発光によるビタミンＣ検出法及び定量法
【課題】従来法の問題点を克服しうる、新規なビタミンＣの検出法及び定量法を提供することを目的とする。特に、生体内でのビタミンＣの挙動を解明しうるバイオイメージングへの応用が可能な、発光によるビタミンＣの検出法及び定量法を提供することを目的とする。
【解決手段】ニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニン、特にニトロキシドラジカルを軸配位子として有するフタロシアニナトケイ素錯体からなるレドックス応答性蛍光プローブ及びそれを含有するリポソーム製剤、並びにそれを用いた生体内外におけるビタミンＣの検出法及び定量法。
【解決手段】ニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニン、特にニトロキシドラジカルを軸配位子として有するフタロシアニナトケイ素錯体からなるレドックス応答性蛍光プローブ及びそれを含有するリポソーム製剤、並びにそれを用いた生体内外におけるビタミンＣの検出法及び定量法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レドックス応答性蛍光プローブ及びそれを含有するリポソーム製剤、並びにそれを用いたビタミンＣの検出法及び定量法に関する。具体的に本発明は、ニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニン、特にニトロキシドラジカルを軸配位子として有するフタロシアニナトケイ素錯体からなる蛍光プローブ及びそれを含有するリポソーム製剤、並びにそれを用いた生体内外におけるビタミンＣの検出法及び定量法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビタミンＣ（アスコルビン酸）は、水溶性ビタミンの一種であり、広く植物界に分布するが、とくに果物類、緑黄色野菜類などに多く含まれていることが知られている。ビタミンＣは、生体内において重要な役割を果たしており、その例として（１）アミノ酸生合成への利用、（２）副腎からのホルモン分泌、（３）脂肪酸をミトコンドリアに運ぶための担体であるＬ−カルニチンの合成などが挙げられる。また、結合組織でコラーゲンを生成する際に必要とされるため、ビタミンＣ不足により壊血病の症状（歯のぐらつき・血管の脆弱化・皮膚からの出血・怪我の回復や免疫機能の低下・軽度の貧血など）を呈するようになる。
【０００３】
ヒトはビタミンＣを体内で合成することができないため、必要量をすべて食品などを通じて外部から摂取しなければならない。さらにビタミンＣは強力な抗酸化活性を有することが知られている。したがって、抗酸化ビタミンとして、又は食品添加物である酸化防止剤として、加工・健康食品などへの添加が広く行なわれている。
【０００４】
食品又は生体由来試料中のビタミンＣの検出法及び定量法としては、例えば、ＨＰＬＣ法、ヒドラジン比色法及びインドフェノール法などが従来から用いられている。その他、アスコルビン酸酸化酵素の存在下、還元型アスコルビン酸と酸素から酸化型アスコルビン酸と過酸化水素を生成する反応と、生成した過酸化水素と色源体とをパーオキシダーゼの存在下に反応させて色素を生成する反応とを同一反応系で行わせ、生成する色素を定量することによって試料中のアスコルビン酸を定量する方法（例えば、特許文献１参照）や、ビタミンＣを含む試料にｏ−フェニレンジアミンを加え、この試料に偏光性をもたせた励起光を照射し、これにより生じる蛍光の偏光度を測定し、その測定値に基づきビタミンＣを定量する方法（例えば、特許文献２参照）などが報告されている。しかしながら、これらの定量法には、前処理等の操作が煩雑である、定量に多くの時間を要する、及び／又は精度に劣るなどの問題点が依然として存在する。
【０００５】
さらに近年、ビタミンＣと老化の関係が注目されているだけでなく、ビタミンＣの高濃度投与ががん治療に効果的であることが報告されている。例えば、がん治療に関しては２００５年に発表された「Pharmacologic ascorbic acid concentrations selectively kill cancer cells（薬理学的濃度のアスコルビン酸はがん細胞を選択的に殺す）」という論文が注目されており、高濃度のビタミンＣを点滴することががん治療に有効であるという結果が報告されている（例えば、非特許文献１参照）。しかし、生体内でのビタミンＣの正確な挙動についてははっきりと解明されていないという現状があり、バイオイメージング技術などを利用して、その生体内機能を解明することが強く期待されている。しかしながら、上記のいずれの方法を用いても、ビタミンＣのバイオイメージングへの応用は不可能である。
【０００６】
バイオイメージングへの応用可能性のある方法として、発光によるビタミンＣの検出法及び定量法が挙げられ、例えば、ダンシル基、ピリル基のような蛍光発色団とニトロキシドラジカルからなるデュアル分子を蛍光プローブとして用いる方法が報告されている（例えば、非特許文献２参照）。しかしながら、かかる蛍光プローブは、励起光・蛍光ともに生体組織透過性の低い波長領域（６５０nm以下）であるため、蛍光バイオイメージングへの応用は困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第４０７３９６３号
【特許文献２】特開平１１−３２６２０７号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Qi chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (38), 13604-13609 (2005)
【非特許文献２】E. Lozinsky et al., J. Biochem. Biophys. Methods 38, 29-42 (1999)
【非特許文献３】K. Ishii et al., The Porphirin Handbook; ed by K. Kadish, R. M. Smith and R. Guilard, Academic Press, Volume 16, 1-42 (2003)
【非特許文献４】H. Miwa, K. Ishii et al., Chem. Eur. J. 10, 4422-4435 (2004)
【非特許文献５】K. Ishii et al., J. Phys. Chem. A 109 (26), 5781-5787 (2005)
【非特許文献６】K. Ishii et al., J. Porphyrins Phthalocyanines 3, 439-443 (1999)
【非特許文献７】K. Ishii et al., J. Am. Chem. Soc. 123 (4), 702-708 (2001)
【非特許文献８】K. Ishii et al., J. Phys. Chem. A 105 (28), 6794-6799 (2001)
【非特許文献９】K. Ishii et al., J. Phys. Chem. A 108 (16), 3276-3280 (2004)
【非特許文献１０】K. Ishii et al., Free Radical Biology & Medicine 38, 920-927 (2005)
【非特許文献１１】石井和之、生産研究 ６０巻２号（２００８）、１６０−１６３頁
【非特許文献１２】Yang Liu et al., Chem. Lett. 38, 588-589 (2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、これまでにポルフィリン又はフタロシアニンの光物理的性質について報告してきた（例えば、非特許文献３〜５参照）。その中で、ニトロキシドラジカルにフタロシアニンの蛍光を強く消光する働きがあることを明らかにした（例えば、非特許文献６〜９参照）。一方、ニトロキシドラジカルは、ビタミンＣ（やその他の少数の反応活性物質）と反応して不対電子を失う（ラジカルではなくなる）ことも知られている。本発明者らはこれらの点に注目し、ビタミンＣとの反応による発光強度増大から、ビタミンＣ濃度を定量・検出できるのではないかと考え検討した結果、本発明を完成させた。
【００１０】
本発明の目的は、従来法の問題点を克服しうる、新規なビタミンＣの検出法及び定量法を提供すること、特に、研究目的の生体内（細胞中など）でのビタミンＣの挙動を解明しうるバイオイメージングへの応用が可能な、発光によるビタミンＣの検出法及び定量法を提供することである。本発明の目的はまた、かかる方法において有用な蛍光プローブを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
すなわち本発明は、以下１〜１３に挙げるような、ニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンからなるレドックス応答性蛍光プローブ及びそれを含有するリポソーム製剤、並びにそれらを用いる発光によるビタミンＣの検出法及び定量法を提供するものである。
【００１２】
１．ニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンからなるレドックス応答性蛍光プローブ。
２．ニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンが、下記式Ｉ：
【００１３】
【化１】
【００１４】
〔式中、
Ｘは、Ｎ又はＣＲ′（ここで、Ｒ′は、水素原子、Ｃ1-18−アルキル基、アリール基又は含窒素ヘテロシクリル基である）であり；
Ｍは、Ｈ2であるか、あるいは周期表第２〜４族、又は第８〜１５族の元素から選択される原子であり；
Ｍが周期表第２〜４族、又は第８〜１５族の元素から選択される原子である場合、１又は２個の軸配位子Ｌが存在していてもよく、ここでＬは、独立して、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、トリ（Ｃ1-18−アルキル）シリルオキシ基又はニトロキシドラジカルであり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は、互いに独立して、水素原子、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、アリール基、含窒素ヘテロシクリル基、又はニトロキシドラジカルであるか、あるいは
Ｒ1及びＲ2は、それらが結合する炭素原子と一緒になって、芳香環若しくは含窒素ヘテロ環を形成し、該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環は、非置換であるか、又はハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基及び含窒素ヘテロシクリル基から選択される１つ以上の置換基により置換されているか、又は該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環の２個の隣接する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよく、
Ｒ3及びＲ4は、それらが結合する炭素原子と一緒になって、芳香環若しくは含窒素ヘテロ環を形成し、該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環は、非置換であるか、又はハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基及び含窒素ヘテロシクリル基から選択される１つ以上の置換基により置換されているか、又は該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環の２個の隣接する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよく、
Ｒ5及びＲ6は、それらが結合する炭素原子と一緒になって、芳香環若しくは含窒素ヘテロ環を形成し、該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環は、非置換であるか、又はハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基及び含窒素ヘテロシクリル基から選択される１つ以上の置換基により置換されているか、又は該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環の２個の隣接する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよく、又は
Ｒ7及びＲ8は、それらが結合する炭素原子と一緒になって、芳香環若しくは含窒素ヘテロ環を形成し、該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環は、非置換であるか、又はハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基及び含窒素ヘテロシクリル基から選択される１つ以上の置換基により置換されているか、又は該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環の２個の隣接する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよいが；
但し、化合物には少なくとも１個のニトロキシドラジカルが存在する〕
で表される化合物である、上記１に記載の蛍光プローブ。
３．ニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンが、下記式ＩＩ：
【００１５】
【化２】
【００１６】
〔式中、
Ｘ、Ｎ又はＣＲ′（ここで、Ｒ′は、水素原子、Ｃ1-18−アルキル基、アリール基又は含窒素ヘテロシクリル基である）であり；
Ｍは、Ｈ2であるか、あるいは周期表第２〜４族、又は第８〜１５族の元素から選択される原子であり；
Ｍが周期表第２〜４族、又は第８〜１５族の元素から選択される原子である場合、１又は２個の軸配位子Ｌが存在していてもよく、ここでＬは、独立して、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、トリ（Ｃ1-18−アルキル）シリルオキシ基又はニトロキシドラジカルであり；
ｎは、互いに独立して、０、１、２、３又は４であり；
Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ及びＲｄは、互いに独立して、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基又は含窒素ヘテロシクリル基であるか、あるいはｎが２である場合、２個の隣接する各Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ及びＲｄは、それらが結合する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよいが；
但し、化合物には少なくとも１個のニトロキシドラジカルが存在する〕
で表される化合物である、上記１又は２に記載の蛍光プローブ。
４．Ｍが、周期表第２族、又は第１２〜１５族の元素から選択される原子であり、１又は２個の軸配位子Ｌが存在する、上記２又は３に記載の蛍光プローブ。
５．ニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンが、下記式ＩＩＩ：
【００１７】
【化３】
【００１８】
〔式中、
Ｘは、Ｎ又はＣＲ′（ここで、Ｒ′は、水素原子、Ｃ1-18−アルキル基、アリール基又は含窒素ヘテロシクリル基である）であり；
Ｌ1及びＬ2の一方は、ニトロキシドラジカルであり、他方は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、トリ（Ｃ1-18−アルキル）シリルオキシ基又はニトロキシドラジカルであり；
Ｒａ′、Ｒｂ′、Ｒｃ′及びＲｄ′は、互いに独立して、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基又は含窒素ヘテロシクリル基であり；
ｎは、互いに独立して、０、１、２、３又は４である〕
で表される錯体である、上記１〜４のいずれかに記載の蛍光プローブ。
６．Ｘが、Ｎである、上記２〜５のいずれかに記載の蛍光プローブ。
７．Ｌ、Ｌ1又はＬ2、あるいはＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7又はＲ8におけるニトロキシドラジカルが、下記式ＩＶ：
【００１９】
【化４】
【００２０】
〔式中、
Ｙは、Ｎと一緒になって、５〜６員の飽和若しくは部分不飽和の含窒素ヘテロ環（ここで、＞Ｎ−Ｏ・基に隣接する２つの原子は、第三級炭素原子であり、そして含窒素ヘテロ環は、追加のＮ若しくはＯ原子を含んでいてもよい）を形成し、；
Ｚは、単結合、又はスペーサーである〕
である、上記２〜６のいずれかに記載の蛍光プローブ。
８．ニトロキシドラジカルが、２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）、２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ（ＰＲＯＸＹＬ）、４，４−ジメチル−３−オキサゾリジニルオキシ（ＤＯＸＹＬ）又はニトロニルニトロキシド（ＮＮ）から選択される５〜６員の飽和若しくは部分不飽和の含窒素ヘテロ環構造を含む基である、上記１〜７のいずれかに記載の蛍光プローブ。
９．環原子と一緒になって形成されるニトロキシドラジカルを含む環が、２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）又は２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ（ＰＲＯＸＹＬ）である、上記２〜６のいずれかに記載の蛍光プローブ。
１０．上記１〜９のいずれかに記載の蛍光プローブを含有するリポソーム製剤。
１１．試料中のビタミンＣを検出する方法であって、
（１）励起光の照射下、上記１〜９のいずれかに記載の蛍光プローブ又は上記１０に記載のリポソーム製剤と、試料とを接触させる工程；及び
（２）発光をモニターする工程、を含む方法。
１２．試料中のビタミンＣを定量する方法であって、
（１）励起光の照射下、上記１〜９のいずれかに記載の蛍光プローブ又は上記１０に記載のリポソーム製剤と、試料とを接触させる工程；
（２）発光をモニターし、発光強度の時間変化を測定する工程；及び
（３）試料中のビタミンＣの濃度を決定する工程、を含む方法。
１３．生体内のビタミンＣを検出する方法であって、
（１）上記１０に記載のリポソーム製剤を、被験動物（ヒトを除く）に投与する工程；及び
（２）波長６５０nm以上の励起光を被験動物に照射し、発光をモニターする工程、を含む方法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明のビタミンＣを定量する方法の基本的な操作は、試料と蛍光プローブとを接触させ、発光強度時間変化を測定するだけという簡単なものであり（錯体濃度すら正確に調整する必要はない）、且つ精度良く定量することができる。発光強度時間変化で定量しているので、試料は溶液であっても懸濁液であってもよい。したがって、ＨＰＬＣ法に必要な機器調整や試料前処理、インドフェノール法の滴定など煩雑な操作は必要ない。
【００２２】
