検出キット
【課題】検出対象物を高感度に検出するための検出キットを提供すること。
【解決手段】検出キットは、検出対象物を選択的に検出し得る検出キットであって、検出対象物と特異的に結合する結合部位１１と、反応性を有する第１の反応部位１２とを含む第１の化合物１と、第１の反応部位１２と反応する第２の反応部位２１と、標識部位２２とを含む第２の化合物２とを有し、第１の化合物１と第２の化合物２とを反応させることにより、第１の反応部位１２と第２の反応部位２１とを連結させる。
【解決手段】検出キットは、検出対象物を選択的に検出し得る検出キットであって、検出対象物と特異的に結合する結合部位１１と、反応性を有する第１の反応部位１２とを含む第１の化合物１と、第１の反応部位１２と反応する第２の反応部位２１と、標識部位２２とを含む第２の化合物２とを有し、第１の化合物１と第２の化合物２とを反応させることにより、第１の反応部位１２と第２の反応部位２１とを連結させる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検出キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来から、抗原または抗体を検出するために、種々の方法が用いられている。例えば、抗原または抗体は、抗原抗体反応を利用したＥＬＩＳＡ法を用いて検出される。
このＥＬＩＳＡ法による抗原抗体反応検出法では、２次抗体反応時に抗体に固定化された酵素による色素反応によって抗原の検出が行われている。しかし、抗原の存在量が超微量である場合、抗原の検出感度が得られないという問題を有する。
【０００３】
一方で、基板表面から光重合等によって、末端に抗体分子を有するアンカー可能なＰＥＧポリマーを成長させて、抗原検出可能な機能表面を作成している例がある（例えば、非特許文献１）。
ところが、基板に成長させたＰＥＧポリマーの密度、大きさに比較して抗体分子は大きい。そのため、基板表面に固定化できる抗体分子の数は少なくなる。その結果、抗原の検出感度が、得られないという問題を有している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Robert P. Serba et al, Langmuir 2005 21, 10907
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、検出対象物を高感度に検出するための検出キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
このような目的は、下記の本発明により達成される。
本発明の検出キットは、検出対象物を選択的に検出し得る検出キットであって、
前記検出対象物と特異的に結合する結合部位と、反応性を有する第１の反応部位とを含む第１の化合物と、
前記第１の反応部位と反応する第２の反応部位と、標識部位とを含む第２の化合物とを有し、
前記第１の化合物と前記第２の化合物とを反応させることにより、前記第１の反応部位と前記第２の反応部位とを連結させることを特徴とする。
これにより、結合部位と標識部位とを有する検出試薬が得られるので、検出対象物を高感度に検出することができる。
【０００７】
本発明の検出キットでは、前記結合部位は、抗原または抗体であることが好ましい。
これにより、抗原または抗体と特異的に結合し得る検出対象物（抗体または抗原）を高感度に検出することができる。
本発明の検出キットでは、前記第１の反応部位および前記第２の反応部位は、それぞれ重合性基で構成されていることが好ましい。
これにより、第１の反応部位および第２の反応部位の反応性が高いので、第１の反応部位と第２の反応部位とを容易に連結することができる。また、重合性基で重合反応が起こるので、第２の化合物を複数導入することができる。
【０００８】
本発明の検出キットでは、前記第１の化合物は、前記結合部位と前記第１の反応部位との間に、前記結合部位と前記第１の反応部位とを連結する第１の連結部位を有することが好ましい。
これにより、第１の連結部位は反応性の高い基を有するので、結合部位および第１の反応部位を確実に連結することができる。
本発明の検出キットでは、前記第１の連結部位は、粒子を含むものであることが好ましい。
これにより、粒子は表面積が大きいので、粒子表面側に複数の結合部位および／または第１の反応部位を結合することができる。
【０００９】
本発明の検出キットでは、前記粒子の表面に、前記結合部位および／または前記第１の反応部位が複数結合していることが好ましい。
これにより、複数の検出対象物および／または複数の第２の化合物と結合することができるので、検出対象物の検出感度を向上させることができる。
本発明の検出キットでは、前記粒子に結合する前記結合部位および前記第１の反応部位の存在比は、前記結合部位を［Ａ］、前記第１の反応部位を［Ｂ］としたとき、Ａ／Ｂが０．１〜１．０であることが好ましい。
これにより、第１の反応部位の存在割合が多いので、第２の化合物を多く結合することができる。その結果、複数の標識部位を有する検出試薬を得ることができる。
【００１０】
本発明の検出キットでは、前記標識部位は、酸化還元物質、蛍光物質および色素化合物の少なくとも１種で構成されることが好ましい。
これにより、酸化還元電流、蛍光強度または色調が変化するので、電気化学的検出または蛍光検出が可能となる。
本発明の検出キットでは、前記標識部位を複数有することが好ましい。
これにより、標識部位を複数有する検出試薬が得られるので、検出対象物の検出感度をより向上させることができる。
【００１１】
本発明の検出キットでは、前記第２の化合物は、前記第２の反応部位と前記標識部位との間に、前記第２の反応部位と前記標識部位とを連結する第２の連結部位を有することが好ましい。
これにより、第２の連結部位は、反応性の高い基を有するので、標識部位および第２の反応部位を確実に連結することができる。
本発明の検出キットでは、さらに、検出対象物を選択的に捕捉し得る捕捉物が担持された基体を有することが好ましい。
これにより、基体と第１の化合物と第２の化合物とを用いることで検出対象物を検出できるので、簡易かつ迅速に検出対象物を検出することができる。
【００１２】
本発明の検出キットでは、前記基体は、ウェルを備え、
当該ウェルの内面に前記捕捉物が担持されていることが好ましい。
これにより、ウェルと第１の化合物と第２の化合物とを用いることで検出対象物を検出できるので、より簡易かつ迅速に検出対象物を検出することができる。
本発明の検出キットでは、前記基体は、粒状に形成されていることが好ましい。
これにより、基体の表面を滑らかにすることができるので、低抵抗で試料溶液中を移動することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の検出キットの第１の化合物を模式的に示す図である。
【図２】本発明の検出キットの第１の化合物を模式的に示す図である。
【図３】本発明の検出キットの第２の化合物を模式的に示す図である。
【図４】本発明の検出キットを用いた抗原の第１の検出方法を説明するための図（縦断面）である。
【図５】本発明の検出キットを用いた抗原の第２の検出方法に用いられるバイオセンサーの斜視図である。
【図６】図５に示すバイオセンサーを模式的に示す平面図である
【図７】図６に示すＡ−Ａ線断面図の部分拡大図である。
【図８】本発明の検出キットを用いた抗原の第２の検出方法を説明するための図（縦断面図）である。
【図９】本発明の検出キットを用いた抗原の第３の検出方法に用いられるバイオセンサーを模式的に示す平面図である。
【図１０】図９に示すＢ−Ｂ線断面図の部分拡大図である。
【図１１】本発明の検出キットを用いた抗原の第４の検出方法を説明するための図（縦断面図）である。
【図１２】本発明の検出キットを用いた抗原の第５の検出方法に用いられるウェルを模式的に示す断面斜視図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の検出キットについて、詳細に説明する。
＜検出キット＞
本実施形態の検出キットは、検出対象物と特異的に結合する結合部位を有する第１の化合物と、検出対象物の検出感度を上げる標識部位を有する第２の化合物とを含むものである。
【００１５】
まず、本発明の検出キットの第１の化合物および第２の化合物について説明する。
図１、２は、第１の化合物を模式的に示す図、図３は、第２の化合物を模式的に示す図である。
図１に示す第１の化合物１は、結合部位１１と、反応性を有する第１の反応部位１２と、結合部位１１と第１の反応部位１２とを連結する第１の連結部位１３とを有している。
【００１６】
結合部位１１は、検出対象物を特異的に認識し得るものであれば特に限定されず、例えば、抗体、抗原、微生物、酵素、糖類、タンパク質などが挙げられる。これらのうち、本実施形態では、結合部位１１は、抗原または抗体であることが好ましい。
このような抗体の種類は、特に限定されず、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ等が挙げられる。これらの中でも、ＩｇＧが好ましい。ＩｇＧは、生産が容易であり、検出等可能な抗原の種類が増大する。
【００１７】
第１の反応部位１２は、後述する第２の化合物２の第２の反応部位２１と反応して、結合する部位である。すなわち、第１の反応部位１２は、第１の化合物１と第２の化合物２とを連結する機能を有する。
このような第１の反応部位１２は、特に限定されないが、例えば、ビニル基、アリル基、アクリル基、メタクリル基、スチリル基などの重合性基、マレイミド基、ピリジルジスルフィド基、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド基、ＮＨＳ基などが挙げられる。これらのうち、重合性基であることが好ましく、ビニル基であることがより好ましい。重合性基、特にビニル基は、反応性に富む基であるので、第１の反応部位１２と第２の反応部位２１とを効率よく反応させることができる。
【００１８】
第１の連結部位１３は、結合部位１１と第１の反応部位１２とを連結し得る結合基（官能基）を有している。このような結合基としては、例えば、アミド結合、エーテル結合、エステル結合、スルフィド結合、カルボニル結合などが挙げられる。これらは、２種以上含まれていてもよい。
例えば、結合部位１１を抗体とした場合、結合部位１１の表面にはフリーアミノ基が存在するので、結合基はアミド結合が含まれていることが好ましい。これにより、抗体と結合基とが効率良く反応するので、抗体と結合基とを確実に結合することができる。
【００１９】
また、例えば、結合部位１１をシステインを有するタンパク質とした場合、システインはＳＨ基を有するので、スルフィド結合が含まれていることが好ましい。
また、第１の連結部位１３には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖（スペーサ）が含まれていることが好ましい。これにより、結合部位１１と第一の反応部位１２とが一定距離離間するので、第１の反応部位１２と第２の反応部位２１とを効率的に反応することができる。
【００２０】
ＰＥＧ鎖は、アルキル鎖と比較すると、鎖上にエーテル結合を含むため、エーテル酸素原子の非結合対の電子の影響で金属イオンや極性官能基との相互作用を形成し易く、水分子とも会合し易い。また、エーテル酸素原子と隣接炭素原子間の双極子モーメントの影響でダイポールモーメントが比較的大きく、水和し易さにも影響与える。
このように、ＰＥＧ鎖は、一般的に水溶性になりやすい鎖構造のため、水中にて緩和伸張構造を取り易い。
【００２１】
一方、アルキル鎖は疎水性のため水中では、疎水性凝集効果によって鎖が縮まり、反応部位間との距離が保てない。
したがって、第１の連結部位１３にＰＥＧ鎖が含まれていることにより、水中において伸長構造を取り易くなるので、液体試料１５１中の検出対象物を高感度に検出することができる。
また、第１の連結部位１３は、粒子１３ａを含むことが好ましい。これにより、粒子１３ａは表面積が大きいので、粒子１３ａの表面に複数の結合部位１１、第１の反応部位１２を結合することができる。
以上のような結合部位１１、第１の反応部位１２、第１の連結部位１３を有する第１の化合物１は、例えば、以下に示す化合物（１）、化合物（２）、図２に示す構造のものが挙げられる。なお、化合物（１）および化合物（２）のいずれも、結合部位（ＰＥＧ鎖とアミド結合している部位）１１は抗体である。
【００２２】
【化１】
（式中、ｎは３〜１５を示す。）
【００２３】
【化２】
（式中、ｎは３〜１５を示す。）
【００２４】
図２に示す第１の化合物１は、結合部位１１と、第１の反応部位１２と、粒子１３ａを含む第１の連結部１３とを有している。そして、結合部位１１および第１の反応部位１２は、それぞれ硫黄原子を介して粒子１３ａに結合している。
このような粒子１３ａとしては、例えば、金、銀などの金属、これらの金属酸化物、色素、顔料、ポリスチレン、メタクリル酸などが挙げられる。このうち、金属であることが好ましく、金であることがより好ましい。
金は、硫黄原子とスルフィド結合することができるので、図２に示すように、複数の結合部位１１および第１の反応部位１２を硫黄原子を介して簡単に結合させることができる。その結果、第２の化合物２の連結により、標識部位２２が多く存在するので、検出対象物を高感度に検出することができる。
【００２５】
第１の連結部１３が粒子１３ａを含む場合、粒子１３ａ表面に結合する結合部位１１および第１の反応部位１２の存在比は、結合部位１１をＡ、第１の反応部位１２をＢとしたとき、Ａ／Ｂ＝０．１〜１．０であることが好ましく、０．３〜０．８であることがより好ましい。
これにより、結合部位１１よりも第１の反応部位１２の存在割合が大きいので、標識部位２２を有する第２の化合物２をより多く連結することができる。その結果、標識部位２２の存在割合が増大し、検出対象物をより高感度に検出することができる。
【００２６】
結合部位１１および第１の反応部位１２の存在比が前記範囲よりも小さすぎると、結合部位１１の存在割合が小さくなり、検出対象物と十分に結合しなくなるおそれがある。
一方、結合部位１１および第１の反応部位１２の存在比が前記範囲よりも大きすぎると、第１の反応部位１２の存在割合が小さくなりすぎ、第２の化合物２を連結する割合が小さくなるおそれがある。
【００２７】
図３に示す第２の化合物２は、第１の反応部位１２と反応する第２の反応部位２１と、標識部位２２と、第２の反応部位２１と標識部位２２とを連結する第２の連結部位２３とを有している。
第２の反応部位２１は、第１の化合物１の第１の反応部位１２と反応して、結合する部位である。すなわち、第２の反応部位２１は、第１の化合物１と第２の化合物２とを連結する機能を有する。
【００２８】
このような第２の反応部位２１は、特に限定されないが、例えば、ビニル基、アリル基、アクリル基、メタクリル基、スチリル基などの重合性基、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド基、ＮＨＳ基、マレイミド基、ピリジルジスルフィド基などが挙げられる。これらのうち、重合性基であることが好ましく、ビニル基であることがより好ましい。重合性基、特にビニル基は、反応性に富む基であるので、第２の反応部位２１を第１の反応部位１２と効率よく反応することができる。
