核酸分析装置
【課題】本発明の目的は、予め解析対象となる生体分子を表面に固定しておいた担体の濃度に、微細流路中で勾配を生じさせ、支持基体表面に高濃度の担体を供給しすることで、担体の固定化効率を向上させた核酸分析装置に関する。
【解決手段】本発明は、担体を固定する基板と、基板上に流路を形成する反応チャンバーを備え、微細流路中において解析対象分子を保持した担体の濃度に、慣性力・電磁気力等を用いて勾配を生じさせる構造を有する、核酸分析装置に関する。本発明により、担体の固定化反応を起こす基板の表面における担体濃度を高め、効率の良い固定化反応を行うことができ、結果、固定化反応時間の短縮と使用サンプル量の低減を図ることができる。
【解決手段】本発明は、担体を固定する基板と、基板上に流路を形成する反応チャンバーを備え、微細流路中において解析対象分子を保持した担体の濃度に、慣性力・電磁気力等を用いて勾配を生じさせる構造を有する、核酸分析装置に関する。本発明により、担体の固定化反応を起こす基板の表面における担体濃度を高め、効率の良い固定化反応を行うことができ、結果、固定化反応時間の短縮と使用サンプル量の低減を図ることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微粒子に固定された生体分子の検出、並びに分析を行うために用いる核酸分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡやＲＮＡの塩基配列を決定する新しい技術が開発されてきている。
【０００３】
旧来、塩基配列の決定には電気泳動を利用した方法が用いられており、予め配列決定用のＤＮＡ断片又はＲＮＡ試料から逆転写反応を行い合成したｃＤＮＡ断片試料を調製し、周知のサンガー法によるジデオキシ反応を実行した後、電気泳動を行い、分子量分離展開パターンを計測して解析していた。
【０００４】
これに対し昨今、基板に試料となるＤＮＡ断片を数多く固定して、パラレルに数多くの断片の配列情報を決定する方法が開発され、塩基解析速度は飛躍的に向上した。
【０００５】
例えば、非特許文献１では、ＤＮＡ断片を担持する担体として微粒子を用い、核酸を結合させた微粒子をガラス基板上にランダムに固定することで、平面状に複数のサンプルを展開し、二次元画像センサを用いて測定することで多数のサンプルを平行して解析している。
【０００６】
また近年では、更に塩基解読のスループットや解析結果の精度を高める目的で、担体を固定させる部位を限定する技術も開発されている。
【０００７】
例えば特許文献１では、解析対象の担体の配置が、二次元画像センサの画素配置に適した形態となるように、担体の固定に用いる足場を基板上に規則的に設置している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００８−１９０９３７号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Science 2005, VOL. 309, pp.1728-1732
【非特許文献２】P.N.A.S. 2006, vol. 103, pp 19635-19640
【非特許文献３】Nanotechnology, 2007, vol. 18, pp 044017-044021
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
解析対象となる担体の固定化は、基板表面の官能基と担体上の官能基との反応によって起こるものであり、固定化には両者の接触が必須となる。
【００１１】
しかしながら、特許文献１には、微粒子を基板上に投入した場合、微粒子が接触しないサイトが出てくる可能性がある。
【００１２】
本発明はこの課題を解決するためのものであり、その目的は、担体をなるべく高い確率で基板上に接触させる、核酸分析装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の核酸分析装置は、基板上の目的物質の解析を行う核酸分析装置であって、目的物質を結合させた担体を固定する基板と、基板との間に第一の流路と、反応領域とを形成する封止部材と、封止部材中に形成され第一の流路と連続した第二の流路と、を有し、第一の流路と第二の流路の構造がなす角度が５度〜９０度である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、基板表面における担体の局所的な濃度が向上することで、効率の良い固定化反応を行うことができる。結果、固定化反応時間の短縮と使用サンプル量の低減を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】本発明の核酸分析用反応デバイスの構成の一例を説明するための図である。
【図１Ｂ】本発明の核酸分析用反応デバイスの構成の一例を説明するための図である。
【図１Ｃ】本発明の核酸分析用反応デバイスの構成の一例を説明するための図である。
【図２Ａ】本発明の核酸分析用反応デバイスの構成の一例を説明するための図である。
【図２Ｂ】本発明の核酸分析用反応デバイスの構成の一例を説明するための図である。
【図３】本発明の核酸分析用反応デバイスの構成の一例を説明するための図である。
【図４】本発明の核酸分析用反応デバイスを用いた装置の構成の一例を説明するための図である。
【図５】本発明の核酸分析用反応デバイスに用いる固定化反応基板の構成の一例を説明するための図である。
【図６】本発明の核酸分析用反応デバイスに用いる固定化反応基板の作成方法の一例を説明するための図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の実施形態について、図を参照して説明する。
【００１７】
〔実施例１：担体の慣性力を用いた濃度勾配の作成〕
本発明の核酸分析反応用デバイスについて、図１Ａ〜図１Ｃを用いて説明する。固定基板１０１の上に凹みを有する流路基板（封止部材）１０２を張り合わせることで、流入口１０３と流出口１０４の少なくとも二箇所以上の開口部を有し、固定基板１０１へ溶液を供給する流路系が形成される。流入口より核酸を固定した担体（微粒子，ビーズとも称する）１０５を含んだ溶液をポンプ１０６で送液する。
【００１８】
ここで、微細流路は、固定基板１０１を含む平面と平行な流路（微細流路）１０７と固定基板１０１を含む平面と交差する流路１０８を有しており、その交わる曲げ部１０９において担体１０５は自身の慣性力によって流路外周部へと濃縮される。基板と平行な流路内部は層流状態にあり、曲げ部１０９で形成された濃度勾配を保ったまま固定化反応の場である固定基板１０１表面へと供給する。
【００１９】
固定基板１０１の材質としては、ガラス基板，サファイア基板，シリコン基板などの無機物質からなる基板，ステンレスなどの金属からなる基板，ポリメタクリル酸メチル樹脂，ポリカーボネート樹脂，シクロオレフィン樹脂などの有機物質からなる基板を用いることができる。
【００２０】
流路基板１０２の材質に特に制限はないが１mm以下の加工が可能な材質と加工法の組み合わせが望まれる。例えば、ポリメタクリル酸メチル樹脂やシクロオレフィン樹脂などの熱可塑性樹脂への射出成型やナノインプリント加工，ＵＶ硬化樹脂を用いた光インプリント，シリコンや石英，ガラスなどへのフォトリソグラフィとエッチングを組み合わせた加工，ＰＤＭＳなどの熱硬化性樹脂を金型に流し硬化させる加工法などがある。
【００２１】
固定基板１０１と流路基板１０２との張り合わせには、ガラス同士，ガラスとＰＤＭＳ，ＰＤＭＳ同士であれば、酸素プラズマ処理やエキシマＵＶ照射を行った後に張り合わせることで両者を強固に接合させることができる。また、一方が熱可塑性樹脂基板の場合は、ガラス転移温度まで加熱することで溶着することが可能である。
【００２２】
流路基板１０２内部に形成された固定基板１０１を含む平面と交差する流路１０８は、内部の流れが層流となるように十分に微細かつ長さを有するものとする。具体的には、流路断面積４mm2以下、長さ１mm以上が望ましいが、内部流体のレイノルズ数が２３００以下となり、層流支配な環境となるのであれば、これに限らない。
【００２３】
固定基板１０１と平行な微細流路１０７の長さは短いほうが好ましい。本発明の実施形態としては１００mm以下が好ましく、１０mm以下がより好ましい。また、基板と平行な微細流路１０７は必須ではなく、固定反応部１１０と縦方向の流路１０８を直接連結させる構造であってもかまわない。基板と平行な微細流路１０７の長さを短くすることで、曲げ部から固定基板１０１に溶液が到達する時間を短縮することができ、担体濃度勾配の拡散による解消を防ぐことができる。
【００２４】
