硫酸化糖の脱硫酸化方法
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、硫酸化糖の硫酸基を部分的又は完全に脱硫酸化する方法に関し、更に詳しくは硫酸化糖の硫酸エステルのうち、第１級水酸基、第２級水酸基及びアミノ基の何れの基に結合している硫酸基も脱硫酸化できる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】生物活性を有する脱硫酸化糖を提供するために、様々な硫酸化糖の脱硫酸方法が研究されている。硫酸化糖の脱硫酸方法としては、塩化水素／メタノ−ル中で酸触媒により脱硫酸化する方法が知られている（Kantor T.G. and Schubert M.,J. Amer. Chem. Soc. 79, 152 (1957) ）。しかし、この方法ではグリコシド結合のメタノリシスによる糖鎖の切断が起こるため低分子化し、もとの鎖長を有する反応生成物の収量は低下する。
【０００３】収量よく脱硫酸を行う方法として、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド又はピリジン等の非プロトン性溶媒中〔Usov A. I., Adamyants K.S., Miroshnikova L. I., Shaposhnikova A.A. and Kochetkov N.K.,Carbohydr. Res. 18,336 (1971)〕又は少量の水又はメタノ−ルを含むジメチルスルホキシド中〔Nagasawa K., Inoue Y. and Kamata T., Carbohydr. Res., 58, 47 (1977) , Nagasawa K., Inoue Y. and Tokuyasu T , J. Biochem., 86, 1323 (1979)〕で行うソルボリシスがある。このソルボリシスの反応機構は、非プロトン性の溶媒中で三酸化硫黄とアミンの複合体を用いて行う硫酸化反応の逆反応であることが知られている。この反応は、反応条件をコントロ−ルすることによりＮ−硫酸基を選択的に脱硫酸化する方法として用いることができる。しかし、第１級又は第２級水酸基に結合しているＯ−硫酸基を脱離させることはできなかった。さらに、この方法をオリゴ糖に適用した場合、ＤＭＳＯ等の溶媒を反応後に除去する操作が煩雑であること、完全に脱硫酸化するには反応温度を上昇させる必要があり、このような反応条件ではグリコシド結合の切断が起こること、などの問題点がある。他方、糖類の第１級水酸基に結合した硫酸基を特異的に脱硫酸化する方法として、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（ＢＴＳＡ）を用いる方法があるが、この方法では第２級水酸基やアミノ基に結合した硫酸基を脱硫酸化することはできない（Matsuo, M., Takano, R., Kamei-Hayashi, K. and Hata, S.,Carbohydr. Res. 241,209-215,(1993) ）。また、ヘパリンをＢＴＳＡを用いて脱硫酸化した場合、脱硫酸化率が高くないという問題点があった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】硫酸化糖の脱硫酸化法の開発は、ヒトに対して好ましい生物活性を有する医薬品として有用な硫酸化糖を提供するために非常に重要である。例えば、硫酸化多糖であるデキストラン硫酸、キシラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン等は、脂質代謝改善剤、抗血栓剤として使用されているが、人工的に硫酸基を導入したものは、導入した硫酸基の位置が特定できず、多量に硫酸基を導入するに従い組織からの出血傾向が強まる副作用が生ずることも知られている。また、天然由来の硫酸化糖は、起源の違いにより硫酸基の位置、量がそれぞれ異なり、各硫酸化糖の生理活性も微妙に異なる。すなわち、硫酸化糖の硫酸基の位置及び硫酸化率を効率よくコントロールする技術が求められている。本発明者は、硫酸化糖の生物活性を改善することを目的として、脱硫酸化率が高く、グリコシド結合の切断等の副反応のない、硫酸化糖の脱硫酸化方法を開発すべく鋭意検討し、本発明に到達した。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明の方法は、硫酸化糖を、下式（Ｉ）
【０００６】
【化２】
〔式中、Ｒは同一又は異なるアルキル基又はアリール基を示す〕で表されるシリル化剤の存在下に脱硫酸化反応に付すことを特徴とする広範囲の特定位置が選択的に脱硫酸化された脱硫酸化糖の製造法である。
【０００７】すなわち、本発明の方法によれば、硫酸化糖の第１級水酸基、第２級水酸基及びアミノ基の何れの基に結合している硫酸基も効率よく脱硫酸化できる。また、反応条件を制御することによって部分的に脱硫酸化することもできる。
【０００８】本発明の方法が適用される硫酸化糖は、単糖、オリゴ糖、多糖、複合多糖等の糖類の官能基が硫酸化されたものである。このような硫酸化糖は天然物から抽出単離されたものであっても、合成されたものであってもよい。特に本発明は、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸等の硫酸基を有するグリコサミノグリカンに適用し、これら糖類の生理活性を改変もしくは改善するために、必要な位置に必要な個数（置換度）の硫酸基が結合した硫酸化糖を得るために有用である。
【０００９】本発明では通常脱硫酸化反応を有機溶媒中で行うので、硫酸化糖は有機溶媒に可溶性の塩として反応に供される。この様な有機溶媒可溶性塩としては、硫酸化糖の有機塩基塩が挙げられ、有機塩基としては、ピリジン、ジメチルアニリン、ジエチルアニリン等の芳香族アミン；トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、トリオクチルアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，８−ナフタレンジアミン等の３級アミン；Ｎ−メチルピリミジン、Ｎ−エチルピリミジン、Ｎ−メチルモルホリン、Ｎ−エチルモルホリン等のＮ−アルキル複素環アミン等が挙げられる。硫酸化糖の有機塩基塩は、遊離の硫酸化糖を有機塩基と反応させることによって容易に得ることができる。
【００１０】脱硫酸化反応は、通常無水の有機溶媒中、硫酸化糖に前記式（Ｉ）で示されるシリル化剤を作用させることによって達成される。反応に使用する有機溶媒は、硫酸化糖の塩の形成に使用した前記の有機塩基（ピリジン等）が好ましいが、有機塩基の代わりに、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、１，４−ジオキサン等の非プロトン性溶媒を使用してもよい。