【００２９】
標識部位２２は、検出対象物の検出感度を向上させる機能を有する。
この標識部位２２としては、例えば、蛍光物質、酸化還元物質または色素化合物などが挙げられる。これらは２種以上組み合せて用いることもできる。標識部位２２を複数用いることにより、検出対象物を高感度に検出することができる。
標識部位２２に蛍光物質を用いた場合、検出対象物を含む液体試料１５１中に第１の反応部位１２と第２の反応部位２１とが連結した蛍光検出試薬５を混合することで、蛍光強度が変化するので、簡単に検出対象物の検出をすることができる。
【００３０】
標識部位２２に酸化還元物質を用いた場合、第１の反応部位１２と第２の反応部位２１とが連結した酸化還元検出試薬４を検出対象物を捕捉したセンサーに接触させることで、酸化還元反応が生じるので、酸化還元電流を計測することができる。
標識部位２２に色素化合物を用いた場合、検出対象物を含む試料の色調の変化により、検出対象物の存在を確認できるので、より簡単に検出対象物を検出することができる。
このような蛍光物質５２としては、特に限定されないが、例えば、フルオレセイン、ダンシルクロライド、フルオレスカミン、７−クロロ−４−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾ−ル（ＮＢＤ−クロライド）、オルトアミノチオフェノール、ダンシルヒドラジンなどの芳香族有機化合物などが挙げられる。
【００３１】
酸化還元物質４２としては、特に限定されないが、例えば、フェロセン（化３）、オスミウム−ビピリジル錯体（化４）、フタロシアニン、テトラゾリウム塩、テトラメチルベンジジン、ジアミノベンジジン、トリアミノトリフェニルメタン、トリンダー試薬等が挙げられる。このうち、フェロセンまたはオスミウム−ビピリジル錯体であることが好ましい。
【００３２】
【化３】
【００３３】
【化４】
【００３４】
フェロセンは、酸化還元活性に優れるので、検出対象物の検出を行った場合、酸化還元電流をより効率よく検出することができる。
オスミウム−ビピリジル錯体は、水溶性であるためポリマーとの親和性が高い。また、ポリマー鎖も水和構造の中で伸張し、反応が進行しやすい。そのため、検出対象物の検出を行った場合、酸化還元電流をより効率よく検出することができる。
色素化合物としては、特に限定されないが、例えば、ポルフィリン、クロロフィル、ニュートラルレッド、メチレンブルー、フェノールフタレイン、インドシアニングリーン、シアニン色素、アゾ色素、フラボノイド、カロチノイドなどが挙げられる。
【００３５】
第２の連結部位２３は、第２の反応部位２１と標識部位２２とを連結し得る結合基（官能基）を有している。このような結合基としては、例えば、アミド結合、エーテル結合、エステル結合、スルフィド結合、カルボニル結合などが挙げられる。これらは、２種以上含まれていてもよい。
例えば、標識部位２２をフェロセンとした場合、結合基はエステル結合が含まれていることが好ましい。これにより、フェロセンと結合基とが効率良く反応するので、フェロセンと結合基とを確実に結合することができる。
【００３６】
また、第２の連結部位２３には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖（スペーサ）が含まれていることが好ましい。これにより、第２の反応部位２１と標識部位２２とが一定距離離間するので、検出対象物を検出する場合、当該検出対象物を効率よく検出することができる。また、第１の連結部位１３で説明したように、水中において伸長構造を取り易くなるので、液体試料１５１中の検出対象物を高感度に検出することができる。
以上のような第２の反応部位２１、標識部位２２、第２の連結部位２３を有する第２の化合物２は、例えば、以下に示す化合物（５）〜（７）などが挙げられる。
【００３７】
【化５】
（式中、ｎは３〜１５を示す。）
【００３８】
【化６】
（式中、ｎは３〜１５を示す。）
【００３９】
【化７】
（式中、ｎは３〜１５を示す。）
【００４０】
以上の第１の化合物１と第２の化合物２とを含むことにより、検出キットが得られる。
この検出キットには、検出対象物の検出に必要なもの、例えば、検出対象物を選択的に捕捉し得る捕捉物８が担持された基体１９０が含まれていてもよい。
このような基体１９０としては、例えば、バイオセンサーに用いる作用電極１２１、基板１２０、担体１２４などが挙げられる。これにより、検出対象物を一旦基体１９０の捕捉物８に捕捉した後、第１の化合物１および第２の化合物２を用いて、検出対象物の高感度検出をすることができる。
【００４１】
なお、基体１９０の形状は特に限定されないが、担体１２４を用いる場合は、球状（粒状）であることが好ましい。これにより、表面が滑らかになるので、液体試料１５１中を小さい抵抗で沈降、浮遊することができる。
その他、本発明の検出キットは、スパチュラ、反応容器、スポイトなどを含んでいてもよい。これにより、測定場所を問わず、より迅速に検出対象物の検出を行うことができる。
また、本発明の検出キットは、持ち運びを容易にするために、第１の化合物１や第２の化合物２などを容器に収容して提供することができる。
このような検出キットに含まれる第１の化合物１および第２の化合物２は、それぞれ、次のようにして製造することができる。
【００４２】
以下、第１の化合物１の製造方法および第２の化合物２の製造方法について、それぞれ２つの方法を例に挙げて詳細に説明する。なお、以下の説明では、結合部位１１に抗体を用いた場合を代表して説明する。
【００４３】
＜第１の化合物の製造方法＞
［１］第１の製造方法
まず、結合部位１１である抗体と、ＰＥＧの一端にエステル基を介してコハク酸イミドを、他端にエステル基を介して第１の反応部位１２を有する下記化合物（８）を用意する。
【００４４】
【化８】
（式中、ｎは３〜１５を示す。）
【００４５】
次に、下記反応式に示すように、抗体と化合物（８）とを反応させる。
【００４６】
【化９】
（式中、ｎは３〜１５を示す。）
【００４７】
反応に用いる化合物（８）の量は、抗体１μｇに対して、２〜１００倍量であることが好ましく、５〜５０倍量であることがより好ましい。
抗体の表面には、アミノ酸の１種であるリシン由来のフリーアミノ基が存在する。そのため、当該アミノ基と化合物（８）とで反応が進行する。したがって、化合物（８）が前記したような量であることにより、化合物（８）が過剰に存在するので、抗体のアミノ基と過不足なく反応することができる。
【００４８】
反応時間は、０．５〜１０時間であることが好ましく、１〜５時間であることがより好ましい。
反応温度は、０〜６０℃であることが好ましく、２０〜４０℃であることがより好ましい。
反応のｐＨは、６〜８であることが好ましく、６．５〜７．５であることがより好ましい。
以上のような反応条件を好ましい条件に設定することにより、抗体と化合物（８）との反応が効率よく進行するので、収率よく第１の化合物１（化合物（９））を得ることができる。
【００４９】
［２］第２の製造方法
次に、第１の連結部１３に金微粒子を含む場合の第１の化合物１の第２の製造方法について説明する。
［Ａ１］ まず、金微粒子とアミノエタンチオールを用意する。
この金微粒子の外径は、０．０１〜１０μｍであることが好ましく、０．０５〜１μｍであることがより好ましい。
また、金微粒子の表面積は、１×１０−１５〜１×１０−１１ｍ２であることが好ましく、５×１０−１５〜８×１０−１３ｍ２であることがより好ましい。
【００５０】
金微粒子の外径、表面積がこのような範囲であることにより、金微粒子の表面に複数の化合物を結合することができる。
アミノエタンチオールの使用量は、０．１〜１ｍｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、０．５〜０．８ｍｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。アミノエタンチオールの使用量がこのような範囲であることにより、アミノエタンチオールの量が金微粒子の量よりも多いので、金微粒子の表面に複数のアミノエタンチオールを結合することができる。
【００５１】
［Ａ２］ 用意した金微粒子とアミノエタンチオールとを以下の反応式に示すように、混合し、反応させる。
【００５２】
【化１０】
【００５３】
このときの反応条件は、反応溶媒中、２５℃で１時間攪拌をしながら反応を行うことが好ましい。
反応溶媒は、特に限定されないが、ジクロロエタン、アセトニトリル、塩化メチレン、メタノールなどの各種溶媒が挙げられる。
これにより、金に硫黄原子を介してアミノエタンが結合した化合物（１０）を得た。
【００５４】
［Ａ３］ 得られた化合物（１０）を下記の反応式に示すように化合物（１１）と混合し、反応させる。
【００５５】
【化１１】
（式中、ｎは３〜１５を示す。）
【００５６】
化合物（１１）の使用量は、化合物（１０）に対して１〜１００当量であることが好ましく、５〜５０当量であることがより好ましい。化合物（１１）の使用量がこのような範囲であることにより、金微粒子に対して化合物（１１）の量が多いので、金微粒子の表面に硫黄原子を介して複数の化合物（１１）を結合することができる。
このときの反応条件は、反応溶媒中、２５℃で１時間攪拌をしながら反応を行うことが好ましい。
反応溶媒は前記［Ａ２］で挙げたものと同様である。
これにより、金微粒子に硫黄原子を介してアミノ基と第１の反応部位１２とが結合した化合物（１２）を得た。
【００５７】
［Ａ４］ 次に、下記の反応式で示すように、［Ａ３］で得られた化合物（１２）とコハク酸イミドを両末端に有する化合物（１３）とを混合し、反応させる。
【００５８】
【化１２】
（式中、ｎは３〜１５を示す。）
【００５９】
化合物（１３）の使用量は、化合物（１２）に対して１〜１０当量であることが好ましく、１．５〜５当量であることがより好ましい。
このときの反応条件は、反応溶媒中、２５℃で１時間攪拌をしながら反応を行うことが好ましい。
反応溶媒は前記［Ａ２］で挙げたものと同様である。
これにより、アミノ基とコハク酸イミド基が反応した化合物（１４）を得た。
【００６０】
［Ａ５］ 最後に、下記反応式に示すように、［Ａ４］で得られた化合物（１４）と抗体とを混合し、反応させる。
【００６１】
【化１３】
（式中、ｎは３〜１５を示す。）
【００６２】
化合物（１４）の使用量は、抗体１μｇに対して、２〜１００倍量であることが好ましく、５〜５０倍量であることがより好ましい。前述したように、抗体表面のアミノ基と化合物（１４）のコハク酸イミド基が反応する。そのため、化合物（１４）が前記したような量であることにより、過剰に化合物（１４）が存在するので、抗体のアミノ基と過不足なく反応することができる。
このときの反応条件は、反応溶媒中、２５℃で１時間攪拌をしながら反応を行うことが好ましい。
反応溶媒は前記［Ａ２］で挙げたものと同様である。
これにより、第１の連結部１３に粒状の金微粒子を有する第１の化合物１（化合物（１５））を得た。
【００６３】
なお、金微粒子の表面にアミノエタンチオールおよび／または化合物（１１）を複数結合することにより、図２に示すように、金微粒子の表面に硫黄原子を介して結合部位１１および／または第１の反応部位１２を複数結合することができる。換言すると、金微粒子の表面から放射状に結合部位１１および／または第１の反応部位１２を複数形成することができる。
これにより、複数の検出対象物と複数の結合部位１１とが、複数の第２の反応部位２１と複数の第１の反応部位とが反応するので、検出対象物の検出感度をより一層向上することができる。
【００６４】
＜第２の化合物の製造方法＞
［１］第１の製造方法
まず、下記に示す標識化合物（１６）と、下記に示すＰＥＧの一端に第２の反応部位２１と、他端に水酸基とを有する化合物（１７）とを用意する。
【００６５】
【化１４】
【００６６】
【化１５】
（式中、ｎは３〜１５を示す。）
【００６７】
次に、下記反応式に示すように、触媒存在下、化合物（１６）と化合物（１７）とを反応させる。
【００６８】
【化１６】
（式中、ｎは３〜１５を示す。）
【００６９】
反応に用いる化合物（１６）の量は、化合物（１７）に対して１〜１０当量であることが好ましく、１．５〜５当量であることがより好ましい。
反応時間は、０．５〜１０時間であることが好ましく、１〜５時間であることがより好ましい。
反応温度は、０〜６０℃であることが好ましく、２０〜４０℃であることがより好ましい。
以上のような反応条件を好ましい条件に設定することにより、化合物（１６）と化合物（１７）との反応が過不足なく進行するので、収率よく第２の化合物２（化合物（１８））を得ることができる。
【００７０】
［２］第２の製造方法
次に、第２の化合物２の第２の製造方法について説明する。
まず、一端に第２の反応部位２１を有する化合物（１９）と、一端に標識部位２２を有する化合物（２０）とを用意する。
【００７１】
【化１７】
（式中、ｎは３〜１５を示す。）
【００７２】
【化１８】
（式中、ｎは３〜１５を示す。）
【００７３】
次に、下記反応式に示すように、触媒存在下、化合物（１９）と化合物（２０）とをラジカル重合させる。
【００７４】
【化１９】
（式中、ｎは３〜１５を示す。）
【００７５】
反応に用いる化合物（１９）の量は、化合物（２０）に対して１〜１０当量であることが好ましく、１．５〜５当量であることがより好ましい。
ラジカル重合反応時間は、０．５〜１０時間であることが好ましく、１〜５時間であることがより好ましい。
ラジカル重合反応温度は、５０〜３００℃であることが好ましく、１００〜２５０℃であることがより好ましい。
反応圧力は、常圧程度であることが好ましい。
触媒としては、例えば、過酸化ベンゾイルなどのラジカル触媒などが挙げられる。そして、触媒の量は、０．１〜５ｍｍｏｌであることが好ましく、０．５〜１ｍｍｏｌであることがより好ましい。
【００７６】
以上のような反応条件を好ましい条件に設定することにより、化合物（１９）と化合物（２０）との反応が過不足なく進行するので、収率よく第２の化合物２（化合物（２１））を得ることができる。
この化合物（２１）は、標識部位２２を複数有するので、第１の化合物１との結合により、検出対象物をより高感度に検出することができる。
以上のような製造方法により、第１の化合物１と第２の化合物２とが得られ、これらを含む検出キットが得られる。
【００７７】
＜検出キットの使用方法＞
このようにして得られた第１の化合物１および第２の化合物２を含む検出キットは、例えば、次のようにして使用することができる。
以下、検出キットの使用方法（検出対象物の検出方法）について、図を用いて詳細に説明する。以下の説明では、検出対象物質に抗原３を、結合部位１１に抗体を用いた場合を代表して説明する。
【００７８】
［１］第１の検出方法
まず、本発明の検出キットを用いた検出対象物の第１の検出方法について説明する。
図４は、第１の検出方法を説明を模式的に示す縦断面図である。
なお、以下の説明では、図４中の上側を「上」、下側を「下」と言う。
第１の検出方法は、第１の化合物１と第２の化合物２とを反応させて蛍光検出試薬５を調製する工程［Ａ１］と、蛍光検出試薬５を液体試料１５１中に供給する工程［Ａ２］と、蛍光検出試薬５と抗原３との結合により生じる蛍光強度の変化を検出する工程［Ａ３］とを有する。