固定基板１０１を含む平面とそれと交差する流路１０８の交差角度は、１度以上であればよいがより好ましくは５度〜１７５度、さらに好ましくは９０度の角度で交わることが望ましい。曲げ部において急激な方向変化をつけることで、担体にかかる慣性力の方向と流体の流れの方向との齟齬が大きくなり、より大きな担体濃度勾配を生むことができる。
【００２５】
固定基板１０１を含む平面と交差する流路１０８は、反応部よりも流入口側にと流出口側両方に存在することが望ましいが、一方であってもかまわない。
【００２６】
担体溶液を送液するポンプに特に指定はないが、往復送液が可能な機構を有するものが好ましい。往復送液を行うことで、復路時にも曲げ部１０９（排出口側）で担体濃度を高めた溶液を固定基板１０１表面に供給することができる。これによって、担体１０５の利用効率を向上することが可能となる。また反応に時間が掛かり担体の濃度勾配が拡散によって解消されてしまった場合も、往復送液を継続して行うことで、常に固定基板１０１近傍の担体濃度を高い状態に維持することができる。
【００２７】
本発明において、担体１０５と固定基板１０１との間の結合に制約はないが、例えばビオチンとアビジンの親和性や静電相互作用，疎水相互作用，共有結合，物理的な捕捉などを挙げることができる。いずれの手法も担体と基板が影響を及ぼしうる距離に存在する時に起こる確立依存の現象であり、効果範囲に存在する担体濃度を向上させることで、担体の固定率・基板の単位面積あたりの担体固定量を共に向上させることができる。
【００２８】
〔実施例２：電場による濃度勾配の形成〕
担体２０１がツェータ電位を有する場合、実施例１を構成する要素の微細流路曲げ部１０９の代わりに、微細流路２０２中の流体の流れと直交する位置に電極対２０３を設置し、電圧を印加することで担体の濃度勾配を作り出すことができる。この実施例について図２Ａ，図２Ｂを用いて説明する。
【００２９】
例えば、担体が微粒子であり負のツェータ電位を有する場合、固定基板側の電極対２０３に正電荷を遠位側の電極に負電荷を印加することで、正極側（つまり基板表面側）の担体濃度を高めることができる。この電場によって形成された、濃度勾配を有した担体溶液は実施例１と同様に固定反応基板２０４に供給され、効率的な固定化反応を行うことができる。
【００３０】
電極対２０３の位置は、流路内である必要はなく、流体の流れに直交する電場を形成できるように流路に沿って設置されていれば良い。電極を微細流路２０２の外に設置することで担体分散液の電気分解を防ぎつつ担体の濃度勾配を作り出すことができる。
【００３１】
電極に印加する電圧は一定電圧であってもかまわないが、経時的に変化するものであってもかまわない。担体溶液中に含まれる担体２０１の濃度が希薄な場合には、強い電場をかけ担体を電極周囲に付着させ、溶液から分離させることで、担体濃度を増加させることができる。この工程により、たとえ希薄な担体溶液しか得られずとも、固定化反応に利用することができる。
【００３２】
また電場の強度だけでなく電荷の正負の方向も変化させてかまわない。この際の担体２０１は、正負いずれのツェータ電位を有していても良く、電極対２０３に印加する電圧を切り替えることで、幅広い種類の担体や溶液環境（ｐＨ・塩濃度など）に対応することができる。
【００３３】
また図２Ｂに示すように、微細流路２０２を通る担体溶液中に核酸と結合した担体２０５と核酸を結合していない担体２０６とが含まれる場合、固定反応基板２０４側に正の電荷を印加することで、核酸は負の電荷を有しているため核酸と結合した担体２０５を優先的に濃縮することができる。すなわち、固定反応基板２０４の単位面積あたりの核酸固定濃度を向上させることができる。
【００３４】
〔実施例３：磁場による濃度勾配の作成〕
磁性担体３０１を用いる場合、実施例２を構成する要素の電極対２０３の代わりに、磁力源３０２（永久磁石または電磁石）を設置し、磁場によって担体の濃度勾配を作り出すことができる。この実施例について図３を用いて説明する。この磁力源３０２を微細流路３０３の固定反応基板３０４側に設けることで、固定反応基板３０４表面側の担体濃度を高めることができる。この磁場によって形成された、濃度勾配を有した担体溶液は実施例１と同様に固定反応基板３０４に供給され、効率的な固定化反応を行うことができる。
【００３５】
微細流路３０３中での磁場の強度は、一定でもかまわないが任意に調整可能な機構を備えることが望ましい。すなわち、永久磁石を用いる場合であれば流路からの距離を可変とし、またあるいは微細流路３０３と磁力源３０２との間に磁気遮蔽物を挿入可能な構造とする。磁力源が電磁石の場合は、前述の永久磁石の場合に加えて電流量を制御することで、磁場の強度をコントロールできる。これにより磁性担体３０１密度に応じた適切な磁力設定が可能となる。
【００３６】
磁力源３０２の位置は、固定反応基板３０４の直下であってもかまわないが、微細流路３０３上に設置することがより好ましい。磁力源３０２を固定反応基板３０４の直下に設ける場合は、担体固定密度の斑を避けるために、広い面積で均一な磁場を発生させる必要があるが、磁力源の位置を微細流路３０３にすることで、均一な磁場を要求する面積を小さくすることができ、磁力源の簡素化とコスト減少につながる。
【００３７】
〔実施例４〕
本実施例では、核酸分析デバイスを用いた核酸分析装置の好ましい構成の一例について図４を参照しながら説明する。
【００３８】
本実施例の核酸分析装置は、核酸分析デバイスに対して、蛍光色素を有するヌクレオチド，核酸合成酵素、及び核酸試料を供給する手段と、核酸分析デバイスに光を照射する手段と、核酸分析デバイス上においてヌクレオチド，核酸合成酵素、及び核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する発光検出手段と、を備える。より具体的には、流路基板４０１と固定化基板４０２と溶液交換用口である注入口４０３と排出口４０４から構成される前記のデバイス４０５を設置する。なお、流路基板４０１には、ＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）を使用する。ＹＡＧレーザ光源（波長５３２ｎｍ，出力２０ｍＷ）４０７およびＹＡＧレーザ光源（波長３５５ｎｍ，出力２０ｍＷ）４０８から発振するレーザ光４０９および４１０を、レーザ光４０９のみをλ／４板４１１によって円偏光し、ダイクロイックミラー４１２（４１０ｎｍ以下を反射）によって、前記２つのレーザ光を同軸になるよう調整した後、レンズ４１３によって集光し、その後、プリズム４１４を介してデバイス４０５へ臨界角以上で照射する。
【００３９】
以下、担体として直径５０ｎｍ程度の金微粒子を用いた場合を例にとり、説明する。この場合、レーザ照射により、固定化基板４０２表面上に存在する金微粒子において局在型表面プラズモンが発生し、金微粒子に結合したＤＮＡプローブにより捕捉された標的物質の蛍光体は蛍光増強場内に存在することになる。蛍光体はレーザ光で励起され、その増強された蛍光の一部は流路基板４０１の一部に設けられた検出窓４０６を介して出射される。また、検出窓４０６より出射される蛍光は、対物レンズ４１５（×６０，ＮＡ１.３５，作動距離０.１５mm）により平行光束とされ、光学フィルタ４１６により背景光及び励起光が遮断され、結像レンズ４１７により２次元ＣＣＤカメラ４１８上に結像される。
【００４０】
逐次反応方式の場合には、蛍光色素付きヌクレオチドとして、P.N.A.S. 2006, vol. 103, pp 19635-19640（非特許文献２）に開示されているような、リボースの３′ＯＨの位置に３′−Ｏ−アリル基を保護基として入れ、また、ピリミジンの５位の位置にあるいはプリンの７位の位置にアリル基を介して蛍光色素と結びつけたものが使用できる。アリル基は光照射（例えば波長３５５ｎｍ）あるいはパラジウムと接触することで切断されるため、色素の消光と伸長反応の制御を同時に達成することができる。逐次反応でも、未反応のヌクレオチドを洗浄で除去する必要はない。さらに、洗浄工程が必要ないことからリアルタイムで伸長反応を計測することも可能である。この場合には、前記ヌクレオチドにおいて、リボースの３′ＯＨの位置に３′−Ｏ−アリル基を保護基として入れる必要は無く、光照射（例えば波長３５５ｎｍ）で切断可能な官能基を介して色素と結びついているヌクレオチドを用いれば良い。
【００４１】
担体として、半導体微粒子を用いた場合にも、上述の核酸分析装置の例は適用可能である。例えば、半導体微粒子としてQdot（Ｒ）565 conjugate（インビトロジェン社製）を用いると、ＹＡＧレーザ光源（波長５３２ｎｍ，出力２０ｍＷ）４０７で十分に励起できる。この励起エネルギーは５３２ｎｍの光では励起されないアレクサ６３３（インビトロジェン社製）へ移動することにより蛍光を発するようになる。つまり、未反応のヌクレオチドに付随する色素は励起されることはなく、ＤＮＡプローブに捕捉され半導体微粒子に近接しエネルギー移動が起きてはじめて発光するので、捕捉されたヌクレオチドを蛍光測定で識別することが可能である。
