機能性高分子複合体の製造方法
【課題】様々な機能性分子を任意にナノメートルオーダーの距離で配列させること、溶液中での機能性分子間の距離を一定に設定して制御すること、機能性分子間の距離を長い距離で安定に保つこと、機能性高分子の種類の組み合わせを容易に変えることができること、任意の溶液中で機能性分子の機能を損なうことなく簡便にスペーサー分子に結合させることができること、機能性分子間の距離が長い機能性高分子複合体を簡便に、高い収率で製造すること等の少なくとも１つを可能にする、機能性高分子複合体の製造方法を提供すること。
【解決手段】生体高分子に対する結合活性を有する少なくとも２つの機能性分子を、核酸又はその誘導体を含有した連結可能なスペーサー構造を介して連結させることを特徴とする、機能性高分子複合体の製造方法。
【解決手段】生体高分子に対する結合活性を有する少なくとも２つの機能性分子を、核酸又はその誘導体を含有した連結可能なスペーサー構造を介して連結させることを特徴とする、機能性高分子複合体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、同一種の機能性分子又は異なる種の少なくとも２つの機能性分子が核酸スペーサーを介して連結した機能性高分子複合体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
物質の評価、医療等の用途に細胞を利用する場合、細胞本来の性質を再現させるために、生体外、すなわち、人工的な基材の上で、細胞の機能、例えば、接着、増殖、分化、未分化、細胞死等を精緻に制御する技術が必要となる。本来の性質を失った細胞の使用は、例えば、薬物の作用の誤った解釈、移植した細胞の生体に対する不適合等を招く場合があるという欠点がある。そのため、人工基材を種々改変する試みが活発になされている。その際に、細胞、特に、細胞表面受容体が認識できる細胞接着性の機能性分子が重要な機能を担うことになる。
【０００３】
機能性分子として、生体内から抽出した細胞外マトリクスであるコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン等を用いて、人工基材を被覆し、生体内と同等の環境を再現することで細胞機能を制御する研究が古くから行われている（例えば、非特許文献１、２参照）。また、機能性分子として、ホルモンやサイトカインを用いて、人工基材を被覆する方法を利用することによっても、生体内と同等の環境を再現することで細胞機能を制御する研究がなされている（例えば、非特許文献３参照）。
【０００４】
しかし、抽出した細胞外マトリクスによって細胞の機能を制御する方法では、生体内から精製できる細胞外マトリクスの種類が実質的に限られること、微量の抽出困難な細胞外マトリクスを用いることが実質的にできないこと、純度や不純物等の影響により再現性の高い結果を得ることが困難であること等の欠点がある。そのため、それぞれの細胞の、それぞれの機能に見合った環境を、人工基材上に設計して再構成することは困難であるのが現状である。
【０００５】
そこで、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン等の細胞外マトリクスに含まれたアミノ酸配列を有し、かつ細胞表面受容体が認識できる合成ペプチド分子を機能性分子として用い、密度及び種類を種々変更して人工基材上に被覆して細胞機能を制御する試みもなされている（例えば、非特許文献４、５）。
【０００６】
前記機能性分子を配列させる方法の１つとして、ナノメーターの長さを有する高分子スペーサーにより機能性分子同士を連結する技術（スペーサー法）が報告されている。
【０００７】
例えば、ダイ（Ｗ．Ｄａｉ）らは、フィブロネクチン中に含まれる配列であって、細胞表面受容体との相互作用に関与するアミノ酸配列から構成される機能性分子であるＲＧＤ分子同士又はラミニン中のアミノ酸配列から構成される機能性分子であるＹＩＧＳＲ分子同士を、平均分子量約３５００のポリエチレングリコール鎖を介して、結合させ、細胞凝集剤を製造することを報告している（例えば、非特許文献６参照）。
【０００８】
また、川崎らは、フィブロネクチン中に含まれるアミノ酸配列から構成される機能性分子であるＲＧＤ分子と、そのシナジー配列であるＰＨＳＲＮ分子とを、平均分子量約２５００〜約３４００のポリエチレングリコール鎖を介して結合させ、ヘテロリガンド分子を製造することを報告している（非特許文献７及び８参照）。同様に、フィブロネクチン中のアミノ酸配列から構成される機能性分子であるＲＧＤとＥＩＬＤＶとを結合させ、あるいはラミニン中の機能性分子であるＰＤＳＧＲとＹＩＧＳＲとを結合させ、分子を製造することが報告されている（例えば、非特許文献９及び１０参照）。
【非特許文献１】ＰＰ．Ｌａｎｚａ，Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ，Ｊ．Ｖａｃａｎｔｉ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（２０００）
【非特許文献２】小出輝、林利彦 編、細胞外マトリクス−基礎と臨床−、愛智出版（２０００）
【非特許文献３】Ｙ．Ｉｔｏ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０，２３３３（１９９９）
【非特許文献４】Ｕ．Ｈｅｒｓｅｌ，Ｃ．Ｄａｈｍｅｎ，Ｈ．Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２４，４３８５（２００３）
【非特許文献５】Ｈ．Ｓｈｉｎ，Ｓ．Ｊｏ，ＡＧ．Ｍｉｋｏｓ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２４，４３５３（２００３）
【非特許文献６】Ｗ．Ｄａｉ，Ｊ．Ｂｅｌｔ，ＷＭ．Ｓａｌｔｚｍａｎ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２，７９７−８０１（１９９４）
【非特許文献７】Ｓ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｙ．Ｋａｎｅｄａ，Ｎ．Ｏｋａｄａ，Ｓ．Ｎａｋａｇａｗａ，Ｋ．Ｋｕｂｏ，Ｓ．Ｉｎｏｕｅ，Ｍ．Ｍａｅｄａ，Ｙ．Ｙａｍａｓｈｉｒｏ，Ｋ．Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｔ．Ｍａｙｕｍｉ，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ，５，４２４−４２８（１９９４）
【非特許文献８】Ｙ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．Ｈｏｊｏ，Ｉ．Ｏｋａｚａｋｉ，Ｈ．Ｋａｍａｔａ，Ｍ．Ｓａｓａｋｉ，Ｍ．Ｍａｅｄａ，Ｍ．Ｎｏｍｉｚｕ，Ｙ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｓ．Ｎａｋａｇａｗａ，Ｔ．Ｍａｙｕｍｉ，Ｋ．Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．５０（９），１２２９−１２３２（２００２）
【非特許文献９】Ｍ．Ｍａｅｄａ，Ｙ．Ｉｚｕｎｏ，Ｋ．Ｋａｗａｓａｋｉ，ｙ．Ｋａｎｅｄａ，ｙ．Ｍｕ，ｙ．Ｔｓｕｔｓｕｍｉ，ＫＷ．Ｌｅｍ，Ｔ．Ｍａｙｕｍｉ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２４１，５９５−５９８（１９９７）
【非特許文献１０】Ｍ．Ｍａｅｄａ，Ｋ．Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｙ．Ｍｕ，Ｈ．Ｋａｍａｄａ，Ｙ．Ｔｓｕｔｓｕｍｉ，ＴＪ．Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｍａｙｕｍｉ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２４８，４８５−４８９（１９９８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、１つの側面では、様々な機能性分子を任意にナノメートルオーダーの距離で配列させること、溶液中での機能性分子間の距離を一定に設定して制御すること、機能性分子間の距離を長い距離で安定に保つこと、機能性高分子の種類の組み合わせを容易に変えることができること、任意の溶液中で機能性分子の機能を損なうことなく簡便にスペーサー分子に結合させることができること、機能性分子間の距離が長い機能性高分子複合体を簡便に、高い収率で製造すること等の少なくとも１つを可能にする、機能性高分子複合体の製造方法を提供することにある。なお、本発明の他の課題は、本明細書の記載等から明らかである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
すなわち、本発明は、
〔１〕 （Ｉ）生体高分子に対する結合活性を有する機能性分子と、該機能性分子に対する結合性部位を少なくとも１つ有する核酸又はその誘導体からなるスペーサーとを結合させて予備的機能性高分子（Ａ）を得る工程、
（ＩＩ）工程（Ｉ）で得られた予備的機能性高分子（Ａ）と、該予備的機能性高分子（Ａ）に含まれるスペーサーに対して相補性を有するスペーサーとを対合させ、予備的機能性高分子複合体（Ｂ）を得る工程、及び
（ＩＩＩ）工程（ＩＩ）で得られた予備的機能性高分子複合体（Ｂ）の少なくとも２種を連結させる工程
を含む、少なくとも２つの機能性分子を有する機能性高分子複合体の製造方法、
〔２〕 （Ｉ）生体高分子に対する結合活性を有する機能性分子に対する結合性部位を少なくとも１つ有する核酸又はその誘導体からなるスペーサーと、該スペーサーに対して相補性を有するスペーサーとを対合させ、予備的高分子複合体（Ｃ）を得る工程、
（ＩＩ）工程（Ｉ）で得られた予備的高分子複合体（Ｃ）と、機能性分子とを結合させ、予備的機能性高分子複合体（Ｂ）を得る工程、及び
（ＩＩＩ）工程（ＩＩ）で得られた予備的機能性高分子複合体（Ｂ）の少なくとも２種を連結させる工程
を含む、少なくとも２つの機能性分子を有する機能性高分子複合体の製造方法、並びに
〔３〕 （Ｉ）生体高分子に対する結合活性を有する機能性分子に対する結合性部位を少なくとも１つ有する核酸又はその誘導体からなるスペーサーと、該スペーサーに対して相補性を有するスペーサーとを対合させ、予備的高分子複合体（Ｃ）を得る工程、
（ＩＩ）工程（Ｉ）で得られた予備的高分子複合体（Ｃ）の少なくとも２種を連結させ、高分子複合体（Ｄ）を得る工程、及び
（ＩＩＩ）工程（ＩＩ）で得られた高分子複合体（Ｄ）に少なくとも２種の機能性分子を結合させる工程
を含む、少なくとも２つの機能性分子を有する機能性高分子複合体の製造方法
に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の機能性高分子複合体の製造方法によれば、様々な機能性分子を任意にナノメートルオーダーの距離で配列させることができるという優れた効果を奏する。また、本発明の機能性高分子複合体の製造方法によれば、機能性分子の位置関係をナノメートルオーダーで一定に制御された機能性高分子複合体を得ることができるという優れた効果を奏する。また、本発明の製造方法によれば、機能性分子間の距離が長い機能性高分子複合体を簡便に、高い収率で製造することができるという優れた効果を奏する。したがって、本発明の製造方法により得られた機能性高分子複合体によれば、機能性分子の位置関係がナノメートルオーダーで規定可能であり、本発明の製造方法により得られた機能性高分子複合体は、生体分子内あるいは生体分子間の距離を正確に推定する際に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本明細書において、ペプチドのアミノ酸配列は、慣用の生化学命名法に準拠したアミノ酸の１文字表記又は３文字表記により表される場合がある。かかる表記とアミノ酸との対応関係を以下に示す。Ａ又はＡｌａ：アラニン残基；Ｄ又はＡｓｐ：アスパラギン酸残基；Ｅ又はＧｌｕ：グルタミン酸残基；Ｆ又はＰｈｅ：フェニルアラニン残基；Ｇ又はＧｌｙ：グリシン残基；Ｈ又はＨｉｓ：ヒスチジン残基；Ｉ又はＩｌｅ：イソロイシン残基；Ｋ又はＬｙｓ：リジン残基；Ｌ又はＬｅｕ：ロイシン残基；Ｍ又はＭｅｔ：メチオニン残基；Ｎ又はＡｓｎ：アスパラギン残基；Ｐ又はＰｒｏ：プロリン残基；Ｑ又はＧｌｎ：グルタミン残基；Ｒ又はＡｒｇ：アルギニン残基；Ｓ又はＳｅｒ：セリン残基；Ｔ又はＴｈｒ：スレオニン残基；Ｖ又はＶａｌ：バリン残基；Ｗ又はＴｒｐ：トリプトファン残基；Ｙ又はＴｙｒ：チロシン残基；Ｃ又はＣｙｓ：システイン残基。
【００１３】
本発明は、１つの側面では、生体高分子に対する結合活性を有する少なくとも２つの機能性分子を、核酸又はその誘導体を含有した連結可能なスペーサー構造を介して連結させることを特徴とする、機能性高分子複合体の製造方法に関する。
【００１４】
本発明の製造方法は、機能性高分子複合体の製造に際して、核酸又はその誘導体を含有したスペーサー構造が用いられていることに１つの大きな特徴がある。
【００１５】
従って、本発明の製造方法によれば、様々な機能性分子を、所望の間隔で制御して配列させることができるという優れた効果を発揮する。また、本発明の製造方法によれば、前記機能性分子間の位置関係をナノメートルオーダーで実質的に一定に制御された機能性高分子複合体を得ることができるという優れた効果を発揮する。
【００１６】
また、本発明の製造方法は、機能性高分子複合体の製造に際して、連結可能なスペーサー構造が用いられていることにも１つの大きな特徴がある。
【００１７】
従って、本発明の製造方法によれば、様々な機能性分子を、所望の間隔で制御して、より容易に配列させることができるという優れた効果を発揮する。さらに、本発明の製造方法によれば、前記機能性分子間の位置関係をナノメートルオーダーで実質的に一定に制御して、機能性高分子複合体を作製することができるという優れた効果を発揮する。
【００１８】
本発明の製造方法では、機能性高分子複合体の製造に際して、互いに同一又は異なる少なくとも２つのスペーサー構造が用いられていることにも１つの特徴がある。
【００１９】
従って、本発明の製造方法によれば、前記スペーサー構造を介して、２つ以上の機能性分子を連結することができるという優れた効果を発揮する。
【００２０】
さらに、本発明の製造方法は、機能性高分子複合体の製造に際して、スペーサー構造を連結することに１つの大きな特徴がある。
【００２１】
従って、本発明の製造方法によれば、機能性分子間の距離が長い機能性高分子複合体を高い収率で製造することができるという優れた効果を発揮する。また、本発明の製造方法によれば、機能性分子間の距離が長い機能性高分子複合体を簡便に製造することができるという優れた効果を発揮する。
【００２２】
本発明の製造方法によれば、互いに異なる核酸鎖に少なくとも１つの機能性分子が配置された構造を有する機能性高分子複合体〔「機能性高分子複合体１」ともいう；例えば、図１の（Ａ）等参照〕、又は一方の一本鎖の核酸鎖上に少なくとも２つの機能性分子が配置され、かつ他方の一本鎖の核酸鎖上には存在しない構造を有する機能性高分子複合体〔「機能性高分子複合体２」ともいう；例えば、図１の（Ｂ）等参照〕を得ることができる。
【００２３】
本明細書において、前記「スペーサー構造」とは、２つ以上の機能性分子を連結するために使用されている構造体をいう。具体的には、本発明において、スペーサー構造は、機能性分子に対する結合活性を少なくとも１つ有する核酸又はその誘導体からなるスペーサーと、該スペーサーに対して相補性を有するスペーサー（本発明において、相補スペーサーともいう）とから構成される。
【００２４】
前記スペーサー構造は、連結可能な末端形状を有している。前記末端形状は、いわゆる突出末端であってもよく、平滑末端であってもよい。機能性分子間の距離を、より容易に制御する観点から、前記末端形状は突出末端であることが望ましい。
【００２５】
なお、本明細書において、機能性分子に対する結合活性を少なくとも１つ有する核酸又はその誘導体からなるスペーサー及び相補スペーサーを、「核酸スペーサー」ともいう。
【００２６】
本発明の機能性高分子複合体の製造方法において、機能性分子の種類、数、機能性分子間の距離等は、目的に応じて選択されうる。
【００２７】
本明細書において、前記「機能性分子」とは、生体高分子との間で結合活性を有する、合成又は天然の分子をいう。ここで、前記生体高分子としては、例えば、細胞、細胞外マトリクス、細胞間接着の受容体、その他各種生体組織表面におけるタンパク質、ホルモン、サイトカイン（増殖因子）、抗体、糖質等が挙げられる。
【００２８】
前記機能性分子の結合活性は、例えば、表面プラズモン解析、ゲルシフトアッセイ、ファージディスプレイ法等により、評価されうる。例えば、表面プラズモン解析による結合活性の評価は、生体高分子を固定化したチップに、評価対象の機能性分子を含有した溶液を、一定の流速で、送液し、適切な検出手段により相互作用を検出することにより行われうる。前記検出手段としては、例えば、蛍光強度、蛍光偏向度等による光学的検出手段；マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）、エレクトロスプレー・イオン化質量分析計（ＥＳＩ−ＭＳ）等の質量分析計；これらの組み合わせ等が挙げられる。ここで、機能性分子と生体高分子とからなる複合体の形成を示すセンサーグラムが呈示された場合、該機能性分子が結合活性を有することの指標となる。
【００２９】
本発明の製造方法においては、前記「少なくとも２つの機能性分子」は、互いに同一又は異なる機能性分子であってもよい。
【００３０】
本発明の製造方法に用いられる機能性分子は、化学的に誘導体化されたものであってもよい。
【００３１】
また、本明細書において、前記「受容体」とは、細胞に存在し、各種の生理活性物質を特異的に認識し、該生理活性物質の作用を伝達し発現する生体高分子をいう。前記受容体としては、例えば、細胞内に存在する受容体（以下、細胞内受容体ともいう）、形質膜上に存在する受容体（以下、細胞表面受容体ともいう）等が挙げられる。
【００３２】
細胞外マトリクスとしては、例えば、コラーゲン（例えば、プロコラーゲン等）、エラスチン、フィブロイン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、エンタクチン、テネイシン、アグリン、アンカリン、トロンボスポンジン、エンタクチン、オステオポンチン、オステオカルシン、フィブリノーゲン、プロテオグリカン等が挙げられる。また、前記プロテオグリカンとしては、例えば、アグリカン、アグリン、パールカン、デュリン、フィブロモジュリン、ブレビカン等が挙げられる。
【００３３】
なお、本発明の製造方法においては、前記細胞外マトリクスに由来する一部分の構造、すなわち、生体内の細胞マトリクスの断片又は該断片に対応する合成ペプチドを、機能性分子として用いてもよい。
【００３４】
前記「生体内の細胞マトリクスの断片」とは、細胞外マトリクスの一部分を化学的又は酵素的に切断し精製後に得られる、ある特定の細胞表面受容体が結合可能な精製断片をいう。前記生体内の細胞マトリクスの断片としては、特に限定されないが、例えば、ＣＮＢｒ処理されて得られるＩ型コラーゲンの精製断片（例えば、WD. Staatz, JJ. Walsh, T. Pexton, SA. Santoro, J. Biol. Chem., 265(9), 4778-4781(1990)に記載の断片等）；ＣＮＢｒやさらに必要に応じてトリプシン、サーモライシン、コラゲナーゼ等のプロテアーゼで処理をしたＩＶ型コラーゲンの精製断片（例えば、JA. Eble, R. Golbik, K. Mann, K. Kuhn, EMBO J., 12(12), 4795-4802(1993) に記載の方法により得られる三重らせん構造を有する断片；EC. Tsilibary, AS. Charonis, J. Cell. Biol., 103(6), 2467-2473(1986)に記載の方法により得られるＮＣ１ドメイン等）、フィブロネクチンをトリプシン又はペプシン等のプロテアーゼで処理することにより得られる細胞接着性の断片（例えば、SK. Akiyama, E. Hasegawa, T. Hasegawa, KM. Yamada, J. Biol. Chem., 260(24), 13256-13260(1985)参照）等が挙げられる。
【００３５】
また、前記「生体内の細胞マトリクスの断片に対応する合成ペプチド」とは、細胞外マトリクスに含まれるアミノ酸配列を含有し、かつある特定の細胞表面受容体が結合できる最小のアミノ酸配列の単位を有する化学的に合成されたオリゴペプチドをいう。
【００３６】
本発明において機能性分子として利用されうる全てのペプチドには、目的に応じて付加的なアミノ酸残基がそのＮ末端側及び／又はＣ末端側に結合していてもよい。
【００３７】
また、本発明において機能性分子として利用されうる合成ペプチドには、目的に応じて非天然型アミノ酸、化学的な修飾基、Ｌ体及びＤ体のアミノ酸のどちらか一方又はその両方等が含まれていてもよい。
【００３８】
前記合成ペプチドとしては、特に限定されないが、例えば、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、コラーゲン、トロンボスポンジン等に共通して含まれ、受容体が結合する最小のアミノ酸配列の単位として、アミノ酸が３個結合したＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列等が挙げられる。
【００３９】
前記ＲＧＤ配列を含む直鎖状の合成ペプチドであって、本発明において、機能性分子として用いうるペプチドのアミノ酸配列としては、具体的には、特に限定されないが、例えば、ＲＧＤ、ＲＧＤＳ、ＲＧＤＶ、ＲＧＤＴ、ＲＧＤＦ、ＧＲＧＤ、ＧＲＧＤＧ、ＧＲＧＤＳ、ＧＲＧＤＦ、ＧＲＧＤＹ、ＧＲＧＤＶＹ、ＧＲＧＤＹＰＣ、ＧＲＧＤＳＰ、ＧＲＧＤＳＧ、ＧＲＧＤＮＰ、ＧＲＧＤＳＹ、ＧＲＧＤＳＰＫ、ＹＲＧＤＳ、ＹＲＧＤＧ、ＹＧＲＧＤ、ＣＧＲＧＤＳＹ、ＣＧＲＧＤＳＰＫ、ＹＡＶＴＧＲＧＤＳ、ＲＧＤＳＰＡＳＳＫＰ（配列番号：１）、ＧＲＧＤＳＰＡＳＳＫＧ（配列番号：２）、ＧＣＧＹＧＲＧＤＳＰＧ（配列番号：３）、及びＧＧＧＰＨＳＲＮＧＧＧＧＧＧＲＧＤＧ（配列番号：４）等が挙げられる。
【００４０】
また、ＲＧＤ配列を含むペプチドを環状にすることで、受容体への結合活性を制御した機能性分子も本発明に利用することができる。
【００４１】
前記環状ペプチドとしては、特に限定されないが、例えば、ＧＰｅｎ＊ＧＲＧＤＳＰＣ＊Ａ、ＧＡＣ＊ＲＧＤＣ＊ＬＧＡ、ＡＣ＊ＲＧＤＧＷＣ＊Ｇ、シクロ（ＲＧＤｆ（ＮＭｅ）Ｖ）、シクロ（ＲＧＤｆＶ）、シクロ（ＲＧＤｆＫ）、シクロ（ＲＧＤＥｖ）、シクロ（ＧＲＧＤｆＬ）、シクロ（ＡＲＧＤｆＶ）、シクロ（ＧＲＧＤｆＶ）等が挙げられる。なお、ペプチド配列を示すアミノ酸一文字表記に含まれる小文字は、Ｄ−アミノ酸を示す。また、前記「Ｐｅｎ」は、ペニシラミンを示し、「＊」は、分子内でジスルフィド結合をしたシステイン残基を示す。以下も同様である。
【００４２】
本発明の製造方法では、前記ＲＧＤ配列以外にも種々の細胞外マトリクスに由来する最小のアミノ酸配列の単位を利用することができる。
【００４３】
細胞外マトリクスの１つであるフィブロネクチン由来の最小アミノ酸配列としては、特に限定されないが、例えば、ＮＧＲ、ＬＤＶ、ＲＥＤＶ、ＥＩＬＤＶ、ＫＱＡＧＤＶ等の配列が挙げられる。
【００４４】
また、細胞外マトリクスの１つであるラミニン由来の最小アミノ酸配列としては、特に限定されないが、例えば、ＬＲＧＤＮ、ＩＫＶＡＶ、ＹＩＧＳＲ、ＣＤＰＧＹＩＧＳＲ、ＰＤＳＧＲ、ＹＦＱＲＹＬＩ、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＡ（配列番号：５）等の配列が挙げられる。また、ラミニン由来の最小アミノ酸配列には、例えば、野水基義、蛋白質 核酸 酵素、第４５巻、１５号、２４７５−２４８２（２０００）等に記載の細胞接着活性のあるペプチドの配列等も包含される。前記細胞接着活性のあるペプチドの配列としては、例えば、ラミニンのα１鎖に由来するＲＱＶＦＱＶＡＹＩＩＩＫＡ（配列番号：６）、α１鎖Ｇドメインに由来するＲＫＲＬＱＶＱＬＳＩＲＴ（配列番号：７）等が挙げられる。
【００４５】
同様に、細胞外マトリクスの１つであるＩ型コラーゲン由来の最小アミノ酸配列としては、特に限定されないが、例えば、ＤＧＥＡ、ＫＤＧＥＡ及びＧＰＡＧＧＫＤＧＥＡＧＡＱＧ（配列番号：８）、ＧＥＲ、ＧＦＯＧＥＲ等の配列が挙げられる。