【００７９】
［Ａ１］検出試薬調製工程
まず、第１の化合物１と第２の化合物２とを反応して蛍光検出試薬５を調製する。なお、以下の説明では、蛍光検出試薬５の結合部位１１を抗体５１、標識部位２２を蛍光物質５２として説明する。
蛍光検出試薬５の調製は、例えば、下記反応式で示すように、第１の反応部位１２にビニル基を有する第１の化合物１（化合物（２２））と標識部位２２に蛍光物質５２を有する第２の化合物２（化合物（２３））とを、高圧水銀灯による紫外線照射により光重合反応させることにより行う。
【００８０】
【化２０】
（式中、ｎは３〜１５を示す。）
【００８１】
なお、化合物（２２）は１ｍｏｌ、化合物（２３）は５ｍｏｌ用いた。また、紫外線は、強度１６００ｍＪ／ｃｍ２、３６５ｎｍの波長の光を２５℃で１５分間照射した。これにより、蛍光検出試薬５（化合物（２４））を調製した。
なお、蛍光検出試薬５の重合度（紫外線照射時間）を制御することによって、抗体５１分子表面に第１の連結部１２を介して多数の蛍光物質５２を導入できる。
例えば、第１の連結部１２の１鎖長あたり１００個の蛍光物質５２を導入できる。仮に、１０ポリマー鎖が１抗体より成長反応を起こしたとすると、１抗体５１分子あたり１０００個の蛍光物質５２を導入できる。これにより、蛍光物質５２を大量に導入できるので、抗原の検出感度を大幅に増幅することができる。
【００８２】
また、化合物（２）と化合物（７）のフェロセンが蛍光物質５２に置換した化合物とを反応する場合は、まず、当該化合物を緩衝溶液中分散させたものを用意する。次に、該緩衝溶液中に０．１ｍｏｌ／Ｌの２−メルカプトエタノール入れ、ジスルフィドを開裂させる。そして、この溶液と化合物（２）とを混合すると、ポリマー末端のチオールと抗体５１分子表面のマレイミド分子が反応する。これにより、共有結合が形成し、抗体５１分子表面に多数の蛍光物質５２を固定化できる。
また、後述する第２の検出方法と同様に、化合物（２８）と化合物（２３）との反応により、金微粒子を含む蛍光検出試薬５を調製することもできる。
【００８３】
［Ａ２］検出試薬供給工程
図４（ａ）に示すように、検出対象物である抗原３を含む液体試料１５１を反応容器１５２に入れる。
次に、図４（ａ）に示すように、液体試料１５１（試料供給空間１５０）中に蛍光検出試薬５を供給する。これにより、抗原３と蛍光検出試薬５とが接触する。
【００８４】
抗原３と蛍光検出試薬５とが接触すると、図４（ｂ）に示すように、蛍光検出試薬５の抗体５１が抗原３と反応し、抗原３と抗体５１が結合する。
ここで、液体試料（被検体）１５１としては、例えば、血液、尿、汗、リンパ液、髄液、胆汁、唾液等の体液や、これらの体液に各種処理を施した処理済み液、お酒などの飲食品、医薬品、化粧品等が挙げられる。
なお、蛍光検出試薬５の供給濃度は、特に限定されないが、０．０１〜１ｍｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、０．０５〜０．５ｍｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。
【００８５】
［Ａ３］抗原検出工程
抗体５１が抗原３に結合すると、蛍光検出試薬５の蛍光物質５２により、抗原３の蛍光強度が増大する。すなわち、抗原３に抗体５１が結合していない状態では、抗原３の蛍光強度は、０または極めて低い値である。しかし、蛍光検出試薬５の抗体５１が抗原３に結合することにより、抗原３の蛍光強度が増大する。この蛍光強度を蛍光光度計や蛍光検出器を用いたＨＰＬＣなどで測定することにより、抗原３を検出することができる。
なお、液体試料１５１中の抗原３の濃度を測定する場合は、予め濃度既知の抗原３含有液体試料１５１を段階的に複数調製する。そして、上記検出方法により、各濃度の液体試料１５１中の抗原３を測定する。測定により得られた各液体試料１５１中の抗原３の蛍光強度を縦軸に、抗原３の濃度を横軸として検量線を作成する。
【００８６】
次に、液体試料１５１中の抗原３を前述したような方法で測定する。そして、測定により得られた蛍光強度と前記検量線とから液体試料１５１中に存在する抗原３の濃度を定量することができる。
以上のような方法により、抗原３の存在を検出することができ、抗原３の濃度を定量することもできる。
【００８７】
［２］第２の検出方法
次に、本発明の検出キットを用いた検出対象物の第２の検出方法について説明する。
図５は、バイオセンサーを測定装置に装着した状態を示す模式図（斜視図）、図６は、図５に示すバイオセンサーを模式的に示す平面図、図７は、図６に示すバイオセンサーのＡ−Ａ線断面図、図８は、図６に示すＡ−Ａ線断面図の部分拡大図である。
なお、以下の説明では、図６中の紙面手前側を「上」、紙面奥側を「下」と言う。また、図７および図８中の上側を「上」、下側を「下」と言う。
【００８８】
まず、図５のバイオセンサーについて説明する。
図５に示す測定装置（電子機器）１０１は、バイオセンサー１００と、バイオセンサー１００で得られた電流値（酸化還元電流）を解析する処理回路２００を備えた演算装置１０２と、バイオセンサー１００を装着するコネクタ１３１と、処理回路２００とコネクタ１３１とを接続する配線１３２とを有する。
バイオセンサー１００は、図６に示すように、基板１２０上に、作用電極１２１、対向電極１２２および参照電極１２３を備える検出部１１０を有している。
【００８９】
これらの各電極１２１、１２２、１２３は、それぞれ独立して、配線１３０、コネクタ１３１および配線１３２を介して、処理回路２００と電気的に接続されている。また、バイオセンサー１００は、コネクタ１３１において着脱可能となっている。
また、検出部１１０以外の基板１２０上の範囲は、図７に示すように、絶縁膜１６０で覆われている。すなわち、基板１２０上に絶縁膜１６０が設けられ、検出部１１０は、絶縁膜１６０の一部に設けられた開口部１６５から露出している。
【００９０】
このようなバイオセンサー１００は、図７に示すように、基板１２０と絶縁膜１６０とで画成される試料供給空間１５０に、液体試料１５１を供給することにより、作用電極１２１上に設けられた後述する反応層１４０と液体試料１５１とが接触する。そして、液体試料１５１中の抗原３と反応層１４０とが反応することにより、電流値が変化する。これにより、この電流値と電圧とから酸化還元電流の変化に基づいて、液体試料１５１中の抗原３の量を測定することができる。
【００９１】
基板１２０は、バイオセンサー１００を構成する各部を支持するとともに、前述した各電極１２１、１２２、１２３および配線１３０を、互いに絶縁するものである。
基板１２０の構成材料としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレンナフタレート（ＰＥＳ）、ポリイミド（ＰＩ）等の各種樹脂材料、石英ガラスのような各種ガラス材料、アルミナ、ジルコニアのような各種セラミックス材料等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００９２】
作用電極１２１の構成材料としては、例えば、金、銀、銅、白金またはこれらを含む合金のような金属材料、ＩＴＯのような金属酸化物系材料、グラファイトのような炭素系材料等が挙げられる。これらのうち、金属材料であることが好ましく、金または銀であることがより好ましい。作用電極１２１の構成材料が金または銀であることにより、後述する捕捉物８を硫黄原子を介して容易に結合できるので、より簡単にバイオセンサー１００を製造することができる。
作用電極１２１の上側には、反応層１４０が設けられている。
【００９３】
図７に示すように、反応層１４０の一部は、試料供給空間１５０に露出している。そして、試料供給空間１５０に液体試料１５１を供給することにより、液体試料１５１を反応層１４０に接触させることができる。
対向電極１２２は、作用電極１２１との間に電圧を印加する電極である。試料供給空間１５０に液体試料１５１を供給した状態で、作用電極１２１と対向電極１２２との間に、作用電極１２１側が高電位となるように電圧を印加すると、抗原３と捕捉物８との結合により、電流値の変化を確実に捉えることができる。
【００９４】
対向電極１２２の構成材料としては、前述の作用電極１２１の構成材料と同様の材料が挙げられる。
また、対向電極１２２の面積は、作用電極１２１の２倍以上であるのが好ましく、１０倍以上であるのがより好ましい。これにより、より高い精度で電流値を測定することができる。
【００９５】
参照電極１２３は、対向電極１２２との間に電圧を印加する電極である。試料供給空間１５０に液体試料１５１を供給した状態で、参照電極１２３と対向電極１２２との間に電圧を印加する。そして、これらの電極間に流れる電流値と、前述の作用電極１２１と対向電極１２２との間に流れる電流値とを比較することにより、抗原３と捕捉物８との反応により生じた電流値を、より高い精度で測定することができる。
参照電極１２３の構成材料としては、例えば、銀−塩化銀、水銀−硫酸水銀等が挙げられる。
【００９６】
また、前述の作用電極１２１、対向電極１２２、参照電極１２３、および配線１３０は、導電性材料粉末の集合体で構成されていてもよい。これにより、これらの電極１２１、１２２、１２３および配線１３０を、各種印刷法を用いて容易に形成することができる。その結果、バイオセンサー１００の製造工程を大幅に簡素化することができ、バイオセンサー１００の低コスト化を図ることができる。
【００９７】
絶縁膜１６０は、前述したように、検出部１１０付近に開口する開口部１６５を有し、この開口部１６５により試料供給空間１５０を形成している。
このような絶縁膜１６０は、絶縁性の材料で構成されている。絶縁膜１６０の種類は特に限定されず、有機材料や無機材料のいずれも用いることができる。
有機材料としては、ポリメチルメタクリレート、ポリビニルフェノール、ポリイミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセテートなどの高分子化合物が挙げられる。これらは、１種または２種以上組み合わせて用いることができる。
【００９８】
無機材料としては、酸化ケイ素、酸化アルミニウム、酸化タンタル、酸化ジルコニウム、酸化セリウム、酸化亜鉛、酸化コバルトなどの金属酸化物、窒化ケイ素、窒化アルミニウム、窒化ジルコニウム、窒化セリウム、窒化亜鉛、窒化コバルト、窒化チタン、窒化タンタルなどの金属窒化物、チタン酸バリウムストロンチウム、ジルコニウムチタン酸鉛などの金属複合酸化物が挙げられる。これらは、１種または２種以上組み合わせて用いることができる。
このような絶縁膜１６０の平均厚さは、特に限定されないが、１０〜５０００ｎｍ程度であるのが好ましく、５０〜１０００ｎｍ程度であるのがより好ましい。絶縁膜１６０の厚さを前記範囲とすることにより、各電極１２１、１２２、１２３同士および配線１３０同士を、確実に絶縁することができる。
【００９９】
反応層１４０は、作用電極１２１表面側に検出対象物を特異的に捕捉する捕捉物８が担持されている。この反応層１４０は、当該捕捉物８と検出対象物である抗原３とが結合する機能を有する。
捕捉物８は、抗原３と特異的に反応するものであれば特に限定されないが、例えば、抗体が挙げられる。この抗体は、第１の化合物１の抗体と同様の抗体とすることができる。
【０１００】
捕捉物８を作用電極１２１に担持（固定化）するためには、例えば、ＥＬＩＳＡ法を利用することができる。その際、作用電極１２１表面に、捕捉物８を直接結合させるために、架橋剤を介することが好ましい。
このような架橋剤としては、作用電極１２１の金属表面へ結合し得る官能基と、捕捉物８と結合し得る官能基とを有するものであればよい。
【０１０１】
金属表面へ結合し得る官能基としては、硫黄（Ｓ）、メルカプト基（−ＳＨ）、ジスルフィド基（−Ｓ−Ｓ−）等が挙げられる。
捕捉物８と結合し得る基としては、カルボキシル基、酸ハライド、活性エステル（フタル酸イミドエステル、コハク酸イミドエステル等）等のカルボキシル基反応性誘導体等のアミド結合形成基、エステル結合形成基、チオエステル結合形成基等が挙げられる。
【０１０２】
次に、このようなバイオセンサー１００を用いた本発明の第２の検出方法を説明する。
第２の検出方法は、第１の化合物１と第２の化合物２とを反応させて酸化還元検出試薬４を調製する工程［Ｂ１］と、試料供給空間１５０に液体試料１５１を供給する工程［Ｂ２］と、酸化還元検出試薬４を液体試料１５１中に供給する工程［Ｂ３］と、酸化還元検出試薬４と抗原３との結合により生じる酸化還元電流の変化を検出する工程［Ｂ４］とを有する。
【０１０３】
［Ｂ１］酸化還元検出試薬調製工程
まず、第１の化合物１と第２の化合物２とを反応して酸化還元検出試薬４を調製する。
なお、以下の説明では酸化還元検出試薬４の結合部位を抗体４１、標識部位２２をフェロセン（酸化還元物質）４２として説明する。
酸化還元検出試薬４の調製は、例えば、第１の化合物１（化合物（２２））と標識部位２２にフェロセン４２を有する第２の化合物２（化合物（２５））とを、第１の検出方法と同様の条件で反応させることにより行う。
【０１０４】
【化２１】
（式中、ｎは３〜１５を示す。）
【０１０５】
これにより、酸化還元検出試薬４（化合物（２６））を調製した。
なお、第１の検出方法と同様に、酸化還元検出試薬４の重合度（紫外線照射時間）を制御することによって、抗体４１分子表面に第１の連結部１２を介して多数のフェロセン４２を導入することができる。
また、第１の検出方法と同様の方法により、化合物（２）と化合物（７）とを反応させて、酸化還元検出試薬４（化合物（２７））を得ることもできる。
【０１０６】
【化２２】
（式中、ｎは３〜１５を示す。）
【０１０７】
また、例えば、下記反応式に示すように、化合物（２８）と化合物（５）とを、第１の検出方法と同様に光重合反応することにより、酸化還元検出試薬４（化合物（２９））を調製することもできる。
【０１０８】
【化２３】
（式中、ｎは３〜１５を示す。）
【０１０９】
例えば、直径約１．５μｍの金微粒子を用いた場合、その表面積は約７×１０−１２ｍ２である。そのため、約０．５ｎｍ平方に表面バインディング分子（ＰＶ）が固定化されると仮定すると、単分子膜として表面には約３×１０７個の酸化還元物質４２が固定化される。そして、さらに増幅効果高めるために、アクリル酸エステル系のモノマー末端（エステル部）にＰＶを固定化したものと、酸化還元物質４２（フェロセンまたはオスミウムービピリジル錯体等）を固定化したものとでブロックポリマーを作成する。さらに、水溶性を高めるため、カルボン酸塩としてのポリマー部位も導入する。これにより、酸化還元検出試薬４を得ることができる。
【０１１０】
［Ｂ２］液体試料供給工程
図８（ａ）に示すように、液体試料１５１を試料供給空間１５０に供給する。
試料供給空間１５０に液体試料１５１を供給すると、反応層１４０と液体試料１５１が接触する。
反応層１４０と液体試料１５１とが接触すると、図８（ｂ）に示すように、反応層１４０の表面に存在する捕捉物８が液体試料１５１中に含まれる抗原３と反応し、結合する。
【０１１１】
このとき、作用電極１２１と対向電極１２２との間に、作用電極１２１側が高電位となるように電圧を印加しておくと、捕捉物８と抗原３との結合により、電流値が変化し、その変化を処理回路２００が検出する。
