神経変性性障害のトランスジェニック動物モデル
【課題】ヒトＡＤ表現型の重要な側面を迅速に示すＡＤのトランスジェニック動物モデルを提供すること。
【解決手段】本発明は、ＴｇＣＲＮＤ８と名付けられたアルツハイマー病のトランスジェニック動物モデルを提供する。そして本発明はまた、このようなモデルを作製するための方法を提供する。このような本発明のＴｇＣＲＮＤ８と名付けられたアルツハイマー病のトランスジェニック動物モデルによって、アルツハイマー病という疾患の病因論の特徴づけが可能になる。そしてまたアルツハイマー病のための可能性のある処置の開発、および試験のためのシステムを提供することが可能になる。
【解決手段】本発明は、ＴｇＣＲＮＤ８と名付けられたアルツハイマー病のトランスジェニック動物モデルを提供する。そして本発明はまた、このようなモデルを作製するための方法を提供する。このような本発明のＴｇＣＲＮＤ８と名付けられたアルツハイマー病のトランスジェニック動物モデルによって、アルツハイマー病という疾患の病因論の特徴づけが可能になる。そしてまたアルツハイマー病のための可能性のある処置の開発、および試験のためのシステムを提供することが可能になる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、アルツハイマー病を含む、神経変性性障害のトランスジェニック非ヒト動物モデルに関する。より詳細には、本発明は、アルツハイマー病の病理モ機構の特徴づけ、ならびに診断、治療および治療用化合物の開発を容易にするマウスモデルに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
以下の説明において、参考は、本明細書の巻末に列挙する特定の文献引用に対してなされており、その全てが本明細書において参考として援用されている。
【０００３】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、痴呆の最も一般的な原因であり、おそらく遺伝的および環境的決定要因を含む、複雑な病因を有する。アルツハイマー病は、アミロイドβペプチド（Ａβ）から形成された脳のアミロイド沈着、神経欠損、および神経原線維変化（ＮＦＴ）として公知の細胞内沈着（微小管結合蛋白質タウ（τ）の高リン酸化形態から構成される）によって特徴付けられる。
【０００４】
多様な家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）家系の遺伝子解析によって、アミロイドβ−ペプチド（Ａβ）の生合成が、この疾患の病因において共通する特徴であることが示されている。第２１染色体に関連した家系の場合、変異はエンドプロテアーゼ部分に隣接し、この変異ではＡβが、アルツハイマーアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）から切り取られるが、プレセニリン１および２における変異は、ＡβのＣ末端境界（いわゆるγセクレターゼ部位）でＡＰＰの切断を強化すると考えられる。第１７染色体上のタウ遺伝子は、ＡＤでは変異していないが、ミスセンス置換およびスプライス部位変異が、ＡＤに対するいくつかの病理的に類似性の条件（例えば、前頭側頭痴呆）で存在する。
【０００５】
この遺伝子データによって、Ａβ生合成が、ＮＦＴの生成において最高に達する病理的経路の上流に存在することが示される。初期の議論は、ＡβアミロイドまたはＮＦＴのいずれが神経の欠損および機能不全を生じるかということに集中していたが、現在では、両方のタイプのタンパク質凝集とも毒性であってＡＤの臨床的表現型に寄与しているようにみえる。
【０００６】
天然に存在する動物のＡＤ形態は存在しないが、この疾患のトランスジェニック動物モデルは、ヒト疾患における重要な病理的事象を明確にし、そして順序付ける能力を有する。しかし、労力の大きさにもかかわらず、満足なモデルはほとんど存在しない。
【０００７】
特許文献１は、ヒトまたはマウスのＡＰＰ６９５（野生型か、または「スウェーデン型」変異を有するかのいずれか）を発現し、そして一般に出生から１年以内に進行性の神経学的障害を発症するトランスジェニックマウスに関する。特許文献２は、ヒトＡＰＰのカルボキシ末端部分の９９〜１０３アミノ酸をコードする導入遺伝子を有するアルツハイマー病の動物モデルに関する。特許文献３は、トランスジェニックマウスであって、そのゲノムが神経フィラメント遺伝子のエキソンＩに挿入されたヒトβＡＰＰのカルボキシ末端の１００アミノ酸をコードするＤＮＡ配列を含むトランスジェニックマウスに関する。特許文献４は、スウェーデン型変異を有するヒトＡＰＰ７５１をコードする導入遺伝子を保有するトランスジェニックマウスに関する。
【０００８】
特許文献５は、ＡＤのトランスジェニック動物モデルに関する。ここでは、この動物は、変異プレセニリン１導入遺伝子、およびＡＰＰ６９５導入遺伝子（スウェーデン型変異を保有する）の両方を保有し、かつ発現する。
【０００９】
これらのモデルのいくつかは、生理学的に適切な経路によって、ＡＰＰおよび／またはその代謝体を生成することができず、そしてその警告を適用しない場合、このトランスジェニック動物は、ＡＤ表現型の特定の側面しか示し得ない。神経病理学に関して、ＡＤにおいてみられるアミロイド沈着に非常に密接に類似しているアミロイド沈着、選択的神経欠損（ある場合には）、およびタウの高リン酸化が存在し得るが、ＮＦＴの沈着は存在しない。さらに、これらの神経病理学的異常は、８〜９ヶ月齢まで、または６ヶ月齢まで（二遺伝子（ｂｉｇｅｎｉｃ）またはホモ接合性の動物の場合）出現し得ない。これらのモデルの作成において遭遇する他の問題としては、ＡＰＰの過剰発現に起因する新生児死亡率、複雑な遺伝子背景の使用、および一般には明確な証拠のない進行性の認知機能不全が挙げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第５，８７７，３９９号明細書
【特許文献２】米国特許第６，０３７，５２１号明細書
【特許文献３】米国特許第５，８９４，０７８号明細書
【特許文献４】米国特許第５，８５０，００３号明細書
【特許文献５】米国特許第５，８９８，０９４号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、ヒトＡＤ表現型の重要な側面を迅速に示すＡＤのトランスジェニック動物モデルの必要性が存在する。これによって動物は長期間維持される必要がなくなり、そして診断および治療の化合物が開発され、そしてさらにかなり迅速にそしてコストがかからずにスクリーニングできる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
本発明は、トランスジェニック哺乳動物を含むＡＤの新しい動物モデルに関する。この動物モデルは、好ましい実施形態において、ＴｇＣＲＮＤ８と名付けられたトランスジェニックマウスを含むが、このトランスジェニックマウスは、３ヶ月齢までにＣＮＳにおいて、高レベルのＡβ合成およびアミロイド沈着を示す。さらに、ＴｇＣＲＮＤ８マウスは、アミロイド沈着が開始する時点までに認知の変化を示す。本発明はまた、アルツハイマー病のＴｇＣＲＮＤ８トランスジェニック動物モデルの生成のための方法を提供する。
アルツハイマー病のＴｇＣＲＮＤ８トランスジェニックマウスモデルの開発によって、この疾患の病因は、さらに良好に理解され得、そして有効な薬物治療を含む、可能性のある処置が開発され、そして試験され得る。
【００１３】
トランスジェニックＴｇＣＲＮＤ８マウスモデルを、ＣＮＳにおけるＡβアミロイドタンパク質の発現、ならびに組織学的分析、神経学、および行動不全に基づく、天然に存在するアルツハイマー病表現型に対する類似の大きさによって、特徴付ける。
【００１４】
ＡＰＰ遺伝子は、選択的スプライシングを受けて、３つの共通のアイソフォームを生成する。７７０アミノ酸を含む最長のアイソフォーム（ＡＰＰ７７０）、および７５１アミノ酸を含む２番目の長さのアイソフォーム（ＡＰＰ７５１）は、ほとんどの組織で発現される。６９５アミノ酸を含む３番目の転写物（ＡＰＰ６９５）は、脳において主に発現される。慣例により、より短いアイソフォームのコドン位置をいう場合でも、最長のアイソフォーム（ＡＰＰ７７０）のコドン番号付けを用いる。
【００１５】
ＴｇＣＲＮＤ８トランスジェニックマウスは、脳特異的ＡＰＰ６９５アイソフォームの変異形態を発現する導入遺伝子を含む；この導入遺伝子は、「スウェーデン型（Ｓｗｅｄｉｓｈ）」ＡＰＰ変異および「インディアナ型（Ｉｎｄｉａｎａ）」ＡＰＰ変異の両方を保有する。
【００１６】
変異体Ｋ５９５Ｎ／Ｍ５９６Ｌ（スウェーデン型変異）およびＶ６４２Ｆ（インディアナ型変異）を含む（ＡＰＰ６９５のコドン番号付けを用いる）ＡＰＰ６９５のｃＤＮＡを生成した。これらおよび他のＡＰＰ変異は、さらに一般的なＡＰＰ７７０コドン番号付けシステムを用いて（すなわち、これらの２つの変異である、Ｋ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ（スウェーデン型変異）およびＶ７１７Ｆ（インディアナ変異）について）、一般に本明細書（特許請求の範囲を含む）において言及されている。
【００１７】
二重変異体ＡＰＰ６９５ｃＤＮＡカセットをコスミド発現ベクターであるｃｏｓＴｅｔに挿入した。このベクターは、Ｓｉｒｉａｎ（シリア）ハムスタープリオンタンパク質遺伝子プロモーターを含む。次いで、このベクターをマウスの卵母細胞にマイクロインジェクションして、ＴｇＣＲＮＤ８と名付けられたトランスジェニック系統を作製した。これらのマウスは、３ヶ月齢までに複数の散在性のアミロイド沈着を示し、この時点で空間学習における欠損が明らかになる。
【００１８】
本発明のさらなる局面に従って、ＴｇＣＲＮＤ８マウスを、ＡＤ関連変異を保有する種々の他のトランスジェニックマウスと交配して、さらに増強されたＡＤ関連神経病理を示す、二重トランスジェニック（ｂｉ−ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ））マウスを産生する。
【００１９】
１つの実施形態に従って、本発明は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、そのゲノムは、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種アミロイド前駆体タンパク質６９５（ＡＰＰ６９５）ポリペプチドをコードしており、ここで、このポリペプチドの６７０位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、６７１位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして７１７位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そしてこの導入遺伝子が発現される、トランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。
【００２０】
好ましい実施形態に従って、上記の哺乳動物はマウスであり、そして上記異種ＡＰＰ６９５はヒトＡＰＰ６９５である。
【００２１】
さらなる実施形態に従って、トランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、以下：
（ａ）ゲノムが導入遺伝子を含む第一のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を、第二の遺伝子を含むゲノムを有する第二の非ヒト哺乳動物と交配して第一世代の子孫を産生する工程であって、この導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種アミロイド前駆体タンパク質６９５（ＡＰＰ６９５）ポリペプチドをコードしており、ここで、このポリペプチドの６７０位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、６７１位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして７１７位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そしてこの導入遺伝子が発現され、そしてこの第二の遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ少なくとも１つの選択された変異を有する選択されたタンパク質をコードする、工程；ならびに
（ｂ）この第一世代の子孫から、少なくとも１つの第一導入遺伝子および少なくとも１つの第二遺伝子を含むゲノムを有し、そしてこの少なくとも１つの第一導入遺伝子およびこの少なくとも１つの第二遺伝子の両方を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を選択する工程であって、この第一導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種ＡＰＰ６９５ポリペプチドをコードし、ここでこのポリペプチドの６７０位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、６７１位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして７１７位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そしてこの第二遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ少なくとも１つの選択された変異体を有する上記選択されたタンパク質をコードする、工程、
によって産生される、トランスジェニック非ヒト哺乳動物が提供される。
【００２２】
さらなる実施形態に従って、本発明は、以下：
（ａ）そのゲノムが導入遺伝子を含む第一のトランスジェニックマウスを、第二の遺伝子を含むゲノムを有する第二のマウスと交配して第一世代の子孫を産生する工程であって、この導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつヒトＡＰＰ６９５ポリペプチドをコードしており、ここで、このポリペプチドの６７０位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、６７１位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして７１７位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そしてこの導入遺伝子が発現され、そしてこの第二の遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ少なくとも１つの選択された変異を有する選択されたタンパク質をコードする、工程；ならびに
（ｂ）この第一世代の子孫から、少なくとも１つの第一導入遺伝子および少なくとも１つの第二遺伝子を含むゲノムを有し、そしてこの少なくとも１つの第一導入遺伝子およびこの少なくとも１つの第二遺伝子の両方を発現するトランスジェニックマウスを選択する工程であって、この第一導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種ＡＰＰ６９５ポリペプチドをコードし、ここでこのポリペプチドの６７０位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、６７１位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして７１７位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そしてこの第二遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ少なくとも１つの選択された変異を有するこの選択されたタンパク質をコードする、工程、
によって産生される、トランスジェニックマウスを提供する。
【００２３】
さらなる実施形態に従って、ＡＤの発生を防止または遅延する有効性について候補化合物をスクリーニングするための方法であって、以下の工程：
（ａ）本明細書に記載されたような第一のトランスジェニックマウスにおける、選択されたＡＤ関連表現型特徴の出現の前に、このマウスに対してこの候補化合物を投与する工程；および
（ｂ）このマウスにおいてこの選択されたＡＤ関連表現型特徴が出現する年齢を、この化合物を投与しなかった、同じタイプの第二のトランスジェニックマウスにおいてこの特徴が出現する年齢と比較する工程；
を包含し、
ここでこの第二のマウスにおいてこの特徴が出現した年齢と比べた、この第一のマウスにおいてこの特徴が出現した年齢の上昇は、この化合物の有効性を示す、方法が提供される。
【００２４】
さらなる実施形態に従って、アルツハイマー病の症状を寛解するのにおける有効性について候補化合物をスクリーニングするための方法であって、以下の工程：
（ａ）本明細書に記載のような第一のトランスジェニックマウスに対してこの候補化合物を投与する工程；
（ｂ）記憶試験または学習試験においてこのマウスの能力を決定する工程；および
（ｃ）このマウスのこの能力を、この化合物を投与しなかった、同じタイプの第二のトランスジェニックマウスの能力と比較する工程；
を包含し、
ここでこの第二のマウスの能力と比べた、この第一のマウスの改善された能力は、この化合物の有効性を示す、方法が提供される。
【００２５】
さらなる実施形態に従って、中枢神経系において異常なＡβ沈着を示すトランスジェニック非ヒト哺乳動物を産生する方法であって、以下：
（ａ）導入遺伝子をこの哺乳動物の受精した卵母細胞に導入する工程であって、この導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種アミロイド前駆体タンパク質６９５（ＡＰＰ６９５）ポリペプチドをコードしており、ここで、このポリペプチドの６７０位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、６７１位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして７１７位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されている、工程；
（ｂ）偽妊娠哺乳動物中にこの受精卵母細胞を移植する工程；
（ｃ）この受精卵母細胞を生きて誕生した子孫中で発育させる工程；および
（ｄ）ゲノムが導入遺伝子を含む子孫を選択する工程であって、この導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種アミロイド前駆体タンパク質６９５（ＡＰＰ６９５）ポリペプチドをコードしており、ここで、このポリペプチドの６７０位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、６７１位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして７１７位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そしてこの導入遺伝子が発現される、工程；
を包含する、方法が提供される。
【００２６】
さらなる実施形態に従って、異種アミロイド前駆体タンパク質６９５（ＡＰＰ６９５）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここでこのポリペプチドの６７０位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、６７１位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして７１７位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されている、ヌクレオチド配列が提供される。また、プロモーターに作動可能に連結されたこのようなヌクレオチド配列を含む、ベクターも提供される。
本発明はさらに、以下の項目を提供する。
（項目１）ゲノムが導入遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、該導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種アミロイド前駆体タンパク質６９５（ＡＰＰ６９５）ポリペプチドをコードしており、ここで、該ポリペプチドの６７０位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、６７１位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして７１７位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そして該導入遺伝子が発現される、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（項目２）前記哺乳動物がマウスである、項目１に記載のトランスジェニック哺乳動物。
（項目３）前記マウスが、（Ｃ３Ｈ×Ｃ５７ＢＬ６）×Ｃ５７マウスである、項目２に記載のトランスジェニックマウス。
（項目４）前記異種ＡＰＰ６９５がヒトＡＰＰ６９５である、項目３に記載のトランスジェニックマウス。
（項目５）前記マウスがその中枢神経系において異常なＡβ沈着を示す、項目４に記載のトランスジェニックマウス。
（項目６）前記動物が、アルツハイマー病関連の病状の加速された出現を示す、項目４に記載のトランスジェニックマウス。
（項目７）祖先として項目４に記載のトランスジェニックマウスを有する、トランスジェニックマウス。
（項目８）トランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、以下：
（ａ）項目１に記載の第一のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を、第二の遺伝子を含むゲノムを有する第二の非ヒト哺乳動物と交配して第一世代の子孫を産生する工程であって、該第二の遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ少なくとも１つの選択された変異を有する選択されたタンパク質をコードする、工程；ならびに
（ｂ）該第一世代の子孫から、少なくとも１つの第一導入遺伝子および少なくとも１つの第二遺伝子を含むゲノムを有し、そして該少なくとも１つの第一導入遺伝子および該少なくとも１つの第二遺伝子の両方を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を選択する工程であって、該第一導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種ＡＰＰ６９５ポリペプチドをコードし、ここで該ポリペプチドの６７０位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、６７１位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして７１７位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そして該第二遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ少なくとも１つの選択された変異を有する前記選択されたタンパク質をコードする、工程、
によって産生される、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（項目９）前記選択されたタンパク質が、プレセニリンであり、そして前記選択された変異がＡＤ関連変異である、項目８に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（項目１０）前記選択されたタンパク質が、低密度リポタンパク質レセプター関連遺伝子、α２−マクログロブリン遺伝子およびβ−セクレターゼ遺伝子からなる群より選択され、そして前記選択された変異がＡβプロセシング関連変異である、項目８に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（項目１１）前記動物がマウスである、項目１０に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物
（項目１２）トランスジェニックマウスであって、以下：
（ａ）項目４に記載の第一のトランスジェニックマウスを、第二の遺伝子を含むゲノムを有する第二のマウスと交配して第一世代の子孫を産生する工程であって、該第二の遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ少なくとも１つの選択された変異を有する選択されたタンパク質をコードする、工程；ならびに
（ｂ）該第一世代の子孫から、少なくとも１つの第一導入遺伝子および少なくとも１つの第二遺伝子を含むゲノムを有し、そして該少なくとも１つの第一導入遺伝子および該少なくとも１つの第二遺伝子の両方を発現するトランスジェニックマウスを選択する工程であって、該第一導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種ＡＰＰ６９５ポリペプチドをコードし、ここで該ポリペプチドの６７０位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、６７１位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして７１７位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そして該第二遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ少なくとも１つの選択された変異を有する該選択されたタンパク質をコードする、工程、
によって産生される、トランスジェニックマウス。