【００４６】
さらに、細胞外マトリクスの１つであるエラスチン由来の最小アミノ酸配列としては、特に限定されないが、例えば、ＶＡＰＧ、ＶＧＶＡＰＧ、ＶＡＶＡＰＧ等の配列が挙げられる。
【００４７】
さらに、細胞外マトリクスの１つであるトロンボスポンジン由来の最小アミノ酸配列としては、ＶＴＸＧ等の配列が挙げられる。
【００４８】
前記最小のアミノ酸配列の単位は、機能性分子として用いられる合成ペプチドに含有させることができる。
【００４９】
また、本発明の製造方法においては、前記機能性分子は、細胞外マトリクスに由来するもの以外の物質であってもよい。具体的には、単純に受容体に結合する物質、例えば、低分子物質として人工的に設計して合成された物質を、機能性分子として用いてもよい。
【００５０】
前記受容体に結合する物質は、細胞外マトリクスに由来する一部分の構造モチーフを含むものであってもよく、該構造モチーフを含まないものであってもよい。前記物質としては、例えば、α５β１インテグリンに対するリガンド分子として、Ｃ＊ＲＲＥＴＡＷＡＣ＊のペプチド等、α６β１インテグリンに対するリガンド分子として、ＶＳＷＦＳＲＨＲＹＳＰＦＡＶＳ（配列番号：９）のペプチド等、αＭβ２インテグリンに対するリガンド分子として、ＧＹＲＤＧＹＡＧＰＩＬＹＮ（配列番号：１０）のペプチド等が挙げられる。
【００５１】
さらに、本発明の製造方法においては、GA. Sulyok, C. Gibson, SL. Goodman, G. Holzemann, M. Wiesner, H. Kessler, J. Med. Chem., 44(12), 1938-1950(2001)等に記載されているような非ペプチド性の低分子物質であって、受容体に結合する低分子物質も機能性分子として利用可能である。
【００５２】
また、受容体のうち、例えば、シンデカン、ＮＧ２、ＣＤ４４等の受容体は、プロテオグリカンを含有することから、前記受容体中のアミノ酸配列を含有し、プロテオグリカンに対して結合するペプチドを機能性分子として用いることもできる。
【００５３】
プロテオグリカンに対して結合するペプチドのアミノ酸配列としては、特に限定されないが、例えば、ＢＢＸＢ、ＸＢＢＸＢＸ、ＸＢＢＢＸＸＢＸ等のコンセンサス配列が挙げられる。なお、前記「Ｘ」は、疎水性アミノ酸、「Ｂ」は、塩基性アミノ酸を示す。前記コンセンサス配列としては、具体的には、例えば、ＫＲＳＲ、ＦＨＲＲＩＫＡ（骨シアロタンパク質に由来）、ＰＲＲＡＲＶ（フィブロネクチンに由来）、ＷＱＰＰＲＡＲＩ等や、より長いペプチド配列として、ＹＥＫＰＧＳＰＰＲＥＶＶＰＲＰＲＰＧＶ（配列番号：１１）（フィブロネクチンに由来）、ＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲ（配列番号：１２）（ビトロネクチンに由来）、ＲＩＱＮＬＬＫＩＴＮＬＲＩＫＦＶＫ（配列番号：１３）（ラミニンに由来）等が挙げられる。
【００５４】
本発明の製造方法では、例えば、U. Hersel, C. Dahmen, H. Kessler, Biomaterials, 24, 4385-4415(2003)、JA. Hubbell, Bio/Technology, 13, 565-576(1995)、H. Shin, S. Jo, AG. Mikos, Biomaterials, 24, 4353-4364(2003)及びE. Koivunen, W. Arap, D. Rajotte, J. Lahdenranta, R. Pasqualini, J. Nuclear Med., 40(5), 883-888(1999)等やそれらの引用文献に記載されているような直鎖状又は環状の合成ペプチドを機能性分子として利用することができる。
【００５５】
前記「ホルモン」とは、動物組織の内分泌細胞によって生産・分泌され、血流によって標的細胞へ輸送され、外来性のシグナルとして標的細胞の活性を調節する物質をいう。前記ホルモンとしては、特に限定されないが、例えば、膵臓で生産されるインスリンやグルカゴン、副腎髄質で生産されるアドレナリンやノルアドレナリン、性腺で生産されるアンドロゲン、エストロゲン及びゲスターゲン等が挙げられる。また、前記細胞外マトリクスの場合と同様に、ホルモンの分子中に含まれるアミノ酸配列を有し、活性が期待できる一部の構造又は人工的に合成された物質を用いてもよい。
【００５６】
前記「サイトカイン」とは、細胞から放出され、免疫、炎症反応の制御作用、抗ウイルス作用、抗腫瘍作用、細胞増殖・分化の調節作用等の細胞間相互作用を媒介するタンパク質性因子をいう。前記サイトカインとしては、特に限定されるものではないが、例えば、インターロイキン類、インターフェロン類、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、リンホトキシン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、骨形成因子（ＢＭＰ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）等が挙げられる。
【００５７】
サイトカインについても、前記細胞外マトリクスの場合と同様に、それらの分子中に含まれ、活性が期待できる一部の構造又は人工的に合成された物質を用いてもよい。かかる物質としては、例えば、骨形成因子（ＢＭＰ）に関して、ＢＭＰ−２と同様の性質を示すＮＳＶＮＳＫＩＰＫＡＣＣＶＰＴＥＬＳＡＩ（配列番号：１４）のペプチド等が挙げられる（例えば、Y. Suzuki, M. Tanihara, K. Suzuki, A. Saitou, W. Sufan, Y. Nishimura, J. Biomed. Mater. Res., 50, 405-409(2000)）。また、前記物質としては、エリスロポエチンに関して、ＹＸＣＸＸＧＰＸＴＷＸＣＸＰ（Ｘは数種のアミノ酸で置換可能な位置を示す（ＮＣ．Ｗｒｉｎｇｔｏｎ，ＦＸ．Ｆａｒｒｅｌｌ，Ｒ．Ｃｈａｎｇ，ＡＫ．Ｋａｓｈｙａｐ，ＦＰ．Ｂａｒｂｏｎｅ，ＬＳ．Ｍｕｌｃａｈｙ，ＤＬ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，ＲＷ．Ｂａｒｒｅｔｔ，ＬＫ．Ｊｏｌｌｉｆｆｅ，ＷＪ．Ｄｏｗｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７３，４５８−４６３（１９９６）参照）のペプチド等が挙げられる。
【００５８】
なお、本発明の製造方法においては、CD. Reyes, AJ. Garcia, J. Biomed. Mater. Res., 65A, 511-523 (2003) に記載のように、例示されたアミノ酸配列等を含むペプチドが幾つか会合したような構造体を機能性分子として用いてもよい。
【００５９】
本発明の製造方法では、抗体を機能性分子として用いることもできる。前記抗体は、目的に応じて自由に選択でき、特に限定されないが、例えば、種々の細胞、細胞外マトリクス、その他各種生体組織表面におけるタンパク質、脂質その他の生体高分子に対する抗体等が挙げられる。具体的には、前記抗体としては、モノクローナル抗体、各種の抗インテグリン抗体、シンデカン、ＮＧ２、ＣＤ４４／ＣＳＰＧ等の細胞表面プロテオグリカンに対する抗体、抗カドヘリン抗体、抗セレクチン抗体等が挙げられる。前記抗体を機能性分子として用いる場合には、抗体そのものを用いてもよく、ペプシンやパパイン等のプロテアーゼ処理によって得られる断片等を用いてもよい。
【００６０】
本発明の製造方法では、糖質を機能性分子として用いることもできる。本発明の製造方法では、機能性分子として、単糖、数個（２〜１０個）の単糖の縮合体であるオリゴ糖、さらに多数の単糖からなる多糖等のいずれを用いてもよい。また、オリゴ糖や多糖には、構成糖の種類の違い、構成糖間の結合様式の違い、重合度の違い等によりきわめて多種類のものがあるが、本発明の製造方法では、受容体や生体高分子等に結合する能力を有する糖質であれば、機能性分子として用いることができる。
【００６１】
前記糖質としては、例えば、β−ガラクトース、ラクトース又は重合して接着性基質を形成することができる重合性ラクトースモノマー等、肝細胞上のアシアロ糖タンパク質受容体に結合する単糖類等；セレクチンに結合するものとして、シアル酸とフコースとを含むオリゴ糖であるシアリルルイスエックス（例えば、Ａ．Ｖａｒｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，７３９０−７３９７（１９９４）参照）等；ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸等のグリコサミノグリカン類等が挙げられる。
【００６２】
また、本発明の機能性分子として使用できる「細胞間接着の受容体に結合する分子」とは、それぞれの細胞膜外成分に存在する細胞間接着の受容体に結合する分子をいう。前記細胞間接着の受容体に結合する分子としては、特に限定されないが、例えば、ＮＣＡＭ、カドヘリン等が挙げられる。さらに、前記細胞間接着の受容体に結合する分子としては、例えば、セレクチンに対する受容体のうち、合成ペプチドとして、ＤＩＴＷＤＱＬＷＤＬＭＫ（配列番号：１５）等が挙げられる。本発明の製造方法では、前記細胞間接着の受容体に結合する分子を機能性分子として用いることにより、細胞−細胞間相互作用を模倣することができるという優れた効果を発揮する。
【００６３】
本発明の製造方法では、前記機能性分子として、細胞外マトリクス、ホルモン、サイトカイン（増殖因子）、抗体、糖質、細胞間接着の受容体に結合する分子等から、それぞれの細胞毎に最適なものを２つ以上選択することができる。機能性分子の配列をナノメートルオーダーで制御した機能性高分子複合体を実用的に製造する観点から、天然由来の機能性分子の断片、合成ペプチド分子、糖類及び人工的に合成された物質（低分子物質を含む）等やこれらの複合体を利用することが好ましい。なお、機能性分子が、ペプチドからなるものである場合、該ペプチドの鎖長は、アミノ酸３〜１５０残基程度であることが好ましい。また、機能性分子が、糖鎖からなる場合、該糖鎖の鎖長は、単糖１〜１００残基程度であることが好ましい。
【００６４】
本発明の機能性高分子複合体の製造方法において、機能性分子は、後述の核酸スペーサーに共有結合又は非共有結合によって結合される。
【００６５】
本発明の製造方法は、１つの側面では、少なくとも２つの同一又は異なる機能性分子とスペーサー構造、具体的には、核酸スペーサーとを結合させ、該機能性分子をナノメートルオーダーで配列させる方法である。
【００６６】
機能性分子間の間隔は、スペーサー構造長、すなわちスペーサー分子が伸長した状態での長さで規定される。スペーサー構造長、すなわち、シス配置で隣接する機能性分子間又はトランス配置で隣接する機能性分子間の距離は、それぞれの機能性分子の大きさや利用する目的によって最適な距離を選択すればよく、溶液中で剛直性を発揮させる観点から、好ましくは、１〜３００ｎｍの範囲であり、より好ましくは、５〜１００ｎｍの範囲である。
【００６７】
核酸スペーサーとしては、デオキシリボ核酸、リボ核酸又はそれらの誘導体等の基本骨格を有するものが挙げられる。なお、前記核酸等をまとめて、「核酸」ともいう。
【００６８】
前記デオキシリボ核酸（以下、「ＤＮＡ」ともいう）及びリボ核酸（以下、「ＲＮＡ」ともいう）は、それぞれデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドがモノマー単位となって、３’→５’ホスホジエステル結合したポリマーである。
【００６９】
本発明の製造方法では、スペーサー構造として、核酸スペーサー、例えば、前述の基本骨格を有するポリマーを用いることで、機能性分子の間隔を任意の距離に規定し、かつスペーサー部分の分子量が単一であるナノ構造を有する機能性高分子複合体が提供できるという優れた効果を発揮する。前記核酸スペーサーは、例えば、ポリエチレングリコール等の従来用いられているスペーサーと比較して、段階的・選択的にヌクレオチド等のモノマー単位を縮合させることができるため、長さの揃ったスペーサーが合成でき、分岐構造等複雑な高次構造を調製することができるという優れた効果を発揮する。
【００７０】
本発明の製造方法では、前記核酸スペーサーは、ＤＮＡおよびＲＮＡからなる群より選択された少なくとも２種を含む混合物からなるものでもよい。
【００７１】
本発明の製造方法においては、例えば、生体成分との接触条件において、機能性高分子複合体自体の安定性を増加させること、該機能性高分子複合体をエンザイムイムノアッセイ又は蛍光ラベル等によって定量分析すること、微粒子によりラベル化して電子顕微鏡等により観察すること等を可能とする観点から、前記核酸スペーサーは、化学的に修飾されていてもよい。
【００７２】
ここで、「化学的な修飾」とは、リン酸部位、リボース部位等の核酸の主鎖を化学的に改変すること、又は核酸塩基部位等に化学修飾を施すことをいう。
【００７３】
核酸の主鎖を化学的に改変する例としては、構造的に不安定なデオキシリボ核酸やリボ核酸のリン酸部分のチオール化等によりヌクレアーゼに対する耐性を向上させたホスホロチオエート等の化学的修飾体；フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体及びアレクサ等の発色団及び例えば、栗原靖之、武内恒成、松田洋一編「ｎｏｎ−ＲＩ実験の最新プロトコール−蛍光の原理と実際：遺伝子解析からバイオイメージングまで」別冊実験医学、羊土社（１９９９）等に記載されている発色団；ビオチン、ブロモデオキシウリジンやジゴキシゲニン等の抗原部位等を導入した化学的修飾体等が挙げられる。前記発色団あるいは、ビオチン、ブロモデオキシウリジン、ジゴキシゲニン等の抗原部位等の導入法としては、例えば、高橋豊三著「ＤＮＡプローブ−技術と応用―」シーエムシー（１９８８）や高橋豊三著「ＤＮＡプローブＩＩ−新技術と新展開―」シーエムシー（１９９０）等に記載されている方法等が挙げられる。
【００７４】
また、核酸スペーサーの原料となる一本鎖の核酸を合成する段階で、前記化学的修飾が施されてもよい。化学的修飾は、それぞれ最適な製法で行われ得、上述した目的に応じて選択でき、特に限定されるものではない。
【００７５】
前記核酸スペーサーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそれらの誘導体からなるものであって、一旦、機能性高分子複合体が形成された際には、その構造として少なくとも一部分が二重らせん、さらに、前記核酸スペーサーは、これらの構造単位が組み合わさって、さらに大きな一次元的、二次元的又は三次元的な構造体を形成してもよい。
【００７６】
本発明の製造方法においては、所望のスペーサー構造の形状を問わず、スペーサー原料は、一本鎖核酸であることが好ましい。前記一本鎖核酸は、１５０ヌクレオチド長、より実用的には、１００ヌクレオチド長程度の鎖長まで化学的に合成されうる。前記一本鎖核酸は、ホスホアミダイト法による固相合成法等により化学的に合成されうる。例えば、前記化学合成の段階で位置特異的に機能性分子を導入するための機能性分子結合用官能基を導入しておけば、その後、当該官能基に対して、機能性分子を、機能性分子が元来有するか又は該機能性分子に意図的に導入された核酸スペーサー結合用の官能基部分で結合させることによって、容易に機能性分子を所定の間隔をもってナノメートルオーダーで適正に配列させることができる。
【００７７】
また、前記核酸スペーサーに関して、ヌクレオチド３０量体を超える長鎖スペーサーの合成し易さの観点から、デオキシリボ核酸を核酸スペーサーとして利用するのが好ましい。特に、二重らせんのＤＮＡ鎖においては、１０ヌクレオチド長で３．４ｎｍの長さを有するという構造的にも明確である。したがって、本発明の製造方法においては、特に好ましくは、核酸スペーサーとして二重らせんのＤＮＡ鎖（以下、ｄｓＤＮＡと略称することがある）を使用することが望ましい。
【００７８】
機能性分子結合用官能基と、機能性分子の核酸スペーサー結合用官能基とは、互いに共有結合又は非共有結合を形成させて結合させればよい。
【００７９】
なお、スペーサーが複数の核酸からなる場合、機能性分子は、それぞれ、同一又は異なる核酸に結合されていればよい。例えば、核酸スペーサーが２本鎖を形成する核酸からなるものであり、かつ２つの機能性分子が核酸の５’末端又は３’末端にそれぞれ結合する場合、該核酸スペーサーには２つの５’末端及び３’末端が存在するが、同一核酸の当該両末端に機能性分子が結合すると機能性分子は同一の核酸に結合することになり、一方、いずれか一方の核酸の５’末端にいずれか一方の機能性分子が結合し、他方の核酸の５´末端に他方の機能性分子が結合すると、機能性分子は異なる核酸に結合することになる（例えば、図２参照）。
【００８０】
本発明の製造方法は、１つの実施態様では、
（Ｉ）生体高分子に対する結合活性を有する機能性分子と、該機能性分子に対する結合性部位を少なくとも１つ有する核酸又はその誘導体からなるスペーサーとを結合させて予備的機能性高分子（Ａ）を得る工程、
（ＩＩ）工程（Ｉ）で得られた予備的機能性高分子（Ａ）と、該予備的機能性高分子（Ａ）に含まれるスペーサーに対して相補性を有するスペーサーとを対合させ、予備的機能性高分子複合体（Ｂ）を得る工程、及び
（ＩＩＩ）工程（ＩＩ）で得られた予備的機能性高分子複合体（Ｂ）の少なくとも２種を連結させる工程を含む、製造方法である（本明細書中において「製造方法1」ともいう）。
【００８１】
前記製造方法１は、予備的機能性高分子（Ａ）と相補スペーサーとの対合に先立ち、機能性分子と該機能性分子に対する結合性部位を有するスペーサーとを結合させるため、かかる製造方法１によれば、予備的機能性高分子（Ａ）を製造する際に用いる機能性分子とスペーサーとの組み合わせを任意に選択することによって、少なくとも２種の機能性分子の組み合わせを任意に変えることができ、また、少なくとも２種の機能性分子間の距離を任意に設定し得るという優れた効果を発揮する。
【００８２】
本明細書において、前記「予備的機能性高分子（Ａ）」とは、少なくとも１つの機能性分子と、該機能性分子に対する結合性部位を有するスペーサーとを結合させた構築物をいう。
【００８３】
また、本明細書において、前記「予備的機能性高分子複合体（Ｂ）」とは、少なくとも１つの機能性分子と、該機能性分子に対する結合性部位を少なくとも１つ有する核酸又はその誘導体からなるスペーサーと、該スペーサーに対して相補性を有するスペーサーとから構成され、該機能性分子とスペーサーとが結合し、該スペーサーと相補スペーサーとが対合した状態にある複合体をいう。
【００８４】
前記製造方法１においては、前記予備的機能性高分子複合体（Ｂ）は、例えば、前記予備的機能性高分子（Ａ）と、前記予備的機能性高分子（Ａ）に含まれるスペーサーに対する相補性を有するスペーサーとを対合させることによって得られうる。
【００８５】
本明細書において、前記「対合」とは、水素結合を介して、２種の核酸が会合することを意図する。前記「対合」には、具体的には、「核酸のハイブリッド形成」及び「核酸のアニーリング」の概念をも包含する。なお、前記「対合」は、本発明の目的を妨げないものであれば、不完全相補の対合であってもよく、完全相補の対合であってもよい。
【００８６】
また、前記「連結」とは、少なくとも２種類の前記予備的機能性高分子複合体（Ｂ）を、適当な緩衝液中で、二本鎖核酸連結酵素の触媒作用によって連結させることをいう。
【００８７】
本発明の製造方法１の工程（Ｉ）では、生体高分子に対する結合活性を有する機能性分子と、該機能性分子に対する結合性部位を有するスペーサーとを結合させて、予備的機能性高分子（Ａ）を得る。
【００８８】
前記工程（Ｉ）において、前記機能性分子と核酸スペーサーとの結合は、例えば、機能性分子及び核酸スペーサーそれぞれに適切な官能基を導入し、該官能基を利用して行うことができる。本明細書中において、機能性分子に導入する官能基を、「核酸スペーサー結合用官能基」ともいい、核酸スペーサーに導入する官能基を、「機能性分子結合用官能基」ともいう。核酸スペーサー結合用官能基及び機能性分子結合用官能基は、特に限定されるものではなく、互いに対応して、該核酸スペーサー結合用官能基と機能性分子結合用官能基とが結合するように、適宜選択されうる。
【００８９】
核酸スペーサーに含まれる機能性分子結合用官能基と、機能性分子に含まれる核酸スペーサー結合用官能基との結合様式は、反応中における核酸スペーサーや機能性分子の分解、意図しない部位同士での非特異的な導入反応の発生が実質的に生じないものであれば、共有結合であってもよく、非共有結合であってもよい。
【００９０】
共有結合による導入反応としては、アミド結合形成反応（カルボジイミド等の縮合剤を用いてアミノ基とカルボキシル基を縮合させるか、又はアミノ基と予めＮ−ヒドロキシスクシンイミド等により活性化されたカルボキシル基活性エステルを反応させる方法等が例示できる）、マイケル付加反応（マレイミド基、アクリルエステル基、アクリルアミド基、ビニルスルホン基等のα，β−不飽和カルボニル基とチオール基を反応させる方法が例示できる）、チオエーテル形成反応（ハロアセチル基等のハロゲン化アルキル基やエポキシ基、アジリジン基等とチオールの反応が例示できる）、ディールスアルダー環化付加反応（シクロペンタジエン等の共役ジエン類とキノン等のオレフィン類とを反応させる方法が例示できる）、シッフベース形成反応（グリオキシル酸等のアルデヒド基とオキシアミノ基等のアミノ基を反応させる方法等が例示でき、形成されるシッフベース基は適切な還元剤で還元されていてもよい）、チアゾリジン環形成反応（アミノ基及びチオール基が残留したシステインとアルデヒド基を反応させる方法である）等が挙げられる。さらに、アミド結合形成反応としては、チオエステル基とアミノ基とチオール基が残留したシステインとを反応させてアミド結合を形成させる方法も例示される。
【００９１】
非共有結合による導入反応としては、例えば、錯体形成反応（例えば、トリニトリロ酢酸−ニッケル錯体とオリゴヒスチジンの三元錯体形成を利用したＨｉｓ−Ｔａｇ形成反応、金−チオール結合反応等）、生物学的な認識反応（例えば、糖鎖−レクチン反応、アビジン−ビオチン反応、抗原−抗体反応等）等が挙げられる。
【００９２】
導入反応は、機能性分子結合用官能基と核酸スペーサー結合用官能基との組み合わせを上記の反応様式で互いに結合し得るものとしておくことで行うことができる。そのような組み合わせは、上記を参照すれば適宜選択することができる。なお、前記導入反応は、光、熱、振動、時間、脱保護等別の因子によって開始されるものであってもよい。
【００９３】
核酸スペーサー結合用官能基として、機能性分子にもともと含まれる反応性のアミノ酸残基等や糖に含まれる反応性部位等を用いてもよく、機能性分子に核酸スペーサー結合用官能基を意図的に導入して用いてもよい。機能性分子に核酸スペーサー結合用官能基を導入する方法としては、核酸スペーサー用官能基を含有し、かつ機能性分子に結合する官能基を同一分子中に含有する二官能性試薬を使って、機能性分子を化学修飾する方法が挙げられる。ペプチドを含む機能性分子を化学修飾する１つの方法は、機能性分子を合成した後にアミノ酸残基の反応性等を利用して二官能性試薬を結合させるものであり、例えば駒野徹、志村憲助、中村研三、中村道徳、山崎信行編、大野素徳、金岡祐一、崎山文夫、前田浩著、「蛋白質の化学修飾＜上＞」生物化学実験法１２、学会出版センター（１９８１）等に記載されている公知の方法が用いられる。また、機能性分子を化学的に合成する段階で、Ｎ末端やアミノ酸残基等に対して、例えばＭＷ．Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，ＢＭ．Ｄｕｎｎ Ｅｄ．，“Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３５，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）等に記載されている公知の方法を用いることで自由に導入することが可能である。糖類を含む機能性分子に関しても同様のことがいえ、例えば糖鎖工学編集員会編「糖鎖工学」、産業調査会、バイオテクノロジー情報センター（１９９２）等に記載されている公知の方法を用いることができる。
【００９４】