しかしながら、捕捉物８と抗原３とが結合しても感度が低い場合があり、処理回路２００が電流値の変化を十分に検出することができない場合がある。このような場合、抗原３の検出感度を上げるために、本発明の酸化還元検出試薬４（検出キット）が用いられる。
【０１１２】
［Ｂ３］酸化還元検出試薬供給工程
図８（ｃ）に示すように、捕捉物８と抗原３とが結合した液体試料１５１中に、酸化還元検出試薬４を供給する。
液体試料１５１中に酸化還元検出試薬４を供給すると、捕捉物８に結合している抗原３に酸化還元検出試薬４の抗体４１が接触する。
抗原３に抗体４１が接触すると、図８（ｄ）に示すように、抗原３と抗体４１とが反応し、結合する。
なお、酸化還元検出試薬４の供給量は、蛍光検出試薬５と同様である。
【０１１３】
［Ｂ４］抗原検出工程
作用電極１２１と対向電極１２２との間に、作用電極１２１側が高電位となるように電圧を印加しておくと、抗原３と抗体４１との結合による、酸化還元物質４２の酸化還元反応により酸化還元電流値が変化する。この酸化還元電流の変化を処理回路２００が検出することにより、抗原３を検出することができる。
また、液体試料１５１中の抗原３の濃度を測定する場合は、第１の検出方法と同様の方法で行うことができる。
【０１１４】
以上のような動作により、捕捉物８に結合した抗原３に酸化還元検出試薬４が結合した場合と結合していない場合とで酸化還元電流値が大きく変化するので、液体試料１５１中の抗原３の量を高感度に検出することができる。
なお、ポリマー鎖に１０００個程度の酸化還元物質４２（フェロセン分子）が存在する場合、約３×１０１０ 個のフェロセン分子が存在する。そのため、１個あたりのフェロセン分子のモル濃度は０．５×１０−１３ｍｏｌ／Ｌとなり、高感度の電気化学測定（ＣＶ測定）を行えばナノレベルにて抗体分子１個あたりの検出が可能となる。
【０１１５】
また、上記フェロセン（酸化還元）ポリマー修飾表面に別途、フェロセン修飾されたサイズの小さい金微粒子（１０ｎｍφ）を、例えば、静電的相互作用または化学結合によって導入させると、測定電流をさらに増幅できる。
例えば、金微粒子１個あたり、同様のフェロセンポリマー導入された状態にて約１６００個のフェロセンが存在し、これが例えば、抗原３に細密固定化できたとすると、５×１０４個の金微粒子が抗原３に存在する。これら固定化された全フェロセン分子数は約８×１０１１個となり約１．２×１０−１２ｍｏｌ／Ｌにて、さらに一桁検出感度が向上する。
このように、この機能性ポリマーによる抗体反応増幅手法によれば、原理的には１分子抗体反応の結果がモニター可能であり、計測速度及び感度向上に大きな効果が期待できる。
【０１１６】
［３］第３の検出方法
次に、本発明の検出キットを用いた検出対象物の第３の検出方法について説明する。
以下、第３の検出方法について説明するが、前記第２検出方法との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。
図９は、バイオセンサーを模式的に示す平面図、図１０は、図９に示すバイオセンサーのＢ−Ｂ線断面図。
なお、以下の説明では、図１０中の上側を「上」、下側を「下」と言う。
【０１１７】
第３の検出方法に用いられるバイオセンサー１００は、非捕捉状態と捕捉状態との違いを、反応層１４０の電流値の変化に基づいて検出するのに代えて、反応層１４０の質量変化に基づいて検出するよう構成した以外は、前記第２の検出方法と同様である。
すなわち、図９および図１０に示すバイオセンサー１００は、各検出部１１０に圧電素子１８０が設けられている。
【０１１８】
圧電素子１８０は、平板状の圧電体１８１と、その両側の面にそれぞれ設けられた上電極１８２、下電極１８３とで構成されている。各電極１８２、１８３は、それぞれ独立して、配線１３０、配線１３０を介して、処理回路２００と電気的に接続されている。
また、基板１２０には、凹部１２６が設けられている。この凹部１２６に下電極１８３（および上電極１８２）が対応するように、圧電体１８１の縁部が基板１２０に固定（固着）されている。
【０１１９】
各電極１８２および１８３の構成材料としては、それぞれ、前記作用電極１２１と同様の材料を用いることができる。
圧電体１８１の材料としては、例えば、水晶、ニオブ酸リチウム、タンタル酸リチウムおよびホウ酸リチウム等の圧電材料を用いることができる。なお、これらの材料は、単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて（例えば、積層体として）用いることができる。
【０１２０】
また、絶縁膜１６０は、開口部１６５を有し、この開口部１６５から上電極１８２が露出している。
そして、上電極１８２の上面には、反応層１４０が設けられている。
絶縁膜１６０および反応層１４０は、それぞれ、前記第２の検出方法で説明した絶縁膜１６０および反応層１４０と同様の構成とすることができ、前記第２の検出方法と同様にして形成することができる。
【０１２１】
次に、このようなバイオセンサー１００を用いた本発明の第３の検出方法を説明する。
［Ｃ１］検出試薬調製工程
Ｂ１工程と同様に行う。
［Ｃ２］液体試料供給工程
Ｂ２工程と同様に行う。
【０１２２】
［Ｃ３］酸化還元検出試薬供給工程
Ｂ３工程と同様に行う。
［Ｃ４］抗原検出工程
作用電極１２１と対向電極１２２との間に、作用電極１２１側が高電位となるように電圧を印加しておくと、抗原３と抗体４１との結合により、反応層１４０の質量が変化し、圧電素子１８０から検出される振動数も変化する。この振動数の変化を処理回路２００が検出することにより、抗原３を検出することができる。
以上のような動作により、捕捉物８に結合した抗原３に酸化還元検出試薬４が結合した場合と結合していない場合とで振動周波数が大きく変化するので、液体試料１５１中の抗原３の量を簡単に高感度に検出することができる。
【０１２３】
［４］第４の検出方法
次に、本発明の検出キットを用いた検出対象物の第４の検出方法について説明する。
図１１は、第４の検出方法を模式的に説明するための縦断面図である。
なお、以下の説明では、図１１中の上側を「上」、下側を「下」と言う。
本検出方法では、捕捉物８を作用電極１２１上に担持する代わりに、捕捉物８を粒状の担体１２４に担持した捕捉物担体７を用いている。
【０１２４】
まず、検出方法の説明に先立って、捕捉物担体７について説明する。
捕捉物担体７は、液体試料１５１中の抗原３を捕捉する機能を有する。
この捕捉物担体７の担体１２４は、本実施形態においては球状（粒状）に形成されている。これにより、試料溶液中１５１を少ない抵抗で移動するので、抗原３の検出を迅速に行うことができる。また、球状であることにより、表面積が大きくなるので、捕捉物８をより多く担体１２４の表面に担持することができる。
なお、担体１２４の形状は、球状に限定されず、角柱状、円柱状などであってもよい。
担体１２４を構成する材料は、特に限定されず、前述した基板１２０や作用電極１２１を構成する材料と同様のものが挙げられる。
【０１２５】
本検出方法は、このような捕捉物担体７を用いて抗原３を捕捉し、検出が行われる。しかし、捕捉物担体７は、電極を用いておらず、蛍光物質４２も有していない。そのため、捕捉物担体７が抗原３を捕捉しても抗原３を検出することは困難である。
そこで、本発明の検出キットにより得られる色調検出試薬６を用いて、抗原３の存在を検出する。
【０１２６】
次に、このような捕捉物担体７を用いた本発明の第４の検出方法を説明する。
第４の検出方法は、第１の化合物１と第２の化合物２とを反応させて色調検出試薬６を調製する工程［Ｄ１］と、試料供給空間１５０に液体試料１５１を供給する工程［Ｄ２］と、色調検出試薬６を液体試料１５１中に供給する工程［Ｄ３］と、色調検出試薬６と抗原３との結合により生じる色調の変化を検出する工程［Ｄ４］とを有する。
【０１２７】
［Ｄ１］色調検出試薬調製工程
まず、第１の化合物１と第２の化合物２とを反応して色調検出試薬６を調製する。
なお、以下の説明では色調検出試薬６の結合部位１１を抗体６１、標識部位２２を色素化合物６２として説明する。
色調検出試薬６の調製は、例えば、第１の化合物１（化合物（２２））と標識部位２２に色素化合物６２を有する第２の化合物２（化合物（３０））とを、第１の検出方法と同様の条件で反応させることにより行う。
【０１２８】
【化２４】
（式中、ｎは３〜１５を示す。）
これにより、色調検出試薬６（化合物（３１））を調製した。
【０１２９】
［Ｄ２］液体試料供給工程
まず、図１１（ａ）に示すように、液体試料１５１を反応容器１５２に供給する。
次に、図１１（ａ）に示すように、液体試料１５１（試料供給空間１５０）中に捕捉物担体７を供給する。
液体試料１５１中に捕捉物担体７を供給すると、抗原３と捕捉物担体７の捕捉物８とが接触する。
抗原３と捕捉物８とが接触すると、図１１（ｂ）に示すように、捕捉物担体７の捕捉物８が抗原３を捕捉し、結合する。
【０１３０】
［Ｄ３］色調検出試薬供給工程
次に、図１１（ｃ）に示すように、液体試料１５１中に色調検出試薬６を供給する。
液体試料１５１中に色調検出試薬６を供給すると、捕捉物担体７の捕捉物８に結合している抗原３に色調検出試薬６の抗体６１が接触する。
抗原３に抗体６１が接触すると、図１１（ｄ）に示すように、抗原３と抗体６１とが反応し、結合する。
【０１３１】
このとき、色調検出試薬６は標識部位２２に色素化合物６２を有するため、抗原３に色調検出試薬６と捕捉物担体７とが結合した抗原捕捉物９の色調は、当該色素化合物６２の色調に変色する。
なお、色調検出試薬６の液体試料１５１に対する比重は、１ｇ／ｃｍ３以下であることが好ましい。
【０１３２】
［Ｄ４］抗原検出工程
液体試料１５１中に含まれていた抗原３は、捕捉物担体７との結合により不溶化し、そして、色調検出試薬６との結合により抗原捕捉物９となって色調が変化する。
抗原捕捉物９は、液体試料１５１に対する比重が大きくなるので、時間の経過とともに除々に液体試料空間１５０の下部へと沈降し、凝集していく。そのため、反応容器１５２を外部から視認したとき、色調も除々に反応容器１５２の下部へと移動する。
【０１３３】
そして、図１１（ｅ）に示すように、抗原捕捉物９が反応容器１５２の底部に到達し、抗原捕捉物９の全てが凝集沈殿する。
このとき、反応容器１２５中の色調は、反応容器１５２内の下端部では抗原捕捉物９の色素化合物６２の色調が認められ、反応容器１５２内の上方側では液体試料１５１の色調、例えば、無色透明が認められる。
【０１３４】
以上のような方法により、捕捉物担体７に結合した抗原３が色調検出試薬６に結合することにより、色調が変化するので、液体試料１５１中の抗原３の存在を高感度に検出することができる。
なお、液体試料１５１中の抗原３の濃度を測定する場合は、第１の検出方法と同様の方法で行うことができる。
【０１３５】
［５］第５の検出方法
次に、本発明の検出キットを用いた検出対象物の第５の検出方法について説明する。
図１２は、第５の検出方法を模式的に説明する縦断面斜視図である。
なお、以下の説明では、図１２中の上側を「上」、下側を「下」と言う。
以下、第５の検出方法について説明するが、前記第１の検出方法との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。
本検出方法は、ウェル１２５を有する基板１２０を用いて行う。
基板１２０は、複数のウェル１２５を有している。そして、そのウェル１２５の底面に捕捉物８が担持されている。
抗原３の検出は、第２の検出方法と同様の方法で行われる。しかし、ウェル１２５が電極を有していない場合には、例えば、第１の検出方法と同様に、蛍光により検出される。
以上、本発明の検出キットを説明したが、本発明はこれに限定されるものでない。
例えば、本発明の検出キットでは、各部の構成は、同様の機能を発揮する任意の構成のものに置換することができ、また、任意の構成を付加することもできる。
【符号の説明】
【０１３６】
１……第１の化合物 １１……結合部位 １２……第１の反応部位 １３……第１の連結部位 １３ａ……粒子 ２……第２の化合物 ２１……第２の反応部位 ２２……標識部位 ２３……第２の連結部位 ３……抗原 ４……酸化還元検出試薬 ４１……抗体 ４２……酸化還元物質 ５……蛍光検出試薬 ５１……抗体 ５２……蛍光物質 ６……色調検出試薬 ６１……抗体 ６２……色素化合物 ７……捕捉物担体 ８……捕捉物 ９……抗原捕捉物 １００……バイオセンサー １０１……測定装置 １０２……演算装置 １１０……検出部 １２０……基板 １２１……作用電極 １２２……対向電極 １２３……参照電極 １２４……担体 １２５……ウェル １２６……凹部 １３０……配線 １３１……コネクタ １３２……配線 １４０……反応層 １５０……試料供給空間 １５１……液体試料 １５２……反応容器 １６０……絶縁膜 １６５……開口部 １８０……圧電体素子 １８１……圧電体 １８２……上電極 １８３……下電極 １９０……基体 ２００……処理回路
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検出キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来から、抗原または抗体を検出するために、種々の方法が用いられている。例えば、抗原または抗体は、抗原抗体反応を利用したＥＬＩＳＡ法を用いて検出される。
このＥＬＩＳＡ法による抗原抗体反応検出法では、２次抗体反応時に抗体に固定化された酵素による色素反応によって抗原の検出が行われている。しかし、抗原の存在量が超微量である場合、抗原の検出感度が得られないという問題を有する。
【０００３】
一方で、基板表面から光重合等によって、末端に抗体分子を有するアンカー可能なＰＥＧポリマーを成長させて、抗原検出可能な機能表面を作成している例がある（例えば、非特許文献１）。
ところが、基板に成長させたＰＥＧポリマーの密度、大きさに比較して抗体分子は大きい。そのため、基板表面に固定化できる抗体分子の数は少なくなる。その結果、抗原の検出感度が、得られないという問題を有している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Robert P. Serba et al, Langmuir 2005 21, 10907
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、検出対象物を高感度に検出するための検出キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
このような目的は、下記の本発明により達成される。
本発明の検出キットは、検出対象物を選択的に検出し得る検出キットであって、
前記検出対象物と特異的に結合する結合部位と、反応性を有する第１の反応部位とを含む第１の化合物と、
前記第１の反応部位と反応する第２の反応部位と、標識部位とを含む第２の化合物とを有し、
前記第１の化合物と前記第２の化合物とを反応させることにより、前記第１の反応部位と前記第２の反応部位とを連結させることを特徴とする。
これにより、結合部位と標識部位とを有する検出試薬が得られるので、検出対象物を高感度に検出することができる。
【０００７】
本発明の検出キットでは、前記結合部位は、抗原または抗体であることが好ましい。
これにより、抗原または抗体と特異的に結合し得る検出対象物（抗体または抗原）を高感度に検出することができる。
