核酸増幅方法および核酸増幅装置、ならびに核酸増幅用チップ
【課題】核酸増幅に要する反応液量を低減することができ、省電力化および低コスト化を達成でき、かつ増幅に要する時間を短縮できる核酸増幅装置および核酸増幅方法、ならびに核酸増幅用チップを提供する。
【解決手段】核酸増幅用チップは、反応液が導入され、第１のチャンバーと、第２のチャンバーと、第１のチャンバーと第２のチャンバーとを接続し、第２のチャンバーの最小幅よりも小さい最大幅を有する連結部と、第２のチャンバーに充填された液体と、を含み、液体は、所定の温度範囲内では比重が反応液よりも軽く、かつ、反応液と混和しない。
【解決手段】核酸増幅用チップは、反応液が導入され、第１のチャンバーと、第２のチャンバーと、第１のチャンバーと第２のチャンバーとを接続し、第２のチャンバーの最小幅よりも小さい最大幅を有する連結部と、第２のチャンバーに充填された液体と、を含み、液体は、所定の温度範囲内では比重が反応液よりも軽く、かつ、反応液と混和しない。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅方法および核酸増幅装置、ならびに核酸増幅用チップに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡやＲＮＡ等の遺伝子を検査するための方法として、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）が例えば研究用および臨床検査用に広く用いられている（特許文献１）。このＰＣＲでは通常、標的核酸を含みうる検体および試薬を含む反応液を容器に入れ、サーマルサイクラーと呼ばれる温度制御装置を用いて、例えば９５℃、７４℃、５５℃という複数段階の温度変化を繰り返すことにより標的核酸を増幅させる。しかしながら、ＰＣＲでは通常、反応液を一定の温度に調節するのに時間がかかることが、作業効率の向上を妨げる一要因となっている。また、作業時間短縮のために反応液を急速に加熱または冷却すると、消費電力が大きくなるうえ、サーマルサイクラーの温度制御を司る温度制御素子の耐久性を下げるおそれがある。
【０００３】
そこで、ＰＣＲ反応をより効率良く行うために、所定の温度に制御されたサーマルサイクラーの温度制御素子に対して反応液を移動させ、反応液の温度変化を生じさせる技術も提案されている（特許文献２）。しかし、この温度制御方法では、反応容器内に残る気泡により温度勾配が乱され、標的核酸増幅における温度制御の効率が低下してしまうことがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特公平４−６７９５７号公報
【特許文献２】特願２００７−３１８６２７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、反応液導入時に気泡が内部に残り難い核酸増幅用チップを提供し、かつ、前記核酸増幅用チップを用いることで、省電力化および低コスト化を達成でき、かつ増幅に要する時間を短縮できる核酸増幅方法および核酸増幅装置を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一態様に係る核酸増幅方法は、
反応液を用いて核酸増幅を行う方法であって、
前記反応液より比重が軽く、かつ、前記反応液と混和しない液体が充填された第２のチャンバーを有する核酸増幅用チップの第１のチャンバーに前記反応液を導入する工程と、
遠心によって前記第１のチャンバーの前記反応液を前記第２のチャンバーに導入させる工程と、
前記核酸増幅用チップの一方の端部の温度を調節する工程と、
回転軸を中心として前記核酸増幅用チップを所定の速度で回転させる工程と、を含む。
【０００７】
上記核酸増幅方法によれば、反応液より比重が軽く反応液と混和しない液体が充填された第２のチャンバーを有する核酸増幅用チップの第１のチャンバーに反応液を供給し、遠心して前記第１のチャンバーから前記第２のチャンバーに前記反応液を移動させ、前記核酸増幅用チップの一方の端部の温度を調節し、回転軸を中心として前記核酸増幅用チップを所定の速度で回転させるので、重力を利用して前記一方の端部から他方の端部へと前記反応液を移動させることができ、前記一方の端部での温度領域から前記他方の端部での温度領域へと、前記反応液の温度を制御することができる。
【０００８】
また、予め前記反応液より比重が軽く前記反応液と混和しない前記液体が前記第２のチャンバーに充填されているので、遠心することにより気泡を残さずに前記反応液を前記第１のチャンバーから前記第２のチャンバーへ移動させることができる。これにより、気泡によって前記第２チャンバーに充填された前記液体の温度勾配が乱されることがなくなるので、前記反応液の温度をより効率良く制御できる。
【０００９】
本発明の別の一態様に係る反応液が導入される核酸増幅用チップは、
反応液が導入される核酸増幅用チップであって、
第１のチャンバーと、
第２のチャンバーと、
前記第１のチャンバーと前記第２のチャンバーとを接続し、前記第２のチャンバーの最小幅よりも小さい最大幅を有する連結部と、
前記第２のチャンバーに充填された液体と、を有し、
前記液体は、所定の温度範囲内では比重が反応液よりも軽く、かつ、反応液とは混和しない。
【００１０】
上記核酸増幅用チップにおいて、前記連結部の最大幅は、前記第１のチャンバーの最小幅よりも小さいとより好適である。本発明において、連結部の最大幅とは、連結部のうち最も広い部分の幅をいい、第１のチャンバー（第２のチャンバー）の最小幅とは、第１のチャンバー（第２のチャンバー）のうち最も狭い部分の幅をいう。
【００１１】
上記核酸増幅用チップによれば、第１のチャンバーと、第２のチャンバーと、前記第１のチャンバーと前記第２のチャンバーとを接続し、かつ、前記第２のチャンバーの最小幅よりも小さい最大幅を持つ連結部と、第２のチャンバーに充填された所定の温度範囲内では比重が反応液よりも軽く反応液とは混和しない液体と、を有するので、前記反応液が第１のチャンバーから第２のチャンバーへ導入された場合に、前記反応液と前記液体とが分離された状態にすることができる。これにより、前記第２のチャンバー内における前記反応液の位置を容易に確認することができる。なお、前記反応液と前記液体とが分離された状態においては前記反応液が球状になることから、本発明で前記第２のチャンバーに導入された前記反応液を液滴と表現することもある。
【００１２】
さらに、上記核酸増幅用チップの前記第２のチャンバーに充填する液体の量を、前記第２のチャンバーの容積から前記反応液の容積を引いた量以上、かつ、前記第１チャンバーの容積から前記反応液の容積を引いた量と、前記第２のチャンバーの容積と、前記連結部の容積と、を足した量以内にすることで、前記第２のチャンバー内に気泡が残り難くすることができる。
【００１３】
本発明の別の一態様に係る核酸増幅装置は、
反応液が導入される核酸増幅用チップを用いた核酸増幅装置であって、
前記核酸増幅用チップは、
第１のチャンバーと、
第２のチャンバーと、
前記第１のチャンバーと前記第２のチャンバーとを接続し、前記第２チャンバーの最小幅より小さい最大幅を有する連結部と、
前記第２のチャンバーに充填された液体と、を含み、
前記液体は、所定の温度範囲内では比重が前記反応液よりも軽く、かつ、前記反応液とは混和せず、
前記核酸増幅装置は、
前記核酸増幅用チップを設置可能なチップ保持部と、
回転軸を中心に前記チップ保持部を所定の回転速度で回転させる回転部と、
前記回転軸に沿って設けられた温度制御部と、を含み、
前記回転部は、回転時に重力方向における前記第２のチャンバー内の最下点と前記回転軸との距離が変化するように前記チップ保持部を回転させる。
【００１４】
上記核酸増幅装置において、前記核酸増幅用チップは、前記第２のチャンバーと、前記第１のチャンバーと前記第２チャンバーとを接続する前記連結部と、を含む反応部と、を有し、複数の前記反応部は、それぞれ前記第１チャンバーに接続されていることができる。
【００１５】
上記核酸増幅装置において、前記温度制御部は、第１温度制御部と第２温度制御部とからなり、前記第２温度制御部は、前記第１温度制御部よりも前記回転軸から遠い位置に設けられていることができる。
【００１６】
上記核酸増幅装置において、前記第２のチャンバー内に、標的核酸を増幅するための試薬が塗布されていることができる。なお、本発明において「標的核酸」とは、本発明の核酸増幅装置による増幅対象となる核酸のことをいう。
【００１７】
上記核酸増幅装置によれば、前記回転部によって、前記チップ保持部により保持された前記核酸増幅用チップの前記第２のチャンバー内の重力方向における最下点と前記回転軸との距離が変化するように前記核酸増幅用チップを回転させることができるので、前記回転軸に沿って設けられた温度制御部によって、前記核酸増幅用チップ内の所定の位置を所定の温度に調節することができる。これにより、前記核酸増幅用チップ内に導入される反応液の温度をより効率良く調節することができるので、省電力化および低コスト化を達成でき、かつ増幅に要する時間を短縮できる。
【００１８】
本発明の他の一態様に係る核酸増幅用チップは、
反応液が導入される核酸増幅用チップであって、
前記核酸増幅用チップの中央部に配置された第１のチャンバーと、
第２のチャンバーと、前記第１のチャンバーと前記第２チャンバーとを接続する連結部と、を含む反応部と、を有し、
前記反応部を複数含み、
複数の前記反応部は、それぞれ前記第１のチャンバーに接続されており、かつ、前記中央部から放射線状方向に配置されている。
【００１９】
上記核酸増幅用チップを用いて核酸増幅を行うことにより、複数の前記反応部毎に異なる試薬を使用することが可能となるので、異なる標的核酸を同時に増幅することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の第１実施形態に係る核酸増幅装置を説明する斜視図（図１（ａ）は核酸増幅装置の全体図、図１（ｂ）は図１（ａ）の核酸増幅装置から保持部材を取り外した図、図１（ｃ）は図１（ｂ）の核酸増幅装置から断熱部材を取り外した図。）。
【図２】図１（ｂ）の第１温度制御部、第２温度制御部および核酸増幅用チップ収容部を抜き出して、回転軸Ａの延びる方向と垂直な方向（図１（ａ）〜図１（ｃ）の左側）から記載した拡大図。
【図３】本発明の第１実施形態に係る核酸増幅装置に設けられる核酸増幅用チップの断面図（図３（ａ））および前記核酸増幅用チップの第１基板の平面図（図３（ｂ））。
【図４】図３（ｂ）の核酸増幅用チップに液体が充填された状態を説明する図。
【図５】図３（ｂ）の核酸増幅用チップに液滴が充填された状態を説明する図（図５（ａ））および図３（ｂ）の核酸増幅用チップ内の液体中を液滴が移動する状態を説明する図（図５（ｂ））。
【図６】図３（ｂ）の核酸増幅用チップを第１の温度で保持する状態を説明する図（図６（ａ））および図３（ｂ）の核酸増幅用チップを第２の温度で保持する状態を説明する図（図６（ｂ））。
【図７】本発明の第２実施形態に係る核酸増幅装置を説明する斜視図（図７（ａ）は核酸増幅装置の全体図、図７（ｂ）は図７（ａ）の装置から保持部材および第２温度制御部を取り外した図、図７（ｃ）は図７（ｂ）の装置から測定用ポート、断熱部材および核酸増幅用チップを取り外した図。）。
【図８】本発明の第２実施形態に係る核酸増幅装置に設けられる核酸増幅用チップの平面図。
【図９】図８の核酸増幅用チップに液体および液滴を充填する方法を説明する断面図（図９（ａ）〜図９（ｃ））。
【図１０】図８の核酸増幅用チップを用いて核酸増幅を行う工程を説明する平面図（図１０（ａ）〜図１０（ｄ））。