特に、本発明の生体内のビタミンＣを検出する方法では、（１）リポソームに取り込まれたニトロキシドラジカルを有するフタロシアニンが細胞内に到達すること（例えば、非特許文献１０〜１１参照）、（２）蛍光プローブ（還元体）の励起光・蛍光の波長は、生体組織透過性の高い領域（＞６５０nm）にあること、（３）ニトロキシドラジカルの還元により、十分な発光強度の増大が確認されたことなどから、バイオ蛍光イメージングへの応用が期待できる。すなわち、蛍光顕微鏡で発光増大時間変化を追うことによって、生体内ビタミンＣ濃度分布を知ることができ、さらにはビタミンＣの生体内の働きを知るためのツールとしての利用が期待される。また、リポソーム製剤とすることにより、ビタミンＣ以外の反応活性物質（鉄二価イオン、スーパーオキサイドなど）によって発光強度に影響が及ばないことから選択性の面で有利と期待される。
【００２３】
例えば、最近、下記：
【化５】
【００２４】
で示されるニトロキシドラジカルを有する化合物を水溶性蛍光プローブとして細胞に投与すると、細胞に取り込まれた後、細胞内還元物質との酸化還元反応によって速やかに蛍光プローブのニトロキシドラジカルが還元され、発光強度増強が観測されることが報告された（例えば、非特許文献１２参照）。一方、下記実施例５及び６に明らかにしたように、本発明の蛍光プローブを含有するリポソーム製剤は、細胞に取り込まれた後も、細胞内還元物質による影響をほとんど受けずに、高濃度ビタミンＣを投与した場合にのみ発光強度増大が観測された。したがって、本発明の蛍光プローブを含有するリポソームはin vivoにおいてもビタミンＣの検出及び定量への利用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】製造例１で得られた錯体であり、本発明の代表的な例Ｒ１及びＲ２である。
【図２】本発明の発光によるビタミンＣの検出法及び定量法の反応模式図である。
【図３】実施例１のビタミンＣ定量実験で得られた、発光強度時間変化を示したグラフである。
【図４】実施例１のビタミンＣ定量実験で得られた、反応速度定数とビタミンＣ濃度の間の相関を示したグラフである。
【図５】実施例２のビタミンＣ定量実験で得られた、発光強度時間変化を示したグラフである。
【図６】実施例４のビタミンＣ定量実験で得られた、発光強度時間変化を示したグラフである。
【図７】実施例４で得られた、ビタミンＣの添加前後のＲ２リポソーム溶液の発光スペクトルである。
【図８】実施例４のビタミンＣ定量実験で得られた、反応速度定数とビタミンＣ濃度の間の相関を示したグラフである。
【図９】実施例５の細胞におけるビタミンＣバイオイメージング実験で得られた、Ｒ２リポソームの添加後、（ａ）はビタミンＣを添加しない細胞系における発光の様子を示す顕微鏡画像であり（Ｒ２リポソーム添加後２４時間）、（ｂ）はビタミンＣを添加した細胞系における発光の様子を示す顕微鏡画像である（ビタミンＣ添加後２４０分）。
【図１０】実施例５の細胞におけるビタミンＣバイオイメージング実験で得られた、ビタミンＣ添加後の細胞内Ｒ２リポソームの発光強度時間変化を示したグラフである。
【図１１】実施例６におけるＲ２リポソームと過酸化水素との反応実験で得られた、発光強度時間変化を示したグラフである。
【図１２】実施例７のデヒドロアスコルビン酸の細胞内還元のリアルタイム観察実験で得られた、デヒドロアスコルビン酸の添加後、（ａ）は２分後、（ｂ）は１８０分後の細胞系における発光の様子を示す顕微鏡画像である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明のニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンは、その化学構造の一部に（例えば、軸配位子として、ポルフィリン又はフタロシアニン環への縮合環として、あるいはポルフィリン又はフタロシアニン環上の置換基として）ニトロキシドラジカルを含むポルフィリン又はフタロシアニンを意味する。本発明において「ポルフィリン」及び「フタロシアニン」という用語は、各々「ポルフィリン又はその誘導体」及び「フタロシアニン又はその誘導体」を意味する。したがって、本発明の「ポルフィリン」及び「フタロシアニン」いう用語は、ポルフィリン及びフタロシアニンと共に、ナフタロシアニン、５，１０，１５，２０−テトラアザポルフィリン、サブフタロシアニン、スーパーフタロシアニンのような類縁体、及びそれらの置換誘導体を含む。本発明の化合物は、ニトロキシドラジカルの不対電子を失う（ラジカルではなくなる）と、生体組織透過性の高い領域（＞６５０nm）での発光強度の増大を示す。
【００２７】
本発明のニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンは、好ましくは、下記式Ｉ：
【００２８】
【化６】
【００２９】
で表される化合物であり、より好ましくは、下記式ＩＩ：
【００３０】
【化７】
【００３１】
で表される化合物である。式Ｉ又はＩＩにおいて、Ｘは、Ｎ又はＣＲ′（ここで、Ｒ′は、水素原子、Ｃ1-18−アルキル基、アリール基又は含窒素ヘテロシクリル基である）を意味する。Ｘは、好ましくはＮである。
【００３２】
式Ｉ又はＩＩにおいて、Ｍは、Ｈ2（すなわち、メタルフリー）であるか、あるいは周期表第２〜４族、又は第８〜１５族の元素から選択される原子、例えば、Ｍｇ、Ａｌ、Ｓｉ、Ｓｃ、Ｔｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｇａ、Ｇｅ、Ｙ、Ｚｒ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｓｎ、Ｌａ、Ｃｅ、Ｌｕ、Ｈｆ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ａｕ、Ｈｇ、Ｔｌ、Ｔｈ又はＵから選択される原子である。好ましくは、Ｍは、周期表第２族、又は第１２〜１５族の元素、例えばＭｇ、Ａｌ、Ｓｉ、Ｚｎ、Ｇａ、Ｇｅ、Ｃｄ、Ｉｎ又はＳｎから選択される原子である。
【００３３】
より好ましくは、Ｍが周期表第１４族の元素から選択される原子であり、特に好ましくは、ＭがＳｉであり、２個の軸配位子Ｌが存在する化合物、すなわち、下記式ＩＩＩ：
【００３４】
【化８】
【００３５】
で表される錯体である。式ＩＩＩにおいて、Ｘは、式Ｉ又はＩＩと同義であるが、好ましくはＮである。すなわち、ニトロキシドラジカルを軸配位子として有するフタロシアニナトケイ素錯体が特に好ましい。
【００３６】
式Ｉ又はＩＩにおいて、ニトロキシドラジカルは、Ｍが周期表第２〜４族、又は第８〜１５族の元素から選択される原子である場合、軸配位子Ｌとして存在していてもよく、あるいは式Ｉにおいて、ポルフィリン又はフタロシアニン環上の置換基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7又はＲ8として存在してもよい。また式ＩＩＩの化合物において、軸配位子Ｌ1及びＬ2の一方は、ニトロキシドラジカルである。そのような軸配位子又は置換基としてのニトロキシドラジカルは、＞Ｎ−Ｏ・を含む基であればよいが、好ましくは、下記式ＩＶ：
【００３７】
【化９】
【００３８】
で表されるものである。式ＩＶにおいて、Ｙは、Ｎと一緒になって、５〜６員の飽和若しくは部分不飽和の含窒素ヘテロ環（ここで、＞Ｎ−Ｏ・基に隣接する２つの原子は、第三級炭素原子であり、そして含窒素ヘテロ環は、追加のＮ若しくはＯ原子を含んでいてもよい）を形成する。ニトロキシドラジカルは、好ましくは、２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）、２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ（ＰＲＯＸＹＬ）、４，４−ジメチル−３−オキサゾリジニルオキシ（ＤＯＸＹＬ）又はニトロニルニトロキシド（ＮＮ）から選択される５〜６員の飽和若しくは部分不飽和の含窒素ヘテロ環構造を含む基である。
【００３９】
【化１０】
（式中、Ｒは、Ｃ1-18−アルキル基などを意味する）
【００４０】
式ＩＶにおいて、Ｚは、単結合であるか、又は−Ｏ−、−（ＣＨ2）1-18−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＮＨ−、−ＮＨＣＯ−若しくは−ＣＯＮＨ−又はそれらの組み合わせなどの錯体中心原子Ｍ又はポルフィリン又はフタロシアニン環へのスペーサーである。
【００４１】
別の態様として、式Ｉ又はＩＩにおいて、ニトロキシドラジカルは、ポルフィリン又はフタロシアニン環への縮合環として存在してもよい。すなわち、式Ｉにおいて、Ｒ1とＲ2、Ｒ3とＲ4、Ｒ5とＲ6、及び／又はＲ7とＲ8が、「それらが結合する炭素原子と一緒になって、芳香環若しくは含窒素ヘテロ環を形成し、該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環の２個の隣接する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよい」とは、Ｒ1とＲ2、Ｒ3とＲ4、Ｒ5とＲ6、及び／又はＲ7とＲ8が、それらが結合する炭素原子と一緒になって形成した芳香環若しくは含窒素ヘテロ環において、さらに該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環の２個の隣接する環原子と一緒になって、＞Ｎ−Ｏ・基を含む５〜６員の飽和若しくは部分不飽和の含窒素ヘテロ環（ここで、＞Ｎ−Ｏ・基に隣接する２つの原子は、第三級炭素原子であり、そして含窒素ヘテロ環は、追加のＮ若しくはＯ原子を含んでいてもよい）を形成することを意味する。好ましい環は、前記のＴＥＭＰＯ、ＰＲＯＸＹＬ、ＤＯＸＹＬ又はＮＮで示されるような５〜６員の飽和若しくは部分不飽和の含窒素ヘテロ環である。特に好ましくは、ＴＥＭＰＯ又はＰＲＯＸＹＬである。
【００４２】
同様に、式ＩＩにおいて、「ｎが２である場合、２個の隣接する各Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ及びＲｄは、それらが結合する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよい」とは、各Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ及び／又はＲｄが、その２個の隣接する環原子と一緒になって、＞Ｎ−Ｏ・基を含む５〜６員の飽和若しくは部分不飽和の含窒素ヘテロ環（ここで、＞Ｎ−Ｏ・基に隣接する２つの原子は、第三級炭素原子であり、そして含窒素ヘテロ環は、追加のＮ若しくはＯ原子を含んでいてもよい）を形成することを意味する。好ましい環は、前記のＴＥＭＰＯ、ＰＲＯＸＹＬ、ＤＯＸＹＬ又はＮＮで示されるような５〜６員の飽和若しくは部分不飽和の含窒素ヘテロ環である。特に好ましくは、ＴＥＭＰＯ又はＰＲＯＸＹＬである。そのような式ＩＩの化合物の例としては、以下：
【００４３】
【化１１】
【００４４】
（式中、Ｍは、前記と同義である）が挙げられる。かかる化合物は、例えば、Anthony G. M. Barrett, et al., Tetrahedron 63 (24), 5244-5250 (2007) に記載の方法に従って、調製することができる。
【００４５】
本発明の式Ｉにおいて、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は、互いに独立して、水素原子、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、アリール基、含窒素ヘテロシクリル基、又はニトロキシドラジカルであるか、あるいは
Ｒ1及びＲ2は、それらが結合する炭素原子と一緒になって、芳香環若しくは含窒素ヘテロ環を形成し、該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環は、非置換であるか、又はハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基及び含窒素ヘテロシクリル基から選択される１つ以上の置換基により置換されているか、又は該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環の２個の隣接する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよく、
Ｒ3及びＲ4は、それらが結合する炭素原子と一緒になって、芳香環若しくは含窒素ヘテロ環を形成し、該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環は、非置換であるか、又はハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基及び含窒素ヘテロシクリル基から選択される１つ以上の置換基により置換されているか、又は該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環の２個の隣接する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよく、
Ｒ5及びＲ6は、それらが結合する炭素原子と一緒になって、芳香環若しくは含窒素ヘテロ環を形成し、該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環は、非置換であるか、又はハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基及び含窒素ヘテロシクリル基から選択される１つ以上の置換基により置換されているか、又は該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環の２個の隣接する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよく、又は
Ｒ7及びＲ8は、それらが結合する炭素原子と一緒になって、芳香環若しくは含窒素ヘテロ環を形成し、該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環は、非置換であるか、又はハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基及び含窒素ヘテロシクリル基から選択される１つ以上の置換基により置換されているか、又は該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環の２個の隣接する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよい。
【００４６】
上記「Ｒ1及びＲ2は、それらが結合する炭素原子と一緒になって芳香環又は含窒素ヘテロ環を形成し」とは、Ｒ1及びＲ2が、それらが結合するピロール環部分の２個の炭素原子と一緒になって、芳香環、例えば、ベンゼン又はナフタレン環を形成するか、あるいは含窒素ヘテロ環、例えば、ピリジン又はピラジン環のような、少なくとも１個、好ましくは１又は２個の窒素原子を含む、５〜６員の飽和、部分不飽和又は不飽和環を形成することを意味する。「Ｒ3及びＲ4」、「Ｒ5及びＲ6」、「Ｒ7及びＲ8」についての同様の記載も前記と同義である。
【００４７】
本発明の式ＩＩの化合物は、本発明の式Ｉにおいて、Ｒ1及びＲ2、Ｒ3及びＲ4、Ｒ5及びＲ6、並びにＲ7及びＲ8が、各々それらが結合する炭素原子と一緒になってベンゼン環を形成したものに相当する。したがって、式ＩＩにおいて、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ及びＲｄは、互いに独立して、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基又は含窒素ヘテロシクリル基であるか、あるいはｎが２である場合、２個の隣接する各Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ及びＲｄは、それらが結合する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよく、ｎは、互いに独立して、０、１、２、３又は４である。
【００４８】
本発明の式ＩＩＩの錯体は、さらに本発明の式ＩＩにおいて、Ｍが、少なくとも一方がニトロキシドラジカルである軸配位子Ｌ1及びＬ2を有するＳｉ（ケイ素）であるものに相当する。したがって、式ＩＩＩにおいて、Ｒａ′、Ｒｂ′、Ｒｃ′及びＲｄ′は、互いに独立して、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基又は含窒素ヘテロシクリル基であり、ｎは、互いに独立して、０、１、２、３又は４である。
【００４９】
なお、本明細書及び特許請求の範囲において、他に記載のない限り、「ハロゲン原子」という用語は、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素を意味する。好ましくは、塩素である。
【００５０】
同様に、他に記載のない限り「Ｃ1-18−アルキル基」という用語は、単独で、又は他の用語との組み合わせにおいて、炭素数１〜１８の直鎖状又は分岐鎖状飽和炭化水素基を意味する。例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、デシル、ドデシル、オクタデシルが挙げられる。好ましくは、Ｃ1-8−アルキル基が挙げられる。
【００５１】
同様に、他に記載のない限り「Ｃ1-18−アルコキシ基」という用語は、酸素原子を介して結合する前記「Ｃ1-18−アルキル基」、すなわちＣ1-18−アルキル−Ｏ−基を意味する。例としては、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｉｓｏ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｉｓｏ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｎ−ペンチルオキシ、ｎ−ヘキシルオキシ、ｎ−ヘプチルオキシ、ｎ−オクチルオキシ、デシルオキシ、ドデシルオキシ、オクタデシルオキシなどが挙げられる。好ましくは、Ｃ1-8−アルコキシ基が挙げられる。
【００５２】
同様に、他に記載のない限り「トリ（Ｃ1-18−アルキル）シリルオキシ基」という用語において、かかる基に存在する３個の「Ｃ1-18−アルキル」部分は、同一であっても異なっていてよく、前記「Ｃ1-18−アルキル基」から選択される。そのようなトリ（Ｃ1-18−アルキル）シリルオキシ基の例としては、トリメチルシリルオキシ、トリエチルシリルオキシ、トリ−ｉｓｏ−プロピルシリルオキシ、トリ−ｎ−ヘキシルシリルオキシ、デシル−ジメチルシリルオキシ、ジメチル−オクタデシルシリルオキシなどが挙げられる。
【００５３】
同様に、他に記載のない限り「−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル」という用語は、−Ｓ−Ｃ1-18−アルキル、−Ｓ（Ｏ）−Ｃ1-18−アルキル及び−Ｓ（Ｏ）2−Ｃ1-18−アルキルを含むことを意味する。好ましくは、−Ｓ−Ｃ1-8−アルキル、−Ｓ（Ｏ）−Ｃ1-8−アルキル及び−Ｓ（Ｏ）2−Ｃ1-8−アルキル、例えば、メチルチオ、エチルチオなどが挙げられる。さらに「−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル」という用語は、オキシエチレン（ＯＣＨ2ＣＨ2）単位が１〜８である、エチレングリコール基を意味する。好ましくは、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）2-4Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、例えば３，６，９−トリオキサデシルオキシなどが挙げられる。
【００５４】
