植物からポリヒドロキシアルカノエートを単離する方法
【課題】トランスジェニック油料作物植物のような植物からポリヒドロキシアルカノエート（「ＰＨＡ」）を分離するための方法を提供することを本発明の課題とする。
【解決手段】１つの実施態様では、ＰＨＡの単離のために、油料作物植物由来のバイオマスは、例えば、粉砕、破砕、または圧延によりプレプロセスされる。次いで、油を、第１の溶媒（この溶媒中に、油は溶解しかつＰＨＡはあまり溶解しない）を用いてバイオマスから抽出し、油を取り除く。次いで、バイオマスは、第２の溶媒（この溶媒中に、ＰＨＡは溶解する）を用いて抽出され、ＰＨＡをバイオマスから分離し得る。あるいは、ＰＨＡ含有バイオマスは、化学的薬剤または生化学的薬剤で処理され、ＰＨＡをＰＨＡ誘導体に化学的に変換する。次いで、ＰＨＡ誘導体は、物理的分離プロセスを用いて混合物から分離される。
【解決手段】１つの実施態様では、ＰＨＡの単離のために、油料作物植物由来のバイオマスは、例えば、粉砕、破砕、または圧延によりプレプロセスされる。次いで、油を、第１の溶媒（この溶媒中に、油は溶解しかつＰＨＡはあまり溶解しない）を用いてバイオマスから抽出し、油を取り除く。次いで、バイオマスは、第２の溶媒（この溶媒中に、ＰＨＡは溶解する）を用いて抽出され、ＰＨＡをバイオマスから分離し得る。あるいは、ＰＨＡ含有バイオマスは、化学的薬剤または生化学的薬剤で処理され、ＰＨＡをＰＨＡ誘導体に化学的に変換する。次いで、ＰＨＡ誘導体は、物理的分離プロセスを用いて混合物から分離される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、植物からポリエステルを単離する領域に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）は、環境ストレスに応答して種々の生物により合成される、天然に存在するポリエステルのクラスである。概説のために、非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；ならびに非特許文献６を参照のこと。
【０００３】
ＰＨＡ生体ポリマーは、それらの側鎖の長さに応じて２つの群に分けられ得る。短い側鎖を有するもの（例えば、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、Ｒ−３−ヒドロキシ酪酸ユニットのホモポリマー）は、結晶熱可塑性プラスチックであるが、長い側鎖を有するＰＨＡは、よりエラストマー性である。前者は、約７０年間にわたって公知である（非特許文献７）が、一方、後者の物質は、１９８０年代初期に最初に同定された。非特許文献８。
【０００４】
短側鎖物質は、その早い発見およびその望ましい物理的特性のために、より広範に研究されてきた。天然の熱可塑性プラスチックであるＰＨＡポリマーは、従来のポリマー技術を用いてプロセッシングされ得、そして産業上有用な特性（例えば、土壌中および海洋環境における生分解性、生体適合性、ならびに良好なバリア特性）を有する。これらの特性により、これらの物質は、広範な産業上の適用に有用である。
【０００５】
ＰＨＡポリマーは、細菌の乾燥細胞重量の９０％までを構成し得、これらは細菌細胞内の分散顆粒（ｄｉｓｃｒｅｔｅｇｒａｎｕｌｅｓ）として見出される。これらのＰＨＡ顆粒は、栄養制限に応答して蓄積し、そして炭素およびエネルギーの保存物質として作用する。異なる経路が、各クラスのこれらのポリマーを産生する微生物により用いられる。短側鎖ポリヒドロキシアルカノエート（ＳＳＣＰＨＡ）に至る経路には、３つの酵素（チオラーゼ、レダクターゼ、およびＰＨＢシンターゼ（時々ポリメラーゼと呼ばれる））が挙げられる。この経路を用いて、アセチル−補酵素Ａの２分子を縮合して、アセトアセチル−補酵素Ａを得、続いてこの中間体をＲ−３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａに還元し、続いて重合することにより、ホモポリマーＰＨＢを合成する。この経路における最後の酵素（シンターゼ）は、Ｒ−４−ヒドロキシ酸ユニットおよびＲ−５−ヒドロキシ酸ユニットを含むＣ３〜Ｃ５モノマーユニットを適合し得る基質特異性を有する。この生合成経路は、例えば、細菌ＺｏｏｇｌｏｅａｒａｍｉｇｅｒａおよびＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｅｕｔｒｏｐｈｕｓ中に見出される。
【０００６】
長側鎖ポリヒドロキシアルカノエート（ＬＳＣＰＨＡ）を作製するのに用いられる生合成経路は、未だに部分的に不明であるが、ＬＳＣＰＨＡに至るモノマーヒドロキシアシルユニットは、脂肪酸のβ−酸化および脂肪酸経路により誘導されると現在考えられている。次いで、これらの経路から得られるＲ−３−ヒドロキシアシル−補酵素基質は、ＰＨＡシンターゼ（これは、Ｃ６〜Ｃ１４の範囲内にあるより大きいモノマーユニットを選択する（ｆａｖｏｒｉｎｇ）基質特異性を有する）により重合される。例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓにより、長側鎖ＰＨＡが産生される。
【０００７】
ＰＨＡの生合成は、生化学レベルおよび遺伝子レベルの両方において、広範な細菌において研究されており、そして非特許文献９において概説される。最初のＰＨＡシンターゼ遺伝子は１９８９年に同定されそして特徴付けされた（非特許文献１０；ならびにＰｅｏｐｌｅｓａｎｄ Ｓｉｎｓｋｅｙの特許文献１、特許文献２、および特許文献３）ので、多くの他の微生物ＰＨＡポリメラーゼが研究され、そしてそれらのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列が公開されている。非特許文献１１。より近年では、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍｖｉｎｏｓｕｍ（非特許文献１２；ならびに特許文献４）およびＴｈｉｏｃｙｓｔｉｓ ｖｉｏｌａｃｅａ（非特許文献１３）由来の２つのサブユニットＰＨＡシンターゼが記載されている。
【０００８】
例えば、Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａおよびＡ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓにおけるＳＳＣＰＨＡの産生を担う酵素をコードする遺伝子が単離され、そして配列決定されている。非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６、ならびに非特許文献１７；ならびに非特許文献１８。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第５，２２９，２７９号明細書
【特許文献２】米国特許第５，２４５，０２３号明細書
【特許文献３】米国特許第５，２５０，４３０号明細書
【特許文献４】国際公開第９３／０２１９４号パンフレット
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｂｙｒｏｍ， Ｄ．、「ＭｉｓｃｅｌｌａｎｅｏｕｓＢｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ」（Ｄ． Ｂｙｒｏｍ編、「Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ」ＭａｃＭｉｌｌａｎＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９９１、３３３−３５９頁中）
【非特許文献２】Ｈｏｃｋｉｎｇ、Ｐ．Ｊ． およびＭａｒｃｈｅｓｓａｕｌｔ， Ｒ． Ｈ．、「Ｂｉｏｐｏｌｙｅｓｔｅｒｓ」（Ｇ． Ｊ． Ｌ． Ｇｒｉｆｆｉｎ編、「ＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ」、Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９９４、４８−９６頁
【非特許文献３】Ｈｏｌｍｅｓ，Ｐ． Ａ．、「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ （Ｒ）−３−ｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅＰｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄＣｏｐｏｌｙｍｅｒｓ」（Ｄ． Ｃ． Ｂａｓｓｅｔｔ編、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｌｏｎｄｏｎ、第２巻、１９８８、１−６５頁中）
【非特許文献４】Ｌａｆｆｅｒｔｙら、「ＭｉｃｒｏｂｉａｌＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙ−β−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ」、Ｈ． Ｊ．ＲｅｈｍおよびＧ． Ｒｅｅｄ編、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、第６６巻、１９８８、１３５−１７６頁
【非特許文献５】ＭｕｌｌｅｒおよびＳｅｅｂａｃｈ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ、Ｅｎｇｌ．、３２：４７７−５０２（１９９３）
【非特許文献６】Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ， Ａ．、「ＰｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏｉｃＡｃｉｄｓ」、Ｂｙｒｏｍ， Ｄ．編、「Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ」、ＭａｃＭｉｌｌａｎＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９９１、１２３−２１３頁
【非特許文献７】ＬｅｍｏｉｇｎｅおよびＲｏｕｋｈｅｌｍａｎ、Ａｎｎａｌｅｓｄｅｓ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ， ５：５２７−５３６（１９２５）
【非特許文献８】Ｄｅ Ｓｍｅｔら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１５４：８７０−８７８（１９８３）
【非特許文献９】Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌら、ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ、１０３：２１７−２３０（１９９２）
【非特許文献１０】Ｐｅｏｐｌｅｓａｎｄ Ｓｉｎｓｋｅｙ、Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、２６４：１５２９８−１５３０３（１９８９）
【非特許文献１１】Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌら、ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ、１０３：２１７−２３０（１９９２）
【非特許文献１２】Ｌｉｅｂｅｒｓｇｅｓｅｌｌ，Ｍ．およびＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ， Ａ．、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２０９：１３５−１５０（１９９２）
【非特許文献１３】Ｔｈｉｏｃｙｓｔｉｓ ｖｉｏｌａｃｅａ（Ｌｉｅｂｅｒｓｇｅｓｅｌｌ， Ｍ．およびＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ， Ａ．、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３８：４９３−５０１（１９９３）
【非特許文献１４】ＰｅｏｐｌｅｓおよびＳｉｎｓｋｙ、Ｐｒｏｇ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３：５１−５６（１９８７）
【非特許文献１５】Ｐｅｏｐｌｅｓら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６２：９７−１０２（１９８７）
【非特許文献１６】ＰｅｏｐｌｅｓおよびＳｉｎｓｋｙ（１９８９）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：１５２９８−１５３０３、Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：１５２９３−１５２９７
【非特許文献１７】ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３：３４９−３５７；Ｓｌａｔｅｒら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７０：４４３１−４４３６（１９８８）
【非特許文献１８】Ｓｃｈｕｂｅｒｔら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７０：５８３７−５８４７（１９８８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ＰＨＡを産生する微生物は、６０％（全乾燥重量）より多くまでＰＨＡを産生し、これらは有機溶媒により容易に抽出され得る。Ｌａｆｆｅｒｔｙら、「ＭｉｃｒｏｂｉａｌＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆ Ｐｏｌｙ−β−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｉｃ Ａｃｉｄ」（Ｈ．Ｊ．ＲｅｈｍおよびＧ．Ｒｅｅｄ編、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、第６６巻、１９８８、１３５−１７６頁中）。植物において、ＰＨＡの抽出および回収は、大量の植物油の存在とより低い割合のＰＨＡにより、著しく複雑である。これらの複雑化要因のために、植物からのＰＨＡの首尾良い抽出、分離、および回収がより難しくなっている。
【００１２】
植物バイオマス（ｂｉｏｍａｓｓ）由来のポリヒドロキシアルカノエートの大規模なプロセシングおよび精製のための方法を開発することが必要とされている。従って、本発明の目的は、植物バイオマス由来のＰＨＡを大規模でプロセシングするための方法を提供することである。本発明の別の目的は、トランスジェニック油料作物植物（ｏｉｌｃｒｏｐｐｌａｎｔ）からＰＨＡを単離するための方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、植物油のような非ＰＨＡ産生物の回収もまた最大化されるように、油料種子作物植物（ｏｉｌｓｅｅｄｃｒｏｐ ｐｌａｎｔ）由来の植物バイオマスをプロセッシングするための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、以下を提供する。
（項目１） 植物油および粉（ｍｅａｌ）を含む植物バイオマスからポリヒドロキシアルカノエート（「ＰＨＡ」）を分離する方法であって、第１の溶媒を用いて該植物バイオマスを抽出して該バイオマスから該油を本質的に除去する工程、次いで、該植物バイオマスから該ＰＨＡを分離する工程を包含する、方法。
（項目２） 前記植物バイオマスが、トランスジェニック植物に由来する、項目１に記載の方法。
（項目３） 前記バイオマスから前記ＰＨＡを分離する前に、該ＰＨＡを誘導体化する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目４） 前記分離されたＰＨＡが、以下の式を有する１つ以上のユニットを含む、項目１に記載の方法であって：
−ＯＣＲ１Ｒ２（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＯ−
ここで、ｎは０または整数であり；そして
ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ、炭化水素基、ハロおよびヒドロキシ置換基、ヒドロキシ基、ハロゲン基、窒素置換基、酸素置換基、ならびに水素原子からなる群より独立して選択される、方法。
（項目５） 前記分離されたＰＨＡが、前記ユニットの、モノマー、ダイマー、直線状オリゴマーおよび環状オリゴマー、ならびにラクトンからなる群より選択される、項目４に記載の方法。
（項目６） 前記分離されたＰＨＡが、以下からなる群より選択される項目３に記載の方法であって：
次式で定義されるエステル：ＨＯＣＲ１Ｒ２（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＯ２Ｒ５；
次式で定義されるアミド：ＨＯＣＲ１Ｒ２（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＯＮＲ５Ｒ６；