【図１１】図８の核酸増幅用チップの一変形例を示す平面図。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下に、本発明の一実施形態に係る核酸増幅方法および核酸増幅装置、ならびに核酸増幅用チップ（チップ）について具体的に説明する。
【００２２】
１．第１実施形態
図１（ａ）〜図１（ｃ）は、本発明の第１実施形態に係る核酸増幅装置４０を説明する斜視図である（図１（ａ）は核酸増幅装置４０の全体図、図１（ｂ）は図１（ａ）の核酸増幅装置４０から保持部材４７ｂを取り外した図、図１（ｃ）は図１（ｂ）の核酸増幅装置４０から断熱部材４４を取り外した図。）。
【００２３】
１．１．核酸増幅装置の構成
図１（ａ）〜図１（ｃ）に示されるように、本実施形態に係る核酸増幅装置４０は、温度制御部（第１温度制御部４９および第２温度制御部４５）と、チップ１００を設置可能なチップ保持部４７と、回転軸Ａを中心にチップ１００を回転させる回転部４１とを含む。
【００２４】
チップ１００は、図３（ａ）および図３（ｂ）に示されるように、第１のチャンバー１２と、第２のチャンバー１４と、第１のチャンバー１２と第２のチャンバー１４とを接続する連結部１６とを基板１０の第１の面１０ａに有する。
【００２５】
チップ保持部４７は、回転時にチップ１００の長手方向に重力が作用するようにチップ１００を保持する。
【００２６】
温度制御部は、チップ１００の所定の位置を所定の温度に調節する。第１温度制御部４９は回転軸Ａに沿って設けられている。
【００２７】
チップ回転部４９は、回転時に重力方向における第２のチャンバー１４内の最下点と回転軸Ａとの距離が変化するようにチップ１００を回転させる。
【００２８】
核酸増幅装置４０には、複数のチップ収容部４３が、回転軸Ａに対称にかつ回転軸Ａの中心から放射線状方向に配置されており、１つのチップ収容部４３内に、１つのチップ１００（図１（ａ）〜図１（ｃ）ではチップ１００は図示せず）が収容されている。図１（ｂ）および図１（ｃ）に示されるように、隣り合うチップ収容部４３の間には断熱部材４４が配置されており、隣り合うチップ収容部４３の間での熱の移動を遮断している。チップ収容部４３には例えば、チップ１００（図６（ａ）および図６（ｂ）参照）の第１のチャンバー１２が第２のチャンバー１４よりも回転軸Ａに近くなるようにチップ１００を収容することができる。なお、チップ１００の第２のチャンバー１４が第１のチャンバー１２よりも回転軸Ａに近くなるようにチップ１００を収容してもよい。
【００２９】
図２は、図１（ｂ）の第１温度制御部４９および第２温度制御部４５ならびにチップ収容部４３を抜き出して、回転軸Ａの延びる方向と垂直な方向（図１（ａ）〜図１（ｃ）の左側）から記載した拡大図である。
【００３０】
本実施形態に係る核酸増幅装置４０では、温度制御部は、第１温度制御部４９と第２温度制御部４５とからなり、第２温度制御部４５は図１（ｂ）に示されるように、第１温度制御部４９よりも回転軸Ａから遠い位置に設けられている。また、第１温度制御部４９は図１（ｂ）に示されるように、回転軸Ａに沿って設けることができる。
【００３１】
第２温度制御部４５は、図２に示されるように、円盤状の形状を有する。すなわち、第２温度制御部４５は、外周部に設けられた第２ヒーター４５ａを有する。
【００３２】
回転部４１は、回転軸Ａを中心にチップ保持部４７を所定の回転速度で回転させることによってチップ１００を回転させる。回転部４１は例えばアルミ等の金属からなる。また、図２に示されるように、回転部４１の外周には、断熱部材４４が設けられ、この断熱部材４４を挟むように２枚の熱伝導性部材４１ｂ，４１ｃが配置されている。熱伝導性部材４１ｂ、断熱部材４２ａ、および熱伝導性部材４３ａが同心円盤を構成し、また、熱伝導性部材４１ｃ、断熱部材４２ｂ、および熱伝導性部材４３ｃが同心円盤を構成し、これらの２枚の同心円盤がチップ収容部４３および断熱部材４４を挟むように配置されている。また、回転部４１の少なくとも一部が、熱伝導性部材４１ｂ、断熱部材４４および熱伝導性部材４１ｃを貫通する穴４４ａ内に設けられている。熱伝導性部材４１ｂ，４１ｃは例えばアルミ等の金属からなる。
【００３３】
また、チップ１００を収容するチップ収容部４３は、チップ１００からの情報を光学的に読み取る光学的検出部（測定用ポート）４３ｂを有する。すなわち、光学的検出部４３ｂは第２のチャンバー１４内で増幅された核酸の濃度を測定する。光学的検出部４３ｂの近傍には、ＬＥＤおよびＣＣＤセンサ（図示せず）等を配置することができる。これにより、本実施形態による核酸増幅装置４０を用いてリアルタイムＰＣＲを行う場合、チップ１００が回転中にＣＣＤセンサに対向したときに、第２のチャンバー１４内で増幅された核酸の濃度を光学的に測定することができるため、サイクル毎の増幅産物量を測定することができる。
【００３４】
熱伝導性部材４３ａ，４３ｃは第２ヒーター４５ａに接している。熱伝導性部材４３ａ，４３ｃは例えばアルミなどの金属からなる。第２ヒーター４５ａの熱が熱伝導性部材４３ａ，４３ｃに伝搬することで、チップ収容部４３内のチップ１００の所定の位置が所定の温度に調節される。第２ヒーター４５ａは例えば、外周部に取り付けられたフィルム状のヒーターであることができる。さらに、熱伝導性部材４１ａ、断熱部材４４および熱伝導性部材４１ｃを貫通する穴４４ａが設けられている。
【００３５】
第１温度制御部４９は、図１（ｂ）および図２に示されるように、第１ヒーター４９ａと、第１ヒーター４９ａを収容する第１ヒーター収容部（回転部４１の穴）４１ａとを含む。第１ヒーター４９は例えば棒状のヒーターであり、回転軸Ａに沿って、穴４４ａを貫通するように配置される。
【００３６】
第１ヒーター収容部４１に設けられた穴４１ａは、回転軸Ａに沿って設けられ、この穴４１ａに第１ヒーター４９ａが収容される。これにより、第１温度制御部４９は、チップ収容部４３に収容されるチップ１００のうち回転軸Ａ近傍の領域を所定の温度に調節することができる。より具体的には、第１温度制御部４９が、回転軸Ａに沿って設けられた第１ヒーター４９ａを含むことにより、回転軸Ａからの距離が大きくなるにつれて温度が小さくなるような温度勾配をチップ１００に生じさせることができる。第１ヒーター収容部４１ａは、円筒状の被覆部材４８ａ，４８ｂ内に配置されている。
【００３７】
例えば、チップ１００のうち第１のチャンバー１２が第２のチャンバー１４よりも回転軸Ａに近くなるように配置する場合、第１温度制御部４９によって、回転軸Ａ近傍の領域をＰＣＲの熱変性温度（例えば９５℃）に調節し、第２温度制御部４５によって、回転軸Ａ近傍から離れた領域をアニーリングおよび塩基配列の伸長が起こる温度（例えば６０℃）に調節することができる。これにより、チップ１００の第２のチャンバー１４のうち第１のチャンバー１２に近い側をＰＣＲの熱変性温度（例えば９５℃）に調節し、チップ１００の第２のチャンバー１４のうち第１のチャンバー１２から離れている側をアニーリングおよび塩基配列の伸長が起こる温度（例えば６０℃）に調節することができる。
【００３８】
図１（ａ）に示されるように、チップ１００が収容されるチップ収容部４３の外周部には第２温度制御部４５が配置されており、さらにその外側が保持部材４７ａ，４７ｂで挟まれている。保持部材４７ａ，４７ｂはそれぞれ被覆部材４８ａ，４８ｂを介して支持部材４６ａ，４６ｂに固定されている。回転部４１は被覆部材４８ａ，４８ｂに覆われており、被覆部材４８ａ，４８ｂの両端が支持部材４６ａ，４６ｂに固定されていることから、被覆部材４８ａ，４８ｂが図１（ａ）に示される矢印ＩまたはＩＩの方向に回転すると、保持部材４７ａ，４７ｂもともに、図１（ａ）に示される矢印Ｉまたは矢印ＩＩの方向に回転する。なお、本実施形態に係る核酸増幅装置４０は、回転部４１が取り付けられた支持部材４６ｂの外側に、回転部４１の回転を制御するモータを備えている。
【００３９】
また、回転部４１が回転軸Ａを中心に回転することにより、回転軸Ａを中心にチップ１００が回転する。すなわち、回転部４１にチップ保持部４７が固定されているため、回転部４１が回転軸Ａを中心に回転すると、チップ保持部４７も回転軸Ａを中心に回転する。なお、チップ１００の第１のチャンバー１２に供給された反応液３２（図５（ａ）参照）は、遠心分離装置（図示せず）を用いてチップ１００に対して遠心分離処理を施すことより、遠心力によって、連結部１６を介して第２のチャンバー１４に導入することができる（図５（ｂ）参照）。遠心処理は例えば１，０００〜１５，０００ｒｐｍで０．５〜５分間行うことができる。
【００４０】
１．２．チップの構成
次に、本実施形態に係る核酸増幅装置４０に設けられるチップ１００の構成について説明する。図３（ａ）は、本実施形態に係る核酸増幅装置に設けられるチップ１００の断面図であり、図３（ｂ）は、チップ１００の第１基板１０の平面図である。なお、後述する図４、図５（ａ）、図５（ｂ）、図６（ａ）、および図６（ｂ）でも図３（ｂ）と同様に、チップ１００の第１基板１０の平面図を示している。
【００４１】
チップ１００は、反応液３２が導入される核酸増幅用チップであり、図３（ａ）および図３（ｂ）に示されるように、第１のチャンバー１２と、第２のチャンバー１４と、第１のチャンバー１２と第２のチャンバー１４とを接続し、第２のチャンバー１４の最小幅ｄ2よりも小さい最大幅ｄ3を有する連結部１６とを含む。図３（ａ）に示されるように、チップ１００は２枚の透明基板（第１基板１０および第２基板２０）から構成されており、第１のチャンバー１２、第２のチャンバー１４および連結部１６を表面（第１の面）１０ａに有する第１基板１０と、穴２２を有する第２基板２０とが、穴２２が第１ウェル１２の供給口２３上に配置された状態で接着されている。
【００４２】
第１基板１０および第２基板２０の材質は限定されないが、耐熱性で自家蛍光が低いものが好ましく、例えば、ポリカーボネート等の樹脂が挙げられる。第１基板１０および第２基板２０の材質は、撥水性を有するため、後述する液滴３２がチップ１００中を容易に移動できる点で、樹脂が好ましい。また、後述するように、第２のチャンバー１４には、例えばマイクロピペットによる充填や真空充填などの方法により、所定の温度範囲内（例えば４５℃〜１００℃）で液滴（反応液）３２より比重が低くかつ液滴３２と混和しない液体３０を充填させることができる。
【００４３】
第１のチャンバー１２は、反応液を導入しうる供給口２３を有する。後述するように、第１のチャンバー１２の供給口２３から、核酸増幅を行うための反応液からなる液滴３２（図５（ａ）および図５（ｂ）参照）が導入される。
【００４４】
第２のチャンバー１４では、液滴３２の核酸増幅が行われる。第２のチャンバー１４には、後述するように、液体３０（図５（ａ）および図５（ｂ）参照）が充填される。また、第２のチャンバー１４内（例えば第２チャンバー１４の表面）には、標的核酸を増幅するための試薬が塗布されていてもよい。この試薬には、例えばプライマーや蛍光プローブが含まれる。この試薬は第２のチャンバー１４の表面に塗布された後、乾燥させた状態で該表面に配置されていてもよい。あるいは、試薬が液体３０内に液滴の状態で存在していてもよい。第２のチャンバー１４の表面に試薬が塗布されている場合、液滴（反応液）３２と接触することにより、液滴３２中に試薬が溶解することができる。なお、試薬は、標的核酸の種類に応じて適切なものを選択できる。したがって、本実施形態に係る核酸増幅装置４０が複数のチップ１００を使用する場合、チップ１００毎に異なる標的核酸を同時に増幅することができ、この場合、各標的核酸に応じた試薬を選択することが好ましい。
【００４５】