（項目１３）前記第二の遺伝子が、内因性変異遺伝子である、項目１２に記載のトランスジェニックマウス。
（項目１４）前記第二の遺伝子が、導入遺伝子である、項目１２に記載のトランスジェニックマウス。
（項目１５）前記第二の遺伝子が、ＡＤ関連アミノ酸置換を有する選択されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、項目１２に記載のトランスジェニックマウス。
（項目１６）前記選択されたタンパク質が、プレセニリンである、項目１５に記載のトランスジェニックマウス。
（項目１７）項目１２に記載のトランスジェニックマウスであって、以下：
（ａ）項目４に記載の第一のトランスジェニックマウスを、導入遺伝子を含むゲノムを有する第二のトランスジェニックマウスと交配して第一世代の子孫を産生する工程であって、該導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種プレセニリン２ポリペプチドをコードしており、ここで該ポリペプチドの２３９位のメチオニン残基がバリンで置換されている、工程；ならびに
（ｂ）該第一世代の子孫から、少なくとも１つの第一導入遺伝子および少なくとも１つの第二導入遺伝子を含むゲノムを有し、そして該第一導入遺伝子および該第二遺伝子の両方を発現するトランスジェニックマウスを選択する工程であって、該第一導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）ポリペプチドをコードし、ここで該ポリペプチドの６７０位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、６７１位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして７１７位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そして該第二導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種プレセニリン２ポリペプチドをコードし、ここで該ポリペプチドの２３９位のメチオニン残基はバリンで置換されている、工程、
によって産生される、トランスジェニックマウス。
（項目１８）項目１２に記載のトランスジェニックマウスであって、以下：
（ａ）項目４に記載の第一のトランスジェニックマウスを、導入遺伝子を含むゲノムを有する第二のトランスジェニックマウスと交配して第一世代の子孫を産生する工程であって、該導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種プレセニリン１ポリペプチドをコードしており、ここで該ポリペプチドの２８６位のロイシン残基がバリンで置換されている、工程；ならびに
（ｂ）該第一世代の子孫から、少なくとも１つの第一導入遺伝子および少なくとも１つの第二導入遺伝子を含むゲノムを有し、そして該第一導入遺伝子および該第二遺伝子の両方を発現するトランスジェニックマウスを選択する工程であって、該第一導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）ポリペプチドをコードし、ここで該ポリペプチドの６７０位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、６７１位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして７１７位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そして該第二導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種プレセニリン１ポリペプチドをコードし、ここで該ポリペプチドの２８６位のロイシン残基はバリンで置換されている、工程、
によって産生される、トランスジェニックマウス。
（項目１９）項目１２に記載のトランスジェニックマウスであって、以下：
（ａ）項目４に記載の第一のトランスジェニックマウスを、導入遺伝子を含むゲノムを有する第二のトランスジェニックマウスと交配して第一世代の子孫を産生する工程であって、該導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種プレセニリン１ポリペプチドをコードしており、ここで該ポリペプチドの１４６位のメチオニン残基がロイシンで置換されており、そして２８６位のロイシン残基がバリンで置換されている、工程；ならびに
（ｂ）該第一世代の子孫から、少なくとも１つの第一導入遺伝子および少なくとも１つの第二導入遺伝子を含むゲノムを有し、そして該第一導入遺伝子および該第二遺伝子の両方を発現するトランスジェニックマウスを選択する工程であって、該第一導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）ポリペプチドをコードし、ここで該ポリペプチドの６７０位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、６７１位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして７１７位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そして該第二導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種プレセニリン１ポリペプチドをコードし、ここで該ポリペプチドの１４６位置のメチオニン残基はロイシンで置換されており、そして２８６位のロイシン残基はバリンで置換されている、工程、
によって産生される、トランスジェニックマウス。
（項目２０）ＡＤの発生を防止または遅延するのにおける有効性について候補化合物をスクリーニングするための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）項目１〜１９のいずれか１項に記載の第一のトランスジェニックマウスにおける、選択されたＡＤ関連表現型特徴の出現の前に、該マウスに対して該候補化合物を投与する工程；および
（ｂ）該マウスにおいて該選択されたＡＤ関連表現型特徴が出現する年齢を、該化合物を投与しなかった、同じタイプの第二のトランスジェニックマウスにおいて該特徴が出現する年齢と比較する工程；
を包含し、
ここで該第二のマウスにおいて該特徴が出現した年齢と比べた、該第一のマウスにおいて該特徴が出現した年齢の上昇は、該化合物の有効性を示す、方法。
（項目２１）前記特徴が行動障害である、項目２０に記載の方法。
（項目２２）前記特徴が異常なＣＮＳアミロイド沈着である、項目２０に記載の方法。
（項目２３）アルツハイマー病の症状を寛解するのにおける有効性について候補化合物をスクリーニングするための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）項目１〜１９のいずれか１項に記載の第一のトランスジェニックマウスに対して該候補化合物を投与する工程；
（ｂ）記憶試験または学習試験において該マウスの能力を決定する工程；および
（ｃ）該マウスの該能力を、該化合物を投与しなかった、同じタイプの第二のトランスジェニックマウスの能力と比較する工程；
を包含し、
ここで該第二のマウスの能力と比べた、該第一のマウスの改善された能力は、該化合物の有効性を示す、方法。
（項目２４）中枢神経系において異常なＡβ沈着を示すトランスジェニック非ヒト哺乳動物を産生する方法であって、該方法は以下：
（ａ）導入遺伝子を該哺乳動物の受精した卵母細胞に導入する工程であって、該導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種アミロイド前駆体タンパク質６９５（ＡＰＰ６９５）ポリペプチドをコードしており、ここで、該ポリペプチドの６７０位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、６７１位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして７１７位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されている、工程；
（ｂ）偽妊娠哺乳動物中に該受精卵母細胞を移植する工程；
（ｃ）該受精した卵母細胞を生きて誕生した子孫中で発育させる工程；および
（ｄ）ゲノムが導入遺伝子を含む子孫を選択する工程であって、該導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種アミロイド前駆体タンパク質６９５（ＡＰＰ６９５）ポリペプチドをコードしており、ここで、該ポリペプチドの６７０位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、６７１位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして７１７位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そして該導入遺伝子が発現される、工程；
を包含する、方法。
（項目２５）前記哺乳動物がマウスである、項目２４に記載の方法。
（項目２６）前記プロモーターが、プリオンタンパク質ｃｏｓ．Ｔｅｔプロモーターである、項目２４に記載の方法。
（項目２７）異種アミロイド前駆体タンパク質６９５（ＡＰＰ６９５）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで該ポリペプチドの６７０位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、６７１位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして７１７位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されている、ヌクレオチド配列。
（項目２８）プロモーターに作動可能に連結された項目２７に記載のヌクレオチド配列を含む、ベクター。
（項目２９）中枢神経系における異常なアミロイド沈着を罹患する哺乳動物において、認識不全を減弱する方法であって、該方法は、認識不全を減弱するのに有効な量のＡβペプチドを該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
（項目３０）前記異常なアミロイド沈着がＡβ沈着である、項目２９に記載の方法。
（項目３１）前記投与されたペプチドがＡβ４２である、項目２９または３０に記載の方法。
（項目３２）前記哺乳動物が、アルツハイマー病に罹患しているヒトである、項目２９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
（項目３３）中枢神経系において異常なアミロイド沈着を罹患している哺乳動物において認識不全を減弱するための医薬の製造のためのＡβペプチドの使用。
（項目３４）前記ＡβペプチドがＡβ４２である、項目３３に記載の使用。
（項目３５）前記医薬がアルツハイマー病の予防または処置のための医薬である、項目３３または３４に記載の使用。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
本発明の特定の実施形態が記載されており、参照は、添付の図面に対してなされている。
【図１−１】図１は、１１週齢で試験したＴｇＣＲＮＤ８マウスの水迷路能力を示す。ＴｇＣＲＮＤ８マウス（ｎ＝５）は、非Ｔｇ同腹仔（ｎ＝８）よりも有意に長いエスケープ潜時（パネルＡ）、および通路探索（パネルＢ）を有し（それぞれ、Ｆ（１，１０）＝２８．８，ｐ＜０．００１およびＦ（１，１０）＝２２．０，ｐ＜０．０１）、そして結果的に、隠したプラットフォームを含む目標の四分区画（ＴＱ：Ｔａｒｇｅｔ Ｑｕａｄｒａｎｔ）への移動が有意に少なかった（Ｆ（１，１０）＝１４．９，ｐ＜０．０１）（パネルＣ）。Ｔｇマウスと非Ｔｇマウスとの間の泳ぐ速さによって評価した移動能力（パネルＤ）は匹敵していた（Ｆ（１，１０）＝０．４８，ｐ＞０．０５）。ＴｇＣＲＮＤ８マウスは、隠したプラットフォームがこのプールから取り除かれた場合、探索試行（プローブトライアル）における６０秒の泳ぎの間にその探索パターンによって測定した場合、プラットフォーム位置に対する空間的記憶の障害を示した。これらのマウスは、非Ｔｇマウスよりも、ＴＱを探索する傾向が少なく（パネルＥ）、そしてプラットフォーム位置の正確な帯を横切ることがしばしば有意に少ない（ｔ（１０）＝２．１，ｐ＝０．０６）（パネルＦ）ことが示された。
【図１−２】図１は、１１週齢で試験したＴｇＣＲＮＤ８マウスの水迷路能力を示す。ＴｇＣＲＮＤ８マウス（ｎ＝５）は、非Ｔｇ同腹仔（ｎ＝８）よりも有意に長いエスケープ潜時（パネルＡ）、および通路探索（パネルＢ）を有し（それぞれ、Ｆ（１，１０）＝２８．８，ｐ＜０．００１およびＦ（１，１０）＝２２．０，ｐ＜０．０１）、そして結果的に、隠したプラットフォームを含む目標の四分区画（ＴＱ：Ｔａｒｇｅｔ Ｑｕａｄｒａｎｔ）への移動が有意に少なかった（Ｆ（１，１０）＝１４．９，ｐ＜０．０１）（パネルＣ）。Ｔｇマウスと非Ｔｇマウスとの間の泳ぐ速さによって評価した移動能力（パネルＤ）は匹敵していた（Ｆ（１，１０）＝０．４８，ｐ＞０．０５）。ＴｇＣＲＮＤ８マウスは、隠したプラットフォームがこのプールから取り除かれた場合、探索試行（プローブトライアル）における６０秒の泳ぎの間にその探索パターンによって測定した場合、プラットフォーム位置に対する空間的記憶の障害を示した。これらのマウスは、非Ｔｇマウスよりも、ＴＱを探索する傾向が少なく（パネルＥ）、そしてプラットフォーム位置の正確な帯を横切ることがしばしば有意に少ない（ｔ（１０）＝２．１，ｐ＝０．０６）（パネルＦ）ことが示された。
【図１−３】図１は、１１週齢で試験したＴｇＣＲＮＤ８マウスの水迷路能力を示す。ＴｇＣＲＮＤ８マウス（ｎ＝５）は、非Ｔｇ同腹仔（ｎ＝８）よりも有意に長いエスケープ潜時（パネルＡ）、および通路探索（パネルＢ）を有し（それぞれ、Ｆ（１，１０）＝２８．８，ｐ＜０．００１およびＦ（１，１０）＝２２．０，ｐ＜０．０１）、そして結果的に、隠したプラットフォームを含む目標の四分区画（ＴＱ：Ｔａｒｇｅｔ Ｑｕａｄｒａｎｔ）への移動が有意に少なかった（Ｆ（１，１０）＝１４．９，ｐ＜０．０１）（パネルＣ）。Ｔｇマウスと非Ｔｇマウスとの間の泳ぐ速さによって評価した移動能力（パネルＤ）は匹敵していた（Ｆ（１，１０）＝０．４８，ｐ＞０．０５）。ＴｇＣＲＮＤ８マウスは、隠したプラットフォームがこのプールから取り除かれた場合、探索試行（プローブトライアル）における６０秒の泳ぎの間にその探索パターンによって測定した場合、プラットフォーム位置に対する空間的記憶の障害を示した。これらのマウスは、非Ｔｇマウスよりも、ＴＱを探索する傾向が少なく（パネルＥ）、そしてプラットフォーム位置の正確な帯を横切ることがしばしば有意に少ない（ｔ（１０）＝２．１，ｐ＝０．０６）（パネルＦ）ことが示された。
【図２−１】図２は、二重トランスジェニックマウスＴｇＣＲＮＤ８×ＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）１３７９の水迷路能力を示す。２ヶ月齢で試験した場合、二重トランスジェニックマウス（ｎ＝５）は、単一のＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）１３７９同腹仔（ｎ＝８）よりも有意に長い（Ｆ（１，１１）＝８．１，ｐ＜０．０５、遺伝子型によるエフェクトサイズ（η２）＝４２％））エスケープ潜時（パネルＡ）、および通路探索（Ｆ（１，１１）＝８．４６，ｐ＜０．０５、η２＝４３％）（パネルＢ）を有した。隠したプラットフォームをもとのＴＱと反対の四分区画に移動した場合、逆学習試験の直後には、二重トランスジェニックマウスは、さらに長いエスケープ潜時の傾向を示した（Ｆ（１，１１）＝３．２８，ｐ＝０．１、η２＝２３％、パネルＣ）が、その経路探索（パネルＤ）は、単一ＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）１３７９マウスとは有意に異ならなかった（Ｆ（１，１１）＝２．４６，ｐ＞０．０５、η２＝１８％）。両方のトランスジェニック群におけるマウスの泳ぐ速度は試験間で匹敵した。５ヶ月齢で再試験した場合、二重トランスジェニックマウスは、単一のＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）１３７９同腹仔よりも、有意に長い（Ｆ（１，１０）＝１６．６，ｐ＜０．０１、η２＝６２％（二重トランスジェニックマウスの１匹が死んだ））エスケープ潜時（パネルＥ）、および有意に長い通路探索（Ｆ（１，１０）＝２０．３，ｐ＜０．００１、η２＝６６％、パネルＦ）を示した。この有意な欠陥は、この試験における二重トランスジェニックマウスの最初の能力の乏しさ（群×日数相互作用：潜時について、Ｆ（２，４０）＝３．３２、ｐ＜０．０５、そして通路についてＦ（２，４０）＝２．８５，ｐ＝０．０７）に起因していた。二重トランスジェニックマウスがなお、単一のＴ９同腹仔よりも、有意に長い潜時（Ｆ（１，１０）＝２８．５８，ｐ＜０．００１、η２＝７４％、パネルＧ）および、長い通路探索（Ｆ（１，１０）＝２７．４３，ｐ＜０．００１、η２＝７３％、パネルＨ）を示した場合、学習獲得の欠陥は、逆試験において持続した。このマウスは最終的に、逆トレーニング学習の最後には能力を改善したが、両方の測定に関する群×日数相互作用は、α＝０．０５で有意には達しなかった。
【図２−２】図２は、二重トランスジェニックマウスＴｇＣＲＮＤ８×ＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）１３７９の水迷路能力を示す。２ヶ月齢で試験した場合、二重トランスジェニックマウス（ｎ＝５）は、単一のＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）１３７９同腹仔（ｎ＝８）よりも有意に長い（Ｆ（１，１１）＝８．１，ｐ＜０．０５、遺伝子型によるエフェクトサイズ（η２）＝４２％））エスケープ潜時（パネルＡ）、および通路探索（Ｆ（１，１１）＝８．４６，ｐ＜０．０５、η２＝４３％）（パネルＢ）を有した。隠したプラットフォームをもとのＴＱと反対の四分区画に移動した場合、逆学習試験の直後には、二重トランスジェニックマウスは、さらに長いエスケープ潜時の傾向を示した（Ｆ（１，１１）＝３．２８，ｐ＝０．１、η２＝２３％、パネルＣ）が、その経路探索（パネルＤ）は、単一ＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）１３７９マウスとは有意に異ならなかった（Ｆ（１，１１）＝２．４６，ｐ＞０．０５、η２＝１８％）。両方のトランスジェニック群におけるマウスの泳ぐ速度は試験間で匹敵した。５ヶ月齢で再試験した場合、二重トランスジェニックマウスは、単一のＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）１３７９同腹仔よりも、有意に長い（Ｆ（１，１０）＝１６．６，ｐ＜０．０１、η２＝６２％（二重トランスジェニックマウスの１匹が死んだ））エスケープ潜時（パネルＥ）、および有意に長い通路探索（Ｆ（１，１０）＝２０．３，ｐ＜０．００１、η２＝６６％、パネルＦ）を示した。この有意な欠陥は、この試験における二重トランスジェニックマウスの最初の能力の乏しさ（群×日数相互作用：潜時について、Ｆ（２，４０）＝３．３２、ｐ＜０．０５、そして通路についてＦ（２，４０）＝２．８５，ｐ＝０．０７）に起因していた。二重トランスジェニックマウスがなお、単一のＴ９同腹仔よりも、有意に長い潜時（Ｆ（１，１０）＝２８．５８，ｐ＜０．００１、η２＝７４％、パネルＧ）および、長い通路探索（Ｆ（１，１０）＝２７．４３，ｐ＜０．００１、η２＝７３％、パネルＨ）を示した場合、学習獲得の欠陥は、逆試験において持続した。このマウスは最終的に、逆トレーニング学習の最後には能力を改善したが、両方の測定に関する群×日数相互作用は、α＝０．０５で有意には達しなかった。
【図２−３】図２は、二重トランスジェニックマウスＴｇＣＲＮＤ８×ＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）１３７９の水迷路能力を示す。２ヶ月齢で試験した場合、二重トランスジェニックマウス（ｎ＝５）は、単一のＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）１３７９同腹仔（ｎ＝８）よりも有意に長い（Ｆ（１，１１）＝８．１，ｐ＜０．０５、遺伝子型によるエフェクトサイズ（η２）＝４２％））エスケープ潜時（パネルＡ）、および通路探索（Ｆ（１，１１）＝８．４６，ｐ＜０．０５、η２＝４３％）（パネルＢ）を有した。隠したプラットフォームをもとのＴＱと反対の四分区画に移動した場合、逆学習試験の直後には、二重トランスジェニックマウスは、さらに長いエスケープ潜時の傾向を示した（Ｆ（１，１１）＝３．２８，ｐ＝０．１、η２＝２３％、パネルＣ）が、その経路探索（パネルＤ）は、単一ＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）１３７９マウスとは有意に異ならなかった（Ｆ（１，１１）＝２．４６，ｐ＞０．０５、η２＝１８％）。両方のトランスジェニック群におけるマウスの泳ぐ速度は試験間で匹敵した。５ヶ月齢で再試験した場合、二重トランスジェニックマウスは、単一のＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）１３７９同腹仔よりも、有意に長い（Ｆ（１，１０）＝１６．６，ｐ＜０．０１、η２＝６２％（二重トランスジェニックマウスの１匹が死んだ））エスケープ潜時（パネルＥ）、および有意に長い通路探索（Ｆ（１，１０）＝２０．３，ｐ＜０．００１、η２＝６６％、パネルＦ）を示した。この有意な欠陥は、この試験における二重トランスジェニックマウスの最初の能力の乏しさ（群×日数相互作用：潜時について、Ｆ（２，４０）＝３．３２、ｐ＜０．０５、そして通路についてＦ（２，４０）＝２．８５，ｐ＝０．０７）に起因していた。二重トランスジェニックマウスがなお、単一のＴ９同腹仔よりも、有意に長い潜時（Ｆ（１，１０）＝２８．５８，ｐ＜０．００１、η２＝７４％、パネルＧ）および、長い通路探索（Ｆ（１，１０）＝２７．４３，ｐ＜０．００１、η２＝７３％、パネルＨ）を示した場合、学習獲得の欠陥は、逆試験において持続した。このマウスは最終的に、逆トレーニング学習の最後には能力を改善したが、両方の測定に関する群×日数相互作用は、α＝０．０５で有意には達しなかった。
【図２−４】図２は、二重トランスジェニックマウスＴｇＣＲＮＤ８×ＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）１３７９の水迷路能力を示す。２ヶ月齢で試験した場合、二重トランスジェニックマウス（ｎ＝５）は、単一のＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）１３７９同腹仔（ｎ＝８）よりも有意に長い（Ｆ（１，１１）＝８．１，ｐ＜０．０５、遺伝子型によるエフェクトサイズ（η２）＝４２％））エスケープ潜時（パネルＡ）、および通路探索（Ｆ（１，１１）＝８．４６，ｐ＜０．０５、η２＝４３％）（パネルＢ）を有した。隠したプラットフォームをもとのＴＱと反対の四分区画に移動した場合、逆学習試験の直後には、二重トランスジェニックマウスは、さらに長いエスケープ潜時の傾向を示した（Ｆ（１，１１）＝３．２８，ｐ＝０．１、η２＝２３％、パネルＣ）が、その経路探索（パネルＤ）は、単一ＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）１３７９マウスとは有意に異ならなかった（Ｆ（１，１１）＝２．４６，ｐ＞０．０５、η２＝１８％）。両方のトランスジェニック群におけるマウスの泳ぐ速度は試験間で匹敵した。５ヶ月齢で再試験した場合、二重トランスジェニックマウスは、単一のＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）１３７９同腹仔よりも、有意に長い（Ｆ（１，１０）＝１６．６，ｐ＜０．０１、η２＝６２％（二重トランスジェニックマウスの１匹が死んだ））エスケープ潜時（パネルＥ）、および有意に長い通路探索（Ｆ（１，１０）＝２０．３，ｐ＜０．００１、η２＝６６％、パネルＦ）を示した。この有意な欠陥は、この試験における二重トランスジェニックマウスの最初の能力の乏しさ（群×日数相互作用：潜時について、Ｆ（２，４０）＝３．３２、ｐ＜０．０５、そして通路についてＦ（２，４０）＝２．８５，ｐ＝０．０７）に起因していた。二重トランスジェニックマウスがなお、単一のＴ９同腹仔よりも、有意に長い潜時（Ｆ（１，１０）＝２８．５８，ｐ＜０．００１、η２＝７４％、パネルＧ）および、長い通路探索（Ｆ（１，１０）＝２７．４３，ｐ＜０．００１、η２＝７３％、パネルＨ）を示した場合、学習獲得の欠陥は、逆試験において持続した。このマウスは最終的に、逆トレーニング学習の最後には能力を改善したが、両方の測定に関する群×日数相互作用は、α＝０．０５で有意には達しなかった。
