染色体標本の製造方法および製造装置
【目的】染色体を明瞭に識別することのできる標本を、再現性よく得る。
【構成】低張処理された細胞を、酸とアルコールとの混合溶液中に懸濁させた細胞懸濁液を、細胞拡散チャンバ１１１内にセットされた基板にピペット１１３から滴下して、基板上で細胞を拡散させたのち、細胞膜破壊チャンバ１１２内で、噴霧ノズル１１７から該基板に酸および水を噴霧して、基板上の細胞に酸および水を作用させ、細胞膜を破壊して、内部の染色体を遊離させる。
【構成】低張処理された細胞を、酸とアルコールとの混合溶液中に懸濁させた細胞懸濁液を、細胞拡散チャンバ１１１内にセットされた基板にピペット１１３から滴下して、基板上で細胞を拡散させたのち、細胞膜破壊チャンバ１１２内で、噴霧ノズル１１７から該基板に酸および水を噴霧して、基板上の細胞に酸および水を作用させ、細胞膜を破壊して、内部の染色体を遊離させる。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、染色体検査の標本作成方法および標本作成装置に係り、特に、一つの細胞に含まれる染色体を、基板上で観察や検査に適した分布、広がりを持つように分散させることのできる染色体標本の製造方法および該方法に用いる染色体標本の製造装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】生体の組織、器官はそれぞれ特異的な機能を持つ細胞よりなり、これらの機能の発現をコントロールしているのが細胞内に存在するＤＮＡである。従って、ＤＮＡに異常が生じると、生体は正常な働きをしなくなり、病気等となって現れることが多い。このＤＮＡの異常には、遺伝子自身の異常（核酸配列の異常）や、遺伝子コピーの数的な異常、さらには、ＤＮＡ中での遺伝子の位置異常等があると考えられている。
【０００３】例えば、鎌状赤血球症は遺伝子自身の塩基配列の異常によるものであると考えられており、ダウン症は遺伝子の数的な異常によるものであと考えられている。また、遺伝子の位置異常による疾病には、染色体の転座に伴う各種の異常、たとえば慢性骨髄性白血病等が挙げられる。このように、近年、多くの疾患と、遺伝子異常との関係が明らかにされてきている。
【０００４】このような遺伝子の異常の診断は、遺伝子自身の異常に対しては直接的に塩基配列を同定したり、プローブＤＮＡとのハイブリダイゼーションの有無を検出したり、塩基配列の異常に伴うＤＮＡフラグメントのコンフォメーションの違いを検出したりして行なわれる。
【０００５】しかし、これらの方法では数的異常や位置の異常を検出するのは難しいので、これらの異常の検出についてはＤＮＡを染色体の形にして検出している。すなわち、細胞分裂中期にある細胞の染色体をスライドガラス上に広げて固定した標本を作り、適当な染色処理等を経て観察し、検出している。これらの検出は出生前診断、癌の進行度の把握・予後の予測、放射線の染色体への影響の調査、食品の安全性試験等に用いられている。
【０００６】一方最近の分子生物学の進展にはめざましいものがあるが、その研究対象が染色体に大きくかかわりあって来ているものがあり、その一つの領域として特定遺伝子がどの染色体のどの位置に存在するのを調べる遺伝子マッピングがある。ここでも細胞分裂中期にある細胞の染色体をスライドガラス上に広げて固定した標本を作り、適当な染色処理等を経て観察している。
【０００７】このように検診目的にも、また、研究目的にも、染色体は用いられており、それぞれの目的に合った染色体の標本が作成されている。ここで、まず従来どのようにしてこの染色体標本が作成されて検査なり研究に供されているかを述べる。なお、以下で述べる内容は対象細胞として末梢血細胞を用いているが基本的には前記の他の細胞でも同じである。
【０００８】採取した末梢血細胞のうち細胞分裂刺激剤（例えばPhytohaemagglutinin、以下、PHAと略す）により分裂が特に促進されるＴ−細胞を含むリンパ球を分離したり、または採取した全血をそのまま適当な緩衝液、例えばハンクス液にて洗浄した後、適当な培地に加えて培養する。培地としては、例えばRMPI 1640（商品名：RPMI MEDIUM 1640,IRVINE SCIENTIFIC社製より調製）にウシ胎児血清とPHAを添加した培地を用いることが知られている。
【０００９】細胞回収の数時間前に、培地に細胞分裂阻止剤であるコルセミドを加えて培養し、適度に細胞分裂の中期細胞を含んだ培養液を得る。培養後、培養細胞を分離し、ついで細胞が適度に膨張し標本として適度に個々の染色体が広がり、かつ染色体が観察され易くなるように、０．０７５ＭのＫＣｌ溶液を用いて低張処理を行う。
【００１０】つぎに、低張処理された細胞を固定液、例えばメタノールと酢酸を３：１の割合にて混合したカルノア液にて固定処理を行う。なお、本明細書では、「カルノア液」という用語を、メタノールと酢酸との３：１（体積比）混合液を意味するものとして用いる。また、特にことわらない限り、「酢酸」とは「氷酢酸」を意味する。
【００１１】最後に、細胞をこのカルノア液にて数度洗浄処理をした後、適量の、例えば０．０１〜０．０１５ｍｌの細胞懸濁液をスライドガラス上に滴下する。滴下後スライドガラス上に適度に広がった液が蒸発していく時に、観察に適した標本、すなわち一つの細胞の個々の染色体が適度な間隔を持って分布しており、互いに重なっていない標本が得られる。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】上記のような標本作成法は確かに場合によっては良好な標本を得ることができるが、この方法により良好な標本を得るためには、かなりの熟練を要する。また、熟練をもってしても時には良好ならざる標本となることがあり、再現性よく良好な標本を得ることは非常に困難であった。
【００１３】すなわち、この従来の方法を用いた場合、一つの細胞に含まれる個々の染色体が、基板であるスライドガラス上適当にで広がらずに重なりを生じたり、逆に広がりすぎて隣どうしの細胞との間で染色体が混じり合ってもともとの所属が不明になったり、さらに標本の中央部と周辺部の染色体の状態、例えば一つの細胞からの染色体の広がり方といったものに差異を生じたりする事が多かった。従って、従来の方法を用いて標本を作成する場合、精度の高い測定が出来なかったり、測定に時間がかかるといった不具合を生じていた。
【００１４】そこで、本発明は、このような不都合の無い、染色体を明瞭に識別できる標本を、再現性よく得ることを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】本発明の発明者は、この問題を検討した結果カルノア液の細胞は酸と水との混合液にさらされると細胞膜が破壊されてそれにより細胞の個々の染色体が遊離するという現象を発見し、この新たな知見に基づいて、本発明をなすに至った。
【００１６】本発明では、細胞を低張処理する低張工程と、低張処理された細胞を、酸とアルコールとの混合溶液中に懸濁させ、細胞懸濁液を得る固定工程と、細胞懸濁液を基板上に滴下し、基板上で細胞を拡散させる拡散工程と、基板上の細胞懸濁液中の細胞に、水と酸とを作用させる細胞膜破壊工程とを、この順で有する染色体標本の製造方法が提供される。
【００１７】ここで、細胞膜破壊工程は、拡散工程において上記基板上に滴下された細胞懸濁液が流動していない状態で行われることが望ましい。細胞懸濁液が流動していると、細胞膜を破壊したのちに、細胞の内容物が流動して過度に拡散してしまうことがあるからである。
【００１８】また、細胞膜破壊工程において細胞に酸と水とを作用させることは、基板上の細胞懸濁液に水と酸との混合液を添加することにより行われてもよく、酸と水とをそれぞれ別に添加してもよい。水と酸との混合液の添加は、該混合液、または、酸および水それぞれの噴霧、または滴下により行なうことができる。また、基板雰囲気を該混合液、または、酸および水それぞれの蒸気とすることにより該混合液を添加してもよい。
【００１９】固定工程において細胞を懸濁させる酸とアルコールとの混合溶液は、アルコールを、該混合溶液全体の３／４（体積比）以上含むことが望ましく、５／６（体積比）以上含むことがさらに望ましい。また、このアルコールは、炭素数１〜３の脂肪族アルコールであることが好ましく、メタノール、エタノール、プロパノール、およびアリルアルコールの内の少なくとも一種であることがさらに好ましく、これらの内、メタノールが特に好ましい。
【００２０】また、細胞懸濁液の溶媒である混合溶液中に含まれる酸、および細胞膜破壊工程において細胞に作用させる酸は、それぞれカルボン酸であることが望ましく、酢酸、ギ酸、乳酸、酪酸、およびプロピオン酸の内の少なくとも一種であることがさらに望ましく、これらのうち、酢酸が特に好ましい。
【００２１】上記細胞膜破壊工程において作用させる酸と水との体積比は、酸：水＝１０：１〜１：１０であることが望ましく、酸：水＝１０：１〜１：１であることがさらに望ましく、酸：水＝５：１であることが特に好ましい。
【００２２】また、本発明では、基板を保持するための基板保持部と、基板に、あらかじめ定められた量の細胞懸濁液を滴下する細胞懸濁液供給機構と、細胞懸濁液の滴下された基板に、酸および水を添加する細胞膜破壊液供給機構とを備える染色体標本の製造装置が提供される。
【００２３】ここで、細胞膜破壊液供給機構は、液体を噴霧するための噴霧ノズル、または、液体を蒸気にするための機構を備えることが望ましい。また、細胞膜破壊液供給機構は、酸と水との混合液を保持するための細胞膜破壊液保持部を、さらに備えていてもよい。なお、噴霧ノズルとして、酸の噴霧のためのノズルと水の噴霧のためのノズルとの二つを備えていてもよい。また、基板保持部は、細胞懸濁液を供給するためのチャンバと、細胞膜破壊液を供給するためのチャンバとを備えることが望ましい。
【００２４】
【作用】つぎに、本発明によれば、何故良好な染色体標本が得られるかを、実験データをもとに説明する。以下に説明する各実験は、主に、人の末梢血よりリンパ球を分離し、該細胞を培養後、低張処理、固定処理を施して細胞懸濁液を得、これを用いて基板であるスライドガラス上に分裂中期細胞の染色体が適当な広がった標本を作成する実験である。なお、本明細書では、特に記載しないかぎり、混合比は体積比である。
【００２５】まず、細胞の変遷について若干説明しておく。図５（ａ）の写真−１は、採取されたリンパ球の写真である。採取されたリンパ球の大きさは、直径０．００６〜０．００８ｍｍ程度である。なお、写真中の線の間隔は０．０５ｍｍである。
【００２６】この細胞を培養し、低張処理を行うと、約５分後には図５（ｂ）の写真−２のようになる。このときの細胞の大きさは、大きいもので０．０１５ｍｍを越えるようになる。さらに低張処理を続けると、処理開始より１２０分後には、図５（ｃ）の写真−３のようになる。なお、写真−３中の１は分裂間期の細胞である。分裂間期の細胞は、写真−３からわかるように、細胞膜と核膜がはっきりと区別できるようになる。一方、写真−３中の２は分裂中期の細胞である。分裂中期の細胞は、写真−３からわかるように、核膜が無く、該細胞の構造物であると思われる染色体が固まった状態で見られる。
【００２７】つぎに、これらをカルノア液にて固定すると、固定液中では写真−４（図５（ｄ））および写真−５（図５（ｅ））に示すような状態になる。写真−４および写真−５中の１は分裂間期の細胞である。この固定液中の分裂間期の細胞は、写真−３と比較してわかるように、低張液中のそれよりはるかに核膜と細胞膜の双方がはっきり区別して見られるようになる。一方、写真−４および写真−５中の２は分裂中期の細胞である。分裂中期の細胞も、固定液中では大きさが低張液中よりも大きく、０．０２５ｍｍ程度になり、細胞中の個々の染色体が、よりはっきりと観察できるようになる。
【００２８】また固定液中には、写真−４中の３に見られるように、中期細胞が半分に割れたもの、写真−４および写真−５中の４のように、間期細胞が細胞膜を失って核膜のみになったもの、および、写真−５中の５のように、中期細胞であるが形状が球形に近いものではなくて回転楕円体のようなものも存在している。この写真−４および写真−５に見られるような状態の分裂中期細胞がスライドガラス上で染色体の標本になる。
【００２９】この標本化に際して、良好な標本、すなわち、各染色体が、その起因する細胞ごとにまとまりをもちつつ、個々の染色体を観察できる程度に分散しており、さらに染色体の集合が、同一細胞に起因するものごとに適当に分散している標本を得るための適正条件の代表的なものとしては、つぎの（ａ）〜（ｃ）などが知られている。
【００３０】（ａ）よく拭いたスライドガラス上に2〜3滴（ピペットにより）滴下して自然乾燥させる（外村 晶編 染色体異常 P.331 朝倉書店）。
【００３１】（ｂ）１０℃に冷却した蒸留水にスライドガラスを浸しておき、水から取り出し、濡れたままのスライドガラスの上にパスツールピペットで細胞懸濁液を１滴落とす（堀 雅明、中村 祐輔編 ラボマニュアル ヒトゲノムマッピング P.107丸善株式会社）。
【００３２】（ｃ）予め冷凍庫に保存していた清浄な、油脂成分のついていないスライドガラスを取り出し、息を吹きかけてスライド上についた霜を解かし、その上に細胞懸濁液１〜２滴をパスツールピペットにより滴下する（TECHNICAL REPORTS SERIESNO.260 "BIOLOGICAL DOSIMETRY:CHROMOSOMAL ABERRATION ANALYSIS FOR DOSEASSESSMENT " P.60 INTERNATIONAL ATOMIC ENERGY AGENCY）。
【００３３】この三つの例を見ても判るように、実験者によりかなり条件が異なるのが実状であり、どの方法が一番良いかは一概には判断できない。そこで、再現性よく良好な標本を得るためには、どのようにしたらよいか、標本の状態に影響を与える各条件について、個々に検討を加えた。
【００３４】Ａ．染色体の分散（細胞膜の破壊、染色体の遊離）
染色体の観察のためには、中期細胞においては、細胞の細胞膜が破壊され、かつ、内部に包含されていた染色体が、相互に重ならない程度に分散している必要がある。上述した各例から、水が何らかの作用を持っている事を示すものであると考えられるので、まず、水のもつ作用の検討から始めた。