同様に、他に記載のない限り「アリール基」という用語は、単独で、又は他の用語との組み合わせにおいて、炭素数６〜１４の芳香族単環及び多環式炭化水素の一価の基を意味する。例としては、フェニル、ナフタチル、アントリル、フェナントリルなどが挙げられる。「アリール基」は、非置換であるか、又はハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基及びフェニル基から選択される１つ以上の置換基により置換されていてもよい。好ましいアリール基としては、フェニル又はナフチルが挙げられる。
【００５５】
同様に、他に記載のない限り「含窒素ヘテロシクリル基」という用語は、単独で、又は他の用語との組み合わせにおいて、少なくとも１個、好ましくは１又は２個の窒素原子を含む、５〜６員の飽和、部分不飽和又は不飽和環の一価の基を意味する。例としては、ピロリル、ピラゾリル、ピリジル、ピラジニルなどが挙げられる。「含窒素ヘテロシクリル基」は、非置換であるか、又はハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基及びフェニル基から選択される１つ以上の置換基により置換されていてもよく、あるいは少なくとも１個の窒素原子へのプロトン又はＣ1-8−アルキル基の付加によりオニウムを形成してもよい。好ましい含窒素ヘテロシクリル基としては、ピリジル、ピラジニル又はまたはそのオニウム化合物（例えば、Ｎ−メチルピリジニウミル）が挙げられる。
【００５６】
本発明の蛍光プローブとして用いられるニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンの代表的な例を、以下の表１に示す。
【００５７】
【化１２】
【００５８】
【表１】
【００５９】
本発明の代表的な例として表１に挙げたフタロシアニナトケイ素錯体Ｒ１〜Ｒ６は、上記の非特許文献６〜９に記載の方法、又は下記の実施例に記載した手順に従って製造することができる。また、当業者であれば、これらの方法と技術常識に準じて、本発明のニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニン、特に式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩに包含される化合物を製造することができる。
【００６０】
本発明のリポソーム製剤は、かかるニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンが、脂質二重層からなる閉鎖小胞（リポソーム）に取り込まれたものを意味する。例えば、本発明のリポソーム製剤は、本発明のニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンが、卵黄または大豆由来の天然リン脂質、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン等の合成リン脂質などのリン脂質から形成される単膜または多重膜リポソームに取り込まれたものである。微粒子状であっても、微粒子を含む溶液又は懸濁液であってもよい。リポソーム製剤は、当業者に公知の方法、又は下記の実施例に記載した手順に従い、適宜製造すればよい。例えば、活性成分以外の助剤、例えば糖類（ラクトース、マンニトール等）、中性脂質（コレステロール、トリグリセライド等）、荷電脂質（ホスファチジン酸、ステアリルアミン等）を加えることもでき、公知の方法に従いリポソームの膜修飾を行い、所望の性質を付与することもできる。
【００６１】
本発明の発光によるビタミンＣの検出法及び定量法は、（１）波長６５０nm以上の励起光の照射下、本発明の蛍光プローブ又はリポソーム製剤と、試料とを接触させる工程；及び（２）発光をモニターする工程、を含む。ここで試料は、ビタミンＣを含有する（とされる）検体を、水、緩衝液、又はメタノールのようなビタミンＣを溶解しうる有機溶媒、あるいはそれらの混合物を用いて適切な濃度の溶液又は懸濁液として調製するか、あるいは検体が液体の場合は、そのまま又は適切な前処理に付して調製すればよい。
【００６２】
本発明の発光によるビタミンＣの検出法及び定量法は、本発明の蛍光プローブ、すなわちニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンが、ビタミンＣと接触し、ニトロキシドラジカルが還元され、不対電子を失った環元体に変換されることにより（すなわち、ニトロキシドラジカルによる蛍光消光作用の消失により）起こる発光強度の増大をモニターする（図２の反応模式図を参照）。本発明の特徴の一つは、発光強度の増大が、生体組織透過性の高い領域（＞６５０nm）で起こることである（例えば、図７参照）。したがって、通常、励起光は、波長６５０nm以上、好適には還元体の励起極大波長付近に設定し、発光もまた、還元体の蛍光極大波長付近に設定してモニターすればよい。
【００６３】
本発明のビタミンＣの定量法はさらに（２）発光をモニターし、発光強度の時間変化を測定する工程；及び（３）試料中のビタミンＣの濃度を決定する工程を含む。本発明者らは、発光強度の時間変化から算出される反応速度定数と、ビタミンＣ濃度との間に相関関係があることを見出した（下記実施例１〜４参照）。なおビタミンＣは２電子還元剤であるが、１電子目の還元が律速段階であるので、例えばメタノール中での１個のニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンからなる蛍光プローブとビタミンＣとの反応は、二次反応（擬一次反応）、２個のニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンからなる蛍光プローブとビタミンＣとの反応は、逐次反応と解することができる。また１又は２個のニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンからなる蛍光プローブを含有するリポソーム製剤を用いた場合では、いずれも二次反応（擬一次反応）と解することができることを本発明者らは確認している。したがって、当業者であれば、得られた発光強度の時間変化を適切な反応速度式を用いて解析することにより、速度定数を適宜算出することができる。このように、本発明のビタミンＣの定量法は、発光強度の時間変化の解析から速度定数を算出し、検量線を用いて濃度を求めることができるという、非常に簡便なものである。
【００６４】
さらに本発明のビタミンＣの検出法又は定量法は、生体内のビタミンＣを検出する方法へ応用することが可能である。本発明の生体内のビタミンＣを検出する方法は、（１）本発明のリポソーム製剤を、被験動物に投与する工程；及び（２）波長６５０nm以上の励起光を被験動物に照射し、発光をモニターする工程を含む。本発明者らは、リポソームに取り込まれたニトロキシドラジカルを軸配位子として有するフタロシアニナトケイ素錯体が、細胞内に到達すること、且つ生体内の酸化還元による影響が少ないことを既に報告している（例えば、非特許文献１０〜１１参照）。一方、本明細書において、かかるリポソーム製剤がビタミンＣと反応し、生体組織透過性の高い領域で発光強度増大を示すことを確認した。したがって、本発明の蛍光プローブ又はリポソーム製剤は、ビタミンＣのバイオ蛍光イメージングへの応用が十分に期待できる。
【実施例】
【００６５】
製造例１：錯体Ｒ１及びＲ２（図１あるいは表１参照）の製造
ジヒドロキシ（テトラ−ｔｅｒｔ−ブチルフタロシアニナト）ケイ素（ＳｉＰｃ（ＯＨ）2）（Ｒ０：上記表１参照）は、Macromolecules, 11 (1), 186-191 (1978)の方法に従って入手できる。ＳｉＰｃ（ＯＨ）2（５０mg）及び２，２，６，６−テトラメチル−４−ピペリジノール−１−オキシル（４３０mg、Cat.-No. 176141、Sigma-Aldrich Co.より購入；以下、４−ヒドロキシ−ＴＥＭＰＯという）をトルエン中、塩化カルシウム（２g）の存在下に４８時間加熱還流した。得られた混合物を冷却後、塩基性アルミナ及びゲルろ過クロマトグラフィー（Bio-Beads SX-1、Bio-Radより購入）による精製後、錯体Ｒ１及びＲ２をそれぞれ４０％及び１５％の収率で得た。
【００６６】
Ｒ１の元素分析（Ｃ57Ｈ66Ｎ9Ｏ3Ｓｉ）：
計算値 Ｃ，７１．８２； Ｈ，６．９８； Ｎ，１３．２２％
実測値 Ｃ，７０．８４； Ｈ，７．０８； Ｎ，１２．４４％
Ｒ２の元素分析（Ｃ66Ｈ82Ｎ10Ｏ4Ｓｉ）：
計算値 Ｃ，７１．５６； Ｈ，７．４８； Ｎ，１２．６５％
実測値 Ｃ，７０．９８； Ｈ，７．０５； Ｎ，１２．５１％
【００６７】
製造例２：錯体Ｒ３（表１参照）の製造
４−ヒドロキシ−ＴＥＭＰＯに代えて、３−ヒドロキシ−２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ〔以下、３−ヒドロキシ−ＰＲＯＸＹＬという；E. G. Rozantsev et. al., Tetrahedron 21, 491 (1965) に記載の方法に従って、３−カルバモイル−２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ（Cat.-No. C5151、Sigma-Aldrich Co.より購入）から調製した〕を用い、還流時間を２４時間とした以外は、製造例１と同様にして、錯体Ｒ３を３７％の収率で得た。
【００６８】
UV-vis (λ/nm(ε/104)) 685.0 (28.0), 651.0 (3.76), 612.0 (4.41), 360.0 (8.90);
FAB mass m/e 938 (M+);
元素分析（Ｃ56Ｈ64Ｎ9Ｏ3Ｓｉ）：
計算値 Ｃ，７１．６１； Ｈ，６．８７； Ｎ，１３．４２％
実測値 Ｃ，７０．８９３； Ｈ，６．６３３； Ｎ，１２．７６６％
【００６９】
製造例３：錯体Ｒ４（表１参照）の製造
４−ヒドロキシ−ＴＥＭＰＯに代えて、３−ヒドロキシ−ＰＲＯＸＹＬを用い、還流時間を４２時間とした以外は、製造例１と同様にして、錯体Ｒ４を１９％の収率で得た。
【００７０】
UV-vis (λ/nm(ε/104)) 682.5 (26.0), 651.5 (3.45), 613.5 (4.19), 359.5 (8.69);
ESI-TOF m/e 1079 (M+);
元素分析（Ｃ64Ｈ78Ｎ10Ｏ4Ｓｉ）：
計算値 Ｃ，７１．２１； Ｈ，７．２８； Ｎ，１２．９８％
実測値 Ｃ，７０．４５９； Ｈ，７．４０２； Ｎ，１２．７８３％
【００７１】
製造例４：錯体Ｒ５（表１参照）の製造
ＳｉＰｃ（ＯＨ）2及び４−カルボキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル（Cat.-No. 382000、Sigma-Aldrich Co.より購入；以下、４−カルボキシ−ＴＥＭＰＯという）をピリジン中、２４時間加熱還流した。得られた混合物を冷却後、中性アルミナ及びゲルろ過クロマトグラフィー（Bio-Beads SX-1又はSX-8、Bio-Radより購入）による精製後、錯体Ｒ５を９％の収率で得た。
【００７２】
UV-vis (λ/nm(ε/104)) 685.5 (24.2), 656.0 (3.33), 616.5 (3.72), 362.5 (7.64);
FAB mass m/e 980 (M+);
元素分析（Ｃ58Ｈ66Ｎ9Ｏ4Ｓｉ）：
計算値 Ｃ，７０．９９； Ｈ，６．７８； Ｎ，１２．８５％
実測値 Ｃ，７１．９９７； Ｈ，７．１３３； Ｎ，１１．９５５％
【００７３】
製造例５：錯体Ｒ６（表１参照）の製造
４−ヒドロキシ−ＴＥＭＰＯに代えて、３−カルボキシ−２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ（Cat.-No. 253324、Sigma-Aldrich Co.より購入；以下、３−カルボキシ−ＰＲＯＸＹＬという）を用いた以外は、製造例４と同様にして、錯体Ｒ６を１５％の収率で得た。
【００７４】
UV-vis (λ/nm(ε/104)) 685.0 (23.6), 653.0 (3.61), 616.5 (3.77), 362.0 (7.75);
FAB mass m/e 966 (M+);
元素分析（Ｃ57Ｈ64Ｎ9Ｏ4Ｓｉ）：
計算値 Ｃ，７０．７８； Ｈ，６．６７； Ｎ，１３．０３％
実測値 Ｃ，７０．６２２； Ｈ，６．５０３； Ｎ，１２．２５１％
【００７５】
実施例１：錯体Ｒ１を用いたビタミンＣ定量実験（メタノール溶液中）
〔実験手順〕
（１）製造例１で得られた錯体Ｒ１の、５．６×１０-6Mメタノール溶液を調製した。
（２）ビタミンＣの、６４mM、１６mM、８mM、４mMメタノール溶液を調製した。
（３）ガラスセルに上記（１）で得られた溶液１．８mlとマイクロ攪拌子を入れてスターラー（１０００r.p.m）で攪拌した。
（４）攪拌したまま、励起光としてヤマキ社製ダイオードレーザー（ＬＤＸ−２６１５−６５０−ＴＯ３、波長６５０nm）を照射し、日本分光社製分光器（ＣＴ−２５ＴＰ）と浜松ホトニクス社製光電子増倍管（Ｒ９２８）を用いて、６８０nmの発光をモニターしながら、上記（２）で得られたビタミンＣメタノール溶液０．２mlを加え、発光強度時間変化を測定した。このとき、光ファイバーがマイクロ攪拌子の乱反射を捉えないように角度や位置関係を調節した。
（５）不均一な拡散の寄与を考慮し、ビタミンＣを加えてから３００秒後以降のデータを解析に用いた。
【００７６】
〔実験結果〕
得られた発光強度時間変化を図３に示す。ビタミンＣの添加後３００秒以降のデータを用いて擬一次反応で解析し、反応速度定数を得た。この反応速度定数とビタミンＣ濃度の間に比例関係があることを確認した（図４）。これによって、この方法でビタミンＣの定量が精度良く行えることが示された。
【００７７】
実施例２：錯体Ｒ１を用いたビタミンＣ定量実験（リポソーム水溶液中）
〔実験手順〕
（１）吸収スペクトルを用いて、製造例１で得られた錯体Ｒ１ ０．１５mg（１．５８×１０-7mol）を定量した。
（２）ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）２０．９mg（２．８６×１０-5mol）をクロロホルム３．６mlに溶かした。
（３）Ｒ１をナスフラスコにいれＴＨＦ１８０μlを加えた。さらに上記（２）で得られたリポソームのクロロホルム溶液を加え、エバポレータで溶媒を除去した。
（４）乾燥した固体にＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、D-PBS(-)）２．０mlとグラスビーズ０．５gを加え、ボルテックスミキサーにかけ、その後５０℃で１時間超音波処理を行った。
（５）放冷後、遠心分離を行い（３５００r.p.m、１０分、４０００r.p.m、１０分室温）、目的物である上澄み溶液を得た。
（６）ビタミンＣの、６４mM、３２mM、１６mM、８mM、４mM、２mMＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、D-PBS(-)）溶液を調製した。
（７）ガラスセルにピーク波長の吸収がＡｂｓ＝０．５程度になるようＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、D-PBS(-)）で希釈した上記（５）の溶液１．３５mlとマイクロ攪拌子を入れてスターラー（１０００r.p.m）で攪拌した。
（８）攪拌したまま、励起光としてヤマキ社製ダイオードレーザー（ＬＤＸ−２６１５−６５０−ＴＯ３、波長６５０nm）を照射し、日本分光社製分光器（ＣＴ−２５ＴＰ）と浜松ホトニクス社製光電子増倍管（Ｒ９２８）を用いて、６９０nmの発光をモニターしながら、上記（６）で得られたビタミンＣのＰＢＳ溶液０．１５mlを加え、発光強度時間変化を測定した。このとき、光ファイバーがマイクロ攪拌子の乱反射を捉えないように角度や位置関係を調節した。
【００７８】
〔実験結果〕
得られた発光強度時間変化を図５に示す。メタノール溶液中と同様、発光強度の指数関数的増大を観測することに成功した。
【００７９】
実施例３：錯体Ｒ２を用いたビタミンＣ定量実験（メタノール溶液中）
〔実験手順〕
（１）製造例１で得られた錯体Ｒ２の、５×１０-6Mメタノール溶液を調製した。
（２）ビタミンＣの、６４mMメタノール溶液を調製した。
（３）ガラスセルに上記（１）で得られた溶液１．３５mlとマイクロ攪拌子を入れてスターラー（１０００r.p.m）で攪拌した。
（４）攪拌したまま、励起光としてヤマキ社製ダイオードレーザー（ＬＤＸ−２６１５−６５０−ＴＯ３、波長６５０nm）を照射し、日本分光社製分光器（ＣＴ−２５ＴＰ）と浜松ホトニクス社製光電子増倍管（Ｒ９２８）を用いて、６８６nmの発光をモニターしながら、上記（２）で得られたビタミンＣメタノール溶液０．１５mlを加え、発光強度時間変化を測定した。このとき、光ファイバーがマイクロ攪拌子の乱反射を捉えないように角度や位置関係を調節した。
【００８０】
〔実験結果〕
約６３００％の発光強度増大を観測した。
【００８１】
実施例４：錯体Ｒ２を用いたビタミンＣ定量実験（リポソーム水溶液中）
〔実験手順〕
（１）吸収スペクトルを用いて、製造例１で得られた錯体Ｒ２ ０．１７５mg（１．５８×１０-7mol）を定量した。
（２）ＤＰＰＣ２０．９mg（２．８６×１０-5mol）をクロロホルム３．６mlに溶かした。
（３）Ｒ２をナスフラスコにいれＴＨＦ１８０μlを加えた。さらに上記（２）で得られたリポソームのクロロホルム溶液を加え、エバポレータで溶媒を除去した。
（４）乾燥した固体にＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、D-PBS(-)）２mlとグラスビーズ０．５gを加え、ボルテックスミキサーにかけ、その後５０℃で１時間超音波処理を行った。
（５）放冷後、遠心分離を行い（３５００r.p.m、１０分、室温）、目的物である上澄み溶液を得た。
（６）ビタミンＣの、１２８mM、６４mM、１６mM、８mM、４mM、２mMＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、D-PBS(-)）溶液を調製した。
（７）ピーク波長の吸収がＡｂｓ＝１．４程度になるよう、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、D-PBS(-)）で希釈した上記（５）の溶液１．３５mlとマイクロ攪拌子をガラスセルに入れてスターラー（１０００r.p.m）で攪拌した。
（８）攪拌したまま、励起光としてヤマキ社製ダイオードレーザー（ＬＤＸ−２６１５−６５０−ＴＯ３、波長６５０nm）を照射し、日本分光社製分光器（ＣＴ−２５ＴＰ）と浜松ホトニクス社製光電子増倍管（Ｒ９２８）を用いて、６８６nm（１２．８mMでは７００nm）の発光をモニターしながら、上記（６）で得られたビタミンＣのＰＢＳ溶液０．１５mlを加え、発光強度時間変化を測定した。このとき、光ファイバーがマイクロ攪拌子の乱反射を捉えないように角度や位置関係を調節した。
【００８２】
〔実験結果〕
得られた発光強度時間変化を図６に示す。ビタミンＣ濃度と発光強度の間に相関が認められた。また、発光強度５００％増とバイオイメージングに十分と思われる発光強度変化が観測された（図７）。さらに発光強度時間変化は擬一次反応でフィッティングすることができ、低濃度領域ではビタミンＣ濃度と反応速度定数の間に相関が見られた（図８）。これらのことから研究目的の細胞中でのビタミンＣ蛍光バイオイメージングへの応用が期待できる。
【００８３】
実施例５：細胞におけるビタミンＣバイオイメージング実験
〔実験手順〕
（１）上記実施例４の手順（１）〜（５）で調製した錯体Ｒ２のリポソーム（以下、「Ｒ２リポソーム」という）の溶液をＤＭＦで１０倍希釈し、吸収スペクトルの吸光度から光増感剤（錯体Ｒ２）のリポソームへの取り込み量を算出し濃度計算を行い、濃度調整を行った。
