生物活性の精製ＨｓｐＥ７組成物
精製Ｈｓｐ６５−Ｅ７融合蛋白質（ＨｓｐＥ７）の生物学的活性を増加する方法が提供される。方法はＨｓｐＥ７をＣｐＧ、ＰｏｌｙＬＣ、ＰｏｌｙＩＣＬＣのようなＴＬＲ３作用薬、モノリン酸リピドＡ（ＭＰＬ）、ＭＰＬ−トレハロース６，６’−ジミコレート（ＭＰＬ−ＴＤＭ）、および抗ＣＤ４０からなるグループから選ばれた免疫刺激剤とともに混合することからなる。ＨｓｐＥ７、およびＣｐＧ、ＰｏｌｙＬＣ、ＰｏｌｙＩＣＬＣのようなＴＬＲ３作用薬、ＭＰＬ、ＭＰＬ−ＴＤＭおよび抗ＣＤ４０の１つあるいはそれ以上からなる組成物および組成物を使用することによりその必要に応じ哺乳類あるいは被験者の腫瘍あるいはウイルス発生を縮小する方法がまた提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫学の分野に関する。さらに、本発明はＨｓｐＥ７を含む組成物およびこれらの使用を提供する。
【０００２】
［発明の背景］
ワクチン接種および免疫療法戦略は一連の細胞の相互作用の複雑に構成された系列の操作を目指している。細胞の相互反応は、一般的に抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）そして特に樹状細胞（ＤＣｓ）が抗原に遭遇しそして吸収し、抗原からペプチドエピトープを生成し、そして必須組織適合遺伝子複合体（MHC）によって記号化される分子の認識切片内にエピトープを負荷することによる免疫の監視を含んでいる。ＤＣ表面に輸送の後、エピトープ負荷ＭＨＤ分子はエピトープ−ＭＨＣ複合体をＴ細胞に提供しそしてＴ細胞を活性化する。活性化したＣＤ４＋Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞は他のＤＣｓにケモカインとサイトカイン信号を供給し、これらに特別の能力をあたえ、順次、生来のＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化し、抗原−特殊細胞傷害Ｔリンパ球（ＣＴＬ）内にこれらの細胞の遺伝子を移転する。活性化したＴヘルパー細胞はＢ細胞と反応し、同様に分化、クローンの拡大を制御する分子信号、およびこれらが獲得免疫の液性応答のマウンティングにおいて分泌する抗体アイソタイプの定義でこれらを提供する。
【０００３】
ワクチン接種および免疫療法はある種の感染症あるいは癌のような異常な範囲の予防あるいは治療に対して興味ある手がかりである。しかしながら、このような治療の成功は免疫療法の実施要項、例えば、選ばれた細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープの貧弱な免疫原性に対するいくつかの固有の欠点によってしばしば制約される。免疫応答を増加する標準的方法は免疫原から分離されそして使用に典型的に先立って免疫原と混合されるアジュバントの使用がある。硫酸バンドおよび不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）がアジュバントの例として知られている。ある種の生体活性自然製品がアジュバントとして使用されることがまた示されている。一般的な例はグラム陰性細菌からのリポ多糖（ＬＰＳ）およびグラム陰性そしてグラム陽性細菌の両方からのムレインあるいはペプチドグリカン（ＰＧ）としてまた知られる細菌細胞壁糖ペプチドを含んでいる。
【０００４】
微生物アジュバントは哺乳類細胞におけるパターン認識受容体（ＰＲＲｓ）を活性化することによりアジュバントの前起炎症を働かせると考えられる。Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲｓ）として知られている哺乳類表面受容体はＰＲＲシステム内の必須受容体クラスの一つである。ＴＬＲの活性化は、ケモカインおよびある種のサイトカインのような前起炎症メディエイターを符号化する遺伝子の発現を順次刺激する転写因子ＮＦｋＢおよびＡＰＩの誘発に導く細胞内部の信号化カスケードを引き起こす。１１の異なるＴＬＲがヒトにおいて始まることを確認されそして各ＴＬＲは微生物由来の組成物のユニークな小さな一組を認識する能力をもっている。
【０００５】
例えば、ＬＰＳはＴＬＲ４の配位子でありそしてペプチドグリカンはＴＬＲ２の配位子である。ＴＬＲｓはまたユニークな配位子特異性をもつヘテロ二量体を形成することができる。例えば、マイコプラズマからのマクロファージ活性リポペプチド２（ＭＡＬＰ−２）はＴＬＲ２／ＴＬＲ６に対する配位子であるが、一方ウイルスのリポペプチドＰａｍ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ（４）がＴＬＲ１／ＴＬＲ２ヘテロ二量体に対する配位子である。
【０００６】
ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）のＥ７蛋白質は小さく（約１０，０００Ｍw）、網膜芽細胞種遺伝子生成物Ｒｂ（転写因子Ｅ２Ｆに結合しそして不活性化する腫瘍抑制）に結合する能力により発癌性をもつＺｎ−結合リン酸蛋白質である。転写因子Ｅ２Ｆはこれらを符号化するチミジンキナーゼ、ｃ−ｍｙｃ、ジヒドロ葉酸レダクターゼおよびＤＮＡポリメラーゼアルファを含む数多くの増殖関連遺伝子の転写を制御する。Ｒｂ−Ｅ２Ｆ複合体形成はＧ０およびＧ１相における後の遺伝子の発現を防止し、Ｒｂ−Ｅ２Ｆ複合体が解離するようにプログラム化されるＳ相への発現を制約し、活性転写因子Ｅ２Ｆを解放する。このようにＥ７は、それはウイルスのライフサイクルを通して発現されそして事実それはＨＰＶ感染症により引き起こされる終末段階子宮頸肉腫の間に発現するただ２つのウイルス性蛋白質の１つであるので、乳頭種ウイルス感染症において免疫学的介在に対して魅力的な目標を提供する。
【０００７】
ＨＰＶ蛋白質とアジュバントの共投与が報告されている。例えば、Ｆｒｅｙｓｃｈｍｉｄｔ等（Ｆｒｅｙｓｃｈｍｉｄｔ Ｅ−Ｊ等、２００４、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｔｈｅｒ．９：４７９−４８９）はリポ多糖（ＬＰＳ）、非メチル化ＣｐＧおよびソルビトールが樹状細胞のＨＰＶ１６Ｌ１−Ｅ７融合粒子誘発刺激を強調したことを論証した。Ｋｉｍ等（Ｋｉｍ Ｔ−Ｙ等、２００２ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２：７２３４−７２４０）はＨＰＶ Ｅ７のＣｐＧ オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ ＯＤＮ）１８２６の共供給がＨＰＶ１６に対する防御的免疫性を増加することを教えている。Ｅ５を含む腫瘍増殖の除去はＣｐＧ ＯＤＮ １８２６あるいはフロイントアジュバントとＨＰＶ Ｅ５共投与を使用することをＣｈｅｎ等（Ｃｈｅｎ Ｙ−Ｆ等、２００４、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：１３３３−１３４３）によってまた報告されている。
【０００８】
ＷＯ９９／０７８６０はＨＰＶ感染症の間、抗Ｅ７免疫応答を引き出すためのワクチン薬剤として有用である組換え体Ｈｓｐ６５−Ｅ７融合蛋白質（ＨｓｐＥ７）を開示している。ここに記述されたＨｓｐＥ７融合蛋白質はＥ．Ｃｏｌｉによって発表されそしてＥ７−特異ＣＤ８免疫応答を引き出す能力に関して生物学的に活性である。
【０００９】
［発明の概要］
本発明はＨｓｐＥ７を含む組成物およびこれらの使用の方法に関する。さらに特に、本発明は精製Ｈｓｐ６５−ＨＰＶ Ｅ７融合体（ＨｓｐＥ７）を含む組成物および使用の方法を提供する。
【００１０】
改善されたＨｓｐＥ７組成物を提供することが本発明の目的である。
【００１１】
本発明に従って、ＣｐＧ、ＴＬＲ３作用薬、モノホスホリル−リピド Ａ（ＭＰＬ）、ＭＰＬ−テレハロース６，６’−ジミコレート（ＭＰＬ−ＴＤＭ）、および抗ＣＤ４０を含むグループから選ばれた免疫刺激剤と共にＨｓｐＥ７を混合することを含む精製ＨｓｐＥ７の生体活性を増加させる方法が提供される。望ましくは、免疫刺激剤は投与量当り約１μｇから５０００μｇの量でＨｓｐＥ７と共に共投与される。本発明のある観点では、免疫刺激剤は、陽イオン性アミノ酸の大部分を含むポリリジン、ポリアルギニン、あるいは陽イオン性ペプチドのような陽イオン性ポリマーで複合化されたＰｏｌｙＩ：ＣあるいはｐｏｌｙＩ：Ｃである。本発明の他の観点で、免疫刺激剤はＰｏｌｙＩＣＬＣである。さらに、精製ＨｓｐＥ７はゲル電気泳動法、ＨＰＬＣ、あるいは両方を使用して決定された純度約９５％から約９９．９９％である。
【００１２】
本発明はまた精製ＨｓｐＥ７およびＣｐＧ、ＴＬＲ３作用薬、ＭＰＬ、ＭＰＬ−ＴＤＭおよび抗ＣＤ４０を含むグループから選ばれた免疫刺激剤を含む組成物を目指している。望ましくは、免疫刺激剤は投与量当り約１μｇから５０００μｇの量で提供される。本発明のある観点では、免疫刺激剤は、陽イオン性アミノ酸の大部分を含むポリリジン、ポリアルギニン、あるいは陽イオン性ペプチドのような陽イオン性ポリマーで複合化されたＰｏｌｙＩ：ＣあるいはｐｏｌｙＩ：Ｃである。本発明の他の観点で、免疫刺激剤はＰｏｌｙＩＣＬＣである。さらに、精製ＨｓｐＥ７はゲル電気泳動法、ＨＰＬＣ、あるいは両方を使用して決定された純度約９５％から約９９．９９％である。
【００１３】
本発明はまた哺乳類あるいは被験者における腫瘍の重荷あるいはウイルスの発生を減らす方法を目指しており、それを必要としている被験者に精製ＨｓｐＥ７を含む組成物およびＣｐＧ、ＴＬＲ３作用薬、ＭＰＬ、ＭＰＬ−ＴＤＭ、および抗ＣＤ４０からなるグループから選ばれた免疫刺激剤を投与することを含む。望ましくは、免疫刺激剤は投与量当り約１μｇから５０００μｇの量で共投与される。本発明のある観点では、免疫刺激剤は、陽イオン性アミノ酸の大部分からなるポリリジン、ポリアルギニン、あるいは陽イオン性ペプチドのような陽イオン性ポリマーで複合化されたＰｏｌｙＩ：ＣあるいはｐｏｌｙＩ：Ｃである。本発明の他の観点で、免疫刺激剤はＰｏｌｙＩＣＬＣである。さらに、精製ＨｓｐＥ７はゲル電気泳動法、ＨＰＬＣ、あるいは両方を使用して決定された純度約９５％から約９９．９９％である。
【００１４】
本発明はさらに精製ＨｓｐＥ７およびＣｐＧ、ＴＬＲ３作用薬、ＭＰＬ、ＭＰＬ−ＴＤＭおよび抗ＣＤ４０を含むグループから選ばれた免疫刺激剤そしてこれらの使用のための説明書を含むキットを提供する。望ましくは、免疫刺激剤は投与量当り約１μｇから５０００μｇの量で提供される。本発明のある観点では、免疫刺激剤は、陽イオン性アミノ酸の大部分からなるポリリジン、ポリアルギニン、あるいは陽イオン性ペプチドのような陽イオン性ポリマーで複合化されたＰｏｌｙＩ：ＣあるいはｐｏｌｙＩ：Ｃである。本発明の他の観点で、免疫刺激剤はＰｏｌｙＩＣＬＣである。さらに、精製ＨｓｐＥ７はゲル電気泳動法、ＨＰＬＣ、あるいは両方を使用して決定された純度約９５％から約９９．９９％である。
【００１５】
本発明はＨＰＶ蛋白質抗原に対する免疫応答そして特別な実施態様ではＨＰＶ蛋白質抗原を発現する腫瘍あるいはＨＰＶ感染細胞に対する免疫応答を強めるための組成物の使用に関する。組成物はそれを必要としている被験者に癌の防止あるいは治療に使用される。
【００１６】
本発明はまた組成物の投与スケジュールに関する。本発明の特別の観点において、本発明の組成物は少なくとも２回の投与からなる投与スケジュールで投与される。投与は連続した日、あるいは非連続の日、あるいはこれらの組み合わせで投与される。
【００１７】
本発明の概要は本発明の全ての特徴を必ずしも記述していない。
【００１８】
［図面の簡単な説明］
本発明のこれらおよび他の特徴は言及が付帯する図面に対してなされる次の説明からもっと明らかとなる。
【００１９】
図１は種々のＨｓｐＥ７調合剤の抗腫瘍活性を示す。プロセスＬ：プロセスＬ ＨｓｐＥ７は高精製ＨｓｐＥ７調合剤である。プロセスＡ ＨｓｐＥ７はより低い純度のＨｓｐＥ７（ＷＯ９９／０７８６０）である。確立したＥ７−発現ＴＣ−１腫瘍をもつハツカネズミはプロセスＡあるいはプロセスＬ（ｎ＝３０／ｇｒｐ／投与量）のいずれかにより製造されたＨｓｐＥ７の等級のある投与で頸の首筋に皮下注射されそして４９日間腫瘍増殖を続けられた。ＲＤ４−プロセスＬ ＨｓｐＥ７（▼）；ＲＤ５−プロセスＬ ＨｓｐＥ７（◆）；ＣＬ４−プロセス ＨｓｐＥ７（○）；ＣＬ６−プロセスＡ ＨｓｐＥ７（□）。Ｘ軸：ＴＣ１評価でμｇで使用されたＨｓｐＥ７の投与量。
【００２０】
図２はＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ＴＬＲ９作用薬）の存在においてＥ７特異ＣＤ８陽性Ｔリンパ球を誘発するためのＨｓｐＥ７の能力の増加を示す。生来のＣ５７ＢＩ／６ハツカネズミはＨｓｐＥ７のみかあるいはＨｓｐＥ７プラス３０μｇＣｐＧオリゴヌクレオチドのいずれかの皮下注射をされそしてＥ７特殊脾臓細胞の数がＥＬＩＳＰＯＴにより測定された。左から右へ（治療当り２匹のハツカネズミの同齢集団）、免疫化抗原は４００μｇプロセスＡ ＨｓｐＥ７（ＷＯ９９／０７８６０に記述された低純度のＨｓｐＥ７）；４００μｇプロセスＡ ＨｓｐＥ７プラス３０μｇＣｐＧオリゴヌクレオチド；４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７（高精製ＨｓｐＥ７）；４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７プラス３０μｇＣｐＧオリゴヌクレオチドであった。ＥＬＩＳＰＯＴ分析のために使用された回収抗原はＨＢＶコア抗原（ＨＢＶｃＡｇ）（９３−１００）の不適当な制御ペプチド（黒色棒）；Ｅ７（４９−５７）特異ペプチド（灰色棒）；溶媒のみ制御（中空棒）であった。
【００２１】
図３はプロセスＬ ＨｓｐＥ７（精製ＨｓｐＥ７）のＰｏｌｙＩ：Ｃ（ＴＲＬ３作用薬）あるいはＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＴＬＲ９作用薬）でしかしＰＡＭ３ＣｙｓＳＫ４（ＴＬＲ２作用薬）ではないものを共注射することによりＥ７特異ＣＤ８陽性Ｔリンパ球を誘発するためのＨｓｐＥ７の能力の増加を示す。ハツカネズミは指示された投薬量でプロセスＬ ＨｓｐＥ７プラスＴＬＲ作用薬の混合物（溶液）で皮下注射をされそしてＥ７−特異脾臓細胞の数がＥＬＩＳＰＯＴで測定された。左から右へ（治療当り２匹のハツカネズミの同齢集団）、免疫化抗原は５０μｇプロセスＬ プラス１０μｇＣｐＧオリゴヌクレオチド；５０μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７プラス１００μｇｐｏｌｙＩ：Ｃ；５０μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７プラス２０μｇPａｍ３ＣｙｓＳＫ４；あるいは生来のハツカネズミであった。ＥＬＩＳＰＯＴ分析のために使用された回収抗原はＨＢＶｃＡｇ（９３−１００）の不適当な制御ペプチド（斜線棒）；Ｅ７（４９−５７）特異ペプチド（黒色棒）；溶媒のみ制御（中空棒）であった。
【００２２】
図４はモノリン酸リピドＡ（ＭＰＬ；ＴＬＲ４作用薬）の存在でＥ７特異ＣＤ８陽性Ｔリンパ球を誘発するためにプロセスＬ ＨｓｐＥ７の能力の増加を示す。生来のＣ５７Ｂ１／６ハツカネズミはプロセスＬ ＨｓｐＥ７（精製ＨｓｐＥ７）のみで、あるいはＨｓｐＥ７プラスＭＰＬ＋ＴＤＭのいずれかで皮下注射されそしてＥ７−特異脾臓細胞の数がＥＬＩＳＰＯＴで測定された。左から右へ（治療当り２匹のハツカネズミの同齢集団）、免疫化抗原は４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７；ＭＰＬ＋ＴＤＭ（Ｒｉｂｉ）中に４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７あるいは生来のハツカネズミであった。ＥＬＩＳＰＯＴ分析のために使用された回収抗原はＨＢＶｃＡｇ（９３−１００）の関連性のない制御ペプチド（黒色棒）；Ｅ７（４９−５７）特異ペプチド（斜線棒）；溶媒のみの制御（中空棒）であった。
【００２３】
図５はＰｏｌｙ ＩＣＬＣ（ＴＬＲ３作用薬）の存在でＥ７特異ＣＤ８陽性Ｔリンパ球を誘発するためにプロセスＬ ＨｓｐＥ７の能力の増加を示す。生来のＣ５７Ｂ１／６ハツカネズミはプロセスＬ ＨｓｐＥ７（精製ＨｓｐＥ７）のみで、あるいはＨｓｐＥ７プラスＰｏｌｙＩＣＬＣの等級のある投薬量のいずれかで皮下注射されそしてＥ７−特異脾臓細胞の数がＥＬＩＳＰＯＴで測定された。左から右へ（治療当り２匹のハツカネズミの同齢集団）、免疫化抗原は４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７；４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７プラス１００μｇＰｏｌｙＩＣＬＣ；４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７プラス１０μｇＰｏｌｙ ＩＣＬＣ；４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７プラス１μｇＰｏｌｙＩＣＬＣ；４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７プラス０．１μｇＰｏｌｙＩＣＬＣ；１００μｇＰｏｌｙＩＣＬＣのみあるいは生来のハツカネズミであった。ＥＬＩＳＰＯＴ分析のために使用された回収抗原はＨＢＶｃＡｇ（９３−１００）の関連性のない制御ペプチド（灰色棒）；Ｅ７（４９−５７）特異ペプチド（斜線棒）；溶媒のみの制御（中空棒）であった。
【００２４】
図６は腫瘍発生率におけるプロセスＬ ＨｓｐＥ７あるいはプロセスＡ ＨｓｐＥ７の効果を示す。種々のＨｓｐＥ７調合剤の抗腫瘍活性はプロセスＡ ＨｓｐＥ７（低純度のＨｓｐＥ７、ＷＯ９９／０７８６０に記述される）、あるいはプロセスＬ ＨｓｐＥ７（精製ＨｓｐＥ７）およびＣｐＧオリゴヌクレオチドを共投与することにより決定された。確立したＥ７−発現ＴＣ−１腫瘍をもつハツカネズミはプロセスＡ ＨｓｐＥ７のみあるいはＣｐＧオリゴヌクレオチド（ｎ＝３０／ｇｒｐ）の異なる投与量で混合されたプロセスＬ ＨｓｐＥ７の等級のある投与量で頸の首筋に皮下注射されそして４９日間腫瘍増殖を続けられた。３μｇオリゴヌクレオチド＋プロセスＬ ＨｓｐＥ７（■）；１０μｇＣｐＧオリゴヌクレオチド＋プロセスＬ ＨｓｐＥ７（▲）；３０μｇＣｐＧオリゴヌクレオチド＋プロセスＬ ＨｓｐＥ７（▼）；プロセスＡ ＨｓｐＥ７（◆）；平均プロセスＡ ＨｓｐＥ７ 歴史的（○）。Ｘ軸はＴＣ−１評価で使用されたＨｓｐＥ７のμｇ。
【００２５】
図７はＰｏｌｙＩ：ＣとプロセスＬ ＨｓｐＥ７（精製ＨｓｐＥ７）を組み合わせることによりプロセスＬ ＨｓｐＥ７の抗腫瘍活性の増加を示す。確立されたＥ７−発現ＴＣ−１腫瘍をもつハツカネズミはプロセスＬ ＨｓｐＥ７のみあるいはＰｏｌｙＩ：Ｃ（ｎ＝２０／ｇｒｐ）を組み合わせたプロセス Ｌ ＨｓｐＥ７の等級のある投与量で頸の首筋に皮下注射されそして４９日間で腫瘍増殖を続けられた。プロセスＬ ＨｓｐＥ７の８００μｇで注射されたハツカネズミのおおよそ５０％は４９日目で腫瘍をもった。ＨｓｐＥ７（■）；ＨｓｐＥ７＋ＰｏｌｙＩＣ（▲）。Ｘ軸はＴＣ−１評価で使用されたＨｓｐＥ７のμｇ。
【００２６】
図８はＥ７特異ＣＤ８陽性Ｔリンパ球の誘発において精製ＨｓｐＥ７（プロセスＬ ＨｓｐＥ７）で混合されたアジュバント硫酸バンドあるいはフロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ）の効果を示す。ハツカネズミはプロセスＬ ＨｓｐＥ７のみあるいはプロセスＬ ＨｓｐＥ７、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、硫酸バンドおよびフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）の指示投与量で皮下注射されそしてＥ７−特異脾臓細胞の数がＥＬＩＳＰＯＴで測定された。左から右へ（治療当り２匹のハツカネズミの同齢集団）、免疫化抗原は４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７；ＩＦＡ中に４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７；ＩＦＡ中に４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７プラスＣｐＧオリゴヌクレオチド；４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７プラス硫酸バンド；４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７プラス硫酸バンドプラスＣｐＧオリゴヌクレオチド；４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７プラスＣｐＧオリゴヌクレオチド、あるいは生来のハツカネズミであった。ＥＬＩＳＰＯＴ分析のために使用された回収抗原はＨＢＶｃＡｇ（９３−１００）の関連性のない制御ペプチド（斜線棒）；Ｅ７（４９−５７）特異ペプチド（平行線付棒）；溶媒のみの制御（中空棒）であった。
【００２７】
図９は種々のＴＬＲ作用薬あるいは作用薬の抗ＣＤ抗体の存在で共投与されたときＥ７特異ＣＤ８陽性Ｔリンパ球を誘発するためにＨｓｐＥ７の能力の比較を示す。Ｅ７特殊Ｔ細胞の無視できる数がイミキミド（ＴＬＲ７作用薬）ＰＡＭ３ＣｙｓＳＫ４（ＴＬＲ１／２作用薬）あるいはＬＰＳ（ＴＬＲ４作用薬）とＨｓｐＥ７の共投与の後、引き出された。対照的にＥ７特異Ｔ細胞の多くの数がＣｐＧオリゴヌクレオチドあるいは作用薬の抗ＣＤ４０抗体とＨｓｐＥ７の共投与の後、引き出された。ハツカネズミは精製ＨｓｐＥ７（プロセスＬ ＨｓｐＥ７）プラス指示されたＴＬＲ作用薬の混合物で皮下注射され、そしてＥ７特異脾臓細胞の数がＥＬＩＳＰＯＴによって測定された。左から右へ（治療当り２匹のハツカネズミの同齢集団）、免疫化抗原は４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７；４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７プラス１００μｇイミキモド；４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７プラス３０μｇＬＰＳ；４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７プラス２５μｇＰＡＭ３ＣｙｓＳＫ４；４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７プラス２５μｇ抗ＣＤ４０抗体（クローン１Ｃ１０）；４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７プラス３０μｇＣｐＧオリゴヌクレオチド；あるいは生来のハツカネズミであった。ＥＬＩＳＰＯＴ分析のために使用された回収抗原はＨＢＶｃＡｇ（９３−１００）の関連性のない制御ペプチド（黒色棒）；Ｅ７（４９−５７）特殊ペプチド（平行線付棒）；溶媒のみ制御（中空棒）であった。
【００２８】
図１０はＩＦＭガンマＥＬＩＳＰＯＴにより測定されるようにクラスＩ制限ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を引き出す能力への日々の主要な押し上げ戦略の効果を示す。Ｃ５７Ｂ１／６ハツカネズミ（グループ当り２匹）は１日間隔で、１日当り最大４日間までＨｓｐＥ７（１００μｇ）そしてｐｏｌｙＩＣＬＣ（１０μｇ）で免疫化された。抗体に最初の曝露の後７日、全ての動物は安楽死されそしてこれらの脾臓細胞が分析のため採取された。ＩＦＭガンマＥＬＩＳＰＯＴが１６Ｅ７．４９−５７．Ｄｂペプチドでの刺激へのクラスＩ制限ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を評価するために使用された（回収抗体−中空棒；媒体−制御のみ−黒色棒）。左から右へ（治療当り２匹のハツカネズミの同齢集団）、免疫化抗原は４０μｇｐｏｌｙＩＣＬＣと４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７（１回投与）；１０μｇｐｏｌｙＩＣＬＣと１００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７（１回投与）；１０μｇｐｏｌｙＩＣＬＣと１００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７（２回投与）；１０μｇｐｏｌｙＩＣＬＣと１００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７（３回投与）；１０μｇｐｏｌｙＩＣＬＣと１００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７（４回投与）；生来のハツカネズミであった。
【００２９】
図１１は液性免疫へのＨｓｐＥ７プラスＰｏｌｙ−ＩＣＬＣの共免疫性化の効果を示す。Ｃ５７Ｂ１／６ハツカネズミ（ｎ＝５）のグループは緩衝液、５００μｇＨｓｐＥ７、１２．５μｇＰｏｌｙＩＣＬＣ、５００μｇＨｓｐＥ７＋１．２５μｇＰｏｌｙ−ＩＣＬＣ、５００μｇＨｓｐＥ７＋１２．５μｇＰｏｌｙ−ＩＣＬＣあるいは５００μｇＨｓｐＥ７＋１２５μｇＰｏｌｙ−ＩＣＬＣで毎月の間隔（１日目、２８日目）で２回（Ｘ軸の左から右へ）免疫性を与えられた。血液試料は投与前に７日毎（７日目がベースライン）そして２１日、４９日、７７日目に血清の分析のため採取された。個々のハツカネズミからの血清はＥ７およびＨｓｐＥ７に対して標準ＥＬＩＳＡによって抗体（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ、およびＩｇG２ｃ）の存在に対して試験された。データは評価プレートのバックグランド（０．２ＯＤユニットとして定義）よりも大きい吸光度を与えた血清の最も高い希釈で表される。パネルＡ）抗Ｅ７ ＩｇＧ１タイター；Ｂ）抗ＨｓｐＥ７ ＩｇＧ１タイター；Ｃ）抗Ｅ７ ＩｇＧ２ｂタイター；Ｄ）抗ＨｓｐＥ７ ＩｇＧ２ｂタイター；Ｅ）抗Ｅ７ ＩｇＧ２ｃタイター；Ｆ）抗ＨｓｐＥ７ ＩｇＧ２ｃタイター。中空棒―血出前制御；斜線棒―２１日目出血；黒色棒―４９日目出血；縦線棒―７７日目出血。
【００３０】
図１２は抗原特異性ＣＤ８＋T細胞応答を引き出しにおいて外因性抗原プラスｐｏｌｙＩＣＬＣで免疫性化の結果を示す。Ｃ５７Ｂ１／６ハツカネズミ（同齢集団当り２匹のハツカネズミ）は４００μｇＨｓｐＥ７のみ、１００μｇｐｏｌｙＩＣＬＣと４００μｇＨｓｐＥ７、１０μｇｐｏｌｙＩＣＬＣと４００μｇＨｓｐＥ７、１μｇｐｏｌｙＩＣＬＣと４００μｇＨｓｐＥ７、０．１μｇｐｏｌｙＩＣＬＣと４００μｇＨｓｐＥ７、１００μｇｐｏｌｙＩＣＬＣのみ、あるいは緩衝液（制御）の皮下注射で免疫性化された。免疫化７日後、Ｈ−２Ｄｂ制約エピトープＥ４９−５７に対する抗体特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答がＩＦＮガンマＥＬＩＳＰＯＴによって評価された。ＥＬＩＳＰＯＴのための回収抗体：空白棒―媒体制御；灰色棒―Ｅ７ペプチド；黒棒―ＨＢＶＣあるいはペプチド。
【００３１】
図１３は大きい、確立したＴＣ−１腫瘍の退化の誘発においてＨｓｐＥ７抗原プラスｐｏｌｙＩＣＬＣで多重投与免疫化の結果を示す。Ｃ５７ＢＩ／６ハツカネズミ（同齢集団当り１５匹のハツカネズミ）が０日目にＥ７発現ＴＣ−１．Ｋ腫瘍細胞（６×１０４）で移殖されそして緩衝液のみの４連続日投与で治療された（中空の４角）；１００μｇＨｓｐＥ７蛋白質（中空の３角）、１０μｇＰｏｌｙＩＣＬＣ（中空の円）；あるいは１００μｇＨｓｐＥ７＋１０μｇＰｏｌｙＩＣＬＣ（黒色円）、移殖後２８日目に開始。データは経過時間あたり各同齢集団に対する中央値腫瘍容積（パネルＡ）としてあるいは経過時間あたり各同齢集団内の個々の動物に対する腫瘍容積（パネルＢ）として表される。
【００３２】
図１４はＨｓｐＥ７抗原プラスＴＬＲ３作用薬を使用する多重投与免疫化戦略の結果を示す。（Ａ）Ｃ５７Ｂ１／６ハツカネズミ（同齢集団当り２匹のハツカネズミ）が組み替えＨｓｐＥ７蛋白質（１００μｇ）プラスＴＬＲ３作用薬ＰｏｌｙＩＣＬＣ（１０μｇ）の自己含有で０日目に１度（黒色の４角）かあるいは０日目と２日目に２度（中空の４角）のいずれか、あるいは０日目と４日目に２回（黒色の円）免疫性化をされた。指定された時間点（最初の免疫性化後の日数）で、Ｈ−２Ｄｂ制約エピトープＥ４９−５７に対する抗体特異ＣＤ８Ｔ細胞応答がＩＦＮガンマＥＬＩＳＰＯＴによって評価された。（Ｂ）Ｃ５７Ｂ１／６ハツカネズミ（同齢集団当り４匹のハツカネズミ）が組み替えＨｓｐＥ７蛋白質（１００μｇ）プラスＴＬＲ作用薬ＰｏｌｙＩＣＬＣ（１０μｇ）自己含有で４日の連続する日の間毎日一緒に、１日目に１度一緒に、あるいは２、３、４日目のみにＰｏｌｙＩＣＬＣ（１０μｇ）によって引き続けられる１日目に１度一緒に免疫性化された。最初の免疫性化７日後、Ｈ−２Ｄｂ制約エピトープＥ４９−５７に対する抗体特異ＣＤ８Ｔ細胞応答がＩＦＮガンマＥＬＩＳＰＯＴによって評価された。
【００３３】