【００３５】（１）水の影響カルノア液中の細胞を、遠心分離により単離し、得られた細胞に、種々の溶液（作用液と呼ぶ）を加えて、細胞がどのように変化するかを調べた。各条件と、結果として得られた細胞の状態を、表１に示す。なお、表１において、Ａは酢酸を、Ｍはメタノールを、Ｗは水をそれぞれ表し、Ａ／Ｗは酢酸と水の混合液を、Ｗ／Ｍは水とメタノールの混合液を、Ｗ／Ｍはメタノールと酢酸の混合液を、Ａ／Ｗ／Ｍは酢酸、水、メタノール三つの混合液を、それぞれ表す。ただし、カルノア液以外の各混合液は、特に限定しない限り、各成分の同体積を混合したものである。
【００３６】
【表１】
表１に挙げられている写真−６〜９は、それぞれ、図６の（ａ）〜（ｄ）であり、写真−１０〜１２は、それぞれ、図７の（ａ）〜（ｃ）である。なお、いずれの写真中においても、１は分裂間期の細胞で細胞膜を維持しているものであり、２は分裂中期の細胞で細胞膜が破損を受けていないものであり、３は分裂間期の細胞で細胞膜を失ったものであり、４は分裂中期の細胞で割れ等の破損を生じているものである。
【００３７】これらの結果から、酸（ケース番号１−１）、メタノール（ケース番号１−２）、またはその混合液（ケース番号１−６）のみを作用させても、細胞は破壊されず、細胞の破壊が起きるのは、水が作用した場合（ケース番号１−３〜５、１−７）であることがわかる。また、水のみを作用させた場合（ケース番号１−３）よりも、水と酸との混合液（ケース番号１−４）を作用させた方が、破壊率が上がることがわかる。
【００３８】なお、これらの結果からわかるように、間期細胞が細胞膜を失う時には中期細胞にも割れ等の破損を生じる。また、このような細胞膜破損の現象は写真−１１中の５のような変形細胞に最も生じ易いようであり、このような変形細胞が観察される時には、他の無破損細胞、例えば各写真中の１や２のような細胞の残存量が多い。
【００３９】これらの結果から、この細胞膜破壊作用は、酸と水との混合液を用いた時に最も強くなると考えられる。酢酸と水の等量混合液に固定された細胞を入れると（ケース番号１−４）細胞膜がほとんど破壊されて、分裂中期細胞では染色体が遊離し、分裂の間期細胞では核膜だけが見えるようになる。
【００４０】（２）酸と水との影響以上のように、水のみを作用させるより、水と酸との混合液を作用させた方が、破壊率が上がることがわかったので、つぎに、この細胞（膜）破壊現象がカルノア液より分離された細胞に特異的に起きる現象なのか、それとも他の溶液に懸濁されていた細胞でも生じるのかを調べた。
【００４１】実験としては、上記の実験により細胞が壊れなかった細胞（ケース番号１−１、１−２、１−５、１−７の細胞）を、溶液中から遠心分離し、いろいろな溶液を加えてそれぞれの溶液の中での細胞および染色体の状態を観察した。実験条件および実験結果を表２に示す。
【００４２】
【表２】
表２に挙げられている写真−１３〜１６は、それぞれ、図８の（ａ）〜（ｄ）である。なお、いずれの写真中においても、１は細胞膜が維持され核膜とともに明瞭認識される間期細胞、２は細胞膜が維持され、中の染色体が識別できる中期細胞、３は細胞膜を失い核膜だけが識別される間期細胞、４は割れ等の損傷を受けた中期細胞である。
【００４３】酢酸と水との混合液を加えたものは（ケース番号２−２、３、５、７）、直前に浸されていた作用液がいずれの場合にも、写真−１４からわかるように細胞膜が維持された間期細胞１や細胞膜が維持された中期細胞２は見られず、写真−１４中の６のように、遊離した染色体が無数に存在した。
【００４４】これらの結果より、酢酸と水との混合液は、直前に細胞がどういう溶液中に懸濁されていたのかという点には関係なく、細胞を破壊する作用を有すると考えられる。
【００４５】一方、酢酸のみを加えたものは（ケース番号２−６）、十分な破壊はおこらず、特にケース番号２−６では、写真−１６からわかるように、細胞は殆ど変化しなかった。
【００４６】しかし、ケース番号２−１では、水のみを加えたが、この場合も細胞膜の破損が見られた。ケース番号２−１は、酢酸に懸濁されていた細胞（ケース番号１−１）に、水を加えたため、細胞内では、酢酸と水との混合が生じたと考えられる。同様に、ケース番号２−４でも、酢酸のみを加えたにもかかわらず、細胞の破壊のがみられた。ケース番号２−４は、水とメタノールとの混合液に懸濁されていた細胞（ケース番号１−５）に、酢酸を加えたため、細胞内では酢酸と水との混合が生じたと考えられる。
【００４７】この結果から、混合液を加えなくても、結果的に酢酸と水との混合状態になると考えられる条件（先に水に懸濁されていた細胞に酢酸を加える場合や、先に酢酸に懸濁されていた細胞に水を加える場合）では、細胞は破壊されることがわかった。
【００４８】（３）カルノア液の影響上述のように、直前に浸されていた液がなんであるかに拘りなく、酸と水とを作用させれば細胞を破壊することができることが推測される。そこで、この点を確認するために、低張処理後の細胞を、カルノア液で処理することなく、直接、他の溶液にさらすとどのような事が起こるのかを調べてみた。実験結果を表３に示す。
【００４９】なお、表３において、「低Ｍ」は、細胞を懸濁させた低張処理液１ｍｌにピペットでカルノア液１〜２滴を加えたのち、液をメタノールに置換し、さらに遠心分離して得られた細胞を示す。また、「低Ｍ／Ｗ」は、細胞を懸濁させた低張処理液１ｍｌにピペットでカルノア液を１〜２滴加えたのち、液をメタノールと水との混合液に置換し、さらに遠心分離して得られた細胞を示す。さらに、「収」は細胞の収縮を、「凝」は細胞どうしの凝集を表す。
【００５０】
【表３】
表３に挙げられている写真−１７〜１９は、それぞれ、図９の（ａ）〜（ｃ）である。上述の場合と同様に、いずれの写真中においても、１は細胞膜が維持され核膜とともに明瞭認識される間期細胞、２は細胞膜が維持され、中の染色体が識別できる中期細胞、３は細胞膜を失い核膜だけが識別される間期細胞、４は割れ等の損傷を受けた中期細胞である。
【００５１】カルノア液を用いた場合も含めて、酸と水との混合がない場合（ケース番号３−１、２、４、６、８）は、細胞の凝縮や収縮は起こるが、細胞の破壊はほとんど起こらない。
【００５２】これに対して、酸と水との混合液が作用すれば、水と酢酸との混合液を添加する場合（ケース番号３−３、７）、および、あらかじめ存在していた水に酢酸が添加される場合（ケース番号３−５）のいずれの場合も、細胞の破壊が見られた。特に、酢酸と水との混合液を添加した場合、細胞はほとんど破壊され、良好な結果が得られた。
【００５３】以上の結果から、細胞がどのような処理液中に存在していたかに拘らず、酢酸と水との混合液には、細胞膜を破壊し、中期細胞であればその染色体を露出させ、間期細胞であれば核膜を残した形の状態にすることができるという作用があることがわかった。
【００５４】（４）酸と水との混合比つぎに、酢酸と水との混合比率によりその作用力が異なるのかどうかを実験した。すなわち、カルノア液により固定したのちカルノア液中から遠心分離した細胞に、種々の混合比率の酢酸−水混合液を加え、結果を観察するという実験を行った。結果を表４に示す。なお、表４における混合比は体積比である。
【００５５】
【表４】
表４に挙げられている写真−２１〜２６は、それぞれ、図１１の（ａ）〜（ｆ）である。上述の場合と同様に、いずれの写真中においても、１は細胞膜が維持され核膜とともに明瞭認識される間期細胞、２は細胞膜が維持され、中の染色体が識別できる中期細胞、３は細胞膜を失い核膜だけが識別される間期細胞、６は中期細胞より遊離した染色体である。
【００５６】表４に示した結果では、作用液の混合比が、酢酸：水＝５：１のときが最も効果的であり、細胞膜は完全に破壊された。作用液の混合比がこの比率から離れるほど、細胞膜を維持している細胞１，２が多くなり、細胞に対する破壊作用が小さくなることがわかる。また、作用液の混合比が５：１に近いほど、３，６が増え、細胞膜の破壊された細胞が多くなることがわかる。
【００５７】酢酸−水混合液を用いて細胞膜を破壊する場合、その混合比は、細胞膜の破壊能の観点から、酢酸：水＝１０：１〜１：１０であることが望ましく、酢酸：水＝１０：１〜１：１であることがさらに望ましく、酢酸：水＝５：１であることが特に望ましい。
【００５８】（５）酸の種類の影響つぎに、水と混合すると細胞膜を破壊する作用は、酢酸に特有のものであるのかどうかを調べる実験をおこなった。酸として、ギ酸、乳酸、プロピオン酸、酪酸、燐酸を用い、上述の（３）と同様な実験を行ってみたところ、酢酸と同じように水との混合液は作用力の差はあるが細胞、細胞膜を破壊する作用がある事がわかった。
【００５９】例として、低張処理後の細胞を、プロピオン酸と水との混合液に加えた場合の、細胞の状態を、図１０１０の写真−２０に示す。写真−２０中には、細胞膜を失い核膜だけが識別される間期細胞、および、中期細胞より遊離した染色体のみが存在する。
【００６０】さらに、酸と水との混合比について、上述の（４）と同様の実験を行ったところ、すべての酸において酢酸と同様な効果が認められた。ただし、効果の程度に関しては、ギ酸では酢酸よりも広い範囲で破壊作用があり、プロピオン酸では酢酸より水が多い方が効果があるが効果を有する混合比率の範囲は狭く、乳酸もプロピオン酸と同様の傾向にあることがわかった。なお、酸は標本から気化して失われることが望ましい。したがって、気化速度の点から、これらの酸のうち、酢酸およびギ酸が特に好ましい。また、ガラスを基板として用いる場合には、ガラスに対する濡れ性の点から、酢酸が特に好ましい。
【００６１】（６）アルコールの種類および量の影響上述した（１）〜（３）の実験結果から、酢酸と水とが混在しても、それにメタノールが混じっていると細胞を割る作用が薄れることがわかった。そこで、このメタノールの酸／水による細胞膜破壊に対する抑止効果は、メタノール固有の性質なのか、それともアルコールが一般的に持つ性質なのかを調べる実験をおこなった。
【００６２】まず、酢酸と水との１：１混合液を用意し、これにメタノール、エタノール、２−プロパノール、または、アリルアルコールを、それぞれ種々の体積比で加えて、１９種類の作用液を調製した。カルノア液により固定したのち、カルノア液より分離した細胞に、この作用液を加えて標本を作成し、得られた標本中の細胞の状態を観察した。表５にその結果を示す。
【００６３】
【表５】
表５に挙げられている写真−２７〜３１は、それぞれ、図１２の（ａ）〜（ｅ）である。上述の場合と同様に、いずれの写真中においても、１は細胞膜が維持され核膜とともに明瞭認識される間期細胞、２は細胞膜が維持され、中の染色体が識別できる中期細胞、３は細胞膜を失い核膜だけが識別される間期細胞、４は割れ等の損傷を受けた中期細胞、６は中期細胞より遊離した染色体である。なお、写真２７〜３１は、いずれもメタノールを用いて作成した標本の写真であるが、他のアルコールを用いた場合も、同様な標本が得られた。
【００６４】表５に示した結果から、アルコールは、メタノールのみならず他のものでも酢酸と水の混合液が持つ細胞膜破壊作用を減じる効果があることがわかる。また、アルコールがある量より多いと、細胞膜は破壊されない（写真中の１や２で示される状態にある）が、アルコールが少ないと、細胞膜の破壊が起こる（写真中の３や４で示される状態）がわかる。なお、酢酸以外の酸についても同様にして実験したところ、アルコールとして、ギ酸、プロピオン酸、または乳酸を用いた場合でも、アルコールは細胞損傷抑止剤として働くことがわかった。
【００６５】破壊抑止作用をもう少し細かく見てみると、ケース番号５−１（酸：アルコール＝１：４）の実験では細胞は破壊されていないが、ケース番号５−２（酸：アルコール＝１：３）の実験では若干の細胞が破壊された。したがって、水と酸との細胞破壊作用を抑えるためには、細胞懸濁液におけるアルコールの割合は、酸：アルコール＝１：３以上であることが望ましく、さらに破壊を減らすためには１：４以上とすることが好ましい。
【００６６】ここで、アルコールは、酸および水よりも一般に蒸気圧が高く、先に蒸発してしまい、その濃度は刻々と低くなることを考慮すると、確実に細胞の破壊を抑制するためには、細胞懸濁液を酸とアルコールとの混合液とし、アルコール濃度を、酸：アルコール＝１：５以上にすることが望ましい。
【００６７】（７）まとめ以上の実験結果より、染色体の標本として好ましいもの、少なくともその形態が好ましいもの、すなわち、破損細胞や所属の判らない染色体を含まないものを作るには、以下のＡおよびＢが必要である事が結論できる。
【００６８】Ａ．細胞膜を維持したままの細胞の分散好ましい標本とは、染色体が、細胞間で混ざり合わないように、その起因する細胞ごとにまとまって、適度に分散し、さらに、個々の染色体も、重なり合わないように適度に分散している標本である。
【００６９】したがって、細胞膜を破壊して内部の染色体が遊離しても、他の細胞の染色体と混ざり合わない程度に、あらかじめ細胞を分散させておく必要がある。このためには、まず、細胞膜が破壊されない条件で、細胞を分散させる必要がある。これを実現するには、細胞が破損しないように、酸と水とが混合する事を避け、さらに、細胞懸濁液中にアルコールが比較的高い濃度で存在するようにすることが望ましい。アルコールの存在により、細胞懸濁液中に少量の水が存在しても、細胞の破壊が抑止されることになる。
【００７０】そこで、細胞を拡散させる際の細胞懸濁液の溶媒には、アルコールを用いることが好ましいと考えられるが、アルコールのみの溶液に細胞を懸濁させると、細胞が収縮してしまい、良好な標本を得ることはできない。そこで、この細胞の収縮を避けるためには、細胞懸濁液の溶媒に酸を含ませる必要がある。
【００７１】では、細胞懸濁液中にどの程度までアルコールの混合すればよいだろうか。この点に関しては、上述した（６）の実験（アルコールの破壊抑止作用の実験）が参考になる。上述のように、この実験の結果からは、細胞懸濁液におけるアルコールの割合が、酸：アルコール＝１：３以上であれば、細胞の破壊が一応抑止され、１：４以上であれば、十分な抑止効果が得られることがわかる。従って、アルコールの蒸発により低濃度化を考慮しても、アルコール濃度は、酸：アルコール＝１：５以上であれば、十分に良好な標本を得ることができる。