なお、増幅対象となる標的核酸としては、例えば、血液、尿、唾液、髄液等の検体中のＤＮＡ、または該検体から抽出したＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡ等が挙げられる。
【００４６】
図３（ｂ）に示されるように、連結部１６の最大幅ｄ3は、第２のチャンバー１４の最小幅ｄ2よりも小さい。これにより、後述する液滴（反応液）３２（図５参照）が第２のチャンバー１４から第１のチャンバー１２へと侵入するのを効果的に防止することができ、かつ、第１のチャンバー１２から第２のチャンバー１４への気泡の混入を防止するとともに、遠心分離処理による反応液の導入時に第２チャンバーに気泡が残留してしまうことを効果的に防止することができる。
【００４７】
より具体的には、液滴３２が球形である場合、液滴３２の直径をｄ（ｍｍ）とすると、液滴３２の体積（Ｖ＝πｄ3／６）は０．２〜２０μｌであることが好ましい。ここで、液滴３２の体積が２０μｌを超える場合、液滴３２が不安定となり壊れやすくなることがあり、一方、０．２μｌ未満である場合、粘性によって液滴３２の移動が遅くなることがある。
【００４８】
また、液滴３２の移動が円滑に行われる点で、第２のチャンバー１４の最小幅ｄ2＞ｄ＋０．２（ｍｍ）であることが好ましく、さらに、対流を低減できる点で、第２のチャンバー１４の最小幅ｄ2≦２．５（ｍｍ）であるのがより好ましい。
【００４９】
さらに、液滴３２が重力の影響を受けにくい点で、連結部１６の最大幅ｄ3＜ｄ×０．２（ｍｍ）であることが好ましく、また、液滴３２が遠心力により連結部１６をより円滑に通過できる点で、連結部１６の最大幅ｄ3≧０．１ｍｍであるのがより好ましい。
【００５０】
１．３．核酸増幅方法
次に、本実施形態に係る核酸増幅装置４０を用いた核酸増幅方法について説明する。本実施形態に係る核酸増幅方法は、反応液を用いて核酸増幅を行う方法であって、
反応液３２より比重が軽く、かつ、反応液３２と混和しない液体３０が充填された第２のチャンバー１４を有する核酸増幅用チップ１００の第１のチャンバー１２に反応液３２を導入する工程と、
遠心によって第１のチャンバー１２の反応液３２を第２のチャンバー１４に導入させる工程と、
核酸増幅用チップ（チップ）１００の一方の端部の温度を調節する工程と、
回転軸Ａを中心として核酸増幅用チップ１００を所定の速度で回転させる工程と、を含む。
【００５１】
本実施形態に係る核酸増幅方法によれば、反応液３２が第２のチャンバー１４に導入された状態で回転軸Ａを中心として核酸増幅用チップ１００を所定の速度で回転させることにより、重力によって前記一方の端部から他方の端部へと反応液３２を移動させることによって反応液３２の温度を調節することができ、前記一方の端部での温度領域から前記他方の端部での温度領域へと、反応液３２の温度を制御することができる。
まず、チップ１００への液体３０の充填方法について説明する。図４は、図３（ｂ）のチップに液体３０が充填された状態を説明する図である。まず、チップ１００の第２のチャンバー１４に、例えばマイクロピペットや真空充填などの方法により、液体３０を充填する。液体３０は例えば、第２のチャンバー１４に設けられた図示しない注入口から導入することができる。
【００５２】
液体３０としては、例えばオイルが挙げられる。オイルは、水より比重が軽く、水と混和せず、核酸増幅に使用する試薬および検体に影響を与えないものであれば特に限定されないが、例えばミネラルオイル、シリコンオイルが挙げられる、なお、液体３０の粘度を調節することにより、液滴（反応液）３２の移動速度を調節する（すなわち、液滴３２の温度変化を調節する）ことができる。
【００５３】
ここで、第２のチャンバー１４に気泡が残り難くなる観点から、液体３０は、第２のチャンバー１４の容積から反応液（液滴）３２の容積を引いた量以上、かつ、第１チャンバー１２の容積から反応液（液滴）３２の容積を引いた量と、第２のチャンバー１２の容積と、連結部１６の容積と、を足した量以内を充填させることができる。
【００５４】
次いで、図５（ａ）に示されるように、ウェル１００の蓋部２４を開き、穴２３から第１のチャンバー１２に液滴（反応液）３２を導入する。図５（ａ）は、図３（ｂ）のチップ１００に液滴３２が充填された状態を説明する図である。
【００５５】
液滴３２は例えば、マイクロピペットを用いて第１のチャンバー１２に導入することができる。また、液滴３２は例えば、標的核酸を含みうる検体、ＰＣＲマスターミックス、プライマー、蛍光プローブを適切な濃度に調整して混合されたものである。なお、第２のチャンバー１４の表面にプライマーや蛍光プローブ等の試薬が塗布されている場合、液滴３２は該試薬を含まないものであってもよい。また、導入する液滴３２の好ましい量は上述したとおりである。
【００５６】
続いて、第１のチャンバー１２の穴２２を例えばシール等の蓋部２４で封止した状態で、遠心分離装置（図示せず）の回転中心から第２のチャンバー１４までの距離が、遠心分離装置の回転中心から第１のチャンバー１２までの距離よりも大きくなるような配置にて、遠心分離機にチップ１００を取り付ける。遠心分離装置としては、市販されている公知のものを使用することができる。これにより、遠心分離装置によって、遠心力を利用して、第１のチャンバー１２から第２のチャンバー１４の方向に液滴３２を移動させる。その結果、液滴３２は第１のチャンバー１２から連結部１６を介して第２のチャンバー１４に導入され、図５（ｂ）に示されるように、第２のチャンバー１４の先端（第１のチャンバー１２から離れた側の先端）まで移動する。図５（ｂ）は、図３（ｂ）のチップ１００内を液滴３２が移動した状態を説明する図である。
【００５７】
次に、得られたチップ１００の第１のチャンバー１２が回転軸Ａの近傍に配置され、第２のチャンバー１４が測定用ポート４３ｂ近傍に配置されるように、本実施形態に係る核酸増幅装置４０にチップ１００を取り付ける。
【００５８】
この場合、第１温度制御部４９によって、回転軸Ａに近い領域が第１の温度に保持され、第２温度制御部４５によって、回転軸Ａから離れた領域が、第１の温度より低い（高い）第２の温度で保持される場合、チップ１００を回転させる際に重力を利用して、液滴３２の位置を回転軸Ａから離れた領域に移動させることにより、液滴３２を第２の温度に調節することができ、また、チップ１００を回転させる際に重力を利用して、液滴３２の位置を回転軸Ａ近傍の領域に移動させることにより、液滴３２を第１の温度に調節することができる。
【００５９】
例えば、第１の温度がＰＣＲの熱変性温度（例えば９５℃）であり、第２の温度がアニーリングおよび塩基配列の伸長が起こる温度（例えば６０℃）である場合、重力を利用して、液滴３２を適切な位置に移動させることにより、液滴３２を所定の温度に調節して、核酸増幅を行うことができる。なお、この工程では、重力を利用するため、地面とチップ１００とのなす角（鋭角）θ1が０＜θ1＜９０°になるように本実施形態に係る核酸増幅装置４０を配置する。
【００６０】
より具体的には、チップ１００を回転させる際に重力を利用して、図６（ａ）に示されるように、チップ１００の第１のチャンバー１２を第２のチャンバー１４よりも地面に近い位置に配置することにより、液体３０と液滴３２との比重の差によって、液滴３２は第２のチャンバー１４中において第１のチャンバー１２近傍に移動する。これにより、図３（ｂ）のチップ１００を回転軸Ａに近い領域における温度（第１の温度）に調節することができる（工程１）。
【００６１】
また、チップ１００を回転させる際に重力を利用して、図６（ｂ）に示されるように、チップ１００の第２のチャンバー１４を第１のチャンバー１２よりも重力方向側に配置することにより、液体３０と液滴３２との比重の差によって、液滴３２は第２のチャンバー１４中で第１のチャンバー１２から離れた位置に移動する。これにより、液滴３２を回転軸Ａから離れた領域における温度（第１の温度より低い（高い）第２の温度）に調節することができる（工程２）。
【００６２】
上記の工程１および工程２を繰り返すことにより、液滴３２に含まれうる標的核酸の増幅を行うことができる。なお、工程１および工程２の繰り返しは例えば、１〜２０回／分行なうことができる。
【００６３】
なお、第１基板１０ａが例えば樹脂からなる場合、チップ１００を構成する第１基板１０ａの表面が撥水性を有するため、液滴３２がチップ１００の表面１０ａに付着するのを防止することができる。これにより、液滴３２をチップ１００中で容易に移動させることができる。
【００６４】
１．４．特徴
本実施形態に係る核酸増幅装置４０によれば、チップ収容部４３にチップ１００に装着させた状態で回転部４１によって回転軸Ａを中心にチップ１００を回転させる。ここで、チップ１００の第２のチャンバー１４内の液滴３２は液体３０より比重が重いため、回転によりチップ１００の向きを変えることにより、液滴３２は第２のチャンバー１４の中を沈降しながら周期的に移動する。この動作を繰り返すことにより、液滴３２を所定の位置に配置することで、所定の温度（すなわちＰＣＲの温度サイクルの温度）に調節することができる。
【００６５】
したがって、本実施形態に係る核酸増幅装置４０によれば、公知のＰＣＲ用の温度調節方法（例えば、チューブを差し込んだヒートブロックについて過熱冷却を繰り返す方法や、反応チューブを複数のヒートブロック間で移動させる方式）に比べて、核酸増幅に要する反応液量を低減することができ、温度制御が簡単であり、かつ消費電力を低減することができるうえ、短時間で核酸増幅を行うことができる。
【００６６】
２．第２実施形態
図７（ａ）〜図７（ｃ）は、本発明の第２実施形態に係る核酸増幅装置１４０を説明する斜視図である（図７（ａ）は核酸増幅装置１４０の全体図、図７（ｂ）は図７（ａ）の核酸増幅装置１４０から保持部材４７ｂおよび第２温度制御部４５を取り外した図、図７（ｃ）は図７（ｂ）の核酸増幅装置４０から測定用ポート４３ｂ、断熱部材１４４およびチップ２００を取り外した図。）。
【００６７】
２．１．核酸増幅装置の構成
本実施形態に係る核酸増幅装置１４０は、第１のチャンバー１２と、第２のチャンバー１４と、第１のチャンバー１２と第２のチャンバー１４とを接続する連結部１６を含む核酸増幅用チップ（チップ）２００（図８参照）を用いて核酸増幅を行う点で、第１実施形態に係る核酸増幅装置４０とは異なる。なお、本実施形態に係る核酸増幅装置１４０において、第１実施形態に係る核酸増幅装置４０と共通の構成については共通の符号を付して詳しい説明を省略する。
【００６８】
図８は、本実施形態に係る核酸増幅装置１４０に設けられるチップ２００の平面図である。
【００６９】
チップ２００は図８に示されるように、反応液３２が導入される核酸増幅用チップであり、チップ２００の中央部に配置された第１のチャンバー２１２と、反応部２１１とを有する。反応部２１１は、第２のチャンバー２１４と、第１のチャンバー２１２と第２のチャンバー２１４とを接続する連結部２１６とを含む。
【００７０】
また、チップ２００は反応部２１１を複数含み、複数の反応部２１１は、それぞれ第１のチャンバー２１２に接続されており、かつ、チップ２００の中央部から放射線状方向に配置されている。また、第１のチャンバー２１２、第２のチャンバー２１４、および連結部２１６は、基板（第１基板２１０）の第１の面２１０ａに設けられている。また、連結部２１６の最大幅ｄ3は、各第２のチャンバー２１４の最小幅ｄ2よりも小さい。
【００７１】