一本鎖核酸、すなわち、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそれらの誘導体に対し、位置特異的に機能性分子結合用官能基を導入する方法として、例えば、高分子学会／バイオ・高分子研究会編「高分子化学と核酸の機能デザイン」、バイオ・高分子研究法６、学会出版センター（１９９６）やＹ．Ｉｔｏ，Ｅ．Ｆｕｋｕｓａｋｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌ．Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，２８，１５５−１６６（２００４）及び該文献に記載された参考文献等に記載された方法等が利用できる。
【００９５】
機能性分子結合用官能基を導入した一本鎖核酸は、機能性分子結合用官能基の核酸スペーサーにおける位置が特定できるものであればよく、例えば、リン酸部位やリボース又はデオキシリボース等を含む主鎖や核酸塩基等の部分に機能性分子結合用官能基を導入した化学的修飾体、５´末端や３´末端へ機能性分子結合用官能基を導入した化学的修飾体等が挙げられる。
【００９６】
核酸スペーサーと機能性分子結合用官能基との間及び／又は機能性分子と核酸スペーサー結合用官能基との間にはリンカーを含んでいてもよい。前記リンカーによれば、核酸スペーサーと機能性分子との間の距離を僅かに隔離しておくことができ、核酸スペーサーと機能性分子との間の反応において立体障害等を低減させて導入反応を迅速に進行させる機能や、本発明の製造方法で得られるナノ構造を有する機能性高分子複合体を細胞と接触させた場合に細胞表面受容体と機能性分子との結合反応を阻害しない機能等を発揮させることができるという優れた効果を発揮する。前記リンカーは、０．１〜５ｎｍ程度までの長さであれば、特に素材等に制限されるものではなく、例えば、アルキル鎖、ペプチド鎖、オキシエチレン鎖、オキシプロピレン鎖等やそれらが混合された構造であってもよい。なお、リンカーは、前記構造に限定されるものではなく、目的により最適なものが選ばれる。リンカーは、例えば、機能性分子結合用官能基、核酸スペーサー結合用官能基の一部として核酸スペーサー及び／又は機能性分子に導入しておけばよい。
【００９７】
ついで、前記製造方法１では、前記工程（Ｉ）で得られた予備的機能性高分子（Ａ）と、該予備的機能性高分子（Ａ）に含まれるスペーサーに対して相補性を有するスペーサーとを対合させることで予備的機能性高分子複合体（Ｂ）を得る〔工程（ＩＩ）という〕。
【００９８】
前記予備的機能性高分子（Ａ）に含まれるスペーサーに対して相補性を有するスペーサー（相補スペーサー）とは、前記工程（Ｉ）で得られた予備的機能性高分子（Ａ）に含まれるスペーサーに対して相補性を有し、５’末端にリン酸基を有する核酸又はその誘導体をさす。
【００９９】
なお、本発明において、前記相補スペーサーは、機能性分子結合用官能基を含んでいてもよく、含まなくてもよい。また、相補スペーサーが機能性分子結合用官能基を含んでいる場合であっても、該相補スペーサーには、機能性分子を結合させてもよく、結合させなくてもよい。
【０１００】
前記工程（ＩＩ）において、機能性分子が結合した相補スペーサーを用いた場合、それぞれの核酸鎖に機能性分子が配置された機能性高分子複合体を得ることができる。かかる機能性高分子複合体としては、例えば、図１の（Ａ）に示される機能性高分子複合体が挙げられる。また、前記工程（ＩＩ）において、機能性分子が結合していない相補スペーサーを用いた場合、一方の核酸鎖に機能性分子が配置された機能性高分子複合体を得ることができる。かかる機能性高分子複合体としては、例えば、図１の（Ｂ）に示される機能性高分子複合体が挙げられる。
【０１０１】
また、前記「５’末端にリン酸基を有する核酸又はその誘導体」とは、末端リボースの５’位がモノリン酸エステル化されたものを指す。リン酸基の導入方法としては、ホスホアミダイト法による固相合成法及びリン酸化酵素の触媒作用を利用する方法のいずれであってもよい。
【０１０２】
前記工程（ＩＩ）において、前記対合は、例えば、前記予備的機能性高分子（Ａ）に含まれるスペーサー中の核酸成分と、相補スペーサー中の核酸成分との間に適切な水素結合が生じる条件下で行われ得る。具体的には、前記対合は、特に限定されないが、例えば、慣用のアニーリング、ハイブリダイゼーションに準じて行われ得る。アニーリングは、特に限定はされないが、例えば、１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、５０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム溶液中で、９４℃で３０秒間熱変性させた後、５５℃で３０秒間アニーリングさせるなどの条件で行うことができ、また、ハイブリダイゼーションも、特に限定されないが、例えば、上記アニーリングと同様の条件で行うことができる。
【０１０３】
その後、前記製造方法１においては、前記工程（ＩＩ）で得られた予備的機能性高分子複合体（Ｂ）の少なくとも２種を連結させる〔工程（ＩＩＩ）という〕。
【０１０４】
前記工程（ＩＩＩ）において、前記連結は、例えば、少なくとも２種類の予備的機能性高分子複合体（Ｂ）を適当な緩衝液中で、二本鎖核酸連結酵素の触媒作用によって連結させることにより行われ得る。前記連結は、例えば、慣用のライゲーション方法に準じて行われ得、特に限定はされないが、例えば、連結酵素の存在下に、１６℃、３０分間インキュベートするなどの条件で行われ得る。なお、該工程（ＩＩＩ）において、連結させる該予備的機能性高分子複合体（Ｂ）の連結末端は３’突出末端あるいは平滑末端のいずれであってもよい。
【０１０５】
前記緩衝液としては、ｐＨが酵素活性に適した範囲に調整された塩を含む緩衝液であればよく、特に限定されないが、例えば、６６ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、６．６ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭジチオスレイトール、０．１ｍＭＡＴＰ等が挙げられる。
【０１０６】
また、前記二本鎖核酸連結酵素としては、ＤＮＡリガーゼであればよく、特に限定されないが、例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、大腸菌 ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ等が挙げられる。
【０１０７】
本明細書中においては、上述の製造方法１のように、核酸又はその誘導体からなるスペーサーと機能性分子とを予め結合させて、最初に予備的機能性高分子（Ａ）を得、以後の工程に該予備的機能性高分子（Ａ）を用いて、機能性高分子複合体を製造する方法を、「前変性法」ともいう。
【０１０８】
本発明の製造方法は、他の実施態様では、
（Ｉ）前記機能性分子に対する結合性部位を少なくとも１つ有する核酸又はその誘導体からなるスペーサーと、該スペーサーに対して相補性を有するスペーサー（相補スペーサー）とを対合させ、予備的高分子複合体（Ｃ）を得る工程、
（ＩＩ）工程（Ｉ）で得られた予備的高分子複合体（Ｃ）と、機能性分子を結合させ、予備的機能性高分子複合体（Ｂ）を得る工程、及び
（ＩＩＩ）工程（ＩＩ）で得られた予備的機能性高分子複合体（Ｂ）の少なくとも２種を連結させる工程、
を含む方法である（「製造方法２」ともいう）。
【０１０９】
本発明の製造方法２は、予備的高分子複合体（Ｃ）の機能性分子との結合に先立ち、前記機能性分子に対する結合性部位を少なくとも１つ有する核酸又はその誘導体からなるスペーサーと、該スペーサーに対して相補性を有するスペーサーとを対合させているため、かかる製造方法２によれば、核酸の折りたたみ等による立体障害等の影響を低減することができ、機能性分子の導入効率が高まるという優れた効果を発揮する。
【０１１０】
前記製造方法２の工程（Ｉ）においては、前記機能性分子に対する結合性部位を少なくとも１つ有する核酸又はその誘導体からなるスペーサーと、該スペーサーに対して相補性を有するスペーサー（相補スペーサー）を対合させ、予備的高分子複合体（Ｃ）を得る。
【０１１１】
ここで、前記機能性分子に対する結合性部位を少なくとも１つ有する核酸又はその誘導体からなるスペーサーと、相補スペーサーとの対合は、前記製造方法１の工程（ＩＩ）の場合と同様の手法により行われうる。
【０１１２】
前記工程（Ｉ）において、機能性分子が結合した相補スペーサーを用いた場合、それぞれの核酸鎖に機能性分子が配置された機能性高分子複合体を得ることができる。また、前記工程（Ｉ）において、機能性分子が結合していない相補スペーサーを用いた場合、一方の核酸鎖に機能性分子が配置された機能性高分子複合体を得ることができる。
【０１１３】
ついで、前記製造方法２では、前記工程（Ｉ）で得られた予備的高分子複合体（Ｃ）のスペーサーと、機能性分子とを結合させ、予備的機能性高分子複合体（Ｂ）を得る〔工程（ＩＩ）という〕。
【０１１４】
なお、本明細書において、前記「予備的高分子複合体（Ｃ）」とは、前記機能性分子に対する結合性部位を少なくとも１つ有する核酸又はその誘導体からなるスペーサーと、該スペーサーに対して相補性を有するスペーサーと対合させたものをいう。
【０１１５】
前記製造方法２においては、前記予備的機能性高分子複合体（Ｂ）は、前記予備的高分子複合体（Ｃ）に少なくとも１つの機能性分子を結合させることによって得られうる。
【０１１６】
前記工程（ＩＩ）において、予備的高分子複合体（Ｃ）のスペーサーと、機能性分子との結合は、前記製造方法１の工程（Ｉ）の場合と同様の手法により行われうる。
【０１１７】
その後、前記製造方法２では、工程（ＩＩ）で得られた予備的機能性高分子複合体（Ｂ）の少なくとも２種を連結させる〔工程（ＩＩＩ）という〕。
【０１１８】
前記工程（ＩＩ）において、少なくとも２種の予備的機能性高分子複合体（Ｂ）間の連結は、前記製造方法１の工程（ＩＩＩ）の場合と同様の手法により行われうる。
【０１１９】
本発明の製造方法は、更に他の実施態様では、
（Ｉ）該機能性分子に対する結合性部位を少なくとも１つ有する核酸又はその誘導体からなるスペーサーと、該スペーサーに対して相補性を有するスペーサー（相補スペーサー）とを対合させ、予備的高分子複合体（Ｃ）を得る工程、
（ＩＩ）工程（Ｉ）で得られた予備的高分子複合体（Ｃ）の少なくとも２種を連結させ、高分子複合体（Ｄ）を得る工程、及び
（ＩＩＩ）工程（ＩＩ）で得られた高分子複合体（Ｄ）に少なくとも２種の機能性分子を結合させる工程、
を含む方法である（「製造方法３」ともいう）。
【０１２０】
本発明の製造方法３は、スペーサーと相補スペーサーとを対合させて予備的高分子複合体（Ｃ）を得た後、機能性分子の結合に先立ち、少なくとも２種の予備的高分子複合体（Ｃ）を連結させて、高分子複合体（Ｄ）を得るために、かかる製造方法３によれば、高分子複合体（Ｄ）をまとめて製造しておくことにより、その中の必要量を、任意の種類あるいは量の機能性分子との結合あるいは化学的修飾に使用することができ、従って多様な機能性高分子複合体を効率的に製造することができるという優れた効果を発揮する。
【０１２１】
前記製造方法３の工程（Ｉ）においては、該機能性分子に対する結合性部位を少なくとも１つ有する核酸又はその誘導体からなるスペーサーと、該スペーサーに対して相補性を有するスペーサーを対合させ、予備的高分子複合体（Ｃ）を得る。
【０１２２】
前記工程（Ｉ）において、前記機能性分子に対する結合性部位を少なくとも１つ有する核酸又はその誘導体からなるスペーサーと、相補スペーサーとの対合は、前記製造方法１の工程（ＩＩ）の場合と同様の手法により行われうる。
【０１２３】
前記工程（Ｉ）において、機能性分子が結合した相補スペーサーを用いた場合、それぞれの核酸鎖に機能性分子が配置された機能性高分子複合体を得ることができる。また、前記工程（Ｉ）において、機能性分子が結合していない相補スペーサーを用いた場合、一方の核酸鎖に機能性分子が配置された機能性高分子複合体を得ることができる。
【０１２４】
ついで、前記製造方法３では、前記工程（Ｉ）で得られた予備的高分子複合体（Ｃ）の少なくとも２種を連結させ、高分子複合体（Ｄ）を得る〔工程（ＩＩ）という〕。
【０１２５】
本明細書において、「高分子複合体（Ｄ）」とは、前記機能性分子に対する結合性部位を少なくとも１つ有する核酸又はその誘導体からなるスペーサーと、該スペーサーに対して相補性を有するスペーサーと対合させたスペーサー構造を、少なくとも２つ連結させた高分子複合体をいう。
【０１２６】
前記工程（ＩＩ）において、少なくとも２種の予備的高分子複合体（Ｃ）の連結は、前記製造方法１の工程（ＩＩＩ）の場合と同様の手法により行われうる。
【０１２７】
その後、前記製造方法３では、前記工程（ＩＩ）で得られた高分子複合体（Ｄ）に、少なくとも２種の機能性分子を結合させる〔工程（ＩＩＩ）という〕。
【０１２８】
前記工程（ＩＩＩ）において、高分子複合体（Ｄ）と少なくとも２種の機能性分子との結合は、前記製造方法１の工程（Ｉ）の場合と同様の手法により行われうる。
【０１２９】
なお、本明細書中においては、上述の製造方法２または３のように、該機能性分子に対する結合性部位を少なくとも１つ有する核酸又はその誘導体からなるスペーサーと、該スペーサーに対して相補性を有するスペーサーを対合させて、最初に予備的高分子複合体（Ｃ）を得、その後、該予備的高分子複合体（Ｃ）又は該予備的高分子複合体（Ｃ）を使用して得られた高分子複合体（Ｄ）に機能性分子を結合させることによって本発明の機能性高分子複合体を製造する方法を、「後変性法」ともいう。
【０１３０】
かかる後変性法は、あらかじめ作製した二本鎖核酸スペーサーに対して機能性分子あるいは化学的修飾を導入する製造方法であるため、機能性分子または化学修飾の種類に変化を持たせた多様な機能性高分子複合体を製造することができるという優れた効果を発揮する。
【０１３１】
本発明における機能性高分子複合体の製造方法としては、前変性法及び後変性法のいずれも用いることができるが、核酸スペーサーに対する機能性分子の導入の簡便さ、及び機能性高分子の製造効率の観点から、前変性法のほうが好ましい。
【０１３２】
本発明の製造方法により得られる機能性高分子複合体において、ｄｓＤＮＡからなる核酸スペーサーの中で機能性分子を導入する好ましい位置としては、目的に応じて選択でき、特に限定されるものではなく、５’末端（途中分岐等が無い場合に限れば、計２箇所存在する）、及び３’末端（途中分岐等が無い場合に限れば、計２箇所存在する）等ｄｓＤＮＡスペーサーの末端部位や核酸塩基部位等ｄｓＤＮＡスペーサーの途中の任意の位置が挙げられる。２つの機能性分子を含有する場合を記載すると、ｄｓＤＮＡ鎖の２つの５’末端にそれぞれ機能性分子が結合した分子、又は２つの３’末端にそれぞれ機能性分子が結合した分子、又はそれらの組み合わされた分子（例えば、５’末端及び３’末端のそれぞれに機能性分子が結合した分子等）が挙げられる。３つ以上の機能性分子を導入する場合には空いている末端を利用することもできる。
【０１３３】
前変性法により機能性分子を導入するため、核酸スペーサーの原料となる１本鎖ＤＮＡ（以下、「ｓｓＤＮＡ」ともいう）に機能性分子結合用官能基をＤＮＡの化学合成の段階で導入する。機能性分子結合用官能基としては、上述したように種々のものが選択でき、特に限定されるものではなく、反応選択性を発揮する観点から、チオール基またはアミノ基を導入するのが好ましい。
【０１３４】
機能性分子には、チオール基またはアミノ基と結合活性を有する核酸スペーサー結合用官能基を導入しておくことが好ましい。前記チオール基と結合活性を有する核酸スペーサー結合用官能基としては、例えば、チオール基とマイケル付加反応させるためのマレイミド基、アクリルエステル基、アクリルアミド基、ビニルスルホン基等、チオール基とチオエーテル形成反応をさせるためのハロアセチル基、エポキシ基、アジリジン基等が挙げられる。この中でも機能性分子への導入のし易さ、安定性の点からマレイミド基やハロアセチル基が好適な核酸スペーサー結合用官能基として例示できる。
【０１３５】
機能性分子として、合成ペプチド分子を使用する場合、合成ペプチド分子を合成する際に、リジン残基等のアミノ基側鎖やＮ末端のアミノ基等に対して、カルボン酸や、酸クロライド、活性エステル基等を有する二官能性試薬であるマレイミド誘導体（例えば、マレイミド酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、４−マレイミドブタン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル等）又はハロアセチル誘導体（例えば、ブロモ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、６−（ヨードアセトアミド）カプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ヨード酢酸無水物等）を作用させることで、容易に機能性分子に対して核酸スペーサー結合用官能基を導入することができる。
【０１３６】
本発明の製造方法においては、前記ｓｓＤＮＡ及び機能性分子を用いることで、前変性法により機能性分子が導入されたｓｓＤＮＡを調製することができる。なお、このように機能性分子が導入されたｓｓＤＮＡを単に「コンジュゲート」ともいう。前記導入の際の反応条件や精製方法等は、特に限定されるものはなく、公知の方法が利用できる。
【０１３７】
本発明の製造方法においては、ｓｓＤＮＡにおける機能性分子結合用官能基の導入方法、部位及び官能基の種類、機能性分子における核酸スペーサー結合用官能基の導入方法、部位及び種類は、目的により適宜選択されうる。また、本発明の製造方法においては、核酸スペーサー構造は単純な二重らせんだけではなく、種々の複雑な構造、例えば、分岐構造や三次元構造、二次元的、三次元的に多重に核酸スペーサーが連結した構造等を持たせた機能性高分子複合体を作製できる。
【０１３８】
本発明の製造方法で得られた機能性高分子複合体は、単独で用いてもよく、２種以上の機能性高分子複合体を混合して用いてもよい。それぞれの細胞によって最適な使用形態が選択される。
【０１３９】
本発明の製造方法で得られた機能性高分子複合体は、必要に応じて、滅菌してもよい。滅菌方法は、特に限定されるものではなく、用途に応じて適宜選択されうる。前記滅菌方法としては、例えば、オートクレーブ滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、γ線滅菌、電子線滅菌、濾過滅菌等が挙げられる。
【実施例】
【０１４０】
以下、本発明を実施例等により具体的に説明するが、本発明はそれらにより何ら限定さ
れない。以下の実施例等において使用した測定方法又は評価方法をまとめて示す。
【０１４１】
（逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるペプチドの分析）
逆相ＨＰＬＣによるペプチドの分析は、以下のような条件で行った。カラムとして、商品名：ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ（東ソー株式会社製）を用いた。溶出の際の溶離液の流速は、１．０ｍＬ／分、検出波長は、２１０ｎｍに設定した。ペプチドは、５重量％〜１０重量％のアセトニトリルによる２０分のリニアグラジエントで溶出させた。前記リニアグラジエントには、０．０５重量％ トリフルオロ酢酸（以下、「ＴＦＡ」ともいう）を含有した５重量％ アセトニトリル水溶液と、０．０５重量％ ＴＦＡを含有した３０重量％ アセトニトリル水溶液とを用いた。
【０１４２】
（逆相ＨＰＬＣによるペプチドの精製）
逆相ＨＰＬＣによるペプチドの精製は、以下のような条件で行った。カラムとして、商品名：ＰＲＥＰ−ＯＤＳ（株式会社島津製作所製）を用いた。溶出の際の溶離液の流速１０ｍＬ／分、検出波長は、２１０ｎｍに設定した。ペプチドは、１０重量％〜２０重量％のアセトニトリルによる８分のリニアグラジエントで溶出させた。前記リニアグラジェントには、０．０５重量％ トリフルオロ酢酸を含有した１０重量％ アセトニトリル水溶液と、０．０５重量％ ＴＦＡを含有した２０重量％ アセトニトリル水溶液とを用いた。
【０１４３】
（マススペクトルの測定）
マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計〔商品名：Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ ＳＴＲ（アプライドバイオシステムズ社製）〕により、マトリクスとして、α−ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ（ＣＨＣＡ）を用いて、マススペクトルを測定した。
【０１４４】
（逆相ＨＰＬＣによる機能性分子が導入されたｓｓＤＮＡ（コンジュゲート）の分析）
逆相ＨＰＬＣによるコンジュゲートの分析は、以下のような条件で行った。カラムとして、商品名：ＯｌｉｇｏＤＮＡ ＲＰ（東ソー株式会社製）を用いた。流速は、１．０ｍＬ／分、検出波長は、２６０ｎｍに設定した。コンジュゲートは、５％のアセトニトリルを含む０．１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液で５分間溶出し、その後、５重量％〜３０重量％のアセトニトリルによる５０分のリニアグラジエントで溶出させた。前記リニアグラジエントには、５重量％のアセトニトリルを含有した０．１Ｍ 酢酸アンモニウム水溶液と、３０重量％のアセトニトリルを含有した０．１Ｍ 酢酸アンモニウム水溶液とを用いた。
【０１４５】
（ｓｓＤＮＡの濃度測定）
ｓｓＤＮＡ溶液 ２５μＬを、１０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．０） ９７５μＬに添加して希釈した。得られた希釈物について、１０ｍＭ トリス塩酸緩衝液のみでベース補正した分光光度計で、２６０ｎｍの吸光度を測定した。このとき測定される吸光度に４０を乗じた値をｓｓＤＮＡ溶液のＯＤ値とした。本実施例で用いられるｓｓＤＮＡのＯＤあたりの重量（μｇ）は、それぞれ計算されたＯＤ値から算出できる。ｓｓＤＮＡの分子量を用いることで、前記ＯＤ値を、モル濃度に換算できる。
【０１４６】
（ＤＮＡスペーサーを有する機能性高分子複合体の濃度測定）
以下の実施例で示されるリガンド構築物の濃度は、商品名：ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ＤＮＡ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ピアース社製）を用いて決定した。濃度既知のλＤＮＡ標準液を用いて検量線を作成した。記載した測定値は、全て３回測定の平均値である。
【０１４７】
以下の実施例では、本発明における最も単純な実施態様の１つを例示する。すなわち、機能性分子として、ＫＤＧＥＡペプチド（Ｉ型コラーゲンに由来する機能性分子）とＧＲＧＤＳペプチド（フィブロネクチンに由来する機能性分子）との２つの機能性分子、その２つの機能性分子間を繋ぐスペーサー構造として、相補的な塩基対を形成した二重らせん構造を有するｄｓＤＮＡ、２つの機能性分子の導入位置として、ｄｓＤＮＡに二箇所存在する５´末端とした。
【０１４８】
また、本発明において好適な長さとして記載した範囲のスペーサー構造が調製できることを示すため、ＤＮＡスペーサー構造の長さは、２０ｎｍ（ＤＮＡとしては６０量体）とした。以上の概念に従って設計された機能性高分子複合体の構造（模式図）を以下に示す。ＤＮＡスペーサー構造の長さが２０ｎｍの機能性高分子複合体を、ＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳと呼ぶ。
【０１４９】
【化１】
【０１５０】
以下の実施例で示される全ての機能性高分子複合体は前変性法を使用して調製されるため、まず、ｓｓＤＮＡに機能性分子を結合させたコンジュゲートが合成される。以下の実施例では、機能性分子に含まれる核酸スペーサー結合用官能基としてマレイミド基を選び、ＫＤＧＥＡペプチド分子及びＧＲＧＤＳペプチド分子それぞれのＮ末端に該マレイミド基が導入されたもの（それぞれマレイミド化ＫＤＧＥＡ、マレイミド化ＧＲＧＤＳと呼ぶ）を使用した。また、ｓｓＤＮＡには、機能性分子結合用官能基としてチオール基が５’末端に導入されているものを用いた。より具体的に構造を説明すると、５’末端のリン酸基に対して６−メルカプト−１−ヘキサノールのＯＨ部位が結合した状態となっている合成ｓｓＤＮＡである。合成された直後では、５’末端のチオール部位は、チオール基を有する保護基とジスルフィド結合とにより保護されている。これを脱保護してチオール基を生成し、マレイミド化ＫＤＧＥＡ又はマレイミド化ＧＲＧＤＳを導入してｓｓＤＮＡとのコンジュゲートを形成する。
【０１５１】
実施例１