【００７２】そこで、細胞を基板上に分散する際の細胞懸濁液の溶媒を、酸およびアルコールの混合液とし、その混合液中に占めるアルコールの割合を、酸：アルコール＝１：３以上、好ましくは１：５以上とすれば、たとえ標本作成途中に水が混入しても、細胞膜を破壊することなく、細胞を基板上に分散できる。
【００７３】Ｂ．細胞膜の破壊良好な標本を得るためにつぎに必要になるのは、所定のばらつきで分散した細胞の細胞膜を破壊し、内部の染色体を遊離させることである。このためには、基板上に拡散した細胞懸濁液から、アルコールを除去し、残った細胞に酸および水を作用させればよい。なお、蒸気圧の高いアルコールを用いれば、特に除去のための工程を経なくても、すみやかに気化して時間経過とともに標本から除去される。
【００７４】そこで、基板上に滴下された細胞懸濁液（溶媒は酸およびアルコール）に水を添加すれば、細胞膜の破壊を抑止するアルコールはやがて蒸発して無くなっしまうため、細胞が分散した状態で細胞膜を破壊することができる。なお、水の添加は、細胞懸濁液の流動が停止し、細胞がそれ以上移動しなくなった時点で行うことが望ましい。これは、細胞がまだ移動している間に細胞膜を破壊すると、その内容物が液の流動に従って移動し、細胞感で混じり合ったり、広く分散してしまったりするためである。
【００７５】では、水はどのようにして添加するのが望ましいであろうか。例えば、基板としてガラス板を用いる場合には、ガラス表面に水を吸着させておく方法が考えられる。しかし、吸着水は、滴下された細胞懸濁液が広がる時にはじかれる傾向にあり、従ってどうしてもその量のコントロールは不安定になる。また、細胞懸濁液の広がった基板全体を水蒸気中に保持することも考えられるが、このようにした場合、細胞懸濁液中に取り込まれる水の量は、ほとんどコントロールできない。
【００７６】そこで、水の量の正確なコントロールのために、細胞懸濁液の流動が停止した標本に、酸と水との混合液を噴霧、または滴下するか、あるいは、酸と水との混合蒸気中に標本をさらすことが好ましい。あるいは、細胞懸濁液の流動が停止した標本に、酸および水を同時に噴霧、または滴下してもよい。
【００７７】なお、酸と水の混合液による細胞破壊作用は細胞の分裂期によっても異なるようである。酸と水との混合液を用いて細胞膜を破壊する場合、染色体が観察し易い状態の中期細胞の細胞膜が壊れやすい傾向にあり、染色体が完全に凝縮してしまった細胞や、逆に、染色体がほとんど凝縮していない細胞（染色体が細長い形状に見える細胞）は比較的壊れにくい傾向を示す。
【００７８】従って、本発明によれば、標本の作成条件によっては、染色体が観察しやすい状態の中期細胞の細胞膜を選択的に破壊し、その内容物である染色体を観察可能な状態に分散することができ、かつ、染色体が観察しにくい状態の細胞については細胞膜を破壊せず、その内容物の流出を防止することができる。ゆえに、本発明によれば、細胞期の選択的な標本を得ることもできる。
【００７９】従来より、染色体が基板（ガラス基板など）上で細胞より流れ出て標本となる過程における水の作用、は、例えば水の存在により個々の染色体が流れ易くなって広がりが良くなるというような物理的な作用であると考えられてきた。しかし、以上の実験結果の考察により、本発明者は、染色体の遊離に対する水の作用が、そのような物理的なものではなく、詳細は不明であるが、酸と水との混合状態が持つ化学的な作用が大きいと考えるに至った。そして、分裂中期の細胞が染色体の標本となる過程を、つぎのように考えた。
【００８０】従来のように、低張処理を施した細胞をカルノア液により固定し、この液を基板上に滴下すると、細胞懸濁液は基板との塗れ性により表面上に広がっていく。この時の液の広がりは、基板と液の塗れ性および基板の水平面との傾きにより定まる。細胞懸濁液の溶媒は、広がると同時に蒸発を開始する。この溶媒の蒸発は成分により速度が異なるが、通常のカルノア液ではメタノールが先に蒸発する事になる。したがって、標本中の酢酸の割合は、次第に高まることになる。この時に系内に存在する水の量と、細胞懸濁液の持つ表面張力の大きさとが、細胞の割れ方、および、染色体の広がり方を決定すると考えられる。
【００８１】上述の（ｂ）の予め基板を水に浸しておく処理や、水蒸気中での処理が好ましいといわれているのは、上述のような物理的作用ではなく、実際には、酢酸と水の混合液を一時的に作り出して、細胞膜を破壊することができるために有効であったものと考えられる。
【００８２】ただし、従来の技術では、本発明のように、細胞の分散が終了してから水を加えるのではなく、細胞懸濁液を基板上へ滴下する当初から水が存在していることになり、移動途中に細胞膜が破壊され、内容物が広範囲に流出する細胞がでてきてしまう。また、上述の実験（４）からわかるように、細胞膜を確実に破壊するためには、酸と水との混合比を一定の範囲内にコントロールする必要があるが、従来の方法では、水の量をコントロールすることは事実上できない。
【００８３】しかし、本発明によれば、あらかじめ酸とアルコールとの混合液中に細胞を懸濁させ、この細胞懸濁液を基板上に滴下して懸濁液ごと細胞を拡散させ、その核酸が停止した後に、系内に水を加えて中期細胞の細胞膜を破壊し、染色体を遊離させるため、確実に、再現性よく良好な標本を得ることができる。
【００８４】なお、本発明は、末梢血細胞、骨髄細胞、羊水細胞、胎盤絨毛細胞、固形癌細胞等、種々の細胞の染色体標本の調製に適用することができる。また、これらの細胞は、培養せずに直接低張処理したものであっても、培養後に低張処理したものであってもよい。
【００８５】
【実施例】以下、本発明の実施例を図面を用いて説明する。なお、以下の実施例は、ヒトのリンパ球を試料として染色体の標本を作る実施例であるので、まず、細胞懸濁液の調製について説明する。
【００８６】（１）細胞培養から低張処理ヒトの末梢血を10ml採取し、これをリンパ球分離用チューブ（商品名：LeucoPREP Becton Dickinson社製）に入れて遠心分離しリンパ球を含む液を得た。これをハンクス液（商品名：HANK'S BALANCE SALT SOLUTION, BioWHITTAKER社製）に入れてリンパ球を洗浄してから培養液にいれた。なお、培養液はRMPI 1640（商品名：RPMI MEDIUM 1640,IRVINE SCIENTIFIC社製より調製）8mlに子牛の胎児血清2ml、さらに細胞分裂刺激剤PHA-P（DIFCO LABORATORIES製）0.02mlを加えて作成した。この細胞を含む培養液を、炭酸ガスインキュベータにて69時間培養した後、細胞分裂阻止剤であるコルセミド（デメコルシン溶液、和光純薬）を0.1ml加えてさらに3時間培養した。培養後、遠心分離により細胞を回収し、0.075MのKCl溶液10mlにいれて、37℃にて10分間放置して低張処理を行った。
【００８７】（２）固定処理低張処理を終えた低張液に、カルノア液（メタノールと酢酸の混合液でその混合比率が3:1になっている）を0.02ml滴下して撹拌した。この液を二つの遠心用のチューブに取り分け、遠心分離して、それぞれ細胞を分離した。
【００８８】一方のチューブの細胞は、カルノア液にて固定し、さらにもう一度同液にて置換処理して細胞懸濁液（以下、細胞液Ａと呼ぶ）を得た。
【００８９】他方のチューブの細胞は、メタノールのみで固定し、続いて、メタノールをメタノールと酸の混合比率が10:1（体積比）である液に置換して、細胞懸濁液（以下、細胞液Ｂと呼ぶ）を得た。なお、ここでメタノールのみではなく、酸を加えているのは、メタノール処理だけでは細胞が収縮してしまうためである。
【００９０】以上により得られた細胞懸濁溶液を用い、以下の条件で染色体いの標本を得た。
【００９１】［実施例１］
Ａ．標本作成用装置まず、本実施例１で用いた標本作成用装置について説明しておく。本実施例１で用いた標本作成用装置は、図１に示すように、筐体２１０と、細胞懸濁液供給部１１３と、細胞膜破壊液供給部１１４と、基板支持部２１１（図２に図示）とを備える。なお、図１では、基板支持部２１１の図示は省略した。
【００９２】筐体２１０は、内部の隔壁１１６により２つのチャンバ１１１，１１２に仕切られている。チャンバ１１１は細胞を基板上で拡散させるための領域であり、チャンバ１１２は細胞膜を破壊するための領域である。隔壁１１６は、中央部分に、標本を作成する基板を、チャンバ１１１からチャンバ１１２に移動させるため窓部２１４を備える。なお、筐体２１０の前面は、標本基板の出し入れが容易なように、開閉可能になっている。
【００９３】細胞懸濁液供給部１１３は、ピペッタを備る。ピペッタはマイクロピペットであり、その内部に保持された細胞懸濁液を、その先端から一定量ずつ排出するようになっている。ピペッタは、その先端が、細胞拡散用チャンバ１１１内に位置するように筐体２１０に取付けられている。
【００９４】細胞膜破壊液供給部１１４は、噴霧ノズル１１７と、酸（本実施例では酢酸）と水との混合液（細胞膜破壊液）１１９を保持するための細胞膜破壊液保持部１１５と、圧縮空気を発生するエアコンプレッサ１１８および電源１２０とを備え、これらはこの順でパイプにより連通可能に接続されている。細胞膜破壊液供給部１１４は、起動されると、エアコンプレッサ１１８が駆動され、圧縮空気により、細胞膜破壊液保持部１１５内に保持された細胞膜破壊液１１９が一定量だけノズル１１７に送られ、一定量の霧化された細胞膜破壊液１１９がノズル１１７の先端からチャンバ１１２内に噴霧されるようになっている。
【００９５】基板支持部２１１は、図２に示すように、円柱形の軸であり、長軸方向に移動可能、および円周方向に回動可能な状態で、筐体２１０の２つのチャンバ１１１，１１２を貫通している。なお、図２は、基板支持部２１１および筐体２１０の斜視図であるが、基板支持部２１１の構成が確認しやすいように、筐体２１０の前面と上面の図示を省略した。また、図２では、細胞懸濁液供給部１１３および細胞膜破壊液供給部１１４の図示は省略した。
【００９６】基板支持部２１１は、スライドガラスを保持するための基板取付部２１２と、仕切補助板２１３とを備えている。基板取付部２１２は、隔壁１１６の窓部２１４を通過できる大きさであるが、仕切補助板２１３は、窓部２１４を完全に覆うことのできる大きさになっている。基板取付部２１２は、基板取付面２１５の四隅に基板挾持部２１６を備え、この基板挾持部２１６によって基板を挾持することにより、基板を基板取付面２１５に固定することができる。
【００９７】この標本作成用装置を使用する際には、まず、基板支持部２１１の軸を操作して、基板取付部２１２が細胞拡散用チャンバ１１１の中央部分に位置し、かつ基板取付面２１５が水平方向に対して４５度程度傾いているようにする。このときの基板取付部２１２および仕切補助板２１３の位置は、図２に実線で示した位置になり、基板取付部２１２の基板取付面２１５中央が、細胞懸濁液供給機構１１３のピペッタ先端の真下に位置することになる。
【００９８】ここで、基板取付部２１２の基板取付面２１５にスライドガラスをセットし、細胞懸濁液供給機構１１３を操作て、あらかじめ定められた量の細胞懸濁液をスライドガラス上に滴下する。
【００９９】つぎに、スライドガラス上の液の拡散が停止するのを待ったのち、基板支持部２１１の軸を４５度回転させて基板取付面２１５を水平にして、隔壁１１６の窓部２１４を通して、細胞膜破壊用チャンバ１１２に移動させ、基板取付面２１５中央が、細胞膜破壊液供給部１１４のノズル先端１１７の真下に位置するようにする。このとき、基板取付部２１２および仕切補助板２１３は、図２に点線で示す場所２１２ａおよび２１３ａに位置することになる。なお、このとき、仕切補助板２１３は、図２の２１３ａの位置にあり、隔壁１１６の窓部２１４を完全に覆っている。
【０１００】最後に、細胞膜破壊液供給部１１４を起動して、一定量の細胞膜破壊液１１９をチャンバ１１２中のスライドガラスに噴霧したのち、自然乾燥すれば、染色体の標本が得られる。なお、本標本作成用装置では、チャンバ１１２内に細胞膜破壊液１１９を噴霧する際には、隔壁１１６の窓部２１４は仕切補助板２１３により覆われているので、細胞膜破壊液１１９が細胞拡散用チャンバ１１１内に混入することはない。
【０１０１】Ｂ．標本の作成まず、細胞懸濁液供給機構１１３のマイクロピペットを用いて、０．０１ｍｌの細胞液Ｂをスライドガラス（チャンバ１１１内の基板取付部２１５に固定されている）上に滴下し、自然に液が広がりきるまで待つ。
【０１０２】つぎに、基板保持部２１１の軸を回動してスライドガラスを水平にし、基板取付部２１５ごとスライドガラスをチャンバ１１１に移動させ、細胞膜破壊液供給機構１１４を起動して、噴霧ノズルから細胞膜破壊液１１９（本実施例では、酢酸と水との等量混合液）をスライドガラス上の懸濁液の表面に均一に噴霧し、自然乾燥した。得られた標本の写真（写真−３４）を、図１３R>３（ｃ）に示す。なお、噴霧する混合液の量は、乾いたスライドガラス上に均一に噴霧したとき、ガラス表面が薄く曇状になる程度の量である。
【０１０３】本実施例１により調製された標本では、染色体が個々に識別可能な程度に広がり、かつ、染色体がその起因する細胞ごとにまとまっていて、他の細胞に起因するものとの混同を生じることなく、さらに、標本中心部と周辺部とを比較しても大きな差はなかった。また、本実施例１では、このような良好な標本を再現性よく調製することができた。
【０１０４】なお、本実施例１では、細胞膜破壊液をノズル１１７から直接スライドガラス上に噴霧したが、あらかじめノズル１１７から細胞膜破壊液をチャンバ１１２内に噴霧しておき、このチャンバ１１２内にスライドガラスを入れ、一定時間保持することにより、細胞懸濁液に細胞膜破壊液を加えるようにしてもよい。なお、このようにする場合には、チャンバ１１２内に細胞膜破壊液を噴霧する際には、隔壁１１６の窓部２１４を閉じる機構を設ける必要がある。
【０１０５】また、本実施例１のように、細胞膜破壊液をノズル１１７から噴霧するのではなく、超音波蒸気発生器などによって細胞膜破壊液の蒸気を発生させ、この蒸気で満たしたチャンバ内に、細胞懸濁液を広げたスライドガラスを入れ、一定時間保持することにより、細胞懸濁液に細胞膜破壊液を加えるようにしてもよい。