（２）６cmシャーレに、５mlずつヒト子宮頸癌由来細胞（HeLa細胞［JCRB9004］、２×１０4cells/cm2、ヒューマンサイエンス研究資源バンクより購入）を播種し、インキュベーター内で２４時間培養した。２×１０−６Mになるように調整したＲ２リポソームＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、D-PBS(-)）溶液をシャーレに添加し、２０時間培養した。
（３）培地を除去し、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、D-PBS(-)）で２回洗浄してから培地（Eagle’s minimal essential medium ５００mlに、MEM non essential Amino Acids solution ５ml、抗生物質５ml、HEPES １M １０ml、FBS（fetal bovine serum、ウシ胎児血清）５０mlを加えた）５mlを加え、そこに濃度が１２．８mMになるように調整したビタミンＣのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、D-PBS(-)）溶液を０．５５ml加えた。
（４）Leica社製カットフィルタ：Y5を用い、定期的にLeica 社製DM IRB蛍光顕微鏡、Leica社製DFC350FX CCDカメラを用いて発光の様子を観察し（励起光：５９０−６５０nm、モニター波長：６６４−７３４nm）、画像を記録した。
（５）得られた蛍光顕微鏡画像について、画像処理ソフトウェア（ImageJ）を用いて発光強度時間変化の解析を行った。
【００８４】
〔実験結果〕
Ｒ２リポソームの添加後、ビタミンＣを添加しない細胞系を上記と同様に観察したが、２４時間経過後も発光はほとんど観察されなかった（図９ａ）。一方、ビタミンＣを添加した細胞系では、添加後発光の様子に大きな変化が見られ、２４０分後でも強い発光が確認された（図９ｂ）。画像処理ソフトウェアを用いて解析した発光強度時間変化を図１０に示す。本実験により、再現性のある指数関数な発光強度時間変化を見出し、細胞におけるビタミンＣバイオイメージングに成功した。画像解析による細胞内発光強度時間変化の定量的なデータを介して、生体におけるビタミンＣの細胞取り込み速度や、ニトロキシドラジカルのビタミンＣによる細胞内還元速度が決定され、それによりビタミンＣの生体内機能解明につながることが期待される。
【００８５】
実施例６：Ｒ２リポソームと過酸化水素との反応性実験
〔実験手順〕
（１）上記実施例４の手順（１）〜（５）に従い、Ｒ２リポソームの溶液を調製した。
（２）過酸化水素の、１MＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、D-PBS(-)）溶液を調製した。
（３）ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、D-PBS(-)）で１０倍希釈した上記（１）の溶液１．５mlとマイクロ攪拌子をガラスセルに入れてスターラー（１０００r.p.m）で攪拌した。
（４）攪拌したまま、励起光としてヤマキ社製ダイオードレーザー（ＬＤＸ−２６１５−６５０−ＴＯ３、波長６５０nm）を照射し、日本分光社製分光器（ＣＴ−２５ＴＰ）と浜松ホトニクス社製光電子増倍管（Ｒ９２８）を用いて、６９５nmの発光をモニターしながら、上記（２）で得られた過酸化水素のＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、D-PBS(-)）溶液０．０１５mlを加え、発光強度時間変化を測定した。このとき、光ファイバーがマイクロ攪拌子の乱反射を捉えないように角度や位置関係を調節した。
（５）対照として、過酸化水素のＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、D-PBS(-)）溶液に代えて、ビタミンＣのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、D-PBS(-)）溶液を用い、上記（４）の手順を繰り返した。
【００８６】
〔実験結果〕
本実験は、血清タンパク質であるアルブミン存在下におけるビタミンＣ副産物として知られる過酸化水素が、本発明の蛍光プローブに与える影響について調べるために行った。なお、本実験においてＲ２リポソームに添加した１０mM 過酸化水素溶液は、２mMのアスコルビン酸がＦＢＳ存在下で発生させる過酸化水素の６７倍量に相当する。得られた発光強度時間変化を図１１に示す。本実験により過酸化水素には本発明の蛍光プローブと反応性が無いことが示された。これによって、本発明の蛍光プローブとビタミンＣの反応は、その副産物（過酸化水素）によって影響を受けない、すなわち本発明の方法により、ビタミンＣのみをターゲットとした蛍光バイオイメージングが可能であることが示された。
【００８７】
実施例７：デヒドロアスコルビン酸の細胞内還元のリアルタイム観察実験
〔実験手順〕
（１）上記実施例４の手順（１）〜（５）で調製したＲ２リポソームをＤＭＦで１０倍希釈し、吸収スペクトルの吸光度から光増感剤（錯体Ｒ２）のリポソームへの取り込み量を算出し濃度計算を行い、濃度調整を行った。
（２）６cmシャーレに、５mlずつHeLa細胞（２×１０4cells/cm2、ヒューマンサイエンス研究資源バンクより購入）を播種し、インキュベーター内で２４時間培養した。２×１０-6Mになるように調整したＲ２リポソームのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、D-PBS(-)）溶液をシャーレに添加し、２０時間培養した。
（３）培地を除去し、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、D-PBS(-)）で２回洗浄してから培地（Eagle's minimal essential medium ５００mlに、MEM non essential Amino Acids solution ５ml、抗生物質５ml、HEPES １M １０ml、FBS（fetal bovine serum、ウシ胎児血清）５mlを加え、そこに濃度が１２．８mMになるように調整したデヒドロアスコルビン酸のＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、D-PBS(-)）溶液を０．５５ml加えた。
（４）Leica社製カットフィルタ：Y5を用い、定期的に蛍光顕微鏡で発光の様子を観察し（励起光：５９０−６５０nm、モニター波長：６６４−７３４nm）、画像を記録した。
【００８８】
〔実験結果〕
デヒドロアスコルビン酸はビタミンＣ（アスコルビン酸）の酸化体であり、細胞内に取り込まれると速やかに還元されてビタミンＣに変化することが知られている。本実験では、本発明の蛍光プローブによる蛍光バイオイメージング技術を応用してデヒドロアスコルビン酸の細胞内還元の様子をリアルタイムで観察できるかを調べるために行った。デヒドロアスコルビン酸添加後２分及び１８０分の細胞系の蛍光顕微鏡画像を、それぞれ図１２（ａ）及び図１２（ｂ）に示す。デヒドロアスコルビン酸添加後に細胞内蛍光プローブの発光が増大する様子が観測された（図１２（ａ）から図１２（ｂ）への変化）。これによって、デヒドロアスコルビン酸細胞内還元の様子をリアルタイム観察することに成功した。また、ビタミンＣと同様に画像解析によって発光強度時間変化を定量的に解析することで、デヒドロアスコルビン酸の細胞内取り込み速度や細胞内還元速度の決定が期待される。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
上記の結果より、（１）リポソーム水溶液中及びメタノール溶液中においてビタミンＣの添加後に蛍光強度が増大すること、（２）本発明の蛍光プローブ（錯体）の反応速度とビタミンＣ濃度に比例関係があること、（３）本発明の蛍光プローブ（錯体）の蛍光増大の速度がＥＳＲによるスピン消失速度と一致することを見出した。これによって、我々は、親水・疎水両溶媒中でビタミンＣの新たな定量法を開発することに成功した。
【００９０】
また本方法は既存法に対して、（１）励起光・蛍光ともに生体組織透過性が高い領域（＞６５０nm）に観測されること、（２）生体膜モデルであるリポソーム水溶液中で発光が増大したことから、生体内への応用が期待できること、（３）リポソーム水溶液中で、例えば錯体Ｒ２で、最大５００％増という蛍光顕微鏡などで追うのに十分な発光強度増大比を有すること、（４）メタノール中の錯体Ｒ１で約１５０％増、Ｒ２で約６３００％増と高い発光強度増大比を有すること、（５）さらに、Ｒ１のＴＥＭＰＯラジカルを、Ｒ０に対する蛍光量子収率比がさらに高いことが知られているＰＲＯＸＹＬラジカルに代えることによってさらに高い発光強度比を出すこと、あるいは軸配位子のヒドロキシ基をトリアルキルシロキシ基とすることで会合の影響を無くし、発光強度を増大させることなどの簡便な化学的修飾により発光強度の調節が容易に達成できること、（６）リポソームに取り込まれたフタロシアニナトケイ素錯体（すなわち、本発明のリポソーム製剤）が細胞内に到達し、かつ再現性のある逐次反応的な発光強度時間変化が確認されていること、（７）本発明のリポソーム製剤が細胞内における様々な還元物質の影響受けず、ビタミンＣを特異的に検出及び定量できること、（８）既存の蛍光プローブよりも反応速度が遅いので、がん治療に要求される薬理学的濃度（０．３−２０mM）の定量にも適する（０．４mM−６．４mMまで確認済み）などが優れており、これまで不可能だったビタミンＣの蛍光バイオイメージングの実現と、それによるビタミンＣの生体内機能解明などが期待される。
【００９１】
したがって、本発明の方法は、ビタミンＣの検出及び定量に有用である。特に本発明の方法は、これまで不可能だった生体内におけるビタミンＣの検出、すなわち研究目的の生体内（細胞中など）でのビタミンＣの蛍光バイオイメージングの実現が期待され、ビタミンＣの生体内機能解明を飛躍的に進めることが出来る。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レドックス応答性蛍光プローブ及びそれを含有するリポソーム製剤、並びにそれを用いたビタミンＣの検出法及び定量法に関する。具体的に本発明は、ニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニン、特にニトロキシドラジカルを軸配位子として有するフタロシアニナトケイ素錯体からなる蛍光プローブ及びそれを含有するリポソーム製剤、並びにそれを用いた生体内外におけるビタミンＣの検出法及び定量法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビタミンＣ（アスコルビン酸）は、水溶性ビタミンの一種であり、広く植物界に分布するが、とくに果物類、緑黄色野菜類などに多く含まれていることが知られている。ビタミンＣは、生体内において重要な役割を果たしており、その例として（１）アミノ酸生合成への利用、（２）副腎からのホルモン分泌、（３）脂肪酸をミトコンドリアに運ぶための担体であるＬ−カルニチンの合成などが挙げられる。また、結合組織でコラーゲンを生成する際に必要とされるため、ビタミンＣ不足により壊血病の症状（歯のぐらつき・血管の脆弱化・皮膚からの出血・怪我の回復や免疫機能の低下・軽度の貧血など）を呈するようになる。
【０００３】
ヒトはビタミンＣを体内で合成することができないため、必要量をすべて食品などを通じて外部から摂取しなければならない。さらにビタミンＣは強力な抗酸化活性を有することが知られている。したがって、抗酸化ビタミンとして、又は食品添加物である酸化防止剤として、加工・健康食品などへの添加が広く行なわれている。
【０００４】
食品又は生体由来試料中のビタミンＣの検出法及び定量法としては、例えば、ＨＰＬＣ法、ヒドラジン比色法及びインドフェノール法などが従来から用いられている。その他、アスコルビン酸酸化酵素の存在下、還元型アスコルビン酸と酸素から酸化型アスコルビン酸と過酸化水素を生成する反応と、生成した過酸化水素と色源体とをパーオキシダーゼの存在下に反応させて色素を生成する反応とを同一反応系で行わせ、生成する色素を定量することによって試料中のアスコルビン酸を定量する方法（例えば、特許文献１参照）や、ビタミンＣを含む試料にｏ−フェニレンジアミンを加え、この試料に偏光性をもたせた励起光を照射し、これにより生じる蛍光の偏光度を測定し、その測定値に基づきビタミンＣを定量する方法（例えば、特許文献２参照）などが報告されている。しかしながら、これらの定量法には、前処理等の操作が煩雑である、定量に多くの時間を要する、及び／又は精度に劣るなどの問題点が依然として存在する。
【０００５】
さらに近年、ビタミンＣと老化の関係が注目されているだけでなく、ビタミンＣの高濃度投与ががん治療に効果的であることが報告されている。例えば、がん治療に関しては２００５年に発表された「Pharmacologic ascorbic acid concentrations selectively kill cancer cells（薬理学的濃度のアスコルビン酸はがん細胞を選択的に殺す）」という論文が注目されており、高濃度のビタミンＣを点滴することががん治療に有効であるという結果が報告されている（例えば、非特許文献１参照）。しかし、生体内でのビタミンＣの正確な挙動についてははっきりと解明されていないという現状があり、バイオイメージング技術などを利用して、その生体内機能を解明することが強く期待されている。しかしながら、上記のいずれの方法を用いても、ビタミンＣのバイオイメージングへの応用は不可能である。
【０００６】
バイオイメージングへの応用可能性のある方法として、発光によるビタミンＣの検出法及び定量法が挙げられ、例えば、ダンシル基、ピリル基のような蛍光発色団とニトロキシドラジカルからなるデュアル分子を蛍光プローブとして用いる方法が報告されている（例えば、非特許文献２参照）。しかしながら、かかる蛍光プローブは、励起光・蛍光ともに生体組織透過性の低い波長領域（６５０nm以下）であるため、蛍光バイオイメージングへの応用は困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第４０７３９６３号
【特許文献２】特開平１１−３２６２０７号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Qi chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (38), 13604-13609 (2005)
【非特許文献２】E. Lozinsky et al., J. Biochem. Biophys. Methods 38, 29-42 (1999)
【非特許文献３】K. Ishii et al., The Porphirin Handbook; ed by K. Kadish, R. M. Smith and R. Guilard, Academic Press, Volume 16, 1-42 (2003)
【非特許文献４】H. Miwa, K. Ishii et al., Chem. Eur. J. 10, 4422-4435 (2004)
【非特許文献５】K. Ishii et al., J. Phys. Chem. A 109 (26), 5781-5787 (2005)
【非特許文献６】K. Ishii et al., J. Porphyrins Phthalocyanines 3, 439-443 (1999)
【非特許文献７】K. Ishii et al., J. Am. Chem. Soc. 123 (4), 702-708 (2001)
【非特許文献８】K. Ishii et al., J. Phys. Chem. A 105 (28), 6794-6799 (2001)
【非特許文献９】K. Ishii et al., J. Phys. Chem. A 108 (16), 3276-3280 (2004)
【非特許文献１０】K. Ishii et al., Free Radical Biology & Medicine 38, 920-927 (2005)
【非特許文献１１】石井和之、生産研究 ６０巻２号（２００８）、１６０−１６３頁
【非特許文献１２】Yang Liu et al., Chem. Lett. 38, 588-589 (2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、これまでにポルフィリン又はフタロシアニンの光物理的性質について報告してきた（例えば、非特許文献３〜５参照）。その中で、ニトロキシドラジカルにフタロシアニンの蛍光を強く消光する働きがあることを明らかにした（例えば、非特許文献６〜９参照）。一方、ニトロキシドラジカルは、ビタミンＣ（やその他の少数の反応活性物質）と反応して不対電子を失う（ラジカルではなくなる）ことも知られている。本発明者らはこれらの点に注目し、ビタミンＣとの反応による発光強度増大から、ビタミンＣ濃度を定量・検出できるのではないかと考え検討した結果、本発明を完成させた。
【００１０】
本発明の目的は、従来法の問題点を克服しうる、新規なビタミンＣの検出法及び定量法を提供すること、特に、研究目的の生体内（細胞中など）でのビタミンＣの挙動を解明しうるバイオイメージングへの応用が可能な、発光によるビタミンＣの検出法及び定量法を提供することである。本発明の目的はまた、かかる方法において有用な蛍光プローブを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
すなわち本発明は、以下１〜１３に挙げるような、ニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンからなるレドックス応答性蛍光プローブ及びそれを含有するリポソーム製剤、並びにそれらを用いる発光によるビタミンＣの検出法及び定量法を提供するものである。
【００１２】
１．ニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンからなるレドックス応答性蛍光プローブ。
２．ニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンが、下記式Ｉ：
【００１３】
【化１】
【００１４】
〔式中、
Ｘは、Ｎ又はＣＲ′（ここで、Ｒ′は、水素原子、Ｃ1-18−アルキル基、アリール基又は含窒素ヘテロシクリル基である）であり；
Ｍは、Ｈ2であるか、あるいは周期表第２〜４族、又は第８〜１５族の元素から選択される原子であり；
Ｍが周期表第２〜４族、又は第８〜１５族の元素から選択される原子である場合、１又は２個の軸配位子Ｌが存在していてもよく、ここでＬは、独立して、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、トリ（Ｃ1-18−アルキル）シリルオキシ基又はニトロキシドラジカルであり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は、互いに独立して、水素原子、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、アリール基、含窒素ヘテロシクリル基、又はニトロキシドラジカルであるか、あるいは
Ｒ1及びＲ2は、それらが結合する炭素原子と一緒になって、芳香環若しくは含窒素ヘテロ環を形成し、該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環は、非置換であるか、又はハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基及び含窒素ヘテロシクリル基から選択される１つ以上の置換基により置換されているか、又は該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環の２個の隣接する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよく、