【００４２】
上記のように、本実施例の核酸分析デバイスを用いて核酸分析装置を組み上げることにより核酸と結合した担体の固定化効率を高め、固定化時間の短縮，使用サンプル量の低減を図ることができる。
【００４３】
〔実施例５〕
本発明に用いる固定化基板について、その好ましい構成の一例を、図５を用いて説明する。
【００４４】
平滑支持基板５０１の上に接着パッド５０２が規則正しく、例えば図５に示すように格子状に形成されている。接着パッド５０２と微粒子５０３は、線状分子５０５を介して化学結合により結ばれている。線状分子５０５の末端の官能基５０６と、接着パッド５０２とは化学的相互作用により結合していることが好ましい。その際、官能基５０６は、平滑支持基板５０１との相互作用が弱く、接着パッド５０２との相互作用が強いことが好ましい。このような観点から、平滑基板としては、石英ガラス，サファイア，シリコン基板などを用いることができる。また、接着パッド５０２には、金，チタン，ニッケル，アルミから選ばれる材料で構成することができる。官能基５０６には、平滑支持基板５０１と接着パッド５０２との組み合わせを考えて選択せねばならないが、例えば、スルホヒドリル基，アミノ基，カルボキシル基，リン酸基，アルデヒド基等を用いることができる。線状分子５０５は、微粒子５０３と接着パッド５０２を結ぶ役割を果たし、長さに大きな限定はないが、低分子の場合には炭素数にして３から２０程度の直鎖状分子が好ましい。線状分子５０５の末端の官能基５０７は、微粒子５０３との接着性をもたらす。また、線状分子５０５として高分子を用いる場合には、複数の側鎖を有し、官能基５０６を有する側鎖と官能基５０７を持つ側鎖を併せ持つものを用いることができる。微粒子５０３としては、金属微粒子や半導体微粒子を用いることができる。例えば、金の微粒子として、直径５ｎｍ〜１００ｎｍのものが市販されており、活用することができる。また、半導体微粒子としては、直径が１０ｎｍ〜２０ｎｍ程度のＣｄＳｅ等の化合物半導体が市販されており、活用することができる。官能基５０７として用いることができる官能基は、微粒子の種類によって異なるが、例えば金微粒子を用いた場合にはスルホヒドリル基，アミノ基等が好ましい。半導体微粒子を用いる場合には、ストレプトアビジンで表面が修飾された微粒子が市販されており、官能基５０７としてビオチンを用いることができる。核酸分子５０４には、ＤＮＡやＲＮＡの核酸分子を用いることができる。核酸分子の末端を官能基５０７と同様に予め修飾しておき、微粒子５０３と反応させておく。また、解析対象となる核酸分子と相補な領域を持つ核酸を微粒子５０３へ官能基５０７を介して結合させておき、ハイブリダイゼーションによって核酸分子５０４を微粒子５０３に結合させても良い。この相補領域を持つ核酸としてオリゴｄＴを用いることで、幅広くｍＲＮＡを捕捉することができる。一つの微粒子５０３に固定する核酸分子５０４は、一分子であることが好ましい。一つの微粒子５０３に一分子の核酸分子５０４を固定するためには、微粒子５０３の粒径が小さいほど好ましい。一つの核酸分子が微粒子表面に固定されると、微粒子上の電荷の状態が変化して、他の未固定の核酸分子の固定反応を阻害する効果が生じる。微粒子サイズが小さくなると、この効果が大きくなるからである。発明者らが鋭意検討した結果、微粒子サイズとして約２０ｎｍ以下が好ましいことが判明している。また、微粒子５０３と核酸分子５０４との結合反応を液相で行い、かつ、微粒子５０３に対して核酸分子５０４の濃度を約１／１０以下に下げて反応させることで、微粒子５０３の直径が１μｍ程度であっても、一つの微粒子５０３に固定する核酸分子５０４を一分子とすることができる。一方、微粒子５０３のサイズが大きくなるに従い、核酸分子５０４の固定密度が低下してしまう。簡便な蛍光検出で輝点を識別する場合回折限界を考慮すると輝点間が１μｍ程度離れていることが好ましい。したがって、微粒子５０３のサイズは１μｍ以下であることが適している。
【００４５】
接着パッド５０２を平滑支持基板５０１上に形成する方法としては、半導体で既に実用化されている薄膜プロセスを活用することができる。例えば、マスクを通した蒸着・スパッタリング、あるいは蒸着・スパッタリングにより薄膜を形成した後、ドライあるいはウエットエッチングにより製造することができる。規則正しく配置することは、薄膜プロセスを用いることで容易に実現できる。パッド間の間隔は任意に設定できるが、検出手段として光計測を行う場合、光検出の回折限界を考えると５００ｎｍ以上が好ましい。
【００４６】
接着パッド５０２を平滑支持基板５０１上に形成した後、微粒子５０３と接着パッド５０２を結ぶ線状分子５０５を供給し、接着パッド５０２上に線状分子５０５を固定する。この際、平滑支持基板５０１上での非特異的吸着を防止する目的で、線状分子５０５を供給する前に、平滑支持基板５０１との接着力の強い材料を平滑支持基板５０１上に反応させる方法が有効である。例えば、シランカップリング剤等が利用できる。次に固定基板と流路基板を張り合わせ、核酸分子５０４を表面に固定させた微粒子５０３を基板上に供給して、微粒子５０３を接着パッド５０２上に固定させることにより、分析に用いることができる。
【００４７】
接着パッド５０２上に微粒子５０３を固定させる際、一つの接着パッド５０２に複数個の微粒子５０３が固定される可能性がある。複数個が固定されてしまうと、種類の違う核酸断片の情報が重なり合ってしまい、正確な核酸分析ができなくなってしまう。そのため、一つの接着パッド５０２には、１個の微粒子５０３を固定させねばならない。そこで、発明者らは、種々の条件での固定実験を繰り返し、鋭意検討した結果、接着パッド５０２の直径ｄが微粒子５０３の直径Ｄに比べて小さい、という条件が成り立てば、一つの接着パッド５０２に１個の微粒子５０３を固定できることを見出した。接着パッド５０２に比べて同等以上の大きさの微粒子５０３が固定されると、未反応の線状分子が固定された微粒子に覆い隠されてしまい、別の微粒子と反応できなくなってしまうものと説明される。１個の微粒子５０３に核酸分子５０４を一分子固定するには、微粒子５０３の直径Ｄが２０ｎｍ以下であることが好ましいことから、接着パッド５０２の直径ｄは２０ｎｍ以下であることが好ましい。さらに、鋭意検討を続けた結果、微粒子５０３がその表面に電荷を有する場合には、微粒子間に静電的な反発力が働くため、接着パッド５０２の直径ｄが微粒子５０３の直径Ｄに比べて大きい場合にも接着パッドあたりの固定微粒子数が１個になることが判明した。したがって、微粒子５０３の表面電荷が小さく静電反発力が弱い場合には、接着パッド５０２の直径ｄが微粒子５０３の直径Ｄに比べて小さいことが好ましく、微粒子５０３の表面電荷が大きく静電反発力が強い場合には、接着パッド５０２の直径ｄは必ずしも微粒子５０３の直径Ｄよりも小さくなくても良いことが明らかとなった。
【００４８】
本実施例の核酸分析デバイスを用いて、核酸試料に関する情報を検出するやり方にはいくつかの方式が考えられるが、感度や簡便性の観点から蛍光検出法を用いる方式が好ましい。まず、試料となる核酸分子５０４を補足した微粒子を流路基板と固定基板とを張り合わせて作製した核酸分析反応デバイスに供給し、固定基板表面に微粒子を固定化する。次に、蛍光色素を有するヌクレオチドと核酸合成酵素を供給する。デバイス上で核酸伸長反応を起こし、伸長反応中に核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光測定を行う。この場合、ヌクレオチドの一種類を供給，未反応ヌクレオチドの洗浄，蛍光観察，違う種類のヌクレオチドの供給、以降を繰り返し行う、いわゆる逐次伸長反応方式は容易に実現できる。蛍光観察後に蛍光色素を消光するか、蛍光色素がリン酸部位に付いたヌクレオチドを用いることにより、連続的な反応を起こし、核酸試料の塩基配列情報を得ることができる。一方、４種類のヌクレオチドが各々異なる蛍光色素を有すものを供給し、洗浄することなく、連続的な核酸伸長反応を起こし、連続的に蛍光観察を行うことで、いわゆるリアルタイム反応方式を実現することもできる。この場合、蛍光色素がリン酸部位に付いたヌクレオチドを用いると、伸長反応後リン酸部位が切断されるため、消光することなく連続的に蛍光測定して核酸試料の塩基配列情報を得ることができる。
【００４９】
微粒子として、可視域で局在プラズモンを励起することが可能な、金，銀，白金，アルミニウム等の直径が１００ｎｍ程度以下の微粒子を用いることにより、蛍光を増強して観察することができる。金微粒子の表面プラズモンによる蛍光増強の現象については、例えば、Nanotechnology, 2007, vol. 18, pp 044017-044021（非特許文献３）に報告されている。ヌクレオチドに付いた蛍光色素の蛍光を増強させて測定することができ、信号／ノイズを高くすることができる。
