神経変性疾患モデル非ヒト哺乳動物
【課題】線条体におけるプロサイモシンα遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物および該動物を用いたハンチントン病等の予防／治療薬のスクリーニング方法の提供。
【解決手段】線条体においてプロサイモシンα遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物であって、対応する野生型動物と比較して、
（１）脳虚血処置に対して脆弱である、
（２）運動性が劣る、
（３）加齢によって、上記（１）および（２）の症状を自然発症する、および
（４）ドパミンＤ２受容体アゴニスト、ドパミン代謝阻害剤、ＮＭＤＡ受容体拮抗剤またはドパミンＤ１受容体アゴニストによって上記（１）、（２）および（３）の症状が改善する、
ことを特徴とする動物など。
【解決手段】線条体においてプロサイモシンα遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物であって、対応する野生型動物と比較して、
（１）脳虚血処置に対して脆弱である、
（２）運動性が劣る、
（３）加齢によって、上記（１）および（２）の症状を自然発症する、および
（４）ドパミンＤ２受容体アゴニスト、ドパミン代謝阻害剤、ＮＭＤＡ受容体拮抗剤またはドパミンＤ１受容体アゴニストによって上記（１）、（２）および（３）の症状が改善する、
ことを特徴とする動物など。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、線条体におけるプロサイモシンα遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物などに関する。
【背景技術】
【０００２】
中枢神経系の神経細胞が変性・脱落することで起こる神経変性疾患は、それぞれの疾患ごとに特定の部位が傷害されることが知られている。そのなかで、運動機能を制御、調節する錐体外路の主要な構成部位である大脳基底核の神経細胞が傷害されるものにパーキンソン病、ハンチントン病が挙げられる。前者は黒質緻密部から線条体へ投射するドパミン作動性神経（非特許文献１）、後者は線条体から淡蒼球や黒質網様層へ投射するＧＡＢＡ作動性神経の変性が原因とされている（非特許文献２）。両者はともに難治度、重症度が高い疾患として特定疾患治療研究事業の対象に指定されており、さらなる原因の究明と治療薬の開発が期待されている。ハンチントン病は白人で１万人に１人弱、その他の人種ではその数分の一に発症する、優勢遺伝性の疾患である。特に父親由来の原因遺伝子を持つ場合、症状が重篤となることが知られている。その症状は、異常不随意運動や姿勢異常といったジストニアと呼ばれる運動症状に加えて、うつや痴呆などの精神症状が見られる。ハンチントン病の新薬の開発が試みられ複数の物質が候補に挙げられているものの、現在のところ有効性は確立されていない状態である（非特許文献３）。
ハンチントン病の症状のうちジストニアについては、経験的にＬ−ＤＯＰＡ製剤が投与されてきた（非特許文献４）。しかしながら、Ｌ−ＤＯＰＡ製剤は有効性に優れる反面、作用持続時間が短く、長期使用で効果の変動（ｗｅａｒｉｎｇ ｏｆｆ，ｏｎ−ｏｆｆ）やジスキネジアなどの症状を生じるため患者のＱＯＬ低下の原因となる。そのため、Ｌ−ＤＯＰＡ製剤に次ぐ効果を有し、作用持続時間が長いドパミンアゴニストが注目されるようになった。現在、我が国では６種類のドパミンアゴニストが臨床で使用されているが、なかでもプラミペキソールはハンチントン病における筋剛直に対し治療効果を示すとの報告があり（非特許文献５）、有効性の確立に期待が集まっている。
【０００３】