【図３−１】図３は、Ａβ４２で免疫したＴｇＣＲＮＤ８マウス（Ｔｇ（ＡＰＰ）８；ｎ＝１２）および非トランスジェニック同腹仔（非Ｔｇ；ｎ＝２０）、ならびにＩＡＰＰペプチドで免疫したＴｇＣＲＮＤ８マウス（Ｔｇ（ＡＰＰ）８；ｎ＝９）および非トランスジェニック同腹仔（非Ｔｇ；ｎ＝１９）の水迷路能力を示す。Ａβ４２ペプチドでの免疫は、非Ｔｇ同腹仔に比べて、エスケープ潜時および通路探索によって測定した場合、ＴｇＣＲＮＤ８マウスの認識欠陥を有意に減弱した。Ａβ４２で免疫したＴｇＣＲＮＤ８マウスは、非Ｔｇマウスよりも全体的に長いエスケープ潜時（パネルＡ）、および通路探索（パネルＣ）を有した（潜時および通路について、それぞれ、（Ｆ（１，３０）＝９．７１，ｐ＜０．０１；Ｆ（１，３０）＝１０．９，ｐ＜０．０１）。この差異は、その最初の探索がより長かったこと（群×日数相互作用：潜時について、Ｆ（４，１２０）＝２．８３、ｐ＜０．０５；通路についてＦ（３，１２０）＝４．７３，ｐ＜０．０１）に起因していた。トレーニングの最後の３日間のそれらの能力の比較は群間で有意な差異を示さなかった（潜時について、Ｆ（１，３０）＝０．６４、ｐ＞０．０５；通路についてＦ（１，３０）＝１．２４，ｐ＞０．０５）。Ａβ４２で免疫したＴｇマウスは、ＴＱの探索がやや短い傾向（Ｆ（１，３０）＝３．７１，ｐ＝０．０６、パネルＥ）を示したが、その泳ぐ速度は非Ｔｇマウスと有意に異なることはなかった（Ｆ（１，３０）＝１．３３，ｐ＞０．０５）（パネルＧ）。ＩＡＰＰで免疫したＴｇＣＲＮＤ８マウスは、非Ｔｇ同腹仔よりも有意に長いエスケープ潜時（パネルＢ）および通路探索（パネルＤ）を示した（潜時について、Ｆ（１，２６）＝３９．９、ｐ＜０．００１；通路についてＦ（１，２６）＝４３．９、ｐ＜０．００１）。これらのマウスは非Ｔｇマウスとは最初の探索は異ならなかったが、トレーニング中にはその能力は改善しなかった（群×日数相互作用：潜時について、Ｆ（４，１０４）＝６．３１、ｐ＜０．００１；通路について、Ｆ（４，１０４）＝５．６９，ｐ＜０．００１）。これらのマウスはまた、目標四分区画を探索するのにかかる時間が有意に短かった（Ｆ（１，２６）＝７．３９、ｐ＜０．０５；パネルＦ）、しかしその泳ぐ速度は免疫によって有意に影響されなかった（Ｆ（１，２６）＝１．７３，ｐ＞０．０５、パネルＨ）。
【図３−２】図３は、Ａβ４２で免疫したＴｇＣＲＮＤ８マウス（Ｔｇ（ＡＰＰ）８；ｎ＝１２）および非トランスジェニック同腹仔（非Ｔｇ；ｎ＝２０）、ならびにＩＡＰＰペプチドで免疫したＴｇＣＲＮＤ８マウス（Ｔｇ（ＡＰＰ）８；ｎ＝９）および非トランスジェニック同腹仔（非Ｔｇ；ｎ＝１９）の水迷路能力を示す。Ａβ４２ペプチドでの免疫は、非Ｔｇ同腹仔に比べて、エスケープ潜時および通路探索によって測定した場合、ＴｇＣＲＮＤ８マウスの認識欠陥を有意に減弱した。Ａβ４２で免疫したＴｇＣＲＮＤ８マウスは、非Ｔｇマウスよりも全体的に長いエスケープ潜時（パネルＡ）、および通路探索（パネルＣ）を有した（潜時および通路について、それぞれ、（Ｆ（１，３０）＝９．７１，ｐ＜０．０１；Ｆ（１，３０）＝１０．９，ｐ＜０．０１）。この差異は、その最初の探索がより長かったこと（群×日数相互作用：潜時について、Ｆ（４，１２０）＝２．８３、ｐ＜０．０５；通路についてＦ（３，１２０）＝４．７３，ｐ＜０．０１）に起因していた。トレーニングの最後の３日間のそれらの能力の比較は群間で有意な差異を示さなかった（潜時について、Ｆ（１，３０）＝０．６４、ｐ＞０．０５；通路についてＦ（１，３０）＝１．２４，ｐ＞０．０５）。Ａβ４２で免疫したＴｇマウスは、ＴＱの探索がやや短い傾向（Ｆ（１，３０）＝３．７１，ｐ＝０．０６、パネルＥ）を示したが、その泳ぐ速度は非Ｔｇマウスと有意に異なることはなかった（Ｆ（１，３０）＝１．３３，ｐ＞０．０５）（パネルＧ）。ＩＡＰＰで免疫したＴｇＣＲＮＤ８マウスは、非Ｔｇ同腹仔よりも有意に長いエスケープ潜時（パネルＢ）および通路探索（パネルＤ）を示した（潜時について、Ｆ（１，２６）＝３９．９、ｐ＜０．００１；通路についてＦ（１，２６）＝４３．９、ｐ＜０．００１）。これらのマウスは非Ｔｇマウスとは最初の探索は異ならなかったが、トレーニング中にはその能力は改善しなかった（群×日数相互作用：潜時について、Ｆ（４，１０４）＝６．３１、ｐ＜０．００１；通路について、Ｆ（４，１０４）＝５．６９，ｐ＜０．００１）。これらのマウスはまた、目標四分区画を探索するのにかかる時間が有意に短かった（Ｆ（１，２６）＝７．３９、ｐ＜０．０５；パネルＦ）、しかしその泳ぐ速度は免疫によって有意に影響されなかった（Ｆ（１，２６）＝１．７３，ｐ＞０．０５、パネルＨ）。
【図３−３】図３は、Ａβ４２で免疫したＴｇＣＲＮＤ８マウス（Ｔｇ（ＡＰＰ）８；ｎ＝１２）および非トランスジェニック同腹仔（非Ｔｇ；ｎ＝２０）、ならびにＩＡＰＰペプチドで免疫したＴｇＣＲＮＤ８マウス（Ｔｇ（ＡＰＰ）８；ｎ＝９）および非トランスジェニック同腹仔（非Ｔｇ；ｎ＝１９）の水迷路能力を示す。Ａβ４２ペプチドでの免疫は、非Ｔｇ同腹仔に比べて、エスケープ潜時および通路探索によって測定した場合、ＴｇＣＲＮＤ８マウスの認識欠陥を有意に減弱した。Ａβ４２で免疫したＴｇＣＲＮＤ８マウスは、非Ｔｇマウスよりも全体的に長いエスケープ潜時（パネルＡ）、および通路探索（パネルＣ）を有した（潜時および通路について、それぞれ、（Ｆ（１，３０）＝９．７１，ｐ＜０．０１；Ｆ（１，３０）＝１０．９，ｐ＜０．０１）。この差異は、その最初の探索がより長かったこと（群×日数相互作用：潜時について、Ｆ（４，１２０）＝２．８３、ｐ＜０．０５；通路についてＦ（３，１２０）＝４．７３，ｐ＜０．０１）に起因していた。トレーニングの最後の３日間のそれらの能力の比較は群間で有意な差異を示さなかった（潜時について、Ｆ（１，３０）＝０．６４、ｐ＞０．０５；通路についてＦ（１，３０）＝１．２４，ｐ＞０．０５）。Ａβ４２で免疫したＴｇマウスは、ＴＱの探索がやや短い傾向（Ｆ（１，３０）＝３．７１，ｐ＝０．０６、パネルＥ）を示したが、その泳ぐ速度は非Ｔｇマウスと有意に異なることはなかった（Ｆ（１，３０）＝１．３３，ｐ＞０．０５）（パネルＧ）。ＩＡＰＰで免疫したＴｇＣＲＮＤ８マウスは、非Ｔｇ同腹仔よりも有意に長いエスケープ潜時（パネルＢ）および通路探索（パネルＤ）を示した（潜時について、Ｆ（１，２６）＝３９．９、ｐ＜０．００１；通路についてＦ（１，２６）＝４３．９、ｐ＜０．００１）。これらのマウスは非Ｔｇマウスとは最初の探索は異ならなかったが、トレーニング中にはその能力は改善しなかった（群×日数相互作用：潜時について、Ｆ（４，１０４）＝６．３１、ｐ＜０．００１；通路について、Ｆ（４，１０４）＝５．６９，ｐ＜０．００１）。これらのマウスはまた、目標四分区画を探索するのにかかる時間が有意に短かった（Ｆ（１，２６）＝７．３９、ｐ＜０．０５；パネルＦ）、しかしその泳ぐ速度は免疫によって有意に影響されなかった（Ｆ（１，２６）＝１．７３，ｐ＞０．０５、パネルＨ）。
【図３−４】図３は、Ａβ４２で免疫したＴｇＣＲＮＤ８マウス（Ｔｇ（ＡＰＰ）８；ｎ＝１２）および非トランスジェニック同腹仔（非Ｔｇ；ｎ＝２０）、ならびにＩＡＰＰペプチドで免疫したＴｇＣＲＮＤ８マウス（Ｔｇ（ＡＰＰ）８；ｎ＝９）および非トランスジェニック同腹仔（非Ｔｇ；ｎ＝１９）の水迷路能力を示す。Ａβ４２ペプチドでの免疫は、非Ｔｇ同腹仔に比べて、エスケープ潜時および通路探索によって測定した場合、ＴｇＣＲＮＤ８マウスの認識欠陥を有意に減弱した。Ａβ４２で免疫したＴｇＣＲＮＤ８マウスは、非Ｔｇマウスよりも全体的に長いエスケープ潜時（パネルＡ）、および通路探索（パネルＣ）を有した（潜時および通路について、それぞれ、（Ｆ（１，３０）＝９．７１，ｐ＜０．０１；Ｆ（１，３０）＝１０．９，ｐ＜０．０１）。この差異は、その最初の探索がより長かったこと（群×日数相互作用：潜時について、Ｆ（４，１２０）＝２．８３、ｐ＜０．０５；通路についてＦ（３，１２０）＝４．７３，ｐ＜０．０１）に起因していた。トレーニングの最後の３日間のそれらの能力の比較は群間で有意な差異を示さなかった（潜時について、Ｆ（１，３０）＝０．６４、ｐ＞０．０５；通路についてＦ（１，３０）＝１．２４，ｐ＞０．０５）。Ａβ４２で免疫したＴｇマウスは、ＴＱの探索がやや短い傾向（Ｆ（１，３０）＝３．７１，ｐ＝０．０６、パネルＥ）を示したが、その泳ぐ速度は非Ｔｇマウスと有意に異なることはなかった（Ｆ（１，３０）＝１．３３，ｐ＞０．０５）（パネルＧ）。ＩＡＰＰで免疫したＴｇＣＲＮＤ８マウスは、非Ｔｇ同腹仔よりも有意に長いエスケープ潜時（パネルＢ）および通路探索（パネルＤ）を示した（潜時について、Ｆ（１，２６）＝３９．９、ｐ＜０．００１；通路についてＦ（１，２６）＝４３．９、ｐ＜０．００１）。これらのマウスは非Ｔｇマウスとは最初の探索は異ならなかったが、トレーニング中にはその能力は改善しなかった（群×日数相互作用：潜時について、Ｆ（４，１０４）＝６．３１、ｐ＜０．００１；通路について、Ｆ（４，１０４）＝５．６９，ｐ＜０．００１）。これらのマウスはまた、目標四分区画を探索するのにかかる時間が有意に短かった（Ｆ（１，２６）＝７．３９、ｐ＜０．０５；パネルＦ）、しかしその泳ぐ速度は免疫によって有意に影響されなかった（Ｆ（１，２６）＝１．７３，ｐ＞０．０５、パネルＨ）。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物、好ましくはげっ歯類、およびより好ましくはマウスを提供し、これは、アルツハイマー病（ＡＤ）、アルツハイマー病のレーヴィ体変種、および特定の型のクロイツフェルト−ヤーコプ病（ＣＪＤ）（これは、痴呆を引き起こす）、アミロイドーシスオランダ型（ＨＣＡＷＡ−Ｄ）を有する遺伝性小脳性血管障害、および脳出血を引き起こす老年性アミロイド血管症のような多数のヒト障害において見られるものと同様の異常なＡβ沈着を示す。
本発明の非ヒトトランスジェニック哺乳動物は、異常なＡβ沈着の結果として、組織学的および行動性欠損を示す。特に、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、種々の面のヒトＡＤ関連病態の促進された出現を示し、そしてＡＤの改善された動物モデルを提供する。
【００２９】
１つの実施形態に従って、本発明の非ヒト哺乳動物は、異種ＡＰＰ６９５ポリペプチド、好ましくはヒトＡＰＰ６９５ポリペプチドをコードする導入遺伝子をそのゲノム中に有する哺乳動物を含み、このポリペプチドは、アルツハイマー病アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）の「スウェーデン」変異および「インディアナ」変異の両方を保有する。これらの変異の両方は、ヒトにおいて、家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）に関連する。
【００３０】
好ましい実施形態に従って、本発明は、ＴｇＣＲＮＤ８と命名されたトランスジェニックマウスを含み、これは、「スウェーデン」ＡＰＰ変異および「インディアナ」ＡＰＰ変異の両方を保有するＡＰＰ６９５導入遺伝子を有する。
【００３１】
導入遺伝子構築物は、ヒト脳における主要なＡＰＰアイソフォーム（ＡＰＰ６９５）をコードするｃＤＮＡカセットに基づく。このカセットは、ＡＰＰ ＡβドメインのＮ末端およびＣ末端境界に隣接して位置する、２つのＦＡＤ変異：「スウェーデン」変異（Ｋ６７０Ｎ、Ｍ６７１Ｌ）および「インディアナ」変異（Ｖ７１７Ｆ）を含むように改変される。このカセットは、ｃｏｓＴｅｔ（ＣＮＳニューロンそしてより少ない程度で星状細胞における位置独立導入遺伝子発現を指向するプリオンプロモーター発現ベクター）に導入された。微小注入は、ハイブリッド遺伝的背景の卵母細胞（Ｃ３ＨおよびＣ５７ＢＬ６株を含む）中に行なった。得られたトランスジェニックマウス系統を、ＴｇＣＲＮＤ８と命名した。
【００３２】
当業者に理解されるように、導入遺伝子の中枢神経系またはニューロンの発現を指向する、任意のプロモーターが使用され得る。これらとしては、ニューロン特異的エノラーゼ遺伝子プロモーター（３７）；ヒト血小板由来増殖因子Ｂサブユニットプロモーター（３８）、Ｔｈｙ−１プロモーター（１９）および神経フィラメントプロモーター（４１）が挙げられる。
【００３３】
発現カセットは、好ましくは、脳において発現され、そして好ましくはゲノム中に組み込まれた導入遺伝子コピーに比例して発現される、遺伝子由来のプロモーター配列および遺伝子座位制御領域配列を含む。
【００３４】
二重シス変異ＡＰＰ６９５導入遺伝子カセットの使用は、以前に報告されていない；他のＡＤモデルは、ＡＰＰ７５１（ＫＭ６７０／７６１ＮＬ＋Ｖ７１７Ｉ）（１９）導入遺伝子またはＡＰＰ７７０（ＫＭ６７０／６７１ＮＬ＋Ｖ７１７Ｆ）（２７）導入遺伝子を使用した。
【００３５】
ＴｇＣＲＮＤ８マウスは、生後９０日ほども早く、Ａβペプチドについて免疫反応性の球状プラークの形態で沈着する大量のＣＮＳアミロイドを示す；このようなプラークは、ヒトＡＤに特徴的である。単離されたプラーク沈着物は、生後６６日ほども早く、ＴｇＣＲＮＤ８マウスにおいて明白である。ＴｇＣＲＮＤ８マウスにおけるアミロイド沈着の出現は、任意の以前に報告された単一の導入遺伝子を使用するＡＤの動物モデルよりも、より早く生じる（表１を参照のこと）。
【００３６】
アルツハイマー病のマウスモデルの総説が出版され（１６）、そしていくつかの例が表１に列挙されている。列挙された特性から注目されるように、ＴｇＣＲＮＤ８マウスは、他の現在利用可能なＡＤの動物モデルに対して予想外かつ実質的な改善を示す。
【００３７】
例えば、以前に記載された二重シス変異ＡＰＰ導入遺伝子モデル（「ＴｇＡＰＰ２２」マウス）（これは、二重変異ＡＰＰ７５１カセット（ＫＭ６７０／６７１ＮＬ＋Ｖ７１７Ｉ）を使用した）は、１８か月齢でのＡβプラークの出現を示し（１９）、そしてＪ９系統（二重変異ＡＰＰ７７０カセット（ＫＭ６７０／６７１ＮＬ＋Ｖ７１７Ｆ））は、８〜１０か月でプラークを発生することが報告された（２７）。
【００３８】
以前に報告された二重導入遺伝子マウス（Ｔｇ２５７６×ＴｇＰＳ１）は、７０日齢由来の帯状皮質における最小のプラーク沈着を有したが（３９）、最終的に、６か月齢で、十分に形成された沈着物を示した（２２）。
【００３９】
ＴｇＣＲＮＤ８マウスは、ＡＤの処置の診断化合物および治療化合物の発見および開発のため、ならびに疾患の病原性機構のより良い解明のために有用である。
【００４０】
ＴｇＣＲＮＤ８マウスは、Ｍｏｒｒｉｓ水迷路の隠したプラットフォーム（ｈｉｄｄｅｎ−ｐｌａｔｆｏｒｍ）バージョンによって評価されるように、空間的学習における欠損を示す。コントロールの非トランスジェニック同腹仔に対して測定されるこれらの欠損は、１１週齢ほども早くに検出され得る（図１）。
【００４１】
本発明はまた、Ｓｃｈｅｃｋらのプロトコル（２６）を使用して、ヒトＡβ４２ペプチドでのＴｇＣＲＮＤ８マウスの免疫化が、実施例５に記載されるように、１０〜２２週齢で、行動および神経病理の両方において有意な改善を生じることを示してきた。対照的に、Ｓｃｈｅｎｋらによって使用されたＰＤＡＰＰマウスは、行動ではなく、神経病理において改善を示したのみであった（２６）。
【００４２】
従って、ＴｇＣＲＮＤ８モデルは、Ａβ沈着（アルツハイマー病における公知かつ広範に受け入れられた開始事象）の調節が、病理および行動の両方の改善を生じることが示されている第１のＡＤ動物モデルであり、従って、新しい治療を試験するためおよび候補治療化合物をスクリーニングするための最新の最も適切なモデルを提供する。
【００４３】
このような治療または化合物は、βＡＰＰのγ−セクレターゼ切断において、またはβＡＰＰのタンパク質分解誘導体の除去を促進する際、ＰＳ１の機能を阻害することを目的とし得る。これらのタンパク質分解ＡＰＰ誘導体は、Ａβ自身（これは、凝集形態で神経毒性であることが公知である）ならびにαＡＰＰおよびβＡＰＰの残りのγ−セクレターゼ切断から生じるＣ末端誘導体（Ｃ８３／Ｃ９９−βＡＰＰ）（これは、神経毒性であることが示唆されている）を含む（２５）。
【００４４】
本発明のトランスジェニックマウスはまた、新しい診断薬の開発のために有用であり得る。例えば、脳のＡβ充填の推定アッセイまたはＡβ蓄積に応答するニューロンの損傷の試験は、本明細書中に記載されるトランスジェニックマウスを用いて行なわれ得る。
【００４５】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物（スウェーデン変異およびインディアナ変異の両方を有するＡＰＰ６９５をコードする導入遺伝子を有する）は、「二重トランスジェニック（ｂｉ−ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）哺乳動物」を生成するために、導入遺伝子中かまたは内因性遺伝子中かのいずれかで異なる変異を保有する他の系統の哺乳動物と交配され得る。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、「二重トランスジェニック哺乳動物」は、ゲノムが、異種ＡＰＰ６９５ポリペプチド、好ましくはヒトＡＰＰ６９５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子（スウェーデンＡＰＰ変異およびインディアナＡＰＰ変異ならびに選択された第２の遺伝子を保有する）、好ましくは少なくとも１つの選択された変異を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子を含む哺乳動物を意味する。
【００４７】
第２の遺伝子は、少なくとも１つの選択された変異を保有する内因性遺伝子、または少なくとも１つの選択された変異を保有する同種導入遺伝子もしくは異種導入遺伝子であり得る。選択された変異は、例えば、ＡＤ関連変異またはＡβプロセシングに関連する遺伝子における変異であり得る。
【００４８】
あるいは、選択された第２の遺伝子は、正常な導入遺伝子であり得る。
【００４９】
本明細書中に記載されるＴｇＣＲＮＤ８マウスは、Ａβペプチドの促進された合成経路がこれらのマウスにおいて飽和していないという点で、さらなるＡＤ動物モデルの作成のために有用であり、ＡＤ動物モデルを、他のトランスジェニックマウスと交配し、アミロイドペプチド合成および沈着のＡＤ関連病理学的プロセスのさらなる増強を有する二重トランスジェニックモデルを得ることが可能である。
【００５０】
ＴｇＣＲＮＤ８マウスは、例えば、変異プレセニリン遺伝子、変異ＡＰＯＥ４遺伝子、変異ニカストリン（ｎｉｃａｓｔｒｉｎ）遺伝子またはＡＰＰ遺伝子の異なる変異を保有するトランスジェニック動物と交配され得る。
【００５１】
好ましい実施形態に従って、本発明は、以下：
（ａ）変異プレセニリン１タンパク質、好ましくはＰＳ１（Ｌ２８６Ｖ）プレセニリン１タンパク質をコードする導入遺伝子を含むトランスジェニックマウス；
（ｂ）変異プレセニリン２タンパク質、好ましくはＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）プレセニリン２タンパク質をコードする導入遺伝子を含むトランスジェニックマウス；
（ｃ）２つの変異を有するプレセニリン１タンパク質、好ましくはＰＳ１（Ｍ１４６Ｌ＋Ｌ２８６Ｌ）プレセニリン１タンパク質をコードする導入遺伝子を含むトランスジェニックマウス、
とＴｇＣＲＮＤ８マウスとを交配することによって生成される二重トランスジェニックマウスを提供する。
【００５２】
交配によって生成された第１世代の子孫を、二重特異的マウスを選択するために、従来の方法を使用して、第１および第２の導入遺伝子の両方存在および発現についてスクリーニングする。
【００５３】
ＴｇＣＲＮＤ８マウスはまた、Ａβプロセシングに関連する遺伝子（例えば、低密度リポタンパク質レセプター関連遺伝子、α２−マクログロブリン遺伝子またはβ−セクレターゼ遺伝子）中に変異を保有するトランスジェニック動物と交配され得る。
【００５４】
ＴｇＣＲＮＤ８マウスを、変異ヒトプレセニリン（ＰＳ１またはＰＳ２）導入遺伝子を過剰発現するトランスジェニックマウスと交配した（表２）。プラーク密度における強力な増加が、ＴｇＰＳ１（Ｌ２８６Ｖ）１２７４（これは、家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）変異を保有する）と表されるヒト変異プレセニリン導入遺伝子を同時発現するＴｇＣＲＮＤ８マウスにおいて注目された。従って、ＴｇＣＲＮＤ８×ＴｇＰＳ１（Ｌ２８６Ｖ）１２７４マウスにおいて、死後のＡＤ脳に酷似するアミロイド負担はすでに、６２日齢までに存在する（図１Ａ：パネルＣ中の１１７日齢のＴｇＣＲＮＤ８マウスと比較する）。
【００５５】
類似の様式で、ＴｇＣＲＮＤ８マウスを、プレセニリン２のＦＡＤ変異形態（ＰＳ２遺伝子コード領域のアミノ酸残基２３９におけるメチオニンからバリンへの変異）を保有するマウスと交配することによってもまた、プラーク密度における強力な増加を生じる。ＴｇＣＲＮＤ８マウスおよびＴｇＣＲＮＤ８×ＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）マウス（ここで、ＰＳ２導入遺伝子系統は１３７９と命名される）の９１日齢での比較は、図２に示される。
【００５６】
なおより大きい増強は、ＴｇＣＲＮＤ８マウスを、お互いにシスで２つのＦＡＤ変異を有するヒト変異プレセニリン導入遺伝子を保有するマウス（Ｔｇ（Ｍ１４６Ｌ＋Ｌ２８６Ｖ）６５００と表される）と交配することによって得られた。ＴｇＣＲＮＤ８×ＴｇＰＳ１（Ｍ１４６Ｌ＋Ｌ２８６Ｖ）６５００マウスにおいて、海馬アミロイド沈着は、３０日齢までで検出可能であり（図３）、これは、任意の他の二重ＡＰＰ／ＰＳ１−Ｔｇマウス（これは、代表的に６か月齢以降にプラークを発生する）について以前に報告されたよりも、５か月早い（２２、２３）。
【００５７】
これら全ての二重トランスジェニックマウスは、ＴｇＣＲＮＤ８親またはＴｇＰＳ１親のいずれかと比較した場合、海馬アミロイドプラークのなおより促進された出現を示した（表２）。
【００５８】
以前に記載されたＴｇマウスと比較した、ＡＤ関連特徴の促進された出現に加えて、予備分析は、皮質ニューロンの実質的な喪失が、４３週齢のＴｇＣＲＮＤ８×ＴｇＰＳ１（Ｍ１４６Ｌ＋Ｌ２８６Ｖ）６５００二重導入遺伝子マウスにおいて明らかであることを示す。
【００５９】
８〜１０週齢で始まる認識性能における進行性の低下はまた、プレセニリン２（ＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ））のＦＡＤ対立遺伝子を発現するマウスと、ＴｇＣＲＮＤ８マウス（系統１３７９）を交配することによって作成された二重導入遺伝子マウスにおいて見られる（図５）。
【００６０】
本明細書中に記載されるＴｇＣＲＮＤ８マウス、および選択された変異（例えば、ＡＤ関連変異）を保有する他のマウス系統とのこれらのマウスの交配は、本明細書中にさらに記載されるように、多数の目的に有用である。
【００６１】
これらのマウスは、これらのマウスにおいて見られる病理学的指標（例えば、ＡＤ関連表現型形質）のいずれかの発生を防止または遅延する際にそれらの効力について潜在的な薬学的化合物をスクリーニングするために使用され得る。従って、ＡＤの発生を防止または遅延する際にそれらの効力について候補化合物をスクリーニングするための方法が提供される。このスクリーニング方法は、選択されたＡＤ関連表現型形質の出現の前に本発明のトランスジェニックマウスに候補化合物を投与する工程、および未処置のトランスジェニックマウスにおけるその形質の出現の齢と、選択された表現型形質が処置されたマウスにおいて出現する齢を比較する工程を包含する。試験するための適切なＡＤ関連形質は、異常な脳の病歴の出現または行動的欠損の出現を含む。行動性欠損は、本明細書中に記載されるように、例えば、水迷路のような記憶試験または学習試験におけるマウスの成績を調査することによって、決定され得る。
【００６２】
これらのマウスはまた、選択されたＡＤ関連形質（例えば、異常な脳組織または行動性欠損）の出現後、同様に投与することによって、そしてトランスジェニック動物における候補化合物の効果を比較することによって、ＡＤの症状を軽減する際にそれらの効率について潜在的な薬学的化合物をスクリーニングするために使用され得る。
【００６３】
疾患の特定の原因は、疾患の進行および効果を、生理学的および身体的の両方に研究するために、トランスジェニック動物の成長および発達の間に同定され得る。脳において短期間にＡβを迅速に過剰発現する本発明のトランスジェニック動物が、ここで作製され、そして研究され、そして薬学的介入、遺伝子標的技術、アンチセンス療法、抗体療法などを含む可能性のある治療法を研究するためのモデルとして使用される。さらに、トランスジェニックインビトロ細胞株はまた、ここで、本発明に従って樹立され、そして疾患に関与する細胞内シグナル伝達系を解明するため、ならびに潜在的な治療化合物を試験および同定するために使用され得る。
【００６４】
さらに、本発明のトランスジェニック動物はまた、アルツハイマー病を促進および開始すると疑われている状態または環境危険（例えば、頭部外傷または毒性環境因子）を調査するために使用され得る。この場合、トランスジェニック動物は、特定の状態に曝露され、次いでＡＤをさらに引き起こすそして／または増強する状態の能力の指標として、神経行動学的減退、早過ぎる死、神経膠症などを決定するために観察される。
【００６５】
本発明のトランスジェニック動物は、アルツハイマー病のより詳細な特徴付けについて有用であり、進行性の神経病理の病原性および分子事象の配列の決定の解明を導く。トランスジェニック動物は、疾患の病理の種々の提唱された機構を研究するために有用であり、疾患のよりよい処置を導く。
【００６６】
本発明のトランスジェニックマウスはまた、ＡＤにおいて有益または有害のいずれかで役割を果たし得る以前に認識されていない遺伝子の同定のために有用である。候補遺伝子を保有するトランスジェニックマウスは、本発明のトランスジェニックマウスと交配され、そしてこのトランスジェニックのＡＤ関連形質に関する候補遺伝子の存在の効果が調査される。候補遺伝子は、アミロイド沈着および障害性うっ血性動作のようなＡＤ関連表現型を遅延または薄める場合、有益であるとしてスコア付けされる。逆に、候補遺伝子は、発現の齢を進行するかまたはアミロイド沈着および障害性うっ血性動作のようなＡＤ関連表現型の浸透を増強する場合、ＡＤの発生を支持するとしてスコア付けされる。
【００６７】
さらに、本発明のトランスジェニックマウスは、家族性ＡＤの潜在的な遺伝子治療（例えば、さらなるコピーの正常なプレセニリン遺伝子の投与による遺伝子治療）を試験するために有用である。
【００６８】
本発明は、トランスジェニックマウスの生成に限定されず、そしてヒトアルツハイマー病の非ヒト動物モデルを提供することが当業者によって理解される。このようなモデルは、胚発生、成長および発達の間のβＡＰＰおよびＡβペプチドの役割の同定、ならびにアルツハイマー病に関与するようなβＡＰＰおよびＡβペプチドの機能の理解を提供する。
【００６９】