Ｒ3及びＲ4は、それらが結合する炭素原子と一緒になって、芳香環若しくは含窒素ヘテロ環を形成し、該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環は、非置換であるか、又はハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基及び含窒素ヘテロシクリル基から選択される１つ以上の置換基により置換されているか、又は該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環の２個の隣接する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよく、
Ｒ5及びＲ6は、それらが結合する炭素原子と一緒になって、芳香環若しくは含窒素ヘテロ環を形成し、該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環は、非置換であるか、又はハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基及び含窒素ヘテロシクリル基から選択される１つ以上の置換基により置換されているか、又は該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環の２個の隣接する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよく、又は
Ｒ7及びＲ8は、それらが結合する炭素原子と一緒になって、芳香環若しくは含窒素ヘテロ環を形成し、該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環は、非置換であるか、又はハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基及び含窒素ヘテロシクリル基から選択される１つ以上の置換基により置換されているか、又は該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環の２個の隣接する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよいが；
但し、化合物には少なくとも１個のニトロキシドラジカルが存在する〕
で表される化合物である、上記１に記載の蛍光プローブ。
３．ニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンが、下記式ＩＩ：
【００１５】
【化２】
【００１６】
〔式中、
Ｘ、Ｎ又はＣＲ′（ここで、Ｒ′は、水素原子、Ｃ1-18−アルキル基、アリール基又は含窒素ヘテロシクリル基である）であり；
Ｍは、Ｈ2であるか、あるいは周期表第２〜４族、又は第８〜１５族の元素から選択される原子であり；
Ｍが周期表第２〜４族、又は第８〜１５族の元素から選択される原子である場合、１又は２個の軸配位子Ｌが存在していてもよく、ここでＬは、独立して、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、トリ（Ｃ1-18−アルキル）シリルオキシ基又はニトロキシドラジカルであり；
ｎは、互いに独立して、０、１、２、３又は４であり；
Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ及びＲｄは、互いに独立して、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基又は含窒素ヘテロシクリル基であるか、あるいはｎが２である場合、２個の隣接する各Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ及びＲｄは、それらが結合する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよいが；
但し、化合物には少なくとも１個のニトロキシドラジカルが存在する〕
で表される化合物である、上記１又は２に記載の蛍光プローブ。
４．Ｍが、周期表第２族、又は第１２〜１５族の元素から選択される原子であり、１又は２個の軸配位子Ｌが存在する、上記２又は３に記載の蛍光プローブ。
５．ニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンが、下記式ＩＩＩ：
【００１７】
【化３】
【００１８】
〔式中、
Ｘは、Ｎ又はＣＲ′（ここで、Ｒ′は、水素原子、Ｃ1-18−アルキル基、アリール基又は含窒素ヘテロシクリル基である）であり；
Ｌ1及びＬ2の一方は、ニトロキシドラジカルであり、他方は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、トリ（Ｃ1-18−アルキル）シリルオキシ基又はニトロキシドラジカルであり；
Ｒａ′、Ｒｂ′、Ｒｃ′及びＲｄ′は、互いに独立して、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基又は含窒素ヘテロシクリル基であり；
ｎは、互いに独立して、０、１、２、３又は４である〕
で表される錯体である、上記１〜４のいずれかに記載の蛍光プローブ。
６．Ｘが、Ｎである、上記２〜５のいずれかに記載の蛍光プローブ。
７．Ｌ、Ｌ1又はＬ2、あるいはＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7又はＲ8におけるニトロキシドラジカルが、下記式ＩＶ：
【００１９】
【化４】
【００２０】
〔式中、
Ｙは、Ｎと一緒になって、５〜６員の飽和若しくは部分不飽和の含窒素ヘテロ環（ここで、＞Ｎ−Ｏ・基に隣接する２つの原子は、第三級炭素原子であり、そして含窒素ヘテロ環は、追加のＮ若しくはＯ原子を含んでいてもよい）を形成し、；
Ｚは、単結合、又はスペーサーである〕
である、上記２〜６のいずれかに記載の蛍光プローブ。
８．ニトロキシドラジカルが、２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）、２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ（ＰＲＯＸＹＬ）、４，４−ジメチル−３−オキサゾリジニルオキシ（ＤＯＸＹＬ）又はニトロニルニトロキシド（ＮＮ）から選択される５〜６員の飽和若しくは部分不飽和の含窒素ヘテロ環構造を含む基である、上記１〜７のいずれかに記載の蛍光プローブ。
９．環原子と一緒になって形成されるニトロキシドラジカルを含む環が、２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）又は２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ（ＰＲＯＸＹＬ）である、上記２〜６のいずれかに記載の蛍光プローブ。
１０．上記１〜９のいずれかに記載の蛍光プローブを含有するリポソーム製剤。
１１．試料中のビタミンＣを検出する方法であって、
（１）励起光の照射下、上記１〜９のいずれかに記載の蛍光プローブ又は上記１０に記載のリポソーム製剤と、試料とを接触させる工程；及び
（２）発光をモニターする工程、を含む方法。
１２．試料中のビタミンＣを定量する方法であって、
（１）励起光の照射下、上記１〜９のいずれかに記載の蛍光プローブ又は上記１０に記載のリポソーム製剤と、試料とを接触させる工程；
（２）発光をモニターし、発光強度の時間変化を測定する工程；及び
（３）試料中のビタミンＣの濃度を決定する工程、を含む方法。
１３．生体内のビタミンＣを検出する方法であって、
（１）上記１０に記載のリポソーム製剤を、被験動物（ヒトを除く）に投与する工程；及び
（２）波長６５０nm以上の励起光を被験動物に照射し、発光をモニターする工程、を含む方法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明のビタミンＣを定量する方法の基本的な操作は、試料と蛍光プローブとを接触させ、発光強度時間変化を測定するだけという簡単なものであり（錯体濃度すら正確に調整する必要はない）、且つ精度良く定量することができる。発光強度時間変化で定量しているので、試料は溶液であっても懸濁液であってもよい。したがって、ＨＰＬＣ法に必要な機器調整や試料前処理、インドフェノール法の滴定など煩雑な操作は必要ない。
【００２２】
特に、本発明の生体内のビタミンＣを検出する方法では、（１）リポソームに取り込まれたニトロキシドラジカルを有するフタロシアニンが細胞内に到達すること（例えば、非特許文献１０〜１１参照）、（２）蛍光プローブ（還元体）の励起光・蛍光の波長は、生体組織透過性の高い領域（＞６５０nm）にあること、（３）ニトロキシドラジカルの還元により、十分な発光強度の増大が確認されたことなどから、バイオ蛍光イメージングへの応用が期待できる。すなわち、蛍光顕微鏡で発光増大時間変化を追うことによって、生体内ビタミンＣ濃度分布を知ることができ、さらにはビタミンＣの生体内の働きを知るためのツールとしての利用が期待される。また、リポソーム製剤とすることにより、ビタミンＣ以外の反応活性物質（鉄二価イオン、スーパーオキサイドなど）によって発光強度に影響が及ばないことから選択性の面で有利と期待される。
【００２３】
例えば、最近、下記：
【化５】
【００２４】
で示されるニトロキシドラジカルを有する化合物を水溶性蛍光プローブとして細胞に投与すると、細胞に取り込まれた後、細胞内還元物質との酸化還元反応によって速やかに蛍光プローブのニトロキシドラジカルが還元され、発光強度増強が観測されることが報告された（例えば、非特許文献１２参照）。一方、下記実施例５及び６に明らかにしたように、本発明の蛍光プローブを含有するリポソーム製剤は、細胞に取り込まれた後も、細胞内還元物質による影響をほとんど受けずに、高濃度ビタミンＣを投与した場合にのみ発光強度増大が観測された。したがって、本発明の蛍光プローブを含有するリポソームはin vivoにおいてもビタミンＣの検出及び定量への利用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】製造例１で得られた錯体であり、本発明の代表的な例Ｒ１及びＲ２である。
【図２】本発明の発光によるビタミンＣの検出法及び定量法の反応模式図である。
【図３】実施例１のビタミンＣ定量実験で得られた、発光強度時間変化を示したグラフである。
【図４】実施例１のビタミンＣ定量実験で得られた、反応速度定数とビタミンＣ濃度の間の相関を示したグラフである。
【図５】実施例２のビタミンＣ定量実験で得られた、発光強度時間変化を示したグラフである。
【図６】実施例４のビタミンＣ定量実験で得られた、発光強度時間変化を示したグラフである。
【図７】実施例４で得られた、ビタミンＣの添加前後のＲ２リポソーム溶液の発光スペクトルである。
【図８】実施例４のビタミンＣ定量実験で得られた、反応速度定数とビタミンＣ濃度の間の相関を示したグラフである。
【図９】実施例５の細胞におけるビタミンＣバイオイメージング実験で得られた、Ｒ２リポソームの添加後、（ａ）はビタミンＣを添加しない細胞系における発光の様子を示す顕微鏡画像であり（Ｒ２リポソーム添加後２４時間）、（ｂ）はビタミンＣを添加した細胞系における発光の様子を示す顕微鏡画像である（ビタミンＣ添加後２４０分）。
【図１０】実施例５の細胞におけるビタミンＣバイオイメージング実験で得られた、ビタミンＣ添加後の細胞内Ｒ２リポソームの発光強度時間変化を示したグラフである。
【図１１】実施例６におけるＲ２リポソームと過酸化水素との反応実験で得られた、発光強度時間変化を示したグラフである。
【図１２】実施例７のデヒドロアスコルビン酸の細胞内還元のリアルタイム観察実験で得られた、デヒドロアスコルビン酸の添加後、（ａ）は２分後、（ｂ）は１８０分後の細胞系における発光の様子を示す顕微鏡画像である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明のニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンは、その化学構造の一部に（例えば、軸配位子として、ポルフィリン又はフタロシアニン環への縮合環として、あるいはポルフィリン又はフタロシアニン環上の置換基として）ニトロキシドラジカルを含むポルフィリン又はフタロシアニンを意味する。本発明において「ポルフィリン」及び「フタロシアニン」という用語は、各々「ポルフィリン又はその誘導体」及び「フタロシアニン又はその誘導体」を意味する。したがって、本発明の「ポルフィリン」及び「フタロシアニン」いう用語は、ポルフィリン及びフタロシアニンと共に、ナフタロシアニン、５，１０，１５，２０−テトラアザポルフィリン、サブフタロシアニン、スーパーフタロシアニンのような類縁体、及びそれらの置換誘導体を含む。本発明の化合物は、ニトロキシドラジカルの不対電子を失う（ラジカルではなくなる）と、生体組織透過性の高い領域（＞６５０nm）での発光強度の増大を示す。
【００２７】
本発明のニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンは、好ましくは、下記式Ｉ：
【００２８】
【化６】
【００２９】
で表される化合物であり、より好ましくは、下記式ＩＩ：
【００３０】
【化７】
【００３１】
で表される化合物である。式Ｉ又はＩＩにおいて、Ｘは、Ｎ又はＣＲ′（ここで、Ｒ′は、水素原子、Ｃ1-18−アルキル基、アリール基又は含窒素ヘテロシクリル基である）を意味する。Ｘは、好ましくはＮである。
【００３２】
式Ｉ又はＩＩにおいて、Ｍは、Ｈ2（すなわち、メタルフリー）であるか、あるいは周期表第２〜４族、又は第８〜１５族の元素から選択される原子、例えば、Ｍｇ、Ａｌ、Ｓｉ、Ｓｃ、Ｔｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｇａ、Ｇｅ、Ｙ、Ｚｒ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｓｎ、Ｌａ、Ｃｅ、Ｌｕ、Ｈｆ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ａｕ、Ｈｇ、Ｔｌ、Ｔｈ又はＵから選択される原子である。好ましくは、Ｍは、周期表第２族、又は第１２〜１５族の元素、例えばＭｇ、Ａｌ、Ｓｉ、Ｚｎ、Ｇａ、Ｇｅ、Ｃｄ、Ｉｎ又はＳｎから選択される原子である。
【００３３】
より好ましくは、Ｍが周期表第１４族の元素から選択される原子であり、特に好ましくは、ＭがＳｉであり、２個の軸配位子Ｌが存在する化合物、すなわち、下記式ＩＩＩ：
【００３４】
【化８】
【００３５】
で表される錯体である。式ＩＩＩにおいて、Ｘは、式Ｉ又はＩＩと同義であるが、好ましくはＮである。すなわち、ニトロキシドラジカルを軸配位子として有するフタロシアニナトケイ素錯体が特に好ましい。
【００３６】
式Ｉ又はＩＩにおいて、ニトロキシドラジカルは、Ｍが周期表第２〜４族、又は第８〜１５族の元素から選択される原子である場合、軸配位子Ｌとして存在していてもよく、あるいは式Ｉにおいて、ポルフィリン又はフタロシアニン環上の置換基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7又はＲ8として存在してもよい。また式ＩＩＩの化合物において、軸配位子Ｌ1及びＬ2の一方は、ニトロキシドラジカルである。そのような軸配位子又は置換基としてのニトロキシドラジカルは、＞Ｎ−Ｏ・を含む基であればよいが、好ましくは、下記式ＩＶ：
【００３７】
【化９】
【００３８】
で表されるものである。式ＩＶにおいて、Ｙは、Ｎと一緒になって、５〜６員の飽和若しくは部分不飽和の含窒素ヘテロ環（ここで、＞Ｎ−Ｏ・基に隣接する２つの原子は、第三級炭素原子であり、そして含窒素ヘテロ環は、追加のＮ若しくはＯ原子を含んでいてもよい）を形成する。ニトロキシドラジカルは、好ましくは、２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）、２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ（ＰＲＯＸＹＬ）、４，４−ジメチル−３−オキサゾリジニルオキシ（ＤＯＸＹＬ）又はニトロニルニトロキシド（ＮＮ）から選択される５〜６員の飽和若しくは部分不飽和の含窒素ヘテロ環構造を含む基である。
【００３９】
【化１０】
（式中、Ｒは、Ｃ1-18−アルキル基などを意味する）
【００４０】
式ＩＶにおいて、Ｚは、単結合であるか、又は−Ｏ−、−（ＣＨ2）1-18−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＮＨ−、−ＮＨＣＯ−若しくは−ＣＯＮＨ−又はそれらの組み合わせなどの錯体中心原子Ｍ又はポルフィリン又はフタロシアニン環へのスペーサーである。
【００４１】
別の態様として、式Ｉ又はＩＩにおいて、ニトロキシドラジカルは、ポルフィリン又はフタロシアニン環への縮合環として存在してもよい。すなわち、式Ｉにおいて、Ｒ1とＲ2、Ｒ3とＲ4、Ｒ5とＲ6、及び／又はＲ7とＲ8が、「それらが結合する炭素原子と一緒になって、芳香環若しくは含窒素ヘテロ環を形成し、該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環の２個の隣接する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよい」とは、Ｒ1とＲ2、Ｒ3とＲ4、Ｒ5とＲ6、及び／又はＲ7とＲ8が、それらが結合する炭素原子と一緒になって形成した芳香環若しくは含窒素ヘテロ環において、さらに該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環の２個の隣接する環原子と一緒になって、＞Ｎ−Ｏ・基を含む５〜６員の飽和若しくは部分不飽和の含窒素ヘテロ環（ここで、＞Ｎ−Ｏ・基に隣接する２つの原子は、第三級炭素原子であり、そして含窒素ヘテロ環は、追加のＮ若しくはＯ原子を含んでいてもよい）を形成することを意味する。好ましい環は、前記のＴＥＭＰＯ、ＰＲＯＸＹＬ、ＤＯＸＹＬ又はＮＮで示されるような５〜６員の飽和若しくは部分不飽和の含窒素ヘテロ環である。特に好ましくは、ＴＥＭＰＯ又はＰＲＯＸＹＬである。
【００４２】
同様に、式ＩＩにおいて、「ｎが２である場合、２個の隣接する各Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ及びＲｄは、それらが結合する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよい」とは、各Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ及び／又はＲｄが、その２個の隣接する環原子と一緒になって、＞Ｎ−Ｏ・基を含む５〜６員の飽和若しくは部分不飽和の含窒素ヘテロ環（ここで、＞Ｎ−Ｏ・基に隣接する２つの原子は、第三級炭素原子であり、そして含窒素ヘテロ環は、追加のＮ若しくはＯ原子を含んでいてもよい）を形成することを意味する。好ましい環は、前記のＴＥＭＰＯ、ＰＲＯＸＹＬ、ＤＯＸＹＬ又はＮＮで示されるような５〜６員の飽和若しくは部分不飽和の含窒素ヘテロ環である。特に好ましくは、ＴＥＭＰＯ又はＰＲＯＸＹＬである。そのような式ＩＩの化合物の例としては、以下：
【００４３】
【化１１】
【００４４】
（式中、Ｍは、前記と同義である）が挙げられる。かかる化合物は、例えば、Anthony G. M. Barrett, et al., Tetrahedron 63 (24), 5244-5250 (2007) に記載の方法に従って、調製することができる。