【０１０６】［実施例２］
Ａ．標本作成用装置まず、本実施例２に用いた標本作成用装置を説明する。本実施例２で用いた標本作成用装置は、図３に示すように、上面および全面の囲まれていない筐体３１０と、該筐体３１０の上面に、長軸方向に移動可能なように取付けられたピペットホルダ３１３と、先端が下向きになるように該ピペットホルダ３１３に取付けられた２本のピペット３１１、３１２とを備える。ピペット３１１は細胞懸濁液滴下用のピペットであり、ピペット３１２は細胞膜破壊液（酸／水の混合液）滴下用のピペットである。
【０１０７】本実施例２の標本作成装置は、つぎのようにして使用される。まず、標本の基板（本実施例ではスライドガラス）３１４を筐体３１０の内部の、スライドガラス３１４中央が細胞懸濁液滴下用ピペット３１１の先端の真下になる位置に立てかけ、ピペット３１１より細胞懸濁液をスライドガラス３１４上に滴下する。つぎに、ピペットホルダ３１３を少し移動させて、細胞膜破壊液滴下用ピペット３１２の先端がスライドガラス３１４中央の真上に位置するようにし、スライドガラス３１４上の細胞懸濁液の移動が停止したら、ピペット３１２より細胞膜破壊液（酸／水の混合液）をスライドガラス上に滴下する。最後に、スライドガラス３１４を自然乾燥すれば、染色体の標本が得られる。
【０１０８】Ｂ．標本の作成まず、ピペット３１１を用いて、０．０１ｍｌの細胞液Ｂをスライドガラス３１４（チャンバ３１０内の所定の位置に立てかけられている）上に滴下し、自然に液が広がりきるまで待つ。
【０１０９】スライドガラス３１４上の細胞懸濁液の移動が停止したら、該細胞懸濁液中のアルコールが蒸発している間に、該細胞懸濁液表面に、ピペット３１２を用いて細胞膜破壊液（酢酸と水との等量混合液）を０．００５ｍｌ滴下し、その後自然乾燥して染色体標本を得た。
【０１１０】本実施例３により調製された標本では、細胞懸濁液中に含まれる酢酸の量が少ないにも拘らず、染色体は良好に拡散しており、かつ周辺部と中央部との差も少なかった。なお、本実施例３により調製された標本では、周辺領域では染色体がやや過度に広がる傾向が見られたが、特に標本の観察上問題になるほどではなかった。
【０１１１】［実施例３］
Ａ．標本作成用装置本実施例で用いた標本作成用装置は、図４に示すように、細胞膜破壊液供給部１１４の構成を除けば、実施例１で用いた標本作成用装置と同様である。ただし、実施例１の装置では、あらかじめ酸と水との混合液を用意し、この混合液を細胞膜破壊液保持部１１５に保持して、これを噴霧するのに対して、本実施例の装置では、酸と水とをあらかじめ混合しておかずに、酸と水とを別々に噴霧する。なお、図４では、基板支持部２１１の図示は省略した。
【０１１２】すなわち、本実施例３の細胞膜破壊液供給部１１４は、２系統の液体噴霧機構を備える。第１の液体噴霧機構は、この順で連通可能にパイプにより接続された、酸の噴霧のための噴霧ノズル１１７ａと、酸１１９ａを保持するための酸保持部１１５ａと、圧縮空気を発生するエアコンプレッサ１１８および電源１２０（図４R>４では図示を省略した）とを備える。また、第２の液体噴霧機構は、この順で連通可能にパイプにより接続された、水１１９ｂを噴霧するための噴霧ノズル１１７ｂと、水を保持するための水保持部１１５ｂと、圧縮空気を発生するエアコンプレッサ１１８および電源１２０（図４では図示を省略した）とを備える。
【０１１３】細胞膜破壊液供給部１１４は、起動されると、２つのエアコンプレッサ１１８から供給される圧縮空気により、第１の液体噴霧機構からは酸が、第２の液体噴霧機構からは水が、それぞれチャンバチャンバ１１２内に噴霧されるようになっている。従って、本実施例３の標本作成用装置の細胞膜破壊液供給部１１４は、直接細胞膜破壊液を供給するのではなく、第１の系統からは酸が、第２の系統からは水が、それぞれ別々に噴霧され、噴霧後にこれらが混合することにより、結果として細胞膜破壊液が供給することになる。
【０１１４】Ｂ．標本の作成まず、細胞懸濁液供給機構１１３のマイクロピペットを用いて、０．０１ｍｌの細胞液Ｂをスライドガラス（チャンバ１１１内の基板取付部２１５に固定されている）上に滴下し、自然に液が広がりきるまで待つ。
【０１１５】つぎに、基板保持部２１１の軸を回動してスライドガラスを水平にし、基板取付部２１５ごとスライドガラスをチャンバ１１１に移動させ、細胞膜破壊液供給機構１１４を起動して、酸用噴霧ノズル１１７ａからは酸１１９ａ（本実施例では酢酸）を、水用噴霧ノズル１１７ｂからは水１１９ｂを、それぞれ噴霧時間の制御により等量ずつ、スライドガラス上の懸濁液の表面に均一に噴霧し、自然乾燥した。なお、噴霧する各液の量は、それぞれ、乾いたスライドガラス上に均一に噴霧したとき、ガラス表面が薄く曇状になる程度の量である。
【０１１６】本実施例３では、実施例１と同様に、染色体が個々に識別可能な程度に広がり、かつ、染色体がその起因する細胞ごとにまとまっていて、他の細胞に起因するものとの混同を生じることなく、さらに、標本中心部と周辺部とを比較しても大きな差のない標本を、再現性よく得ることができた。
【０１１７】なお、ここでは、等量比の酢酸と水の混合液を基板上で作るために、噴霧ノズル１１７ａおよび１１７ｂとして、単位時間当たりの噴霧量の等しいノズルを用い、さらに噴霧時間も一致させたが、酸と水との混合比は、ノズルの噴霧能および／または噴霧時間を変えることにより、任意の比率に調製することができる。
【０１１８】［比較例１］マイクロピペットを用いて、０．０１ｍｌの細胞液Ａをスライドガラス上に滴下し、自然に液が広がりきるまで待った後、自然乾燥した。得られた標本の写真（写真−３２）を、図１３（ａ）に示す。
【０１１９】本比較例１により調製された標本では、細胞の広がり具合に標本ごとのばらつきがあり、さらに標本の中心部と周辺部では細胞の状態が違っている。すなわち、周辺部では、破損細胞や起因する細胞のはっきりしない細胞内容物が多く観察された。これは、細胞懸濁液がガラス表面に広がる際、割れてしまう細胞があり、この破壊された細胞の内容物の一部はバラバラになって周辺部まで運ばれるためであると考えられる。
【０１２０】［比較例２］マイクロピペットを用いて、０．０１ｍｌの細胞液Ｂをスライドガラス上に滴下し、自然に液が広がりきるまで待った後、自然乾燥した。得られた標本の写真（写真−３３）を、図１３（ｂ）に示す。
【０１２１】本比較例２により調製された標本では、染色体がまだ細胞の形の中に残っているように見える。細胞外に広がった染色体はほとんどなく、また細胞によっては細胞膜が残ったままになっているものも見られる。従って、本比較例２により調製された標本では、個々の染色体の観察が困難であり、染色体の標本として望ましいものではない。
【０１２２】［比較例３］まず、スライドガラスを１０分間水に浸して表面に水を吸着させた。つぎに、マイクロピペットを用いて、０．０１ｍｌの細胞液Ｂを、水の付着したままの、水を吸着させたスライドガラス上に滴下し、自然に液が広がりきるまで待った後、自然乾燥し、染色体の標本を得た。得られた標本では、細胞膜の破壊が十分ではなかった。これは、本比較例３では、滴下された細胞懸濁液は、スライドガラス表面に付着した水を押し広げるようにしてガラス表面に広がるため、十分な水の効果が得られないためであると考えられる。
【０１２３】
【発明の効果】本発明によれば、標本作成者の熟練度にかかわりなく、染色体を明瞭に識別することのできる標本を、再現性よく得ることができる。従って、本発明により作成された標本を用いれば、染色体の検査における所要時間の短縮や、精度の向上などの効果がある。さらに、本発明によれば、細胞分裂の分裂期に応じた選択的標本の調製がある程度可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例１の標本作成用装置の斜視図である。
【図２】 実施例１の標本作成用装置の部分斜視図である。
【図３】 実施例２の標本作成用装置の斜視図である。
【図４】 実施例３の標本作成用装置の斜視図である。
【図５】 細胞の変遷について説明するための、細胞の形態を示す写真である。
【図６】 水の影響を示すための、細胞の形態を示す写真である。
【図７】 水の影響を示すための、細胞の形態を示す写真である。
【図８】 酸および水の影響を示すための、細胞の形態を示す写真である。
【図９】 カルノア液の影響を示すための、細胞の形態を示す写真である。
【図１０】 酸の種類および量の影響を示すための、細胞の形態を示す写真である。
【図１１】 酸と水との混合比の影響を示すための、細胞の形態を示す写真である。
【図１２】 アルコールの種類および量の影響を示すための、細胞の形態を示す写真である。
【図１３】 実施例１、比較例１、および比較例２により得られた標本における、細胞の形態を示す写真である。
【符号の説明】
１１１…細胞拡散用チャンバ、１１２…細胞膜破壊用チャンバ、１１３…細胞懸濁液供給部、１１４…細胞膜破壊液供給部１１４、１１５…細胞膜破壊液保持部、１１６…隔壁、１１７…噴霧ノズル、１１７ａ…酸用噴霧ノズル、１１７ｂ…水用噴霧ノズル、１１８…エアコンプレッサ、１１９…細胞膜破壊液、１１９ａ…酸、１１９ｂ…水、１２０…電源、２１０…筐体、２１１…基板支持部、２１２…基板取付部、２１３…仕切補助板、２１４…隔壁の窓部、２１５…基板取付面、２１６…基板挾持部、３１０…筐体、３１１…細胞懸濁液滴下用ピペット、３１２…細胞膜破壊液滴下用ピペット、３１３…ピペットホルダ、３１４…標本基板。
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、染色体検査の標本作成方法および標本作成装置に係り、特に、一つの細胞に含まれる染色体を、基板上で観察や検査に適した分布、広がりを持つように分散させることのできる染色体標本の製造方法および該方法に用いる染色体標本の製造装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】生体の組織、器官はそれぞれ特異的な機能を持つ細胞よりなり、これらの機能の発現をコントロールしているのが細胞内に存在するＤＮＡである。従って、ＤＮＡに異常が生じると、生体は正常な働きをしなくなり、病気等となって現れることが多い。このＤＮＡの異常には、遺伝子自身の異常（核酸配列の異常）や、遺伝子コピーの数的な異常、さらには、ＤＮＡ中での遺伝子の位置異常等があると考えられている。
【０００３】例えば、鎌状赤血球症は遺伝子自身の塩基配列の異常によるものであると考えられており、ダウン症は遺伝子の数的な異常によるものであと考えられている。また、遺伝子の位置異常による疾病には、染色体の転座に伴う各種の異常、たとえば慢性骨髄性白血病等が挙げられる。このように、近年、多くの疾患と、遺伝子異常との関係が明らかにされてきている。
【０００４】このような遺伝子の異常の診断は、遺伝子自身の異常に対しては直接的に塩基配列を同定したり、プローブＤＮＡとのハイブリダイゼーションの有無を検出したり、塩基配列の異常に伴うＤＮＡフラグメントのコンフォメーションの違いを検出したりして行なわれる。
【０００５】しかし、これらの方法では数的異常や位置の異常を検出するのは難しいので、これらの異常の検出についてはＤＮＡを染色体の形にして検出している。すなわち、細胞分裂中期にある細胞の染色体をスライドガラス上に広げて固定した標本を作り、適当な染色処理等を経て観察し、検出している。これらの検出は出生前診断、癌の進行度の把握・予後の予測、放射線の染色体への影響の調査、食品の安全性試験等に用いられている。
【０００６】一方最近の分子生物学の進展にはめざましいものがあるが、その研究対象が染色体に大きくかかわりあって来ているものがあり、その一つの領域として特定遺伝子がどの染色体のどの位置に存在するのを調べる遺伝子マッピングがある。ここでも細胞分裂中期にある細胞の染色体をスライドガラス上に広げて固定した標本を作り、適当な染色処理等を経て観察している。
【０００７】このように検診目的にも、また、研究目的にも、染色体は用いられており、それぞれの目的に合った染色体の標本が作成されている。ここで、まず従来どのようにしてこの染色体標本が作成されて検査なり研究に供されているかを述べる。なお、以下で述べる内容は対象細胞として末梢血細胞を用いているが基本的には前記の他の細胞でも同じである。
【０００８】採取した末梢血細胞のうち細胞分裂刺激剤（例えばPhytohaemagglutinin、以下、PHAと略す）により分裂が特に促進されるＴ−細胞を含むリンパ球を分離したり、または採取した全血をそのまま適当な緩衝液、例えばハンクス液にて洗浄した後、適当な培地に加えて培養する。培地としては、例えばRMPI 1640（商品名：RPMI MEDIUM 1640,IRVINE SCIENTIFIC社製より調製）にウシ胎児血清とPHAを添加した培地を用いることが知られている。
【０００９】細胞回収の数時間前に、培地に細胞分裂阻止剤であるコルセミドを加えて培養し、適度に細胞分裂の中期細胞を含んだ培養液を得る。培養後、培養細胞を分離し、ついで細胞が適度に膨張し標本として適度に個々の染色体が広がり、かつ染色体が観察され易くなるように、０．０７５ＭのＫＣｌ溶液を用いて低張処理を行う。
【００１０】つぎに、低張処理された細胞を固定液、例えばメタノールと酢酸を３：１の割合にて混合したカルノア液にて固定処理を行う。なお、本明細書では、「カルノア液」という用語を、メタノールと酢酸との３：１（体積比）混合液を意味するものとして用いる。また、特にことわらない限り、「酢酸」とは「氷酢酸」を意味する。
【００１１】最後に、細胞をこのカルノア液にて数度洗浄処理をした後、適量の、例えば０．０１〜０．０１５ｍｌの細胞懸濁液をスライドガラス上に滴下する。滴下後スライドガラス上に適度に広がった液が蒸発していく時に、観察に適した標本、すなわち一つの細胞の個々の染色体が適度な間隔を持って分布しており、互いに重なっていない標本が得られる。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】上記のような標本作成法は確かに場合によっては良好な標本を得ることができるが、この方法により良好な標本を得るためには、かなりの熟練を要する。また、熟練をもってしても時には良好ならざる標本となることがあり、再現性よく良好な標本を得ることは非常に困難であった。