このような状況下、ハンチントン病に対する治療薬の評価・スクリーニングを目的として、これまでにいくつかのハンチントン病様モデル動物が確立されてきた。最初に報告されたハンチントン病様モデルマウスは、ハンチントン病患者の持つハンチントン病遺伝子のｅｘｏｎ１を導入したＲ６／２マウスであり、神経細胞死までは観察されないものの、脳重量の減少、筋肉量の低下、カロリー摂取量の増加、排尿頻度の増加、寿命の大幅な短縮、クラスピング、振戦などの症状を呈することが報告されている（非特許文献６）。しかし、該ハンチントン病様モデル動物は平均１０−１２週齢で死亡してしまうため、長期的に薬物の効果を検討することは困難であった。また、その症状は運動障害以外にも多岐に渡るため特異的な機能解析が難しいという問題点があった。これらの問題を解決すべく開発された、神経細胞死を誘発しないモデルマウスとしては、ヒトのハンチンチン病患者より得られたＣＡＧリピート配列をノックインしたマウスが報告されている（非特許文献７、８）が、運動症状の改善を狙う新たな薬物の検討に適したモデルのニーズが高まっていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｌａｎｇ，Ａ．Ｅ．ａｎｄ Ａ．Ｍ．Ｌｏｚａｎｏ，Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｓｅｃｏｎｄ ｏｆ ｔｗｏ ｐａｒｔｓ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，１９９８．３３９（１６）：ｐ．１１３０−４３．
【非特許文献２】Ｋｅｌｌｙ，Ｃ．Ｍ．，Ｓ．Ｂ．Ｄｕｎｎｅｔｔ，ａｎｄ Ａ．Ｅ．Ｒｏｓｓｅｒ，Ｍｅｄｉｕｍ ｓｐｉｎｙ ｎｅｕｒｏｎｓ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ，２００９．３７（Ｐｔ１）：ｐ．３２３−８．
【非特許文献３】Ｗａｌｋｅｒ，Ｆ．Ｏ．，Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｌａｎｃｅｔ，２００７．３６９（９５５７）：ｐ．２１８−２８．
【非特許文献４】Ｓｅｇａｗａ，Ｍ．，Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｄｙｓｔｏｎｉａ ｗｉｔｈ ｍａｒｋｅｄ ｄｉｕｒｎａｌ ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ．Ｂｒａｉｎ Ｄｅｖ．
【非特許文献５】Ｂｏｎｅｌｌｉ，Ｒ．Ｍ．ａｎｄ Ｇ．Ｋ．Ｗｅｎｎｉｎｇ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ：ａｎ ｅｖｉｄｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ｒｅｖｉｅｗ．Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ，２００６．１２（２１）：ｐ．２７０１−２０．
【非特許文献６】Ｌａｕｒａ Ｍａｎｇｉａｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．８７，１９９６：ｐ．４９３−５０６．
【非特許文献７】Ｌｉｌｉａｎａ Ｂ．Ｍｅｎａｌｌｅｄ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４６５，２００３：ｐ．１１−２６．
【非特許文献８】Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ Ｊ．Ｓｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１２，Ｎｏ．１３，２００３：ｐ．１５５５−１５６７．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、線条体におけるプロサイモシンα遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物および該動物を用いたハンチントン病を含む神経変性疾患の予防／治療薬のスクリーニング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は以前に、虚血ストレスによって誘導される神経性ネクローシス細胞死を抑制する核タンパク質としてプロサイモシンαを見出した（Ｕｅｄａ Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．１７６（６），８５３−８６２，２００７）。