DNAスペーサー構造として、２０ｎｍ（６０量体）のｄｓＤＮＡを有するＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳの調製法について説明する。合成プロセスの概略は図２の通りである。
【０１５２】
（マレイミド化ＫＤＧＥＡの合成）
Ｆｍｏｃ−Ａｌａ（なお、前記「Ｆｍｏｃ」は、９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌの略称である）が予め導入された樹脂（株式会社島津製作所製、商品名：ＰｒｅｌｏａｄｅｄＨＭＰレジン）から、マレイミド化ＫＤＧＥＡの合成を開始した。Ｆｍｏｃ基の脱保護は、２０重量％ ピペリジン（アプライドバイオシステムズ社製）／ジメチルホルムアミド（以下、ＤＭＦともいう）溶液を用いて行った。また、ペプチド鎖の伸長のための縮合反応は、前記レジン中のアミノ酸量に対して１０当量のＦｍｏｃ−ａａ（ａａは、適切に保護されたアミノ酸を示す）と、縮合試薬として１０当量のＨＢＴＵ〔株式会社島津製作所製；ＨＢＴＵは、２−（１−Ｈ−ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ−１，１，３，３−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍ ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅの略称である）、１０当量のＨＯＢｔ〔株式会社ペプチド研究所製；ＨＯＢｔは、１−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅの略称である〕及び２０当量のＤＩＥＡ（アプライドバイオシステムズ社製；ＤＩＥＡは、Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅの略称である）をＤＭＦに溶解して得られた溶液を、アミノ酸配列に対応して逐次的に前記レジンに添加することにより樹脂上で行った。Ｎ末端のＦｍｏｃ基を２０重量％ ピペリジン／ＤＭＦにより脱保護した。得られた産物に、生成した遊離のＮ末端アミノ基に対して５当量のＧＭＢＳ〔同仁化学株式会社製；ＧＭＢＳは、Ｎ−（４−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｕｔｙｒｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅの略称である〕と、１０当量のＤＩＥＡとをＤＭＦに溶解して加えた。４時間室温で反応させ、その後、得られた産物に、さらに１当量のＧＭＢＳを追加し、１時間室温で反応させた。得られた産物を保持した樹脂をＤＭＦで洗浄し、その後、該樹脂を、メタノール及びジエチルエーテルで洗浄した。洗浄後の樹脂を減圧乾燥した。樹脂からのマレイミド基含有ペプチドの切断には、９０容積％ ＴＦＡ（株式会社ペプチド研究所製）／５容積％ チオアニソール（アルドリッチ社製）／３容積％ Ｈ2Ｏ／２容積％ アニソール（Ｖ／Ｖ／Ｖ／Ｖ）溶液を用いた。前記溶液を、樹脂に添加し、得られた混合物を、２時間室温で攪拌した。その後、樹脂を濾別し、濾液を減圧下で濃縮した。残渣に冷却したジエチルエーテルを加えてペプチドを沈澱させ、固体を濾別して減圧乾燥した。得られたペプチドを、上述の条件下、精製用ＨＰＬＣにより精製した。単離されたペプチドは、分析用ＨＰＬＣでシングルピーク（保持時間１０．４分）であることを確認した。また、マススペクトルによって前記ペプチドの分子量を測定するとｍ／ｚ＝６８４．６０［Ｍ＋Ｈ］+であり、計算値とよく一致した。凍結乾燥して固体のマレイミド化ＫＤＧＥＡを得た。
【０１５３】
（マレイミド化ＧＲＧＤＳの合成）
Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒが予め導入されたレジン（株式会社島津製作所製、商品名：ＰｒｅｌｏａｄｅｄＨＭＰレジン）を用いて、前記マレイミド化ＫＤＧＥＡの場合と同様の方法で合成した。得られた粗ペプチドを、上述の条件下、精製用ＨＰＬＣにより精製した。単離されたペプチドは分析用ＨＰＬＣでシングルピーク（保持時間８．６分）であることを確認した。また、マススペクトルによって前記ペプチドの分子量を測定するとｍ／ｚ＝６５６．６１［Ｍ＋Ｈ］+であり、計算値とよく一致した。凍結乾燥して固体のマレイミド化ＧＲＧＤＳを得た。
【０１５４】
（チオール基を含有するｓｓＤＮＡの脱保護）
ＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳの原料となるチオール基が保護されたｓｓＤＮＡは、ＰＳ−Ｓ−ＳＰ２０Ａ及びＰＳ−Ｓ−ＳＰ２０Ｂの２種類である（図２参照）。ＰＳ−Ｓ−ＳＰ２０Ａ（シグマジェノシス社製）を１００ｎｍｏｌ／ｍＬとなるように、ＴＥバッファー（１ｍＭＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ８．０）に溶解させた。得られた溶液 ０．２ｍＬに対して、０．０８Ｍジチオスレイトール溶液（０．２５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解して作製）を０．２ｍＬ混合し、その後、得られた混合物を室温で１６時間攪拌した。溶離液〔０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．０）〕で平衡化したファルマシアバイオテク社製、商品名：ＮＡＰ−５カラムにより精製して、チオール基が脱保護されたＨＳ−ＳＰ２０Ａを得た。得られた産物について、２６０ｎｍの吸光度を測定することによりＨＳ−ＳＰ２０Ａの濃度を決定した。同様にＰＳ−Ｓ−ＳＰ２０Ｂも脱保護してHＳ−ＳＰ２０Ｂを得た。得られたＨＳ−ＳＰ２０Ｂの濃度を、同様に決定した。結果を表１に示す。
【０１５５】
【表１】
【０１５６】
（ＫＤＧＥＡ−Ｓ−ＳＰ２０Ａ及びＧＲＧＤＳ−Ｓ−ＳＰ２０Ｂの調製）
上述のように脱保護して得られたＨＳ−ＳＰ２０Ａへのマレイミド化ＫＤＧＥＡの結合形成により、以下のように、ＫＤＧＥＡ−Ｓ−ＳＰ２０Ａ（図２を参照）を調製した。
【０１５７】
ＨＳ−ＳＰ２０Ａ溶液（濃度１７．０ｎｍｏｌ／ｍＬ） ０．８ｍＬと、ＨＳ−ＳＰ２０Ａに対して２５当量のマレイミド化ＫＤＧＥＡを０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に溶解させた溶液 ０．８ｍＬとを混合し、４℃で２４時間反応させた。得られた反応溶液を凍結乾燥させた。得られた産物を、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．０） ０．５ｍＬに溶解させた。得られた溶液を、溶離液で平衡化したＮＡＰ−５（商品名）を用いたゲル濾過に供して、ＫＤＧＥＡ−Ｓ−ＳＰ２０Ａを精製した。なお、前記溶離液として、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた。得られた産物について、２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、ＨＳ−ＳＰ２０Ａ（表１）のデータを利用して、ＫＤＧＥＡ−Ｓ−ＳＰ２０Ａの濃度を決定した。同様に、マレイミド化ＧＲＧＤＳとＨＳ−ＳＰ２０ＢのコンジュゲートであるＧＲＧＤＳ−Ｓ−ＳＰ２０Ｂを得た。得られたＧＲＧＤＳ−Ｓ−ＳＰ２０Ｂの濃度を同様に決定した。結果を表２に示す。
【０１５８】
【表２】
【０１５９】
また、全てのコンジュゲートが、ＨＰＬＣによりシングルピークであることが確認できた。
【０１６０】
（ＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳの調製）
ＫＤＧＥＡ−Ｓ−ＳＰ２０Ａ及びＧＲＧＤＳ−Ｓ−ＳＰ２０Ｂの各３２量体のＤＮＡ部位にそれぞれ相補的に結合する、５´末端がリン酸化された、２８量体のｓｓＤＮＡであるＳＰ２０Ｃを準備した。ＫＤＧＥＡ−Ｓ−ＳＰ２０Ａ、ＧＲＧＤＳ−Ｓ−ＳＰ２０Ｂ、ＳＰ２０Ｃ、緩衝液（１Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．６），５０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１Ｍ ＮａＣｌ）及びＨ２Ｏを、それぞれ表３に示す量で混合した。得られた混合物を、９４℃で３０秒間、次いで５５℃で３０秒間インキュベーションして、ＫＤＧＥＡ−Ｓ−ＳＰ２０ＡとＳＰ２０Ｃ、及びＧＲＧＤＳ−Ｓ−ＳＰ２０ＢとＳＰ２０Ｃとをそれぞれアニーリングさせた。アニーリング後の反応液のうち９０μＬを取り出し、ＤＮＡライゲーションキット（商品名：ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｖｅｒ．１）、タカラバイオ社製）の酵素溶液９０μＬと混合した。得られた混合液に対して、１６℃で６０分間、ライゲーション反応を行った。ライゲーション反応後の反応液を、スピンカラム（商品名：ＱＩＡ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、キアゲン社製）により精製して、ＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳを得た。
【０１６１】
【表３】
【０１６２】
また、得られたＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳを、定法に従ったポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、核酸スペーサー部分の検出を行った。その結果、得られたＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳのｄｓＤＮＡが６０量体であることが確認できた。これによりｄｓＤＮＡからなるスペーサー構造が設計どおりの長さで合成できたことが分かった。商品名：ＰｉｃｏＧｒｅｅｎによって濃度を定量したところ、４８．０μｇ／ｍＬであった。ＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳのｄｓＤＮＡ部分の分子量を約３６８００とすると１．３ｎｍｏｌ／ｍＬと計算される。
【０１６３】
（機能性高分子複合体が持つ細胞の機能を制御する性能の評価）
細胞の機能を制御する性能は、マウス由来の未成熟骨芽細胞（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞）を成熟した骨芽細胞に分化させる能力を比較することにより評価した。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を、１０重量％牛胎仔由来血清（ＦＢＳ）を添加したα−ＭＥＭ（ギブコ社製、α−ＭＥＭはＡｌｐｈａ−Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍの略称である）培地で培養した。その後、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を９０％コンフルエント状態時にトリプシン処理により回収した。１０ｍＭ β−グリセロリン酸（シグマ社製）と５０μｇ／ｍＬ アスコルビン酸（シグマ社製）と１０重量％ ＦＢＳ（シグマ社製）とを添加したα−ＭＥＭに、１９０００個／ｍＬとなるように、前記ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を再分散させた。その後、ＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳを以下に示す方法により固定化した１２ウェルプレートに１ウェルあたり２ｍＬとなるように前記ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を播種した。この時の細胞密度は、５０００個／ｃｍ2であった。３７℃、５容積％ ＣＯ2を含む湿潤空気中で前記ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を培養した。３日毎に培地の交換を行った。１１日後にＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞のアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性を測定した。前記ＡＬＰ活性をＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の分化度合の指標として、機能性高分子複合体が持つ細胞の機能を制御する性能を評価した。
【０１６４】
培養後の細胞をトリプシン処理により回収し、０．５ｍＬのＰＢＳに再分散した。得られた分散液を用い、細胞数を、ビルケルチルク氏血球計算盤で計数した。その後、分化の指標として、細胞のＡＬＰ活性の測定を行った。ＡＬＰ活性測定は、基質溶液〔商品名：ＦＡＳＴ ｐ−ＮＩＴＲＯＰＨＥＮＹＬ ＰＨＯＳＰＨＡＴＥ ＴＡＢＬＥＴ ＳＥＴＳ（シグマ社製）を溶解して使用した〕を用いて、ｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）法により行った。ここで、基質であるｐＮＰＰが、ＡＬＰによりｐ−ニトロフェノールとなり黄色を呈することを利用し、一定時間に生じるｐ−ニトロフェノール量で酵素活性値を示した。ｐ−ニトロフェノールの生成量は、ｐ−ニトロフェノールをＰＢＳに溶解させたものを検量線の作成に使用した。また、細胞膜の溶解には、界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎTM Ｘ−１００（シグマ社製）を用いた。９６ウェルプレートに、細胞液又は検量線溶液 １００μＬと、０．３重量％ＴｒｉｔｏｎTM Ｘ−１００ ５０μＬと、基質溶液 １００μＬとを入れ、得られた混合物を３７℃で１時間インキュベーションして反応を行った。得られた反応産物に、３Ｎ 水酸化ナトリウム水溶液 ５０μＬを添加し、酵素反応を停止させた。その後、得られた産物について、マイクロプレートリーダー（デカン社製ジェニオス）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。１個の細胞あたりのＡＬＰ活性（細胞１個あたりのｐ−ニトロフェノールの生成速度（ｆｍｏｌ／分／細胞））を算出した。
【０１６５】
試験例１
（ポリ−Ｌ−リジン表面の調製）
ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）塩酸塩（ペプチド研究所製、平均分子量約８０００以上）を１０ｍｇ／ｍＬとなるようにリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解させた。なお、これ以降の操作は、安全キャビネット内で全て滅菌した器具や緩衝液を使用して行った。得られた溶液を０．２μｍ内径のフィルターを通して濾過滅菌し、ＰＢＳでさらに１０倍に希釈して、１ｍｇ／ｍＬのＰＬＬ溶液を得た。得られたＰＬＬ溶液を、ヌンク社製のデルタ処理１２ウェルプレートに対して１ウェルあたり０．５ｍＬ添加し、ついで、プレートを密封した。前記プレートを３７℃で２時間インキュベーションすることにより、該プレートにＰＬＬを吸着させた。その後、前記プレートからＰＬＬ溶液を吸引してウェル内から除去した。さらに、前記プレートに、１ウェルあたり１ｍＬのＰＢＳを添加して３分間放置し、アスピレーションする洗浄操作を３回行い、ＰＬＬ表面を調製した。
【０１６６】
（ポリイオンコンプレックス形成によるポリ−Ｌ−リジン表面への機能性高分子複合体の固定化）
全ての操作は安全キャビネット内で全て滅菌した器具や緩衝液を使用して行った。実施例１で調製した機能性高分子複合体、すなわち、ＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳを目標密度となるように、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈した。得られた希釈物を、０．２μｍ内径のフィルターで濾過滅菌した。滅菌後の産物を、ＰＬＬ表面を形成させた１２ウェルプレートに対して１ウェルあたり０．５ｍＬとなるように添加した。ここで、前記産物 ０．５ｍＬ中に０．４５ｐｍｏｌのＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳを含むようにした。１２ウェルプレートの場合、１ウェルに液体を０．５ｍＬ入れると液体が覆う面積は、約４．５ｃｍ2となる。したがって、この場合のリガンド構築物が全てＰＬＬ表面に結合したときの密度は、１００ｆｍｏｌ／ｃｍ2と判断される。その後、４℃において１２時間以上吸着させた。吸着後の機能性高分子複合体溶液を回収した。ついで、得られた機能性高分子複合体溶液について、商品名：ＰｉｃｏＧｒｅｅｎによりｄｓＤＮＡ濃度を測定し、添加した機能性高分子複合体がどの程度ＰＬＬ表面に固定化されているかを確認した。その結果を表４に示す。
【０１６７】
【表４】
【０１６８】
その結果、機能性高分子複合体がＰＬＬ表面に固定化されたことが分かった。
【０１６９】
試験例２
（機能性高分子複合体が持つ細胞の機能を制御する性能の評価）
実施例１で作製したＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳを固定化したＰＬＬ表面が持つ、細胞の機能を制御する性能を評価した。既に説明したようにＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳがマウス由来の未成熟骨芽細胞（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞）を成熟した骨芽細胞に分化させる能力（ＡＬＰ活性）を比較することにより行った。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を培養して１１日目の１細胞あたりのＡＬＰ活性を測定した結果を表５に示す。
【０１７０】
【表５】
【０１７１】
比較例１
（ポリエチレングリコールスペーサーを有する機能性高分子の調製）
リガンド分子としてＫＤＧＥＡ分子とＧＲＧＤＳ分子とを含有し、かつ平均分子量約３０００のポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと略称することがある）をスペーサーとする機能性高分子を合成した。Ｆｍｏｃ基により保護されたアミノ基及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドにより活性化されたカルボキシル基をもう１つの末端に持つＦｍｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（ＮＥＫＴＡＲ社製，分子量３４００）をＰＥＧスペーサー結合部位として用いた以外は、非特許文献７および８に記載された方法を適用し、ＫＤＧＥＡ−ＰＥＧ−ＧＲＧＤＳを合成した。
【０１７２】
（ポリエチレングリコールスペーサーを有する機能性高分子のディッシュ表面への固定化）
９ｎｍｏｌ／ｍＬとなるようにＫＤＧＥＡ−ＰＥＧ−ＧＲＧＤＳを純水に溶解させた。得られた溶液を、１２ウェルプレート（Ｎｕｎｃ社製、デルタ処理）のウェルに、１ウェルあたり０．５ｍＬ添加した。前記プレートを、そのままクリーンベンチ内で放置し、溶液を風乾した。前記プレートのウェルに、３容積％ ウシ血清アルブミン／ＤＭＥＭ（ギブコ社製、ＤＭＥＭはＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍの略称である）を１ウェルあたり２ｍＬ添加して室温１時間静置した。その後、溶液を吸引した。０．１容積％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＤＭＥＭ溶液を、前記プレートの１ウェルあたり２ｍＬ入れてアスピレーションする一連の洗浄操作を３回行って、機能性高分子を固定化した表面を調製した。
【０１７３】
（ポリエチレングリコールスペーサーを有する機能性高分子を固定化した表面による細胞機能制御）
以上のように調製した１２ウェルプレートを用いて、実施例１の機能性高分子複合体を用いた場合と全く同じ条件で、かつ同時に細胞機能の評価を行った。その結果、１１日間培養を続けるとＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞がプレート底面から剥がれてしまった。また、１細胞あたりのＡＬＰ活性は、２８ｆｍｏｌ／ｍｉｎ／ｃｅｌｌであり、きわめて低かった。かかる結果は、比較例１で得られたプレートの表面では細胞機能の制御ができなかったことを意味する。
【産業上の利用可能性】
【０１７４】
本発明の製造方法により得られる機能性高分子複合体を用いて、細胞表面、細胞外マトリクス、その他の生体組織表面におけるタンパク質、糖質等の生体高分子内の特定の部位間の距離あるいは、複数の同一又は異なるタンパク質、糖質その他の生体分子間の距離を推定することは、細胞、細胞外マトリクス、その他の生体組織の構造を知る上で、また、それらの生体分子間の相互作用の有無を推定する上で有用である。また、細胞表面上の複数の特定の部位に同時に結合することによって、細胞に対して同時に信号を与え、その細胞の反応を観察することは、それらの生体分子の機能を調べることは細胞生理学上非常に有用である。本発明の製造方法により得られる機能性高分子複合体は、例えば、前記学問の発展により、医療、診断、医薬品等有用物質の製造等の分野に大きく寄与するものである。
【図面の簡単な説明】
【０１７５】
【図１】図１は、機能性高分子複合体の一例を示す。
【図２】図２は、スペーサー構造として２０ｎｍ（６０量体）のｄｓＤＮＡを有するＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳの調製法に関する合成プロセスの一例を示す概略図である。図中、DMTは、ジメトキシトリチル基を示す。
【符号の説明】
【０１７６】
１ 一本鎖ＤＮＡ
２ 機能性分子
【配列表フリーテキスト】
【０１７７】
配列番号：１はリガンドを示す。
【０１７８】
配列番号：２はリガンドを示す。
【０１７９】
配列番号：３はリガンドを示す。
【０１８０】
配列番号：４はリガンドを示す。
【０１８１】
配列番号：５はリガンドを示す。
【０１８２】
配列番号：６はリガンドを示す。
【０１８３】
配列番号：７はリガンドを示す。
【０１８４】
配列番号：８はリガンドを示す。
【０１８５】
配列番号：９はリガンドを示す。
【０１８６】
配列番号：１０はリガンドを示す。
【０１８７】
配列番号：１１はリガンドを示す。
【０１８８】
配列番号：１２はリガンドを示す。
【０１８９】
配列番号：１３はリガンドを示す。
【０１９０】
配列番号：１４はリガンドを示す。
【０１９１】
配列番号：１５はリガンドを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、同一種の機能性分子又は異なる種の少なくとも２つの機能性分子が核酸スペーサーを介して連結した機能性高分子複合体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
物質の評価、医療等の用途に細胞を利用する場合、細胞本来の性質を再現させるために、生体外、すなわち、人工的な基材の上で、細胞の機能、例えば、接着、増殖、分化、未分化、細胞死等を精緻に制御する技術が必要となる。本来の性質を失った細胞の使用は、例えば、薬物の作用の誤った解釈、移植した細胞の生体に対する不適合等を招く場合があるという欠点がある。そのため、人工基材を種々改変する試みが活発になされている。その際に、細胞、特に、細胞表面受容体が認識できる細胞接着性の機能性分子が重要な機能を担うことになる。
【０００３】
機能性分子として、生体内から抽出した細胞外マトリクスであるコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン等を用いて、人工基材を被覆し、生体内と同等の環境を再現することで細胞機能を制御する研究が古くから行われている（例えば、非特許文献１、２参照）。また、機能性分子として、ホルモンやサイトカインを用いて、人工基材を被覆する方法を利用することによっても、生体内と同等の環境を再現することで細胞機能を制御する研究がなされている（例えば、非特許文献３参照）。
【０００４】