マウスはしばしば、トランスジェニック動物モデルとして使用される。なぜなら、これらは、飼うのが容易であり、比較的安価で、そして繁殖が容易であるためである。しかし、他の非ヒトトランスジェニック動物（例えば、これらに限定されないが、サル、ヒツジ、ウサギおよびラット）がまた、本発明に従って作製され得る。トランスジェニック動物は、連続する世代に継代される導入遺伝子を保有する（すなわち、クローニングされた遺伝子が導入され、そして安定して組み込まれた）動物である。本発明において、ヒトＡＰＰ６９５ｃＤＮＡがクローニングされ、そして２つのＦＡＤ変異（「スウェーデン」変異（Ｋ６７０Ｎ、Ｍ６７１Ｌ）および「インディアナ」変異（Ｖ７１７Ｆ））を含むように改変された。次いで、この構築物をマウスのゲノムに安定して組み込んだ。
【００７０】
本明細書中に詳細に説明される方法に加えて、特定の遺伝子配列を保有するトランスジェニック動物モデルを作製する方法がいくつか存在する。
【００７１】
ヒトＡＰＰ遺伝子配列の特定の変更／変異の生成は、１つの戦略である。変更は、インビトロで使用される種々の酵素学的方法および化学的方法によって達成され得る。最も一般的な方法の１つは、ＤＮＡ配列における正確に設計された欠失、挿入および点変異を作製するために、変異原として特定のオリゴヌクレオチドを使用する方法である。第２に、野生型ヒト遺伝子および／またはヒト化マウス遺伝子は、相同組換えによって挿入され得る。野生型または変異または人工プロモーターエレメントを使用するゲノムまたはミニ遺伝子構築物として、変更されたかまたは変異（単一または複数の）ヒト遺伝子を挿入することはまた可能である。内因性マウス遺伝子のノックアウトは、相同組換えによって内因性遺伝子の人工的に改変されたフラグメントの挿入によって達成され得る。この技術において、変異対立遺伝子は、相同組換えによって、胚性幹細胞に導入される。研究されている遺伝子の１つの対立遺伝子においてノックアウト変異を含む胚性幹細胞は、初期マウス胚に導入される。得られたマウスは、移植ＥＳ細胞および宿主細胞の両方に由来する組織を含むキメラである。キメラマウスを、変異が生殖系列に組み込まれたか否かを評価するために、交尾させる。各々がノックアウト変異にヘテロ接合性であるこれらのキメラマウスを、ホモ接合性のノックアウトマウスを生成するために交尾させる。
【００７２】
遺伝子ノックアウトを生成する遺伝子標的化は、変更されそして正常なコピーを置換するために使用される遺伝子の機能をインビボで評価することを可能にする。改変としては、変異終止コドンの挿入、ＤＮＡ配列の欠失、またはＣｒｅリコンビナーゼのような酵素によって認識される組換えエレメント（ｌｏｘ ｐ部位）の包含が挙げられる。Ｃｒｅ−ｌｏｘ系は、所定の遺伝子の除去または遺伝子配列の特定の一部の除去を可能にする。
【００７３】
遺伝子を不活化するために、マウス配偶子の化学的またはＸ線変異誘発が適用され、その後受精が続く。次いで、異種接合性子孫が、サザンブロッティングによって同定され得、投薬による１つの対立遺伝子の喪失、またはＲＦＬＰマーカーを使用する１つの親対立遺伝子を遺伝することの失敗を示す。
【００７４】
トランスジェニックマウスを作製するために、目的のヒト遺伝子の変更されたバージョンは、標準的技術の卵母細胞の微小注入もしくはトランスフェクションまたは幹細胞へのトランスフェクションを使用して、マウス生殖系列に挿入され得る。あるいは、内因性遺伝子を不活化または置換することが望ましい場合、幹細胞を使用する相同組換えは、上記のように適用され得る。
【００７５】
卵母細胞注入について、１つ以上のコピーの変更／変異ヒトＡＰＰ遺伝子配列は、ちょうど受精したマウス卵母細胞の前核に挿入され得る。次いで、この卵母細胞は、偽妊娠仮母親に再移植される。次いで、生産マウスは、変更されたＡＰＰ遺伝子配列の存在についてテールＤＮＡの分析を使用して成分についてスクリーニングされ得る。導入遺伝子は、ＹＡＣもしくは染色体フラグメントとして注入される完全ゲノム配列、天然プロモーターもしくは異種プロモーターのいずれかを有するｃＤＮＡ、または最適な発現に必要であることが見出されている全てのコード領域および他のエレメントを含むミニ遺伝子のいずれかであり得る。
【００７６】
初期胚のレトロウイルス感染はまた、変更された遺伝子を挿入するために行なわれ得る。この方法において、変更された遺伝子は、キメラを生成するための発生の初期段階の間にマウス胚を直接感染するために使用されるレトロウイルスベクターに挿入され、キメラのいくつかは、生殖系列伝達を生じる。
【００７７】
幹細胞を使用する相同組換えは、遺伝子移入細胞のスクリーニングが、まれな相同組換え事象を同定することを可能にする。一旦同定されると、これらは、マウス胚盤胞の注入によってキメラを生成するために使用され、そして得られたマウスの比率は、組換え系統からの生殖伝達を示す。この遺伝子標的化方法論は、遺伝子の不活化が望ましい場合、特に有用である。例えば、遺伝子の不活化は、選択マーカーに隣接するエキソン由来の配列を含むＤＮＡフラグメントを設計することによって、行なわれ得る。相同組換えは、エキソンの真ん中にマーカー配列の挿入を生じ、遺伝子を不活化する。次いで、個々のクローンのＤＮＡ分析は、相同組換え事象を認識するために使用され得る。
【００７８】
目的の変異を含むオリゴヌクレオチドを注入すること、および得られた細胞をＰＣＲによってスクリーニングすることによって、マウス生殖系列において変異を作製することはまた可能である。
【００７９】
当業者は、本発明のトランスジェニック哺乳動物を生成するために使用されるような核酸構築物が、脳における増加したＡβ生成を生じる変異ＡＰＰ６９５タンパク質をコードする任意の適切な核酸配列を含み得ることを容易に理解する。このような核酸配列は、好ましくは全長変異ＡＰＰ６９５ｃＤＮＡであるが、タンパク質の所望の変異形態が発現されそしてＡβ生成が顕著に増加する限り、このような配列の他の変更された誘導体を含み得る。
【実施例】
【００８０】
（実施例）
実施例は例示のために記載され、発明の範囲を制限することを意図していない。
【００８１】
この開示および実施例において言及されているが、明確には記載されていない合成化学、タンパク質生化学およびペプチド生化学、分子生物学、組織学ならびに免疫学の方法は、科学論文に報告されそして当業者に周知である。
【００８２】
（実施例１−ＴｇＣＲＮＤ８トランスジェニックマウス）
９０塩基対の５’非翻訳領域、６９５アミノ酸残基コード領域（「ＡＰＰ６９５」）および２７１ｂｐの３’非翻訳領域を含むヒトβ−アミロイド前駆体タンパク質（１）（βＡＰＰ）ｃＤＮＡカセットを変異誘発して、互いにシスの、家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）に関連する２つの変異を導入した。第一の変異は、隣接する２つのコドンに影響するジヌクレオチドの変化（ＡＰＰ７７０転写物のコドン／ヌクレオチド番号付け（１）を用いると、ヌクレオチド１７８５および１７８６でＫＭ６７０／６７１ＮＬ：ＧＡ→ＴＣ）である、「Ｓｗｅｄｉｓｈ」変異（２）であった。第二の変異は、Ｖ７１７Ｆ置換を産生する単一ヌクレオチドの変化（３）であった（ＡＰＰ７７０転写物（１）のコドン／ヌクレオチド番号付けを用いると、ヌクレオチド１９２４でＧ→Ｔ）。Ｋｕｎｉｔｚ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒドメインをコードするエキソン７および８を欠くＡＰＰ６９５転写物は、脳で発現される主要な転写物である。βＡＰＰ二重変異体ｃＤＮＡカセットを、プリオンタンパク質コスミド発現ベクターｃｏｓＴｅｔ（１０）に挿入した。
【００８３】
生じた組換え体コスミドクローンを培養で増殖させ、溶解してスーパーコイルＤＮＡを得て、そしてＰｒＰ遺伝子調節エレメントおよびＡＰＰコード領域を含む哺乳動物のＤＮＡ挿入物を、制限エンドヌクレアーゼＮｏｔ１を用いた消化によって、この分子クローンの原核生物ベクター配列から切り出した。アガロースゲル電気泳動して、このトランスジーンＮｏｔ１ ＤＮＡフラグメントを精製した後、精製したＤＮＡを、標準のプロトコール（２９）を用いてマウスの受精した卵母細胞（（Ｃ３Ｈマウス×Ｃ５７ＢＬ６マウス）の交配から誘導した）にマイクロインジェクションした。養母に移植後、生産児うちトランスジーン陽性子孫を、ＳｙｒｉａｎハムスターＰｒＰ遺伝子（３０）の３’非翻訳領域由来のＤＮＡプローブフラグメントを用いて、尾部のＤＮＡのハイブリダイゼーション分析によってスクリーニングした。
【００８４】
ＡＰＰ特異的抗体（Ｓｅｎｅｔｅｋ Ｉｎｃ，，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を、トランスジーン陽性の子孫でのトランスジーンの発現を確証するために用いた。０．３２Ｍショ糖中で作製した１０％脳ホモジネートを、Ｌａｅｍｌｌｉ緩衝液で希釈し、超音波処理し、そして１０〜２０％トリシン（ｔｒｉｃｉｎｅ）勾配ゲル（Ｎｏｖｅｘ）で電気泳動した。ニトロセルロースに転写後、ヒトＡＰＰおよびＰＳ１を、Ｃ末端特異的ＭａｂおよびＮ末端特異的Ｍａｂを用いて検出し、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって発色させた。結果を図６に示す。１２０ｋＤａおよび１００ｋＤａの全長の成熟ＡＰＰホロタンパク質および未成熟ＡＰＰホロタンパク質に加えて、ウエスタンブロット分析は、ＴｇＣＲＮＤ８マウスの脳の抽出物における、より低い分子量種およびより低い発現レベルのＡＰＰを示した。６Ｅ１０抗血清（α−セクレターゼ切断部位に対してＮ末端に位置する）および抗体３６９を用いたこれらの種の検出は、これらがＡＰＰのＣ末端に由来することを示す。これらは、過剰発現によって高レベルで蓄積され、そしてβ−セクレターゼ部位（いわゆるβ−ｓｔｕｂ）で始まるＣ末端フラグメント（ＣＴＦ）に対応する、ＡＰＰプロセシング中間体のようであった。老年期のＴｇＣＲＮＤ８マウスでは、動物が老化するのにつれて増加するレベルの４ｋＤａの種もまた、検出されたが、齢の一致した非Ｔｇ同腹仔でもＴｇ２５７６マウスでもこれは検出されなかった。４ｋＤａの免疫応答性種は、これらの動物の生涯の間に高レベルに蓄積するＡβペプチドに対応する。
【００８５】
卵母細胞へのＤＮＡトランスジーンのマイクロインジェクションは、上に記載のように、マウスゲノム中にトランスジーンの無作為な挿入を導く。挿入したトランスジーンの制限エンドヌクレアーゼマッピングは、これらが、頭−尾（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ）アレイで挿入され、１アレイあたりのトランスジーン数（コピー数）は、一倍体ゲノムあたり１００を超えるまでトランスジーンコピーに達することを証明する（２４）。
【００８６】
ヒトＡＰＰを発現するトランスジェニックマウスは、最適なアミロイド生成のために、好ましくは内在性発現レベルの５〜６倍のＡＰＰの過剰発現を示すはずである。脳でのＡＰＰ発現を、マウスＡＰＰおよびヒトＡＰＰの両方を認識する２２Ｃ１１（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）のようなＡＰＰ指向性抗体を用いたウエスタンブロット分析によって決定する。
【００８７】
プリオンタンパク質ｃｏｓ．Ｔｅｔベクターについての以前の研究は、トランスジーンの発現レベルがコピー数と並行して増加するような、トランスジーンアレイの位置非依存性の発現を示している（４，４０）。それゆえ、このベクターを使用する場合、所望の高レベルのＡＰＰ発現を有するトランスジェニックマウスを、高いトランスジーンコピー数（好ましくは、少なくとも３０コピー）を有するトランスジーン陽性マウスを、ハイブリダイゼーション分析（３０）で同定することによって、最初に同定し得る。
【００８８】
ＦＶＢ／Ｎ遺伝的バックグラウンドを有するマウスは、ＡＰＰ過剰発現のほとんど明らかになっていない影響に起因して、成体早期で早死にする傾向があるとはいえ、この傾向は、Ｃ５７系統およびＣ３Ｈ系統由来の遺伝的バックグラウンドにおいて弱まる。それゆえ、ＴｇＣＲＮＤ８マウスは、Ａβペプチドレベルを、生存率を損なうことなしに許容させ得ることを確立する。
【００８９】
（ＴｇＣＲＮＤ８マウスでの神経病理学的変化）
免疫染色を、ＡＰＰのＡβタンパク質分解フラグメントと反応するヒト特異的抗体４Ｇ８を用い、ホルマリン固定し、パラフィンワックス包埋した脳材料からの切片を用いて行った。この免疫組織化学的手順のための標準プロトコールは、別に記載されている（１７，２０，２３）。単離したプラーク沈着物は、生後６０日という早期にＴｇＣＲＮＤ８マウスにおいて可視化になり、びまん性アミロイド斑の頑強な沈着物は９０日齢から可能になる。高密度の中心を有する斑は、４〜５ヶ月齢で明らかであり、これらの型の沈着物の多くは、コンゴ−レッド（β−シートリッチアミロイド沈着物中にインターカレートされる試薬）で染まり、偏光下で緑／金複屈折をもたらす。同様の複屈折沈着物は、ヒトＡＤの脳サンプルに存在する。アミロイド沈着物は、ＴｇＣＲＮＤ８マウスにおいて、ヒトアルツハイマー病によって重大な影響を受ける領域である海馬および大脳皮質（特に前頭皮質）に顕著であった。散発性ＡＤでは通常免れるが、ＡＤの重症な早発型症例でのびまん性Ａβ沈着物によって穏やかに影響を受け得る小脳もまた、１年齢のＴｇＣＲＮＤ８マウスおよび６ヶ月齢で変異体ＰＳ１または変異体ＰＳ２を同時発現するＴｇＣＲＮＤ８マウスにおいて、穏やかに影響を受ける。
【００９０】
ＡＰＰは、（ハムスターＰｒＰ遺伝子と同様に）ＴｇＣＲＮＤ８マウスにおいて全身性に発現したが、腎臓、骨格筋、および心筋はＰｒＰ ｍＲＮＡの発現が知られている部位であるにもかかわらず、アミロイド沈着物は、顕症のＣＮＳ沈着物を有する老化した動物の腎臓、骨格筋、および心筋における免疫染色によって視覚的に明らかではなかった。
【００９１】
（ＴｇＣＲＮＤ８マウスでの行動的変化）
ＴｇＣＲＮＤ８マウスの空間学習を、（３２）に記載の十分に確立されたパラダイムのＭｏｒｒｉｓ水迷路（３１）を用いて評価した。ＴｇＣＲＮＤ８マウスの行動分析は、１１週齢という早期の水迷路の場所識別（同じ空間的位置の隠したプラットフォーム）バージョンにて評価された、それらの空間情報獲得の重大な認知欠損を明らかにした。トレーニングの間、マウスは有意に遅い学習速度を示し、この学習速度は、より長いエスケープ潜時および探索通路ならびに隠したプラットフォームを含む四分区画の偶然のレベル探索に反映される（図１）。ＴｇＣＲＮＤ８マウスはまた、探索足跡（ｐｒｏｂｅ ｔｒａｉｌ）で試験する場合、空間記憶の欠損を示した。この試行の間、隠したプラットフォームを取り外し、そしてマウスに６０秒間その位置を探索させた。非Ｔｇマウスは、プラットフォーム位置に対する明らかで選択的な空間の偏りを示し（図１，ＥおよびＦ）、ＴｇＣＲＮＤ８マウスの探索は、非Ｔｇ同腹仔よりも全体にわたりかつＴＱ四分区画に隣接して含まれ、そしてプラットフォーム位置の周りの環状部を有意に少なく横断した。ＡＰＰ陽性マウスおよび非Ｔｇマウスの両方の泳ぐ能力は、試験の間は同等であり、従って、学習の尺度は偏らなかった。
【００９２】
（実施例２−ＴｇＣＲＮＤ８×ＴｇＰＳ１（Ｌ２８６Ｖ）１２７４二重トランスジェニックマウス）
ＴｇＣＲＮＤ８マウスを、ＴｇＰＳ１（Ｌ２８６Ｖ）系統１２７４と称されるＦＡＤ関連変異体プレセニリン１遺伝子を有するトランスジェニックマウスと交配させた。これらの子孫を離乳させ、そしてゲノムＤＮＡの調製のために尾部の生検を取り出した。精製された尾部のＤＮＡを、ナイロン膜上にニ連の「ドット−ブロット」アレイで固定化し、そしてｃＤＮＡクローンから切り出したヒトＡＰＰコード領域の遺伝子特異的プローブまたはｃＤＮＡクローンから切り出したヒトＰＳ１クローニング領域プローブフラグメントを用いてハイブリダイズさせた。これらのＤＮＡ制限フラグメントを、α−３２ｐ−ｄＣＴＰ（３３）で無作為にプライミングすることによって標識した。二連のナイロン膜を、ＡＰＰまたはＰＳ１のいずれかのハイブリダイゼーションプローブとともにインキュベートし、そして６５℃の温度で０．１％ ドデシル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｐｈａｔｅ）、０．１×クエン酸ナトリウム生理食塩水の溶液（これは、マウスのゲノム内で内在性ＰＳ１遺伝子およびＡＰＰ遺伝子に由来するシグナルを最少化するような「ストリンジェント」なハイブリダイゼーション後の洗浄に対応する）中で洗浄した。二重トランスジェニックマウスを、対応する尾部のＤＮＡサンプルがＡＰＰ遺伝子特異的プローブおよびＰＳ１遺伝子特異的プローブの両方にハイブリダイズするという事実によって同定した。
【００９３】
（ＴｇＣＲＮＤ８×ＴｇＰＳ１（Ｌ２８６Ｖ）１２７４二重トランスジェニックマウスでの神経病理学的変化）
アミロイド沈着は、生じた二重トランスジェニックマウスにおいて増強された。これらのマウスは、６２日齢まで、死後のヒトＡＤの脳に非常に似ているアミロイド負荷量を示した。
【００９４】
老化したマウスにおいて、アミロイド沈着物は、一連トランスジェニックマウスにおいて通常免れる構造体（例えば、小脳）に及ぶに十分に顕症であった。
【００９５】
（実施例３−ＴｇＣＲＮＤ８ｘＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）１３７９二重トランスジェニックマウス）
ＴｇＣＲＮＤ８マウスをまた、同様のプリオンタンパク質コスミド発現ベクターｃｏｓＴｅｔ中に変異プレセニリン２対立遺伝子を発現する、ＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）系統１３７９と名づけたトランスジェニック系統と交配した。二重トランスジェニックマウスＴｇＣＲＮＤ８ｘＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）１３７９マウスは、ＰＳ２コード領域ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブを、ＰＳ１コード領域ハイブリダイゼーションプローブの代わりに使用したことを除いて、上に記載のＴｇＣＲＮＤ８ｘＴｇＰＳ１（Ｌ２８６Ｖ）１２７４マウスとして遺伝子型を特定した。
【００９６】
これらの二重トランスジェニックマウスは、生後９１日までにＡβペプチドに対して免疫反応性の球状プラークの形態で、大量のＣＮＳのアミロイド沈着を呈した。これらのアミロイド沈着は、ヒトアルツハイマー病によって重大な影響を受ける領域である海馬および大脳皮質に局在した。通常、小脳は重症な早発型アルツハイマー病の症例においてのみ、散在性Ａβ沈着によって影響を受け；これは、マウスにおいて最も重いプラーク負荷で影響を受ける。
【００９７】
（ＴｇＣＲＮＤ８ｘＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）１３７９二重オトランスジェニックマウスでの行動変化）
ＴｇＣＲＮＤ８ｘＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）１３７９二重トランスジェニックマウスを２ヶ月齢で試験し、そして空間学習の獲得において４０％範囲内にエフェクトサイズを有する有意な認知欠陥を示した（図２、パネルＡおよびＢ）。しかしながら、以下の逆試験の間、最初は下位であったけれども、この二重トランスジェニックマウスは、試験の最後まで比較し得る能力を示した（導入遺伝子型によって説明される分散の約２０％）（図２、パネルＣおよびＣ）。５ヶ月齢での再試験の間、同様の二重トランスジェニックマウスは、獲得試験および逆試験の間に有意に高い学習欠陥を示した（それぞれ６０％および７０％の導入遺伝子型に起因するエフェクトサイズ）（図２、パネルＥおよびＦ）。また、この二重トランスジェニックマウスは、任意の年齢で試験したこれらの泳ぐ速度において、ＴｇＰＳ２（ｍ２３９Ｖ）１３７９マウスと相違しなかった。変異したＰＳ２遺伝子の存在中の変異したヒトＡＰＰの発現は、同系統の同様の組み合わせから由来した非トランスジェニックマウスと同様の様式で行動するＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）１３７９マウスの能力と比較して、２ヶ月齢程度の早さで空間学習および記憶の障害を起こす。この障害は加齢に伴いかつ５ヶ月齢までに進行する。このマウスは、常に新しい空間情報の獲得の欠陥を示す。
【００９８】
（実施例４−ＴｇＣＲＮＤ８ｘＴｇ（Ｍ１４６Ｌ＋Ｌ２８６Ｖ）６５００二重トランスジェニックマウス）
ＴｇＣＲＮＤ８マウスを、ＰＳ１（Ｍ１４６Ｌ＋Ｌ２８６Ｖ）の２つの変異を有するトランスジェニックマウスと交配した（３４）。このＰＳ１二重変異体マウスを、先に記載のように（３５）、標準プロトコールによって作製した。二重トランスジェニックマウスを、上に記載のＴｇＣＲＮＤ８ｘＴｇＰＳ１（Ｌ２８６Ｖ）１２７４二重トランスジェニックマウスのための、２つの独立したＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーションによる尾部のＤＮＡの遺伝子型分析によって同定した。
【００９９】
生じた２つの二重トランスジェニックマウスは、４３日齢までに多発性の散在性Ａβ（ＡＢ）アミロイドプラークを呈し、１ヶ月齢までに皮質におけるＡβ（ＡＢ）アミロイド沈着の斑点を示した。４３日齢で現れるこのプラークのいくつかは、コンゴ−レッド色素性である（すなわち、コンゴ−レッド試薬で染色し得る）。
【０１００】
（実施例５−ＴｇＣＲＮＤ８マウスでのＡβに対する能動免疫は認知欠陥を変化させる）
ＴｇＣＲＮＤ８マウスの群および非トランスジェニック同腹仔の群を、Ｓｃｈｅｎｋら（３６）による記載のように、合成Ａβ４２ペプチドで免疫した。ＴｇＣＲＮＤ８マウスおよび非トランスジェニック同腹仔のコントロール群を、コントロールアミロイド生成性ペプチド（糖尿病の病因と関連する島状のアミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ））で免疫した。水迷路試験でのこれらの２つのトランスジェニック群の能力を、上に記載のように、非Ｔｇ同腹仔の能力と比較した。この結果を図３に示す。
【０１０１】
図３に見えるように、Ａβ４２ペプチドを用いた免疫は、免疫の初期段階でＴｇＣＲＮＤ８マウスの認知障害を減衰した。Ａβ４２または１ＡＰＰを用いて免疫にしたＴｇＣＲＮＤ８マウス（６週齢で免疫を開始した）の水迷路能力を、１１週齢で試験した。Ａβ４２ペプチドを用いた免疫は、非Ｔｇ同腹仔と比較して、逃避潜伏時間の長さ（パネルＡ）および通路探索の長さ（パネルＤ）によって計測したように、ＴｇＣＲＮＤ８マウスの認知欠陥を有意に減少させた。Ａβ４２で免疫したＴｇＣＲＮＤ８マウスは、非Ｔｇマウスよりも全体に長い逃避潜伏時間（パネルＡ）および通路探索（パネルＤ）、（潜伏時間および通路それぞれ、Ｆ（１，３０）＝９．７１，ｐ＜０．０１；Ｆ（１，３０）＝１０．９，ｐ＜０．０１）を示し、この違いは、これらの最初のより長い探索（群ｘ日数の相互作用：潜伏時間について、Ｆ（４，１２０）−２．８３，ｐ＜０．０５；通路について、Ｆ（３，１２０）＝４．７３，ｐ＜０．０１）に起因した。トレーニング最後の３日間のこれらの能力比較は、群間に有意差を示さなかった（潜伏時間について、Ｆ（１，３０）＝０．６４，ｐ＞０．０５；通路について、Ｆ（１，３０）＝１．２４，ｐ＞０．０５）。Ａβ４２で免疫したＴｇＣＲＮＤ８マウスは、ＴＱを探索する傾向はわずかに少ないが（Ｆ（１，３０）＝３．７１，ｐ＝０．０６，パネルＥ）、それらの泳ぐ速度（パネルＧ）は、非Ｔｇマウスと有意な差（Ｆ（１，３０）＝１．３３，ｐ＞０．０５）がないことを示した。ＩＡＰＰで免疫したＴｇＣＲＮＤ８マウスは、これらの非Ｔｇ同腹仔より有意に長い逃避潜伏時間（パネルＢ）および通路探索（パネルＣ）を示した（潜時について、Ｆ（１．２６）＝３９．９，ｐ＜０．００１；通路について、Ｆ（１，２６）＝４３．９，ｐ＜０．００１）。トランスジェニックマウスは、非Ｔｇマウスと最初の探索において差異はなかったけれども、これらはトレーニングの間に能力を改善しなかった（群ｘ日数の相互作用：潜伏時間について、Ｆ（４，１０４）＝６．３１，ｐ＜０．００１；通路について、Ｆ（４，１０４）＝５．６９，ｐ＜０．００１）。これらはまた、標的四分区画の探索に有意にわずかな時間を費やしたが（Ｆ（１，２６）＝７．３９，ｐ＜０．０５，パネルＦ）、これらの泳ぐ速度は免疫によって影響を受けなかった（Ｆ（１，２６）＝１．７３，ｐ＞０．０５，パネルＨ）。
【０１０２】
まとめると、６週でのＡβ４２ペプチドを用いたＴｇＣＲＮＤ８マウスの免疫に続く８週での追加免疫は、１１週齢で施行した水迷路のパラダイムにおいて、ＴｇＣＲＮＤ８マウスの認知能力を有意に改善した。一方、ＩＡＰＰで免疫したマウスは、非Ｔｇ同腹仔と比較して空間情報の獲得において有意に障害を示し（図３）、そしてこの障害は、非免疫のＴｇＣＲＮＤ８マウスにおいて見られるのと類似の性質であった（データは示していない）。
【０１０３】
Ａβ４２またはＩＡＰＰペプチドを用いた免疫は、このマウスの泳ぐ能力に影響しなかった。これらの発見は、Ａβ４２を用いた免疫（コントロールＩＡＰＰペプチドではなく）が、水迷路での能力改善し、そしてこの改善が、海馬のＡβアミロイドプラークの最初の沈着が起こる時期と一致し得ることを示す。これらの発見はまた、ＴｇＣＲＮＤ８における認知の欠陥が、不可逆性の認知欠陥に起因しないことを確立する。
【０１０４】
本発明は、明細書中に記載の実施形態の特徴で制限されないが、全ての改変および修飾を特許請求の範囲内に含む。
【０１０５】
【数１−１】
【０１０６】
【数１−２】
【０１０７】
【数１−３】
【０１０８】
【数１−４】
【０１０９】
【数１−５】
【０１１０】
【数１−６】
【０１１１】
【表１】
【０１１２】
【表２】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、アルツハイマー病を含む、神経変性性障害のトランスジェニック非ヒト動物モデルに関する。より詳細には、本発明は、アルツハイマー病の病理モ機構の特徴づけ、ならびに診断、治療および治療用化合物の開発を容易にするマウスモデルに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
以下の説明において、参考は、本明細書の巻末に列挙する特定の文献引用に対してなされており、その全てが本明細書において参考として援用されている。