本発明の検出キットでは、前記第１の反応部位および前記第２の反応部位は、それぞれ重合性基で構成されていることが好ましい。
これにより、第１の反応部位および第２の反応部位の反応性が高いので、第１の反応部位と第２の反応部位とを容易に連結することができる。また、重合性基で重合反応が起こるので、第２の化合物を複数導入することができる。
【０００８】
本発明の検出キットでは、前記第１の化合物は、前記結合部位と前記第１の反応部位との間に、前記結合部位と前記第１の反応部位とを連結する第１の連結部位を有することが好ましい。
これにより、第１の連結部位は反応性の高い基を有するので、結合部位および第１の反応部位を確実に連結することができる。
本発明の検出キットでは、前記第１の連結部位は、粒子を含むものであることが好ましい。
これにより、粒子は表面積が大きいので、粒子表面側に複数の結合部位および／または第１の反応部位を結合することができる。
【０００９】
本発明の検出キットでは、前記粒子の表面に、前記結合部位および／または前記第１の反応部位が複数結合していることが好ましい。
これにより、複数の検出対象物および／または複数の第２の化合物と結合することができるので、検出対象物の検出感度を向上させることができる。
本発明の検出キットでは、前記粒子に結合する前記結合部位および前記第１の反応部位の存在比は、前記結合部位を［Ａ］、前記第１の反応部位を［Ｂ］としたとき、Ａ／Ｂが０．１〜１．０であることが好ましい。
これにより、第１の反応部位の存在割合が多いので、第２の化合物を多く結合することができる。その結果、複数の標識部位を有する検出試薬を得ることができる。
【００１０】
本発明の検出キットでは、前記標識部位は、酸化還元物質、蛍光物質および色素化合物の少なくとも１種で構成されることが好ましい。
これにより、酸化還元電流、蛍光強度または色調が変化するので、電気化学的検出または蛍光検出が可能となる。
本発明の検出キットでは、前記標識部位を複数有することが好ましい。
これにより、標識部位を複数有する検出試薬が得られるので、検出対象物の検出感度をより向上させることができる。
【００１１】
本発明の検出キットでは、前記第２の化合物は、前記第２の反応部位と前記標識部位との間に、前記第２の反応部位と前記標識部位とを連結する第２の連結部位を有することが好ましい。
これにより、第２の連結部位は、反応性の高い基を有するので、標識部位および第２の反応部位を確実に連結することができる。
本発明の検出キットでは、さらに、検出対象物を選択的に捕捉し得る捕捉物が担持された基体を有することが好ましい。
これにより、基体と第１の化合物と第２の化合物とを用いることで検出対象物を検出できるので、簡易かつ迅速に検出対象物を検出することができる。
【００１２】
本発明の検出キットでは、前記基体は、ウェルを備え、
当該ウェルの内面に前記捕捉物が担持されていることが好ましい。
これにより、ウェルと第１の化合物と第２の化合物とを用いることで検出対象物を検出できるので、より簡易かつ迅速に検出対象物を検出することができる。
本発明の検出キットでは、前記基体は、粒状に形成されていることが好ましい。
これにより、基体の表面を滑らかにすることができるので、低抵抗で試料溶液中を移動することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の検出キットの第１の化合物を模式的に示す図である。
【図２】本発明の検出キットの第１の化合物を模式的に示す図である。
【図３】本発明の検出キットの第２の化合物を模式的に示す図である。
【図４】本発明の検出キットを用いた抗原の第１の検出方法を説明するための図（縦断面）である。
【図５】本発明の検出キットを用いた抗原の第２の検出方法に用いられるバイオセンサーの斜視図である。
【図６】図５に示すバイオセンサーを模式的に示す平面図である
【図７】図６に示すＡ−Ａ線断面図の部分拡大図である。
【図８】本発明の検出キットを用いた抗原の第２の検出方法を説明するための図（縦断面図）である。
【図９】本発明の検出キットを用いた抗原の第３の検出方法に用いられるバイオセンサーを模式的に示す平面図である。
【図１０】図９に示すＢ−Ｂ線断面図の部分拡大図である。
【図１１】本発明の検出キットを用いた抗原の第４の検出方法を説明するための図（縦断面図）である。
【図１２】本発明の検出キットを用いた抗原の第５の検出方法に用いられるウェルを模式的に示す断面斜視図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の検出キットについて、詳細に説明する。
＜検出キット＞
本実施形態の検出キットは、検出対象物と特異的に結合する結合部位を有する第１の化合物と、検出対象物の検出感度を上げる標識部位を有する第２の化合物とを含むものである。
【００１５】
まず、本発明の検出キットの第１の化合物および第２の化合物について説明する。
図１、２は、第１の化合物を模式的に示す図、図３は、第２の化合物を模式的に示す図である。
図１に示す第１の化合物１は、結合部位１１と、反応性を有する第１の反応部位１２と、結合部位１１と第１の反応部位１２とを連結する第１の連結部位１３とを有している。
【００１６】
結合部位１１は、検出対象物を特異的に認識し得るものであれば特に限定されず、例えば、抗体、抗原、微生物、酵素、糖類、タンパク質などが挙げられる。これらのうち、本実施形態では、結合部位１１は、抗原または抗体であることが好ましい。
このような抗体の種類は、特に限定されず、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ等が挙げられる。これらの中でも、ＩｇＧが好ましい。ＩｇＧは、生産が容易であり、検出等可能な抗原の種類が増大する。
【００１７】
第１の反応部位１２は、後述する第２の化合物２の第２の反応部位２１と反応して、結合する部位である。すなわち、第１の反応部位１２は、第１の化合物１と第２の化合物２とを連結する機能を有する。
このような第１の反応部位１２は、特に限定されないが、例えば、ビニル基、アリル基、アクリル基、メタクリル基、スチリル基などの重合性基、マレイミド基、ピリジルジスルフィド基、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド基、ＮＨＳ基などが挙げられる。これらのうち、重合性基であることが好ましく、ビニル基であることがより好ましい。重合性基、特にビニル基は、反応性に富む基であるので、第１の反応部位１２と第２の反応部位２１とを効率よく反応させることができる。
【００１８】
第１の連結部位１３は、結合部位１１と第１の反応部位１２とを連結し得る結合基（官能基）を有している。このような結合基としては、例えば、アミド結合、エーテル結合、エステル結合、スルフィド結合、カルボニル結合などが挙げられる。これらは、２種以上含まれていてもよい。
例えば、結合部位１１を抗体とした場合、結合部位１１の表面にはフリーアミノ基が存在するので、結合基はアミド結合が含まれていることが好ましい。これにより、抗体と結合基とが効率良く反応するので、抗体と結合基とを確実に結合することができる。
【００１９】
また、例えば、結合部位１１をシステインを有するタンパク質とした場合、システインはＳＨ基を有するので、スルフィド結合が含まれていることが好ましい。
また、第１の連結部位１３には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖（スペーサ）が含まれていることが好ましい。これにより、結合部位１１と第一の反応部位１２とが一定距離離間するので、第１の反応部位１２と第２の反応部位２１とを効率的に反応することができる。
【００２０】
ＰＥＧ鎖は、アルキル鎖と比較すると、鎖上にエーテル結合を含むため、エーテル酸素原子の非結合対の電子の影響で金属イオンや極性官能基との相互作用を形成し易く、水分子とも会合し易い。また、エーテル酸素原子と隣接炭素原子間の双極子モーメントの影響でダイポールモーメントが比較的大きく、水和し易さにも影響与える。
このように、ＰＥＧ鎖は、一般的に水溶性になりやすい鎖構造のため、水中にて緩和伸張構造を取り易い。
【００２１】
一方、アルキル鎖は疎水性のため水中では、疎水性凝集効果によって鎖が縮まり、反応部位間との距離が保てない。
したがって、第１の連結部位１３にＰＥＧ鎖が含まれていることにより、水中において伸長構造を取り易くなるので、液体試料１５１中の検出対象物を高感度に検出することができる。
また、第１の連結部位１３は、粒子１３ａを含むことが好ましい。これにより、粒子１３ａは表面積が大きいので、粒子１３ａの表面に複数の結合部位１１、第１の反応部位１２を結合することができる。
以上のような結合部位１１、第１の反応部位１２、第１の連結部位１３を有する第１の化合物１は、例えば、以下に示す化合物（１）、化合物（２）、図２に示す構造のものが挙げられる。なお、化合物（１）および化合物（２）のいずれも、結合部位（ＰＥＧ鎖とアミド結合している部位）１１は抗体である。
【００２２】
【化１】
（式中、ｎは３〜１５を示す。）
【００２３】
【化２】
（式中、ｎは３〜１５を示す。）
【００２４】
図２に示す第１の化合物１は、結合部位１１と、第１の反応部位１２と、粒子１３ａを含む第１の連結部１３とを有している。そして、結合部位１１および第１の反応部位１２は、それぞれ硫黄原子を介して粒子１３ａに結合している。
このような粒子１３ａとしては、例えば、金、銀などの金属、これらの金属酸化物、色素、顔料、ポリスチレン、メタクリル酸などが挙げられる。このうち、金属であることが好ましく、金であることがより好ましい。
金は、硫黄原子とスルフィド結合することができるので、図２に示すように、複数の結合部位１１および第１の反応部位１２を硫黄原子を介して簡単に結合させることができる。その結果、第２の化合物２の連結により、標識部位２２が多く存在するので、検出対象物を高感度に検出することができる。
【００２５】
第１の連結部１３が粒子１３ａを含む場合、粒子１３ａ表面に結合する結合部位１１および第１の反応部位１２の存在比は、結合部位１１をＡ、第１の反応部位１２をＢとしたとき、Ａ／Ｂ＝０．１〜１．０であることが好ましく、０．３〜０．８であることがより好ましい。
これにより、結合部位１１よりも第１の反応部位１２の存在割合が大きいので、標識部位２２を有する第２の化合物２をより多く連結することができる。その結果、標識部位２２の存在割合が増大し、検出対象物をより高感度に検出することができる。
【００２６】
結合部位１１および第１の反応部位１２の存在比が前記範囲よりも小さすぎると、結合部位１１の存在割合が小さくなり、検出対象物と十分に結合しなくなるおそれがある。
一方、結合部位１１および第１の反応部位１２の存在比が前記範囲よりも大きすぎると、第１の反応部位１２の存在割合が小さくなりすぎ、第２の化合物２を連結する割合が小さくなるおそれがある。
【００２７】
図３に示す第２の化合物２は、第１の反応部位１２と反応する第２の反応部位２１と、標識部位２２と、第２の反応部位２１と標識部位２２とを連結する第２の連結部位２３とを有している。
第２の反応部位２１は、第１の化合物１の第１の反応部位１２と反応して、結合する部位である。すなわち、第２の反応部位２１は、第１の化合物１と第２の化合物２とを連結する機能を有する。
【００２８】
このような第２の反応部位２１は、特に限定されないが、例えば、ビニル基、アリル基、アクリル基、メタクリル基、スチリル基などの重合性基、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド基、ＮＨＳ基、マレイミド基、ピリジルジスルフィド基などが挙げられる。これらのうち、重合性基であることが好ましく、ビニル基であることがより好ましい。重合性基、特にビニル基は、反応性に富む基であるので、第２の反応部位２１を第１の反応部位１２と効率よく反応することができる。
【００２９】
標識部位２２は、検出対象物の検出感度を向上させる機能を有する。
この標識部位２２としては、例えば、蛍光物質、酸化還元物質または色素化合物などが挙げられる。これらは２種以上組み合せて用いることもできる。標識部位２２を複数用いることにより、検出対象物を高感度に検出することができる。
標識部位２２に蛍光物質を用いた場合、検出対象物を含む液体試料１５１中に第１の反応部位１２と第２の反応部位２１とが連結した蛍光検出試薬５を混合することで、蛍光強度が変化するので、簡単に検出対象物の検出をすることができる。
【００３０】
標識部位２２に酸化還元物質を用いた場合、第１の反応部位１２と第２の反応部位２１とが連結した酸化還元検出試薬４を検出対象物を捕捉したセンサーに接触させることで、酸化還元反応が生じるので、酸化還元電流を計測することができる。
標識部位２２に色素化合物を用いた場合、検出対象物を含む試料の色調の変化により、検出対象物の存在を確認できるので、より簡単に検出対象物を検出することができる。
このような蛍光物質５２としては、特に限定されないが、例えば、フルオレセイン、ダンシルクロライド、フルオレスカミン、７−クロロ−４−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾ−ル（ＮＢＤ−クロライド）、オルトアミノチオフェノール、ダンシルヒドラジンなどの芳香族有機化合物などが挙げられる。
【００３１】
酸化還元物質４２としては、特に限定されないが、例えば、フェロセン（化３）、オスミウム−ビピリジル錯体（化４）、フタロシアニン、テトラゾリウム塩、テトラメチルベンジジン、ジアミノベンジジン、トリアミノトリフェニルメタン、トリンダー試薬等が挙げられる。このうち、フェロセンまたはオスミウム−ビピリジル錯体であることが好ましい。
【００３２】
【化３】
【００３３】
【化４】
【００３４】
フェロセンは、酸化還元活性に優れるので、検出対象物の検出を行った場合、酸化還元電流をより効率よく検出することができる。
オスミウム−ビピリジル錯体は、水溶性であるためポリマーとの親和性が高い。また、ポリマー鎖も水和構造の中で伸張し、反応が進行しやすい。そのため、検出対象物の検出を行った場合、酸化還元電流をより効率よく検出することができる。
色素化合物としては、特に限定されないが、例えば、ポルフィリン、クロロフィル、ニュートラルレッド、メチレンブルー、フェノールフタレイン、インドシアニングリーン、シアニン色素、アゾ色素、フラボノイド、カロチノイドなどが挙げられる。
【００３５】
第２の連結部位２３は、第２の反応部位２１と標識部位２２とを連結し得る結合基（官能基）を有している。このような結合基としては、例えば、アミド結合、エーテル結合、エステル結合、スルフィド結合、カルボニル結合などが挙げられる。これらは、２種以上含まれていてもよい。
例えば、標識部位２２をフェロセンとした場合、結合基はエステル結合が含まれていることが好ましい。これにより、フェロセンと結合基とが効率良く反応するので、フェロセンと結合基とを確実に結合することができる。
【００３６】