次式で定義されるチオエステル：ＨＯＣＲ１Ｒ２（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＯＳＲ５；
次式で定義される酸：ＨＯＣＲ１Ｒ２（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＯ２Ｈ；
次式で定義されるエーテル：Ｒ６ＯＣＲ１Ｒ２（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＯ２Ｒ５；
次式で定義されるエステル：Ｒ６ＣＯ２Ｒ１Ｒ２（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＯ２Ｒ５；
次式で定義される不飽和化合物：
Ｒ１Ｒ２Ｃ＝ＣＲ３（ＣＲ４Ｒ５）ｎＣＯ２Ｒ６；および
Ｒ１Ｒ２Ｒ３ＣＣ（Ｒ４）＝Ｃ（Ｒ５）ＣＯ２Ｒ６；
次式で定義されるジオール：ＨＯＣＲ１Ｒ２（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＨ２ＯＨ；
次式で定義されるラクトンまたはマクロライド：
【００１４】
【化１】
ここで、ｘは整数である；ならびに
以下の式で定義されるケトンまたはアルデヒド：
【００１５】
【化２】
ここで、ｎは０または整数であり；そして
ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６はそれぞれ、炭化水素基、ハロおよびヒドロキシ置換基、ヒドロキシ基、ハロゲン基、窒素置換基、酸素置換基、ならびに水素原子からなる群より独立して選択される、方法。
（項目７） 項目１に記載の方法であって、
ａ）ＰＨＡを含有する植物バイオマスを提供する工程；
ｂ）該植物バイオマスをプレプロセシングして、該ＰＨＡ、油および植物粉を含有する混合物を得る工程；
ｃ）該油が溶解する温度にて、該油は溶解しかつ該ＰＨＡはあまり溶解しない第１の溶媒を用いて該混合物から該油を抽出し、該ＰＨＡを含有する残留粉混合物を得る工程；および
ｄ）該ＰＨＡが溶解する第２の溶媒を用いて、工程ｃ）において得られた該残留粉混合物を抽出し、該バイオマスから該ＰＨＡを分離する工程、
を包含する、方法。
（項目８） 項目１に記載の方法であって、
ａ）ＰＨＡを含有する植物バイオマスを提供する工程；
ｂ）該植物バイオマスをプレプロセシングして、該ＰＨＡ、油および植物粉を含有する混合物を得る工程；
ｃ）該油が溶解する温度にて、該油は溶解しかつ該ＰＨＡはあまり溶解しない第１の溶媒を用いて該混合物から該油を抽出し、該ＰＨＡを含有する残留粉混合物を得る工程；
ｄ）工程ｃ）において得られたＰＨＡを含有する該残留粉混合物を、少なくとも１つの化学的薬剤または生化学的薬剤で処理して、該ＰＨＡを化学的に誘導体化する工程；および
ｅ）工程ｄ）において得られた該残留粉混合物から誘導体化されたＰＨＡを分離する工程；
を包含する、方法。
（項目９） 前記工程ｂ）が、以下からなる群より選択される１つ以上のプロセス：乾燥、皮むき、クリーニング、エイジング、秤量、分解、圧ぺん、加圧、圧延、粉砕、クッキング、破砕、沈降、濾過、洗浄、遠心分離分画、および空気分級、を用いて前記植物バイオマスをプレプロセシングする工程を包含する、項目７または８に記載の方法。
（項目１０） 前記第２の溶媒が、塩素化された有機溶媒、アルキルカーボネート、アルコール、ヒドロキシ酸、酢酸、およびそれらの混合物からなる群より選択される、項目７に記載の方法。
（項目１１） 前記第２の溶媒が、クロロホルム、塩化メチレン、ジクロロエタン、トリクロロエタン、テトラクロロエタン、およびジクロロアセテートからなる群より選択される塩素化された有機溶媒を包含する、項目１０に記載の方法。
（項目１２） 前記第２の溶媒が、プロピレンカーボネート、エチレンカーボネート、トリフルオロエタノール、無水酢酸、酢酸、ジメチルホルムアミド、エチルアセトアセテート、トリオレイン、トルエン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ピリジン、および３より多い炭素原子を有するアルコールからなる群より選択される組成物を包含する、項目７に記載の方法。
（項目１３） 前記工程ｄ）において、前記ＰＨＡを含有する残留粉混合物が、酸、塩基、界面活性剤、酸化剤、キレート剤、還元剤、求核剤、求電子剤、金属イオン、およびフリーラジカルからなる群より選択される、少なくとも１つの化学的薬剤で処理される、項目８に記載の方法。
（項目１４） 前記ＰＨＡが、エステル化、エステル交換、加水分解、けん化、アミノリシス、チオリシス、エーテル化、シリル化、付加、脱離、再配列、還元、および縮合からなる群より選択される化学変換により誘導体化される、項目８に記載の方法。
（項目１５） 前記生化学的薬剤が酵素である、項目８に記載の方法。
（項目１６） 前記酵素が、デポリメラーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、リパーゼ、ホスホリラーゼ、およびグリコシダーゼからなる群より選択される、項目１５に記載の方法。
（項目１７） 前記工程ｅ）において、前記誘導体化されたＰＨＡが、蒸留、抽出、遠心分離、濾過、蒸発、およびクロマトグラフィーからなる群より選択される物理的プロセスにより分離される、項目８に記載の方法。
（項目１８） 前記第１および第２の溶媒がそれぞれ、３０℃と２５０℃との間の沸点を有する、項目７または８に記載の方法。
（項目１９） 前記分離されたＰＨＡ誘導体を沈殿させる工程をさらに包含する、項目７または８に記載の方法。
（項目２０） 前記バイオマスが、ダイズ、ワタ、ココナッツ、アメリカホドイモ、ナタネ、ヒマワリの種子、オリーブ、ヤシ、ゴマの種子、アマニ、トウゴマ、ベニバナの種子、タバコ、トウモロコシ、アブラナ、およびジャガイモからなる群より選択される植物供給源に由来する、項目１に記載の方法。
（項目２１） 前記分離されたＰＨＡが、ヒドロキシブチレート、ヒドロキシバレレート、ヒドロキシヘキサノエート、ヒドロキシヘプタノエート、ヒドロキシオクタノエート、ヒドロキシノナノエート、およびヒドロキシデカノエートからなる群より選択される、１つ以上の同じまたは異なるユニットを含む、項目４に記載の方法。
（項目２２） 前記分離されたＰＨＡが、３−ヒドロキシ酪酸、４−ヒドロキシ酪酸、クロトン酸、およびそのアルキルエステルからなる群より選択される、項目８に記載の方法。
（項目２３） 前記植物バイオマスが、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｈｉｏｃｙｓｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、およびＺｏｏｇｌｏｅａからなる群より選択される微生物由来の異種ＰＨＡシンターゼ遺伝子を含む植物に由来する、項目２に記載の方法。
（項目２４） 植物油を含む植物バイオマスからポリヒドロキシアルカノエート（「ＰＨＡ」）を分離する方法であって、該油および該ＰＨＡが溶解する温度にて、該油および該ＰＨＡが溶解する第１の溶媒を用いて該植物バイオマスを抽出して、該バイオマスから該油および該ＰＨＡを本質的に取り出す工程、次いで、該油から該ＰＨＡを分離する工程を包含する、方法。
（項目２５） 前記植物バイオマスが、トランスジェニック油料作物植物に由来する、項目２４に記載の方法。
（項目２６） 項目２５に記載の方法であって、
ａ）ＰＨＡを含有する植物バイオマスを提供する工程；
ｂ）該植物バイオマスをプレプロセシングして、該ＰＨＡ、油および植物粉の混合物を得る工程；
ｃ）該油および該ＰＨＡは溶解し、かつ該粉はあまり溶解しない第１の溶媒を用いて、該混合物から該油および該ＰＨＡを抽出する工程；および
ｄ）該油から該ＰＨＡを分離する工程；
を包含する、方法。
（項目２７） 前記工程ｄ）において、前記ＰＨＡ−油混合物を化学的薬剤または生化学的薬剤で処理し、それによって該ＰＨＡを化学的に誘導体化し、そして誘導体化されたＰＨＡを該油から分離することによって、該ＰＨＡが該油から分離される、項目２６に記載の方法。
（項目２８） 前記溶媒が、塩素化された有機溶媒、アルキルカーボネート、アルコール、ヒドロキシ酸および炭化水素、ならびにそれらの混合物からなる群より選択される、項目２６に記載の方法。
（項目２９） 前記溶媒が、ヘキサン、トリフルオロエタノール、無水酢酸、ジメチルホルムアミド、エチルアセトアセテート、トリオレイン、酢酸、トルエン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、およびピリジンからなる群より選択される、項目２６に記載の方法。
（項目３０） 前記生化学的薬剤が、ＰＨＡデポリメラーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、リパーゼ、ヒドラターゼ、ホスホリラーゼ、セルラーゼ、およびグルコシダーゼからなる群より選択される酵素である、項目２７に記載の方法。
（項目３１） 前記分離されたＰＨＡが、アミド、チオエステル、酸、エーテル、エステル、不飽和化合物、ジオール、ケトン、およびアルデヒドからなる群より選択される官能基を含む、項目７、８、２６、または２７に記載の方法。
（項目３２） 前記分離されたＰＨＡが、３−ヒドロキシ酸、４−ヒドロキシ酸、および５−ヒドロキシ酸からなる群より選択される１つ以上のユニットを含む、項目７、８、２６、または２７に記載の方法。
（項目３３） 項目７または２６に記載の方法であって、前記分離されたＰＨＡが有機溶媒中にて分離され；ここで、該方法が、該有機溶媒中の該ＰＨＡを、界面活性剤を含有する水溶液中にエマルジョン化し、それによりＰＨＡラテックスを形成する工程をさらに包含する、方法。
（項目３４） 項目７または２６に記載の方法であって、前記分離されたＰＨＡが有機溶媒中にて分離され、ここで、該方法が、該有機溶媒中の該ＰＨＡを水溶液中にエマルジョン化する工程、および該溶媒を除去し、それによりＰＨＡラテックスを形成する工程をさらに包含する、方法。
【００１６】
（発明の要旨）
ポリヒドロキシアルカノエート（「ＰＨＡ」）を植物から分離するための方法が提供される。１つの実施態様では、植物油を含むトランスジェニック作物植物に由来する植物バイオマスからＰＨＡを単離するための方法が提供される。この方法は、油およびＰＨＡの両方が植物バイオマスから回収されることを有利に可能にする。１つの実施態様では、ＰＨＡを単離するために、油料作物植物に由来するバイオマスは、例えば粉砕、破砕、または圧延によってプレプロセシング（ｐｒｅ−ｐｒｏｃｅｓｓ）される。次いで、油は、第１の溶媒（油はこの溶媒に溶解し、ＰＨＡはこの溶媒にあまり溶解しない）を用いてバイオマスから抽出され、油はＰＨＡから分離される。次いで、実質的に油を含まない植物バイオマスは、第２の溶媒（ＰＨＡはこの溶媒に溶解する）を用いて抽出され、ＰＨＡはバイオマスから分離される。あるいは、ＰＨＡ含有バイオマスは、化学的薬剤または生化学的薬剤（例えば、酵素）を用いて処理され、ＰＨＡはＰＨＡ誘導体に化学的に変換される。次いで、誘導体化されたＰＨＡは、例えば物理的分離プロセス（例えば、蒸留、抽出、またはクロマトグラフィー）を用いて、混合物から分離される。好都合なことに、この方法を用いて、植物油、ＰＨＡ、およびＰＨＡ誘導体の全てが、トランスジェニックな油料作物植物のような植物から大規模で回収され得、そして精製され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１ａは、短側鎖ポリヒドロキシアルカノエートの構造を図示したものである。図１ｂは、長側鎖ポリヒドロキシアルカノエートの構造を図示したものである。
【図２】図２ａは、短側鎖ポリヒドロキシアルカノエートであるポリヒドロキシブチレートの合成のための生合成経路を図示したものである。図２ｂは、長側鎖ポリヒドロキシアルカノエートの合成のための生合成経路を図示したものである。
【図３】図３は、植物からポリヒドロキシアルカノエートを分離するためのプロセスの１つの実施態様を例示するフローチャートである。
【図４】図４は、植物からポリヒドロキシアルカノエートを分離するためのプロセスの別の実施態様を例示するフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（発明の詳細な説明）
植物油および粉（ｍｅａｌ）を含む植物バイオマスからポリヒドロキシアルカノエート（「ＰＨＡ」）を分離するための方法が提供される。植物バイオマスから単離され得るＰＨＡは、ＰＨＡの分解物また他の生成物（例えば、モノマー、ダイマー、オリゴマー、酸、エステル、アミド、およびラクトン）を含み、そしてこれは、バイオマスをプロセシングの間の、化学的、生化学的、または物理的処理から形成され得るか、または植物バイオマス内に生じるプロセスから形成され得る。好ましい実施態様では、ＰＨＡは、トランスジェニック油料作物植物に由来するバイオマスから単離される。ＰＨＡ物質の回収を最大にすることに加えて、バイオマスからの商業的に有用な非ＰＨＡ生成物の回収もまた最大となる。例えば、油料種子植物の種子からＰＨＡを分離する場合、油および粉もまた単離され得、次いで商業的に使用され得る。
【００１９】
（Ｉ．ＰＨＡ単離のための物質）
（Ａ．単離され得るＰＨＡ物質）
植物バイオマスから単離され得るＰＨＡ物質は、モノマー、ポリマー、およびＰＨＡから誘導される他の生成物（化学的および生物学的に改変された誘導体を含む）を含む。ＰＨＡ物質は、１つの実施態様では、以下の式Ｉの１つ以上のユニット（例えば、１０〜１００，０００ユニット、好ましくは、１００〜３０，０００ユニット）を含むものとして定義される：
−ＯＣＲ１Ｒ２（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＯ−；
ここで、ｎは０または整数（例えば、１〜１５の間）であり、そして好ましい実施態様では、１〜４の間であり；そして
ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、独立して、長鎖炭化水素基を含む炭化水素基；ハロおよびヒドロキシ置換基；ヒドロキシ基；ハロゲン基；窒素置換基；酸素置換基；ならびに／または水素原子であり得る。
【００２０】
本明細書中に定義される、式−（ＣＲ３Ｒ４）ｎ−は、以下の式を含むがそれに限定されないように定義される：
−ＣＲ３Ｒ４（ここで、ｎは１である）；
−ＣＲ３Ｒ４ＣＲ３’Ｒ４’−（ここで、ｎは２である）；および
−ＣＲ３Ｒ４ＣＲ３’Ｒ４’ＣＲ３”Ｒ４”−（ここで、ｎは３である）；
ここで，Ｒ３、Ｒ４、Ｒ３’、Ｒ４’、Ｒ３”、およびＲ４”は、独立して、長鎖炭化水素基を含む炭化水素基；ハロおよびヒドロキシ置換基；ヒドロキシ基；ハロゲン基；窒素置換基；酸素置換基；ならびに／または水素原子であり得る。従って、式Ｉは、３−ヒドロキシ酸（ｎ＝１）、４−ヒドロキシ酸（ｎ＝２）、５−ヒドロキシ酸（ｎ＝３）から誘導されるユニットを含む。
【００２１】
これらのユニットは、ホモポリマーのように同一であってもよく、あるいはコポリマーまたはターポリマーのように２つ以上の異なるユニットから選択されてもよい。１つの実施態様におけるポリマーは、３００ダルトンを超える、例えば、３００ダルトンと１，０００，０００ダルトンとの間、そして好適な実施態様では、１０，０００ダルトンと３，０００，０００ダルトンとの間の分子量を有する。１つの実施態様では、ＰＨＡホモポリマー（例えば、ポリヒドロキシブチレート、ポリヒドロキシバレレート、またはポリ乳酸）が単離され得る。さらに、少なくとも２つのヒドロキシアルカノエートのモノマー（例えば、ヒドロキシブチレート、ヒドロキシバレレート、ヒドロキシヘキサノエート、ヒドロキシヘプタノエート、ヒドロキシオクタノエート、ヒドロキシノナノエート、およびヒドロキシデカノエート）を含むＰＨＡコポリマーまたはターポリマーが、単離され得る。ＰＨＡ（３−ヒドロキシ酸、４−ヒドロキシ酸、および５−ヒドロキシ酸のモノマー、およびポリマー、ならびに誘導体を含む）もまた単離され得る。
【００２２】
ＰＨＡポリマーはまた、非ヒドロキシ酸ユニット（例えば、長鎖脂肪酸、アミノ酸、炭水化物、リン含有化合物およびイオウ含有化合物、ならびにグリセリンのようなトリオール）を含んでもよく、またはこれらを含むように改変されてもよい。単離され得るＰＨＡ生成物は、バイオマスを物理的、化学的または生化学的に処理した際に形成される誘導体、あるいはヒドロキシ酸モノマー、ダイマー、トリマー、直線状および環状オリゴマー、ならびにラクトンを含むバイオマス内のプロセスによって形成される誘導体を含む。単離され得るＰＨＡ誘導体生成物は、ポリヒドロキシアルカノエートまたはポリヒドロキシアルカノエートから誘導されるモノマーの、エステル、ジオール、不飽和化合物、アルデヒド、酸、アルコール、ラクトン、環状および直線状エステル、アミド、およびチオエステルを含む。
【００２３】
植物バイオマスから単離され得る代表的なＰＨＡ生成物は、以下を含む：
次式で定義されるエステル：ＨＯＣＲ１Ｒ２（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＯ２Ｒ５；
次式で定義されるアミド：ＨＯＣＲ１Ｒ２（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＯＮＲ５Ｒ６；