図１５はＨｓｐＥ７抗原プラスＴＬＲ３作用薬を使用する多重投与免疫化戦略の結果を示す。（Ａ）Ｃ５７ＢＩ／６ハツカネズミ（同齢集団当り２匹のハツカネズミ）が組み替えＨｓｐＥ７蛋白質（１００μｇ）プラスＰｏｌｙＩＣＬＣ（１０μｇ）、あるいはＨｓｐＥ７蛋白質（４００μｇ）プラスＰｏｌｙＩＣＬＣ（４０μｇ）の単独投与で連続する日の指示された数に対し毎日免疫化された。最初の免疫化７日後、Ｈ−２Ｄｂ制約エピトープＥ４９−５７に対する抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答がＩＦＮガンマＥＬＩＳＰＯＴによって評価された。Ｂ）生来のハツカネズミからの脾臓細胞（右パネル）あるいはＨｓｐＥ７蛋白質（１００μｇ）プラスＰｏｌｙＩＣＬＣ（１０μｇ）の４日連続する毎日の投与をうけるハツカネズミ（左パネル）はＥ４９−５７ペプチドで負荷されたＰＥ共役のＨ−２Ｄｂ五量体（Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅ社）で染色されそして表面は抗ＣＤ８および抗ＣＤ４４ｍＡｂｓで染色された。示された細胞はゲートされたＣＤ８＋ 陽性集団を表す。（Ｃ）Ｃ５７Ｂ１／６ハツカネズミ（同齢集団当り２匹のハツカネズミ）が組み替えＨｓｐＥ７蛋白質（１００μｇ）プラスＰｏｌｙＩＣＬＣ（１０μｇ）で連続する日の指示された数に対し毎日免疫化された。指定された時間（最初の免疫化後の日）にＨ−２Ｄｂ制約エピトープＥ４９−５７に対する抗体特異ＣＤ８Ｔ細胞応答がＩＦＮガンマＥＬＩＳＰＯＴによって評価された。
【００３４】
［詳細説明］
本発明はＨｓｐＥ７を含む組成物およびその使用法に関する。
【００３５】
次の説明は望ましい実施態様である。
【００３６】
本発明はＴＬＲ作用薬に限られないような免疫刺激剤と一緒に精製ＨｓｐＥ７および任意に他の薬学的に受け入れられる成分を含む組成物を提供する。免疫刺激剤はＴＬＲ３、あるいはＴＬＲ９作用薬であるが、しかしながら他のＴＬＲ作用薬もまた採用される。精製ＨｓｐＥ７と混合される免疫刺激剤の例は、制約されないが、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ＴＬＲ９作用薬）、ＴＬＲ３作用薬例えば二重標準のＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）あるいはＰｏｌｙＩ：Ｃ、あるいはポリＬリシン（ｐｏｌｙＩＣＬＣ）をともなうＰｏｌｙＩ：Ｃ、モノリン酸リピドＡ（ＭＰＬ；ＴＬＲ４作用薬）、あるいはＭＰＬ−トレハロース６，６’−ジミコレート（ＭＰＬ−ＴＤＭ）、および抗ＣＤ−４０を含む。
【００３７】
精製ＨｓｐＥ７によって、約９５％から約９９．９９％あるいはその間の量からなり、引き続くＨｓｐＥ７調合および精製を提供する組成物からなる残りの成分で特徴づけられるＨｓｐＥ７調合を意味する。例えば、精製ＨｓｐＥ７は約９５％から約９９．９９％あるいはその間の量からなり、あるいは約９７％から９９．６％、あるいはその間のＨｓｐＥ７量からなることを特徴としている。精製ＨｓｐＥ７は約９５、９６、９７、９８、９９、９９．２、９９．４、９９．６、９９．８、９９．９、９９．９５、９９．９９％ＨｓｐＥ７あるいはその間のいずれかの量からなる。精製ＨｓｐＥ７の例はプロセスＬ ＨｓｐＥ７である。
【００３８】
ＨｓｐＥ７の純度、あるいはプロセスＬ ＨｓｐＥ７は例えば制限されないがＨＰＬＣあるいはゲル電気泳動法を含むいずれかの純度評価の方法を使用して決定される。例えば、当業者に技術の一つとして知られる誘導および非誘導ゲル電気泳動法の組み合わせ（ＳＤＳと１％ＰＡＧＥ、±ベータメルカプトエタノール）。
【００３９】
Ｈｓｐ６５−ＨＰＶ Ｅ７融合生成物（ＨｓｐＥ７）は、例えば、ＷＯ９９／０７８６０（参考としてここに組み入れられる）に開示されたような種々な方法に従って生成される。ここで記述される使用に対して、ＨｓｐＥ７の調合はさらに精製に続けられる。さらなる精製は一つあるいはそれ以上の寸法の排除を使用するクロマトグラフィー、イオン交換（陽イオン、陰イオンあるいは両者）、親和性、逆浸透、クロマトグラフィーの他の方法、ゲル電気泳動法、寸法と電化あるいは両者によるいずれか、例えば尿素あるいは塩酸グアニジン、塩に制約されないがカオトロープ試薬を使用する変性、ｐＨ沈澱、膜濾過、および当業者に技術の一つとして知られるような同様法を含むいずれかの既知の精製法を使用して達成される。
【００４０】
ＷＯ９９／０７８６０に開示されたＨｓｐＥ７は、例えば、約９５％より低い、ここで記述する高い精製ＨｓｐＥ７（プロセスＬ ＨｓｐＥ７）よりも低い純度からなる低い純度調合である。ＨｓｐＥ７からの低い純度形式はプロセスＡ ＨｓｐＥ７、あるいはプロセスＡとして参照される。理論を超えることを希望することなく、プロセスＡ ＨｓｐＥ７は、もっと精製されたＨｓｐＥ７、例えばプロセスＬ ＨｓｐＥ７（例えば、図１そして図２参照）と比較されるときその強調される生体活性となる一つあるいはそれ以上の組成物を含む。しかしながら、ここに記述されるように、先行技術ＨｓｐＥ７（プロセスＡ ＨｓｐＥ７）が、約９５％から約９９．９９％の間の純度に、あるいはその間のいずれかの量（プロセスＬ ＨｓｐＥ７）に低い毒性のＨｓｐＥ７を製造するためにさらに精製されたとき、ＨｓｐＥ７の生体活性の損失が観察される（図１および２：プロセスＬ ＨｓｐＥ７対プロセスＡ ＨｓｐＥ７；実施例２および３参照）。図１に示されるように、プロセスＬ ＨｓｐＥ７（精製ＨｓｐＥ７）の使用は、低い純度プロセスＡ ＨｓｐＥ７を使用して観察されるような腫瘍発生率における縮小を、同様な投与量範囲を超えても著しく示されない。しかしながら、以下に記述するように高い精製ＨｓｐＥ７は、例えば、プロセスＬ ＨｓｐＥ７に制約されないで、ＴＬＲ作用薬に制約されないが免疫刺激剤と共投与されるとき生体活性を示す。精製ＨｓｐＥ７そして免疫刺激剤を含む精製ＨｓｐＥ７組成物は他の薬学的受入可能な成分をさらに含む。免疫刺激剤はＴＬＲ３あるいはＴＬＲ９作用薬であるが、しかしながら、他のＴＬＲ作用薬あるいはアジュバント、例えば、ＣＤ４０がまた採用される。
【００４１】
精製ＨｓｐＥ７と混合される免疫刺激剤の例は、制約されないで、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ＴＬＲ９作用薬）、ＰｏｌｙＩ：Ｃ、ＰｏｌｙＩＣＬＣ（ＴＬＲ３作用薬）、モノリン酸リピドＡ（ＭＰＬ；ＴＬＲ４作用薬）、ＭＰＬ−トレハロース６，６’−ジミコレート（ＭＰＬ−ＴＤＭ）、そして抗ＣＤ−４０抗体を含む。ＣｐＧオリゴヌクレオチドの制約のない例は例えばクラスＢ型コア配列：ＧＡＣＧＴＴ、制約のない例としてＣｐＧ１９８２、１８２６、あるいは１６６８を含む。ＣｐＧ１９８２は次の配列をもつ：ＴＣＣ、ＡＴＧ ＡＣＧ ＴＴＣ ＣＴＧ、ＡＴＧ ＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）。ＣｐＧ１９８２はホスホロチオエートバックボーンと共に利用できる（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、そして表示されている：ＺＯＯ ＦＺＥ ＦＯＥ ＺＺＯ ＯＺＥ ＦＺＥ ＯＴ）。ＣｐＧ１８２６は次の配列をもつ：ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＣＧ ＴＴＣ ＣＴＧ ＡＣＧ ＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）。ＣｐＧ１６６８は配列からなる：ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＣＧ ＴＴＣ ＣＴＧ ＡＴＧ ＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）。望ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチド１９８２および１６６８はホスホロチオエートバックボーンからなる。最適のハツカネズミのクラスＢ型コア配列（ＧＡＣＧＴＴ）で１６６８を含む種々のＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドはプロセスＬ ＨｓｐＥ７活性の増大に高い活性であることを示されている。同様にＣｐＧクラスＣ型オリゴヌクレオチド（２３９５）は高い活性であることが発見された。しかしながら、クラスＡ型ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドはＥＬＩＳＰＯＴ評価においてＨｓｐＥ７の活性の増大に効果は非常に少ないことが発見された。ＣｐＧのＡ、ＢおよびＣクラスの説明に対しては、Ｖｏｌｌｍｅｒ Ｊ等を参照せよ（Ｖｏｌｌｍｅｒ Ｊ．等、２００４、Ｅｕｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４：２５１−２６２）。
【００４２】
他の試薬と組み合わせた二重鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を含むｐｏｌｙＩＣリボ核酸は、例えば内生のＲＮＡへの感受性を減らされた例として改善された安定した輪郭を示している。ｄｓＲＮＡは、例えば、リピド小嚢に包まれるかあるいは多イオン性ポリマーと複合化されている。このようなポリマーの例は制約されないが多くの陽イオン性アミノ酸、ポリリジン、ポリアルギニンあるいは同様なものからなるペプチドを含んでいる。ＵＳ特許４，３４６，５３８は比較的高い分子量のｐｏｌｙＩ：Ｃ、分子量１３−３５ｋＤａの範囲のポリＬ−リジンそしてカルボキシメチルセルロース（“ｐｏｌｙＩＣＬＣ”）からなるｐｏｌｙＩＣ複合体；およびそのような組成物を調合そして使用する方法を記述している。ある種の癌、ある種のＨＩＶあるいはエボラのようなウイルス病そしてまた多重硬化症の治療のための治療試薬としてｐｏｌｙＩＣＬＣの使用はまた提案されている（ＵＳ公開 ２００６／０２２３７４２）。
【００４３】
二重鎖ＲＮＡｐｏｌｙＩＣリボ核酸はある実施態様において、逆平行ベースペア立体配置でｐｏｌｙＩオリゴヌクレオチドとｐｏｌｙＣオリゴヌクレオチドからなる。このような二重鎖核酸分子の鎖は水素結合による秩序のある方式で反応する―‘Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ’塩基対としてまた参照される。異なる塩基対はＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対を含む標準的でない水素結合により起きる。ある熱力学、イオン性あるいはｐＨ状況のもとで、三重螺旋は特にリボ核酸で生じる。これらおよび他の別の水素結合あるいは塩基対は技術として知られ、そして、例えば、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ―“生化学の原理”、第３版（Ｎｅｌｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｘ編、Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、ニューヨーク）に見られ、ここに参照として取り入れられる。
【００４４】
“ｐｏｌｙＩ” オリゴヌクレオチドは多くのイノシン、イノシン類似ヌクレオシド、あるいはその組み合わせを含む。イノシン類似ヌクレオシドは、例えば、７−デアザイノシン、２’−Ｏ−メチル−イノシン、７−チア−７，９−ジデアザイノシン、フォルマイシンＢ、８−アザイノシン、９− デアザイノシン、アロプリノールリボシド、８−ブロモ−イノシン、８−クロロイノシンおよび同様のものを含む。
【００４５】
“ｐｏｌｙＣ” オリゴヌクレオチドは多くのシチジン、シチジン類似ヌクレオシド、あるいはその組み合わせを含む。シチジン類似ヌクレオシドは、例えば、５−メチルシチジン、２’−Ｏ−メチル−シチジン、５−（１−プロピニル）シチジンおよび同様のものを含む。
【００４６】
非標準的ヌクレオシドおよび／あるいはインターヌクレオシドリンケージからなる核酸はアジュバントとして使用されるとき、改善された安定容貌をまた提供しそして修正された免疫刺激効果を与え、あるいはここに記述するＨｓｐＥ７組成物の生物的活性を修正する。“標準的” ヌクレオシドはデオキシデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、デオキシウリジン、デオキシシチジン、デオキシイノシン、グアノシン、５−メチルウリジン、ウリジンおよびシチジンのような自然に発生するヌクレオシドを含む。修正された免疫刺激効果は適用でき、生来のあるいは液性の免疫応答の速い応答を証明しそしてより永く続くが、しかし低い即時応答である。
【００４７】
非標準的ヌクレオシドの例は技術として広く知られており、そして、例えば、‘ロックされた核酸’あるいは‘ＬＮＡ’を含む。ＬＮＡはＷＯ９９／１４２２６，ＷＯ００／５６７４６、ＷＯ００／５６７４８、ＷＯ０１／２５２４８、ＷＯ０１／４８１９０、ＷＯ０２／２８８７５、ＷＯ０３／００６４７５、ＷＯ０３／０９５４７、ＷＯ２００４／０８３４３０、ＵＳ６，２６８，４９０、ＵＳ６，７９４，４４９、ＵＳ７，０３４，１３３に記述された２’−４’環状リンケージをもつヌクレオシドである。他の非ＬＮＡ２環ヌクレオシドはまた技術として知られており、例えば：
−付加的Ｃ−３’，Ｃ−５’−エタノブリッジをもつビシクロ［３．３．０］ヌクレオシド；
−付加的Ｃ−１’，Ｃ−６’あるいはＣ−６’，Ｃ−４’メタノブリッジをもつビカルボシクロ［３．１．０］ヌクレオシド
【００４８】
−付加的環が天然のホスホルジエステルリンケージを置換するインターヌクレオシドリンケージの部分である未修正ヌクレオシドで２量体として合成される付加的Ｃ−２’，Ｃ−５’ジオキサレン環を含むビシクロ［３．３．０］および［４．３．０］ヌクレオシド；アミドおよびスルホンアミド型インターヌクレオシドリンケージの部分としてＣ−２’，Ｃ−３’メタノブリッジをもつビシクロ［３．１．０］ヌクレオシドを含む２量体。
【００４９】
−フォマセタルインターヌクレオシドリンケージにより３量体の中央に合体するビシクロ［３．３．０］グルコース由来ヌクレオシド同類体
【００５０】
−２つの５員環および１つの３員環がバックボーンを形成するトリシクロ−ＤＮＡ
【００５１】
−１，５アンヒドロヘキシトール核酸；および
【００５２】
−付加的Ｃ−２’，Ｃ−３’結合した６および５員環をもつ二環［４．３．０］および［３．３．０］ヌクレオシド。
【００５３】
ｄｓＲＮＡに使用される他の非標準ヌクレオシドおよび非標準インターヌクレオシドリンケージ（‘バックボーン’）は、例えば、Ｆｒｅｉｅｒ，１９９７（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：４４２９−４４４３）あるいはＰｒａｓｅｕｔｈ等（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １４８９：１８１−２０６）。
【００５４】
本発明の精製ＨｓｐＥ７はプロセスＬ ＨｓｐＥ７（あるいはプロセスＬ）として参照される。理論を超える望みはなく、一つあるいはそれ以上の組成物がプロセスＬ ＨｓｐＥ７精製の間ＨｓｐＥ７調合から除去され、そして一つあるいはそれ以上の組成物がより低い純度（プロセスＡ）ＨｓｐＥ７調合にアジュバントのような活性を分け与える。しかしながら、ＨｓｐＥ７組成物の臨床的試行および規定の承認に対して、組成物内の未知の組成物のパーセントは最小にする必要がある。
【００５５】
ＨｓｐＥ７の生物学的活性により、それはＨｓｐＥ７による体外あるいは体内の生物学的活性の調整、増加、刺激のいずれかを意味する。生物学的活性はＨｓｐＥ７による体外あるいは体内の生物学的活性の阻害をまた含む。多くのそのような活性はＨｓｐＥ７の生物学的活性を決定する基本として知られそして使用される。制約を考慮されない例として、Ｅ７特異ＣＤ８陽性Ｔリンパ球の誘発はＨｓｐＥ７の生物学的活性を決定するために使用される。この性質を測定するために設計された評価の一つの型（ＥＬＩＳＰＯＴ）は与えられた数の脾臓細胞当りのＩＦＮガンマ産出細胞の数が関心のある化合物あるいは混合物をもつＣ５７Ｂ１／６のハツカネズミの引き続く治療を決定する（実施例２参照）。交互の評価は関心のある化合物あるいは混合物でＴＣ１のハツカネズミを治療しそして一定時間、例えば、４９日の間隔の後、腫瘍発生率のパーセントを決定することによりＨｓｐＥ７の抗腫瘍活性を決定することを含む（実施例２参照）。代わりに、細胞溶解活性の刺激（ＣＴＬ評価）はまた当業者に知られているように使用される。生物学的活性はまた特異な細胞仲介の誘発あるいは免疫原あるいは抗体に対する液性応答を含み、種々な型およびサブ型の特異抗体の産出を含む。
【００５６】
ＨｓｐＥ７の精製から起きる活性の損失はＨｓｐＥ７組成物に対して制限されないでＴＬＲ作用薬のような適当なアジュバントあるいは免疫刺激剤の添加で復活される。ＨｓｐＥ７組成物を設計し直すためにアジュバントはＨｓｐＥ７活性復活におけるこれらの効率に対して試験された。これらのアジュバントはＣｐＧオリゴヌクレオチド、ＰｏｌｙＩ：Ｃ、ＰｏｌｙＩＣＬＣ、ＭＰＬ、ＭＰＬ−ＴＭＤ、イミキミド、粗いＬＰＳ（リポ多糖）、平滑ＬＰＳ、Ｐａｍ３ＣｙｓＳＫ４、抗ＣＤ４０、硫酸バンド、およびフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）を含む。
【００５７】
“アジュバント”あるいは“免疫刺激剤”は免疫原と組み合わされたとき免疫原に対して免疫応答を強化するかあるいは増強する物質あるいは組成物の組み合わせである。免疫応答の強化あるいは増強はここで記述される評価を含む標準評価を使用して決定される。アジュバントあるいは免疫刺激剤は１つあるいは１つ以上の組成物を含む。
【００５８】
“免疫応答”は適応性のある、液性の、生来のそして細胞調整システムを含む免疫システムの前炎症性あるいは抗炎症性応答のいずれかを意味している。用語“調整する”あるいは“調整”あるいは同様なことは選択された変数における増加あるいは減少のいずれかを意味する。
【００５９】
精製ＨｓｐＥ７に対するいくつかの良く知られたアジュバント、例えば、硫酸バンドあるいはフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ；図８、実施例６を参照）は、例えば、制限されないでプロセスＬ ＨｓｐＥ７精製に続いて観察されたＨｓｐＥ７と結びついた生物学的活性の損失を回復しなかった。同様に、粗ＬＰＳ（実施例７、図９）、イミキモド（実施例７、図９）、あるいはＰａｍ３ＣｙｓＳＫ（実施例７、図９）の混合はまたＨｓｐＥ７生物学的活性を増強しなかった。しかしながら、精製ＨｓｐＥ７のＣｐＧオリゴヌクレオチド（例えば、実施例３、図２および３）、ＰｏｌｙＩ：Ｃ（実施例４、図３）、ＰｏｌｙＩＣＬＣ（図５）、モノリン酸リピドＡ（ＭＰＬ；図４）、あるいは抗ＣＤ４０（図９）との混合は高精製ＨｓｐＥ７と結びつく生物学的活性の回復の結果となった。ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ＰｏｌｙＩ：ＣあるいはＰｏｌｙＩＣＬＣの添加はＨｓｐＥ７なしに投与されたとき、この活性を示さなかった。
【００６０】
それ故、本発明は精製ＨｓｐＥ７をＣｐＧオリゴヌクレオチド、ＰｏｌｙＩ：Ｃ、ＰｏｌｙＩＣＬＣ、モノリン酸リピドＡ（ＭＰＬ）、ＭＰＬ−ＴＤＭ、および抗ＣＤ４０を含むグループから選ばれた免疫刺激剤と一緒に混合あるいは共投与することからなる高精製ＨｓｐＥの生物学的活性の増加の方法にまた関係する。望ましくは、免疫刺激剤は約０．１μｇから約２０ｍｇの量、あるいはその間のいずれかの量、例えば、約１μｇから約５０００μｇ／投与の量あるいはその間のいずれかの量、約１０μｇから１０００μｇの量あるいはその間のいずれかの量、あるいは約３０μｇから約１０００μｇの量あるいはその間のいずれかの量で提供される。例えば、約０．１、０．５、１．０、２．０、５．０、１０．０、１５．０、２０．０、２５．０、３０．０、３５．０、４０．０、５０．０、６０．０、７０．０、８０．０、９０．０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、５０００、１００００、２００００μｇの投与量、あるいはその間の量が使用される。同様に、精製ＨｓｐＥ７は約０．１μｇから約２０ｍｇの量、あるいはその間のいずれかの量、例えば、約１μｇから約２０００μｇ／投与量あるいはその間の量、約１０μｇから約１０００μｇの量あるいはその間のいずれかの量、あるいは約３０μｇから約１０００μｇの量あるいはその間のいずれかの量が使用される。例えば、約０．１、０．５、１．０、２．０、５．０、１０．０、１５．０、２０．０、２５．０、３０．０、３５．０、４０．０、５０．０、６０．０、７０．０、８０．０、９０．０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、５０００、１００００、２００００μｇの投与量、あるいはその間のいずれかの量が使用される。
【００６１】
“効果的な量”は希望するあるいは指示された免疫学的あるいは治療効果を生むために効果のある本発明の化合物あるいは組成物の量に関する。哺乳類あるいは被験者内で達成できる投与量の制限のない例は要求により、約０．０３ｍｇ／ｋｇから約３０ｍｇ／ｋｇＨｓｐＥ７、免疫刺激剤、あるいは両者、あるいはその間のいずれかの量である。しかしながら、０．０３ｍｇ／ｋｇより少なく、あるいは３０ｍｇ／ｋｇより多くのＨｓｐＥ７、免疫刺激剤、あるいは両者の投与量はまた使用されそしてまたここで熟慮される。当業者はＨｓｐＥ７、免疫刺激剤、あるいは両者の適当な投与量を決定することができる。
【００６２】
さらに、本発明は精製ＨｓｐＥ７およびＣｐＧ、ＰｏｌｙＩ：Ｃ、あるいはＰｏｌｙＩＣＬＣのようなＴＬＲ３作用薬、ＭＰＬ、およびＣＤ４０からなるグループから選ばれた免疫刺激剤からなる組成物を提供する。望ましくは、上記したように免疫刺激剤は約０．１μｇから約２０ｍｇ／投与量、あるいはその間のいずれかの量で提供する。
【００６３】
本発明はまた精製ＨｓｐＥ７およびＣｐＧ、ＰｏｌｙＩ：Ｃ、あるいはＰｏｌｙＩＣＬＣのようなＴＬＲ３作用薬、ＭＰＬ、およびＣＤ４０からなるグループから選ばれた免疫刺激剤を含む組成物を投与する被験者、動物、患者の腫瘍の増殖を減らす方法に関係する。望ましくは、上記したように、それを必要とする被験者、動物、患者に免疫刺激剤は約０．１μｇから約２０ｍｇ／投与量、あるいはその間のいずれかの量で提供される。
【００６４】
用語“患者”あるいは“被験者”はヒトそして他の霊長類、愛玩動物、制約はなく猫、犬、齧歯類、ドブネズミ、ハツカネズミ、ハムスター、兔、馬、牛、羊、豚、山羊を含む動物園および農園の動物；家禽類；その他を含む哺乳類および他の動物に適用される。
【００６５】
本発明のＨｓｐＥ７組成物はいずれかの適切な薬学的キャリアーあるいは塩で混合される。“薬学的に適切な塩”は本発明の組成物の比較的無毒の、無機および有機酸添加塩、および塩基性添加塩に適用される。これらの塩は組成物の最終分離および精製の間にその位置で調合される。特に、酸性添加塩は適切な有機あるいは無機酸で塩基性でない精製化合物を別々に反応させそしてこのように形成された塩を分離することによって調合される。実施例の酸性添加塩は臭化水素、塩化水素、硫酸塩、酸性硫酸塩、燐酸塩、硝酸塩、酢酸塩、蓚酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリ酸塩、硼酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、燐酸塩、トシラート、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、琥珀酸塩、酒石酸塩、ナフチレート、メシレート、グルコヘプトン酸塩、ラクチオビオナート、スルファミン酸塩、マロン酸塩、サリチル酸塩、プロピオン酸塩、メチレン−ビス−β−ヒドロシルナフタレン酸塩、ゲンチサート、イセチオン酸塩、ジ−p−トルオイルタータレート、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、シクロヘキシルスルファメートおよびキナテスラウリルスルホン酸塩、および同等品を含む。例えば、ここに参照として取り入れられるＳ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅ等、“薬学的塩”、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、６６，１−１９（１９５５）を参照。塩基性添加塩は適切な有機あるいは無機塩基と酸性の形の精製化合物を別々に反応させそしてこのように形成された塩を分離することによって調合される。塩基性添加塩は薬学的に適切な金属およびアミン塩を含んでいる。適切な金属塩はナトリウム、燐、カルシウム、バリウム、亜鉛、マグネシウムおよびアルミニウム塩を含む。ナトリウムおよび燐の塩は望ましい。適切な無機塩基性添加塩は水素化ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化アルミニウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化亜鉛を含む金属塩基から調合される。適合するアミン塩基性塩は安定した塩を形成するために十分な塩基性をもつアミンから調合され、そして望ましくは低い毒性そして医療用のための容認性の理由で医療化学においてしばしば使用されるアミン、例えば、アンモニア、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、リジン、アルギニン、オルニシン、コリン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、ジエタノールアミン、プロカイン、Ｎ−ベンジルフェネチルアミン、ジエチルアミン、ピペラジン、ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）−アミノメタン、水酸化テトラメチルアンモニウム、トリエチルアミン、ジベンジルアミン、エヘンアミン、デヒドロアビエチルアミン、Ｎ−エチルピペリジン、ベンジルアミン、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、エチルアミン、塩基性アミノ酸、例えば、リジンおよびアルギニン、およびジシクロヘキシルアミン、および同等品から調合される。
【００６６】
本発明のＨｓｐＥ７組成物は注射、皮膚貼り付け、あるいは口を含むいずれかの適切なルートにより投与される。このように、一つの観点で、本発明は、免疫刺激剤、例えば、抗ＣＤ４０、あるいはＣｐＧを含むＴＬＲ作用薬、あるいはＰｏｌｙＩ：Ｃ、あるいはＰｏｌｙＩＣＬＣのようなＴＬＲ３作用薬、あるいはＭＰＬ、あるいはそこから薬学的に許認される塩と、１つあるいはそれ以上の薬学的あるいは生理学的に許認される緩衝液、キャリアー、添加剤、希釈剤、および任意に他の治療薬剤と一緒に混合された精製ＨｓｐＥ７を含む組成物からなるヒトおよび獣医医療使用の薬学的組成物を提供する。本発明の組成物は個々に、あるいは２つあるいはそれ以上の組成物からなる混合物として投与されることは注意すべきである。本発明は、伝染病あるいは病理学、あるいは炎病性の免疫応答が有益である病気の状況あるいは状態の予防あるいは治療のための薬剤の調合のために、ＣｐＧを含むＴＬＲ作用薬、あるいはＰｏｌｙＩ：Ｃあるいはそこから薬学的に許認される塩と混合された精製ＨｓｐＥ７を含む組成物の使用をまた包含する。
【００６７】
本発明の組成物は、塩、緩衝薬剤、保存剤、同等のキャリアー、希釈剤、添加剤、分散剤、その他、および任意の他の治療成分の薬学的あるいは生理学的に許認される濃度を含む薬学的あるいは生理学的に許認される溶液中で投与される。本発明の化合物および組成物は当業者に知られた種々の標準の薬学的許認の非経口的調合でこのようにして調合される。
【００６８】
本発明の薬学的組成物は薬学的あるいは生理学的に許認される緩衝液、キャリアー、添加剤、あるいは希釈剤に任意に含まれる今回開示する組成物の効果的量を含む。用語“薬学的あるいは生理学的に許認される緩衝液、キャリアー、添加剤、あるいは希釈剤”はヒトあるいは他の動物への投与に適した１つあるいはそれ以上の同等の固体あるいは液体の充填物、希釈物あるいはカプセルに入れた薬物を意味する。用語“キャリアー”は活性成分が効果を促進するために組み合わされる有機あるいは無機成分、天然あるいは合成品を意味している。薬学的組成物の配合成分は本発明のポリマーとそして互いに望ましい活性組成物の薬学的効果を本質的に弱めなく反応のないような方法で混合されることができる。
【００６９】
非経口的投与に適した組成物は受容者の血液に等調な殺菌した水溶液調合から便利よくなっている。容認される媒体および溶媒の一つは水、リンゲル液、そして等調の塩化ナトリウム溶液である。付け加えると、殺菌した凝固油は溶媒あるいは懸濁培地として便利よく採用される。この目的のために、いずれの穏やかな凝固油も合成モノ−あるいはジグリセリドを含んで採用される。付け加えると、オレイン酸のような油脂性酸は注射可能な調合に効果的である。皮下、筋肉内、腹腔内、静脈等の投与に適したキャリアー調合はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，第１９版，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，（１９９５，参照によりここに組み込まれる）に見いだされる。
【００７０】