また、反応部２１１において、第２のチャンバー２１４は、連結部２１６を介して第１のチャンバー２１２に接続されている。さらに、第１のチャンバー２１２は、反応液（液滴）３２を供給しうる導入口２２２ａと、第１のチャンバー２１２内の空気を排出しうる排出口２２２ｂとを含む。導入口２２２ａおよび排出口２２２ｂはそれぞれ、溝２１８および溝２１９を介して第１のチャンバー２１２と接続されている。チップ２００が１個の第１のチャンバー２１２と、この第１のチャンバー２１２に連結部２１６を介して接続される複数の第２のチャンバー２１４と、反応液（液滴）３２を供給しうる導入口２２２ａと、第１のチャンバー２１２内の空気を排出しうる排出口２２２ｂとを有することにより、１回の反応液供給動作ですべての第２のチャンバー２１４に反応液３２を供給することができる。
【００７２】
また、チップ２００を構成する第１基板２１０および第２基板２２０は例えば図８に示されるように円形状であり、第１のチャンバー２１２が第１基板２１０の中央部に配置され、複数の第２のチャンバー２１４が第１のチャンバー２１２より外側に、チップ２００の中央部から放射線状方向に配置されている。
【００７３】
第１のチャンバー２１２は図８に示されるように、第２のチャンバー２１４に対向する部分の幅が大きく、隣り合う第２のチャンバー２１４の間に位置する部分の幅が小さくなるような形状を有する。第１のチャンバー２１２がこのような形状を有することにより、遠心処理を施した時に、第１のチャンバー２１２間で反応液３２の移動および残留が生じるのを防止することができ、また、複数の第２のチャンバー２１４それぞれに導入される反応液の量をほぼ均一にすることができる。
【００７４】
図９（ａ）〜図９（ｃ）は、図８のチップ２００に液体３０および液滴３２を充填する方法を説明する断面図である。なお、図９（ａ）〜図９（ｃ）は、図８のＸ−Ｘ’における断面を示している。
【００７５】
図９（ａ）に示されるように、第１のチャンバー２１２および第２のチャンバー２１４は第１基板２１０に設けられている。第２基板２２０には、穴２２２ａおよび穴２２４が設けられている。この穴２２２ａは第１のチャンバー２１２の上に設けられ、穴２２４は第２のチャンバー２１４の上に設けられている。第１基板２１０および第２基板２２０としては、第１実施形態における第１基板１０および第２基板２０と同様のものを使用することができる。
【００７６】
まず、図９（ｂ）に示されるように、例えばピペット３４を用いて、穴２２４から第２のチャンバー２１４に液体３０を導入する。液体３０の材質および導入方法は第１実施形態で説明した通りである。次いで、図９（ｃ）に示されるように、例えばピペット３４を用いて、第１のチャンバー２１２に液滴３２を導入する。液滴３２の材質および導入方法は第１実施形態で説明した通りである。
【００７７】
次に、図８のチップ２００を用いて核酸増幅を行う工程について説明する。図１０（ａ）〜図１０（ｄ）は、図８のチップ２００を用いて核酸増幅を行う工程を説明する平面図である。
【００７８】
まず、図１０（ａ）に示されるように、図７（ｂ）に示される手順によって、第２のチャンバー２１４に液体３０を導入する。次に、図１０（ｂ）に示されるように、図７（ｃ）に示される手順によって、第１のチャンバー２１２に反応液３２を導入する。次いで、図１０（ｃ）に示されるように、チップ２００を遠心分離装置（図示せず）に取り付けて遠心処理を施すことにより、遠心力を利用して、第１のチャンバー２１２内の反応液３２を、連結部２１６を介して第２のチャンバー２１４内に導入する。これにより、反応液は液滴３２として、第２のチャンバー２１４内において回転軸Ａから離れた位置（チップ２００の外周部近傍）に移動する。遠心処理は例えば１，０００〜１５，０００ｒｐｍで０．５〜５分間行うことができる。遠心分離装置としては、第１実施形態で使用する遠心分離装置と同様に、市販されている公知のものを使用することができる。
【００７９】
続いて、図１０（ｄ）に示されるように、チップ２００を本実施形態に係る核酸増幅装置１４０に取り付け、回転部４１によりチップ２００を回転させる際に、重力を利用することにより、液滴３２を第２のチャンバー２１４内において回転軸Ａ近傍に移動させる。この状態で、回転軸Ａ近傍に液滴３２を保持することにより、液滴３２を回転軸Ａ近傍の第１の温度に調節することができる（図１０（ｄ）の左上の第２のチャンバー２１４参照、工程３）。
【００８０】
さらに、所定時間経過後に、再び回転部４１によりチップ２００を回転させる際に、重力を利用することにより、液滴３２を第２のチャンバー２１４内において回転軸Ａから離れた位置（例えば図１０（ｃ）で示される位置）に移動させる。これにより、この状態で、第２のチャンバー２１４内において回転軸Ａから離れた位置に液滴３２を保持することにより、液滴３２を回転軸Ａから離れた第２の温度に調節することができる（図１０（ｄ）の右下の第２のチャンバー２１４参照、工程４）。
【００８１】
上記の工程３および工程４を繰り返すことにより、液滴３２に含まれうる標的核酸の増幅を行うことができる。なお、工程３および工程４における重力を利用したチップ２００の回転速度は１〜２０回／分であり、工程３および工程４の繰り返しは例えば、２０〜６０回行なうことができる。なお、工程３および工程４では、重力を利用するため、地面とチップ２００とのなす角（鋭角）θ2が０＜θ2＜９０°になるように本実施形態に係る核酸増幅装置１４０を配置する。
【００８２】
２．２．変形例
図１１は、図８のチップ２００の一変形例であるチップ３００を示す平面図である。図１１に示されるチップ３００は、第１のチャンバー２１２の形状が図８に示されるチップ２００と異なる点以外は、チップ２００と同様の構成を有する。このため、チップ２００と同様の機能を有する構成要素については同じ符号を付して、詳しい説明は省略する。
【００８３】
図１１に示されるチップ３００は、ほぼ同一幅の波型形状の第１のチャンバー３１２を有する。この第１のチャンバー３１２は、波型の頂上部分において、連結部２１６を介して各第２のチャンバー２１４に接続されている。この形状の第１のチャンバー３１２によって、第１のチャンバー３１２から各第２のチャンバー２１４へとより容易に液滴３２を導入することができる。
【００８４】
２．３．特徴
本実施形態に係る核酸増幅装置１４０によれば、上述した第１実施形態に係る核酸増幅装置４０と同様の作用効果を有する。さらに、本実施形態に係る核酸増幅装置１４０によれば、チップ２００（３００）の第１のチャンバー２１２（３１２）が複数の第２のチャンバー２１４に接続されているため、一回の操作ですべての第２のチャンバー２１４に反応液３２を供給することができる。
【００８５】
本発明に係る実施の形態の説明は以上である。本発明は、実施の形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法及び結果が同一の構成、あるいは目的及び結果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。
【符号の説明】
【００８６】
１０，２１０…基板（第１基板），２０，２２０…基板（第２基板）、１０ａ，２１０ａ…第１の面、１２，２１２，３１２…第１のチャンバー、１４，２１４…第２のチャンバー、１６，２１６…連結部、２２，２２４…穴、２３…供給口、２４…蓋部、３０…液体、３２…液滴（反応液）、３４…ピペット、４０，１４０…核酸増幅装置、４１…回転部、４１ａ…穴（第１ヒーター４９ａの収容部）、４１ｂ，４１ｃ…熱伝導性部材、４２ａ，４２ｂ…断熱部材、４３…チップ収容部、４３ａ，４３ｃ…熱伝導性部材、４３ｂ…測定用ポート、４４，１４４…断熱部材、４４ａ…穴、４５…第２温度制御部、４５ａ…第２ヒーター、４５ｃ…支持部材、４６ａ，４６ｂ…支持部材、４７…チップ保持部、４７ａ，４７ｂ…保持部材、４８ａ，４８ｂ…被覆部材、４９…第１温度制御部、４９ａ…第１ヒーター、１００，２００，３００…チップ、２１１…反応部、２１８，２１９…溝、２２２a…穴（導入口）、２２２ｂ…穴（排出口）、ｄ1…第１のチャンバーの最大幅、ｄ2…第２のチャンバーの最大幅、ｄ3…連結部の最大幅。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅方法および核酸増幅装置、ならびに核酸増幅用チップに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡやＲＮＡ等の遺伝子を検査するための方法として、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）が例えば研究用および臨床検査用に広く用いられている（特許文献１）。このＰＣＲでは通常、標的核酸を含みうる検体および試薬を含む反応液を容器に入れ、サーマルサイクラーと呼ばれる温度制御装置を用いて、例えば９５℃、７４℃、５５℃という複数段階の温度変化を繰り返すことにより標的核酸を増幅させる。しかしながら、ＰＣＲでは通常、反応液を一定の温度に調節するのに時間がかかることが、作業効率の向上を妨げる一要因となっている。また、作業時間短縮のために反応液を急速に加熱または冷却すると、消費電力が大きくなるうえ、サーマルサイクラーの温度制御を司る温度制御素子の耐久性を下げるおそれがある。
【０００３】
そこで、ＰＣＲ反応をより効率良く行うために、所定の温度に制御されたサーマルサイクラーの温度制御素子に対して反応液を移動させ、反応液の温度変化を生じさせる技術も提案されている（特許文献２）。しかし、この温度制御方法では、反応容器内に残る気泡により温度勾配が乱され、標的核酸増幅における温度制御の効率が低下してしまうことがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特公平４−６７９５７号公報
【特許文献２】特願２００７−３１８６２７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、反応液導入時に気泡が内部に残り難い核酸増幅用チップを提供し、かつ、前記核酸増幅用チップを用いることで、省電力化および低コスト化を達成でき、かつ増幅に要する時間を短縮できる核酸増幅方法および核酸増幅装置を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一態様に係る核酸増幅方法は、
反応液を用いて核酸増幅を行う方法であって、
前記反応液より比重が軽く、かつ、前記反応液と混和しない液体が充填された第２のチャンバーを有する核酸増幅用チップの第１のチャンバーに前記反応液を導入する工程と、
遠心によって前記第１のチャンバーの前記反応液を前記第２のチャンバーに導入させる工程と、
前記核酸増幅用チップの一方の端部の温度を調節する工程と、
回転軸を中心として前記核酸増幅用チップを所定の速度で回転させる工程と、を含む。
【０００７】
上記核酸増幅方法によれば、反応液より比重が軽く反応液と混和しない液体が充填された第２のチャンバーを有する核酸増幅用チップの第１のチャンバーに反応液を供給し、遠心して前記第１のチャンバーから前記第２のチャンバーに前記反応液を移動させ、前記核酸増幅用チップの一方の端部の温度を調節し、回転軸を中心として前記核酸増幅用チップを所定の速度で回転させるので、重力を利用して前記一方の端部から他方の端部へと前記反応液を移動させることができ、前記一方の端部での温度領域から前記他方の端部での温度領域へと、前記反応液の温度を制御することができる。
【０００８】
また、予め前記反応液より比重が軽く前記反応液と混和しない前記液体が前記第２のチャンバーに充填されているので、遠心することにより気泡を残さずに前記反応液を前記第１のチャンバーから前記第２のチャンバーへ移動させることができる。これにより、気泡によって前記第２チャンバーに充填された前記液体の温度勾配が乱されることがなくなるので、前記反応液の温度をより効率良く制御できる。
