第１段階粒子および第２段階粒子を含む多段階送達ビヒクルが開示される。第１段階粒子は、第２段階粒子を含有するマイクロ粒子またはナノ粒子である。第２段階粒子は、治療剤または造影剤などの活性剤を含む。この多段階送達ビヒクルにより、生物学的バリアーの連続的な克服または迂回が可能になる。この多段階送達ビヒクルは、複数のビヒクルを含む組成物の一部として投与される。この多段階送達ビヒクルを作製する方法も提供される。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦支援の研究または開発に関する陳述
米国政府は、ＤＯＤ助成番号Ｗ８１ＸＷＨ−０４−２−００３５プロジェクト１６；ＮＡＳＡ助成番号ＳＡ２３−０６−０１７；およびＮＩＨ助成番号ＮＣ１ １Ｒ２１ＣＡ１２２２８６４−０１の条件によって提供されるように、本発明における支払済みライセンスおよび限定された状況において権利を有し、特許権者に、他者に適当な条件で実施許諾することを要求する。
【０００２】
本発明は、一般に、ナノテクノロジーの分野、特に、治療剤および造影剤などの活性剤の送達用にマイクロ粒子および／またはナノ粒子を利用する組成物、ならびにそのような組成物を作製する方法および使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
健康および疾患の基礎的な理解における過去四半世紀の進歩は、臨床医学において匹敵する進展につながっていない。わずかな損傷しか伴わず、または付帯的損傷を伴うことなく所望の標的に選択的に到達するように治療成分を投与する能力の不足が、この不一致の主な理由である。例えば、Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．Ｎａｔｕｒｅ ３９２、５〜１０（１９９８）；およびＤｕｎｃａｎ，Ｒ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２、３４７〜３６０（２００３）を参照されたい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
理想的には、治療剤または造影剤などの活性剤は、脈管構造を通って移動し、十分な濃度で意図された標的に到達し、次いで望まれない副作用を引き起こすことなく、患部細胞および患部組織のみに選択的に作用するべきである。残念ながら、現在の最良の療法でさえ、この理想的な挙動に到達することに大きく失敗している。
【０００５】
「ナノベクター（nanovector）」としても知られている、ナノスケールおよびマイクロスケール薬物送達システムは、健康に有害な副作用を低減しながら、治療についての治療指数を最適化する、すなわち効力を最大にするという課題に対する解決策を提供するための有望な候補である。この目標に向けた比較的小さな量の進歩でさえ、医学の多数の分野にわたって実質的な利益を歴史的に生じさせている。例えば、腫瘍学のサブフィールドから、感染症の治療ほどのかけ離れた分野への転用可能性は、その進歩が根底の技術基盤において１つの共通点を有していたという事実によって可能にされる。例えばリポソームは、カポジ肉腫の治療用に１０年を超える前に健康管理の結実に到る最初のナノベクター療法であるが、乳癌および卵巣癌、ならびに真菌感染の治療においても進展をもたらした。
【０００６】
現在、数千でなくとも、数百の異なるナノベクター技術基盤が、リポソームに加わっており、それぞれは、異なる性質、長所、および短所を有する。様々なナノベクター基盤として、ポリマーベースの基盤、デンドリマー、金ナノシェル、半導体ナノ結晶、フラーレン、生物学的に誘導されたナノコンストラクト、シリコンおよびシリカベースのナノシステム、ならびに超常磁性ナノ粒子が挙げられ、文献に記載されている^{４９〜７５}。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ある特定の実施形態では、マイクロ粒子またはナノ粒子であり、（ｉ）本体、（ｉｉ）少なくとも１つの表面、および（ｉｉｉ）本体内部に少なくとも１つの貯蔵部を有する少なくとも１種の第１段階粒子であって、この貯蔵部が、少なくとも１種の活性剤を含む少なくとも１種の第２段階粒子を含有する第１段階粒子を含む組成物が提供される。
【０００８】
ある特定の実施形態では、マイクロ粒子またはナノ粒子であり、（ｉ）本体、（ｉｉ）少なくとも１つの表面、および（ｉｉｉ）本体内部に少なくとも１つの貯蔵部を有する少なくとも１種の第１段階粒子であって、この貯蔵部が、少なくとも１種の活性剤を含む少なくとも１種の第２段階粒子を含有する第１段階粒子を含む組成物を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０００９】
さらに別の実施形態では、（Ａ）マイクロ粒子またはナノ粒子であり、（ｉ）本体、（ｉｉ）少なくとも１つの表面、および（ｉｉｉ）本体内部に少なくとも１つの貯蔵部を有する、少なくとも１種の第１段階粒子を提供するステップと、（Ｂ）少なくとも１種の第２段階粒子を提供するステップと、（Ｃ）この少なくとも１種の第２段階粒子を、第１段階粒子の貯蔵部内部に装填するステップとを含む、多段階送達システムを作製する方法が提供される。これらおよび他の実施形態、特徴、および利点は、以下の説明および図面を参照して明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の実施形態による多段階送達ビヒクルを例示する図である。第１段階粒子は、第２段階粒子を内部に含有する。第２段階粒子は、治療剤または造影剤などの、少なくとも１種の活性剤を含むことができる。第１段階粒子は、追加の作用剤、例えば、透過エンハンサー、または造影剤もしくは治療剤であってもよい、追加の活性剤なども内部に含有する。場合により、第２段階粒子は、第３段階粒子を含有する。標的化部分、例えば、第１段階粒子表面に結合した抗体、アプタマーまたはリガンドなどは、選択された身体部位で局在化を促進する。
【図２Ａ】実施形態により、血管内に投与される多段階送達ビヒクルの作用の原理を例示する図である。第１段階粒子は、標的の脈管構造の位置で局在化する。局在化すると、この粒子は、脈管構造中に開窓を生成する透過エンハンサーを放出する。第２段階部分は、抗体などの標的化部分を担持する。第２段階粒子は、開窓を通じて浸透し、抗体を使用して、表面マーカー抗原を担持する特定の細胞を標的にすることができる。
【図２Ｂ】実施形態により、血管内に投与される多段階送達ビヒクルの作用の原理を例示する図である。第１段階粒子は、標的の脈管構造の位置で局在化する。局在化すると、この粒子は、脈管構造中に開窓を生成する透過エンハンサーを放出する。第２段階部分は、抗体などの標的化部分を担持する。第２段階粒子は、開窓を通じて浸透し、抗体を使用して、表面マーカー抗原を担持する特定の細胞を標的にすることができる。
【図３】パネルＡは、ＡＰＴＥＳ修飾「粗孔」ＬＰおよび「細孔」ナノ多孔質シリコン第１段階粒子中の、アミノおよびカルボキシ修飾量子ドット（ｑ−ドット）の時間依存性を示すグラフである。パネルＢは、第２段階ＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴナノ粒子濃度の、ナノ多孔質シリコン第１段階粒子中へのその装填への効果を示すグラフである。パネルＡおよびＢにおいて、Ｙ軸は平均蛍光量を示す。
【図４】パネルＡ〜Ｄは、ナノ多孔質シリコン第１段階粒子中への第２段階ナノ粒子の装填の時間ダイナミクスを示すグラフである。パネルＡは、「粗孔」（ＬＰ）酸化シリコン第１段階粒子についてであり、パネルＢは、ＬＰ ＡＰＴＥＳ修飾シリコン第１段階粒子についてであり、パネルＣは、「細孔」（ＳＰ）酸化シリコン第１段階粒子についてであり、パネルＤは、ＳＰ ＡＰＴＥＳ修飾シリコン第１段階粒子についてである。パネルＡ〜Ｄにおいて、Ｙ軸は平均蛍光量を示す。
【図５】ＬＰ酸化ナノ多孔質シリコン第１段階粒子（パネルＡ）およびＬＰ ＡＰＴＥＳ修飾ナノ多孔質シリコン第１段階粒子（パネルＢ）からの、第２段階ナノ粒子の放出の時間ダイナミクスを示すグラフである。パネルＡおよびパネルＢにおいて、Ｙ軸は放出されたペイロード（％）を示す。
【図６Ａ】パネルＡは、カルボキシ修飾量子ドットおよびＦＩＴＣ結合単一壁カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）の装填の濃度効果を示すグラフである。パネルＡのＹ軸は平均蛍光（％）を示す。パネルＢは、フルオレッセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合単一壁カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）の蛍光消光を示すグラフである。
【図６Ｂ】第２段階粒子をナノ多孔質シリコン粒子中に装填するための化学的条件の最適化に関するグラフである。ナノ多孔質シリコン粒子を、漸増濃度のＴＲＩＳの存在下で、第２段階ナノ粒子（図６ＢのパネルＣおよびパネルＤにおいてＱ−ドット；パネルＥおよびパネルＦにおいてＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴ）と混合した。高濃度のＴＲＩＳにより、第１段階シリコン粒子中に装填されるＱ−ドットの量を増加させることが助長された（パネルＣおよびパネルＤ）。一方、ＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴの装填効率は、２０ＭｍのＴＲＩＳでそのピークに到達し、次いでより高いＴＲＩＳ濃度で減少した（パネルＥおよびパネルＦ）。パネルＢ〜ＦのＹ軸は平均蛍光量を示す。
【図７】それぞれＳＷＮＴ第２段階粒子に結合されたＦＩＴＣの、ＬＰナノ多孔質シリコン第１段階粒子中への装填および放出についてのデータを示すグラフである。パネルＡは、装填カラムを示し、洗浄の前にＦＩＴＣ−ＳＷＮＴ溶液に暴露した後の、ナノ多孔質シリコン第１段階粒子中に最初に装填されたＦＩＴＣ−ＳＷＮＴの量に相当する。パネルＡ中の洗浄カラムは、第１段階粒子を洗浄した後のＦＩＴＣ−ＳＷＮＴの量に相当する。第１段階粒子中のＦＩＴＣ−ＳＷＮＴの実際の装填量は、洗浄後に第１段階粒子中に保持されたＦＩＴＣ−ＳＷＮＴの量、すなわち、装填カラムと洗浄カラムのそれぞれの値の間の差である。パネルＢは、時間に対する、第１段階粒子からのＦＩＴＣ−ＳＷＮＴの放出についてのデータを示す。時間とともに第１段階粒子から放出されたＦＩＴＣ−ＳＷＮＴの全量、すなわち、パネルＢ中のすべてのカラムの合計は、パネルＡ中のそれぞれの装填および洗浄カラムの間の差に実施的に対応する。パネルＡおよびＢのＹ軸はＦＩＴＣ−ＳＷＮＴの量（ｎｇ）を示す。
【図８Ａ】ナノ多孔質シリコン第１段階粒子中への、脂質ベース第２段階粒子の装填についてのデータを示す図である。図８Ａにおいて、パネルＡ〜Ｃは、１ミクロンのナノ多孔質シリコン第１段階粒子中に装填された陽イオン性および中性リポソームについてのデータを示す。パネルＡは、中性リポソーム（左）および陽イオン性リポソーム（右）の共焦点顕微鏡像を示す。パネルＢおよびＣは、それぞれ、１ミクロンのナノ多孔質シリコン第１段階粒子中への、中性および陽イオン性リポソームの装填のＦＡＣＳ分析およびＥｘｃｅｌ定量化を示す。パネルＢのＹ軸は粒子数を示し、パネルＣのＹ軸は緑色蛍光量（対数値）を示す。
【図８Ｂ】ナノ多孔質シリコン第１段階粒子中への、脂質ベース第２段階粒子の装填についてのデータを示す図である。図８Ｂにおいて、パネルＤは、３．５ミクロンのナノ多孔質酸化シリコン第１段階粒子中に、Ａｌｅｘａ５５５標識ＳｉＲＮＡを含有するリポソームを装填する時間ダイナミクスを示す。パネルＤのＹ軸は平均蛍光量を示す。パネルＥおよびパネルＦは、３．５ミクロンのナノ多孔質酸化シリコン第１段階粒子中のＡｌｅｘａ５５５標識ＳｉＲＮＡを含有するリポソームに関連する蛍光を可視化する蛍光顕微鏡像を示す。
【図９】パネルＡ〜Ｄは、「粗孔」（ＬＰ）ナノ多孔質シリコン第１段階粒子の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）像を示す図である。
【図１０】パネルＡ〜Ｄは、「細孔」（ＳＰ）ナノ多孔質シリコン第１段階粒子の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）像を示す図である。
【図１１】パネルＡ〜Ｄは、Ｚ２Ｃｏｕｌｔｅｒ（登録商標）粒子計数器を使用して測定した、ナノ多孔質シリコン粒子の分解を示すグラフである。パネルＡおよびＢのＹ軸は、粒子の数を示す。パネルＣおよびＤのＹ軸は、粒子の体積を示す。
【図１２Ａ】誘導結合プラズマ原子発光分析を使用して測定した、ナノ多孔質シリコン粒子の分解を示すグラフである。図１２ＡのパネルＡは、ＬＰ酸化シリコン粒子についてであり、パネルＢは、ＳＰ酸化シリコン粒子についてである。図１２Ａ〜１２ＢのＹ軸は、シリコンの濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示す。
【図１２Ｂ】誘導結合プラズマ原子発光分析を使用して測定した、ナノ多孔質シリコン粒子の分解を示すグラフである。図１２ＢのパネルＣは、ＬＰ ＡＰＴＥＳ修飾シリコン粒子についてである。パネルＤは、ＳＰ ＡＰＴＥＳ修飾シリコン粒子についてである。図１２Ａ〜１２ＢのＹ軸は、シリコンの濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示す。
【図１３】選択したナノ多孔質シリコン粒子およびヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の明視野顕微鏡像を示すことによって、ナノ多孔質シリコン第１段階粒子の生体適合性を示す図である。特に、パネルＡは、細孔酸化シリコンナノ粒子についての像を示し、パネルＢは、細孔ＡＰＴＥＳ修飾シリコンナノ粒子についての像を示し、パネルＣは、粗孔酸化シリコンナノ粒子についての像を示し、パネルＤは、粗孔ＡＰＴＥＳ修飾シリコンナノ粒子についての像を示す。パネルＡ〜Ｄのそれぞれにおいて、左から右に、第１の像は０日目（粒子を添加して２時間後）であり、第２の像は１日目であり、第３の像は２日目であり、第４の像は３日目である。
【図１４Ａ】ナノ多孔質シリコンナノ粒子と共にインキュベートしたＨＵＶＥＣ細胞への乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）毒性アッセイについてのデータを示すことによって、ナノ多孔質シリコン粒子の生体適合性を示すグラフである。パネルＡ〜ＦのＹ軸は、４９０ｎｍでの吸光度を示す。
【図１４Ｂ】ナノ多孔質シリコンナノ粒子と共にインキュベートしたＨＵＶＥＣ細胞への乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）毒性アッセイについてのデータを示すことによって、ナノ多孔質シリコン粒子の生体適合性を示すグラフである。パネルＡ〜ＦのＹ軸は、４９０ｎｍでの吸光度を示す。
【図１５Ａ】ナノ多孔質シリコンナノ粒子と共にインキュベートしたＨＵＶＥＣ細胞へのＭＴＴ増殖アッセイについてのデータを示すグラフである。図１５ＡのパネルＡ〜ＢのＹ軸は、５７０ｎｍでの吸光度を示す。
【図１５Ｂ】ナノ多孔質シリコンナノ粒子と共にインキュベートしたＨＵＶＥＣ細胞へのＭＴＴ増殖アッセイについてのデータを示すグラフである。図１５ＢのパネルＣ〜ＦのＹ軸は、５７０ｎｍでの吸光度を示す。
【図１６】パネルＡ〜Ｃは、ナノ多孔質シリコン粒子と共にインキュベートし、そのサイズおよび形状を分析したＨＵＶＥＣ細胞のＦＡＣＳ ３次元プロファイルを示す図である。
【図１７Ａ】細胞周期を研究するために、ナノ多孔質シリコン第１段階粒子と共にインキュベートし、ヨウ化プロピジウムで染色したＨＵＶＥＣ細胞のＦＡＣＳ ３次元プロファイルを示す図である。
【図１７Ｂ】細胞周期を研究するために、ナノ多孔質シリコン第１段階粒子と共にインキュベートし、ヨウ化プロピジウムで染色したＨＵＶＥＣ細胞のＦＡＣＳ ３次元プロファイルを示す図である。
【図１７Ｃ】細胞周期を研究するために、ナノ多孔質シリコン第１段階粒子と共にインキュベートし、ヨウ化プロピジウムで染色したＨＵＶＥＣ細胞のＦＡＣＳ ３次元プロファイルを示す図である。
【図１７Ｄ】細胞周期を研究するために、ナノ多孔質シリコン第１段階粒子と共にインキュベートし、ヨウ化プロピジウムで染色したＨＵＶＥＣ細胞のＦＡＣＳ ３次元プロファイルを示す図である。
【図１８Ａ】ナノ多孔質シリコン第１段階粒子に暴露された細胞の細胞周期の異なる位相の統計分析を示すグラフである。図１８ＡのパネルＡ〜ＣのＹ軸は、全細胞集団の％を示す。
【図１８Ｂ】ナノ多孔質シリコン第１段階粒子に暴露された細胞の細胞周期の異なる位相の統計分析を示すグラフである。図１８ＢのパネルＤ〜ＧのＹ軸は、全細胞集団の％を示す。
【図１８Ｃ】ナノ多孔質シリコン第１段階粒子に暴露された細胞の細胞周期の異なる位相の統計分析を示すグラフである。図１８ＣのパネルＨ〜ＫのＹ軸は、全細胞集団の％を示す。
【図１９】パネルａおよびｂは、多孔質シリコン粒子のＳＥＭ像を示す図である。「粗孔」（ＬＰ、図１９ａ）および「細孔」（ＳＰ，パネルｂ）の粒子像であり、（左から右に）裏面、前面、断面、裏面上の孔および断面内の孔のさらなる近接視野を示している。ＬＰおよびＳＰ粒子のサイズおよび形状は同じであるが、孔のサイズおよび構造は著しく異なる。
【図２０】ナノ多孔質シリコン粒子中への、蛍光標識Ｑ−ドットおよびＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴの装填のフローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡観察の結果を示す図である。装填溶液中のナノ粒子量の増加により、フローサイトメトリー（パネルＡおよびＢ）によって測定される、シリコン粒子の平均蛍光量が増加する（◆ＬＰ ＡＰＴＥＳ＋カルボキシルＱ−ドット ●ＬＰ酸化＋アミノＱ−ドット ■ＳＰ ＡＰＴＥＳ＋カルボキシルＱ−ドット ▲ＳＰ酸化＋アミノＱ−ドット）。蛍光顕微鏡観察（パネルＣおよびＤ）により、使用されるナノ粒子の量がより少ない場合、第１段階粒子に関連する蛍光は、より弱いことが確認された。パネルＡおよびＢのＹ軸は、平均蛍光量を示す。
【図２１】ナノ多孔質シリコン第１段階粒子中の第２段階粒子の時間依存性の装填および放出を示すグラフである。４つの異なる種類のナノ多孔質シリコン第１段階粒子（ＬＰ酸化（パネルａ）、ＬＰ ＡＰＴＥＳ（パネルｂ）、ＳＰ酸化（パネルｃ）、およびＳＰ ＡＰＴＥＳ（パネルｄ））に、異なる第２段階ナノ粒子（●カルボキシルｑ−ドット、■アミノｑ−ドット、▲ＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴ）を装填し、その蛍光をフローサイトメトリーによって測定した。パネルｅ〜ｈのヒストグラムは、時間の経過とともに、第１段階シリコン粒子から放出された第２段階粒子のパーセンテージを表す。
【図２２】シリコン粒子の裏面の非常に多孔質な領域における、Ｑ−ドットの集中した装填を示す共焦点顕微鏡像を示す図である。パネルａは、様々な視点を表示すために回転した１個の多孔質シリコン粒子を示す、一連の３次元投影で復元した共焦点顕微鏡像を示す。パネルｂは、パネルａに示したような粒子の回転を例示する、コンピューターで作製した３次元モデルを示す。
【図２３Ａ】ナノ多孔質シリコン第１段階粒子中のＱ−ドットおよびＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴ第２段階粒子の同時の装填および放出を例示する図である。ＬＰ ＡＰＴＥＳ粒子のバックグラウンド緑色および赤色蛍光（未装填；それぞれ図２３ＡのパネルＡおよびパネルＢ）ならびにＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴ（＋ＳＷＮＴ）、Ｑ−ドット（＋Ｑ−ドット）および両方（＋Ｑ−ドット＋ＳＷＮＴ）と共にインキュベートした後の蛍光シグナルのシフトを示すフローサイトメトリー分析。フローサイトメトリー分析により、ＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴは、急速に装填され、安定化し、一方、Ｑ−ドットは、徐々に装填された後にプラトーに到達することが示される。図２３ＢのパネルＣを参照されたい。Ｑ−ドットおよびＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴの放出プロファイルは両方とも、別の種類のナノ粒子の存在によって変化せず、両方とも時間とともに持続される。図２３ＢのパネルＤ。共焦点顕微鏡像により、１個の多孔質シリコン粒子中のＱ−ドット（赤色）およびＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴ（緑色）の局在化が示される。図２３ＣのパネルＥ、パネルＦおよびパネルＧは、それぞれ、明視野、緑色および赤色蛍光を示し、パネルｈは、３つのチャネルの重ね合わせを示すことを示す。黄色の表示により、緑色および赤色蛍光シグナルの共局在化が示された。図２３ＢのパネルＤのＹ軸は、平均蛍光量を示し、パネルＤのＹ軸は、放出されたペイロードを示す。
【図２３Ｂ】ナノ多孔質シリコン第１段階粒子中のＱ−ドットおよびＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴ第２段階粒子の同時の装填および放出を例示する図である。ＬＰ ＡＰＴＥＳ粒子のバックグラウンド緑色および赤色蛍光（未装填；それぞれ図２３ＡのパネルＡおよびパネルＢ）ならびにＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴ（＋ＳＷＮＴ）、Ｑ−ドット（＋Ｑ−ドット）および両方（＋Ｑ−ドット＋ＳＷＮＴ）と共にインキュベートした後の蛍光シグナルのシフトを示すフローサイトメトリー分析。フローサイトメトリー分析により、ＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴは、急速に装填され、安定化し、一方、Ｑ−ドットは、徐々に装填された後にプラトーに到達することが示される。図２３ＢのパネルＣを参照されたい。Ｑ−ドットおよびＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴの放出プロファイルは両方とも、別の種類のナノ粒子の存在によって変化せず、両方とも時間とともに持続される。図２３ＢのパネルＤ。共焦点顕微鏡像により、１個の多孔質シリコン粒子中のＱ−ドット（赤色）およびＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴ（緑色）の局在化が示される。図２３ＣのパネルＥ、パネルＦおよびパネルＧは、それぞれ、明視野、緑色および赤色蛍光を示し、パネルｈは、３つのチャネルの重ね合わせを示すことを示す。黄色の表示により、緑色および赤色蛍光シグナルの共局在化が示された。図２３ＢのパネルＤのＹ軸は、平均蛍光量を示し、パネルＤのＹ軸は、放出されたペイロードを示す。
【図２３Ｃ】ナノ多孔質シリコン第１段階粒子中のＱ−ドットおよびＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴ第２段階粒子の同時の装填および放出を例示する図である。ＬＰ ＡＰＴＥＳ粒子のバックグラウンド緑色および赤色蛍光（未装填；それぞれ図２３ＡのパネルＡおよびパネルＢ）ならびにＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴ（＋ＳＷＮＴ）、Ｑ−ドット（＋Ｑ−ドット）および両方（＋Ｑ−ドット＋ＳＷＮＴ）と共にインキュベートした後の蛍光シグナルのシフトを示すフローサイトメトリー分析。フローサイトメトリー分析により、ＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴは、急速に装填され、安定化し、一方、Ｑ−ドットは、徐々に装填された後にプラトーに到達することが示される。図２３ＢのパネルＣを参照されたい。Ｑ−ドットおよびＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴの放出プロファイルは両方とも、別の種類のナノ粒子の存在によって変化せず、両方とも時間とともに持続される。図２３ＢのパネルＤ。共焦点顕微鏡像により、１個の多孔質シリコン粒子中のＱ−ドット（赤色）およびＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴ（緑色）の局在化が示される。図２３ＣのパネルＥ、パネルＦおよびパネルＧは、それぞれ、明視野、緑色および赤色蛍光を示し、パネルｈは、３つのチャネルの重ね合わせを示すことを示す。黄色の表示により、緑色および赤色蛍光シグナルの共局在化が示された。図２３ＢのパネルＤのＹ軸は、平均蛍光量を示し、パネルＤのＹ軸は、放出されたペイロードを示す。
【図２４】パネルａ〜ｍは、第２段階粒子を装填したナノ多孔質シリコン粒子を、ＨＵＶＥＣ細胞を用いて、３７Ｃで１時間インキュベートすることに関係する、蛍光分光像を示す図である。図２４のパネルａ〜ｄでは、第２段階粒子はＱ−ドットであり、パネルｅ〜ｈでは、第２段階粒子はＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴであり、パネルｊ〜ｍでは、第２段階粒子は、Ｑ−ドットとＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴである。図２４のパネルｄ、ｈおよびｍは、粒子の形態の詳細を示す明視野像である。
【図２５】パネルＡ〜Ｃは、第１段階シリコン担体中の第２段階ナノ粒子の装填および放出に関与する、３つの主要な物理的、化学的および静電気的機構を表すコンピュータモデルを示す図である。（パネルＡ）サイズ依存性：孔のサイズにより、シリコン粒子中に装填されるのが好ましいナノ粒子の種類が決定される。（パネルＢ）適用量依存性：装填溶液中のより多い数のナノ粒子により、孔中に装填される粒子の数が増加する。（パネルＢ）電荷依存性：適合性に帯電したナノ粒子は、孔中に引きつけられることになるが、不適合な電荷は、ナノ粒子にある程度反発することになり、したがってナノ粒子が孔に入ることを妨げる。