しかし、抽出した細胞外マトリクスによって細胞の機能を制御する方法では、生体内から精製できる細胞外マトリクスの種類が実質的に限られること、微量の抽出困難な細胞外マトリクスを用いることが実質的にできないこと、純度や不純物等の影響により再現性の高い結果を得ることが困難であること等の欠点がある。そのため、それぞれの細胞の、それぞれの機能に見合った環境を、人工基材上に設計して再構成することは困難であるのが現状である。
【０００５】
そこで、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン等の細胞外マトリクスに含まれたアミノ酸配列を有し、かつ細胞表面受容体が認識できる合成ペプチド分子を機能性分子として用い、密度及び種類を種々変更して人工基材上に被覆して細胞機能を制御する試みもなされている（例えば、非特許文献４、５）。
【０００６】
前記機能性分子を配列させる方法の１つとして、ナノメーターの長さを有する高分子スペーサーにより機能性分子同士を連結する技術（スペーサー法）が報告されている。
【０００７】
例えば、ダイ（Ｗ．Ｄａｉ）らは、フィブロネクチン中に含まれる配列であって、細胞表面受容体との相互作用に関与するアミノ酸配列から構成される機能性分子であるＲＧＤ分子同士又はラミニン中のアミノ酸配列から構成される機能性分子であるＹＩＧＳＲ分子同士を、平均分子量約３５００のポリエチレングリコール鎖を介して、結合させ、細胞凝集剤を製造することを報告している（例えば、非特許文献６参照）。
【０００８】
また、川崎らは、フィブロネクチン中に含まれるアミノ酸配列から構成される機能性分子であるＲＧＤ分子と、そのシナジー配列であるＰＨＳＲＮ分子とを、平均分子量約２５００〜約３４００のポリエチレングリコール鎖を介して結合させ、ヘテロリガンド分子を製造することを報告している（非特許文献７及び８参照）。同様に、フィブロネクチン中のアミノ酸配列から構成される機能性分子であるＲＧＤとＥＩＬＤＶとを結合させ、あるいはラミニン中の機能性分子であるＰＤＳＧＲとＹＩＧＳＲとを結合させ、分子を製造することが報告されている（例えば、非特許文献９及び１０参照）。
【非特許文献１】ＰＰ．Ｌａｎｚａ，Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ，Ｊ．Ｖａｃａｎｔｉ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（２０００）
【非特許文献２】小出輝、林利彦 編、細胞外マトリクス−基礎と臨床−、愛智出版（２０００）
【非特許文献３】Ｙ．Ｉｔｏ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０，２３３３（１９９９）
【非特許文献４】Ｕ．Ｈｅｒｓｅｌ，Ｃ．Ｄａｈｍｅｎ，Ｈ．Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２４，４３８５（２００３）
【非特許文献５】Ｈ．Ｓｈｉｎ，Ｓ．Ｊｏ，ＡＧ．Ｍｉｋｏｓ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２４，４３５３（２００３）
【非特許文献６】Ｗ．Ｄａｉ，Ｊ．Ｂｅｌｔ，ＷＭ．Ｓａｌｔｚｍａｎ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２，７９７−８０１（１９９４）
【非特許文献７】Ｓ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｙ．Ｋａｎｅｄａ，Ｎ．Ｏｋａｄａ，Ｓ．Ｎａｋａｇａｗａ，Ｋ．Ｋｕｂｏ，Ｓ．Ｉｎｏｕｅ，Ｍ．Ｍａｅｄａ，Ｙ．Ｙａｍａｓｈｉｒｏ，Ｋ．Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｔ．Ｍａｙｕｍｉ，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ，５，４２４−４２８（１９９４）
【非特許文献８】Ｙ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．Ｈｏｊｏ，Ｉ．Ｏｋａｚａｋｉ，Ｈ．Ｋａｍａｔａ，Ｍ．Ｓａｓａｋｉ，Ｍ．Ｍａｅｄａ，Ｍ．Ｎｏｍｉｚｕ，Ｙ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｓ．Ｎａｋａｇａｗａ，Ｔ．Ｍａｙｕｍｉ，Ｋ．Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．５０（９），１２２９−１２３２（２００２）
【非特許文献９】Ｍ．Ｍａｅｄａ，Ｙ．Ｉｚｕｎｏ，Ｋ．Ｋａｗａｓａｋｉ，ｙ．Ｋａｎｅｄａ，ｙ．Ｍｕ，ｙ．Ｔｓｕｔｓｕｍｉ，ＫＷ．Ｌｅｍ，Ｔ．Ｍａｙｕｍｉ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２４１，５９５−５９８（１９９７）
【非特許文献１０】Ｍ．Ｍａｅｄａ，Ｋ．Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｙ．Ｍｕ，Ｈ．Ｋａｍａｄａ，Ｙ．Ｔｓｕｔｓｕｍｉ，ＴＪ．Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｍａｙｕｍｉ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２４８，４８５−４８９（１９９８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、１つの側面では、様々な機能性分子を任意にナノメートルオーダーの距離で配列させること、溶液中での機能性分子間の距離を一定に設定して制御すること、機能性分子間の距離を長い距離で安定に保つこと、機能性高分子の種類の組み合わせを容易に変えることができること、任意の溶液中で機能性分子の機能を損なうことなく簡便にスペーサー分子に結合させることができること、機能性分子間の距離が長い機能性高分子複合体を簡便に、高い収率で製造すること等の少なくとも１つを可能にする、機能性高分子複合体の製造方法を提供することにある。なお、本発明の他の課題は、本明細書の記載等から明らかである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
すなわち、本発明は、
〔１〕 （Ｉ）生体高分子に対する結合活性を有する機能性分子と、該機能性分子に対する結合性部位を少なくとも１つ有する核酸又はその誘導体からなるスペーサーとを結合させて予備的機能性高分子（Ａ）を得る工程、
（ＩＩ）工程（Ｉ）で得られた予備的機能性高分子（Ａ）と、該予備的機能性高分子（Ａ）に含まれるスペーサーに対して相補性を有するスペーサーとを対合させ、予備的機能性高分子複合体（Ｂ）を得る工程、及び
（ＩＩＩ）工程（ＩＩ）で得られた予備的機能性高分子複合体（Ｂ）の少なくとも２種を連結させる工程
を含む、少なくとも２つの機能性分子を有する機能性高分子複合体の製造方法、
〔２〕 （Ｉ）生体高分子に対する結合活性を有する機能性分子に対する結合性部位を少なくとも１つ有する核酸又はその誘導体からなるスペーサーと、該スペーサーに対して相補性を有するスペーサーとを対合させ、予備的高分子複合体（Ｃ）を得る工程、
（ＩＩ）工程（Ｉ）で得られた予備的高分子複合体（Ｃ）と、機能性分子とを結合させ、予備的機能性高分子複合体（Ｂ）を得る工程、及び
（ＩＩＩ）工程（ＩＩ）で得られた予備的機能性高分子複合体（Ｂ）の少なくとも２種を連結させる工程
を含む、少なくとも２つの機能性分子を有する機能性高分子複合体の製造方法、並びに
〔３〕 （Ｉ）生体高分子に対する結合活性を有する機能性分子に対する結合性部位を少なくとも１つ有する核酸又はその誘導体からなるスペーサーと、該スペーサーに対して相補性を有するスペーサーとを対合させ、予備的高分子複合体（Ｃ）を得る工程、
（ＩＩ）工程（Ｉ）で得られた予備的高分子複合体（Ｃ）の少なくとも２種を連結させ、高分子複合体（Ｄ）を得る工程、及び
（ＩＩＩ）工程（ＩＩ）で得られた高分子複合体（Ｄ）に少なくとも２種の機能性分子を結合させる工程
を含む、少なくとも２つの機能性分子を有する機能性高分子複合体の製造方法
に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の機能性高分子複合体の製造方法によれば、様々な機能性分子を任意にナノメートルオーダーの距離で配列させることができるという優れた効果を奏する。また、本発明の機能性高分子複合体の製造方法によれば、機能性分子の位置関係をナノメートルオーダーで一定に制御された機能性高分子複合体を得ることができるという優れた効果を奏する。また、本発明の製造方法によれば、機能性分子間の距離が長い機能性高分子複合体を簡便に、高い収率で製造することができるという優れた効果を奏する。したがって、本発明の製造方法により得られた機能性高分子複合体によれば、機能性分子の位置関係がナノメートルオーダーで規定可能であり、本発明の製造方法により得られた機能性高分子複合体は、生体分子内あるいは生体分子間の距離を正確に推定する際に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本明細書において、ペプチドのアミノ酸配列は、慣用の生化学命名法に準拠したアミノ酸の１文字表記又は３文字表記により表される場合がある。かかる表記とアミノ酸との対応関係を以下に示す。Ａ又はＡｌａ：アラニン残基；Ｄ又はＡｓｐ：アスパラギン酸残基；Ｅ又はＧｌｕ：グルタミン酸残基；Ｆ又はＰｈｅ：フェニルアラニン残基；Ｇ又はＧｌｙ：グリシン残基；Ｈ又はＨｉｓ：ヒスチジン残基；Ｉ又はＩｌｅ：イソロイシン残基；Ｋ又はＬｙｓ：リジン残基；Ｌ又はＬｅｕ：ロイシン残基；Ｍ又はＭｅｔ：メチオニン残基；Ｎ又はＡｓｎ：アスパラギン残基；Ｐ又はＰｒｏ：プロリン残基；Ｑ又はＧｌｎ：グルタミン残基；Ｒ又はＡｒｇ：アルギニン残基；Ｓ又はＳｅｒ：セリン残基；Ｔ又はＴｈｒ：スレオニン残基；Ｖ又はＶａｌ：バリン残基；Ｗ又はＴｒｐ：トリプトファン残基；Ｙ又はＴｙｒ：チロシン残基；Ｃ又はＣｙｓ：システイン残基。
【００１３】
本発明は、１つの側面では、生体高分子に対する結合活性を有する少なくとも２つの機能性分子を、核酸又はその誘導体を含有した連結可能なスペーサー構造を介して連結させることを特徴とする、機能性高分子複合体の製造方法に関する。
【００１４】
本発明の製造方法は、機能性高分子複合体の製造に際して、核酸又はその誘導体を含有したスペーサー構造が用いられていることに１つの大きな特徴がある。
【００１５】
従って、本発明の製造方法によれば、様々な機能性分子を、所望の間隔で制御して配列させることができるという優れた効果を発揮する。また、本発明の製造方法によれば、前記機能性分子間の位置関係をナノメートルオーダーで実質的に一定に制御された機能性高分子複合体を得ることができるという優れた効果を発揮する。
【００１６】
また、本発明の製造方法は、機能性高分子複合体の製造に際して、連結可能なスペーサー構造が用いられていることにも１つの大きな特徴がある。
【００１７】
従って、本発明の製造方法によれば、様々な機能性分子を、所望の間隔で制御して、より容易に配列させることができるという優れた効果を発揮する。さらに、本発明の製造方法によれば、前記機能性分子間の位置関係をナノメートルオーダーで実質的に一定に制御して、機能性高分子複合体を作製することができるという優れた効果を発揮する。
【００１８】
本発明の製造方法では、機能性高分子複合体の製造に際して、互いに同一又は異なる少なくとも２つのスペーサー構造が用いられていることにも１つの特徴がある。
【００１９】
従って、本発明の製造方法によれば、前記スペーサー構造を介して、２つ以上の機能性分子を連結することができるという優れた効果を発揮する。
【００２０】
さらに、本発明の製造方法は、機能性高分子複合体の製造に際して、スペーサー構造を連結することに１つの大きな特徴がある。
【００２１】
従って、本発明の製造方法によれば、機能性分子間の距離が長い機能性高分子複合体を高い収率で製造することができるという優れた効果を発揮する。また、本発明の製造方法によれば、機能性分子間の距離が長い機能性高分子複合体を簡便に製造することができるという優れた効果を発揮する。
【００２２】
本発明の製造方法によれば、互いに異なる核酸鎖に少なくとも１つの機能性分子が配置された構造を有する機能性高分子複合体〔「機能性高分子複合体１」ともいう；例えば、図１の（Ａ）等参照〕、又は一方の一本鎖の核酸鎖上に少なくとも２つの機能性分子が配置され、かつ他方の一本鎖の核酸鎖上には存在しない構造を有する機能性高分子複合体〔「機能性高分子複合体２」ともいう；例えば、図１の（Ｂ）等参照〕を得ることができる。
【００２３】
本明細書において、前記「スペーサー構造」とは、２つ以上の機能性分子を連結するために使用されている構造体をいう。具体的には、本発明において、スペーサー構造は、機能性分子に対する結合活性を少なくとも１つ有する核酸又はその誘導体からなるスペーサーと、該スペーサーに対して相補性を有するスペーサー（本発明において、相補スペーサーともいう）とから構成される。
【００２４】
前記スペーサー構造は、連結可能な末端形状を有している。前記末端形状は、いわゆる突出末端であってもよく、平滑末端であってもよい。機能性分子間の距離を、より容易に制御する観点から、前記末端形状は突出末端であることが望ましい。
【００２５】
なお、本明細書において、機能性分子に対する結合活性を少なくとも１つ有する核酸又はその誘導体からなるスペーサー及び相補スペーサーを、「核酸スペーサー」ともいう。
【００２６】
本発明の機能性高分子複合体の製造方法において、機能性分子の種類、数、機能性分子間の距離等は、目的に応じて選択されうる。
【００２７】
本明細書において、前記「機能性分子」とは、生体高分子との間で結合活性を有する、合成又は天然の分子をいう。ここで、前記生体高分子としては、例えば、細胞、細胞外マトリクス、細胞間接着の受容体、その他各種生体組織表面におけるタンパク質、ホルモン、サイトカイン（増殖因子）、抗体、糖質等が挙げられる。
【００２８】
前記機能性分子の結合活性は、例えば、表面プラズモン解析、ゲルシフトアッセイ、ファージディスプレイ法等により、評価されうる。例えば、表面プラズモン解析による結合活性の評価は、生体高分子を固定化したチップに、評価対象の機能性分子を含有した溶液を、一定の流速で、送液し、適切な検出手段により相互作用を検出することにより行われうる。前記検出手段としては、例えば、蛍光強度、蛍光偏向度等による光学的検出手段；マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）、エレクトロスプレー・イオン化質量分析計（ＥＳＩ−ＭＳ）等の質量分析計；これらの組み合わせ等が挙げられる。ここで、機能性分子と生体高分子とからなる複合体の形成を示すセンサーグラムが呈示された場合、該機能性分子が結合活性を有することの指標となる。
【００２９】
本発明の製造方法においては、前記「少なくとも２つの機能性分子」は、互いに同一又は異なる機能性分子であってもよい。
【００３０】
本発明の製造方法に用いられる機能性分子は、化学的に誘導体化されたものであってもよい。
【００３１】
また、本明細書において、前記「受容体」とは、細胞に存在し、各種の生理活性物質を特異的に認識し、該生理活性物質の作用を伝達し発現する生体高分子をいう。前記受容体としては、例えば、細胞内に存在する受容体（以下、細胞内受容体ともいう）、形質膜上に存在する受容体（以下、細胞表面受容体ともいう）等が挙げられる。
【００３２】
細胞外マトリクスとしては、例えば、コラーゲン（例えば、プロコラーゲン等）、エラスチン、フィブロイン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、エンタクチン、テネイシン、アグリン、アンカリン、トロンボスポンジン、エンタクチン、オステオポンチン、オステオカルシン、フィブリノーゲン、プロテオグリカン等が挙げられる。また、前記プロテオグリカンとしては、例えば、アグリカン、アグリン、パールカン、デュリン、フィブロモジュリン、ブレビカン等が挙げられる。
【００３３】
なお、本発明の製造方法においては、前記細胞外マトリクスに由来する一部分の構造、すなわち、生体内の細胞マトリクスの断片又は該断片に対応する合成ペプチドを、機能性分子として用いてもよい。
【００３４】
前記「生体内の細胞マトリクスの断片」とは、細胞外マトリクスの一部分を化学的又は酵素的に切断し精製後に得られる、ある特定の細胞表面受容体が結合可能な精製断片をいう。前記生体内の細胞マトリクスの断片としては、特に限定されないが、例えば、ＣＮＢｒ処理されて得られるＩ型コラーゲンの精製断片（例えば、WD. Staatz, JJ. Walsh, T. Pexton, SA. Santoro, J. Biol. Chem., 265(9), 4778-4781(1990)に記載の断片等）；ＣＮＢｒやさらに必要に応じてトリプシン、サーモライシン、コラゲナーゼ等のプロテアーゼで処理をしたＩＶ型コラーゲンの精製断片（例えば、JA. Eble, R. Golbik, K. Mann, K. Kuhn, EMBO J., 12(12), 4795-4802(1993) に記載の方法により得られる三重らせん構造を有する断片；EC. Tsilibary, AS. Charonis, J. Cell. Biol., 103(6), 2467-2473(1986)に記載の方法により得られるＮＣ１ドメイン等）、フィブロネクチンをトリプシン又はペプシン等のプロテアーゼで処理することにより得られる細胞接着性の断片（例えば、SK. Akiyama, E. Hasegawa, T. Hasegawa, KM. Yamada, J. Biol. Chem., 260(24), 13256-13260(1985)参照）等が挙げられる。
【００３５】
また、前記「生体内の細胞マトリクスの断片に対応する合成ペプチド」とは、細胞外マトリクスに含まれるアミノ酸配列を含有し、かつある特定の細胞表面受容体が結合できる最小のアミノ酸配列の単位を有する化学的に合成されたオリゴペプチドをいう。
【００３６】
本発明において機能性分子として利用されうる全てのペプチドには、目的に応じて付加的なアミノ酸残基がそのＮ末端側及び／又はＣ末端側に結合していてもよい。
【００３７】
また、本発明において機能性分子として利用されうる合成ペプチドには、目的に応じて非天然型アミノ酸、化学的な修飾基、Ｌ体及びＤ体のアミノ酸のどちらか一方又はその両方等が含まれていてもよい。
【００３８】
前記合成ペプチドとしては、特に限定されないが、例えば、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、コラーゲン、トロンボスポンジン等に共通して含まれ、受容体が結合する最小のアミノ酸配列の単位として、アミノ酸が３個結合したＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列等が挙げられる。
【００３９】
前記ＲＧＤ配列を含む直鎖状の合成ペプチドであって、本発明において、機能性分子として用いうるペプチドのアミノ酸配列としては、具体的には、特に限定されないが、例えば、ＲＧＤ、ＲＧＤＳ、ＲＧＤＶ、ＲＧＤＴ、ＲＧＤＦ、ＧＲＧＤ、ＧＲＧＤＧ、ＧＲＧＤＳ、ＧＲＧＤＦ、ＧＲＧＤＹ、ＧＲＧＤＶＹ、ＧＲＧＤＹＰＣ、ＧＲＧＤＳＰ、ＧＲＧＤＳＧ、ＧＲＧＤＮＰ、ＧＲＧＤＳＹ、ＧＲＧＤＳＰＫ、ＹＲＧＤＳ、ＹＲＧＤＧ、ＹＧＲＧＤ、ＣＧＲＧＤＳＹ、ＣＧＲＧＤＳＰＫ、ＹＡＶＴＧＲＧＤＳ、ＲＧＤＳＰＡＳＳＫＰ（配列番号：１）、ＧＲＧＤＳＰＡＳＳＫＧ（配列番号：２）、ＧＣＧＹＧＲＧＤＳＰＧ（配列番号：３）、及びＧＧＧＰＨＳＲＮＧＧＧＧＧＧＲＧＤＧ（配列番号：４）等が挙げられる。
【００４０】
また、ＲＧＤ配列を含むペプチドを環状にすることで、受容体への結合活性を制御した機能性分子も本発明に利用することができる。
【００４１】
前記環状ペプチドとしては、特に限定されないが、例えば、ＧＰｅｎ＊ＧＲＧＤＳＰＣ＊Ａ、ＧＡＣ＊ＲＧＤＣ＊ＬＧＡ、ＡＣ＊ＲＧＤＧＷＣ＊Ｇ、シクロ（ＲＧＤｆ（ＮＭｅ）Ｖ）、シクロ（ＲＧＤｆＶ）、シクロ（ＲＧＤｆＫ）、シクロ（ＲＧＤＥｖ）、シクロ（ＧＲＧＤｆＬ）、シクロ（ＡＲＧＤｆＶ）、シクロ（ＧＲＧＤｆＶ）等が挙げられる。なお、ペプチド配列を示すアミノ酸一文字表記に含まれる小文字は、Ｄ−アミノ酸を示す。また、前記「Ｐｅｎ」は、ペニシラミンを示し、「＊」は、分子内でジスルフィド結合をしたシステイン残基を示す。以下も同様である。
【００４２】
本発明の製造方法では、前記ＲＧＤ配列以外にも種々の細胞外マトリクスに由来する最小のアミノ酸配列の単位を利用することができる。
【００４３】
細胞外マトリクスの１つであるフィブロネクチン由来の最小アミノ酸配列としては、特に限定されないが、例えば、ＮＧＲ、ＬＤＶ、ＲＥＤＶ、ＥＩＬＤＶ、ＫＱＡＧＤＶ等の配列が挙げられる。
【００４４】
また、細胞外マトリクスの１つであるラミニン由来の最小アミノ酸配列としては、特に限定されないが、例えば、ＬＲＧＤＮ、ＩＫＶＡＶ、ＹＩＧＳＲ、ＣＤＰＧＹＩＧＳＲ、ＰＤＳＧＲ、ＹＦＱＲＹＬＩ、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＡ（配列番号：５）等の配列が挙げられる。また、ラミニン由来の最小アミノ酸配列には、例えば、野水基義、蛋白質 核酸 酵素、第４５巻、１５号、２４７５−２４８２（２０００）等に記載の細胞接着活性のあるペプチドの配列等も包含される。前記細胞接着活性のあるペプチドの配列としては、例えば、ラミニンのα１鎖に由来するＲＱＶＦＱＶＡＹＩＩＩＫＡ（配列番号：６）、α１鎖Ｇドメインに由来するＲＫＲＬＱＶＱＬＳＩＲＴ（配列番号：７）等が挙げられる。
【００４５】
同様に、細胞外マトリクスの１つであるＩ型コラーゲン由来の最小アミノ酸配列としては、特に限定されないが、例えば、ＤＧＥＡ、ＫＤＧＥＡ及びＧＰＡＧＧＫＤＧＥＡＧＡＱＧ（配列番号：８）、ＧＥＲ、ＧＦＯＧＥＲ等の配列が挙げられる。
【００４６】
さらに、細胞外マトリクスの１つであるエラスチン由来の最小アミノ酸配列としては、特に限定されないが、例えば、ＶＡＰＧ、ＶＧＶＡＰＧ、ＶＡＶＡＰＧ等の配列が挙げられる。
【００４７】
さらに、細胞外マトリクスの１つであるトロンボスポンジン由来の最小アミノ酸配列としては、ＶＴＸＧ等の配列が挙げられる。
【００４８】
前記最小のアミノ酸配列の単位は、機能性分子として用いられる合成ペプチドに含有させることができる。
【００４９】
また、本発明の製造方法においては、前記機能性分子は、細胞外マトリクスに由来するもの以外の物質であってもよい。具体的には、単純に受容体に結合する物質、例えば、低分子物質として人工的に設計して合成された物質を、機能性分子として用いてもよい。
【００５０】
前記受容体に結合する物質は、細胞外マトリクスに由来する一部分の構造モチーフを含むものであってもよく、該構造モチーフを含まないものであってもよい。前記物質としては、例えば、α５β１インテグリンに対するリガンド分子として、Ｃ＊ＲＲＥＴＡＷＡＣ＊のペプチド等、α６β１インテグリンに対するリガンド分子として、ＶＳＷＦＳＲＨＲＹＳＰＦＡＶＳ（配列番号：９）のペプチド等、αＭβ２インテグリンに対するリガンド分子として、ＧＹＲＤＧＹＡＧＰＩＬＹＮ（配列番号：１０）のペプチド等が挙げられる。
【００５１】
さらに、本発明の製造方法においては、GA. Sulyok, C. Gibson, SL. Goodman, G. Holzemann, M. Wiesner, H. Kessler, J. Med. Chem., 44(12), 1938-1950(2001)等に記載されているような非ペプチド性の低分子物質であって、受容体に結合する低分子物質も機能性分子として利用可能である。
【００５２】
また、受容体のうち、例えば、シンデカン、ＮＧ２、ＣＤ４４等の受容体は、プロテオグリカンを含有することから、前記受容体中のアミノ酸配列を含有し、プロテオグリカンに対して結合するペプチドを機能性分子として用いることもできる。
【００５３】
プロテオグリカンに対して結合するペプチドのアミノ酸配列としては、特に限定されないが、例えば、ＢＢＸＢ、ＸＢＢＸＢＸ、ＸＢＢＢＸＸＢＸ等のコンセンサス配列が挙げられる。なお、前記「Ｘ」は、疎水性アミノ酸、「Ｂ」は、塩基性アミノ酸を示す。前記コンセンサス配列としては、具体的には、例えば、ＫＲＳＲ、ＦＨＲＲＩＫＡ（骨シアロタンパク質に由来）、ＰＲＲＡＲＶ（フィブロネクチンに由来）、ＷＱＰＰＲＡＲＩ等や、より長いペプチド配列として、ＹＥＫＰＧＳＰＰＲＥＶＶＰＲＰＲＰＧＶ（配列番号：１１）（フィブロネクチンに由来）、ＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲ（配列番号：１２）（ビトロネクチンに由来）、ＲＩＱＮＬＬＫＩＴＮＬＲＩＫＦＶＫ（配列番号：１３）（ラミニンに由来）等が挙げられる。