【０００９】
本発明の別の一態様に係る反応液が導入される核酸増幅用チップは、
反応液が導入される核酸増幅用チップであって、
第１のチャンバーと、
第２のチャンバーと、
前記第１のチャンバーと前記第２のチャンバーとを接続し、前記第２のチャンバーの最小幅よりも小さい最大幅を有する連結部と、
前記第２のチャンバーに充填された液体と、を有し、
前記液体は、所定の温度範囲内では比重が反応液よりも軽く、かつ、反応液とは混和しない。
【００１０】
上記核酸増幅用チップにおいて、前記連結部の最大幅は、前記第１のチャンバーの最小幅よりも小さいとより好適である。本発明において、連結部の最大幅とは、連結部のうち最も広い部分の幅をいい、第１のチャンバー（第２のチャンバー）の最小幅とは、第１のチャンバー（第２のチャンバー）のうち最も狭い部分の幅をいう。
【００１１】
上記核酸増幅用チップによれば、第１のチャンバーと、第２のチャンバーと、前記第１のチャンバーと前記第２のチャンバーとを接続し、かつ、前記第２のチャンバーの最小幅よりも小さい最大幅を持つ連結部と、第２のチャンバーに充填された所定の温度範囲内では比重が反応液よりも軽く反応液とは混和しない液体と、を有するので、前記反応液が第１のチャンバーから第２のチャンバーへ導入された場合に、前記反応液と前記液体とが分離された状態にすることができる。これにより、前記第２のチャンバー内における前記反応液の位置を容易に確認することができる。なお、前記反応液と前記液体とが分離された状態においては前記反応液が球状になることから、本発明で前記第２のチャンバーに導入された前記反応液を液滴と表現することもある。
【００１２】
さらに、上記核酸増幅用チップの前記第２のチャンバーに充填する液体の量を、前記第２のチャンバーの容積から前記反応液の容積を引いた量以上、かつ、前記第１チャンバーの容積から前記反応液の容積を引いた量と、前記第２のチャンバーの容積と、前記連結部の容積と、を足した量以内にすることで、前記第２のチャンバー内に気泡が残り難くすることができる。
【００１３】
本発明の別の一態様に係る核酸増幅装置は、
反応液が導入される核酸増幅用チップを用いた核酸増幅装置であって、
前記核酸増幅用チップは、
第１のチャンバーと、
第２のチャンバーと、
前記第１のチャンバーと前記第２のチャンバーとを接続し、前記第２チャンバーの最小幅より小さい最大幅を有する連結部と、
前記第２のチャンバーに充填された液体と、を含み、
前記液体は、所定の温度範囲内では比重が前記反応液よりも軽く、かつ、前記反応液とは混和せず、
前記核酸増幅装置は、
前記核酸増幅用チップを設置可能なチップ保持部と、
回転軸を中心に前記チップ保持部を所定の回転速度で回転させる回転部と、
前記回転軸に沿って設けられた温度制御部と、を含み、
前記回転部は、回転時に重力方向における前記第２のチャンバー内の最下点と前記回転軸との距離が変化するように前記チップ保持部を回転させる。
【００１４】
上記核酸増幅装置において、前記核酸増幅用チップは、前記第２のチャンバーと、前記第１のチャンバーと前記第２チャンバーとを接続する前記連結部と、を含む反応部と、を有し、複数の前記反応部は、それぞれ前記第１チャンバーに接続されていることができる。
【００１５】
上記核酸増幅装置において、前記温度制御部は、第１温度制御部と第２温度制御部とからなり、前記第２温度制御部は、前記第１温度制御部よりも前記回転軸から遠い位置に設けられていることができる。
【００１６】
上記核酸増幅装置において、前記第２のチャンバー内に、標的核酸を増幅するための試薬が塗布されていることができる。なお、本発明において「標的核酸」とは、本発明の核酸増幅装置による増幅対象となる核酸のことをいう。
【００１７】
上記核酸増幅装置によれば、前記回転部によって、前記チップ保持部により保持された前記核酸増幅用チップの前記第２のチャンバー内の重力方向における最下点と前記回転軸との距離が変化するように前記核酸増幅用チップを回転させることができるので、前記回転軸に沿って設けられた温度制御部によって、前記核酸増幅用チップ内の所定の位置を所定の温度に調節することができる。これにより、前記核酸増幅用チップ内に導入される反応液の温度をより効率良く調節することができるので、省電力化および低コスト化を達成でき、かつ増幅に要する時間を短縮できる。
【００１８】
本発明の他の一態様に係る核酸増幅用チップは、
反応液が導入される核酸増幅用チップであって、
前記核酸増幅用チップの中央部に配置された第１のチャンバーと、
第２のチャンバーと、前記第１のチャンバーと前記第２チャンバーとを接続する連結部と、を含む反応部と、を有し、
前記反応部を複数含み、
複数の前記反応部は、それぞれ前記第１のチャンバーに接続されており、かつ、前記中央部から放射線状方向に配置されている。
【００１９】
上記核酸増幅用チップを用いて核酸増幅を行うことにより、複数の前記反応部毎に異なる試薬を使用することが可能となるので、異なる標的核酸を同時に増幅することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の第１実施形態に係る核酸増幅装置を説明する斜視図（図１（ａ）は核酸増幅装置の全体図、図１（ｂ）は図１（ａ）の核酸増幅装置から保持部材を取り外した図、図１（ｃ）は図１（ｂ）の核酸増幅装置から断熱部材を取り外した図。）。
【図２】図１（ｂ）の第１温度制御部、第２温度制御部および核酸増幅用チップ収容部を抜き出して、回転軸Ａの延びる方向と垂直な方向（図１（ａ）〜図１（ｃ）の左側）から記載した拡大図。
【図３】本発明の第１実施形態に係る核酸増幅装置に設けられる核酸増幅用チップの断面図（図３（ａ））および前記核酸増幅用チップの第１基板の平面図（図３（ｂ））。
【図４】図３（ｂ）の核酸増幅用チップに液体が充填された状態を説明する図。
【図５】図３（ｂ）の核酸増幅用チップに液滴が充填された状態を説明する図（図５（ａ））および図３（ｂ）の核酸増幅用チップ内の液体中を液滴が移動する状態を説明する図（図５（ｂ））。
【図６】図３（ｂ）の核酸増幅用チップを第１の温度で保持する状態を説明する図（図６（ａ））および図３（ｂ）の核酸増幅用チップを第２の温度で保持する状態を説明する図（図６（ｂ））。
【図７】本発明の第２実施形態に係る核酸増幅装置を説明する斜視図（図７（ａ）は核酸増幅装置の全体図、図７（ｂ）は図７（ａ）の装置から保持部材および第２温度制御部を取り外した図、図７（ｃ）は図７（ｂ）の装置から測定用ポート、断熱部材および核酸増幅用チップを取り外した図。）。
【図８】本発明の第２実施形態に係る核酸増幅装置に設けられる核酸増幅用チップの平面図。
【図９】図８の核酸増幅用チップに液体および液滴を充填する方法を説明する断面図（図９（ａ）〜図９（ｃ））。
【図１０】図８の核酸増幅用チップを用いて核酸増幅を行う工程を説明する平面図（図１０（ａ）〜図１０（ｄ））。
【図１１】図８の核酸増幅用チップの一変形例を示す平面図。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下に、本発明の一実施形態に係る核酸増幅方法および核酸増幅装置、ならびに核酸増幅用チップ（チップ）について具体的に説明する。
【００２２】
１．第１実施形態
図１（ａ）〜図１（ｃ）は、本発明の第１実施形態に係る核酸増幅装置４０を説明する斜視図である（図１（ａ）は核酸増幅装置４０の全体図、図１（ｂ）は図１（ａ）の核酸増幅装置４０から保持部材４７ｂを取り外した図、図１（ｃ）は図１（ｂ）の核酸増幅装置４０から断熱部材４４を取り外した図。）。
【００２３】
１．１．核酸増幅装置の構成
図１（ａ）〜図１（ｃ）に示されるように、本実施形態に係る核酸増幅装置４０は、温度制御部（第１温度制御部４９および第２温度制御部４５）と、チップ１００を設置可能なチップ保持部４７と、回転軸Ａを中心にチップ１００を回転させる回転部４１とを含む。
【００２４】
チップ１００は、図３（ａ）および図３（ｂ）に示されるように、第１のチャンバー１２と、第２のチャンバー１４と、第１のチャンバー１２と第２のチャンバー１４とを接続する連結部１６とを基板１０の第１の面１０ａに有する。
【００２５】
チップ保持部４７は、回転時にチップ１００の長手方向に重力が作用するようにチップ１００を保持する。
【００２６】
温度制御部は、チップ１００の所定の位置を所定の温度に調節する。第１温度制御部４９は回転軸Ａに沿って設けられている。
【００２７】
チップ回転部４９は、回転時に重力方向における第２のチャンバー１４内の最下点と回転軸Ａとの距離が変化するようにチップ１００を回転させる。
【００２８】
核酸増幅装置４０には、複数のチップ収容部４３が、回転軸Ａに対称にかつ回転軸Ａの中心から放射線状方向に配置されており、１つのチップ収容部４３内に、１つのチップ１００（図１（ａ）〜図１（ｃ）ではチップ１００は図示せず）が収容されている。図１（ｂ）および図１（ｃ）に示されるように、隣り合うチップ収容部４３の間には断熱部材４４が配置されており、隣り合うチップ収容部４３の間での熱の移動を遮断している。チップ収容部４３には例えば、チップ１００（図６（ａ）および図６（ｂ）参照）の第１のチャンバー１２が第２のチャンバー１４よりも回転軸Ａに近くなるようにチップ１００を収容することができる。なお、チップ１００の第２のチャンバー１４が第１のチャンバー１２よりも回転軸Ａに近くなるようにチップ１００を収容してもよい。
【００２９】
図２は、図１（ｂ）の第１温度制御部４９および第２温度制御部４５ならびにチップ収容部４３を抜き出して、回転軸Ａの延びる方向と垂直な方向（図１（ａ）〜図１（ｃ）の左側）から記載した拡大図である。
【００３０】
本実施形態に係る核酸増幅装置４０では、温度制御部は、第１温度制御部４９と第２温度制御部４５とからなり、第２温度制御部４５は図１（ｂ）に示されるように、第１温度制御部４９よりも回転軸Ａから遠い位置に設けられている。また、第１温度制御部４９は図１（ｂ）に示されるように、回転軸Ａに沿って設けることができる。
【００３１】
第２温度制御部４５は、図２に示されるように、円盤状の形状を有する。すなわち、第２温度制御部４５は、外周部に設けられた第２ヒーター４５ａを有する。
【００３２】
回転部４１は、回転軸Ａを中心にチップ保持部４７を所定の回転速度で回転させることによってチップ１００を回転させる。回転部４１は例えばアルミ等の金属からなる。また、図２に示されるように、回転部４１の外周には、断熱部材４４が設けられ、この断熱部材４４を挟むように２枚の熱伝導性部材４１ｂ，４１ｃが配置されている。熱伝導性部材４１ｂ、断熱部材４２ａ、および熱伝導性部材４３ａが同心円盤を構成し、また、熱伝導性部材４１ｃ、断熱部材４２ｂ、および熱伝導性部材４３ｃが同心円盤を構成し、これらの２枚の同心円盤がチップ収容部４３および断熱部材４４を挟むように配置されている。また、回転部４１の少なくとも一部が、熱伝導性部材４１ｂ、断熱部材４４および熱伝導性部材４１ｃを貫通する穴４４ａ内に設けられている。熱伝導性部材４１ｂ，４１ｃは例えばアルミ等の金属からなる。
【００３３】
また、チップ１００を収容するチップ収容部４３は、チップ１００からの情報を光学的に読み取る光学的検出部（測定用ポート）４３ｂを有する。すなわち、光学的検出部４３ｂは第２のチャンバー１４内で増幅された核酸の濃度を測定する。光学的検出部４３ｂの近傍には、ＬＥＤおよびＣＣＤセンサ（図示せず）等を配置することができる。これにより、本実施形態による核酸増幅装置４０を用いてリアルタイムＰＣＲを行う場合、チップ１００が回転中にＣＣＤセンサに対向したときに、第２のチャンバー１４内で増幅された核酸の濃度を光学的に測定することができるため、サイクル毎の増幅産物量を測定することができる。