【００１１】シリル化剤である式（Ｉ）で表される化合物において、Ｒは同一又は異なりアルキル基又はアリール基を示し、好ましくは炭素数１〜６の低級アルキル基、フェニル基である。すなわち、式（Ｉ）における（Ｒ)3ＳｉＯとしては、トリメチルシリルオキシ、トリエチルシリルオキシ、ジメチルイソプロピルシリルオキシ、イソプロピルジメチルシリルオキシ、メチルジ−ｔ−ブチルシリルオキシ、ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ、ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ、トリイソプロピルシリルオキシ等が例示される。式（Ｉ）で表されるシリル化剤として最も好ましいものは、２−トリメチルシロキシペント−２−エン−４−オンである。
【００１２】反応は、室温〜１００℃において数分〜数十時間で終了する。室温より低い温度では反応が十分に進行せず、１００℃以上の温度では硫酸化糖のグリコシド結合が開裂するおそれがある。反応条件、特に反応温度を変化させることによって脱硫酸化の程度を制御することができる。例えば、７０〜８０℃、３０分〜６時間程度では存在する硫酸基の部分的な脱硫酸化を行うことができ、８５〜１００℃、１０分〜数時間程度の反応では、より完全な脱硫酸化を行うことができる。
【００１３】シリル化剤の使用量は、硫酸化糖の全水酸基（非置換及び置換水酸基の全て）１モルに対して２〜１００倍モル程度である。シリル化剤の使用量を変化させることによっても脱硫酸化の程度を制御することができる。部分的に脱硫酸化を行う場合には２〜１６倍モル程度、より完全に脱硫酸化を行う場合にはそれ以上の量のシリル化剤を使用すればよい。
【００１４】脱硫酸化反応の終了後、未反応のシリル化剤を非反応性とすることにより反応を停止させる。例えば、反応液に水を加え、又は／及び反応液を水に対して透析することによって目的を達成することができる。
【００１５】かくして、硫酸化糖から部分的又は完全に硫酸基が除去された脱硫酸化糖を得ることができる。なお、脱硫酸化反応後、脱硫酸化糖の水酸基等の官能基はシリル化されているが、例えば反応液に水を加え又は／及び反応液を水に対して透析することによりシリル基除去される。さらに、必要に応じて常法に従ってシリル基の除去反応を行うこともできる。この反応は、例えば上記の処理を行った溶液を、アルカリ条件下又は加熱条件下に置くことによって行う。
【００１６】脱硫酸化糖にアニオン性の官能基が存在する場合、それに対する対イオンを溶液中に存在させて塩を形成させることができる。例えば、シリル基除去反応後の脱硫酸化糖の水溶液に水酸化アルカリ金属（水酸化ナトリウム等）を添加し、必要に応じて透析した後、凍結乾燥等の非加熱条件下における脱水工程に付すことによって、脱硫酸化糖のアルカリ金属塩を得ることができる。
【００１７】
【実施例】以下、実施例及び試験例により本発明を更に詳細に説明するが、これらは本発明の範囲をなんら制限するものではない。硫酸化糖の分析は以下の方法に基づいて行った。
【００１８】硫酸化糖の分析法１）硫酸基の定量硫酸化糖及び脱硫酸化糖の硫酸基の定量は、新生化学実験講座３，糖質II ｐ３７，ｐ８１（東京化学同人刊）に記載の方法に従い、酸加水分解により硫酸基を遊離硫酸イオンとし、次いで該イオンをイオン交換樹脂に吸着させた後、溶媒を用いて溶出し、その遊離硫酸イオンを電気電導度計を用いて検出、定量した。すなわち、３００μg の硫酸化糖に３N −塩酸１mlを加え、１００℃で１８時間加水分解した。その溶液を乾燥した後、１mlの水に溶解した。ミリポア限外ろ過膜（０．４５μm ）でろ過した後、硫酸イオン含量をＨＰＬＣ（Waters ILC-1）によるイオン交換クロマロトグラフィーで分析した。カラムに IC Pak Anion（Waters, ４．６mm×５cm）を用い、１．３mM四ホウ酸ナトリウム、１．５mMグルコン酸ナトリウム、６mMホウ酸、０．２５％グリセリン及び１２％アセトニトリルの組成の移動相を使用して、０．８ml／分の流速で展開した。硫酸イオンの検出には電気電導度計（Waters 430）を用いた。
【００１９】２）13Ｃ−ＮＭＲ硫酸化糖の水酸基の性質を判定する目的で、骨格炭素の核磁気共鳴スペクトルを測定した。１０％糖の重水溶液でのスペクトルは、８０℃、７５．４MHz(General Electoric Company, QE-300)で測定した。
【００２０】３）酵素消化による構造解析デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン等のグリコサミノグリカン（ムコ多糖）は構成二糖単位の種々の位置が硫酸化されており、本発明による脱硫酸化反応により、どの位置の硫酸が除去されるかを知ることは、これらのグリコサミノグリカンの生理活性を改変する際に重要である。
【００２１】このようなグリコサミノグリカンの硫酸基位置の分析は、次のようにして行うことができる。すなわち、脱硫酸化反応の処理前後のグリコサミノグリカンを酵素で消化し、生成した不飽和糖を含む二糖（不飽和二糖；図１参照）を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した〔新生化学実験講座３，糖質II ｐ４９〜６２に記載の「２・８グリコサミノグリカン分解酵素とＨＰＬＣを組合せた構造解析」参照〕。なお、コンドロイチン硫酸及びデルマタン硫酸に対してはコンドロイチナ−ゼＡＢＣを、ヘパリンに対してはヘパリン分解酵素を用いて酵素消化を行った。
【００２２】ａ）コンドロイチナ−ゼＡＢＣによる消化吉田らの方法〔生化学，57,1189 (1985)〕により、デルマタン硫酸及びコンドロイチン硫酸の水溶液（１０mg/ml)２０μl に、０．４M トリス−塩酸(pH ８．０) ２０μl 、０．４M 酢酸ナトリウム２０μl 、０．１％ウシ血清アルブミン２０μl 及び水１２０μl を加え、コンドロイチナ−ゼＡＢＣ（５U/mL）を２０μl 加えて、３７℃で２時間反応させた。
【００２３】ｂ）ヘパリン分解酵素による消化新実験生化学講座３，糖質II ｐ５４〜５９（東京化学同人刊）の方法により、ヘパリン０．１ mg を２mM酢酸カルシウムを含む２０mM酢酸ナトリウム (pH７．０) ２２０μl に溶解して、２０mUのヘパリナ−ゼ、２０mUのヘパリチナ−ゼＩ及びIIを加えて、３７℃で２時間反応させた。なお、脱硫酸化処理によってアミノ基に結合した硫酸基が脱離する。このような脱硫酸化ヘパリンにはヘパリン分解酵素が作用しなくなる。このため、酵素反応に先立ってアミノ基をアセチル化する必要がある。Ｎ−アセチル化は炭酸ナトリウムまたはダウエックス(Dowex) −１（ＨＣＯ3-型）イオン交換樹脂を含む水溶液中、無水酢酸によって定量的に進行する〔「糖鎖工学」、（株）産業調査会 バイオテクノロジー情報センター発行、３２４頁参照〕。