【００５４】
本発明の製造方法では、例えば、U. Hersel, C. Dahmen, H. Kessler, Biomaterials, 24, 4385-4415(2003)、JA. Hubbell, Bio/Technology, 13, 565-576(1995)、H. Shin, S. Jo, AG. Mikos, Biomaterials, 24, 4353-4364(2003)及びE. Koivunen, W. Arap, D. Rajotte, J. Lahdenranta, R. Pasqualini, J. Nuclear Med., 40(5), 883-888(1999)等やそれらの引用文献に記載されているような直鎖状又は環状の合成ペプチドを機能性分子として利用することができる。
【００５５】
前記「ホルモン」とは、動物組織の内分泌細胞によって生産・分泌され、血流によって標的細胞へ輸送され、外来性のシグナルとして標的細胞の活性を調節する物質をいう。前記ホルモンとしては、特に限定されないが、例えば、膵臓で生産されるインスリンやグルカゴン、副腎髄質で生産されるアドレナリンやノルアドレナリン、性腺で生産されるアンドロゲン、エストロゲン及びゲスターゲン等が挙げられる。また、前記細胞外マトリクスの場合と同様に、ホルモンの分子中に含まれるアミノ酸配列を有し、活性が期待できる一部の構造又は人工的に合成された物質を用いてもよい。
【００５６】
前記「サイトカイン」とは、細胞から放出され、免疫、炎症反応の制御作用、抗ウイルス作用、抗腫瘍作用、細胞増殖・分化の調節作用等の細胞間相互作用を媒介するタンパク質性因子をいう。前記サイトカインとしては、特に限定されるものではないが、例えば、インターロイキン類、インターフェロン類、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、リンホトキシン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、骨形成因子（ＢＭＰ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）等が挙げられる。
【００５７】
サイトカインについても、前記細胞外マトリクスの場合と同様に、それらの分子中に含まれ、活性が期待できる一部の構造又は人工的に合成された物質を用いてもよい。かかる物質としては、例えば、骨形成因子（ＢＭＰ）に関して、ＢＭＰ−２と同様の性質を示すＮＳＶＮＳＫＩＰＫＡＣＣＶＰＴＥＬＳＡＩ（配列番号：１４）のペプチド等が挙げられる（例えば、Y. Suzuki, M. Tanihara, K. Suzuki, A. Saitou, W. Sufan, Y. Nishimura, J. Biomed. Mater. Res., 50, 405-409(2000)）。また、前記物質としては、エリスロポエチンに関して、ＹＸＣＸＸＧＰＸＴＷＸＣＸＰ（Ｘは数種のアミノ酸で置換可能な位置を示す（ＮＣ．Ｗｒｉｎｇｔｏｎ，ＦＸ．Ｆａｒｒｅｌｌ，Ｒ．Ｃｈａｎｇ，ＡＫ．Ｋａｓｈｙａｐ，ＦＰ．Ｂａｒｂｏｎｅ，ＬＳ．Ｍｕｌｃａｈｙ，ＤＬ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，ＲＷ．Ｂａｒｒｅｔｔ，ＬＫ．Ｊｏｌｌｉｆｆｅ，ＷＪ．Ｄｏｗｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７３，４５８−４６３（１９９６）参照）のペプチド等が挙げられる。
【００５８】
なお、本発明の製造方法においては、CD. Reyes, AJ. Garcia, J. Biomed. Mater. Res., 65A, 511-523 (2003) に記載のように、例示されたアミノ酸配列等を含むペプチドが幾つか会合したような構造体を機能性分子として用いてもよい。
【００５９】
本発明の製造方法では、抗体を機能性分子として用いることもできる。前記抗体は、目的に応じて自由に選択でき、特に限定されないが、例えば、種々の細胞、細胞外マトリクス、その他各種生体組織表面におけるタンパク質、脂質その他の生体高分子に対する抗体等が挙げられる。具体的には、前記抗体としては、モノクローナル抗体、各種の抗インテグリン抗体、シンデカン、ＮＧ２、ＣＤ４４／ＣＳＰＧ等の細胞表面プロテオグリカンに対する抗体、抗カドヘリン抗体、抗セレクチン抗体等が挙げられる。前記抗体を機能性分子として用いる場合には、抗体そのものを用いてもよく、ペプシンやパパイン等のプロテアーゼ処理によって得られる断片等を用いてもよい。
【００６０】
本発明の製造方法では、糖質を機能性分子として用いることもできる。本発明の製造方法では、機能性分子として、単糖、数個（２〜１０個）の単糖の縮合体であるオリゴ糖、さらに多数の単糖からなる多糖等のいずれを用いてもよい。また、オリゴ糖や多糖には、構成糖の種類の違い、構成糖間の結合様式の違い、重合度の違い等によりきわめて多種類のものがあるが、本発明の製造方法では、受容体や生体高分子等に結合する能力を有する糖質であれば、機能性分子として用いることができる。
【００６１】
前記糖質としては、例えば、β−ガラクトース、ラクトース又は重合して接着性基質を形成することができる重合性ラクトースモノマー等、肝細胞上のアシアロ糖タンパク質受容体に結合する単糖類等；セレクチンに結合するものとして、シアル酸とフコースとを含むオリゴ糖であるシアリルルイスエックス（例えば、Ａ．Ｖａｒｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，７３９０−７３９７（１９９４）参照）等；ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸等のグリコサミノグリカン類等が挙げられる。
【００６２】
また、本発明の機能性分子として使用できる「細胞間接着の受容体に結合する分子」とは、それぞれの細胞膜外成分に存在する細胞間接着の受容体に結合する分子をいう。前記細胞間接着の受容体に結合する分子としては、特に限定されないが、例えば、ＮＣＡＭ、カドヘリン等が挙げられる。さらに、前記細胞間接着の受容体に結合する分子としては、例えば、セレクチンに対する受容体のうち、合成ペプチドとして、ＤＩＴＷＤＱＬＷＤＬＭＫ（配列番号：１５）等が挙げられる。本発明の製造方法では、前記細胞間接着の受容体に結合する分子を機能性分子として用いることにより、細胞−細胞間相互作用を模倣することができるという優れた効果を発揮する。
【００６３】
本発明の製造方法では、前記機能性分子として、細胞外マトリクス、ホルモン、サイトカイン（増殖因子）、抗体、糖質、細胞間接着の受容体に結合する分子等から、それぞれの細胞毎に最適なものを２つ以上選択することができる。機能性分子の配列をナノメートルオーダーで制御した機能性高分子複合体を実用的に製造する観点から、天然由来の機能性分子の断片、合成ペプチド分子、糖類及び人工的に合成された物質（低分子物質を含む）等やこれらの複合体を利用することが好ましい。なお、機能性分子が、ペプチドからなるものである場合、該ペプチドの鎖長は、アミノ酸３〜１５０残基程度であることが好ましい。また、機能性分子が、糖鎖からなる場合、該糖鎖の鎖長は、単糖１〜１００残基程度であることが好ましい。
【００６４】
本発明の機能性高分子複合体の製造方法において、機能性分子は、後述の核酸スペーサーに共有結合又は非共有結合によって結合される。
【００６５】
本発明の製造方法は、１つの側面では、少なくとも２つの同一又は異なる機能性分子とスペーサー構造、具体的には、核酸スペーサーとを結合させ、該機能性分子をナノメートルオーダーで配列させる方法である。
【００６６】
機能性分子間の間隔は、スペーサー構造長、すなわちスペーサー分子が伸長した状態での長さで規定される。スペーサー構造長、すなわち、シス配置で隣接する機能性分子間又はトランス配置で隣接する機能性分子間の距離は、それぞれの機能性分子の大きさや利用する目的によって最適な距離を選択すればよく、溶液中で剛直性を発揮させる観点から、好ましくは、１〜３００ｎｍの範囲であり、より好ましくは、５〜１００ｎｍの範囲である。
【００６７】
核酸スペーサーとしては、デオキシリボ核酸、リボ核酸又はそれらの誘導体等の基本骨格を有するものが挙げられる。なお、前記核酸等をまとめて、「核酸」ともいう。
【００６８】
前記デオキシリボ核酸（以下、「ＤＮＡ」ともいう）及びリボ核酸（以下、「ＲＮＡ」ともいう）は、それぞれデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドがモノマー単位となって、３’→５’ホスホジエステル結合したポリマーである。
【００６９】
本発明の製造方法では、スペーサー構造として、核酸スペーサー、例えば、前述の基本骨格を有するポリマーを用いることで、機能性分子の間隔を任意の距離に規定し、かつスペーサー部分の分子量が単一であるナノ構造を有する機能性高分子複合体が提供できるという優れた効果を発揮する。前記核酸スペーサーは、例えば、ポリエチレングリコール等の従来用いられているスペーサーと比較して、段階的・選択的にヌクレオチド等のモノマー単位を縮合させることができるため、長さの揃ったスペーサーが合成でき、分岐構造等複雑な高次構造を調製することができるという優れた効果を発揮する。
【００７０】
本発明の製造方法では、前記核酸スペーサーは、ＤＮＡおよびＲＮＡからなる群より選択された少なくとも２種を含む混合物からなるものでもよい。
【００７１】
本発明の製造方法においては、例えば、生体成分との接触条件において、機能性高分子複合体自体の安定性を増加させること、該機能性高分子複合体をエンザイムイムノアッセイ又は蛍光ラベル等によって定量分析すること、微粒子によりラベル化して電子顕微鏡等により観察すること等を可能とする観点から、前記核酸スペーサーは、化学的に修飾されていてもよい。
【００７２】
ここで、「化学的な修飾」とは、リン酸部位、リボース部位等の核酸の主鎖を化学的に改変すること、又は核酸塩基部位等に化学修飾を施すことをいう。
【００７３】
核酸の主鎖を化学的に改変する例としては、構造的に不安定なデオキシリボ核酸やリボ核酸のリン酸部分のチオール化等によりヌクレアーゼに対する耐性を向上させたホスホロチオエート等の化学的修飾体；フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体及びアレクサ等の発色団及び例えば、栗原靖之、武内恒成、松田洋一編「ｎｏｎ−ＲＩ実験の最新プロトコール−蛍光の原理と実際：遺伝子解析からバイオイメージングまで」別冊実験医学、羊土社（１９９９）等に記載されている発色団；ビオチン、ブロモデオキシウリジンやジゴキシゲニン等の抗原部位等を導入した化学的修飾体等が挙げられる。前記発色団あるいは、ビオチン、ブロモデオキシウリジン、ジゴキシゲニン等の抗原部位等の導入法としては、例えば、高橋豊三著「ＤＮＡプローブ−技術と応用―」シーエムシー（１９８８）や高橋豊三著「ＤＮＡプローブＩＩ−新技術と新展開―」シーエムシー（１９９０）等に記載されている方法等が挙げられる。
【００７４】
また、核酸スペーサーの原料となる一本鎖の核酸を合成する段階で、前記化学的修飾が施されてもよい。化学的修飾は、それぞれ最適な製法で行われ得、上述した目的に応じて選択でき、特に限定されるものではない。
【００７５】
前記核酸スペーサーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそれらの誘導体からなるものであって、一旦、機能性高分子複合体が形成された際には、その構造として少なくとも一部分が二重らせん、さらに、前記核酸スペーサーは、これらの構造単位が組み合わさって、さらに大きな一次元的、二次元的又は三次元的な構造体を形成してもよい。
【００７６】
本発明の製造方法においては、所望のスペーサー構造の形状を問わず、スペーサー原料は、一本鎖核酸であることが好ましい。前記一本鎖核酸は、１５０ヌクレオチド長、より実用的には、１００ヌクレオチド長程度の鎖長まで化学的に合成されうる。前記一本鎖核酸は、ホスホアミダイト法による固相合成法等により化学的に合成されうる。例えば、前記化学合成の段階で位置特異的に機能性分子を導入するための機能性分子結合用官能基を導入しておけば、その後、当該官能基に対して、機能性分子を、機能性分子が元来有するか又は該機能性分子に意図的に導入された核酸スペーサー結合用の官能基部分で結合させることによって、容易に機能性分子を所定の間隔をもってナノメートルオーダーで適正に配列させることができる。
【００７７】
また、前記核酸スペーサーに関して、ヌクレオチド３０量体を超える長鎖スペーサーの合成し易さの観点から、デオキシリボ核酸を核酸スペーサーとして利用するのが好ましい。特に、二重らせんのＤＮＡ鎖においては、１０ヌクレオチド長で３．４ｎｍの長さを有するという構造的にも明確である。したがって、本発明の製造方法においては、特に好ましくは、核酸スペーサーとして二重らせんのＤＮＡ鎖（以下、ｄｓＤＮＡと略称することがある）を使用することが望ましい。
【００７８】
機能性分子結合用官能基と、機能性分子の核酸スペーサー結合用官能基とは、互いに共有結合又は非共有結合を形成させて結合させればよい。
【００７９】
なお、スペーサーが複数の核酸からなる場合、機能性分子は、それぞれ、同一又は異なる核酸に結合されていればよい。例えば、核酸スペーサーが２本鎖を形成する核酸からなるものであり、かつ２つの機能性分子が核酸の５’末端又は３’末端にそれぞれ結合する場合、該核酸スペーサーには２つの５’末端及び３’末端が存在するが、同一核酸の当該両末端に機能性分子が結合すると機能性分子は同一の核酸に結合することになり、一方、いずれか一方の核酸の５’末端にいずれか一方の機能性分子が結合し、他方の核酸の５´末端に他方の機能性分子が結合すると、機能性分子は異なる核酸に結合することになる（例えば、図２参照）。
【００８０】
本発明の製造方法は、１つの実施態様では、
（Ｉ）生体高分子に対する結合活性を有する機能性分子と、該機能性分子に対する結合性部位を少なくとも１つ有する核酸又はその誘導体からなるスペーサーとを結合させて予備的機能性高分子（Ａ）を得る工程、
（ＩＩ）工程（Ｉ）で得られた予備的機能性高分子（Ａ）と、該予備的機能性高分子（Ａ）に含まれるスペーサーに対して相補性を有するスペーサーとを対合させ、予備的機能性高分子複合体（Ｂ）を得る工程、及び
（ＩＩＩ）工程（ＩＩ）で得られた予備的機能性高分子複合体（Ｂ）の少なくとも２種を連結させる工程を含む、製造方法である（本明細書中において「製造方法1」ともいう）。
【００８１】
前記製造方法１は、予備的機能性高分子（Ａ）と相補スペーサーとの対合に先立ち、機能性分子と該機能性分子に対する結合性部位を有するスペーサーとを結合させるため、かかる製造方法１によれば、予備的機能性高分子（Ａ）を製造する際に用いる機能性分子とスペーサーとの組み合わせを任意に選択することによって、少なくとも２種の機能性分子の組み合わせを任意に変えることができ、また、少なくとも２種の機能性分子間の距離を任意に設定し得るという優れた効果を発揮する。
【００８２】
本明細書において、前記「予備的機能性高分子（Ａ）」とは、少なくとも１つの機能性分子と、該機能性分子に対する結合性部位を有するスペーサーとを結合させた構築物をいう。
【００８３】
また、本明細書において、前記「予備的機能性高分子複合体（Ｂ）」とは、少なくとも１つの機能性分子と、該機能性分子に対する結合性部位を少なくとも１つ有する核酸又はその誘導体からなるスペーサーと、該スペーサーに対して相補性を有するスペーサーとから構成され、該機能性分子とスペーサーとが結合し、該スペーサーと相補スペーサーとが対合した状態にある複合体をいう。
【００８４】
前記製造方法１においては、前記予備的機能性高分子複合体（Ｂ）は、例えば、前記予備的機能性高分子（Ａ）と、前記予備的機能性高分子（Ａ）に含まれるスペーサーに対する相補性を有するスペーサーとを対合させることによって得られうる。
【００８５】
本明細書において、前記「対合」とは、水素結合を介して、２種の核酸が会合することを意図する。前記「対合」には、具体的には、「核酸のハイブリッド形成」及び「核酸のアニーリング」の概念をも包含する。なお、前記「対合」は、本発明の目的を妨げないものであれば、不完全相補の対合であってもよく、完全相補の対合であってもよい。
【００８６】
また、前記「連結」とは、少なくとも２種類の前記予備的機能性高分子複合体（Ｂ）を、適当な緩衝液中で、二本鎖核酸連結酵素の触媒作用によって連結させることをいう。
【００８７】
本発明の製造方法１の工程（Ｉ）では、生体高分子に対する結合活性を有する機能性分子と、該機能性分子に対する結合性部位を有するスペーサーとを結合させて、予備的機能性高分子（Ａ）を得る。
【００８８】
前記工程（Ｉ）において、前記機能性分子と核酸スペーサーとの結合は、例えば、機能性分子及び核酸スペーサーそれぞれに適切な官能基を導入し、該官能基を利用して行うことができる。本明細書中において、機能性分子に導入する官能基を、「核酸スペーサー結合用官能基」ともいい、核酸スペーサーに導入する官能基を、「機能性分子結合用官能基」ともいう。核酸スペーサー結合用官能基及び機能性分子結合用官能基は、特に限定されるものではなく、互いに対応して、該核酸スペーサー結合用官能基と機能性分子結合用官能基とが結合するように、適宜選択されうる。
【００８９】
核酸スペーサーに含まれる機能性分子結合用官能基と、機能性分子に含まれる核酸スペーサー結合用官能基との結合様式は、反応中における核酸スペーサーや機能性分子の分解、意図しない部位同士での非特異的な導入反応の発生が実質的に生じないものであれば、共有結合であってもよく、非共有結合であってもよい。
【００９０】
共有結合による導入反応としては、アミド結合形成反応（カルボジイミド等の縮合剤を用いてアミノ基とカルボキシル基を縮合させるか、又はアミノ基と予めＮ−ヒドロキシスクシンイミド等により活性化されたカルボキシル基活性エステルを反応させる方法等が例示できる）、マイケル付加反応（マレイミド基、アクリルエステル基、アクリルアミド基、ビニルスルホン基等のα，β−不飽和カルボニル基とチオール基を反応させる方法が例示できる）、チオエーテル形成反応（ハロアセチル基等のハロゲン化アルキル基やエポキシ基、アジリジン基等とチオールの反応が例示できる）、ディールスアルダー環化付加反応（シクロペンタジエン等の共役ジエン類とキノン等のオレフィン類とを反応させる方法が例示できる）、シッフベース形成反応（グリオキシル酸等のアルデヒド基とオキシアミノ基等のアミノ基を反応させる方法等が例示でき、形成されるシッフベース基は適切な還元剤で還元されていてもよい）、チアゾリジン環形成反応（アミノ基及びチオール基が残留したシステインとアルデヒド基を反応させる方法である）等が挙げられる。さらに、アミド結合形成反応としては、チオエステル基とアミノ基とチオール基が残留したシステインとを反応させてアミド結合を形成させる方法も例示される。
【００９１】
非共有結合による導入反応としては、例えば、錯体形成反応（例えば、トリニトリロ酢酸−ニッケル錯体とオリゴヒスチジンの三元錯体形成を利用したＨｉｓ−Ｔａｇ形成反応、金−チオール結合反応等）、生物学的な認識反応（例えば、糖鎖−レクチン反応、アビジン−ビオチン反応、抗原−抗体反応等）等が挙げられる。
【００９２】
導入反応は、機能性分子結合用官能基と核酸スペーサー結合用官能基との組み合わせを上記の反応様式で互いに結合し得るものとしておくことで行うことができる。そのような組み合わせは、上記を参照すれば適宜選択することができる。なお、前記導入反応は、光、熱、振動、時間、脱保護等別の因子によって開始されるものであってもよい。
【００９３】
核酸スペーサー結合用官能基として、機能性分子にもともと含まれる反応性のアミノ酸残基等や糖に含まれる反応性部位等を用いてもよく、機能性分子に核酸スペーサー結合用官能基を意図的に導入して用いてもよい。機能性分子に核酸スペーサー結合用官能基を導入する方法としては、核酸スペーサー用官能基を含有し、かつ機能性分子に結合する官能基を同一分子中に含有する二官能性試薬を使って、機能性分子を化学修飾する方法が挙げられる。ペプチドを含む機能性分子を化学修飾する１つの方法は、機能性分子を合成した後にアミノ酸残基の反応性等を利用して二官能性試薬を結合させるものであり、例えば駒野徹、志村憲助、中村研三、中村道徳、山崎信行編、大野素徳、金岡祐一、崎山文夫、前田浩著、「蛋白質の化学修飾＜上＞」生物化学実験法１２、学会出版センター（１９８１）等に記載されている公知の方法が用いられる。また、機能性分子を化学的に合成する段階で、Ｎ末端やアミノ酸残基等に対して、例えばＭＷ．Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，ＢＭ．Ｄｕｎｎ Ｅｄ．，“Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３５，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）等に記載されている公知の方法を用いることで自由に導入することが可能である。糖類を含む機能性分子に関しても同様のことがいえ、例えば糖鎖工学編集員会編「糖鎖工学」、産業調査会、バイオテクノロジー情報センター（１９９２）等に記載されている公知の方法を用いることができる。
【００９４】
一本鎖核酸、すなわち、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそれらの誘導体に対し、位置特異的に機能性分子結合用官能基を導入する方法として、例えば、高分子学会／バイオ・高分子研究会編「高分子化学と核酸の機能デザイン」、バイオ・高分子研究法６、学会出版センター（１９９６）やＹ．Ｉｔｏ，Ｅ．Ｆｕｋｕｓａｋｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌ．Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，２８，１５５−１６６（２００４）及び該文献に記載された参考文献等に記載された方法等が利用できる。
【００９５】
機能性分子結合用官能基を導入した一本鎖核酸は、機能性分子結合用官能基の核酸スペーサーにおける位置が特定できるものであればよく、例えば、リン酸部位やリボース又はデオキシリボース等を含む主鎖や核酸塩基等の部分に機能性分子結合用官能基を導入した化学的修飾体、５´末端や３´末端へ機能性分子結合用官能基を導入した化学的修飾体等が挙げられる。
【００９６】
核酸スペーサーと機能性分子結合用官能基との間及び／又は機能性分子と核酸スペーサー結合用官能基との間にはリンカーを含んでいてもよい。前記リンカーによれば、核酸スペーサーと機能性分子との間の距離を僅かに隔離しておくことができ、核酸スペーサーと機能性分子との間の反応において立体障害等を低減させて導入反応を迅速に進行させる機能や、本発明の製造方法で得られるナノ構造を有する機能性高分子複合体を細胞と接触させた場合に細胞表面受容体と機能性分子との結合反応を阻害しない機能等を発揮させることができるという優れた効果を発揮する。前記リンカーは、０．１〜５ｎｍ程度までの長さであれば、特に素材等に制限されるものではなく、例えば、アルキル鎖、ペプチド鎖、オキシエチレン鎖、オキシプロピレン鎖等やそれらが混合された構造であってもよい。なお、リンカーは、前記構造に限定されるものではなく、目的により最適なものが選ばれる。リンカーは、例えば、機能性分子結合用官能基、核酸スペーサー結合用官能基の一部として核酸スペーサー及び／又は機能性分子に導入しておけばよい。
【００９７】
ついで、前記製造方法１では、前記工程（Ｉ）で得られた予備的機能性高分子（Ａ）と、該予備的機能性高分子（Ａ）に含まれるスペーサーに対して相補性を有するスペーサーとを対合させることで予備的機能性高分子複合体（Ｂ）を得る〔工程（ＩＩ）という〕。
【００９８】
前記予備的機能性高分子（Ａ）に含まれるスペーサーに対して相補性を有するスペーサー（相補スペーサー）とは、前記工程（Ｉ）で得られた予備的機能性高分子（Ａ）に含まれるスペーサーに対して相補性を有し、５’末端にリン酸基を有する核酸又はその誘導体をさす。
【００９９】
なお、本発明において、前記相補スペーサーは、機能性分子結合用官能基を含んでいてもよく、含まなくてもよい。また、相補スペーサーが機能性分子結合用官能基を含んでいる場合であっても、該相補スペーサーには、機能性分子を結合させてもよく、結合させなくてもよい。
【０１００】