【００５０】
微粒子として、半導体微粒子を用いた場合には、半導体微粒子を外部光源の光で励起しておき、取り込まれたヌクレオチドに付随する蛍光色素にその励起エネルギーを移動させることにより、個々の蛍光色素の蛍光を観察することもできる。この場合、励起光源は半導体微粒子のみを励起すればよく、一種類の光源でよい点で好ましい。
【００５１】
微粒子として、高分子材料からなる微粒子を用いた場合には、微粒子の粒径を揃えることができ、粒径の大きさも数十ｎｍから数μｍまで幅広く選択することができる。また、高分子材料が有する官能基を足場に表面修飾を施すことで、微粒子表面に固定する核酸分子５０４の固定反応のための官能基の導入量を均一にすることができるという点で好ましい。特に、核酸分子５０４を一分子だけ微粒子表面に固定する場合、固定率の再現性が非常に高く、好ましい。
【００５２】
この本構成例のように、基板上における担体の接着部位を制限することで、担体の結合可能な基板上の面積が減少し、担体の結合効率が低下してしまうが、本発明の特徴とする流路中の担体濃度に勾配を生じさせる流路基板と組み合わせることで、基板表面の担体濃度を高め、固定反応の効率の低下を抑えることができる。
【００５３】
〔実施例６〕
実施例５で示した固定化基板の製造方法の一例を、図６を用いて説明する。平滑な支持基体６０１上に電子線用ポジ型レジスト６０２をスピンコート法により塗工する。平滑な支持基体としては、ガラス基板，サファイア基板，シリコンウエハ等が用いられる。デバイスとしたときに、微粒子を配列した面と反対側の裏面より励起光を照射する必要がある場合には、光透過性に優れた石英基板やサファイア基板を用いればよい。電子線用ポジ型レジストとしては、例えば、ポリメチルメタクリレートやＺＥＰ−５２０Ａ（日本ゼオン社製）を挙げることができる。基板上のマーカーの位置を用いて位置合わせを行ったうえ電子線直描露光を行って、レジストにスルーホールを形成する。例えば、直径１５ｎｍのスルーホールを形成する。スルーホールは並行処理で解析できる核酸の分子数に依存するが、１μｍ程度のピッチで形成することが、製造上の簡便さ，歩留まりの高さ、及び並行処理で解析できる核酸の分子数を勘案すると適している。スルーホール形成領域も、並行処理で解析できる核酸の分子数によるが、検出装置側の位置精度や位置分解能にも大きく依存する。例えば、１μｍピッチで反応サイト（微粒子）を構成した場合、スルーホール形成領域を１mm×１mmとすると、１００万反応サイトを形成できる。スルーホールを形成後、接着用パッド６０３を構成する材料、例えば、金，チタン，ニッケル，アルミ、をスパッタリングで製膜する。平滑な支持基体としてガラス基板，サファイア基板を用い、接着用パッド材料として金，アルミ，ニッケルを用いる場合には、基板材料と接着用パッド材料との間に接着を補強する意味でチタンやクロムの薄膜を入れることが好ましい。次に、接着用パッド６０３に線状分子６０４を反応させる。接着用パッド６０３が金，チタン，アルミ，ニッケルの場合には、線状分子末端の官能基６０５としては、各々、スルホヒドニル基，リン酸基，リン酸基，チアゾール基を用いることが好ましい。線状分子の反対側の官能基６０６には、例えばビオチンを用いることができる。線状分子を接着用パッドと反応させた後、レジストを剥離する。レジストを剥離後、接着用パッドを形成した以外の平滑基板表面に非特異吸着防止処理を施す。蛍光色素付きヌクレオチドに対する吸着防止を実現するには負の電荷を帯びた官能基を有する非特異吸着防止用分子６０７でコートする。例えば、エポキシシランを表面にスピンコートで塗工し、加熱処理後、弱酸性溶液（ｐＨ５〜ｐＨ６程度）で処理することにより、エポキシ基を開環させＯＨ基を表面に導入することで非特異吸着防止効果をもたらすことができる。
【符号の説明】
【００５４】
１０１ 固定基板
１０２，４０１ 流路基板
１０３ 流入口
１０４ 流出口
１０５，２０１ 担体
１０６ ポンプ
１０７，２０２，３０３ 微細流路
１０８，１１１ 流路
１０９ 曲げ部
１１０ 固定反応部
２０３ 電極対
２０４，３０４ 固定反応基板
２０５ 核酸と結合した担体
２０６ 核酸と結合していない担体
３０１ 磁性担体
３０２ 磁力源
３０５ 磁気遮蔽物
４０２ 固定化基板
４０３ 注入口
４０４ 排出口
４０５ デバイス
４０６ 検出窓
４０７，４０８ ＹＡＧレーザ光源
４０９，４１０ レーザ光
４１１ λ／４板
４１２ ダイクロイックミラー
４１３ レンズ
４１４ プリズム
４１５ 対物レンズ
４１６ 光学フィルタ
４１７ 結像レンズ
４１８ ２次元ＣＣＤカメラ
５０１ 平滑支持基板
５０２ 接着パッド
５０３ 微粒子
５０４ 核酸分子
５０５，６０４ 線状分子
５０６，５０７，６０５，６０６ 官能基
６０１ 平滑な支持基体
６０２ 電子線用ポジ型レジスト
６０３ 接着用パッド
６０７ 非特異吸着防止用分子
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微粒子に固定された生体分子の検出、並びに分析を行うために用いる核酸分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡやＲＮＡの塩基配列を決定する新しい技術が開発されてきている。
【０００３】
旧来、塩基配列の決定には電気泳動を利用した方法が用いられており、予め配列決定用のＤＮＡ断片又はＲＮＡ試料から逆転写反応を行い合成したｃＤＮＡ断片試料を調製し、周知のサンガー法によるジデオキシ反応を実行した後、電気泳動を行い、分子量分離展開パターンを計測して解析していた。
【０００４】
これに対し昨今、基板に試料となるＤＮＡ断片を数多く固定して、パラレルに数多くの断片の配列情報を決定する方法が開発され、塩基解析速度は飛躍的に向上した。
【０００５】
例えば、非特許文献１では、ＤＮＡ断片を担持する担体として微粒子を用い、核酸を結合させた微粒子をガラス基板上にランダムに固定することで、平面状に複数のサンプルを展開し、二次元画像センサを用いて測定することで多数のサンプルを平行して解析している。
【０００６】
また近年では、更に塩基解読のスループットや解析結果の精度を高める目的で、担体を固定させる部位を限定する技術も開発されている。
【０００７】
例えば特許文献１では、解析対象の担体の配置が、二次元画像センサの画素配置に適した形態となるように、担体の固定に用いる足場を基板上に規則的に設置している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００８−１９０９３７号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Science 2005, VOL. 309, pp.1728-1732
【非特許文献２】P.N.A.S. 2006, vol. 103, pp 19635-19640
【非特許文献３】Nanotechnology, 2007, vol. 18, pp 044017-044021
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
解析対象となる担体の固定化は、基板表面の官能基と担体上の官能基との反応によって起こるものであり、固定化には両者の接触が必須となる。
【００１１】
しかしながら、特許文献１には、微粒子を基板上に投入した場合、微粒子が接触しないサイトが出てくる可能性がある。
【００１２】
本発明はこの課題を解決するためのものであり、その目的は、担体をなるべく高い確率で基板上に接触させる、核酸分析装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の核酸分析装置は、基板上の目的物質の解析を行う核酸分析装置であって、目的物質を結合させた担体を固定する基板と、基板との間に第一の流路と、反応領域とを形成する封止部材と、封止部材中に形成され第一の流路と連続した第二の流路と、を有し、第一の流路と第二の流路の構造がなす角度が５度〜９０度である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、基板表面における担体の局所的な濃度が向上することで、効率の良い固定化反応を行うことができる。結果、固定化反応時間の短縮と使用サンプル量の低減を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】本発明の核酸分析用反応デバイスの構成の一例を説明するための図である。
【図１Ｂ】本発明の核酸分析用反応デバイスの構成の一例を説明するための図である。
【図１Ｃ】本発明の核酸分析用反応デバイスの構成の一例を説明するための図である。