【００２４】ｃ）ＨＰＬＣによる分析コンドロイチナ−ゼＡＢＣ又はヘパリン分解酵素消化を行った後の溶液５０μl を、ＨＰＬＣ（医理化、モデル８５２型）を用いて分析した。イオン交換カラム（島津 ＰＮＨ2 カラム，４．０mm×２５０mm）を使用し、２３２nmでの吸光度を測定した。流速１ml／分で、１６mMリン酸水素ナトリウムを６０分間に０％から５０％まで上昇させて溶出した。溶出した種々の位置に硫酸基を有する不飽和二糖のピーク（図２中の各記号で各ピークに対応する不飽和二糖を表す）を同定した。
【００２５】４）ゲルろ過硫酸化糖の３％溶液１０μl をＨＰＬＣによるゲルろ過で分析した。カラムはＴＳＫgel-G4000PWX1 （東ソ−、７．８mm×３０cm）を用い、溶離液に０．２M硫酸カリウムを使用して、１．０ml／分の流速で展開した。硫酸化糖の検出には示差屈折計（島津，ＡＩＤ−２Ａ）を用いた。
【００２６】 実施例１メチル α−ガラクトピラノシド−６硫酸ピリジニウム塩（Ｇａｌ−６Ｓ；１．１４２mg／ml）及びメチル α−ガラクトピラノシド−３硫酸ピリジニウム塩（Ｇａｌ−３Ｓ；０．８４９mg／ml）のそれぞれを含む水溶液、各１００μl にガスクロマトグラフィー分析の内部標準として、メチル α−グルコピラノシド（Ｍｅ−Ｇｌｃ）の水溶液（１．０００mg／ml）１００μl を加えて凍結乾燥し、脱硫酸化反応の試料とした。凍結乾燥した試料に乾燥ピリジン１００μl と２−トリメチルシロキシペント−２−エン−４−オン（以下ＴＰＥＮＯＮという）各１００μl を加え、封管後４０℃で５時間加熱して脱硫酸化反応を行った。完全にＯ−トリメチルシリル化してガスクロマトグラフィー分析を行うために、トリメチルシリルイミダゾールを反応液に加えて、８０℃で２０分間加熱した。この溶液各１μl をガスクロマトグラフィーで分析し、遊離したメチル α−ガラクトピラノシド量を定量したところ、Ｇａｌ−６Ｓの５２．２４％、Ｇａｌ−３Ｓの１０．９１％が脱硫酸化されていた。また、ＴＰＥＮＯＮ処理前後に各硫酸化糖の硫酸基を定量したところ、処理前のＧａｌ−６Ｓ及びＧａｌ−３Ｓの硫酸基含量は何れも３５．１％であったが、ＴＰＥＮＯＮ処理後には、それぞれ１６．５％及び３０．８％であった。この結果から明らかなように、ＴＰＥＮＯＮを用いると第１級水酸基及び第２級水酸基に結合した硫酸基のいずれも脱硫酸化することができる。一方、脱硫酸化剤として公知のＢＴＳＡを用いて同様に反応を行ったところ、Ｇａｌ−６Ｓはほぼ完全に脱硫酸化されたが、Ｇａｌ−３Ｓは２．１２％しか脱硫酸化されなかった。すなわち、ＢＴＳＡを用いても第２級水酸基に結合した硫酸基は、ほとんど脱硫酸化されない。
【００２７】実施例２及び比較例１ヘパリン−ピリジニウム塩（硫酸基の位置及び量比は後述の表２参照）２００mgを乾燥ピリジン２０mlに溶かし、これにＴＰＥＮＯＮ４mlを添加して封管した。７０℃で２時間加熱した後、反応液を大過剰の水に対して１夜透析した。透析内液に１N 水酸化ナトリウム溶液を加えてpH９に調整し、再び大過剰の水に対して３日間透析した。この間、透析外液の水を１日に２回交換した。透析後、非透析画分を凍結乾燥して部分脱硫酸ヘパリン−ナトリウム塩を得た（収量１３８mg）。一方、比較例として、ヘパリン−トリブチルアンモニウム塩１８６mgを乾燥ピリジン２０mlに溶かし、これにＢＴＳＡ４mlを添加し、２０℃で３０分間放置した。反応液を大過剰の水に対して１夜透析した。透析内液に１N 水酸化ナトリウム溶液を加えてpH９〜１０に調整し、再び大過剰の水に対して３日間透析した。この間、透析外液の水を１日に２回交換した。透析後、非透析画分を凍結乾燥して部分脱硫酸ヘパリン−ナトリウム塩を得た（収量１４０mg）。上記それぞれの方法で得られた脱硫酸ヘパリン−ナトリウム塩の各種分析結果を表１に示す。
【００２８】
【表１】
【００２９】表中、ウロン酸含量は、グルクロノラクトンを標準物質とし、カルバゾール−硫酸法（T.Bitter, H.N.Muirの改良法による）によって測定し、ウロン酸を−Ｃ6 Ｈ7 Ｏ6 Ｎａ−（Ｍｗ＝１９８) として計算した。硫酸基含量は、ロジゾン酸法によって測定し、硫酸基を−ＳＯ3 Ｎａとして計算した。モル比は、カルバゾール・硫酸法におけるヘパリン中のウロン酸の発色率が通常の５０％増とされているため、これを補正して算出した。ＴＰＥＮＯＮによって脱硫酸化したヘパリンについて13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを測定した。なお、比較のために未処理のヘパリン、ソルボリシスによってＮ−脱硫酸化したヘパリン〔Y.Inoue et al, Carbohydr. Res.,46, 87-95(1976)の方法による〕及び完全脱硫酸化ヘパリン〔A.Ogamo et al, Carbohydr. Res.,193,165-172(1989) の方法による〕についても13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを測定した。その結果、イズロン酸２−硫酸（ＩｄｏＡ−２Ｓ）の硫酸基の一部が脱離したこと（ＩｄｏＡ−２ＳのＣ−１のピークの他にイズロン酸（ＩｄｏＡ）のＣ−１のピークが出現した）、グルコサミン部分の６−硫酸が脱離したこと（グルコサミンのＣ−６のピークが出現した）、グルコサミン部分の６−硫酸の一部が脱離したこと（Ｎ−脱硫酸化ヘパリンのグルコサミン６−硫酸のＣ−１のピークと同位置のピークの左側に完全脱硫酸化ヘパリンのグルコサミンのＣ−１と同位置のピークが出現した）などが判明した。
【００３０】実施例３及び比較例２コンドロイチン硫酸−ピリジニウム塩（鮫由来；６−硫酸：４−硫酸：４，６−ジ硫酸の量比は後述の表３参照）２００mgを乾燥ピリジン２０mlに溶かし、これにＴＰＥＮＯＮ４mlを添加して封管した。７０℃で２時間加熱した後、実施例２と同じ操作で部分脱硫酸コンドロイチン硫酸−ナトリウム塩を得た（収量１５６mg）。ＴＰＥＮＯＮ処理前後に硫酸基を定量したところ、処理前の硫酸基含量は１９．８％であったが、ＴＰＥＮＯＮ処理後には３．６％となっていた。一方、比較例２として、コンドロイチン硫酸−ピリジニウム塩２００mgを、ＢＴＳＡ４mlを使用した他は上記と同じ操作で反応及び精製を行い、部分脱硫酸コンドロイチン硫酸−ナトリウム塩を得た。上記各反応生成物及び未処理のコンドロイチン硫酸について、13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを測定した。その結果、ＴＰＥＮＯＮ処理コンドロイチン硫酸では、コンドロイチン４−硫酸に由来するピークが消滅し、全て脱硫酸化されてコンドロイチンが生じるためにピークが単純化されたが、ＢＴＳＡ処理コンドロイチン硫酸では、６−硫酸が脱硫酸化されて生成したコンドロイチン及びコンドロイチン４−硫酸の両方のピークが認められた。