そこで本発明者は、興奮性ドパミン受容体を持つ線条体のＧＡＢＡ神経において、線条体特異的に発現するＧ蛋白質γ７サブユニット遺伝子（Ｇｎｇ７）プロモーターの下流にｃｒｅ蛋白質遺伝子を連結することで、ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムを利用して、プロサイモシンαが線条体において発現不全となったコンディショナルノックアウトマウスを作成した。該マウスは、線条体ＧＡＢＡ神経において機能的プロサイモシンαを欠失しており、虚血ストレス時の神経保護作用を喪失している。発明者は週齢の若い該マウスの虚血処置時の表現型を評価すると共に、ドパミンＤ２受容体のアゴニストであるプラミペキソール、ドパミン代謝阻害剤であるセレギリンの該マウスに対する効果の検討を行った。その結果、該マウスは公知のハンチントン病モデルマウスに見られるような特徴を有することが確認された。また、その症状は、ドパミンＤ２受容体アゴニスト、ドパミン代謝阻害剤またはＮＭＤＡ受容体拮抗剤の投与によって改善されることを見出した。さらに、発明者は週齢を重ねた該マウスの表現型についても評価し、ドパミンＤ１受容体アゴニストであるＳＫＦ３８３９３の効果の検討を行った。その結果、加齢によって虚血処置時と類似の症状を自然発症すると共に、該症状は、ドパミンＤ１受容体アゴニストによって改善されることを見出した。
本発明者は、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、
［１］線条体においてプロサイモシンα遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物であって、対応する野生型動物と比較して、
（１）脳虚血処置に対して脆弱である、
（２）運動性が劣る、
（３）加齢によって、上記（１）および（２）の症状を自然発症する、および
（４）ドパミンＤ２受容体アゴニスト、ドパミン代謝阻害剤、ＮＭＤＡ受容体拮抗剤またはドパミンＤ１受容体アゴニストによって上記（１）、（２）および（３）の症状が改善する、
ことを特徴とする動物；
［２］Ｇ蛋白質γ７サブユニット遺伝子プロモーターにより発現制御されたｃｒｅ遺伝子を有し、かつｌｏｘＰ配列に挟まれたプロサイモシンα遺伝子をホモ接合型で有する、上記［１］に記載の動物；
［３］ドパミンＤ２受容体アゴニストがプラミペキソール、ペルゴリド、カベルゴリン、タリペキソールまたはロビニロールである、上記［１］に記載の動物；
［４］ドパミン代謝阻害剤がセレギリン、エンタカルボン、ドアマンタジン、Ｌ−ドーパ、ドロキシドパまたはゾニサミドである、上記［１］に記載の動物；
［５］ＮＭＤＡ受容体拮抗剤がメマンチンまたはＣＰ−１０１６０６である、上記［１］に記載の動物；
［６］ドパミンＤ１受容体アゴニストがＳＫＦ３８３９３である、上記［１］に記載の動物；
［７］動物がマウスまたはラットである、上記［１］に記載の動物；
［８］上記［１］に記載の動物に試験化合物を適用し、（１）脳虚血処置に対する生存率および／または（２）運動性を測定することを特徴とする、神経変性疾患または虚血性疾患由来のジストニアの治療／予防薬のスクリーニング方法；
［９］上記［１］に記載の動物であって、週齢が進んだ該動物に試験化合物を適用し、（１）生存率および／または（２）運動性を測定することを特徴とする、神経変性疾患または虚血性疾患由来のジストニアの治療／予防薬のスクリーニング方法；
［１０］試験化合物がドパミンＤ２受容体アゴニストである、上記［８］または［９］に記載のスクリーニング方法；
［１１］試験化合物がドパミン代謝阻害剤である、上記［８］または［９］に記載のスクリーニング方法；
［１２］試験化合物がＮＭＤＡ受容体拮抗剤である、上記［８］または［９］に記載のスクリーニング方法；
［１３］試験化合物がドパミンＤ１受容体アゴニストである、上記［８］または［９］に記載のスクリーニング方法；
［１４］神経変性疾患がハンチントン病である、上記［８］または［９］に記載のスクリーニング方法；