【００１３】すなわち、この従来の方法を用いた場合、一つの細胞に含まれる個々の染色体が、基板であるスライドガラス上適当にで広がらずに重なりを生じたり、逆に広がりすぎて隣どうしの細胞との間で染色体が混じり合ってもともとの所属が不明になったり、さらに標本の中央部と周辺部の染色体の状態、例えば一つの細胞からの染色体の広がり方といったものに差異を生じたりする事が多かった。従って、従来の方法を用いて標本を作成する場合、精度の高い測定が出来なかったり、測定に時間がかかるといった不具合を生じていた。
【００１４】そこで、本発明は、このような不都合の無い、染色体を明瞭に識別できる標本を、再現性よく得ることを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】本発明の発明者は、この問題を検討した結果カルノア液の細胞は酸と水との混合液にさらされると細胞膜が破壊されてそれにより細胞の個々の染色体が遊離するという現象を発見し、この新たな知見に基づいて、本発明をなすに至った。
【００１６】本発明では、細胞を低張処理する低張工程と、低張処理された細胞を、酸とアルコールとの混合溶液中に懸濁させ、細胞懸濁液を得る固定工程と、細胞懸濁液を基板上に滴下し、基板上で細胞を拡散させる拡散工程と、基板上の細胞懸濁液中の細胞に、水と酸とを作用させる細胞膜破壊工程とを、この順で有する染色体標本の製造方法が提供される。
【００１７】ここで、細胞膜破壊工程は、拡散工程において上記基板上に滴下された細胞懸濁液が流動していない状態で行われることが望ましい。細胞懸濁液が流動していると、細胞膜を破壊したのちに、細胞の内容物が流動して過度に拡散してしまうことがあるからである。
【００１８】また、細胞膜破壊工程において細胞に酸と水とを作用させることは、基板上の細胞懸濁液に水と酸との混合液を添加することにより行われてもよく、酸と水とをそれぞれ別に添加してもよい。水と酸との混合液の添加は、該混合液、または、酸および水それぞれの噴霧、または滴下により行なうことができる。また、基板雰囲気を該混合液、または、酸および水それぞれの蒸気とすることにより該混合液を添加してもよい。
【００１９】固定工程において細胞を懸濁させる酸とアルコールとの混合溶液は、アルコールを、該混合溶液全体の３／４（体積比）以上含むことが望ましく、５／６（体積比）以上含むことがさらに望ましい。また、このアルコールは、炭素数１〜３の脂肪族アルコールであることが好ましく、メタノール、エタノール、プロパノール、およびアリルアルコールの内の少なくとも一種であることがさらに好ましく、これらの内、メタノールが特に好ましい。
【００２０】また、細胞懸濁液の溶媒である混合溶液中に含まれる酸、および細胞膜破壊工程において細胞に作用させる酸は、それぞれカルボン酸であることが望ましく、酢酸、ギ酸、乳酸、酪酸、およびプロピオン酸の内の少なくとも一種であることがさらに望ましく、これらのうち、酢酸が特に好ましい。
【００２１】上記細胞膜破壊工程において作用させる酸と水との体積比は、酸：水＝１０：１〜１：１０であることが望ましく、酸：水＝１０：１〜１：１であることがさらに望ましく、酸：水＝５：１であることが特に好ましい。
【００２２】また、本発明では、基板を保持するための基板保持部と、基板に、あらかじめ定められた量の細胞懸濁液を滴下する細胞懸濁液供給機構と、細胞懸濁液の滴下された基板に、酸および水を添加する細胞膜破壊液供給機構とを備える染色体標本の製造装置が提供される。
【００２３】ここで、細胞膜破壊液供給機構は、液体を噴霧するための噴霧ノズル、または、液体を蒸気にするための機構を備えることが望ましい。また、細胞膜破壊液供給機構は、酸と水との混合液を保持するための細胞膜破壊液保持部を、さらに備えていてもよい。なお、噴霧ノズルとして、酸の噴霧のためのノズルと水の噴霧のためのノズルとの二つを備えていてもよい。また、基板保持部は、細胞懸濁液を供給するためのチャンバと、細胞膜破壊液を供給するためのチャンバとを備えることが望ましい。
【００２４】
【作用】つぎに、本発明によれば、何故良好な染色体標本が得られるかを、実験データをもとに説明する。以下に説明する各実験は、主に、人の末梢血よりリンパ球を分離し、該細胞を培養後、低張処理、固定処理を施して細胞懸濁液を得、これを用いて基板であるスライドガラス上に分裂中期細胞の染色体が適当な広がった標本を作成する実験である。なお、本明細書では、特に記載しないかぎり、混合比は体積比である。
【００２５】まず、細胞の変遷について若干説明しておく。図５（ａ）の写真−１は、採取されたリンパ球の写真である。採取されたリンパ球の大きさは、直径０．００６〜０．００８ｍｍ程度である。なお、写真中の線の間隔は０．０５ｍｍである。
【００２６】この細胞を培養し、低張処理を行うと、約５分後には図５（ｂ）の写真−２のようになる。このときの細胞の大きさは、大きいもので０．０１５ｍｍを越えるようになる。さらに低張処理を続けると、処理開始より１２０分後には、図５（ｃ）の写真−３のようになる。なお、写真−３中の１は分裂間期の細胞である。分裂間期の細胞は、写真−３からわかるように、細胞膜と核膜がはっきりと区別できるようになる。一方、写真−３中の２は分裂中期の細胞である。分裂中期の細胞は、写真−３からわかるように、核膜が無く、該細胞の構造物であると思われる染色体が固まった状態で見られる。
【００２７】つぎに、これらをカルノア液にて固定すると、固定液中では写真−４（図５（ｄ））および写真−５（図５（ｅ））に示すような状態になる。写真−４および写真−５中の１は分裂間期の細胞である。この固定液中の分裂間期の細胞は、写真−３と比較してわかるように、低張液中のそれよりはるかに核膜と細胞膜の双方がはっきり区別して見られるようになる。一方、写真−４および写真−５中の２は分裂中期の細胞である。分裂中期の細胞も、固定液中では大きさが低張液中よりも大きく、０．０２５ｍｍ程度になり、細胞中の個々の染色体が、よりはっきりと観察できるようになる。
【００２８】また固定液中には、写真−４中の３に見られるように、中期細胞が半分に割れたもの、写真−４および写真−５中の４のように、間期細胞が細胞膜を失って核膜のみになったもの、および、写真−５中の５のように、中期細胞であるが形状が球形に近いものではなくて回転楕円体のようなものも存在している。この写真−４および写真−５に見られるような状態の分裂中期細胞がスライドガラス上で染色体の標本になる。
【００２９】この標本化に際して、良好な標本、すなわち、各染色体が、その起因する細胞ごとにまとまりをもちつつ、個々の染色体を観察できる程度に分散しており、さらに染色体の集合が、同一細胞に起因するものごとに適当に分散している標本を得るための適正条件の代表的なものとしては、つぎの（ａ）〜（ｃ）などが知られている。
【００３０】（ａ）よく拭いたスライドガラス上に2〜3滴（ピペットにより）滴下して自然乾燥させる（外村 晶編 染色体異常 P.331 朝倉書店）。
【００３１】（ｂ）１０℃に冷却した蒸留水にスライドガラスを浸しておき、水から取り出し、濡れたままのスライドガラスの上にパスツールピペットで細胞懸濁液を１滴落とす（堀 雅明、中村 祐輔編 ラボマニュアル ヒトゲノムマッピング P.107丸善株式会社）。
【００３２】（ｃ）予め冷凍庫に保存していた清浄な、油脂成分のついていないスライドガラスを取り出し、息を吹きかけてスライド上についた霜を解かし、その上に細胞懸濁液１〜２滴をパスツールピペットにより滴下する（TECHNICAL REPORTS SERIESNO.260 "BIOLOGICAL DOSIMETRY:CHROMOSOMAL ABERRATION ANALYSIS FOR DOSEASSESSMENT " P.60 INTERNATIONAL ATOMIC ENERGY AGENCY）。
【００３３】この三つの例を見ても判るように、実験者によりかなり条件が異なるのが実状であり、どの方法が一番良いかは一概には判断できない。そこで、再現性よく良好な標本を得るためには、どのようにしたらよいか、標本の状態に影響を与える各条件について、個々に検討を加えた。
【００３４】Ａ．染色体の分散（細胞膜の破壊、染色体の遊離）
染色体の観察のためには、中期細胞においては、細胞の細胞膜が破壊され、かつ、内部に包含されていた染色体が、相互に重ならない程度に分散している必要がある。上述した各例から、水が何らかの作用を持っている事を示すものであると考えられるので、まず、水のもつ作用の検討から始めた。
【００３５】（１）水の影響カルノア液中の細胞を、遠心分離により単離し、得られた細胞に、種々の溶液（作用液と呼ぶ）を加えて、細胞がどのように変化するかを調べた。各条件と、結果として得られた細胞の状態を、表１に示す。なお、表１において、Ａは酢酸を、Ｍはメタノールを、Ｗは水をそれぞれ表し、Ａ／Ｗは酢酸と水の混合液を、Ｗ／Ｍは水とメタノールの混合液を、Ｗ／Ｍはメタノールと酢酸の混合液を、Ａ／Ｗ／Ｍは酢酸、水、メタノール三つの混合液を、それぞれ表す。ただし、カルノア液以外の各混合液は、特に限定しない限り、各成分の同体積を混合したものである。
【００３６】
【表１】
表１に挙げられている写真−６〜９は、それぞれ、図６の（ａ）〜（ｄ）であり、写真−１０〜１２は、それぞれ、図７の（ａ）〜（ｃ）である。なお、いずれの写真中においても、１は分裂間期の細胞で細胞膜を維持しているものであり、２は分裂中期の細胞で細胞膜が破損を受けていないものであり、３は分裂間期の細胞で細胞膜を失ったものであり、４は分裂中期の細胞で割れ等の破損を生じているものである。
【００３７】これらの結果から、酸（ケース番号１−１）、メタノール（ケース番号１−２）、またはその混合液（ケース番号１−６）のみを作用させても、細胞は破壊されず、細胞の破壊が起きるのは、水が作用した場合（ケース番号１−３〜５、１−７）であることがわかる。また、水のみを作用させた場合（ケース番号１−３）よりも、水と酸との混合液（ケース番号１−４）を作用させた方が、破壊率が上がることがわかる。
【００３８】なお、これらの結果からわかるように、間期細胞が細胞膜を失う時には中期細胞にも割れ等の破損を生じる。また、このような細胞膜破損の現象は写真−１１中の５のような変形細胞に最も生じ易いようであり、このような変形細胞が観察される時には、他の無破損細胞、例えば各写真中の１や２のような細胞の残存量が多い。
【００３９】これらの結果から、この細胞膜破壊作用は、酸と水との混合液を用いた時に最も強くなると考えられる。酢酸と水の等量混合液に固定された細胞を入れると（ケース番号１−４）細胞膜がほとんど破壊されて、分裂中期細胞では染色体が遊離し、分裂の間期細胞では核膜だけが見えるようになる。
【００４０】（２）酸と水との影響以上のように、水のみを作用させるより、水と酸との混合液を作用させた方が、破壊率が上がることがわかったので、つぎに、この細胞（膜）破壊現象がカルノア液より分離された細胞に特異的に起きる現象なのか、それとも他の溶液に懸濁されていた細胞でも生じるのかを調べた。
【００４１】実験としては、上記の実験により細胞が壊れなかった細胞（ケース番号１−１、１−２、１−５、１−７の細胞）を、溶液中から遠心分離し、いろいろな溶液を加えてそれぞれの溶液の中での細胞および染色体の状態を観察した。実験条件および実験結果を表２に示す。
【００４２】
【表２】
表２に挙げられている写真−１３〜１６は、それぞれ、図８の（ａ）〜（ｄ）である。なお、いずれの写真中においても、１は細胞膜が維持され核膜とともに明瞭認識される間期細胞、２は細胞膜が維持され、中の染色体が識別できる中期細胞、３は細胞膜を失い核膜だけが識別される間期細胞、４は割れ等の損傷を受けた中期細胞である。
【００４３】酢酸と水との混合液を加えたものは（ケース番号２−２、３、５、７）、直前に浸されていた作用液がいずれの場合にも、写真−１４からわかるように細胞膜が維持された間期細胞１や細胞膜が維持された中期細胞２は見られず、写真−１４中の６のように、遊離した染色体が無数に存在した。
【００４４】これらの結果より、酢酸と水との混合液は、直前に細胞がどういう溶液中に懸濁されていたのかという点には関係なく、細胞を破壊する作用を有すると考えられる。
【００４５】一方、酢酸のみを加えたものは（ケース番号２−６）、十分な破壊はおこらず、特にケース番号２−６では、写真−１６からわかるように、細胞は殆ど変化しなかった。
【００４６】しかし、ケース番号２−１では、水のみを加えたが、この場合も細胞膜の破損が見られた。ケース番号２−１は、酢酸に懸濁されていた細胞（ケース番号１−１）に、水を加えたため、細胞内では、酢酸と水との混合が生じたと考えられる。同様に、ケース番号２−４でも、酢酸のみを加えたにもかかわらず、細胞の破壊のがみられた。ケース番号２−４は、水とメタノールとの混合液に懸濁されていた細胞（ケース番号１−５）に、酢酸を加えたため、細胞内では酢酸と水との混合が生じたと考えられる。
【００４７】この結果から、混合液を加えなくても、結果的に酢酸と水との混合状態になると考えられる条件（先に水に懸濁されていた細胞に酢酸を加える場合や、先に酢酸に懸濁されていた細胞に水を加える場合）では、細胞は破壊されることがわかった。
【００４８】（３）カルノア液の影響上述のように、直前に浸されていた液がなんであるかに拘りなく、酸と水とを作用させれば細胞を破壊することができることが推測される。そこで、この点を確認するために、低張処理後の細胞を、カルノア液で処理することなく、直接、他の溶液にさらすとどのような事が起こるのかを調べてみた。実験結果を表３に示す。
【００４９】なお、表３において、「低Ｍ」は、細胞を懸濁させた低張処理液１ｍｌにピペットでカルノア液１〜２滴を加えたのち、液をメタノールに置換し、さらに遠心分離して得られた細胞を示す。また、「低Ｍ／Ｗ」は、細胞を懸濁させた低張処理液１ｍｌにピペットでカルノア液を１〜２滴加えたのち、液をメタノールと水との混合液に置換し、さらに遠心分離して得られた細胞を示す。さらに、「収」は細胞の収縮を、「凝」は細胞どうしの凝集を表す。