【００３１】実施例４デルマタン硫酸−ピリジニウム塩（６−硫酸：４−硫酸：４，６−ジ硫酸の量比は後述の表４参照）２００mgを乾燥ピリジン２０mlに溶かし、これにＴＰＥＮＯＮ４mlを添加して封管した。７０℃で２時間加熱した後、実施例２と同じ操作で部分脱硫酸デルマタン硫酸−ナトリウム塩を得た（収量１４８mg）。ＴＰＥＮＯＮ処理前後に硫酸基を定量したところ、処理前の硫酸基含量は１５．３％であったが、ＴＰＥＮＯＮ処理後には４．４％となっていた。上記反応生成物及び未処理のデルマタン硫酸について、13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを測定した。その結果、脱硫酸化されて生じたＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンのＣ−４に由来するピークが出現し、イズロン酸のＣ−１のピークのパターンが変化していた。
【００３２】試験例（１）酵素消化による構造解析実施例２〜４で得られた、部分脱硫酸化されたヘパリン、コンドロイチン硫酸及びデルマタン硫酸のそれぞれについて、更に詳しい構造変化を調べるために、２糖単位に酵素消化してＨＰＬＣにより分析した。また、比較のために脱硫酸化を行っていない各硫酸化糖も同様に分析した。酵素消化によって生成した不飽和二糖の各種異性体（図１）のＨＰＬＣ分画クロマトグラムを図２に示す。また、各種異性体のＨＰＬＣ画分の量比（％）を、表２にヘパリン、表３にコンドロイチン硫酸、表４にデルマタン硫酸について示す。
【００３３】
【表２】
【００３４】
【表３】
【００３５】
【表４】
【００３６】図２及び表２〜４より以下のことが明かとなった。すなわち、ヘパリンでは、ＴＰＥＮＯＮ処理によってウロン酸の２位水酸基、グルコサミンの２位アミノ基及び６位水酸基の全てが硫酸化されたΔＤｉＨＳ−ｔｒｉ（Ｕ，６，Ｎ）Ｓが殆ど無くなり、殆どもしくは全く存在しなかったΔＤｉＨｓ−ＯＳ（全てが脱硫酸化されたもの）及びΔＤｉＨＳ−ｄｉ（Ｕ，６）Ｓ（ウロン酸の２位及びグルコサミンの６位が硫酸化されたもの）が著しく増加していた。すなわち、２位アミノ基に結合した硫酸基は著しく減少し、その他の硫酸基も相当量減少していた。コンドイチン硫酸では、６−硫酸、４−硫酸、４，６−ジ硫酸等の混合物を用いたが、ＴＰＥＮＯＮ処理によってガラクトサミンの６位水酸基が硫酸化されたΔＤｉ−６Ｓ及び４位水酸基が硫酸化されたΔＤｉ−４Ｓが相当量減少し、ΔＤｉ−０Ｓ（全てが脱硫酸化されたもの）が著しく増加していた。デルマタン硫酸では、殆んどが４−硫酸であり、６−硫酸が少量混ざっているものを用いたが、ＴＰＥＮＯＮ処理によってガラクトサミンの４位水酸基が硫酸化されたΔＤｉ−４Ｓが相当量減少し、ΔＤｉ０Ｓ（全てが脱硫酸化されたもの）が著しく増加していた。
【００３７】（２）ゲルろ過ＴＰＥＮＯＮ処理前後のヘパリン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸について、ゲルろ過によって分子量変化を調べ、結果を表５に示した。
【００３８】
【表５】
【００３９】 表５に示したように分子量分布の変化は殆んど認められず、ＴＰＥＮＯＮ処理による硫酸化糖のグリコシド結合の切断（低分子化）は起こらなかった。
【００４０】
【発明の効果】本発明による脱硫酸化反応は、ＢＴＳＡを用いる場合とは異なり、アミノ基に結合している硫酸基を優先的に脱硫酸化するが、第１級水酸基及び第２級水酸基の何れの基に結合している硫酸基も効率よく脱硫酸化し、グリコシド結合には影響を与えない方法である。すなわち、第１級水酸基に結合している硫酸基（例えば、ヘパリン、コンドロイチン６−硫酸の６−Ｏ−硫酸基）に特異的なＢＴＳＡによる脱硫酸化とは異なった機構によって脱硫酸化が進むものと考えられる。また、ＢＴＳＡによる脱硫酸化と比較して、より完全な脱硫酸化を行うことが可能で、反応条件を制御すれば部分的な脱硫酸化も可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】グリコサミノグリカンを酵素消化することによって生成する各種不飽和二糖の各種異性体の構造と略称の関係を示すものである。
【図２】酵素消化によって生成した不飽和二糖の各種異性体のＨＰＬＣ分画クロマトグラムを示すグラフである。
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、硫酸化糖の硫酸基を部分的又は完全に脱硫酸化する方法に関し、更に詳しくは硫酸化糖の硫酸エステルのうち、第１級水酸基、第２級水酸基及びアミノ基の何れの基に結合している硫酸基も脱硫酸化できる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】生物活性を有する脱硫酸化糖を提供するために、様々な硫酸化糖の脱硫酸方法が研究されている。硫酸化糖の脱硫酸方法としては、塩化水素／メタノ−ル中で酸触媒により脱硫酸化する方法が知られている（Kantor T.G. and Schubert M.,J. Amer. Chem. Soc. 79, 152 (1957) ）。しかし、この方法ではグリコシド結合のメタノリシスによる糖鎖の切断が起こるため低分子化し、もとの鎖長を有する反応生成物の収量は低下する。
【０００３】収量よく脱硫酸を行う方法として、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド又はピリジン等の非プロトン性溶媒中〔Usov A. I., Adamyants K.S., Miroshnikova L. I., Shaposhnikova A.A. and Kochetkov N.K.,Carbohydr. Res. 18,336 (1971)〕又は少量の水又はメタノ−ルを含むジメチルスルホキシド中〔Nagasawa K., Inoue Y. and Kamata T., Carbohydr. Res., 58, 47 (1977) , Nagasawa K., Inoue Y. and Tokuyasu T , J. Biochem., 86, 1323 (1979)〕で行うソルボリシスがある。このソルボリシスの反応機構は、非プロトン性の溶媒中で三酸化硫黄とアミンの複合体を用いて行う硫酸化反応の逆反応であることが知られている。この反応は、反応条件をコントロ−ルすることによりＮ−硫酸基を選択的に脱硫酸化する方法として用いることができる。しかし、第１級又は第２級水酸基に結合しているＯ−硫酸基を脱離させることはできなかった。さらに、この方法をオリゴ糖に適用した場合、ＤＭＳＯ等の溶媒を反応後に除去する操作が煩雑であること、完全に脱硫酸化するには反応温度を上昇させる必要があり、このような反応条件ではグリコシド結合の切断が起こること、などの問題点がある。