次式で定義されるチオエステル：ＨＯＣＲ１Ｒ２（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＯＳＲ５；
次式で定義される酸：ＨＯＣＲ１Ｒ２（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＯ２Ｈ；
次式で定義されるエーテル：Ｒ６ＯＣＲ１Ｒ２（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＯ２Ｒ５；
次式で定義されるエステル：Ｒ６ＣＯ２Ｒ１Ｒ２（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＯ２Ｒ５；
次式で定義される不飽和化合物：
Ｒ１Ｒ２Ｃ＝ＣＲ３（ＣＲ４Ｒ５）ｎＣＯ２Ｒ６；および
Ｒ１Ｒ２Ｒ３ＣＣ（Ｒ４）＝Ｃ（Ｒ５）ＣＯ２Ｒ６；
次式で定義されるジオール：ＨＯＣＲ１Ｒ２（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＨ２ＯＨ；
次式で定義されるラクトンまたはマクロライド：
【００２４】
【化３】
ここで、ｘは整数、例えば、１〜１０である；ならびに
以下の式で定義されるケトンまたはアルデヒド：
【００２５】
【化４】
ここで、ｎは０または整数であり；そして
ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、それぞれ独立して、長鎖炭化水素基を含む炭化水素基、ハロおよびヒドロキシ置換基、ヒドロキシ基、ハロゲン基、窒素置換基、酸素置換基、ならびに水素原子であり；そしてここで、−（ＣＲ２Ｒ３）ｎ−は、上記で定義される通りである。
【００２６】
商業的に有用なモノマーＰＨＡ生成物（例えば、３−ヒドロキシ酪酸またはクロトン酸、またはそのアルキルエステル（メチル−３−ヒドロキシブタノエート、エチル−３−ヒドロキシブタノエート、プロピル−３−ヒドロキシブタノエートおよびブチル−３−ヒドロキシブタノエートを含む））もまた、単離され得る。ＰＨＡ由来のヒドロキシ酸モノマーは、より高分子量の形態に加えて、さらなる改変をしてもしなくても商業的に使用され得る価値ある化学物質の供給源である。
【００２７】
本明細書中で使用される、用語「ＰＨＡ物質」または「ＰＨＡ」または「ポリヒドロキシアルカノエート」は、プロセシングの前にバイオマス中に元来存在する、モノマー、ポリマー、および他のＰＨＡベースの物質、ならびにプロセシングの間に形成される生成物（例えば、植物バイオマス内に生じる分解またはプロセスから形成される生成物、あるいは化学的薬剤または生物学的薬剤でバイオマスを処理して化学的に変換させることにによって形成される誘導体生成物）を意味する。
【００２８】
（Ｂ．ＰＨＡが単離され得る植物供給源）
（植物種）
ＰＨＡおよびＰＨＡ生成物は、植物（例えば、ダイズ、ワタ、ココナッツ、アメリカホドイモ、ナタネ、ヒマワリの種子、オリーブ、ヤシ、ゴマの種子、アマニ、トウゴマ（ｃａｓｔｏｒ）、ベニバナの種子、タバコ、およびジャガイモ）由来の植物バイオマスから単離され得る。好ましい実施態様において、バイオマスは、油料作物植物（特に、ナタネ、ヒマワリの種子、ベニバナの種子、アマニ、およびダイズ）に由来し得る。ＰＨＡポリマーに加えて、種子作物植物中の植物油が単離され得、そしてプロセシングの間に回収される。植物油は、代表的には、種子の１０〜５０重量％を構成する。植物油の世界的な需要が考慮されている。植物バイオマスをプロセシングするための方法は、単離される特定のＰＨＡポリマーまたは誘導体の性質に基づいて、および抽出される植物作物および植物成分の型に基づいて適合され得る。
【００２９】
（トランスジェニック植物の作製）
トランスジェニック油料作物植物の使用は、多くの利点を提供する。ＰＨＡ生成のためのトランスジェニック作物植物は、当該分野で利用可能な方法を用いて得られ得る。トランスジェニック植物作物の作製は、石油化学に由来するプラスチックと価格および規模の両方で競争し得るＰＨＡポリマーを生成し得る。トランスジェニック植物由来のＰＨＡポリマーまたはそれらの誘導体は、商業的に有用な形態で植物バイオマスからプロセスされ、そして分離され得る。植物作物におけるＰＨＡの位置（例えば、葉、種子、茎、またはそれらの組合せ）は、植物からのＰＨＡの収率を最大にするために変化され得る。
【００３０】
例えば、Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａおよびＡ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓの短側鎖ＰＨＡの生成を担う酵素をコードする遺伝子が、同定され、単離され、そして配列決定されている。ＰｅｏｐｌｅｓおよびＳｉｎｓｋｅｙ，Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：５１−５６（１９８７）；Ｐｅｏｐｌｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：９７−１０２（１９８７）；ＰｅｏｐｌｅｓおよびＳｉｎｓｋｅｙ（１９８９），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１５２９８−１５３０３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１５２９３−１５２９７、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：３４９−３５７；Ｓｌａｔｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７０：４４３１−４４３６（１９８８）；およびＳｃｈｕｂｅｒｔら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７０：５８３７−５８４７（１９８８）。Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓにおいて、それらは、短側鎖ＰＨＡのシンターゼ、チオラーゼ、およびレダクターゼをそれぞれコードする、オペロンｐｈｂＣ−ｐｈｂＡ−ｐｈｂＢ遺伝子から見出された。長側鎖ＰＨＡについては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ生物のそのシンターゼ酵素が、ｐｈａ遺伝子座によりコードされると見出された。この遺伝子座は、２つの密接に関連するＰＨＡシンターゼ遺伝子であるｐｈａＡおよびｐｈａＣ、ならびにｐｈａＢ遺伝子の産物であるデポリメラーゼ遺伝子を含む。
【００３１】
トランスジェニック作物種においてＰＨＡポリメラーゼを産生するために使用され得る方法は、米国特許第５，２４５，０２３号および同第５，２５０，４３０号；ＷＯ９１／００９１７；ＷＯ９２／１９７４７；ＷＯ９３／０２１８７；ＷＯ９３／０２１９４；ＷＯ９４／１１５１９；ＷＯ９４／１２０１４；ＷＯ９４／２３０２７；ＷＯ９５／０５４７２；Ｐｏｉｒｉｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：５２０−５２３（１９９２）、Ｐｏｉｒｉｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１３：１４２−１５０（１９９５）、およびＮａｗｒａｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：１２７６０−１２７６４（１９９４）に記載されている。
【００３２】
トランスジェニック作物種を形成するために、ＰＨＡシンターゼをコードする遺伝子を微生物から植物細胞に移入して、適切なレベルのＰＨＡシンターゼ酵素の産生を得る。遺伝子は、微生物（例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｈｉｏｃｙｓｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、またはＺｏｏｇｌｏｅａ）に由来し得る。さらなるＰＨＡ生合成遺伝子（例えば、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子またはＰＨＡシンターゼ酵素の基質を合成するために必要とされる酵素をコードする他の遺伝子）もまた提供され得る。異なる植物組織または細胞小器官における発現は、当業者に公知の方法を用いて制御され得る。ＧａｓｓｅｒおよびＦｒａｌｅｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１２９３−１２９９（１９８９）。ＰＨＢは、標準的な技術により遺伝子操作された植物系において産生されている。Ｐｏｉｒｅｒ，Ｙ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：５２０−５２３（１９９２）；Ｐｏｉｒｉｅｒ，Ｙら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１３：１４２−１５０（１９９５）；およびＮａｗｒａｔｈ，Ｃら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：１２７６０−１２７６４（１９９４）。
【００３３】
好ましい実施態様において、抽出前の植物バイオマスのＰＨＡ含有量は、バイオマスの乾燥重量の少なくとも１重量％、より好ましくはバイオマスの乾燥重量の５〜９５重量％、そして別の好ましい実施態様においてバイオマスの乾燥重量の約５〜６０重量％、最も好ましくは１０〜６０％である。好ましくは、ＰＨＡの少なくとも２４％が、油から分離するプロセスにおいて回収される。
【００３４】
（ＩＩ．植物からのＰＨＡの単離のための方法）
（Ａ．植物バイオマスのプレプロセシング）
ＰＨＡ含有植物バイオマス（例えば、異種ＰＨＡシンターゼ遺伝子を含むトランスジェニック油料作物植物）が栽培され、そして収穫される。植物バイオマスは、ＰＨＡポリマーの抽出の前に、当該分野で利用可能な方法（例えば、撹拌、加熱、冷却、圧縮、減圧、超音波処理、遠心分離、および／または放射）を用いてプレプロセシングされ得る。本明細書中で使用する用語「植物バイオマス」は、植物の構成部分（例えば、種子、葉、葉柄および茎）をいう。さらに、植物バイオマスは、乾燥、皮むき、クリーニング、エイジング、秤量、分解、圧ぺん、加圧、圧延、粉砕、クッキング、破砕、沈降、および／または濾過を含む手順の任意の１つ以上の組合せを用いてプレプロセシングされ得る。油を有する植物のプロセシングにおける粉から油を分離するこれらの手順の使用は、「ＯｉｌＣｒｏｐｓｏｆ ｔｈｅ Ｗｏｒｌｄ」、Ｇ．Ｒｏｂｂｌｅｎら編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９８９，第１１章に記載される。さらに、乾式製粉および湿式製粉の両方のアプローチを含むトウモロコシ製粉に使用される方法は、デンプンを含む胚乳から油を含む胚を分離する工程を含有する。これは、例えば、「ＣｏｒｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、１９９４年版、Ｗａｔｓｏｎ，Ｓ．Ａ．およびＲａｍｓｔａｄ，Ｐ．Ｅ．編、ＡｍｅｒｉｃａｎＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆＣｅｒｅａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａに記載されるような、遠心分離または空気分級により達成され得る。
【００３５】
（Ｂ．植物バイオマスの抽出）
ＰＨＡのモノマー、ポリマーおよび誘導体は、適切な手段（溶媒抽出および／または溶媒洗浄、水抽出および／または水洗浄、破砕、温度処理、酵素処理、遠心分離、超臨界抽出法、高圧処理および／または減圧処理、クロマトグラフィー、蒸留、融解、あるいはＰＨＡ物質の分離を容易にするための試薬を用いた処理を含む）を用いて植物バイオマスから取り出され得る。
【００３６】
当該分野で利用可能なプレプロセシング物質から油を抽出する方法、例えば、油エキスペラー（ｅｘｐｅｌｌｅｒ）加圧（ここで、油は、油を含有する物質から機械的に圧搾される）、および前加圧溶媒抽出（ここで、油の一部は、エキスペラーにより取り出され、そして残余物は、炭化水素（例えば、ヘキサン）のような有機溶媒を用いる抽出により取り出される）もまた使用され得る。さらに、二酸化炭素およびプロパンを含む超臨界気体が使用され得る。他の方法として、直接溶媒抽出（ここで、油は、馴化（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ）種子から有機溶媒を用いて直接取り出され；プロパン精製により脂肪は分離され；そして脂肪または油の水による加水分解を含む脂肪分解により、グリセロールおよび脂肪酸が生成される）が挙げられる。「ＯｉｌＣｒｏｐｓｏｆ ｔｈｅ Ｗｏｒｌｄ」、Ｇ．Ｒｏｂｂｌｅｎら編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９８９；「ＬｉｑｕｉｄＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ」、Ｒ．Ｔｒｅｙｂａｌ編、ＭｃＧｒａｗ−ＨｉｌｌＢｏｏｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９５１；および「Ｗｏｒｌｄ Ｏｉｌｓｅｅｄｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ」、Ｄ．Ｋ．Ｓａｌｕｎｋｈｅら編、ＶａｎＮｏｓｔｒａｎｄ Ｒｅｉｎｈｏｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２。
【００３７】
（植物バイオマスからの油の抽出）
植物バイオマスからＰＨＡを単離するための１つの好ましい方法は、図３のフローチャートにおいて例示される。この処理において、ＰＨＡを含有する植物バイオマスは、最初に必要に応じて上記に記載したようにプレプロセシングされる。次いで、プレプロセシングされたかまたはプロセシングされていないＰＨＡを含有する植物バイオマスは、油が溶解しかつＰＨＡおよび粉が高度に溶解しない溶媒に抽出されて、ＰＨＡを含有する植物バイオマスから大部分のまたは全ての油が取り出される。この溶媒は、油が良好に抽出され、そしてＰＨＡおよび植物粉が低い溶解度により乏しく（ｐｏｏｒ）抽出されるように選択される。ＰＨＡ−油−粉の混合物の抽出により、図３のフローチャートにおいて例示されるように、ＰＨＡを本質的に含まない油画分（例えば、約１０重量％未満のＰＨＡを含む）、および油を本質的に含まないＰＨＡ−粉混合物（例えば、約１０重量％未満の油を含む）が得られる。次いで、ＰＨＡ−粉混合物は、ＰＨＡが溶解する第２の溶媒で抽出されて、精製されたＰＨＡ物質が得られる。あるいは、図３に例示されるように、ＰＨＡ−粉混合物は化学的または酵素的に処理され、次いでＰＨＡ誘導体が粉から単離されて得られる。
【００３８】
植物バイオマスから油を抽出するために使用される第１の溶媒は、油を可溶化するその能力に基づいて選択される。好ましくは、油が溶解しかつＰＨＡおよび植物物質が高度に溶解しない溶媒が使用される。適切な溶媒として、炭化水素（例えば、プロパン、ブタン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、およびデカン）が挙げられる。本明細書中で使用する用語「溶媒」は、複数の溶媒および溶媒混合物（例えば、炭化水素の混合物）を含む。好ましくは、ＰＨＡが１％未満、最も好ましくは０．１％未満まで溶解し、かつ油が１０％（ｗ／ｖ、室温）を超えて溶解する、第１の溶媒が選択される。
【００３９】
バイオマスからＰＨＡおよび油成分を単離するために、バイオマスのＰＨＡおよび油成分に特徴的な物理的性質および溶解度の差を利用する抽出で使用される溶媒が選択される。単離工程は、特定のＰＨＡ、植物宿主、またはＰＨＡ／植物宿主の組合せに依存して調製される。例えば、ＰＨＢおよびＬＳＣＰＨＡの抽出において、異なる溶媒または溶媒の組合せは、それらの溶解度に基づくＰＨＡを含有するトランスジェニック植物バイオマスからのそれらの抽出で使用される。
【００４０】