組成物は単位投与量あるいは投与単位形式で便利よく提供され、そして薬学の技術としてよく知られたいずれかの方法により提供される。全ての方法は１つあるいはそれ以上の付属の成分を構成するキャリアーと一緒に組成物をもたらす段階を含んでいる。一般的に、組成物は液体キャリアー、綺麗に区分された固形キャリアー、あるいはその両者と一緒に組成物を均一にそして親密にもたらすことにより提供される。本発明の組成物は冷凍乾燥して保存されそして使用前に混合するためのキットとして提供される。
【００７１】
他の供給システムは時間−放出、遅延−放出、あるいは維持−放出供給システムを含んでいる。このようなシステムは被験者および内科医に対して便利性を増す本発明の組成物の繰り返し投与を防止することができる。
【００７２】
薬剤を含む前記ポリマーのマイクロカプセルは、例えば、ＵＳ特許５，０７５，１０９に記述されている。供給システムはまた次のような非ポリマーシステムを含んでいる：コレステロール、コレステロールエステルのようなステロールおよびモノ−、ジ−、およびトリ−グリセリドのような脂肪酸あるいは天然脂肪を含む脂質；水素放出システム；シラスティックシステム；ペプチドベースのシステム；ワックス被覆、従来の結合剤および添加剤を使用する圧縮された錠剤；部分的に一体となった埋め込み物；および同様なもの。
【００７３】
ＨＰＶ感染と関連する慢性ＨＰＶ感染あるいは病理学、あるいは免疫システム刺激から利益を得る病気あるいは障害の予防あるいは治療の必要性のあるヒトあるいは動物に投与する組成物の最適量の決定は、このような組成物からなる治療あるいは薬学的組成物を投与する方法と同様に、全く薬学、医学、そして獣医学の技術の技能内である。ヒトあるいは動物の投与量は、ＨＰＶ感染と関連する慢性ＨＰＶあるいは病理学あるいは治療される病気あるいは障害の性質、患者の状態、体重、一般的な健康、セックス、ダイエット、時間、継続期間、および投与のルート、吸収速度、分配、新陳代謝、および組成物の排出、他の薬剤との組み合わせ、ＨＰＶ感染と関連する慢性ＨＰＶあるいは病理学あるいは治療される病気あるいは障害の重大性、そして治療される病理学あるいは病気の状況の応答性に依存し、そして効果の望ましい水準を得るために容易に最適化される。治療のコースは数日、数週あるいは数月間、あるいは治療効果があるかあるいは病気の状況の容認される縮小あるいは防止が達成されるまで続けられる。最適の投与スケジュールは治療の効果と関連して患者の身体における免疫応答の測定から計算される。通常の技能の人は容易に最適投与量、投与手順、および反復速度を決定できる。最適投与量は免疫調合ポリマー組成物の効能に依存して変化し、そして体外そして体内の動物モデルにおける効果でみられるＥＤ５０ 値を基準として一般的に推算される。ＨＰＶ感染と関連する慢性ＨＰＶあるいは病理学あるいは治療される病気あるいは障害の治療あるいは防止のために提供される組成物、これらの組成物を含む供給媒体、作用薬の効果的な量、および治療処方箋は従来の手段で決定される。例えば、医療あるいは獣医の開業医は、最初の被験者あるいは患者に低い投与量の組成物あるいは被験者あるいは患者に最初のセットで治療を開始し、そして第２のあるいは続く被験者あるいは患者に投与量を増加するか、あるいは第２のあるいは続く被験者あるいは患者に系統的に投与量養生法あるいは第２のあるいは続く被験者あるいは患者のセットを変え、被験者あるいは患者におけるその効果を観察し、そして希望する治療的効果を最大化するための投与量あるいは治療様態を調整する。投与量および治療養生の最適化のさらなる議論はＧｏｏｄｍａｎｎ＆ＧｉｌｍａｎのＢｅｎｅｔ等、（１９９６、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｎｉｎｔｈ Ｅｄｉｔｏｎ、Ｈａｒｄｍａｎ等編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、第１章、３−２７頁、参照によりここに取り入れられる）；あるいはＢａｕｅｒ（Ｌ．Ａ．Ｂａｕｅｒ，１９９９，Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ内、Ａ Ｐｈａｔｈｏｐｈｓｉｏｌｏｇｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４版、ＤｉＰｉｒｏ等編、Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ、Ｓｔａｍｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ、第３章、２１−４３頁；参照によりここに取り入れられる）にみられる。
【００７４】
いくつかの投与のルートが利用できる。選らばれる特殊なモードはどのような組成物が選ばれ、治療される特殊な状態、そして治療効果のために要求される投与量に依存する。一般的に言えば、本発明の方法は、臨床の容認されない反対の効果を起こすことなく免疫応答の効果的水準を生み出すモードを意味する医療的に容認されるいずれかの投与のモードを使用して実施される。投与の望ましいモードは、経口投与はまた採用されるけれども非経口的ルートである。この目的のために、用語“非経口的”は皮下の、内皮の、静脈内の、筋肉内の、あるいは腹腔内の注射、あるいは点滴技術を含んでいる。
【００７５】
本発明の背景で、ここで使用される用語“治療”、“治療法の使用”あるいは“治療の処方計画”は、本発明の組成物の投与の予防の、一時的緩和の、そしての治療法の様態を包含していることを意味し、そしてＨＰＶ感染あるいは治療される他の病気あるいは障害と関連する慢性のＨＰＶ感染のあるいは病理によっておきる病気の状況、状態、兆候、信号、あるいは障害を治療し、あるいはそれと関連する兆候、信号、状態、あるいは障害の進行を防止し、遅らせ、妨害し、あるいは逆転する本特許請求項の組成物の何れかのそして全ての使用を包含する。このように、慢性ＨＰＶ感染と関連する望まない病気の状況、兆候、状態、信号、あるいは障害、あるいはＨＰＶ感染と関連する病理、あるいは身体の免疫反応の刺激から利益を得る他の病気あるいは障害のどのような防止、改善、緩和、逆転あるいは完全な排除も本発明によって包含される。
【００７６】
本発明の目的に対して、用語“治療する”“治療”および癌療法に適用される
同様の用語は広範囲で そして技術において通常受け入れられている広い種々な異なる概念を含んでいる。このように、ここで使用されるこの用語は、制約されずに、進展する病気の時間の延養；腫瘍の縮小；病気の緩和；苦痛の軽減；生活の質の改善；痛み、呼吸困難、食欲の損失および体重の損失、疲労、衰弱、躁鬱状および苦悩、精神錯乱、その他のような症状の改善あるいは調整等；患者の安楽の改善等を含んでいる。別のゴールは全く完全に病気を治すことにある。
【００７７】
本発明のＨｓｐＥ７は非上皮内腫瘍（非新生物）、ＨＰＶ感染細胞、あるいは病気の状況を誘発されたＨＰＶ、例えば制約なしに生殖器のいぼ、過細胞増殖状態、ウイルス感染細胞、慢性的なウイルス感染細胞および同様なものを治療するために使用される。
【００７８】
用語“癌”は多くの定義がある。米国癌協会に従えば、癌は異常な細胞の制御不可能な増殖（および時には広がり）により特徴づけられる病気のグループである。しばしば単独の状態として参照されるが、癌は２００以上の異なる病気からなっている。癌性の増殖はこのような細胞が元気な器官の正常な機能を防ぎ、身体を通して拡散するとき、損傷しつつある必要不可欠なシステムを殺す。本発明の化合物あるいは組成物の効果的な量をその必要において動物あるいは被験者に投与することからなる方法で、動物あるいは被験者に受け入れられる上皮内腫瘍（新生物）を治療するために使用される。
【００７９】
本発明の組成物が治療薬剤として効果的である癌の異なる制限のない例は次を含む：多形性膠芽腫、星状膠細胞腫、乏突起膠細胞腫瘍、上皮細胞腫、脈絡叢乳頭腫、松果体腫瘍、神経細胞性腫瘍、髄芽細胞腫、神経鞘腫、髄膜腫および脳軟膜肉腫を含む中枢神経系の上皮内腫瘍のような腫瘍；基底細胞癌、扁平上皮癌、黒色腫、横紋筋腫、および網膜芽細胞腫を含む眼の上皮内腫瘍；下垂体上皮内腫瘍、甲状腺上皮内腫瘍、副腎臓外皮の上皮内腫瘍、神経内分泌系の上皮内腫瘍、胃のカルチノイド腫瘍内分泌系の上皮内腫瘍および生殖腺の上皮内腫瘍を含む内分泌線の上皮内腫瘍；頭および首の癌、口腔、咽頭、および咽喉の上皮内腫瘍、および菌原生腫を含む頭および首の上皮内腫瘍；大細胞肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、悪性胸膜中皮腫、胸腺上皮腫瘍、および胸郭の原発胚細胞腫瘍を含む胸腔の上皮内腫瘍；食道、胃、肝臓、胆嚢、外分泌膵臓、小腸、虫垂、および腹膜の上皮内腫瘍、結腸および直腸の腺癌および肛門の上皮内腫瘍を含む消化器細管の上皮内腫瘍；腎臓細胞癌、腎盤、尿管、膀胱、尿道、前立腺、ペニス、睾丸の上皮内腫瘍含む泌尿生殖器路の上皮内腫瘍；外陰部および膣、子宮頸部の上皮内腫瘍、子宮体の腺癌、卵巣癌、産婦人科の肉腫および胸の上皮内腫瘍を含む女性性殖器；基底細胞癌、扁平上皮癌、隆起性皮膚線維肉腫、メルケル細胞腫および悪性黒色腫を含む皮膚の上皮内腫瘍；骨肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、原始神経外胚葉腫瘍、および脈管肉腫を含む皮膚の上皮内腫瘍；骨髄異形症候群、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、ＨＴＬＶ−１および５細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、有毛細胞白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、および肥満細胞白血病を含む造血臓器系の上皮内腫瘍；急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、神経芽細胞腫、骨腫瘍、横紋筋肉腫、リンパ腫、腎臓腫瘍を含む子供の上皮内腫瘍。
【００８０】
ＰＣＴ特許出願 ＷＯ ９９／０７８６０は、ＨｓｐＥ７の製造方法に追加して、種々の型のＨＰＶ感染の制約のない議論および慢性ＨＰＶとリンクするかあるいは結びつくことにより起きるいくつかの病理学あるいはＨＰＶ感染と結びつく病理を提供する。本発明の組成物が療法薬剤として有効であるＨＰＶ感染とむすびつく慢性ＨＰＶあるいは病理学の異なる型の他の（制約のない）例は、次のものを含む：子宮頸部上皮内腫瘍（例えば、ＨＰＶ型１６、１８、３１、３３、３５、３９）、ボーエン様丘疹症（例えば、ＨＰＶ型１６、１８、３３、３９）、ブシュケ−レーヴェンシュタイン腫瘍（例えば、ＨＰＶ型６、１１）、肉屋／肉の取扱者のいぼ（例えば、ＨＰＶ型７）、有棘細胞癌（例えば、ＨＰＶ型３８、４１、４８）、疣贅状表皮発育異常症（例えば、ＨＰＶ型１−５、７−９、１０、１２、１４、１５、１７−２０、２３−２５、３６、４７、５０）、角質化棘細胞腫（例えば、ＨＰＶ型７７）、口腔病巣性粘液沈着症（ヘック病）（例えば、ＨＰＶ型１３、３２）、腎臓移植患者のいぼ（例えば、ＨＰＶ型７５−７７）、通常いぼ（尋常性疣贅）、糸状いぼ、扁平いぼ、足底、手掌あるいはモザイクいぼ、爪囲被角いぼ、不応性いぼ、生殖器いぼ、コンジローム、陰部湿疣、陰部いぼ、皮膚パピローマウイルス病、扁平上皮細胞乳頭腫、移行細胞乳頭腫（膀胱乳頭腫）、および同様なもの。
【００８１】
特別の治療養生は、特別な慢性ＨＰＶ感染あるいはＨＰＶ感染と結びつく病理あるいは他の治療される病気あるいは障害、その感度および患者の全体の状態に依存する時間の間続き、そして数日、数週間、数ヶ月、あるいはそれより永く１日に１回あるいは数回、全化合物を含む組成物の投与を含む。治療に続き、患者は彼／彼女の状態の変化そして兆候、信号あるいは障害の状態あるいは病気の状況の緩和について観察される。組成物の投与量は、患者がその時の投与量水準に十分に応答していない場合に増加されるか、あるいは障害の兆候あるいは病気の状況の緩和が観察されるか、あるいは障害あるいは病気の状況が融除されるなら減らされる。
【００８２】
最適の投与スケジュールは本発明の治療効果量の組成物を引き渡すために使用される。本発明の目的のために、ここに開示される組成物に関する用語“治療効果量”あるいは“治療的な効果量”は毒性、焦燥、あるいはアレルギー性の応答のような望ましくない副効果なしに完全に意図した目的を達成するために効果的である組成物の量に関する。個々の患者の必要量は変わるけれども、薬剤組成物の効果的量の最適範囲の決定は当業者内である。ヒト投与量は動物の研究から外挿される（Ａ．Ｓ．Ｋａｔｏｃｓ、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第１９版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．（１９９５）、第３０章、参照によりここに組み込まれる）。通常、当業者により調整される薬学組成物の治療的な効果量を提供するために要求される投与量は、年齢、健康、身体的条件、体重、受容者の病気あるいは障害の型および程度、治療の頻度、同時に存在する治療の性質、そして希望する効果の性質および範囲に依存して変わる。
【００８３】
本発明のいくつかの実施態様において、投与スケジュールは、治療養生として代わりに参照され、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日あるいはもっと多い日数にわたり、ここに記述する組成物の効果的な量の投与からなる。例えば、４日間の投与スケジュールに対して（日数０は最初の投与の日である）投与量は連続した日、あるいは不連続な日、あるいはこれらの組み合わせで投与される。いくつかの実施例では、投与スケジュールは０日目および１日目；０日目および２日目；０日目および３日目；０日目および４日目；０日目、１日目および２日目；０日目、１日目および３日目；０日目、１日目および４日目；０日目、２日目および３日目；０日目、２日目および４日目；０日目、２日目および４日目；０日目、３日目および４日目；および同様の投与を含む。
【００８４】
他の実施態様において、投与スケジュールは、例えば、皮膚の吸収薬を経てあるいは移殖により投与される緩やかな放出調合において連続的で効果的である。
【００８５】
本発明のいくつかの実施態様において、精製ＨｓｐＥ７、免疫刺激剤、および使用のための取扱説明書を含むキットが提供される。免疫刺激剤はＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、ＰｏｌｙＩ：ＣあるいはｐｏｌｙＩＣＩＣのようなＴＬＲ３作用薬、モノリン酸リピドＡ（ＭＰＬ）、ＭＰＬ−トレハロース ６，６’−ジミコレート（ＭＰＬ−ＴＤＭ）、および抗ＣＤ４０を含み、制約なくいずれかのヌクレオシド、インターヌクレオシド結合をもつｐｏｌｙＩＣ核酸およびここに記述する組成物を含む。代わりに、キットは薬局あるいは内科医あるいは他の適当な人によって投与の箇所で単独の投与ユニットに分轄される多重投与調合を提供する。
【００８６】
本発明は分子生物学、微生物学、ウイルス学、ＤＮＡ組み替え技術、溶液中のペプチド合成、固相ペプチド合成、および免疫学の従来技術を使用している。このような手順は、例えば、参照として取り入れられる次の原典に記述されている。
１． Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （１９８９）， ｗｈｏｌｅ ｏｆ ＶｏＩｓ Ｉ， ＩＩ， ａｎｄ ＩＩＩ；
２． Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （Ｍ． Ｊ． Ｇａｉｔ， ｅｄ．， １９８４） ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｇａｉｔ， ｐｐ． １−２２； Ａｔｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ｐｐ． ３５−８１； Ｓｐｒｏａｔ ｅｔ ａｌ．， ｐｐ． ８３− １１５； ａｎｄ Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， ｐｐ． １３５−１５１；
３． Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ： Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｊｏｈｎ Ｒ．Ｗ． Ｍａｓｔｅｒｓ， ｅｄ．， ２０００）， ＩＳＢＮ ０１９９６３７９７０；
４． Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （１９８６） ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， ｗｈｏｌｅ ｏｆ ｔｅｘｔ；
５． Ｊ． Ｆ． Ｒａｍａｌｈｏ Ｏｒｔｉｇａｏ， “Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ” Ｉｎ： Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ Ａｃｃｅｓｓ ｔｏ Ｖｉｒｔｕａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｗｅｂｓｉｔｅ （Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ）；
６． Ｂａｒａｎｙ， Ｇ． ａｎｄ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｒ．Ｂ． （１９７９） ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ （Ｇｒｏｓｓ， Ｅ． ａｎｄ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ． ｅｄｓ．）， ｖｏｌ． ２， ｐｐ．１−２８４， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；
７． Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ， Ｍ． （１９８４） Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ− Ｖｅｒｌａｇ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ； Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ， Ｍ． ＆ Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ， Ａ． （１９８４） Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ− Ｖｅｒｌａｇ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；
８． Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ＶｏＩｓ． １−ＩＶ， Ｄ． Ｍ． Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ． Ｃ． Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ， ｅｄｓ．， １９８６， Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ．
【００８７】
本発明は次の実施例でさらに説明される。
【００８８】
［実施例］
［実施例１：ＨｓｐＥ７調合］
Ｈｓｐ６５−Ｅ７融合（ＨｓｐＥ７）はＷＯ９９／０７８６０に記述されるように得られた（参照としてここに組み込まれる）。ＨｓｐＥ７はＨｓｐ６５遺伝子（ｐＥＴ６５Ｈ）のカルボキシ端末に挿入された完全ＨＰＶ１６Ｅ−コーディング領域からなる融合蛋白質である。ＨｓｐＥ７はプロセスＡ ＨｓｐＥ７に関連し、そして要求によりＮｖｅｎｔａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから利用できる。
【００８９】
利用に先立ち、ＨｓｐＥ７は純度９５％以上に精製される。ＨｓｐＥ７発現のＥ大腸菌の種培養が２５０Ｌの発酵媒体を接種するために使用された。発酵工程の間、イースト抽出物およびグルコースが餌として添加され、そして純酸素が十分な曝気を行うため発酵容器に強く供給された。ＨｓｐＥ７の発現はＩＰＴＧ（イソプロピール−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）の添加によって誘発された。発酵物の内容はそれから−２０℃以下に冷却されそして細胞のペーストは遠心分離によって収集された。細胞ペーストは尿素および亜硫酸分解剤を含む緩衝液に再懸濁された。亜硫酸分解剤はＨｓｐＥ７中のスルフヒドリル基のグループをＳ−スルホシステインに転換した。ＨｓｐＥ７の溶液はＰＥＩ（ポリエチレンイミン）で沈澱することにより精製され、その等電点で製品の沈澱を続けた。ＨｓｐＥ７はそれから一連の陽イオンおよび陰イオンのクロマトグラフィ段階を使用して均一に精製され、そして修飾スルフヒドリルはＤＴＴ（ジチオトレイトール）で希釈された。最終的に、ＨｓｐＥ７はヒスチジン／マニトール緩衝液中に超濾過そして透析濾過され、そして−７０℃で貯蔵された。ＨｓｐＥ７の精製された形式はプロセスＬ ＨｓｐＥ７と称される。
ＨｓｐＥ７の純度はゲル電気泳動法によって決定された。
【００９０】
下記に概要を示すように、高精製プロセスＬ ＨｓｐＥ７はより低純度（プロセスＡ ＨｓｐＥ７）製品と比較したとき、生物学的活性を失うことを観察された。低純度のＨｓｐＥ７製品（プロセスＡ ＨｓｐＥ７）はＷＯ９９／０７８６０に開示された生物学的活性を示した。
【００９１】
［実施例２：ＨｓｐＥ７調合の決定生物学的活性］
［ＩＮＦ−ガンマの脾臓細胞産生の抗原−特異刺激：ＥＬＩＳＰＯＴ評価］
Ｅ７特異ＣＤ８陽性Ｔリンパ球（ＩＦＮ−ガンマ産生細胞）を誘発するＨｓｐＥ７の能力の増加は、次のようにＥＬＩＳＰＯＴによりＥ７ペプチドの存在において決定された（Ａｓａｉ．Ｔ等、２０００、Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７（２）：１４５−１５４）：ハツカネズミはＨｓｐＥ７で、アジュバントがあるあるいはなしで、２００μＬの全量で頸の首筋に皮下で免疫化された。５日から７日後に、ハツカネズミは犠牲にされ、その脾臓は切除され単一細胞懸濁液中で処理された。細胞は抗ハツカネズミＩＦＮガンマ抗体で予め被覆されたＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社の濾過プレート上に完全なＲＰＭＩにプレートにされた。プレートは３７℃で２０時間培養された。細胞は洗浄されそしてＩＦＮガンマスポットがビオチン標識された二次抗ハツカネズミＩＦＮガンマ抗体でプレートの培養により検出された。スポットはＶａｃｔａｓｔａｉｎ社 ＡＢＣ ＥｌｉｔｅキットおよびＡＥＣ基板で可視化された。スポットはＺｅｉｓｓ社自動ＥＬＩＳＰＯＴ計数機で計数された。
【００９２】
［腫瘍縮小評価］
腫瘍縮小は腫瘍細胞ラインＴＣ−１．Ｋからなる評価を使用して決定され、肺上皮腫瘍はＨＰＶ１６Ｅ６およびＥ７癌遺伝子で安定的にトランスフェクトされた。ＴＣ−１．Ｋ細胞は７日後試験試料注射およびその後通常の腫瘍触診によりハツカネズミに移殖された。評価は、Ｃｈｕ Ｎ．Ｒ．等（Ｃｈｕ Ｎ．Ｒ．等、２０００、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２１（２）：２１６―２２５）に基本的に記述されたように、ＴＣ．１Ｋ腫瘍細胞を培養のため播種しそして年齢７−１４週のＣ５７ＢＬ／６ハツカネズミ内に移殖する前に細胞の数を拡大することを含む。腫瘍移植後７日後、腫瘍を帯びたハツカネズミは試験および制御試料で治療された。典型的に１８０のハツカネズミのグループは６の等分のグループに区分され、そして各グループは制御（賦活剤のみ）かあるいは５０、１００、２００、４００あるいは８００μｇのＨｓｐＥ７参照試料で注射される。ハツカネズミは１４、２８そして４９日において腫瘍のため激しく動悸を打った。
【００９３】
［実施例３：ＨｓｐＥ７に対するＴＬＲ９作用薬ＣｐＧの効果］
図１に示すように、プロセスＡ ＨｓｐＥ７の抗腫瘍活性は、プロセスＬ ＨｓｐＥ７の同等の投与量と比較したとき、同じかあるいは減った腫瘍発生率を達成する低い投与量でプロセスＬ ＨｓｐＥ７よりも大きい。この評価のため確立したＴＣ−１腫瘍を帯びたハツカネズミはプロセスＡあるいはプロセスＬ（ｎ＝３０／ｇｒｐ／投与）のいずれかにより製造されたＨｓｐＥ７の等級のある投与量で頸の首筋に皮下注射されそして４９日間腫瘍増殖に従わされた。
【００９４】
Ｅ７特異ＣＤ８陽性Ｔリンパ球を誘発するためにＨｓｐＥ７の活性の増大はＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＴＬＲ９作用薬）の存在で決定された。生来のＣ５７Ｂ１／６ハツカネズミは実施例２に記述されるように、２つの異なる精製プロセス（４００μｇプロセスＡ ＨｓｐＥ７あるいは４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７）によって製造されたＨｓｐＥ７のみか、あるいはＨｓｐＥ７（４００μｇプロセスＡ ＨｓｐＥ７あるいは４００μｇプロセスＬ ４００μｇプロセスＡ ＨｓｐＥ７あるいは４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７のいずれか）プラス３０μｇのＣｐＧ（ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＣＧ ＴＴＣ ＣＴＧ ＡＴＧ ＣＴ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１；ホスホロチオエートバックボーンそしてＺＯＯ ＦＺＥ ＦＯＥ ＺＺＯ ＯＺＥ ＦＺＥ ＯＴと表示されたものからなりＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から得られる）のいずれかで皮下注射された。５日後、脾臓はハツカネズミから切除されそしてＥ７特異脾臓細胞の数が、回収抗体としてＥ７特異クラスＩ ＭＨＣ結合ペプチドＥ７４９―５７（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ；Ｄａｌｔｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、あるいは制御ペプチドＨＢＣＡｇ９３−１００（ＭＧＬＫＦＲＱＬ；Ｄａｌｔｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を使用するＥＬＩＳＰＯＴで測定された。
【００９５】
図２に示される結果は精製ＨｓｐＥ７評価（プロセスＬ ＨｓｐＥ７）がＥ７特異ＣＤ８陽性Ｔリンパ球の最小の誘発を表現すことを示している。プロセスＡ ＨｓｐＥ７はＥ７特異ＣＤ８陽性Ｔリンパ球のより大きい誘発を表現する。しかしながら、プロセスＬ ＨｓｐＥ７およびプロセスＡ ＨｓｐＥ７の両方の誘発はＴＬＲ９作用薬ＣｐＧ（プロセスＡ ＨｓｐＥ７＋ＣｐＧあるいはプロセスＬ ＨｓｐＥ７＋ＣｐＧ）の存在で３から１００倍強調される。
【００９６】
１６６８を含む最適のハツカネズミのクラス７Ｂ型コア配列（ＧＡＣＧＴＴ）でいくつかのＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドはＥＬＩＳＰＯＴ評価およびＴＣ−１腫瘍縮小評価においてＨｓｐＥ７の活性の増大に高い活性があることが示された（データは示されていない）。同様に、ＣｐＧクラスＣ型オリゴヌクレオチド（２３９５）は高い活性があることが見出された。しかしながら、クラスＡ型ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドはＥＬＩＳＰＯＴ評価においてＨｓｐＥ７の活性の増大に大変低い活性であることが見出された（Ｖｏｌｌｍｅｒ Ｊ．等、２００４ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４：２５１−２６２）。
【００９７】
これらのデータは精製ＨｓｐＥ７が生物学的活性があり、そしてＨｓｐＥ７の生物学的活性（プロセスＡあるいはプロセスＬ ＨｓｐＥ７のいずれか）が免疫刺激剤ＣｐＧを添加することにより増加することを示している。
【００９８】
［ＨｓｐＥ７に添加ＴＬＲ作用薬の効果］
Ｅ７特異ＣＤ８陽性Ｔリンパ球のＨｓｐＥ７（プロセスＬ ＨｓｐＥ７）誘発を増大するための代わりのＴＬＲ作用薬の能力はＴＬＲ３作用薬ＰｏｌｙＩ：Ｃ（Ｓｉｇｍａ社 Ｃａｔ＃１９１３）、およびＴＬＲ２作用薬ＰＡＭ３ＣｙｓＳＫ４（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社 Ｃａｔ＃ＴＬＲ１−ｐｍｓ）、およびＴＬＲ９作用薬（実施例３参照）を使用して決定された。
【００９９】
ハツカネズミはＨｓｐＥ７プラスＴＬＲ作用薬の混合物で皮下に共注射された。この研究のためにプロセスＬ ＨｓｐＥ７の５０μｇが１０μｇＣｐＧ、２０μｇＰＡＭ３ＣｙｓＳＫ４あるいは１００μｇＰｏｌｙＩ：Ｃと一緒に共注射された。５日間の後、脾臓はハツカネズミより切除されそしてＥ７特異脾臓細胞は回収抗原としてＥ７特異クラスＩ ＭＨＣ結合Ｅ７４９−５７、あるいは制御ペプチドＨＢＣＡｇ９３−１００を使用するＥＬＩＳＰＯＴによって（実施例３の概要のように）測定された。結果は図３に示される。
【０１００】