他方、糖類の第１級水酸基に結合した硫酸基を特異的に脱硫酸化する方法として、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（ＢＴＳＡ）を用いる方法があるが、この方法では第２級水酸基やアミノ基に結合した硫酸基を脱硫酸化することはできない（Matsuo, M., Takano, R., Kamei-Hayashi, K. and Hata, S.,Carbohydr. Res. 241,209-215,(1993) ）。また、ヘパリンをＢＴＳＡを用いて脱硫酸化した場合、脱硫酸化率が高くないという問題点があった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】硫酸化糖の脱硫酸化法の開発は、ヒトに対して好ましい生物活性を有する医薬品として有用な硫酸化糖を提供するために非常に重要である。例えば、硫酸化多糖であるデキストラン硫酸、キシラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン等は、脂質代謝改善剤、抗血栓剤として使用されているが、人工的に硫酸基を導入したものは、導入した硫酸基の位置が特定できず、多量に硫酸基を導入するに従い組織からの出血傾向が強まる副作用が生ずることも知られている。また、天然由来の硫酸化糖は、起源の違いにより硫酸基の位置、量がそれぞれ異なり、各硫酸化糖の生理活性も微妙に異なる。すなわち、硫酸化糖の硫酸基の位置及び硫酸化率を効率よくコントロールする技術が求められている。本発明者は、硫酸化糖の生物活性を改善することを目的として、脱硫酸化率が高く、グリコシド結合の切断等の副反応のない、硫酸化糖の脱硫酸化方法を開発すべく鋭意検討し、本発明に到達した。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明の方法は、硫酸化糖を、下式（Ｉ）
【０００６】
【化２】
〔式中、Ｒは同一又は異なるアルキル基又はアリール基を示す〕で表されるシリル化剤の存在下に脱硫酸化反応に付すことを特徴とする広範囲の特定位置が選択的に脱硫酸化された脱硫酸化糖の製造法である。
【０００７】すなわち、本発明の方法によれば、硫酸化糖の第１級水酸基、第２級水酸基及びアミノ基の何れの基に結合している硫酸基も効率よく脱硫酸化できる。また、反応条件を制御することによって部分的に脱硫酸化することもできる。
【０００８】本発明の方法が適用される硫酸化糖は、単糖、オリゴ糖、多糖、複合多糖等の糖類の官能基が硫酸化されたものである。このような硫酸化糖は天然物から抽出単離されたものであっても、合成されたものであってもよい。特に本発明は、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸等の硫酸基を有するグリコサミノグリカンに適用し、これら糖類の生理活性を改変もしくは改善するために、必要な位置に必要な個数（置換度）の硫酸基が結合した硫酸化糖を得るために有用である。
【０００９】本発明では通常脱硫酸化反応を有機溶媒中で行うので、硫酸化糖は有機溶媒に可溶性の塩として反応に供される。この様な有機溶媒可溶性塩としては、硫酸化糖の有機塩基塩が挙げられ、有機塩基としては、ピリジン、ジメチルアニリン、ジエチルアニリン等の芳香族アミン；トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、トリオクチルアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，８−ナフタレンジアミン等の３級アミン；Ｎ−メチルピリミジン、Ｎ−エチルピリミジン、Ｎ−メチルモルホリン、Ｎ−エチルモルホリン等のＮ−アルキル複素環アミン等が挙げられる。硫酸化糖の有機塩基塩は、遊離の硫酸化糖を有機塩基と反応させることによって容易に得ることができる。
【００１０】脱硫酸化反応は、通常無水の有機溶媒中、硫酸化糖に前記式（Ｉ）で示されるシリル化剤を作用させることによって達成される。反応に使用する有機溶媒は、硫酸化糖の塩の形成に使用した前記の有機塩基（ピリジン等）が好ましいが、有機塩基の代わりに、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、１，４−ジオキサン等の非プロトン性溶媒を使用してもよい。
【００１１】シリル化剤である式（Ｉ）で表される化合物において、Ｒは同一又は異なりアルキル基又はアリール基を示し、好ましくは炭素数１〜６の低級アルキル基、フェニル基である。すなわち、式（Ｉ）における（Ｒ)3ＳｉＯとしては、トリメチルシリルオキシ、トリエチルシリルオキシ、ジメチルイソプロピルシリルオキシ、イソプロピルジメチルシリルオキシ、メチルジ−ｔ−ブチルシリルオキシ、ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ、ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ、トリイソプロピルシリルオキシ等が例示される。式（Ｉ）で表されるシリル化剤として最も好ましいものは、２−トリメチルシロキシペント−２−エン−４−オンである。
【００１２】反応は、室温〜１００℃において数分〜数十時間で終了する。室温より低い温度では反応が十分に進行せず、１００℃以上の温度では硫酸化糖のグリコシド結合が開裂するおそれがある。反応条件、特に反応温度を変化させることによって脱硫酸化の程度を制御することができる。例えば、７０〜８０℃、３０分〜６時間程度では存在する硫酸基の部分的な脱硫酸化を行うことができ、８５〜１００℃、１０分〜数時間程度の反応では、より完全な脱硫酸化を行うことができる。
【００１３】シリル化剤の使用量は、硫酸化糖の全水酸基（非置換及び置換水酸基の全て）１モルに対して２〜１００倍モル程度である。シリル化剤の使用量を変化させることによっても脱硫酸化の程度を制御することができる。部分的に脱硫酸化を行う場合には２〜１６倍モル程度、より完全に脱硫酸化を行う場合にはそれ以上の量のシリル化剤を使用すればよい。
【００１４】脱硫酸化反応の終了後、未反応のシリル化剤を非反応性とすることにより反応を停止させる。例えば、反応液に水を加え、又は／及び反応液を水に対して透析することによって目的を達成することができる。
【００１５】かくして、硫酸化糖から部分的又は完全に硫酸基が除去された脱硫酸化糖を得ることができる。なお、脱硫酸化反応後、脱硫酸化糖の水酸基等の官能基はシリル化されているが、例えば反応液に水を加え又は／及び反応液を水に対して透析することによりシリル基除去される。さらに、必要に応じて常法に従ってシリル基の除去反応を行うこともできる。この反応は、例えば上記の処理を行った溶液を、アルカリ条件下又は加熱条件下に置くことによって行う。