【図２Ａ】本発明の核酸分析用反応デバイスの構成の一例を説明するための図である。
【図２Ｂ】本発明の核酸分析用反応デバイスの構成の一例を説明するための図である。
【図３】本発明の核酸分析用反応デバイスの構成の一例を説明するための図である。
【図４】本発明の核酸分析用反応デバイスを用いた装置の構成の一例を説明するための図である。
【図５】本発明の核酸分析用反応デバイスに用いる固定化反応基板の構成の一例を説明するための図である。
【図６】本発明の核酸分析用反応デバイスに用いる固定化反応基板の作成方法の一例を説明するための図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の実施形態について、図を参照して説明する。
【００１７】
〔実施例１：担体の慣性力を用いた濃度勾配の作成〕
本発明の核酸分析反応用デバイスについて、図１Ａ〜図１Ｃを用いて説明する。固定基板１０１の上に凹みを有する流路基板（封止部材）１０２を張り合わせることで、流入口１０３と流出口１０４の少なくとも二箇所以上の開口部を有し、固定基板１０１へ溶液を供給する流路系が形成される。流入口より核酸を固定した担体（微粒子，ビーズとも称する）１０５を含んだ溶液をポンプ１０６で送液する。
【００１８】
ここで、微細流路は、固定基板１０１を含む平面と平行な流路（微細流路）１０７と固定基板１０１を含む平面と交差する流路１０８を有しており、その交わる曲げ部１０９において担体１０５は自身の慣性力によって流路外周部へと濃縮される。基板と平行な流路内部は層流状態にあり、曲げ部１０９で形成された濃度勾配を保ったまま固定化反応の場である固定基板１０１表面へと供給する。
【００１９】
固定基板１０１の材質としては、ガラス基板，サファイア基板，シリコン基板などの無機物質からなる基板，ステンレスなどの金属からなる基板，ポリメタクリル酸メチル樹脂，ポリカーボネート樹脂，シクロオレフィン樹脂などの有機物質からなる基板を用いることができる。
【００２０】
流路基板１０２の材質に特に制限はないが１mm以下の加工が可能な材質と加工法の組み合わせが望まれる。例えば、ポリメタクリル酸メチル樹脂やシクロオレフィン樹脂などの熱可塑性樹脂への射出成型やナノインプリント加工，ＵＶ硬化樹脂を用いた光インプリント，シリコンや石英，ガラスなどへのフォトリソグラフィとエッチングを組み合わせた加工，ＰＤＭＳなどの熱硬化性樹脂を金型に流し硬化させる加工法などがある。
【００２１】
固定基板１０１と流路基板１０２との張り合わせには、ガラス同士，ガラスとＰＤＭＳ，ＰＤＭＳ同士であれば、酸素プラズマ処理やエキシマＵＶ照射を行った後に張り合わせることで両者を強固に接合させることができる。また、一方が熱可塑性樹脂基板の場合は、ガラス転移温度まで加熱することで溶着することが可能である。
【００２２】
流路基板１０２内部に形成された固定基板１０１を含む平面と交差する流路１０８は、内部の流れが層流となるように十分に微細かつ長さを有するものとする。具体的には、流路断面積４mm2以下、長さ１mm以上が望ましいが、内部流体のレイノルズ数が２３００以下となり、層流支配な環境となるのであれば、これに限らない。
【００２３】
固定基板１０１と平行な微細流路１０７の長さは短いほうが好ましい。本発明の実施形態としては１００mm以下が好ましく、１０mm以下がより好ましい。また、基板と平行な微細流路１０７は必須ではなく、固定反応部１１０と縦方向の流路１０８を直接連結させる構造であってもかまわない。基板と平行な微細流路１０７の長さを短くすることで、曲げ部から固定基板１０１に溶液が到達する時間を短縮することができ、担体濃度勾配の拡散による解消を防ぐことができる。
【００２４】
固定基板１０１を含む平面とそれと交差する流路１０８の交差角度は、１度以上であればよいがより好ましくは５度〜１７５度、さらに好ましくは９０度の角度で交わることが望ましい。曲げ部において急激な方向変化をつけることで、担体にかかる慣性力の方向と流体の流れの方向との齟齬が大きくなり、より大きな担体濃度勾配を生むことができる。
【００２５】
固定基板１０１を含む平面と交差する流路１０８は、反応部よりも流入口側にと流出口側両方に存在することが望ましいが、一方であってもかまわない。
【００２６】
担体溶液を送液するポンプに特に指定はないが、往復送液が可能な機構を有するものが好ましい。往復送液を行うことで、復路時にも曲げ部１０９（排出口側）で担体濃度を高めた溶液を固定基板１０１表面に供給することができる。これによって、担体１０５の利用効率を向上することが可能となる。また反応に時間が掛かり担体の濃度勾配が拡散によって解消されてしまった場合も、往復送液を継続して行うことで、常に固定基板１０１近傍の担体濃度を高い状態に維持することができる。
【００２７】
本発明において、担体１０５と固定基板１０１との間の結合に制約はないが、例えばビオチンとアビジンの親和性や静電相互作用，疎水相互作用，共有結合，物理的な捕捉などを挙げることができる。いずれの手法も担体と基板が影響を及ぼしうる距離に存在する時に起こる確立依存の現象であり、効果範囲に存在する担体濃度を向上させることで、担体の固定率・基板の単位面積あたりの担体固定量を共に向上させることができる。
【００２８】
〔実施例２：電場による濃度勾配の形成〕
担体２０１がツェータ電位を有する場合、実施例１を構成する要素の微細流路曲げ部１０９の代わりに、微細流路２０２中の流体の流れと直交する位置に電極対２０３を設置し、電圧を印加することで担体の濃度勾配を作り出すことができる。この実施例について図２Ａ，図２Ｂを用いて説明する。
【００２９】
例えば、担体が微粒子であり負のツェータ電位を有する場合、固定基板側の電極対２０３に正電荷を遠位側の電極に負電荷を印加することで、正極側（つまり基板表面側）の担体濃度を高めることができる。この電場によって形成された、濃度勾配を有した担体溶液は実施例１と同様に固定反応基板２０４に供給され、効率的な固定化反応を行うことができる。
【００３０】
電極対２０３の位置は、流路内である必要はなく、流体の流れに直交する電場を形成できるように流路に沿って設置されていれば良い。電極を微細流路２０２の外に設置することで担体分散液の電気分解を防ぎつつ担体の濃度勾配を作り出すことができる。
【００３１】
電極に印加する電圧は一定電圧であってもかまわないが、経時的に変化するものであってもかまわない。担体溶液中に含まれる担体２０１の濃度が希薄な場合には、強い電場をかけ担体を電極周囲に付着させ、溶液から分離させることで、担体濃度を増加させることができる。この工程により、たとえ希薄な担体溶液しか得られずとも、固定化反応に利用することができる。
【００３２】
また電場の強度だけでなく電荷の正負の方向も変化させてかまわない。この際の担体２０１は、正負いずれのツェータ電位を有していても良く、電極対２０３に印加する電圧を切り替えることで、幅広い種類の担体や溶液環境（ｐＨ・塩濃度など）に対応することができる。
【００３３】
また図２Ｂに示すように、微細流路２０２を通る担体溶液中に核酸と結合した担体２０５と核酸を結合していない担体２０６とが含まれる場合、固定反応基板２０４側に正の電荷を印加することで、核酸は負の電荷を有しているため核酸と結合した担体２０５を優先的に濃縮することができる。すなわち、固定反応基板２０４の単位面積あたりの核酸固定濃度を向上させることができる。
【００３４】
〔実施例３：磁場による濃度勾配の作成〕
磁性担体３０１を用いる場合、実施例２を構成する要素の電極対２０３の代わりに、磁力源３０２（永久磁石または電磁石）を設置し、磁場によって担体の濃度勾配を作り出すことができる。この実施例について図３を用いて説明する。この磁力源３０２を微細流路３０３の固定反応基板３０４側に設けることで、固定反応基板３０４表面側の担体濃度を高めることができる。この磁場によって形成された、濃度勾配を有した担体溶液は実施例１と同様に固定反応基板３０４に供給され、効率的な固定化反応を行うことができる。
【００３５】
微細流路３０３中での磁場の強度は、一定でもかまわないが任意に調整可能な機構を備えることが望ましい。すなわち、永久磁石を用いる場合であれば流路からの距離を可変とし、またあるいは微細流路３０３と磁力源３０２との間に磁気遮蔽物を挿入可能な構造とする。磁力源が電磁石の場合は、前述の永久磁石の場合に加えて電流量を制御することで、磁場の強度をコントロールできる。これにより磁性担体３０１密度に応じた適切な磁力設定が可能となる。
【００３６】
磁力源３０２の位置は、固定反応基板３０４の直下であってもかまわないが、微細流路３０３上に設置することがより好ましい。磁力源３０２を固定反応基板３０４の直下に設ける場合は、担体固定密度の斑を避けるために、広い面積で均一な磁場を発生させる必要があるが、磁力源の位置を微細流路３０３にすることで、均一な磁場を要求する面積を小さくすることができ、磁力源の簡素化とコスト減少につながる。