【図２６】パネルＡ〜Ｂは、ナノ多孔質シリコン第１段階粒子中に装填された、ＳｉＲＮＡを含有するリポソームについてのデータを示すグラフである。パネルＡ：Ａｌｅｘａ５５５蛍光標識ｓｉＲＮＡをナノリポソーム中に被包し、第１段階ナノベクター中に装填した。データは、多孔質シリコン担体に関連する蛍光は、ナノリポソームの量とともに増加したことを示す。パネルＡにおいて、Ｙ軸は平均蛍光量を示す。図２６のパネルＢは、第１段階ナノ多孔質シリコン粒子から放出されるリポソームの相対量を示すグラフを示す。Ｙ軸は、放出されたリポソームの全量の％を示す。第１段階担体からのナノリポソームの放出を試験するために、集合多段階粒子を、１０％のウシ胎児血清（ｐＨ７．４）と共にインキュベートし、第１段階粒子からのナノリポソームの放出を、蛍光定量法を使用して時間とともに追跡した。完全な除去は、約３６時間で達成された。
【図２７】量子ドットおよびＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴを装填するための物理的条件の最適化を示すグラフである。パネルａおよびパネルｂのＹ軸は、平均蛍光量を示す。多孔質シリコン粒子は、デシケーター中で一晩乾燥させ、次いで第２段階ナノ粒子を含有する装填溶液と混合した。乾燥状態での装填効率は、湿潤環境での装填効率と有意に異なっていなかった（ｐ値＞０．５）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
定義
別段の指定のない限り、「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは複数を意味する。
【００１２】
「標的身体部位の生化学的環境」は、粒子内容物の放出を開始し、促進するのに有効な、標的部位での１つまたは複数の固有の生理的条件、例えば、ｐＨ、塩濃度、温度、または標的特異的部分の存在などを指す。
【００１３】
「生分解性」は、生理的媒質中で溶解もしくは分解することのできる材料、または生理的酵素および／もしくは化学的条件によって生理的条件下で分解することのできる生体適合性ポリマー材料を指す。
【００１４】
「粘膜付着性」は、粒子の、小腸および大腸内の表面全体を裏打ちする粘膜層に付着する能力を指す。付着性は、ムチンまたは腸上皮細胞表面中に存在する化学受容体に結合する、粒子の表面にグラフトされたリガンドによって媒介される。
【００１５】
「標的化部分」は、粒子による特定の部位の標的化を促進することのできる任意の要素である。例えば、標的化部分は、化学的標的化部分、物理的標的化部分、幾何学的標的化部分、またはその組合せとすることができる。化学的標的化部分は、粒子表面上の化学基または分子とすることができる。物理的標的化部分は、粒子の特定の物理的性質、例えば、そのような表面または疎水性などとすることができる。幾何学的標的化部分には、粒子のサイズおよび形状が含まれる。
【００１６】
「マイクロ粒子」は、１ミクロンから１０００ミクロン、または１ミクロンから１００ミクロンの特有の最大サイズを有する粒子を意味する。「ナノ粒子」は、１ミクロン未満の特有の最大サイズを有する粒子を意味する。
【００１７】
「生体適合性」は、生細胞に暴露された場合、細胞中の望まれない作用、例えば、細胞の生存周期の変化、細胞の増殖速度の変化、および細胞毒性作用などを引き起こすことなく、細胞の適切な細胞活性を補助する材料を指す。
【００１８】
詳細な説明
本発明の実施形態では、後段階の粒子（より小さいサイズの粒子）が前段階の粒子（より大きい粒子）中に含まれているような、２つ以上の段階の粒子を含む組成物により、血液系を有する任意の動物とすることのできる対象（例えば、対象は、ヒトを含めた哺乳動物などの温血動物とすることができる）において、疾患などの生理的状態を治療、予防および／画像化するために１つまたは複数の利点が潜在的に提供されることになる。そのような多段階組成物の実施形態により、以下の特徴または利点のうちの１つまたは複数が提供される。（１）治療剤または造影剤などの活性剤は、対象の身体の特定の標的部位に優先的に送達され、かつ／または局在化する。優先的な送達および／または局在化は、標的部位に送達される、かつ／または標的部位で局在化する活性剤の量または濃度が、対象の身体中の他の部位に送達される、かつ／またはこの他の部位で局在化する活性剤の量または濃度よりも高いことを意味する。（２）多段階組成物により、対象の身体中の多数の生物学的バリアーが連続的に克服される。および（３）多段階組成物により、多数の活性剤の、同じまたは異なる標的部位での同時の送達および局在化が可能になる。
【００１９】
生物学的バリアー
投与後、従来法またはナノベクターで製剤化された、治療剤または造影剤などの活性剤は、作用剤の、所望の濃度で意図された標的に到達する能力に不利に影響する、多種多様な生物学的バリアーに遭遇する。生物学的バリアーには、例えば、タイトジャンクションに基づき、活性剤のパラ型細胞輸送（para-celluar transport）を妨害または制限する、上皮バリアーまたは内皮バリアー、例えば、血液脳関門または腸管腔内皮などである場合がある。内皮／上皮バリアーのそれぞれには、分子識別を１種または複数種の閉鎖帯タンパク質のおかげとするタイトジャンクションバリアーなどの複数の連続したサブバリアー（subbarrier）、および血管内皮基底膜もしくは腸内皮の粘膜層などの１種または複数種の追加の生体膜が含まれる。細網内皮系の細胞も、ナノ粒子内部に被包された活性剤に対して生物学的バリアーとして作用する場合があるが、これはそのような細胞が、ナノ粒子を隔離する／取り込むためである。生物学的バリアーは、活性剤が通過しなければならない細胞中の細胞膜または核膜によって代表され得る。
【００２０】
多段階送達ビヒクル
生物学的バリアーは連続的であるので、そのようなバリアーの克服または迂回も連続的でなければならない。したがって、実施形態では、多段階で作用する送達ビヒクルが開発された。ビヒクルの各段階は、別々の意図される機能を有する粒子によって画定され、この機能は、別の段階の粒子の意図される機能と異なっていてもよい。例えば、一段階の粒子は、別の段階の粒子によって標的にされる部位と異なっていてもよい、特定の身体部位を標的とし、こうして、別の段階の粒子によって克服または迂回される生物学的バリアーと異なる、特定の生物学的バリアーを克服または迂回するように設計される。それぞれの引き続く段階の粒子は、直前の段階の粒子内部に含まれている。任意の特定の段階の粒子は、この特定の段階で使用するために意図された、治療剤または造影剤などの活性剤を含有することができる。
【００２１】
好ましい実施形態では、最終段階の粒子は、ナノ粒子として製剤化された活性剤であり、あるいは、最終段階の粒子は、内部に活性剤を含有するが、任意の前段階の粒子は、それ自体活性剤を含んでいても、含んでいなくてもよい。いくつかの実施形態では、特定の身体部位を標的にすることに加えて、各段階の粒子は、その内容物の標的放出を実施することができるように設計される。実施形態では、多段階送達ビヒクル中の段階の数および種類は、活性剤についての投与経路および意図された最終標的を含めた、いくつかのパラメーターに依存する。多段階送達ビヒクルの実施形態を図１に例示する。
【００２２】
第１段階粒子
いくつかの実施形態では、第１段階の粒子は、マイクロ粒子またはナノ粒子である。いくつかの実施形態では、第１段階粒子は、少なくとも５００ミクロンまたは少なくとも１ｍｍの特有のサイズを有する。そのような粒子は、少なくとも１種のマイクロ粒子またはナノ粒子を内部に含有するように構成することができ、この粒子はさらには、より小さいサイズの少なくとも１種の粒子を内部に含有することができる。第１段階粒子は、より小さいサイズの粒子を内部に含有することができる、任意の粒子である。
【００２３】
いくつかの実施形態では、第１段階粒子は、トップダウン加工された粒子、すなわち、トップダウンマイクロ加工またはナノ加工法、例えば、フォトリソグラフィー、電子ビームリソグラフィー、Ｘ線リソグラフィー、深紫外線リソグラフィーまたはナノプリントリソグラフィーなどによって調製される粒子である。トップダウン加工法を使用することの強力な利点は、そのような方法により、寸法が均一な粒子の大規模な製造が提供されることである。
【００２４】
第１段階の粒子は、以下の生物学的バリアー、すなわち、ヘモレオロジー（hemo-rheology）バリアー、細網内皮系バリアー、内皮バリアー、血液脳関門、腫瘍関連浸透圧性間質圧（osmotic interstitial pressure）バリアー、イオンおよび分子ポンプバリアー、細胞膜バリアー、酵素分解バリアー、核膜バリアー、またはその組合せのうちの少なくとも１つを克服するように構成することができる。
【００２５】
第１段階粒子は、粒子のサイズおよび形状によって画定される本体、およびこの本体内部に１つまたは複数の貯蔵部を有することができる。１つまたは複数の第２段階粒子を、この貯蔵部内部に入れることができる。
【００２６】
第１段階粒子の本体は、任意の適切な材料を含む。第１段階粒子の本体の材料は、生体適合性であることが好ましい。いくつかの実施形態では、第１段階粒子の本体は、酸化物材料、例えば、酸化ケイ素、酸化アルミニウム、酸化チタン、もしくは酸化鉄など；シリコンなどの半導体材料；ポリマーもしくはポリマー酸化物材料；またはセラミック材料を含む。いくつかの実施形態では、第１段階粒子の本体は、例えば、ナノ多孔質シリコンなどの生分解性材料を含む。生分解性材料は、ケイ酸などの生理的媒質に暴露されると分解するようなものとすることができる。
【００２７】
いくつかの実施形態では、第１段階粒子の本体の材料は、本体の異なる領域において実質的に同じである。第１段階粒子の形状は、投与経路に依存し得る。例えば、形状は、第１段階粒子と標的部位の表面、例えば、血管内投与のための内皮表面、または経口投与のための腸管上皮などとの間の接触を最大にするように構成することができる。したがって、経口および血管内投与については、第１段階粒子は、粒子と内皮表面との間の接触を最大にするように構成された、選択された非球形状を有することができる。適切な形状の例には、それだけに限らないが、偏球または円盤が含まれる。経肺投与、すなわち、対象の肺への投与については、第１段階粒子は、粒子と肺中の上皮組織の１つとの間の接触を最大にするように構成された、選択された非球形状を有することもできる。
【００２８】
経肺投与、すなわち、対象の肺を通じた粒子の通過を伴う投与経路については、第１段階粒子は、針状形状も有することができ、これは、必ずしも血液循環を通じてではなく、肺から身体組織中への粒子の侵入を促進することができる。
【００２９】
トップダウン加工により、５０ｎｍから最大数ミリメートルまでの広い範囲のサイズを有する粒子を製造することが可能になるが、ある特定の投与経路については、特定の粒径が好ましい場合がある。例えば、血管内投与については、粒子の特有の最大サイズ、例えば、円盤形状の粒子についての直径は、最小の毛細血管の半径よりも十分に小さいことが好ましい。ヒトでは、そのような半径は約４から５ミクロンである。したがって、粒子の特有の最大サイズは、いくつかの実施形態では、約３ミクロン未満、約２ミクロン未満、または約１ミクロン未満である。
【００３０】
実施形態では、第１段階粒子の特有の最大サイズは、５００ｎｍから３ミクロン、または７００ｎｍから２ミクロンである。さらに、腫瘍の用途における血管内投与についてのいくつかの実施形態では、第１段階粒子の特有の最大サイズは、この第１段階粒子が、血管の癌内皮中の開窓を貫通することなく、標的とした脈管構造部位で局在化することができるようなものである。そのような用途では、第１段階粒子の特有の最大サイズは、約１００ｎｍ超、または約１５０ｎｍ超、または約２００ｎｍ超である。
【００３１】
さらに、血管内投与についてのいくつかの実施形態では、第１段階粒子のサイズは、この粒子が開窓を貫通することができるようなものである。したがって、そのような用途における特有の最大サイズは、約２００ｎｍ未満、または約１５０ｎｍ未満、または約２００ｎｍ未満であることが好ましい。いくつかの実施形態では、第１段階粒子のサイズを選択することができ、これは、Ｐａｏｌｏ ＤｅｃｕｚｚｉおよびＭａｕｒｏ Ｆｅｒｒａｒｉへの、２００６年９月２７日に出願された、ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３８９１６号「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｆｅｎｅｓｔｒａｔｅｄ Ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ」に詳述されているように、有窓脈管構造を標的にするための、通常の非有窓脈管構造の臨界半径であるように選択される。
【００３２】
経口投与については、約２ミクロン超、または約５ミクロン超、または約１０ミクロン超の特有の最大サイズを有する第１段階粒子を使用することが好ましい場合がある。経口投与のためにそのようなサイズの第１段階粒子を使用することの一利点は、そのような粒子は、大きすぎて腸上皮細胞によってエンドサイトーシスできないことである。腸上皮細胞によるエンドサイトーシスは、以下のような少なくとも２つの潜在的な不利点を有する。１）第１段階粒子の内容物は、所望の標的に到達する前に、内皮細胞によって処理されるので、不活性化される場合がある。２）特定の担体、例えば、粒子の材料の潜在的な毒性は、消化管を通じて除かれる場合よりも、エンドサイトーシスされる場合のほうが大きな懸念となる。
【００３３】
いくつかの実施形態では、経口投与については、第１段階粒子は、５００ミクロンから数センチメートル、または１ｍｍから２ｃｍの範囲のサイズを有する。
【００３４】
経肺投与については、標的部位が、肺の気道に位置している場合、第１段階粒子の特有の最大サイズは、約２０ミクロン未満であるが、約５ミクロン超であることが好ましい。肺胞中の部位を標的にする場合、特有の最大部位は、約５ミクロン未満とすることができる。
【００３５】
いくつかの実施形態では、皮下投与については、第１段階粒子の特有のサイズは、５０ミクロンから１ｍｍ、または１００ミクロンから１ｍｍである。
【００３６】
第１段階粒子の機能のうちの１つは、実施形態では、特定の標的部位での局在化である。血管内投与については、そのような標的部位は、特定の脈管構造部位とすることができる。例えば、抗癌用途では、標的脈管構造部位は、腫瘍の脈管構造、例えば、血管新生の脈管構造、組み込まれた（coopted）脈管構造または再正常化された脈管構造などとすることができる。標的部位での第１段階粒子の局在化は、粒子のサイズおよび形状などの幾何学的要因によって促進することができる。
【００３７】
血管内投与については、標的部位での局在化は、第１段階粒子表面上の１つまたは複数の認識因子によっても促進することができる。認識因子は、化学的標的化部分、例えば、デンドリマー、抗体、アプタマーなどとすることができ、これは、標的部位上の特定の受容体を結合する、チオアプタマー（thioaptamer）、リガンドまたは生体分子とすることができる。経口送達については、化学的部分は、米国特許第６，３５５，２７０号の表１に記載されているように、１つまたは複数の粘膜付着性リガンドを含むことができる。
【００３８】
標的化の選択性は、粒子表面の化学的部分を変更することによって調整することができる。例えば、組み込まれた脈管構造は、アンジオポエチン２に対する抗体を使用して、特定的に標的にされる。血管新生の脈管構造は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦｂ）またはαｖβ３インテグリンなどの内皮マーカーに対する抗体を使用して認識され、一方、再正常化された脈管構造は、癌胎児抗原関連細胞接着分子１（ＣＥＡＣＡＭ１）、エンドセリン−Ｂ受容体（ＥＴ−Ｂ）、血管内皮成長因子阻害剤グラビン（gravin）／ＡＫＡＰ１２、プロテインキナーゼＡおよびプロテインキナーゼＣの足場形成（scallofldoing）タンパク質を使用して認識される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔ Ｓ．Ｋｏｒｂｅｌ「Ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ？」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００６年５月２６日、３１２巻、５７７７号、１１７１〜１１７５を参照されたい。
【００３９】
非循環脈管構造細胞に標的化するために、第１段階粒子と標的脈管構造部位の分子マーカーとの間の結合は、血流によって及ぼされる抵抗力を克服するために、十分強くするべきである。この目的は、特異的結合のための比較的大きな平面表面積および毛細血管の血流空間における比較的薄い外形を有することによって、すなわち、偏球または円盤などの選択された非球形状の粒子を有することによって満たすことができる。
【００４０】
認識因子は、表面電荷などの物理的認識部分とすることもできる。この電荷は、特殊な洗浄などの化学的処理を使用することによって、粒子製造中に導入することができる。例えば、多孔質シリカまたは酸化シリコンの表面を水中に浸漬すると、この表面上に負電荷を獲得することができる。例えば、ＢｅｈｒｅｎｓおよびＧｒｉｅｒ、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１１５（１４）、（２００１）．６７１６〜６７６１ページを参照されたい。表面電荷は、粒子表面上の、追加の層またはポリマー鎖などの化学的鎖によっても提供することができる。例えば、ポリエチレングリコール鎖は、表面上の負電荷源となり得る。ポリエチレングリコール鎖は、Ｐ．Ｋ．Ｊａｌ、Ｓ．Ｐａｔｅｌ、Ｂ．Ｋ．Ｍｉｓｈｒａ、Ｔａｌａｎｔａ ６２（２００４）１００５〜１０２８ページ；Ｓ．Ｗ．ＭｅｔｚｇｅｒおよびＭ．Ｎａｔｅｓａｎ、Ｊ．Ｖａｃ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ａ１７（５）、（１９９９）２６２３〜２６２８ページ；ならびにＭ．Ｚｈａｎｇ、Ｔ．Ａ．ＤｅｓａｉおよびＭ．Ｆｅｒｒａｒｉ、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、１９、（１９９８）、９５３ページに記載されているように、表面にコーティングする、または共有結合的に結合させることができる。正電荷は、例えば、表面をポリリシンなどの塩基性ポリマーでコーティングすることによって、または表面に３−アミノプロピルトリエトキシシランなどのアミノ含有分子を共有結合的に連結させることによって導入される。
【００４１】
いくつかの実施形態では、選択された標的部位の１つまたは複数の性質に基づく粒子の、サイズおよび形状などの幾何学的要因、ならびに／または化学的修飾および静電気的修飾などの表面修飾を選択するために、モデル化手法が適用される。そのようなモデル化手法は、例えば、１）Ｐａｏｌｏ ＤｅｃｕｚｚｉおよびＭａｕｒｏ Ｆｅｒｒａｒｉへの、２００６年１０月１１日に出願された、米国仮特許出願第６０／８２９，０７５号「Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｃｅｌｌ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ」；２）Ｐａｏｌｏ ＤｅｃｕｚｚｉおよびＭａｕｒｏ Ｆｅｒｒａｒｉへの、２００７年２月２６日に出願された、米国仮特許出願第６０／８９１，５８４号「Ｅｎｄｏｃｙｔｏｔｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅ」；３）Ｄｅｃｕｚｚｉ，Ｐ．、Ｃａｕｓａ，Ｆ．、Ｆｅｒｒａｒｉ，Ｍ．＆Ｎｅｔｔｉ，Ｐ．Ａ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｎａｎｏｖｅｃｔｏｒｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ．Ａｎｎ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ ３４、６３３〜４１（２００６）；４）Ｄｅｃｕｚｚｉ，Ｐ．＆Ｆｅｒｒａｒｉ，Ｍ．Ｔｈｅ ａｄｈｅｓｉｖｅ ｓｔｒｅｎｇｔｈ ｏｆ ｎｏｎ−ｓｐｈｅｒｉｃａｌ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２７、５３０７〜１４（２００６）；５）Ｄｅｃｕｚｚｉ，Ｐ．＆Ｆｅｒｒａｒｉ，Ｍ．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ ｏｆ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２８、２９１５〜２２（２００７）；６）Ｄｅｃｕｚｚｉ，Ｐ．、Ｌｅｅ，Ｓ．、Ｂｈｕｓｈａｎ，Ｂ．＆Ｆｅｒｒａｒｉ，Ｍ．Ａ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍａｒｇｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｗｉｔｈｉｎ ｂｌｏｏｄ ｖｅｓｓｅｌｓ．Ａｎｎ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ ３３、１７９〜９０（２００５）；Ｄｅｃｕｚｚｉ，Ｐ．、Ｌｅｅ、Ｓ．、Ｄｅｃｕｚｚｉ，Ｍ．＆Ｆｅｒｒａｒｉ，Ｍ．Ａｄｈｅｓｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｏｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ：ａ ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ａｎｎ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ ３２、７９３〜８０２（２００４）に開示されている。
【００４２】
いくつかの実施形態では、第１段階粒子は、標的部位で、その貯蔵部から第２段階粒子を放出するように構成されている。第２段階粒子の放出は、それだけに限らないが、第１段階粒子の貯蔵部と表面を接続しているチャネルを通じた第２段階粒子の拡散、および第１段階粒子の本体の分解または浸食を含めた、様々な機構によって実施することができる。そのような目的のために、第１段階粒子は、対象に投与されたとき、その標的部位への第１段階粒子の特有の送達時間より長い特有の放出時間を有するように構成されている。
【００４３】
いくつかの実施形態では、第１段階粒子は、対象に投与されたとき、その標的部位への第１段階粒子の特有の送達時間より長い時間にわたって持続される、その貯蔵部からの第２段階の放出を実施するように構成されている。いくつかの実施形態では、第１段階粒子は、少なくとも０．５時間超、または少なくとも１時間超、または少なくとも２時間超、または少なくとも８時間超、または少なくとも１５時間超、または３０時間超の時間にわたって第２段階粒子を放出するように構成されている。
【００４４】
いくつかの実施形態では、第１段階粒子の物理的局在化および／または標的放出は、標的部位での１つまたは複数の固有の生理的条件、例えば、ｐＨ、塩濃度または温度などによって開始される。いくつかの実施形態では、第１段階粒子の物理的局在化および／または標的放出は、外部刺激によって開始される。外部刺激の例として、超音波による活性化などの機械的活性化；可視光、紫外光、近赤外光もしくは赤外光、高周波、またはＸ線照射による活性化などの電磁活性化；磁気照射が挙げられる。例えば、第１段階粒子は、スマートポリマー、すなわち、特定の刺激、例えば、光、温度またはｐＨなどに応答して収縮または伸張するポリマーを含むことができる。スマートポリマーは、例えば、「Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ Ｄｒｕｇｓ（ＭＳＣ−２２８６６）」、ＮＡＳＡ Ｔｅｃｈ Ｂｒｉｅｆｓ、２４巻、９号（２０００年９月）、６４ページ；「Ｅｘｔｅｒｎａｌｌｙ Ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ Ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｓｉｔｕ（ＭＳＣ−２２９３９）」、ＮＡＳＡ Ｔｅｃｈ Ｂｒｉｅｆｓ、（２００２年４月）、５０ページ；および２０００年８月８日にＭｏｒｒｉｓｏｎおよびＭｏｓｉｅｒに発行された米国特許第６，０９９，８６４号に記載されている。場合によっては、放出を活性化するために、１つを超える外部刺激が一緒に使用される。
【００４５】
局在化／標的化効率を増大させるために、第１段階粒子は、多数、すなわち、１つを超える認識／局在化／標的化要因を利用することができ、これは、互いに干渉しないことが好ましい。例えば、第１粒子は、上述したような選択された非球形状を有し、同時にその表面に腫瘍標的化抗体を担持することができる。
【００４６】
いくつかの実施形態では、第１段階粒子表面は、部分的または完全にポリマー鎖でコーティングすることができる。ポリマー鎖は、血管内段階粒子を作製した後に加えることができる。ポリマー鎖は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖または合成糖衣鎖などの親水性鎖とすることができ、これは、細網内皮系の細胞による粒子の取り込みを克服し、したがって血管内段階粒子の血液循環を延長するために使用することができる。親水性基は、多段階送達デバイスの溶解度を高めるための役割も果たすことができる。
【００４７】
様々な材料をポリマー鎖で誘導体化することができる。例えば、粒子の表面材料がポリマーを含む場合、ポリマー鎖は、ポリマーのカルボン酸基、およびポリマー鎖中のアミンまたはヒドロキシル基を連結することによって結合することができる。粒子の表面材料が金などの金属を含む場合、ポリマー鎖は、チオールの化学的性質を介して表面に結合することができる。粒子の表面材料が酸化物、例えば、酸化ケイ素、酸化チタンまたは酸化アルミニウムなどを含む場合、ポリマー鎖は、シランの化学的性質を介して結合することができる。
【００４８】
１つまたは複数の第２段階粒子に加えて、第１段階粒子の貯蔵部は、１つまたは複数の追加の作用剤を含有することができる。そのような追加の作用剤として、治療剤もしくは造影剤などの追加の活性剤、標的化剤、１つもしくは複数の透過エンハンサーまたはその任意の組合せを挙げることができる。透過エンハンサーとして、表１に列挙した１つまたは複数の化合物を挙げることができる。
【表１】