ＰＨＡが、第２の溶媒を用いた処理によりＰＨＡ−粉産物から分離される実施態様において、第２の溶媒（図３における溶媒２）は、ＰＨＡが良好に抽出され、そして粉がより乏しく抽出されるその能力に基づいて選択される。使用され得る溶媒として、塩素化された（ｃｈｌｏｒｏｎａｔｅｄ）有機溶媒（例えば、クロロホルム、塩化メチレン、ジクロロエタン、トリクロロエタン、テトラクロロエタン、およびジクロロアセテート）を含む複数の溶媒または溶媒混合物が挙げられる。例えば、炭化水素安定化クロロホルムが使用され得る。使用され得る微生物供給源からＰＨＡを抽出するために使用されている他の溶媒として、アルキルカーボネート（例えば、プロピレンカーボネートおよびエチレンカーボネート）、トリフルオロエタノール、無水酢酸、ジメチルホルムアミド、エチルアセトアセテート、トリオレイン、トルエン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ピリジン、３を超える炭素原子を有するヒドロキシ酸およびアルコール、ならびにその混合物が挙げられる。Ｌａｆｆｅｒｔｙら、「ＭｉｃｒｏｂｉａｌＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆ Ｐｏｌｙ−β−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｉｃ Ａｃｉｄ」、Ｈ．Ｊ．ＲｅｈｍおよびＧ．Ｒｅｅｄ編、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，６６巻、１９８８、１３５−１７６頁。好ましい実施態様において、第２の溶媒は、塩素化された有機溶媒またはアルキルカーボネートである。さらに好ましい実施態様において、第１および第２の溶媒は、室温と４００℃との間、より好ましくは３０℃と２５０℃との間の沸点を有する。
【００４１】
溶媒抽出工程はまた、超臨界抽出法（この方法では、エチレン、プロピレン、酸化プロピレン、ブタン、または二酸化炭素のような気体が用いられる）を用いて行われ得る。好ましい実施態様において、気体は、−２５０℃と室温との間、好ましくは−１５０と−２０℃との間の沸点を有する。ＰＨＡは、溶解した状態でも抽出され得る。
【００４２】
図３のフローチャートに例示される別の実施態様において、ＰＨＡ−粉混合物を、化学的または生化学的薬剤（例えば、酵素）を用いて処理して、以下に詳細に記載するようにＰＨＡをＰＨＡ誘導体に化学的に変える。次いで、ＰＨＡ誘導体は、必要に応じて、その後の１つ以上の物理的な分離工程（例えば、蒸留、抽出、遠心分離、濾過、またはクロマトグラフィー）を用いて、植物バイオマスから分離される。
【００４３】
（ＰＨＡおよび油の抽出）
図４のフローチャートに示される別の実施態様において、ＰＨＡを含有する植物バイオマスは、必要に応じて最初に上記のようにプレプロセシングされる。次いで、プレプロセシングされたまたはプロセシングされていないＰＨＡを含有する植物バイオマスは、油およびＰＨＡが溶解し、かつ粉が低い溶解度を有する溶媒中に溶媒抽出されて、油およびＰＨＡが植物粉から本質的に取り出される。その結果、例えば、約１０重量％未満の油およびＰＨＡは植物粉に残存する。このプロセスに使用される溶媒は、ＰＨＡおよび油に対する良好な抽出剤であり、そして粉に対する乏しい抽出剤であるように選択される。次いで、ＰＨＡ−油産物中のＰＨＡ物質は、物理的分離工程（例えば、蒸留）により、またはＰＨＡと油との間における溶解度差のさらなる利用により、油からさらに分離される。
【００４４】
あるいは、以下に記載のように（図４に示されるように）、ＰＨＡ−油産物は、化学的または生物学的処理により改変されて、ＰＨＡ誘導体（単数または複数）−油産物が提供され得る。後者のＰＨＡ誘導体成分は、物理的プロセッシング（蒸留、溶媒抽出、洗浄、沈澱、超臨界抽出法、濾過、およびクロマトグラフィーを含む）により続いて精製され得る。
【００４５】
植物バイオマスから油−ＰＨＡ成分を抽出するために使用され得る溶媒として、塩素化有機溶媒（例えば、クロロホルム、塩化メチレン、ジクロロエタン、トリクロロエタン、テトラクロロエタン、およびジクロロアセテート）、アルキルカーボネート（例えば、プロピレンカーボネートおよびエチレンカーボネート）、トリフルオロエタノール、無水酢酸、ジメチルホルムアミド、エチルアセトアセテート、トリオレイン、酢酸、トルエン、アルコール、ヒドロキシ酸、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、および／またはピリジンが挙げられる。溶媒はまた、炭化水素（例えば、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、またはデカン、あるいはそれらの混合物）からなり得るか、またはこれらを含み得る。好ましい溶媒は、室温と４００℃との間、好ましくは３０℃と２５０℃との間の沸点を有する溶媒である。好ましくは、このような溶媒は、少なくとも５％（ｗ／ｖ、室温）のＰＨＡおよび油成分の両方に対する溶解度を有し、そして図１で定義されたＰＨＡの構造に依存して選択される。ＰＨＡ物質はまた、融解した状態で抽出され得る。溶媒の選択は、バイオマスが得られる植物、ならびに分離されるＰＨＡ、誘導体、油の溶解度特性の選択に依存する。
【００４６】
図４のフローチャートに例示されるように、抽出されたＰＨＡ−油はまた、以下に詳細に記載されるような、化学的または生物学的薬剤（例えば、ＰＨＡ物質を分解する酵素）を用いた処理によりＰＨＡ誘導体−油生成物を形成するための化学的改変により分離され得る。次いで、ＰＨＡ誘導体は、例えば、物理的プロセス（例えば、蒸留、抽出、遠心分離、超臨界抽出法、分取濾過（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、および／またはクロマトグラフィー）を用いて、ＰＨＡ誘導体−油混合物から分離される。
【００４７】
本質的に油を含まないＰＨＡのさらなる精製は、当業者に公知の標準的な手順により行われ得る。
【００４８】
（ＩＩＩ．ＰＨＡ誘導体の合成）
上記のように、プロセシングの間、バイオマス中のＰＨＡ物質は、物質のそれらの単離の前に、物質の単離を容易にするためかまたは所望の誘導体生成物を生成するために、物理的、化学的、または酵素的な誘導体への変換により誘導体化され得る。形成され得るＰＨＡ誘導体として、当該分野で利用可能な方法を用いて形成され得る、酸、エステル、オリゴマー、環状オリゴマー、ラクトン、マクロライド、アミド、アミン、チオエステル、ジオール、および不飽和化合物が挙げられる。Ｇｒｉｅｓｂｅｃｋ，Ａ．およびＳｅｅｂａｃｈ，Ｄ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，７０：１３２０−１３２５ （１９８７）；Ｐｌａｔｔｎｅｒ，Ｄ．Ａ．， Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ， ７６：２００４−２０３３ （１９９３）；Ｓｅｅｂａｃｈ，Ｄ．ら、「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ−Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ３−ＨｙｄｒｏｘｙｃａｒｂｏｘｙｌｉｃＡｃｉｄｓ ａｎｄＴｈｅｉｒ Ｕｓｅ ｉｎ ＥＰＣ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｗ．ＢａｒｔｍａｎｎおよびＫ．Ｂ．Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ編、「ＳｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆＯｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ」ＶＣＨ， Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，１９８７，８５−１２６頁、およびＳｅｅｂａｃｈ，Ｄ．ら、Ｃｈｉｍｉａ，４４：１１２−１１６ （１９９０）；Ｏｒｇ．Ｓｙｎｔｈ．，７１：３９−４７（１９９２）；Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇ．，４３４−４３５（１９９２）；およびＨｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，７７：１０９９−１１２３（１９９４）。ＰＨＡポリマーを形成するために使用され得るエステルを誘導体化するためのさらなる方法は、当業者に公知である。
【００４９】
バイオマスのプロセシングにおいてＰＨＡ物質を改変するために使用され得る化学的薬剤として、例えば、酸、塩基、界面活性剤、キレーター、酸化剤または還元剤、求核剤または求電子剤、金属イオン、水溶液または有機溶液、ならびにフリーラジカルが挙げられる。使用され得る他の化学的薬剤として、過酸化水素、次亜塩素酸塩、オゾン、およびアルキル過酸化物が挙げられる。化学的変換は、例えば、エステル化、エステル交換、加水分解、けん化、アミノリシス、チオリシス、エーテル化、シリル化、付加、脱離、再配列、または縮合ような化学反応であり得る。例えば、植物バイオマス中のＰＨＡ開始物質の分子量より少ない分子量を有する誘導体を生成するために化学的薬剤が使用され得る。さらに、ＰＨＡ物質は、物理的処理（例えば、加熱、冷却、または撹拌）により改変され得る。
【００５０】
ＰＨＡ物質はまた、例えば、バイオマスまたはＰＨＡ物質を分解する生物学的薬剤（例えば、酵素）を用いたバイオマス物質（ＰＨＡ−粉またはＰＨＡ−油の混合物）の処理により、プロセシングの間化学的に改変され得る。使用され得る酵素として、ＰＨＡデポリメラーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、リパーゼ、ヒドラターゼ、ホスホリラーゼ、セルラーゼ、および／またはグリコシダーゼが挙げられる。ＰＨＡポリマーは、オリゴマー、モノマー、ダイマー、トリマー、または他の誘導体に変換され得る。ＰＨＡ官能性はまた、非ＰＨＡ化学官能性に変換されることもある。
【００５１】
（ＩＶ．適用）
本明細書中に記載されるように単離されたＰＨＡは、広範な種々の異なる適用に使用され得る。１つの実施態様において、単離されたＰＨＡは、ラテックスを形成するために使用され得る。ＰＣＴＷＯ９１／１３２０７は、ラテックス（すなわち、非結晶性の、無定型の粒子の水性懸濁液）の形態のβ−ヒドロキシブチレートおよびβ−ヒドロキシバレレートのポリマーまたはコポリマーの使用を開示する。ラテックスは、例えば、生分解性かつ再生利用可能なフィルムまたは被覆紙を形成するために使用され得る。ＰＣＴＷＯ９６／０３４６８は、構築的な被覆におけるＰＨＡラテックスの使用を記載する。精製された結晶性ＰＨＡからＰＨＡラテックスを形成するための方法は、ＰＣＴＷＯ９４／０７９４０に記載されている。この方法において、有機溶媒中のＰＨＡの精製された溶液（これは、本明細書中に記載されるように得られ得る）は、界面活性剤を含む水溶液にエマルジョン化され、無定型ラテックスが形成される。従って、本明細書中に開示される方法は、種々の産業上の適用および生物医学的適用（例えば、ＰＨＡラテックス物質の形成）に使用され得る精製されたＰＨＡを提供した。
【００５２】
本発明は、以下の非限定的な実施例からさらに理解される。
【実施例】
【００５３】
（実施例１：植物バイオマスからのポリヒドロキシブチレートの抽出）
図３に例示されるプロセスを用いて、ヘキサン（溶媒１）を用いた抽出により、植物バイオマスからポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）を単離して、油を取り出し、続いて炭化水素安定化クロロホルム（溶媒２）を用いた抽出によりＰＨＢを単離した。
【００５４】
約４０重量％の油を含むナタネ（３２ｇ）のサンプルを、６ｇのＰＨＢ粉末（Ａｒｄｒｉｃｈ）と混合し、そして電気食物粉砕器を用いて粉砕した。このサンプルは、３４重量％の油および１６重量％のＰＨＢを含有するトランスジェニック油料種子の代表例である。混合物を、６時間ｓｏｘｈｌｅｔ装置中で、３００ｍＬのヘキサン（溶媒１）を用いて連続的に抽出し、その後サンプルを冷却して有機溶媒相と固形粉とを得た。有機溶媒を濃縮して黄色の油（１１．８ｇ、混合物の３１重量％）を得た。ＮＭＲ分析は、この油がＰＨＢを含まないことを示した。この結果は、ＰＨＢを含まない油を、ＰＨＡ含有植物バイオマスから９０％より大きな収率で容易に回収し得ることを示した。次いで、固形粉（７．７ｇ）の一部を、２２時間ｓｏｘｈｌｅｔ装置中で、１２０ｍＬの炭化水素安定化クロロホルム（溶媒２）を用いてさらに抽出した。クロロホルム溶液の蒸発により、１．１５ｇの重さの黄色／白色のプラスチックフィルムが形成した。粗ＰＨＢフィルム（２２７ｍｇ）の一部を、３回、ヘキサンの１ｍＬ部分で洗浄した。風乾後、ＰＨＢフィルム（８６ｍｇ）は、オフホワイトの色であった。このフィルムのＮＭＲ分析は、本質的に純粋なＰＨＢであることを示した。ＰＨＢフィルムの回収は、混合物中の元のＰＨＢ含有量に基づいて２４％の収量を示す。
【００５５】
（実施例２：植物バイオマスからのＰＨＢ誘導体の抽出）
図３に例示されるプロセスを用いて、ヘキサン（溶媒１）を用いた植物バイオマスの抽出により、植物バイオマスからポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）を単離して、油画分を取り出し、続いて化学的処理、次いで誘導体形態のＰＨＢの物理的分離を行った。
【００５６】
実施例１からのＰＨＢ含有残存粉（２．３２ｇ）の一部を、１５．５時間、ｎ−ブタノール（２５ｍＬ）および濃硫酸（０．３３ｍＬ）と共に加熱還流した。得られた黒色の混合物に、飽和炭酸水素ナトリウム（２０ｍＬ）、ブライン（２０ｍＬ）、および酢酸エチル（５０ｍＬ）を添加した。この混合物を分離漏斗中で振盪し、そして相分離させた。有機相を、セライトのパッドに通して濾過し、ブラインで洗浄し、少量の活性炭で処理し、濾過し、そして暗色の油まで濃縮した。この物質を、減圧下で蒸留した。４９〜５３℃および０．２５ｔｏｒｒで蒸留する画分を回収して、わずかに黄色い液体（０．４７ｇ）を得た。この物質のＮＭＲ分析により、これがブチル３−ヒドロキシブチレートであることを確認した。回収された物質の量は、残存粉に含まれるＰＨＢの量に基づいて誘導体化ＰＨＢの４６％収率を示す。
【００５７】
（実施例３：ナタネからのＰＨＡの抽出）
ＰＨＡを、以下のような図４のプロセスを用いて、ナタネからポリマー形態で抽出した。約４０重量％の油を含むナタネのサンプル（２０ｇ）を、約９４％の３−ヒドロキシオクタン酸および約６％の３−ヒドロキシヘキサン酸を含むコポリマーであるＰＨＯの小片（５．４３ｇ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａから単離された）と混合し、電気食物粉砕器で粉砕した。このサンプルは、３１重量％の油および２１重量％のＰＨＯを含むトランスジェニック油料種子の代表例である。混合物を、１２時間ｓｏｘｈｌｅｔ装置中で、３００ｍＬのヘキサン（溶媒１）を用いて連続的に抽出した。サンプルを、冷却し、そして濾過して、有機溶媒相および固形粉（風乾後１１．０２ｇ）を得た。溶媒相を濃縮して、黄色の非常に粘性のゲル様物質（１２．９２ｇ、混合物の５１重量％）を得た。静置すると、この物質は、黄色のプラスチック様固体になった。ＮＭＲ分析により、この物質はＰＨＯおよびナタネ油を含むことが示された。これらの結果により、ＰＨＯ油混合物を、ＰＨＡ含有植物バイオマスから９０％を超える収率で容易に回収し得ることが示された。得られたＰＨＡ／油混合物は、さらなる精製に適切であった。
【００５８】
さらなる精製を以下のように行った。黄色のプラスチック様物質の一部（０．１３６ｇ、約４１重量％のＰＨＯ、１．１×０．２ｃｍ）を、２ｍｌのｎ−プロパノールで洗浄した。室温で３日間ゆっくりと回旋した後、上清を取り除き、そして残存固体を、２ｍｌのメタノールで一晩洗浄した。メタノール洗浄液を、プロパノール洗浄液と混合し、そして濃縮して黄色の油（０．０８７６ｇ）を得た。減圧下での乾燥後の残存固形ポリマー（０．０４８ｇ）は、半透明でありほとんど無色であった。これは、元のナタネ／ＰＨＯ混合物からＰＨＯの８４％収率を示す。精製されたポリマーのＮＭＲ分析により、これが少量のナタネ油を含むＰＨＯ（約９５％純度）であることが示された。Ｇ．Ｃ．分析により、ヘキサン抽出により最初に単離された黄色のプラスチック様物質と比較して、主要な混入物は１０倍減少したことが示された。
【００５９】
（実施例４：植物バイオマスからのＰＨＡ誘導体の単離）
実施例３に記載された、さらなる精製の前に得られた黄色のＰＨＯ含有プラスチック様物質を、化学的処理および物理的分離により誘導体形態でさらに精製した：実施例３からのヘキサン抽出により単離された部分的に精製されたＰＨＯ含有プラスチック物質の一部（２．７５ｇ、約４０重量％のＰＨＯを含む）を、加熱しながらｎ−ブタノール（５０ｍＬ）で溶解した。濃硫酸（０．７ｍＬ）を添加し、そして混合物を２０時間加熱還流した。室温まで冷却した後、飽和炭酸ナトリウム（４ｍＬ）を混合し、混合物をｐＨ紙に対して塩基性にした。反応混合物を濾過し、相を分離し、そして有機層をブライン（２×３０ｍＬ）で洗浄した。有機相を約１０ｍＬまで濃縮し、クロロホルム（５０ｍＬ）に溶解し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、真空下で濃縮して黄色の油（２．７５ｇ）を得た。この物質を減圧下で蒸留した。９３〜９７℃および０．４５ｔｏｒｒで蒸留する画分を回収して、透明な無色の液体（０．４１ｇ）を得た。回収された物質の量は、プラスチック様開始物質に含まれるＰＨＯの量に基づいて誘導体化されたＰＨＯの２５％収率を示す。この物質のＮＭＲ分析により、これは約９５％純度のブチル３−ヒドロキシオクタノエートであり、そして非常に少量の不飽和物質を含むことが示された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、植物からポリエステルを単離する領域に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）は、環境ストレスに応答して種々の生物により合成される、天然に存在するポリエステルのクラスである。概説のために、非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；ならびに非特許文献６を参照のこと。