図３にみられるように、ＨｓｐＥ７そしてＣｐＧの共注射はＥ７特異ＣＤ８陽性Ｔリンパ球の顕著な増大の結果となった。同様な増加はＴＬＲ作用薬ＰｏｌｙＩ：Ｃの共投与でまた観察された。しかしながら、ＴＬＲ２作用薬Ｐａｍ３ＣｙｓＳＫ４単独はＩＦＮガンマ産出細胞の無視できる増大の結果になった。
【０１０１】
これらの結果はＣｐＧおよびＰｏｌｙＩ：Ｃが、しかしＰａｍ３ＣｙｓＳＫ４は違うが、精製ＨｓｐＥ７（プロセスＬ ＨｓｐＥ７）の増加に効果があり、そして全てのアジュバントは精製ＨｓｐＥ７の生物学的活性の増大に効果がないことを示している。さらなる実験（図４および５）は精製ＨｓｐＥ７とＰｏｌｙＩＣＬＣ（Ｏｎｃｏｖｉｒ社、３２０３ Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ａｖｅ ＮＷ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ）あるいはＭＰＬ−トレハロース６，６’−ジミコレート（ＭＰＬ−ＴＤＭ；Ｒｉｂｉ ＩｍｍｉｎｏＣｈｅｍ Ｒｅｓｒａｒｃｈ Ｉｎｃ．から；またＯｓｉｏ Ｒ．等、Ｍｉｃｒｏｂ Ｐａｔｈｏｇ．２００５ Ｊｕｌ−Ａｕｇ；３９（１−２）：３５−４３をまた参照）との混合が精製ＨｓｐＥ７（これは９５％純度よりも大きい）の免疫学的活性の増大に効果がまたあったことを示している。図５において、ＨｓｐＥ７の免疫学的活性の増大は０．１μｇのＰｏｌｙＩＣＬＣから１００μｇのＰｏｌｙＩＣＬＣで観察された活性の増大で免疫刺激剤の１０００倍量を越して検出されたことが示されている。
【０１０２】
［実施例５：ＨｓｐＥ７の抗腫瘍活性］
抗腫瘍活性への精製ＨｓｐＥ７調合の効果は実施例３に概要を示す方法を使用して試験された。データは精製ＨｓｐＥ７とＣｐＧあるいはＰｏｌｙＩ：Ｃの組み合わせは精製ＨｓｐＥ７（プロセスＬ ＨｓｐＥ７）単独に比較して抗腫瘍効果を顕著に増加することを示している。
【０１０３】
ハツカネズミは６×１０４ＴＣ−１腫瘍細胞で横腹に注射された。７日目に、確立したＴＣ−１腫瘍を帯びたハツカネズミは希釈剤、精製ＨｓｐＥ７単独（実施例１と比較；プロセスＬ；９５％純度以下）あるいはＣｐＧ（ｎ＝３０／ｇｒｐ）、あるいはＰｏｌｙＩ：Ｃ（ｎ＝２０／ｇｒｐ；図７）と混合された精製ＨｓｐＥ７の等級のある投与量で頸の首筋に皮下注射された。ハツカネズミはさらに４２日間腫瘍の増殖に従がわされた。腫瘍移殖４９日後の腫瘍のないハツカネズミは腫瘍がないと考えられた。希釈剤のみで注射されたハツカネズミの１００％は４９日目に腫瘍をもっていた。以前の研究はＣｐｇ単独、あるいはＰｏｌｙＩ：Ｃ単独は腫瘍増殖に対して効果をもたないことを示している（データは示されていない）。
【０１０４】
ＨｓｐＥ７のＣｐＧとの共投与に対する結果は図６に示され、そしてＨｓｐＥ７のＰｏｌｙＩ：Ｃとの共投与に対する結果は図７に示される。
【０１０５】
図６を参照して、９５％以下の純度のＨｓｐＥ７の投与は、５０から８００μｇの投与量範囲（ＨｓｐＥ７および平均ＨｓｐＥ７歴史的）以上で、高い（８００μｇ）ＨｓｐＥ７（“歴史的”）で観察される約１５％の腫瘍発生率で減少した。しかしながら、精製ＨｓｐＥ７のＣｐＧとの共注射は約２５から約２００μｇＨｓｐＥ７の投与量で５％より低い腫瘍発生率で腫瘍発生率を劇的に低下した。４００μｇのプロセスＢ ＨｓｐＥ７で治療されたハツカネズミのおおよそ２７％は、歴史的データから示されるように４９日で腫瘍をもった。しかしながら、少なくとも３μｇのＣｐＧと混合された２５μｇのプロセスＬ ＨｓｐＥ７の少量で注射されたハツカネズミは完全な腫瘍排除をした。
【０１０６】
図７を参照して、精製ＨｓｐＥ７（９５％の純度以上；プロセスＬ ＨｓｐＥ７）の投与は、８００μｇ（ＨｓｐＥ７）の投与量範囲以上で、高い（８００μｇ）ＨｓｐＥ７で観察される約５０％の腫瘍発生率で腫瘍活性を減らすことにおいて９５％純度のＨｓｐＥ７と同様な能力はなかったことがみられる。しかしながら、精製ＨｓｐＥ７と１００μｇＰｏｌｙＩ：Ｃとの共注射は５％腫瘍発生率より低い結果である約２００μｇＨｓｐＥ７の投与量で腫瘍発生率において劇的な減少となった。
【０１０７】
これらのデータは、精製ＨｓｐＥ７がＣｐＧのようなＴＬＲ９作用薬、あるいはＴＬＲ３作用薬ＰｏｌｙＩ：Ｃと投与されたとき約５から約８０倍に増加される抗腫瘍活性を示す。
【０１０８】
［実施例６：ＨｓｐＥ７活性への伝統的アジュバントの効果］
Ｅ７特異ＣＤ８陽性Ｔリンパ球の精製ＨｓｐＥ７誘発を増大するため硫酸バンドあるいはフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）のような伝統的アジュバントの能力が決定された。
【０１０９】
ハツカネズミは精製ＨｓｐＥ７（４００μｇ）プロセスＬ ＨｓｐＥ７；プロセスＬで皮下注射されるか、硫酸バンド（Ｐｉｅｒｃｅ社）と１：１で混合された、あるいはＩＦＡ（Ｂａｃｔｏ社）と１：１で混合された３０μｇＣｐＧと共に、あるいは硫酸バンド＋３０μｇＣｐＧと共に、あるいはＩＦＡ＋３０μｇＣｐＧと共に精製ＨｓｐＥ７と共注射された。５日後、脾臓はハツカネズミより除去されそしてＥ７特異脾臓細胞は、回収抗体としてＥ７特異クラスＩ ＭＨＣ結合ペプチドＥ７（４９−５７）（１６．Ｅ７．４９−５７．Ｄｂ）、あるいは制御ペプチドＨＢＣＡｇ（９３−１００）を使用するＥＬＩＳＰＯＴで測定された。結果は図８に示される。
【０１１０】
実施例３および４に提供された結果と一致して精製ＨｓｐＥ７（プロセスＬＨｓｐＥ７）単独の注射は脾臓細胞によるＩＦＮガンマの産出を増大しなかったが、しかしＨｓｐＥ７とＣｐＧ（プロセスＬ ＨｓｐＥ７＋ＣｐＧ）の共注射はＥ７特異クラスＣＤ陽性リンパ球の顕著な（１０倍以上）増大となった（図８）。しかしながら、精製ＨｓｐＥ７とＩＦＡ（プロセスＬ ＨｓｐＥ７＋ＩＦＡ）と、あるいは硫酸バンド（プロセスＬ ＨｓｐＥ７＋硫酸バンド）との共注射はＥ７特異Ｔリンパ球の刺激の評価可能な増大にはならず、精製ＨｓｐＥ７単独の投与の効果と釣り合った。
【０１１１】
精製ＨｓｐＥ７とＣｐＧの共投与および硫酸バンド（プロセスＬ ＨｓｐＥ７＋硫酸バンド＋ＣｐＧ）あるいはＩＦＡ（プロセスＬ ＨｓｐＥ７＋ＩＦＡ＋ＣｐＧ）のいずれかとの共投与は、ＨｓｐＥ７とＣｐＧ（プロセスＬ ＨｓｐＥ７＋ＣｐＧ）の共注射で観察された増大と同様のＥ７特異Ｔリンパ球の刺激の増大となった。このデータは、硫酸バンドあるいはＩＦＡが存在しているかあるいはしていないにかかわらず、ＨｓｐＥ７の活性の増大と同様な効果をもっているため、ＩＦＡおよび硫酸バンドがＨｓｐＥ７を阻止あるいは刺激にかかわらず中性であることを示している。
【０１１２】
これらのデータは、Ｅ７特異ＣＤ８陽性Ｔリンパ球が精製ＨｓｐＥ７と良く知られたアジュバントの硫酸バンドあるいはフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）のいずれかとの混合によって増大されないことを示している。これらの結果は、硫酸バンドあるいはフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）を含む全てのアジュバントが精製ＨｓｐＥ７の生物学的活性の増大に効果があるとは言えないことをさらに示している。
【０１１３】
［実施例７：ＨｓｐＥ７活性への添加ＴＬＲ作用薬の効果］
この実施例において、Ｅ７特異ＣＤ陽性Ｔリンパ球の精製ＨｓｐＥ７誘発を増大するために、イミキモド、ＬＰＳ、Ｐａｍ３ＣｙｓＳＫ４、あるいはＣＤ４０の効果が決定された。
【０１１４】
ハツカネズミは１００μｇイミキモド（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社 ＃ＴＬＲＬ−ＩＭＱ）、３０μｇＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ社）、２５μｇＰａｍ３ＣｙｓＳＫ４（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社 Ｃａｔ＃ＴＬＲ１−ｐｍｓ）、２５μｇ抗ＣＤ４０（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ社；クローン番号 １Ｃ１０）、あるいは３０μｇＣｐＧと精製ＨｓｐＥ７混合物（４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７；プロセスＬ）あるいは精製ＨｓｐＥ７（４００μｇ）単独と一緒に皮下注射された。５日後、脾臓はハツカネズミより除去されそしてＥ７特異脾臓細胞の数は、ペプチドＥ７４９−５７結合のＥ７特異クラスＩ ＭＨＣを使用するＥＬＩＳＰＯＴによって測定された。結果は図９に示される。
【０１１５】
精製ＨｓｐＥ７とイミキモド（ＴＬＲ７作用薬）、ＰＡＭ３ＣｙｓＳＫ４（ＴＬＲ２作用薬）あるいはＬＰＳ（ＴＬＲ４作用薬）の共投与はＥ７特異ＣＤ陽性Ｔリンパ球を誘発するために精製ＨｓｐＥ７の能力を毎週さえ増大した（図９）。しかしながら、Ｅ７特異ＣＤ陽性Ｔリンパ球の生成における刺激はＨｓｐＥ７に抗ＣＤ４０あるいはＣｐＧの添加によって観察された。
【０１１６】
これらの結果は、ＩＦＮガンマ分泌細胞の数の過度の増加がイミキモド（ＴＬＲ７作用薬）、ＰＡＭ３ＣｙｓＳＫ４（ＴＬＲ２作用薬）およびＬＰＳ（ＴＬＲ４作用薬）をＨｓｐＥ７に添加することによってのみ観察されるので、Ｅ７特異ＣＤ陽性Ｔリンパ球の生成の増大に効果があるとは言えないことをさらに示している。
【０１１７】
［実施例８：毎日の注射計画］
ＨｓｐＥ７およびｐｏｌｙＩＣＬＣはハツカネズミのＣＤ８＋Ｔ細胞応答を引き出すための毎日の注射計画の有用性を評価するために使用された。Ｃ５７Ｂ１／６ハツカネズミ（グループ当り２）は毎日、１日に１回最大４日間まで、ＨｓｐＥ７（１００μｇ）とｐｏｌｙＩＣＬＣ（１０μｇ）で免疫化された。最初の抗体発現の７日後、全ての動物は安楽死されそしてこれらの脾臓細胞は分析のため取得された。ＩＦＭガンマＥＬＩＳＰＯＴが１６Ｅ７．４９−５７．Ｄｂペプチドで刺激に対するクラス１制限ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を評価するため使用された。
【０１１８】
ＨｓｐＥ７＋ｐｏｌｙＩＣＬＣの多重注射をされたグループは単一注射のグループと比較して応答の頻度において適度な増加を発揮した。
【０１１９】
毎日の注射の数の増加は応答の頻度の増加に相関する。毎日の注射の最大の回数を受けたグループは応答の頻度において最大の増加を示した（図１０）。
【０１２０】
毎日の注射戦略の使用は、他のＣｏＶａｌＴＭ抗体と組み合わせてあるいは非ＣｏＶａｌＴＭ抗体と組み合わせてｐｏｌｙＩＣＬＣを使用して増加したＣＤ８＋Ｔ細胞応答を引き出す有用性を提供する。付け加えて、この戦略は毎週あるいは２週間間隔で再挑戦に対する次の免疫応答を押し上げるために増加する能力をもっているより大きいＣＤ８＋記憶プールとなる。
【０１２１】
［実施例９： ＨｓｐＥ７プラスｐｏｌｙＩＣＬＣで免疫化への液性応答］
ｐｏｌｙ−ＩＣＬＣは抗体に対して細胞および液性免疫応答の両方の増大を示した。液性免疫性へのＨｓｐＥ７プラスｐｏｌｙＩＣＬＣで共免疫化の効果を研究するために、Ｃ５７Ｂ１／６雌のハツカネズミのグループ（ｎ＝５／グループ）が毎月２回の間隔（１日、２８日）で免疫化された。ハツカネズミのグループは緩衝液、５００μｇＨｓｐＥ７、１２．５μｇＰｏｌｙ−ＩＣＬＣ、５００μｇＨｓｐＥ７＋１．２５Ｐｏｌｙ−ＩＣＬＣ、５００μｇＨｓｐＥ７＋１２．５μｇＰｏｌｙ−ＩＣＬＣあるいは５００μｇＨｓｐＥ７＋１２５μｇＰｏｌｙ−ＩＣＬＣで免疫化された。血液試料が投与に先立つ７日（７日が基準日）そして２１日、４９日、７７日に血清抗体の分析のために採取された。個々のハツカネズミからの血清は標準ＥＬＩＳＡによりＥ７およびＨｓｐＥ７に対する抗体（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ２ｃ）の存在に対して試験された。手短に言えば、９６のウエルプレートがＥ７あるいはＨｓｐＥ７で一晩被覆され、１．５％ＢＳＡ溶液で洗浄されそしてブロックされた。血清はＢＳＡ溶液中の血清の５０に１の希釈で開始する２倍の連続的希釈で個々のウエルに添加された。洗浄に続いて、ＨｓｐＥ７（図１１Ｂ、Ｄ、Ｆ）あるいはＥ７（図１１Ａ、Ｃ、Ｅ）抗原に対して結合したＩｇＧ１（図１１Ａ、Ｂ）、ＩｇＧ２ｂ（図１１Ｃ、Ｄ）あるいはＩｇＧ２ｃ（図１１Ｅ、Ｆ）抗体が適切なイムノグロビンアイソタイプに対するビオチン共役抗体で培養することにより検出された。プレートはそれから洗浄されそしてストレプトアビジン共役西洋ワサビペルオキシターゼで培養された。色の発現はテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基板を使用して行われそして着色した成果物は自動ＥＬＩＳＡプレート読取器により４５０ｎｍで読み取られた。図１１のデータは評価プレートのバックグラウンド（０．２ＯＤユニット限界）よりも大きい吸収率を与えた血清の最も高い希釈として表現されている。
【０１２２】
ＨｓｐＥ７単独での免疫化は、単独の注射に従って現れる抗ＨｓｐＥ７応答でＨｓｐＥ７およびＥ７の両方に対して顕著な抗体応答を産出し、一方、抗Ｅ７応答は単独の注射に従って弱くそして２つの免疫化に従ってさらに完全に発現した。両方の場合において、産出した抗体のアイソタイプは顕著にＩｇＧ１で（図１１Ａ、Ｂ）、Ｔｈ２シフト液性応答を示している。Ｐｏｌｙ−ＩＣＬＣのみでの免疫化はＥ７あるいはＨｓｐＥ７のいずれにも抗体応答を産出しなかった。ＨｓｐＥ７プラスＰｏｌｙ−ＩＣＬＣでの免疫化はより強くそしてさらに速く抗体応答発現になった。これは、Ｐｏｌｙ−ＩＣＬＣがＨｓｐＥ７で共免疫化されたとき免疫応答が単独の注射に従って不可能であるＥ７の場合に最も顕著であった。そこには顕著なより大きいＴｈ１液性応答があり、産出されたＩｇＧ２ｂ＆ｃ（図１Ｃ−Ｆ）抗体の増加した規模になった。この応答はＰｏｌｙ−ＩＣＬＣの高い投与量でさらに特徴づけられるような投薬量依存性であった。ＨｓｐＥ７およびＰｏｌｙ−ＩＣＬＣが共注射されるとき、免疫応答の増加したＴｈ−１のシフトはＥＬＩＳＰＯＴにより取得されたＣＤ８陽性Ｔリンパ球を産出するＩＦＮガンマの増加した大きさと一致する。
【０１２３】
［実施例１０：ＰｏｌｙＩＣＬＣとＨｓｐＥ７の投与量範囲］
ＨｓｐＥ７と組み合わせで共供給されたときＴＬＲ３作用薬がＥ７特異ＣＤ８Ｔ細胞のクロスプライミングを促進することができる投与量の範囲は検討された。図１２に示すように、我々は、ＨｓｐＥ７プラスＴＬＲ３作用薬プラスｐｏｌｙＩＣＬＣでハツカネズミの免疫化がＩＦＮガンマＥＬＩＳＰＯＴにより測定されたようにＥ７４９−５７特異Ｔ細胞引き出しに高い効果があったことを観察した。引き出されたＥ７４９−５７特異Ｔ細胞の数は使用したｐｏｌｙＩＣＬＣアジュバントの投与量に依存したが、しかしながら大変低い投与量ですら（０．１μｇｐｏｌｙＩＣＬＣ）ＨｓｐＥ７のクロスプライミングを増大することができた。
【０１２４】
［実施例１１：ＨｓｐＥ７プラスｐｏｌｙＩＣＬＣの連続する日の投与で大きく確立した腫瘍の縮小］
Ｅ７発現ＴＣ−１腫瘍細胞ラインはＥ７直接接種戦略の効果を評価するために広く使用される攻撃的で速い増殖腫瘍モデルである。通常、ハツカネズミはＴＣ−１腫瘍細胞ラインの１０５から１０６細胞の間で移殖されそして腫瘍が触診可能でも７から１４日後、関心のある薬剤で治療される。この腫瘍モデルにおいて、腫瘍負担が抗しがたくなる前に、腫瘍が腫瘍に打ち勝つことができないよりも速く増殖するため、抗原−特異Ｔ細胞のクローン拡大は免疫学的介入が最早有用でないとき以降の治療窓である。
【０１２５】
これらの実験に使用されたＴＣ−１腫瘍モデルシステムはさらに進んだ腫瘍に対して開発を許容した。図１３に示すように、従来の７から１４日よりもむしろＴＣ−１腫瘍は治療前２８日間体内で増殖を許容された。この時点で平均腫瘍寸法において大きい範囲であったけれども、全ての動物は触診可能な腫瘍をもちそしていくつかの動物は２０００ｍｍ３を越す容積の腫瘍をもった。注目すべきことに、ＨｓｐＥ７プラスｐｏｌｙＩＣＬＣで続けて４日連続免疫化を受けたハツカネズミは４日連続投与免疫養生を開始の通常１週間内に大変大きく確立した腫瘍を縮小し始めた。腫瘍容積は治療期間の間毎日測定されそしてその後２から３日毎に測定された。腫瘍は電子デジタルキャリパー（Ｆｏｗｌｅｒ Ｓｙｌｖａｃ社 Ｕｌｔｒａ−Ｃａｌ Ｍａｒｋ III）を使用して測定されそして幅の二乗×長さ×０．５で計算された。腫瘍は大多数（９の７）のハツカネズミにおいて治療に続いて１７日間縮小を続けた。再現する腫瘍を示すハツカネズミでは消えた変異体のみを現れ、Ｅ７４９―５７エピトープは最早発現しなかった（データは示されない）。緩衝液のみ、ＨｓｐＥ７蛋白質のみ、あるいはｐｏｌｙＩＣＬＣアジュバントのみ４日連続投与を受けたハツカネズミはこれらの大きな腫瘍の縮小を示さなかった。
【０１２６】
［実施例１２：ＣＤ８応答の拡大相の間の繰り返し免疫化の推進効果］
ハツカネズミがＨｓｐＥ７プラスｐｏｌｙＩＣＬＣで１、２、３あるいは４連続日間免疫化されたとき、引き出されたＥ７４９―５７特異Ｔ細胞の水準は引き続く各日の免疫化の後、劇的な増加を受けた（図１５Ａ）。１００μｇＨｓｐＥ７プラス１０μｇｐｏｌｙＩＣＬＣで４連続日の免疫化後、Ｅ７４９―５７で刺激応答において体外で直接ＩＦＭガンマを産生する細胞の数は１０６脾臓細胞当り１０，０００に達した。事実、正確なＩＦＮガンマＥＬＩＳＰＯＴ定量に対して、免疫動物からの脾臓細胞は自動化ＥＬＩＳＰＯＴ読取器により‘計数可能’な数に減らすためにスポットに対して生来の動物から１：１６脾臓細胞で希釈されねばならなかった。これは ＨｓｐＥ７プラスｐｏｌｙＩＣＬＣの単独の投与量を受ける動物で観察される抗原特異細胞の数のおおよそ１０倍である。最も驚くことは抗原特異細胞の大変高い数は最終の免疫化の３日以内に到達されたことである（ハツカネズミの全てのグループは最初の免疫化後７日で分析された）。４連続免疫化は抗原の量の追加的増加を単には示していない。ハツカネズミは、単独の免疫化において抗原／アジュバント提供量の４倍を含む単独免疫化を与えられたハツカネズミがＥ７４９―５７特異Ｔ細胞数において増加するがしかし４連続免疫化を受けているハツカネズミにおいて観察されるＥ７４９―５７特異Ｔ細胞数よりずっと低いように曝された（図１５Ａ）。Ｅ７４９―５７特異Ｔ細胞はまたＨ−２Ｄｂ／Ｅ７４９―５７五量体を使用するフローサイトメトリーにより容易に観察できた（図１５Ｂ）。ＨｓｐＥ７プラスｐｏｌｙＩＣＬＣで４日連続免疫化の後、いくつかの動物のＥ７４９―５７特異Ｔ細胞の数はＣＤ８＋脾臓細胞の全数の２．９％の高さに到達した。ＭＨＣクラスＩ五量体薬剤でＥ７特異Ｔ細胞のフローサイトメトリー定量はいくぶんＥＬＩＳＰＯＴと比較して抗原−特異細胞の数を低く評価したが、しかしながら特にフローサイトメトリー分析は４連続免疫化の最後の後に３日間のみ実施されるため、これは抗原−特異Ｔ細胞の表面ＴＣＲの下方調整の反映のようである。事実、図５Ｂに示されるフローサイトメトリーデータの厳密な検査は、そこには生来のハツカネズミに比較された４日連続免疫化を受けているハツカネズミにおいてＨ−２Ｄｂ／Ｅ７４９―５７五量体−陰性であるがしかしＣＤ４４活性化マーカーを発現するＣＤ８＋の高い数であることを裏づける。これらの活性化したフェノタイプをもつＣＤ８＋細胞はこれらの生体内活性化状況の結果としてこれらの表面ＴＣＲを下方に制御する抗原−特異細胞に良く一致する。さらに、我々は、多重連続日の免疫化が次の免疫応答の間に顕著な影響力をもつかどうか評価するために免疫応答の縮小相を分析した。図１５Ｃに示すように、７日目の後免疫化で観察されたピークの免疫応答における大きな差異にかかわらず、Ｅ７特異ＣＤ８＋細胞数は１日目から４日目の連続する免疫化の数と関係なく全てのハツカネズミにおいて１３日目の後免疫化によって顕著な縮小を受けた。しかしながら、Ｅ７特異ＣＤ８＋細胞は１３日目の後免疫化でＥＬＩＳＰＯＴによってなお容易に検出できたことおよびさらに重要なことに、初生応答のピークにおける高い抗原−特異Ｔ細胞数は１３日目に観察されたＥ７特異ＣＤ８＋細胞の残りの数と相関したことは注目すべきである。
【０１２７】
応答の拡大相内であるがしかし次の初生のＣＤ８Ｔ細胞応答の増強に関して第１と第２注射の間の間隔を変化して与えられる２回の注射の効果が研究された。脾臓は次の応答の動力学を調査する研究の間、変化する間隔で採取された。ＨｓｐＥ７プラスｐｏｌｙＩＣＬＣの単独注射をされたハツカネズミは免疫化の後５日で容易に検出できそして免疫化後７日目に後でピークとなる応答をみせた（図１４Ａ）。この応答は９日までに衰えそして１１日目までに低く（しかし安定）そして容易に検出できる水準まで衰えた。対照的に、０日にＨｓｐＥ７プラスｐｏｌｙＩＣＬＣの初生の免疫化そしてそれから２日目に第２回の同一の免疫化を与えられたハツカネズミは単独の免疫化を受けているハツカネズミに引き出されるよりももっと強い応答をみせた。単独の免疫化を受けているハツカネズミで観察されたように、ＣＤ８Ｔ細胞応答は７日目に最大であったがしかし抗体−特異細胞の顕著な高い全体の数に到達した。さらに、抗体−特異細胞の数は９日目までに減ったけれども、この時点で存在する抗体−特異細胞の全体の数は単独の免疫化を受けているハツカネズミで観察されたよりも顕著に高く保たれた。第２回の免疫化が初生免疫化後４日目に遅らされたとき、効果はもっと著しかった。この場合において、抗体−特異Ｔ細胞の数は７日を通して上昇を続けそして９日目まで最大に達せず、その時抗体−特異Ｔ細胞の頻度は単独免疫化後観察された最大数のおおよそ４倍であった。
【０１２８】
ｐｏｌｙＩＣＬＣの３回の連続した単独投与に続くＨｓｐＥ７プラスｐｏｌｙＩＣＬＣの単独投与は、ＨｓｐＥ７プラスｐｏｌｙＩＣＬＣの単独投与を受けているハツカネズミに比べてＥ７特異ＣＤ８＋細胞の数に顕著な増加を引き出さなかった（図１４Ｂ）。この結果は連続した日々の免疫化を受けているハツカネズミに引き出されたＥ７特異ＣＤ８＋細胞の劇的な拡大は単にアジュバントの連続的存在の間接的影響ではなく特異抗体の存在に依存した。
【０１２９】
全ての例示は参照によってここに組み入れられる。
【０１３０】
本発明は１つあるいはそれ以上の実施態様に関連して記述されている。しかしながら、多くの変形および修正が特許請求項で定義される本発明の範囲を逸脱することなくなされることは当業者には明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】種々のＨｓｐＥ７調合剤の抗腫瘍活性を示す。
【図２】ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ＴＬＲ９作用薬）の存在においてＥ７特異ＣＤ８陽性Ｔリンパ球を誘発するためのＨｓｐＥ７の能力の増加を示す。
【図３】プロセスＬ ＨｓｐＥ７（精製ＨｓｐＥ７）のＰｏｌｙＩ：Ｃ（ＴＲＬ３作用薬）あるいはＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＴＬＲ９作用薬）でしかしＰＡＭ３ＣｙｓＳＫ４（ＴＬＲ２作用薬）ではないものを共注射することによりＥ７特異ＣＤ８陽性Ｔリンパ球を誘発するためのＨｓｐＥ７の能力の増加を示す。
【図４】モノリン酸リピドＡ（ＭＰＬ；ＴＬＲ４作用薬）の存在でＥ７特異ＣＤ８陽性Ｔリンパ球を誘発するためにプロセスＬ ＨｓｐＥ７の能力の増加を示す。
【図５】Ｐｏｌｙ ＩＣＬＣ（ＴＬＲ３作用薬）の存在でＥ７特異ＣＤ８陽性Ｔリンパ球を誘発するためにプロセスＬ ＨｓｐＥ７の能力の増加を示す。
【図６】腫瘍発生率におけるプロセスＬ ＨｓｐＥ７あるいはプロセスＡ ＨｓｐＥ７の効果を示す。
【図７】ＰｏｌｙＩ：ＣとプロセスＬ ＨｓｐＥ７（精製ＨｓｐＥ７）を組み合わせることによりプロセスＬ ＨｓｐＥ７の抗腫瘍活性の増加を示す。
【図８】Ｅ７特異ＣＤ８陽性Ｔリンパ球の誘発において精製ＨｓｐＥ７（プロセスＬ ＨｓｐＥ７）で混合されたアジュバント硫酸バンドあるいはフロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ）の効果を示す。
【図９】種々のＴＬＲ作用薬あるいは作用薬の抗ＣＤ抗体の存在で共投与されたときＥ７特異ＣＤ８陽性Ｔリンパ球を誘発するためにＨｓｐＥ７の能力の比較を示す。
【図１０】ＩＦＭガンマＥＬＩＳＰＯＴにより測定されるようにクラスＩ制限ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を引き出す能力への日々の主要な押し上げ戦略の効果を示す。
【図１１Ａ】液性免疫へのＨｓｐＥ７プラスＰｏｌｙ−ＩＣＬＣの共免疫性化の効果を示す。
【図１１Ｂ】液性免疫へのＨｓｐＥ７プラスＰｏｌｙ−ＩＣＬＣの共免疫性化の効果を示す。
【図１１Ｃ】液性免疫へのＨｓｐＥ７プラスＰｏｌｙ−ＩＣＬＣの共免疫性化の効果を示す。
【図１１Ｄ】液性免疫へのＨｓｐＥ７プラスＰｏｌｙ−ＩＣＬＣの共免疫性化の効果を示す。
【図１１Ｅ】液性免疫へのＨｓｐＥ７プラスＰｏｌｙ−ＩＣＬＣの共免疫性化の効果を示す。
【図１１Ｆ】液性免疫へのＨｓｐＥ７プラスＰｏｌｙ−ＩＣＬＣの共免疫性化の効果を示す。
【図１２】抗原特異性ＣＤ８＋T細胞応答を引き出しにおいて外因性抗原プラスｐｏｌｙＩＣＬＣで免疫性化の結果を示す。
【図１３】大きい、確立したＴＣ−１腫瘍の退化の誘発においてＨｓｐＥ７抗原プラスｐｏｌｙＩＣＬＣで多重投与免疫化の結果を示す。
【図１４】ＨｓｐＥ７抗原プラスＴＬＲ３作用薬を使用する多重投与免疫化戦略の結果を示す。
【図１５】ＨｓｐＥ７抗原プラスＴＬＲ３作用薬を使用する多重投与免疫化戦略の結果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫学の分野に関する。さらに、本発明はＨｓｐＥ７を含む組成物およびこれらの使用を提供する。
【０００２】
［発明の背景］
ワクチン接種および免疫療法戦略は一連の細胞の相互作用の複雑に構成された系列の操作を目指している。細胞の相互反応は、一般的に抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）そして特に樹状細胞（ＤＣｓ）が抗原に遭遇しそして吸収し、抗原からペプチドエピトープを生成し、そして必須組織適合遺伝子複合体（MHC）によって記号化される分子の認識切片内にエピトープを負荷することによる免疫の監視を含んでいる。ＤＣ表面に輸送の後、エピトープ負荷ＭＨＤ分子はエピトープ−ＭＨＣ複合体をＴ細胞に提供しそしてＴ細胞を活性化する。活性化したＣＤ４＋Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞は他のＤＣｓにケモカインとサイトカイン信号を供給し、これらに特別の能力をあたえ、順次、生来のＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化し、抗原−特殊細胞傷害Ｔリンパ球（ＣＴＬ）内にこれらの細胞の遺伝子を移転する。活性化したＴヘルパー細胞はＢ細胞と反応し、同様に分化、クローンの拡大を制御する分子信号、およびこれらが獲得免疫の液性応答のマウンティングにおいて分泌する抗体アイソタイプの定義でこれらを提供する。
【０００３】
ワクチン接種および免疫療法はある種の感染症あるいは癌のような異常な範囲の予防あるいは治療に対して興味ある手がかりである。しかしながら、このような治療の成功は免疫療法の実施要項、例えば、選ばれた細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープの貧弱な免疫原性に対するいくつかの固有の欠点によってしばしば制約される。免疫応答を増加する標準的方法は免疫原から分離されそして使用に典型的に先立って免疫原と混合されるアジュバントの使用がある。硫酸バンドおよび不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）がアジュバントの例として知られている。ある種の生体活性自然製品がアジュバントとして使用されることがまた示されている。一般的な例はグラム陰性細菌からのリポ多糖（ＬＰＳ）およびグラム陰性そしてグラム陽性細菌の両方からのムレインあるいはペプチドグリカン（ＰＧ）としてまた知られる細菌細胞壁糖ペプチドを含んでいる。
【０００４】
微生物アジュバントは哺乳類細胞におけるパターン認識受容体（ＰＲＲｓ）を活性化することによりアジュバントの前起炎症を働かせると考えられる。Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲｓ）として知られている哺乳類表面受容体はＰＲＲシステム内の必須受容体クラスの一つである。ＴＬＲの活性化は、ケモカインおよびある種のサイトカインのような前起炎症メディエイターを符号化する遺伝子の発現を順次刺激する転写因子ＮＦｋＢおよびＡＰＩの誘発に導く細胞内部の信号化カスケードを引き起こす。１１の異なるＴＬＲがヒトにおいて始まることを確認されそして各ＴＬＲは微生物由来の組成物のユニークな小さな一組を認識する能力をもっている。
【０００５】
例えば、ＬＰＳはＴＬＲ４の配位子でありそしてペプチドグリカンはＴＬＲ２の配位子である。ＴＬＲｓはまたユニークな配位子特異性をもつヘテロ二量体を形成することができる。例えば、マイコプラズマからのマクロファージ活性リポペプチド２（ＭＡＬＰ−２）はＴＬＲ２／ＴＬＲ６に対する配位子であるが、一方ウイルスのリポペプチドＰａｍ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ（４）がＴＬＲ１／ＴＬＲ２ヘテロ二量体に対する配位子である。
【０００６】
ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）のＥ７蛋白質は小さく（約１０，０００Ｍw）、網膜芽細胞種遺伝子生成物Ｒｂ（転写因子Ｅ２Ｆに結合しそして不活性化する腫瘍抑制）に結合する能力により発癌性をもつＺｎ−結合リン酸蛋白質である。転写因子Ｅ２Ｆはこれらを符号化するチミジンキナーゼ、ｃ−ｍｙｃ、ジヒドロ葉酸レダクターゼおよびＤＮＡポリメラーゼアルファを含む数多くの増殖関連遺伝子の転写を制御する。Ｒｂ−Ｅ２Ｆ複合体形成はＧ０およびＧ１相における後の遺伝子の発現を防止し、Ｒｂ−Ｅ２Ｆ複合体が解離するようにプログラム化されるＳ相への発現を制約し、活性転写因子Ｅ２Ｆを解放する。このようにＥ７は、それはウイルスのライフサイクルを通して発現されそして事実それはＨＰＶ感染症により引き起こされる終末段階子宮頸肉腫の間に発現するただ２つのウイルス性蛋白質の１つであるので、乳頭種ウイルス感染症において免疫学的介在に対して魅力的な目標を提供する。
【０００７】
ＨＰＶ蛋白質とアジュバントの共投与が報告されている。例えば、Ｆｒｅｙｓｃｈｍｉｄｔ等（Ｆｒｅｙｓｃｈｍｉｄｔ Ｅ−Ｊ等、２００４、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｔｈｅｒ．９：４７９−４８９）はリポ多糖（ＬＰＳ）、非メチル化ＣｐＧおよびソルビトールが樹状細胞のＨＰＶ１６Ｌ１−Ｅ７融合粒子誘発刺激を強調したことを論証した。Ｋｉｍ等（Ｋｉｍ Ｔ−Ｙ等、２００２ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２：７２３４−７２４０）はＨＰＶ Ｅ７のＣｐＧ オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ ＯＤＮ）１８２６の共供給がＨＰＶ１６に対する防御的免疫性を増加することを教えている。Ｅ５を含む腫瘍増殖の除去はＣｐＧ ＯＤＮ １８２６あるいはフロイントアジュバントとＨＰＶ Ｅ５共投与を使用することをＣｈｅｎ等（Ｃｈｅｎ Ｙ−Ｆ等、２００４、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：１３３３−１３４３）によってまた報告されている。
【０００８】
ＷＯ９９／０７８６０はＨＰＶ感染症の間、抗Ｅ７免疫応答を引き出すためのワクチン薬剤として有用である組換え体Ｈｓｐ６５−Ｅ７融合蛋白質（ＨｓｐＥ７）を開示している。ここに記述されたＨｓｐＥ７融合蛋白質はＥ．Ｃｏｌｉによって発表されそしてＥ７−特異ＣＤ８免疫応答を引き出す能力に関して生物学的に活性である。
【０００９】
［発明の概要］
本発明はＨｓｐＥ７を含む組成物およびこれらの使用の方法に関する。さらに特に、本発明は精製Ｈｓｐ６５−ＨＰＶ Ｅ７融合体（ＨｓｐＥ７）を含む組成物および使用の方法を提供する。
【００１０】
改善されたＨｓｐＥ７組成物を提供することが本発明の目的である。
【００１１】
本発明に従って、ＣｐＧ、ＴＬＲ３作用薬、モノホスホリル−リピド Ａ（ＭＰＬ）、ＭＰＬ−テレハロース６，６’−ジミコレート（ＭＰＬ−ＴＤＭ）、および抗ＣＤ４０を含むグループから選ばれた免疫刺激剤と共にＨｓｐＥ７を混合することを含む精製ＨｓｐＥ７の生体活性を増加させる方法が提供される。望ましくは、免疫刺激剤は投与量当り約１μｇから５０００μｇの量でＨｓｐＥ７と共に共投与される。本発明のある観点では、免疫刺激剤は、陽イオン性アミノ酸の大部分を含むポリリジン、ポリアルギニン、あるいは陽イオン性ペプチドのような陽イオン性ポリマーで複合化されたＰｏｌｙＩ：ＣあるいはｐｏｌｙＩ：Ｃである。本発明の他の観点で、免疫刺激剤はＰｏｌｙＩＣＬＣである。さらに、精製ＨｓｐＥ７はゲル電気泳動法、ＨＰＬＣ、あるいは両方を使用して決定された純度約９５％から約９９．９９％である。
【００１２】
本発明はまた精製ＨｓｐＥ７およびＣｐＧ、ＴＬＲ３作用薬、ＭＰＬ、ＭＰＬ−ＴＤＭおよび抗ＣＤ４０を含むグループから選ばれた免疫刺激剤を含む組成物を目指している。望ましくは、免疫刺激剤は投与量当り約１μｇから５０００μｇの量で提供される。本発明のある観点では、免疫刺激剤は、陽イオン性アミノ酸の大部分を含むポリリジン、ポリアルギニン、あるいは陽イオン性ペプチドのような陽イオン性ポリマーで複合化されたＰｏｌｙＩ：ＣあるいはｐｏｌｙＩ：Ｃである。本発明の他の観点で、免疫刺激剤はＰｏｌｙＩＣＬＣである。さらに、精製ＨｓｐＥ７はゲル電気泳動法、ＨＰＬＣ、あるいは両方を使用して決定された純度約９５％から約９９．９９％である。
【００１３】
本発明はまた哺乳類あるいは被験者における腫瘍の重荷あるいはウイルスの発生を減らす方法を目指しており、それを必要としている被験者に精製ＨｓｐＥ７を含む組成物およびＣｐＧ、ＴＬＲ３作用薬、ＭＰＬ、ＭＰＬ−ＴＤＭ、および抗ＣＤ４０からなるグループから選ばれた免疫刺激剤を投与することを含む。望ましくは、免疫刺激剤は投与量当り約１μｇから５０００μｇの量で共投与される。本発明のある観点では、免疫刺激剤は、陽イオン性アミノ酸の大部分からなるポリリジン、ポリアルギニン、あるいは陽イオン性ペプチドのような陽イオン性ポリマーで複合化されたＰｏｌｙＩ：ＣあるいはｐｏｌｙＩ：Ｃである。本発明の他の観点で、免疫刺激剤はＰｏｌｙＩＣＬＣである。さらに、精製ＨｓｐＥ７はゲル電気泳動法、ＨＰＬＣ、あるいは両方を使用して決定された純度約９５％から約９９．９９％である。
【００１４】
本発明はさらに精製ＨｓｐＥ７およびＣｐＧ、ＴＬＲ３作用薬、ＭＰＬ、ＭＰＬ−ＴＤＭおよび抗ＣＤ４０を含むグループから選ばれた免疫刺激剤そしてこれらの使用のための説明書を含むキットを提供する。望ましくは、免疫刺激剤は投与量当り約１μｇから５０００μｇの量で提供される。本発明のある観点では、免疫刺激剤は、陽イオン性アミノ酸の大部分からなるポリリジン、ポリアルギニン、あるいは陽イオン性ペプチドのような陽イオン性ポリマーで複合化されたＰｏｌｙＩ：ＣあるいはｐｏｌｙＩ：Ｃである。本発明の他の観点で、免疫刺激剤はＰｏｌｙＩＣＬＣである。さらに、精製ＨｓｐＥ７はゲル電気泳動法、ＨＰＬＣ、あるいは両方を使用して決定された純度約９５％から約９９．９９％である。
【００１５】
本発明はＨＰＶ蛋白質抗原に対する免疫応答そして特別な実施態様ではＨＰＶ蛋白質抗原を発現する腫瘍あるいはＨＰＶ感染細胞に対する免疫応答を強めるための組成物の使用に関する。組成物はそれを必要としている被験者に癌の防止あるいは治療に使用される。
【００１６】
本発明はまた組成物の投与スケジュールに関する。本発明の特別の観点において、本発明の組成物は少なくとも２回の投与からなる投与スケジュールで投与される。投与は連続した日、あるいは非連続の日、あるいはこれらの組み合わせで投与される。
【００１７】
本発明の概要は本発明の全ての特徴を必ずしも記述していない。
【００１８】
［図面の簡単な説明］
本発明のこれらおよび他の特徴は言及が付帯する図面に対してなされる次の説明からもっと明らかとなる。
【００１９】
図１は種々のＨｓｐＥ７調合剤の抗腫瘍活性を示す。プロセスＬ：プロセスＬ ＨｓｐＥ７は高精製ＨｓｐＥ７調合剤である。プロセスＡ ＨｓｐＥ７はより低い純度のＨｓｐＥ７（ＷＯ９９／０７８６０）である。確立したＥ７−発現ＴＣ−１腫瘍をもつハツカネズミはプロセスＡあるいはプロセスＬ（ｎ＝３０／ｇｒｐ／投与量）のいずれかにより製造されたＨｓｐＥ７の等級のある投与で頸の首筋に皮下注射されそして４９日間腫瘍増殖を続けられた。ＲＤ４−プロセスＬ ＨｓｐＥ７（▼）；ＲＤ５−プロセスＬ ＨｓｐＥ７（◆）；ＣＬ４−プロセス ＨｓｐＥ７（○）；ＣＬ６−プロセスＡ ＨｓｐＥ７（□）。Ｘ軸：ＴＣ１評価でμｇで使用されたＨｓｐＥ７の投与量。
【００２０】
図２はＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ＴＬＲ９作用薬）の存在においてＥ７特異ＣＤ８陽性Ｔリンパ球を誘発するためのＨｓｐＥ７の能力の増加を示す。生来のＣ５７ＢＩ／６ハツカネズミはＨｓｐＥ７のみかあるいはＨｓｐＥ７プラス３０μｇＣｐＧオリゴヌクレオチドのいずれかの皮下注射をされそしてＥ７特殊脾臓細胞の数がＥＬＩＳＰＯＴにより測定された。左から右へ（治療当り２匹のハツカネズミの同齢集団）、免疫化抗原は４００μｇプロセスＡ ＨｓｐＥ７（ＷＯ９９／０７８６０に記述された低純度のＨｓｐＥ７）；４００μｇプロセスＡ ＨｓｐＥ７プラス３０μｇＣｐＧオリゴヌクレオチド；４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７（高精製ＨｓｐＥ７）；４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７プラス３０μｇＣｐＧオリゴヌクレオチドであった。ＥＬＩＳＰＯＴ分析のために使用された回収抗原はＨＢＶコア抗原（ＨＢＶｃＡｇ）（９３−１００）の不適当な制御ペプチド（黒色棒）；Ｅ７（４９−５７）特異ペプチド（灰色棒）；溶媒のみ制御（中空棒）であった。
【００２１】
図３はプロセスＬ ＨｓｐＥ７（精製ＨｓｐＥ７）のＰｏｌｙＩ：Ｃ（ＴＲＬ３作用薬）あるいはＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＴＬＲ９作用薬）でしかしＰＡＭ３ＣｙｓＳＫ４（ＴＬＲ２作用薬）ではないものを共注射することによりＥ７特異ＣＤ８陽性Ｔリンパ球を誘発するためのＨｓｐＥ７の能力の増加を示す。ハツカネズミは指示された投薬量でプロセスＬ ＨｓｐＥ７プラスＴＬＲ作用薬の混合物（溶液）で皮下注射をされそしてＥ７−特異脾臓細胞の数がＥＬＩＳＰＯＴで測定された。左から右へ（治療当り２匹のハツカネズミの同齢集団）、免疫化抗原は５０μｇプロセスＬ プラス１０μｇＣｐＧオリゴヌクレオチド；５０μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７プラス１００μｇｐｏｌｙＩ：Ｃ；５０μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７プラス２０μｇPａｍ３ＣｙｓＳＫ４；あるいは生来のハツカネズミであった。ＥＬＩＳＰＯＴ分析のために使用された回収抗原はＨＢＶｃＡｇ（９３−１００）の不適当な制御ペプチド（斜線棒）；Ｅ７（４９−５７）特異ペプチド（黒色棒）；溶媒のみ制御（中空棒）であった。
【００２２】
図４はモノリン酸リピドＡ（ＭＰＬ；ＴＬＲ４作用薬）の存在でＥ７特異ＣＤ８陽性Ｔリンパ球を誘発するためにプロセスＬ ＨｓｐＥ７の能力の増加を示す。生来のＣ５７Ｂ１／６ハツカネズミはプロセスＬ ＨｓｐＥ７（精製ＨｓｐＥ７）のみで、あるいはＨｓｐＥ７プラスＭＰＬ＋ＴＤＭのいずれかで皮下注射されそしてＥ７−特異脾臓細胞の数がＥＬＩＳＰＯＴで測定された。左から右へ（治療当り２匹のハツカネズミの同齢集団）、免疫化抗原は４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７；ＭＰＬ＋ＴＤＭ（Ｒｉｂｉ）中に４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７あるいは生来のハツカネズミであった。ＥＬＩＳＰＯＴ分析のために使用された回収抗原はＨＢＶｃＡｇ（９３−１００）の関連性のない制御ペプチド（黒色棒）；Ｅ７（４９−５７）特異ペプチド（斜線棒）；溶媒のみの制御（中空棒）であった。
【００２３】
図５はＰｏｌｙ ＩＣＬＣ（ＴＬＲ３作用薬）の存在でＥ７特異ＣＤ８陽性Ｔリンパ球を誘発するためにプロセスＬ ＨｓｐＥ７の能力の増加を示す。生来のＣ５７Ｂ１／６ハツカネズミはプロセスＬ ＨｓｐＥ７（精製ＨｓｐＥ７）のみで、あるいはＨｓｐＥ７プラスＰｏｌｙＩＣＬＣの等級のある投薬量のいずれかで皮下注射されそしてＥ７−特異脾臓細胞の数がＥＬＩＳＰＯＴで測定された。左から右へ（治療当り２匹のハツカネズミの同齢集団）、免疫化抗原は４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７；４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７プラス１００μｇＰｏｌｙＩＣＬＣ；４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７プラス１０μｇＰｏｌｙ ＩＣＬＣ；４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７プラス１μｇＰｏｌｙＩＣＬＣ；４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７プラス０．１μｇＰｏｌｙＩＣＬＣ；１００μｇＰｏｌｙＩＣＬＣのみあるいは生来のハツカネズミであった。ＥＬＩＳＰＯＴ分析のために使用された回収抗原はＨＢＶｃＡｇ（９３−１００）の関連性のない制御ペプチド（灰色棒）；Ｅ７（４９−５７）特異ペプチド（斜線棒）；溶媒のみの制御（中空棒）であった。
【００２４】
図６は腫瘍発生率におけるプロセスＬ ＨｓｐＥ７あるいはプロセスＡ ＨｓｐＥ７の効果を示す。種々のＨｓｐＥ７調合剤の抗腫瘍活性はプロセスＡ ＨｓｐＥ７（低純度のＨｓｐＥ７、ＷＯ９９／０７８６０に記述される）、あるいはプロセスＬ ＨｓｐＥ７（精製ＨｓｐＥ７）およびＣｐＧオリゴヌクレオチドを共投与することにより決定された。確立したＥ７−発現ＴＣ−１腫瘍をもつハツカネズミはプロセスＡ ＨｓｐＥ７のみあるいはＣｐＧオリゴヌクレオチド（ｎ＝３０／ｇｒｐ）の異なる投与量で混合されたプロセスＬ ＨｓｐＥ７の等級のある投与量で頸の首筋に皮下注射されそして４９日間腫瘍増殖を続けられた。３μｇオリゴヌクレオチド＋プロセスＬ ＨｓｐＥ７（■）；１０μｇＣｐＧオリゴヌクレオチド＋プロセスＬ ＨｓｐＥ７（▲）；３０μｇＣｐＧオリゴヌクレオチド＋プロセスＬ ＨｓｐＥ７（▼）；プロセスＡ ＨｓｐＥ７（◆）；平均プロセスＡ ＨｓｐＥ７ 歴史的（○）。Ｘ軸はＴＣ−１評価で使用されたＨｓｐＥ７のμｇ。
【００２５】
図７はＰｏｌｙＩ：ＣとプロセスＬ ＨｓｐＥ７（精製ＨｓｐＥ７）を組み合わせることによりプロセスＬ ＨｓｐＥ７の抗腫瘍活性の増加を示す。確立されたＥ７−発現ＴＣ−１腫瘍をもつハツカネズミはプロセスＬ ＨｓｐＥ７のみあるいはＰｏｌｙＩ：Ｃ（ｎ＝２０／ｇｒｐ）を組み合わせたプロセス Ｌ ＨｓｐＥ７の等級のある投与量で頸の首筋に皮下注射されそして４９日間で腫瘍増殖を続けられた。プロセスＬ ＨｓｐＥ７の８００μｇで注射されたハツカネズミのおおよそ５０％は４９日目で腫瘍をもった。ＨｓｐＥ７（■）；ＨｓｐＥ７＋ＰｏｌｙＩＣ（▲）。Ｘ軸はＴＣ−１評価で使用されたＨｓｐＥ７のμｇ。
【００２６】
図８はＥ７特異ＣＤ８陽性Ｔリンパ球の誘発において精製ＨｓｐＥ７（プロセスＬ ＨｓｐＥ７）で混合されたアジュバント硫酸バンドあるいはフロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ）の効果を示す。ハツカネズミはプロセスＬ ＨｓｐＥ７のみあるいはプロセスＬ ＨｓｐＥ７、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、硫酸バンドおよびフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）の指示投与量で皮下注射されそしてＥ７−特異脾臓細胞の数がＥＬＩＳＰＯＴで測定された。左から右へ（治療当り２匹のハツカネズミの同齢集団）、免疫化抗原は４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７；ＩＦＡ中に４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７；ＩＦＡ中に４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７プラスＣｐＧオリゴヌクレオチド；４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７プラス硫酸バンド；４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７プラス硫酸バンドプラスＣｐＧオリゴヌクレオチド；４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７プラスＣｐＧオリゴヌクレオチド、あるいは生来のハツカネズミであった。ＥＬＩＳＰＯＴ分析のために使用された回収抗原はＨＢＶｃＡｇ（９３−１００）の関連性のない制御ペプチド（斜線棒）；Ｅ７（４９−５７）特異ペプチド（平行線付棒）；溶媒のみの制御（中空棒）であった。
【００２７】
図９は種々のＴＬＲ作用薬あるいは作用薬の抗ＣＤ抗体の存在で共投与されたときＥ７特異ＣＤ８陽性Ｔリンパ球を誘発するためにＨｓｐＥ７の能力の比較を示す。Ｅ７特殊Ｔ細胞の無視できる数がイミキミド（ＴＬＲ７作用薬）ＰＡＭ３ＣｙｓＳＫ４（ＴＬＲ１／２作用薬）あるいはＬＰＳ（ＴＬＲ４作用薬）とＨｓｐＥ７の共投与の後、引き出された。対照的にＥ７特異Ｔ細胞の多くの数がＣｐＧオリゴヌクレオチドあるいは作用薬の抗ＣＤ４０抗体とＨｓｐＥ７の共投与の後、引き出された。ハツカネズミは精製ＨｓｐＥ７（プロセスＬ ＨｓｐＥ７）プラス指示されたＴＬＲ作用薬の混合物で皮下注射され、そしてＥ７特異脾臓細胞の数がＥＬＩＳＰＯＴによって測定された。左から右へ（治療当り２匹のハツカネズミの同齢集団）、免疫化抗原は４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７；４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７プラス１００μｇイミキモド；４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７プラス３０μｇＬＰＳ；４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７プラス２５μｇＰＡＭ３ＣｙｓＳＫ４；４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７プラス２５μｇ抗ＣＤ４０抗体（クローン１Ｃ１０）；４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７プラス３０μｇＣｐＧオリゴヌクレオチド；あるいは生来のハツカネズミであった。ＥＬＩＳＰＯＴ分析のために使用された回収抗原はＨＢＶｃＡｇ（９３−１００）の関連性のない制御ペプチド（黒色棒）；Ｅ７（４９−５７）特殊ペプチド（平行線付棒）；溶媒のみ制御（中空棒）であった。
【００２８】
図１０はＩＦＭガンマＥＬＩＳＰＯＴにより測定されるようにクラスＩ制限ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を引き出す能力への日々の主要な押し上げ戦略の効果を示す。Ｃ５７Ｂ１／６ハツカネズミ（グループ当り２匹）は１日間隔で、１日当り最大４日間までＨｓｐＥ７（１００μｇ）そしてｐｏｌｙＩＣＬＣ（１０μｇ）で免疫化された。抗体に最初の曝露の後７日、全ての動物は安楽死されそしてこれらの脾臓細胞が分析のため採取された。ＩＦＭガンマＥＬＩＳＰＯＴが１６Ｅ７．４９−５７．Ｄｂペプチドでの刺激へのクラスＩ制限ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を評価するために使用された（回収抗体−中空棒；媒体−制御のみ−黒色棒）。左から右へ（治療当り２匹のハツカネズミの同齢集団）、免疫化抗原は４０μｇｐｏｌｙＩＣＬＣと４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７（１回投与）；１０μｇｐｏｌｙＩＣＬＣと１００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７（１回投与）；１０μｇｐｏｌｙＩＣＬＣと１００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７（２回投与）；１０μｇｐｏｌｙＩＣＬＣと１００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７（３回投与）；１０μｇｐｏｌｙＩＣＬＣと１００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７（４回投与）；生来のハツカネズミであった。
【００２９】
図１１は液性免疫へのＨｓｐＥ７プラスＰｏｌｙ−ＩＣＬＣの共免疫性化の効果を示す。Ｃ５７Ｂ１／６ハツカネズミ（ｎ＝５）のグループは緩衝液、５００μｇＨｓｐＥ７、１２．５μｇＰｏｌｙＩＣＬＣ、５００μｇＨｓｐＥ７＋１．２５μｇＰｏｌｙ−ＩＣＬＣ、５００μｇＨｓｐＥ７＋１２．５μｇＰｏｌｙ−ＩＣＬＣあるいは５００μｇＨｓｐＥ７＋１２５μｇＰｏｌｙ−ＩＣＬＣで毎月の間隔（１日目、２８日目）で２回（Ｘ軸の左から右へ）免疫性を与えられた。血液試料は投与前に７日毎（７日目がベースライン）そして２１日、４９日、７７日目に血清の分析のため採取された。個々のハツカネズミからの血清はＥ７およびＨｓｐＥ７に対して標準ＥＬＩＳＡによって抗体（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ、およびＩｇG２ｃ）の存在に対して試験された。データは評価プレートのバックグランド（０．２ＯＤユニットとして定義）よりも大きい吸光度を与えた血清の最も高い希釈で表される。パネルＡ）抗Ｅ７ ＩｇＧ１タイター；Ｂ）抗ＨｓｐＥ７ ＩｇＧ１タイター；Ｃ）抗Ｅ７ ＩｇＧ２ｂタイター；Ｄ）抗ＨｓｐＥ７ ＩｇＧ２ｂタイター；Ｅ）抗Ｅ７ ＩｇＧ２ｃタイター；Ｆ）抗ＨｓｐＥ７ ＩｇＧ２ｃタイター。中空棒―血出前制御；斜線棒―２１日目出血；黒色棒―４９日目出血；縦線棒―７７日目出血。
【００３０】
図１２は抗原特異性ＣＤ８＋T細胞応答を引き出しにおいて外因性抗原プラスｐｏｌｙＩＣＬＣで免疫性化の結果を示す。Ｃ５７Ｂ１／６ハツカネズミ（同齢集団当り２匹のハツカネズミ）は４００μｇＨｓｐＥ７のみ、１００μｇｐｏｌｙＩＣＬＣと４００μｇＨｓｐＥ７、１０μｇｐｏｌｙＩＣＬＣと４００μｇＨｓｐＥ７、１μｇｐｏｌｙＩＣＬＣと４００μｇＨｓｐＥ７、０．１μｇｐｏｌｙＩＣＬＣと４００μｇＨｓｐＥ７、１００μｇｐｏｌｙＩＣＬＣのみ、あるいは緩衝液（制御）の皮下注射で免疫性化された。免疫化７日後、Ｈ−２Ｄｂ制約エピトープＥ４９−５７に対する抗体特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答がＩＦＮガンマＥＬＩＳＰＯＴによって評価された。ＥＬＩＳＰＯＴのための回収抗体：空白棒―媒体制御；灰色棒―Ｅ７ペプチド；黒棒―ＨＢＶＣあるいはペプチド。
【００３１】
図１３は大きい、確立したＴＣ−１腫瘍の退化の誘発においてＨｓｐＥ７抗原プラスｐｏｌｙＩＣＬＣで多重投与免疫化の結果を示す。Ｃ５７ＢＩ／６ハツカネズミ（同齢集団当り１５匹のハツカネズミ）が０日目にＥ７発現ＴＣ−１．Ｋ腫瘍細胞（６×１０４）で移殖されそして緩衝液のみの４連続日投与で治療された（中空の４角）；１００μｇＨｓｐＥ７蛋白質（中空の３角）、１０μｇＰｏｌｙＩＣＬＣ（中空の円）；あるいは１００μｇＨｓｐＥ７＋１０μｇＰｏｌｙＩＣＬＣ（黒色円）、移殖後２８日目に開始。データは経過時間あたり各同齢集団に対する中央値腫瘍容積（パネルＡ）としてあるいは経過時間あたり各同齢集団内の個々の動物に対する腫瘍容積（パネルＢ）として表される。
【００３２】
図１４はＨｓｐＥ７抗原プラスＴＬＲ３作用薬を使用する多重投与免疫化戦略の結果を示す。（Ａ）Ｃ５７Ｂ１／６ハツカネズミ（同齢集団当り２匹のハツカネズミ）が組み替えＨｓｐＥ７蛋白質（１００μｇ）プラスＴＬＲ３作用薬ＰｏｌｙＩＣＬＣ（１０μｇ）の自己含有で０日目に１度（黒色の４角）かあるいは０日目と２日目に２度（中空の４角）のいずれか、あるいは０日目と４日目に２回（黒色の円）免疫性化をされた。指定された時間点（最初の免疫性化後の日数）で、Ｈ−２Ｄｂ制約エピトープＥ４９−５７に対する抗体特異ＣＤ８Ｔ細胞応答がＩＦＮガンマＥＬＩＳＰＯＴによって評価された。（Ｂ）Ｃ５７Ｂ１／６ハツカネズミ（同齢集団当り４匹のハツカネズミ）が組み替えＨｓｐＥ７蛋白質（１００μｇ）プラスＴＬＲ作用薬ＰｏｌｙＩＣＬＣ（１０μｇ）自己含有で４日の連続する日の間毎日一緒に、１日目に１度一緒に、あるいは２、３、４日目のみにＰｏｌｙＩＣＬＣ（１０μｇ）によって引き続けられる１日目に１度一緒に免疫性化された。最初の免疫性化７日後、Ｈ−２Ｄｂ制約エピトープＥ４９−５７に対する抗体特異ＣＤ８Ｔ細胞応答がＩＦＮガンマＥＬＩＳＰＯＴによって評価された。
【００３３】
図１５はＨｓｐＥ７抗原プラスＴＬＲ３作用薬を使用する多重投与免疫化戦略の結果を示す。（Ａ）Ｃ５７ＢＩ／６ハツカネズミ（同齢集団当り２匹のハツカネズミ）が組み替えＨｓｐＥ７蛋白質（１００μｇ）プラスＰｏｌｙＩＣＬＣ（１０μｇ）、あるいはＨｓｐＥ７蛋白質（４００μｇ）プラスＰｏｌｙＩＣＬＣ（４０μｇ）の単独投与で連続する日の指示された数に対し毎日免疫化された。最初の免疫化７日後、Ｈ−２Ｄｂ制約エピトープＥ４９−５７に対する抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答がＩＦＮガンマＥＬＩＳＰＯＴによって評価された。Ｂ）生来のハツカネズミからの脾臓細胞（右パネル）あるいはＨｓｐＥ７蛋白質（１００μｇ）プラスＰｏｌｙＩＣＬＣ（１０μｇ）の４日連続する毎日の投与をうけるハツカネズミ（左パネル）はＥ４９−５７ペプチドで負荷されたＰＥ共役のＨ−２Ｄｂ五量体（Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅ社）で染色されそして表面は抗ＣＤ８および抗ＣＤ４４ｍＡｂｓで染色された。示された細胞はゲートされたＣＤ８＋ 陽性集団を表す。（Ｃ）Ｃ５７Ｂ１／６ハツカネズミ（同齢集団当り２匹のハツカネズミ）が組み替えＨｓｐＥ７蛋白質（１００μｇ）プラスＰｏｌｙＩＣＬＣ（１０μｇ）で連続する日の指示された数に対し毎日免疫化された。指定された時間（最初の免疫化後の日）にＨ−２Ｄｂ制約エピトープＥ４９−５７に対する抗体特異ＣＤ８Ｔ細胞応答がＩＦＮガンマＥＬＩＳＰＯＴによって評価された。
【００３４】
［詳細説明］
本発明はＨｓｐＥ７を含む組成物およびその使用法に関する。
【００３５】
次の説明は望ましい実施態様である。
【００３６】
本発明はＴＬＲ作用薬に限られないような免疫刺激剤と一緒に精製ＨｓｐＥ７および任意に他の薬学的に受け入れられる成分を含む組成物を提供する。免疫刺激剤はＴＬＲ３、あるいはＴＬＲ９作用薬であるが、しかしながら他のＴＬＲ作用薬もまた採用される。精製ＨｓｐＥ７と混合される免疫刺激剤の例は、制約されないが、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ＴＬＲ９作用薬）、ＴＬＲ３作用薬例えば二重標準のＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）あるいはＰｏｌｙＩ：Ｃ、あるいはポリＬリシン（ｐｏｌｙＩＣＬＣ）をともなうＰｏｌｙＩ：Ｃ、モノリン酸リピドＡ（ＭＰＬ；ＴＬＲ４作用薬）、あるいはＭＰＬ−トレハロース６，６’−ジミコレート（ＭＰＬ−ＴＤＭ）、および抗ＣＤ−４０を含む。
【００３７】
精製ＨｓｐＥ７によって、約９５％から約９９．９９％あるいはその間の量からなり、引き続くＨｓｐＥ７調合および精製を提供する組成物からなる残りの成分で特徴づけられるＨｓｐＥ７調合を意味する。例えば、精製ＨｓｐＥ７は約９５％から約９９．９９％あるいはその間の量からなり、あるいは約９７％から９９．６％、あるいはその間のＨｓｐＥ７量からなることを特徴としている。精製ＨｓｐＥ７は約９５、９６、９７、９８、９９、９９．２、９９．４、９９．６、９９．８、９９．９、９９．９５、９９．９９％ＨｓｐＥ７あるいはその間のいずれかの量からなる。精製ＨｓｐＥ７の例はプロセスＬ ＨｓｐＥ７である。
【００３８】
ＨｓｐＥ７の純度、あるいはプロセスＬ ＨｓｐＥ７は例えば制限されないがＨＰＬＣあるいはゲル電気泳動法を含むいずれかの純度評価の方法を使用して決定される。例えば、当業者に技術の一つとして知られる誘導および非誘導ゲル電気泳動法の組み合わせ（ＳＤＳと１％ＰＡＧＥ、±ベータメルカプトエタノール）。
【００３９】
Ｈｓｐ６５−ＨＰＶ Ｅ７融合生成物（ＨｓｐＥ７）は、例えば、ＷＯ９９／０７８６０（参考としてここに組み入れられる）に開示されたような種々な方法に従って生成される。ここで記述される使用に対して、ＨｓｐＥ７の調合はさらに精製に続けられる。さらなる精製は一つあるいはそれ以上の寸法の排除を使用するクロマトグラフィー、イオン交換（陽イオン、陰イオンあるいは両者）、親和性、逆浸透、クロマトグラフィーの他の方法、ゲル電気泳動法、寸法と電化あるいは両者によるいずれか、例えば尿素あるいは塩酸グアニジン、塩に制約されないがカオトロープ試薬を使用する変性、ｐＨ沈澱、膜濾過、および当業者に技術の一つとして知られるような同様法を含むいずれかの既知の精製法を使用して達成される。
【００４０】