また、第２の連結部位２３には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖（スペーサ）が含まれていることが好ましい。これにより、第２の反応部位２１と標識部位２２とが一定距離離間するので、検出対象物を検出する場合、当該検出対象物を効率よく検出することができる。また、第１の連結部位１３で説明したように、水中において伸長構造を取り易くなるので、液体試料１５１中の検出対象物を高感度に検出することができる。
以上のような第２の反応部位２１、標識部位２２、第２の連結部位２３を有する第２の化合物２は、例えば、以下に示す化合物（５）〜（７）などが挙げられる。
【００３７】
【化５】
（式中、ｎは３〜１５を示す。）
【００３８】
【化６】
（式中、ｎは３〜１５を示す。）
【００３９】
【化７】
（式中、ｎは３〜１５を示す。）
【００４０】
以上の第１の化合物１と第２の化合物２とを含むことにより、検出キットが得られる。
この検出キットには、検出対象物の検出に必要なもの、例えば、検出対象物を選択的に捕捉し得る捕捉物８が担持された基体１９０が含まれていてもよい。
このような基体１９０としては、例えば、バイオセンサーに用いる作用電極１２１、基板１２０、担体１２４などが挙げられる。これにより、検出対象物を一旦基体１９０の捕捉物８に捕捉した後、第１の化合物１および第２の化合物２を用いて、検出対象物の高感度検出をすることができる。
【００４１】
なお、基体１９０の形状は特に限定されないが、担体１２４を用いる場合は、球状（粒状）であることが好ましい。これにより、表面が滑らかになるので、液体試料１５１中を小さい抵抗で沈降、浮遊することができる。
その他、本発明の検出キットは、スパチュラ、反応容器、スポイトなどを含んでいてもよい。これにより、測定場所を問わず、より迅速に検出対象物の検出を行うことができる。
また、本発明の検出キットは、持ち運びを容易にするために、第１の化合物１や第２の化合物２などを容器に収容して提供することができる。
このような検出キットに含まれる第１の化合物１および第２の化合物２は、それぞれ、次のようにして製造することができる。
【００４２】
以下、第１の化合物１の製造方法および第２の化合物２の製造方法について、それぞれ２つの方法を例に挙げて詳細に説明する。なお、以下の説明では、結合部位１１に抗体を用いた場合を代表して説明する。
【００４３】
＜第１の化合物の製造方法＞
［１］第１の製造方法
まず、結合部位１１である抗体と、ＰＥＧの一端にエステル基を介してコハク酸イミドを、他端にエステル基を介して第１の反応部位１２を有する下記化合物（８）を用意する。
【００４４】
【化８】
（式中、ｎは３〜１５を示す。）
【００４５】
次に、下記反応式に示すように、抗体と化合物（８）とを反応させる。
【００４６】
【化９】
（式中、ｎは３〜１５を示す。）
【００４７】
反応に用いる化合物（８）の量は、抗体１μｇに対して、２〜１００倍量であることが好ましく、５〜５０倍量であることがより好ましい。
抗体の表面には、アミノ酸の１種であるリシン由来のフリーアミノ基が存在する。そのため、当該アミノ基と化合物（８）とで反応が進行する。したがって、化合物（８）が前記したような量であることにより、化合物（８）が過剰に存在するので、抗体のアミノ基と過不足なく反応することができる。
【００４８】
反応時間は、０．５〜１０時間であることが好ましく、１〜５時間であることがより好ましい。
反応温度は、０〜６０℃であることが好ましく、２０〜４０℃であることがより好ましい。
反応のｐＨは、６〜８であることが好ましく、６．５〜７．５であることがより好ましい。
以上のような反応条件を好ましい条件に設定することにより、抗体と化合物（８）との反応が効率よく進行するので、収率よく第１の化合物１（化合物（９））を得ることができる。
【００４９】
［２］第２の製造方法
次に、第１の連結部１３に金微粒子を含む場合の第１の化合物１の第２の製造方法について説明する。
［Ａ１］ まず、金微粒子とアミノエタンチオールを用意する。
この金微粒子の外径は、０．０１〜１０μｍであることが好ましく、０．０５〜１μｍであることがより好ましい。
また、金微粒子の表面積は、１×１０−１５〜１×１０−１１ｍ２であることが好ましく、５×１０−１５〜８×１０−１３ｍ２であることがより好ましい。
【００５０】
金微粒子の外径、表面積がこのような範囲であることにより、金微粒子の表面に複数の化合物を結合することができる。
アミノエタンチオールの使用量は、０．１〜１ｍｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、０．５〜０．８ｍｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。アミノエタンチオールの使用量がこのような範囲であることにより、アミノエタンチオールの量が金微粒子の量よりも多いので、金微粒子の表面に複数のアミノエタンチオールを結合することができる。
【００５１】
［Ａ２］ 用意した金微粒子とアミノエタンチオールとを以下の反応式に示すように、混合し、反応させる。
【００５２】
【化１０】
【００５３】
このときの反応条件は、反応溶媒中、２５℃で１時間攪拌をしながら反応を行うことが好ましい。
反応溶媒は、特に限定されないが、ジクロロエタン、アセトニトリル、塩化メチレン、メタノールなどの各種溶媒が挙げられる。
これにより、金に硫黄原子を介してアミノエタンが結合した化合物（１０）を得た。
【００５４】
［Ａ３］ 得られた化合物（１０）を下記の反応式に示すように化合物（１１）と混合し、反応させる。
【００５５】
【化１１】
（式中、ｎは３〜１５を示す。）
【００５６】
化合物（１１）の使用量は、化合物（１０）に対して１〜１００当量であることが好ましく、５〜５０当量であることがより好ましい。化合物（１１）の使用量がこのような範囲であることにより、金微粒子に対して化合物（１１）の量が多いので、金微粒子の表面に硫黄原子を介して複数の化合物（１１）を結合することができる。
このときの反応条件は、反応溶媒中、２５℃で１時間攪拌をしながら反応を行うことが好ましい。
反応溶媒は前記［Ａ２］で挙げたものと同様である。
これにより、金微粒子に硫黄原子を介してアミノ基と第１の反応部位１２とが結合した化合物（１２）を得た。
【００５７】
［Ａ４］ 次に、下記の反応式で示すように、［Ａ３］で得られた化合物（１２）とコハク酸イミドを両末端に有する化合物（１３）とを混合し、反応させる。
【００５８】
【化１２】
（式中、ｎは３〜１５を示す。）
【００５９】
化合物（１３）の使用量は、化合物（１２）に対して１〜１０当量であることが好ましく、１．５〜５当量であることがより好ましい。
このときの反応条件は、反応溶媒中、２５℃で１時間攪拌をしながら反応を行うことが好ましい。
反応溶媒は前記［Ａ２］で挙げたものと同様である。
これにより、アミノ基とコハク酸イミド基が反応した化合物（１４）を得た。
【００６０】
［Ａ５］ 最後に、下記反応式に示すように、［Ａ４］で得られた化合物（１４）と抗体とを混合し、反応させる。
【００６１】
【化１３】
（式中、ｎは３〜１５を示す。）
【００６２】
化合物（１４）の使用量は、抗体１μｇに対して、２〜１００倍量であることが好ましく、５〜５０倍量であることがより好ましい。前述したように、抗体表面のアミノ基と化合物（１４）のコハク酸イミド基が反応する。そのため、化合物（１４）が前記したような量であることにより、過剰に化合物（１４）が存在するので、抗体のアミノ基と過不足なく反応することができる。
このときの反応条件は、反応溶媒中、２５℃で１時間攪拌をしながら反応を行うことが好ましい。
反応溶媒は前記［Ａ２］で挙げたものと同様である。
これにより、第１の連結部１３に粒状の金微粒子を有する第１の化合物１（化合物（１５））を得た。
【００６３】
なお、金微粒子の表面にアミノエタンチオールおよび／または化合物（１１）を複数結合することにより、図２に示すように、金微粒子の表面に硫黄原子を介して結合部位１１および／または第１の反応部位１２を複数結合することができる。換言すると、金微粒子の表面から放射状に結合部位１１および／または第１の反応部位１２を複数形成することができる。
これにより、複数の検出対象物と複数の結合部位１１とが、複数の第２の反応部位２１と複数の第１の反応部位とが反応するので、検出対象物の検出感度をより一層向上することができる。
【００６４】
＜第２の化合物の製造方法＞
［１］第１の製造方法
まず、下記に示す標識化合物（１６）と、下記に示すＰＥＧの一端に第２の反応部位２１と、他端に水酸基とを有する化合物（１７）とを用意する。
【００６５】
【化１４】
【００６６】
【化１５】
（式中、ｎは３〜１５を示す。）
【００６７】
次に、下記反応式に示すように、触媒存在下、化合物（１６）と化合物（１７）とを反応させる。
【００６８】
【化１６】
（式中、ｎは３〜１５を示す。）
【００６９】
反応に用いる化合物（１６）の量は、化合物（１７）に対して１〜１０当量であることが好ましく、１．５〜５当量であることがより好ましい。
反応時間は、０．５〜１０時間であることが好ましく、１〜５時間であることがより好ましい。
反応温度は、０〜６０℃であることが好ましく、２０〜４０℃であることがより好ましい。
以上のような反応条件を好ましい条件に設定することにより、化合物（１６）と化合物（１７）との反応が過不足なく進行するので、収率よく第２の化合物２（化合物（１８））を得ることができる。
【００７０】
［２］第２の製造方法
次に、第２の化合物２の第２の製造方法について説明する。
まず、一端に第２の反応部位２１を有する化合物（１９）と、一端に標識部位２２を有する化合物（２０）とを用意する。
【００７１】
【化１７】
（式中、ｎは３〜１５を示す。）
【００７２】
【化１８】
（式中、ｎは３〜１５を示す。）
【００７３】
次に、下記反応式に示すように、触媒存在下、化合物（１９）と化合物（２０）とをラジカル重合させる。
【００７４】
【化１９】
（式中、ｎは３〜１５を示す。）
【００７５】
反応に用いる化合物（１９）の量は、化合物（２０）に対して１〜１０当量であることが好ましく、１．５〜５当量であることがより好ましい。
ラジカル重合反応時間は、０．５〜１０時間であることが好ましく、１〜５時間であることがより好ましい。
ラジカル重合反応温度は、５０〜３００℃であることが好ましく、１００〜２５０℃であることがより好ましい。
反応圧力は、常圧程度であることが好ましい。
触媒としては、例えば、過酸化ベンゾイルなどのラジカル触媒などが挙げられる。そして、触媒の量は、０．１〜５ｍｍｏｌであることが好ましく、０．５〜１ｍｍｏｌであることがより好ましい。
【００７６】
以上のような反応条件を好ましい条件に設定することにより、化合物（１９）と化合物（２０）との反応が過不足なく進行するので、収率よく第２の化合物２（化合物（２１））を得ることができる。
この化合物（２１）は、標識部位２２を複数有するので、第１の化合物１との結合により、検出対象物をより高感度に検出することができる。
以上のような製造方法により、第１の化合物１と第２の化合物２とが得られ、これらを含む検出キットが得られる。
【００７７】
＜検出キットの使用方法＞
このようにして得られた第１の化合物１および第２の化合物２を含む検出キットは、例えば、次のようにして使用することができる。
以下、検出キットの使用方法（検出対象物の検出方法）について、図を用いて詳細に説明する。以下の説明では、検出対象物質に抗原３を、結合部位１１に抗体を用いた場合を代表して説明する。
【００７８】
［１］第１の検出方法
まず、本発明の検出キットを用いた検出対象物の第１の検出方法について説明する。
図４は、第１の検出方法を説明を模式的に示す縦断面図である。
なお、以下の説明では、図４中の上側を「上」、下側を「下」と言う。
第１の検出方法は、第１の化合物１と第２の化合物２とを反応させて蛍光検出試薬５を調製する工程［Ａ１］と、蛍光検出試薬５を液体試料１５１中に供給する工程［Ａ２］と、蛍光検出試薬５と抗原３との結合により生じる蛍光強度の変化を検出する工程［Ａ３］とを有する。
【００７９】
［Ａ１］検出試薬調製工程
まず、第１の化合物１と第２の化合物２とを反応して蛍光検出試薬５を調製する。なお、以下の説明では、蛍光検出試薬５の結合部位１１を抗体５１、標識部位２２を蛍光物質５２として説明する。
蛍光検出試薬５の調製は、例えば、下記反応式で示すように、第１の反応部位１２にビニル基を有する第１の化合物１（化合物（２２））と標識部位２２に蛍光物質５２を有する第２の化合物２（化合物（２３））とを、高圧水銀灯による紫外線照射により光重合反応させることにより行う。
【００８０】
【化２０】
（式中、ｎは３〜１５を示す。）
【００８１】
なお、化合物（２２）は１ｍｏｌ、化合物（２３）は５ｍｏｌ用いた。また、紫外線は、強度１６００ｍＪ／ｃｍ２、３６５ｎｍの波長の光を２５℃で１５分間照射した。これにより、蛍光検出試薬５（化合物（２４））を調製した。
なお、蛍光検出試薬５の重合度（紫外線照射時間）を制御することによって、抗体５１分子表面に第１の連結部１２を介して多数の蛍光物質５２を導入できる。
例えば、第１の連結部１２の１鎖長あたり１００個の蛍光物質５２を導入できる。仮に、１０ポリマー鎖が１抗体より成長反応を起こしたとすると、１抗体５１分子あたり１０００個の蛍光物質５２を導入できる。これにより、蛍光物質５２を大量に導入できるので、抗原の検出感度を大幅に増幅することができる。
【００８２】
また、化合物（２）と化合物（７）のフェロセンが蛍光物質５２に置換した化合物とを反応する場合は、まず、当該化合物を緩衝溶液中分散させたものを用意する。次に、該緩衝溶液中に０．１ｍｏｌ／Ｌの２−メルカプトエタノール入れ、ジスルフィドを開裂させる。そして、この溶液と化合物（２）とを混合すると、ポリマー末端のチオールと抗体５１分子表面のマレイミド分子が反応する。これにより、共有結合が形成し、抗体５１分子表面に多数の蛍光物質５２を固定化できる。
また、後述する第２の検出方法と同様に、化合物（２８）と化合物（２３）との反応により、金微粒子を含む蛍光検出試薬５を調製することもできる。
【００８３】
［Ａ２］検出試薬供給工程
図４（ａ）に示すように、検出対象物である抗原３を含む液体試料１５１を反応容器１５２に入れる。
次に、図４（ａ）に示すように、液体試料１５１（試料供給空間１５０）中に蛍光検出試薬５を供給する。これにより、抗原３と蛍光検出試薬５とが接触する。
【００８４】
抗原３と蛍光検出試薬５とが接触すると、図４（ｂ）に示すように、蛍光検出試薬５の抗体５１が抗原３と反応し、抗原３と抗体５１が結合する。
ここで、液体試料（被検体）１５１としては、例えば、血液、尿、汗、リンパ液、髄液、胆汁、唾液等の体液や、これらの体液に各種処理を施した処理済み液、お酒などの飲食品、医薬品、化粧品等が挙げられる。
なお、蛍光検出試薬５の供給濃度は、特に限定されないが、０．０１〜１ｍｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、０．０５〜０．５ｍｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。
【００８５】
［Ａ３］抗原検出工程
抗体５１が抗原３に結合すると、蛍光検出試薬５の蛍光物質５２により、抗原３の蛍光強度が増大する。すなわち、抗原３に抗体５１が結合していない状態では、抗原３の蛍光強度は、０または極めて低い値である。しかし、蛍光検出試薬５の抗体５１が抗原３に結合することにより、抗原３の蛍光強度が増大する。この蛍光強度を蛍光光度計や蛍光検出器を用いたＨＰＬＣなどで測定することにより、抗原３を検出することができる。