【０００３】
ＰＨＡ生体ポリマーは、それらの側鎖の長さに応じて２つの群に分けられ得る。短い側鎖を有するもの（例えば、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、Ｒ−３−ヒドロキシ酪酸ユニットのホモポリマー）は、結晶熱可塑性プラスチックであるが、長い側鎖を有するＰＨＡは、よりエラストマー性である。前者は、約７０年間にわたって公知である（非特許文献７）が、一方、後者の物質は、１９８０年代初期に最初に同定された。非特許文献８。
【０００４】
短側鎖物質は、その早い発見およびその望ましい物理的特性のために、より広範に研究されてきた。天然の熱可塑性プラスチックであるＰＨＡポリマーは、従来のポリマー技術を用いてプロセッシングされ得、そして産業上有用な特性（例えば、土壌中および海洋環境における生分解性、生体適合性、ならびに良好なバリア特性）を有する。これらの特性により、これらの物質は、広範な産業上の適用に有用である。
【０００５】
ＰＨＡポリマーは、細菌の乾燥細胞重量の９０％までを構成し得、これらは細菌細胞内の分散顆粒（ｄｉｓｃｒｅｔｅｇｒａｎｕｌｅｓ）として見出される。これらのＰＨＡ顆粒は、栄養制限に応答して蓄積し、そして炭素およびエネルギーの保存物質として作用する。異なる経路が、各クラスのこれらのポリマーを産生する微生物により用いられる。短側鎖ポリヒドロキシアルカノエート（ＳＳＣＰＨＡ）に至る経路には、３つの酵素（チオラーゼ、レダクターゼ、およびＰＨＢシンターゼ（時々ポリメラーゼと呼ばれる））が挙げられる。この経路を用いて、アセチル−補酵素Ａの２分子を縮合して、アセトアセチル−補酵素Ａを得、続いてこの中間体をＲ−３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａに還元し、続いて重合することにより、ホモポリマーＰＨＢを合成する。この経路における最後の酵素（シンターゼ）は、Ｒ−４−ヒドロキシ酸ユニットおよびＲ−５−ヒドロキシ酸ユニットを含むＣ３〜Ｃ５モノマーユニットを適合し得る基質特異性を有する。この生合成経路は、例えば、細菌ＺｏｏｇｌｏｅａｒａｍｉｇｅｒａおよびＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｅｕｔｒｏｐｈｕｓ中に見出される。
【０００６】
長側鎖ポリヒドロキシアルカノエート（ＬＳＣＰＨＡ）を作製するのに用いられる生合成経路は、未だに部分的に不明であるが、ＬＳＣＰＨＡに至るモノマーヒドロキシアシルユニットは、脂肪酸のβ−酸化および脂肪酸経路により誘導されると現在考えられている。次いで、これらの経路から得られるＲ−３−ヒドロキシアシル−補酵素基質は、ＰＨＡシンターゼ（これは、Ｃ６〜Ｃ１４の範囲内にあるより大きいモノマーユニットを選択する（ｆａｖｏｒｉｎｇ）基質特異性を有する）により重合される。例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓにより、長側鎖ＰＨＡが産生される。
【０００７】
ＰＨＡの生合成は、生化学レベルおよび遺伝子レベルの両方において、広範な細菌において研究されており、そして非特許文献９において概説される。最初のＰＨＡシンターゼ遺伝子は１９８９年に同定されそして特徴付けされた（非特許文献１０；ならびにＰｅｏｐｌｅｓａｎｄ Ｓｉｎｓｋｅｙの特許文献１、特許文献２、および特許文献３）ので、多くの他の微生物ＰＨＡポリメラーゼが研究され、そしてそれらのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列が公開されている。非特許文献１１。より近年では、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍｖｉｎｏｓｕｍ（非特許文献１２；ならびに特許文献４）およびＴｈｉｏｃｙｓｔｉｓ ｖｉｏｌａｃｅａ（非特許文献１３）由来の２つのサブユニットＰＨＡシンターゼが記載されている。
【０００８】
例えば、Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａおよびＡ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓにおけるＳＳＣＰＨＡの産生を担う酵素をコードする遺伝子が単離され、そして配列決定されている。非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６、ならびに非特許文献１７；ならびに非特許文献１８。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第５，２２９，２７９号明細書
【特許文献２】米国特許第５，２４５，０２３号明細書
【特許文献３】米国特許第５，２５０，４３０号明細書
【特許文献４】国際公開第９３／０２１９４号パンフレット
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｂｙｒｏｍ， Ｄ．、「ＭｉｓｃｅｌｌａｎｅｏｕｓＢｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ」（Ｄ． Ｂｙｒｏｍ編、「Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ」ＭａｃＭｉｌｌａｎＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９９１、３３３−３５９頁中）
【非特許文献２】Ｈｏｃｋｉｎｇ、Ｐ．Ｊ． およびＭａｒｃｈｅｓｓａｕｌｔ， Ｒ． Ｈ．、「Ｂｉｏｐｏｌｙｅｓｔｅｒｓ」（Ｇ． Ｊ． Ｌ． Ｇｒｉｆｆｉｎ編、「ＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ」、Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９９４、４８−９６頁
【非特許文献３】Ｈｏｌｍｅｓ，Ｐ． Ａ．、「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ （Ｒ）−３−ｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅＰｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄＣｏｐｏｌｙｍｅｒｓ」（Ｄ． Ｃ． Ｂａｓｓｅｔｔ編、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｌｏｎｄｏｎ、第２巻、１９８８、１−６５頁中）
【非特許文献４】Ｌａｆｆｅｒｔｙら、「ＭｉｃｒｏｂｉａｌＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙ−β−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ」、Ｈ． Ｊ．ＲｅｈｍおよびＧ． Ｒｅｅｄ編、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、第６６巻、１９８８、１３５−１７６頁
【非特許文献５】ＭｕｌｌｅｒおよびＳｅｅｂａｃｈ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ、Ｅｎｇｌ．、３２：４７７−５０２（１９９３）
【非特許文献６】Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ， Ａ．、「ＰｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏｉｃＡｃｉｄｓ」、Ｂｙｒｏｍ， Ｄ．編、「Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ」、ＭａｃＭｉｌｌａｎＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９９１、１２３−２１３頁
【非特許文献７】ＬｅｍｏｉｇｎｅおよびＲｏｕｋｈｅｌｍａｎ、Ａｎｎａｌｅｓｄｅｓ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ， ５：５２７−５３６（１９２５）
【非特許文献８】Ｄｅ Ｓｍｅｔら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１５４：８７０−８７８（１９８３）
【非特許文献９】Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌら、ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ、１０３：２１７−２３０（１９９２）
【非特許文献１０】Ｐｅｏｐｌｅｓａｎｄ Ｓｉｎｓｋｅｙ、Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、２６４：１５２９８−１５３０３（１９８９）
【非特許文献１１】Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌら、ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ、１０３：２１７−２３０（１９９２）
【非特許文献１２】Ｌｉｅｂｅｒｓｇｅｓｅｌｌ，Ｍ．およびＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ， Ａ．、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２０９：１３５−１５０（１９９２）
【非特許文献１３】Ｔｈｉｏｃｙｓｔｉｓ ｖｉｏｌａｃｅａ（Ｌｉｅｂｅｒｓｇｅｓｅｌｌ， Ｍ．およびＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ， Ａ．、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３８：４９３−５０１（１９９３）
【非特許文献１４】ＰｅｏｐｌｅｓおよびＳｉｎｓｋｙ、Ｐｒｏｇ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３：５１−５６（１９８７）
【非特許文献１５】Ｐｅｏｐｌｅｓら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６２：９７−１０２（１９８７）
【非特許文献１６】ＰｅｏｐｌｅｓおよびＳｉｎｓｋｙ（１９８９）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：１５２９８−１５３０３、Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：１５２９３−１５２９７
【非特許文献１７】ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３：３４９−３５７；Ｓｌａｔｅｒら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７０：４４３１−４４３６（１９８８）
【非特許文献１８】Ｓｃｈｕｂｅｒｔら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７０：５８３７−５８４７（１９８８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ＰＨＡを産生する微生物は、６０％（全乾燥重量）より多くまでＰＨＡを産生し、これらは有機溶媒により容易に抽出され得る。Ｌａｆｆｅｒｔｙら、「ＭｉｃｒｏｂｉａｌＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆ Ｐｏｌｙ−β−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｉｃ Ａｃｉｄ」（Ｈ．Ｊ．ＲｅｈｍおよびＧ．Ｒｅｅｄ編、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、第６６巻、１９８８、１３５−１７６頁中）。植物において、ＰＨＡの抽出および回収は、大量の植物油の存在とより低い割合のＰＨＡにより、著しく複雑である。これらの複雑化要因のために、植物からのＰＨＡの首尾良い抽出、分離、および回収がより難しくなっている。
【００１２】
植物バイオマス（ｂｉｏｍａｓｓ）由来のポリヒドロキシアルカノエートの大規模なプロセシングおよび精製のための方法を開発することが必要とされている。従って、本発明の目的は、植物バイオマス由来のＰＨＡを大規模でプロセシングするための方法を提供することである。本発明の別の目的は、トランスジェニック油料作物植物（ｏｉｌｃｒｏｐｐｌａｎｔ）からＰＨＡを単離するための方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、植物油のような非ＰＨＡ産生物の回収もまた最大化されるように、油料種子作物植物（ｏｉｌｓｅｅｄｃｒｏｐ ｐｌａｎｔ）由来の植物バイオマスをプロセッシングするための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、以下を提供する。
（項目１） 植物油および粉（ｍｅａｌ）を含む植物バイオマスからポリヒドロキシアルカノエート（「ＰＨＡ」）を分離する方法であって、第１の溶媒を用いて該植物バイオマスを抽出して該バイオマスから該油を本質的に除去する工程、次いで、該植物バイオマスから該ＰＨＡを分離する工程を包含する、方法。
（項目２） 前記植物バイオマスが、トランスジェニック植物に由来する、項目１に記載の方法。
（項目３） 前記バイオマスから前記ＰＨＡを分離する前に、該ＰＨＡを誘導体化する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目４） 前記分離されたＰＨＡが、以下の式を有する１つ以上のユニットを含む、項目１に記載の方法であって：
−ＯＣＲ１Ｒ２（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＯ−
ここで、ｎは０または整数であり；そして
ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ、炭化水素基、ハロおよびヒドロキシ置換基、ヒドロキシ基、ハロゲン基、窒素置換基、酸素置換基、ならびに水素原子からなる群より独立して選択される、方法。
（項目５） 前記分離されたＰＨＡが、前記ユニットの、モノマー、ダイマー、直線状オリゴマーおよび環状オリゴマー、ならびにラクトンからなる群より選択される、項目４に記載の方法。
（項目６） 前記分離されたＰＨＡが、以下からなる群より選択される項目３に記載の方法であって：
次式で定義されるエステル：ＨＯＣＲ１Ｒ２（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＯ２Ｒ５；
次式で定義されるアミド：ＨＯＣＲ１Ｒ２（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＯＮＲ５Ｒ６；
次式で定義されるチオエステル：ＨＯＣＲ１Ｒ２（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＯＳＲ５；
次式で定義される酸：ＨＯＣＲ１Ｒ２（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＯ２Ｈ；
次式で定義されるエーテル：Ｒ６ＯＣＲ１Ｒ２（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＯ２Ｒ５；
次式で定義されるエステル：Ｒ６ＣＯ２Ｒ１Ｒ２（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＯ２Ｒ５；
次式で定義される不飽和化合物：
Ｒ１Ｒ２Ｃ＝ＣＲ３（ＣＲ４Ｒ５）ｎＣＯ２Ｒ６；および
Ｒ１Ｒ２Ｒ３ＣＣ（Ｒ４）＝Ｃ（Ｒ５）ＣＯ２Ｒ６；
次式で定義されるジオール：ＨＯＣＲ１Ｒ２（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＨ２ＯＨ；
次式で定義されるラクトンまたはマクロライド：
【００１４】
【化１】
ここで、ｘは整数である；ならびに
以下の式で定義されるケトンまたはアルデヒド：
【００１５】
【化２】
ここで、ｎは０または整数であり；そして
ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６はそれぞれ、炭化水素基、ハロおよびヒドロキシ置換基、ヒドロキシ基、ハロゲン基、窒素置換基、酸素置換基、ならびに水素原子からなる群より独立して選択される、方法。