【０００３】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、痴呆の最も一般的な原因であり、おそらく遺伝的および環境的決定要因を含む、複雑な病因を有する。アルツハイマー病は、アミロイドβペプチド（Ａβ）から形成された脳のアミロイド沈着、神経欠損、および神経原線維変化（ＮＦＴ）として公知の細胞内沈着（微小管結合蛋白質タウ（τ）の高リン酸化形態から構成される）によって特徴付けられる。
【０００４】
多様な家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）家系の遺伝子解析によって、アミロイドβ−ペプチド（Ａβ）の生合成が、この疾患の病因において共通する特徴であることが示されている。第２１染色体に関連した家系の場合、変異はエンドプロテアーゼ部分に隣接し、この変異ではＡβが、アルツハイマーアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）から切り取られるが、プレセニリン１および２における変異は、ＡβのＣ末端境界（いわゆるγセクレターゼ部位）でＡＰＰの切断を強化すると考えられる。第１７染色体上のタウ遺伝子は、ＡＤでは変異していないが、ミスセンス置換およびスプライス部位変異が、ＡＤに対するいくつかの病理的に類似性の条件（例えば、前頭側頭痴呆）で存在する。
【０００５】
この遺伝子データによって、Ａβ生合成が、ＮＦＴの生成において最高に達する病理的経路の上流に存在することが示される。初期の議論は、ＡβアミロイドまたはＮＦＴのいずれが神経の欠損および機能不全を生じるかということに集中していたが、現在では、両方のタイプのタンパク質凝集とも毒性であってＡＤの臨床的表現型に寄与しているようにみえる。
【０００６】
天然に存在する動物のＡＤ形態は存在しないが、この疾患のトランスジェニック動物モデルは、ヒト疾患における重要な病理的事象を明確にし、そして順序付ける能力を有する。しかし、労力の大きさにもかかわらず、満足なモデルはほとんど存在しない。
【０００７】
特許文献１は、ヒトまたはマウスのＡＰＰ６９５（野生型か、または「スウェーデン型」変異を有するかのいずれか）を発現し、そして一般に出生から１年以内に進行性の神経学的障害を発症するトランスジェニックマウスに関する。特許文献２は、ヒトＡＰＰのカルボキシ末端部分の９９〜１０３アミノ酸をコードする導入遺伝子を有するアルツハイマー病の動物モデルに関する。特許文献３は、トランスジェニックマウスであって、そのゲノムが神経フィラメント遺伝子のエキソンＩに挿入されたヒトβＡＰＰのカルボキシ末端の１００アミノ酸をコードするＤＮＡ配列を含むトランスジェニックマウスに関する。特許文献４は、スウェーデン型変異を有するヒトＡＰＰ７５１をコードする導入遺伝子を保有するトランスジェニックマウスに関する。
【０００８】
特許文献５は、ＡＤのトランスジェニック動物モデルに関する。ここでは、この動物は、変異プレセニリン１導入遺伝子、およびＡＰＰ６９５導入遺伝子（スウェーデン型変異を保有する）の両方を保有し、かつ発現する。
【０００９】
これらのモデルのいくつかは、生理学的に適切な経路によって、ＡＰＰおよび／またはその代謝体を生成することができず、そしてその警告を適用しない場合、このトランスジェニック動物は、ＡＤ表現型の特定の側面しか示し得ない。神経病理学に関して、ＡＤにおいてみられるアミロイド沈着に非常に密接に類似しているアミロイド沈着、選択的神経欠損（ある場合には）、およびタウの高リン酸化が存在し得るが、ＮＦＴの沈着は存在しない。さらに、これらの神経病理学的異常は、８〜９ヶ月齢まで、または６ヶ月齢まで（二遺伝子（ｂｉｇｅｎｉｃ）またはホモ接合性の動物の場合）出現し得ない。これらのモデルの作成において遭遇する他の問題としては、ＡＰＰの過剰発現に起因する新生児死亡率、複雑な遺伝子背景の使用、および一般には明確な証拠のない進行性の認知機能不全が挙げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第５，８７７，３９９号明細書
【特許文献２】米国特許第６，０３７，５２１号明細書
【特許文献３】米国特許第５，８９４，０７８号明細書
【特許文献４】米国特許第５，８５０，００３号明細書
【特許文献５】米国特許第５，８９８，０９４号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、ヒトＡＤ表現型の重要な側面を迅速に示すＡＤのトランスジェニック動物モデルの必要性が存在する。これによって動物は長期間維持される必要がなくなり、そして診断および治療の化合物が開発され、そしてさらにかなり迅速にそしてコストがかからずにスクリーニングできる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
本発明は、トランスジェニック哺乳動物を含むＡＤの新しい動物モデルに関する。この動物モデルは、好ましい実施形態において、ＴｇＣＲＮＤ８と名付けられたトランスジェニックマウスを含むが、このトランスジェニックマウスは、３ヶ月齢までにＣＮＳにおいて、高レベルのＡβ合成およびアミロイド沈着を示す。さらに、ＴｇＣＲＮＤ８マウスは、アミロイド沈着が開始する時点までに認知の変化を示す。本発明はまた、アルツハイマー病のＴｇＣＲＮＤ８トランスジェニック動物モデルの生成のための方法を提供する。
アルツハイマー病のＴｇＣＲＮＤ８トランスジェニックマウスモデルの開発によって、この疾患の病因は、さらに良好に理解され得、そして有効な薬物治療を含む、可能性のある処置が開発され、そして試験され得る。
【００１３】
トランスジェニックＴｇＣＲＮＤ８マウスモデルを、ＣＮＳにおけるＡβアミロイドタンパク質の発現、ならびに組織学的分析、神経学、および行動不全に基づく、天然に存在するアルツハイマー病表現型に対する類似の大きさによって、特徴付ける。
【００１４】
ＡＰＰ遺伝子は、選択的スプライシングを受けて、３つの共通のアイソフォームを生成する。７７０アミノ酸を含む最長のアイソフォーム（ＡＰＰ７７０）、および７５１アミノ酸を含む２番目の長さのアイソフォーム（ＡＰＰ７５１）は、ほとんどの組織で発現される。６９５アミノ酸を含む３番目の転写物（ＡＰＰ６９５）は、脳において主に発現される。慣例により、より短いアイソフォームのコドン位置をいう場合でも、最長のアイソフォーム（ＡＰＰ７７０）のコドン番号付けを用いる。
【００１５】
ＴｇＣＲＮＤ８トランスジェニックマウスは、脳特異的ＡＰＰ６９５アイソフォームの変異形態を発現する導入遺伝子を含む；この導入遺伝子は、「スウェーデン型（Ｓｗｅｄｉｓｈ）」ＡＰＰ変異および「インディアナ型（Ｉｎｄｉａｎａ）」ＡＰＰ変異の両方を保有する。
【００１６】
変異体Ｋ５９５Ｎ／Ｍ５９６Ｌ（スウェーデン型変異）およびＶ６４２Ｆ（インディアナ型変異）を含む（ＡＰＰ６９５のコドン番号付けを用いる）ＡＰＰ６９５のｃＤＮＡを生成した。これらおよび他のＡＰＰ変異は、さらに一般的なＡＰＰ７７０コドン番号付けシステムを用いて（すなわち、これらの２つの変異である、Ｋ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ（スウェーデン型変異）およびＶ７１７Ｆ（インディアナ変異）について）、一般に本明細書（特許請求の範囲を含む）において言及されている。
【００１７】
二重変異体ＡＰＰ６９５ｃＤＮＡカセットをコスミド発現ベクターであるｃｏｓＴｅｔに挿入した。このベクターは、Ｓｉｒｉａｎ（シリア）ハムスタープリオンタンパク質遺伝子プロモーターを含む。次いで、このベクターをマウスの卵母細胞にマイクロインジェクションして、ＴｇＣＲＮＤ８と名付けられたトランスジェニック系統を作製した。これらのマウスは、３ヶ月齢までに複数の散在性のアミロイド沈着を示し、この時点で空間学習における欠損が明らかになる。
【００１８】
本発明のさらなる局面に従って、ＴｇＣＲＮＤ８マウスを、ＡＤ関連変異を保有する種々の他のトランスジェニックマウスと交配して、さらに増強されたＡＤ関連神経病理を示す、二重トランスジェニック（ｂｉ−ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ））マウスを産生する。
【００１９】
１つの実施形態に従って、本発明は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、そのゲノムは、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種アミロイド前駆体タンパク質６９５（ＡＰＰ６９５）ポリペプチドをコードしており、ここで、このポリペプチドの６７０位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、６７１位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして７１７位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そしてこの導入遺伝子が発現される、トランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。
【００２０】
好ましい実施形態に従って、上記の哺乳動物はマウスであり、そして上記異種ＡＰＰ６９５はヒトＡＰＰ６９５である。
【００２１】
さらなる実施形態に従って、トランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、以下：
（ａ）ゲノムが導入遺伝子を含む第一のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を、第二の遺伝子を含むゲノムを有する第二の非ヒト哺乳動物と交配して第一世代の子孫を産生する工程であって、この導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種アミロイド前駆体タンパク質６９５（ＡＰＰ６９５）ポリペプチドをコードしており、ここで、このポリペプチドの６７０位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、６７１位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして７１７位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そしてこの導入遺伝子が発現され、そしてこの第二の遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ少なくとも１つの選択された変異を有する選択されたタンパク質をコードする、工程；ならびに
（ｂ）この第一世代の子孫から、少なくとも１つの第一導入遺伝子および少なくとも１つの第二遺伝子を含むゲノムを有し、そしてこの少なくとも１つの第一導入遺伝子およびこの少なくとも１つの第二遺伝子の両方を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を選択する工程であって、この第一導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種ＡＰＰ６９５ポリペプチドをコードし、ここでこのポリペプチドの６７０位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、６７１位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして７１７位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そしてこの第二遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ少なくとも１つの選択された変異体を有する上記選択されたタンパク質をコードする、工程、
によって産生される、トランスジェニック非ヒト哺乳動物が提供される。
【００２２】
さらなる実施形態に従って、本発明は、以下：
（ａ）そのゲノムが導入遺伝子を含む第一のトランスジェニックマウスを、第二の遺伝子を含むゲノムを有する第二のマウスと交配して第一世代の子孫を産生する工程であって、この導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつヒトＡＰＰ６９５ポリペプチドをコードしており、ここで、このポリペプチドの６７０位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、６７１位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして７１７位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そしてこの導入遺伝子が発現され、そしてこの第二の遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ少なくとも１つの選択された変異を有する選択されたタンパク質をコードする、工程；ならびに
（ｂ）この第一世代の子孫から、少なくとも１つの第一導入遺伝子および少なくとも１つの第二遺伝子を含むゲノムを有し、そしてこの少なくとも１つの第一導入遺伝子およびこの少なくとも１つの第二遺伝子の両方を発現するトランスジェニックマウスを選択する工程であって、この第一導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種ＡＰＰ６９５ポリペプチドをコードし、ここでこのポリペプチドの６７０位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、６７１位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして７１７位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そしてこの第二遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ少なくとも１つの選択された変異を有するこの選択されたタンパク質をコードする、工程、
によって産生される、トランスジェニックマウスを提供する。
【００２３】
さらなる実施形態に従って、ＡＤの発生を防止または遅延する有効性について候補化合物をスクリーニングするための方法であって、以下の工程：
（ａ）本明細書に記載されたような第一のトランスジェニックマウスにおける、選択されたＡＤ関連表現型特徴の出現の前に、このマウスに対してこの候補化合物を投与する工程；および
（ｂ）このマウスにおいてこの選択されたＡＤ関連表現型特徴が出現する年齢を、この化合物を投与しなかった、同じタイプの第二のトランスジェニックマウスにおいてこの特徴が出現する年齢と比較する工程；
を包含し、
ここでこの第二のマウスにおいてこの特徴が出現した年齢と比べた、この第一のマウスにおいてこの特徴が出現した年齢の上昇は、この化合物の有効性を示す、方法が提供される。
【００２４】
さらなる実施形態に従って、アルツハイマー病の症状を寛解するのにおける有効性について候補化合物をスクリーニングするための方法であって、以下の工程：
（ａ）本明細書に記載のような第一のトランスジェニックマウスに対してこの候補化合物を投与する工程；
（ｂ）記憶試験または学習試験においてこのマウスの能力を決定する工程；および
（ｃ）このマウスのこの能力を、この化合物を投与しなかった、同じタイプの第二のトランスジェニックマウスの能力と比較する工程；
を包含し、
ここでこの第二のマウスの能力と比べた、この第一のマウスの改善された能力は、この化合物の有効性を示す、方法が提供される。
【００２５】
さらなる実施形態に従って、中枢神経系において異常なＡβ沈着を示すトランスジェニック非ヒト哺乳動物を産生する方法であって、以下：
（ａ）導入遺伝子をこの哺乳動物の受精した卵母細胞に導入する工程であって、この導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種アミロイド前駆体タンパク質６９５（ＡＰＰ６９５）ポリペプチドをコードしており、ここで、このポリペプチドの６７０位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、６７１位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして７１７位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されている、工程；
（ｂ）偽妊娠哺乳動物中にこの受精卵母細胞を移植する工程；
（ｃ）この受精卵母細胞を生きて誕生した子孫中で発育させる工程；および
（ｄ）ゲノムが導入遺伝子を含む子孫を選択する工程であって、この導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種アミロイド前駆体タンパク質６９５（ＡＰＰ６９５）ポリペプチドをコードしており、ここで、このポリペプチドの６７０位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、６７１位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして７１７位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そしてこの導入遺伝子が発現される、工程；
を包含する、方法が提供される。
【００２６】
さらなる実施形態に従って、異種アミロイド前駆体タンパク質６９５（ＡＰＰ６９５）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここでこのポリペプチドの６７０位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、６７１位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして７１７位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されている、ヌクレオチド配列が提供される。また、プロモーターに作動可能に連結されたこのようなヌクレオチド配列を含む、ベクターも提供される。
本発明はさらに、以下の項目を提供する。
（項目１）ゲノムが導入遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、該導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種アミロイド前駆体タンパク質６９５（ＡＰＰ６９５）ポリペプチドをコードしており、ここで、該ポリペプチドの６７０位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、６７１位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして７１７位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そして該導入遺伝子が発現される、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（項目２）前記哺乳動物がマウスである、項目１に記載のトランスジェニック哺乳動物。
（項目３）前記マウスが、（Ｃ３Ｈ×Ｃ５７ＢＬ６）×Ｃ５７マウスである、項目２に記載のトランスジェニックマウス。
（項目４）前記異種ＡＰＰ６９５がヒトＡＰＰ６９５である、項目３に記載のトランスジェニックマウス。
（項目５）前記マウスがその中枢神経系において異常なＡβ沈着を示す、項目４に記載のトランスジェニックマウス。
（項目６）前記動物が、アルツハイマー病関連の病状の加速された出現を示す、項目４に記載のトランスジェニックマウス。
（項目７）祖先として項目４に記載のトランスジェニックマウスを有する、トランスジェニックマウス。
（項目８）トランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、以下：
（ａ）項目１に記載の第一のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を、第二の遺伝子を含むゲノムを有する第二の非ヒト哺乳動物と交配して第一世代の子孫を産生する工程であって、該第二の遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ少なくとも１つの選択された変異を有する選択されたタンパク質をコードする、工程；ならびに
（ｂ）該第一世代の子孫から、少なくとも１つの第一導入遺伝子および少なくとも１つの第二遺伝子を含むゲノムを有し、そして該少なくとも１つの第一導入遺伝子および該少なくとも１つの第二遺伝子の両方を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を選択する工程であって、該第一導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種ＡＰＰ６９５ポリペプチドをコードし、ここで該ポリペプチドの６７０位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、６７１位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして７１７位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そして該第二遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ少なくとも１つの選択された変異を有する前記選択されたタンパク質をコードする、工程、
によって産生される、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（項目９）前記選択されたタンパク質が、プレセニリンであり、そして前記選択された変異がＡＤ関連変異である、項目８に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（項目１０）前記選択されたタンパク質が、低密度リポタンパク質レセプター関連遺伝子、α２−マクログロブリン遺伝子およびβ−セクレターゼ遺伝子からなる群より選択され、そして前記選択された変異がＡβプロセシング関連変異である、項目８に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（項目１１）前記動物がマウスである、項目１０に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物
（項目１２）トランスジェニックマウスであって、以下：
（ａ）項目４に記載の第一のトランスジェニックマウスを、第二の遺伝子を含むゲノムを有する第二のマウスと交配して第一世代の子孫を産生する工程であって、該第二の遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ少なくとも１つの選択された変異を有する選択されたタンパク質をコードする、工程；ならびに
（ｂ）該第一世代の子孫から、少なくとも１つの第一導入遺伝子および少なくとも１つの第二遺伝子を含むゲノムを有し、そして該少なくとも１つの第一導入遺伝子および該少なくとも１つの第二遺伝子の両方を発現するトランスジェニックマウスを選択する工程であって、該第一導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種ＡＰＰ６９５ポリペプチドをコードし、ここで該ポリペプチドの６７０位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、６７１位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして７１７位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そして該第二遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ少なくとも１つの選択された変異を有する該選択されたタンパク質をコードする、工程、
によって産生される、トランスジェニックマウス。
（項目１３）前記第二の遺伝子が、内因性変異遺伝子である、項目１２に記載のトランスジェニックマウス。
（項目１４）前記第二の遺伝子が、導入遺伝子である、項目１２に記載のトランスジェニックマウス。
（項目１５）前記第二の遺伝子が、ＡＤ関連アミノ酸置換を有する選択されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、項目１２に記載のトランスジェニックマウス。
（項目１６）前記選択されたタンパク質が、プレセニリンである、項目１５に記載のトランスジェニックマウス。
（項目１７）項目１２に記載のトランスジェニックマウスであって、以下：
（ａ）項目４に記載の第一のトランスジェニックマウスを、導入遺伝子を含むゲノムを有する第二のトランスジェニックマウスと交配して第一世代の子孫を産生する工程であって、該導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種プレセニリン２ポリペプチドをコードしており、ここで該ポリペプチドの２３９位のメチオニン残基がバリンで置換されている、工程；ならびに
（ｂ）該第一世代の子孫から、少なくとも１つの第一導入遺伝子および少なくとも１つの第二導入遺伝子を含むゲノムを有し、そして該第一導入遺伝子および該第二遺伝子の両方を発現するトランスジェニックマウスを選択する工程であって、該第一導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）ポリペプチドをコードし、ここで該ポリペプチドの６７０位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、６７１位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして７１７位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そして該第二導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種プレセニリン２ポリペプチドをコードし、ここで該ポリペプチドの２３９位のメチオニン残基はバリンで置換されている、工程、