なお、液体試料１５１中の抗原３の濃度を測定する場合は、予め濃度既知の抗原３含有液体試料１５１を段階的に複数調製する。そして、上記検出方法により、各濃度の液体試料１５１中の抗原３を測定する。測定により得られた各液体試料１５１中の抗原３の蛍光強度を縦軸に、抗原３の濃度を横軸として検量線を作成する。
【００８６】
次に、液体試料１５１中の抗原３を前述したような方法で測定する。そして、測定により得られた蛍光強度と前記検量線とから液体試料１５１中に存在する抗原３の濃度を定量することができる。
以上のような方法により、抗原３の存在を検出することができ、抗原３の濃度を定量することもできる。
【００８７】
［２］第２の検出方法
次に、本発明の検出キットを用いた検出対象物の第２の検出方法について説明する。
図５は、バイオセンサーを測定装置に装着した状態を示す模式図（斜視図）、図６は、図５に示すバイオセンサーを模式的に示す平面図、図７は、図６に示すバイオセンサーのＡ−Ａ線断面図、図８は、図６に示すＡ−Ａ線断面図の部分拡大図である。
なお、以下の説明では、図６中の紙面手前側を「上」、紙面奥側を「下」と言う。また、図７および図８中の上側を「上」、下側を「下」と言う。
【００８８】
まず、図５のバイオセンサーについて説明する。
図５に示す測定装置（電子機器）１０１は、バイオセンサー１００と、バイオセンサー１００で得られた電流値（酸化還元電流）を解析する処理回路２００を備えた演算装置１０２と、バイオセンサー１００を装着するコネクタ１３１と、処理回路２００とコネクタ１３１とを接続する配線１３２とを有する。
バイオセンサー１００は、図６に示すように、基板１２０上に、作用電極１２１、対向電極１２２および参照電極１２３を備える検出部１１０を有している。
【００８９】
これらの各電極１２１、１２２、１２３は、それぞれ独立して、配線１３０、コネクタ１３１および配線１３２を介して、処理回路２００と電気的に接続されている。また、バイオセンサー１００は、コネクタ１３１において着脱可能となっている。
また、検出部１１０以外の基板１２０上の範囲は、図７に示すように、絶縁膜１６０で覆われている。すなわち、基板１２０上に絶縁膜１６０が設けられ、検出部１１０は、絶縁膜１６０の一部に設けられた開口部１６５から露出している。
【００９０】
このようなバイオセンサー１００は、図７に示すように、基板１２０と絶縁膜１６０とで画成される試料供給空間１５０に、液体試料１５１を供給することにより、作用電極１２１上に設けられた後述する反応層１４０と液体試料１５１とが接触する。そして、液体試料１５１中の抗原３と反応層１４０とが反応することにより、電流値が変化する。これにより、この電流値と電圧とから酸化還元電流の変化に基づいて、液体試料１５１中の抗原３の量を測定することができる。
【００９１】
基板１２０は、バイオセンサー１００を構成する各部を支持するとともに、前述した各電極１２１、１２２、１２３および配線１３０を、互いに絶縁するものである。
基板１２０の構成材料としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレンナフタレート（ＰＥＳ）、ポリイミド（ＰＩ）等の各種樹脂材料、石英ガラスのような各種ガラス材料、アルミナ、ジルコニアのような各種セラミックス材料等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００９２】
作用電極１２１の構成材料としては、例えば、金、銀、銅、白金またはこれらを含む合金のような金属材料、ＩＴＯのような金属酸化物系材料、グラファイトのような炭素系材料等が挙げられる。これらのうち、金属材料であることが好ましく、金または銀であることがより好ましい。作用電極１２１の構成材料が金または銀であることにより、後述する捕捉物８を硫黄原子を介して容易に結合できるので、より簡単にバイオセンサー１００を製造することができる。
作用電極１２１の上側には、反応層１４０が設けられている。
【００９３】
図７に示すように、反応層１４０の一部は、試料供給空間１５０に露出している。そして、試料供給空間１５０に液体試料１５１を供給することにより、液体試料１５１を反応層１４０に接触させることができる。
対向電極１２２は、作用電極１２１との間に電圧を印加する電極である。試料供給空間１５０に液体試料１５１を供給した状態で、作用電極１２１と対向電極１２２との間に、作用電極１２１側が高電位となるように電圧を印加すると、抗原３と捕捉物８との結合により、電流値の変化を確実に捉えることができる。
【００９４】
対向電極１２２の構成材料としては、前述の作用電極１２１の構成材料と同様の材料が挙げられる。
また、対向電極１２２の面積は、作用電極１２１の２倍以上であるのが好ましく、１０倍以上であるのがより好ましい。これにより、より高い精度で電流値を測定することができる。
【００９５】
参照電極１２３は、対向電極１２２との間に電圧を印加する電極である。試料供給空間１５０に液体試料１５１を供給した状態で、参照電極１２３と対向電極１２２との間に電圧を印加する。そして、これらの電極間に流れる電流値と、前述の作用電極１２１と対向電極１２２との間に流れる電流値とを比較することにより、抗原３と捕捉物８との反応により生じた電流値を、より高い精度で測定することができる。
参照電極１２３の構成材料としては、例えば、銀−塩化銀、水銀−硫酸水銀等が挙げられる。
【００９６】
また、前述の作用電極１２１、対向電極１２２、参照電極１２３、および配線１３０は、導電性材料粉末の集合体で構成されていてもよい。これにより、これらの電極１２１、１２２、１２３および配線１３０を、各種印刷法を用いて容易に形成することができる。その結果、バイオセンサー１００の製造工程を大幅に簡素化することができ、バイオセンサー１００の低コスト化を図ることができる。
【００９７】
絶縁膜１６０は、前述したように、検出部１１０付近に開口する開口部１６５を有し、この開口部１６５により試料供給空間１５０を形成している。
このような絶縁膜１６０は、絶縁性の材料で構成されている。絶縁膜１６０の種類は特に限定されず、有機材料や無機材料のいずれも用いることができる。
有機材料としては、ポリメチルメタクリレート、ポリビニルフェノール、ポリイミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセテートなどの高分子化合物が挙げられる。これらは、１種または２種以上組み合わせて用いることができる。
【００９８】
無機材料としては、酸化ケイ素、酸化アルミニウム、酸化タンタル、酸化ジルコニウム、酸化セリウム、酸化亜鉛、酸化コバルトなどの金属酸化物、窒化ケイ素、窒化アルミニウム、窒化ジルコニウム、窒化セリウム、窒化亜鉛、窒化コバルト、窒化チタン、窒化タンタルなどの金属窒化物、チタン酸バリウムストロンチウム、ジルコニウムチタン酸鉛などの金属複合酸化物が挙げられる。これらは、１種または２種以上組み合わせて用いることができる。
このような絶縁膜１６０の平均厚さは、特に限定されないが、１０〜５０００ｎｍ程度であるのが好ましく、５０〜１０００ｎｍ程度であるのがより好ましい。絶縁膜１６０の厚さを前記範囲とすることにより、各電極１２１、１２２、１２３同士および配線１３０同士を、確実に絶縁することができる。
【００９９】
反応層１４０は、作用電極１２１表面側に検出対象物を特異的に捕捉する捕捉物８が担持されている。この反応層１４０は、当該捕捉物８と検出対象物である抗原３とが結合する機能を有する。
捕捉物８は、抗原３と特異的に反応するものであれば特に限定されないが、例えば、抗体が挙げられる。この抗体は、第１の化合物１の抗体と同様の抗体とすることができる。
【０１００】
捕捉物８を作用電極１２１に担持（固定化）するためには、例えば、ＥＬＩＳＡ法を利用することができる。その際、作用電極１２１表面に、捕捉物８を直接結合させるために、架橋剤を介することが好ましい。
このような架橋剤としては、作用電極１２１の金属表面へ結合し得る官能基と、捕捉物８と結合し得る官能基とを有するものであればよい。
【０１０１】
金属表面へ結合し得る官能基としては、硫黄（Ｓ）、メルカプト基（−ＳＨ）、ジスルフィド基（−Ｓ−Ｓ−）等が挙げられる。
捕捉物８と結合し得る基としては、カルボキシル基、酸ハライド、活性エステル（フタル酸イミドエステル、コハク酸イミドエステル等）等のカルボキシル基反応性誘導体等のアミド結合形成基、エステル結合形成基、チオエステル結合形成基等が挙げられる。
【０１０２】
次に、このようなバイオセンサー１００を用いた本発明の第２の検出方法を説明する。
第２の検出方法は、第１の化合物１と第２の化合物２とを反応させて酸化還元検出試薬４を調製する工程［Ｂ１］と、試料供給空間１５０に液体試料１５１を供給する工程［Ｂ２］と、酸化還元検出試薬４を液体試料１５１中に供給する工程［Ｂ３］と、酸化還元検出試薬４と抗原３との結合により生じる酸化還元電流の変化を検出する工程［Ｂ４］とを有する。
【０１０３】
［Ｂ１］酸化還元検出試薬調製工程
まず、第１の化合物１と第２の化合物２とを反応して酸化還元検出試薬４を調製する。
なお、以下の説明では酸化還元検出試薬４の結合部位を抗体４１、標識部位２２をフェロセン（酸化還元物質）４２として説明する。
酸化還元検出試薬４の調製は、例えば、第１の化合物１（化合物（２２））と標識部位２２にフェロセン４２を有する第２の化合物２（化合物（２５））とを、第１の検出方法と同様の条件で反応させることにより行う。
【０１０４】
【化２１】
（式中、ｎは３〜１５を示す。）
【０１０５】
これにより、酸化還元検出試薬４（化合物（２６））を調製した。
なお、第１の検出方法と同様に、酸化還元検出試薬４の重合度（紫外線照射時間）を制御することによって、抗体４１分子表面に第１の連結部１２を介して多数のフェロセン４２を導入することができる。
また、第１の検出方法と同様の方法により、化合物（２）と化合物（７）とを反応させて、酸化還元検出試薬４（化合物（２７））を得ることもできる。
【０１０６】
【化２２】
（式中、ｎは３〜１５を示す。）
【０１０７】
また、例えば、下記反応式に示すように、化合物（２８）と化合物（５）とを、第１の検出方法と同様に光重合反応することにより、酸化還元検出試薬４（化合物（２９））を調製することもできる。
【０１０８】
【化２３】
（式中、ｎは３〜１５を示す。）
【０１０９】
例えば、直径約１．５μｍの金微粒子を用いた場合、その表面積は約７×１０−１２ｍ２である。そのため、約０．５ｎｍ平方に表面バインディング分子（ＰＶ）が固定化されると仮定すると、単分子膜として表面には約３×１０７個の酸化還元物質４２が固定化される。そして、さらに増幅効果高めるために、アクリル酸エステル系のモノマー末端（エステル部）にＰＶを固定化したものと、酸化還元物質４２（フェロセンまたはオスミウムービピリジル錯体等）を固定化したものとでブロックポリマーを作成する。さらに、水溶性を高めるため、カルボン酸塩としてのポリマー部位も導入する。これにより、酸化還元検出試薬４を得ることができる。
【０１１０】
［Ｂ２］液体試料供給工程
図８（ａ）に示すように、液体試料１５１を試料供給空間１５０に供給する。
試料供給空間１５０に液体試料１５１を供給すると、反応層１４０と液体試料１５１が接触する。
反応層１４０と液体試料１５１とが接触すると、図８（ｂ）に示すように、反応層１４０の表面に存在する捕捉物８が液体試料１５１中に含まれる抗原３と反応し、結合する。
【０１１１】
このとき、作用電極１２１と対向電極１２２との間に、作用電極１２１側が高電位となるように電圧を印加しておくと、捕捉物８と抗原３との結合により、電流値が変化し、その変化を処理回路２００が検出する。
しかしながら、捕捉物８と抗原３とが結合しても感度が低い場合があり、処理回路２００が電流値の変化を十分に検出することができない場合がある。このような場合、抗原３の検出感度を上げるために、本発明の酸化還元検出試薬４（検出キット）が用いられる。
【０１１２】
［Ｂ３］酸化還元検出試薬供給工程
図８（ｃ）に示すように、捕捉物８と抗原３とが結合した液体試料１５１中に、酸化還元検出試薬４を供給する。
液体試料１５１中に酸化還元検出試薬４を供給すると、捕捉物８に結合している抗原３に酸化還元検出試薬４の抗体４１が接触する。
抗原３に抗体４１が接触すると、図８（ｄ）に示すように、抗原３と抗体４１とが反応し、結合する。
なお、酸化還元検出試薬４の供給量は、蛍光検出試薬５と同様である。
【０１１３】
［Ｂ４］抗原検出工程
作用電極１２１と対向電極１２２との間に、作用電極１２１側が高電位となるように電圧を印加しておくと、抗原３と抗体４１との結合による、酸化還元物質４２の酸化還元反応により酸化還元電流値が変化する。この酸化還元電流の変化を処理回路２００が検出することにより、抗原３を検出することができる。
また、液体試料１５１中の抗原３の濃度を測定する場合は、第１の検出方法と同様の方法で行うことができる。
【０１１４】
以上のような動作により、捕捉物８に結合した抗原３に酸化還元検出試薬４が結合した場合と結合していない場合とで酸化還元電流値が大きく変化するので、液体試料１５１中の抗原３の量を高感度に検出することができる。
なお、ポリマー鎖に１０００個程度の酸化還元物質４２（フェロセン分子）が存在する場合、約３×１０１０ 個のフェロセン分子が存在する。そのため、１個あたりのフェロセン分子のモル濃度は０．５×１０−１３ｍｏｌ／Ｌとなり、高感度の電気化学測定（ＣＶ測定）を行えばナノレベルにて抗体分子１個あたりの検出が可能となる。
【０１１５】
また、上記フェロセン（酸化還元）ポリマー修飾表面に別途、フェロセン修飾されたサイズの小さい金微粒子（１０ｎｍφ）を、例えば、静電的相互作用または化学結合によって導入させると、測定電流をさらに増幅できる。
例えば、金微粒子１個あたり、同様のフェロセンポリマー導入された状態にて約１６００個のフェロセンが存在し、これが例えば、抗原３に細密固定化できたとすると、５×１０４個の金微粒子が抗原３に存在する。これら固定化された全フェロセン分子数は約８×１０１１個となり約１．２×１０−１２ｍｏｌ／Ｌにて、さらに一桁検出感度が向上する。
このように、この機能性ポリマーによる抗体反応増幅手法によれば、原理的には１分子抗体反応の結果がモニター可能であり、計測速度及び感度向上に大きな効果が期待できる。
【０１１６】
［３］第３の検出方法
次に、本発明の検出キットを用いた検出対象物の第３の検出方法について説明する。
以下、第３の検出方法について説明するが、前記第２検出方法との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。
図９は、バイオセンサーを模式的に示す平面図、図１０は、図９に示すバイオセンサーのＢ−Ｂ線断面図。
なお、以下の説明では、図１０中の上側を「上」、下側を「下」と言う。
【０１１７】
第３の検出方法に用いられるバイオセンサー１００は、非捕捉状態と捕捉状態との違いを、反応層１４０の電流値の変化に基づいて検出するのに代えて、反応層１４０の質量変化に基づいて検出するよう構成した以外は、前記第２の検出方法と同様である。