などを提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の線条体におけるプロサイモシンα遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物によれば、ハンチントン病を含む神経変性疾患の新規予防／治療薬をスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、マウスのプロサイモシンα遺伝子の野生型アリル、Ｆｌｏｘｅｄアリルおよび欠失アリルの構造を示す図である。
【図２】図２は、ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｍｉｄｄｌｅ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ａｒｔｅｒｙ Ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ（ｔＭＣＡＯ）処置を１５分間実施後における、ＷＴマウスの病態を示す図である。Ａ：ＷＴマウスに対するｔＭＣＡＯ処置と試験実施のタイムスケジュール、Ｂ：ＷＴマウスの生存率、Ｃ：ＷＴマウスのＣｌｉｎｉｃａｌ ｓｃｏｒｅ、Ｄ：ＷＴマウスのロータロッド（６ｒｐｍ）上の滞在時間。
【図３】図３は、ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｍｉｄｄｌｅ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ａｒｔｅｒｙ Ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ（ｔＭＣＡＯ）処置を１５分間実施後における、ＧｇマウスおよびＧｇＦＦマウスの病態を示す図である。＊は、有意差（ｐ＜０．０５，Ｇｇ ｖｓ ＧｇＦＦ）を示す。Ａ：ＧｇマウスおよびＧｇＦＦマウスに対するｔＭＣＡＯ処置と試験実施のタイムスケジュール、Ｂ：ＧｇマウスおよびＧｇＦＦマウスの生存率、Ｃ：ＧｇマウスおよびＧｇＦＦマウスのＣｌｉｎｉｃａｌ ｓｃｏｒｅ、Ｄ：ＧｇマウスおよびＧｇＦＦマウスのロータロッド（６ｒｐｍ）上の滞在時間。
【図４】図４は、プラミペキソールを投与され、ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｍｉｄｄｌｅ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ａｒｔｅｒｙ Ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ（ｔＭＣＡＯ）処置を１５分間実施後における、各種マウスの病態を示す図である。Ａ：各種マウスに対するプラミペキソールを投与、ｔＭＣＡＯ処置および試験実施のタイムスケジュール、Ｂ：各種マウスの生存率、Ｃ：各種マウスのＣｌｉｎｉｃａｌ ｓｃｏｒｅ。
【図５】図５は、プラミペキソールを投与され、ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｍｉｄｄｌｅ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ａｒｔｅｒｙ Ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ（ｔＭＣＡＯ）処置を１５分間実施後における、ＷＴマウスおよびＧｇＦＦマウスの病態を示す図である。＊＊は、有意差（ｐ＜０．０１，ｉｓｃｈｅｍｉａ ｖｓ ｉｓｃｈｅｍｉａ＋ＰＰＸ）を示す。Ａ：ＷＴマウスおよびＧｇＦＦマウスに対するプラミペキソールを投与、ｔＭＣＡＯ処置および試験実施のタイムスケジュール、Ｂ：ＷＴマウスおよびＧｇＦＦマウスのロータロッド（６ｒｐｍ）上の滞在時間、Ｃ：ＷＴマウスおよびＧｇＦＦマウスのロータロッド（１２ｒｐｍ）上の滞在時間。
【図６】図６は、セレギリンを投与され、ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｍｉｄｄｌｅ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ａｒｔｅｒｙ Ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ（ｔＭＣＡＯ）処置を１５分間実施後における、各種マウスの病態を示す図である。Ａ：各種マウスに対するセレギリンを投与、ｔＭＣＡＯ処置および試験実施のタイムスケジュール、Ｂ：各種マウスの生存率、Ｃ：各種マウスのＣｌｉｎｉｃａｌ ｓｃｏｒｅ。