【００３７】
〔実施例４〕
本実施例では、核酸分析デバイスを用いた核酸分析装置の好ましい構成の一例について図４を参照しながら説明する。
【００３８】
本実施例の核酸分析装置は、核酸分析デバイスに対して、蛍光色素を有するヌクレオチド，核酸合成酵素、及び核酸試料を供給する手段と、核酸分析デバイスに光を照射する手段と、核酸分析デバイス上においてヌクレオチド，核酸合成酵素、及び核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する発光検出手段と、を備える。より具体的には、流路基板４０１と固定化基板４０２と溶液交換用口である注入口４０３と排出口４０４から構成される前記のデバイス４０５を設置する。なお、流路基板４０１には、ＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）を使用する。ＹＡＧレーザ光源（波長５３２ｎｍ，出力２０ｍＷ）４０７およびＹＡＧレーザ光源（波長３５５ｎｍ，出力２０ｍＷ）４０８から発振するレーザ光４０９および４１０を、レーザ光４０９のみをλ／４板４１１によって円偏光し、ダイクロイックミラー４１２（４１０ｎｍ以下を反射）によって、前記２つのレーザ光を同軸になるよう調整した後、レンズ４１３によって集光し、その後、プリズム４１４を介してデバイス４０５へ臨界角以上で照射する。
【００３９】
以下、担体として直径５０ｎｍ程度の金微粒子を用いた場合を例にとり、説明する。この場合、レーザ照射により、固定化基板４０２表面上に存在する金微粒子において局在型表面プラズモンが発生し、金微粒子に結合したＤＮＡプローブにより捕捉された標的物質の蛍光体は蛍光増強場内に存在することになる。蛍光体はレーザ光で励起され、その増強された蛍光の一部は流路基板４０１の一部に設けられた検出窓４０６を介して出射される。また、検出窓４０６より出射される蛍光は、対物レンズ４１５（×６０，ＮＡ１.３５，作動距離０.１５mm）により平行光束とされ、光学フィルタ４１６により背景光及び励起光が遮断され、結像レンズ４１７により２次元ＣＣＤカメラ４１８上に結像される。
【００４０】
逐次反応方式の場合には、蛍光色素付きヌクレオチドとして、P.N.A.S. 2006, vol. 103, pp 19635-19640（非特許文献２）に開示されているような、リボースの３′ＯＨの位置に３′−Ｏ−アリル基を保護基として入れ、また、ピリミジンの５位の位置にあるいはプリンの７位の位置にアリル基を介して蛍光色素と結びつけたものが使用できる。アリル基は光照射（例えば波長３５５ｎｍ）あるいはパラジウムと接触することで切断されるため、色素の消光と伸長反応の制御を同時に達成することができる。逐次反応でも、未反応のヌクレオチドを洗浄で除去する必要はない。さらに、洗浄工程が必要ないことからリアルタイムで伸長反応を計測することも可能である。この場合には、前記ヌクレオチドにおいて、リボースの３′ＯＨの位置に３′−Ｏ−アリル基を保護基として入れる必要は無く、光照射（例えば波長３５５ｎｍ）で切断可能な官能基を介して色素と結びついているヌクレオチドを用いれば良い。
【００４１】
担体として、半導体微粒子を用いた場合にも、上述の核酸分析装置の例は適用可能である。例えば、半導体微粒子としてQdot（Ｒ）565 conjugate（インビトロジェン社製）を用いると、ＹＡＧレーザ光源（波長５３２ｎｍ，出力２０ｍＷ）４０７で十分に励起できる。この励起エネルギーは５３２ｎｍの光では励起されないアレクサ６３３（インビトロジェン社製）へ移動することにより蛍光を発するようになる。つまり、未反応のヌクレオチドに付随する色素は励起されることはなく、ＤＮＡプローブに捕捉され半導体微粒子に近接しエネルギー移動が起きてはじめて発光するので、捕捉されたヌクレオチドを蛍光測定で識別することが可能である。
【００４２】
上記のように、本実施例の核酸分析デバイスを用いて核酸分析装置を組み上げることにより核酸と結合した担体の固定化効率を高め、固定化時間の短縮，使用サンプル量の低減を図ることができる。
【００４３】
〔実施例５〕
本発明に用いる固定化基板について、その好ましい構成の一例を、図５を用いて説明する。
【００４４】
平滑支持基板５０１の上に接着パッド５０２が規則正しく、例えば図５に示すように格子状に形成されている。接着パッド５０２と微粒子５０３は、線状分子５０５を介して化学結合により結ばれている。線状分子５０５の末端の官能基５０６と、接着パッド５０２とは化学的相互作用により結合していることが好ましい。その際、官能基５０６は、平滑支持基板５０１との相互作用が弱く、接着パッド５０２との相互作用が強いことが好ましい。このような観点から、平滑基板としては、石英ガラス，サファイア，シリコン基板などを用いることができる。また、接着パッド５０２には、金，チタン，ニッケル，アルミから選ばれる材料で構成することができる。官能基５０６には、平滑支持基板５０１と接着パッド５０２との組み合わせを考えて選択せねばならないが、例えば、スルホヒドリル基，アミノ基，カルボキシル基，リン酸基，アルデヒド基等を用いることができる。線状分子５０５は、微粒子５０３と接着パッド５０２を結ぶ役割を果たし、長さに大きな限定はないが、低分子の場合には炭素数にして３から２０程度の直鎖状分子が好ましい。線状分子５０５の末端の官能基５０７は、微粒子５０３との接着性をもたらす。また、線状分子５０５として高分子を用いる場合には、複数の側鎖を有し、官能基５０６を有する側鎖と官能基５０７を持つ側鎖を併せ持つものを用いることができる。微粒子５０３としては、金属微粒子や半導体微粒子を用いることができる。例えば、金の微粒子として、直径５ｎｍ〜１００ｎｍのものが市販されており、活用することができる。また、半導体微粒子としては、直径が１０ｎｍ〜２０ｎｍ程度のＣｄＳｅ等の化合物半導体が市販されており、活用することができる。官能基５０７として用いることができる官能基は、微粒子の種類によって異なるが、例えば金微粒子を用いた場合にはスルホヒドリル基，アミノ基等が好ましい。半導体微粒子を用いる場合には、ストレプトアビジンで表面が修飾された微粒子が市販されており、官能基５０７としてビオチンを用いることができる。核酸分子５０４には、ＤＮＡやＲＮＡの核酸分子を用いることができる。核酸分子の末端を官能基５０７と同様に予め修飾しておき、微粒子５０３と反応させておく。また、解析対象となる核酸分子と相補な領域を持つ核酸を微粒子５０３へ官能基５０７を介して結合させておき、ハイブリダイゼーションによって核酸分子５０４を微粒子５０３に結合させても良い。この相補領域を持つ核酸としてオリゴｄＴを用いることで、幅広くｍＲＮＡを捕捉することができる。一つの微粒子５０３に固定する核酸分子５０４は、一分子であることが好ましい。一つの微粒子５０３に一分子の核酸分子５０４を固定するためには、微粒子５０３の粒径が小さいほど好ましい。一つの核酸分子が微粒子表面に固定されると、微粒子上の電荷の状態が変化して、他の未固定の核酸分子の固定反応を阻害する効果が生じる。微粒子サイズが小さくなると、この効果が大きくなるからである。発明者らが鋭意検討した結果、微粒子サイズとして約２０ｎｍ以下が好ましいことが判明している。また、微粒子５０３と核酸分子５０４との結合反応を液相で行い、かつ、微粒子５０３に対して核酸分子５０４の濃度を約１／１０以下に下げて反応させることで、微粒子５０３の直径が１μｍ程度であっても、一つの微粒子５０３に固定する核酸分子５０４を一分子とすることができる。一方、微粒子５０３のサイズが大きくなるに従い、核酸分子５０４の固定密度が低下してしまう。簡便な蛍光検出で輝点を識別する場合回折限界を考慮すると輝点間が１μｍ程度離れていることが好ましい。したがって、微粒子５０３のサイズは１μｍ以下であることが適している。
【００４５】
接着パッド５０２を平滑支持基板５０１上に形成する方法としては、半導体で既に実用化されている薄膜プロセスを活用することができる。例えば、マスクを通した蒸着・スパッタリング、あるいは蒸着・スパッタリングにより薄膜を形成した後、ドライあるいはウエットエッチングにより製造することができる。規則正しく配置することは、薄膜プロセスを用いることで容易に実現できる。パッド間の間隔は任意に設定できるが、検出手段として光計測を行う場合、光検出の回折限界を考えると５００ｎｍ以上が好ましい。
【００４６】
接着パッド５０２を平滑支持基板５０１上に形成した後、微粒子５０３と接着パッド５０２を結ぶ線状分子５０５を供給し、接着パッド５０２上に線状分子５０５を固定する。この際、平滑支持基板５０１上での非特異的吸着を防止する目的で、線状分子５０５を供給する前に、平滑支持基板５０１との接着力の強い材料を平滑支持基板５０１上に反応させる方法が有効である。例えば、シランカップリング剤等が利用できる。次に固定基板と流路基板を張り合わせ、核酸分子５０４を表面に固定させた微粒子５０３を基板上に供給して、微粒子５０３を接着パッド５０２上に固定させることにより、分析に用いることができる。