すなわち、図９および図１０に示すバイオセンサー１００は、各検出部１１０に圧電素子１８０が設けられている。
【０１１８】
圧電素子１８０は、平板状の圧電体１８１と、その両側の面にそれぞれ設けられた上電極１８２、下電極１８３とで構成されている。各電極１８２、１８３は、それぞれ独立して、配線１３０、配線１３０を介して、処理回路２００と電気的に接続されている。
また、基板１２０には、凹部１２６が設けられている。この凹部１２６に下電極１８３（および上電極１８２）が対応するように、圧電体１８１の縁部が基板１２０に固定（固着）されている。
【０１１９】
各電極１８２および１８３の構成材料としては、それぞれ、前記作用電極１２１と同様の材料を用いることができる。
圧電体１８１の材料としては、例えば、水晶、ニオブ酸リチウム、タンタル酸リチウムおよびホウ酸リチウム等の圧電材料を用いることができる。なお、これらの材料は、単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて（例えば、積層体として）用いることができる。
【０１２０】
また、絶縁膜１６０は、開口部１６５を有し、この開口部１６５から上電極１８２が露出している。
そして、上電極１８２の上面には、反応層１４０が設けられている。
絶縁膜１６０および反応層１４０は、それぞれ、前記第２の検出方法で説明した絶縁膜１６０および反応層１４０と同様の構成とすることができ、前記第２の検出方法と同様にして形成することができる。
【０１２１】
次に、このようなバイオセンサー１００を用いた本発明の第３の検出方法を説明する。
［Ｃ１］検出試薬調製工程
Ｂ１工程と同様に行う。
［Ｃ２］液体試料供給工程
Ｂ２工程と同様に行う。
【０１２２】
［Ｃ３］酸化還元検出試薬供給工程
Ｂ３工程と同様に行う。
［Ｃ４］抗原検出工程
作用電極１２１と対向電極１２２との間に、作用電極１２１側が高電位となるように電圧を印加しておくと、抗原３と抗体４１との結合により、反応層１４０の質量が変化し、圧電素子１８０から検出される振動数も変化する。この振動数の変化を処理回路２００が検出することにより、抗原３を検出することができる。
以上のような動作により、捕捉物８に結合した抗原３に酸化還元検出試薬４が結合した場合と結合していない場合とで振動周波数が大きく変化するので、液体試料１５１中の抗原３の量を簡単に高感度に検出することができる。
【０１２３】
［４］第４の検出方法
次に、本発明の検出キットを用いた検出対象物の第４の検出方法について説明する。
図１１は、第４の検出方法を模式的に説明するための縦断面図である。
なお、以下の説明では、図１１中の上側を「上」、下側を「下」と言う。
本検出方法では、捕捉物８を作用電極１２１上に担持する代わりに、捕捉物８を粒状の担体１２４に担持した捕捉物担体７を用いている。
【０１２４】
まず、検出方法の説明に先立って、捕捉物担体７について説明する。
捕捉物担体７は、液体試料１５１中の抗原３を捕捉する機能を有する。
この捕捉物担体７の担体１２４は、本実施形態においては球状（粒状）に形成されている。これにより、試料溶液中１５１を少ない抵抗で移動するので、抗原３の検出を迅速に行うことができる。また、球状であることにより、表面積が大きくなるので、捕捉物８をより多く担体１２４の表面に担持することができる。
なお、担体１２４の形状は、球状に限定されず、角柱状、円柱状などであってもよい。
担体１２４を構成する材料は、特に限定されず、前述した基板１２０や作用電極１２１を構成する材料と同様のものが挙げられる。
【０１２５】
本検出方法は、このような捕捉物担体７を用いて抗原３を捕捉し、検出が行われる。しかし、捕捉物担体７は、電極を用いておらず、蛍光物質４２も有していない。そのため、捕捉物担体７が抗原３を捕捉しても抗原３を検出することは困難である。
そこで、本発明の検出キットにより得られる色調検出試薬６を用いて、抗原３の存在を検出する。
【０１２６】
次に、このような捕捉物担体７を用いた本発明の第４の検出方法を説明する。
第４の検出方法は、第１の化合物１と第２の化合物２とを反応させて色調検出試薬６を調製する工程［Ｄ１］と、試料供給空間１５０に液体試料１５１を供給する工程［Ｄ２］と、色調検出試薬６を液体試料１５１中に供給する工程［Ｄ３］と、色調検出試薬６と抗原３との結合により生じる色調の変化を検出する工程［Ｄ４］とを有する。
【０１２７】
［Ｄ１］色調検出試薬調製工程
まず、第１の化合物１と第２の化合物２とを反応して色調検出試薬６を調製する。
なお、以下の説明では色調検出試薬６の結合部位１１を抗体６１、標識部位２２を色素化合物６２として説明する。
色調検出試薬６の調製は、例えば、第１の化合物１（化合物（２２））と標識部位２２に色素化合物６２を有する第２の化合物２（化合物（３０））とを、第１の検出方法と同様の条件で反応させることにより行う。
【０１２８】
【化２４】
（式中、ｎは３〜１５を示す。）
これにより、色調検出試薬６（化合物（３１））を調製した。
【０１２９】
［Ｄ２］液体試料供給工程
まず、図１１（ａ）に示すように、液体試料１５１を反応容器１５２に供給する。
次に、図１１（ａ）に示すように、液体試料１５１（試料供給空間１５０）中に捕捉物担体７を供給する。
液体試料１５１中に捕捉物担体７を供給すると、抗原３と捕捉物担体７の捕捉物８とが接触する。
抗原３と捕捉物８とが接触すると、図１１（ｂ）に示すように、捕捉物担体７の捕捉物８が抗原３を捕捉し、結合する。
【０１３０】
［Ｄ３］色調検出試薬供給工程
次に、図１１（ｃ）に示すように、液体試料１５１中に色調検出試薬６を供給する。
液体試料１５１中に色調検出試薬６を供給すると、捕捉物担体７の捕捉物８に結合している抗原３に色調検出試薬６の抗体６１が接触する。
抗原３に抗体６１が接触すると、図１１（ｄ）に示すように、抗原３と抗体６１とが反応し、結合する。
【０１３１】
このとき、色調検出試薬６は標識部位２２に色素化合物６２を有するため、抗原３に色調検出試薬６と捕捉物担体７とが結合した抗原捕捉物９の色調は、当該色素化合物６２の色調に変色する。
なお、色調検出試薬６の液体試料１５１に対する比重は、１ｇ／ｃｍ３以下であることが好ましい。
【０１３２】
［Ｄ４］抗原検出工程
液体試料１５１中に含まれていた抗原３は、捕捉物担体７との結合により不溶化し、そして、色調検出試薬６との結合により抗原捕捉物９となって色調が変化する。
抗原捕捉物９は、液体試料１５１に対する比重が大きくなるので、時間の経過とともに除々に液体試料空間１５０の下部へと沈降し、凝集していく。そのため、反応容器１５２を外部から視認したとき、色調も除々に反応容器１５２の下部へと移動する。
【０１３３】
そして、図１１（ｅ）に示すように、抗原捕捉物９が反応容器１５２の底部に到達し、抗原捕捉物９の全てが凝集沈殿する。
このとき、反応容器１２５中の色調は、反応容器１５２内の下端部では抗原捕捉物９の色素化合物６２の色調が認められ、反応容器１５２内の上方側では液体試料１５１の色調、例えば、無色透明が認められる。
【０１３４】
以上のような方法により、捕捉物担体７に結合した抗原３が色調検出試薬６に結合することにより、色調が変化するので、液体試料１５１中の抗原３の存在を高感度に検出することができる。
なお、液体試料１５１中の抗原３の濃度を測定する場合は、第１の検出方法と同様の方法で行うことができる。
【０１３５】
［５］第５の検出方法
次に、本発明の検出キットを用いた検出対象物の第５の検出方法について説明する。
図１２は、第５の検出方法を模式的に説明する縦断面斜視図である。
なお、以下の説明では、図１２中の上側を「上」、下側を「下」と言う。
以下、第５の検出方法について説明するが、前記第１の検出方法との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。
本検出方法は、ウェル１２５を有する基板１２０を用いて行う。
基板１２０は、複数のウェル１２５を有している。そして、そのウェル１２５の底面に捕捉物８が担持されている。
抗原３の検出は、第２の検出方法と同様の方法で行われる。しかし、ウェル１２５が電極を有していない場合には、例えば、第１の検出方法と同様に、蛍光により検出される。
以上、本発明の検出キットを説明したが、本発明はこれに限定されるものでない。
例えば、本発明の検出キットでは、各部の構成は、同様の機能を発揮する任意の構成のものに置換することができ、また、任意の構成を付加することもできる。
【符号の説明】
【０１３６】
１……第１の化合物 １１……結合部位 １２……第１の反応部位 １３……第１の連結部位 １３ａ……粒子 ２……第２の化合物 ２１……第２の反応部位 ２２……標識部位 ２３……第２の連結部位 ３……抗原 ４……酸化還元検出試薬 ４１……抗体 ４２……酸化還元物質 ５……蛍光検出試薬 ５１……抗体 ５２……蛍光物質 ６……色調検出試薬 ６１……抗体 ６２……色素化合物 ７……捕捉物担体 ８……捕捉物 ９……抗原捕捉物 １００……バイオセンサー １０１……測定装置 １０２……演算装置 １１０……検出部 １２０……基板 １２１……作用電極 １２２……対向電極 １２３……参照電極 １２４……担体 １２５……ウェル １２６……凹部 １３０……配線 １３１……コネクタ １３２……配線 １４０……反応層 １５０……試料供給空間 １５１……液体試料 １５２……反応容器 １６０……絶縁膜 １６５……開口部 １８０……圧電体素子 １８１……圧電体 １８２……上電極 １８３……下電極 １９０……基体 ２００……処理回路
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出対象物を選択的に検出し得る検出キットであって、
前記検出対象物と特異的に結合する結合部位と、反応性を有する第１の反応部位とを含む第１の化合物と、
前記第１の反応部位と反応する第２の反応部位と、標識部位とを含む第２の化合物とを有し、
前記第１の化合物と前記第２の化合物とを反応させることにより、前記第１の反応部位と前記第２の反応部位とを連結させることを特徴とする検出キット。
【請求項２】
前記結合部位は、抗原または抗体である請求項１に記載の検出キット。
【請求項３】
前記第１の反応部位および前記第２の反応部位は、それぞれ重合性基で構成されている請求項１または２に記載の検出キット。
【請求項４】
前記第１の化合物は、前記結合部位と前記第１の反応部位との間に、前記結合部位と前記第１の反応部位とを連結する第１の連結部位を有する請求項１ないし３のいずれかに記載の検出キット。
【請求項５】
前記第１の連結部位は、粒子を含むものである請求項４に記載の検出キット。
【請求項６】
前記粒子の表面に、前記結合部位および／または前記第１の反応部位が複数結合している請求項５に記載の検出キット。
【請求項７】
前記粒子に結合する前記結合部位および前記第１の反応部位の存在比は、前記結合部位を［Ａ］、前記第１の反応部位を［Ｂ］としたとき、Ａ／Ｂが０．１〜１．０である請求項６に記載の検出キット。
【請求項８】
前記標識部位は、酸化還元物質、蛍光物質および色素化合物の少なくとも１種で構成される請求項１ないし７のいずれかに記載の検出キット。
【請求項９】
前記標識部位を複数有する請求項１ないし８のいずれかに記載の検出キット。
【請求項１０】
前記第２の化合物は、前記第２の反応部位と前記標識部位との間に、前記第２の反応部位と前記標識部位とを連結する第２の連結部位を有する請求項１ないし９のいずれかに記載の検出キット。
【請求項１１】
さらに、検出対象物を選択的に捕捉し得る捕捉物が担持された基体を有する請求項１ないし１０のいずれかに記載の検出キット。
【請求項１２】
前記基体は、ウェルを備え、
当該ウェルの内面に前記捕捉物が担持されている請求項１１に記載の検出キット。
【請求項１３】
前記基体は、粒状に形成されている請求項１１または１２に記載の検出キット。
【請求項１】
検出対象物を選択的に検出し得る検出キットであって、
前記検出対象物と特異的に結合する結合部位と、反応性を有する第１の反応部位とを含む第１の化合物と、
前記第１の反応部位と反応する第２の反応部位と、標識部位とを含む第２の化合物とを有し、
前記第１の化合物と前記第２の化合物とを反応させることにより、前記第１の反応部位と前記第２の反応部位とを連結させることを特徴とする検出キット。
【請求項２】
前記結合部位は、抗原または抗体である請求項１に記載の検出キット。
【請求項３】
前記第１の反応部位および前記第２の反応部位は、それぞれ重合性基で構成されている請求項１または２に記載の検出キット。
【請求項４】
前記第１の化合物は、前記結合部位と前記第１の反応部位との間に、前記結合部位と前記第１の反応部位とを連結する第１の連結部位を有する請求項１ないし３のいずれかに記載の検出キット。
【請求項５】
前記第１の連結部位は、粒子を含むものである請求項４に記載の検出キット。
【請求項６】
前記粒子の表面に、前記結合部位および／または前記第１の反応部位が複数結合している請求項５に記載の検出キット。
【請求項７】
前記粒子に結合する前記結合部位および前記第１の反応部位の存在比は、前記結合部位を［Ａ］、前記第１の反応部位を［Ｂ］としたとき、Ａ／Ｂが０．１〜１．０である請求項６に記載の検出キット。
【請求項８】
前記標識部位は、酸化還元物質、蛍光物質および色素化合物の少なくとも１種で構成される請求項１ないし７のいずれかに記載の検出キット。
【請求項９】
前記標識部位を複数有する請求項１ないし８のいずれかに記載の検出キット。
【請求項１０】
前記第２の化合物は、前記第２の反応部位と前記標識部位との間に、前記第２の反応部位と前記標識部位とを連結する第２の連結部位を有する請求項１ないし９のいずれかに記載の検出キット。
【請求項１１】
さらに、検出対象物を選択的に捕捉し得る捕捉物が担持された基体を有する請求項１ないし１０のいずれかに記載の検出キット。
【請求項１２】
前記基体は、ウェルを備え、
当該ウェルの内面に前記捕捉物が担持されている請求項１１に記載の検出キット。
【請求項１３】
前記基体は、粒状に形成されている請求項１１または１２に記載の検出キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２０１１−２０９３０７（Ｐ２０１１−２０９３０７Ａ）
【公開日】平成２３年１０月２０日（２０１１．１０．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１６７２５２（Ｐ２０１１−１６７２５２）
【出願日】平成２３年７月２９日（２０１１．７．２９）
【分割の表示】特願２００７−８０３６７（Ｐ２００７−８０３６７）の分割
【原出願日】平成１９年３月２６日（２００７．３．２６）
【出願人】（０００００２３６９）セイコーエプソン株式会社 (51,324)
【公開日】平成２３年１０月２０日（２０１１．１０．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年７月２９日（２０１１．７．２９）
【分割の表示】特願２００７−８０３６７（Ｐ２００７−８０３６７）の分割
【原出願日】平成１９年３月２６日（２００７．３．２６）
【出願人】（０００００２３６９）セイコーエプソン株式会社 (51,324)
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