【００３４】
熱伝導性部材４３ａ，４３ｃは第２ヒーター４５ａに接している。熱伝導性部材４３ａ，４３ｃは例えばアルミなどの金属からなる。第２ヒーター４５ａの熱が熱伝導性部材４３ａ，４３ｃに伝搬することで、チップ収容部４３内のチップ１００の所定の位置が所定の温度に調節される。第２ヒーター４５ａは例えば、外周部に取り付けられたフィルム状のヒーターであることができる。さらに、熱伝導性部材４１ａ、断熱部材４４および熱伝導性部材４１ｃを貫通する穴４４ａが設けられている。
【００３５】
第１温度制御部４９は、図１（ｂ）および図２に示されるように、第１ヒーター４９ａと、第１ヒーター４９ａを収容する第１ヒーター収容部（回転部４１の穴）４１ａとを含む。第１ヒーター４９は例えば棒状のヒーターであり、回転軸Ａに沿って、穴４４ａを貫通するように配置される。
【００３６】
第１ヒーター収容部４１に設けられた穴４１ａは、回転軸Ａに沿って設けられ、この穴４１ａに第１ヒーター４９ａが収容される。これにより、第１温度制御部４９は、チップ収容部４３に収容されるチップ１００のうち回転軸Ａ近傍の領域を所定の温度に調節することができる。より具体的には、第１温度制御部４９が、回転軸Ａに沿って設けられた第１ヒーター４９ａを含むことにより、回転軸Ａからの距離が大きくなるにつれて温度が小さくなるような温度勾配をチップ１００に生じさせることができる。第１ヒーター収容部４１ａは、円筒状の被覆部材４８ａ，４８ｂ内に配置されている。
【００３７】
例えば、チップ１００のうち第１のチャンバー１２が第２のチャンバー１４よりも回転軸Ａに近くなるように配置する場合、第１温度制御部４９によって、回転軸Ａ近傍の領域をＰＣＲの熱変性温度（例えば９５℃）に調節し、第２温度制御部４５によって、回転軸Ａ近傍から離れた領域をアニーリングおよび塩基配列の伸長が起こる温度（例えば６０℃）に調節することができる。これにより、チップ１００の第２のチャンバー１４のうち第１のチャンバー１２に近い側をＰＣＲの熱変性温度（例えば９５℃）に調節し、チップ１００の第２のチャンバー１４のうち第１のチャンバー１２から離れている側をアニーリングおよび塩基配列の伸長が起こる温度（例えば６０℃）に調節することができる。
【００３８】
図１（ａ）に示されるように、チップ１００が収容されるチップ収容部４３の外周部には第２温度制御部４５が配置されており、さらにその外側が保持部材４７ａ，４７ｂで挟まれている。保持部材４７ａ，４７ｂはそれぞれ被覆部材４８ａ，４８ｂを介して支持部材４６ａ，４６ｂに固定されている。回転部４１は被覆部材４８ａ，４８ｂに覆われており、被覆部材４８ａ，４８ｂの両端が支持部材４６ａ，４６ｂに固定されていることから、被覆部材４８ａ，４８ｂが図１（ａ）に示される矢印ＩまたはＩＩの方向に回転すると、保持部材４７ａ，４７ｂもともに、図１（ａ）に示される矢印Ｉまたは矢印ＩＩの方向に回転する。なお、本実施形態に係る核酸増幅装置４０は、回転部４１が取り付けられた支持部材４６ｂの外側に、回転部４１の回転を制御するモータを備えている。
【００３９】
また、回転部４１が回転軸Ａを中心に回転することにより、回転軸Ａを中心にチップ１００が回転する。すなわち、回転部４１にチップ保持部４７が固定されているため、回転部４１が回転軸Ａを中心に回転すると、チップ保持部４７も回転軸Ａを中心に回転する。なお、チップ１００の第１のチャンバー１２に供給された反応液３２（図５（ａ）参照）は、遠心分離装置（図示せず）を用いてチップ１００に対して遠心分離処理を施すことより、遠心力によって、連結部１６を介して第２のチャンバー１４に導入することができる（図５（ｂ）参照）。遠心処理は例えば１，０００〜１５，０００ｒｐｍで０．５〜５分間行うことができる。
【００４０】
１．２．チップの構成
次に、本実施形態に係る核酸増幅装置４０に設けられるチップ１００の構成について説明する。図３（ａ）は、本実施形態に係る核酸増幅装置に設けられるチップ１００の断面図であり、図３（ｂ）は、チップ１００の第１基板１０の平面図である。なお、後述する図４、図５（ａ）、図５（ｂ）、図６（ａ）、および図６（ｂ）でも図３（ｂ）と同様に、チップ１００の第１基板１０の平面図を示している。
【００４１】
チップ１００は、反応液３２が導入される核酸増幅用チップであり、図３（ａ）および図３（ｂ）に示されるように、第１のチャンバー１２と、第２のチャンバー１４と、第１のチャンバー１２と第２のチャンバー１４とを接続し、第２のチャンバー１４の最小幅ｄ2よりも小さい最大幅ｄ3を有する連結部１６とを含む。図３（ａ）に示されるように、チップ１００は２枚の透明基板（第１基板１０および第２基板２０）から構成されており、第１のチャンバー１２、第２のチャンバー１４および連結部１６を表面（第１の面）１０ａに有する第１基板１０と、穴２２を有する第２基板２０とが、穴２２が第１ウェル１２の供給口２３上に配置された状態で接着されている。
【００４２】
第１基板１０および第２基板２０の材質は限定されないが、耐熱性で自家蛍光が低いものが好ましく、例えば、ポリカーボネート等の樹脂が挙げられる。第１基板１０および第２基板２０の材質は、撥水性を有するため、後述する液滴３２がチップ１００中を容易に移動できる点で、樹脂が好ましい。また、後述するように、第２のチャンバー１４には、例えばマイクロピペットによる充填や真空充填などの方法により、所定の温度範囲内（例えば４５℃〜１００℃）で液滴（反応液）３２より比重が低くかつ液滴３２と混和しない液体３０を充填させることができる。
【００４３】
第１のチャンバー１２は、反応液を導入しうる供給口２３を有する。後述するように、第１のチャンバー１２の供給口２３から、核酸増幅を行うための反応液からなる液滴３２（図５（ａ）および図５（ｂ）参照）が導入される。
【００４４】
第２のチャンバー１４では、液滴３２の核酸増幅が行われる。第２のチャンバー１４には、後述するように、液体３０（図５（ａ）および図５（ｂ）参照）が充填される。また、第２のチャンバー１４内（例えば第２チャンバー１４の表面）には、標的核酸を増幅するための試薬が塗布されていてもよい。この試薬には、例えばプライマーや蛍光プローブが含まれる。この試薬は第２のチャンバー１４の表面に塗布された後、乾燥させた状態で該表面に配置されていてもよい。あるいは、試薬が液体３０内に液滴の状態で存在していてもよい。第２のチャンバー１４の表面に試薬が塗布されている場合、液滴（反応液）３２と接触することにより、液滴３２中に試薬が溶解することができる。なお、試薬は、標的核酸の種類に応じて適切なものを選択できる。したがって、本実施形態に係る核酸増幅装置４０が複数のチップ１００を使用する場合、チップ１００毎に異なる標的核酸を同時に増幅することができ、この場合、各標的核酸に応じた試薬を選択することが好ましい。
【００４５】
なお、増幅対象となる標的核酸としては、例えば、血液、尿、唾液、髄液等の検体中のＤＮＡ、または該検体から抽出したＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡ等が挙げられる。
【００４６】
図３（ｂ）に示されるように、連結部１６の最大幅ｄ3は、第２のチャンバー１４の最小幅ｄ2よりも小さい。これにより、後述する液滴（反応液）３２（図５参照）が第２のチャンバー１４から第１のチャンバー１２へと侵入するのを効果的に防止することができ、かつ、第１のチャンバー１２から第２のチャンバー１４への気泡の混入を防止するとともに、遠心分離処理による反応液の導入時に第２チャンバーに気泡が残留してしまうことを効果的に防止することができる。
【００４７】
より具体的には、液滴３２が球形である場合、液滴３２の直径をｄ（ｍｍ）とすると、液滴３２の体積（Ｖ＝πｄ3／６）は０．２〜２０μｌであることが好ましい。ここで、液滴３２の体積が２０μｌを超える場合、液滴３２が不安定となり壊れやすくなることがあり、一方、０．２μｌ未満である場合、粘性によって液滴３２の移動が遅くなることがある。
【００４８】
また、液滴３２の移動が円滑に行われる点で、第２のチャンバー１４の最小幅ｄ2＞ｄ＋０．２（ｍｍ）であることが好ましく、さらに、対流を低減できる点で、第２のチャンバー１４の最小幅ｄ2≦２．５（ｍｍ）であるのがより好ましい。
【００４９】
さらに、液滴３２が重力の影響を受けにくい点で、連結部１６の最大幅ｄ3＜ｄ×０．２（ｍｍ）であることが好ましく、また、液滴３２が遠心力により連結部１６をより円滑に通過できる点で、連結部１６の最大幅ｄ3≧０．１ｍｍであるのがより好ましい。
【００５０】
１．３．核酸増幅方法
次に、本実施形態に係る核酸増幅装置４０を用いた核酸増幅方法について説明する。本実施形態に係る核酸増幅方法は、反応液を用いて核酸増幅を行う方法であって、
反応液３２より比重が軽く、かつ、反応液３２と混和しない液体３０が充填された第２のチャンバー１４を有する核酸増幅用チップ１００の第１のチャンバー１２に反応液３２を導入する工程と、
遠心によって第１のチャンバー１２の反応液３２を第２のチャンバー１４に導入させる工程と、
核酸増幅用チップ（チップ）１００の一方の端部の温度を調節する工程と、
回転軸Ａを中心として核酸増幅用チップ１００を所定の速度で回転させる工程と、を含む。
【００５１】
本実施形態に係る核酸増幅方法によれば、反応液３２が第２のチャンバー１４に導入された状態で回転軸Ａを中心として核酸増幅用チップ１００を所定の速度で回転させることにより、重力によって前記一方の端部から他方の端部へと反応液３２を移動させることによって反応液３２の温度を調節することができ、前記一方の端部での温度領域から前記他方の端部での温度領域へと、反応液３２の温度を制御することができる。
まず、チップ１００への液体３０の充填方法について説明する。図４は、図３（ｂ）のチップに液体３０が充填された状態を説明する図である。まず、チップ１００の第２のチャンバー１４に、例えばマイクロピペットや真空充填などの方法により、液体３０を充填する。液体３０は例えば、第２のチャンバー１４に設けられた図示しない注入口から導入することができる。
【００５２】
液体３０としては、例えばオイルが挙げられる。オイルは、水より比重が軽く、水と混和せず、核酸増幅に使用する試薬および検体に影響を与えないものであれば特に限定されないが、例えばミネラルオイル、シリコンオイルが挙げられる、なお、液体３０の粘度を調節することにより、液滴（反応液）３２の移動速度を調節する（すなわち、液滴３２の温度変化を調節する）ことができる。
【００５３】
ここで、第２のチャンバー１４に気泡が残り難くなる観点から、液体３０は、第２のチャンバー１４の容積から反応液（液滴）３２の容積を引いた量以上、かつ、第１チャンバー１２の容積から反応液（液滴）３２の容積を引いた量と、第２のチャンバー１２の容積と、連結部１６の容積と、を足した量以内を充填させることができる。
【００５４】
次いで、図５（ａ）に示されるように、ウェル１００の蓋部２４を開き、穴２３から第１のチャンバー１２に液滴（反応液）３２を導入する。図５（ａ）は、図３（ｂ）のチップ１００に液滴３２が充填された状態を説明する図である。
【００５５】
液滴３２は例えば、マイクロピペットを用いて第１のチャンバー１２に導入することができる。また、液滴３２は例えば、標的核酸を含みうる検体、ＰＣＲマスターミックス、プライマー、蛍光プローブを適切な濃度に調整して混合されたものである。なお、第２のチャンバー１４の表面にプライマーや蛍光プローブ等の試薬が塗布されている場合、液滴３２は該試薬を含まないものであってもよい。また、導入する液滴３２の好ましい量は上述したとおりである。
【００５６】