【００４５】
本発明の式Ｉにおいて、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は、互いに独立して、水素原子、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、アリール基、含窒素ヘテロシクリル基、又はニトロキシドラジカルであるか、あるいは
Ｒ1及びＲ2は、それらが結合する炭素原子と一緒になって、芳香環若しくは含窒素ヘテロ環を形成し、該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環は、非置換であるか、又はハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基及び含窒素ヘテロシクリル基から選択される１つ以上の置換基により置換されているか、又は該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環の２個の隣接する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよく、
Ｒ3及びＲ4は、それらが結合する炭素原子と一緒になって、芳香環若しくは含窒素ヘテロ環を形成し、該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環は、非置換であるか、又はハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基及び含窒素ヘテロシクリル基から選択される１つ以上の置換基により置換されているか、又は該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環の２個の隣接する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよく、
Ｒ5及びＲ6は、それらが結合する炭素原子と一緒になって、芳香環若しくは含窒素ヘテロ環を形成し、該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環は、非置換であるか、又はハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基及び含窒素ヘテロシクリル基から選択される１つ以上の置換基により置換されているか、又は該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環の２個の隣接する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよく、又は
Ｒ7及びＲ8は、それらが結合する炭素原子と一緒になって、芳香環若しくは含窒素ヘテロ環を形成し、該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環は、非置換であるか、又はハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基及び含窒素ヘテロシクリル基から選択される１つ以上の置換基により置換されているか、又は該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環の２個の隣接する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよい。
【００４６】
上記「Ｒ1及びＲ2は、それらが結合する炭素原子と一緒になって芳香環又は含窒素ヘテロ環を形成し」とは、Ｒ1及びＲ2が、それらが結合するピロール環部分の２個の炭素原子と一緒になって、芳香環、例えば、ベンゼン又はナフタレン環を形成するか、あるいは含窒素ヘテロ環、例えば、ピリジン又はピラジン環のような、少なくとも１個、好ましくは１又は２個の窒素原子を含む、５〜６員の飽和、部分不飽和又は不飽和環を形成することを意味する。「Ｒ3及びＲ4」、「Ｒ5及びＲ6」、「Ｒ7及びＲ8」についての同様の記載も前記と同義である。
【００４７】
本発明の式ＩＩの化合物は、本発明の式Ｉにおいて、Ｒ1及びＲ2、Ｒ3及びＲ4、Ｒ5及びＲ6、並びにＲ7及びＲ8が、各々それらが結合する炭素原子と一緒になってベンゼン環を形成したものに相当する。したがって、式ＩＩにおいて、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ及びＲｄは、互いに独立して、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基又は含窒素ヘテロシクリル基であるか、あるいはｎが２である場合、２個の隣接する各Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ及びＲｄは、それらが結合する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよく、ｎは、互いに独立して、０、１、２、３又は４である。
【００４８】
本発明の式ＩＩＩの錯体は、さらに本発明の式ＩＩにおいて、Ｍが、少なくとも一方がニトロキシドラジカルである軸配位子Ｌ1及びＬ2を有するＳｉ（ケイ素）であるものに相当する。したがって、式ＩＩＩにおいて、Ｒａ′、Ｒｂ′、Ｒｃ′及びＲｄ′は、互いに独立して、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基又は含窒素ヘテロシクリル基であり、ｎは、互いに独立して、０、１、２、３又は４である。
【００４９】
なお、本明細書及び特許請求の範囲において、他に記載のない限り、「ハロゲン原子」という用語は、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素を意味する。好ましくは、塩素である。
【００５０】
同様に、他に記載のない限り「Ｃ1-18−アルキル基」という用語は、単独で、又は他の用語との組み合わせにおいて、炭素数１〜１８の直鎖状又は分岐鎖状飽和炭化水素基を意味する。例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、デシル、ドデシル、オクタデシルが挙げられる。好ましくは、Ｃ1-8−アルキル基が挙げられる。
【００５１】
同様に、他に記載のない限り「Ｃ1-18−アルコキシ基」という用語は、酸素原子を介して結合する前記「Ｃ1-18−アルキル基」、すなわちＣ1-18−アルキル−Ｏ−基を意味する。例としては、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｉｓｏ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｉｓｏ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｎ−ペンチルオキシ、ｎ−ヘキシルオキシ、ｎ−ヘプチルオキシ、ｎ−オクチルオキシ、デシルオキシ、ドデシルオキシ、オクタデシルオキシなどが挙げられる。好ましくは、Ｃ1-8−アルコキシ基が挙げられる。
【００５２】
同様に、他に記載のない限り「トリ（Ｃ1-18−アルキル）シリルオキシ基」という用語において、かかる基に存在する３個の「Ｃ1-18−アルキル」部分は、同一であっても異なっていてよく、前記「Ｃ1-18−アルキル基」から選択される。そのようなトリ（Ｃ1-18−アルキル）シリルオキシ基の例としては、トリメチルシリルオキシ、トリエチルシリルオキシ、トリ−ｉｓｏ−プロピルシリルオキシ、トリ−ｎ−ヘキシルシリルオキシ、デシル−ジメチルシリルオキシ、ジメチル−オクタデシルシリルオキシなどが挙げられる。
【００５３】
同様に、他に記載のない限り「−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル」という用語は、−Ｓ−Ｃ1-18−アルキル、−Ｓ（Ｏ）−Ｃ1-18−アルキル及び−Ｓ（Ｏ）2−Ｃ1-18−アルキルを含むことを意味する。好ましくは、−Ｓ−Ｃ1-8−アルキル、−Ｓ（Ｏ）−Ｃ1-8−アルキル及び−Ｓ（Ｏ）2−Ｃ1-8−アルキル、例えば、メチルチオ、エチルチオなどが挙げられる。さらに「−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル」という用語は、オキシエチレン（ＯＣＨ2ＣＨ2）単位が１〜８である、エチレングリコール基を意味する。好ましくは、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）2-4Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、例えば３，６，９−トリオキサデシルオキシなどが挙げられる。
【００５４】
同様に、他に記載のない限り「アリール基」という用語は、単独で、又は他の用語との組み合わせにおいて、炭素数６〜１４の芳香族単環及び多環式炭化水素の一価の基を意味する。例としては、フェニル、ナフタチル、アントリル、フェナントリルなどが挙げられる。「アリール基」は、非置換であるか、又はハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基及びフェニル基から選択される１つ以上の置換基により置換されていてもよい。好ましいアリール基としては、フェニル又はナフチルが挙げられる。
【００５５】
同様に、他に記載のない限り「含窒素ヘテロシクリル基」という用語は、単独で、又は他の用語との組み合わせにおいて、少なくとも１個、好ましくは１又は２個の窒素原子を含む、５〜６員の飽和、部分不飽和又は不飽和環の一価の基を意味する。例としては、ピロリル、ピラゾリル、ピリジル、ピラジニルなどが挙げられる。「含窒素ヘテロシクリル基」は、非置換であるか、又はハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基及びフェニル基から選択される１つ以上の置換基により置換されていてもよく、あるいは少なくとも１個の窒素原子へのプロトン又はＣ1-8−アルキル基の付加によりオニウムを形成してもよい。好ましい含窒素ヘテロシクリル基としては、ピリジル、ピラジニル又はまたはそのオニウム化合物（例えば、Ｎ−メチルピリジニウミル）が挙げられる。
【００５６】
本発明の蛍光プローブとして用いられるニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンの代表的な例を、以下の表１に示す。
【００５７】
【化１２】
【００５８】
【表１】
【００５９】
本発明の代表的な例として表１に挙げたフタロシアニナトケイ素錯体Ｒ１〜Ｒ６は、上記の非特許文献６〜９に記載の方法、又は下記の実施例に記載した手順に従って製造することができる。また、当業者であれば、これらの方法と技術常識に準じて、本発明のニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニン、特に式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩに包含される化合物を製造することができる。
【００６０】
本発明のリポソーム製剤は、かかるニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンが、脂質二重層からなる閉鎖小胞（リポソーム）に取り込まれたものを意味する。例えば、本発明のリポソーム製剤は、本発明のニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンが、卵黄または大豆由来の天然リン脂質、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン等の合成リン脂質などのリン脂質から形成される単膜または多重膜リポソームに取り込まれたものである。微粒子状であっても、微粒子を含む溶液又は懸濁液であってもよい。リポソーム製剤は、当業者に公知の方法、又は下記の実施例に記載した手順に従い、適宜製造すればよい。例えば、活性成分以外の助剤、例えば糖類（ラクトース、マンニトール等）、中性脂質（コレステロール、トリグリセライド等）、荷電脂質（ホスファチジン酸、ステアリルアミン等）を加えることもでき、公知の方法に従いリポソームの膜修飾を行い、所望の性質を付与することもできる。
【００６１】
本発明の発光によるビタミンＣの検出法及び定量法は、（１）波長６５０nm以上の励起光の照射下、本発明の蛍光プローブ又はリポソーム製剤と、試料とを接触させる工程；及び（２）発光をモニターする工程、を含む。ここで試料は、ビタミンＣを含有する（とされる）検体を、水、緩衝液、又はメタノールのようなビタミンＣを溶解しうる有機溶媒、あるいはそれらの混合物を用いて適切な濃度の溶液又は懸濁液として調製するか、あるいは検体が液体の場合は、そのまま又は適切な前処理に付して調製すればよい。
【００６２】
本発明の発光によるビタミンＣの検出法及び定量法は、本発明の蛍光プローブ、すなわちニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンが、ビタミンＣと接触し、ニトロキシドラジカルが還元され、不対電子を失った環元体に変換されることにより（すなわち、ニトロキシドラジカルによる蛍光消光作用の消失により）起こる発光強度の増大をモニターする（図２の反応模式図を参照）。本発明の特徴の一つは、発光強度の増大が、生体組織透過性の高い領域（＞６５０nm）で起こることである（例えば、図７参照）。したがって、通常、励起光は、波長６５０nm以上、好適には還元体の励起極大波長付近に設定し、発光もまた、還元体の蛍光極大波長付近に設定してモニターすればよい。
【００６３】
本発明のビタミンＣの定量法はさらに（２）発光をモニターし、発光強度の時間変化を測定する工程；及び（３）試料中のビタミンＣの濃度を決定する工程を含む。本発明者らは、発光強度の時間変化から算出される反応速度定数と、ビタミンＣ濃度との間に相関関係があることを見出した（下記実施例１〜４参照）。なおビタミンＣは２電子還元剤であるが、１電子目の還元が律速段階であるので、例えばメタノール中での１個のニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンからなる蛍光プローブとビタミンＣとの反応は、二次反応（擬一次反応）、２個のニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンからなる蛍光プローブとビタミンＣとの反応は、逐次反応と解することができる。また１又は２個のニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンからなる蛍光プローブを含有するリポソーム製剤を用いた場合では、いずれも二次反応（擬一次反応）と解することができることを本発明者らは確認している。したがって、当業者であれば、得られた発光強度の時間変化を適切な反応速度式を用いて解析することにより、速度定数を適宜算出することができる。このように、本発明のビタミンＣの定量法は、発光強度の時間変化の解析から速度定数を算出し、検量線を用いて濃度を求めることができるという、非常に簡便なものである。
【００６４】
さらに本発明のビタミンＣの検出法又は定量法は、生体内のビタミンＣを検出する方法へ応用することが可能である。本発明の生体内のビタミンＣを検出する方法は、（１）本発明のリポソーム製剤を、被験動物に投与する工程；及び（２）波長６５０nm以上の励起光を被験動物に照射し、発光をモニターする工程を含む。本発明者らは、リポソームに取り込まれたニトロキシドラジカルを軸配位子として有するフタロシアニナトケイ素錯体が、細胞内に到達すること、且つ生体内の酸化還元による影響が少ないことを既に報告している（例えば、非特許文献１０〜１１参照）。一方、本明細書において、かかるリポソーム製剤がビタミンＣと反応し、生体組織透過性の高い領域で発光強度増大を示すことを確認した。したがって、本発明の蛍光プローブ又はリポソーム製剤は、ビタミンＣのバイオ蛍光イメージングへの応用が十分に期待できる。
【実施例】
【００６５】
製造例１：錯体Ｒ１及びＲ２（図１あるいは表１参照）の製造
ジヒドロキシ（テトラ−ｔｅｒｔ−ブチルフタロシアニナト）ケイ素（ＳｉＰｃ（ＯＨ）2）（Ｒ０：上記表１参照）は、Macromolecules, 11 (1), 186-191 (1978)の方法に従って入手できる。ＳｉＰｃ（ＯＨ）2（５０mg）及び２，２，６，６−テトラメチル−４−ピペリジノール−１−オキシル（４３０mg、Cat.-No. 176141、Sigma-Aldrich Co.より購入；以下、４−ヒドロキシ−ＴＥＭＰＯという）をトルエン中、塩化カルシウム（２g）の存在下に４８時間加熱還流した。得られた混合物を冷却後、塩基性アルミナ及びゲルろ過クロマトグラフィー（Bio-Beads SX-1、Bio-Radより購入）による精製後、錯体Ｒ１及びＲ２をそれぞれ４０％及び１５％の収率で得た。
【００６６】
Ｒ１の元素分析（Ｃ57Ｈ66Ｎ9Ｏ3Ｓｉ）：
計算値 Ｃ，７１．８２； Ｈ，６．９８； Ｎ，１３．２２％
実測値 Ｃ，７０．８４； Ｈ，７．０８； Ｎ，１２．４４％
Ｒ２の元素分析（Ｃ66Ｈ82Ｎ10Ｏ4Ｓｉ）：
計算値 Ｃ，７１．５６； Ｈ，７．４８； Ｎ，１２．６５％
実測値 Ｃ，７０．９８； Ｈ，７．０５； Ｎ，１２．５１％
【００６７】
製造例２：錯体Ｒ３（表１参照）の製造
４−ヒドロキシ−ＴＥＭＰＯに代えて、３−ヒドロキシ−２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ〔以下、３−ヒドロキシ−ＰＲＯＸＹＬという；E. G. Rozantsev et. al., Tetrahedron 21, 491 (1965) に記載の方法に従って、３−カルバモイル−２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ（Cat.-No. C5151、Sigma-Aldrich Co.より購入）から調製した〕を用い、還流時間を２４時間とした以外は、製造例１と同様にして、錯体Ｒ３を３７％の収率で得た。
【００６８】
UV-vis (λ/nm(ε/104)) 685.0 (28.0), 651.0 (3.76), 612.0 (4.41), 360.0 (8.90);
FAB mass m/e 938 (M+);
元素分析（Ｃ56Ｈ64Ｎ9Ｏ3Ｓｉ）：
計算値 Ｃ，７１．６１； Ｈ，６．８７； Ｎ，１３．４２％
実測値 Ｃ，７０．８９３； Ｈ，６．６３３； Ｎ，１２．７６６％
【００６９】
製造例３：錯体Ｒ４（表１参照）の製造
４−ヒドロキシ−ＴＥＭＰＯに代えて、３−ヒドロキシ−ＰＲＯＸＹＬを用い、還流時間を４２時間とした以外は、製造例１と同様にして、錯体Ｒ４を１９％の収率で得た。
【００７０】
UV-vis (λ/nm(ε/104)) 682.5 (26.0), 651.5 (3.45), 613.5 (4.19), 359.5 (8.69);
ESI-TOF m/e 1079 (M+);
元素分析（Ｃ64Ｈ78Ｎ10Ｏ4Ｓｉ）：
計算値 Ｃ，７１．２１； Ｈ，７．２８； Ｎ，１２．９８％
実測値 Ｃ，７０．４５９； Ｈ，７．４０２； Ｎ，１２．７８３％
【００７１】
製造例４：錯体Ｒ５（表１参照）の製造
ＳｉＰｃ（ＯＨ）2及び４−カルボキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル（Cat.-No. 382000、Sigma-Aldrich Co.より購入；以下、４−カルボキシ−ＴＥＭＰＯという）をピリジン中、２４時間加熱還流した。得られた混合物を冷却後、中性アルミナ及びゲルろ過クロマトグラフィー（Bio-Beads SX-1又はSX-8、Bio-Radより購入）による精製後、錯体Ｒ５を９％の収率で得た。