【００４９】
血管内投与については、透過エンハンサーとして、基底膜に対して作用することのできる基底膜透過エンハンサー、および／またはタイトジャンクションタンパク質（ＴＪＰ）に対して作用することのできる、１つもしくは複数の透過エンハンサーを挙げることができる。基底膜透過エンハンサーの例は、メタロプロテイナーゼ、例えば、コラゲナーゼＩＶ、ＭＭＰ−２、およびＭＭＰ−９などである。抗ＴＪＰ透過エンハンサーの例は、閉鎖帯トキシンである。抗ＴＪＰ透過エンハンサーおよびタイトジャンクションの透過性を調節するための方策は、例えば、Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｍａｒｉｓｃａｌ，Ｌ．、Ｎａｖａ，Ｐ．およびＨｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｓ．Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．、２００５．２０７（２）：５５〜６８ページに詳述されている。
【００５０】
図２Ａ〜Ｂは、実施形態により、標的脈管構造部位で第１段階粒子が局在化したときの透過エンハンサーの作用を例示する。第１段階粒子は、透過エンハンサーを放出し、これより標的脈管構造中に１つまたは複数の開窓が生じ、これを通じて第２段階粒子が脈管構造中に貫入する。
【００５１】
いくつかの実施形態では、第１段階粒子は、貯蔵部を表面と流体的に接続している１つまたは複数のチャネルを有し、これは、内皮細胞または上皮細胞と接触することができる。血管内投与については、そのような第１段階粒子は、米国特許出願公開第２００３／０１１４３６６号および米国特許第６，１０７，１０２号に詳述されているものなどのマイクロまたはナノ加工粒子とすることができ、経口投与については、そのような第１段階粒子は、米国特許第６，３５５，２７０号に開示されているものなどのマイクロまたは加工粒子とすることができる。
【００５２】
いくつかの実施形態では、貯蔵部およびチャネルは、第１段階粒子の本体中の孔である。そのような場合では、第１段階粒子は、多孔質またはナノ多孔質材料を含むことができる。多孔質またはナノ多孔質の孔は、次段階粒子の所望の装填および所望の放出速度を達成するように制御することができることが好ましい。制御可能な孔径を有するナノ多孔質材料は、酸化物材料、例えば、酸化ケイ素、酸化アルミニウム、酸化チタン、または酸化鉄などとすることができる。ゾルゲル粒子としても知られている、ナノ多孔質酸化物粒子の製造は、例えば、Ｐａｉｋ Ｊ．Ａ．ら Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．、１７巻、２００２年８月に詳述されている。制御可能な孔径を有するナノ多孔質材料は、ナノ多孔質シリコンとすることもできる。ナノ多孔質シリコン粒子の製造の詳細については、Ｃｏｈｅｎ Ｍ．Ｈ．ら Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ ５：３、２５３〜２５９、２００３を参照されたい。孔の密度、サイズ、形状および／または配向の制御は、非多孔質シリコンからナノ多孔質シリコンを形成する間に、電流およびエッチング時間を変更することによって達成することができる。孔の密度、サイズ、形状および／または配向の制御は、ナノ多孔質シリコンの形成に使用される非多孔質シリコン中のドーピングを変更することによっても達成することができる。こうして、ナノ多孔質の孔径、密度、サイズ、形状および／または配向は、第２段階粒子を効率的に装填するために構成することができる。
【００５３】
いくつかの実施形態では、ナノ多孔質第１段階粒子中の孔径は、例えば、約１ｎｍから約２００ｎｍ、または約２ｎｍから約１００ｎｍとすることができる。場合によっては、ナノ多孔質第１段階粒子中の孔径は、約３から約１０ｎｍ、または約５から約７ｎｍとすることができる。さらに場合によっては、ナノ多孔質第１段階粒子中の孔径は、約１０から約６０ｎｍ、または約２０から約４０ｎｍとすることができる。
【００５４】
いくつかの実施形態では、多孔質またはナノ多孔質材料の孔中への第２段階粒子の装填を促進するため、化学的および／または静電気的に修飾することによって、第２段階粒子の化学的および／または静電気的な表面性質に適合させることができる。例えば、負に帯電した第２段階粒子を装填するために、正に帯電した孔表面を使用することが好ましい場合がある。正電荷は、例えば、孔表面上に、３−アミノプロピルトリエトキシシランなどのアミノ含有分子を堆積させることによって達成することができる。正に帯電した第２段階粒子を装填するために、負に帯電した孔表面を使用することが好ましい場合がある。負の孔表面電荷は、例えば、孔表面を水で酸化することによって達成することができる。
【００５５】
いくつかの実施形態では、第１段階粒子は、チャネルをまったく有していない。そのような粒子は、例えば、生分解性材料を含むことができる。経口投与については、材料は、消化管中で浸食されるように設計することができる。例として、第１段階粒子は、金属、例えば、鉄、チタン、金、銀、白金、銅、ならびにその合金および酸化物などから形成することができる。生分解性材料は、生分解性ポリマー、例えば、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリアミド、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリホスファゼン、およびポリエステルなどとすることもできる。例示的な生分解性ポリマーは、例えば、米国特許第４，９３３，１８５号、同第４，８８８，１７６号、および同第５，０１０，１６７号に記載されている。そのような生分解性ポリマー材料の具体的な例として、ポリ（乳酸）、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシブチレート、ポリ（Ｎ−パルミトイル−ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）およびポリ（ＤＴＨカーボネート）が挙げられる。
【００５６】
いくつかの実施形態では、第１段階粒子の本体は、異なる集団の第２段階粒子を含有するように構成された２つ以上の領域を含む。例えば、第１段階粒子の本体は、第１集団の第２段階粒子を含有するように構成された第１領域と、第２集団の第２段階粒子を含有するように構成された第２領域とを有することができる。例えば、多孔質ナノ多孔質材料から形成された第１段階粒子は、その本体が、互いに異なる２つ以上の多孔質領域を有するようなものとすることができる。ナノ多孔質第１段階粒子の本体は、少なくとも１つの性質、例えば、孔密度、孔形状、孔電荷、孔表面の化学的性質、孔配向、またはその任意の組合せなどにおいて互いに異なる、第１多孔質領域と第２多孔質領域を含むことができる。そのような第１および第２領域は、それぞれ第１および第２集団の第２段階粒子を含有するように構成することができる。
【００５７】
いくつかの実施形態では、第１および第２集団の第２段階粒子は、少なくとも１つの性質、例えば、サイズ、形状、表面化学的修飾、表面電荷、またはその組合せが異なる。
【００５８】
いくつかの実施形態では、第１および第２集団の第２段階粒子は、同じ活性剤を含有する。さらに、いくつかの実施形態では、第１および第２集団の第２段階粒子は、それぞれ、互いに異なる第１の活性剤および第２の活性剤を含有する。
【００５９】
第１および第２集団の第２段階粒子は、異なる機能を実施するように構成することができる。例えば、いくつかの実施形態では、第１および第２集団は、それぞれ、互いに異なる第１および第２の標的部位を標的にするように構成することができる。
【００６０】
いくつかの実施形態では、第１集団は、対象の身体中の特定の部位を標的にするように構成されており、一方、第２集団は、対象の血液系中で自由に循環するように構成されている。
【００６１】
いくつかの実施形態では、第１および第２集団は、対象の身体中の同じ標的部位を標的にするが、その身体部位で異なる機能を実施する。例えば、第１集団は、標的部位に送達される治療剤を含有するが、第２集団は、標的部位を画像化または可視化するために標的部位に送達される造影剤を含有する。
【００６２】
第１段階粒子の本体の第１および第２領域は、そのうちの少なくとも１つが生分解性領域であるようにすることができる。第１段階粒子の本体の第１および第２領域の両方が、生分解性であることが好ましい。
【００６３】
第１段階粒子の本体の第１および第２領域は、第１および第２集団の第２段階粒子の放出に関して、異なる特有の時間を有することができる。いくつかの実施形態では、第１領域から第１集団の第２段階粒子を放出するための特有の時間と第２領域から第２集団の第２段階粒子を放出するための特有の時間の両方は、対象に投与されたとき、その標的部位での第１段階粒子の送達および／または局在化の特性よりも長くすることができる。
【００６４】
いくつかの実施形態では、第１段階粒子は、第１段階粒子の標的部位で存在し得る媒質などの生理的媒質に暴露されているとき、第１領域を含む第１の成分と第２領域を含む第２の成分とに分離するように構成されている。そのような暴露は、例えば、粒子が対象に投与される場合に起こり得る。
【００６５】
いくつかの実施形態では、第１段階粒子の本体の第１および第２領域は、粒子が対象に投与されたとき、異なる機能を実施するように構成されている。例えば、第１段階粒子の本体の第１および第２領域は、それぞれ、互いに異なる第１および第２の生物学的バリアーを克服するように構成することができる。そのような生物学的バリアーは、例えば、ヘモレオロジーバリアー、細網内皮系バリアー、内皮バリアー、血液脳関門、腫瘍関連浸透圧性間質圧バリアー、イオンおよび分子ポンプバリアー、細胞膜バリアー、酵素分解バリアー、核膜バリアー、またはその組合せからそれぞれ選択することができる。
【００６６】
第２段階粒子
第２段階粒子は、第１段階粒子の貯蔵部内部に装着し得る、任意のマイクロ粒子またはナノ粒子とすることができる。例えば、ある特定の実施形態では、経口または経肺投与については、第２段階粒子は、血管内投与のための第１段階粒子と同じである。
【００６７】
第２段階の粒子は、ヘモレオロジーバリアー、細網内皮系バリアー、内皮バリアー、血液脳関門、腫瘍関連浸透圧性間質圧バリアー、イオンおよび分子ポンプバリアー、細胞膜バリアー、酵素分解バリアー、核膜バリアー、またはその組合せから選択される、少なくとも１つのバリアーを克服するように構成することができる。
【００６８】
第２段階粒子の組成、サイズおよび形状は、特に限定されない。例えば、多くの投与経路については、第２段階粒子は、脂質ベースの粒子、例えば、リポソーム、ミセルもしくは脂質で覆われたペルフルオロカーボンエマルジョンなど；エソソーム（ethosome）；単一壁カーボンナノチューブなどのカーボンナノチューブ；フラーレンナノ粒子；金属ナノ粒子、例えば、金ナノシェルもしくは三角形銀ナノ粒子など；半導体ナノ粒子、例えば、量子ドットもしくはホウ素ドープシリコンナノワイヤーなど；ポリマーナノ粒子、例えば、生分解性ポリマー製の粒子およびイオンドープポリアクリルアミド粒子など；酸化物ナノ粒子、例えば、酸化鉄粒子、ポリマー被覆酸化鉄ナノ粒子もしくは酸化ケイ素粒子など；ウイルス粒子、例えば、遺伝子操作（engineered）ウイルス粒子もしくは遺伝子操作ウイルス−ポリマー粒子など；結合ポリカチオン（leashed polycation）などのポリイオン粒子；シリカベースセラミックナノ粒子などのセラミック粒子、またはその組合せとすることができる。
【００６９】
いくつかの実施形態では、第２段階粒子は、対象の身体中の特定の標的部位を標的にするように構成されている。そのような標的部位は、第１段階粒子によって標的にされる標的部位と同じであっても、異なっていてもよい。
【００７０】
例えば、第２段階粒子表面は、ある特定の種類の細胞の表面マーカー抗原と結合することのできる１つまたは複数の抗体を有することができる。したがって、第２段階粒子は、そのようなマーカー抗原を担持する細胞を選択的に標的にすることができる。表面マーカー抗原を担持する細胞の例には、幹細胞またはクローン化可能細胞および腫瘍細胞が含まれる。幹細胞またはクローン化可能細胞上の表面マーカー抗原は、ＣＤ３３抗体によって標的にされ得る。腫瘍特異的抗原に対するいくつかのモノクローナル抗体が入手可能である。例えば、ＣＡＮＣＥＲ、３版、Ｄｅ Ｖｉｔａら編の３０１〜３２３ページ；Ｊａｎｅｗａｙら Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５版、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２００１；Ａ．Ｎ．Ｎａｇａｐｐａ、Ｄ．Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ＆Ｋ．Ａｎｕｓｈａ「Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、ＰｈａｒｍａＢｉｚ．ｃｏｍ、２００４年９月２２日、水曜日を参照されたい。表２は、癌の治療用の、ＦＤＡに認可されたモノクローナル抗体を示す。
【表２】