【００４７】
接着パッド５０２上に微粒子５０３を固定させる際、一つの接着パッド５０２に複数個の微粒子５０３が固定される可能性がある。複数個が固定されてしまうと、種類の違う核酸断片の情報が重なり合ってしまい、正確な核酸分析ができなくなってしまう。そのため、一つの接着パッド５０２には、１個の微粒子５０３を固定させねばならない。そこで、発明者らは、種々の条件での固定実験を繰り返し、鋭意検討した結果、接着パッド５０２の直径ｄが微粒子５０３の直径Ｄに比べて小さい、という条件が成り立てば、一つの接着パッド５０２に１個の微粒子５０３を固定できることを見出した。接着パッド５０２に比べて同等以上の大きさの微粒子５０３が固定されると、未反応の線状分子が固定された微粒子に覆い隠されてしまい、別の微粒子と反応できなくなってしまうものと説明される。１個の微粒子５０３に核酸分子５０４を一分子固定するには、微粒子５０３の直径Ｄが２０ｎｍ以下であることが好ましいことから、接着パッド５０２の直径ｄは２０ｎｍ以下であることが好ましい。さらに、鋭意検討を続けた結果、微粒子５０３がその表面に電荷を有する場合には、微粒子間に静電的な反発力が働くため、接着パッド５０２の直径ｄが微粒子５０３の直径Ｄに比べて大きい場合にも接着パッドあたりの固定微粒子数が１個になることが判明した。したがって、微粒子５０３の表面電荷が小さく静電反発力が弱い場合には、接着パッド５０２の直径ｄが微粒子５０３の直径Ｄに比べて小さいことが好ましく、微粒子５０３の表面電荷が大きく静電反発力が強い場合には、接着パッド５０２の直径ｄは必ずしも微粒子５０３の直径Ｄよりも小さくなくても良いことが明らかとなった。
【００４８】
本実施例の核酸分析デバイスを用いて、核酸試料に関する情報を検出するやり方にはいくつかの方式が考えられるが、感度や簡便性の観点から蛍光検出法を用いる方式が好ましい。まず、試料となる核酸分子５０４を補足した微粒子を流路基板と固定基板とを張り合わせて作製した核酸分析反応デバイスに供給し、固定基板表面に微粒子を固定化する。次に、蛍光色素を有するヌクレオチドと核酸合成酵素を供給する。デバイス上で核酸伸長反応を起こし、伸長反応中に核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光測定を行う。この場合、ヌクレオチドの一種類を供給，未反応ヌクレオチドの洗浄，蛍光観察，違う種類のヌクレオチドの供給、以降を繰り返し行う、いわゆる逐次伸長反応方式は容易に実現できる。蛍光観察後に蛍光色素を消光するか、蛍光色素がリン酸部位に付いたヌクレオチドを用いることにより、連続的な反応を起こし、核酸試料の塩基配列情報を得ることができる。一方、４種類のヌクレオチドが各々異なる蛍光色素を有すものを供給し、洗浄することなく、連続的な核酸伸長反応を起こし、連続的に蛍光観察を行うことで、いわゆるリアルタイム反応方式を実現することもできる。この場合、蛍光色素がリン酸部位に付いたヌクレオチドを用いると、伸長反応後リン酸部位が切断されるため、消光することなく連続的に蛍光測定して核酸試料の塩基配列情報を得ることができる。
【００４９】
微粒子として、可視域で局在プラズモンを励起することが可能な、金，銀，白金，アルミニウム等の直径が１００ｎｍ程度以下の微粒子を用いることにより、蛍光を増強して観察することができる。金微粒子の表面プラズモンによる蛍光増強の現象については、例えば、Nanotechnology, 2007, vol. 18, pp 044017-044021（非特許文献３）に報告されている。ヌクレオチドに付いた蛍光色素の蛍光を増強させて測定することができ、信号／ノイズを高くすることができる。
【００５０】
微粒子として、半導体微粒子を用いた場合には、半導体微粒子を外部光源の光で励起しておき、取り込まれたヌクレオチドに付随する蛍光色素にその励起エネルギーを移動させることにより、個々の蛍光色素の蛍光を観察することもできる。この場合、励起光源は半導体微粒子のみを励起すればよく、一種類の光源でよい点で好ましい。
【００５１】
微粒子として、高分子材料からなる微粒子を用いた場合には、微粒子の粒径を揃えることができ、粒径の大きさも数十ｎｍから数μｍまで幅広く選択することができる。また、高分子材料が有する官能基を足場に表面修飾を施すことで、微粒子表面に固定する核酸分子５０４の固定反応のための官能基の導入量を均一にすることができるという点で好ましい。特に、核酸分子５０４を一分子だけ微粒子表面に固定する場合、固定率の再現性が非常に高く、好ましい。
【００５２】
この本構成例のように、基板上における担体の接着部位を制限することで、担体の結合可能な基板上の面積が減少し、担体の結合効率が低下してしまうが、本発明の特徴とする流路中の担体濃度に勾配を生じさせる流路基板と組み合わせることで、基板表面の担体濃度を高め、固定反応の効率の低下を抑えることができる。
【００５３】
〔実施例６〕
実施例５で示した固定化基板の製造方法の一例を、図６を用いて説明する。平滑な支持基体６０１上に電子線用ポジ型レジスト６０２をスピンコート法により塗工する。平滑な支持基体としては、ガラス基板，サファイア基板，シリコンウエハ等が用いられる。デバイスとしたときに、微粒子を配列した面と反対側の裏面より励起光を照射する必要がある場合には、光透過性に優れた石英基板やサファイア基板を用いればよい。電子線用ポジ型レジストとしては、例えば、ポリメチルメタクリレートやＺＥＰ−５２０Ａ（日本ゼオン社製）を挙げることができる。基板上のマーカーの位置を用いて位置合わせを行ったうえ電子線直描露光を行って、レジストにスルーホールを形成する。例えば、直径１５ｎｍのスルーホールを形成する。スルーホールは並行処理で解析できる核酸の分子数に依存するが、１μｍ程度のピッチで形成することが、製造上の簡便さ，歩留まりの高さ、及び並行処理で解析できる核酸の分子数を勘案すると適している。スルーホール形成領域も、並行処理で解析できる核酸の分子数によるが、検出装置側の位置精度や位置分解能にも大きく依存する。例えば、１μｍピッチで反応サイト（微粒子）を構成した場合、スルーホール形成領域を１mm×１mmとすると、１００万反応サイトを形成できる。スルーホールを形成後、接着用パッド６０３を構成する材料、例えば、金，チタン，ニッケル，アルミ、をスパッタリングで製膜する。平滑な支持基体としてガラス基板，サファイア基板を用い、接着用パッド材料として金，アルミ，ニッケルを用いる場合には、基板材料と接着用パッド材料との間に接着を補強する意味でチタンやクロムの薄膜を入れることが好ましい。次に、接着用パッド６０３に線状分子６０４を反応させる。接着用パッド６０３が金，チタン，アルミ，ニッケルの場合には、線状分子末端の官能基６０５としては、各々、スルホヒドニル基，リン酸基，リン酸基，チアゾール基を用いることが好ましい。線状分子の反対側の官能基６０６には、例えばビオチンを用いることができる。線状分子を接着用パッドと反応させた後、レジストを剥離する。レジストを剥離後、接着用パッドを形成した以外の平滑基板表面に非特異吸着防止処理を施す。蛍光色素付きヌクレオチドに対する吸着防止を実現するには負の電荷を帯びた官能基を有する非特異吸着防止用分子６０７でコートする。例えば、エポキシシランを表面にスピンコートで塗工し、加熱処理後、弱酸性溶液（ｐＨ５〜ｐＨ６程度）で処理することにより、エポキシ基を開環させＯＨ基を表面に導入することで非特異吸着防止効果をもたらすことができる。
【符号の説明】
【００５４】
１０１ 固定基板
１０２，４０１ 流路基板
１０３ 流入口
１０４ 流出口
１０５，２０１ 担体
１０６ ポンプ
１０７，２０２，３０３ 微細流路
１０８，１１１ 流路
１０９ 曲げ部
１１０ 固定反応部
２０３ 電極対
２０４，３０４ 固定反応基板
２０５ 核酸と結合した担体
２０６ 核酸と結合していない担体
３０１ 磁性担体
３０２ 磁力源
３０５ 磁気遮蔽物
４０２ 固定化基板
４０３ 注入口
４０４ 排出口
４０５ デバイス
４０６ 検出窓
４０７，４０８ ＹＡＧレーザ光源
４０９，４１０ レーザ光
４１１ λ／４板
４１２ ダイクロイックミラー
４１３ レンズ
４１４ プリズム
４１５ 対物レンズ
４１６ 光学フィルタ
４１７ 結像レンズ
４１８ ２次元ＣＣＤカメラ
５０１ 平滑支持基板
５０２ 接着パッド
５０３ 微粒子
５０４ 核酸分子
５０５，６０４ 線状分子
５０６，５０７，６０５，６０６ 官能基
６０１ 平滑な支持基体
６０２ 電子線用ポジ型レジスト
６０３ 接着用パッド
６０７ 非特異吸着防止用分子