前記工程（ＩＩ）において、機能性分子が結合した相補スペーサーを用いた場合、それぞれの核酸鎖に機能性分子が配置された機能性高分子複合体を得ることができる。かかる機能性高分子複合体としては、例えば、図１の（Ａ）に示される機能性高分子複合体が挙げられる。また、前記工程（ＩＩ）において、機能性分子が結合していない相補スペーサーを用いた場合、一方の核酸鎖に機能性分子が配置された機能性高分子複合体を得ることができる。かかる機能性高分子複合体としては、例えば、図１の（Ｂ）に示される機能性高分子複合体が挙げられる。
【０１０１】
また、前記「５’末端にリン酸基を有する核酸又はその誘導体」とは、末端リボースの５’位がモノリン酸エステル化されたものを指す。リン酸基の導入方法としては、ホスホアミダイト法による固相合成法及びリン酸化酵素の触媒作用を利用する方法のいずれであってもよい。
【０１０２】
前記工程（ＩＩ）において、前記対合は、例えば、前記予備的機能性高分子（Ａ）に含まれるスペーサー中の核酸成分と、相補スペーサー中の核酸成分との間に適切な水素結合が生じる条件下で行われ得る。具体的には、前記対合は、特に限定されないが、例えば、慣用のアニーリング、ハイブリダイゼーションに準じて行われ得る。アニーリングは、特に限定はされないが、例えば、１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、５０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム溶液中で、９４℃で３０秒間熱変性させた後、５５℃で３０秒間アニーリングさせるなどの条件で行うことができ、また、ハイブリダイゼーションも、特に限定されないが、例えば、上記アニーリングと同様の条件で行うことができる。
【０１０３】
その後、前記製造方法１においては、前記工程（ＩＩ）で得られた予備的機能性高分子複合体（Ｂ）の少なくとも２種を連結させる〔工程（ＩＩＩ）という〕。
【０１０４】
前記工程（ＩＩＩ）において、前記連結は、例えば、少なくとも２種類の予備的機能性高分子複合体（Ｂ）を適当な緩衝液中で、二本鎖核酸連結酵素の触媒作用によって連結させることにより行われ得る。前記連結は、例えば、慣用のライゲーション方法に準じて行われ得、特に限定はされないが、例えば、連結酵素の存在下に、１６℃、３０分間インキュベートするなどの条件で行われ得る。なお、該工程（ＩＩＩ）において、連結させる該予備的機能性高分子複合体（Ｂ）の連結末端は３’突出末端あるいは平滑末端のいずれであってもよい。
【０１０５】
前記緩衝液としては、ｐＨが酵素活性に適した範囲に調整された塩を含む緩衝液であればよく、特に限定されないが、例えば、６６ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、６．６ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭジチオスレイトール、０．１ｍＭＡＴＰ等が挙げられる。
【０１０６】
また、前記二本鎖核酸連結酵素としては、ＤＮＡリガーゼであればよく、特に限定されないが、例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、大腸菌 ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ等が挙げられる。
【０１０７】
本明細書中においては、上述の製造方法１のように、核酸又はその誘導体からなるスペーサーと機能性分子とを予め結合させて、最初に予備的機能性高分子（Ａ）を得、以後の工程に該予備的機能性高分子（Ａ）を用いて、機能性高分子複合体を製造する方法を、「前変性法」ともいう。
【０１０８】
本発明の製造方法は、他の実施態様では、
（Ｉ）前記機能性分子に対する結合性部位を少なくとも１つ有する核酸又はその誘導体からなるスペーサーと、該スペーサーに対して相補性を有するスペーサー（相補スペーサー）とを対合させ、予備的高分子複合体（Ｃ）を得る工程、
（ＩＩ）工程（Ｉ）で得られた予備的高分子複合体（Ｃ）と、機能性分子を結合させ、予備的機能性高分子複合体（Ｂ）を得る工程、及び
（ＩＩＩ）工程（ＩＩ）で得られた予備的機能性高分子複合体（Ｂ）の少なくとも２種を連結させる工程、
を含む方法である（「製造方法２」ともいう）。
【０１０９】
本発明の製造方法２は、予備的高分子複合体（Ｃ）の機能性分子との結合に先立ち、前記機能性分子に対する結合性部位を少なくとも１つ有する核酸又はその誘導体からなるスペーサーと、該スペーサーに対して相補性を有するスペーサーとを対合させているため、かかる製造方法２によれば、核酸の折りたたみ等による立体障害等の影響を低減することができ、機能性分子の導入効率が高まるという優れた効果を発揮する。
【０１１０】
前記製造方法２の工程（Ｉ）においては、前記機能性分子に対する結合性部位を少なくとも１つ有する核酸又はその誘導体からなるスペーサーと、該スペーサーに対して相補性を有するスペーサー（相補スペーサー）を対合させ、予備的高分子複合体（Ｃ）を得る。
【０１１１】
ここで、前記機能性分子に対する結合性部位を少なくとも１つ有する核酸又はその誘導体からなるスペーサーと、相補スペーサーとの対合は、前記製造方法１の工程（ＩＩ）の場合と同様の手法により行われうる。
【０１１２】
前記工程（Ｉ）において、機能性分子が結合した相補スペーサーを用いた場合、それぞれの核酸鎖に機能性分子が配置された機能性高分子複合体を得ることができる。また、前記工程（Ｉ）において、機能性分子が結合していない相補スペーサーを用いた場合、一方の核酸鎖に機能性分子が配置された機能性高分子複合体を得ることができる。
【０１１３】
ついで、前記製造方法２では、前記工程（Ｉ）で得られた予備的高分子複合体（Ｃ）のスペーサーと、機能性分子とを結合させ、予備的機能性高分子複合体（Ｂ）を得る〔工程（ＩＩ）という〕。
【０１１４】
なお、本明細書において、前記「予備的高分子複合体（Ｃ）」とは、前記機能性分子に対する結合性部位を少なくとも１つ有する核酸又はその誘導体からなるスペーサーと、該スペーサーに対して相補性を有するスペーサーと対合させたものをいう。
【０１１５】
前記製造方法２においては、前記予備的機能性高分子複合体（Ｂ）は、前記予備的高分子複合体（Ｃ）に少なくとも１つの機能性分子を結合させることによって得られうる。
【０１１６】
前記工程（ＩＩ）において、予備的高分子複合体（Ｃ）のスペーサーと、機能性分子との結合は、前記製造方法１の工程（Ｉ）の場合と同様の手法により行われうる。
【０１１７】
その後、前記製造方法２では、工程（ＩＩ）で得られた予備的機能性高分子複合体（Ｂ）の少なくとも２種を連結させる〔工程（ＩＩＩ）という〕。
【０１１８】
前記工程（ＩＩ）において、少なくとも２種の予備的機能性高分子複合体（Ｂ）間の連結は、前記製造方法１の工程（ＩＩＩ）の場合と同様の手法により行われうる。
【０１１９】
本発明の製造方法は、更に他の実施態様では、
（Ｉ）該機能性分子に対する結合性部位を少なくとも１つ有する核酸又はその誘導体からなるスペーサーと、該スペーサーに対して相補性を有するスペーサー（相補スペーサー）とを対合させ、予備的高分子複合体（Ｃ）を得る工程、
（ＩＩ）工程（Ｉ）で得られた予備的高分子複合体（Ｃ）の少なくとも２種を連結させ、高分子複合体（Ｄ）を得る工程、及び
（ＩＩＩ）工程（ＩＩ）で得られた高分子複合体（Ｄ）に少なくとも２種の機能性分子を結合させる工程、
を含む方法である（「製造方法３」ともいう）。
【０１２０】
本発明の製造方法３は、スペーサーと相補スペーサーとを対合させて予備的高分子複合体（Ｃ）を得た後、機能性分子の結合に先立ち、少なくとも２種の予備的高分子複合体（Ｃ）を連結させて、高分子複合体（Ｄ）を得るために、かかる製造方法３によれば、高分子複合体（Ｄ）をまとめて製造しておくことにより、その中の必要量を、任意の種類あるいは量の機能性分子との結合あるいは化学的修飾に使用することができ、従って多様な機能性高分子複合体を効率的に製造することができるという優れた効果を発揮する。
【０１２１】
前記製造方法３の工程（Ｉ）においては、該機能性分子に対する結合性部位を少なくとも１つ有する核酸又はその誘導体からなるスペーサーと、該スペーサーに対して相補性を有するスペーサーを対合させ、予備的高分子複合体（Ｃ）を得る。
【０１２２】
前記工程（Ｉ）において、前記機能性分子に対する結合性部位を少なくとも１つ有する核酸又はその誘導体からなるスペーサーと、相補スペーサーとの対合は、前記製造方法１の工程（ＩＩ）の場合と同様の手法により行われうる。
【０１２３】
前記工程（Ｉ）において、機能性分子が結合した相補スペーサーを用いた場合、それぞれの核酸鎖に機能性分子が配置された機能性高分子複合体を得ることができる。また、前記工程（Ｉ）において、機能性分子が結合していない相補スペーサーを用いた場合、一方の核酸鎖に機能性分子が配置された機能性高分子複合体を得ることができる。
【０１２４】
ついで、前記製造方法３では、前記工程（Ｉ）で得られた予備的高分子複合体（Ｃ）の少なくとも２種を連結させ、高分子複合体（Ｄ）を得る〔工程（ＩＩ）という〕。
【０１２５】
本明細書において、「高分子複合体（Ｄ）」とは、前記機能性分子に対する結合性部位を少なくとも１つ有する核酸又はその誘導体からなるスペーサーと、該スペーサーに対して相補性を有するスペーサーと対合させたスペーサー構造を、少なくとも２つ連結させた高分子複合体をいう。
【０１２６】
前記工程（ＩＩ）において、少なくとも２種の予備的高分子複合体（Ｃ）の連結は、前記製造方法１の工程（ＩＩＩ）の場合と同様の手法により行われうる。
【０１２７】
その後、前記製造方法３では、前記工程（ＩＩ）で得られた高分子複合体（Ｄ）に、少なくとも２種の機能性分子を結合させる〔工程（ＩＩＩ）という〕。
【０１２８】
前記工程（ＩＩＩ）において、高分子複合体（Ｄ）と少なくとも２種の機能性分子との結合は、前記製造方法１の工程（Ｉ）の場合と同様の手法により行われうる。
【０１２９】
なお、本明細書中においては、上述の製造方法２または３のように、該機能性分子に対する結合性部位を少なくとも１つ有する核酸又はその誘導体からなるスペーサーと、該スペーサーに対して相補性を有するスペーサーを対合させて、最初に予備的高分子複合体（Ｃ）を得、その後、該予備的高分子複合体（Ｃ）又は該予備的高分子複合体（Ｃ）を使用して得られた高分子複合体（Ｄ）に機能性分子を結合させることによって本発明の機能性高分子複合体を製造する方法を、「後変性法」ともいう。
【０１３０】
かかる後変性法は、あらかじめ作製した二本鎖核酸スペーサーに対して機能性分子あるいは化学的修飾を導入する製造方法であるため、機能性分子または化学修飾の種類に変化を持たせた多様な機能性高分子複合体を製造することができるという優れた効果を発揮する。
【０１３１】
本発明における機能性高分子複合体の製造方法としては、前変性法及び後変性法のいずれも用いることができるが、核酸スペーサーに対する機能性分子の導入の簡便さ、及び機能性高分子の製造効率の観点から、前変性法のほうが好ましい。
【０１３２】
本発明の製造方法により得られる機能性高分子複合体において、ｄｓＤＮＡからなる核酸スペーサーの中で機能性分子を導入する好ましい位置としては、目的に応じて選択でき、特に限定されるものではなく、５’末端（途中分岐等が無い場合に限れば、計２箇所存在する）、及び３’末端（途中分岐等が無い場合に限れば、計２箇所存在する）等ｄｓＤＮＡスペーサーの末端部位や核酸塩基部位等ｄｓＤＮＡスペーサーの途中の任意の位置が挙げられる。２つの機能性分子を含有する場合を記載すると、ｄｓＤＮＡ鎖の２つの５’末端にそれぞれ機能性分子が結合した分子、又は２つの３’末端にそれぞれ機能性分子が結合した分子、又はそれらの組み合わされた分子（例えば、５’末端及び３’末端のそれぞれに機能性分子が結合した分子等）が挙げられる。３つ以上の機能性分子を導入する場合には空いている末端を利用することもできる。
【０１３３】
前変性法により機能性分子を導入するため、核酸スペーサーの原料となる１本鎖ＤＮＡ（以下、「ｓｓＤＮＡ」ともいう）に機能性分子結合用官能基をＤＮＡの化学合成の段階で導入する。機能性分子結合用官能基としては、上述したように種々のものが選択でき、特に限定されるものではなく、反応選択性を発揮する観点から、チオール基またはアミノ基を導入するのが好ましい。
【０１３４】
機能性分子には、チオール基またはアミノ基と結合活性を有する核酸スペーサー結合用官能基を導入しておくことが好ましい。前記チオール基と結合活性を有する核酸スペーサー結合用官能基としては、例えば、チオール基とマイケル付加反応させるためのマレイミド基、アクリルエステル基、アクリルアミド基、ビニルスルホン基等、チオール基とチオエーテル形成反応をさせるためのハロアセチル基、エポキシ基、アジリジン基等が挙げられる。この中でも機能性分子への導入のし易さ、安定性の点からマレイミド基やハロアセチル基が好適な核酸スペーサー結合用官能基として例示できる。
【０１３５】
機能性分子として、合成ペプチド分子を使用する場合、合成ペプチド分子を合成する際に、リジン残基等のアミノ基側鎖やＮ末端のアミノ基等に対して、カルボン酸や、酸クロライド、活性エステル基等を有する二官能性試薬であるマレイミド誘導体（例えば、マレイミド酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、４−マレイミドブタン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル等）又はハロアセチル誘導体（例えば、ブロモ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、６−（ヨードアセトアミド）カプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ヨード酢酸無水物等）を作用させることで、容易に機能性分子に対して核酸スペーサー結合用官能基を導入することができる。
【０１３６】
本発明の製造方法においては、前記ｓｓＤＮＡ及び機能性分子を用いることで、前変性法により機能性分子が導入されたｓｓＤＮＡを調製することができる。なお、このように機能性分子が導入されたｓｓＤＮＡを単に「コンジュゲート」ともいう。前記導入の際の反応条件や精製方法等は、特に限定されるものはなく、公知の方法が利用できる。
【０１３７】
本発明の製造方法においては、ｓｓＤＮＡにおける機能性分子結合用官能基の導入方法、部位及び官能基の種類、機能性分子における核酸スペーサー結合用官能基の導入方法、部位及び種類は、目的により適宜選択されうる。また、本発明の製造方法においては、核酸スペーサー構造は単純な二重らせんだけではなく、種々の複雑な構造、例えば、分岐構造や三次元構造、二次元的、三次元的に多重に核酸スペーサーが連結した構造等を持たせた機能性高分子複合体を作製できる。
【０１３８】
本発明の製造方法で得られた機能性高分子複合体は、単独で用いてもよく、２種以上の機能性高分子複合体を混合して用いてもよい。それぞれの細胞によって最適な使用形態が選択される。
【０１３９】
本発明の製造方法で得られた機能性高分子複合体は、必要に応じて、滅菌してもよい。滅菌方法は、特に限定されるものではなく、用途に応じて適宜選択されうる。前記滅菌方法としては、例えば、オートクレーブ滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、γ線滅菌、電子線滅菌、濾過滅菌等が挙げられる。
【実施例】
【０１４０】
以下、本発明を実施例等により具体的に説明するが、本発明はそれらにより何ら限定さ
れない。以下の実施例等において使用した測定方法又は評価方法をまとめて示す。
【０１４１】
（逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるペプチドの分析）
逆相ＨＰＬＣによるペプチドの分析は、以下のような条件で行った。カラムとして、商品名：ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ（東ソー株式会社製）を用いた。溶出の際の溶離液の流速は、１．０ｍＬ／分、検出波長は、２１０ｎｍに設定した。ペプチドは、５重量％〜１０重量％のアセトニトリルによる２０分のリニアグラジエントで溶出させた。前記リニアグラジエントには、０．０５重量％ トリフルオロ酢酸（以下、「ＴＦＡ」ともいう）を含有した５重量％ アセトニトリル水溶液と、０．０５重量％ ＴＦＡを含有した３０重量％ アセトニトリル水溶液とを用いた。
【０１４２】
（逆相ＨＰＬＣによるペプチドの精製）
逆相ＨＰＬＣによるペプチドの精製は、以下のような条件で行った。カラムとして、商品名：ＰＲＥＰ−ＯＤＳ（株式会社島津製作所製）を用いた。溶出の際の溶離液の流速１０ｍＬ／分、検出波長は、２１０ｎｍに設定した。ペプチドは、１０重量％〜２０重量％のアセトニトリルによる８分のリニアグラジエントで溶出させた。前記リニアグラジェントには、０．０５重量％ トリフルオロ酢酸を含有した１０重量％ アセトニトリル水溶液と、０．０５重量％ ＴＦＡを含有した２０重量％ アセトニトリル水溶液とを用いた。
【０１４３】
（マススペクトルの測定）
マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計〔商品名：Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ ＳＴＲ（アプライドバイオシステムズ社製）〕により、マトリクスとして、α−ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ（ＣＨＣＡ）を用いて、マススペクトルを測定した。
【０１４４】
（逆相ＨＰＬＣによる機能性分子が導入されたｓｓＤＮＡ（コンジュゲート）の分析）
逆相ＨＰＬＣによるコンジュゲートの分析は、以下のような条件で行った。カラムとして、商品名：ＯｌｉｇｏＤＮＡ ＲＰ（東ソー株式会社製）を用いた。流速は、１．０ｍＬ／分、検出波長は、２６０ｎｍに設定した。コンジュゲートは、５％のアセトニトリルを含む０．１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液で５分間溶出し、その後、５重量％〜３０重量％のアセトニトリルによる５０分のリニアグラジエントで溶出させた。前記リニアグラジエントには、５重量％のアセトニトリルを含有した０．１Ｍ 酢酸アンモニウム水溶液と、３０重量％のアセトニトリルを含有した０．１Ｍ 酢酸アンモニウム水溶液とを用いた。
【０１４５】
（ｓｓＤＮＡの濃度測定）
ｓｓＤＮＡ溶液 ２５μＬを、１０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．０） ９７５μＬに添加して希釈した。得られた希釈物について、１０ｍＭ トリス塩酸緩衝液のみでベース補正した分光光度計で、２６０ｎｍの吸光度を測定した。このとき測定される吸光度に４０を乗じた値をｓｓＤＮＡ溶液のＯＤ値とした。本実施例で用いられるｓｓＤＮＡのＯＤあたりの重量（μｇ）は、それぞれ計算されたＯＤ値から算出できる。ｓｓＤＮＡの分子量を用いることで、前記ＯＤ値を、モル濃度に換算できる。
【０１４６】
（ＤＮＡスペーサーを有する機能性高分子複合体の濃度測定）
以下の実施例で示されるリガンド構築物の濃度は、商品名：ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ＤＮＡ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ピアース社製）を用いて決定した。濃度既知のλＤＮＡ標準液を用いて検量線を作成した。記載した測定値は、全て３回測定の平均値である。
【０１４７】
以下の実施例では、本発明における最も単純な実施態様の１つを例示する。すなわち、機能性分子として、ＫＤＧＥＡペプチド（Ｉ型コラーゲンに由来する機能性分子）とＧＲＧＤＳペプチド（フィブロネクチンに由来する機能性分子）との２つの機能性分子、その２つの機能性分子間を繋ぐスペーサー構造として、相補的な塩基対を形成した二重らせん構造を有するｄｓＤＮＡ、２つの機能性分子の導入位置として、ｄｓＤＮＡに二箇所存在する５´末端とした。
【０１４８】
また、本発明において好適な長さとして記載した範囲のスペーサー構造が調製できることを示すため、ＤＮＡスペーサー構造の長さは、２０ｎｍ（ＤＮＡとしては６０量体）とした。以上の概念に従って設計された機能性高分子複合体の構造（模式図）を以下に示す。ＤＮＡスペーサー構造の長さが２０ｎｍの機能性高分子複合体を、ＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳと呼ぶ。
【０１４９】
【化１】
【０１５０】
以下の実施例で示される全ての機能性高分子複合体は前変性法を使用して調製されるため、まず、ｓｓＤＮＡに機能性分子を結合させたコンジュゲートが合成される。以下の実施例では、機能性分子に含まれる核酸スペーサー結合用官能基としてマレイミド基を選び、ＫＤＧＥＡペプチド分子及びＧＲＧＤＳペプチド分子それぞれのＮ末端に該マレイミド基が導入されたもの（それぞれマレイミド化ＫＤＧＥＡ、マレイミド化ＧＲＧＤＳと呼ぶ）を使用した。また、ｓｓＤＮＡには、機能性分子結合用官能基としてチオール基が５’末端に導入されているものを用いた。より具体的に構造を説明すると、５’末端のリン酸基に対して６−メルカプト−１−ヘキサノールのＯＨ部位が結合した状態となっている合成ｓｓＤＮＡである。合成された直後では、５’末端のチオール部位は、チオール基を有する保護基とジスルフィド結合とにより保護されている。これを脱保護してチオール基を生成し、マレイミド化ＫＤＧＥＡ又はマレイミド化ＧＲＧＤＳを導入してｓｓＤＮＡとのコンジュゲートを形成する。
【０１５１】
実施例１
DNAスペーサー構造として、２０ｎｍ（６０量体）のｄｓＤＮＡを有するＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳの調製法について説明する。合成プロセスの概略は図２の通りである。
【０１５２】
（マレイミド化ＫＤＧＥＡの合成）
Ｆｍｏｃ−Ａｌａ（なお、前記「Ｆｍｏｃ」は、９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌの略称である）が予め導入された樹脂（株式会社島津製作所製、商品名：ＰｒｅｌｏａｄｅｄＨＭＰレジン）から、マレイミド化ＫＤＧＥＡの合成を開始した。Ｆｍｏｃ基の脱保護は、２０重量％ ピペリジン（アプライドバイオシステムズ社製）／ジメチルホルムアミド（以下、ＤＭＦともいう）溶液を用いて行った。また、ペプチド鎖の伸長のための縮合反応は、前記レジン中のアミノ酸量に対して１０当量のＦｍｏｃ−ａａ（ａａは、適切に保護されたアミノ酸を示す）と、縮合試薬として１０当量のＨＢＴＵ〔株式会社島津製作所製；ＨＢＴＵは、２−（１−Ｈ−ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ−１，１，３，３−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍ ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅの略称である）、１０当量のＨＯＢｔ〔株式会社ペプチド研究所製；ＨＯＢｔは、１−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅの略称である〕及び２０当量のＤＩＥＡ（アプライドバイオシステムズ社製；ＤＩＥＡは、Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅの略称である）をＤＭＦに溶解して得られた溶液を、アミノ酸配列に対応して逐次的に前記レジンに添加することにより樹脂上で行った。Ｎ末端のＦｍｏｃ基を２０重量％ ピペリジン／ＤＭＦにより脱保護した。得られた産物に、生成した遊離のＮ末端アミノ基に対して５当量のＧＭＢＳ〔同仁化学株式会社製；ＧＭＢＳは、Ｎ−（４−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｕｔｙｒｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅの略称である〕と、１０当量のＤＩＥＡとをＤＭＦに溶解して加えた。４時間室温で反応させ、その後、得られた産物に、さらに１当量のＧＭＢＳを追加し、１時間室温で反応させた。得られた産物を保持した樹脂をＤＭＦで洗浄し、その後、該樹脂を、メタノール及びジエチルエーテルで洗浄した。洗浄後の樹脂を減圧乾燥した。樹脂からのマレイミド基含有ペプチドの切断には、９０容積％ ＴＦＡ（株式会社ペプチド研究所製）／５容積％ チオアニソール（アルドリッチ社製）／３容積％ Ｈ2Ｏ／２容積％ アニソール（Ｖ／Ｖ／Ｖ／Ｖ）溶液を用いた。前記溶液を、樹脂に添加し、得られた混合物を、２時間室温で攪拌した。その後、樹脂を濾別し、濾液を減圧下で濃縮した。残渣に冷却したジエチルエーテルを加えてペプチドを沈澱させ、固体を濾別して減圧乾燥した。得られたペプチドを、上述の条件下、精製用ＨＰＬＣにより精製した。単離されたペプチドは、分析用ＨＰＬＣでシングルピーク（保持時間１０．４分）であることを確認した。また、マススペクトルによって前記ペプチドの分子量を測定するとｍ／ｚ＝６８４．６０［Ｍ＋Ｈ］+であり、計算値とよく一致した。凍結乾燥して固体のマレイミド化ＫＤＧＥＡを得た。