【００７１】
いくつかの実施形態では、第２段階粒子は、第１段階粒子から放出されると、対象の血液系中で自由に循環するように構成されている。場合によっては、そのような第２段階粒子は、抗体などの標的化部分がない表面を有することができる。自由循環する第２段階粒子は、例えば、第１段階粒子自体に付随する治療剤の治療作用の報告に応じて使用することができる。
【００７２】
いくつかの実施形態では、第２段階粒子表面は、そこに配置される、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの親水性ポリマー鎖を有していない。ある特定の場合では、このことは、多段階送達ビヒクルの利点となり得るが、これは、ＰＥＧ鎖は、通常、リポソームおよび他のナノ粒子に結合することによって、細網内皮系のマクロファージによる認識および隔離を遅延させるためである。残念ながら、ＰＥＧ鎖はまた、ナノ粒子表面上の抗体を隠し、したがって、抗体の標的化／局在化の能力を阻害する場合もある。多段階送達ビヒクルでは、第１段階粒子に結合したＰＥＧは、ＲＥＳマクロファージからの遮蔽を行う場合がある。ＰＥＧは、第１段階粒子上の抗体を隠す場合があるが、第１段階粒子の認識／局在化能力は、抗体に限定されない。これは、粒子のサイズおよび形状などの他の要因も、そのような能力に寄与することができるためである。いくつかの実施形態では、第２段階粒子表面は、そこに配置される、ＰＥＧ鎖などの親水性ポリマー鎖を有する。
【００７３】
いくつかの実施形態では、第２段階粒子表面は修飾されることによって、例えば、第２段階粒子の、第１段階粒子の貯蔵部中に装填される能力が促進される、かつ／または第２段階粒子の、その標的部位に到達する能力が促進される。表面修飾として、第２段階粒子表面の化学的修飾、および／または第２段階粒子表面の静電気的修飾を挙げることができる。例えば、多孔質またはナノ多孔質第１段階粒子中への、第２段階粒子の装填を促進するために、第２段階粒子表面を修飾することによって、その性質が、多孔質またはナノ多孔質第１段階粒子の孔の表面性質と適合するようにすることができる。例えば、多孔質またはナノ多孔質第１段階粒子の孔が正に帯電している場合、第２段階粒子表面を修飾することによって、これらが静電気的に中性であるか、または負の表面電荷を有するようにすることが好ましい場合がある。一方、多孔質またはナノ多孔質第１段階粒子の孔が負に帯電している場合、第２段階粒子表面を修飾することによって、これらが静電気的に中性であるか、または正の表面電荷を有するようにすることが好ましい場合がある。第２段階粒子の化学的および／または静電気的表面修飾は、第１段階粒子に対して上記に詳述したのと同じ方法を使用して実施することができる。
【００７４】
リポソームまたはミセルなどの脂質含有第２段階粒子については、静電気的修飾は、その脂質層に、リポソームの静電気的電荷に影響し得る脂質を取り込むことによって実施することができる。例えば、正に帯電した陽イオン性脂質含有粒子を形成するために、１，２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）などの陽イオン性脂質を使用することができ、負に帯電した陰イオン性脂質含有粒子を形成するために、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）などの陰イオン性脂質を使用することができ、中性脂質含有粒子を形成するために、ＤＯＰＣなどの中性脂質を使用することができる。
【００７５】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の標的細胞に結合すると、第２段階粒子は、細胞の細胞質中にその内容物を放出することができる。いくつかの実施形態では、そのような放出は、電磁照射などの外部要因によって活性化される。フラーレンナノ粒子およびカーボンナノチューブについては、そのような照射は高周波照射とすることができ、金シェルナノ粒子については、照射は近赤外照射とすることができる。外部照射によるナノ粒子の活性化は、例えば、Ｈｉｒｓｃｈ，Ｌ．Ｒ．、Ｈａｌａｓ，Ｎ．Ｊ．＆Ｗｅｓｔ，Ｊ．Ｌ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７５、２３７７〜２３８１（２００３）；Ｈｉｒｓｃｈ，Ｌ．Ｒ．、Ｈａｌａｓ，Ｎ．Ｊ．＆Ｗｅｓｔ，Ｊ．Ｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００、１３５４９〜１３５５４（２００３）；およびＯ’Ｎｅａｌ，Ｄ．Ｐ．、Ｈａｌａｓ，Ｎ．Ｊ．＆Ｗｅｓｔ，Ｊ．Ｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．２０９、１７１〜１７６（２００４）に詳述されている。
【００７６】
いくつかの実施形態では、第２段階粒子の内容物は、それ自体で１つまたは複数の活性剤である。いくつかの実施形態では、第２段階粒子は、第３段階粒子を内部に含有し、これはそれ自体、１つまたは複数の活性剤を内部に含有する。第３段階粒子は、例えば、標的細胞の核膜を通過することができるのに十分小さい粒子とすることができる。したがって、第３段階粒子は、活性剤を細胞の核に送達するために役割を果たすことができ、この活性剤は、核酸に対して作用する作用剤または遺伝子治療剤であってもよい。核膜を通過することができるために、第３段階粒子は、約３ｎｍから約１０ｎｍの範囲とすることができる。３ｎｍから１０ｎｍのサイズ範囲のナノ粒子を送達する能力は、多段階送達ビヒクルの利点の１つとなり得るが、これは、注射によるそのような粒子の従来の投与では、通常、その即時の球状クリアランス（globular clearance）がもたらされるためである。
【００７７】
いくつかの実施形態では、多段階ビヒクルは第３段階を含む。第３段階は、第２段階粒子内部に装着し得る任意のナノ粒子とすることができる。第２段階粒子と同様に、第３段階粒子は、脂質ベースの粒子、例えば、リポソーム、ミセルもしくは脂質で覆われたペルフルオロカーボンエマルジョンなど；エソソーム；単一壁カーボンナノチューブなどのカーボンナノチューブ；フラーレンナノ粒子；金属ナノ粒子、例えば、金ナノシェルもしくは三角形銀ナノ粒子など；半導体ナノ粒子、例えば、量子ドットもしくはホウ素ドープシリコンナノワイヤーなど；ポリマーナノ粒子、例えば、生分解性ポリマー製の粒子およびイオンドープポリアクリルアミド粒子など；酸化物ナノ粒子、例えば、酸化鉄粒子、ポリマー被覆酸化鉄ナノ粒子もしくは酸化ケイ素粒子など；ウイルス粒子、例えば、遺伝子操作ウイルス粒子もしくは遺伝子操作ウイルス−ポリマー粒子など；結合ポリカチオンなどのポリイオン粒子；シリカベースセラミックナノ粒子などのセラミック粒子、またはその組合せとすることができる。いくつかの実施形態では、第３段階粒子は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）粒子などの核酸ナノ粒子である。
【００７８】
前段階粒子の貯蔵部中への後段階粒子の装填
後段階粒子は、任意の適切な技法によって、前段階の前段階粒子中に導入することができる。いくつかの実施形態では、作製したナノ多孔質前段階粒子を、担持流体および後段階粒子を含有する溶液中に浸漬することができ、この後段階粒子は、毛管作用および／または拡散によって前段階粒子の孔に入ることができる。担持流体は、生物学的に無害であり、前段階粒子の材料に関して中性である液体とすることができる。担持流体の例は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）または脱イオン水とすることができる。この溶液は、第１段階粒子中に導入することが望まれている、１つまたは複数の追加の作用剤、例えば、１つまたは複数の追加の治療剤および１つまたは複数の適切な透過エンハンサーも含有することができる。後段階粒子の装填量を最大にするために、飽和濃度の後段階粒子を有する溶液を使用することができる。
【００７９】
前段階粒子は、懸濁液の形態で溶液中に導入することができる。ナノ多孔質粒子懸濁液の調製は、例えば、米国特許出願第２００３／０１１４３６６号に記載されている。ナノ多孔質粒子の孔は、後段階粒子を含有する溶液中に浸漬する前に乾燥させることができる。
【００８０】
いくつかの実施形態では、後段階粒子の孔を含有する溶液は、前段階粒子を導入する前に脱気することができる。次いで、前段階粒子は、密閉チャンバー中で脱気溶液中に浸漬することができる。前段階粒子を減圧に曝すことによって、閉じ込められた空気が粒子の孔から追い出されるのを確実にすることができる。次いで、前段階粒子は、溶液中に完全に浸漬することができ、密閉チャンバー中の圧力を、大気圧よりわずかに上に上昇させることによって、溶液が前段階粒子の孔に入るのを確実にすることができる。次いで、前段階粒子をフィルター上に捕捉し、以下に説明する３つの方法のうちの１つを使用して乾燥させることができる。
【００８１】
いくつかの実施形態では、浸漬した前段階粒子中の貯蔵部内のあらゆる閉じ込められた空気を除去するために、チャンバー内の圧力が低減され、次いで大気圧よりわずかに上に上昇させられる。
【００８２】
いくつかの実施形態では、前段階粒子の孔中に溶液を満たした後、以下の３つの方法のうちの１つまたは複数によって乾燥が実現される。水は、真空チャンバー中で減圧下で蒸発させる、またはフィルター上に収集された表面粒子上に暖気もしくは窒素などの不活性ガス流を通過させる、または凍結乾燥させることによって除去することができる。凍結乾燥の場合、平らな熱交換器を、良好な熱接触状態で、例えば、前段階粒子が収集されたフィルターの直下に配置することができる。フレオンなどの−２０℃から−６０℃の範囲の温度の冷媒流体、または液体窒素などの冷液を、ポートに流入させ、ポートから排出して熱交換器を通過させることによって、孔内に残っているあらゆる水を凍結させることができる。次いですべての水が昇華するまで、圧力を低減することができる。
【００８３】
いくつかの実施形態では、後段階粒子をナノ多孔質前段階粒子中に装填するために、前段階ナノ多孔質粒子、後段階粒子および担体液体を含有する溶液が調製される。担体液体は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌなどの生理的緩衝液とすることができる。担体液体の濃度は、標準的な技法を使用して選択することによって、ナノ多孔質前段階粒子中への後段階粒子の装填を最大にすることができる。例えば、いくつかの実施形態では、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌについては、最適濃度は、１から５００ｍＭから選択することができる。
【００８４】
後段階粒子の幾何学的性質、例えばサイズおよび形状などは、ナノ多孔質前段階粒子の孔の性質、例えば、孔密度、孔径、および孔配向などと適合するように選択することができる。
【００８５】
いくつかの実施形態では、ナノ多孔質前段階粒子中への後段階粒子の装填は、後段階および前段階粒子の両方を含有する溶液を撹拌することによって促進される。そのような撹拌は、回転ホイール中で溶液を回転させることによって実施することができる。回転ホイールの回転速度などの撹拌条件は、所望の装填度および／または装填時間を達成するために、標準的な技法を使用して最適化することができる。
【００８６】
いくつかの実施形態では、前段階ナノ多孔質粒子中への後段階粒子の装填は、溶液中の後段階粒子の濃度を変更することによって制御される。いくつかの実施形態では、溶液中のより高い濃度の後段階粒子を使用することによって、より高い装填量を達成することができる。さらに、いくつかの実施形態では、溶液中の最も高い可能な濃度の後段階粒子よりも低い濃度の後段階粒子を使用することによって、後段階粒子のより高い装填量を達成することができる。ナノ多孔質前段階粒子中への後段階粒子の装填を最大にする濃度の決定は、標準的な方法を使用して実施することができる。
【００８７】
いくつかの実施形態では、前段階ナノ多孔質粒子中への後段階粒子の装填は、ナノ多孔質前段階粒子の孔表面および／または後段階粒子の表面を修飾して、これらをより適合性にすることによって制御される。そのような修飾は、いずれかの表面上の表面化学基を修飾する、かつ／またはいずれかの表面上の電荷を修飾することによって実施することができる。例えば、いくつかの実施形態では、後段階粒子のより高い装填量を達成するために、負に帯電した表面の後段階粒子と正に帯電した多孔質表面の前段階ナノ多孔質粒子、または正に帯電した表面の後段階粒子と負に帯電した多孔質表面の前段階ナノ多孔質粒子を使用することができる。いくつかの実施形態では、ナノ多孔質前段階粒子の孔表面および後段階粒子の表面は、互いに適合性の化学基で修飾される。例えば、ナノ多孔質前段階粒子の孔表面と後段階粒子の表面の一方は、カルボキシ基で修飾することができ、他方はアミノ基で修飾することができる。
【００８８】
活性剤
活性剤は、治療剤、造影剤、またはその組合せとすることができる。活性剤は、それを含有する粒子から放出することのできる、任意の適切な作用剤とすることができる。活性剤の選択は、用途に依存する。
【００８９】
活性剤が、それ自体でいずれの段階の粒子でもない場合、これは、任意の適切な技法を使用して粒子中に導入することができる。例えば、活性剤がドキソルビシンである場合、これは、実施例４に詳述されるプロトコルを使用して、リポソーム粒子中に導入することができる。
【００９０】
活性剤が、多段階送達ビヒクルの段階の１つの粒子である場合、この活性剤は、上記に開示した方法の１つを使用して導入することができる。
【００９１】
治療剤
治療剤は、哺乳動物またはヒトなどの動物における標的部位で所望の生物学的効果を生じることのできる、任意の生理的または薬理学的に活性な物質とすることができる。治療剤は、限定することなく、ペプチド、タンパク質、核酸、および小分子を含めた、任意の無機または有機化合物とすることができ、そのいずれも特徴付けられていても、特徴付けられていなくてもよい。治療剤は、様々な形態、例えば、未変化分子、分子複合体、薬理学的に許容可能な塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、ラウリン酸塩、パルミチン酸塩、リン酸塩、亜硝酸塩、硝酸塩、ホウ酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、サリチル酸塩などとすることができる。酸性治療剤については、金属の塩、アミンまたは有機陽イオン、例えば、四級アンモニウムを使用することができる。薬剤の誘導体、例えば、塩基、エステルおよびアミドも治療剤として使用することができる。水不溶性である治療剤は、その水可溶性誘導体である形態、またはその塩基誘導体として使用することができ、これは、いずれの場合も、またはその送達によって、酵素によって変換され、身体のｐＨもしくは他の代謝プロセスによって加水分解されることによって、最初の治療的に活性な形態になる。
【００９２】
治療剤は、化学療法剤、免疫抑制剤、サイトカイン、細胞毒性剤、核酸分解化合物、放射性同位元素、受容体、およびプロドラッグ活性化酵素とすることができ、これらは、天然に存在するもの、または合成もしくは組換え法によって作製されるもの、またはその組合せとすることができる。
【００９３】
古典的な多剤耐性によって影響される薬剤、例えば、ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチンおよびビンクリスチン）、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシンおよびダウノルビシン）、ＲＮＡ転写阻害剤（例えば、アクチノマイシン−Ｄ）および微小管安定化剤（例えば、パクリタキセル）などは、治療剤として特定の有用性を有する。
【００９４】
癌化学療法剤は好ましい治療剤となり得る。有用な癌化学療法剤として、ナイトロジェンマスタード、ニトロソ尿素、エチレンイミン、アルカンスルホネート、テトラジン、白金化合物、ピリミジン類似体、プリン類似体、代謝拮抗剤、葉酸類似体、アントラサイクリン、タキサン、ビンカアルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤およびホルモン剤が挙げられる。例示的な化学療法剤は、アクチノマイシン−Ｄ、アルケラン、Ａｒａ−Ｃ、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、ＢｉＣＮＵ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルボプラチナム（carboplatinum）、カルムスチン、ＣＣＮＵ、クロランブシル、シスプラチン、クラドリビン、ＣＰＴ−１１、シクロホスファミド、シタラビン、シトシンアラビノシド、シトキサン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ＤＴＩＣ、エピルビシン、エチレンイミン、エトポシド、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルタミド、ホテムスチン、ゲムシタビン、ハーセプチン、ヘキサメチルアミン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキセート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、プロカルバジン、リツキシマブ、ステロイド、ストレプトゾシン、ＳＴＩ−５７１、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テトラジン、チオグアニン、チオテパ、トムデックス、トポテカン、トレオスルファン（treosulphan）、トリメトレキセート、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ＶＰ−１６、およびキセロダである。
【００９５】
有用な癌化学療法剤として、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびシクロスホスファミド（cyclosphosphamide）など；アルキルスルホネート、例えば、ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなど；アジリジン、例えば、ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ（meturedopa）、およびウレドパ（uredopa）など；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスファオラミド（triethylenethiophosphaoramide）およびトリメチルオロメラミン（trimethylolomelamine）を含めたエチレンイミンおよびメチルアメラミン（methylamelamine）；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロランブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（cholophosphamide）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビエヒン（novembiehin）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなど；ニトロ尿素、例えば、カンヌスチン（cannustine）、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチンなど；抗生物質、例えば、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウスラマイシン（authramycin）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアミシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモイニシン（chromoinycin）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダムビシン（idambicin）、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、およびゾルビシンなど；代謝拮抗剤、例えば、メトトレキセートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）など；葉酸類似体、例えば、デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、およびトリメトレキセート；プリン類似体、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、およびチオグアニンなど；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、および５−ＦＵなど；アンドロゲン、例えば、カルステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、ルネピチオスタン（rnepitiostane）、およびテストラクトンなど；抗副腎剤（anti-adrenal）、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、およびトリロスタンなど；フロリン酸などの葉酸補充物質（replenisher）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デホファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルホルニチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメト（phenamet）；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；シゾフラン（sizofrran）；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；ｔｈｉｏｔＥＰａ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）およびドキセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；白金類似体、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチンなど；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセロダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン；ならびに上記の任意の医薬として許容可能な塩、酸または誘導体も挙げられる。腫瘍へのホルモン作用を制御または阻害するために作用する抗ホルモン剤、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）−イミダゾール、４ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、オナプリストン、およびトレミフェン（ファレストン）を含めた抗エストロゲン剤；ならびに抗アンドロゲン、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリンなど；ならびに上記の任意の医薬として許容可能な塩、酸、または誘導体も含まれる。
【００９６】
サイトカインも治療剤として使用することができる。そのようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、および伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインの中に含まれるのは、成長ホルモン、例えば、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンなど；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；糖タンパク質ホルモン、例えば、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）など；肝成長因子；線維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子−αおよび−β；ミュラー管抑制物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−βなどの神経成長因子；血小板成長因子；トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、例えば、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βなど；インスリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン、例えば、インターフェロン−α、−βおよび−γなど；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、マクロファージ−ＣＳＦ（ＭＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、および顆粒球−ＣＳＦ（ＧＣＳＦ）など；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５など；腫瘍壊死因子、例えば、ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−βなど；ならびにＬＩＦおよびキットリガンド（ＫＬ）を含めた他のポリペプチド因子である。本明細書で使用する場合、用語サイトカインには、天然源または組み換え細胞培養物からのタンパク質、および天然配列サイトカインの生物学的に活性な等価物が含まれる。
【００９７】
造影剤
造影剤は、哺乳動物またはヒトなどの動物の身体の標的部位についての画像情報を提供する任意の物質とすることができる。造影剤は、磁気共鳴画像法のための酸化鉄などの磁気材料を含むことができる。光学的画像法については、活性剤は、例えば、半導体ナノ結晶または量子ドットとすることができる。光コヒーレンストモグラフィー画像法については、造影剤は、金属、例えば、金または銀、ナノケージ粒子とすることができる。造影剤は、超音波造影剤、例えば、マイクロバブルもしくはナノバブルまたは酸化鉄マイクロ粒子もしくはナノ粒子でもよい。
【００９８】
投与
多段階送達ビヒクルは、疾患などの生理的状態を治療、予防および／またはモニターするために、任意の適当な投与方法によって、ヒトなどの対象に、複数のビヒクルを含む組成物の一部として投与することができる。具体的な用途に使用される特定の方法は、主治医によって決定される。一般に、組成物は、以下の経路、すなわち、局所、非経口、吸入／肺、経口、膣および肛門のうちの１つによって投与することができる。
【００９９】
多段階送達ビヒクルの実施形態は、腫瘍学的用途、すなわち、癌または癌に関連する腫瘍などの状態を治療および／またはモニターするために特に有用となり得る。例えば、皮膚癌は、好ましくは粘性懸濁液の局所適用によって治療および／またはモニターすることができ、肺癌は、エアロゾル化した水性微小デバイス懸濁液（microdevice suspension）の吸入によって治療および／またはモニターすることができ、子宮頸癌は、微小デバイス懸濁液の膣投与によって治療および／またはモニターすることができ、大腸癌は、そのような懸濁液の直腸投与によって治療および／またはモニターすることができる。治療用途の大部分は、いくつかの種類の非経口投与を伴う場合があり、これには、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）および皮下（ｓ．ｃ．）注射が含まれる。
【０１００】
多段階送達ビヒクルの投与は、全身性であっても局所性であってもよい。上記に列挙した投与のうちの非経口でない例、ならびにｉ．ｍ．およびｓ．ｃ．注射は、局所投与の例である。血管内投与は、局所性または全身性のいずれにもなり得る。局所血管内送達は、ＣＡＴスキャンガイドカテーテルなどのガイドカテーテルシステムを使用することによって、既知の病変部の近傍に治療物質を導くのに使用することができる。一般的な注射、例えば、大量瞬時投与ｉ．ｖ．注射または連続／点滴供給ｉ．ｖ．注入は、一般的に全身性である。
【０１０１】
静脈内投与については、多段階送達ビヒクルは、複数のビヒクルを含有する懸濁液として製剤化することができる。ビヒクルは、その寸法およびその内容物において均一であることが好ましい。懸濁液を形成するために、上述したようなビヒクルは、任意の適当な水性担体ビヒクル中に懸濁させることができる。適当な医薬担体は、使用される投与量および濃度でレシピエントに対して無毒性であり、製剤中の他の成分と適合性であるものである。マイクロ加工粒子の懸濁液の調製は、例えば、米国特許出願公開第２００３０１１４３６６号に開示されている。
【０１０２】
経口投与については、多段階送達ビヒクルは、複数のビヒクルで構成されている経口組成物の一部として投与することができる。組成物中のビヒクルは、寸法において均一である、すなわち、各ビヒクルの第１段階粒子は、同じまたは実質的に同じ寸法を有し、各ビヒクルの第２段階粒子は、同じまたは実質的に同じ寸法を有することが好ましい。組成物は、ビヒクルを、適当な非水性担体、例えば、油または微粉化した粉末などと混合することによって作製し、標準的な腸溶カプセル中に単位投与量で満たす、あるいは、圧縮して錠剤にし、腸溶コーティング材料でコーティングすることができる。腸溶コーティングにより、ビヒクルが、胃の低（酸性）ｐＨ環境を通って乾燥形態で輸送され、小腸または大腸の事前に選択した領域で放出されることが保証される。
【０１０３】
組成物は、保護ポリマーでコーティングすることができる。この材料は、錠剤またはカプセルのいずれかにフィルムコーティング技法により施すことによって、製品を胃環境の作用から保護し、または胃環境中での薬剤の放出を防止することができる。そのようなコーティングは、胃中で無傷のままであるが、小腸に到達すると溶解し、剤形の内容物を放出することができるものである。腸溶コーティングの目的は、第１段階粒子の内容物の放出を遅延させるためとすることができる。
【０１０４】
最も広範に使用される腸溶ポリマーの１つは、セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）とすることができる。別の有用なポリマーは、ポリビニルアセテートフタレート（ＰＶＡＰ）とすることができ、これは、ＣＡＰよりも、水分に対して浸透性が低く、加水分解に対して安定であり、より低いｐＨでイオン化することができる。これらの性質により、十二指腸におけるより信頼できる放出が可能となり得る。現在使用されているポリマーの別の例は、酸イオン性基を有する、メタクリル酸−メタクリル酸エステルコポリマーに基づくものとすることができる。これの中で代表されるのは、Ｒｏｈｍ Ｐｈａｒｍａを通じて入手可能な、商品名Ｅｕｄｒａｇｉｔを有するポリマーである。一般に、腸溶コーティングは、錠剤またはカプセルの約０．５重量％から約１０重量％で適用することができる。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、メチルセルロースなどの水溶性の低いポリマーを使用することによって、十二指腸中で粒子を放出した後の、チャンバーからの薬剤の放出を遅延させることができるであろう。ＡＬＺＡ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｔ．Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．）によって開発されたＣｈｒｏｎＳｅｔＲＴＭ技法を使用することによって、胃から小腸中に通過した後に、指定された時間および標的部位に多段階送達ビヒクルを大量瞬時に放出することができる。この場合、ビヒクルの懸濁液を、ＣｈｒｏｎＳｅｔカプセル中に装填してもよい。嚥下した後、このカプセルは、無傷で胃を通過する。シェルは、システムの浸透圧透過性部分による水吸収の割合を制御するように設計することができる。浸透圧力（osmotic engine）は増大することによって、カプセルの２つの半分を押し、分離することができる。カプセルの半分の長さは、事前に選択した時間で分離するように特に設計することができる。各カプセルの内容物は、投与して２から２０時間後に腸管腔中に排出することができる。内容物（この場合では、薬剤を満たしたマイクロ加工粒子の懸濁液）の８０％超を、１５分の時間枠内に排出することができる。この手法は、小腸また大腸の事前に選択した範囲で、ビヒクルの懸濁液を放出する手段を提供することができる。そのようなシステムは、粒子にグラフトされた粘膜付着性リガンドのための受容体を含有する範囲などの結合に最適な小腸または大腸中の部位、および／または第１段階粒子内部に含まれる透過エンハンサーに感受性である腸管上皮の領域などの吸収に最適な小腸または大腸中の部位で、多段階送達ビヒクルを放出するために使用することができる。