（項目７） 項目１に記載の方法であって、
ａ）ＰＨＡを含有する植物バイオマスを提供する工程；
ｂ）該植物バイオマスをプレプロセシングして、該ＰＨＡ、油および植物粉を含有する混合物を得る工程；
ｃ）該油が溶解する温度にて、該油は溶解しかつ該ＰＨＡはあまり溶解しない第１の溶媒を用いて該混合物から該油を抽出し、該ＰＨＡを含有する残留粉混合物を得る工程；および
ｄ）該ＰＨＡが溶解する第２の溶媒を用いて、工程ｃ）において得られた該残留粉混合物を抽出し、該バイオマスから該ＰＨＡを分離する工程、
を包含する、方法。
（項目８） 項目１に記載の方法であって、
ａ）ＰＨＡを含有する植物バイオマスを提供する工程；
ｂ）該植物バイオマスをプレプロセシングして、該ＰＨＡ、油および植物粉を含有する混合物を得る工程；
ｃ）該油が溶解する温度にて、該油は溶解しかつ該ＰＨＡはあまり溶解しない第１の溶媒を用いて該混合物から該油を抽出し、該ＰＨＡを含有する残留粉混合物を得る工程；
ｄ）工程ｃ）において得られたＰＨＡを含有する該残留粉混合物を、少なくとも１つの化学的薬剤または生化学的薬剤で処理して、該ＰＨＡを化学的に誘導体化する工程；および
ｅ）工程ｄ）において得られた該残留粉混合物から誘導体化されたＰＨＡを分離する工程；
を包含する、方法。
（項目９） 前記工程ｂ）が、以下からなる群より選択される１つ以上のプロセス：乾燥、皮むき、クリーニング、エイジング、秤量、分解、圧ぺん、加圧、圧延、粉砕、クッキング、破砕、沈降、濾過、洗浄、遠心分離分画、および空気分級、を用いて前記植物バイオマスをプレプロセシングする工程を包含する、項目７または８に記載の方法。
（項目１０） 前記第２の溶媒が、塩素化された有機溶媒、アルキルカーボネート、アルコール、ヒドロキシ酸、酢酸、およびそれらの混合物からなる群より選択される、項目７に記載の方法。
（項目１１） 前記第２の溶媒が、クロロホルム、塩化メチレン、ジクロロエタン、トリクロロエタン、テトラクロロエタン、およびジクロロアセテートからなる群より選択される塩素化された有機溶媒を包含する、項目１０に記載の方法。
（項目１２） 前記第２の溶媒が、プロピレンカーボネート、エチレンカーボネート、トリフルオロエタノール、無水酢酸、酢酸、ジメチルホルムアミド、エチルアセトアセテート、トリオレイン、トルエン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ピリジン、および３より多い炭素原子を有するアルコールからなる群より選択される組成物を包含する、項目７に記載の方法。
（項目１３） 前記工程ｄ）において、前記ＰＨＡを含有する残留粉混合物が、酸、塩基、界面活性剤、酸化剤、キレート剤、還元剤、求核剤、求電子剤、金属イオン、およびフリーラジカルからなる群より選択される、少なくとも１つの化学的薬剤で処理される、項目８に記載の方法。
（項目１４） 前記ＰＨＡが、エステル化、エステル交換、加水分解、けん化、アミノリシス、チオリシス、エーテル化、シリル化、付加、脱離、再配列、還元、および縮合からなる群より選択される化学変換により誘導体化される、項目８に記載の方法。
（項目１５） 前記生化学的薬剤が酵素である、項目８に記載の方法。
（項目１６） 前記酵素が、デポリメラーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、リパーゼ、ホスホリラーゼ、およびグリコシダーゼからなる群より選択される、項目１５に記載の方法。
（項目１７） 前記工程ｅ）において、前記誘導体化されたＰＨＡが、蒸留、抽出、遠心分離、濾過、蒸発、およびクロマトグラフィーからなる群より選択される物理的プロセスにより分離される、項目８に記載の方法。
（項目１８） 前記第１および第２の溶媒がそれぞれ、３０℃と２５０℃との間の沸点を有する、項目７または８に記載の方法。
（項目１９） 前記分離されたＰＨＡ誘導体を沈殿させる工程をさらに包含する、項目７または８に記載の方法。
（項目２０） 前記バイオマスが、ダイズ、ワタ、ココナッツ、アメリカホドイモ、ナタネ、ヒマワリの種子、オリーブ、ヤシ、ゴマの種子、アマニ、トウゴマ、ベニバナの種子、タバコ、トウモロコシ、アブラナ、およびジャガイモからなる群より選択される植物供給源に由来する、項目１に記載の方法。
（項目２１） 前記分離されたＰＨＡが、ヒドロキシブチレート、ヒドロキシバレレート、ヒドロキシヘキサノエート、ヒドロキシヘプタノエート、ヒドロキシオクタノエート、ヒドロキシノナノエート、およびヒドロキシデカノエートからなる群より選択される、１つ以上の同じまたは異なるユニットを含む、項目４に記載の方法。
（項目２２） 前記分離されたＰＨＡが、３−ヒドロキシ酪酸、４−ヒドロキシ酪酸、クロトン酸、およびそのアルキルエステルからなる群より選択される、項目８に記載の方法。
（項目２３） 前記植物バイオマスが、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｈｉｏｃｙｓｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、およびＺｏｏｇｌｏｅａからなる群より選択される微生物由来の異種ＰＨＡシンターゼ遺伝子を含む植物に由来する、項目２に記載の方法。
（項目２４） 植物油を含む植物バイオマスからポリヒドロキシアルカノエート（「ＰＨＡ」）を分離する方法であって、該油および該ＰＨＡが溶解する温度にて、該油および該ＰＨＡが溶解する第１の溶媒を用いて該植物バイオマスを抽出して、該バイオマスから該油および該ＰＨＡを本質的に取り出す工程、次いで、該油から該ＰＨＡを分離する工程を包含する、方法。
（項目２５） 前記植物バイオマスが、トランスジェニック油料作物植物に由来する、項目２４に記載の方法。
（項目２６） 項目２５に記載の方法であって、
ａ）ＰＨＡを含有する植物バイオマスを提供する工程；
ｂ）該植物バイオマスをプレプロセシングして、該ＰＨＡ、油および植物粉の混合物を得る工程；
ｃ）該油および該ＰＨＡは溶解し、かつ該粉はあまり溶解しない第１の溶媒を用いて、該混合物から該油および該ＰＨＡを抽出する工程；および
ｄ）該油から該ＰＨＡを分離する工程；
を包含する、方法。
（項目２７） 前記工程ｄ）において、前記ＰＨＡ−油混合物を化学的薬剤または生化学的薬剤で処理し、それによって該ＰＨＡを化学的に誘導体化し、そして誘導体化されたＰＨＡを該油から分離することによって、該ＰＨＡが該油から分離される、項目２６に記載の方法。
（項目２８） 前記溶媒が、塩素化された有機溶媒、アルキルカーボネート、アルコール、ヒドロキシ酸および炭化水素、ならびにそれらの混合物からなる群より選択される、項目２６に記載の方法。
（項目２９） 前記溶媒が、ヘキサン、トリフルオロエタノール、無水酢酸、ジメチルホルムアミド、エチルアセトアセテート、トリオレイン、酢酸、トルエン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、およびピリジンからなる群より選択される、項目２６に記載の方法。
（項目３０） 前記生化学的薬剤が、ＰＨＡデポリメラーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、リパーゼ、ヒドラターゼ、ホスホリラーゼ、セルラーゼ、およびグルコシダーゼからなる群より選択される酵素である、項目２７に記載の方法。
（項目３１） 前記分離されたＰＨＡが、アミド、チオエステル、酸、エーテル、エステル、不飽和化合物、ジオール、ケトン、およびアルデヒドからなる群より選択される官能基を含む、項目７、８、２６、または２７に記載の方法。
（項目３２） 前記分離されたＰＨＡが、３−ヒドロキシ酸、４−ヒドロキシ酸、および５−ヒドロキシ酸からなる群より選択される１つ以上のユニットを含む、項目７、８、２６、または２７に記載の方法。
（項目３３） 項目７または２６に記載の方法であって、前記分離されたＰＨＡが有機溶媒中にて分離され；ここで、該方法が、該有機溶媒中の該ＰＨＡを、界面活性剤を含有する水溶液中にエマルジョン化し、それによりＰＨＡラテックスを形成する工程をさらに包含する、方法。
（項目３４） 項目７または２６に記載の方法であって、前記分離されたＰＨＡが有機溶媒中にて分離され、ここで、該方法が、該有機溶媒中の該ＰＨＡを水溶液中にエマルジョン化する工程、および該溶媒を除去し、それによりＰＨＡラテックスを形成する工程をさらに包含する、方法。
【００１６】
（発明の要旨）
ポリヒドロキシアルカノエート（「ＰＨＡ」）を植物から分離するための方法が提供される。１つの実施態様では、植物油を含むトランスジェニック作物植物に由来する植物バイオマスからＰＨＡを単離するための方法が提供される。この方法は、油およびＰＨＡの両方が植物バイオマスから回収されることを有利に可能にする。１つの実施態様では、ＰＨＡを単離するために、油料作物植物に由来するバイオマスは、例えば粉砕、破砕、または圧延によってプレプロセシング（ｐｒｅ−ｐｒｏｃｅｓｓ）される。次いで、油は、第１の溶媒（油はこの溶媒に溶解し、ＰＨＡはこの溶媒にあまり溶解しない）を用いてバイオマスから抽出され、油はＰＨＡから分離される。次いで、実質的に油を含まない植物バイオマスは、第２の溶媒（ＰＨＡはこの溶媒に溶解する）を用いて抽出され、ＰＨＡはバイオマスから分離される。あるいは、ＰＨＡ含有バイオマスは、化学的薬剤または生化学的薬剤（例えば、酵素）を用いて処理され、ＰＨＡはＰＨＡ誘導体に化学的に変換される。次いで、誘導体化されたＰＨＡは、例えば物理的分離プロセス（例えば、蒸留、抽出、またはクロマトグラフィー）を用いて、混合物から分離される。好都合なことに、この方法を用いて、植物油、ＰＨＡ、およびＰＨＡ誘導体の全てが、トランスジェニックな油料作物植物のような植物から大規模で回収され得、そして精製され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１ａは、短側鎖ポリヒドロキシアルカノエートの構造を図示したものである。図１ｂは、長側鎖ポリヒドロキシアルカノエートの構造を図示したものである。
【図２】図２ａは、短側鎖ポリヒドロキシアルカノエートであるポリヒドロキシブチレートの合成のための生合成経路を図示したものである。図２ｂは、長側鎖ポリヒドロキシアルカノエートの合成のための生合成経路を図示したものである。
【図３】図３は、植物からポリヒドロキシアルカノエートを分離するためのプロセスの１つの実施態様を例示するフローチャートである。
【図４】図４は、植物からポリヒドロキシアルカノエートを分離するためのプロセスの別の実施態様を例示するフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（発明の詳細な説明）
植物油および粉（ｍｅａｌ）を含む植物バイオマスからポリヒドロキシアルカノエート（「ＰＨＡ」）を分離するための方法が提供される。植物バイオマスから単離され得るＰＨＡは、ＰＨＡの分解物また他の生成物（例えば、モノマー、ダイマー、オリゴマー、酸、エステル、アミド、およびラクトン）を含み、そしてこれは、バイオマスをプロセシングの間の、化学的、生化学的、または物理的処理から形成され得るか、または植物バイオマス内に生じるプロセスから形成され得る。好ましい実施態様では、ＰＨＡは、トランスジェニック油料作物植物に由来するバイオマスから単離される。ＰＨＡ物質の回収を最大にすることに加えて、バイオマスからの商業的に有用な非ＰＨＡ生成物の回収もまた最大となる。例えば、油料種子植物の種子からＰＨＡを分離する場合、油および粉もまた単離され得、次いで商業的に使用され得る。
【００１９】
（Ｉ．ＰＨＡ単離のための物質）
（Ａ．単離され得るＰＨＡ物質）
植物バイオマスから単離され得るＰＨＡ物質は、モノマー、ポリマー、およびＰＨＡから誘導される他の生成物（化学的および生物学的に改変された誘導体を含む）を含む。ＰＨＡ物質は、１つの実施態様では、以下の式Ｉの１つ以上のユニット（例えば、１０〜１００，０００ユニット、好ましくは、１００〜３０，０００ユニット）を含むものとして定義される：
−ＯＣＲ１Ｒ２（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＯ−；
ここで、ｎは０または整数（例えば、１〜１５の間）であり、そして好ましい実施態様では、１〜４の間であり；そして
ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、独立して、長鎖炭化水素基を含む炭化水素基；ハロおよびヒドロキシ置換基；ヒドロキシ基；ハロゲン基；窒素置換基；酸素置換基；ならびに／または水素原子であり得る。
【００２０】
本明細書中に定義される、式−（ＣＲ３Ｒ４）ｎ−は、以下の式を含むがそれに限定されないように定義される：
−ＣＲ３Ｒ４（ここで、ｎは１である）；
−ＣＲ３Ｒ４ＣＲ３’Ｒ４’−（ここで、ｎは２である）；および
−ＣＲ３Ｒ４ＣＲ３’Ｒ４’ＣＲ３”Ｒ４”−（ここで、ｎは３である）；
ここで，Ｒ３、Ｒ４、Ｒ３’、Ｒ４’、Ｒ３”、およびＲ４”は、独立して、長鎖炭化水素基を含む炭化水素基；ハロおよびヒドロキシ置換基；ヒドロキシ基；ハロゲン基；窒素置換基；酸素置換基；ならびに／または水素原子であり得る。従って、式Ｉは、３−ヒドロキシ酸（ｎ＝１）、４−ヒドロキシ酸（ｎ＝２）、５−ヒドロキシ酸（ｎ＝３）から誘導されるユニットを含む。
【００２１】
これらのユニットは、ホモポリマーのように同一であってもよく、あるいはコポリマーまたはターポリマーのように２つ以上の異なるユニットから選択されてもよい。１つの実施態様におけるポリマーは、３００ダルトンを超える、例えば、３００ダルトンと１，０００，０００ダルトンとの間、そして好適な実施態様では、１０，０００ダルトンと３，０００，０００ダルトンとの間の分子量を有する。１つの実施態様では、ＰＨＡホモポリマー（例えば、ポリヒドロキシブチレート、ポリヒドロキシバレレート、またはポリ乳酸）が単離され得る。さらに、少なくとも２つのヒドロキシアルカノエートのモノマー（例えば、ヒドロキシブチレート、ヒドロキシバレレート、ヒドロキシヘキサノエート、ヒドロキシヘプタノエート、ヒドロキシオクタノエート、ヒドロキシノナノエート、およびヒドロキシデカノエート）を含むＰＨＡコポリマーまたはターポリマーが、単離され得る。ＰＨＡ（３−ヒドロキシ酸、４−ヒドロキシ酸、および５−ヒドロキシ酸のモノマー、およびポリマー、ならびに誘導体を含む）もまた単離され得る。
【００２２】
ＰＨＡポリマーはまた、非ヒドロキシ酸ユニット（例えば、長鎖脂肪酸、アミノ酸、炭水化物、リン含有化合物およびイオウ含有化合物、ならびにグリセリンのようなトリオール）を含んでもよく、またはこれらを含むように改変されてもよい。単離され得るＰＨＡ生成物は、バイオマスを物理的、化学的または生化学的に処理した際に形成される誘導体、あるいはヒドロキシ酸モノマー、ダイマー、トリマー、直線状および環状オリゴマー、ならびにラクトンを含むバイオマス内のプロセスによって形成される誘導体を含む。単離され得るＰＨＡ誘導体生成物は、ポリヒドロキシアルカノエートまたはポリヒドロキシアルカノエートから誘導されるモノマーの、エステル、ジオール、不飽和化合物、アルデヒド、酸、アルコール、ラクトン、環状および直線状エステル、アミド、およびチオエステルを含む。
【００２３】
植物バイオマスから単離され得る代表的なＰＨＡ生成物は、以下を含む：
次式で定義されるエステル：ＨＯＣＲ１Ｒ２（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＯ２Ｒ５；
次式で定義されるアミド：ＨＯＣＲ１Ｒ２（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＯＮＲ５Ｒ６；
次式で定義されるチオエステル：ＨＯＣＲ１Ｒ２（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＯＳＲ５；
次式で定義される酸：ＨＯＣＲ１Ｒ２（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＯ２Ｈ；
次式で定義されるエーテル：Ｒ６ＯＣＲ１Ｒ２（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＯ２Ｒ５；
次式で定義されるエステル：Ｒ６ＣＯ２Ｒ１Ｒ２（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＯ２Ｒ５；
次式で定義される不飽和化合物：
Ｒ１Ｒ２Ｃ＝ＣＲ３（ＣＲ４Ｒ５）ｎＣＯ２Ｒ６；および
Ｒ１Ｒ２Ｒ３ＣＣ（Ｒ４）＝Ｃ（Ｒ５）ＣＯ２Ｒ６；
次式で定義されるジオール：ＨＯＣＲ１Ｒ２（ＣＲ３Ｒ４）ｎＣＨ２ＯＨ；
次式で定義されるラクトンまたはマクロライド：
【００２４】
【化３】
ここで、ｘは整数、例えば、１〜１０である；ならびに
以下の式で定義されるケトンまたはアルデヒド：
【００２５】
【化４】
ここで、ｎは０または整数であり；そして
ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、それぞれ独立して、長鎖炭化水素基を含む炭化水素基、ハロおよびヒドロキシ置換基、ヒドロキシ基、ハロゲン基、窒素置換基、酸素置換基、ならびに水素原子であり；そしてここで、−（ＣＲ２Ｒ３）ｎ−は、上記で定義される通りである。
