＨｐａ Ｉ切片とｐＬｏｘＣＡＴ２のＨｉｎｃ ＩＩ切片とを連結させて、再組合プラスミドｐＧｅｍＴΔｌｙｓＲ：：ｌｏｘｐＣＡＴ（約５．５ｋｂ）を得た（図２）。
【００３４】
このプラスミドＤＮＡを鋳型として使用して、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を行ってｌｙｓＲ遺伝子のＯＲＦ（Ｏｐｅｎ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ）とｌｏｘｐＣＡＴ部位とを含むＤＮＡ切片、約４．６ｋｂ（ΔｌｙｓＲ：：ｌｏｘｐＣＡＴ）を増幅した。使われたプライマーは、配列番号３と配列番号４のオリゴヌクレオチドであり、変性段階は９４℃で３０秒、アニーリング段階は６０℃で３０秒、延長段階は７２℃で４分間実施し、３０回繰り返した。
【００３５】
実施例２：大腸菌ＫＣＣＭ１０４５１のｌｙｓＲ遺伝子の不活性化及びＰＣＲを利用したｌｙｓＲ遺伝子の不活性化の確認
実施例１で製造されたＤＮＡ切片ΔｌｙｓＲ：：ｌｏｘｐＣＡＴを、トレオニン生産菌株ＫＣＣＭ−１０５４１（ＦＴＲ２５３３）に電気せん孔法で流入して、クロラムフェニコールが含まれた固体培地に塗抹して成長したコロニーを得ており、該当候補菌株のｌｙｓＲ遺伝子が特異的に再組合されたか否かを確認するために、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。親株であるＫＣＣＭ−１０５４１菌株と上で得られた候補菌株を３ｍｌの液体培地で一晩培養した後、ゲノムキット（ＱＩＡＧＥＮ ｇｅｎｏｍｉｃ ｋｉｔ ２０）を利用してゲノムＤＮＡを分離した。
【００３６】
該ゲノムＤＮＡを鋳型として使用して、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を通じてｌｙｓＲ遺伝子のＯＲＦまたはｌｙｓＲ遺伝子のＯＲＦとｌｏｘｐＣＡＴ部位とを含む、ＤＮＡ切片、約４ｋｂまたは５．５ｋｂを増幅した。使われたプライマーは、配列番号１及び配列番号２のオールオリゴヌクレオチドである。ＰＣＲは、変性段階は９４℃で３０秒、アニーリング段階は６０℃で３０秒、延長段階は７２℃で４分間実施し、３０回繰り返した。親株（ＫＣＣＭ−１０５４１）のゲノムＤＮＡを鋳型として使用して重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を行った場合、４ｋｂのＤＮＡ切片が合成され、候補菌株のゲノムＤＮＡを鋳型として使用して重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を行った場合、ｌｏｘｐＣＡＴ部位を含むＤＮＡ切片、５．５ｋｂが得られた。
【００３７】
このような過程を通じて、候補菌株のｌｙｓＲ遺伝子がｌｏｘｐＣＡＴ遺伝子により不活性化されたことを確認し、大腸菌ＦＴＲ４０１４と命名した。
【００３８】
実施例３：ｌｙｓＲ遺伝子不活性化菌株のトレオニン生産性確認
実施例２で得られた菌株ＦＴＲ４０１４を、表１に示すトレオニン力価培地を含有する三角フラスコで下記方法のように培養して、トレオニン生産性を比較した。
【００３９】
（表１）トレオニン力価培地
【００４０】
３２℃の培養器でＬＢ固体培地中に一晩培養したＦＴＲ４０１４を２５ｍｌの力価培地に１白金耳ずつ接種して、３２℃で２５０ｒｐｍで４８時間培養し、その分析結果を下記表２に示す。表２に示すように、Ｌ−トレオニン生産量は、親株であるＫＣＣＭ−１０５４１菌株は２３ｇ／Ｌである一方、ｌｙｓＲ遺伝子が破壊された再組合菌株ＦＴＲ４０１４は２５ｇ／Ｌに向上した結果を示す。この結果に基づいて、濃度が親株対比８．６％程度向上したことを観察した。
【００４１】
（表２）再組合菌株のフラスコ力価試験結果
【００４２】
本実施例の大腸菌ＦＴＲ４０１４菌株をブダペスト条約下の国際機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に２００４年１１月３０日に寄託した（受託番号ＫＣＣＭ−１０６３４）。
【００４３】
以上、本発明についてその望ましい実施形態を参照して説明したが、当業者は、本発明がその技術的思想や必須特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施できるということを理解できるであろう。なお、以上で記述した実施例は、例示的なものであり、限定的なものではないと考慮しなければならない。したがって、本発明の範囲は、前記詳細な説明よりは特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導き出される全ての変更または変形された形態が、本発明の範囲に含まれると解釈されなければならない。