【０１０６】
本明細書に説明した実施形態は、まったく限定されないが、以下の実施例によってさらに例示される。
【実施例１】
【０１０７】
以下の実験を行うことによって、ナノ多孔質シリコン第１段階マイクロ粒子中への選択された第２段階粒子の装填および放出を研究した。ナノ多孔質シリコン第１段階粒子の生分解および生体適合性も研究した。
【０１０８】
材料および方法
Ｚ２分析
粒子を、Ｚ２ Ｃｏｕｌｔｅｒ（登録商標）粒子計数器およびサイズ分析器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）でカウントした。粒子分析に使用した開口部のサイズは、５０μｍであった。分析のためのサイズの下限および上限を１．８および３．６μｍに設定した。分析のために、装置（ＩＳＯＴＯＮ（登録商標）ＩＩ Ｄｉｌｕｅｎｔ）の平衡化電解質溶液中に粒子を懸濁させ、カウントした。粒子の最初の懸濁液の全体積は、最終分析体積の０．３％を超えなかった。
【０１０９】
シリコンマイクロ粒子の酸化
ＩＰＡ中のシリコンマイクロ粒子を、ホットプレート（８０〜９０℃）上に維持したガラスビーカー中で乾燥させた。シリコン粒子を、ピラニア（１容量のＨ_２Ｏ_２および２容量のＨ_２ＳＯ_４）中で酸化させた。Ｈ_２Ｏ_２を加えた後、粒子を超音波処理し、次いで酸を加えた。この懸濁液を断続的に超音波処理して粒子を分散させながら、１００〜１１０℃に２時間加熱した。次いで、懸濁液のｐＨが約５．５〜６になるまで、この懸濁液をＤＩ水中で洗浄した。次いで粒子を適切な緩衝液、ＩＰＡに移し、または水中に保管し、その後に使用するまで冷蔵した。
【０１１０】
ＡＰＴＥＳでのＳｉ粒子の表面修飾
シラン化プロセスの前に、酸化した粒子を１．５ＭのＨＮＯ_３酸中で約１．５時間（室温）ヒドロキシル化した。粒子は、ＤＩ水中で３〜５回洗浄した（洗浄には、水中での懸濁および遠心処理が含まれ、その後に上澄みを除去し、この手順を繰り返した）。
【０１１１】
粒子は、ＩＰＡ（イソプロピルアルコール）中で２回洗浄することによって、ＩＰＡ中に懸濁させた。次いでこれらを、０．５％（ｖ／ｖ）のＡＰＴＥＳ（３−アミノプロピルトリエトキシシラン）を含有するＩＰＡ中に、室温で４５分間懸濁させた。次いでこの粒子を、遠心によってＩＰＡを用いて４〜６回洗浄し、冷蔵したＩＰＡ中に保管した。あるいは、この粒子をアリコートし、乾燥させ、その後に使用するまで真空および乾燥剤下で保管した。
【０１１２】
ＡＰＴＥＳ修飾粒子へのＰＥＧの結合
ＰＥＧをマイクロ粒子に結合させることによって、抗ＶＥＧＦＲ２抗体をさらにカップリングさせるためのスペーサーを提供した。Ｆｍｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳを使用した。これは、アミン基への急速なカップリングのためのＮＨＳエステルおよびＰＥＧ上のアミンを保護するためのＦｍｏｃ基を提供した。１０６〜１０９粒子／ｍｌのＡＰＴＥＳ修飾マイクロ粒子をＰＢＳ（ｐＨ約７．２）中に再懸濁させ、１〜１０ｍＭの濃度のＦｍｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳをこの粒子に加えた。
【０１１３】
カップリングは、室温で３０分から１時間実施し、次いで、未反応のＦｍｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳ基を、ＰＢＳ中で遠心によって３〜５回洗浄した。シリコンマイクロ粒子にカップリングしたＰＥＧの遠位末端上のＦｍｏｃ基を、ピペリジン（２０％ｖ／ｖで３０分間）で脱保護することによって、抗体とさらにカップリングさせるためのＰＥＧ上の遊離アミンを提供した。
【０１１４】
抗ＶＥＧＦＲ２の蛍光タギング
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．からの抗体標識化キットを使用して、ＶＥＧＦＲ２に対する抗体を、Ａｌｅｘａ４８８と結合させた。蛍光タグは、このキットのマニュアルに提供された手順に従って抗体と結合させた。１ｍｇ／ｍｌの抗体をタギングに使用した。蛍光タグに結合した抗体の量は、ＤＵ（登録商標）７３０ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、２８０および４９４ｎｍで抗体を分析することによって求めた。結合した抗体の量は、４０７μｇ／ｍｌであることが判明した。
【０１１５】
ＰＥＧ修飾粒子への抗ＶＥＧＦＲ２のカップリング
ＰＢＳ中に再懸濁させたシリコン粒子を、ヘテロ二官能性架橋剤ＡＮＢ−ＮＯＳ（ＤＭＦ中に溶解させ、１０ｍＭの最終濃度まで加えた）で３０分から１時間処理した。反応を暗所で実施することによって、架橋剤上のニトロフェニルアジド基の光分解を防止した。次いで粒子をＰＢＳで洗浄することによって、未反応の架橋剤を除去し、蛍光標識抗ＶＥＧＦＲ２と混合した。各実験点について４．６×１０６個の粒子を使用した。使用した異なる量の抗体は、０．８１４、０．４０７、および０．１６３μｇであり、それぞれ２．７、１．３５、および０．５４μｇ／ｍｌに相当し、ＵＶ光に１０〜１５分間暴露することによって、抗体上に存在するアミン基を結合した架橋剤にカップリングさせた。
【０１１６】
多孔質シリコンマイクロ粒子中へのアミノ−ＰＥＧ量子ドット（Ｑ−ドット）の装填のための緩衝液濃度の決定
低結合性（low binding）マイクロ遠心管中で、３．０×１０^５個の粗孔（ＬＰ）および細孔（ＳＰ）酸化シリコン（３００×１０^６粒子／ｍｌの濃度で保管した）またはＡＰＴＥＳ修飾マイクロ粒子（２００×１０^６粒子／ｍｌの濃度で保管した）、ならびに２μＭのアミノ−ＰＥＧ Ｑ−ドットまたはカルボキシルＱ−ドットを、１０、２０、５０、１００または２００ｍＭの、ｐＨ７．３のＴＲＩＳ−ＨＣｌを含有する溶液中で混合した。試料を、各実験点について２０μｌの最終体積で、２５℃で１５分間、回転ホイール（２０ｒｐｍ）中でインキュベートした。インキュベーション後、試料を２０ｍＭ、ｐＨ７．３のＴｒｉｓで希釈して１５０μｌにし、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで蛍光強度を即座に読み取った。図３のパネルＡは、ＡＰＴＥＳ修飾ＬＰおよびＳＰシリコン粒子中への、カルボキシ修飾量子ドットおよびアミノ修飾量子ドットの装填についての時間ダイナミクスの結果を示す。図４のパネルＡ〜Ｄは、（パネルＡ）ＬＰ酸化シリコン粒子、（パネルＢ）ＬＰ ＡＰＴＥＳ修飾シリコン粒子、（パネルＣ）ＳＰ酸化シリコン粒子、および（パネルＤ）ＳＰ ＡＰＴＥＳ修飾シリコン粒子中への、カルボキシ修飾量子ドットおよびアミノ修飾量子ドットの装填についての時間ダイナミクスの結果を示す。パネルＡ〜Ｄのそれぞれは、以下に説明するように、ＰＥＧ−ＦＩＴＣ単一壁カーボンナノチューブの装填についての時間ダイナミクスも示す。
【０１１７】
多孔質シリコンマイクロ粒子装填のためのアミノＰＥＧおよびカルボキシルＱ−ドットの濃度の決定
低結合性マイクロ遠心管中で、３．０×１０^５個のＬＰもしくはＳＰ酸化シリコン、またはＡＰＴＥＳ修飾マイクロ粒子を、２００ｍＭ、ｐＨ７．３のＴＲＩＳ−ＨＣｌ中で、それぞれ、０．０１、０．１、１、１０、１００、１０００および２０００ｎＭのアミノＰＥＧまたはカルボキシルＱ−ドットと混合した。試料を、各実験点について２０μｌの最終体積で、２５℃で１５分間、回転ホイール（２０ｒｐｍ）中でインキュベートした。インキュベーション後、試料を２０ｍＭ、ｐＨ７．３のＴｒｉｓで希釈して１５０μｌにし、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで蛍光強度を即座に読み取った。
【０１１８】
多孔質シリコンマイクロ粒子中への、アミノＰＥＧおよびカルボキシルＱ−ドットの装填のための時間の決定
低結合性マイクロ遠心管中で、１．２×１０^６個のＬＰおよびＳＰ酸化シリコン、またはＡＰＴＥＳ修飾マイクロ粒子を、８０μｌの最終体積で、２００ｍＭ、ｐＨ７．３のＴＲＩＳ−ＨＣｌ中で、２μＭのアミノ−ＰＥＧ Ｑ−ドットまたはカルボキシルＱ−ドットと混合した。粒子およびＱ−ドットを、回転ホイール（２０ｒｐｍ）中でインキュベートし、２５℃で１５、３０、４５および６０分後にバイアルからサンプリングした。インキュベーション後、試料を２０ｍＭ、ｐＨ７．３のＴｒｉｓで希釈して１５０μｌにし、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで蛍光強度を即座に読み取った。
【０１１９】
酸化およびＡＰＴＥＳ修飾多孔質シリコンマイクロ粒子中への、アミノＰＥＧおよびカルボキシルＱ−ドットの装填
酸化またはＡＰＴＥＳ修飾した、２．１×１０^６個のＬＰシリコンマイクロ粒子を、２００ｍＭ、ｐＨ７．３のＴＲＩＳ−ＨＣｌ溶液中で、それぞれ２μＭのアミノ−ＰＥＧ Ｑ−ドットまたはカルボキシルＱ−ドットと混合した。最終インキュベーション体積は、１４０μｌであった。試料は、２５℃で１５分間、回転ホイール（２０ｒｐｍ）中でインキュベートした。次いで、このマイクロ粒子を１．４ｍＬの脱イオン水（１０倍希釈）中で洗浄し、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ−２２遠心機中、４２００ＲＰＭで５分遠心した。粒子ペレットを７０μｌの脱イオン水中で懸濁させ、１０μｌをバイアルから採取し、２０ｍＭ、ｐＨ７．３のＴｒｉｓ溶液で希釈して１５０μｌの最終体積にした。試料の蛍光をＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで直ちに読み取り、時間０または装填した蛍光として記録した。
【０１２０】
酸化およびＡＰＴＥＳ修飾多孔質シリコンマイクロ粒子からの、アミノＰＥＧおよびカルボキシルＱ−ドットの放出
残りの６０μｌを１０倍希釈して６００μＬのＴＲＩＳ−ＨＣｌ ２０ｍＭ ＮａＣｌ ０．９％の放出緩衝液にした。１００μｌをこの溶液から取り出し、４００μＬのＴＲＩＳ−ＨＣｌ ２０ｍＭ ＮａＣｌ ０．９％の放出緩衝液で予め満たした管中に、試料をアリコートすることによってさらに５倍希釈した。この時点での最終希釈は、５００倍であった。試料を、３７℃で所定量の時間（１５、４５、９０、１８０、３６０および１２００分）、回転ホイール（２０ｒｐｍ）中に入れた。各時点で、アリコートを、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ−２２遠心機中、４２００ＲＰＭで５分遠心した。次いで各ペレットを１５０μｌ、２０ｍＭのＴＲＩＳ中で再懸濁させ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで、蛍光を直ちに読み取った。図５Ａは、ＬＰ酸化シリコン粒子からの、アミノ修飾量子ドットの放出の時間ダイナミクスを示す。図５Ｂは、ＡＰＴＥＳ修飾ＬＰシリコン粒子からの、カルボキシ修飾量子ドットの放出の時間ダイナミクスを示す。
【０１２１】
多孔質シリコンマイクロ粒子中への、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合単一壁カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）の装填のための緩衝液濃度の決定
低結合性マイクロ遠心管中で、３．０×１０^５個の粗孔酸化シリコンまたはＡＰＴＥＳ修飾マイクロ粒子を、異なるモル濃度（２０、１００、２００ｍＭ）の、ｐＨ７．３のＴＲＩＳ−ＨＣｌを含有する溶液中で、２０ｎｇ／μｌのＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴと混合した。各実験点について、最終体積は２０μｌであった。試料を、２５℃で１５分間、回転ホイール（２０ｒｐｍ）中でインキュベートした。インキュベーション後、試料を１５０μｌ、２０ｍＭのＴＲＩＳ中で再懸濁させ、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで蛍光強度を直ちに読み取った。
【０１２２】
多孔質シリコンマイクロ粒子中へのＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴの装填のための時間の決定
低結合性マイクロ遠心管中で、１．２×１０^６個の粗孔酸化シリコンまたはＡＰＴＥＳ修飾マイクロ粒子を、８０μｌの最終体積で、２０ｍＭ、ｐＨ７．３のＴＲＩＳ−ＨＣｌ中で、２０ｎｇ／μｌのＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴと混合した。粒子およびＳＷＮＴを、回転ホイール（２０ｒｐｍ）中でインキュベートし、２５℃で１５、３０、４５および６０分後にバイアルからサンプリングした。インキュベーション後、試料を２０ｍＭ、ｐＨ７．３のＴｒｉｓで希釈して１５０μｌにし、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで蛍光強度を即座に読み取った。
【０１２３】
多孔質シリコンマイクロ粒子装填のためのＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴの濃度の決定
低結合性マイクロ遠心管中で、３．０×１０^５個のＬＰもしくはＳＰ酸化シリコン、またはＡＰＴＥＳ修飾マイクロ粒子を、各実験点について２０μｌの最終体積で、２０ｍＭ、ｐＨ７．３のＴＲＩＳ−ＨＣｌ中で、１、１０、２０および５０ｎｇ／μｌのＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴと混合した。インキュベーション後、試料を２０ｍＭ、ｐＨ７．３のＴｒｉｓで希釈して１５０μｌにし、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで蛍光強度を即座に読み取った。
【０１２４】
蛍光定量法を使用した、ＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴの蛍光強度および消光効果の判定
２０ｍＭ、ｐＨ７．３のＴＲＩＳ−ＨＣｌ中のＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴについての濃度曲線を、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ蛍光光度計を使用して求めた。３５ｎｇ／μｌから出発し、１０７ｐｇ／μｌの最小検出可能量まで１：２の係数で下げ進めて、段階希釈を実施した。アリコートを９６ウェルプレート中に入れ、４８５での励起および５２０での発光を使用して蛍光を読み取った。蛍光消光は、そのより低い蛍光によって示されるように、ＳＷＮＴのより高い濃度で観察された。
【０１２５】
酸化およびＡＰＴＥＳ修飾多孔質シリコンマイクロ粒子中へのＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴの装填
１．８×１０^６個の「粗孔」（ＬＰ、約３０ｎｍ）シリコンマイクロ粒子を、２０ｍＭ、ｐＨ７．３のＴＲＩＳ−ＨＣｌ溶液中で、２０ｎｇ／μｌのＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴと混合した。最終インキュベーション体積は、１２０μｌであった。試料は、２５℃で１５分間、回転ホイール（２０ｒｐｍ）中でインキュベートした。次いで、このマイクロ粒子を１．２ｍＬの脱イオン水（１０倍希釈）中で洗浄し、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ−２２遠心機中、４２００ＲＰＭで５分遠心した。インキュベーション後、上澄みを取り出し、９６ウェルプレート中に入れ、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘプレートリーダーを使用して蛍光を読み取った。
【０１２６】
粒子ペレットを６０μｌの脱イオン水中で再懸濁させ、１０μｌをバイアルから採取し、２０ｍＭ、ｐＨ７．３のＴＲＩＳ溶液で希釈して１５０μｌの最終体積にした。試料の蛍光を、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで直ちに読み取り、時間０または蛍光添加として記録した。
【０１２７】
酸化およびＡＰＴＥＳ修飾多孔質シリコンマイクロ粒子からの、ＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴの放出
残りの５０μｌを１０倍希釈して５００μＬのＴＲＩＳ−ＨＣｌ ２０ｍＭ ＮａＣｌ ０．９％の放出緩衝液にした。１００μｌをこの溶液から取り出し、４００μＬのＴＲＩＳ−ＨＣｌ ２０ｍＭ ＮａＣｌ ０．９％の放出緩衝液で予め満たした管中に、試料をアリコートすることによってさらに５倍希釈した。この時点での最終希釈は、５００倍であった。試料を、３７℃で所定量の時間（１５、４５、１２０、２４０および１２００分）、回転ホイール（２０ｒｐｍ）中に入れた。各時点で、アリコートを、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ−２２遠心機中、４２００ＲＰＭで５分遠心した。上澄みを取り出し、９６ウェルプレート中に入れ、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘプレートリーダーを使用して蛍光を読み取った。次いで、各ペレットを１５０μｌの、２０ｍＭのＴＲＩＳ中で再懸濁させ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで蛍光を即座に読み取った。図５Ａは、ＬＰ酸化シリコン粒子からの、ＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴの放出の時間ダイナミクスを示す。図５Ｂは、ＡＰＴＥＳ修飾ＬＰシリコン粒子からの、ＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴの放出の時間ダイナミクスを示す。
【０１２８】
酸化およびＡＰＴＥＳ修飾多孔質シリコンマイクロ粒子中へのナノリポソームの装填
１．５×１０^６個のＬＰおよびＳＰ酸化シリコンマイクロ粒子を、２０ｍＭ、ｐＨ７．３のＴＲＩＳ−ＨＣｌ溶液中で、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏ ５５５結合ｓｉＲＮＡを含有する、１０ｎｇ／μｌのリポソームと混合した。粒子およびナノリポソームを、回転ホイール（２０ｒｐｍ）中でインキュベートし、２５℃で１５、３０および６０分後にバイアルからサンプリングした。インキュベーション後、試料を２０ｍＭ、ｐＨ７．３のＴｒｉｓで希釈して１５０μｌにし、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで蛍光強度を即座に読み取った。
【０１２９】
分解
５×１０^６個のＬＰおよびＳＰ酸化シリコン粒子を、ｐＨ７．３で２．５ｍＭのＴＲＩＳおよび０．９％のＮａＣｌを含有する溶液（生理食塩水）中、または１０％のＦＢＳを補充した細胞培養培地（ＣＣＭ）中のいずれかで混合した。この混合物を、３７℃で回転ホイール（８ｒｐｍ）中でインキュベートし、ＳＥＭ、Ｚ２およびＩＣＰのためのサンプリングを、時間０ならびに６、１８および２４時間後に実施した。
【０１３０】
分解研究のための３種類の分析を同時に並行して実施するのに十分な材料を有するようにこの実験を設計し、これによって制御されない、または気づかない変数による差異を回避した。したがって、このプロトコルを、ＳＥＭ、Ｚ２およびＩＣＰのために得た試料に適用した。
【０１３１】
追加の分解実験を実施することによって、ＨＵＶＥＣ細胞での毒性実験のための材料を提供した。各実験点について、３×１０^６個のＬＰ、酸化もしくはＡｐｔｅｓ修飾、またはＳＰ、酸化もしくはＡｐｔｅｓ修飾シリコン粒子を、３７℃で、回転ホイール（８ｒｐｍ）内のＣＣＭ中で２４の間インキュベートした。
【０１３２】
ＩＣＰ
多孔質シリコン粒子が溶液から消失したかどうかを理解するために、これらをインキュベートし、この多孔質シリコン粒子をケイ酸中に溶解させ、誘導結合プラズマ原子発光分析（ＩＣＰ−ＡＥＳ）と呼ばれる技法によって研究した。
【０１３３】
この方法により、溶液中に存在する任意の所与の元素の絶対量を定量化することが可能になる。Ｚ２およびＳＥＭ分析と同じ時点で十分な量を回収し、これらを遠心することによってまだ分解されていない粒子をペレット化した。０．４５０μｍのフィルターユニットを通して濾過された上澄みを、ＩＣＰで分析した。
【０１３４】
細胞培養
５０万個の新たに単離したヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（商標）Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉｎｃ）を、完全培地と呼ばれる、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン（Ｓｉｇｍａ）、１００ｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）、７．５ＩＵ／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ）、２ｎｇ／ｍｌの上皮成長因子（ＥＧＦ）（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）および２５０ｐｇ／ｍｌの内皮細胞成長因子（−ＥＣＧＦ）（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ、ＵＳＡ）を含有する、１０％胎児ウシ血清（ＦＣＳ、Ｇｉｂｃｏ）を補充したＭ１９９培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）中に播種した。コンフルエントな細胞を、トリプシン（Ｓｉｇｍａ）を用いて剥がし、継代培養した。細胞は継代６まで展開し、生体適合性研究のために使用した。
【０１３５】
顕微鏡観察
細胞を、４０倍の拡大レンズを有するＯｌｙｍｐｕｓ ＣＫＸ４１顕微鏡を用いて、明視野コントラストで分析した。ＳＰ−３５０ Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｔｒｕｅ−Ｐｉｃ ＴＵＲＢＯ画像プロセッサーカメラで画像を撮影した。
【０１３６】
ＬＤＨ毒性アッセイ
毒性アッセイの較正のために、異なる量の細胞（１２５、２５０、５００、１０００、２０００）を３つの９６ウェルプレート中に播種した。１２、２４および４８時間後に、細胞培養培地を、１％のトリトンを含有する新鮮な培地と取り替えた。細胞を、室温（ＲＴ）で１０分間インキュベートし、次いで１２００ｒｐｍで３分間遠心沈殿させ、１００μｌの細胞培養培地を、氷上に維持したレプリカプレート中に移した。再構成した触媒および色素を含有する１００μｌの溶液（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ ＬＤＨ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ）を各ウェルに加え、プレートをオービタルシェイカー上に移し、ホイルで覆い、ＲＴで２０分間振盪した。次いでこのプレートをＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ蛍光光度計中に移し、４９０ｎｍの吸光度を読み取った。すべての実験を３通り行い、結果を標準偏差とともに平均値として表した。
【０１３７】
実験のために、１０００個の細胞を播種し、細胞が表面に付着した後（約６時間）、２μｌの滅菌脱イオンＨ_２Ｏ中に再懸濁させた、異なる量のＬＰ酸化、ＳＰ酸化、ＬＰ ＡＰＴＥＳおよびＳＰ ＡＰＴＥＳシリコン粒子（１０００、５０００および１００００個であり、１：１、１：５、１：１０の細胞：粒子の比に相当する）を、培地に加えた。陽性対照として、２μｌの滅菌脱イオンＨ_２Ｏを細胞に加え、一方、陰性対照として、５０μｇ／ｍｌのシス白金(cis-platinum)を細胞培養培地に加えた。
【０１３８】
プレートを３７℃でインキュベートし、１２、２４、４８および７２時間の時点で、トリトン添加を除外して、較正アッセイについて説明されるように毒性アッセイを実施した。すべての実験を３通り行い、結果を標準偏差とともに平均値として表した。
【０１３９】
ＭＴＴアッセイ
ＭＴＴアッセイの較正のために、異なる量の細胞（１２５、２５０、５００、１０００、２０００）を３つの９６ウェルプレート中に播種した。１２、２４および４８時間後に、細胞培養培地を、５０μｌのＭＴＴ色素を含有する新鮮な培地と取り替えた。細胞を３７℃で４時間インキュベートし、次いで培地およびＭＴＴを取り出し、２００μｌのＤＭＳＯおよび２５μｌの０．１Ｍ グリシン、０．１Ｍ ＮａＣｌの、ｐＨ１０．５の溶液を各ウェルに加え、プレートをＲＴで１０分間インキュベートした。次いでこのプレートをＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ蛍光光度計中に移し、５７０ｎｍの吸光度を読み取った。すべての実験を３通り行い、結果を標準偏差とともに平均値として表した。
【０１４０】
実験のために、１０００個の細胞を播種し、細胞が表面に付着し、５０％コンフルエントな細胞ベッドが生成した後（約６時間）、２μｌの滅菌脱イオンＨ_２Ｏ中に再懸濁させた、異なる量のＬＰ酸化、ＳＰ酸化、ＬＰ ＡＰＴＥＳおよびＳＰ ＡＰＴＥＳシリコン粒子（１０００、５０００および１００００個であり、１：１、１：５、１：１０の細胞：粒子の比に相当する）を、培地に加えた。陽性対照として、２μｌの滅菌脱イオンＨ_２Ｏを細胞に加え、一方、陰性対照として、５０μｇ／ｍｌのシス白金を細胞培養培地に加えた。
【０１４１】
プレートを３７℃でインキュベートし、１２、２４、４８および７２時間の時点で、培地をウェルから取り出し、細胞を滅菌ＰＢＳで大規模に洗浄することによって、シリコン粒子を除去した。次いで較正アッセイについて説明されるように増殖アッセイを実施した。すべての実験を３通り行い、結果を標準偏差とともに平均値として表した。
【０１４２】
ヨウ化プロピジウム染色
０．６×１０^６個の細胞を２５ｃｍ^２のフラスコ中に播種し、細胞が付着したとき（約６時間後、細胞が、６０％コンフルエントな細胞ベッドを生成したとき）、２０μｌの滅菌脱イオンＨ_２Ｏ中に再懸濁させた、３×１０^６個のＬＰ酸化、ＳＰ酸化、ＬＰ ＡＰＴＥＳまたはＳＰ ＡＰＴＥＳシリコン粒子（１：５の比）のいずれかを、各フラスコの培地に加えた。陽性対照として、２０μｌの滅菌脱イオンＨ_２Ｏを細胞に加え、一方、陰性対照として、５０μｇ／ｍｌのシス白金を細胞培養培地に加えた。追加の対照として、同じ量のＨＵＶＥＣ細胞を７５ｃｍ^２のフラスコ中に播種した。この細胞を自由に成長させたが、実験の間コンフルエンシーに到達することはなかった。
【０１４３】
１２、２４、４８および７２時間後に、細胞を５ｍｌの滅菌ＰＢＳで３回洗浄し、次いでトリプシン処理し、収集し、遠心した。ＰＢＳを用いた追加の洗浄ステップの後、各細胞ペレットを、２５０μｌのＰＢＳ中で再懸濁させ、緩やかにボルテックスしながら、７５０μｌの氷冷メタノールを細胞懸濁液に加えた。固定化を２０分間実施し、次いで、細胞を遠心沈殿させ、ＰＢＳで２回洗浄した。次いで、（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ７．３中の５０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムおよび７５μｇ／ｍｌのＲＮＡｓｅ）を含有する溶液を細胞ペレットに加え、この懸濁液を暗所で、回転ホイール（５ｒｐｍ）上で６０分間インキュベートした。次いで試料を、ＦＡＣＳ管中に移し、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎフローサイトメーターで直ちに読み取った。
【０１４４】
フローサイトメトリーのセットアップ
ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して、粒子を蛍光について評価した。対数のＳＳＣ対対数のＦＳＣを定義する２変数ドットプロットを使用することによって、使用したシリコン粒子のサイズおよび形状（直径３ミクロン、高さ１．５）を評価し、分析から非特異的事象を除外した。対照のレインボー（rainbow）ＢＤ ＣａｌｉｂｒｉｔｅＴＭビーズ（サイズ３．５ミクロン）を標準物質として分析した。
【０１４５】
装置の雑音信号に近すぎる事象を除外して、集団の中心付近に多角形領域（polygonal region）（Ｒ１）を画定した。各試料について、Ｒ１領域内で検出された粒子の数は８０％超であった。
【０１４６】
平均蛍光強度（ＭＦＩ）を求めるために、対数のＦＬ１およびＦＬ２対対数のＦＳＣのドットプロットを、画定した領域（Ｒ１）内に入る事象に基づいてゲート設定することによって作製した。それぞれの試料によって生じたピークは、対応する蛍光ヒストグラムおよび記録される幾何平均値で分析した。
【０１４７】
粒子の検出については、使用した検出器は、前方散乱（ＦＳＣ）Ｅ−１、および４７４Ｖの電圧を設定した側方散乱（ＳＳＣ）であった。蛍光検出器ＦＬ１は、８００Ｖに設定した。
【０１４８】
緑色蛍光（ＦＩＴＣおよびＱ−ドット５２５）は、ＦＬ１の５３０／３０ｎｍバンドパスフィルターを使用して検出した。橙色および赤色蛍光（Ｑ−ドットＤ５６５およびヨウ化プロピジウム）は、ＦＬ２を使用して検出した。単一色検出のみを分析していたので、補正はゼロに設定した。装置較正は、それぞれの一連の取得の前、間および後に、レインボーＢＤ ＣａｌｉｂｒｉｔｅＴＭビーズを使用して実施した。
【０１４９】
細胞検出について使用した検出器は、４．５９の増幅ゲインを有する線形前方散乱（ＦＳＣ）Ｅ００、および１．０７の増幅ゲインを有する、４７４Ｖに電圧を設定した線形側方散乱（ＳＳＣ）であった。蛍光検出器ＦＬ２は、４４９Ｖに設定し、増幅ゲインを１．３２に設定した。
【０１５０】
細胞および粒子の残骸は、散乱性質に基づいて分析から電子工学的にゲート設定した。すべての実験において、少なくとも２０，０００個の粒子または細胞を分析した。すべての実験は３通り実施した。結果を、無傷の粒子または生細胞のみの平均蛍光強度として示した。データ分析は、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて実施した。
【０１５１】
蛍光顕微鏡観察
粒子の蛍光画像法は、−３０．１℃に維持したＤＱＣ−ＦＳ Ｎｉｋｏｎ ＣＣＤカメラを備えるＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ２０００−Ｅで実施した。すべての試料は分析の直前に設置し、画像は６３倍の油浸対物レンズで得た。顕微鏡の設定は、すべての実験全体を通して一定に維持した。開口数を１．４、屈折率を１．５１５、露光時間を５００ｍｓ、読み出し速度を１０ＭＨｚ、変換利得を１／６倍に設定した。画像を、ＮＩＳ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ＡＲ ２．３ソフトウェアを用いて分析し、測定した。
【０１５２】
結果
抗体結合
ＡＰＴＥＳ修飾粒子を抗ＶＥＧＦＲ２と結合させるのに使用した粒子の総数は、約７．０３×１０^６個であった。以下の表３に列挙するように、２つの異なる量の抗ＶＥＧＦＲ２を、結合のために使用した。
【表３】