ＷＯ９９／０７８６０に開示されたＨｓｐＥ７は、例えば、約９５％より低い、ここで記述する高い精製ＨｓｐＥ７（プロセスＬ ＨｓｐＥ７）よりも低い純度からなる低い純度調合である。ＨｓｐＥ７からの低い純度形式はプロセスＡ ＨｓｐＥ７、あるいはプロセスＡとして参照される。理論を超えることを希望することなく、プロセスＡ ＨｓｐＥ７は、もっと精製されたＨｓｐＥ７、例えばプロセスＬ ＨｓｐＥ７（例えば、図１そして図２参照）と比較されるときその強調される生体活性となる一つあるいはそれ以上の組成物を含む。しかしながら、ここに記述されるように、先行技術ＨｓｐＥ７（プロセスＡ ＨｓｐＥ７）が、約９５％から約９９．９９％の間の純度に、あるいはその間のいずれかの量（プロセスＬ ＨｓｐＥ７）に低い毒性のＨｓｐＥ７を製造するためにさらに精製されたとき、ＨｓｐＥ７の生体活性の損失が観察される（図１および２：プロセスＬ ＨｓｐＥ７対プロセスＡ ＨｓｐＥ７；実施例２および３参照）。図１に示されるように、プロセスＬ ＨｓｐＥ７（精製ＨｓｐＥ７）の使用は、低い純度プロセスＡ ＨｓｐＥ７を使用して観察されるような腫瘍発生率における縮小を、同様な投与量範囲を超えても著しく示されない。しかしながら、以下に記述するように高い精製ＨｓｐＥ７は、例えば、プロセスＬ ＨｓｐＥ７に制約されないで、ＴＬＲ作用薬に制約されないが免疫刺激剤と共投与されるとき生体活性を示す。精製ＨｓｐＥ７そして免疫刺激剤を含む精製ＨｓｐＥ７組成物は他の薬学的受入可能な成分をさらに含む。免疫刺激剤はＴＬＲ３あるいはＴＬＲ９作用薬であるが、しかしながら、他のＴＬＲ作用薬あるいはアジュバント、例えば、ＣＤ４０がまた採用される。
【００４１】
精製ＨｓｐＥ７と混合される免疫刺激剤の例は、制約されないで、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ＴＬＲ９作用薬）、ＰｏｌｙＩ：Ｃ、ＰｏｌｙＩＣＬＣ（ＴＬＲ３作用薬）、モノリン酸リピドＡ（ＭＰＬ；ＴＬＲ４作用薬）、ＭＰＬ−トレハロース６，６’−ジミコレート（ＭＰＬ−ＴＤＭ）、そして抗ＣＤ−４０抗体を含む。ＣｐＧオリゴヌクレオチドの制約のない例は例えばクラスＢ型コア配列：ＧＡＣＧＴＴ、制約のない例としてＣｐＧ１９８２、１８２６、あるいは１６６８を含む。ＣｐＧ１９８２は次の配列をもつ：ＴＣＣ、ＡＴＧ ＡＣＧ ＴＴＣ ＣＴＧ、ＡＴＧ ＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）。ＣｐＧ１９８２はホスホロチオエートバックボーンと共に利用できる（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、そして表示されている：ＺＯＯ ＦＺＥ ＦＯＥ ＺＺＯ ＯＺＥ ＦＺＥ ＯＴ）。ＣｐＧ１８２６は次の配列をもつ：ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＣＧ ＴＴＣ ＣＴＧ ＡＣＧ ＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）。ＣｐＧ１６６８は配列からなる：ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＣＧ ＴＴＣ ＣＴＧ ＡＴＧ ＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）。望ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチド１９８２および１６６８はホスホロチオエートバックボーンからなる。最適のハツカネズミのクラスＢ型コア配列（ＧＡＣＧＴＴ）で１６６８を含む種々のＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドはプロセスＬ ＨｓｐＥ７活性の増大に高い活性であることを示されている。同様にＣｐＧクラスＣ型オリゴヌクレオチド（２３９５）は高い活性であることが発見された。しかしながら、クラスＡ型ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドはＥＬＩＳＰＯＴ評価においてＨｓｐＥ７の活性の増大に効果は非常に少ないことが発見された。ＣｐＧのＡ、ＢおよびＣクラスの説明に対しては、Ｖｏｌｌｍｅｒ Ｊ等を参照せよ（Ｖｏｌｌｍｅｒ Ｊ．等、２００４、Ｅｕｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４：２５１−２６２）。
【００４２】
他の試薬と組み合わせた二重鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を含むｐｏｌｙＩＣリボ核酸は、例えば内生のＲＮＡへの感受性を減らされた例として改善された安定した輪郭を示している。ｄｓＲＮＡは、例えば、リピド小嚢に包まれるかあるいは多イオン性ポリマーと複合化されている。このようなポリマーの例は制約されないが多くの陽イオン性アミノ酸、ポリリジン、ポリアルギニンあるいは同様なものからなるペプチドを含んでいる。ＵＳ特許４，３４６，５３８は比較的高い分子量のｐｏｌｙＩ：Ｃ、分子量１３−３５ｋＤａの範囲のポリＬ−リジンそしてカルボキシメチルセルロース（“ｐｏｌｙＩＣＬＣ”）からなるｐｏｌｙＩＣ複合体；およびそのような組成物を調合そして使用する方法を記述している。ある種の癌、ある種のＨＩＶあるいはエボラのようなウイルス病そしてまた多重硬化症の治療のための治療試薬としてｐｏｌｙＩＣＬＣの使用はまた提案されている（ＵＳ公開 ２００６／０２２３７４２）。
【００４３】
二重鎖ＲＮＡｐｏｌｙＩＣリボ核酸はある実施態様において、逆平行ベースペア立体配置でｐｏｌｙＩオリゴヌクレオチドとｐｏｌｙＣオリゴヌクレオチドからなる。このような二重鎖核酸分子の鎖は水素結合による秩序のある方式で反応する―‘Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ’塩基対としてまた参照される。異なる塩基対はＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対を含む標準的でない水素結合により起きる。ある熱力学、イオン性あるいはｐＨ状況のもとで、三重螺旋は特にリボ核酸で生じる。これらおよび他の別の水素結合あるいは塩基対は技術として知られ、そして、例えば、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ―“生化学の原理”、第３版（Ｎｅｌｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｘ編、Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、ニューヨーク）に見られ、ここに参照として取り入れられる。
【００４４】
“ｐｏｌｙＩ” オリゴヌクレオチドは多くのイノシン、イノシン類似ヌクレオシド、あるいはその組み合わせを含む。イノシン類似ヌクレオシドは、例えば、７−デアザイノシン、２’−Ｏ−メチル−イノシン、７−チア−７，９−ジデアザイノシン、フォルマイシンＢ、８−アザイノシン、９− デアザイノシン、アロプリノールリボシド、８−ブロモ−イノシン、８−クロロイノシンおよび同様のものを含む。
【００４５】
“ｐｏｌｙＣ” オリゴヌクレオチドは多くのシチジン、シチジン類似ヌクレオシド、あるいはその組み合わせを含む。シチジン類似ヌクレオシドは、例えば、５−メチルシチジン、２’−Ｏ−メチル−シチジン、５−（１−プロピニル）シチジンおよび同様のものを含む。
【００４６】
非標準的ヌクレオシドおよび／あるいはインターヌクレオシドリンケージからなる核酸はアジュバントとして使用されるとき、改善された安定容貌をまた提供しそして修正された免疫刺激効果を与え、あるいはここに記述するＨｓｐＥ７組成物の生物的活性を修正する。“標準的” ヌクレオシドはデオキシデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、デオキシウリジン、デオキシシチジン、デオキシイノシン、グアノシン、５−メチルウリジン、ウリジンおよびシチジンのような自然に発生するヌクレオシドを含む。修正された免疫刺激効果は適用でき、生来のあるいは液性の免疫応答の速い応答を証明しそしてより永く続くが、しかし低い即時応答である。
【００４７】
非標準的ヌクレオシドの例は技術として広く知られており、そして、例えば、‘ロックされた核酸’あるいは‘ＬＮＡ’を含む。ＬＮＡはＷＯ９９／１４２２６，ＷＯ００／５６７４６、ＷＯ００／５６７４８、ＷＯ０１／２５２４８、ＷＯ０１／４８１９０、ＷＯ０２／２８８７５、ＷＯ０３／００６４７５、ＷＯ０３／０９５４７、ＷＯ２００４／０８３４３０、ＵＳ６，２６８，４９０、ＵＳ６，７９４，４４９、ＵＳ７，０３４，１３３に記述された２’−４’環状リンケージをもつヌクレオシドである。他の非ＬＮＡ２環ヌクレオシドはまた技術として知られており、例えば：
−付加的Ｃ−３’，Ｃ−５’−エタノブリッジをもつビシクロ［３．３．０］ヌクレオシド；
−付加的Ｃ−１’，Ｃ−６’あるいはＣ−６’，Ｃ−４’メタノブリッジをもつビカルボシクロ［３．１．０］ヌクレオシド
【００４８】
−付加的環が天然のホスホルジエステルリンケージを置換するインターヌクレオシドリンケージの部分である未修正ヌクレオシドで２量体として合成される付加的Ｃ−２’，Ｃ−５’ジオキサレン環を含むビシクロ［３．３．０］および［４．３．０］ヌクレオシド；アミドおよびスルホンアミド型インターヌクレオシドリンケージの部分としてＣ−２’，Ｃ−３’メタノブリッジをもつビシクロ［３．１．０］ヌクレオシドを含む２量体。
【００４９】
−フォマセタルインターヌクレオシドリンケージにより３量体の中央に合体するビシクロ［３．３．０］グルコース由来ヌクレオシド同類体
【００５０】
−２つの５員環および１つの３員環がバックボーンを形成するトリシクロ−ＤＮＡ
【００５１】
−１，５アンヒドロヘキシトール核酸；および
【００５２】
−付加的Ｃ−２’，Ｃ−３’結合した６および５員環をもつ二環［４．３．０］および［３．３．０］ヌクレオシド。
【００５３】
ｄｓＲＮＡに使用される他の非標準ヌクレオシドおよび非標準インターヌクレオシドリンケージ（‘バックボーン’）は、例えば、Ｆｒｅｉｅｒ，１９９７（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：４４２９−４４４３）あるいはＰｒａｓｅｕｔｈ等（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １４８９：１８１−２０６）。
【００５４】
本発明の精製ＨｓｐＥ７はプロセスＬ ＨｓｐＥ７（あるいはプロセスＬ）として参照される。理論を超える望みはなく、一つあるいはそれ以上の組成物がプロセスＬ ＨｓｐＥ７精製の間ＨｓｐＥ７調合から除去され、そして一つあるいはそれ以上の組成物がより低い純度（プロセスＡ）ＨｓｐＥ７調合にアジュバントのような活性を分け与える。しかしながら、ＨｓｐＥ７組成物の臨床的試行および規定の承認に対して、組成物内の未知の組成物のパーセントは最小にする必要がある。
【００５５】
ＨｓｐＥ７の生物学的活性により、それはＨｓｐＥ７による体外あるいは体内の生物学的活性の調整、増加、刺激のいずれかを意味する。生物学的活性はＨｓｐＥ７による体外あるいは体内の生物学的活性の阻害をまた含む。多くのそのような活性はＨｓｐＥ７の生物学的活性を決定する基本として知られそして使用される。制約を考慮されない例として、Ｅ７特異ＣＤ８陽性Ｔリンパ球の誘発はＨｓｐＥ７の生物学的活性を決定するために使用される。この性質を測定するために設計された評価の一つの型（ＥＬＩＳＰＯＴ）は与えられた数の脾臓細胞当りのＩＦＮガンマ産出細胞の数が関心のある化合物あるいは混合物をもつＣ５７Ｂ１／６のハツカネズミの引き続く治療を決定する（実施例２参照）。交互の評価は関心のある化合物あるいは混合物でＴＣ１のハツカネズミを治療しそして一定時間、例えば、４９日の間隔の後、腫瘍発生率のパーセントを決定することによりＨｓｐＥ７の抗腫瘍活性を決定することを含む（実施例２参照）。代わりに、細胞溶解活性の刺激（ＣＴＬ評価）はまた当業者に知られているように使用される。生物学的活性はまた特異な細胞仲介の誘発あるいは免疫原あるいは抗体に対する液性応答を含み、種々な型およびサブ型の特異抗体の産出を含む。
【００５６】
ＨｓｐＥ７の精製から起きる活性の損失はＨｓｐＥ７組成物に対して制限されないでＴＬＲ作用薬のような適当なアジュバントあるいは免疫刺激剤の添加で復活される。ＨｓｐＥ７組成物を設計し直すためにアジュバントはＨｓｐＥ７活性復活におけるこれらの効率に対して試験された。これらのアジュバントはＣｐＧオリゴヌクレオチド、ＰｏｌｙＩ：Ｃ、ＰｏｌｙＩＣＬＣ、ＭＰＬ、ＭＰＬ−ＴＭＤ、イミキミド、粗いＬＰＳ（リポ多糖）、平滑ＬＰＳ、Ｐａｍ３ＣｙｓＳＫ４、抗ＣＤ４０、硫酸バンド、およびフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）を含む。
【００５７】
“アジュバント”あるいは“免疫刺激剤”は免疫原と組み合わされたとき免疫原に対して免疫応答を強化するかあるいは増強する物質あるいは組成物の組み合わせである。免疫応答の強化あるいは増強はここで記述される評価を含む標準評価を使用して決定される。アジュバントあるいは免疫刺激剤は１つあるいは１つ以上の組成物を含む。
【００５８】
“免疫応答”は適応性のある、液性の、生来のそして細胞調整システムを含む免疫システムの前炎症性あるいは抗炎症性応答のいずれかを意味している。用語“調整する”あるいは“調整”あるいは同様なことは選択された変数における増加あるいは減少のいずれかを意味する。
【００５９】
精製ＨｓｐＥ７に対するいくつかの良く知られたアジュバント、例えば、硫酸バンドあるいはフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ；図８、実施例６を参照）は、例えば、制限されないでプロセスＬ ＨｓｐＥ７精製に続いて観察されたＨｓｐＥ７と結びついた生物学的活性の損失を回復しなかった。同様に、粗ＬＰＳ（実施例７、図９）、イミキモド（実施例７、図９）、あるいはＰａｍ３ＣｙｓＳＫ（実施例７、図９）の混合はまたＨｓｐＥ７生物学的活性を増強しなかった。しかしながら、精製ＨｓｐＥ７のＣｐＧオリゴヌクレオチド（例えば、実施例３、図２および３）、ＰｏｌｙＩ：Ｃ（実施例４、図３）、ＰｏｌｙＩＣＬＣ（図５）、モノリン酸リピドＡ（ＭＰＬ；図４）、あるいは抗ＣＤ４０（図９）との混合は高精製ＨｓｐＥ７と結びつく生物学的活性の回復の結果となった。ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ＰｏｌｙＩ：ＣあるいはＰｏｌｙＩＣＬＣの添加はＨｓｐＥ７なしに投与されたとき、この活性を示さなかった。
【００６０】
それ故、本発明は精製ＨｓｐＥ７をＣｐＧオリゴヌクレオチド、ＰｏｌｙＩ：Ｃ、ＰｏｌｙＩＣＬＣ、モノリン酸リピドＡ（ＭＰＬ）、ＭＰＬ−ＴＤＭ、および抗ＣＤ４０を含むグループから選ばれた免疫刺激剤と一緒に混合あるいは共投与することからなる高精製ＨｓｐＥの生物学的活性の増加の方法にまた関係する。望ましくは、免疫刺激剤は約０．１μｇから約２０ｍｇの量、あるいはその間のいずれかの量、例えば、約１μｇから約５０００μｇ／投与の量あるいはその間のいずれかの量、約１０μｇから１０００μｇの量あるいはその間のいずれかの量、あるいは約３０μｇから約１０００μｇの量あるいはその間のいずれかの量で提供される。例えば、約０．１、０．５、１．０、２．０、５．０、１０．０、１５．０、２０．０、２５．０、３０．０、３５．０、４０．０、５０．０、６０．０、７０．０、８０．０、９０．０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、５０００、１００００、２００００μｇの投与量、あるいはその間の量が使用される。同様に、精製ＨｓｐＥ７は約０．１μｇから約２０ｍｇの量、あるいはその間のいずれかの量、例えば、約１μｇから約２０００μｇ／投与量あるいはその間の量、約１０μｇから約１０００μｇの量あるいはその間のいずれかの量、あるいは約３０μｇから約１０００μｇの量あるいはその間のいずれかの量が使用される。例えば、約０．１、０．５、１．０、２．０、５．０、１０．０、１５．０、２０．０、２５．０、３０．０、３５．０、４０．０、５０．０、６０．０、７０．０、８０．０、９０．０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、５０００、１００００、２００００μｇの投与量、あるいはその間のいずれかの量が使用される。
【００６１】
“効果的な量”は希望するあるいは指示された免疫学的あるいは治療効果を生むために効果のある本発明の化合物あるいは組成物の量に関する。哺乳類あるいは被験者内で達成できる投与量の制限のない例は要求により、約０．０３ｍｇ／ｋｇから約３０ｍｇ／ｋｇＨｓｐＥ７、免疫刺激剤、あるいは両者、あるいはその間のいずれかの量である。しかしながら、０．０３ｍｇ／ｋｇより少なく、あるいは３０ｍｇ／ｋｇより多くのＨｓｐＥ７、免疫刺激剤、あるいは両者の投与量はまた使用されそしてまたここで熟慮される。当業者はＨｓｐＥ７、免疫刺激剤、あるいは両者の適当な投与量を決定することができる。
【００６２】
さらに、本発明は精製ＨｓｐＥ７およびＣｐＧ、ＰｏｌｙＩ：Ｃ、あるいはＰｏｌｙＩＣＬＣのようなＴＬＲ３作用薬、ＭＰＬ、およびＣＤ４０からなるグループから選ばれた免疫刺激剤からなる組成物を提供する。望ましくは、上記したように免疫刺激剤は約０．１μｇから約２０ｍｇ／投与量、あるいはその間のいずれかの量で提供する。
【００６３】
本発明はまた精製ＨｓｐＥ７およびＣｐＧ、ＰｏｌｙＩ：Ｃ、あるいはＰｏｌｙＩＣＬＣのようなＴＬＲ３作用薬、ＭＰＬ、およびＣＤ４０からなるグループから選ばれた免疫刺激剤を含む組成物を投与する被験者、動物、患者の腫瘍の増殖を減らす方法に関係する。望ましくは、上記したように、それを必要とする被験者、動物、患者に免疫刺激剤は約０．１μｇから約２０ｍｇ／投与量、あるいはその間のいずれかの量で提供される。
【００６４】
用語“患者”あるいは“被験者”はヒトそして他の霊長類、愛玩動物、制約はなく猫、犬、齧歯類、ドブネズミ、ハツカネズミ、ハムスター、兔、馬、牛、羊、豚、山羊を含む動物園および農園の動物；家禽類；その他を含む哺乳類および他の動物に適用される。
【００６５】
本発明のＨｓｐＥ７組成物はいずれかの適切な薬学的キャリアーあるいは塩で混合される。“薬学的に適切な塩”は本発明の組成物の比較的無毒の、無機および有機酸添加塩、および塩基性添加塩に適用される。これらの塩は組成物の最終分離および精製の間にその位置で調合される。特に、酸性添加塩は適切な有機あるいは無機酸で塩基性でない精製化合物を別々に反応させそしてこのように形成された塩を分離することによって調合される。実施例の酸性添加塩は臭化水素、塩化水素、硫酸塩、酸性硫酸塩、燐酸塩、硝酸塩、酢酸塩、蓚酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリ酸塩、硼酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、燐酸塩、トシラート、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、琥珀酸塩、酒石酸塩、ナフチレート、メシレート、グルコヘプトン酸塩、ラクチオビオナート、スルファミン酸塩、マロン酸塩、サリチル酸塩、プロピオン酸塩、メチレン−ビス−β−ヒドロシルナフタレン酸塩、ゲンチサート、イセチオン酸塩、ジ−p−トルオイルタータレート、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、シクロヘキシルスルファメートおよびキナテスラウリルスルホン酸塩、および同等品を含む。例えば、ここに参照として取り入れられるＳ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅ等、“薬学的塩”、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、６６，１−１９（１９５５）を参照。塩基性添加塩は適切な有機あるいは無機塩基と酸性の形の精製化合物を別々に反応させそしてこのように形成された塩を分離することによって調合される。塩基性添加塩は薬学的に適切な金属およびアミン塩を含んでいる。適切な金属塩はナトリウム、燐、カルシウム、バリウム、亜鉛、マグネシウムおよびアルミニウム塩を含む。ナトリウムおよび燐の塩は望ましい。適切な無機塩基性添加塩は水素化ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化アルミニウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化亜鉛を含む金属塩基から調合される。適合するアミン塩基性塩は安定した塩を形成するために十分な塩基性をもつアミンから調合され、そして望ましくは低い毒性そして医療用のための容認性の理由で医療化学においてしばしば使用されるアミン、例えば、アンモニア、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、リジン、アルギニン、オルニシン、コリン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、ジエタノールアミン、プロカイン、Ｎ−ベンジルフェネチルアミン、ジエチルアミン、ピペラジン、ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）−アミノメタン、水酸化テトラメチルアンモニウム、トリエチルアミン、ジベンジルアミン、エヘンアミン、デヒドロアビエチルアミン、Ｎ−エチルピペリジン、ベンジルアミン、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、エチルアミン、塩基性アミノ酸、例えば、リジンおよびアルギニン、およびジシクロヘキシルアミン、および同等品から調合される。
【００６６】
本発明のＨｓｐＥ７組成物は注射、皮膚貼り付け、あるいは口を含むいずれかの適切なルートにより投与される。このように、一つの観点で、本発明は、免疫刺激剤、例えば、抗ＣＤ４０、あるいはＣｐＧを含むＴＬＲ作用薬、あるいはＰｏｌｙＩ：Ｃ、あるいはＰｏｌｙＩＣＬＣのようなＴＬＲ３作用薬、あるいはＭＰＬ、あるいはそこから薬学的に許認される塩と、１つあるいはそれ以上の薬学的あるいは生理学的に許認される緩衝液、キャリアー、添加剤、希釈剤、および任意に他の治療薬剤と一緒に混合された精製ＨｓｐＥ７を含む組成物からなるヒトおよび獣医医療使用の薬学的組成物を提供する。本発明の組成物は個々に、あるいは２つあるいはそれ以上の組成物からなる混合物として投与されることは注意すべきである。本発明は、伝染病あるいは病理学、あるいは炎病性の免疫応答が有益である病気の状況あるいは状態の予防あるいは治療のための薬剤の調合のために、ＣｐＧを含むＴＬＲ作用薬、あるいはＰｏｌｙＩ：Ｃあるいはそこから薬学的に許認される塩と混合された精製ＨｓｐＥ７を含む組成物の使用をまた包含する。
【００６７】
本発明の組成物は、塩、緩衝薬剤、保存剤、同等のキャリアー、希釈剤、添加剤、分散剤、その他、および任意の他の治療成分の薬学的あるいは生理学的に許認される濃度を含む薬学的あるいは生理学的に許認される溶液中で投与される。本発明の化合物および組成物は当業者に知られた種々の標準の薬学的許認の非経口的調合でこのようにして調合される。
【００６８】
本発明の薬学的組成物は薬学的あるいは生理学的に許認される緩衝液、キャリアー、添加剤、あるいは希釈剤に任意に含まれる今回開示する組成物の効果的量を含む。用語“薬学的あるいは生理学的に許認される緩衝液、キャリアー、添加剤、あるいは希釈剤”はヒトあるいは他の動物への投与に適した１つあるいはそれ以上の同等の固体あるいは液体の充填物、希釈物あるいはカプセルに入れた薬物を意味する。用語“キャリアー”は活性成分が効果を促進するために組み合わされる有機あるいは無機成分、天然あるいは合成品を意味している。薬学的組成物の配合成分は本発明のポリマーとそして互いに望ましい活性組成物の薬学的効果を本質的に弱めなく反応のないような方法で混合されることができる。
【００６９】
非経口的投与に適した組成物は受容者の血液に等調な殺菌した水溶液調合から便利よくなっている。容認される媒体および溶媒の一つは水、リンゲル液、そして等調の塩化ナトリウム溶液である。付け加えると、殺菌した凝固油は溶媒あるいは懸濁培地として便利よく採用される。この目的のために、いずれの穏やかな凝固油も合成モノ−あるいはジグリセリドを含んで採用される。付け加えると、オレイン酸のような油脂性酸は注射可能な調合に効果的である。皮下、筋肉内、腹腔内、静脈等の投与に適したキャリアー調合はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，第１９版，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，（１９９５，参照によりここに組み込まれる）に見いだされる。
【００７０】
組成物は単位投与量あるいは投与単位形式で便利よく提供され、そして薬学の技術としてよく知られたいずれかの方法により提供される。全ての方法は１つあるいはそれ以上の付属の成分を構成するキャリアーと一緒に組成物をもたらす段階を含んでいる。一般的に、組成物は液体キャリアー、綺麗に区分された固形キャリアー、あるいはその両者と一緒に組成物を均一にそして親密にもたらすことにより提供される。本発明の組成物は冷凍乾燥して保存されそして使用前に混合するためのキットとして提供される。
【００７１】
他の供給システムは時間−放出、遅延−放出、あるいは維持−放出供給システムを含んでいる。このようなシステムは被験者および内科医に対して便利性を増す本発明の組成物の繰り返し投与を防止することができる。
【００７２】
薬剤を含む前記ポリマーのマイクロカプセルは、例えば、ＵＳ特許５，０７５，１０９に記述されている。供給システムはまた次のような非ポリマーシステムを含んでいる：コレステロール、コレステロールエステルのようなステロールおよびモノ−、ジ−、およびトリ−グリセリドのような脂肪酸あるいは天然脂肪を含む脂質；水素放出システム；シラスティックシステム；ペプチドベースのシステム；ワックス被覆、従来の結合剤および添加剤を使用する圧縮された錠剤；部分的に一体となった埋め込み物；および同様なもの。
【００７３】
ＨＰＶ感染と関連する慢性ＨＰＶ感染あるいは病理学、あるいは免疫システム刺激から利益を得る病気あるいは障害の予防あるいは治療の必要性のあるヒトあるいは動物に投与する組成物の最適量の決定は、このような組成物からなる治療あるいは薬学的組成物を投与する方法と同様に、全く薬学、医学、そして獣医学の技術の技能内である。ヒトあるいは動物の投与量は、ＨＰＶ感染と関連する慢性ＨＰＶあるいは病理学あるいは治療される病気あるいは障害の性質、患者の状態、体重、一般的な健康、セックス、ダイエット、時間、継続期間、および投与のルート、吸収速度、分配、新陳代謝、および組成物の排出、他の薬剤との組み合わせ、ＨＰＶ感染と関連する慢性ＨＰＶあるいは病理学あるいは治療される病気あるいは障害の重大性、そして治療される病理学あるいは病気の状況の応答性に依存し、そして効果の望ましい水準を得るために容易に最適化される。治療のコースは数日、数週あるいは数月間、あるいは治療効果があるかあるいは病気の状況の容認される縮小あるいは防止が達成されるまで続けられる。最適の投与スケジュールは治療の効果と関連して患者の身体における免疫応答の測定から計算される。通常の技能の人は容易に最適投与量、投与手順、および反復速度を決定できる。最適投与量は免疫調合ポリマー組成物の効能に依存して変化し、そして体外そして体内の動物モデルにおける効果でみられるＥＤ５０ 値を基準として一般的に推算される。ＨＰＶ感染と関連する慢性ＨＰＶあるいは病理学あるいは治療される病気あるいは障害の治療あるいは防止のために提供される組成物、これらの組成物を含む供給媒体、作用薬の効果的な量、および治療処方箋は従来の手段で決定される。例えば、医療あるいは獣医の開業医は、最初の被験者あるいは患者に低い投与量の組成物あるいは被験者あるいは患者に最初のセットで治療を開始し、そして第２のあるいは続く被験者あるいは患者に投与量を増加するか、あるいは第２のあるいは続く被験者あるいは患者に系統的に投与量養生法あるいは第２のあるいは続く被験者あるいは患者のセットを変え、被験者あるいは患者におけるその効果を観察し、そして希望する治療的効果を最大化するための投与量あるいは治療様態を調整する。投与量および治療養生の最適化のさらなる議論はＧｏｏｄｍａｎｎ＆ＧｉｌｍａｎのＢｅｎｅｔ等、（１９９６、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｎｉｎｔｈ Ｅｄｉｔｏｎ、Ｈａｒｄｍａｎ等編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、第１章、３−２７頁、参照によりここに取り入れられる）；あるいはＢａｕｅｒ（Ｌ．Ａ．Ｂａｕｅｒ，１９９９，Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ内、Ａ Ｐｈａｔｈｏｐｈｓｉｏｌｏｇｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４版、ＤｉＰｉｒｏ等編、Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ、Ｓｔａｍｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ、第３章、２１−４３頁；参照によりここに取り入れられる）にみられる。
【００７４】
いくつかの投与のルートが利用できる。選らばれる特殊なモードはどのような組成物が選ばれ、治療される特殊な状態、そして治療効果のために要求される投与量に依存する。一般的に言えば、本発明の方法は、臨床の容認されない反対の効果を起こすことなく免疫応答の効果的水準を生み出すモードを意味する医療的に容認されるいずれかの投与のモードを使用して実施される。投与の望ましいモードは、経口投与はまた採用されるけれども非経口的ルートである。この目的のために、用語“非経口的”は皮下の、内皮の、静脈内の、筋肉内の、あるいは腹腔内の注射、あるいは点滴技術を含んでいる。