によって産生される、トランスジェニックマウス。
（項目１８）項目１２に記載のトランスジェニックマウスであって、以下：
（ａ）項目４に記載の第一のトランスジェニックマウスを、導入遺伝子を含むゲノムを有する第二のトランスジェニックマウスと交配して第一世代の子孫を産生する工程であって、該導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種プレセニリン１ポリペプチドをコードしており、ここで該ポリペプチドの２８６位のロイシン残基がバリンで置換されている、工程；ならびに
（ｂ）該第一世代の子孫から、少なくとも１つの第一導入遺伝子および少なくとも１つの第二導入遺伝子を含むゲノムを有し、そして該第一導入遺伝子および該第二遺伝子の両方を発現するトランスジェニックマウスを選択する工程であって、該第一導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）ポリペプチドをコードし、ここで該ポリペプチドの６７０位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、６７１位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして７１７位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そして該第二導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種プレセニリン１ポリペプチドをコードし、ここで該ポリペプチドの２８６位のロイシン残基はバリンで置換されている、工程、
によって産生される、トランスジェニックマウス。
（項目１９）項目１２に記載のトランスジェニックマウスであって、以下：
（ａ）項目４に記載の第一のトランスジェニックマウスを、導入遺伝子を含むゲノムを有する第二のトランスジェニックマウスと交配して第一世代の子孫を産生する工程であって、該導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種プレセニリン１ポリペプチドをコードしており、ここで該ポリペプチドの１４６位のメチオニン残基がロイシンで置換されており、そして２８６位のロイシン残基がバリンで置換されている、工程；ならびに
（ｂ）該第一世代の子孫から、少なくとも１つの第一導入遺伝子および少なくとも１つの第二導入遺伝子を含むゲノムを有し、そして該第一導入遺伝子および該第二遺伝子の両方を発現するトランスジェニックマウスを選択する工程であって、該第一導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）ポリペプチドをコードし、ここで該ポリペプチドの６７０位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、６７１位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして７１７位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そして該第二導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種プレセニリン１ポリペプチドをコードし、ここで該ポリペプチドの１４６位置のメチオニン残基はロイシンで置換されており、そして２８６位のロイシン残基はバリンで置換されている、工程、
によって産生される、トランスジェニックマウス。
（項目２０）ＡＤの発生を防止または遅延するのにおける有効性について候補化合物をスクリーニングするための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）項目１〜１９のいずれか１項に記載の第一のトランスジェニックマウスにおける、選択されたＡＤ関連表現型特徴の出現の前に、該マウスに対して該候補化合物を投与する工程；および
（ｂ）該マウスにおいて該選択されたＡＤ関連表現型特徴が出現する年齢を、該化合物を投与しなかった、同じタイプの第二のトランスジェニックマウスにおいて該特徴が出現する年齢と比較する工程；
を包含し、
ここで該第二のマウスにおいて該特徴が出現した年齢と比べた、該第一のマウスにおいて該特徴が出現した年齢の上昇は、該化合物の有効性を示す、方法。
（項目２１）前記特徴が行動障害である、項目２０に記載の方法。
（項目２２）前記特徴が異常なＣＮＳアミロイド沈着である、項目２０に記載の方法。
（項目２３）アルツハイマー病の症状を寛解するのにおける有効性について候補化合物をスクリーニングするための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）項目１〜１９のいずれか１項に記載の第一のトランスジェニックマウスに対して該候補化合物を投与する工程；
（ｂ）記憶試験または学習試験において該マウスの能力を決定する工程；および
（ｃ）該マウスの該能力を、該化合物を投与しなかった、同じタイプの第二のトランスジェニックマウスの能力と比較する工程；
を包含し、
ここで該第二のマウスの能力と比べた、該第一のマウスの改善された能力は、該化合物の有効性を示す、方法。
（項目２４）中枢神経系において異常なＡβ沈着を示すトランスジェニック非ヒト哺乳動物を産生する方法であって、該方法は以下：
（ａ）導入遺伝子を該哺乳動物の受精した卵母細胞に導入する工程であって、該導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種アミロイド前駆体タンパク質６９５（ＡＰＰ６９５）ポリペプチドをコードしており、ここで、該ポリペプチドの６７０位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、６７１位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして７１７位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されている、工程；
（ｂ）偽妊娠哺乳動物中に該受精卵母細胞を移植する工程；
（ｃ）該受精した卵母細胞を生きて誕生した子孫中で発育させる工程；および
（ｄ）ゲノムが導入遺伝子を含む子孫を選択する工程であって、該導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種アミロイド前駆体タンパク質６９５（ＡＰＰ６９５）ポリペプチドをコードしており、ここで、該ポリペプチドの６７０位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、６７１位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして７１７位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されており、そして該導入遺伝子が発現される、工程；
を包含する、方法。
（項目２５）前記哺乳動物がマウスである、項目２４に記載の方法。
（項目２６）前記プロモーターが、プリオンタンパク質ｃｏｓ．Ｔｅｔプロモーターである、項目２４に記載の方法。
（項目２７）異種アミロイド前駆体タンパク質６９５（ＡＰＰ６９５）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで該ポリペプチドの６７０位のリジン残基は、アスパラギンで置換され、６７１位のメチオニン残基は、ロイシンで置換され、そして７１７位のバリン残基は、フェニルアラニンで置換されている、ヌクレオチド配列。
（項目２８）プロモーターに作動可能に連結された項目２７に記載のヌクレオチド配列を含む、ベクター。
（項目２９）中枢神経系における異常なアミロイド沈着を罹患する哺乳動物において、認識不全を減弱する方法であって、該方法は、認識不全を減弱するのに有効な量のＡβペプチドを該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
（項目３０）前記異常なアミロイド沈着がＡβ沈着である、項目２９に記載の方法。
（項目３１）前記投与されたペプチドがＡβ４２である、項目２９または３０に記載の方法。
（項目３２）前記哺乳動物が、アルツハイマー病に罹患しているヒトである、項目２９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
（項目３３）中枢神経系において異常なアミロイド沈着を罹患している哺乳動物において認識不全を減弱するための医薬の製造のためのＡβペプチドの使用。
（項目３４）前記ＡβペプチドがＡβ４２である、項目３３に記載の使用。
（項目３５）前記医薬がアルツハイマー病の予防または処置のための医薬である、項目３３または３４に記載の使用。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
本発明の特定の実施形態が記載されており、参照は、添付の図面に対してなされている。
【図１−１】図１は、１１週齢で試験したＴｇＣＲＮＤ８マウスの水迷路能力を示す。ＴｇＣＲＮＤ８マウス（ｎ＝５）は、非Ｔｇ同腹仔（ｎ＝８）よりも有意に長いエスケープ潜時（パネルＡ）、および通路探索（パネルＢ）を有し（それぞれ、Ｆ（１，１０）＝２８．８，ｐ＜０．００１およびＦ（１，１０）＝２２．０，ｐ＜０．０１）、そして結果的に、隠したプラットフォームを含む目標の四分区画（ＴＱ：Ｔａｒｇｅｔ Ｑｕａｄｒａｎｔ）への移動が有意に少なかった（Ｆ（１，１０）＝１４．９，ｐ＜０．０１）（パネルＣ）。Ｔｇマウスと非Ｔｇマウスとの間の泳ぐ速さによって評価した移動能力（パネルＤ）は匹敵していた（Ｆ（１，１０）＝０．４８，ｐ＞０．０５）。ＴｇＣＲＮＤ８マウスは、隠したプラットフォームがこのプールから取り除かれた場合、探索試行（プローブトライアル）における６０秒の泳ぎの間にその探索パターンによって測定した場合、プラットフォーム位置に対する空間的記憶の障害を示した。これらのマウスは、非Ｔｇマウスよりも、ＴＱを探索する傾向が少なく（パネルＥ）、そしてプラットフォーム位置の正確な帯を横切ることがしばしば有意に少ない（ｔ（１０）＝２．１，ｐ＝０．０６）（パネルＦ）ことが示された。
【図１−２】図１は、１１週齢で試験したＴｇＣＲＮＤ８マウスの水迷路能力を示す。ＴｇＣＲＮＤ８マウス（ｎ＝５）は、非Ｔｇ同腹仔（ｎ＝８）よりも有意に長いエスケープ潜時（パネルＡ）、および通路探索（パネルＢ）を有し（それぞれ、Ｆ（１，１０）＝２８．８，ｐ＜０．００１およびＦ（１，１０）＝２２．０，ｐ＜０．０１）、そして結果的に、隠したプラットフォームを含む目標の四分区画（ＴＱ：Ｔａｒｇｅｔ Ｑｕａｄｒａｎｔ）への移動が有意に少なかった（Ｆ（１，１０）＝１４．９，ｐ＜０．０１）（パネルＣ）。Ｔｇマウスと非Ｔｇマウスとの間の泳ぐ速さによって評価した移動能力（パネルＤ）は匹敵していた（Ｆ（１，１０）＝０．４８，ｐ＞０．０５）。ＴｇＣＲＮＤ８マウスは、隠したプラットフォームがこのプールから取り除かれた場合、探索試行（プローブトライアル）における６０秒の泳ぎの間にその探索パターンによって測定した場合、プラットフォーム位置に対する空間的記憶の障害を示した。これらのマウスは、非Ｔｇマウスよりも、ＴＱを探索する傾向が少なく（パネルＥ）、そしてプラットフォーム位置の正確な帯を横切ることがしばしば有意に少ない（ｔ（１０）＝２．１，ｐ＝０．０６）（パネルＦ）ことが示された。
【図１−３】図１は、１１週齢で試験したＴｇＣＲＮＤ８マウスの水迷路能力を示す。ＴｇＣＲＮＤ８マウス（ｎ＝５）は、非Ｔｇ同腹仔（ｎ＝８）よりも有意に長いエスケープ潜時（パネルＡ）、および通路探索（パネルＢ）を有し（それぞれ、Ｆ（１，１０）＝２８．８，ｐ＜０．００１およびＦ（１，１０）＝２２．０，ｐ＜０．０１）、そして結果的に、隠したプラットフォームを含む目標の四分区画（ＴＱ：Ｔａｒｇｅｔ Ｑｕａｄｒａｎｔ）への移動が有意に少なかった（Ｆ（１，１０）＝１４．９，ｐ＜０．０１）（パネルＣ）。Ｔｇマウスと非Ｔｇマウスとの間の泳ぐ速さによって評価した移動能力（パネルＤ）は匹敵していた（Ｆ（１，１０）＝０．４８，ｐ＞０．０５）。ＴｇＣＲＮＤ８マウスは、隠したプラットフォームがこのプールから取り除かれた場合、探索試行（プローブトライアル）における６０秒の泳ぎの間にその探索パターンによって測定した場合、プラットフォーム位置に対する空間的記憶の障害を示した。これらのマウスは、非Ｔｇマウスよりも、ＴＱを探索する傾向が少なく（パネルＥ）、そしてプラットフォーム位置の正確な帯を横切ることがしばしば有意に少ない（ｔ（１０）＝２．１，ｐ＝０．０６）（パネルＦ）ことが示された。
【図２−１】図２は、二重トランスジェニックマウスＴｇＣＲＮＤ８×ＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）１３７９の水迷路能力を示す。２ヶ月齢で試験した場合、二重トランスジェニックマウス（ｎ＝５）は、単一のＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）１３７９同腹仔（ｎ＝８）よりも有意に長い（Ｆ（１，１１）＝８．１，ｐ＜０．０５、遺伝子型によるエフェクトサイズ（η２）＝４２％））エスケープ潜時（パネルＡ）、および通路探索（Ｆ（１，１１）＝８．４６，ｐ＜０．０５、η２＝４３％）（パネルＢ）を有した。隠したプラットフォームをもとのＴＱと反対の四分区画に移動した場合、逆学習試験の直後には、二重トランスジェニックマウスは、さらに長いエスケープ潜時の傾向を示した（Ｆ（１，１１）＝３．２８，ｐ＝０．１、η２＝２３％、パネルＣ）が、その経路探索（パネルＤ）は、単一ＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）１３７９マウスとは有意に異ならなかった（Ｆ（１，１１）＝２．４６，ｐ＞０．０５、η２＝１８％）。両方のトランスジェニック群におけるマウスの泳ぐ速度は試験間で匹敵した。５ヶ月齢で再試験した場合、二重トランスジェニックマウスは、単一のＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）１３７９同腹仔よりも、有意に長い（Ｆ（１，１０）＝１６．６，ｐ＜０．０１、η２＝６２％（二重トランスジェニックマウスの１匹が死んだ））エスケープ潜時（パネルＥ）、および有意に長い通路探索（Ｆ（１，１０）＝２０．３，ｐ＜０．００１、η２＝６６％、パネルＦ）を示した。この有意な欠陥は、この試験における二重トランスジェニックマウスの最初の能力の乏しさ（群×日数相互作用：潜時について、Ｆ（２，４０）＝３．３２、ｐ＜０．０５、そして通路についてＦ（２，４０）＝２．８５，ｐ＝０．０７）に起因していた。二重トランスジェニックマウスがなお、単一のＴ９同腹仔よりも、有意に長い潜時（Ｆ（１，１０）＝２８．５８，ｐ＜０．００１、η２＝７４％、パネルＧ）および、長い通路探索（Ｆ（１，１０）＝２７．４３，ｐ＜０．００１、η２＝７３％、パネルＨ）を示した場合、学習獲得の欠陥は、逆試験において持続した。このマウスは最終的に、逆トレーニング学習の最後には能力を改善したが、両方の測定に関する群×日数相互作用は、α＝０．０５で有意には達しなかった。
【図２−２】図２は、二重トランスジェニックマウスＴｇＣＲＮＤ８×ＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）１３７９の水迷路能力を示す。２ヶ月齢で試験した場合、二重トランスジェニックマウス（ｎ＝５）は、単一のＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）１３７９同腹仔（ｎ＝８）よりも有意に長い（Ｆ（１，１１）＝８．１，ｐ＜０．０５、遺伝子型によるエフェクトサイズ（η２）＝４２％））エスケープ潜時（パネルＡ）、および通路探索（Ｆ（１，１１）＝８．４６，ｐ＜０．０５、η２＝４３％）（パネルＢ）を有した。隠したプラットフォームをもとのＴＱと反対の四分区画に移動した場合、逆学習試験の直後には、二重トランスジェニックマウスは、さらに長いエスケープ潜時の傾向を示した（Ｆ（１，１１）＝３．２８，ｐ＝０．１、η２＝２３％、パネルＣ）が、その経路探索（パネルＤ）は、単一ＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）１３７９マウスとは有意に異ならなかった（Ｆ（１，１１）＝２．４６，ｐ＞０．０５、η２＝１８％）。両方のトランスジェニック群におけるマウスの泳ぐ速度は試験間で匹敵した。５ヶ月齢で再試験した場合、二重トランスジェニックマウスは、単一のＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）１３７９同腹仔よりも、有意に長い（Ｆ（１，１０）＝１６．６，ｐ＜０．０１、η２＝６２％（二重トランスジェニックマウスの１匹が死んだ））エスケープ潜時（パネルＥ）、および有意に長い通路探索（Ｆ（１，１０）＝２０．３，ｐ＜０．００１、η２＝６６％、パネルＦ）を示した。この有意な欠陥は、この試験における二重トランスジェニックマウスの最初の能力の乏しさ（群×日数相互作用：潜時について、Ｆ（２，４０）＝３．３２、ｐ＜０．０５、そして通路についてＦ（２，４０）＝２．８５，ｐ＝０．０７）に起因していた。二重トランスジェニックマウスがなお、単一のＴ９同腹仔よりも、有意に長い潜時（Ｆ（１，１０）＝２８．５８，ｐ＜０．００１、η２＝７４％、パネルＧ）および、長い通路探索（Ｆ（１，１０）＝２７．４３，ｐ＜０．００１、η２＝７３％、パネルＨ）を示した場合、学習獲得の欠陥は、逆試験において持続した。このマウスは最終的に、逆トレーニング学習の最後には能力を改善したが、両方の測定に関する群×日数相互作用は、α＝０．０５で有意には達しなかった。
【図２−３】図２は、二重トランスジェニックマウスＴｇＣＲＮＤ８×ＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）１３７９の水迷路能力を示す。２ヶ月齢で試験した場合、二重トランスジェニックマウス（ｎ＝５）は、単一のＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）１３７９同腹仔（ｎ＝８）よりも有意に長い（Ｆ（１，１１）＝８．１，ｐ＜０．０５、遺伝子型によるエフェクトサイズ（η２）＝４２％））エスケープ潜時（パネルＡ）、および通路探索（Ｆ（１，１１）＝８．４６，ｐ＜０．０５、η２＝４３％）（パネルＢ）を有した。隠したプラットフォームをもとのＴＱと反対の四分区画に移動した場合、逆学習試験の直後には、二重トランスジェニックマウスは、さらに長いエスケープ潜時の傾向を示した（Ｆ（１，１１）＝３．２８，ｐ＝０．１、η２＝２３％、パネルＣ）が、その経路探索（パネルＤ）は、単一ＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）１３７９マウスとは有意に異ならなかった（Ｆ（１，１１）＝２．４６，ｐ＞０．０５、η２＝１８％）。両方のトランスジェニック群におけるマウスの泳ぐ速度は試験間で匹敵した。５ヶ月齢で再試験した場合、二重トランスジェニックマウスは、単一のＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）１３７９同腹仔よりも、有意に長い（Ｆ（１，１０）＝１６．６，ｐ＜０．０１、η２＝６２％（二重トランスジェニックマウスの１匹が死んだ））エスケープ潜時（パネルＥ）、および有意に長い通路探索（Ｆ（１，１０）＝２０．３，ｐ＜０．００１、η２＝６６％、パネルＦ）を示した。この有意な欠陥は、この試験における二重トランスジェニックマウスの最初の能力の乏しさ（群×日数相互作用：潜時について、Ｆ（２，４０）＝３．３２、ｐ＜０．０５、そして通路についてＦ（２，４０）＝２．８５，ｐ＝０．０７）に起因していた。二重トランスジェニックマウスがなお、単一のＴ９同腹仔よりも、有意に長い潜時（Ｆ（１，１０）＝２８．５８，ｐ＜０．００１、η２＝７４％、パネルＧ）および、長い通路探索（Ｆ（１，１０）＝２７．４３，ｐ＜０．００１、η２＝７３％、パネルＨ）を示した場合、学習獲得の欠陥は、逆試験において持続した。このマウスは最終的に、逆トレーニング学習の最後には能力を改善したが、両方の測定に関する群×日数相互作用は、α＝０．０５で有意には達しなかった。
【図２−４】図２は、二重トランスジェニックマウスＴｇＣＲＮＤ８×ＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）１３７９の水迷路能力を示す。２ヶ月齢で試験した場合、二重トランスジェニックマウス（ｎ＝５）は、単一のＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）１３７９同腹仔（ｎ＝８）よりも有意に長い（Ｆ（１，１１）＝８．１，ｐ＜０．０５、遺伝子型によるエフェクトサイズ（η２）＝４２％））エスケープ潜時（パネルＡ）、および通路探索（Ｆ（１，１１）＝８．４６，ｐ＜０．０５、η２＝４３％）（パネルＢ）を有した。隠したプラットフォームをもとのＴＱと反対の四分区画に移動した場合、逆学習試験の直後には、二重トランスジェニックマウスは、さらに長いエスケープ潜時の傾向を示した（Ｆ（１，１１）＝３．２８，ｐ＝０．１、η２＝２３％、パネルＣ）が、その経路探索（パネルＤ）は、単一ＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）１３７９マウスとは有意に異ならなかった（Ｆ（１，１１）＝２．４６，ｐ＞０．０５、η２＝１８％）。両方のトランスジェニック群におけるマウスの泳ぐ速度は試験間で匹敵した。５ヶ月齢で再試験した場合、二重トランスジェニックマウスは、単一のＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）１３７９同腹仔よりも、有意に長い（Ｆ（１，１０）＝１６．６，ｐ＜０．０１、η２＝６２％（二重トランスジェニックマウスの１匹が死んだ））エスケープ潜時（パネルＥ）、および有意に長い通路探索（Ｆ（１，１０）＝２０．３，ｐ＜０．００１、η２＝６６％、パネルＦ）を示した。この有意な欠陥は、この試験における二重トランスジェニックマウスの最初の能力の乏しさ（群×日数相互作用：潜時について、Ｆ（２，４０）＝３．３２、ｐ＜０．０５、そして通路についてＦ（２，４０）＝２．８５，ｐ＝０．０７）に起因していた。二重トランスジェニックマウスがなお、単一のＴ９同腹仔よりも、有意に長い潜時（Ｆ（１，１０）＝２８．５８，ｐ＜０．００１、η２＝７４％、パネルＧ）および、長い通路探索（Ｆ（１，１０）＝２７．４３，ｐ＜０．００１、η２＝７３％、パネルＨ）を示した場合、学習獲得の欠陥は、逆試験において持続した。このマウスは最終的に、逆トレーニング学習の最後には能力を改善したが、両方の測定に関する群×日数相互作用は、α＝０．０５で有意には達しなかった。
【図３−１】図３は、Ａβ４２で免疫したＴｇＣＲＮＤ８マウス（Ｔｇ（ＡＰＰ）８；ｎ＝１２）および非トランスジェニック同腹仔（非Ｔｇ；ｎ＝２０）、ならびにＩＡＰＰペプチドで免疫したＴｇＣＲＮＤ８マウス（Ｔｇ（ＡＰＰ）８；ｎ＝９）および非トランスジェニック同腹仔（非Ｔｇ；ｎ＝１９）の水迷路能力を示す。Ａβ４２ペプチドでの免疫は、非Ｔｇ同腹仔に比べて、エスケープ潜時および通路探索によって測定した場合、ＴｇＣＲＮＤ８マウスの認識欠陥を有意に減弱した。Ａβ４２で免疫したＴｇＣＲＮＤ８マウスは、非Ｔｇマウスよりも全体的に長いエスケープ潜時（パネルＡ）、および通路探索（パネルＣ）を有した（潜時および通路について、それぞれ、（Ｆ（１，３０）＝９．７１，ｐ＜０．０１；Ｆ（１，３０）＝１０．９，ｐ＜０．０１）。この差異は、その最初の探索がより長かったこと（群×日数相互作用：潜時について、Ｆ（４，１２０）＝２．８３、ｐ＜０．０５；通路についてＦ（３，１２０）＝４．７３，ｐ＜０．０１）に起因していた。トレーニングの最後の３日間のそれらの能力の比較は群間で有意な差異を示さなかった（潜時について、Ｆ（１，３０）＝０．６４、ｐ＞０．０５；通路についてＦ（１，３０）＝１．２４，ｐ＞０．０５）。Ａβ４２で免疫したＴｇマウスは、ＴＱの探索がやや短い傾向（Ｆ（１，３０）＝３．７１，ｐ＝０．０６、パネルＥ）を示したが、その泳ぐ速度は非Ｔｇマウスと有意に異なることはなかった（Ｆ（１，３０）＝１．３３，ｐ＞０．０５）（パネルＧ）。ＩＡＰＰで免疫したＴｇＣＲＮＤ８マウスは、非Ｔｇ同腹仔よりも有意に長いエスケープ潜時（パネルＢ）および通路探索（パネルＤ）を示した（潜時について、Ｆ（１，２６）＝３９．９、ｐ＜０．００１；通路についてＦ（１，２６）＝４３．９、ｐ＜０．００１）。これらのマウスは非Ｔｇマウスとは最初の探索は異ならなかったが、トレーニング中にはその能力は改善しなかった（群×日数相互作用：潜時について、Ｆ（４，１０４）＝６．３１、ｐ＜０．００１；通路について、Ｆ（４，１０４）＝５．６９，ｐ＜０．００１）。これらのマウスはまた、目標四分区画を探索するのにかかる時間が有意に短かった（Ｆ（１，２６）＝７．３９、ｐ＜０．０５；パネルＦ）、しかしその泳ぐ速度は免疫によって有意に影響されなかった（Ｆ（１，２６）＝１．７３，ｐ＞０．０５、パネルＨ）。