【００１６】脱硫酸化糖にアニオン性の官能基が存在する場合、それに対する対イオンを溶液中に存在させて塩を形成させることができる。例えば、シリル基除去反応後の脱硫酸化糖の水溶液に水酸化アルカリ金属（水酸化ナトリウム等）を添加し、必要に応じて透析した後、凍結乾燥等の非加熱条件下における脱水工程に付すことによって、脱硫酸化糖のアルカリ金属塩を得ることができる。
【００１７】
【実施例】以下、実施例及び試験例により本発明を更に詳細に説明するが、これらは本発明の範囲をなんら制限するものではない。硫酸化糖の分析は以下の方法に基づいて行った。
【００１８】硫酸化糖の分析法１）硫酸基の定量硫酸化糖及び脱硫酸化糖の硫酸基の定量は、新生化学実験講座３，糖質II ｐ３７，ｐ８１（東京化学同人刊）に記載の方法に従い、酸加水分解により硫酸基を遊離硫酸イオンとし、次いで該イオンをイオン交換樹脂に吸着させた後、溶媒を用いて溶出し、その遊離硫酸イオンを電気電導度計を用いて検出、定量した。すなわち、３００μg の硫酸化糖に３N −塩酸１mlを加え、１００℃で１８時間加水分解した。その溶液を乾燥した後、１mlの水に溶解した。ミリポア限外ろ過膜（０．４５μm ）でろ過した後、硫酸イオン含量をＨＰＬＣ（Waters ILC-1）によるイオン交換クロマロトグラフィーで分析した。カラムに IC Pak Anion（Waters, ４．６mm×５cm）を用い、１．３mM四ホウ酸ナトリウム、１．５mMグルコン酸ナトリウム、６mMホウ酸、０．２５％グリセリン及び１２％アセトニトリルの組成の移動相を使用して、０．８ml／分の流速で展開した。硫酸イオンの検出には電気電導度計（Waters 430）を用いた。
【００１９】２）13Ｃ−ＮＭＲ硫酸化糖の水酸基の性質を判定する目的で、骨格炭素の核磁気共鳴スペクトルを測定した。１０％糖の重水溶液でのスペクトルは、８０℃、７５．４MHz(General Electoric Company, QE-300)で測定した。
【００２０】３）酵素消化による構造解析デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン等のグリコサミノグリカン（ムコ多糖）は構成二糖単位の種々の位置が硫酸化されており、本発明による脱硫酸化反応により、どの位置の硫酸が除去されるかを知ることは、これらのグリコサミノグリカンの生理活性を改変する際に重要である。
【００２１】このようなグリコサミノグリカンの硫酸基位置の分析は、次のようにして行うことができる。すなわち、脱硫酸化反応の処理前後のグリコサミノグリカンを酵素で消化し、生成した不飽和糖を含む二糖（不飽和二糖；図１参照）を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した〔新生化学実験講座３，糖質II ｐ４９〜６２に記載の「２・８グリコサミノグリカン分解酵素とＨＰＬＣを組合せた構造解析」参照〕。なお、コンドロイチン硫酸及びデルマタン硫酸に対してはコンドロイチナ−ゼＡＢＣを、ヘパリンに対してはヘパリン分解酵素を用いて酵素消化を行った。
【００２２】ａ）コンドロイチナ−ゼＡＢＣによる消化吉田らの方法〔生化学，57,1189 (1985)〕により、デルマタン硫酸及びコンドロイチン硫酸の水溶液（１０mg/ml)２０μl に、０．４M トリス−塩酸(pH ８．０) ２０μl 、０．４M 酢酸ナトリウム２０μl 、０．１％ウシ血清アルブミン２０μl 及び水１２０μl を加え、コンドロイチナ−ゼＡＢＣ（５U/mL）を２０μl 加えて、３７℃で２時間反応させた。
【００２３】ｂ）ヘパリン分解酵素による消化新実験生化学講座３，糖質II ｐ５４〜５９（東京化学同人刊）の方法により、ヘパリン０．１ mg を２mM酢酸カルシウムを含む２０mM酢酸ナトリウム (pH７．０) ２２０μl に溶解して、２０mUのヘパリナ−ゼ、２０mUのヘパリチナ−ゼＩ及びIIを加えて、３７℃で２時間反応させた。なお、脱硫酸化処理によってアミノ基に結合した硫酸基が脱離する。このような脱硫酸化ヘパリンにはヘパリン分解酵素が作用しなくなる。このため、酵素反応に先立ってアミノ基をアセチル化する必要がある。Ｎ−アセチル化は炭酸ナトリウムまたはダウエックス(Dowex) −１（ＨＣＯ3-型）イオン交換樹脂を含む水溶液中、無水酢酸によって定量的に進行する〔「糖鎖工学」、（株）産業調査会 バイオテクノロジー情報センター発行、３２４頁参照〕。
【００２４】ｃ）ＨＰＬＣによる分析コンドロイチナ−ゼＡＢＣ又はヘパリン分解酵素消化を行った後の溶液５０μl を、ＨＰＬＣ（医理化、モデル８５２型）を用いて分析した。イオン交換カラム（島津 ＰＮＨ2 カラム，４．０mm×２５０mm）を使用し、２３２nmでの吸光度を測定した。流速１ml／分で、１６mMリン酸水素ナトリウムを６０分間に０％から５０％まで上昇させて溶出した。溶出した種々の位置に硫酸基を有する不飽和二糖のピーク（図２中の各記号で各ピークに対応する不飽和二糖を表す）を同定した。
【００２５】４）ゲルろ過硫酸化糖の３％溶液１０μl をＨＰＬＣによるゲルろ過で分析した。カラムはＴＳＫgel-G4000PWX1 （東ソ−、７．８mm×３０cm）を用い、溶離液に０．２M硫酸カリウムを使用して、１．０ml／分の流速で展開した。硫酸化糖の検出には示差屈折計（島津，ＡＩＤ−２Ａ）を用いた。
【００２６】 実施例１メチル α−ガラクトピラノシド−６硫酸ピリジニウム塩（Ｇａｌ−６Ｓ；１．１４２mg／ml）及びメチル α−ガラクトピラノシド−３硫酸ピリジニウム塩（Ｇａｌ−３Ｓ；０．８４９mg／ml）のそれぞれを含む水溶液、各１００μl にガスクロマトグラフィー分析の内部標準として、メチル α−グルコピラノシド（Ｍｅ−Ｇｌｃ）の水溶液（１．０００mg／ml）１００μl を加えて凍結乾燥し、脱硫酸化反応の試料とした。凍結乾燥した試料に乾燥ピリジン１００μl と２−トリメチルシロキシペント−２−エン−４−オン（以下ＴＰＥＮＯＮという）各１００μl を加え、封管後４０℃で５時間加熱して脱硫酸化反応を行った。完全にＯ−トリメチルシリル化してガスクロマトグラフィー分析を行うために、トリメチルシリルイミダゾールを反応液に加えて、８０℃で２０分間加熱した。この溶液各１μl をガスクロマトグラフィーで分析し、遊離したメチル α−ガラクトピラノシド量を定量したところ、Ｇａｌ−６Ｓの５２．２４％、Ｇａｌ−３Ｓの１０．９１％が脱硫酸化されていた。また、ＴＰＥＮＯＮ処理前後に各硫酸化糖の硫酸基を定量したところ、処理前のＧａｌ−６Ｓ及びＧａｌ−３Ｓの硫酸基含量は何れも３５．１％であったが、ＴＰＥＮＯＮ処理後には、それぞれ１６．５％及び３０．８％であった。この結果から明らかなように、ＴＰＥＮＯＮを用いると第１級水酸基及び第２級水酸基に結合した硫酸基のいずれも脱硫酸化することができる。一方、脱硫酸化剤として公知のＢＴＳＡを用いて同様に反応を行ったところ、Ｇａｌ−６Ｓはほぼ完全に脱硫酸化されたが、Ｇａｌ−３Ｓは２．１２％しか脱硫酸化されなかった。すなわち、ＢＴＳＡを用いても第２級水酸基に結合した硫酸基は、ほとんど脱硫酸化されない。