【００５０】
【表３】
表３に挙げられている写真−１７〜１９は、それぞれ、図９の（ａ）〜（ｃ）である。上述の場合と同様に、いずれの写真中においても、１は細胞膜が維持され核膜とともに明瞭認識される間期細胞、２は細胞膜が維持され、中の染色体が識別できる中期細胞、３は細胞膜を失い核膜だけが識別される間期細胞、４は割れ等の損傷を受けた中期細胞である。
【００５１】カルノア液を用いた場合も含めて、酸と水との混合がない場合（ケース番号３−１、２、４、６、８）は、細胞の凝縮や収縮は起こるが、細胞の破壊はほとんど起こらない。
【００５２】これに対して、酸と水との混合液が作用すれば、水と酢酸との混合液を添加する場合（ケース番号３−３、７）、および、あらかじめ存在していた水に酢酸が添加される場合（ケース番号３−５）のいずれの場合も、細胞の破壊が見られた。特に、酢酸と水との混合液を添加した場合、細胞はほとんど破壊され、良好な結果が得られた。
【００５３】以上の結果から、細胞がどのような処理液中に存在していたかに拘らず、酢酸と水との混合液には、細胞膜を破壊し、中期細胞であればその染色体を露出させ、間期細胞であれば核膜を残した形の状態にすることができるという作用があることがわかった。
【００５４】（４）酸と水との混合比つぎに、酢酸と水との混合比率によりその作用力が異なるのかどうかを実験した。すなわち、カルノア液により固定したのちカルノア液中から遠心分離した細胞に、種々の混合比率の酢酸−水混合液を加え、結果を観察するという実験を行った。結果を表４に示す。なお、表４における混合比は体積比である。
【００５５】
【表４】
表４に挙げられている写真−２１〜２６は、それぞれ、図１１の（ａ）〜（ｆ）である。上述の場合と同様に、いずれの写真中においても、１は細胞膜が維持され核膜とともに明瞭認識される間期細胞、２は細胞膜が維持され、中の染色体が識別できる中期細胞、３は細胞膜を失い核膜だけが識別される間期細胞、６は中期細胞より遊離した染色体である。
【００５６】表４に示した結果では、作用液の混合比が、酢酸：水＝５：１のときが最も効果的であり、細胞膜は完全に破壊された。作用液の混合比がこの比率から離れるほど、細胞膜を維持している細胞１，２が多くなり、細胞に対する破壊作用が小さくなることがわかる。また、作用液の混合比が５：１に近いほど、３，６が増え、細胞膜の破壊された細胞が多くなることがわかる。
【００５７】酢酸−水混合液を用いて細胞膜を破壊する場合、その混合比は、細胞膜の破壊能の観点から、酢酸：水＝１０：１〜１：１０であることが望ましく、酢酸：水＝１０：１〜１：１であることがさらに望ましく、酢酸：水＝５：１であることが特に望ましい。
【００５８】（５）酸の種類の影響つぎに、水と混合すると細胞膜を破壊する作用は、酢酸に特有のものであるのかどうかを調べる実験をおこなった。酸として、ギ酸、乳酸、プロピオン酸、酪酸、燐酸を用い、上述の（３）と同様な実験を行ってみたところ、酢酸と同じように水との混合液は作用力の差はあるが細胞、細胞膜を破壊する作用がある事がわかった。
【００５９】例として、低張処理後の細胞を、プロピオン酸と水との混合液に加えた場合の、細胞の状態を、図１０１０の写真−２０に示す。写真−２０中には、細胞膜を失い核膜だけが識別される間期細胞、および、中期細胞より遊離した染色体のみが存在する。
【００６０】さらに、酸と水との混合比について、上述の（４）と同様の実験を行ったところ、すべての酸において酢酸と同様な効果が認められた。ただし、効果の程度に関しては、ギ酸では酢酸よりも広い範囲で破壊作用があり、プロピオン酸では酢酸より水が多い方が効果があるが効果を有する混合比率の範囲は狭く、乳酸もプロピオン酸と同様の傾向にあることがわかった。なお、酸は標本から気化して失われることが望ましい。したがって、気化速度の点から、これらの酸のうち、酢酸およびギ酸が特に好ましい。また、ガラスを基板として用いる場合には、ガラスに対する濡れ性の点から、酢酸が特に好ましい。
【００６１】（６）アルコールの種類および量の影響上述した（１）〜（３）の実験結果から、酢酸と水とが混在しても、それにメタノールが混じっていると細胞を割る作用が薄れることがわかった。そこで、このメタノールの酸／水による細胞膜破壊に対する抑止効果は、メタノール固有の性質なのか、それともアルコールが一般的に持つ性質なのかを調べる実験をおこなった。
【００６２】まず、酢酸と水との１：１混合液を用意し、これにメタノール、エタノール、２−プロパノール、または、アリルアルコールを、それぞれ種々の体積比で加えて、１９種類の作用液を調製した。カルノア液により固定したのち、カルノア液より分離した細胞に、この作用液を加えて標本を作成し、得られた標本中の細胞の状態を観察した。表５にその結果を示す。
【００６３】
【表５】
表５に挙げられている写真−２７〜３１は、それぞれ、図１２の（ａ）〜（ｅ）である。上述の場合と同様に、いずれの写真中においても、１は細胞膜が維持され核膜とともに明瞭認識される間期細胞、２は細胞膜が維持され、中の染色体が識別できる中期細胞、３は細胞膜を失い核膜だけが識別される間期細胞、４は割れ等の損傷を受けた中期細胞、６は中期細胞より遊離した染色体である。なお、写真２７〜３１は、いずれもメタノールを用いて作成した標本の写真であるが、他のアルコールを用いた場合も、同様な標本が得られた。
【００６４】表５に示した結果から、アルコールは、メタノールのみならず他のものでも酢酸と水の混合液が持つ細胞膜破壊作用を減じる効果があることがわかる。また、アルコールがある量より多いと、細胞膜は破壊されない（写真中の１や２で示される状態にある）が、アルコールが少ないと、細胞膜の破壊が起こる（写真中の３や４で示される状態）がわかる。なお、酢酸以外の酸についても同様にして実験したところ、アルコールとして、ギ酸、プロピオン酸、または乳酸を用いた場合でも、アルコールは細胞損傷抑止剤として働くことがわかった。
【００６５】破壊抑止作用をもう少し細かく見てみると、ケース番号５−１（酸：アルコール＝１：４）の実験では細胞は破壊されていないが、ケース番号５−２（酸：アルコール＝１：３）の実験では若干の細胞が破壊された。したがって、水と酸との細胞破壊作用を抑えるためには、細胞懸濁液におけるアルコールの割合は、酸：アルコール＝１：３以上であることが望ましく、さらに破壊を減らすためには１：４以上とすることが好ましい。
【００６６】ここで、アルコールは、酸および水よりも一般に蒸気圧が高く、先に蒸発してしまい、その濃度は刻々と低くなることを考慮すると、確実に細胞の破壊を抑制するためには、細胞懸濁液を酸とアルコールとの混合液とし、アルコール濃度を、酸：アルコール＝１：５以上にすることが望ましい。
【００６７】（７）まとめ以上の実験結果より、染色体の標本として好ましいもの、少なくともその形態が好ましいもの、すなわち、破損細胞や所属の判らない染色体を含まないものを作るには、以下のＡおよびＢが必要である事が結論できる。
【００６８】Ａ．細胞膜を維持したままの細胞の分散好ましい標本とは、染色体が、細胞間で混ざり合わないように、その起因する細胞ごとにまとまって、適度に分散し、さらに、個々の染色体も、重なり合わないように適度に分散している標本である。
【００６９】したがって、細胞膜を破壊して内部の染色体が遊離しても、他の細胞の染色体と混ざり合わない程度に、あらかじめ細胞を分散させておく必要がある。このためには、まず、細胞膜が破壊されない条件で、細胞を分散させる必要がある。これを実現するには、細胞が破損しないように、酸と水とが混合する事を避け、さらに、細胞懸濁液中にアルコールが比較的高い濃度で存在するようにすることが望ましい。アルコールの存在により、細胞懸濁液中に少量の水が存在しても、細胞の破壊が抑止されることになる。
【００７０】そこで、細胞を拡散させる際の細胞懸濁液の溶媒には、アルコールを用いることが好ましいと考えられるが、アルコールのみの溶液に細胞を懸濁させると、細胞が収縮してしまい、良好な標本を得ることはできない。そこで、この細胞の収縮を避けるためには、細胞懸濁液の溶媒に酸を含ませる必要がある。
【００７１】では、細胞懸濁液中にどの程度までアルコールの混合すればよいだろうか。この点に関しては、上述した（６）の実験（アルコールの破壊抑止作用の実験）が参考になる。上述のように、この実験の結果からは、細胞懸濁液におけるアルコールの割合が、酸：アルコール＝１：３以上であれば、細胞の破壊が一応抑止され、１：４以上であれば、十分な抑止効果が得られることがわかる。従って、アルコールの蒸発により低濃度化を考慮しても、アルコール濃度は、酸：アルコール＝１：５以上であれば、十分に良好な標本を得ることができる。
【００７２】そこで、細胞を基板上に分散する際の細胞懸濁液の溶媒を、酸およびアルコールの混合液とし、その混合液中に占めるアルコールの割合を、酸：アルコール＝１：３以上、好ましくは１：５以上とすれば、たとえ標本作成途中に水が混入しても、細胞膜を破壊することなく、細胞を基板上に分散できる。
【００７３】Ｂ．細胞膜の破壊良好な標本を得るためにつぎに必要になるのは、所定のばらつきで分散した細胞の細胞膜を破壊し、内部の染色体を遊離させることである。このためには、基板上に拡散した細胞懸濁液から、アルコールを除去し、残った細胞に酸および水を作用させればよい。なお、蒸気圧の高いアルコールを用いれば、特に除去のための工程を経なくても、すみやかに気化して時間経過とともに標本から除去される。
【００７４】そこで、基板上に滴下された細胞懸濁液（溶媒は酸およびアルコール）に水を添加すれば、細胞膜の破壊を抑止するアルコールはやがて蒸発して無くなっしまうため、細胞が分散した状態で細胞膜を破壊することができる。なお、水の添加は、細胞懸濁液の流動が停止し、細胞がそれ以上移動しなくなった時点で行うことが望ましい。これは、細胞がまだ移動している間に細胞膜を破壊すると、その内容物が液の流動に従って移動し、細胞感で混じり合ったり、広く分散してしまったりするためである。
【００７５】では、水はどのようにして添加するのが望ましいであろうか。例えば、基板としてガラス板を用いる場合には、ガラス表面に水を吸着させておく方法が考えられる。しかし、吸着水は、滴下された細胞懸濁液が広がる時にはじかれる傾向にあり、従ってどうしてもその量のコントロールは不安定になる。また、細胞懸濁液の広がった基板全体を水蒸気中に保持することも考えられるが、このようにした場合、細胞懸濁液中に取り込まれる水の量は、ほとんどコントロールできない。
【００７６】そこで、水の量の正確なコントロールのために、細胞懸濁液の流動が停止した標本に、酸と水との混合液を噴霧、または滴下するか、あるいは、酸と水との混合蒸気中に標本をさらすことが好ましい。あるいは、細胞懸濁液の流動が停止した標本に、酸および水を同時に噴霧、または滴下してもよい。
【００７７】なお、酸と水の混合液による細胞破壊作用は細胞の分裂期によっても異なるようである。酸と水との混合液を用いて細胞膜を破壊する場合、染色体が観察し易い状態の中期細胞の細胞膜が壊れやすい傾向にあり、染色体が完全に凝縮してしまった細胞や、逆に、染色体がほとんど凝縮していない細胞（染色体が細長い形状に見える細胞）は比較的壊れにくい傾向を示す。
【００７８】従って、本発明によれば、標本の作成条件によっては、染色体が観察しやすい状態の中期細胞の細胞膜を選択的に破壊し、その内容物である染色体を観察可能な状態に分散することができ、かつ、染色体が観察しにくい状態の細胞については細胞膜を破壊せず、その内容物の流出を防止することができる。ゆえに、本発明によれば、細胞期の選択的な標本を得ることもできる。
【００７９】従来より、染色体が基板（ガラス基板など）上で細胞より流れ出て標本となる過程における水の作用、は、例えば水の存在により個々の染色体が流れ易くなって広がりが良くなるというような物理的な作用であると考えられてきた。しかし、以上の実験結果の考察により、本発明者は、染色体の遊離に対する水の作用が、そのような物理的なものではなく、詳細は不明であるが、酸と水との混合状態が持つ化学的な作用が大きいと考えるに至った。そして、分裂中期の細胞が染色体の標本となる過程を、つぎのように考えた。
【００８０】従来のように、低張処理を施した細胞をカルノア液により固定し、この液を基板上に滴下すると、細胞懸濁液は基板との塗れ性により表面上に広がっていく。この時の液の広がりは、基板と液の塗れ性および基板の水平面との傾きにより定まる。細胞懸濁液の溶媒は、広がると同時に蒸発を開始する。この溶媒の蒸発は成分により速度が異なるが、通常のカルノア液ではメタノールが先に蒸発する事になる。したがって、標本中の酢酸の割合は、次第に高まることになる。この時に系内に存在する水の量と、細胞懸濁液の持つ表面張力の大きさとが、細胞の割れ方、および、染色体の広がり方を決定すると考えられる。
【００８１】上述の（ｂ）の予め基板を水に浸しておく処理や、水蒸気中での処理が好ましいといわれているのは、上述のような物理的作用ではなく、実際には、酢酸と水の混合液を一時的に作り出して、細胞膜を破壊することができるために有効であったものと考えられる。
【００８２】ただし、従来の技術では、本発明のように、細胞の分散が終了してから水を加えるのではなく、細胞懸濁液を基板上へ滴下する当初から水が存在していることになり、移動途中に細胞膜が破壊され、内容物が広範囲に流出する細胞がでてきてしまう。また、上述の実験（４）からわかるように、細胞膜を確実に破壊するためには、酸と水との混合比を一定の範囲内にコントロールする必要があるが、従来の方法では、水の量をコントロールすることは事実上できない。
【００８３】しかし、本発明によれば、あらかじめ酸とアルコールとの混合液中に細胞を懸濁させ、この細胞懸濁液を基板上に滴下して懸濁液ごと細胞を拡散させ、その核酸が停止した後に、系内に水を加えて中期細胞の細胞膜を破壊し、染色体を遊離させるため、確実に、再現性よく良好な標本を得ることができる。
【００８４】なお、本発明は、末梢血細胞、骨髄細胞、羊水細胞、胎盤絨毛細胞、固形癌細胞等、種々の細胞の染色体標本の調製に適用することができる。また、これらの細胞は、培養せずに直接低張処理したものであっても、培養後に低張処理したものであってもよい。