【００４４】
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】ｌｙｓＲ遺伝子を含む再組合プラスミドｐＧｅｍＴ／ｌｙｓＲの作製図である。
【図２】再組合プラスミドｐＧｅｍＴ：ｌｙｓＲ：：ｌｏｘｐＣＡＴからＤＮＡ切片ΔｌｙｓＲ：：ｌｏｘｐＣＡＴを得る作製図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｌｙｓＲ遺伝子が不活性化された染色体を有し、Ｌ−トレオニンを生産する特性を有する大腸菌菌株。
【請求項２】
メチオニン要求性、トレオニン類似体に対する耐性、リシン類似体に対する耐性、イソロイシン類似体に対する耐性、及びメチオニン類似体に対する耐性特性を有する請求項１に記載の大腸菌菌株。
【請求項３】
大腸菌ＦＴＲ４０１４（受託番号ＫＣＣＭ−１０６３４）であることを特徴とする請求項１に記載の菌株。
【請求項４】
不活性化されたｌｙｓＲ遺伝子またはそのＤＮＡ断片を製造し、Ｌ−トレオニンを生産できる微生物に導入させて、前記微生物の染色体上に存在するｌｙｓＲ遺伝子と再組合させ、ｌｙｓＲ遺伝子が不活性化された微生物を選別することを特徴とするＬ−トレオニンの生産用微生物を製造する方法。
【請求項５】
前記不活性化されたｌｙｓＲ遺伝子またはそのＤＮＡ切片が、抗生剤マーカー（ｌｏｘｐＣＡＴ）を含むカセットをｌｙｓＲ遺伝子内部に挿入して製造されたものであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物を培養し、その培養物からＬ−トレオニンを分離することを特徴とするＬ−トレオニンを生産する方法。
【請求項１】
ｌｙｓＲ遺伝子が不活性化された染色体を有し、Ｌ−トレオニンを生産する特性を有する大腸菌菌株。
【請求項２】
メチオニン要求性、トレオニン類似体に対する耐性、リシン類似体に対する耐性、イソロイシン類似体に対する耐性、及びメチオニン類似体に対する耐性特性を有する請求項１に記載の大腸菌菌株。
【請求項３】
大腸菌ＦＴＲ４０１４（受託番号ＫＣＣＭ−１０６３４）であることを特徴とする請求項１に記載の菌株。
【請求項４】
不活性化されたｌｙｓＲ遺伝子またはそのＤＮＡ断片を製造し、Ｌ−トレオニンを生産できる微生物に導入させて、前記微生物の染色体上に存在するｌｙｓＲ遺伝子と再組合させ、ｌｙｓＲ遺伝子が不活性化された微生物を選別することを特徴とするＬ−トレオニンの生産用微生物を製造する方法。
【請求項５】
前記不活性化されたｌｙｓＲ遺伝子またはそのＤＮＡ切片が、抗生剤マーカー（ｌｏｘｐＣＡＴ）を含むカセットをｌｙｓＲ遺伝子内部に挿入して製造されたものであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物を培養し、その培養物からＬ−トレオニンを分離することを特徴とするＬ−トレオニンを生産する方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００８−５２２６１１（Ｐ２００８−５２２６１１Ａ）
【公表日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４５３６７（Ｐ２００７−５４５３６７）
【出願日】平成１７年１２月６日（２００５．１２．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００５／００４１４２
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０６２３２７
【国際公開日】平成１８年６月１５日（２００６．６．１５）
【出願人】（５００４３７３７１）シージェイ コーポレーション (2)
【氏名又は名称原語表記】ＣＪ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月６日（２００５．１２．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００５／００４１４２
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０６２３２７
【国際公開日】平成１８年６月１５日（２００６．６．１５）
【出願人】（５００４３７３７１）シージェイ コーポレーション (2)
【氏名又は名称原語表記】ＣＪ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【Ｆターム（参考）】
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