【００２７】実施例２及び比較例１ヘパリン−ピリジニウム塩（硫酸基の位置及び量比は後述の表２参照）２００mgを乾燥ピリジン２０mlに溶かし、これにＴＰＥＮＯＮ４mlを添加して封管した。７０℃で２時間加熱した後、反応液を大過剰の水に対して１夜透析した。透析内液に１N 水酸化ナトリウム溶液を加えてpH９に調整し、再び大過剰の水に対して３日間透析した。この間、透析外液の水を１日に２回交換した。透析後、非透析画分を凍結乾燥して部分脱硫酸ヘパリン−ナトリウム塩を得た（収量１３８mg）。一方、比較例として、ヘパリン−トリブチルアンモニウム塩１８６mgを乾燥ピリジン２０mlに溶かし、これにＢＴＳＡ４mlを添加し、２０℃で３０分間放置した。反応液を大過剰の水に対して１夜透析した。透析内液に１N 水酸化ナトリウム溶液を加えてpH９〜１０に調整し、再び大過剰の水に対して３日間透析した。この間、透析外液の水を１日に２回交換した。透析後、非透析画分を凍結乾燥して部分脱硫酸ヘパリン−ナトリウム塩を得た（収量１４０mg）。上記それぞれの方法で得られた脱硫酸ヘパリン−ナトリウム塩の各種分析結果を表１に示す。
【００２８】
【表１】
【００２９】表中、ウロン酸含量は、グルクロノラクトンを標準物質とし、カルバゾール−硫酸法（T.Bitter, H.N.Muirの改良法による）によって測定し、ウロン酸を−Ｃ6 Ｈ7 Ｏ6 Ｎａ−（Ｍｗ＝１９８) として計算した。硫酸基含量は、ロジゾン酸法によって測定し、硫酸基を−ＳＯ3 Ｎａとして計算した。モル比は、カルバゾール・硫酸法におけるヘパリン中のウロン酸の発色率が通常の５０％増とされているため、これを補正して算出した。ＴＰＥＮＯＮによって脱硫酸化したヘパリンについて13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを測定した。なお、比較のために未処理のヘパリン、ソルボリシスによってＮ−脱硫酸化したヘパリン〔Y.Inoue et al, Carbohydr. Res.,46, 87-95(1976)の方法による〕及び完全脱硫酸化ヘパリン〔A.Ogamo et al, Carbohydr. Res.,193,165-172(1989) の方法による〕についても13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを測定した。その結果、イズロン酸２−硫酸（ＩｄｏＡ−２Ｓ）の硫酸基の一部が脱離したこと（ＩｄｏＡ−２ＳのＣ−１のピークの他にイズロン酸（ＩｄｏＡ）のＣ−１のピークが出現した）、グルコサミン部分の６−硫酸が脱離したこと（グルコサミンのＣ−６のピークが出現した）、グルコサミン部分の６−硫酸の一部が脱離したこと（Ｎ−脱硫酸化ヘパリンのグルコサミン６−硫酸のＣ−１のピークと同位置のピークの左側に完全脱硫酸化ヘパリンのグルコサミンのＣ−１と同位置のピークが出現した）などが判明した。
【００３０】実施例３及び比較例２コンドロイチン硫酸−ピリジニウム塩（鮫由来；６−硫酸：４−硫酸：４，６−ジ硫酸の量比は後述の表３参照）２００mgを乾燥ピリジン２０mlに溶かし、これにＴＰＥＮＯＮ４mlを添加して封管した。７０℃で２時間加熱した後、実施例２と同じ操作で部分脱硫酸コンドロイチン硫酸−ナトリウム塩を得た（収量１５６mg）。ＴＰＥＮＯＮ処理前後に硫酸基を定量したところ、処理前の硫酸基含量は１９．８％であったが、ＴＰＥＮＯＮ処理後には３．６％となっていた。一方、比較例２として、コンドロイチン硫酸−ピリジニウム塩２００mgを、ＢＴＳＡ４mlを使用した他は上記と同じ操作で反応及び精製を行い、部分脱硫酸コンドロイチン硫酸−ナトリウム塩を得た。上記各反応生成物及び未処理のコンドロイチン硫酸について、13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを測定した。その結果、ＴＰＥＮＯＮ処理コンドロイチン硫酸では、コンドロイチン４−硫酸に由来するピークが消滅し、全て脱硫酸化されてコンドロイチンが生じるためにピークが単純化されたが、ＢＴＳＡ処理コンドロイチン硫酸では、６−硫酸が脱硫酸化されて生成したコンドロイチン及びコンドロイチン４−硫酸の両方のピークが認められた。
【００３１】実施例４デルマタン硫酸−ピリジニウム塩（６−硫酸：４−硫酸：４，６−ジ硫酸の量比は後述の表４参照）２００mgを乾燥ピリジン２０mlに溶かし、これにＴＰＥＮＯＮ４mlを添加して封管した。７０℃で２時間加熱した後、実施例２と同じ操作で部分脱硫酸デルマタン硫酸−ナトリウム塩を得た（収量１４８mg）。ＴＰＥＮＯＮ処理前後に硫酸基を定量したところ、処理前の硫酸基含量は１５．３％であったが、ＴＰＥＮＯＮ処理後には４．４％となっていた。上記反応生成物及び未処理のデルマタン硫酸について、13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを測定した。その結果、脱硫酸化されて生じたＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンのＣ−４に由来するピークが出現し、イズロン酸のＣ−１のピークのパターンが変化していた。
【００３２】試験例（１）酵素消化による構造解析実施例２〜４で得られた、部分脱硫酸化されたヘパリン、コンドロイチン硫酸及びデルマタン硫酸のそれぞれについて、更に詳しい構造変化を調べるために、２糖単位に酵素消化してＨＰＬＣにより分析した。また、比較のために脱硫酸化を行っていない各硫酸化糖も同様に分析した。酵素消化によって生成した不飽和二糖の各種異性体（図１）のＨＰＬＣ分画クロマトグラムを図２に示す。また、各種異性体のＨＰＬＣ画分の量比（％）を、表２にヘパリン、表３にコンドロイチン硫酸、表４にデルマタン硫酸について示す。
【００３３】
【表２】
【００３４】
【表３】
【００３５】
【表４】
【００３６】図２及び表２〜４より以下のことが明かとなった。すなわち、ヘパリンでは、ＴＰＥＮＯＮ処理によってウロン酸の２位水酸基、グルコサミンの２位アミノ基及び６位水酸基の全てが硫酸化されたΔＤｉＨＳ−ｔｒｉ（Ｕ，６，Ｎ）Ｓが殆ど無くなり、殆どもしくは全く存在しなかったΔＤｉＨｓ−ＯＳ（全てが脱硫酸化されたもの）及びΔＤｉＨＳ−ｄｉ（Ｕ，６）Ｓ（ウロン酸の２位及びグルコサミンの６位が硫酸化されたもの）が著しく増加していた。すなわち、２位アミノ基に結合した硫酸基は著しく減少し、その他の硫酸基も相当量減少していた。コンドイチン硫酸では、６−硫酸、４−硫酸、４，６−ジ硫酸等の混合物を用いたが、ＴＰＥＮＯＮ処理によってガラクトサミンの６位水酸基が硫酸化されたΔＤｉ−６Ｓ及び４位水酸基が硫酸化されたΔＤｉ−４Ｓが相当量減少し、ΔＤｉ−０Ｓ（全てが脱硫酸化されたもの）が著しく増加していた。デルマタン硫酸では、殆んどが４−硫酸であり、６−硫酸が少量混ざっているものを用いたが、ＴＰＥＮＯＮ処理によってガラクトサミンの４位水酸基が硫酸化されたΔＤｉ−４Ｓが相当量減少し、ΔＤｉ０Ｓ（全てが脱硫酸化されたもの）が著しく増加していた。