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上の目的物質の解析を行う核酸分析装置において、
目的物質を結合させた担体を固定する基板と、
基板との間に第一の流路と、反応領域とを形成する封止部材と、
封止部材中に形成され第一の流路と連続した第二の流路と、を有し、
第一の流路と第二の流路の構造がなす角度が５度〜９０度であることを特徴とする核酸分析装置。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸分析装置において、
前記第一の流路と前記第二の流路は直交していることを特徴とする核酸分析装置。
【請求項３】
請求項１に記載の核酸分析装置において、
第一の流路及び第二の流路を介して反応領域へ担体を流す送液機構を有することを特徴とする核酸分析装置。
【請求項４】
請求項３に記載の核酸分析装置において、
前記送液機構は、送液方向を逆にすることが可能であることを特徴とする核酸分析装置。
【請求項５】
請求項１に記載の核酸分析装置において、
第一の流路の長さは１００mm以下であることを特徴とする核酸分析装置。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸分析装置において、
第一の流路の長さは１０mm以下であることを特徴とする核酸分析装置。
【請求項７】
請求項１に記載の核酸分析装置において、
第二の流路の断面積は４mm2以下であることを特徴とする核酸分析装置。
【請求項８】
請求項１に記載の核酸分析装置において、
第二の流路の長さは１mm以上であることを特徴とする核酸分析装置。
【請求項９】
基板上の目的物質の解析を行う核酸分析装置において、
目的物質を結合させた担体を固定する基板と、基板との間に流路及び反応領域を形成する封止部材とを有し、
流路内で担体の濃度を、基板の表面に近づくほど高くする濃度制御手段を有することを特徴とする核酸分析装置。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸分析装置において、
前記濃度制御手段は、流路に沿って電場を付与する電場発生機構を有することを特徴とする核酸分析装置。
【請求項１１】
請求項９に記載の核酸分析装置において、
前記濃度制御手段は、流路に直交する磁場を発生させる磁場発生機構を有することを特徴とする核酸分析装置。
【請求項１２】
請求項９に記載の核酸分析装置において、
基板上の反応領域には担体を固定する手段を有する核酸分析装置。
【請求項１３】
請求項９に記載の核酸分析装置において、
前記流路は、反応領域の入口側とつながった流入側流路と、反応領域の出口側とつながった流出側流路を有することを特徴とする核酸分析装置。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸分析装置において、
前記担体の濃度の偏りは、流入側流路で生じることを特徴とする核酸分析装置。
【請求項１５】
請求項１３に記載の核酸分析装置において、
前記担体の濃度の偏りは、流出側流路で生じることを特徴とする核酸分析装置。
【請求項１６】
請求項１３に記載の核酸分析装置において、
前記担体の濃度の偏りは、流入側流路および流出側流路で生じることを特徴とする核酸分析装置。
【請求項１７】
請求項１または９に記載の核酸分析装置において、
検出対象の核酸を前記固相基板に固定した核酸分析用デバイスと、前記核酸分析用デバイスに対して、蛍光色素を有するヌクレオチド、及び核酸試料を供給する手段と、前記核酸分析用デバイスに光を照射する手段と、前記核酸分析用デバイス上において前記ヌクレオチド，前記核酸合成酵素、及び前記核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する発光検出手段と、を備え、前記核酸試料の塩基配列情報を取得する核酸分析装置。
【請求項１】
基板上の目的物質の解析を行う核酸分析装置において、
目的物質を結合させた担体を固定する基板と、
基板との間に第一の流路と、反応領域とを形成する封止部材と、
封止部材中に形成され第一の流路と連続した第二の流路と、を有し、
第一の流路と第二の流路の構造がなす角度が５度〜９０度であることを特徴とする核酸分析装置。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸分析装置において、
前記第一の流路と前記第二の流路は直交していることを特徴とする核酸分析装置。
【請求項３】
請求項１に記載の核酸分析装置において、
第一の流路及び第二の流路を介して反応領域へ担体を流す送液機構を有することを特徴とする核酸分析装置。
【請求項４】
請求項３に記載の核酸分析装置において、
前記送液機構は、送液方向を逆にすることが可能であることを特徴とする核酸分析装置。
【請求項５】
請求項１に記載の核酸分析装置において、
第一の流路の長さは１００mm以下であることを特徴とする核酸分析装置。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸分析装置において、
第一の流路の長さは１０mm以下であることを特徴とする核酸分析装置。
【請求項７】
請求項１に記載の核酸分析装置において、
第二の流路の断面積は４mm2以下であることを特徴とする核酸分析装置。
【請求項８】
請求項１に記載の核酸分析装置において、
第二の流路の長さは１mm以上であることを特徴とする核酸分析装置。
【請求項９】
基板上の目的物質の解析を行う核酸分析装置において、
目的物質を結合させた担体を固定する基板と、基板との間に流路及び反応領域を形成する封止部材とを有し、
流路内で担体の濃度を、基板の表面に近づくほど高くする濃度制御手段を有することを特徴とする核酸分析装置。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸分析装置において、
前記濃度制御手段は、流路に沿って電場を付与する電場発生機構を有することを特徴とする核酸分析装置。
【請求項１１】
請求項９に記載の核酸分析装置において、
前記濃度制御手段は、流路に直交する磁場を発生させる磁場発生機構を有することを特徴とする核酸分析装置。
【請求項１２】
請求項９に記載の核酸分析装置において、
基板上の反応領域には担体を固定する手段を有する核酸分析装置。
【請求項１３】
請求項９に記載の核酸分析装置において、
前記流路は、反応領域の入口側とつながった流入側流路と、反応領域の出口側とつながった流出側流路を有することを特徴とする核酸分析装置。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸分析装置において、
前記担体の濃度の偏りは、流入側流路で生じることを特徴とする核酸分析装置。
【請求項１５】
請求項１３に記載の核酸分析装置において、
前記担体の濃度の偏りは、流出側流路で生じることを特徴とする核酸分析装置。
【請求項１６】
請求項１３に記載の核酸分析装置において、
前記担体の濃度の偏りは、流入側流路および流出側流路で生じることを特徴とする核酸分析装置。
【請求項１７】
請求項１または９に記載の核酸分析装置において、
検出対象の核酸を前記固相基板に固定した核酸分析用デバイスと、前記核酸分析用デバイスに対して、蛍光色素を有するヌクレオチド、及び核酸試料を供給する手段と、前記核酸分析用デバイスに光を照射する手段と、前記核酸分析用デバイス上において前記ヌクレオチド，前記核酸合成酵素、及び前記核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する発光検出手段と、を備え、前記核酸試料の塩基配列情報を取得する核酸分析装置。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１２−１４３２０５（Ｐ２０１２−１４３２０５Ａ）
【公開日】平成２４年８月２日（２０１２．８．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３８７（Ｐ２０１１−５３８７）
【出願日】平成２３年１月１４日（２０１１．１．１４）
【出願人】（５０１３８７８３９）株式会社日立ハイテクノロジーズ (4,325)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年８月２日（２０１２．８．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月１４日（２０１１．１．１４）
【出願人】（５０１３８７８３９）株式会社日立ハイテクノロジーズ (4,325)
【Ｆターム（参考）】
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