【０１５３】
異なる実験では、結合後に、粒子を０．５％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝液中で６回洗浄、遠心し、その後に単純なリン酸緩衝液中で４回洗浄し、次いでプレートリーダーで読み取った。以下の表４に列挙するように、２つの異なる量の抗ＶＥＧＦＲ２を、結合のために使用した。
【表４】

【０１５４】
表４によって示したように、結合の間に、すべての場合において、粒子の数が著しく低減した。これは、溶液から非結合抗体を除去することに伴う多数の洗浄ステップに間に受けた損失に起因し得ると思われる。
【表５】

【０１５５】
装填および放出
量子ドット（Ｑドット）および単一壁カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）を、その独特で優れた性質の理由で、第２段階ナノベクターとして使用した。Ｑ−ドットは、発光半導体ナノ結晶（ＣｄＳｅまたはＣｄＴｅ）であり、その高輝度、光安定性および色識別多重化の能力のために、ｉｎ−ｖｉｔｒｏおよびｉｎ−ｖｉｖｏの分子および細胞の画像化に対して、多くの研究が行われている。Ｑ−ドットは、親水性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でコーティングすることにより、生体適合性を増大させた。ζ電位は、２０ｍＭのＴｒｓ緩衝液中のアミノ−ＰＥＧ Ｑドットについて−１ｍＶであり、カルボキシルＰＥＧ Ｑドットについて−３２．８ｍＶであった。流体力学サイズは、散乱光ダイナミック光散乱法を使用して、溶液中のコロイドの拡散係数によって測定した。アミノおよびカルボキシルＱ−ドットは、同様の流体力学サイズを示す（それぞれ１３および１７ｎｍ）。
【０１５６】
ＳＷＮＴは、秩序だった中空の「巻き上げ」構造であり、高いアスペクト比、大きな表面積、高い機械的強度、超軽量、優れた化学的／熱的安定性を有する。ＳＷＮＴ表面をペプチド、タンパク質および薬剤で官能化するために、多くのプロトコルが研究されている。本研究では、ＳＷＮＴは、直径が２〜４ｎｍであり、長さが３０と１００ｎｍの間であり、表面をＰＥＧ−アミンで官能化して、水および生理的食塩水中での溶解性を提供し、蛍光画像法のためにＦＩＴＣをさらに連結した。ζ電位測定は、２０ｎＭのＴＲＩＳ緩衝液中で−９．２ｍＶを示す。
【０１５７】
量子ドットを粗孔粒子中に装填することへのＴｒｉｓ濃度の効果を、最初に調査した。Ｔｒｉｓを緩衝剤として選択したが、これは、Ｔｒｉｓが他の緩衝剤と比較して、量子ドット（Ｑ−ドット）に対して最も高い安定性を示すことができるためである。装填したＱ−ドット粒子の平均蛍光量を、Ｔｒｉｓ濃度の関数として研究した。この粒子上の蛍光シグナルは、Ｔｒｉｓ濃度が増加するにつれて増大した。２００ｍＭの濃度のＴｒｉｓは、装填に関して最良の効果を示し、したがって、その後のすべての実験のために選択した。
【０１５８】
「大きな（粗い）多孔質」シリコン粒子の装填能力は、対照として「小さな（細かい）多孔質」シリコン粒子を使用することによって評価した。Ｑ−ドットの流体力学サイズは、１３〜１５ｎｍであり、細孔（５ｎｍ未満）中に入ることはできないが、その表面上に留まるはずである。装填についてのＱ−ドットの濃度効果は、Ｑ−ドットの量を１０ピコモルから２マイクロモルに変更し、すべての反応を同じ最終体積（２０μｌ）中でインキュベートすることによって実施した。試料の装填はＦＡＣＳで分析し、２μＭの量子ドット濃度により、最高レベルの装填がもたらされ、したがって、その後のすべての実験のために使用した。
【０１５９】
Ｑ−ドットでの粒子の装填時間／ダイナミクスは、異なるインキュベーション時間（１５分、３０分、および６０分）によって研究した。Ｑ−ドットの粒子中への装填は、１５分以内にその最大に到達する非常に速いプロセスであった。その後、図２１のパネルａ〜ｄに示すように、蛍光シグナルは時間とともに徐々に低下する。
【０１６０】
粒子の表面性質も、装填カイネティクスにおいて重要であることが判明した。図２１のパネルａ〜ｄに示すように、カルボキシルＰＥＧ Ｑ−ドットは、酸化粒子中にわずかしか装填されないことを示した。これは、両粒子が負に帯電していたので、静電気力に起因し得る。シリコン粒子の表面をアミノ基（ＡＰＴＥＳ）で修飾した場合、表５に示したように、ζ電位は、正（＋５〜＋６ｍＶ）になった。ＡＰＴＥＳ処理粒子中へのカルボキシルＱ−ドットの装填は、著しく増大した。アミノ−ＰＥＧ Ｑ−ドットの電荷は、ほとんど中性（−１〜＋１ｍＶのζ電位）であり、シリコン粒子のＡＰＴＥＳ処理は、装填に軽微に影響しただけであった（ζ電位は、−１１ｍＶから＋６ｍＶに変化した）。
【０１６１】
ＬＰ酸化粒子からのアミノ量子ドットの放出のカイネティクスは、指数関数様であり、２０分後に装填ナノ粒子の量が３３％減少し、４５分後に６７．５％減少した。２０時間後では、最初の蛍光量の残りの１％のみが粒子に関連すると判明し、すべての量子ドットをナノ多孔質シリコン粒子から放出することができることを示した。
【０１６２】
蛍光消光
３５μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ結合単一壁カーボンナノチューブ（ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴ）を含有する溶液、およびそのｍｉｌｌｉｑ純水中の段階希釈液（１：２から１：２０４８の範囲）の蛍光を測定した（図６ＡのパネルＡ）。最初の３つおよびより濃縮された試料（それぞれ、３５、１７．５および８．７２５μｇ／ｍｌ）の蛍光値は、濃度のより薄い溶液の値よりも低かった。これは、蛍光消光として知られる現象である。対照として、８μＭから４ｎＭの範囲のカルボキシペグ化量子ドットの一連の溶液を用いて同じ読み取りを実施し、これは、希釈とともに蛍光値の線形性減少を示した。ＡＰＴＥＳ修飾ＬＰ粒子のＦＩＴＣ−ＳＷＮＴでの装填における、蛍光消光ダイナミクスを評価した。実験は以前に説明した通りに実施した。曲線のプロファイルは、より多い量のＦＩＴＣ−ＳＷＮＴの装填により、蛍光消光が誘発され、したがってシリコン粒子の蛍光の減少がもたらされることを示した。２０μｇ／ｍｌの濃度を、その後のすべての実験のために選択した（図６ＡのパネルＢおよび図２０のパネルＢ）。
【０１６３】
粗孔粒子中にＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴおよびｑ−ドットを装填することへのＴｒｉｓ濃度の効果も調査した。図６ＢのパネルＣ〜Ｆを参照されたい。パネルＥおよびパネルＦは、Ｔｒｉｓ濃度の関数としての、ＬＰ ＡＰＴＥＳ修飾およびＬＰ酸化シリコン粒子中のＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴ装填粒子の平均蛍光量を示す。粒子上の蛍光シグナルは、Ｔｒｉｓ濃度が増加するにつれて減少した。２０ｍＭの濃度のＴｒｉｓは、装填に関して最良の効果を示し、したがって、その後のすべての実験のために選択した。
【０１６４】
カーボンナノチューブの装填
酸化およびＡＰＴＥＳ修飾の両方のＬＰおよびＳＰ粒子の、ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴでの装填のダイナミクスを評価した。実験は、２０μｇ／ｍｌの蛍光ナノ粒子を使用して、以前に説明した通りに実施した（図４のパネルＡ〜Ｄを参照されたい）。この実験設定では、装填時間ダイナミクスは、ＬＰ ＡＰＴＥＳ粒子の場合速く、これは、後の時点で同様の減少を示した（図４のパネルＢおよび図２１）。ＬＰ酸化粒子の装填については、異なるカイネティクスが観察され、これは、実験の全継続期間の間増加し、６０分の時点でその最大に到達した（図４のパネルＡ、および図２１）。
【０１６５】
細孔粒子（ＳＰ）の装填の間に、同じ装填パターンが起きていた。ＡＰＴＥＳ修飾粒子は、非常に急速に装填し、次いで時間を通じていくらかのその関連する蛍光を失ったが（図４のパネルＤ、および図２１）、酸化ＳＰ装填は、ＬＰ粒子で起きたように時間とともに増加し、ＡＰＴＥＳ修飾は、装填プロセスにおいて重要な役割を果たすことを示した（図４のパネルＣ、および図２１）。
【０１６６】
ＬＰ酸化粒子からのＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴの放出のカイネティクスは、最初の時点では指数関数様であった。この放出は、後の時点では減速した。２０時間後では、最初の蛍光量の残りの２０％のみが粒子に関連すると判明し、ペイロードの一部は、ナノ多孔質シリコン粒子中に保持される場合があることを示した（図７Ｂおよび図２１）。
【０１６７】
ナノリポソームも、上述したのと同じダイナミクスでＬＰ粒子中に装填された。シリコン粒子に関連する蛍光は、蛍光顕微鏡観察によって可視化した（図８ＡのパネルＡおよびＢ、図８ＢのパネルＥおよびＦ）。
【０１６８】
分解
多孔質シリコン（ＰＳｉ）は、完全に生分解性（Ｍａｙｎｅ ２０００；Ｌｏｗ，Ｗｉｌｌｉａｍｓら、２００６）であり、生体適合性（Ｃａｎｈａｍ １９９５）であることが知られている。シリコンウェハーについてすでに説明されているプロトコル（Ｃａｎｈａｍ １９９７）に従って実施した酸化プロセスにより、露出したシリコン表面上にヒドロキシル基（ＯＨ）を導入し、水の存在下でこれらの基を加水分解にかけ、こうして固体シリコンを非常に可溶性のケイ酸に変換した。
【０１６９】
ＳＥＭ
粒子のサイズ、形状および全体的なアスペクトにおける変化の研究を、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）によって実施した（図９および１０）。像により、粒子は、高い多孔性を有する範囲から開始して時間とともに分解し、次いで分解は、多孔性がより低く、孔のサイズがより小さい粒子縁部に広がることが示された。粒子の全体的な形状は、生じた分解プロセスの最後まで、ほとんど無傷のままであったことが認められるのは驚くべきことである。本発明は、その作用の理論によって限定されないが、この驚くべき観察結果は、酸化シリコン表面の浸食により、孔同士間の壁が進行的に消費され、こうして粒子の中心において欠陥および空孔が生じるという事実によって説明することができる。孔数がより少なく、孔同士間の壁がより厚い粒子側部を溶解するのに、同じプロセスでは、より多くの時間がかかった。
【０１７０】
Ｚ２ Ｃｏｕｌｔｅｒ
ナノ多孔質シリコン粒子の分解の特徴付けを、いくつかの技法によって実施した。粒子数およびその体積の減少の測定は、Ｚ２ Ｃｏｕｌｔｅｒ（登録商標）粒子計数器およびサイズ分析器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて実施した。粒子は、回転ホイール（８ｒｐｍ）内で、２つの異なる溶液、すなわち、ｐＨ７．３のＴｒｉｓ ２．５ｍＭ、０．９％ ＮａＣｌ（生理食塩水）と１０％のＦＢＳを含む細胞培養培地（ＣＣＭ）中、３７℃で２４時間維持した。孔のサイズが、分解カイネティクスにおいて役割を有するかどうかを理解するために、７〜１０（ＳＰ）ナノメートルの小さい孔を有するシリコン粒子と２０〜３０ナノメートルの大きい孔（ＬＰ）を有する粒子の両方を使用した。
【０１７１】
生理食塩水中でインキュベートした粒子では、ＬＰおよびＳＰのいずれの場合でも、その中央値サイズ分布のいかなる有意な減少も示されなかった。一方、その数は、時間全体を通して漸次低下した（図１１のパネルＡ）。これらの結果を一緒に合わせると、図１１のパネルＣに示したように、２４時間で、ＬＰおよびＳＰ粒子の両方について、全体で５０％以上のシリコン粒子質量の損失を意味し得る。
【０１７２】
ＣＣＭ中でインキュベートした粒子で実施した実験では、その中央値サイズおよび数の両方が減少した（図１１のパネルＢ）。これらの結果を一緒に合わせると、ＬＰ粒子について６０％、およびＳＰ粒子について９０％超の粒子質量の損失が示された。
【０１７３】
ＩＣＰ
ＩＣＰでの読み取り値は、分解後に存在するケイ素の量の線形性増加を示した。これらのデータにより、分解の検証についてのＩＣＰ−ＡＥＳ法の能力が確認された。データは、規則的で、低い標準偏差を伴い、試験の間の粒子数および粒径のＺ２の読み取り値との強い相関関係を有していた。ＴＲＩＳ緩衝液とは対照的に、細胞培養培地中で起きた分解の増大により、細胞培養条件下でのこれらの粒子の高い生分解性が示された（図１２ＡのパネルＡ〜Ｂ、および図１２ＢのパネルＣ〜Ｄ）。
【０１７４】
生体適合性
シリコンナノ多孔質粒子は、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）毒性アッセイ（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ Ｉｎｃ．）による細胞毒性、ＭＴＴアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）による細胞増殖、ならびにヨウ化プロピジウム染色によるアポトーシスおよび細胞周期を誘発した。
【０１７５】
明視野顕微鏡観察
多孔質シリコン粒子の存在下で成長した細胞は、時間中にいずれの重大または異常な種類の形態変化も示さなかった（図１３のパネルＡ〜Ｄ）。この細胞は、１２時間後に５０％のコンフルエンシーであり、これは、２４時間後にほぼ１００％のコンフルエンシーに到達した。図１３のパネルＡ〜Ｄ中に白色矢印で示したように、４８時間後に、アポトーシスまたはより一般的に、細胞死の何らかの徴候が明白であり、７２時間後には、さらにより明白であった（明るく、丸みのある、反射性の（reflectant）細胞、または大きな多小葉核（multilobular nuclei）を有する、もしくは細胞体の高い狭小化を伴う細胞）。これは主に、細胞がすでにコンフルエンシーに到達し、さらに成長する空間を見つけることができず、したがって、細胞分解のいくつかのプロセスを起こしたという事実のためであった。
【０１７６】
ＬＤＨ毒性アッセイ
ＬＤＨは、細胞溶解すると細胞質中に放出される細胞質酵素である。したがって、ＬＤＨアッセイは、膜完全性の測定である。ＬＤＨアッセイの基本は、ＬＤＨによる乳酸のピルビン酸への酸化、テトラゾリウム塩とのピルビン酸反応によるホルマザンの形成、および水溶性ホルマザンの分光光度検出である。（Ｄｅｃｋｅｒ，Ｔ．＆ Ｌｏｈｍａｎｎ Ｍａｔｔｈｅｓ，Ｍ．Ｌ．（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １５：６１〜６９；Ｋｏｒｚｅｎｉｅｗｓｋｉ，Ｃ．＆Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔ，Ｄ．Ｍ．（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６４：３１３〜３２０）。
【０１７７】
毒性較正曲線（図１４ＡのパネルＡ）を作成することによって、蛍光光度計で読み取った吸光度を、１％トリトンインキュベーションによって溶解した細胞数と相関させた。この較正曲線から、粒子のインキュベーションの間にＬＤＨ酵素を放出していた細胞の量を導出した。１２および２４時間では、毒性シグナルは非常に低く、トリプシン処理および播種から回収しなかった非結合細胞に主に起因し得ると思われる（バックグラウンド毒性）。これは、実験プレートに由来する毒性値を、対照プレートにおいて測定した毒性値と比較することによって確認した（図１４ＡのパネルＢ）。いずれの粒子も含まない９６ウェルプレート中で成長したＨＵＶＥＣ細胞の毒性（陽性対照）は、７２時間で、４７０ｎｍで０．４９６の平均吸光度を示した。これは、１：１の比でインキュベートした細胞からの値（０．５０７）とほとんど同じ値であった。より高い細胞：粒子の比（１：５および１：１０）では、毒性についての平均値は、それぞれ０．５５および０．５７であった（図１４ＡのパネルＢおよび図１４ＢのパネルＣ〜Ｆ）。すべての実験条件で同じ毒性パターンが観察され、したがって、多孔性および表面の化学的性質により細胞毒性は増加も減少もしなかったことを示している。すべて一緒にして、これらの結果により、細胞を粒子に暴露することによる、いかなる大きな毒性も示されなかった。
【０１７８】
ＭＴＴ増殖アッセイ
ＭＴＴは、黄色の水溶性テトラゾリウム色素であり、これは、生細胞によって還元されて水不溶性紫色のホルマザンになる。ホルマザンの量は、これをＤＭＳＯ中に可溶化し、分光光度的に測定することによって求めることができる。処理細胞と未処理細胞のスペクトル間での比較は、細胞毒性の相対的推定を示すことができる（Ａｌｌｅｙら（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８：５８９〜６０１）。蛍光光度計で読み取った吸光度値を成長中細胞の数と相関させるための毒性較正曲線（図１５のパネルＡ）。この較正曲線から、代謝的に活性であった細胞の量を導いた。
【０１７９】
１２、２４および４８時間では、粒子でインキュベートした細胞の増殖は、対照プレート中の増殖と正確に同じであった（図１５のパネルＢ）。７２時間では、５７０ｎｍの平均吸光度は、いかなる粒子も用いないで培養したＨＵＶＥＣ細胞（陽性対照）について１．６３５であったが、１：１の比でインキュベートした細胞からは、１．６２３であった。より高い細胞：粒子の比（１：５および１：１０）では、ＨＵＶＥＣは、それぞれ１．４６および１．４１に等しい吸光度値を示した（図１５のパネルＢ〜Ｆ）。これらの低い値は、細胞が多数の粒子の存在下で培養された場合の、細胞増殖のわずかな減少と相関した。これは、７２時間で、ＬＤＨアッセイを用いて測定した毒性のわずかな増大と一致した（図１４ＡのパネルＢ、および図１４ＢのパネルＣ〜Ｆ）。
【０１８０】
すべての実験条件で同じ増殖パターンが観察され、したがって、多孔性および表面の化学的性質により、細胞成長は増大も低下もしなかったことを示している。すべて一緒にして、これらの結果により、細胞を粒子に暴露することによる、細胞生存率のいかなる有意な変化も示されなかった。
【０１８１】
細胞周期およびアポトーシス
１：５の比の粒子（酸化またはＡＰＴＥＳ修飾したＬＰおよびＳＰ）に１２、２４、４８および７２時間暴露したＨＵＶＥＣ細胞を、固定化およびヨウ化プロピジウム染色した後にＦＡＣＳで分析した。ドットプロットおよび等高線プロットにおける、前方散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）を最初に分析した（図１６のパネルＡ〜Ｃ）。ＦＳＣパラメーターは細胞サイズの情報を提供し、ＳＳＣは細胞形状の情報を提供した。各パネルの底部の３次元プロットは、ｚ軸上でカウント数または事象を示し、ＦＡＣＳで分析した細胞の全体的な分布に関する情報を提供した。
【０１８２】
より小さく、均一性の低い形状によって特徴付けられた、ネクローシス／アポトーシス細胞のピークを、赤色矢印で示す。図１６のパネルＡ〜Ｃに報告したデータは、生理食塩水（対照）ならびにＬＰおよびＳＰ酸化シリコン粒子と共にインキュベートしたＨＵＶＥＣ細胞に関係する。時間に伴う細胞分布は著しく変化し、４８および７２時間で、低ＳＳＣ、低ＦＳＣ領域で大幅に蓄積していた。３グループの中で細胞分布の有意な差異はまったく認められず、ＬＰおよびＳＰ ＡＰＴＥＳ修飾粒子で処理した細胞から、同じ結果が得られた。本発明は、その作用の理論によって束縛されないが、後の時点での細胞死の誘発は、オーバーコンフルエンシー（overconfluency）に起因し得るであろう。これは予期することができたが、その理由は、粒子が毛細血管の内皮壁に接触すると思われる生理溶液にできるだけ近く実験を維持するために、播種した細胞が、０日目で６０％のコンフルエンシーであったためである。
【０１８３】
細胞周期の異なる位相における、処理したＨＵＶＥＣ細胞の分布も、定量的に測定した（図１７Ａ〜１７Ｄ）。対照細胞に由来するデータ（図１６のパネルＡ、ＨＵＶＥＣ＋生理食塩水）を、ＬＰおよびＳＰ処理した細胞に由来するデータと比較することによって、ナノ多孔質シリコン粒子への暴露は有毒ではなく、細胞死の量のいかなる有意な増加も誘発しないことが確認された。処理細胞と未処理細胞との間で、細胞周期の位相の変化はまったくないことも実証された。
【０１８４】
無傷の粒子だけでなく、その分解産物もいかなる毒性も誘発しなかったことを実証するために、ＨＵＶＥＣ細胞を、すべての粒子種の分解産物を含有するＣＣＭでインキュベートし、これまで説明した結果を確認した（図１７Ｄ）。細胞を、ＳＰ酸化、ならびにＳＰおよびＬＰ ＡＰＴＥＳ修飾粒子の分解産物と７２時間インキュベートした場合、アポトーシス領域の細胞量のわずかな増加が測定された。分解プロセスの間に生じた、より小さいシリコン断片が、何らかの種類の毒性を誘発した可能性もあり得る^{４５〜４８}。
【実施例２】
【０１８５】
正確に制御して、多種類のナノ粒子を細胞中に装填し、担持、放出および送達することのできる第１段階担体として、特定のサイズのナノ孔を含む生分解性シリコン粒子に基づく多段送達システムを開発した。第１段階シリコンナノ多孔質粒子は、異なる種類の第２段階ナノ粒子を同時に装填することができ、この第２段階ナノ粒子は、時間とともに持続性様式で放出される。第２段階ナノ粒子の装填および放出を制御する、主な物理的、化学的、および静電気的機構を明確にした。最後に、多孔質シリコン担体は、第２段階ナノ粒子を細胞質中に局所的に送達することができることを示した。総合すると、これらの研究により、シリコンナノ多孔質粒子は、異なる種類のナノベクターを細胞中に同時に送達するためのカーゴとして使用することができるという証拠が提供される。このシステムは、多数の治療剤および／または造影剤の細胞内送達を達成するための前例のない方法を提供することができる。
【０１８６】
緒言
過去１０年におけるその開発以来、ナノテクノロジーは、疾患の検出、診断、および治療のための生物医学的研究における多種多様の用途において使用されている^１〜３。このナノ粒子の開発および洗練を伴う多くの研究の目的は、器官、組織、および細胞に治療分子または造影分子を送達するための作用剤としての使用に焦点を当てている^４，５。様々なサイズおよび組成のリポソーム^６，７、量子ドット（Ｑ−ドット）^８，９、酸化鉄^１０、単一壁カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）^１１、金ナノシェル^{１２，１３}、ならびにいくつかの他の種類のナノ粒子^１４を含めた、いくつかの異なるナノベクターが、治療上の使用のために評価されてきた。これまでの進歩により、「分子標的治療剤」^{１５〜１８}として定義される分野が発生したが、ナノベクターベース送達システムを使用して治療剤を選択的に送達することである、最初の目的の達成は、完全には実現されていない^{１９，２０}。
【０１８７】
ナノベクターをナノ多孔質シリコン粒子中に組み込むことにより、このナノベクターが、通常その治療効果を遅延させ得る天然の生物学的バリアーをくぐり抜けることが可能になり得る。そのような手法は、治療剤を通常早早に分解する恐れのある周囲の体液および分子、ならびに細網内皮系（ＲＥＳ）による取り込みから治療剤を保護することができる。これは、標的組織への治療剤の送達の増大および投与量の集中を提供しながら、活性剤のより大きな安定性を導くことができる。
【０１８８】
第１段階シリコンナノ多孔質粒子中への、第２段階ナノ粒子の多数および同時装填を達成した。第２段階粒子（Ｑ−ドットおよびＳＷＮＴ）は、第１段階粒子が、特定の生物学的標的部位に到達するのに十分な時間にわたって徐々に放出された。装填および放出プロセスを支配する、主な物理的、化学的および静電気的機構。ナノ送達システムは、そのペイロードを細胞中に局所的に放出することができた。
【０１８９】
結果
第１および第２段階粒子
シリコンマイクロ粒子は、その体積、サイズおよび濃度を測定するために、Ｚ２ Ｃｏｕｌｔｅｒ（登録商標）粒子計数器およびサイズ分析器によって、ならびにその形態を詳細に評価するために走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）によって特徴付けた。図１９のパネルａおよびｂは、それぞれ、「粗孔」（ＬＰ）および「細孔」（ＳＰ）シリコン粒子の、裏面および前面、ならびに断面の代表的なＳＥＭ像を示す。これらの粒子は、非常に多孔質であり、形状が半球状である。ＬＰ粒子の直径は、約３．５μｍであり、直線輪郭の孔を含み、これは、粒子をその外部表面まで垂直に横断し、２０から３０ｎｍの範囲の孔径を有する（図１９のパネルａ）。ＳＰシリコン粒子は、３．２μｍの平均直径を有し、これらを作製するために使用した陽極酸化および電解研磨プロセスの結果として、ＬＰシリコン粒子よりも扁平な形状を有し、１０ｎｍ未満の孔径を伴っている（図１９のパネルｂ）。ＬＰおよびＳＰシリコン粒子の両方は、０．５〜０．６μｍの厚さを有する。ＢＥＴ分析によれば、その表面積は、ＬＰ粒子については１５６ｍ^２ｇ^−１であり、ＳＰ粒子については２９４ｍ^２ｇ^−１である。孔体積は、ＬＰ粒子については０．５４２ｃｍ^３ｇ^−１であり、ＳＰ粒子については０．３８３ｃｍ^３ｇ^−１である。孔の密度、サイズ、形状および輪郭は、電流、エッチング時間、およびドーピングを変更することによって精密に調整することができ、これは、バッチ間で再現性がある。非酸化シリコンは疎水性材料であるが、シリコンベース材料を安定化させ、オリゴヌクレオチド^２７、生体分子^２８、抗体^{２９，３０}、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖^３１でさらに機能化するために、様々な表面処理プロトコルが利用可能である。酸化シリコン粒子は、粒子表面上にヒドロキシル基が存在するために、負のζ電位値（ＬＰについては−１０．１、ＳＰについては−１１〜２５）を有する^３２。ＡＰＴＥＳで修飾された粒子は、その表面上にアミノ基を導入する結果として、正のζ電位値（ＬＰについては６．５２、ＳＰについては６．４５）を有する。Ｑ−ドットの流体力学サイズを、ダイナミック光散乱法を使用して、溶液中のコロイドの拡散係数によって測定した。直径は、アミノ−ＰＥＧ Ｑ−ドットについては１３ｎｍであり、カルボキシルＱ−ドットについては１６ｎｍであった。ＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴのサイズは、ＡＦＭ顕微鏡観察によって評価した。非ＰＥＧ化ＳＷＮＴの直径は、約１ｎｍであるが、ナノチューブを包囲しているＰＥＧのために、本研究のために使用したＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴは、４ｎｍの平均直径、および３０ｎｍの平均長さを有していた。ＳＷＮＴは、ＳＷＮＴ切断プロセスによって得たカルボン酸を介して、ＰＥＧ−アミンを使用して機能化し、ＦＩＴＣに結合させることによって、その蛍光画像化を可能にした。蛍光性を有する第２段階粒子を選択することによって、確立した技法、例えば、フローサイトメトリー、蛍光定量法、ならびに蛍光および共焦点顕微鏡観察の両方などを使用して、シリコンナノ多孔質粒子中への装填およびこの粒子からの放出を定量化した。第１および第２段階粒子の物理的および化学的性質を、表６に要約する。
【表６】