【００８５】
【実施例】以下、本発明の実施例を図面を用いて説明する。なお、以下の実施例は、ヒトのリンパ球を試料として染色体の標本を作る実施例であるので、まず、細胞懸濁液の調製について説明する。
【００８６】（１）細胞培養から低張処理ヒトの末梢血を10ml採取し、これをリンパ球分離用チューブ（商品名：LeucoPREP Becton Dickinson社製）に入れて遠心分離しリンパ球を含む液を得た。これをハンクス液（商品名：HANK'S BALANCE SALT SOLUTION, BioWHITTAKER社製）に入れてリンパ球を洗浄してから培養液にいれた。なお、培養液はRMPI 1640（商品名：RPMI MEDIUM 1640,IRVINE SCIENTIFIC社製より調製）8mlに子牛の胎児血清2ml、さらに細胞分裂刺激剤PHA-P（DIFCO LABORATORIES製）0.02mlを加えて作成した。この細胞を含む培養液を、炭酸ガスインキュベータにて69時間培養した後、細胞分裂阻止剤であるコルセミド（デメコルシン溶液、和光純薬）を0.1ml加えてさらに3時間培養した。培養後、遠心分離により細胞を回収し、0.075MのKCl溶液10mlにいれて、37℃にて10分間放置して低張処理を行った。
【００８７】（２）固定処理低張処理を終えた低張液に、カルノア液（メタノールと酢酸の混合液でその混合比率が3:1になっている）を0.02ml滴下して撹拌した。この液を二つの遠心用のチューブに取り分け、遠心分離して、それぞれ細胞を分離した。
【００８８】一方のチューブの細胞は、カルノア液にて固定し、さらにもう一度同液にて置換処理して細胞懸濁液（以下、細胞液Ａと呼ぶ）を得た。
【００８９】他方のチューブの細胞は、メタノールのみで固定し、続いて、メタノールをメタノールと酸の混合比率が10:1（体積比）である液に置換して、細胞懸濁液（以下、細胞液Ｂと呼ぶ）を得た。なお、ここでメタノールのみではなく、酸を加えているのは、メタノール処理だけでは細胞が収縮してしまうためである。
【００９０】以上により得られた細胞懸濁溶液を用い、以下の条件で染色体いの標本を得た。
【００９１】［実施例１］
Ａ．標本作成用装置まず、本実施例１で用いた標本作成用装置について説明しておく。本実施例１で用いた標本作成用装置は、図１に示すように、筐体２１０と、細胞懸濁液供給部１１３と、細胞膜破壊液供給部１１４と、基板支持部２１１（図２に図示）とを備える。なお、図１では、基板支持部２１１の図示は省略した。
【００９２】筐体２１０は、内部の隔壁１１６により２つのチャンバ１１１，１１２に仕切られている。チャンバ１１１は細胞を基板上で拡散させるための領域であり、チャンバ１１２は細胞膜を破壊するための領域である。隔壁１１６は、中央部分に、標本を作成する基板を、チャンバ１１１からチャンバ１１２に移動させるため窓部２１４を備える。なお、筐体２１０の前面は、標本基板の出し入れが容易なように、開閉可能になっている。
【００９３】細胞懸濁液供給部１１３は、ピペッタを備る。ピペッタはマイクロピペットであり、その内部に保持された細胞懸濁液を、その先端から一定量ずつ排出するようになっている。ピペッタは、その先端が、細胞拡散用チャンバ１１１内に位置するように筐体２１０に取付けられている。
【００９４】細胞膜破壊液供給部１１４は、噴霧ノズル１１７と、酸（本実施例では酢酸）と水との混合液（細胞膜破壊液）１１９を保持するための細胞膜破壊液保持部１１５と、圧縮空気を発生するエアコンプレッサ１１８および電源１２０とを備え、これらはこの順でパイプにより連通可能に接続されている。細胞膜破壊液供給部１１４は、起動されると、エアコンプレッサ１１８が駆動され、圧縮空気により、細胞膜破壊液保持部１１５内に保持された細胞膜破壊液１１９が一定量だけノズル１１７に送られ、一定量の霧化された細胞膜破壊液１１９がノズル１１７の先端からチャンバ１１２内に噴霧されるようになっている。
【００９５】基板支持部２１１は、図２に示すように、円柱形の軸であり、長軸方向に移動可能、および円周方向に回動可能な状態で、筐体２１０の２つのチャンバ１１１，１１２を貫通している。なお、図２は、基板支持部２１１および筐体２１０の斜視図であるが、基板支持部２１１の構成が確認しやすいように、筐体２１０の前面と上面の図示を省略した。また、図２では、細胞懸濁液供給部１１３および細胞膜破壊液供給部１１４の図示は省略した。
【００９６】基板支持部２１１は、スライドガラスを保持するための基板取付部２１２と、仕切補助板２１３とを備えている。基板取付部２１２は、隔壁１１６の窓部２１４を通過できる大きさであるが、仕切補助板２１３は、窓部２１４を完全に覆うことのできる大きさになっている。基板取付部２１２は、基板取付面２１５の四隅に基板挾持部２１６を備え、この基板挾持部２１６によって基板を挾持することにより、基板を基板取付面２１５に固定することができる。
【００９７】この標本作成用装置を使用する際には、まず、基板支持部２１１の軸を操作して、基板取付部２１２が細胞拡散用チャンバ１１１の中央部分に位置し、かつ基板取付面２１５が水平方向に対して４５度程度傾いているようにする。このときの基板取付部２１２および仕切補助板２１３の位置は、図２に実線で示した位置になり、基板取付部２１２の基板取付面２１５中央が、細胞懸濁液供給機構１１３のピペッタ先端の真下に位置することになる。
【００９８】ここで、基板取付部２１２の基板取付面２１５にスライドガラスをセットし、細胞懸濁液供給機構１１３を操作て、あらかじめ定められた量の細胞懸濁液をスライドガラス上に滴下する。
【００９９】つぎに、スライドガラス上の液の拡散が停止するのを待ったのち、基板支持部２１１の軸を４５度回転させて基板取付面２１５を水平にして、隔壁１１６の窓部２１４を通して、細胞膜破壊用チャンバ１１２に移動させ、基板取付面２１５中央が、細胞膜破壊液供給部１１４のノズル先端１１７の真下に位置するようにする。このとき、基板取付部２１２および仕切補助板２１３は、図２に点線で示す場所２１２ａおよび２１３ａに位置することになる。なお、このとき、仕切補助板２１３は、図２の２１３ａの位置にあり、隔壁１１６の窓部２１４を完全に覆っている。
【０１００】最後に、細胞膜破壊液供給部１１４を起動して、一定量の細胞膜破壊液１１９をチャンバ１１２中のスライドガラスに噴霧したのち、自然乾燥すれば、染色体の標本が得られる。なお、本標本作成用装置では、チャンバ１１２内に細胞膜破壊液１１９を噴霧する際には、隔壁１１６の窓部２１４は仕切補助板２１３により覆われているので、細胞膜破壊液１１９が細胞拡散用チャンバ１１１内に混入することはない。
【０１０１】Ｂ．標本の作成まず、細胞懸濁液供給機構１１３のマイクロピペットを用いて、０．０１ｍｌの細胞液Ｂをスライドガラス（チャンバ１１１内の基板取付部２１５に固定されている）上に滴下し、自然に液が広がりきるまで待つ。
【０１０２】つぎに、基板保持部２１１の軸を回動してスライドガラスを水平にし、基板取付部２１５ごとスライドガラスをチャンバ１１１に移動させ、細胞膜破壊液供給機構１１４を起動して、噴霧ノズルから細胞膜破壊液１１９（本実施例では、酢酸と水との等量混合液）をスライドガラス上の懸濁液の表面に均一に噴霧し、自然乾燥した。得られた標本の写真（写真−３４）を、図１３R>３（ｃ）に示す。なお、噴霧する混合液の量は、乾いたスライドガラス上に均一に噴霧したとき、ガラス表面が薄く曇状になる程度の量である。
【０１０３】本実施例１により調製された標本では、染色体が個々に識別可能な程度に広がり、かつ、染色体がその起因する細胞ごとにまとまっていて、他の細胞に起因するものとの混同を生じることなく、さらに、標本中心部と周辺部とを比較しても大きな差はなかった。また、本実施例１では、このような良好な標本を再現性よく調製することができた。
【０１０４】なお、本実施例１では、細胞膜破壊液をノズル１１７から直接スライドガラス上に噴霧したが、あらかじめノズル１１７から細胞膜破壊液をチャンバ１１２内に噴霧しておき、このチャンバ１１２内にスライドガラスを入れ、一定時間保持することにより、細胞懸濁液に細胞膜破壊液を加えるようにしてもよい。なお、このようにする場合には、チャンバ１１２内に細胞膜破壊液を噴霧する際には、隔壁１１６の窓部２１４を閉じる機構を設ける必要がある。
【０１０５】また、本実施例１のように、細胞膜破壊液をノズル１１７から噴霧するのではなく、超音波蒸気発生器などによって細胞膜破壊液の蒸気を発生させ、この蒸気で満たしたチャンバ内に、細胞懸濁液を広げたスライドガラスを入れ、一定時間保持することにより、細胞懸濁液に細胞膜破壊液を加えるようにしてもよい。
【０１０６】［実施例２］
Ａ．標本作成用装置まず、本実施例２に用いた標本作成用装置を説明する。本実施例２で用いた標本作成用装置は、図３に示すように、上面および全面の囲まれていない筐体３１０と、該筐体３１０の上面に、長軸方向に移動可能なように取付けられたピペットホルダ３１３と、先端が下向きになるように該ピペットホルダ３１３に取付けられた２本のピペット３１１、３１２とを備える。ピペット３１１は細胞懸濁液滴下用のピペットであり、ピペット３１２は細胞膜破壊液（酸／水の混合液）滴下用のピペットである。
【０１０７】本実施例２の標本作成装置は、つぎのようにして使用される。まず、標本の基板（本実施例ではスライドガラス）３１４を筐体３１０の内部の、スライドガラス３１４中央が細胞懸濁液滴下用ピペット３１１の先端の真下になる位置に立てかけ、ピペット３１１より細胞懸濁液をスライドガラス３１４上に滴下する。つぎに、ピペットホルダ３１３を少し移動させて、細胞膜破壊液滴下用ピペット３１２の先端がスライドガラス３１４中央の真上に位置するようにし、スライドガラス３１４上の細胞懸濁液の移動が停止したら、ピペット３１２より細胞膜破壊液（酸／水の混合液）をスライドガラス上に滴下する。最後に、スライドガラス３１４を自然乾燥すれば、染色体の標本が得られる。
【０１０８】Ｂ．標本の作成まず、ピペット３１１を用いて、０．０１ｍｌの細胞液Ｂをスライドガラス３１４（チャンバ３１０内の所定の位置に立てかけられている）上に滴下し、自然に液が広がりきるまで待つ。
【０１０９】スライドガラス３１４上の細胞懸濁液の移動が停止したら、該細胞懸濁液中のアルコールが蒸発している間に、該細胞懸濁液表面に、ピペット３１２を用いて細胞膜破壊液（酢酸と水との等量混合液）を０．００５ｍｌ滴下し、その後自然乾燥して染色体標本を得た。
【０１１０】本実施例３により調製された標本では、細胞懸濁液中に含まれる酢酸の量が少ないにも拘らず、染色体は良好に拡散しており、かつ周辺部と中央部との差も少なかった。なお、本実施例３により調製された標本では、周辺領域では染色体がやや過度に広がる傾向が見られたが、特に標本の観察上問題になるほどではなかった。
【０１１１】［実施例３］
Ａ．標本作成用装置本実施例で用いた標本作成用装置は、図４に示すように、細胞膜破壊液供給部１１４の構成を除けば、実施例１で用いた標本作成用装置と同様である。ただし、実施例１の装置では、あらかじめ酸と水との混合液を用意し、この混合液を細胞膜破壊液保持部１１５に保持して、これを噴霧するのに対して、本実施例の装置では、酸と水とをあらかじめ混合しておかずに、酸と水とを別々に噴霧する。なお、図４では、基板支持部２１１の図示は省略した。
【０１１２】すなわち、本実施例３の細胞膜破壊液供給部１１４は、２系統の液体噴霧機構を備える。第１の液体噴霧機構は、この順で連通可能にパイプにより接続された、酸の噴霧のための噴霧ノズル１１７ａと、酸１１９ａを保持するための酸保持部１１５ａと、圧縮空気を発生するエアコンプレッサ１１８および電源１２０（図４R>４では図示を省略した）とを備える。また、第２の液体噴霧機構は、この順で連通可能にパイプにより接続された、水１１９ｂを噴霧するための噴霧ノズル１１７ｂと、水を保持するための水保持部１１５ｂと、圧縮空気を発生するエアコンプレッサ１１８および電源１２０（図４では図示を省略した）とを備える。
【０１１３】細胞膜破壊液供給部１１４は、起動されると、２つのエアコンプレッサ１１８から供給される圧縮空気により、第１の液体噴霧機構からは酸が、第２の液体噴霧機構からは水が、それぞれチャンバチャンバ１１２内に噴霧されるようになっている。従って、本実施例３の標本作成用装置の細胞膜破壊液供給部１１４は、直接細胞膜破壊液を供給するのではなく、第１の系統からは酸が、第２の系統からは水が、それぞれ別々に噴霧され、噴霧後にこれらが混合することにより、結果として細胞膜破壊液が供給することになる。
【０１１４】Ｂ．標本の作成まず、細胞懸濁液供給機構１１３のマイクロピペットを用いて、０．０１ｍｌの細胞液Ｂをスライドガラス（チャンバ１１１内の基板取付部２１５に固定されている）上に滴下し、自然に液が広がりきるまで待つ。
【０１１５】つぎに、基板保持部２１１の軸を回動してスライドガラスを水平にし、基板取付部２１５ごとスライドガラスをチャンバ１１１に移動させ、細胞膜破壊液供給機構１１４を起動して、酸用噴霧ノズル１１７ａからは酸１１９ａ（本実施例では酢酸）を、水用噴霧ノズル１１７ｂからは水１１９ｂを、それぞれ噴霧時間の制御により等量ずつ、スライドガラス上の懸濁液の表面に均一に噴霧し、自然乾燥した。なお、噴霧する各液の量は、それぞれ、乾いたスライドガラス上に均一に噴霧したとき、ガラス表面が薄く曇状になる程度の量である。
【０１１６】本実施例３では、実施例１と同様に、染色体が個々に識別可能な程度に広がり、かつ、染色体がその起因する細胞ごとにまとまっていて、他の細胞に起因するものとの混同を生じることなく、さらに、標本中心部と周辺部とを比較しても大きな差のない標本を、再現性よく得ることができた。
【０１１７】なお、ここでは、等量比の酢酸と水の混合液を基板上で作るために、噴霧ノズル１１７ａおよび１１７ｂとして、単位時間当たりの噴霧量の等しいノズルを用い、さらに噴霧時間も一致させたが、酸と水との混合比は、ノズルの噴霧能および／または噴霧時間を変えることにより、任意の比率に調製することができる。