【００７２】
UV-vis (λ/nm(ε/104)) 685.5 (24.2), 656.0 (3.33), 616.5 (3.72), 362.5 (7.64);
FAB mass m/e 980 (M+);
元素分析（Ｃ58Ｈ66Ｎ9Ｏ4Ｓｉ）：
計算値 Ｃ，７０．９９； Ｈ，６．７８； Ｎ，１２．８５％
実測値 Ｃ，７１．９９７； Ｈ，７．１３３； Ｎ，１１．９５５％
【００７３】
製造例５：錯体Ｒ６（表１参照）の製造
４−ヒドロキシ−ＴＥＭＰＯに代えて、３−カルボキシ−２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ（Cat.-No. 253324、Sigma-Aldrich Co.より購入；以下、３−カルボキシ−ＰＲＯＸＹＬという）を用いた以外は、製造例４と同様にして、錯体Ｒ６を１５％の収率で得た。
【００７４】
UV-vis (λ/nm(ε/104)) 685.0 (23.6), 653.0 (3.61), 616.5 (3.77), 362.0 (7.75);
FAB mass m/e 966 (M+);
元素分析（Ｃ57Ｈ64Ｎ9Ｏ4Ｓｉ）：
計算値 Ｃ，７０．７８； Ｈ，６．６７； Ｎ，１３．０３％
実測値 Ｃ，７０．６２２； Ｈ，６．５０３； Ｎ，１２．２５１％
【００７５】
実施例１：錯体Ｒ１を用いたビタミンＣ定量実験（メタノール溶液中）
〔実験手順〕
（１）製造例１で得られた錯体Ｒ１の、５．６×１０-6Mメタノール溶液を調製した。
（２）ビタミンＣの、６４mM、１６mM、８mM、４mMメタノール溶液を調製した。
（３）ガラスセルに上記（１）で得られた溶液１．８mlとマイクロ攪拌子を入れてスターラー（１０００r.p.m）で攪拌した。
（４）攪拌したまま、励起光としてヤマキ社製ダイオードレーザー（ＬＤＸ−２６１５−６５０−ＴＯ３、波長６５０nm）を照射し、日本分光社製分光器（ＣＴ−２５ＴＰ）と浜松ホトニクス社製光電子増倍管（Ｒ９２８）を用いて、６８０nmの発光をモニターしながら、上記（２）で得られたビタミンＣメタノール溶液０．２mlを加え、発光強度時間変化を測定した。このとき、光ファイバーがマイクロ攪拌子の乱反射を捉えないように角度や位置関係を調節した。
（５）不均一な拡散の寄与を考慮し、ビタミンＣを加えてから３００秒後以降のデータを解析に用いた。
【００７６】
〔実験結果〕
得られた発光強度時間変化を図３に示す。ビタミンＣの添加後３００秒以降のデータを用いて擬一次反応で解析し、反応速度定数を得た。この反応速度定数とビタミンＣ濃度の間に比例関係があることを確認した（図４）。これによって、この方法でビタミンＣの定量が精度良く行えることが示された。
【００７７】
実施例２：錯体Ｒ１を用いたビタミンＣ定量実験（リポソーム水溶液中）
〔実験手順〕
（１）吸収スペクトルを用いて、製造例１で得られた錯体Ｒ１ ０．１５mg（１．５８×１０-7mol）を定量した。
（２）ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）２０．９mg（２．８６×１０-5mol）をクロロホルム３．６mlに溶かした。
（３）Ｒ１をナスフラスコにいれＴＨＦ１８０μlを加えた。さらに上記（２）で得られたリポソームのクロロホルム溶液を加え、エバポレータで溶媒を除去した。
（４）乾燥した固体にＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、D-PBS(-)）２．０mlとグラスビーズ０．５gを加え、ボルテックスミキサーにかけ、その後５０℃で１時間超音波処理を行った。
（５）放冷後、遠心分離を行い（３５００r.p.m、１０分、４０００r.p.m、１０分室温）、目的物である上澄み溶液を得た。
（６）ビタミンＣの、６４mM、３２mM、１６mM、８mM、４mM、２mMＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、D-PBS(-)）溶液を調製した。
（７）ガラスセルにピーク波長の吸収がＡｂｓ＝０．５程度になるようＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、D-PBS(-)）で希釈した上記（５）の溶液１．３５mlとマイクロ攪拌子を入れてスターラー（１０００r.p.m）で攪拌した。
（８）攪拌したまま、励起光としてヤマキ社製ダイオードレーザー（ＬＤＸ−２６１５−６５０−ＴＯ３、波長６５０nm）を照射し、日本分光社製分光器（ＣＴ−２５ＴＰ）と浜松ホトニクス社製光電子増倍管（Ｒ９２８）を用いて、６９０nmの発光をモニターしながら、上記（６）で得られたビタミンＣのＰＢＳ溶液０．１５mlを加え、発光強度時間変化を測定した。このとき、光ファイバーがマイクロ攪拌子の乱反射を捉えないように角度や位置関係を調節した。
【００７８】
〔実験結果〕
得られた発光強度時間変化を図５に示す。メタノール溶液中と同様、発光強度の指数関数的増大を観測することに成功した。
【００７９】
実施例３：錯体Ｒ２を用いたビタミンＣ定量実験（メタノール溶液中）
〔実験手順〕
（１）製造例１で得られた錯体Ｒ２の、５×１０-6Mメタノール溶液を調製した。
（２）ビタミンＣの、６４mMメタノール溶液を調製した。
（３）ガラスセルに上記（１）で得られた溶液１．３５mlとマイクロ攪拌子を入れてスターラー（１０００r.p.m）で攪拌した。
（４）攪拌したまま、励起光としてヤマキ社製ダイオードレーザー（ＬＤＸ−２６１５−６５０−ＴＯ３、波長６５０nm）を照射し、日本分光社製分光器（ＣＴ−２５ＴＰ）と浜松ホトニクス社製光電子増倍管（Ｒ９２８）を用いて、６８６nmの発光をモニターしながら、上記（２）で得られたビタミンＣメタノール溶液０．１５mlを加え、発光強度時間変化を測定した。このとき、光ファイバーがマイクロ攪拌子の乱反射を捉えないように角度や位置関係を調節した。
【００８０】
〔実験結果〕
約６３００％の発光強度増大を観測した。
【００８１】
実施例４：錯体Ｒ２を用いたビタミンＣ定量実験（リポソーム水溶液中）
〔実験手順〕
（１）吸収スペクトルを用いて、製造例１で得られた錯体Ｒ２ ０．１７５mg（１．５８×１０-7mol）を定量した。
（２）ＤＰＰＣ２０．９mg（２．８６×１０-5mol）をクロロホルム３．６mlに溶かした。
（３）Ｒ２をナスフラスコにいれＴＨＦ１８０μlを加えた。さらに上記（２）で得られたリポソームのクロロホルム溶液を加え、エバポレータで溶媒を除去した。
（４）乾燥した固体にＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、D-PBS(-)）２mlとグラスビーズ０．５gを加え、ボルテックスミキサーにかけ、その後５０℃で１時間超音波処理を行った。
（５）放冷後、遠心分離を行い（３５００r.p.m、１０分、室温）、目的物である上澄み溶液を得た。
（６）ビタミンＣの、１２８mM、６４mM、１６mM、８mM、４mM、２mMＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、D-PBS(-)）溶液を調製した。
（７）ピーク波長の吸収がＡｂｓ＝１．４程度になるよう、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、D-PBS(-)）で希釈した上記（５）の溶液１．３５mlとマイクロ攪拌子をガラスセルに入れてスターラー（１０００r.p.m）で攪拌した。
（８）攪拌したまま、励起光としてヤマキ社製ダイオードレーザー（ＬＤＸ−２６１５−６５０−ＴＯ３、波長６５０nm）を照射し、日本分光社製分光器（ＣＴ−２５ＴＰ）と浜松ホトニクス社製光電子増倍管（Ｒ９２８）を用いて、６８６nm（１２．８mMでは７００nm）の発光をモニターしながら、上記（６）で得られたビタミンＣのＰＢＳ溶液０．１５mlを加え、発光強度時間変化を測定した。このとき、光ファイバーがマイクロ攪拌子の乱反射を捉えないように角度や位置関係を調節した。
【００８２】
〔実験結果〕
得られた発光強度時間変化を図６に示す。ビタミンＣ濃度と発光強度の間に相関が認められた。また、発光強度５００％増とバイオイメージングに十分と思われる発光強度変化が観測された（図７）。さらに発光強度時間変化は擬一次反応でフィッティングすることができ、低濃度領域ではビタミンＣ濃度と反応速度定数の間に相関が見られた（図８）。これらのことから研究目的の細胞中でのビタミンＣ蛍光バイオイメージングへの応用が期待できる。
【００８３】
実施例５：細胞におけるビタミンＣバイオイメージング実験
〔実験手順〕
（１）上記実施例４の手順（１）〜（５）で調製した錯体Ｒ２のリポソーム（以下、「Ｒ２リポソーム」という）の溶液をＤＭＦで１０倍希釈し、吸収スペクトルの吸光度から光増感剤（錯体Ｒ２）のリポソームへの取り込み量を算出し濃度計算を行い、濃度調整を行った。
（２）６cmシャーレに、５mlずつヒト子宮頸癌由来細胞（HeLa細胞［JCRB9004］、２×１０4cells/cm2、ヒューマンサイエンス研究資源バンクより購入）を播種し、インキュベーター内で２４時間培養した。２×１０−６Mになるように調整したＲ２リポソームＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、D-PBS(-)）溶液をシャーレに添加し、２０時間培養した。
（３）培地を除去し、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、D-PBS(-)）で２回洗浄してから培地（Eagle’s minimal essential medium ５００mlに、MEM non essential Amino Acids solution ５ml、抗生物質５ml、HEPES １M １０ml、FBS（fetal bovine serum、ウシ胎児血清）５０mlを加えた）５mlを加え、そこに濃度が１２．８mMになるように調整したビタミンＣのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、D-PBS(-)）溶液を０．５５ml加えた。
（４）Leica社製カットフィルタ：Y5を用い、定期的にLeica 社製DM IRB蛍光顕微鏡、Leica社製DFC350FX CCDカメラを用いて発光の様子を観察し（励起光：５９０−６５０nm、モニター波長：６６４−７３４nm）、画像を記録した。
（５）得られた蛍光顕微鏡画像について、画像処理ソフトウェア（ImageJ）を用いて発光強度時間変化の解析を行った。
【００８４】
〔実験結果〕
Ｒ２リポソームの添加後、ビタミンＣを添加しない細胞系を上記と同様に観察したが、２４時間経過後も発光はほとんど観察されなかった（図９ａ）。一方、ビタミンＣを添加した細胞系では、添加後発光の様子に大きな変化が見られ、２４０分後でも強い発光が確認された（図９ｂ）。画像処理ソフトウェアを用いて解析した発光強度時間変化を図１０に示す。本実験により、再現性のある指数関数な発光強度時間変化を見出し、細胞におけるビタミンＣバイオイメージングに成功した。画像解析による細胞内発光強度時間変化の定量的なデータを介して、生体におけるビタミンＣの細胞取り込み速度や、ニトロキシドラジカルのビタミンＣによる細胞内還元速度が決定され、それによりビタミンＣの生体内機能解明につながることが期待される。
【００８５】
実施例６：Ｒ２リポソームと過酸化水素との反応性実験
〔実験手順〕
（１）上記実施例４の手順（１）〜（５）に従い、Ｒ２リポソームの溶液を調製した。
（２）過酸化水素の、１MＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、D-PBS(-)）溶液を調製した。
（３）ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、D-PBS(-)）で１０倍希釈した上記（１）の溶液１．５mlとマイクロ攪拌子をガラスセルに入れてスターラー（１０００r.p.m）で攪拌した。
（４）攪拌したまま、励起光としてヤマキ社製ダイオードレーザー（ＬＤＸ−２６１５−６５０−ＴＯ３、波長６５０nm）を照射し、日本分光社製分光器（ＣＴ−２５ＴＰ）と浜松ホトニクス社製光電子増倍管（Ｒ９２８）を用いて、６９５nmの発光をモニターしながら、上記（２）で得られた過酸化水素のＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、D-PBS(-)）溶液０．０１５mlを加え、発光強度時間変化を測定した。このとき、光ファイバーがマイクロ攪拌子の乱反射を捉えないように角度や位置関係を調節した。
（５）対照として、過酸化水素のＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、D-PBS(-)）溶液に代えて、ビタミンＣのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、D-PBS(-)）溶液を用い、上記（４）の手順を繰り返した。
【００８６】
〔実験結果〕
本実験は、血清タンパク質であるアルブミン存在下におけるビタミンＣ副産物として知られる過酸化水素が、本発明の蛍光プローブに与える影響について調べるために行った。なお、本実験においてＲ２リポソームに添加した１０mM 過酸化水素溶液は、２mMのアスコルビン酸がＦＢＳ存在下で発生させる過酸化水素の６７倍量に相当する。得られた発光強度時間変化を図１１に示す。本実験により過酸化水素には本発明の蛍光プローブと反応性が無いことが示された。これによって、本発明の蛍光プローブとビタミンＣの反応は、その副産物（過酸化水素）によって影響を受けない、すなわち本発明の方法により、ビタミンＣのみをターゲットとした蛍光バイオイメージングが可能であることが示された。
【００８７】
実施例７：デヒドロアスコルビン酸の細胞内還元のリアルタイム観察実験
〔実験手順〕
（１）上記実施例４の手順（１）〜（５）で調製したＲ２リポソームをＤＭＦで１０倍希釈し、吸収スペクトルの吸光度から光増感剤（錯体Ｒ２）のリポソームへの取り込み量を算出し濃度計算を行い、濃度調整を行った。
（２）６cmシャーレに、５mlずつHeLa細胞（２×１０4cells/cm2、ヒューマンサイエンス研究資源バンクより購入）を播種し、インキュベーター内で２４時間培養した。２×１０-6Mになるように調整したＲ２リポソームのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、D-PBS(-)）溶液をシャーレに添加し、２０時間培養した。
（３）培地を除去し、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、D-PBS(-)）で２回洗浄してから培地（Eagle's minimal essential medium ５００mlに、MEM non essential Amino Acids solution ５ml、抗生物質５ml、HEPES １M １０ml、FBS（fetal bovine serum、ウシ胎児血清）５mlを加え、そこに濃度が１２．８mMになるように調整したデヒドロアスコルビン酸のＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、D-PBS(-)）溶液を０．５５ml加えた。
（４）Leica社製カットフィルタ：Y5を用い、定期的に蛍光顕微鏡で発光の様子を観察し（励起光：５９０−６５０nm、モニター波長：６６４−７３４nm）、画像を記録した。
【００８８】
〔実験結果〕
デヒドロアスコルビン酸はビタミンＣ（アスコルビン酸）の酸化体であり、細胞内に取り込まれると速やかに還元されてビタミンＣに変化することが知られている。本実験では、本発明の蛍光プローブによる蛍光バイオイメージング技術を応用してデヒドロアスコルビン酸の細胞内還元の様子をリアルタイムで観察できるかを調べるために行った。デヒドロアスコルビン酸添加後２分及び１８０分の細胞系の蛍光顕微鏡画像を、それぞれ図１２（ａ）及び図１２（ｂ）に示す。デヒドロアスコルビン酸添加後に細胞内蛍光プローブの発光が増大する様子が観測された（図１２（ａ）から図１２（ｂ）への変化）。これによって、デヒドロアスコルビン酸細胞内還元の様子をリアルタイム観察することに成功した。また、ビタミンＣと同様に画像解析によって発光強度時間変化を定量的に解析することで、デヒドロアスコルビン酸の細胞内取り込み速度や細胞内還元速度の決定が期待される。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
上記の結果より、（１）リポソーム水溶液中及びメタノール溶液中においてビタミンＣの添加後に蛍光強度が増大すること、（２）本発明の蛍光プローブ（錯体）の反応速度とビタミンＣ濃度に比例関係があること、（３）本発明の蛍光プローブ（錯体）の蛍光増大の速度がＥＳＲによるスピン消失速度と一致することを見出した。これによって、我々は、親水・疎水両溶媒中でビタミンＣの新たな定量法を開発することに成功した。
【００９０】
また本方法は既存法に対して、（１）励起光・蛍光ともに生体組織透過性が高い領域（＞６５０nm）に観測されること、（２）生体膜モデルであるリポソーム水溶液中で発光が増大したことから、生体内への応用が期待できること、（３）リポソーム水溶液中で、例えば錯体Ｒ２で、最大５００％増という蛍光顕微鏡などで追うのに十分な発光強度増大比を有すること、（４）メタノール中の錯体Ｒ１で約１５０％増、Ｒ２で約６３００％増と高い発光強度増大比を有すること、（５）さらに、Ｒ１のＴＥＭＰＯラジカルを、Ｒ０に対する蛍光量子収率比がさらに高いことが知られているＰＲＯＸＹＬラジカルに代えることによってさらに高い発光強度比を出すこと、あるいは軸配位子のヒドロキシ基をトリアルキルシロキシ基とすることで会合の影響を無くし、発光強度を増大させることなどの簡便な化学的修飾により発光強度の調節が容易に達成できること、（６）リポソームに取り込まれたフタロシアニナトケイ素錯体（すなわち、本発明のリポソーム製剤）が細胞内に到達し、かつ再現性のある逐次反応的な発光強度時間変化が確認されていること、（７）本発明のリポソーム製剤が細胞内における様々な還元物質の影響受けず、ビタミンＣを特異的に検出及び定量できること、（８）既存の蛍光プローブよりも反応速度が遅いので、がん治療に要求される薬理学的濃度（０．３−２０mM）の定量にも適する（０．４mM−６．４mMまで確認済み）などが優れており、これまで不可能だったビタミンＣの蛍光バイオイメージングの実現と、それによるビタミンＣの生体内機能解明などが期待される。
【００９１】
したがって、本発明の方法は、ビタミンＣの検出及び定量に有用である。特に本発明の方法は、これまで不可能だった生体内におけるビタミンＣの検出、すなわち研究目的の生体内（細胞中など）でのビタミンＣの蛍光バイオイメージングの実現が期待され、ビタミンＣの生体内機能解明を飛躍的に進めることが出来る。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンからなるレドックス応答性蛍光プローブ。
【請求項２】
ニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンが、下記式Ｉ：
【化１３】
〔式中、
Ｘは、Ｎ又はＣＲ′（ここで、Ｒ′は、水素原子、Ｃ1-18−アルキル基、アリール基又は含窒素ヘテロシクリル基である）であり；
Ｍは、Ｈ2であるか、あるいは周期表第２〜４族、又は第８〜１５族の元素から選択される原子であり；