【０１９０】
第１段階シリコン粒子中への第２段階ナノ粒子の装填
ナノ粒子を第１段階シリコン粒子の孔内部に効率的に装填するためのプロトコルを開発した。装填プロセスに影響する要因の１つは、粒子を包囲している媒質中の第２段階粒子の量である。漸増量のＱ−ドット（図２０のパネルＡ）およびＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴ（図２０のパネルＢ）の両方を装填したシリコン粒子の蛍光強度の分析により、粒子装填は、第２段階粒子濃度に直接相関することが実証された。第２段階粒子の濃度を上昇させることによって、フローサイトメトリー（図２０のパネルＡおよびＢ）および蛍光顕微鏡観察での直接可視化（図２０のパネルＣおよびＤ）によって評価したように、進行的により高いレベルの装填が達成された。
【０１９１】
これらの研究により、第１段階シリコン粒子および第２段階粒子の両方の表面の化学的性質は、装填効率および集合多段階ナノ粒子担体システムの安定性に影響することも実証された。これらの観察結果は、図２１のパネルａおよびパネルｃに示した結果によって確認され、負の表面電荷（−３２．８ｍＶのζ電位）を有していたカルボキシルＱ−ドット、および負の表面電荷（−９．２１ｍＶのζ電位）を有するＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴは、負の表面電荷を有していたＬＰ酸化シリコン粒子中よりも、ＬＰ ＡＰＴＥＳ修飾シリコン粒子中に効率的に装填することができた。多孔質シリコンを修飾するのに利用可能な広範なプロトコルを考慮すると^{２７，２９〜３５}、第１および第２段階の表面の化学的性質を活用することによって、任意の種類の第２段階粒子を効率的に装填することが可能である。
【０１９２】
第２段階ナノ粒子の装填は、非常に急速なプロセスであった。図２１のパネルａおよびｃは、ＬＰ酸化シリコン粒子およびＬＰ ＡＰＴＥＳ修飾シリコン粒子を、固定量のアミノＱ−ドットおよびカルボキシルＱ−ドットの両方、ならびにＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴでインキュベートした場合に得られた結果を例示する。第１段階多孔質シリコン粒子の完全な装填は、第１段階多孔質シリコン粒子と第２段階粒子の組合せが、上述した静電気的基準に適合する場合、１５分以内に起きた。ＳＰ酸化シリコン粒子およびＳＰ ＡＰＴＥＳ修飾シリコン粒子の、第２段階ナノ粒子での装填も評価した（それぞれ、図２１のパネルｃおよびｄ）。Ｑ−ドットサイズは、１３と１６ｎｍの間であり、したがって、これらは、ＳＰシリコン粒子の孔（５〜７ｎｍ）中に装填することはできなかった。一方、ＬＰシリコン粒子の孔（２０〜４０ｎｍ）は十分に大きいことによって、Ｑ−ドットの装填を可能にした。結果として、ＳＰ粒子の平均蛍光量は、ＬＰ粒子のわずか６％であった。逆に、より小さいサイズのＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴは、ＳＰ粒子の孔と適合し、装填の増大をもたらした（ＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴの２５％がＬＰシリコン粒子中に装填された）。
【０１９３】
第１段階シリコン粒子からの第２段階ナノ粒子の放出
薬剤送達のための手段として多段階送達システムを評価するために、ナノ多孔質シリコン第１段階粒子からの第２段階粒子の放出のカイネティクスを調査した。生理的条件を模倣するために、すべての実験を、緩衝生理食塩水中３７℃で実施し、放出溶液を各時点で交換した。図２１のパネルｅ〜ｈは、両種類の第２段階粒子が、時間とともに第１段階シリコン粒子から放出されたことを示す。驚いたことに、放出プロセスは持続され、完全な放出は２０時間後に到達した。さらに、放出カイネティクスは、Ｑ−ドットとＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴの間で著しく異なり、Ｑ−ドットは、ＳＷＮＴよりも著しく速く放出された。
【０１９４】
ＳＰ酸化シリコン粒子（図２１のパネルｆ）およびＳＰ ＡＰＴＥＳ修飾シリコン粒子（図２１のパネルｈ）を用いて実施した対照実験により、Ｑ−ドットは、孔内部に装填されないことが確認された。ＳＰシリコン粒子表面からのＱ−ドットの脱離は、大量で急速であり（１５分で８０％超）、Ｑ−ドットがシリコン粒子表面と緩く相互作用していたことを示している。対照的にＬＰおよびＳＰシリコン粒子からのＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴ第２段階ナノベクターの放出のカイネティクスは比較に値し、ＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴが、第１段階ＳＰ粒子の孔中に装填されたことを確認した。
【０１９５】
共焦点顕微鏡観察を使用することによって、シリコン担体の孔中への第２段階ナノ粒子の装填をさらに特徴付けた。図２２のパネルａ〜ｂは、カルボキシルＱ−ドットを装填したＬＰ ＡＰＴＥＳシリコン粒子の、一連の３次元投影および回転を示す。より大きな孔が存在する、シリコン粒子の裏面の中心領域において、より強い蛍光シグナルが検出された。図１９のパネルａを参照されたい。周囲範囲に由来する強度の弱いシグナルは、より小さい孔中への部分的な装填、またはＱ−ドットのシリコン粒子表面との相互作用のいずれかによるものであった。
【０１９６】
多重装填
赤色蛍光Ｑ−ドット（５６５ｎｍで発光）および緑色蛍光ＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴ（５１０ｎｍで発光）を、同じナノ多孔質シリコン粒子中に同時に装填した（図２３ＡのパネルＡおよびＢ）。これらの研究により、両種類の第２段階粒子を、同じナノ多孔質シリコン粒子担体中に装填することができることが実証された。多重装填のダイナミクスは、単一装填について説明したものと異なり、６０分後に安定なプラトーに到達した。ＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴは、おそらくそのより小さいサイズの結果として、孔内部に滞在するのが最初であり、一方、より大きなＱ−ドットは、より多くの時間がかかったが、より高いレベルの装填に到達した（図２３ＢのパネルＣ）。シリコン担体からの両種類の第２段階粒子の放出プロファイルは、図２１のパネルＢに示した放出の観察結果と比較して、ほとんど変化しないままであった（図２３ＢのパネルＤ）。図２３ＣのパネルＥ〜Ｈに示した共焦点顕微鏡像は、２つの異なる第２段階ナノベクターが、シリコン粒子の異なる範囲に優先的に局在化したことを示す。その大きなサイズを考慮すると、Ｑ−ドットは、より大きな孔と関連して中心範囲内に専ら見出された。ＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴは、粒子全体のまわりに見出され、より小さな孔と関連して、主に粒子の辺縁部に沿って蓄積していた。
【０１９７】
装填したシリコン粒子を３７℃で１時間、ＨＵＶＥＣ細胞でインキュベートした場合、第２段階粒子は局所的に放出され、第１段階粒子が到達した細胞によって選択的に内部移行された。Ｑ−ドット（図２４のパネルａ〜ｄ）およびＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴ（図２４のパネルｅ〜ｈ）は、細胞の細胞質ゾルに入り、細胞質小胞内部にかなり蓄積した。次に、第１段階シリコン粒子中に両ナノ粒子を装填した後に、このナノ粒子を送達することを試みた。両ナノ粒子の内部移行は、蛍光シグナルの共局在化によって示されるように、同様のカイネティクスおよび同じ機構によって生じた（図２４のパネルｊ〜ｍ）。すべての場合において、３．５μｍのシリコン粒子自体は、１時間以内に細胞によって内部移行されなかった。図２４のパネルｄ、ｈおよびｍの明視野像は、粒子形態の詳細を示し、シリコン粒子は、細胞によって内部移行されるよりも外部の細胞表面に会合されたことを示しており、これは、共焦点画像法によっても検証された。
【０１９８】
考察
シリコンは、マイクロエレクトロニクス産業において広く使用されており、マイクロチップの大量生産、ならびにバイオセンサー、植込み可能デバイス、および薬剤送達システムの開発に関して、その能力を実証している^{３６〜３９}。バルクシリコンは、生理的緩衝液中で不活性なままであるが、多孔質シリコンは、孔径密度によって、数時間から数日まで精密に調整することのできる分解カイネティクスを伴う、高度の生分解性を有する^{４０，４１}。多孔質シリコン粒子は、分解してケイ酸になり、これは身体に対して無害であり、本発明者らは、無傷なシリコン粒子全体またはその分解産物のいずれも、細胞にとって細胞毒性ではないことを見出した。製造プロトコルは、任意の所望の形状、サイズ（１００ｎｍから数百μｍの寸法）、孔径（５〜１００ｎｍ）、および／または孔密度のシリコン粒子を製造することを可能にすることができる。
【０１９９】
さらに、血漿タンパク質吸着、ＲＥＳ取り込みを低減するため、および薬剤送達システムとして粒子の循環時間を増加させるために、シリコン粒子表面にＰＥＧを結合させること^４２（投稿準備中）のような、粒子を化学的に修飾するためのプロトコルを開発した。治療上重要なリガンド、例えば、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）および上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）などに向けられた特定の抗体へのシリコン粒子の結合の成功により、実施例１で上述したように、初代ＨＵＶＥＣのｉｎ−ｖｉｔｒｏ細胞培養モデルを使用して、その標的化および選択的細胞毒性が評価された。
【０２００】
本研究は、ナノ多孔質シリコン粒子に、異なる性質、サイズおよび形状の第２段階ナノ粒子を効率的に装填する能力の証拠を提供する。装填プロセスは、ナノ粒子濃度を調節する、かつ／または第１および第２段階粒子のいずれかもしくは両方の化学的表面性質を利用することによって制御することができる。本研究において、ナノ粒子放出のダイナミクス、およびナノ多孔質シリコン粒子の、多種類のナノ粒子で同時に装填される能力を示した。これらの研究により、第２段階粒子として使用したＱ−ドットおよびＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴが、第２段階粒子のサイズおよび化学的性質によって、第１段階シリコンナノ多孔質粒子担体の異なる区画に局在化することができることが明白に実証された。さらに、装填および放出プロセスに関与する重要な機構および原動力を特定し、分類した。シリコン粒子の孔と第２段階粒子との相対的サイズは一緒に、最も成功する構成の第１および第２段階粒子の組合せを決定することができる（図２５のパネルＡ）。第２段階ナノベクターの濃度は、装填プロセスの効率に影響し、このプロセスは、シリコン粒子のナノ孔中への、第２段階粒子の受動拡散および毛管対流の両方によって制御することができる。第２段階ナノベクターの、シリコン粒子のナノ孔との流体力学的相互作用およびブラウン運動は、集合システムの安定性および第２段階粒子が第１段階シリコン粒子のナノ孔内部に装填されたままでいる時間に影響する（図２５のパネルＢ）。最後に、考慮することのできる第３の機構は、第１段階シリコン粒子担体と第２段階ナノベクターの間の静電気的相互作用である（図２５のパネルＣ）。総合すると、これらの特徴のそれぞれは、第１段階ナノ多孔質シリコン粒子中に装填することのできる第２段階ナノベクターの量の精密な調整を可能にすることができ、これは、薬剤送達の将来用途における特定の薬理学的要求に適合することができる。
【０２０１】
多段階ナノ担体システムの本来の性質および独特の性質により、腫瘍を同時に検出し、次いで破壊するため、または他の病理学的状態を画像化し、次いで治療するために、多数の治療剤、透過エンハンサーまたは造影コントラスト剤を送達することが可能になり得る。
【０２０２】
方法
多孔質シリコン粒子の製造
０．００５オームｃｍ−１の抵抗率を有する、高濃度ドープｐ^＋＋タイプＳｉ（１００）ウェハー（Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｑｕｅｓｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を、基材として使用した。低圧化学気相堆積（ＬＰＣＶＤ）システムによって、２００ｎｍの窒化ケイ素層を堆積させた。標準的なフォトリソグラフィーを使用することによって、接触式アライナー（ＥＶＧ ６２０アライナー）を使用してパターン形成した。小径（１００〜５００ｎｍ）のシリコン粒子を、フラッシュインプリントリソグラフィーによって得た。次いで、反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）によって、窒化物を選択的に除去した。フォトレジストは、ピラニア（Ｈ_２ＳＯ_４：Ｈ_２Ｏ_２＝３：１（ｖ／ｖ））で除去した。次いでウェハーを自作のテフロン（登録商標）セル中に置き、電気化学エッチングを行った。粗孔（ＬＰ）を有するシリコン粒子は、フッ化水素酸（４９％のＨＦ）とエタノールの混合物（３：７ｖ／ｖ）中で、８０ｍＡｃｍ^−２の電流密度を２５秒間印加することによって形成した。高多孔性層は、３２０ｍＡｃｍ^−２の電流密度を６秒間印加することによって形成した。細孔（ＳＰ）を有するシリコン粒子の製造については、ＨＦとエタノールの溶液を１：１（ｖ／ｖ）の比で使用し、６ｍＡｃｍ^−２の電流密度を１．７５分間印加した。高多孔性層は、（２：５ｖ／ｖ）の比を有するＨＦ：エタノール混合物中で、３２０ｍＡｃｍ^−２の電流密度を６秒間印加することによって形成した。ＨＦによって窒化物層を除去した後、イソプロプルアルコール（ＩＰＡ）中、１分間の超音波によって粒子を放出した。多孔質シリコン粒子を含有するＩＰＡ溶液を収集し、４℃で保管した。
【０２０３】
ＢＥＴ測定
７７Ｋで得られる、窒素吸着脱着体積等温線（volumetric isotherm）を、Ｑｕａｎｔａｃｈｒｏｍｅ Ａｕｔｏｓｏｒｂ−３ｂ ＢＥＴ表面分析装置で測定した。試料を、真空中、１５０℃で一晩ベーキングした。粒子表面積は、０．０５から１のＰ／Ｐ０の圧力範囲で、ＢＥＴ線形化によって得た。ＬＰ粒子については、窒素吸着−脱着等温線測定を使用して、ＢＥＴ表面積は１５６ｍ^２ｇ^−１であり、孔体積は０．５４ｃｍ^３ｇ^−１であった。平均孔径は、約２４．２ｎｍであると推定した。ＳＰ粒子については、ＢＥＴ表面積は２９４ｍ^２ｇ^−１と測定し、孔体積は０．３８ｃｍ^３ｇ^−１であり、平均孔径は、７．４ｎｍであった。
【０２０４】
溶液中の粒径および濃度の分析
粒子を、５０μｍの開口部サイズを用いて、Ｚ２ Ｃｏｕｌｔｅｒ（登録商標）粒子計数器およびサイズ分析器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用してカウントした。分析のためのサイズの上限および下限を１．８および３．６μｍに設定した。分析のために、粒子を、平衡電解質溶液（ＩＳＯＴＯＮ（登録商標）ＩＩ Ｄｉｌｕｅｎｔ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）中に懸濁させ、カウントした。粒子の最初の懸濁液の全体積は、最終分析体積の０．３％を超えなかった。この粒子計数器は、溶液中の粒子の濃度ならびに粒径分布の分析結果を表示する。
【０２０５】
シリコンマイクロ粒子の酸化
ＩＰＡ中のシリコンマイクロ粒子を、ガラスビーカー中で加熱する（８０〜９０℃）ことによって乾燥させ、次いでこれらをピラニア溶液（１：２のＨ_２Ｏ_２：濃Ｈ_２ＳＯ_４（ｖ／ｖ））中で酸化させた。この粒子をＨ_２Ｏ_２（３０％）の溶液に加え、５５１０Ｒ−ＭＴ超音波洗浄器（ＢＲＡＮＳＯＮＩＣ、Ｄａｎｂｕｒｙ、ＣＴ、ＵＳＡ）で３０秒間超音波処理し、次いでＨ_２ＳＯ_４（９５〜９８％）を加え、この懸濁液を断続的に超音波処理して粒子を分散させながら、１００〜１１０℃に２時間加熱した。次いでこの粒子を脱イオン（ＤＩ）水で洗浄した。ＤＩ水中での粒子の洗浄は、粒子懸濁液の４，２００ｒｐｍでの５分間の遠心、その後の上澄みの除去およびＤＩ水中での粒子の再懸濁を伴う。酸化シリコン粒子は、その後に使用するまで４℃でＤＩ水中に保管した。
【０２０６】
３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）でのシリコン粒子の表面修飾
シラン化の前に、酸化シリコン粒子を、１．５ＭのＨＮＯ_３中で約１．５時間ヒドロキシル化した。次いでこの粒子をＤＩ水で３〜５回洗浄し、その後にＩＰＡで２回洗浄した。次いでこのシリコン粒子を、０．５％（ｖ／ｖ）のＡＰＴＥＳを含有するＩＰＡ中、室温で４５分間懸濁させた。次いで粒子をＩＰＡで洗浄し（４，２００ｇで５分間、５回）、４℃でＩＰＡ中に保管した。
【０２０７】
Ｑ−ドットおよび水蛍光標識水溶性ＳＷＮＴ
Ｑ−ドットは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した。本研究では、５２５ｎｍおよび５６５ｎｍの発光波長を有するアミノ−ＰＥＧ（それぞれ、カタログ番号Ｑ２１５４１ＭＰおよびＱ２１５３１ＭＰ）および５２５ｎｍおよび５６５ｎｍの発光波長を有するカルボキシルＱ−ドット（それぞれ、カタログ番号Ｑ２１３４１ＭＰおよびＱ２１３３１ＭＰ）を使用した。大幅に側壁をカルボキシル化した（heavily sidewall carboxylated）超短（ＵＳ）−ＳＷＮＴ４３を作製するために、丸底フラスコ中、窒素下で、精製したＨｉＰｃｏ ＳＷＮＴ（０．１００ｇ）に発煙硝酸（ＳＯ_３を含まない２０％、２５ｍＬ）を加え、この混合物を一晩撹拌することによって、ＳＷＮＴを分散させた（ＨｉＰｃｏ ＳＷＮＴは、Ｒｉｃｅ大学のＨｉＰｃｏ研究室から得た）。精製するために、確立された手順を続けた^４４。別個のフラスコ中で、濃硝酸（１８ｍＬ）に発煙硝酸（ＳＯ_３を含まない２０％、２５ｍＬ）を徐々に加えた。この混合物をＳＷＮＴに直ちに加え、このＳＷＮＴを６０℃に２時間加熱した。次いで、この溶液を氷上に徐々に注ぎ、０．２２μｍのポリカーボネート膜によって濾過した。濾過ケーキを水で徹底的に洗浄した。真空を解除し、このケーキを最小量のメタノール中に溶解させ、その後、エーテルを加えてＵＳ−ＳＷＮＴを凝集させ、再度真空にした。洗液が中性のｐＨに達するまで、エーテルを連続的に加えた。ＵＳ−ＳＷＮＴのケーキを真空下で乾燥させた。ＰＥＧ化ＳＷＮＴを得るために、丸底フラスコ中で３０分間、超音波処理（浴またはカップホーン、およびモデル）を使用して、無水ＤＭＦ（３０ｍＬ）中にＵＳ−ＳＷＮＴ（０．０３４ｇ、３．１ｍｅｑＣ）を分散させた。これに、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（０．３２ｇ、１．５ｍｍｏｌ）、および５，２００ＭＷのヒドロキシエチルフタルイミド末端ＰＥＧ（０．３２ｇ）を加え、この混合物を窒素下で２４時間撹拌した。この溶液を透析袋（ＣｅｌｌｕＳｅｐ Ｈ１、５０，０００ＭＷＣＯ、品番：１−５０５０−３４、Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）に５日（５ｄ）間移し、生成物をグラスウールを通して濾過することによって、透析袋中で形成した任意の粒子を取り出した。透析袋の内容物からフタルイミド部分を除去すると、ＰＥＧ−末端アミン（Ｈ_２Ｈ−ＰＥＧ−ＵＳ−ＳＷＮＴ）が露呈した。ヒドラジン一水和物（１０ｍＬ）を加え、この溶液を窒素下で１２時間加熱還流することによって、ＰＥＧ化ＵＳ−ＳＷＮＴの末端上に末端一級アミンを得た。生成物は、ＤＩ水中で５日間透析によって精製した。次いで、この溶液をホイルで包んだ丸底フラスコに移し、少量のＤＭＦ中に予め溶解させたＦＩＴＣ（０．１２ｇ）をＨ_２Ｈ−ＰＥＧ−ＵＳ−ＳＷＮＴ溶液に加えた。反応物を室温で１２時間撹拌した。この溶液を透析袋に移し、暗所で５日間、ＤＩ水を用いて連続透析を続け、その後にグラスウールを通して濾過することによって、溶解しなかった粒子を除去した。最終生成物のＦＩＴＣ−ＰＥＧ−ＵＳ−ＳＷＮＴは、共有結合的に結合する代わりにＰＥＧ−ＵＳ−ＳＷＮＴに物理吸着したいくらかのＦＩＴＣを含んでいた。物理吸着したＦＩＴＣの大部分は、水中で数ヶ月透析した後も、依然としてＳＷＮＴと会合したままであった。
【０２０８】
シリコン粒子、Ｑ−ドット、およびＳＷＮＴのζ電位の測定
シリコン粒子、Ｑ−ドット、およびＦＩＴＣ−ＰＥＧ−ＵＳ−ＳＷＮＴのζ電位は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．、Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して分析した。分析のために、粒子を２０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ−ＨＣＬ）緩衝液（ＰＨ約７．３）中に懸濁させた。
【０２０９】
第１段階シリコン粒子中へのＱ−ドットおよびＳＷＮＴの装填
多段階ナノデバイスの開発に使用したシリコンナノ多孔質粒子には、ＬＰ酸化多孔質シリコン、ＳＰ酸化多孔質シリコン、ならびにＡＰＴＥＳ修飾ＬＰおよびＳＰ粒子が含まれる。第２段階粒子には、アミノ−ＰＥＧ Ｑ−ドット、カルボキシルＱ−ドット、およびＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴが含まれる。最初の実験は、第１段階シリコン粒子中への第２段階粒子の装填量を滴定するために実施した。滴定実験の各実験点については、３．０×１０５個のシリコン粒子を使用し、これは、３μｌのＤＩ水を含む低結合性ポリプロピレンマイクロ遠心管（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ、ＵＳＡ）中で再懸濁させた。実験毎に、所与のモル濃度のＴＲＩＳ−ＨＣｌ溶液を、ｐＨ７．３に調整した。２μＭのＱ−ドット（５μｌ）または２０ｎｇ／μｌのＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴ（９μｌ）のいずれかを、ＴＲＩＳ−ＨＣｌ溶液に加え、装填実験のための最終体積として２０μｌを用いた。試料は、回転ホイール（２０ｒｐｍ）上に、２５℃で１５分間置くことによってインキュベートした。インキュベーション後、試料を２０ｍＭ、ｐＨ７．３のＴＲＩＳ−ＨＣｌで希釈して１５０μの体積にし、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）フローサイトメーターを使用して、蛍光強度について即座に検査した。Ｑ−ドットおよびＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴの、シリコン粒子中への濃度依存的装填を評価するために、０．０１、０．１、１、１０、１００、１，０００および２，０００ｎＭのＱ−ドット、または０．０５、０，１、２．５、１０および２０ｎｇ／μｌのＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴのいずれかとともに、３．０×１０５個のシリコン粒子、ならびに１５分のインキュベーション時間を使用した。時間依存装填を評価するために、１５、３０、４５および６０分のインキュベーション時間で、３．０×１０５個の第１段階粒子、２，０００ｎＭのＱ−ドットまたは２０ｎｇ／μｌのＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴを使用した。シリコン粒子のＱ−ドットおよびＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴの両方での装填を評価するために、３．０×１０５個のシリコン粒子、１，０００ｎＭのＱ−ドット、および１０ｎｇ／μｌのＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴを、インキュベーションの同じ最終体積で使用した。
【０２１０】
第１段階シリコン粒子からのＱ−ドットおよびＳＷＮＴの放出の研究
酸化またはＡＰＴＥＳ修飾したＬＰシリコン粒子（２．１×１０６）を、２００ｍＭ、ｐＨ７．３のＴＲＩＳ−ＨＣｌ溶液中で、２μＭのアミノ−ＰＥＧ Ｑ−ドットもしくはカルボキシルＱ−ドット、または２０ｍＭ、ｐＨ７．３のＴＲＩＳ−ＨＣｌ溶液中で２０ｎｇ／μｌのＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴ、または５０ｍＭ、ｐＨ７．３のＴＲＩＳ−ＨＣｌ溶液中で１μＭのＱ−ドットおよび１０ｎｇ／μｌのＰＥＧ−ＦＩＴＣ−ＳＷＮＴの両方と混合した。すべての研究について、最終インキュベーション体積は１４０μｌであった。第１段階シリコン粒子担体および第２段階粒子の試料は、回転ホイール（２０ｒｐｍ）を使用して、２５℃で１５分間インキュベートした。次いで、第１段階シリコン粒子および第２段階粒子を含有する溶液を、１．４ｍＬのＤＩ Ｈ_２Ｏ中で洗浄し、次いで、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ−２２遠心機中、４，２００ｒｐｍで５分間遠心した。次いで、遠心後に存在するペレットを、７０μｌのＤＩ Ｈ_２Ｏ中で再懸濁させ、各バイアルから１０μｌを取り出すことによって、フローサイトメトリーを使用して試料の蛍光を評価した。蛍光は、時間０、次いで６つの時点にわたって記録し、この時点は、３０、６０、９０、１８０、３６０、および１，２００分を含んでいた。各バイアル中に残った、残りの６０μｌは、２０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ ０．９％ ＮａＣｌ放出緩衝液で３ｍｌに希釈し、その後に回転ホイール（２０ｒｐｍ）を使用して、３７℃で所定量の時間（３０、６０、９０、１８０、３６０、および１，２００分）インキュベートした。各時点で、試料を４，２００ｒｐｍで５分間遠心し、フローサイトメトリーを使用して蛍光を評価した。
【０２１１】
フローサイトメトリーのセットアップ
ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して、粒子を蛍光について評価した。対数の側方散乱（ＳＳＣ）対対数の前方散乱（ＦＳＣ）を定義する２変数ドットプロットを使用することによって、シリコン粒子のサイズおよび形状（直径３μｍ、高さ１．５μｍ）を評価し、分析から非特異的事象を除外した。対照のレインボーＢＤ Ｃａｌｉｂｒｉｔｅ（商標）ビーズ（サイズ３．５μｍ）を使用することによって、装置を較正した。サイトメーターの信号対雑音比の限界に近すぎる事象を除外し、対象の主要集団の中心付近の電子的ゲートとして多角形領域（Ｒ１）を画定した。各試料について、Ｒ１領域内で検出された粒子の数は９０％超であった。幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）の分析のためにドットプロットを作成し、蛍光チャネル１（ＦＬ１）とＦＬ２対対数のＦＳＣを、Ｒ１として画定されるゲート領域内に入る事象の分析結果と比較した。試料のそれぞれにおいて同定されたピークは、対応する蛍光ヒストグラムおよび記録される幾何平均値で分析した。粒子の検出については、使用した検出器は、ＦＳＣ Ｅ−１、および４７４ボルト（Ｖ）の電圧設定のＳＳＣであった。蛍光検出器ＦＬ１は、８００Ｖに設定した。緑色蛍光（ＦＩＴＣおよびＱ−ドット５２５）は、５３０／３０ｎｍバンドパスフィルターを使用して、ＦＬ１を用いて検出した。赤色蛍光（Ｑ−ドット５６５）は、ＦＬ２を使用して検出した。単一色検出のみを分析したとき、色補正はゼロに設定し、赤色−緑色の２色検出を実施したとき、ＦＬ１補正はＦＬ２の２５％に設定し、ＦＬ２補正はＦＬ１の３５％に設定した。装置較正は、データ取得のための各一連の実験の前、間、および後にＢＤ ＣａｌｉｂｒｉｔｅＴＭビーズを使用して実施した。
【０２１２】
走査電子顕微鏡観察
シリカ粒子の形態を、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ，モデルＬＥＯ１５３０）を使用して取得した。粒子は、ＳＥＭ試料ステージ上に直接置き、乾燥させた。高塩濃度緩衝液中で試験する粒子については、ＤＩ水中で穏やかに洗浄するステップを実施した後、ステージ上に置いた。加速電圧は１０ｋＶであった。
【０２１３】
タッピングモード原子間力顕微鏡観察（ＡＦＭ）
ＡＦＭ試料を、新たに劈開した雲母表面上にＤＭＦから堆積させることによって調製した。試料をスピンコートし、断面分析を使用することによって、各試料の高さを求めた。ＡＦＭ試料は、タッピングモードを使用して得た。
【０２１４】
明視野顕微鏡観察
粒子を、４０倍の拡大レンズを有するＯｌｙｍｐｕｓ ＣＫＸ４Ｉ顕微鏡を用いて、明視野コントラストで分析した。ＳＰ−３５０ Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｔｒｕｅ−Ｐｉｃ ＴＵＲＢＯ画像プロセッサーカメラで画像を撮影した。
【０２１５】
蛍光顕微鏡観察
粒子の蛍光画像法は、−３０．１℃に維持したＤＱＣ−ＦＳ Ｎｉｋｏｎ ＣＣＤカメラを有するＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ２０００−Ｅで実施した。すべての試料を分析の直前に設置し、画像を６３倍の油浸対物レンズで得た。すべての実験全体を通して顕微鏡の設定を一定に維持した。開口数を１．４、屈折率を１．５１５、露光時間を５００ｍｓ、読み出し速度を１０ＭＨｚ、変換利得を１／６倍に設定した。
【０２１６】
ＮＩＳ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ＡＲ ２．３ソフトウェアを用いて画像を解析し、測定した。
【０２１７】
共焦点顕微鏡観察
粒子の共焦点画像法は、ＬＥＩＣＡ ＤＭ６０００顕微鏡で実施した。すべての試料を分析の直前に設置し、１．４の開口数および１．５２の屈折率にて、ＨＣＸ ＰＬ ＡＰＯ ＣＳ ６３倍の油浸対物レンズを用いて画像を得た。すべての取得について、ピンホールを９５．６μｍ（１エアリー単位（Airy Unit））に設定し、４８８ｎｍアルゴンおよび５６１ｎｍレーザーの両方は、その最大出力の１５％であり、走査速度を４００Ｈｚに設定した。単一の緑色蛍光画像化用光電子増倍管（green fluorescence imaging photomultiplier）の電圧を７５０Ｖに設定した。２色の画像化のために、赤色チャネル用のＰＭＴを６００Ｖに設定し、一方、緑色チャネル用のＰＭＴを１０００Ｖに設定した。画像品質を改善するために、取得の間、２フレーム蓄積、２ライン蓄積および４フレーム平均を実施した。最終的なボクセルの幅および高さは１９．８ｎｍであった。画像をデジタル処理で拡大し（１０倍）、ＬＡＳ ＡＦ １．６．２ソフトウェアを使用しての後処理の間、中央値調整（３ピクセル、２ラウンド）を使用した。
【実施例３】
【０２１８】
３．５ミクロンのシリコン粒子中のリポソーム
蛍光標識ｓｉＲＮＡ装填１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（phosphaticholine）（ＤＯＰＣ）リポソームを、Ｃ．Ｎ．Ｌａｎｄｅｎ Ｊｒ．ら Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００５、６５（１５）、６９１０〜６９１８、およびＪ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００６；１２（１６）、４９１６〜４９２４に詳述されているように調製した。
【０２１９】
第２段階粒子としての蛍光標識ｓｉＲＮＡ装填ＤＯＰＣリポソーム（最初のｓｉＲＮＡ濃度：１００ｎｇ／μｌ）を、第１段階粗孔「ＬＰ」酸化シリコン粒子（３．５ミクロン）と混合した。２０ｍＭ、ｐＨ７．３のＴｒｉｓ中、室温で３０分間、インキュベーションを実施した。この溶液を室温で１分間、４，２００ｒｐｍで遠心沈殿させた。上澄みを回収し、試料の蛍光を５４４ｎｍ／５９０ｎｍ（励起／発光）の設定を使用して蛍光定量法によって測定した。蛍光リポソームを取り込んだ第１段階粒子を含む粒子ペレットを、１００μｌの脱イオン水中で再懸濁させ、蛍光定量法の読みを取得した。３．５ミクロンのＬＰおよびＳＰ粒子中への、蛍光標識ｓｉＲＮＡ装填ＤＯＰＣリポソームの装填時間ダイナミクスを、図８ＢのパネルＤに示す。図８Ｂにおいて、パネルＥおよびＦは、３．５ミクロンのナノ多孔質シリコン第１段階粒子のＬＰ中の、Ａｌｅｘａ５５５標識ＳｉＲＮＡを含有する第２段階リポソームを、それぞれ白地と赤地で可視化している蛍光顕微鏡像を示す。
【０２２０】
Ａｌｅｘａ５５５蛍光標識ｓｉＲＮＡを、リポソーム中に被包し、第１段階多孔質シリコン粒子中に装填した。図２６のパネルＡ中のデータは、多孔質シリコン担体に関連する蛍光が、ナノリポソームの量とともに増加したことを示す。
【０２２１】
第１段階粒子からのリポソームの放出を試験するために、集合多段階システムを、１０％のウシ胎児血清（ｐＨ７．４）でインキュベートし、第１段階粒子からのナノリポソームの放出を、蛍光定量法を使用して時間とともに追跡した。完全な除去は、約３６時間で達成された。図２６のパネルＢを参照されたい。
【実施例４】
【０２２２】
シリコン粒子中のリポソーム
リポソームの調製：
それぞれ５８：４０：２（Ｍｏｌ％）のＤＰＰＣ：コレステロール：ＤＳＰＥ−メトキシＰＥＧ（２０００）の脂質組成を有するリポソームは、以下のような押出し法によって作製することができる。簡潔に、脂質は、５５ｏＣのエタノール中に溶解させることができる。次いで、溶解した脂質は、３００ｍＭの硫酸アンモニウム溶液で水和させることによって（１５〜３０分間）、ドキソルビシンの活発な装填を促進することができる。Ｌｉら Ｂｉｏｃｈｉｍ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １４１５（１９９８）を参照されたい。リポソームは、一連の漸減孔径のＮｕｃｌｅｐｏｒｅトラックエッチポリカーボネート膜を通して押出すことができる。次いでこのリポソームは、０．２μｍの膜を通して５回押出すことができる。これは、その後に、０．１μｍの膜（５回）、次いで０．０５μｍの膜（５回）を通して押出すことができる。最後の押出しは、０．０３μｍの膜（１０回）を通すものとすることができる。この押出しは、５５ｏＣで実施することができる。
【０２２３】
作製した蛍光標識リポソームは、３０％のジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）脂質、３０％のコレステロール、３０％の１，２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）（陽イオン性リポソーム用）、または３０％のジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）（陰イオン性リポソーム用）、または３０％のジオレオイルホスファチジルコリン ＤＯＰＣ（中性リポソーム用）のいずれかと混合した、１０％の蛍光標識脂質である、Ｎ−［７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル］ジパルミトイル−Ｌ−α−ホスファチジルエタノールアミン（ＮＢＤ−ＰＥ）脂質を含んでいた。
【０２２４】
中性リポソームは、動的光散乱（ＤＬＳ）によって求めた場合、初期平均径が４７．４ｎｍであり、３日後の平均径が７８．２ｎｍであった。中性リポソームのζ電位は、−１３．０４±０．７７ｍＶであった。
【０２２５】
陽イオン性リポソームは、ＤＬＳによって求めた場合、初期平均径が４９．６ｎｍであり、３日後の平均径が５８．２ｎｍであった。陽イオン性リポソームのζ電位は、３０．３０±２．５５ｍＶであった。
【０２２６】
中性および陽イオン性リポソームを、１ミクロンの「粗孔」（ＬＰ）酸化ナノ多孔質シリコン粒子および１ミクロンの「粗孔」（ＸＬＰ）酸化およびＡＰＴＥＳ修飾シリコン粒子中に装填した。図８ＡのパネルＡは、１ミクロンのＸＬＰ ＡＰＴＥＳ修飾シリコン粒子中に装填した、中性（左）および陽イオン性（右）蛍光標識リポソームの共焦点顕微鏡像を示す。図８ＡのパネルＢは、１ミクロンのＸＬＰ 酸化およびＡＰＴＥＳ修飾シリコン粒子、ならびに１ミクロンのＬＰ酸化粒子中に装填した、中性および陽イオン性蛍光標識リポソームについてのＦＡＣＳ分析を示す。図８ＡのパネルＣは、蛍光標識リポソーム装填のＥｘｃｅｌ定量化を示す。
【０２２７】
活性剤としてのドキソルビシンの装填：
リポソームを１５０ｍＭのＮａＣｌに対して一晩透析することによって、被包されなかった硫酸アンモニウムを除去して、膜を横切る(trans-membrane)プロトン勾配を生じることができる。ドキソルビシン（約１０ｍｇ／ｍｌ）を、このリポソームに６０℃で１時間加えることができる。薬剤：脂質の比は０．２：１．０となり、最終脂質濃度は約２５ｍＭとなる。得られるリポソーム製剤は、氷上で１５分間維持することによって、間接的な装填プロセスを停止することができる。このリポソームを１５０ｍＭのＮａＣｌに対して一晩透析することによって、被包されなかったドキソルビシンを除去することができる。最終の被包されたドキソルビシンの濃度は、メタノール（最終体積の３０％）で溶解し、４８０ｎｍでＵＶ吸光度を測定することによって求めることができる。
【０２２８】
参考文献
以下の参考文献を前述の本文に引用する。
【化１】