続いて、第１のチャンバー１２の穴２２を例えばシール等の蓋部２４で封止した状態で、遠心分離装置（図示せず）の回転中心から第２のチャンバー１４までの距離が、遠心分離装置の回転中心から第１のチャンバー１２までの距離よりも大きくなるような配置にて、遠心分離機にチップ１００を取り付ける。遠心分離装置としては、市販されている公知のものを使用することができる。これにより、遠心分離装置によって、遠心力を利用して、第１のチャンバー１２から第２のチャンバー１４の方向に液滴３２を移動させる。その結果、液滴３２は第１のチャンバー１２から連結部１６を介して第２のチャンバー１４に導入され、図５（ｂ）に示されるように、第２のチャンバー１４の先端（第１のチャンバー１２から離れた側の先端）まで移動する。図５（ｂ）は、図３（ｂ）のチップ１００内を液滴３２が移動した状態を説明する図である。
【００５７】
次に、得られたチップ１００の第１のチャンバー１２が回転軸Ａの近傍に配置され、第２のチャンバー１４が測定用ポート４３ｂ近傍に配置されるように、本実施形態に係る核酸増幅装置４０にチップ１００を取り付ける。
【００５８】
この場合、第１温度制御部４９によって、回転軸Ａに近い領域が第１の温度に保持され、第２温度制御部４５によって、回転軸Ａから離れた領域が、第１の温度より低い（高い）第２の温度で保持される場合、チップ１００を回転させる際に重力を利用して、液滴３２の位置を回転軸Ａから離れた領域に移動させることにより、液滴３２を第２の温度に調節することができ、また、チップ１００を回転させる際に重力を利用して、液滴３２の位置を回転軸Ａ近傍の領域に移動させることにより、液滴３２を第１の温度に調節することができる。
【００５９】
例えば、第１の温度がＰＣＲの熱変性温度（例えば９５℃）であり、第２の温度がアニーリングおよび塩基配列の伸長が起こる温度（例えば６０℃）である場合、重力を利用して、液滴３２を適切な位置に移動させることにより、液滴３２を所定の温度に調節して、核酸増幅を行うことができる。なお、この工程では、重力を利用するため、地面とチップ１００とのなす角（鋭角）θ1が０＜θ1＜９０°になるように本実施形態に係る核酸増幅装置４０を配置する。
【００６０】
より具体的には、チップ１００を回転させる際に重力を利用して、図６（ａ）に示されるように、チップ１００の第１のチャンバー１２を第２のチャンバー１４よりも地面に近い位置に配置することにより、液体３０と液滴３２との比重の差によって、液滴３２は第２のチャンバー１４中において第１のチャンバー１２近傍に移動する。これにより、図３（ｂ）のチップ１００を回転軸Ａに近い領域における温度（第１の温度）に調節することができる（工程１）。
【００６１】
また、チップ１００を回転させる際に重力を利用して、図６（ｂ）に示されるように、チップ１００の第２のチャンバー１４を第１のチャンバー１２よりも重力方向側に配置することにより、液体３０と液滴３２との比重の差によって、液滴３２は第２のチャンバー１４中で第１のチャンバー１２から離れた位置に移動する。これにより、液滴３２を回転軸Ａから離れた領域における温度（第１の温度より低い（高い）第２の温度）に調節することができる（工程２）。
【００６２】
上記の工程１および工程２を繰り返すことにより、液滴３２に含まれうる標的核酸の増幅を行うことができる。なお、工程１および工程２の繰り返しは例えば、１〜２０回／分行なうことができる。
【００６３】
なお、第１基板１０ａが例えば樹脂からなる場合、チップ１００を構成する第１基板１０ａの表面が撥水性を有するため、液滴３２がチップ１００の表面１０ａに付着するのを防止することができる。これにより、液滴３２をチップ１００中で容易に移動させることができる。
【００６４】
１．４．特徴
本実施形態に係る核酸増幅装置４０によれば、チップ収容部４３にチップ１００に装着させた状態で回転部４１によって回転軸Ａを中心にチップ１００を回転させる。ここで、チップ１００の第２のチャンバー１４内の液滴３２は液体３０より比重が重いため、回転によりチップ１００の向きを変えることにより、液滴３２は第２のチャンバー１４の中を沈降しながら周期的に移動する。この動作を繰り返すことにより、液滴３２を所定の位置に配置することで、所定の温度（すなわちＰＣＲの温度サイクルの温度）に調節することができる。
【００６５】
したがって、本実施形態に係る核酸増幅装置４０によれば、公知のＰＣＲ用の温度調節方法（例えば、チューブを差し込んだヒートブロックについて過熱冷却を繰り返す方法や、反応チューブを複数のヒートブロック間で移動させる方式）に比べて、核酸増幅に要する反応液量を低減することができ、温度制御が簡単であり、かつ消費電力を低減することができるうえ、短時間で核酸増幅を行うことができる。
【００６６】
２．第２実施形態
図７（ａ）〜図７（ｃ）は、本発明の第２実施形態に係る核酸増幅装置１４０を説明する斜視図である（図７（ａ）は核酸増幅装置１４０の全体図、図７（ｂ）は図７（ａ）の核酸増幅装置１４０から保持部材４７ｂおよび第２温度制御部４５を取り外した図、図７（ｃ）は図７（ｂ）の核酸増幅装置４０から測定用ポート４３ｂ、断熱部材１４４およびチップ２００を取り外した図。）。
【００６７】
２．１．核酸増幅装置の構成
本実施形態に係る核酸増幅装置１４０は、第１のチャンバー１２と、第２のチャンバー１４と、第１のチャンバー１２と第２のチャンバー１４とを接続する連結部１６を含む核酸増幅用チップ（チップ）２００（図８参照）を用いて核酸増幅を行う点で、第１実施形態に係る核酸増幅装置４０とは異なる。なお、本実施形態に係る核酸増幅装置１４０において、第１実施形態に係る核酸増幅装置４０と共通の構成については共通の符号を付して詳しい説明を省略する。
【００６８】
図８は、本実施形態に係る核酸増幅装置１４０に設けられるチップ２００の平面図である。
【００６９】
チップ２００は図８に示されるように、反応液３２が導入される核酸増幅用チップであり、チップ２００の中央部に配置された第１のチャンバー２１２と、反応部２１１とを有する。反応部２１１は、第２のチャンバー２１４と、第１のチャンバー２１２と第２のチャンバー２１４とを接続する連結部２１６とを含む。
【００７０】
また、チップ２００は反応部２１１を複数含み、複数の反応部２１１は、それぞれ第１のチャンバー２１２に接続されており、かつ、チップ２００の中央部から放射線状方向に配置されている。また、第１のチャンバー２１２、第２のチャンバー２１４、および連結部２１６は、基板（第１基板２１０）の第１の面２１０ａに設けられている。また、連結部２１６の最大幅ｄ3は、各第２のチャンバー２１４の最小幅ｄ2よりも小さい。
【００７１】
また、反応部２１１において、第２のチャンバー２１４は、連結部２１６を介して第１のチャンバー２１２に接続されている。さらに、第１のチャンバー２１２は、反応液（液滴）３２を供給しうる導入口２２２ａと、第１のチャンバー２１２内の空気を排出しうる排出口２２２ｂとを含む。導入口２２２ａおよび排出口２２２ｂはそれぞれ、溝２１８および溝２１９を介して第１のチャンバー２１２と接続されている。チップ２００が１個の第１のチャンバー２１２と、この第１のチャンバー２１２に連結部２１６を介して接続される複数の第２のチャンバー２１４と、反応液（液滴）３２を供給しうる導入口２２２ａと、第１のチャンバー２１２内の空気を排出しうる排出口２２２ｂとを有することにより、１回の反応液供給動作ですべての第２のチャンバー２１４に反応液３２を供給することができる。
【００７２】
また、チップ２００を構成する第１基板２１０および第２基板２２０は例えば図８に示されるように円形状であり、第１のチャンバー２１２が第１基板２１０の中央部に配置され、複数の第２のチャンバー２１４が第１のチャンバー２１２より外側に、チップ２００の中央部から放射線状方向に配置されている。
【００７３】
第１のチャンバー２１２は図８に示されるように、第２のチャンバー２１４に対向する部分の幅が大きく、隣り合う第２のチャンバー２１４の間に位置する部分の幅が小さくなるような形状を有する。第１のチャンバー２１２がこのような形状を有することにより、遠心処理を施した時に、第１のチャンバー２１２間で反応液３２の移動および残留が生じるのを防止することができ、また、複数の第２のチャンバー２１４それぞれに導入される反応液の量をほぼ均一にすることができる。
【００７４】
図９（ａ）〜図９（ｃ）は、図８のチップ２００に液体３０および液滴３２を充填する方法を説明する断面図である。なお、図９（ａ）〜図９（ｃ）は、図８のＸ−Ｘ’における断面を示している。
【００７５】
図９（ａ）に示されるように、第１のチャンバー２１２および第２のチャンバー２１４は第１基板２１０に設けられている。第２基板２２０には、穴２２２ａおよび穴２２４が設けられている。この穴２２２ａは第１のチャンバー２１２の上に設けられ、穴２２４は第２のチャンバー２１４の上に設けられている。第１基板２１０および第２基板２２０としては、第１実施形態における第１基板１０および第２基板２０と同様のものを使用することができる。
【００７６】
まず、図９（ｂ）に示されるように、例えばピペット３４を用いて、穴２２４から第２のチャンバー２１４に液体３０を導入する。液体３０の材質および導入方法は第１実施形態で説明した通りである。次いで、図９（ｃ）に示されるように、例えばピペット３４を用いて、第１のチャンバー２１２に液滴３２を導入する。液滴３２の材質および導入方法は第１実施形態で説明した通りである。
【００７７】
次に、図８のチップ２００を用いて核酸増幅を行う工程について説明する。図１０（ａ）〜図１０（ｄ）は、図８のチップ２００を用いて核酸増幅を行う工程を説明する平面図である。
【００７８】
まず、図１０（ａ）に示されるように、図７（ｂ）に示される手順によって、第２のチャンバー２１４に液体３０を導入する。次に、図１０（ｂ）に示されるように、図７（ｃ）に示される手順によって、第１のチャンバー２１２に反応液３２を導入する。次いで、図１０（ｃ）に示されるように、チップ２００を遠心分離装置（図示せず）に取り付けて遠心処理を施すことにより、遠心力を利用して、第１のチャンバー２１２内の反応液３２を、連結部２１６を介して第２のチャンバー２１４内に導入する。これにより、反応液は液滴３２として、第２のチャンバー２１４内において回転軸Ａから離れた位置（チップ２００の外周部近傍）に移動する。遠心処理は例えば１，０００〜１５，０００ｒｐｍで０．５〜５分間行うことができる。遠心分離装置としては、第１実施形態で使用する遠心分離装置と同様に、市販されている公知のものを使用することができる。
【００７９】
続いて、図１０（ｄ）に示されるように、チップ２００を本実施形態に係る核酸増幅装置１４０に取り付け、回転部４１によりチップ２００を回転させる際に、重力を利用することにより、液滴３２を第２のチャンバー２１４内において回転軸Ａ近傍に移動させる。この状態で、回転軸Ａ近傍に液滴３２を保持することにより、液滴３２を回転軸Ａ近傍の第１の温度に調節することができる（図１０（ｄ）の左上の第２のチャンバー２１４参照、工程３）。
【００８０】
さらに、所定時間経過後に、再び回転部４１によりチップ２００を回転させる際に、重力を利用することにより、液滴３２を第２のチャンバー２１４内において回転軸Ａから離れた位置（例えば図１０（ｃ）で示される位置）に移動させる。これにより、この状態で、第２のチャンバー２１４内において回転軸Ａから離れた位置に液滴３２を保持することにより、液滴３２を回転軸Ａから離れた第２の温度に調節することができる（図１０（ｄ）の右下の第２のチャンバー２１４参照、工程４）。
【００８１】