Ｍが周期表第２〜４族、又は第８〜１５族の元素から選択される原子である場合、１又は２個の軸配位子Ｌが存在していてもよく、ここでＬは、独立して、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、トリ（Ｃ1-18−アルキル）シリルオキシ基又はニトロキシドラジカルであり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は、互いに独立して、水素原子、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、アリール基、含窒素ヘテロシクリル基、又はニトロキシドラジカルであるか、あるいは
Ｒ1及びＲ2は、それらが結合する炭素原子と一緒になって、芳香環若しくは含窒素ヘテロ環を形成し、該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環は、非置換であるか、又はハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基及び含窒素ヘテロシクリル基から選択される１つ以上の置換基により置換されているか、又は該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環の２個の隣接する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよく、
Ｒ3及びＲ4は、それらが結合する炭素原子と一緒になって、芳香環若しくは含窒素ヘテロ環を形成し、該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環は、非置換であるか、又はハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基及び含窒素ヘテロシクリル基から選択される１つ以上の置換基により置換されているか、又は該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環の２個の隣接する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよく、
Ｒ5及びＲ6は、それらが結合する炭素原子と一緒になって、芳香環若しくは含窒素ヘテロ環を形成し、該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環は、非置換であるか、又はハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基及び含窒素ヘテロシクリル基から選択される１つ以上の置換基により置換されているか、又は該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環の２個の隣接する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよく、又は
Ｒ7及びＲ8は、それらが結合する炭素原子と一緒になって、芳香環若しくは含窒素ヘテロ環を形成し、該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環は、非置換であるか、又はハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基及び含窒素ヘテロシクリル基から選択される１つ以上の置換基により置換されているか、又は該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環の２個の隣接する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよいが；
但し、化合物には少なくとも１個のニトロキシドラジカルが存在する〕
で表される化合物である、請求項１に記載の蛍光プローブ。
【請求項３】
ニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンが、下記式ＩＩ：
【化１４】
〔式中、
Ｘ、Ｎ又はＣＲ′（ここで、Ｒ′は、水素原子、Ｃ1-18−アルキル基、アリール基又は含窒素ヘテロシクリル基である）であり；
Ｍは、Ｈ2であるか、あるいは周期表第２〜４族、又は第８〜１５族の元素から選択される原子であり；
Ｍが周期表第２〜４族、又は第８〜１５族の元素から選択される原子である場合、１又は２個の軸配位子Ｌが存在していてもよく、ここでＬは、独立して、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、トリ（Ｃ1-18−アルキル）シリルオキシ基又はニトロキシドラジカルであり；
ｎは、互いに独立して、０、１、２、３又は４であり；
Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ及びＲｄは、互いに独立して、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基又は含窒素ヘテロシクリル基であるか、あるいはｎが２である場合、２個の隣接する各Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ及びＲｄは、それらが結合する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよいが；
但し、化合物には少なくとも１個のニトロキシドラジカルが存在する〕
で表される化合物である、請求項１又は２に記載の蛍光プローブ。
【請求項４】
Ｍが、周期表第２族、又は第１２〜１５族の元素から選択される原子であり、１又は２個の軸配位子Ｌが存在する、請求項２又は３に記載の蛍光プローブ。
【請求項５】
ニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンが、下記式ＩＩＩ：
【化１５】
〔式中、
Ｘは、Ｎ又はＣＲ′（ここで、Ｒ′は、水素原子、Ｃ1-18−アルキル基、アリール基又は含窒素ヘテロシクリル基である）であり；
Ｌ1及びＬ2の一方は、ニトロキシドラジカルであり、他方は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、トリ（Ｃ1-18−アルキル）シリルオキシ基又はニトロキシドラジカルであり；
Ｒａ′、Ｒｂ′、Ｒｃ′及びＲｄ′は、互いに独立して、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基又は含窒素ヘテロシクリル基であり；
ｎは、互いに独立して、０、１、２、３又は４である〕
で表される錯体である、請求項１〜４のいずれかに記載の蛍光プローブ。
【請求項６】
Ｘが、Ｎである、請求項２〜５のいずれかに記載の蛍光プローブ。
【請求項７】
Ｌ、Ｌ1又はＬ2、あるいはＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7又はＲ8におけるニトロキシドラジカルが、下記式ＩＶ：
【化１６】
〔式中、
Ｙは、Ｎと一緒になって、５〜６員の飽和若しくは部分不飽和の含窒素ヘテロ環（ここで、＞Ｎ−Ｏ・に隣接する２つの原子は、第三級炭素原子であり、そして含窒素ヘテロ環は、追加のＮ若しくはＯ原子を含んでいてもよい）を形成し、；
Ｚは、単結合、又はスペーサーである〕
である、請求項２〜６のいずれかに記載の蛍光プローブ。
【請求項８】
ニトロキシドラジカルが、２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）、２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ（ＰＲＯＸＹＬ）、４，４−ジメチル−３−オキサゾリジニルオキシ（ＤＯＸＹＬ）又はニトロニルニトロキシド（ＮＮ）から選択される５〜６員の飽和若しくは部分不飽和の含窒素ヘテロ環構造を含む基である、請求項１〜７のいずれかに記載の蛍光プローブ。
【請求項９】
環原子と一緒になって形成されるニトロキシドラジカルを含む環が、２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）又は２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ（ＰＲＯＸＹＬ）である、請求項２〜６のいずれかに記載の蛍光プローブ。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の蛍光プローブを含有するリポソーム製剤。
【請求項１１】
試料中のビタミンＣを検出する方法であって、
（１）励起光の照射下、請求項１〜９のいずれかに記載の蛍光プローブ又は請求項１０に記載のリポソーム製剤と、試料とを接触させる工程；及び
（２）発光をモニターする工程、を含む方法。
【請求項１２】
試料中のビタミンＣを定量する方法であって、
（１）励起光の照射下、請求項１〜９のいずれかに記載の蛍光プローブ又は請求項１０に記載のリポソーム製剤と、試料とを接触させる工程；
（２）発光をモニターし、発光強度の時間変化を測定する工程；及び
（３）試料中のビタミンＣの濃度を決定する工程、を含む方法。
【請求項１３】
生体内のビタミンＣを検出する方法であって、
（１）請求項１０に記載のリポソーム製剤を、被験動物（ヒトを除く）に投与する工程；及び
（２）波長６５０nm以上の励起光を被験動物に照射し、発光をモニターする工程、を含む方法。
【請求項１】
ニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンからなるレドックス応答性蛍光プローブ。
【請求項２】
ニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンが、下記式Ｉ：
【化１３】
〔式中、
Ｘは、Ｎ又はＣＲ′（ここで、Ｒ′は、水素原子、Ｃ1-18−アルキル基、アリール基又は含窒素ヘテロシクリル基である）であり；
Ｍは、Ｈ2であるか、あるいは周期表第２〜４族、又は第８〜１５族の元素から選択される原子であり；
Ｍが周期表第２〜４族、又は第８〜１５族の元素から選択される原子である場合、１又は２個の軸配位子Ｌが存在していてもよく、ここでＬは、独立して、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、トリ（Ｃ1-18−アルキル）シリルオキシ基又はニトロキシドラジカルであり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は、互いに独立して、水素原子、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、アリール基、含窒素ヘテロシクリル基、又はニトロキシドラジカルであるか、あるいは
Ｒ1及びＲ2は、それらが結合する炭素原子と一緒になって、芳香環若しくは含窒素ヘテロ環を形成し、該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環は、非置換であるか、又はハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基及び含窒素ヘテロシクリル基から選択される１つ以上の置換基により置換されているか、又は該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環の２個の隣接する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよく、
Ｒ3及びＲ4は、それらが結合する炭素原子と一緒になって、芳香環若しくは含窒素ヘテロ環を形成し、該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環は、非置換であるか、又はハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基及び含窒素ヘテロシクリル基から選択される１つ以上の置換基により置換されているか、又は該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環の２個の隣接する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよく、
Ｒ5及びＲ6は、それらが結合する炭素原子と一緒になって、芳香環若しくは含窒素ヘテロ環を形成し、該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環は、非置換であるか、又はハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基及び含窒素ヘテロシクリル基から選択される１つ以上の置換基により置換されているか、又は該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環の２個の隣接する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよく、又は
Ｒ7及びＲ8は、それらが結合する炭素原子と一緒になって、芳香環若しくは含窒素ヘテロ環を形成し、該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環は、非置換であるか、又はハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基及び含窒素ヘテロシクリル基から選択される１つ以上の置換基により置換されているか、又は該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環の２個の隣接する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよいが；
但し、化合物には少なくとも１個のニトロキシドラジカルが存在する〕
で表される化合物である、請求項１に記載の蛍光プローブ。
【請求項３】
ニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンが、下記式ＩＩ：
【化１４】
〔式中、
Ｘ、Ｎ又はＣＲ′（ここで、Ｒ′は、水素原子、Ｃ1-18−アルキル基、アリール基又は含窒素ヘテロシクリル基である）であり；
Ｍは、Ｈ2であるか、あるいは周期表第２〜４族、又は第８〜１５族の元素から選択される原子であり；
Ｍが周期表第２〜４族、又は第８〜１５族の元素から選択される原子である場合、１又は２個の軸配位子Ｌが存在していてもよく、ここでＬは、独立して、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、トリ（Ｃ1-18−アルキル）シリルオキシ基又はニトロキシドラジカルであり；
ｎは、互いに独立して、０、１、２、３又は４であり；
Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ及びＲｄは、互いに独立して、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基又は含窒素ヘテロシクリル基であるか、あるいはｎが２である場合、２個の隣接する各Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ及びＲｄは、それらが結合する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよいが；
但し、化合物には少なくとも１個のニトロキシドラジカルが存在する〕
で表される化合物である、請求項１又は２に記載の蛍光プローブ。
【請求項４】
Ｍが、周期表第２族、又は第１２〜１５族の元素から選択される原子であり、１又は２個の軸配位子Ｌが存在する、請求項２又は３に記載の蛍光プローブ。
【請求項５】
ニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンが、下記式ＩＩＩ：
【化１５】
〔式中、
Ｘは、Ｎ又はＣＲ′（ここで、Ｒ′は、水素原子、Ｃ1-18−アルキル基、アリール基又は含窒素ヘテロシクリル基である）であり；
Ｌ1及びＬ2の一方は、ニトロキシドラジカルであり、他方は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、トリ（Ｃ1-18−アルキル）シリルオキシ基又はニトロキシドラジカルであり；
Ｒａ′、Ｒｂ′、Ｒｃ′及びＲｄ′は、互いに独立して、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基又は含窒素ヘテロシクリル基であり；
ｎは、互いに独立して、０、１、２、３又は４である〕
で表される錯体である、請求項１〜４のいずれかに記載の蛍光プローブ。
【請求項６】
Ｘが、Ｎである、請求項２〜５のいずれかに記載の蛍光プローブ。
【請求項７】
Ｌ、Ｌ1又はＬ2、あるいはＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7又はＲ8におけるニトロキシドラジカルが、下記式ＩＶ：
【化１６】
〔式中、
Ｙは、Ｎと一緒になって、５〜６員の飽和若しくは部分不飽和の含窒素ヘテロ環（ここで、＞Ｎ−Ｏ・に隣接する２つの原子は、第三級炭素原子であり、そして含窒素ヘテロ環は、追加のＮ若しくはＯ原子を含んでいてもよい）を形成し、；
Ｚは、単結合、又はスペーサーである〕
である、請求項２〜６のいずれかに記載の蛍光プローブ。
【請求項８】
ニトロキシドラジカルが、２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）、２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ（ＰＲＯＸＹＬ）、４，４−ジメチル−３−オキサゾリジニルオキシ（ＤＯＸＹＬ）又はニトロニルニトロキシド（ＮＮ）から選択される５〜６員の飽和若しくは部分不飽和の含窒素ヘテロ環構造を含む基である、請求項１〜７のいずれかに記載の蛍光プローブ。
【請求項９】
環原子と一緒になって形成されるニトロキシドラジカルを含む環が、２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）又は２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ（ＰＲＯＸＹＬ）である、請求項２〜６のいずれかに記載の蛍光プローブ。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の蛍光プローブを含有するリポソーム製剤。
【請求項１１】
試料中のビタミンＣを検出する方法であって、
（１）励起光の照射下、請求項１〜９のいずれかに記載の蛍光プローブ又は請求項１０に記載のリポソーム製剤と、試料とを接触させる工程；及び
（２）発光をモニターする工程、を含む方法。
【請求項１２】
試料中のビタミンＣを定量する方法であって、
（１）励起光の照射下、請求項１〜９のいずれかに記載の蛍光プローブ又は請求項１０に記載のリポソーム製剤と、試料とを接触させる工程；
（２）発光をモニターし、発光強度の時間変化を測定する工程；及び
（３）試料中のビタミンＣの濃度を決定する工程、を含む方法。
【請求項１３】
生体内のビタミンＣを検出する方法であって、
（１）請求項１０に記載のリポソーム製剤を、被験動物（ヒトを除く）に投与する工程；及び
（２）波長６５０nm以上の励起光を被験動物に照射し、発光をモニターする工程、を含む方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２０１０−２４１７９４（Ｐ２０１０−２４１７９４Ａ）
【公開日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−３７５４４（Ｐ２０１０−３７５４４）
【出願日】平成２２年２月２３日（２０１０．２．２３）
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月２３日（２０１０．２．２３）
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]