【００２６】
商業的に有用なモノマーＰＨＡ生成物（例えば、３−ヒドロキシ酪酸またはクロトン酸、またはそのアルキルエステル（メチル−３−ヒドロキシブタノエート、エチル−３−ヒドロキシブタノエート、プロピル−３−ヒドロキシブタノエートおよびブチル−３−ヒドロキシブタノエートを含む））もまた、単離され得る。ＰＨＡ由来のヒドロキシ酸モノマーは、より高分子量の形態に加えて、さらなる改変をしてもしなくても商業的に使用され得る価値ある化学物質の供給源である。
【００２７】
本明細書中で使用される、用語「ＰＨＡ物質」または「ＰＨＡ」または「ポリヒドロキシアルカノエート」は、プロセシングの前にバイオマス中に元来存在する、モノマー、ポリマー、および他のＰＨＡベースの物質、ならびにプロセシングの間に形成される生成物（例えば、植物バイオマス内に生じる分解またはプロセスから形成される生成物、あるいは化学的薬剤または生物学的薬剤でバイオマスを処理して化学的に変換させることにによって形成される誘導体生成物）を意味する。
【００２８】
（Ｂ．ＰＨＡが単離され得る植物供給源）
（植物種）
ＰＨＡおよびＰＨＡ生成物は、植物（例えば、ダイズ、ワタ、ココナッツ、アメリカホドイモ、ナタネ、ヒマワリの種子、オリーブ、ヤシ、ゴマの種子、アマニ、トウゴマ（ｃａｓｔｏｒ）、ベニバナの種子、タバコ、およびジャガイモ）由来の植物バイオマスから単離され得る。好ましい実施態様において、バイオマスは、油料作物植物（特に、ナタネ、ヒマワリの種子、ベニバナの種子、アマニ、およびダイズ）に由来し得る。ＰＨＡポリマーに加えて、種子作物植物中の植物油が単離され得、そしてプロセシングの間に回収される。植物油は、代表的には、種子の１０〜５０重量％を構成する。植物油の世界的な需要が考慮されている。植物バイオマスをプロセシングするための方法は、単離される特定のＰＨＡポリマーまたは誘導体の性質に基づいて、および抽出される植物作物および植物成分の型に基づいて適合され得る。
【００２９】
（トランスジェニック植物の作製）
トランスジェニック油料作物植物の使用は、多くの利点を提供する。ＰＨＡ生成のためのトランスジェニック作物植物は、当該分野で利用可能な方法を用いて得られ得る。トランスジェニック植物作物の作製は、石油化学に由来するプラスチックと価格および規模の両方で競争し得るＰＨＡポリマーを生成し得る。トランスジェニック植物由来のＰＨＡポリマーまたはそれらの誘導体は、商業的に有用な形態で植物バイオマスからプロセスされ、そして分離され得る。植物作物におけるＰＨＡの位置（例えば、葉、種子、茎、またはそれらの組合せ）は、植物からのＰＨＡの収率を最大にするために変化され得る。
【００３０】
例えば、Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａおよびＡ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓの短側鎖ＰＨＡの生成を担う酵素をコードする遺伝子が、同定され、単離され、そして配列決定されている。ＰｅｏｐｌｅｓおよびＳｉｎｓｋｅｙ，Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：５１−５６（１９８７）；Ｐｅｏｐｌｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：９７−１０２（１９８７）；ＰｅｏｐｌｅｓおよびＳｉｎｓｋｅｙ（１９８９），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１５２９８−１５３０３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１５２９３−１５２９７、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：３４９−３５７；Ｓｌａｔｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７０：４４３１−４４３６（１９８８）；およびＳｃｈｕｂｅｒｔら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７０：５８３７−５８４７（１９８８）。Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓにおいて、それらは、短側鎖ＰＨＡのシンターゼ、チオラーゼ、およびレダクターゼをそれぞれコードする、オペロンｐｈｂＣ−ｐｈｂＡ−ｐｈｂＢ遺伝子から見出された。長側鎖ＰＨＡについては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ生物のそのシンターゼ酵素が、ｐｈａ遺伝子座によりコードされると見出された。この遺伝子座は、２つの密接に関連するＰＨＡシンターゼ遺伝子であるｐｈａＡおよびｐｈａＣ、ならびにｐｈａＢ遺伝子の産物であるデポリメラーゼ遺伝子を含む。
【００３１】
トランスジェニック作物種においてＰＨＡポリメラーゼを産生するために使用され得る方法は、米国特許第５，２４５，０２３号および同第５，２５０，４３０号；ＷＯ９１／００９１７；ＷＯ９２／１９７４７；ＷＯ９３／０２１８７；ＷＯ９３／０２１９４；ＷＯ９４／１１５１９；ＷＯ９４／１２０１４；ＷＯ９４／２３０２７；ＷＯ９５／０５４７２；Ｐｏｉｒｉｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：５２０−５２３（１９９２）、Ｐｏｉｒｉｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１３：１４２−１５０（１９９５）、およびＮａｗｒａｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：１２７６０−１２７６４（１９９４）に記載されている。
【００３２】
トランスジェニック作物種を形成するために、ＰＨＡシンターゼをコードする遺伝子を微生物から植物細胞に移入して、適切なレベルのＰＨＡシンターゼ酵素の産生を得る。遺伝子は、微生物（例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｈｉｏｃｙｓｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、またはＺｏｏｇｌｏｅａ）に由来し得る。さらなるＰＨＡ生合成遺伝子（例えば、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子またはＰＨＡシンターゼ酵素の基質を合成するために必要とされる酵素をコードする他の遺伝子）もまた提供され得る。異なる植物組織または細胞小器官における発現は、当業者に公知の方法を用いて制御され得る。ＧａｓｓｅｒおよびＦｒａｌｅｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１２９３−１２９９（１９８９）。ＰＨＢは、標準的な技術により遺伝子操作された植物系において産生されている。Ｐｏｉｒｅｒ，Ｙ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：５２０−５２３（１９９２）；Ｐｏｉｒｉｅｒ，Ｙら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１３：１４２−１５０（１９９５）；およびＮａｗｒａｔｈ，Ｃら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：１２７６０−１２７６４（１９９４）。
【００３３】
好ましい実施態様において、抽出前の植物バイオマスのＰＨＡ含有量は、バイオマスの乾燥重量の少なくとも１重量％、より好ましくはバイオマスの乾燥重量の５〜９５重量％、そして別の好ましい実施態様においてバイオマスの乾燥重量の約５〜６０重量％、最も好ましくは１０〜６０％である。好ましくは、ＰＨＡの少なくとも２４％が、油から分離するプロセスにおいて回収される。
【００３４】
（ＩＩ．植物からのＰＨＡの単離のための方法）
（Ａ．植物バイオマスのプレプロセシング）
ＰＨＡ含有植物バイオマス（例えば、異種ＰＨＡシンターゼ遺伝子を含むトランスジェニック油料作物植物）が栽培され、そして収穫される。植物バイオマスは、ＰＨＡポリマーの抽出の前に、当該分野で利用可能な方法（例えば、撹拌、加熱、冷却、圧縮、減圧、超音波処理、遠心分離、および／または放射）を用いてプレプロセシングされ得る。本明細書中で使用する用語「植物バイオマス」は、植物の構成部分（例えば、種子、葉、葉柄および茎）をいう。さらに、植物バイオマスは、乾燥、皮むき、クリーニング、エイジング、秤量、分解、圧ぺん、加圧、圧延、粉砕、クッキング、破砕、沈降、および／または濾過を含む手順の任意の１つ以上の組合せを用いてプレプロセシングされ得る。油を有する植物のプロセシングにおける粉から油を分離するこれらの手順の使用は、「ＯｉｌＣｒｏｐｓｏｆ ｔｈｅ Ｗｏｒｌｄ」、Ｇ．Ｒｏｂｂｌｅｎら編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９８９，第１１章に記載される。さらに、乾式製粉および湿式製粉の両方のアプローチを含むトウモロコシ製粉に使用される方法は、デンプンを含む胚乳から油を含む胚を分離する工程を含有する。これは、例えば、「ＣｏｒｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、１９９４年版、Ｗａｔｓｏｎ，Ｓ．Ａ．およびＲａｍｓｔａｄ，Ｐ．Ｅ．編、ＡｍｅｒｉｃａｎＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆＣｅｒｅａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａに記載されるような、遠心分離または空気分級により達成され得る。
【００３５】
（Ｂ．植物バイオマスの抽出）
ＰＨＡのモノマー、ポリマーおよび誘導体は、適切な手段（溶媒抽出および／または溶媒洗浄、水抽出および／または水洗浄、破砕、温度処理、酵素処理、遠心分離、超臨界抽出法、高圧処理および／または減圧処理、クロマトグラフィー、蒸留、融解、あるいはＰＨＡ物質の分離を容易にするための試薬を用いた処理を含む）を用いて植物バイオマスから取り出され得る。
【００３６】
当該分野で利用可能なプレプロセシング物質から油を抽出する方法、例えば、油エキスペラー（ｅｘｐｅｌｌｅｒ）加圧（ここで、油は、油を含有する物質から機械的に圧搾される）、および前加圧溶媒抽出（ここで、油の一部は、エキスペラーにより取り出され、そして残余物は、炭化水素（例えば、ヘキサン）のような有機溶媒を用いる抽出により取り出される）もまた使用され得る。さらに、二酸化炭素およびプロパンを含む超臨界気体が使用され得る。他の方法として、直接溶媒抽出（ここで、油は、馴化（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ）種子から有機溶媒を用いて直接取り出され；プロパン精製により脂肪は分離され；そして脂肪または油の水による加水分解を含む脂肪分解により、グリセロールおよび脂肪酸が生成される）が挙げられる。「ＯｉｌＣｒｏｐｓｏｆ ｔｈｅ Ｗｏｒｌｄ」、Ｇ．Ｒｏｂｂｌｅｎら編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９８９；「ＬｉｑｕｉｄＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ」、Ｒ．Ｔｒｅｙｂａｌ編、ＭｃＧｒａｗ−ＨｉｌｌＢｏｏｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９５１；および「Ｗｏｒｌｄ Ｏｉｌｓｅｅｄｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ」、Ｄ．Ｋ．Ｓａｌｕｎｋｈｅら編、ＶａｎＮｏｓｔｒａｎｄ Ｒｅｉｎｈｏｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２。
【００３７】
（植物バイオマスからの油の抽出）
植物バイオマスからＰＨＡを単離するための１つの好ましい方法は、図３のフローチャートにおいて例示される。この処理において、ＰＨＡを含有する植物バイオマスは、最初に必要に応じて上記に記載したようにプレプロセシングされる。次いで、プレプロセシングされたかまたはプロセシングされていないＰＨＡを含有する植物バイオマスは、油が溶解しかつＰＨＡおよび粉が高度に溶解しない溶媒に抽出されて、ＰＨＡを含有する植物バイオマスから大部分のまたは全ての油が取り出される。この溶媒は、油が良好に抽出され、そしてＰＨＡおよび植物粉が低い溶解度により乏しく（ｐｏｏｒ）抽出されるように選択される。ＰＨＡ−油−粉の混合物の抽出により、図３のフローチャートにおいて例示されるように、ＰＨＡを本質的に含まない油画分（例えば、約１０重量％未満のＰＨＡを含む）、および油を本質的に含まないＰＨＡ−粉混合物（例えば、約１０重量％未満の油を含む）が得られる。次いで、ＰＨＡ−粉混合物は、ＰＨＡが溶解する第２の溶媒で抽出されて、精製されたＰＨＡ物質が得られる。あるいは、図３に例示されるように、ＰＨＡ−粉混合物は化学的または酵素的に処理され、次いでＰＨＡ誘導体が粉から単離されて得られる。
【００３８】
植物バイオマスから油を抽出するために使用される第１の溶媒は、油を可溶化するその能力に基づいて選択される。好ましくは、油が溶解しかつＰＨＡおよび植物物質が高度に溶解しない溶媒が使用される。適切な溶媒として、炭化水素（例えば、プロパン、ブタン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、およびデカン）が挙げられる。本明細書中で使用する用語「溶媒」は、複数の溶媒および溶媒混合物（例えば、炭化水素の混合物）を含む。好ましくは、ＰＨＡが１％未満、最も好ましくは０．１％未満まで溶解し、かつ油が１０％（ｗ／ｖ、室温）を超えて溶解する、第１の溶媒が選択される。
【００３９】
バイオマスからＰＨＡおよび油成分を単離するために、バイオマスのＰＨＡおよび油成分に特徴的な物理的性質および溶解度の差を利用する抽出で使用される溶媒が選択される。単離工程は、特定のＰＨＡ、植物宿主、またはＰＨＡ／植物宿主の組合せに依存して調製される。例えば、ＰＨＢおよびＬＳＣＰＨＡの抽出において、異なる溶媒または溶媒の組合せは、それらの溶解度に基づくＰＨＡを含有するトランスジェニック植物バイオマスからのそれらの抽出で使用される。
【００４０】
ＰＨＡが、第２の溶媒を用いた処理によりＰＨＡ−粉産物から分離される実施態様において、第２の溶媒（図３における溶媒２）は、ＰＨＡが良好に抽出され、そして粉がより乏しく抽出されるその能力に基づいて選択される。使用され得る溶媒として、塩素化された（ｃｈｌｏｒｏｎａｔｅｄ）有機溶媒（例えば、クロロホルム、塩化メチレン、ジクロロエタン、トリクロロエタン、テトラクロロエタン、およびジクロロアセテート）を含む複数の溶媒または溶媒混合物が挙げられる。例えば、炭化水素安定化クロロホルムが使用され得る。使用され得る微生物供給源からＰＨＡを抽出するために使用されている他の溶媒として、アルキルカーボネート（例えば、プロピレンカーボネートおよびエチレンカーボネート）、トリフルオロエタノール、無水酢酸、ジメチルホルムアミド、エチルアセトアセテート、トリオレイン、トルエン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ピリジン、３を超える炭素原子を有するヒドロキシ酸およびアルコール、ならびにその混合物が挙げられる。Ｌａｆｆｅｒｔｙら、「ＭｉｃｒｏｂｉａｌＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆ Ｐｏｌｙ−β−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｉｃ Ａｃｉｄ」、Ｈ．Ｊ．ＲｅｈｍおよびＧ．Ｒｅｅｄ編、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，６６巻、１９８８、１３５−１７６頁。好ましい実施態様において、第２の溶媒は、塩素化された有機溶媒またはアルキルカーボネートである。さらに好ましい実施態様において、第１および第２の溶媒は、室温と４００℃との間、より好ましくは３０℃と２５０℃との間の沸点を有する。
【００４１】
溶媒抽出工程はまた、超臨界抽出法（この方法では、エチレン、プロピレン、酸化プロピレン、ブタン、または二酸化炭素のような気体が用いられる）を用いて行われ得る。好ましい実施態様において、気体は、−２５０℃と室温との間、好ましくは−１５０と−２０℃との間の沸点を有する。ＰＨＡは、溶解した状態でも抽出され得る。
【００４２】
図３のフローチャートに例示される別の実施態様において、ＰＨＡ−粉混合物を、化学的または生化学的薬剤（例えば、酵素）を用いて処理して、以下に詳細に記載するようにＰＨＡをＰＨＡ誘導体に化学的に変える。次いで、ＰＨＡ誘導体は、必要に応じて、その後の１つ以上の物理的な分離工程（例えば、蒸留、抽出、遠心分離、濾過、またはクロマトグラフィー）を用いて、植物バイオマスから分離される。