【０１１８】［比較例１］マイクロピペットを用いて、０．０１ｍｌの細胞液Ａをスライドガラス上に滴下し、自然に液が広がりきるまで待った後、自然乾燥した。得られた標本の写真（写真−３２）を、図１３（ａ）に示す。
【０１１９】本比較例１により調製された標本では、細胞の広がり具合に標本ごとのばらつきがあり、さらに標本の中心部と周辺部では細胞の状態が違っている。すなわち、周辺部では、破損細胞や起因する細胞のはっきりしない細胞内容物が多く観察された。これは、細胞懸濁液がガラス表面に広がる際、割れてしまう細胞があり、この破壊された細胞の内容物の一部はバラバラになって周辺部まで運ばれるためであると考えられる。
【０１２０】［比較例２］マイクロピペットを用いて、０．０１ｍｌの細胞液Ｂをスライドガラス上に滴下し、自然に液が広がりきるまで待った後、自然乾燥した。得られた標本の写真（写真−３３）を、図１３（ｂ）に示す。
【０１２１】本比較例２により調製された標本では、染色体がまだ細胞の形の中に残っているように見える。細胞外に広がった染色体はほとんどなく、また細胞によっては細胞膜が残ったままになっているものも見られる。従って、本比較例２により調製された標本では、個々の染色体の観察が困難であり、染色体の標本として望ましいものではない。
【０１２２】［比較例３］まず、スライドガラスを１０分間水に浸して表面に水を吸着させた。つぎに、マイクロピペットを用いて、０．０１ｍｌの細胞液Ｂを、水の付着したままの、水を吸着させたスライドガラス上に滴下し、自然に液が広がりきるまで待った後、自然乾燥し、染色体の標本を得た。得られた標本では、細胞膜の破壊が十分ではなかった。これは、本比較例３では、滴下された細胞懸濁液は、スライドガラス表面に付着した水を押し広げるようにしてガラス表面に広がるため、十分な水の効果が得られないためであると考えられる。
【０１２３】
【発明の効果】本発明によれば、標本作成者の熟練度にかかわりなく、染色体を明瞭に識別することのできる標本を、再現性よく得ることができる。従って、本発明により作成された標本を用いれば、染色体の検査における所要時間の短縮や、精度の向上などの効果がある。さらに、本発明によれば、細胞分裂の分裂期に応じた選択的標本の調製がある程度可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例１の標本作成用装置の斜視図である。
【図２】 実施例１の標本作成用装置の部分斜視図である。
【図３】 実施例２の標本作成用装置の斜視図である。
【図４】 実施例３の標本作成用装置の斜視図である。
【図５】 細胞の変遷について説明するための、細胞の形態を示す写真である。
【図６】 水の影響を示すための、細胞の形態を示す写真である。
【図７】 水の影響を示すための、細胞の形態を示す写真である。
【図８】 酸および水の影響を示すための、細胞の形態を示す写真である。
【図９】 カルノア液の影響を示すための、細胞の形態を示す写真である。
【図１０】 酸の種類および量の影響を示すための、細胞の形態を示す写真である。
【図１１】 酸と水との混合比の影響を示すための、細胞の形態を示す写真である。
【図１２】 アルコールの種類および量の影響を示すための、細胞の形態を示す写真である。
【図１３】 実施例１、比較例１、および比較例２により得られた標本における、細胞の形態を示す写真である。
【符号の説明】
１１１…細胞拡散用チャンバ、１１２…細胞膜破壊用チャンバ、１１３…細胞懸濁液供給部、１１４…細胞膜破壊液供給部１１４、１１５…細胞膜破壊液保持部、１１６…隔壁、１１７…噴霧ノズル、１１７ａ…酸用噴霧ノズル、１１７ｂ…水用噴霧ノズル、１１８…エアコンプレッサ、１１９…細胞膜破壊液、１１９ａ…酸、１１９ｂ…水、１２０…電源、２１０…筐体、２１１…基板支持部、２１２…基板取付部、２１３…仕切補助板、２１４…隔壁の窓部、２１５…基板取付面、２１６…基板挾持部、３１０…筐体、３１１…細胞懸濁液滴下用ピペット、３１２…細胞膜破壊液滴下用ピペット、３１３…ピペットホルダ、３１４…標本基板。
【特許請求の範囲】
【請求項１】細胞を低張処理する低張工程と、上記低張処理された細胞を、酸とアルコールとの混合溶液中に懸濁させ、細胞懸濁液を得る固定工程と、上記細胞懸濁液を基板上に滴下し、基板上で細胞を拡散させる拡散工程と、上記基板上の細胞懸濁液中の細胞に、水と酸とを作用させる細胞膜破壊工程とを、この順で有することを特徴とする染色体標本の製造方法。
【請求項２】請求項１において、上記細胞膜破壊工程は、上記拡散工程において上記基板上に滴下された細胞懸濁液が流動していない状態で行われることを特徴とする染色体標本の製造方法。
【請求項３】請求項１において、上記細胞膜破壊工程は、上記基板上の細胞懸濁液に、水と酸との混合液を添加することにより、上記細胞に水と酸とを作用させることを特徴とする染色体標本の製造方法。
【請求項４】請求項３において、上記水と酸との混合液の添加は、該混合液の噴霧、または滴下により行われることを特徴とする染色体標本の製造方法。
【請求項５】請求項３において、上記水と酸との混合液の添加は、上記細胞懸濁液を滴下した基板の雰囲気を、該混合液の蒸気とすることにより行われることを特徴とする染色体標本の製造方法。
【請求項６】請求項１において、上記細胞膜破壊工程は、上記基板上の細胞懸濁液に、水と酸とをそれぞれ添加することにより、上記細胞に水と酸とを作用させることを特徴とする染色体標本の製造方法。
【請求項７】請求項６において、上記酸と水との添加は、酸および水を、それぞれ、噴霧または滴下することにより行われることを特徴とする染色体標本の製造方法。
【請求項８】請求項１において、上記酸とアルコールとの混合溶液中のアルコールの体積は、混合溶液全体の３／４以上であることを特徴とする染色体標本の製造方法。
【請求項９】請求項８において、上記酸とアルコールとの混合液中のアルコールの体積は、混合溶液全体の５／６以上であることを特徴とする染色体標本の製造方法。
【請求項１０】請求項１において、上記酸とアルコールとの混合溶液中の酸は、カルボン酸であることを特徴とする染色体標本の製造方法。
【請求項１１】請求項１において、上記細胞膜破壊工程において、細胞に作用させる酸は、カルボン酸であることを特徴とする染色体標本の製造方法。
【請求項１２】請求項１０または１１において、上記カルボン酸は、酢酸、ギ酸、乳酸、酪酸、およびプロピオン酸の内の少なくとも一種であることを特徴とする染色体標本の製造方法。
【請求項１３】請求項１２において、上記カルボン酸は、酢酸であることを特徴とする染色体標本の製造方法。
【請求項１４】請求項１において、上記アルコールは、炭素数１〜３の脂肪族アルコールであることを特徴とする染色体標本の製造方法。
【請求項１５】請求項１４において、上記アルコールは、メタノール、エタノール、プロパノール、およびアリルアルコールの内の少なくとも一種であることを特徴とする染色体標本の製造方法。
【請求項１６】請求項１において、上記細胞膜破壊工程において作用させる酸と水との体積比は、酸：水＝１０：１〜１：１０であることを特徴とする染色体標本の製造方法。
【請求項１７】請求項１６において、上記細胞膜破壊工程において作用させる酸と水との体積比は、酸：水＝１０：１〜１：１であることを特徴とする染色体標本の製造方法。
【請求項１８】請求項１７において、上記細胞膜破壊工程において作用させる酸と水との体積比は、酸：水＝５：１であることを特徴とする染色体標本の製造方法。
【請求項１９】基板を保持するための基板保持部と、上記基板に、あらかじめ定められた量の細胞懸濁液を滴下する細胞懸濁液供給機構と、上記細胞懸濁液の滴下された基板に、酸および水を添加する細胞膜破壊液供給機構とを備えることを特徴とする染色体標本の製造装置。
【請求項２０】請求項１９において、上記細胞膜破壊液供給機構は、液体を噴霧するための噴霧ノズルを備えることを特徴とする染色体標本の製造装置。
【請求項２１】請求項２０において、上記細胞膜破壊液供給機構は、酸と水との混合液を保持するための細胞膜破壊液保持部を、さらに備えることを特徴とする染色体標本の製造装置。
【請求項２２】請求項２０において、上記噴霧ノズルは、少なくとも二つ備えられ、一方は酸の噴霧のためのノズルであり、他方は水の噴霧のためのノズルであることを特徴とする染色体標本の製造装置。
【請求項２３】請求項１９において、上記細胞膜破壊液供給機構は、液体を蒸気にするための機構を備えることを特徴とする染色体標本の製造装置。
【請求項２４】請求項１９において、基板保持部は、細胞懸濁液を供給するためのチャンバと、細胞膜破壊液を供給するためのチャンバとを備えることを特徴とする染色体標本の製造装置。
【請求項１】細胞を低張処理する低張工程と、上記低張処理された細胞を、酸とアルコールとの混合溶液中に懸濁させ、細胞懸濁液を得る固定工程と、上記細胞懸濁液を基板上に滴下し、基板上で細胞を拡散させる拡散工程と、上記基板上の細胞懸濁液中の細胞に、水と酸とを作用させる細胞膜破壊工程とを、この順で有することを特徴とする染色体標本の製造方法。
【請求項２】請求項１において、上記細胞膜破壊工程は、上記拡散工程において上記基板上に滴下された細胞懸濁液が流動していない状態で行われることを特徴とする染色体標本の製造方法。
【請求項３】請求項１において、上記細胞膜破壊工程は、上記基板上の細胞懸濁液に、水と酸との混合液を添加することにより、上記細胞に水と酸とを作用させることを特徴とする染色体標本の製造方法。
【請求項４】請求項３において、上記水と酸との混合液の添加は、該混合液の噴霧、または滴下により行われることを特徴とする染色体標本の製造方法。
【請求項５】請求項３において、上記水と酸との混合液の添加は、上記細胞懸濁液を滴下した基板の雰囲気を、該混合液の蒸気とすることにより行われることを特徴とする染色体標本の製造方法。
【請求項６】請求項１において、上記細胞膜破壊工程は、上記基板上の細胞懸濁液に、水と酸とをそれぞれ添加することにより、上記細胞に水と酸とを作用させることを特徴とする染色体標本の製造方法。
【請求項７】請求項６において、上記酸と水との添加は、酸および水を、それぞれ、噴霧または滴下することにより行われることを特徴とする染色体標本の製造方法。
【請求項８】請求項１において、上記酸とアルコールとの混合溶液中のアルコールの体積は、混合溶液全体の３／４以上であることを特徴とする染色体標本の製造方法。
【請求項９】請求項８において、上記酸とアルコールとの混合液中のアルコールの体積は、混合溶液全体の５／６以上であることを特徴とする染色体標本の製造方法。
【請求項１０】請求項１において、上記酸とアルコールとの混合溶液中の酸は、カルボン酸であることを特徴とする染色体標本の製造方法。
【請求項１１】請求項１において、上記細胞膜破壊工程において、細胞に作用させる酸は、カルボン酸であることを特徴とする染色体標本の製造方法。
【請求項１２】請求項１０または１１において、上記カルボン酸は、酢酸、ギ酸、乳酸、酪酸、およびプロピオン酸の内の少なくとも一種であることを特徴とする染色体標本の製造方法。
【請求項１３】請求項１２において、上記カルボン酸は、酢酸であることを特徴とする染色体標本の製造方法。
【請求項１４】請求項１において、上記アルコールは、炭素数１〜３の脂肪族アルコールであることを特徴とする染色体標本の製造方法。
【請求項１５】請求項１４において、上記アルコールは、メタノール、エタノール、プロパノール、およびアリルアルコールの内の少なくとも一種であることを特徴とする染色体標本の製造方法。
【請求項１６】請求項１において、上記細胞膜破壊工程において作用させる酸と水との体積比は、酸：水＝１０：１〜１：１０であることを特徴とする染色体標本の製造方法。
【請求項１７】請求項１６において、上記細胞膜破壊工程において作用させる酸と水との体積比は、酸：水＝１０：１〜１：１であることを特徴とする染色体標本の製造方法。
【請求項１８】請求項１７において、上記細胞膜破壊工程において作用させる酸と水との体積比は、酸：水＝５：１であることを特徴とする染色体標本の製造方法。
【請求項１９】基板を保持するための基板保持部と、上記基板に、あらかじめ定められた量の細胞懸濁液を滴下する細胞懸濁液供給機構と、上記細胞懸濁液の滴下された基板に、酸および水を添加する細胞膜破壊液供給機構とを備えることを特徴とする染色体標本の製造装置。
【請求項２０】請求項１９において、上記細胞膜破壊液供給機構は、液体を噴霧するための噴霧ノズルを備えることを特徴とする染色体標本の製造装置。
【請求項２１】請求項２０において、上記細胞膜破壊液供給機構は、酸と水との混合液を保持するための細胞膜破壊液保持部を、さらに備えることを特徴とする染色体標本の製造装置。
【請求項２２】請求項２０において、上記噴霧ノズルは、少なくとも二つ備えられ、一方は酸の噴霧のためのノズルであり、他方は水の噴霧のためのノズルであることを特徴とする染色体標本の製造装置。
【請求項２３】請求項１９において、上記細胞膜破壊液供給機構は、液体を蒸気にするための機構を備えることを特徴とする染色体標本の製造装置。
【請求項２４】請求項１９において、基板保持部は、細胞懸濁液を供給するためのチャンバと、細胞膜破壊液を供給するためのチャンバとを備えることを特徴とする染色体標本の製造装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図１０】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図１０】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開平８−１８４５３９
【公開日】平成８年（１９９６）７月１６日
【国際特許分類】
【出願番号】特願平６−３３９０２０
【出願日】平成６年（１９９４）１２月２８日
【出願人】（０００００４１１２）株式会社ニコン (12,601)
【公開日】平成８年（１９９６）７月１６日
【国際特許分類】
【出願日】平成６年（１９９４）１２月２８日
【出願人】（０００００４１１２）株式会社ニコン (12,601)
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