上記の工程３および工程４を繰り返すことにより、液滴３２に含まれうる標的核酸の増幅を行うことができる。なお、工程３および工程４における重力を利用したチップ２００の回転速度は１〜２０回／分であり、工程３および工程４の繰り返しは例えば、２０〜６０回行なうことができる。なお、工程３および工程４では、重力を利用するため、地面とチップ２００とのなす角（鋭角）θ2が０＜θ2＜９０°になるように本実施形態に係る核酸増幅装置１４０を配置する。
【００８２】
２．２．変形例
図１１は、図８のチップ２００の一変形例であるチップ３００を示す平面図である。図１１に示されるチップ３００は、第１のチャンバー２１２の形状が図８に示されるチップ２００と異なる点以外は、チップ２００と同様の構成を有する。このため、チップ２００と同様の機能を有する構成要素については同じ符号を付して、詳しい説明は省略する。
【００８３】
図１１に示されるチップ３００は、ほぼ同一幅の波型形状の第１のチャンバー３１２を有する。この第１のチャンバー３１２は、波型の頂上部分において、連結部２１６を介して各第２のチャンバー２１４に接続されている。この形状の第１のチャンバー３１２によって、第１のチャンバー３１２から各第２のチャンバー２１４へとより容易に液滴３２を導入することができる。
【００８４】
２．３．特徴
本実施形態に係る核酸増幅装置１４０によれば、上述した第１実施形態に係る核酸増幅装置４０と同様の作用効果を有する。さらに、本実施形態に係る核酸増幅装置１４０によれば、チップ２００（３００）の第１のチャンバー２１２（３１２）が複数の第２のチャンバー２１４に接続されているため、一回の操作ですべての第２のチャンバー２１４に反応液３２を供給することができる。
【００８５】
本発明に係る実施の形態の説明は以上である。本発明は、実施の形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法及び結果が同一の構成、あるいは目的及び結果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。
【符号の説明】
【００８６】
１０，２１０…基板（第１基板），２０，２２０…基板（第２基板）、１０ａ，２１０ａ…第１の面、１２，２１２，３１２…第１のチャンバー、１４，２１４…第２のチャンバー、１６，２１６…連結部、２２，２２４…穴、２３…供給口、２４…蓋部、３０…液体、３２…液滴（反応液）、３４…ピペット、４０，１４０…核酸増幅装置、４１…回転部、４１ａ…穴（第１ヒーター４９ａの収容部）、４１ｂ，４１ｃ…熱伝導性部材、４２ａ，４２ｂ…断熱部材、４３…チップ収容部、４３ａ，４３ｃ…熱伝導性部材、４３ｂ…測定用ポート、４４，１４４…断熱部材、４４ａ…穴、４５…第２温度制御部、４５ａ…第２ヒーター、４５ｃ…支持部材、４６ａ，４６ｂ…支持部材、４７…チップ保持部、４７ａ，４７ｂ…保持部材、４８ａ，４８ｂ…被覆部材、４９…第１温度制御部、４９ａ…第１ヒーター、１００，２００，３００…チップ、２１１…反応部、２１８，２１９…溝、２２２a…穴（導入口）、２２２ｂ…穴（排出口）、ｄ1…第１のチャンバーの最大幅、ｄ2…第２のチャンバーの最大幅、ｄ3…連結部の最大幅。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応液を用いて核酸増幅を行う方法であって、
前記反応液より比重が軽く、かつ、前記反応液と混和しない液体が充填された第２のチャンバーを有する核酸増幅用チップの第１のチャンバーに前記反応液を導入する工程と、
遠心によって前記第１のチャンバーの前記反応液を前記第２のチャンバーに導入させる工程と、
前記核酸増幅用チップの一方の端部の温度を調節する工程と、
回転軸を中心として前記核酸増幅用チップを所定の速度で回転させる工程と、を含む、核酸増幅方法。
【請求項２】
反応液が導入される核酸増幅用チップであって、
第１のチャンバーと、
第２のチャンバーと、
前記第１のチャンバーと前記第２のチャンバーとを接続し、前記第２のチャンバーの最小幅よりも小さい最大幅を有する連結部と、
前記第２のチャンバーに充填された液体と、を含み、
前記液体は、所定の温度範囲内では比重が反応液よりも軽く、かつ、反応液と混和しない、核酸増幅用チップ。
【請求項３】
請求項２に記載の核酸増幅用チップであって、
前記液体は、前記第２のチャンバーの容積から前記反応液の容積を引いた量以上、かつ、
前記第１チャンバーの容積から前記反応液の容積を引いた量と、前記第２のチャンバーの容積と、前記連結部の容積と、を足した量以内が充填されている、前記核酸増幅用チップ。
【請求項４】
反応液が導入される核酸増幅用チップを用いた核酸増幅装置であって、
前記核酸増幅用チップは、
第１のチャンバーと、
第２のチャンバーと、
前記第１のチャンバーと前記第２のチャンバーとを接続し、前記第２チャンバーの最小幅より小さい最大幅を有する連結部と、
前記第２のチャンバーに充填された液体と、を含み、
前記液体は、所定の温度範囲内では比重が前記反応液よりも軽く、かつ、反応液と混和せず、
前記核酸増幅装置は、
前記核酸増幅用チップを設置可能なチップ保持部と、
回転軸を中心に前記チップ保持部を所定の回転速度で回転させることによって前記核酸増幅用チップを回転させる回転部と、
前記回転軸に沿って設けられた温度制御部と、を含み、
前記回転部は、回転時に重力方向における前記第２のチャンバー内の最下点と前記回転軸との距離が変化するように前記核酸増幅用チップを回転させる、前記核酸増幅装置。
【請求項５】
請求項４に記載の核酸増幅装置であって、
前記核酸増幅用チップは、
前記第２のチャンバーと、前記第１のチャンバーと前記第２のチャンバーとを接続する前記連結部と、を含む反応部を有し、
複数の前記反応部は、それぞれ前記第１のチャンバーに接続されている、核酸増幅装置。
【請求項６】
請求項４または５記載の核酸増幅装置であって、
前記温度制御部は、
第１温度制御部と第２温度制御部とからなり、
前記第２温度制御部は、
前記第１温度制御部よりも前記回転軸から遠い位置に設けられている、核酸増幅装置。
【請求項７】
請求項４ないし６のいずれか１項に記載の核酸増幅装置であって、
前記第２のチャンバー内に、標的核酸を増幅するための試薬が塗布されている、核酸増幅装置。
【請求項８】
反応液が導入される核酸増幅用チップであって、
前記核酸増幅用チップの中央部に配置された第１のチャンバーと、
第２のチャンバーと、前記第１のチャンバーと前記第２チャンバーとを接続する連結部と、を含む反応部と、を有し、
前記反応部を複数含み、
複数の前記反応部は、それぞれ前記第１のチャンバーに接続されており、かつ、前記中央部から放射線状方向に配置されている、前記核酸増幅用チップ。
【請求項１】
反応液を用いて核酸増幅を行う方法であって、
前記反応液より比重が軽く、かつ、前記反応液と混和しない液体が充填された第２のチャンバーを有する核酸増幅用チップの第１のチャンバーに前記反応液を導入する工程と、
遠心によって前記第１のチャンバーの前記反応液を前記第２のチャンバーに導入させる工程と、
前記核酸増幅用チップの一方の端部の温度を調節する工程と、
回転軸を中心として前記核酸増幅用チップを所定の速度で回転させる工程と、を含む、核酸増幅方法。
【請求項２】
反応液が導入される核酸増幅用チップであって、
第１のチャンバーと、
第２のチャンバーと、
前記第１のチャンバーと前記第２のチャンバーとを接続し、前記第２のチャンバーの最小幅よりも小さい最大幅を有する連結部と、
前記第２のチャンバーに充填された液体と、を含み、
前記液体は、所定の温度範囲内では比重が反応液よりも軽く、かつ、反応液と混和しない、核酸増幅用チップ。
【請求項３】
請求項２に記載の核酸増幅用チップであって、
前記液体は、前記第２のチャンバーの容積から前記反応液の容積を引いた量以上、かつ、
前記第１チャンバーの容積から前記反応液の容積を引いた量と、前記第２のチャンバーの容積と、前記連結部の容積と、を足した量以内が充填されている、前記核酸増幅用チップ。
【請求項４】
反応液が導入される核酸増幅用チップを用いた核酸増幅装置であって、
前記核酸増幅用チップは、
第１のチャンバーと、
第２のチャンバーと、
前記第１のチャンバーと前記第２のチャンバーとを接続し、前記第２チャンバーの最小幅より小さい最大幅を有する連結部と、
前記第２のチャンバーに充填された液体と、を含み、
前記液体は、所定の温度範囲内では比重が前記反応液よりも軽く、かつ、反応液と混和せず、
前記核酸増幅装置は、
前記核酸増幅用チップを設置可能なチップ保持部と、
回転軸を中心に前記チップ保持部を所定の回転速度で回転させることによって前記核酸増幅用チップを回転させる回転部と、
前記回転軸に沿って設けられた温度制御部と、を含み、
前記回転部は、回転時に重力方向における前記第２のチャンバー内の最下点と前記回転軸との距離が変化するように前記核酸増幅用チップを回転させる、前記核酸増幅装置。
【請求項５】
請求項４に記載の核酸増幅装置であって、
前記核酸増幅用チップは、
前記第２のチャンバーと、前記第１のチャンバーと前記第２のチャンバーとを接続する前記連結部と、を含む反応部を有し、
複数の前記反応部は、それぞれ前記第１のチャンバーに接続されている、核酸増幅装置。
【請求項６】
請求項４または５記載の核酸増幅装置であって、
前記温度制御部は、
第１温度制御部と第２温度制御部とからなり、
前記第２温度制御部は、
前記第１温度制御部よりも前記回転軸から遠い位置に設けられている、核酸増幅装置。
【請求項７】
請求項４ないし６のいずれか１項に記載の核酸増幅装置であって、
前記第２のチャンバー内に、標的核酸を増幅するための試薬が塗布されている、核酸増幅装置。
【請求項８】
反応液が導入される核酸増幅用チップであって、
前記核酸増幅用チップの中央部に配置された第１のチャンバーと、
第２のチャンバーと、前記第１のチャンバーと前記第２チャンバーとを接続する連結部と、を含む反応部と、を有し、
前記反応部を複数含み、
複数の前記反応部は、それぞれ前記第１のチャンバーに接続されており、かつ、前記中央部から放射線状方向に配置されている、前記核酸増幅用チップ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図５】
【図６】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図５】
【図６】
【図１０】
【公開番号】特開２０１１−１５２１２６（Ｐ２０１１−１５２１２６Ａ）
【公開日】平成２３年８月１１日（２０１１．８．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２２３５４６（Ｐ２０１０−２２３５４６）
【出願日】平成２２年１０月１日（２０１０．１０．１）
【分割の表示】特願２０１０−１２８８０（Ｐ２０１０−１２８８０）の分割
【原出願日】平成２２年１月２５日（２０１０．１．２５）
【出願人】（０００００２３６９）セイコーエプソン株式会社 (51,324)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年８月１１日（２０１１．８．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月１日（２０１０．１０．１）
【分割の表示】特願２０１０−１２８８０（Ｐ２０１０−１２８８０）の分割
【原出願日】平成２２年１月２５日（２０１０．１．２５）
【出願人】（０００００２３６９）セイコーエプソン株式会社 (51,324)
【Ｆターム（参考）】
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