【化２】

【化３】

【化４】

【０２２９】
前述は、特定の好ましい実施形態を参照するが、本発明はそのように限定されないことが理解されよう。開示した実施形態に対して様々な改変を行うことができ、そのような改変は、本発明の範囲内であることが意図されることを、本開示に照らして当業者は考えつくであろう。本明細書に引用した、すべての刊行物、特許出願および特許は、これらが、本開示と一致し、本開示に補足的な詳細および説明を提供する程度に、参照により本明細書に組み込まれている。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロ粒子またはナノ粒子であり、（ｉ）本体、（ｉｉ）少なくとも１つの表面、および（ｉｉｉ）前記本体内部に少なくとも１つの貯蔵部を有する少なくとも１種の第１段階粒子であって、前記貯蔵部が、少なくとも１種の活性剤を含む少なくとも１種の第２段階粒子を含有する第１段階粒子
を含む組成物。
【請求項２】
前記第１段階粒子が選択された非球形状を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記第１段階粒子の前記本体が生体適合性材料を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記第１段階粒子の前記本体が生分解性材料を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記第１段階粒子の前記本体が、シリコン、無機酸化物材料、ポリマー酸化物材料、またはセラミック材料を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記第１段階粒子の前記本体が、多孔質またはナノ多孔質材料を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記多孔質またはナノ多孔質材料がナノ多孔質シリコンである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記多孔質またはナノ多孔質材料がナノ多孔質酸化物材料である、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記ナノ多孔質酸化物材料が、ナノ多孔質二酸化ケイ素、ナノ多孔質酸化アルミニウム、ナノ多孔質酸化チタン、ナノ多孔質酸化鉄またはその組合せである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記第１段階粒子の前記本体が、第１多孔質領域と、孔密度、孔形状、孔電荷、孔表面の化学的性質および孔配向からなる性質の群から選択される少なくとも１つの性質において前記第１多孔質領域と異なる第２多孔質領域とを含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項１１】
前記第１多孔質領域が、第１集団の第２段階粒子を含有するように構成されており、前記第２多孔質領域が、第２集団の第２段階粒子を含有するように構成されている、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記第１段階粒子の前記本体が、第１集団の第２段階粒子を含有する第１領域と、第２集団の第２段階粒子を含有する第２領域とを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記第１および第２領域が化学組成物を含み、前記第１領域の化学組成物が、前記第２領域の化学組成物と同じである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記第１集団が第１の活性剤を含有し、前記第２集団が、前記第１の活性剤と異なる第２の活性剤を含有する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記第１および第２集団が特有の放出時間を有し、前記第１領域からの前記第１集団の特有の放出時間が、前記第２領域からの前記第２集団の特有の放出時間と異なる、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１６】
前記第１領域および前記第２領域のうちの少なくとも１つが生分解性領域である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１７】
前記第１段階粒子が、生理的媒質に暴露されるとき、前記第１領域を含む第１の成分と前記第２領域を含む第２の成分とに分離するように構成されている、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１８】
前記第１領域が、第１の生物学的バリアーを迂回するように構成されており、前記第２領域が、前記第１の生物学的バリアーと異なる、第２の生物学的バリアーを迂回するように構成されている、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１９】
前記第１の生物学的バリアーおよび前記第２の生物学的バリアーが、それぞれ独立して、ヘモレオロジーバリアー、細網内皮系バリアー、内皮バリアー、血液脳関門、腫瘍関連浸透圧性間質圧バリアー、イオンおよび分子ポンプバリアー、細胞膜バリアー、酵素分解バリアー、核膜バリアー、およびその任意の組合せからなる生物学的バリアーの群から選択される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記第１段階粒子が、ヘモレオロジーバリアー、細網内皮系バリアー、内皮バリアー、血液脳関門、腫瘍関連浸透圧性間質圧バリアー、イオンおよび分子ポンプバリアー、細胞膜バリアー、酵素分解バリアー、核膜バリアーまたはその組合せから選択される生物学的バリアーを迂回するように構成されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
前記第１段階粒子が、（ｉｖ）前記貯蔵部と前記表面を接続している、少なくとも１つのチャネルを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
前記貯蔵部が前記表面に接続されたチャネルを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記第１段階粒子が少なくとも１つの標的化部分を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記少なくとも１つの標的化部分が、化学的標的化部分、物理的標的化部分、幾何学的標的化部分およびその任意の組合せからなる群から選択される、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記少なくとも１つの標的化部分が、前記第１段階粒子の前記本体のサイズ、前記第１段階粒子の前記本体の形状、前記第１段階粒子の前記表面上の電荷、前記第１段階粒子の化学的修飾およびその任意の組合せからなる群から選択される、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
前記少なくとも１つの標的化部分が前記第１段階粒子の前記表面上に配置された化学的標的化部分を含み、前記化学的標的化部分がデンドリマー、アプタマー、抗体、生体分子およびその任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの部分を含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２７】
前記少なくとも１つの貯蔵部が少なくとも１種の追加の作用剤を含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項２８】
前記少なくとも１種の追加の作用剤が、少なくとも１種の透過エンハンサー、少なくとも１種の追加の活性剤および少なくとも１つの標的化部分を含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記少なくとも１種の透過エンハンサーが、基底膜透過エンハンサー、タイトジャンクションタンパク質（ｔｊｐ）透過エンハンサーおよびその任意の組合せからなる群から選択される、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３０】
前記第１段階粒子が外部刺激に応答して前記少なくとも１種の第２段階粒子を放出するように構成されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項３１】
前記第１段階粒子が前記第１段階粒子の環境の変化に応答して前記少なくとも１種の第２段階粒子を放出するように構成されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項３２】
前記少なくとも１種の第２段階粒子が、リポソーム、ミセル、エソソーム、カーボンナノチューブ、フラーレンナノ粒子、金属ナノ粒子、半導体ナノ粒子、ポリマーナノ粒子、酸化物ナノ粒子、ウイルス粒子、ポリイオン粒子およびセラミック粒子からなる群から選択される少なくとも１つの成分を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記第２段階粒子が、前記活性剤を含む少なくとも１種の第３段階粒子を含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３４】
前記第２段階粒子が前記活性剤を含む本体を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３５】
前記第２段階粒子が本体および前記本体内部に貯蔵部を有し、前記第２段階粒子の前記貯蔵部が前記活性剤を含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３６】
前記活性剤が、治療剤または造影剤またはその組合せを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３７】
複数の第１段階粒子および担体を含み、前記複数の第１段階粒子が懸濁されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項３８】
マイクロ粒子またはナノ粒子であり、（ｉ）本体、（ｉｉ）少なくとも１つの表面、（ｉｉｉ）前記本体内部に少なくとも１つの貯蔵部を有する少なくとも１種の第１段階粒子であって、前記貯蔵部が、少なくとも１種の活性剤を含む少なくとも１種の第２段階粒子を含有する第１段階粒子
を含む組成物を対象に投与するステップ
を含む方法。
【請求項３９】
前記第１段階粒子が、前記対象の身体中の第１標的部位に局在化するように構成されている、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記第１標的部位が血管新生の脈管構造または再正常化された脈管構造または組み込まれた脈管構造である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記第２段階粒子が前記対象の身体中の第２標的部位に前記活性剤を送達するように構成されている、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記第２標的部位が細胞である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞が癌細胞である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記癌細胞が幹細胞またはクローン化可能細胞である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記第２標的部位が異質化した病変部を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記第２標的部位が細胞の核である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
前記第２段階粒子が、前記活性剤を含有する少なくとも１種の第３段階粒子を含有する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４８】
前記第１段階粒子が、ヘモレオロジーバリアー、細網内皮系バリアー、内皮バリアー、血液脳関門、腫瘍関連浸透圧性間質圧バリアー、イオンおよび分子ポンプバリアー、細胞膜バリアー、酵素分解バリアー、および核膜バリアー、およびその組合せからなる群から選択される生物学的バリアーを迂回するように構成されている、請求項３８に記載の方法。
【請求項４９】
前記第１段階粒子が多孔質またはナノ多孔質材料を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項５０】
前記多孔質またはナノ多孔質材料がナノ多孔質シリコンまたはナノ多孔質酸化物材料である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記第１段階粒子の前記本体が、第１多孔質領域と、孔密度、孔形状、孔電荷、孔表面の化学的性質および孔配向からなる群から選択される少なくとも１つの性質において前記第１多孔質領域と異なる第２多孔質領域とを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記第１段階粒子の前記本体が、第１集団の第２段階粒子を含有する第１領域と、第２集団の第２段階粒子を含有する第２領域とを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項５３】
前記第１集団の第２段階粒子が第１の活性剤を含有し、前記第２集団の第２段階粒子が、前記第１の活性剤と異なる第２の活性剤を含有する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記第１および第２集団が特有の放出時間を有し、前記第１領域からの前記第１集団の特有の放出時間が、前記第２領域からの前記第２集団の特有の放出時間と異なる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記第１段階粒子が、前記対象に投与されるとき、前記第１領域を含む第１の成分と前記第２領域を含む第２の成分とに分離するように構成されている、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
前記第１領域が第１の生物学的バリアーを迂回するように構成されており、前記第２領域が前記第１の生物学的バリアーと異なる、第２の生物学的バリアーを迂回するように構成されている、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
前記少なくとも１つの貯蔵部が少なくとも１種の透過エンハンサーを含有する、請求項３８に記載の方法。
【請求項５８】
前記対象を外部刺激に暴露することによって前記第１段階粒子から前記少なくとも１種の第２段階粒子を放出するステップをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項５９】
前記外部刺激が、機械的活性化、照射活性化または磁気活性化のうちの少なくとも１つである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記少なくとも１種の第２段階粒子が、リポソーム、ミセル、エソソーム、カーボンナノチューブ、フラーレンナノ粒子、金属ナノ粒子、半導体ナノ粒子、ポリマーナノ粒子、酸化物ナノ粒子、ウイルス粒子、ポリイオン粒子およびセラミック粒子からなる群から選択される少なくとも１つの成分を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項６１】
前記活性剤が、治療剤、造影剤またはその組合せを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項６２】
前記組成物が複数の第１段階粒子を含む懸濁液である、請求項３８に記載の方法。
【請求項６３】
前記第１段階粒子の前記本体が第１の活性剤を含有し、前記第２段階粒子が前記第１の活性剤と異なる第２の活性剤を含有する、請求項３８に記載の方法。
【請求項６４】
前記第１段階粒子が、前記対象の身体中で自由に循環するための前記第２段階粒子を放出するように構成されている、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記投与するステップが前記組成物を血管内に注射するステップを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項６６】
前記第１段階粒子が約７００ｎｍから約３ミクロンの特有の寸法を有する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記投与するステップが前記組成物を皮下に注射するステップを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項６８】
前記投与するステップが経口的に実施される、請求項３８に記載の方法。
【請求項６９】
前記投与するステップが前記組成物を吸入するステップを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項７０】
前記第１粒子が約５ミクロンから約２０ミクロンの特有の寸法を有する、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
多段階送達組成物を作製する方法であって、
（ａ）マイクロ粒子またはナノ粒子であり、（ｉ）本体、（ｉｉ）少なくとも１つの表面、および（ｉｉｉ）前記本体内部に少なくとも１つの貯蔵部を有する、少なくとも１種の第１段階粒子を提供するステップと、
（ｂ）少なくとも１種の第２段階粒子を提供するステップと、
（ｃ）前記第２段階粒子を、前記第１段階粒子の前記貯蔵部内部に装填するステップと
を含む方法。
【請求項７２】
前記少なくとも１種の第２段階粒子が少なくとも１種の活性剤を含有する、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記第１段階粒子の前記本体がナノ多孔質材料を含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
前記ナノ多孔質材料がナノ多孔質シリコンまたはナノ多孔質酸化物材料である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記少なくとも１種の第１段階粒子を提供するステップおよび前記少なくとも１種の第２段階粒子を提供するステップが、前記少なくとも１種の第１段階粒子、前記少なくとも１種の第２段階粒子、および担体を含む溶液を提供するステップを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
前記装填するステップが、受動拡散または毛管対流、またはこれらの組合せによって装填するステップを含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７７】
前記第１段階粒子の前記本体の少なくとも１つの孔表面、または前記第２段階粒子の表面を修飾するステップをさらに含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記修飾するステップが、前記第１段階粒子の前記本体の少なくとも１つの前記孔表面、または前記第２段階粒子の前記表面を化学的に修飾するステップを含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記修飾するステップが、前記第１段階粒子の前記本体の少なくとも１つの前記孔表面、または前記第２段階粒子の前記表面上の表面電荷を改変するステップを含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
前記装填するステップが、前記溶液中の前記少なくとも１種の第２段階粒子の濃度を変更することによって、前記第１段階粒子の前記少なくとも１つの貯蔵部中で、前記第２段階粒子の所望の装填量を達成するステップを含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項８１】
前記少なくとも１種の第２段階粒子が、第１集団の第２段階粒子と第２集団の第２段階粒子とを含み、前記装填するステップが、前記第１集団の第２段階粒子を、前記第１段階粒子の前記本体の第１領域中に装填するステップと、前記第２集団の第２段階粒子を、前記第１段階粒子の前記本体の第２領域中に装填するステップとを含み、前記第１領域が前記第２領域と異なる、請求項７１に記載の方法。
【請求項８２】
前記第１集団の第２段階粒子が第１の活性剤を含み、前記第２集団の第２段階粒子が、前記第１の活性剤と異なる第２の活性剤を含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記第２段階粒子が、リポソーム、ミセル、エソソーム、カーボンナノチューブ、フラーレンナノ粒子、金属ナノ粒子、半導体ナノ粒子、ポリマーナノ粒子、酸化物ナノ粒子、ウイルス粒子、ポリイオン粒子、およびセラミック粒子からなる群から選択される、少なくとも１つの成分を含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項８４】
前記第１段階粒子の前記貯蔵部内部に、少なくとも１種の追加成分を装填するステップをさらに含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項８５】
前記少なくとも１種の追加成分が、少なくとも透過エンハンサーまたは追加の活性剤、または両方を含む、請求項８４に記載の方法。

【図１】

【図２Ａ】

【図２Ｂ】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６Ａ】

【図６Ｂ】

【図７】

【図８Ａ】

【図８Ｂ】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２Ａ】

【図１２Ｂ】

【図１３】

【図１４Ａ】

【図１４Ｂ】

【図１５Ａ】

【図１５Ｂ】

【図１６】

【図１７Ａ】

【図１７Ｂ】

【図１７Ｃ】

【図１７Ｄ】

【図１８Ａ】

【図１８Ｂ】

【図１８Ｃ】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３Ａ】

【図２３Ｂ】

【図２３Ｃ】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【公表番号】特表２０１０−５００３７５（Ｐ２０１０−５００３７５Ａ）
【公表日】平成２２年１月７日（２０１０．１．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２３９８３（Ｐ２００９−５２３９８３）
【出願日】平成１９年８月８日（２００７．８．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７５５１６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０２１９０８
【国際公開日】平成２０年２月２１日（２００８．２．２１）
【出願人】（５０００３９４６３）ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム (115)
【出願人】（３０９０３００５６）
【Ｆターム（参考）】