【図３−２】図３は、Ａβ４２で免疫したＴｇＣＲＮＤ８マウス（Ｔｇ（ＡＰＰ）８；ｎ＝１２）および非トランスジェニック同腹仔（非Ｔｇ；ｎ＝２０）、ならびにＩＡＰＰペプチドで免疫したＴｇＣＲＮＤ８マウス（Ｔｇ（ＡＰＰ）８；ｎ＝９）および非トランスジェニック同腹仔（非Ｔｇ；ｎ＝１９）の水迷路能力を示す。Ａβ４２ペプチドでの免疫は、非Ｔｇ同腹仔に比べて、エスケープ潜時および通路探索によって測定した場合、ＴｇＣＲＮＤ８マウスの認識欠陥を有意に減弱した。Ａβ４２で免疫したＴｇＣＲＮＤ８マウスは、非Ｔｇマウスよりも全体的に長いエスケープ潜時（パネルＡ）、および通路探索（パネルＣ）を有した（潜時および通路について、それぞれ、（Ｆ（１，３０）＝９．７１，ｐ＜０．０１；Ｆ（１，３０）＝１０．９，ｐ＜０．０１）。この差異は、その最初の探索がより長かったこと（群×日数相互作用：潜時について、Ｆ（４，１２０）＝２．８３、ｐ＜０．０５；通路についてＦ（３，１２０）＝４．７３，ｐ＜０．０１）に起因していた。トレーニングの最後の３日間のそれらの能力の比較は群間で有意な差異を示さなかった（潜時について、Ｆ（１，３０）＝０．６４、ｐ＞０．０５；通路についてＦ（１，３０）＝１．２４，ｐ＞０．０５）。Ａβ４２で免疫したＴｇマウスは、ＴＱの探索がやや短い傾向（Ｆ（１，３０）＝３．７１，ｐ＝０．０６、パネルＥ）を示したが、その泳ぐ速度は非Ｔｇマウスと有意に異なることはなかった（Ｆ（１，３０）＝１．３３，ｐ＞０．０５）（パネルＧ）。ＩＡＰＰで免疫したＴｇＣＲＮＤ８マウスは、非Ｔｇ同腹仔よりも有意に長いエスケープ潜時（パネルＢ）および通路探索（パネルＤ）を示した（潜時について、Ｆ（１，２６）＝３９．９、ｐ＜０．００１；通路についてＦ（１，２６）＝４３．９、ｐ＜０．００１）。これらのマウスは非Ｔｇマウスとは最初の探索は異ならなかったが、トレーニング中にはその能力は改善しなかった（群×日数相互作用：潜時について、Ｆ（４，１０４）＝６．３１、ｐ＜０．００１；通路について、Ｆ（４，１０４）＝５．６９，ｐ＜０．００１）。これらのマウスはまた、目標四分区画を探索するのにかかる時間が有意に短かった（Ｆ（１，２６）＝７．３９、ｐ＜０．０５；パネルＦ）、しかしその泳ぐ速度は免疫によって有意に影響されなかった（Ｆ（１，２６）＝１．７３，ｐ＞０．０５、パネルＨ）。
【図３−３】図３は、Ａβ４２で免疫したＴｇＣＲＮＤ８マウス（Ｔｇ（ＡＰＰ）８；ｎ＝１２）および非トランスジェニック同腹仔（非Ｔｇ；ｎ＝２０）、ならびにＩＡＰＰペプチドで免疫したＴｇＣＲＮＤ８マウス（Ｔｇ（ＡＰＰ）８；ｎ＝９）および非トランスジェニック同腹仔（非Ｔｇ；ｎ＝１９）の水迷路能力を示す。Ａβ４２ペプチドでの免疫は、非Ｔｇ同腹仔に比べて、エスケープ潜時および通路探索によって測定した場合、ＴｇＣＲＮＤ８マウスの認識欠陥を有意に減弱した。Ａβ４２で免疫したＴｇＣＲＮＤ８マウスは、非Ｔｇマウスよりも全体的に長いエスケープ潜時（パネルＡ）、および通路探索（パネルＣ）を有した（潜時および通路について、それぞれ、（Ｆ（１，３０）＝９．７１，ｐ＜０．０１；Ｆ（１，３０）＝１０．９，ｐ＜０．０１）。この差異は、その最初の探索がより長かったこと（群×日数相互作用：潜時について、Ｆ（４，１２０）＝２．８３、ｐ＜０．０５；通路についてＦ（３，１２０）＝４．７３，ｐ＜０．０１）に起因していた。トレーニングの最後の３日間のそれらの能力の比較は群間で有意な差異を示さなかった（潜時について、Ｆ（１，３０）＝０．６４、ｐ＞０．０５；通路についてＦ（１，３０）＝１．２４，ｐ＞０．０５）。Ａβ４２で免疫したＴｇマウスは、ＴＱの探索がやや短い傾向（Ｆ（１，３０）＝３．７１，ｐ＝０．０６、パネルＥ）を示したが、その泳ぐ速度は非Ｔｇマウスと有意に異なることはなかった（Ｆ（１，３０）＝１．３３，ｐ＞０．０５）（パネルＧ）。ＩＡＰＰで免疫したＴｇＣＲＮＤ８マウスは、非Ｔｇ同腹仔よりも有意に長いエスケープ潜時（パネルＢ）および通路探索（パネルＤ）を示した（潜時について、Ｆ（１，２６）＝３９．９、ｐ＜０．００１；通路についてＦ（１，２６）＝４３．９、ｐ＜０．００１）。これらのマウスは非Ｔｇマウスとは最初の探索は異ならなかったが、トレーニング中にはその能力は改善しなかった（群×日数相互作用：潜時について、Ｆ（４，１０４）＝６．３１、ｐ＜０．００１；通路について、Ｆ（４，１０４）＝５．６９，ｐ＜０．００１）。これらのマウスはまた、目標四分区画を探索するのにかかる時間が有意に短かった（Ｆ（１，２６）＝７．３９、ｐ＜０．０５；パネルＦ）、しかしその泳ぐ速度は免疫によって有意に影響されなかった（Ｆ（１，２６）＝１．７３，ｐ＞０．０５、パネルＨ）。
【図３−４】図３は、Ａβ４２で免疫したＴｇＣＲＮＤ８マウス（Ｔｇ（ＡＰＰ）８；ｎ＝１２）および非トランスジェニック同腹仔（非Ｔｇ；ｎ＝２０）、ならびにＩＡＰＰペプチドで免疫したＴｇＣＲＮＤ８マウス（Ｔｇ（ＡＰＰ）８；ｎ＝９）および非トランスジェニック同腹仔（非Ｔｇ；ｎ＝１９）の水迷路能力を示す。Ａβ４２ペプチドでの免疫は、非Ｔｇ同腹仔に比べて、エスケープ潜時および通路探索によって測定した場合、ＴｇＣＲＮＤ８マウスの認識欠陥を有意に減弱した。Ａβ４２で免疫したＴｇＣＲＮＤ８マウスは、非Ｔｇマウスよりも全体的に長いエスケープ潜時（パネルＡ）、および通路探索（パネルＣ）を有した（潜時および通路について、それぞれ、（Ｆ（１，３０）＝９．７１，ｐ＜０．０１；Ｆ（１，３０）＝１０．９，ｐ＜０．０１）。この差異は、その最初の探索がより長かったこと（群×日数相互作用：潜時について、Ｆ（４，１２０）＝２．８３、ｐ＜０．０５；通路についてＦ（３，１２０）＝４．７３，ｐ＜０．０１）に起因していた。トレーニングの最後の３日間のそれらの能力の比較は群間で有意な差異を示さなかった（潜時について、Ｆ（１，３０）＝０．６４、ｐ＞０．０５；通路についてＦ（１，３０）＝１．２４，ｐ＞０．０５）。Ａβ４２で免疫したＴｇマウスは、ＴＱの探索がやや短い傾向（Ｆ（１，３０）＝３．７１，ｐ＝０．０６、パネルＥ）を示したが、その泳ぐ速度は非Ｔｇマウスと有意に異なることはなかった（Ｆ（１，３０）＝１．３３，ｐ＞０．０５）（パネルＧ）。ＩＡＰＰで免疫したＴｇＣＲＮＤ８マウスは、非Ｔｇ同腹仔よりも有意に長いエスケープ潜時（パネルＢ）および通路探索（パネルＤ）を示した（潜時について、Ｆ（１，２６）＝３９．９、ｐ＜０．００１；通路についてＦ（１，２６）＝４３．９、ｐ＜０．００１）。これらのマウスは非Ｔｇマウスとは最初の探索は異ならなかったが、トレーニング中にはその能力は改善しなかった（群×日数相互作用：潜時について、Ｆ（４，１０４）＝６．３１、ｐ＜０．００１；通路について、Ｆ（４，１０４）＝５．６９，ｐ＜０．００１）。これらのマウスはまた、目標四分区画を探索するのにかかる時間が有意に短かった（Ｆ（１，２６）＝７．３９、ｐ＜０．０５；パネルＦ）、しかしその泳ぐ速度は免疫によって有意に影響されなかった（Ｆ（１，２６）＝１．７３，ｐ＞０．０５、パネルＨ）。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物、好ましくはげっ歯類、およびより好ましくはマウスを提供し、これは、アルツハイマー病（ＡＤ）、アルツハイマー病のレーヴィ体変種、および特定の型のクロイツフェルト−ヤーコプ病（ＣＪＤ）（これは、痴呆を引き起こす）、アミロイドーシスオランダ型（ＨＣＡＷＡ−Ｄ）を有する遺伝性小脳性血管障害、および脳出血を引き起こす老年性アミロイド血管症のような多数のヒト障害において見られるものと同様の異常なＡβ沈着を示す。
本発明の非ヒトトランスジェニック哺乳動物は、異常なＡβ沈着の結果として、組織学的および行動性欠損を示す。特に、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、種々の面のヒトＡＤ関連病態の促進された出現を示し、そしてＡＤの改善された動物モデルを提供する。
【００２９】
１つの実施形態に従って、本発明の非ヒト哺乳動物は、異種ＡＰＰ６９５ポリペプチド、好ましくはヒトＡＰＰ６９５ポリペプチドをコードする導入遺伝子をそのゲノム中に有する哺乳動物を含み、このポリペプチドは、アルツハイマー病アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）の「スウェーデン」変異および「インディアナ」変異の両方を保有する。これらの変異の両方は、ヒトにおいて、家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）に関連する。
【００３０】
好ましい実施形態に従って、本発明は、ＴｇＣＲＮＤ８と命名されたトランスジェニックマウスを含み、これは、「スウェーデン」ＡＰＰ変異および「インディアナ」ＡＰＰ変異の両方を保有するＡＰＰ６９５導入遺伝子を有する。
【００３１】
導入遺伝子構築物は、ヒト脳における主要なＡＰＰアイソフォーム（ＡＰＰ６９５）をコードするｃＤＮＡカセットに基づく。このカセットは、ＡＰＰ ＡβドメインのＮ末端およびＣ末端境界に隣接して位置する、２つのＦＡＤ変異：「スウェーデン」変異（Ｋ６７０Ｎ、Ｍ６７１Ｌ）および「インディアナ」変異（Ｖ７１７Ｆ）を含むように改変される。このカセットは、ｃｏｓＴｅｔ（ＣＮＳニューロンそしてより少ない程度で星状細胞における位置独立導入遺伝子発現を指向するプリオンプロモーター発現ベクター）に導入された。微小注入は、ハイブリッド遺伝的背景の卵母細胞（Ｃ３ＨおよびＣ５７ＢＬ６株を含む）中に行なった。得られたトランスジェニックマウス系統を、ＴｇＣＲＮＤ８と命名した。
【００３２】
当業者に理解されるように、導入遺伝子の中枢神経系またはニューロンの発現を指向する、任意のプロモーターが使用され得る。これらとしては、ニューロン特異的エノラーゼ遺伝子プロモーター（３７）；ヒト血小板由来増殖因子Ｂサブユニットプロモーター（３８）、Ｔｈｙ−１プロモーター（１９）および神経フィラメントプロモーター（４１）が挙げられる。
【００３３】
発現カセットは、好ましくは、脳において発現され、そして好ましくはゲノム中に組み込まれた導入遺伝子コピーに比例して発現される、遺伝子由来のプロモーター配列および遺伝子座位制御領域配列を含む。
【００３４】
二重シス変異ＡＰＰ６９５導入遺伝子カセットの使用は、以前に報告されていない；他のＡＤモデルは、ＡＰＰ７５１（ＫＭ６７０／７６１ＮＬ＋Ｖ７１７Ｉ）（１９）導入遺伝子またはＡＰＰ７７０（ＫＭ６７０／６７１ＮＬ＋Ｖ７１７Ｆ）（２７）導入遺伝子を使用した。
【００３５】
ＴｇＣＲＮＤ８マウスは、生後９０日ほども早く、Ａβペプチドについて免疫反応性の球状プラークの形態で沈着する大量のＣＮＳアミロイドを示す；このようなプラークは、ヒトＡＤに特徴的である。単離されたプラーク沈着物は、生後６６日ほども早く、ＴｇＣＲＮＤ８マウスにおいて明白である。ＴｇＣＲＮＤ８マウスにおけるアミロイド沈着の出現は、任意の以前に報告された単一の導入遺伝子を使用するＡＤの動物モデルよりも、より早く生じる（表１を参照のこと）。
【００３６】
アルツハイマー病のマウスモデルの総説が出版され（１６）、そしていくつかの例が表１に列挙されている。列挙された特性から注目されるように、ＴｇＣＲＮＤ８マウスは、他の現在利用可能なＡＤの動物モデルに対して予想外かつ実質的な改善を示す。
【００３７】
例えば、以前に記載された二重シス変異ＡＰＰ導入遺伝子モデル（「ＴｇＡＰＰ２２」マウス）（これは、二重変異ＡＰＰ７５１カセット（ＫＭ６７０／６７１ＮＬ＋Ｖ７１７Ｉ）を使用した）は、１８か月齢でのＡβプラークの出現を示し（１９）、そしてＪ９系統（二重変異ＡＰＰ７７０カセット（ＫＭ６７０／６７１ＮＬ＋Ｖ７１７Ｆ））は、８〜１０か月でプラークを発生することが報告された（２７）。
【００３８】
以前に報告された二重導入遺伝子マウス（Ｔｇ２５７６×ＴｇＰＳ１）は、７０日齢由来の帯状皮質における最小のプラーク沈着を有したが（３９）、最終的に、６か月齢で、十分に形成された沈着物を示した（２２）。
【００３９】
ＴｇＣＲＮＤ８マウスは、ＡＤの処置の診断化合物および治療化合物の発見および開発のため、ならびに疾患の病原性機構のより良い解明のために有用である。
【００４０】
ＴｇＣＲＮＤ８マウスは、Ｍｏｒｒｉｓ水迷路の隠したプラットフォーム（ｈｉｄｄｅｎ−ｐｌａｔｆｏｒｍ）バージョンによって評価されるように、空間的学習における欠損を示す。コントロールの非トランスジェニック同腹仔に対して測定されるこれらの欠損は、１１週齢ほども早くに検出され得る（図１）。
【００４１】
本発明はまた、Ｓｃｈｅｃｋらのプロトコル（２６）を使用して、ヒトＡβ４２ペプチドでのＴｇＣＲＮＤ８マウスの免疫化が、実施例５に記載されるように、１０〜２２週齢で、行動および神経病理の両方において有意な改善を生じることを示してきた。対照的に、Ｓｃｈｅｎｋらによって使用されたＰＤＡＰＰマウスは、行動ではなく、神経病理において改善を示したのみであった（２６）。
【００４２】
従って、ＴｇＣＲＮＤ８モデルは、Ａβ沈着（アルツハイマー病における公知かつ広範に受け入れられた開始事象）の調節が、病理および行動の両方の改善を生じることが示されている第１のＡＤ動物モデルであり、従って、新しい治療を試験するためおよび候補治療化合物をスクリーニングするための最新の最も適切なモデルを提供する。
【００４３】
このような治療または化合物は、βＡＰＰのγ−セクレターゼ切断において、またはβＡＰＰのタンパク質分解誘導体の除去を促進する際、ＰＳ１の機能を阻害することを目的とし得る。これらのタンパク質分解ＡＰＰ誘導体は、Ａβ自身（これは、凝集形態で神経毒性であることが公知である）ならびにαＡＰＰおよびβＡＰＰの残りのγ−セクレターゼ切断から生じるＣ末端誘導体（Ｃ８３／Ｃ９９−βＡＰＰ）（これは、神経毒性であることが示唆されている）を含む（２５）。
【００４４】
本発明のトランスジェニックマウスはまた、新しい診断薬の開発のために有用であり得る。例えば、脳のＡβ充填の推定アッセイまたはＡβ蓄積に応答するニューロンの損傷の試験は、本明細書中に記載されるトランスジェニックマウスを用いて行なわれ得る。
【００４５】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物（スウェーデン変異およびインディアナ変異の両方を有するＡＰＰ６９５をコードする導入遺伝子を有する）は、「二重トランスジェニック（ｂｉ−ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）哺乳動物」を生成するために、導入遺伝子中かまたは内因性遺伝子中かのいずれかで異なる変異を保有する他の系統の哺乳動物と交配され得る。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、「二重トランスジェニック哺乳動物」は、ゲノムが、異種ＡＰＰ６９５ポリペプチド、好ましくはヒトＡＰＰ６９５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子（スウェーデンＡＰＰ変異およびインディアナＡＰＰ変異ならびに選択された第２の遺伝子を保有する）、好ましくは少なくとも１つの選択された変異を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子を含む哺乳動物を意味する。
【００４７】
第２の遺伝子は、少なくとも１つの選択された変異を保有する内因性遺伝子、または少なくとも１つの選択された変異を保有する同種導入遺伝子もしくは異種導入遺伝子であり得る。選択された変異は、例えば、ＡＤ関連変異またはＡβプロセシングに関連する遺伝子における変異であり得る。
【００４８】
あるいは、選択された第２の遺伝子は、正常な導入遺伝子であり得る。
【００４９】
本明細書中に記載されるＴｇＣＲＮＤ８マウスは、Ａβペプチドの促進された合成経路がこれらのマウスにおいて飽和していないという点で、さらなるＡＤ動物モデルの作成のために有用であり、ＡＤ動物モデルを、他のトランスジェニックマウスと交配し、アミロイドペプチド合成および沈着のＡＤ関連病理学的プロセスのさらなる増強を有する二重トランスジェニックモデルを得ることが可能である。
【００５０】
ＴｇＣＲＮＤ８マウスは、例えば、変異プレセニリン遺伝子、変異ＡＰＯＥ４遺伝子、変異ニカストリン（ｎｉｃａｓｔｒｉｎ）遺伝子またはＡＰＰ遺伝子の異なる変異を保有するトランスジェニック動物と交配され得る。
【００５１】
好ましい実施形態に従って、本発明は、以下：
（ａ）変異プレセニリン１タンパク質、好ましくはＰＳ１（Ｌ２８６Ｖ）プレセニリン１タンパク質をコードする導入遺伝子を含むトランスジェニックマウス；
（ｂ）変異プレセニリン２タンパク質、好ましくはＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）プレセニリン２タンパク質をコードする導入遺伝子を含むトランスジェニックマウス；
（ｃ）２つの変異を有するプレセニリン１タンパク質、好ましくはＰＳ１（Ｍ１４６Ｌ＋Ｌ２８６Ｌ）プレセニリン１タンパク質をコードする導入遺伝子を含むトランスジェニックマウス、
とＴｇＣＲＮＤ８マウスとを交配することによって生成される二重トランスジェニックマウスを提供する。
【００５２】
交配によって生成された第１世代の子孫を、二重特異的マウスを選択するために、従来の方法を使用して、第１および第２の導入遺伝子の両方存在および発現についてスクリーニングする。
【００５３】
ＴｇＣＲＮＤ８マウスはまた、Ａβプロセシングに関連する遺伝子（例えば、低密度リポタンパク質レセプター関連遺伝子、α２−マクログロブリン遺伝子またはβ−セクレターゼ遺伝子）中に変異を保有するトランスジェニック動物と交配され得る。
【００５４】
ＴｇＣＲＮＤ８マウスを、変異ヒトプレセニリン（ＰＳ１またはＰＳ２）導入遺伝子を過剰発現するトランスジェニックマウスと交配した（表２）。プラーク密度における強力な増加が、ＴｇＰＳ１（Ｌ２８６Ｖ）１２７４（これは、家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）変異を保有する）と表されるヒト変異プレセニリン導入遺伝子を同時発現するＴｇＣＲＮＤ８マウスにおいて注目された。従って、ＴｇＣＲＮＤ８×ＴｇＰＳ１（Ｌ２８６Ｖ）１２７４マウスにおいて、死後のＡＤ脳に酷似するアミロイド負担はすでに、６２日齢までに存在する（図１Ａ：パネルＣ中の１１７日齢のＴｇＣＲＮＤ８マウスと比較する）。
【００５５】
類似の様式で、ＴｇＣＲＮＤ８マウスを、プレセニリン２のＦＡＤ変異形態（ＰＳ２遺伝子コード領域のアミノ酸残基２３９におけるメチオニンからバリンへの変異）を保有するマウスと交配することによってもまた、プラーク密度における強力な増加を生じる。ＴｇＣＲＮＤ８マウスおよびＴｇＣＲＮＤ８×ＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）マウス（ここで、ＰＳ２導入遺伝子系統は１３７９と命名される）の９１日齢での比較は、図２に示される。
【００５６】
なおより大きい増強は、ＴｇＣＲＮＤ８マウスを、お互いにシスで２つのＦＡＤ変異を有するヒト変異プレセニリン導入遺伝子を保有するマウス（Ｔｇ（Ｍ１４６Ｌ＋Ｌ２８６Ｖ）６５００と表される）と交配することによって得られた。ＴｇＣＲＮＤ８×ＴｇＰＳ１（Ｍ１４６Ｌ＋Ｌ２８６Ｖ）６５００マウスにおいて、海馬アミロイド沈着は、３０日齢までで検出可能であり（図３）、これは、任意の他の二重ＡＰＰ／ＰＳ１−Ｔｇマウス（これは、代表的に６か月齢以降にプラークを発生する）について以前に報告されたよりも、５か月早い（２２、２３）。
【００５７】
これら全ての二重トランスジェニックマウスは、ＴｇＣＲＮＤ８親またはＴｇＰＳ１親のいずれかと比較した場合、海馬アミロイドプラークのなおより促進された出現を示した（表２）。
【００５８】
以前に記載されたＴｇマウスと比較した、ＡＤ関連特徴の促進された出現に加えて、予備分析は、皮質ニューロンの実質的な喪失が、４３週齢のＴｇＣＲＮＤ８×ＴｇＰＳ１（Ｍ１４６Ｌ＋Ｌ２８６Ｖ）６５００二重導入遺伝子マウスにおいて明らかであることを示す。
【００５９】
８〜１０週齢で始まる認識性能における進行性の低下はまた、プレセニリン２（ＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ））のＦＡＤ対立遺伝子を発現するマウスと、ＴｇＣＲＮＤ８マウス（系統１３７９）を交配することによって作成された二重導入遺伝子マウスにおいて見られる（図５）。
【００６０】
本明細書中に記載されるＴｇＣＲＮＤ８マウス、および選択された変異（例えば、ＡＤ関連変異）を保有する他のマウス系統とのこれらのマウスの交配は、本明細書中にさらに記載されるように、多数の目的に有用である。
【００６１】
これらのマウスは、これらのマウスにおいて見られる病理学的指標（例えば、ＡＤ関連表現型形質）のいずれかの発生を防止または遅延する際にそれらの効力について潜在的な薬学的化合物をスクリーニングするために使用され得る。従って、ＡＤの発生を防止または遅延する際にそれらの効力について候補化合物をスクリーニングするための方法が提供される。このスクリーニング方法は、選択されたＡＤ関連表現型形質の出現の前に本発明のトランスジェニックマウスに候補化合物を投与する工程、および未処置のトランスジェニックマウスにおけるその形質の出現の齢と、選択された表現型形質が処置されたマウスにおいて出現する齢を比較する工程を包含する。試験するための適切なＡＤ関連形質は、異常な脳の病歴の出現または行動的欠損の出現を含む。行動性欠損は、本明細書中に記載されるように、例えば、水迷路のような記憶試験または学習試験におけるマウスの成績を調査することによって、決定され得る。
【００６２】
これらのマウスはまた、選択されたＡＤ関連形質（例えば、異常な脳組織または行動性欠損）の出現後、同様に投与することによって、そしてトランスジェニック動物における候補化合物の効果を比較することによって、ＡＤの症状を軽減する際にそれらの効率について潜在的な薬学的化合物をスクリーニングするために使用され得る。
【００６３】
疾患の特定の原因は、疾患の進行および効果を、生理学的および身体的の両方に研究するために、トランスジェニック動物の成長および発達の間に同定され得る。脳において短期間にＡβを迅速に過剰発現する本発明のトランスジェニック動物が、ここで作製され、そして研究され、そして薬学的介入、遺伝子標的技術、アンチセンス療法、抗体療法などを含む可能性のある治療法を研究するためのモデルとして使用される。さらに、トランスジェニックインビトロ細胞株はまた、ここで、本発明に従って樹立され、そして疾患に関与する細胞内シグナル伝達系を解明するため、ならびに潜在的な治療化合物を試験および同定するために使用され得る。
【００６４】
さらに、本発明のトランスジェニック動物はまた、アルツハイマー病を促進および開始すると疑われている状態または環境危険（例えば、頭部外傷または毒性環境因子）を調査するために使用され得る。この場合、トランスジェニック動物は、特定の状態に曝露され、次いでＡＤをさらに引き起こすそして／または増強する状態の能力の指標として、神経行動学的減退、早過ぎる死、神経膠症などを決定するために観察される。
【００６５】
本発明のトランスジェニック動物は、アルツハイマー病のより詳細な特徴付けについて有用であり、進行性の神経病理の病原性および分子事象の配列の決定の解明を導く。トランスジェニック動物は、疾患の病理の種々の提唱された機構を研究するために有用であり、疾患のよりよい処置を導く。
【００６６】
本発明のトランスジェニックマウスはまた、ＡＤにおいて有益または有害のいずれかで役割を果たし得る以前に認識されていない遺伝子の同定のために有用である。候補遺伝子を保有するトランスジェニックマウスは、本発明のトランスジェニックマウスと交配され、そしてこのトランスジェニックのＡＤ関連形質に関する候補遺伝子の存在の効果が調査される。候補遺伝子は、アミロイド沈着および障害性うっ血性動作のようなＡＤ関連表現型を遅延または薄める場合、有益であるとしてスコア付けされる。逆に、候補遺伝子は、発現の齢を進行するかまたはアミロイド沈着および障害性うっ血性動作のようなＡＤ関連表現型の浸透を増強する場合、ＡＤの発生を支持するとしてスコア付けされる。
【００６７】
さらに、本発明のトランスジェニックマウスは、家族性ＡＤの潜在的な遺伝子治療（例えば、さらなるコピーの正常なプレセニリン遺伝子の投与による遺伝子治療）を試験するために有用である。
【００６８】
本発明は、トランスジェニックマウスの生成に限定されず、そしてヒトアルツハイマー病の非ヒト動物モデルを提供することが当業者によって理解される。このようなモデルは、胚発生、成長および発達の間のβＡＰＰおよびＡβペプチドの役割の同定、ならびにアルツハイマー病に関与するようなβＡＰＰおよびＡβペプチドの機能の理解を提供する。
【００６９】
マウスはしばしば、トランスジェニック動物モデルとして使用される。なぜなら、これらは、飼うのが容易であり、比較的安価で、そして繁殖が容易であるためである。しかし、他の非ヒトトランスジェニック動物（例えば、これらに限定されないが、サル、ヒツジ、ウサギおよびラット）がまた、本発明に従って作製され得る。トランスジェニック動物は、連続する世代に継代される導入遺伝子を保有する（すなわち、クローニングされた遺伝子が導入され、そして安定して組み込まれた）動物である。本発明において、ヒトＡＰＰ６９５ｃＤＮＡがクローニングされ、そして２つのＦＡＤ変異（「スウェーデン」変異（Ｋ６７０Ｎ、Ｍ６７１Ｌ）および「インディアナ」変異（Ｖ７１７Ｆ））を含むように改変された。次いで、この構築物をマウスのゲノムに安定して組み込んだ。
【００７０】
本明細書中に詳細に説明される方法に加えて、特定の遺伝子配列を保有するトランスジェニック動物モデルを作製する方法がいくつか存在する。
【００７１】
ヒトＡＰＰ遺伝子配列の特定の変更／変異の生成は、１つの戦略である。変更は、インビトロで使用される種々の酵素学的方法および化学的方法によって達成され得る。最も一般的な方法の１つは、ＤＮＡ配列における正確に設計された欠失、挿入および点変異を作製するために、変異原として特定のオリゴヌクレオチドを使用する方法である。第２に、野生型ヒト遺伝子および／またはヒト化マウス遺伝子は、相同組換えによって挿入され得る。野生型または変異または人工プロモーターエレメントを使用するゲノムまたはミニ遺伝子構築物として、変更されたかまたは変異（単一または複数の）ヒト遺伝子を挿入することはまた可能である。内因性マウス遺伝子のノックアウトは、相同組換えによって内因性遺伝子の人工的に改変されたフラグメントの挿入によって達成され得る。この技術において、変異対立遺伝子は、相同組換えによって、胚性幹細胞に導入される。研究されている遺伝子の１つの対立遺伝子においてノックアウト変異を含む胚性幹細胞は、初期マウス胚に導入される。得られたマウスは、移植ＥＳ細胞および宿主細胞の両方に由来する組織を含むキメラである。キメラマウスを、変異が生殖系列に組み込まれたか否かを評価するために、交尾させる。各々がノックアウト変異にヘテロ接合性であるこれらのキメラマウスを、ホモ接合性のノックアウトマウスを生成するために交尾させる。
【００７２】