【００７５】
本発明の背景で、ここで使用される用語“治療”、“治療法の使用”あるいは“治療の処方計画”は、本発明の組成物の投与の予防の、一時的緩和の、そしての治療法の様態を包含していることを意味し、そしてＨＰＶ感染あるいは治療される他の病気あるいは障害と関連する慢性のＨＰＶ感染のあるいは病理によっておきる病気の状況、状態、兆候、信号、あるいは障害を治療し、あるいはそれと関連する兆候、信号、状態、あるいは障害の進行を防止し、遅らせ、妨害し、あるいは逆転する本特許請求項の組成物の何れかのそして全ての使用を包含する。このように、慢性ＨＰＶ感染と関連する望まない病気の状況、兆候、状態、信号、あるいは障害、あるいはＨＰＶ感染と関連する病理、あるいは身体の免疫反応の刺激から利益を得る他の病気あるいは障害のどのような防止、改善、緩和、逆転あるいは完全な排除も本発明によって包含される。
【００７６】
本発明の目的に対して、用語“治療する”“治療”および癌療法に適用される
同様の用語は広範囲で そして技術において通常受け入れられている広い種々な異なる概念を含んでいる。このように、ここで使用されるこの用語は、制約されずに、進展する病気の時間の延養；腫瘍の縮小；病気の緩和；苦痛の軽減；生活の質の改善；痛み、呼吸困難、食欲の損失および体重の損失、疲労、衰弱、躁鬱状および苦悩、精神錯乱、その他のような症状の改善あるいは調整等；患者の安楽の改善等を含んでいる。別のゴールは全く完全に病気を治すことにある。
【００７７】
本発明のＨｓｐＥ７は非上皮内腫瘍（非新生物）、ＨＰＶ感染細胞、あるいは病気の状況を誘発されたＨＰＶ、例えば制約なしに生殖器のいぼ、過細胞増殖状態、ウイルス感染細胞、慢性的なウイルス感染細胞および同様なものを治療するために使用される。
【００７８】
用語“癌”は多くの定義がある。米国癌協会に従えば、癌は異常な細胞の制御不可能な増殖（および時には広がり）により特徴づけられる病気のグループである。しばしば単独の状態として参照されるが、癌は２００以上の異なる病気からなっている。癌性の増殖はこのような細胞が元気な器官の正常な機能を防ぎ、身体を通して拡散するとき、損傷しつつある必要不可欠なシステムを殺す。本発明の化合物あるいは組成物の効果的な量をその必要において動物あるいは被験者に投与することからなる方法で、動物あるいは被験者に受け入れられる上皮内腫瘍（新生物）を治療するために使用される。
【００７９】
本発明の組成物が治療薬剤として効果的である癌の異なる制限のない例は次を含む：多形性膠芽腫、星状膠細胞腫、乏突起膠細胞腫瘍、上皮細胞腫、脈絡叢乳頭腫、松果体腫瘍、神経細胞性腫瘍、髄芽細胞腫、神経鞘腫、髄膜腫および脳軟膜肉腫を含む中枢神経系の上皮内腫瘍のような腫瘍；基底細胞癌、扁平上皮癌、黒色腫、横紋筋腫、および網膜芽細胞腫を含む眼の上皮内腫瘍；下垂体上皮内腫瘍、甲状腺上皮内腫瘍、副腎臓外皮の上皮内腫瘍、神経内分泌系の上皮内腫瘍、胃のカルチノイド腫瘍内分泌系の上皮内腫瘍および生殖腺の上皮内腫瘍を含む内分泌線の上皮内腫瘍；頭および首の癌、口腔、咽頭、および咽喉の上皮内腫瘍、および菌原生腫を含む頭および首の上皮内腫瘍；大細胞肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、悪性胸膜中皮腫、胸腺上皮腫瘍、および胸郭の原発胚細胞腫瘍を含む胸腔の上皮内腫瘍；食道、胃、肝臓、胆嚢、外分泌膵臓、小腸、虫垂、および腹膜の上皮内腫瘍、結腸および直腸の腺癌および肛門の上皮内腫瘍を含む消化器細管の上皮内腫瘍；腎臓細胞癌、腎盤、尿管、膀胱、尿道、前立腺、ペニス、睾丸の上皮内腫瘍含む泌尿生殖器路の上皮内腫瘍；外陰部および膣、子宮頸部の上皮内腫瘍、子宮体の腺癌、卵巣癌、産婦人科の肉腫および胸の上皮内腫瘍を含む女性性殖器；基底細胞癌、扁平上皮癌、隆起性皮膚線維肉腫、メルケル細胞腫および悪性黒色腫を含む皮膚の上皮内腫瘍；骨肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、原始神経外胚葉腫瘍、および脈管肉腫を含む皮膚の上皮内腫瘍；骨髄異形症候群、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、ＨＴＬＶ−１および５細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、有毛細胞白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、および肥満細胞白血病を含む造血臓器系の上皮内腫瘍；急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、神経芽細胞腫、骨腫瘍、横紋筋肉腫、リンパ腫、腎臓腫瘍を含む子供の上皮内腫瘍。
【００８０】
ＰＣＴ特許出願 ＷＯ ９９／０７８６０は、ＨｓｐＥ７の製造方法に追加して、種々の型のＨＰＶ感染の制約のない議論および慢性ＨＰＶとリンクするかあるいは結びつくことにより起きるいくつかの病理学あるいはＨＰＶ感染と結びつく病理を提供する。本発明の組成物が療法薬剤として有効であるＨＰＶ感染とむすびつく慢性ＨＰＶあるいは病理学の異なる型の他の（制約のない）例は、次のものを含む：子宮頸部上皮内腫瘍（例えば、ＨＰＶ型１６、１８、３１、３３、３５、３９）、ボーエン様丘疹症（例えば、ＨＰＶ型１６、１８、３３、３９）、ブシュケ−レーヴェンシュタイン腫瘍（例えば、ＨＰＶ型６、１１）、肉屋／肉の取扱者のいぼ（例えば、ＨＰＶ型７）、有棘細胞癌（例えば、ＨＰＶ型３８、４１、４８）、疣贅状表皮発育異常症（例えば、ＨＰＶ型１−５、７−９、１０、１２、１４、１５、１７−２０、２３−２５、３６、４７、５０）、角質化棘細胞腫（例えば、ＨＰＶ型７７）、口腔病巣性粘液沈着症（ヘック病）（例えば、ＨＰＶ型１３、３２）、腎臓移植患者のいぼ（例えば、ＨＰＶ型７５−７７）、通常いぼ（尋常性疣贅）、糸状いぼ、扁平いぼ、足底、手掌あるいはモザイクいぼ、爪囲被角いぼ、不応性いぼ、生殖器いぼ、コンジローム、陰部湿疣、陰部いぼ、皮膚パピローマウイルス病、扁平上皮細胞乳頭腫、移行細胞乳頭腫（膀胱乳頭腫）、および同様なもの。
【００８１】
特別の治療養生は、特別な慢性ＨＰＶ感染あるいはＨＰＶ感染と結びつく病理あるいは他の治療される病気あるいは障害、その感度および患者の全体の状態に依存する時間の間続き、そして数日、数週間、数ヶ月、あるいはそれより永く１日に１回あるいは数回、全化合物を含む組成物の投与を含む。治療に続き、患者は彼／彼女の状態の変化そして兆候、信号あるいは障害の状態あるいは病気の状況の緩和について観察される。組成物の投与量は、患者がその時の投与量水準に十分に応答していない場合に増加されるか、あるいは障害の兆候あるいは病気の状況の緩和が観察されるか、あるいは障害あるいは病気の状況が融除されるなら減らされる。
【００８２】
最適の投与スケジュールは本発明の治療効果量の組成物を引き渡すために使用される。本発明の目的のために、ここに開示される組成物に関する用語“治療効果量”あるいは“治療的な効果量”は毒性、焦燥、あるいはアレルギー性の応答のような望ましくない副効果なしに完全に意図した目的を達成するために効果的である組成物の量に関する。個々の患者の必要量は変わるけれども、薬剤組成物の効果的量の最適範囲の決定は当業者内である。ヒト投与量は動物の研究から外挿される（Ａ．Ｓ．Ｋａｔｏｃｓ、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第１９版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．（１９９５）、第３０章、参照によりここに組み込まれる）。通常、当業者により調整される薬学組成物の治療的な効果量を提供するために要求される投与量は、年齢、健康、身体的条件、体重、受容者の病気あるいは障害の型および程度、治療の頻度、同時に存在する治療の性質、そして希望する効果の性質および範囲に依存して変わる。
【００８３】
本発明のいくつかの実施態様において、投与スケジュールは、治療養生として代わりに参照され、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日あるいはもっと多い日数にわたり、ここに記述する組成物の効果的な量の投与からなる。例えば、４日間の投与スケジュールに対して（日数０は最初の投与の日である）投与量は連続した日、あるいは不連続な日、あるいはこれらの組み合わせで投与される。いくつかの実施例では、投与スケジュールは０日目および１日目；０日目および２日目；０日目および３日目；０日目および４日目；０日目、１日目および２日目；０日目、１日目および３日目；０日目、１日目および４日目；０日目、２日目および３日目；０日目、２日目および４日目；０日目、２日目および４日目；０日目、３日目および４日目；および同様の投与を含む。
【００８４】
他の実施態様において、投与スケジュールは、例えば、皮膚の吸収薬を経てあるいは移殖により投与される緩やかな放出調合において連続的で効果的である。
【００８５】
本発明のいくつかの実施態様において、精製ＨｓｐＥ７、免疫刺激剤、および使用のための取扱説明書を含むキットが提供される。免疫刺激剤はＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、ＰｏｌｙＩ：ＣあるいはｐｏｌｙＩＣＩＣのようなＴＬＲ３作用薬、モノリン酸リピドＡ（ＭＰＬ）、ＭＰＬ−トレハロース ６，６’−ジミコレート（ＭＰＬ−ＴＤＭ）、および抗ＣＤ４０を含み、制約なくいずれかのヌクレオシド、インターヌクレオシド結合をもつｐｏｌｙＩＣ核酸およびここに記述する組成物を含む。代わりに、キットは薬局あるいは内科医あるいは他の適当な人によって投与の箇所で単独の投与ユニットに分轄される多重投与調合を提供する。
【００８６】
本発明は分子生物学、微生物学、ウイルス学、ＤＮＡ組み替え技術、溶液中のペプチド合成、固相ペプチド合成、および免疫学の従来技術を使用している。このような手順は、例えば、参照として取り入れられる次の原典に記述されている。
１． Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （１９８９）， ｗｈｏｌｅ ｏｆ ＶｏＩｓ Ｉ， ＩＩ， ａｎｄ ＩＩＩ；
２． Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （Ｍ． Ｊ． Ｇａｉｔ， ｅｄ．， １９８４） ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｇａｉｔ， ｐｐ． １−２２； Ａｔｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ｐｐ． ３５−８１； Ｓｐｒｏａｔ ｅｔ ａｌ．， ｐｐ． ８３− １１５； ａｎｄ Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， ｐｐ． １３５−１５１；
３． Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ： Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｊｏｈｎ Ｒ．Ｗ． Ｍａｓｔｅｒｓ， ｅｄ．， ２０００）， ＩＳＢＮ ０１９９６３７９７０；
４． Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （１９８６） ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， ｗｈｏｌｅ ｏｆ ｔｅｘｔ；
５． Ｊ． Ｆ． Ｒａｍａｌｈｏ Ｏｒｔｉｇａｏ， “Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ” Ｉｎ： Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ Ａｃｃｅｓｓ ｔｏ Ｖｉｒｔｕａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｗｅｂｓｉｔｅ （Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ）；
６． Ｂａｒａｎｙ， Ｇ． ａｎｄ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｒ．Ｂ． （１９７９） ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ （Ｇｒｏｓｓ， Ｅ． ａｎｄ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ． ｅｄｓ．）， ｖｏｌ． ２， ｐｐ．１−２８４， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；
７． Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ， Ｍ． （１９８４） Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ− Ｖｅｒｌａｇ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ； Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ， Ｍ． ＆ Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ， Ａ． （１９８４） Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ− Ｖｅｒｌａｇ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；
８． Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ＶｏＩｓ． １−ＩＶ， Ｄ． Ｍ． Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ． Ｃ． Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ， ｅｄｓ．， １９８６， Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ．
【００８７】
本発明は次の実施例でさらに説明される。
【００８８】
［実施例］
［実施例１：ＨｓｐＥ７調合］
Ｈｓｐ６５−Ｅ７融合（ＨｓｐＥ７）はＷＯ９９／０７８６０に記述されるように得られた（参照としてここに組み込まれる）。ＨｓｐＥ７はＨｓｐ６５遺伝子（ｐＥＴ６５Ｈ）のカルボキシ端末に挿入された完全ＨＰＶ１６Ｅ−コーディング領域からなる融合蛋白質である。ＨｓｐＥ７はプロセスＡ ＨｓｐＥ７に関連し、そして要求によりＮｖｅｎｔａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから利用できる。
【００８９】
利用に先立ち、ＨｓｐＥ７は純度９５％以上に精製される。ＨｓｐＥ７発現のＥ大腸菌の種培養が２５０Ｌの発酵媒体を接種するために使用された。発酵工程の間、イースト抽出物およびグルコースが餌として添加され、そして純酸素が十分な曝気を行うため発酵容器に強く供給された。ＨｓｐＥ７の発現はＩＰＴＧ（イソプロピール−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）の添加によって誘発された。発酵物の内容はそれから−２０℃以下に冷却されそして細胞のペーストは遠心分離によって収集された。細胞ペーストは尿素および亜硫酸分解剤を含む緩衝液に再懸濁された。亜硫酸分解剤はＨｓｐＥ７中のスルフヒドリル基のグループをＳ−スルホシステインに転換した。ＨｓｐＥ７の溶液はＰＥＩ（ポリエチレンイミン）で沈澱することにより精製され、その等電点で製品の沈澱を続けた。ＨｓｐＥ７はそれから一連の陽イオンおよび陰イオンのクロマトグラフィ段階を使用して均一に精製され、そして修飾スルフヒドリルはＤＴＴ（ジチオトレイトール）で希釈された。最終的に、ＨｓｐＥ７はヒスチジン／マニトール緩衝液中に超濾過そして透析濾過され、そして−７０℃で貯蔵された。ＨｓｐＥ７の精製された形式はプロセスＬ ＨｓｐＥ７と称される。
ＨｓｐＥ７の純度はゲル電気泳動法によって決定された。
【００９０】
下記に概要を示すように、高精製プロセスＬ ＨｓｐＥ７はより低純度（プロセスＡ ＨｓｐＥ７）製品と比較したとき、生物学的活性を失うことを観察された。低純度のＨｓｐＥ７製品（プロセスＡ ＨｓｐＥ７）はＷＯ９９／０７８６０に開示された生物学的活性を示した。
【００９１】
［実施例２：ＨｓｐＥ７調合の決定生物学的活性］
［ＩＮＦ−ガンマの脾臓細胞産生の抗原−特異刺激：ＥＬＩＳＰＯＴ評価］
Ｅ７特異ＣＤ８陽性Ｔリンパ球（ＩＦＮ−ガンマ産生細胞）を誘発するＨｓｐＥ７の能力の増加は、次のようにＥＬＩＳＰＯＴによりＥ７ペプチドの存在において決定された（Ａｓａｉ．Ｔ等、２０００、Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７（２）：１４５−１５４）：ハツカネズミはＨｓｐＥ７で、アジュバントがあるあるいはなしで、２００μＬの全量で頸の首筋に皮下で免疫化された。５日から７日後に、ハツカネズミは犠牲にされ、その脾臓は切除され単一細胞懸濁液中で処理された。細胞は抗ハツカネズミＩＦＮガンマ抗体で予め被覆されたＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社の濾過プレート上に完全なＲＰＭＩにプレートにされた。プレートは３７℃で２０時間培養された。細胞は洗浄されそしてＩＦＮガンマスポットがビオチン標識された二次抗ハツカネズミＩＦＮガンマ抗体でプレートの培養により検出された。スポットはＶａｃｔａｓｔａｉｎ社 ＡＢＣ ＥｌｉｔｅキットおよびＡＥＣ基板で可視化された。スポットはＺｅｉｓｓ社自動ＥＬＩＳＰＯＴ計数機で計数された。
【００９２】
［腫瘍縮小評価］
腫瘍縮小は腫瘍細胞ラインＴＣ−１．Ｋからなる評価を使用して決定され、肺上皮腫瘍はＨＰＶ１６Ｅ６およびＥ７癌遺伝子で安定的にトランスフェクトされた。ＴＣ−１．Ｋ細胞は７日後試験試料注射およびその後通常の腫瘍触診によりハツカネズミに移殖された。評価は、Ｃｈｕ Ｎ．Ｒ．等（Ｃｈｕ Ｎ．Ｒ．等、２０００、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２１（２）：２１６―２２５）に基本的に記述されたように、ＴＣ．１Ｋ腫瘍細胞を培養のため播種しそして年齢７−１４週のＣ５７ＢＬ／６ハツカネズミ内に移殖する前に細胞の数を拡大することを含む。腫瘍移植後７日後、腫瘍を帯びたハツカネズミは試験および制御試料で治療された。典型的に１８０のハツカネズミのグループは６の等分のグループに区分され、そして各グループは制御（賦活剤のみ）かあるいは５０、１００、２００、４００あるいは８００μｇのＨｓｐＥ７参照試料で注射される。ハツカネズミは１４、２８そして４９日において腫瘍のため激しく動悸を打った。
【００９３】
［実施例３：ＨｓｐＥ７に対するＴＬＲ９作用薬ＣｐＧの効果］
図１に示すように、プロセスＡ ＨｓｐＥ７の抗腫瘍活性は、プロセスＬ ＨｓｐＥ７の同等の投与量と比較したとき、同じかあるいは減った腫瘍発生率を達成する低い投与量でプロセスＬ ＨｓｐＥ７よりも大きい。この評価のため確立したＴＣ−１腫瘍を帯びたハツカネズミはプロセスＡあるいはプロセスＬ（ｎ＝３０／ｇｒｐ／投与）のいずれかにより製造されたＨｓｐＥ７の等級のある投与量で頸の首筋に皮下注射されそして４９日間腫瘍増殖に従わされた。
【００９４】
Ｅ７特異ＣＤ８陽性Ｔリンパ球を誘発するためにＨｓｐＥ７の活性の増大はＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＴＬＲ９作用薬）の存在で決定された。生来のＣ５７Ｂ１／６ハツカネズミは実施例２に記述されるように、２つの異なる精製プロセス（４００μｇプロセスＡ ＨｓｐＥ７あるいは４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７）によって製造されたＨｓｐＥ７のみか、あるいはＨｓｐＥ７（４００μｇプロセスＡ ＨｓｐＥ７あるいは４００μｇプロセスＬ ４００μｇプロセスＡ ＨｓｐＥ７あるいは４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７のいずれか）プラス３０μｇのＣｐＧ（ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＣＧ ＴＴＣ ＣＴＧ ＡＴＧ ＣＴ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１；ホスホロチオエートバックボーンそしてＺＯＯ ＦＺＥ ＦＯＥ ＺＺＯ ＯＺＥ ＦＺＥ ＯＴと表示されたものからなりＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から得られる）のいずれかで皮下注射された。５日後、脾臓はハツカネズミから切除されそしてＥ７特異脾臓細胞の数が、回収抗体としてＥ７特異クラスＩ ＭＨＣ結合ペプチドＥ７４９―５７（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ；Ｄａｌｔｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、あるいは制御ペプチドＨＢＣＡｇ９３−１００（ＭＧＬＫＦＲＱＬ；Ｄａｌｔｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を使用するＥＬＩＳＰＯＴで測定された。
【００９５】
図２に示される結果は精製ＨｓｐＥ７評価（プロセスＬ ＨｓｐＥ７）がＥ７特異ＣＤ８陽性Ｔリンパ球の最小の誘発を表現すことを示している。プロセスＡ ＨｓｐＥ７はＥ７特異ＣＤ８陽性Ｔリンパ球のより大きい誘発を表現する。しかしながら、プロセスＬ ＨｓｐＥ７およびプロセスＡ ＨｓｐＥ７の両方の誘発はＴＬＲ９作用薬ＣｐＧ（プロセスＡ ＨｓｐＥ７＋ＣｐＧあるいはプロセスＬ ＨｓｐＥ７＋ＣｐＧ）の存在で３から１００倍強調される。
【００９６】
１６６８を含む最適のハツカネズミのクラス７Ｂ型コア配列（ＧＡＣＧＴＴ）でいくつかのＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドはＥＬＩＳＰＯＴ評価およびＴＣ−１腫瘍縮小評価においてＨｓｐＥ７の活性の増大に高い活性があることが示された（データは示されていない）。同様に、ＣｐＧクラスＣ型オリゴヌクレオチド（２３９５）は高い活性があることが見出された。しかしながら、クラスＡ型ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドはＥＬＩＳＰＯＴ評価においてＨｓｐＥ７の活性の増大に大変低い活性であることが見出された（Ｖｏｌｌｍｅｒ Ｊ．等、２００４ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４：２５１−２６２）。
【００９７】
これらのデータは精製ＨｓｐＥ７が生物学的活性があり、そしてＨｓｐＥ７の生物学的活性（プロセスＡあるいはプロセスＬ ＨｓｐＥ７のいずれか）が免疫刺激剤ＣｐＧを添加することにより増加することを示している。
【００９８】
［ＨｓｐＥ７に添加ＴＬＲ作用薬の効果］
Ｅ７特異ＣＤ８陽性Ｔリンパ球のＨｓｐＥ７（プロセスＬ ＨｓｐＥ７）誘発を増大するための代わりのＴＬＲ作用薬の能力はＴＬＲ３作用薬ＰｏｌｙＩ：Ｃ（Ｓｉｇｍａ社 Ｃａｔ＃１９１３）、およびＴＬＲ２作用薬ＰＡＭ３ＣｙｓＳＫ４（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社 Ｃａｔ＃ＴＬＲ１−ｐｍｓ）、およびＴＬＲ９作用薬（実施例３参照）を使用して決定された。
【００９９】
ハツカネズミはＨｓｐＥ７プラスＴＬＲ作用薬の混合物で皮下に共注射された。この研究のためにプロセスＬ ＨｓｐＥ７の５０μｇが１０μｇＣｐＧ、２０μｇＰＡＭ３ＣｙｓＳＫ４あるいは１００μｇＰｏｌｙＩ：Ｃと一緒に共注射された。５日間の後、脾臓はハツカネズミより切除されそしてＥ７特異脾臓細胞は回収抗原としてＥ７特異クラスＩ ＭＨＣ結合Ｅ７４９−５７、あるいは制御ペプチドＨＢＣＡｇ９３−１００を使用するＥＬＩＳＰＯＴによって（実施例３の概要のように）測定された。結果は図３に示される。
【０１００】
図３にみられるように、ＨｓｐＥ７そしてＣｐＧの共注射はＥ７特異ＣＤ８陽性Ｔリンパ球の顕著な増大の結果となった。同様な増加はＴＬＲ作用薬ＰｏｌｙＩ：Ｃの共投与でまた観察された。しかしながら、ＴＬＲ２作用薬Ｐａｍ３ＣｙｓＳＫ４単独はＩＦＮガンマ産出細胞の無視できる増大の結果になった。
【０１０１】
これらの結果はＣｐＧおよびＰｏｌｙＩ：Ｃが、しかしＰａｍ３ＣｙｓＳＫ４は違うが、精製ＨｓｐＥ７（プロセスＬ ＨｓｐＥ７）の増加に効果があり、そして全てのアジュバントは精製ＨｓｐＥ７の生物学的活性の増大に効果がないことを示している。さらなる実験（図４および５）は精製ＨｓｐＥ７とＰｏｌｙＩＣＬＣ（Ｏｎｃｏｖｉｒ社、３２０３ Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ａｖｅ ＮＷ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ）あるいはＭＰＬ−トレハロース６，６’−ジミコレート（ＭＰＬ−ＴＤＭ；Ｒｉｂｉ ＩｍｍｉｎｏＣｈｅｍ Ｒｅｓｒａｒｃｈ Ｉｎｃ．から；またＯｓｉｏ Ｒ．等、Ｍｉｃｒｏｂ Ｐａｔｈｏｇ．２００５ Ｊｕｌ−Ａｕｇ；３９（１−２）：３５−４３をまた参照）との混合が精製ＨｓｐＥ７（これは９５％純度よりも大きい）の免疫学的活性の増大に効果がまたあったことを示している。図５において、ＨｓｐＥ７の免疫学的活性の増大は０．１μｇのＰｏｌｙＩＣＬＣから１００μｇのＰｏｌｙＩＣＬＣで観察された活性の増大で免疫刺激剤の１０００倍量を越して検出されたことが示されている。
【０１０２】
［実施例５：ＨｓｐＥ７の抗腫瘍活性］
抗腫瘍活性への精製ＨｓｐＥ７調合の効果は実施例３に概要を示す方法を使用して試験された。データは精製ＨｓｐＥ７とＣｐＧあるいはＰｏｌｙＩ：Ｃの組み合わせは精製ＨｓｐＥ７（プロセスＬ ＨｓｐＥ７）単独に比較して抗腫瘍効果を顕著に増加することを示している。
【０１０３】
ハツカネズミは６×１０４ＴＣ−１腫瘍細胞で横腹に注射された。７日目に、確立したＴＣ−１腫瘍を帯びたハツカネズミは希釈剤、精製ＨｓｐＥ７単独（実施例１と比較；プロセスＬ；９５％純度以下）あるいはＣｐＧ（ｎ＝３０／ｇｒｐ）、あるいはＰｏｌｙＩ：Ｃ（ｎ＝２０／ｇｒｐ；図７）と混合された精製ＨｓｐＥ７の等級のある投与量で頸の首筋に皮下注射された。ハツカネズミはさらに４２日間腫瘍の増殖に従がわされた。腫瘍移殖４９日後の腫瘍のないハツカネズミは腫瘍がないと考えられた。希釈剤のみで注射されたハツカネズミの１００％は４９日目に腫瘍をもっていた。以前の研究はＣｐｇ単独、あるいはＰｏｌｙＩ：Ｃ単独は腫瘍増殖に対して効果をもたないことを示している（データは示されていない）。
【０１０４】
ＨｓｐＥ７のＣｐＧとの共投与に対する結果は図６に示され、そしてＨｓｐＥ７のＰｏｌｙＩ：Ｃとの共投与に対する結果は図７に示される。
【０１０５】
図６を参照して、９５％以下の純度のＨｓｐＥ７の投与は、５０から８００μｇの投与量範囲（ＨｓｐＥ７および平均ＨｓｐＥ７歴史的）以上で、高い（８００μｇ）ＨｓｐＥ７（“歴史的”）で観察される約１５％の腫瘍発生率で減少した。しかしながら、精製ＨｓｐＥ７のＣｐＧとの共注射は約２５から約２００μｇＨｓｐＥ７の投与量で５％より低い腫瘍発生率で腫瘍発生率を劇的に低下した。４００μｇのプロセスＢ ＨｓｐＥ７で治療されたハツカネズミのおおよそ２７％は、歴史的データから示されるように４９日で腫瘍をもった。しかしながら、少なくとも３μｇのＣｐＧと混合された２５μｇのプロセスＬ ＨｓｐＥ７の少量で注射されたハツカネズミは完全な腫瘍排除をした。
【０１０６】
図７を参照して、精製ＨｓｐＥ７（９５％の純度以上；プロセスＬ ＨｓｐＥ７）の投与は、８００μｇ（ＨｓｐＥ７）の投与量範囲以上で、高い（８００μｇ）ＨｓｐＥ７で観察される約５０％の腫瘍発生率で腫瘍活性を減らすことにおいて９５％純度のＨｓｐＥ７と同様な能力はなかったことがみられる。しかしながら、精製ＨｓｐＥ７と１００μｇＰｏｌｙＩ：Ｃとの共注射は５％腫瘍発生率より低い結果である約２００μｇＨｓｐＥ７の投与量で腫瘍発生率において劇的な減少となった。
【０１０７】
これらのデータは、精製ＨｓｐＥ７がＣｐＧのようなＴＬＲ９作用薬、あるいはＴＬＲ３作用薬ＰｏｌｙＩ：Ｃと投与されたとき約５から約８０倍に増加される抗腫瘍活性を示す。
【０１０８】
［実施例６：ＨｓｐＥ７活性への伝統的アジュバントの効果］
Ｅ７特異ＣＤ８陽性Ｔリンパ球の精製ＨｓｐＥ７誘発を増大するため硫酸バンドあるいはフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）のような伝統的アジュバントの能力が決定された。
【０１０９】