【００４３】
（ＰＨＡおよび油の抽出）
図４のフローチャートに示される別の実施態様において、ＰＨＡを含有する植物バイオマスは、必要に応じて最初に上記のようにプレプロセシングされる。次いで、プレプロセシングされたまたはプロセシングされていないＰＨＡを含有する植物バイオマスは、油およびＰＨＡが溶解し、かつ粉が低い溶解度を有する溶媒中に溶媒抽出されて、油およびＰＨＡが植物粉から本質的に取り出される。その結果、例えば、約１０重量％未満の油およびＰＨＡは植物粉に残存する。このプロセスに使用される溶媒は、ＰＨＡおよび油に対する良好な抽出剤であり、そして粉に対する乏しい抽出剤であるように選択される。次いで、ＰＨＡ−油産物中のＰＨＡ物質は、物理的分離工程（例えば、蒸留）により、またはＰＨＡと油との間における溶解度差のさらなる利用により、油からさらに分離される。
【００４４】
あるいは、以下に記載のように（図４に示されるように）、ＰＨＡ−油産物は、化学的または生物学的処理により改変されて、ＰＨＡ誘導体（単数または複数）−油産物が提供され得る。後者のＰＨＡ誘導体成分は、物理的プロセッシング（蒸留、溶媒抽出、洗浄、沈澱、超臨界抽出法、濾過、およびクロマトグラフィーを含む）により続いて精製され得る。
【００４５】
植物バイオマスから油−ＰＨＡ成分を抽出するために使用され得る溶媒として、塩素化有機溶媒（例えば、クロロホルム、塩化メチレン、ジクロロエタン、トリクロロエタン、テトラクロロエタン、およびジクロロアセテート）、アルキルカーボネート（例えば、プロピレンカーボネートおよびエチレンカーボネート）、トリフルオロエタノール、無水酢酸、ジメチルホルムアミド、エチルアセトアセテート、トリオレイン、酢酸、トルエン、アルコール、ヒドロキシ酸、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、および／またはピリジンが挙げられる。溶媒はまた、炭化水素（例えば、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、またはデカン、あるいはそれらの混合物）からなり得るか、またはこれらを含み得る。好ましい溶媒は、室温と４００℃との間、好ましくは３０℃と２５０℃との間の沸点を有する溶媒である。好ましくは、このような溶媒は、少なくとも５％（ｗ／ｖ、室温）のＰＨＡおよび油成分の両方に対する溶解度を有し、そして図１で定義されたＰＨＡの構造に依存して選択される。ＰＨＡ物質はまた、融解した状態で抽出され得る。溶媒の選択は、バイオマスが得られる植物、ならびに分離されるＰＨＡ、誘導体、油の溶解度特性の選択に依存する。
【００４６】
図４のフローチャートに例示されるように、抽出されたＰＨＡ−油はまた、以下に詳細に記載されるような、化学的または生物学的薬剤（例えば、ＰＨＡ物質を分解する酵素）を用いた処理によりＰＨＡ誘導体−油生成物を形成するための化学的改変により分離され得る。次いで、ＰＨＡ誘導体は、例えば、物理的プロセス（例えば、蒸留、抽出、遠心分離、超臨界抽出法、分取濾過（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、および／またはクロマトグラフィー）を用いて、ＰＨＡ誘導体−油混合物から分離される。
【００４７】
本質的に油を含まないＰＨＡのさらなる精製は、当業者に公知の標準的な手順により行われ得る。
【００４８】
（ＩＩＩ．ＰＨＡ誘導体の合成）
上記のように、プロセシングの間、バイオマス中のＰＨＡ物質は、物質のそれらの単離の前に、物質の単離を容易にするためかまたは所望の誘導体生成物を生成するために、物理的、化学的、または酵素的な誘導体への変換により誘導体化され得る。形成され得るＰＨＡ誘導体として、当該分野で利用可能な方法を用いて形成され得る、酸、エステル、オリゴマー、環状オリゴマー、ラクトン、マクロライド、アミド、アミン、チオエステル、ジオール、および不飽和化合物が挙げられる。Ｇｒｉｅｓｂｅｃｋ，Ａ．およびＳｅｅｂａｃｈ，Ｄ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，７０：１３２０−１３２５ （１９８７）；Ｐｌａｔｔｎｅｒ，Ｄ．Ａ．， Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ， ７６：２００４−２０３３ （１９９３）；Ｓｅｅｂａｃｈ，Ｄ．ら、「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ−Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ３−ＨｙｄｒｏｘｙｃａｒｂｏｘｙｌｉｃＡｃｉｄｓ ａｎｄＴｈｅｉｒ Ｕｓｅ ｉｎ ＥＰＣ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｗ．ＢａｒｔｍａｎｎおよびＫ．Ｂ．Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ編、「ＳｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆＯｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ」ＶＣＨ， Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，１９８７，８５−１２６頁、およびＳｅｅｂａｃｈ，Ｄ．ら、Ｃｈｉｍｉａ，４４：１１２−１１６ （１９９０）；Ｏｒｇ．Ｓｙｎｔｈ．，７１：３９−４７（１９９２）；Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇ．，４３４−４３５（１９９２）；およびＨｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，７７：１０９９−１１２３（１９９４）。ＰＨＡポリマーを形成するために使用され得るエステルを誘導体化するためのさらなる方法は、当業者に公知である。
【００４９】
バイオマスのプロセシングにおいてＰＨＡ物質を改変するために使用され得る化学的薬剤として、例えば、酸、塩基、界面活性剤、キレーター、酸化剤または還元剤、求核剤または求電子剤、金属イオン、水溶液または有機溶液、ならびにフリーラジカルが挙げられる。使用され得る他の化学的薬剤として、過酸化水素、次亜塩素酸塩、オゾン、およびアルキル過酸化物が挙げられる。化学的変換は、例えば、エステル化、エステル交換、加水分解、けん化、アミノリシス、チオリシス、エーテル化、シリル化、付加、脱離、再配列、または縮合ような化学反応であり得る。例えば、植物バイオマス中のＰＨＡ開始物質の分子量より少ない分子量を有する誘導体を生成するために化学的薬剤が使用され得る。さらに、ＰＨＡ物質は、物理的処理（例えば、加熱、冷却、または撹拌）により改変され得る。
【００５０】
ＰＨＡ物質はまた、例えば、バイオマスまたはＰＨＡ物質を分解する生物学的薬剤（例えば、酵素）を用いたバイオマス物質（ＰＨＡ−粉またはＰＨＡ−油の混合物）の処理により、プロセシングの間化学的に改変され得る。使用され得る酵素として、ＰＨＡデポリメラーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、リパーゼ、ヒドラターゼ、ホスホリラーゼ、セルラーゼ、および／またはグリコシダーゼが挙げられる。ＰＨＡポリマーは、オリゴマー、モノマー、ダイマー、トリマー、または他の誘導体に変換され得る。ＰＨＡ官能性はまた、非ＰＨＡ化学官能性に変換されることもある。
【００５１】
（ＩＶ．適用）
本明細書中に記載されるように単離されたＰＨＡは、広範な種々の異なる適用に使用され得る。１つの実施態様において、単離されたＰＨＡは、ラテックスを形成するために使用され得る。ＰＣＴＷＯ９１／１３２０７は、ラテックス（すなわち、非結晶性の、無定型の粒子の水性懸濁液）の形態のβ−ヒドロキシブチレートおよびβ−ヒドロキシバレレートのポリマーまたはコポリマーの使用を開示する。ラテックスは、例えば、生分解性かつ再生利用可能なフィルムまたは被覆紙を形成するために使用され得る。ＰＣＴＷＯ９６／０３４６８は、構築的な被覆におけるＰＨＡラテックスの使用を記載する。精製された結晶性ＰＨＡからＰＨＡラテックスを形成するための方法は、ＰＣＴＷＯ９４／０７９４０に記載されている。この方法において、有機溶媒中のＰＨＡの精製された溶液（これは、本明細書中に記載されるように得られ得る）は、界面活性剤を含む水溶液にエマルジョン化され、無定型ラテックスが形成される。従って、本明細書中に開示される方法は、種々の産業上の適用および生物医学的適用（例えば、ＰＨＡラテックス物質の形成）に使用され得る精製されたＰＨＡを提供した。
【００５２】
本発明は、以下の非限定的な実施例からさらに理解される。
【実施例】
【００５３】
（実施例１：植物バイオマスからのポリヒドロキシブチレートの抽出）
図３に例示されるプロセスを用いて、ヘキサン（溶媒１）を用いた抽出により、植物バイオマスからポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）を単離して、油を取り出し、続いて炭化水素安定化クロロホルム（溶媒２）を用いた抽出によりＰＨＢを単離した。
【００５４】
約４０重量％の油を含むナタネ（３２ｇ）のサンプルを、６ｇのＰＨＢ粉末（Ａｒｄｒｉｃｈ）と混合し、そして電気食物粉砕器を用いて粉砕した。このサンプルは、３４重量％の油および１６重量％のＰＨＢを含有するトランスジェニック油料種子の代表例である。混合物を、６時間ｓｏｘｈｌｅｔ装置中で、３００ｍＬのヘキサン（溶媒１）を用いて連続的に抽出し、その後サンプルを冷却して有機溶媒相と固形粉とを得た。有機溶媒を濃縮して黄色の油（１１．８ｇ、混合物の３１重量％）を得た。ＮＭＲ分析は、この油がＰＨＢを含まないことを示した。この結果は、ＰＨＢを含まない油を、ＰＨＡ含有植物バイオマスから９０％より大きな収率で容易に回収し得ることを示した。次いで、固形粉（７．７ｇ）の一部を、２２時間ｓｏｘｈｌｅｔ装置中で、１２０ｍＬの炭化水素安定化クロロホルム（溶媒２）を用いてさらに抽出した。クロロホルム溶液の蒸発により、１．１５ｇの重さの黄色／白色のプラスチックフィルムが形成した。粗ＰＨＢフィルム（２２７ｍｇ）の一部を、３回、ヘキサンの１ｍＬ部分で洗浄した。風乾後、ＰＨＢフィルム（８６ｍｇ）は、オフホワイトの色であった。このフィルムのＮＭＲ分析は、本質的に純粋なＰＨＢであることを示した。ＰＨＢフィルムの回収は、混合物中の元のＰＨＢ含有量に基づいて２４％の収量を示す。
【００５５】
（実施例２：植物バイオマスからのＰＨＢ誘導体の抽出）
図３に例示されるプロセスを用いて、ヘキサン（溶媒１）を用いた植物バイオマスの抽出により、植物バイオマスからポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）を単離して、油画分を取り出し、続いて化学的処理、次いで誘導体形態のＰＨＢの物理的分離を行った。
【００５６】
実施例１からのＰＨＢ含有残存粉（２．３２ｇ）の一部を、１５．５時間、ｎ−ブタノール（２５ｍＬ）および濃硫酸（０．３３ｍＬ）と共に加熱還流した。得られた黒色の混合物に、飽和炭酸水素ナトリウム（２０ｍＬ）、ブライン（２０ｍＬ）、および酢酸エチル（５０ｍＬ）を添加した。この混合物を分離漏斗中で振盪し、そして相分離させた。有機相を、セライトのパッドに通して濾過し、ブラインで洗浄し、少量の活性炭で処理し、濾過し、そして暗色の油まで濃縮した。この物質を、減圧下で蒸留した。４９〜５３℃および０．２５ｔｏｒｒで蒸留する画分を回収して、わずかに黄色い液体（０．４７ｇ）を得た。この物質のＮＭＲ分析により、これがブチル３−ヒドロキシブチレートであることを確認した。回収された物質の量は、残存粉に含まれるＰＨＢの量に基づいて誘導体化ＰＨＢの４６％収率を示す。
【００５７】
（実施例３：ナタネからのＰＨＡの抽出）
ＰＨＡを、以下のような図４のプロセスを用いて、ナタネからポリマー形態で抽出した。約４０重量％の油を含むナタネのサンプル（２０ｇ）を、約９４％の３−ヒドロキシオクタン酸および約６％の３−ヒドロキシヘキサン酸を含むコポリマーであるＰＨＯの小片（５．４３ｇ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａから単離された）と混合し、電気食物粉砕器で粉砕した。このサンプルは、３１重量％の油および２１重量％のＰＨＯを含むトランスジェニック油料種子の代表例である。混合物を、１２時間ｓｏｘｈｌｅｔ装置中で、３００ｍＬのヘキサン（溶媒１）を用いて連続的に抽出した。サンプルを、冷却し、そして濾過して、有機溶媒相および固形粉（風乾後１１．０２ｇ）を得た。溶媒相を濃縮して、黄色の非常に粘性のゲル様物質（１２．９２ｇ、混合物の５１重量％）を得た。静置すると、この物質は、黄色のプラスチック様固体になった。ＮＭＲ分析により、この物質はＰＨＯおよびナタネ油を含むことが示された。これらの結果により、ＰＨＯ油混合物を、ＰＨＡ含有植物バイオマスから９０％を超える収率で容易に回収し得ることが示された。得られたＰＨＡ／油混合物は、さらなる精製に適切であった。
【００５８】
さらなる精製を以下のように行った。黄色のプラスチック様物質の一部（０．１３６ｇ、約４１重量％のＰＨＯ、１．１×０．２ｃｍ）を、２ｍｌのｎ−プロパノールで洗浄した。室温で３日間ゆっくりと回旋した後、上清を取り除き、そして残存固体を、２ｍｌのメタノールで一晩洗浄した。メタノール洗浄液を、プロパノール洗浄液と混合し、そして濃縮して黄色の油（０．０８７６ｇ）を得た。減圧下での乾燥後の残存固形ポリマー（０．０４８ｇ）は、半透明でありほとんど無色であった。これは、元のナタネ／ＰＨＯ混合物からＰＨＯの８４％収率を示す。精製されたポリマーのＮＭＲ分析により、これが少量のナタネ油を含むＰＨＯ（約９５％純度）であることが示された。Ｇ．Ｃ．分析により、ヘキサン抽出により最初に単離された黄色のプラスチック様物質と比較して、主要な混入物は１０倍減少したことが示された。
【００５９】
（実施例４：植物バイオマスからのＰＨＡ誘導体の単離）
実施例３に記載された、さらなる精製の前に得られた黄色のＰＨＯ含有プラスチック様物質を、化学的処理および物理的分離により誘導体形態でさらに精製した：実施例３からのヘキサン抽出により単離された部分的に精製されたＰＨＯ含有プラスチック物質の一部（２．７５ｇ、約４０重量％のＰＨＯを含む）を、加熱しながらｎ−ブタノール（５０ｍＬ）で溶解した。濃硫酸（０．７ｍＬ）を添加し、そして混合物を２０時間加熱還流した。室温まで冷却した後、飽和炭酸ナトリウム（４ｍＬ）を混合し、混合物をｐＨ紙に対して塩基性にした。反応混合物を濾過し、相を分離し、そして有機層をブライン（２×３０ｍＬ）で洗浄した。有機相を約１０ｍＬまで濃縮し、クロロホルム（５０ｍＬ）に溶解し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、真空下で濃縮して黄色の油（２．７５ｇ）を得た。この物質を減圧下で蒸留した。９３〜９７℃および０．４５ｔｏｒｒで蒸留する画分を回収して、透明な無色の液体（０．４１ｇ）を得た。回収された物質の量は、プラスチック様開始物質に含まれるＰＨＯの量に基づいて誘導体化されたＰＨＯの２５％収率を示す。この物質のＮＭＲ分析により、これは約９５％純度のブチル３−ヒドロキシオクタノエートであり、そして非常に少量の不飽和物質を含むことが示された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物油および粉（ｍｅａｌ）を含む植物バイオマスからポリヒドロキシアルカノエート（「ＰＨＡ」）を分離する方法。
【請求項１】
植物油および粉（ｍｅａｌ）を含む植物バイオマスからポリヒドロキシアルカノエート（「ＰＨＡ」）を分離する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００９−１１２３１５（Ｐ２００９−１１２３１５Ａ）
【公開日】平成２１年５月２８日（２００９．５．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−４５９６０（Ｐ２００９−４５９６０）
【出願日】平成２１年２月２７日（２００９．２．２７）
【分割の表示】特願２００８−１８０８１５（Ｐ２００８−１８０８１５）の分割
【原出願日】平成８年１０月２３日（１９９６．１０．２３）
【出願人】（３９８０５５２３３）メタボリックス，インコーポレイテッド (18)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年５月２８日（２００９．５．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月２７日（２００９．２．２７）
【分割の表示】特願２００８−１８０８１５（Ｐ２００８−１８０８１５）の分割
【原出願日】平成８年１０月２３日（１９９６．１０．２３）
【出願人】（３９８０５５２３３）メタボリックス，インコーポレイテッド (18)
【Ｆターム（参考）】
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