遺伝子ノックアウトを生成する遺伝子標的化は、変更されそして正常なコピーを置換するために使用される遺伝子の機能をインビボで評価することを可能にする。改変としては、変異終止コドンの挿入、ＤＮＡ配列の欠失、またはＣｒｅリコンビナーゼのような酵素によって認識される組換えエレメント（ｌｏｘ ｐ部位）の包含が挙げられる。Ｃｒｅ−ｌｏｘ系は、所定の遺伝子の除去または遺伝子配列の特定の一部の除去を可能にする。
【００７３】
遺伝子を不活化するために、マウス配偶子の化学的またはＸ線変異誘発が適用され、その後受精が続く。次いで、異種接合性子孫が、サザンブロッティングによって同定され得、投薬による１つの対立遺伝子の喪失、またはＲＦＬＰマーカーを使用する１つの親対立遺伝子を遺伝することの失敗を示す。
【００７４】
トランスジェニックマウスを作製するために、目的のヒト遺伝子の変更されたバージョンは、標準的技術の卵母細胞の微小注入もしくはトランスフェクションまたは幹細胞へのトランスフェクションを使用して、マウス生殖系列に挿入され得る。あるいは、内因性遺伝子を不活化または置換することが望ましい場合、幹細胞を使用する相同組換えは、上記のように適用され得る。
【００７５】
卵母細胞注入について、１つ以上のコピーの変更／変異ヒトＡＰＰ遺伝子配列は、ちょうど受精したマウス卵母細胞の前核に挿入され得る。次いで、この卵母細胞は、偽妊娠仮母親に再移植される。次いで、生産マウスは、変更されたＡＰＰ遺伝子配列の存在についてテールＤＮＡの分析を使用して成分についてスクリーニングされ得る。導入遺伝子は、ＹＡＣもしくは染色体フラグメントとして注入される完全ゲノム配列、天然プロモーターもしくは異種プロモーターのいずれかを有するｃＤＮＡ、または最適な発現に必要であることが見出されている全てのコード領域および他のエレメントを含むミニ遺伝子のいずれかであり得る。
【００７６】
初期胚のレトロウイルス感染はまた、変更された遺伝子を挿入するために行なわれ得る。この方法において、変更された遺伝子は、キメラを生成するための発生の初期段階の間にマウス胚を直接感染するために使用されるレトロウイルスベクターに挿入され、キメラのいくつかは、生殖系列伝達を生じる。
【００７７】
幹細胞を使用する相同組換えは、遺伝子移入細胞のスクリーニングが、まれな相同組換え事象を同定することを可能にする。一旦同定されると、これらは、マウス胚盤胞の注入によってキメラを生成するために使用され、そして得られたマウスの比率は、組換え系統からの生殖伝達を示す。この遺伝子標的化方法論は、遺伝子の不活化が望ましい場合、特に有用である。例えば、遺伝子の不活化は、選択マーカーに隣接するエキソン由来の配列を含むＤＮＡフラグメントを設計することによって、行なわれ得る。相同組換えは、エキソンの真ん中にマーカー配列の挿入を生じ、遺伝子を不活化する。次いで、個々のクローンのＤＮＡ分析は、相同組換え事象を認識するために使用され得る。
【００７８】
目的の変異を含むオリゴヌクレオチドを注入すること、および得られた細胞をＰＣＲによってスクリーニングすることによって、マウス生殖系列において変異を作製することはまた可能である。
【００７９】
当業者は、本発明のトランスジェニック哺乳動物を生成するために使用されるような核酸構築物が、脳における増加したＡβ生成を生じる変異ＡＰＰ６９５タンパク質をコードする任意の適切な核酸配列を含み得ることを容易に理解する。このような核酸配列は、好ましくは全長変異ＡＰＰ６９５ｃＤＮＡであるが、タンパク質の所望の変異形態が発現されそしてＡβ生成が顕著に増加する限り、このような配列の他の変更された誘導体を含み得る。
【実施例】
【００８０】
（実施例）
実施例は例示のために記載され、発明の範囲を制限することを意図していない。
【００８１】
この開示および実施例において言及されているが、明確には記載されていない合成化学、タンパク質生化学およびペプチド生化学、分子生物学、組織学ならびに免疫学の方法は、科学論文に報告されそして当業者に周知である。
【００８２】
（実施例１−ＴｇＣＲＮＤ８トランスジェニックマウス）
９０塩基対の５’非翻訳領域、６９５アミノ酸残基コード領域（「ＡＰＰ６９５」）および２７１ｂｐの３’非翻訳領域を含むヒトβ−アミロイド前駆体タンパク質（１）（βＡＰＰ）ｃＤＮＡカセットを変異誘発して、互いにシスの、家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）に関連する２つの変異を導入した。第一の変異は、隣接する２つのコドンに影響するジヌクレオチドの変化（ＡＰＰ７７０転写物のコドン／ヌクレオチド番号付け（１）を用いると、ヌクレオチド１７８５および１７８６でＫＭ６７０／６７１ＮＬ：ＧＡ→ＴＣ）である、「Ｓｗｅｄｉｓｈ」変異（２）であった。第二の変異は、Ｖ７１７Ｆ置換を産生する単一ヌクレオチドの変化（３）であった（ＡＰＰ７７０転写物（１）のコドン／ヌクレオチド番号付けを用いると、ヌクレオチド１９２４でＧ→Ｔ）。Ｋｕｎｉｔｚ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒドメインをコードするエキソン７および８を欠くＡＰＰ６９５転写物は、脳で発現される主要な転写物である。βＡＰＰ二重変異体ｃＤＮＡカセットを、プリオンタンパク質コスミド発現ベクターｃｏｓＴｅｔ（１０）に挿入した。
【００８３】
生じた組換え体コスミドクローンを培養で増殖させ、溶解してスーパーコイルＤＮＡを得て、そしてＰｒＰ遺伝子調節エレメントおよびＡＰＰコード領域を含む哺乳動物のＤＮＡ挿入物を、制限エンドヌクレアーゼＮｏｔ１を用いた消化によって、この分子クローンの原核生物ベクター配列から切り出した。アガロースゲル電気泳動して、このトランスジーンＮｏｔ１ ＤＮＡフラグメントを精製した後、精製したＤＮＡを、標準のプロトコール（２９）を用いてマウスの受精した卵母細胞（（Ｃ３Ｈマウス×Ｃ５７ＢＬ６マウス）の交配から誘導した）にマイクロインジェクションした。養母に移植後、生産児うちトランスジーン陽性子孫を、ＳｙｒｉａｎハムスターＰｒＰ遺伝子（３０）の３’非翻訳領域由来のＤＮＡプローブフラグメントを用いて、尾部のＤＮＡのハイブリダイゼーション分析によってスクリーニングした。
【００８４】
ＡＰＰ特異的抗体（Ｓｅｎｅｔｅｋ Ｉｎｃ，，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を、トランスジーン陽性の子孫でのトランスジーンの発現を確証するために用いた。０．３２Ｍショ糖中で作製した１０％脳ホモジネートを、Ｌａｅｍｌｌｉ緩衝液で希釈し、超音波処理し、そして１０〜２０％トリシン（ｔｒｉｃｉｎｅ）勾配ゲル（Ｎｏｖｅｘ）で電気泳動した。ニトロセルロースに転写後、ヒトＡＰＰおよびＰＳ１を、Ｃ末端特異的ＭａｂおよびＮ末端特異的Ｍａｂを用いて検出し、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって発色させた。結果を図６に示す。１２０ｋＤａおよび１００ｋＤａの全長の成熟ＡＰＰホロタンパク質および未成熟ＡＰＰホロタンパク質に加えて、ウエスタンブロット分析は、ＴｇＣＲＮＤ８マウスの脳の抽出物における、より低い分子量種およびより低い発現レベルのＡＰＰを示した。６Ｅ１０抗血清（α−セクレターゼ切断部位に対してＮ末端に位置する）および抗体３６９を用いたこれらの種の検出は、これらがＡＰＰのＣ末端に由来することを示す。これらは、過剰発現によって高レベルで蓄積され、そしてβ−セクレターゼ部位（いわゆるβ−ｓｔｕｂ）で始まるＣ末端フラグメント（ＣＴＦ）に対応する、ＡＰＰプロセシング中間体のようであった。老年期のＴｇＣＲＮＤ８マウスでは、動物が老化するのにつれて増加するレベルの４ｋＤａの種もまた、検出されたが、齢の一致した非Ｔｇ同腹仔でもＴｇ２５７６マウスでもこれは検出されなかった。４ｋＤａの免疫応答性種は、これらの動物の生涯の間に高レベルに蓄積するＡβペプチドに対応する。
【００８５】
卵母細胞へのＤＮＡトランスジーンのマイクロインジェクションは、上に記載のように、マウスゲノム中にトランスジーンの無作為な挿入を導く。挿入したトランスジーンの制限エンドヌクレアーゼマッピングは、これらが、頭−尾（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ）アレイで挿入され、１アレイあたりのトランスジーン数（コピー数）は、一倍体ゲノムあたり１００を超えるまでトランスジーンコピーに達することを証明する（２４）。
【００８６】
ヒトＡＰＰを発現するトランスジェニックマウスは、最適なアミロイド生成のために、好ましくは内在性発現レベルの５〜６倍のＡＰＰの過剰発現を示すはずである。脳でのＡＰＰ発現を、マウスＡＰＰおよびヒトＡＰＰの両方を認識する２２Ｃ１１（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）のようなＡＰＰ指向性抗体を用いたウエスタンブロット分析によって決定する。
【００８７】
プリオンタンパク質ｃｏｓ．Ｔｅｔベクターについての以前の研究は、トランスジーンの発現レベルがコピー数と並行して増加するような、トランスジーンアレイの位置非依存性の発現を示している（４，４０）。それゆえ、このベクターを使用する場合、所望の高レベルのＡＰＰ発現を有するトランスジェニックマウスを、高いトランスジーンコピー数（好ましくは、少なくとも３０コピー）を有するトランスジーン陽性マウスを、ハイブリダイゼーション分析（３０）で同定することによって、最初に同定し得る。
【００８８】
ＦＶＢ／Ｎ遺伝的バックグラウンドを有するマウスは、ＡＰＰ過剰発現のほとんど明らかになっていない影響に起因して、成体早期で早死にする傾向があるとはいえ、この傾向は、Ｃ５７系統およびＣ３Ｈ系統由来の遺伝的バックグラウンドにおいて弱まる。それゆえ、ＴｇＣＲＮＤ８マウスは、Ａβペプチドレベルを、生存率を損なうことなしに許容させ得ることを確立する。
【００８９】
（ＴｇＣＲＮＤ８マウスでの神経病理学的変化）
免疫染色を、ＡＰＰのＡβタンパク質分解フラグメントと反応するヒト特異的抗体４Ｇ８を用い、ホルマリン固定し、パラフィンワックス包埋した脳材料からの切片を用いて行った。この免疫組織化学的手順のための標準プロトコールは、別に記載されている（１７，２０，２３）。単離したプラーク沈着物は、生後６０日という早期にＴｇＣＲＮＤ８マウスにおいて可視化になり、びまん性アミロイド斑の頑強な沈着物は９０日齢から可能になる。高密度の中心を有する斑は、４〜５ヶ月齢で明らかであり、これらの型の沈着物の多くは、コンゴ−レッド（β−シートリッチアミロイド沈着物中にインターカレートされる試薬）で染まり、偏光下で緑／金複屈折をもたらす。同様の複屈折沈着物は、ヒトＡＤの脳サンプルに存在する。アミロイド沈着物は、ＴｇＣＲＮＤ８マウスにおいて、ヒトアルツハイマー病によって重大な影響を受ける領域である海馬および大脳皮質（特に前頭皮質）に顕著であった。散発性ＡＤでは通常免れるが、ＡＤの重症な早発型症例でのびまん性Ａβ沈着物によって穏やかに影響を受け得る小脳もまた、１年齢のＴｇＣＲＮＤ８マウスおよび６ヶ月齢で変異体ＰＳ１または変異体ＰＳ２を同時発現するＴｇＣＲＮＤ８マウスにおいて、穏やかに影響を受ける。
【００９０】
ＡＰＰは、（ハムスターＰｒＰ遺伝子と同様に）ＴｇＣＲＮＤ８マウスにおいて全身性に発現したが、腎臓、骨格筋、および心筋はＰｒＰ ｍＲＮＡの発現が知られている部位であるにもかかわらず、アミロイド沈着物は、顕症のＣＮＳ沈着物を有する老化した動物の腎臓、骨格筋、および心筋における免疫染色によって視覚的に明らかではなかった。
【００９１】
（ＴｇＣＲＮＤ８マウスでの行動的変化）
ＴｇＣＲＮＤ８マウスの空間学習を、（３２）に記載の十分に確立されたパラダイムのＭｏｒｒｉｓ水迷路（３１）を用いて評価した。ＴｇＣＲＮＤ８マウスの行動分析は、１１週齢という早期の水迷路の場所識別（同じ空間的位置の隠したプラットフォーム）バージョンにて評価された、それらの空間情報獲得の重大な認知欠損を明らかにした。トレーニングの間、マウスは有意に遅い学習速度を示し、この学習速度は、より長いエスケープ潜時および探索通路ならびに隠したプラットフォームを含む四分区画の偶然のレベル探索に反映される（図１）。ＴｇＣＲＮＤ８マウスはまた、探索足跡（ｐｒｏｂｅ ｔｒａｉｌ）で試験する場合、空間記憶の欠損を示した。この試行の間、隠したプラットフォームを取り外し、そしてマウスに６０秒間その位置を探索させた。非Ｔｇマウスは、プラットフォーム位置に対する明らかで選択的な空間の偏りを示し（図１，ＥおよびＦ）、ＴｇＣＲＮＤ８マウスの探索は、非Ｔｇ同腹仔よりも全体にわたりかつＴＱ四分区画に隣接して含まれ、そしてプラットフォーム位置の周りの環状部を有意に少なく横断した。ＡＰＰ陽性マウスおよび非Ｔｇマウスの両方の泳ぐ能力は、試験の間は同等であり、従って、学習の尺度は偏らなかった。
【００９２】
（実施例２−ＴｇＣＲＮＤ８×ＴｇＰＳ１（Ｌ２８６Ｖ）１２７４二重トランスジェニックマウス）
ＴｇＣＲＮＤ８マウスを、ＴｇＰＳ１（Ｌ２８６Ｖ）系統１２７４と称されるＦＡＤ関連変異体プレセニリン１遺伝子を有するトランスジェニックマウスと交配させた。これらの子孫を離乳させ、そしてゲノムＤＮＡの調製のために尾部の生検を取り出した。精製された尾部のＤＮＡを、ナイロン膜上にニ連の「ドット−ブロット」アレイで固定化し、そしてｃＤＮＡクローンから切り出したヒトＡＰＰコード領域の遺伝子特異的プローブまたはｃＤＮＡクローンから切り出したヒトＰＳ１クローニング領域プローブフラグメントを用いてハイブリダイズさせた。これらのＤＮＡ制限フラグメントを、α−３２ｐ−ｄＣＴＰ（３３）で無作為にプライミングすることによって標識した。二連のナイロン膜を、ＡＰＰまたはＰＳ１のいずれかのハイブリダイゼーションプローブとともにインキュベートし、そして６５℃の温度で０．１％ ドデシル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｐｈａｔｅ）、０．１×クエン酸ナトリウム生理食塩水の溶液（これは、マウスのゲノム内で内在性ＰＳ１遺伝子およびＡＰＰ遺伝子に由来するシグナルを最少化するような「ストリンジェント」なハイブリダイゼーション後の洗浄に対応する）中で洗浄した。二重トランスジェニックマウスを、対応する尾部のＤＮＡサンプルがＡＰＰ遺伝子特異的プローブおよびＰＳ１遺伝子特異的プローブの両方にハイブリダイズするという事実によって同定した。
【００９３】
（ＴｇＣＲＮＤ８×ＴｇＰＳ１（Ｌ２８６Ｖ）１２７４二重トランスジェニックマウスでの神経病理学的変化）
アミロイド沈着は、生じた二重トランスジェニックマウスにおいて増強された。これらのマウスは、６２日齢まで、死後のヒトＡＤの脳に非常に似ているアミロイド負荷量を示した。
【００９４】
老化したマウスにおいて、アミロイド沈着物は、一連トランスジェニックマウスにおいて通常免れる構造体（例えば、小脳）に及ぶに十分に顕症であった。
【００９５】
（実施例３−ＴｇＣＲＮＤ８ｘＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）１３７９二重トランスジェニックマウス）
ＴｇＣＲＮＤ８マウスをまた、同様のプリオンタンパク質コスミド発現ベクターｃｏｓＴｅｔ中に変異プレセニリン２対立遺伝子を発現する、ＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）系統１３７９と名づけたトランスジェニック系統と交配した。二重トランスジェニックマウスＴｇＣＲＮＤ８ｘＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）１３７９マウスは、ＰＳ２コード領域ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブを、ＰＳ１コード領域ハイブリダイゼーションプローブの代わりに使用したことを除いて、上に記載のＴｇＣＲＮＤ８ｘＴｇＰＳ１（Ｌ２８６Ｖ）１２７４マウスとして遺伝子型を特定した。
【００９６】
これらの二重トランスジェニックマウスは、生後９１日までにＡβペプチドに対して免疫反応性の球状プラークの形態で、大量のＣＮＳのアミロイド沈着を呈した。これらのアミロイド沈着は、ヒトアルツハイマー病によって重大な影響を受ける領域である海馬および大脳皮質に局在した。通常、小脳は重症な早発型アルツハイマー病の症例においてのみ、散在性Ａβ沈着によって影響を受け；これは、マウスにおいて最も重いプラーク負荷で影響を受ける。
【００９７】
（ＴｇＣＲＮＤ８ｘＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）１３７９二重オトランスジェニックマウスでの行動変化）
ＴｇＣＲＮＤ８ｘＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）１３７９二重トランスジェニックマウスを２ヶ月齢で試験し、そして空間学習の獲得において４０％範囲内にエフェクトサイズを有する有意な認知欠陥を示した（図２、パネルＡおよびＢ）。しかしながら、以下の逆試験の間、最初は下位であったけれども、この二重トランスジェニックマウスは、試験の最後まで比較し得る能力を示した（導入遺伝子型によって説明される分散の約２０％）（図２、パネルＣおよびＣ）。５ヶ月齢での再試験の間、同様の二重トランスジェニックマウスは、獲得試験および逆試験の間に有意に高い学習欠陥を示した（それぞれ６０％および７０％の導入遺伝子型に起因するエフェクトサイズ）（図２、パネルＥおよびＦ）。また、この二重トランスジェニックマウスは、任意の年齢で試験したこれらの泳ぐ速度において、ＴｇＰＳ２（ｍ２３９Ｖ）１３７９マウスと相違しなかった。変異したＰＳ２遺伝子の存在中の変異したヒトＡＰＰの発現は、同系統の同様の組み合わせから由来した非トランスジェニックマウスと同様の様式で行動するＴｇＰＳ２（Ｍ２３９Ｖ）１３７９マウスの能力と比較して、２ヶ月齢程度の早さで空間学習および記憶の障害を起こす。この障害は加齢に伴いかつ５ヶ月齢までに進行する。このマウスは、常に新しい空間情報の獲得の欠陥を示す。
【００９８】
（実施例４−ＴｇＣＲＮＤ８ｘＴｇ（Ｍ１４６Ｌ＋Ｌ２８６Ｖ）６５００二重トランスジェニックマウス）
ＴｇＣＲＮＤ８マウスを、ＰＳ１（Ｍ１４６Ｌ＋Ｌ２８６Ｖ）の２つの変異を有するトランスジェニックマウスと交配した（３４）。このＰＳ１二重変異体マウスを、先に記載のように（３５）、標準プロトコールによって作製した。二重トランスジェニックマウスを、上に記載のＴｇＣＲＮＤ８ｘＴｇＰＳ１（Ｌ２８６Ｖ）１２７４二重トランスジェニックマウスのための、２つの独立したＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーションによる尾部のＤＮＡの遺伝子型分析によって同定した。
【００９９】
生じた２つの二重トランスジェニックマウスは、４３日齢までに多発性の散在性Ａβ（ＡＢ）アミロイドプラークを呈し、１ヶ月齢までに皮質におけるＡβ（ＡＢ）アミロイド沈着の斑点を示した。４３日齢で現れるこのプラークのいくつかは、コンゴ−レッド色素性である（すなわち、コンゴ−レッド試薬で染色し得る）。
【０１００】
（実施例５−ＴｇＣＲＮＤ８マウスでのＡβに対する能動免疫は認知欠陥を変化させる）
ＴｇＣＲＮＤ８マウスの群および非トランスジェニック同腹仔の群を、Ｓｃｈｅｎｋら（３６）による記載のように、合成Ａβ４２ペプチドで免疫した。ＴｇＣＲＮＤ８マウスおよび非トランスジェニック同腹仔のコントロール群を、コントロールアミロイド生成性ペプチド（糖尿病の病因と関連する島状のアミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ））で免疫した。水迷路試験でのこれらの２つのトランスジェニック群の能力を、上に記載のように、非Ｔｇ同腹仔の能力と比較した。この結果を図３に示す。
【０１０１】
図３に見えるように、Ａβ４２ペプチドを用いた免疫は、免疫の初期段階でＴｇＣＲＮＤ８マウスの認知障害を減衰した。Ａβ４２または１ＡＰＰを用いて免疫にしたＴｇＣＲＮＤ８マウス（６週齢で免疫を開始した）の水迷路能力を、１１週齢で試験した。Ａβ４２ペプチドを用いた免疫は、非Ｔｇ同腹仔と比較して、逃避潜伏時間の長さ（パネルＡ）および通路探索の長さ（パネルＤ）によって計測したように、ＴｇＣＲＮＤ８マウスの認知欠陥を有意に減少させた。Ａβ４２で免疫したＴｇＣＲＮＤ８マウスは、非Ｔｇマウスよりも全体に長い逃避潜伏時間（パネルＡ）および通路探索（パネルＤ）、（潜伏時間および通路それぞれ、Ｆ（１，３０）＝９．７１，ｐ＜０．０１；Ｆ（１，３０）＝１０．９，ｐ＜０．０１）を示し、この違いは、これらの最初のより長い探索（群ｘ日数の相互作用：潜伏時間について、Ｆ（４，１２０）−２．８３，ｐ＜０．０５；通路について、Ｆ（３，１２０）＝４．７３，ｐ＜０．０１）に起因した。トレーニング最後の３日間のこれらの能力比較は、群間に有意差を示さなかった（潜伏時間について、Ｆ（１，３０）＝０．６４，ｐ＞０．０５；通路について、Ｆ（１，３０）＝１．２４，ｐ＞０．０５）。Ａβ４２で免疫したＴｇＣＲＮＤ８マウスは、ＴＱを探索する傾向はわずかに少ないが（Ｆ（１，３０）＝３．７１，ｐ＝０．０６，パネルＥ）、それらの泳ぐ速度（パネルＧ）は、非Ｔｇマウスと有意な差（Ｆ（１，３０）＝１．３３，ｐ＞０．０５）がないことを示した。ＩＡＰＰで免疫したＴｇＣＲＮＤ８マウスは、これらの非Ｔｇ同腹仔より有意に長い逃避潜伏時間（パネルＢ）および通路探索（パネルＣ）を示した（潜時について、Ｆ（１．２６）＝３９．９，ｐ＜０．００１；通路について、Ｆ（１，２６）＝４３．９，ｐ＜０．００１）。トランスジェニックマウスは、非Ｔｇマウスと最初の探索において差異はなかったけれども、これらはトレーニングの間に能力を改善しなかった（群ｘ日数の相互作用：潜伏時間について、Ｆ（４，１０４）＝６．３１，ｐ＜０．００１；通路について、Ｆ（４，１０４）＝５．６９，ｐ＜０．００１）。これらはまた、標的四分区画の探索に有意にわずかな時間を費やしたが（Ｆ（１，２６）＝７．３９，ｐ＜０．０５，パネルＦ）、これらの泳ぐ速度は免疫によって影響を受けなかった（Ｆ（１，２６）＝１．７３，ｐ＞０．０５，パネルＨ）。
【０１０２】
まとめると、６週でのＡβ４２ペプチドを用いたＴｇＣＲＮＤ８マウスの免疫に続く８週での追加免疫は、１１週齢で施行した水迷路のパラダイムにおいて、ＴｇＣＲＮＤ８マウスの認知能力を有意に改善した。一方、ＩＡＰＰで免疫したマウスは、非Ｔｇ同腹仔と比較して空間情報の獲得において有意に障害を示し（図３）、そしてこの障害は、非免疫のＴｇＣＲＮＤ８マウスにおいて見られるのと類似の性質であった（データは示していない）。
【０１０３】
Ａβ４２またはＩＡＰＰペプチドを用いた免疫は、このマウスの泳ぐ能力に影響しなかった。これらの発見は、Ａβ４２を用いた免疫（コントロールＩＡＰＰペプチドではなく）が、水迷路での能力改善し、そしてこの改善が、海馬のＡβアミロイドプラークの最初の沈着が起こる時期と一致し得ることを示す。これらの発見はまた、ＴｇＣＲＮＤ８における認知の欠陥が、不可逆性の認知欠陥に起因しないことを確立する。
【０１０４】
本発明は、明細書中に記載の実施形態の特徴で制限されないが、全ての改変および修飾を特許請求の範囲内に含む。
【０１０５】
【数１−１】
【０１０６】
【数１−２】
【０１０７】
【数１−３】
【０１０８】
【数１−４】
【０１０９】
【数１−５】
【０１１０】
【数１−６】
【０１１１】
【表１】
【０１１２】
【表２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノムが導入遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、該導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種アミロイド前駆体タンパク質６９５（ＡＰＰ６９５）ポリペプチドをコードしている、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項２】
哺乳動物において認識不全を減弱するための医薬の製造のためのＡβペプチドの使用。
【請求項１】
ゲノムが導入遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、該導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み、かつ異種アミロイド前駆体タンパク質６９５（ＡＰＰ６９５）ポリペプチドをコードしている、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項２】
哺乳動物において認識不全を減弱するための医薬の製造のためのＡβペプチドの使用。
【図１−１】
【図１−２】
【図１−３】
【図２−１】
【図２−２】
【図２−３】
【図２−４】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図３−４】
【図１−２】
【図１−３】
【図２−１】
【図２−２】
【図２−３】
【図２−４】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図３−４】
【公開番号】特開２００９−１７８１６２（Ｐ２００９−１７８１６２Ａ）
【公開日】平成２１年８月１３日（２００９．８．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−６８０７８（Ｐ２００９−６８０７８）
【出願日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【分割の表示】特願２００２−５０３０９３（Ｐ２００２−５０３０９３）の分割
【原出願日】平成１３年６月１９日（２００１．６．１９）
【出願人】（５０１３１８５６７）ザ ガバニング カウンシル オブ ザ ユニバーシティ オブ トロント (8)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年８月１３日（２００９．８．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【分割の表示】特願２００２−５０３０９３（Ｐ２００２−５０３０９３）の分割
【原出願日】平成１３年６月１９日（２００１．６．１９）
【出願人】（５０１３１８５６７）ザ ガバニング カウンシル オブ ザ ユニバーシティ オブ トロント (8)
【Ｆターム（参考）】
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