【０１５３】
（マレイミド化ＧＲＧＤＳの合成）
Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒが予め導入されたレジン（株式会社島津製作所製、商品名：ＰｒｅｌｏａｄｅｄＨＭＰレジン）を用いて、前記マレイミド化ＫＤＧＥＡの場合と同様の方法で合成した。得られた粗ペプチドを、上述の条件下、精製用ＨＰＬＣにより精製した。単離されたペプチドは分析用ＨＰＬＣでシングルピーク（保持時間８．６分）であることを確認した。また、マススペクトルによって前記ペプチドの分子量を測定するとｍ／ｚ＝６５６．６１［Ｍ＋Ｈ］+であり、計算値とよく一致した。凍結乾燥して固体のマレイミド化ＧＲＧＤＳを得た。
【０１５４】
（チオール基を含有するｓｓＤＮＡの脱保護）
ＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳの原料となるチオール基が保護されたｓｓＤＮＡは、ＰＳ−Ｓ−ＳＰ２０Ａ及びＰＳ−Ｓ−ＳＰ２０Ｂの２種類である（図２参照）。ＰＳ−Ｓ−ＳＰ２０Ａ（シグマジェノシス社製）を１００ｎｍｏｌ／ｍＬとなるように、ＴＥバッファー（１ｍＭＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ８．０）に溶解させた。得られた溶液 ０．２ｍＬに対して、０．０８Ｍジチオスレイトール溶液（０．２５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解して作製）を０．２ｍＬ混合し、その後、得られた混合物を室温で１６時間攪拌した。溶離液〔０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．０）〕で平衡化したファルマシアバイオテク社製、商品名：ＮＡＰ−５カラムにより精製して、チオール基が脱保護されたＨＳ−ＳＰ２０Ａを得た。得られた産物について、２６０ｎｍの吸光度を測定することによりＨＳ−ＳＰ２０Ａの濃度を決定した。同様にＰＳ−Ｓ−ＳＰ２０Ｂも脱保護してHＳ−ＳＰ２０Ｂを得た。得られたＨＳ−ＳＰ２０Ｂの濃度を、同様に決定した。結果を表１に示す。
【０１５５】
【表１】
【０１５６】
（ＫＤＧＥＡ−Ｓ−ＳＰ２０Ａ及びＧＲＧＤＳ−Ｓ−ＳＰ２０Ｂの調製）
上述のように脱保護して得られたＨＳ−ＳＰ２０Ａへのマレイミド化ＫＤＧＥＡの結合形成により、以下のように、ＫＤＧＥＡ−Ｓ−ＳＰ２０Ａ（図２を参照）を調製した。
【０１５７】
ＨＳ−ＳＰ２０Ａ溶液（濃度１７．０ｎｍｏｌ／ｍＬ） ０．８ｍＬと、ＨＳ−ＳＰ２０Ａに対して２５当量のマレイミド化ＫＤＧＥＡを０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に溶解させた溶液 ０．８ｍＬとを混合し、４℃で２４時間反応させた。得られた反応溶液を凍結乾燥させた。得られた産物を、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．０） ０．５ｍＬに溶解させた。得られた溶液を、溶離液で平衡化したＮＡＰ−５（商品名）を用いたゲル濾過に供して、ＫＤＧＥＡ−Ｓ−ＳＰ２０Ａを精製した。なお、前記溶離液として、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた。得られた産物について、２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、ＨＳ−ＳＰ２０Ａ（表１）のデータを利用して、ＫＤＧＥＡ−Ｓ−ＳＰ２０Ａの濃度を決定した。同様に、マレイミド化ＧＲＧＤＳとＨＳ−ＳＰ２０ＢのコンジュゲートであるＧＲＧＤＳ−Ｓ−ＳＰ２０Ｂを得た。得られたＧＲＧＤＳ−Ｓ−ＳＰ２０Ｂの濃度を同様に決定した。結果を表２に示す。
【０１５８】
【表２】
【０１５９】
また、全てのコンジュゲートが、ＨＰＬＣによりシングルピークであることが確認できた。
【０１６０】
（ＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳの調製）
ＫＤＧＥＡ−Ｓ−ＳＰ２０Ａ及びＧＲＧＤＳ−Ｓ−ＳＰ２０Ｂの各３２量体のＤＮＡ部位にそれぞれ相補的に結合する、５´末端がリン酸化された、２８量体のｓｓＤＮＡであるＳＰ２０Ｃを準備した。ＫＤＧＥＡ−Ｓ−ＳＰ２０Ａ、ＧＲＧＤＳ−Ｓ−ＳＰ２０Ｂ、ＳＰ２０Ｃ、緩衝液（１Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．６），５０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１Ｍ ＮａＣｌ）及びＨ２Ｏを、それぞれ表３に示す量で混合した。得られた混合物を、９４℃で３０秒間、次いで５５℃で３０秒間インキュベーションして、ＫＤＧＥＡ−Ｓ−ＳＰ２０ＡとＳＰ２０Ｃ、及びＧＲＧＤＳ−Ｓ−ＳＰ２０ＢとＳＰ２０Ｃとをそれぞれアニーリングさせた。アニーリング後の反応液のうち９０μＬを取り出し、ＤＮＡライゲーションキット（商品名：ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｖｅｒ．１）、タカラバイオ社製）の酵素溶液９０μＬと混合した。得られた混合液に対して、１６℃で６０分間、ライゲーション反応を行った。ライゲーション反応後の反応液を、スピンカラム（商品名：ＱＩＡ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、キアゲン社製）により精製して、ＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳを得た。
【０１６１】
【表３】
【０１６２】
また、得られたＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳを、定法に従ったポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、核酸スペーサー部分の検出を行った。その結果、得られたＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳのｄｓＤＮＡが６０量体であることが確認できた。これによりｄｓＤＮＡからなるスペーサー構造が設計どおりの長さで合成できたことが分かった。商品名：ＰｉｃｏＧｒｅｅｎによって濃度を定量したところ、４８．０μｇ／ｍＬであった。ＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳのｄｓＤＮＡ部分の分子量を約３６８００とすると１．３ｎｍｏｌ／ｍＬと計算される。
【０１６３】
（機能性高分子複合体が持つ細胞の機能を制御する性能の評価）
細胞の機能を制御する性能は、マウス由来の未成熟骨芽細胞（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞）を成熟した骨芽細胞に分化させる能力を比較することにより評価した。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を、１０重量％牛胎仔由来血清（ＦＢＳ）を添加したα−ＭＥＭ（ギブコ社製、α−ＭＥＭはＡｌｐｈａ−Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍの略称である）培地で培養した。その後、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を９０％コンフルエント状態時にトリプシン処理により回収した。１０ｍＭ β−グリセロリン酸（シグマ社製）と５０μｇ／ｍＬ アスコルビン酸（シグマ社製）と１０重量％ ＦＢＳ（シグマ社製）とを添加したα−ＭＥＭに、１９０００個／ｍＬとなるように、前記ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を再分散させた。その後、ＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳを以下に示す方法により固定化した１２ウェルプレートに１ウェルあたり２ｍＬとなるように前記ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を播種した。この時の細胞密度は、５０００個／ｃｍ2であった。３７℃、５容積％ ＣＯ2を含む湿潤空気中で前記ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を培養した。３日毎に培地の交換を行った。１１日後にＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞のアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性を測定した。前記ＡＬＰ活性をＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の分化度合の指標として、機能性高分子複合体が持つ細胞の機能を制御する性能を評価した。
【０１６４】
培養後の細胞をトリプシン処理により回収し、０．５ｍＬのＰＢＳに再分散した。得られた分散液を用い、細胞数を、ビルケルチルク氏血球計算盤で計数した。その後、分化の指標として、細胞のＡＬＰ活性の測定を行った。ＡＬＰ活性測定は、基質溶液〔商品名：ＦＡＳＴ ｐ−ＮＩＴＲＯＰＨＥＮＹＬ ＰＨＯＳＰＨＡＴＥ ＴＡＢＬＥＴ ＳＥＴＳ（シグマ社製）を溶解して使用した〕を用いて、ｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）法により行った。ここで、基質であるｐＮＰＰが、ＡＬＰによりｐ−ニトロフェノールとなり黄色を呈することを利用し、一定時間に生じるｐ−ニトロフェノール量で酵素活性値を示した。ｐ−ニトロフェノールの生成量は、ｐ−ニトロフェノールをＰＢＳに溶解させたものを検量線の作成に使用した。また、細胞膜の溶解には、界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎTM Ｘ−１００（シグマ社製）を用いた。９６ウェルプレートに、細胞液又は検量線溶液 １００μＬと、０．３重量％ＴｒｉｔｏｎTM Ｘ−１００ ５０μＬと、基質溶液 １００μＬとを入れ、得られた混合物を３７℃で１時間インキュベーションして反応を行った。得られた反応産物に、３Ｎ 水酸化ナトリウム水溶液 ５０μＬを添加し、酵素反応を停止させた。その後、得られた産物について、マイクロプレートリーダー（デカン社製ジェニオス）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。１個の細胞あたりのＡＬＰ活性（細胞１個あたりのｐ−ニトロフェノールの生成速度（ｆｍｏｌ／分／細胞））を算出した。
【０１６５】
試験例１
（ポリ−Ｌ−リジン表面の調製）
ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）塩酸塩（ペプチド研究所製、平均分子量約８０００以上）を１０ｍｇ／ｍＬとなるようにリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解させた。なお、これ以降の操作は、安全キャビネット内で全て滅菌した器具や緩衝液を使用して行った。得られた溶液を０．２μｍ内径のフィルターを通して濾過滅菌し、ＰＢＳでさらに１０倍に希釈して、１ｍｇ／ｍＬのＰＬＬ溶液を得た。得られたＰＬＬ溶液を、ヌンク社製のデルタ処理１２ウェルプレートに対して１ウェルあたり０．５ｍＬ添加し、ついで、プレートを密封した。前記プレートを３７℃で２時間インキュベーションすることにより、該プレートにＰＬＬを吸着させた。その後、前記プレートからＰＬＬ溶液を吸引してウェル内から除去した。さらに、前記プレートに、１ウェルあたり１ｍＬのＰＢＳを添加して３分間放置し、アスピレーションする洗浄操作を３回行い、ＰＬＬ表面を調製した。
【０１６６】
（ポリイオンコンプレックス形成によるポリ−Ｌ−リジン表面への機能性高分子複合体の固定化）
全ての操作は安全キャビネット内で全て滅菌した器具や緩衝液を使用して行った。実施例１で調製した機能性高分子複合体、すなわち、ＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳを目標密度となるように、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈した。得られた希釈物を、０．２μｍ内径のフィルターで濾過滅菌した。滅菌後の産物を、ＰＬＬ表面を形成させた１２ウェルプレートに対して１ウェルあたり０．５ｍＬとなるように添加した。ここで、前記産物 ０．５ｍＬ中に０．４５ｐｍｏｌのＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳを含むようにした。１２ウェルプレートの場合、１ウェルに液体を０．５ｍＬ入れると液体が覆う面積は、約４．５ｃｍ2となる。したがって、この場合のリガンド構築物が全てＰＬＬ表面に結合したときの密度は、１００ｆｍｏｌ／ｃｍ2と判断される。その後、４℃において１２時間以上吸着させた。吸着後の機能性高分子複合体溶液を回収した。ついで、得られた機能性高分子複合体溶液について、商品名：ＰｉｃｏＧｒｅｅｎによりｄｓＤＮＡ濃度を測定し、添加した機能性高分子複合体がどの程度ＰＬＬ表面に固定化されているかを確認した。その結果を表４に示す。
【０１６７】
【表４】
【０１６８】
その結果、機能性高分子複合体がＰＬＬ表面に固定化されたことが分かった。
【０１６９】
試験例２
（機能性高分子複合体が持つ細胞の機能を制御する性能の評価）
実施例１で作製したＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳを固定化したＰＬＬ表面が持つ、細胞の機能を制御する性能を評価した。既に説明したようにＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳがマウス由来の未成熟骨芽細胞（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞）を成熟した骨芽細胞に分化させる能力（ＡＬＰ活性）を比較することにより行った。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を培養して１１日目の１細胞あたりのＡＬＰ活性を測定した結果を表５に示す。
【０１７０】
【表５】
【０１７１】
比較例１
（ポリエチレングリコールスペーサーを有する機能性高分子の調製）
リガンド分子としてＫＤＧＥＡ分子とＧＲＧＤＳ分子とを含有し、かつ平均分子量約３０００のポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと略称することがある）をスペーサーとする機能性高分子を合成した。Ｆｍｏｃ基により保護されたアミノ基及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドにより活性化されたカルボキシル基をもう１つの末端に持つＦｍｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（ＮＥＫＴＡＲ社製，分子量３４００）をＰＥＧスペーサー結合部位として用いた以外は、非特許文献７および８に記載された方法を適用し、ＫＤＧＥＡ−ＰＥＧ−ＧＲＧＤＳを合成した。
【０１７２】
（ポリエチレングリコールスペーサーを有する機能性高分子のディッシュ表面への固定化）
９ｎｍｏｌ／ｍＬとなるようにＫＤＧＥＡ−ＰＥＧ−ＧＲＧＤＳを純水に溶解させた。得られた溶液を、１２ウェルプレート（Ｎｕｎｃ社製、デルタ処理）のウェルに、１ウェルあたり０．５ｍＬ添加した。前記プレートを、そのままクリーンベンチ内で放置し、溶液を風乾した。前記プレートのウェルに、３容積％ ウシ血清アルブミン／ＤＭＥＭ（ギブコ社製、ＤＭＥＭはＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍの略称である）を１ウェルあたり２ｍＬ添加して室温１時間静置した。その後、溶液を吸引した。０．１容積％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＤＭＥＭ溶液を、前記プレートの１ウェルあたり２ｍＬ入れてアスピレーションする一連の洗浄操作を３回行って、機能性高分子を固定化した表面を調製した。
【０１７３】
（ポリエチレングリコールスペーサーを有する機能性高分子を固定化した表面による細胞機能制御）
以上のように調製した１２ウェルプレートを用いて、実施例１の機能性高分子複合体を用いた場合と全く同じ条件で、かつ同時に細胞機能の評価を行った。その結果、１１日間培養を続けるとＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞がプレート底面から剥がれてしまった。また、１細胞あたりのＡＬＰ活性は、２８ｆｍｏｌ／ｍｉｎ／ｃｅｌｌであり、きわめて低かった。かかる結果は、比較例１で得られたプレートの表面では細胞機能の制御ができなかったことを意味する。
【産業上の利用可能性】
【０１７４】
本発明の製造方法により得られる機能性高分子複合体を用いて、細胞表面、細胞外マトリクス、その他の生体組織表面におけるタンパク質、糖質等の生体高分子内の特定の部位間の距離あるいは、複数の同一又は異なるタンパク質、糖質その他の生体分子間の距離を推定することは、細胞、細胞外マトリクス、その他の生体組織の構造を知る上で、また、それらの生体分子間の相互作用の有無を推定する上で有用である。また、細胞表面上の複数の特定の部位に同時に結合することによって、細胞に対して同時に信号を与え、その細胞の反応を観察することは、それらの生体分子の機能を調べることは細胞生理学上非常に有用である。本発明の製造方法により得られる機能性高分子複合体は、例えば、前記学問の発展により、医療、診断、医薬品等有用物質の製造等の分野に大きく寄与するものである。
【図面の簡単な説明】
【０１７５】
【図１】図１は、機能性高分子複合体の一例を示す。
【図２】図２は、スペーサー構造として２０ｎｍ（６０量体）のｄｓＤＮＡを有するＫＤＧＥＡ−ＳＰ２０−ＧＲＧＤＳの調製法に関する合成プロセスの一例を示す概略図である。図中、DMTは、ジメトキシトリチル基を示す。
【符号の説明】
【０１７６】
１ 一本鎖ＤＮＡ
２ 機能性分子
【配列表フリーテキスト】
【０１７７】
配列番号：１はリガンドを示す。
【０１７８】
配列番号：２はリガンドを示す。
【０１７９】
配列番号：３はリガンドを示す。
【０１８０】
配列番号：４はリガンドを示す。
【０１８１】
配列番号：５はリガンドを示す。
【０１８２】
配列番号：６はリガンドを示す。
【０１８３】
配列番号：７はリガンドを示す。
【０１８４】
配列番号：８はリガンドを示す。
【０１８５】
配列番号：９はリガンドを示す。
【０１８６】
配列番号：１０はリガンドを示す。
【０１８７】
配列番号：１１はリガンドを示す。
【０１８８】
配列番号：１２はリガンドを示す。
【０１８９】
配列番号：１３はリガンドを示す。
【０１９０】
配列番号：１４はリガンドを示す。
【０１９１】
配列番号：１５はリガンドを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ｉ）生体高分子に対する結合活性を有する機能性分子と、該機能性分子に対する結合性部位を少なくとも１つ有する核酸又はその誘導体からなるスペーサーとを結合させて予備的機能性高分子（Ａ）を得る工程、
（ＩＩ）工程（Ｉ）で得られた予備的機能性高分子（Ａ）と、該予備的機能性高分子（Ａ）に含まれるスペーサーに対して相補性を有するスペーサーとを対合させ、予備的機能性高分子複合体（Ｂ）を得る工程、及び
（ＩＩＩ）工程（ＩＩ）で得られた予備的機能性高分子複合体（Ｂ）の少なくとも２種を連結させる工程
を含む、少なくとも２つの機能性分子を有する機能性高分子複合体の製造方法。
【請求項２】
（Ｉ）生体高分子に対する結合活性を有する機能性分子に対する結合性部位を少なくとも１つ有する核酸又はその誘導体からなるスペーサーと、該スペーサーに対して相補性を有するスペーサーとを対合させ、予備的高分子複合体（Ｃ）を得る工程、
（ＩＩ）工程（Ｉ）で得られた予備的高分子複合体（Ｃ）と、機能性分子とを結合させ、予備的機能性高分子複合体（Ｂ）を得る工程、及び
（ＩＩＩ）工程（ＩＩ）で得られた予備的機能性高分子複合体（Ｂ）の少なくとも２種を連結させる工程
を含む、少なくとも２つの機能性分子を有する機能性高分子複合体の製造方法。
【請求項３】
（Ｉ）生体高分子に対する結合活性を有する機能性分子に対する結合性部位を少なくとも１つ有する核酸又はその誘導体からなるスペーサーと、該スペーサーに対して相補性を有するスペーサーとを対合させ、予備的高分子複合体（Ｃ）を得る工程、
（ＩＩ）工程（Ｉ）で得られた予備的高分子複合体（Ｃ）の少なくとも２種を連結させ、高分子複合体（Ｄ）を得る工程、及び
（ＩＩＩ）工程（ＩＩ）で得られた高分子複合体（Ｄ）に少なくとも２種の機能性分子を結合させる工程
を含む、少なくとも２つの機能性分子を有する機能性高分子複合体の製造方法。
【請求項１】
（Ｉ）生体高分子に対する結合活性を有する機能性分子と、該機能性分子に対する結合性部位を少なくとも１つ有する核酸又はその誘導体からなるスペーサーとを結合させて予備的機能性高分子（Ａ）を得る工程、
（ＩＩ）工程（Ｉ）で得られた予備的機能性高分子（Ａ）と、該予備的機能性高分子（Ａ）に含まれるスペーサーに対して相補性を有するスペーサーとを対合させ、予備的機能性高分子複合体（Ｂ）を得る工程、及び
（ＩＩＩ）工程（ＩＩ）で得られた予備的機能性高分子複合体（Ｂ）の少なくとも２種を連結させる工程
を含む、少なくとも２つの機能性分子を有する機能性高分子複合体の製造方法。
【請求項２】
（Ｉ）生体高分子に対する結合活性を有する機能性分子に対する結合性部位を少なくとも１つ有する核酸又はその誘導体からなるスペーサーと、該スペーサーに対して相補性を有するスペーサーとを対合させ、予備的高分子複合体（Ｃ）を得る工程、
（ＩＩ）工程（Ｉ）で得られた予備的高分子複合体（Ｃ）と、機能性分子とを結合させ、予備的機能性高分子複合体（Ｂ）を得る工程、及び
（ＩＩＩ）工程（ＩＩ）で得られた予備的機能性高分子複合体（Ｂ）の少なくとも２種を連結させる工程
を含む、少なくとも２つの機能性分子を有する機能性高分子複合体の製造方法。
【請求項３】
（Ｉ）生体高分子に対する結合活性を有する機能性分子に対する結合性部位を少なくとも１つ有する核酸又はその誘導体からなるスペーサーと、該スペーサーに対して相補性を有するスペーサーとを対合させ、予備的高分子複合体（Ｃ）を得る工程、
（ＩＩ）工程（Ｉ）で得られた予備的高分子複合体（Ｃ）の少なくとも２種を連結させ、高分子複合体（Ｄ）を得る工程、及び
（ＩＩＩ）工程（ＩＩ）で得られた高分子複合体（Ｄ）に少なくとも２種の機能性分子を結合させる工程
を含む、少なくとも２つの機能性分子を有する機能性高分子複合体の製造方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００６−４５２０７（Ｐ２００６−４５２０７Ａ）
【公開日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１９３１８７（Ｐ２００５−１９３１８７）
【出願日】平成１７年６月３０日（２００５．６．３０）
【出願人】（０００００１０８５）株式会社クラレ (1,607)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年６月３０日（２００５．６．３０）
【出願人】（０００００１０８５）株式会社クラレ (1,607)
【Ｆターム（参考）】
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