ハツカネズミは精製ＨｓｐＥ７（４００μｇ）プロセスＬ ＨｓｐＥ７；プロセスＬで皮下注射されるか、硫酸バンド（Ｐｉｅｒｃｅ社）と１：１で混合された、あるいはＩＦＡ（Ｂａｃｔｏ社）と１：１で混合された３０μｇＣｐＧと共に、あるいは硫酸バンド＋３０μｇＣｐＧと共に、あるいはＩＦＡ＋３０μｇＣｐＧと共に精製ＨｓｐＥ７と共注射された。５日後、脾臓はハツカネズミより除去されそしてＥ７特異脾臓細胞は、回収抗体としてＥ７特異クラスＩ ＭＨＣ結合ペプチドＥ７（４９−５７）（１６．Ｅ７．４９−５７．Ｄｂ）、あるいは制御ペプチドＨＢＣＡｇ（９３−１００）を使用するＥＬＩＳＰＯＴで測定された。結果は図８に示される。
【０１１０】
実施例３および４に提供された結果と一致して精製ＨｓｐＥ７（プロセスＬＨｓｐＥ７）単独の注射は脾臓細胞によるＩＦＮガンマの産出を増大しなかったが、しかしＨｓｐＥ７とＣｐＧ（プロセスＬ ＨｓｐＥ７＋ＣｐＧ）の共注射はＥ７特異クラスＣＤ陽性リンパ球の顕著な（１０倍以上）増大となった（図８）。しかしながら、精製ＨｓｐＥ７とＩＦＡ（プロセスＬ ＨｓｐＥ７＋ＩＦＡ）と、あるいは硫酸バンド（プロセスＬ ＨｓｐＥ７＋硫酸バンド）との共注射はＥ７特異Ｔリンパ球の刺激の評価可能な増大にはならず、精製ＨｓｐＥ７単独の投与の効果と釣り合った。
【０１１１】
精製ＨｓｐＥ７とＣｐＧの共投与および硫酸バンド（プロセスＬ ＨｓｐＥ７＋硫酸バンド＋ＣｐＧ）あるいはＩＦＡ（プロセスＬ ＨｓｐＥ７＋ＩＦＡ＋ＣｐＧ）のいずれかとの共投与は、ＨｓｐＥ７とＣｐＧ（プロセスＬ ＨｓｐＥ７＋ＣｐＧ）の共注射で観察された増大と同様のＥ７特異Ｔリンパ球の刺激の増大となった。このデータは、硫酸バンドあるいはＩＦＡが存在しているかあるいはしていないにかかわらず、ＨｓｐＥ７の活性の増大と同様な効果をもっているため、ＩＦＡおよび硫酸バンドがＨｓｐＥ７を阻止あるいは刺激にかかわらず中性であることを示している。
【０１１２】
これらのデータは、Ｅ７特異ＣＤ８陽性Ｔリンパ球が精製ＨｓｐＥ７と良く知られたアジュバントの硫酸バンドあるいはフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）のいずれかとの混合によって増大されないことを示している。これらの結果は、硫酸バンドあるいはフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）を含む全てのアジュバントが精製ＨｓｐＥ７の生物学的活性の増大に効果があるとは言えないことをさらに示している。
【０１１３】
［実施例７：ＨｓｐＥ７活性への添加ＴＬＲ作用薬の効果］
この実施例において、Ｅ７特異ＣＤ陽性Ｔリンパ球の精製ＨｓｐＥ７誘発を増大するために、イミキモド、ＬＰＳ、Ｐａｍ３ＣｙｓＳＫ４、あるいはＣＤ４０の効果が決定された。
【０１１４】
ハツカネズミは１００μｇイミキモド（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社 ＃ＴＬＲＬ−ＩＭＱ）、３０μｇＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ社）、２５μｇＰａｍ３ＣｙｓＳＫ４（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社 Ｃａｔ＃ＴＬＲ１−ｐｍｓ）、２５μｇ抗ＣＤ４０（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ社；クローン番号 １Ｃ１０）、あるいは３０μｇＣｐＧと精製ＨｓｐＥ７混合物（４００μｇプロセスＬ ＨｓｐＥ７；プロセスＬ）あるいは精製ＨｓｐＥ７（４００μｇ）単独と一緒に皮下注射された。５日後、脾臓はハツカネズミより除去されそしてＥ７特異脾臓細胞の数は、ペプチドＥ７４９−５７結合のＥ７特異クラスＩ ＭＨＣを使用するＥＬＩＳＰＯＴによって測定された。結果は図９に示される。
【０１１５】
精製ＨｓｐＥ７とイミキモド（ＴＬＲ７作用薬）、ＰＡＭ３ＣｙｓＳＫ４（ＴＬＲ２作用薬）あるいはＬＰＳ（ＴＬＲ４作用薬）の共投与はＥ７特異ＣＤ陽性Ｔリンパ球を誘発するために精製ＨｓｐＥ７の能力を毎週さえ増大した（図９）。しかしながら、Ｅ７特異ＣＤ陽性Ｔリンパ球の生成における刺激はＨｓｐＥ７に抗ＣＤ４０あるいはＣｐＧの添加によって観察された。
【０１１６】
これらの結果は、ＩＦＮガンマ分泌細胞の数の過度の増加がイミキモド（ＴＬＲ７作用薬）、ＰＡＭ３ＣｙｓＳＫ４（ＴＬＲ２作用薬）およびＬＰＳ（ＴＬＲ４作用薬）をＨｓｐＥ７に添加することによってのみ観察されるので、Ｅ７特異ＣＤ陽性Ｔリンパ球の生成の増大に効果があるとは言えないことをさらに示している。
【０１１７】
［実施例８：毎日の注射計画］
ＨｓｐＥ７およびｐｏｌｙＩＣＬＣはハツカネズミのＣＤ８＋Ｔ細胞応答を引き出すための毎日の注射計画の有用性を評価するために使用された。Ｃ５７Ｂ１／６ハツカネズミ（グループ当り２）は毎日、１日に１回最大４日間まで、ＨｓｐＥ７（１００μｇ）とｐｏｌｙＩＣＬＣ（１０μｇ）で免疫化された。最初の抗体発現の７日後、全ての動物は安楽死されそしてこれらの脾臓細胞は分析のため取得された。ＩＦＭガンマＥＬＩＳＰＯＴが１６Ｅ７．４９−５７．Ｄｂペプチドで刺激に対するクラス１制限ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を評価するため使用された。
【０１１８】
ＨｓｐＥ７＋ｐｏｌｙＩＣＬＣの多重注射をされたグループは単一注射のグループと比較して応答の頻度において適度な増加を発揮した。
【０１１９】
毎日の注射の数の増加は応答の頻度の増加に相関する。毎日の注射の最大の回数を受けたグループは応答の頻度において最大の増加を示した（図１０）。
【０１２０】
毎日の注射戦略の使用は、他のＣｏＶａｌＴＭ抗体と組み合わせてあるいは非ＣｏＶａｌＴＭ抗体と組み合わせてｐｏｌｙＩＣＬＣを使用して増加したＣＤ８＋Ｔ細胞応答を引き出す有用性を提供する。付け加えて、この戦略は毎週あるいは２週間間隔で再挑戦に対する次の免疫応答を押し上げるために増加する能力をもっているより大きいＣＤ８＋記憶プールとなる。
【０１２１】
［実施例９： ＨｓｐＥ７プラスｐｏｌｙＩＣＬＣで免疫化への液性応答］
ｐｏｌｙ−ＩＣＬＣは抗体に対して細胞および液性免疫応答の両方の増大を示した。液性免疫性へのＨｓｐＥ７プラスｐｏｌｙＩＣＬＣで共免疫化の効果を研究するために、Ｃ５７Ｂ１／６雌のハツカネズミのグループ（ｎ＝５／グループ）が毎月２回の間隔（１日、２８日）で免疫化された。ハツカネズミのグループは緩衝液、５００μｇＨｓｐＥ７、１２．５μｇＰｏｌｙ−ＩＣＬＣ、５００μｇＨｓｐＥ７＋１．２５Ｐｏｌｙ−ＩＣＬＣ、５００μｇＨｓｐＥ７＋１２．５μｇＰｏｌｙ−ＩＣＬＣあるいは５００μｇＨｓｐＥ７＋１２５μｇＰｏｌｙ−ＩＣＬＣで免疫化された。血液試料が投与に先立つ７日（７日が基準日）そして２１日、４９日、７７日に血清抗体の分析のために採取された。個々のハツカネズミからの血清は標準ＥＬＩＳＡによりＥ７およびＨｓｐＥ７に対する抗体（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ２ｃ）の存在に対して試験された。手短に言えば、９６のウエルプレートがＥ７あるいはＨｓｐＥ７で一晩被覆され、１．５％ＢＳＡ溶液で洗浄されそしてブロックされた。血清はＢＳＡ溶液中の血清の５０に１の希釈で開始する２倍の連続的希釈で個々のウエルに添加された。洗浄に続いて、ＨｓｐＥ７（図１１Ｂ、Ｄ、Ｆ）あるいはＥ７（図１１Ａ、Ｃ、Ｅ）抗原に対して結合したＩｇＧ１（図１１Ａ、Ｂ）、ＩｇＧ２ｂ（図１１Ｃ、Ｄ）あるいはＩｇＧ２ｃ（図１１Ｅ、Ｆ）抗体が適切なイムノグロビンアイソタイプに対するビオチン共役抗体で培養することにより検出された。プレートはそれから洗浄されそしてストレプトアビジン共役西洋ワサビペルオキシターゼで培養された。色の発現はテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基板を使用して行われそして着色した成果物は自動ＥＬＩＳＡプレート読取器により４５０ｎｍで読み取られた。図１１のデータは評価プレートのバックグラウンド（０．２ＯＤユニット限界）よりも大きい吸収率を与えた血清の最も高い希釈として表現されている。
【０１２２】
ＨｓｐＥ７単独での免疫化は、単独の注射に従って現れる抗ＨｓｐＥ７応答でＨｓｐＥ７およびＥ７の両方に対して顕著な抗体応答を産出し、一方、抗Ｅ７応答は単独の注射に従って弱くそして２つの免疫化に従ってさらに完全に発現した。両方の場合において、産出した抗体のアイソタイプは顕著にＩｇＧ１で（図１１Ａ、Ｂ）、Ｔｈ２シフト液性応答を示している。Ｐｏｌｙ−ＩＣＬＣのみでの免疫化はＥ７あるいはＨｓｐＥ７のいずれにも抗体応答を産出しなかった。ＨｓｐＥ７プラスＰｏｌｙ−ＩＣＬＣでの免疫化はより強くそしてさらに速く抗体応答発現になった。これは、Ｐｏｌｙ−ＩＣＬＣがＨｓｐＥ７で共免疫化されたとき免疫応答が単独の注射に従って不可能であるＥ７の場合に最も顕著であった。そこには顕著なより大きいＴｈ１液性応答があり、産出されたＩｇＧ２ｂ＆ｃ（図１Ｃ−Ｆ）抗体の増加した規模になった。この応答はＰｏｌｙ−ＩＣＬＣの高い投与量でさらに特徴づけられるような投薬量依存性であった。ＨｓｐＥ７およびＰｏｌｙ−ＩＣＬＣが共注射されるとき、免疫応答の増加したＴｈ−１のシフトはＥＬＩＳＰＯＴにより取得されたＣＤ８陽性Ｔリンパ球を産出するＩＦＮガンマの増加した大きさと一致する。
【０１２３】
［実施例１０：ＰｏｌｙＩＣＬＣとＨｓｐＥ７の投与量範囲］
ＨｓｐＥ７と組み合わせで共供給されたときＴＬＲ３作用薬がＥ７特異ＣＤ８Ｔ細胞のクロスプライミングを促進することができる投与量の範囲は検討された。図１２に示すように、我々は、ＨｓｐＥ７プラスＴＬＲ３作用薬プラスｐｏｌｙＩＣＬＣでハツカネズミの免疫化がＩＦＮガンマＥＬＩＳＰＯＴにより測定されたようにＥ７４９−５７特異Ｔ細胞引き出しに高い効果があったことを観察した。引き出されたＥ７４９−５７特異Ｔ細胞の数は使用したｐｏｌｙＩＣＬＣアジュバントの投与量に依存したが、しかしながら大変低い投与量ですら（０．１μｇｐｏｌｙＩＣＬＣ）ＨｓｐＥ７のクロスプライミングを増大することができた。
【０１２４】
［実施例１１：ＨｓｐＥ７プラスｐｏｌｙＩＣＬＣの連続する日の投与で大きく確立した腫瘍の縮小］
Ｅ７発現ＴＣ−１腫瘍細胞ラインはＥ７直接接種戦略の効果を評価するために広く使用される攻撃的で速い増殖腫瘍モデルである。通常、ハツカネズミはＴＣ−１腫瘍細胞ラインの１０５から１０６細胞の間で移殖されそして腫瘍が触診可能でも７から１４日後、関心のある薬剤で治療される。この腫瘍モデルにおいて、腫瘍負担が抗しがたくなる前に、腫瘍が腫瘍に打ち勝つことができないよりも速く増殖するため、抗原−特異Ｔ細胞のクローン拡大は免疫学的介入が最早有用でないとき以降の治療窓である。
【０１２５】
これらの実験に使用されたＴＣ−１腫瘍モデルシステムはさらに進んだ腫瘍に対して開発を許容した。図１３に示すように、従来の７から１４日よりもむしろＴＣ−１腫瘍は治療前２８日間体内で増殖を許容された。この時点で平均腫瘍寸法において大きい範囲であったけれども、全ての動物は触診可能な腫瘍をもちそしていくつかの動物は２０００ｍｍ３を越す容積の腫瘍をもった。注目すべきことに、ＨｓｐＥ７プラスｐｏｌｙＩＣＬＣで続けて４日連続免疫化を受けたハツカネズミは４日連続投与免疫養生を開始の通常１週間内に大変大きく確立した腫瘍を縮小し始めた。腫瘍容積は治療期間の間毎日測定されそしてその後２から３日毎に測定された。腫瘍は電子デジタルキャリパー（Ｆｏｗｌｅｒ Ｓｙｌｖａｃ社 Ｕｌｔｒａ−Ｃａｌ Ｍａｒｋ III）を使用して測定されそして幅の二乗×長さ×０．５で計算された。腫瘍は大多数（９の７）のハツカネズミにおいて治療に続いて１７日間縮小を続けた。再現する腫瘍を示すハツカネズミでは消えた変異体のみを現れ、Ｅ７４９―５７エピトープは最早発現しなかった（データは示されない）。緩衝液のみ、ＨｓｐＥ７蛋白質のみ、あるいはｐｏｌｙＩＣＬＣアジュバントのみ４日連続投与を受けたハツカネズミはこれらの大きな腫瘍の縮小を示さなかった。
【０１２６】
［実施例１２：ＣＤ８応答の拡大相の間の繰り返し免疫化の推進効果］
ハツカネズミがＨｓｐＥ７プラスｐｏｌｙＩＣＬＣで１、２、３あるいは４連続日間免疫化されたとき、引き出されたＥ７４９―５７特異Ｔ細胞の水準は引き続く各日の免疫化の後、劇的な増加を受けた（図１５Ａ）。１００μｇＨｓｐＥ７プラス１０μｇｐｏｌｙＩＣＬＣで４連続日の免疫化後、Ｅ７４９―５７で刺激応答において体外で直接ＩＦＭガンマを産生する細胞の数は１０６脾臓細胞当り１０，０００に達した。事実、正確なＩＦＮガンマＥＬＩＳＰＯＴ定量に対して、免疫動物からの脾臓細胞は自動化ＥＬＩＳＰＯＴ読取器により‘計数可能’な数に減らすためにスポットに対して生来の動物から１：１６脾臓細胞で希釈されねばならなかった。これは ＨｓｐＥ７プラスｐｏｌｙＩＣＬＣの単独の投与量を受ける動物で観察される抗原特異細胞の数のおおよそ１０倍である。最も驚くことは抗原特異細胞の大変高い数は最終の免疫化の３日以内に到達されたことである（ハツカネズミの全てのグループは最初の免疫化後７日で分析された）。４連続免疫化は抗原の量の追加的増加を単には示していない。ハツカネズミは、単独の免疫化において抗原／アジュバント提供量の４倍を含む単独免疫化を与えられたハツカネズミがＥ７４９―５７特異Ｔ細胞数において増加するがしかし４連続免疫化を受けているハツカネズミにおいて観察されるＥ７４９―５７特異Ｔ細胞数よりずっと低いように曝された（図１５Ａ）。Ｅ７４９―５７特異Ｔ細胞はまたＨ−２Ｄｂ／Ｅ７４９―５７五量体を使用するフローサイトメトリーにより容易に観察できた（図１５Ｂ）。ＨｓｐＥ７プラスｐｏｌｙＩＣＬＣで４日連続免疫化の後、いくつかの動物のＥ７４９―５７特異Ｔ細胞の数はＣＤ８＋脾臓細胞の全数の２．９％の高さに到達した。ＭＨＣクラスＩ五量体薬剤でＥ７特異Ｔ細胞のフローサイトメトリー定量はいくぶんＥＬＩＳＰＯＴと比較して抗原−特異細胞の数を低く評価したが、しかしながら特にフローサイトメトリー分析は４連続免疫化の最後の後に３日間のみ実施されるため、これは抗原−特異Ｔ細胞の表面ＴＣＲの下方調整の反映のようである。事実、図５Ｂに示されるフローサイトメトリーデータの厳密な検査は、そこには生来のハツカネズミに比較された４日連続免疫化を受けているハツカネズミにおいてＨ−２Ｄｂ／Ｅ７４９―５７五量体−陰性であるがしかしＣＤ４４活性化マーカーを発現するＣＤ８＋の高い数であることを裏づける。これらの活性化したフェノタイプをもつＣＤ８＋細胞はこれらの生体内活性化状況の結果としてこれらの表面ＴＣＲを下方に制御する抗原−特異細胞に良く一致する。さらに、我々は、多重連続日の免疫化が次の免疫応答の間に顕著な影響力をもつかどうか評価するために免疫応答の縮小相を分析した。図１５Ｃに示すように、７日目の後免疫化で観察されたピークの免疫応答における大きな差異にかかわらず、Ｅ７特異ＣＤ８＋細胞数は１日目から４日目の連続する免疫化の数と関係なく全てのハツカネズミにおいて１３日目の後免疫化によって顕著な縮小を受けた。しかしながら、Ｅ７特異ＣＤ８＋細胞は１３日目の後免疫化でＥＬＩＳＰＯＴによってなお容易に検出できたことおよびさらに重要なことに、初生応答のピークにおける高い抗原−特異Ｔ細胞数は１３日目に観察されたＥ７特異ＣＤ８＋細胞の残りの数と相関したことは注目すべきである。
【０１２７】
応答の拡大相内であるがしかし次の初生のＣＤ８Ｔ細胞応答の増強に関して第１と第２注射の間の間隔を変化して与えられる２回の注射の効果が研究された。脾臓は次の応答の動力学を調査する研究の間、変化する間隔で採取された。ＨｓｐＥ７プラスｐｏｌｙＩＣＬＣの単独注射をされたハツカネズミは免疫化の後５日で容易に検出できそして免疫化後７日目に後でピークとなる応答をみせた（図１４Ａ）。この応答は９日までに衰えそして１１日目までに低く（しかし安定）そして容易に検出できる水準まで衰えた。対照的に、０日にＨｓｐＥ７プラスｐｏｌｙＩＣＬＣの初生の免疫化そしてそれから２日目に第２回の同一の免疫化を与えられたハツカネズミは単独の免疫化を受けているハツカネズミに引き出されるよりももっと強い応答をみせた。単独の免疫化を受けているハツカネズミで観察されたように、ＣＤ８Ｔ細胞応答は７日目に最大であったがしかし抗体−特異細胞の顕著な高い全体の数に到達した。さらに、抗体−特異細胞の数は９日目までに減ったけれども、この時点で存在する抗体−特異細胞の全体の数は単独の免疫化を受けているハツカネズミで観察されたよりも顕著に高く保たれた。第２回の免疫化が初生免疫化後４日目に遅らされたとき、効果はもっと著しかった。この場合において、抗体−特異Ｔ細胞の数は７日を通して上昇を続けそして９日目まで最大に達せず、その時抗体−特異Ｔ細胞の頻度は単独免疫化後観察された最大数のおおよそ４倍であった。
【０１２８】
ｐｏｌｙＩＣＬＣの３回の連続した単独投与に続くＨｓｐＥ７プラスｐｏｌｙＩＣＬＣの単独投与は、ＨｓｐＥ７プラスｐｏｌｙＩＣＬＣの単独投与を受けているハツカネズミに比べてＥ７特異ＣＤ８＋細胞の数に顕著な増加を引き出さなかった（図１４Ｂ）。この結果は連続した日々の免疫化を受けているハツカネズミに引き出されたＥ７特異ＣＤ８＋細胞の劇的な拡大は単にアジュバントの連続的存在の間接的影響ではなく特異抗体の存在に依存した。
【０１２９】
全ての例示は参照によってここに組み入れられる。
【０１３０】
本発明は１つあるいはそれ以上の実施態様に関連して記述されている。しかしながら、多くの変形および修正が特許請求項で定義される本発明の範囲を逸脱することなくなされることは当業者には明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】種々のＨｓｐＥ７調合剤の抗腫瘍活性を示す。
【図２】ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ＴＬＲ９作用薬）の存在においてＥ７特異ＣＤ８陽性Ｔリンパ球を誘発するためのＨｓｐＥ７の能力の増加を示す。
【図３】プロセスＬ ＨｓｐＥ７（精製ＨｓｐＥ７）のＰｏｌｙＩ：Ｃ（ＴＲＬ３作用薬）あるいはＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＴＬＲ９作用薬）でしかしＰＡＭ３ＣｙｓＳＫ４（ＴＬＲ２作用薬）ではないものを共注射することによりＥ７特異ＣＤ８陽性Ｔリンパ球を誘発するためのＨｓｐＥ７の能力の増加を示す。
【図４】モノリン酸リピドＡ（ＭＰＬ；ＴＬＲ４作用薬）の存在でＥ７特異ＣＤ８陽性Ｔリンパ球を誘発するためにプロセスＬ ＨｓｐＥ７の能力の増加を示す。
【図５】Ｐｏｌｙ ＩＣＬＣ（ＴＬＲ３作用薬）の存在でＥ７特異ＣＤ８陽性Ｔリンパ球を誘発するためにプロセスＬ ＨｓｐＥ７の能力の増加を示す。
【図６】腫瘍発生率におけるプロセスＬ ＨｓｐＥ７あるいはプロセスＡ ＨｓｐＥ７の効果を示す。
【図７】ＰｏｌｙＩ：ＣとプロセスＬ ＨｓｐＥ７（精製ＨｓｐＥ７）を組み合わせることによりプロセスＬ ＨｓｐＥ７の抗腫瘍活性の増加を示す。
【図８】Ｅ７特異ＣＤ８陽性Ｔリンパ球の誘発において精製ＨｓｐＥ７（プロセスＬ ＨｓｐＥ７）で混合されたアジュバント硫酸バンドあるいはフロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ）の効果を示す。
【図９】種々のＴＬＲ作用薬あるいは作用薬の抗ＣＤ抗体の存在で共投与されたときＥ７特異ＣＤ８陽性Ｔリンパ球を誘発するためにＨｓｐＥ７の能力の比較を示す。
【図１０】ＩＦＭガンマＥＬＩＳＰＯＴにより測定されるようにクラスＩ制限ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を引き出す能力への日々の主要な押し上げ戦略の効果を示す。
【図１１Ａ】液性免疫へのＨｓｐＥ７プラスＰｏｌｙ−ＩＣＬＣの共免疫性化の効果を示す。
【図１１Ｂ】液性免疫へのＨｓｐＥ７プラスＰｏｌｙ−ＩＣＬＣの共免疫性化の効果を示す。
【図１１Ｃ】液性免疫へのＨｓｐＥ７プラスＰｏｌｙ−ＩＣＬＣの共免疫性化の効果を示す。
【図１１Ｄ】液性免疫へのＨｓｐＥ７プラスＰｏｌｙ−ＩＣＬＣの共免疫性化の効果を示す。
【図１１Ｅ】液性免疫へのＨｓｐＥ７プラスＰｏｌｙ−ＩＣＬＣの共免疫性化の効果を示す。
【図１１Ｆ】液性免疫へのＨｓｐＥ７プラスＰｏｌｙ−ＩＣＬＣの共免疫性化の効果を示す。
【図１２】抗原特異性ＣＤ８＋T細胞応答を引き出しにおいて外因性抗原プラスｐｏｌｙＩＣＬＣで免疫性化の結果を示す。
【図１３】大きい、確立したＴＣ−１腫瘍の退化の誘発においてＨｓｐＥ７抗原プラスｐｏｌｙＩＣＬＣで多重投与免疫化の結果を示す。
【図１４】ＨｓｐＥ７抗原プラスＴＬＲ３作用薬を使用する多重投与免疫化戦略の結果を示す。
【図１５】ＨｓｐＥ７抗原プラスＴＬＲ３作用薬を使用する多重投与免疫化戦略の結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、ＴＬＲ３作用薬、モノリン酸リピドＡ（ＭＰＬ）、ＭＰＬ−トレハロース６，６’−ジミコレート（ＭＰＬ−ＴＤＭ）、および抗ＣＤ４０からなるグループから選ばれた免疫刺激剤とともにＨｓｐＥ７を投与することを含む精製ＨｓｐＥ７の生物学的活性を増加する方法。
【請求項２】
免疫刺激剤が約０．１μｇから約２０ｍｇ／ｍＬの量で存在する請求項１の方法。
【請求項３】
精製ＨｓｐＥ７が１％ＰＡＧＥを使用して決定された約９５％から約９９．９９％の純度である請求項１の方法。
【請求項４】
免疫刺激剤がＴＬＲ３作用薬である請求項１の方法。
【請求項５】
ＴＬＲ３作用薬がｐｏｌｙＩＣＬＣあるいはｐｏｌｙＩ：Ｃである請求項４の方法。
【請求項６】
精製ＨｓｐＥ７、およびＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、ＴＬＲ３作用薬、モノリン酸リピドＡ（ＭＰＬ）、ＭＰＬ−トレハロース６，６’−ジミコレート（ＭＰＬ−ＴＤＭ）および抗ＣＤ４０からなるグループから選ばれた免疫刺激剤を含む組成物。
【請求項７】
免疫刺激剤が約０．１μｇから約２０ｍｇ／ｍＬの量で存在する請求項６の組成物。
【請求項８】
精製ＨｓｐＥ７が１％ＰＡＧＥを使用して決定された約９５％から約９９．９９％の純度である請求項６の組成物。
【請求項９】
免疫刺激剤がＴＬＲ３作用薬である請求項６の組成物。
【請求項１０】
ＴＬＲ３作用薬がｐｏｌｙＩＣＬＣあるいはｐｏｌｙＩ：Ｃである請求項９の組成物。
【請求項１１】
被験者にその必要に応じ請求項６の組成物を投与することを含む被験者の腫瘍あるいはウイルス発生を縮小する方法。
【請求項１２】
精製ＨｓｐＥ７、およびＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、ＴＬＲ３作用薬、モノリン酸リピドＡ（ＭＰＬ）、ＭＰＬ−トレハロース６，６’−ジミコレート（ＭＰＬ−ＴＤＭ）および抗ＣＤ４０からなるグループから選ばれた免疫刺激剤、および使用のための説明書を含むキット。
【請求項１３】
免疫刺激剤が約０．１μｇから約２０ｍｇ／ｍＬの量で存在し、そして精製ＨｓｐＥ７が１％ＰＡＧＥを使用して決定された約９５％から約９９．９９％の純度である請求項１２のキット。
【請求項１４】
免疫刺激剤がＴＬＲ３作用薬である請求項１２のキット。
【請求項１５】
ＴＬＲ３作用薬がｐｏｌｙＩＣＬＣあるいはｐｏｌｙＩ：Ｃである請求項１２のキット。
【請求項１６】
被験者にその必要に応じ被験者の癌の予防あるいは治療ための請求項６の組成物の使用。
【請求項１７】
被験者にその必要に応じ被験者の腫瘍あるいはウイルス発生を縮小するための請求項６の組成物の使用。
【請求項１８】
前記組成物が少なくとも２回の投与を含む投与スケジュールに従って投与される請求項１１の方法。
【請求項１９】
被験者にその必要に応じ請求項６の組成物を投与することを含む被験者の腫瘍あるいはウイルス発生を防止する方法。
【請求項１】
ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、ＴＬＲ３作用薬、モノリン酸リピドＡ（ＭＰＬ）、ＭＰＬ−トレハロース６，６’−ジミコレート（ＭＰＬ−ＴＤＭ）、および抗ＣＤ４０からなるグループから選ばれた免疫刺激剤とともにＨｓｐＥ７を投与することを含む精製ＨｓｐＥ７の生物学的活性を増加する方法。
【請求項２】
免疫刺激剤が約０．１μｇから約２０ｍｇ／ｍＬの量で存在する請求項１の方法。
【請求項３】
精製ＨｓｐＥ７が１％ＰＡＧＥを使用して決定された約９５％から約９９．９９％の純度である請求項１の方法。
【請求項４】
免疫刺激剤がＴＬＲ３作用薬である請求項１の方法。
【請求項５】
ＴＬＲ３作用薬がｐｏｌｙＩＣＬＣあるいはｐｏｌｙＩ：Ｃである請求項４の方法。
【請求項６】
精製ＨｓｐＥ７、およびＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、ＴＬＲ３作用薬、モノリン酸リピドＡ（ＭＰＬ）、ＭＰＬ−トレハロース６，６’−ジミコレート（ＭＰＬ−ＴＤＭ）および抗ＣＤ４０からなるグループから選ばれた免疫刺激剤を含む組成物。
【請求項７】
免疫刺激剤が約０．１μｇから約２０ｍｇ／ｍＬの量で存在する請求項６の組成物。
【請求項８】
精製ＨｓｐＥ７が１％ＰＡＧＥを使用して決定された約９５％から約９９．９９％の純度である請求項６の組成物。
【請求項９】
免疫刺激剤がＴＬＲ３作用薬である請求項６の組成物。
【請求項１０】
ＴＬＲ３作用薬がｐｏｌｙＩＣＬＣあるいはｐｏｌｙＩ：Ｃである請求項９の組成物。
【請求項１１】
被験者にその必要に応じ請求項６の組成物を投与することを含む被験者の腫瘍あるいはウイルス発生を縮小する方法。
【請求項１２】
精製ＨｓｐＥ７、およびＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、ＴＬＲ３作用薬、モノリン酸リピドＡ（ＭＰＬ）、ＭＰＬ−トレハロース６，６’−ジミコレート（ＭＰＬ−ＴＤＭ）および抗ＣＤ４０からなるグループから選ばれた免疫刺激剤、および使用のための説明書を含むキット。
【請求項１３】
免疫刺激剤が約０．１μｇから約２０ｍｇ／ｍＬの量で存在し、そして精製ＨｓｐＥ７が１％ＰＡＧＥを使用して決定された約９５％から約９９．９９％の純度である請求項１２のキット。
【請求項１４】
免疫刺激剤がＴＬＲ３作用薬である請求項１２のキット。
【請求項１５】
ＴＬＲ３作用薬がｐｏｌｙＩＣＬＣあるいはｐｏｌｙＩ：Ｃである請求項１２のキット。
【請求項１６】
被験者にその必要に応じ被験者の癌の予防あるいは治療ための請求項６の組成物の使用。
【請求項１７】
被験者にその必要に応じ被験者の腫瘍あるいはウイルス発生を縮小するための請求項６の組成物の使用。
【請求項１８】
前記組成物が少なくとも２回の投与を含む投与スケジュールに従って投与される請求項１１の方法。
【請求項１９】
被験者にその必要に応じ請求項６の組成物を投与することを含む被験者の腫瘍あるいはウイルス発生を防止する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１１Ｄ】
【図１１Ｅ】
【図１１Ｆ】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１１Ｄ】
【図１１Ｅ】
【図１１Ｆ】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公表番号】特表２００９−５３８８３６（Ｐ２００９−５３８８３６Ａ）
【公表日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１２３８０（Ｐ２００９−５１２３８０）
【出願日】平成１９年５月３０日（２００７．５．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００７／０００９６３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１３７４２７
【国際公開日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【出願人】（５０８３５２９８６）ヌベンタ バイオファーマシューティカルズ コーポレイション (1)
【氏名又は名称原語表記】ＮＶＥＮＴＡ ＢＩＯＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】５６６６ Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，＃３１９，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ ９２０３７−７５２３（ＵＳ）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月３０日（２００７．５．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００７／０００９６３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１３７４２７
【国際公開日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【出願人】（５０８３５２９８６）ヌベンタ バイオファーマシューティカルズ コーポレイション (1)
【氏名又は名称原語表記】ＮＶＥＮＴＡ ＢＩＯＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】５６６６ Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，＃３１９，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ ９２０３７−７５２３（ＵＳ）
【Ｆターム（参考）】
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