【００３７】（２）ゲルろ過ＴＰＥＮＯＮ処理前後のヘパリン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸について、ゲルろ過によって分子量変化を調べ、結果を表５に示した。
【００３８】
【表５】
【００３９】 表５に示したように分子量分布の変化は殆んど認められず、ＴＰＥＮＯＮ処理による硫酸化糖のグリコシド結合の切断（低分子化）は起こらなかった。
【００４０】
【発明の効果】本発明による脱硫酸化反応は、ＢＴＳＡを用いる場合とは異なり、アミノ基に結合している硫酸基を優先的に脱硫酸化するが、第１級水酸基及び第２級水酸基の何れの基に結合している硫酸基も効率よく脱硫酸化し、グリコシド結合には影響を与えない方法である。すなわち、第１級水酸基に結合している硫酸基（例えば、ヘパリン、コンドロイチン６−硫酸の６−Ｏ−硫酸基）に特異的なＢＴＳＡによる脱硫酸化とは異なった機構によって脱硫酸化が進むものと考えられる。また、ＢＴＳＡによる脱硫酸化と比較して、より完全な脱硫酸化を行うことが可能で、反応条件を制御すれば部分的な脱硫酸化も可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】グリコサミノグリカンを酵素消化することによって生成する各種不飽和二糖の各種異性体の構造と略称の関係を示すものである。
【図２】酵素消化によって生成した不飽和二糖の各種異性体のＨＰＬＣ分画クロマトグラムを示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 硫酸化糖を下式（I）
【化１】
〔式中、Ｒは同一又は異なるアルキル基又はアリール基を示す〕で表されるシリル化剤の存在下に脱硫酸化反応に付することを特徴とする脱硫酸化糖の製造法。
【請求項２】 硫酸化糖を有機溶媒可溶性塩とし、反応を有機溶媒中で行う請求項１記載の脱硫酸化糖の製造法。
【請求項３】 有機溶媒可溶性塩がピリジニウム塩であり、有機溶媒がピリジンを含む有機溶媒である請求項２記載の脱硫酸化糖の製造法。
【請求項４】 脱硫酸化反応後、更にシリル化された水酸基のシリル基を除去する請求項１記載の脱硫酸化糖の製造法。
【請求項５】 硫酸化糖の有機溶媒可溶性塩に、有機溶媒中で下式（Ｉ）記載のシリル化剤を作用させることにより得られうる脱硫酸化された硫酸化糖であって、前記硫酸化糖がコンドロイチン硫酸又はデルマタン硫酸であり、脱硫酸化された硫酸化糖が脱硫酸化されたコンドロイチン硫酸の場合、△Ｄｉ−４Ｓが５．６％又は△Ｄｉ−０Ｓが８１．２％であり、脱硫酸化されたデルマタン硫酸の場合、△Ｄｉ−４Ｓが２１．１％又ば△Ｄｉ−０Ｓが７１．３％である脱硫酸化糖。
【化３】
〔式中、Ｒは同一又は異なるアルキル基又はアリール基を示す〕
【請求項６】 ヘパリンの有機溶媒可溶性塩に、有機溶媒中で下式（Ｉ）記載のシリル化剤を作用させることにより得られうる脱硫酸化ヘパリンであって、ヘパリン分解酵素による消化産物をＨＰＬＣにより解析した際に、△ＤｉＨＳ−ｄｉ（６，Ｎ）Ｓ又は△ＤｉＨＳ−ｄｉ（Ｕ，Ｎ）Ｓが実質的に検出されないことを特徴とする脱硫酸化ヘパリン。
【化４】
〔式中、Ｒは同一又は異なるアルキル基又はアリール基を示す〕
【請求項１】 硫酸化糖を下式（I）
【化１】
〔式中、Ｒは同一又は異なるアルキル基又はアリール基を示す〕で表されるシリル化剤の存在下に脱硫酸化反応に付することを特徴とする脱硫酸化糖の製造法。
【請求項２】 硫酸化糖を有機溶媒可溶性塩とし、反応を有機溶媒中で行う請求項１記載の脱硫酸化糖の製造法。
【請求項３】 有機溶媒可溶性塩がピリジニウム塩であり、有機溶媒がピリジンを含む有機溶媒である請求項２記載の脱硫酸化糖の製造法。
【請求項４】 脱硫酸化反応後、更にシリル化された水酸基のシリル基を除去する請求項１記載の脱硫酸化糖の製造法。
【請求項５】 硫酸化糖の有機溶媒可溶性塩に、有機溶媒中で下式（Ｉ）記載のシリル化剤を作用させることにより得られうる脱硫酸化された硫酸化糖であって、前記硫酸化糖がコンドロイチン硫酸又はデルマタン硫酸であり、脱硫酸化された硫酸化糖が脱硫酸化されたコンドロイチン硫酸の場合、△Ｄｉ−４Ｓが５．６％又は△Ｄｉ−０Ｓが８１．２％であり、脱硫酸化されたデルマタン硫酸の場合、△Ｄｉ−４Ｓが２１．１％又ば△Ｄｉ−０Ｓが７１．３％である脱硫酸化糖。
【化３】
〔式中、Ｒは同一又は異なるアルキル基又はアリール基を示す〕
【請求項６】 ヘパリンの有機溶媒可溶性塩に、有機溶媒中で下式（Ｉ）記載のシリル化剤を作用させることにより得られうる脱硫酸化ヘパリンであって、ヘパリン分解酵素による消化産物をＨＰＬＣにより解析した際に、△ＤｉＨＳ−ｄｉ（６，Ｎ）Ｓ又は△ＤｉＨＳ−ｄｉ（Ｕ，Ｎ）Ｓが実質的に検出されないことを特徴とする脱硫酸化ヘパリン。
【化４】
〔式中、Ｒは同一又は異なるアルキル基又はアリール基を示す〕
【図１】
【図２】
【図２】
【特許番号】特許第３４９７２０９号（Ｐ３４９７２０９）
【登録日】平成１５年１１月２８日（２００３．１１．２８）
【発行日】平成１６年２月１６日（２００４．２．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願平５−２０９１４８
【出願日】平成５年８月２４日（１９９３．８．２４）
【公開番号】特開平７−６２００１
【公開日】平成７年３月７日（１９９５．３．７）
【審査請求日】平成１２年８月１５日（２０００．８．１５）
【出願人】（０００１９５５２４）生化学工業株式会社 (143)
【参考文献】
【文献】特開 昭５２−１５５６９０（ＪＰ，Ａ）
【文献】Ｒｙｏ Ｔａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９２年，５６（１０），１５７７−１５８０
【登録日】平成１５年１１月２８日（２００３．１１．２８）
【発行日】平成１６年２月１６日（２００４．２．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成５年８月２４日（１９９３．８．２４）
【公開番号】特開平７−６２００１
【公開日】平成７年３月７日（１９９５．３．７）
【審査請求日】平成１２年８月１５日（２０００．８．１５）
【出願人】（０００１９５５２４）生化学工業株式会社 (143)
【参考文献】
【文献】特開 昭５２−１５５６９０（ＪＰ，Ａ）
【文献】Ｒｙｏ Ｔａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９２年，５６（１０），１５７７−１５８０
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