【図７】図７は、セレギリンを投与され、ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｍｉｄｄｌｅ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ａｒｔｅｒｙ Ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ（ｔＭＣＡＯ）処置を１５分間実施後における、ＧｇＦＦマウスの病態を示す図である。Ａ：ＧｇＦＦマウスに対するセレギリンを投与、ｔＭＣＡＯ処置および試験実施のタイムスケジュール、Ｂ：ＧｇＦＦマウスのロータロッド（６ｒｐｍ）上の滞在時間、Ｃ：ＧｇＦＦマウスのロータロッド（１２ｒｐｍ）上の滞在時間。
【図８】図８は、ＷＴマウス、ＧｇマウスおよびＧｇＦＦマウスのｃｌａｓｐｉｎｇ ｓｃｏｒｅ、ロータロッド上での滞在時間を示す図である。＊＊は、有意差（ｐ＜０．０１，Ｇｇ ｖｓ ＧｇＦＦ）、＃は、（ｐ＜０．０５，ＷＴ ｖｓ ＧｇＦＦ）、＃＃は、（ｐ＜０．０５，ＷＴ ｖｓ ＧｇＦＦ）を示す。Ａ：１０週齢の各種マウスのｃｌａｓｐｉｎｇ ｓｃｏｒｅ、Ｂ：２０週齢の各種マウスのｃｌａｓｐｉｎｇ ｓｃｏｒｅ、Ｃ：各種マウスの抱擁反射の写真像、Ｄ：１０週齢の各種マウスのロータロッド（３０ｒｐｍ）上の滞在時間、Ｅ：１０週齢の各種マウスのロータロッド（４０ｒｐｍ）上の滞在時間、Ｆ：２０週齢の各種マウスのロータロッド（３０ｒｐｍ）上の滞在時間、Ｇ：２０週齢の各種マウスのロータロッド（４０ｒｐｍ）上の滞在時間。
【図９】図９は、プラミペキソール投与後２４時間以内のＧｇマウスおよびＧｇＦＦマウスのｃｌａｓｐｉｎｇ ｓｃｏｒｅ、ロータロッド上での滞在時間を示す図である。Ａ：ＧｇマウスおよびＧｇＦＦマウスのｃｌａｓｐｉｎｇ ｓｃｏｒｅ、Ｂ：ＧｇマウスおよびＧｇＦＦマウスのロータロッド（３０ｒｐｍ）上の滞在時間、Ｃ：ＧｇマウスおよびＧｇＦＦマウスのロータロッド（４０ｒｐｍ）上の滞在時間。
【図１０】図１０は、プラミペキソール投与後７日目までのＷＴマウス、ＧｇマウスおよびＧｇＦＦマウスのｃｌａｓｐｉｎｇ ｓｃｏｒｅ、ロータロッド上での滞在時間を示す図である。Ａ：ＧｇマウスおよびＧｇＦＦマウスに対するプラミペキソール投与と試験実施のタイムスケジュール、Ｂ：ＧｇマウスおよびＧｇＦＦマウスのｃｌａｓｐｉｎｇ ｓｃｏｒｅ、Ｃ：ＧｇマウスおよびＧｇＦＦマウスのロータロッド（３０ｒｐｍ）上の滞在時間、Ｄ：ＧｇマウスおよびＧｇＦＦマウスのロータロッド（４０ｒｐｍ）上の滞在時間。
【図１１】図１１は、セレギリン投与後２４時間以内のＧｇＦＦマウスのｃｌａｓｐｉｎｇ ｓｃｏｒｅ、ロータロッド上での滞在時間を示す図である。Ａ：ＧｇＦＦマウスに対するセレギリン投与と試験実施のタイムスケジュール、Ｂ：ＧｇＦＦマウスのｃｌａｓｐｉｎｇ ｓｃｏｒｅ、Ｃ：ＧｇＦＦマウスのロータロッド（３０ｒｐｍ）上の滞在時間、Ｄ：ＧｇＦＦマウスのロータロッド（４０ｒｐｍ）上の滞在時間。
【図１２】図１２は、メマンチン投与後２４時間以内のＧｇＦＦマウスのｃｌａｓｐｉｎｇ ｓｃｏｒｅ、ロータロッド上での滞在時間を示す図である。Ａ：ＧｇＦＦマウスに対するメマンチン投与と試験実施のタイムスケジュール、Ｂ：ＧｇＦＦマウスのｃｌａｓｐｉｎｇ ｓｃｏｒｅ、Ｃ：ＧｇＦＦマウスのロータロッド（３０ｒｐｍ）上の滞在時間、Ｄ：ＧｇＦＦマウスのロータロッド（４０ｒｐｍ）上の滞在時間。
【図１３】図１３は、メマンチン投与後７日目までのＧｇＦＦマウスのｃｌａｓｐｉｎｇ ｓｃｏｒｅ、ロータロッド上での滞在時間を示す図である。Ａ：ＧｇＦＦマウスに対するメマンチン投与と試験実施のタイムスケジュール、Ｂ：ＧｇＦＦマウスのｃｌａｓｐｉｎｇ ｓｃｏｒｅ、Ｃ：ＧｇＦＦマウスのロータロッド（３０ｒｐｍ）上の滞在時間、Ｄ：ＧｇＦＦマウスのロータロッド（４０ｒｐｍ）上の滞在時間。
【図１４】図１４は、ＧｇＦＦマウス由来のゲノムを鋳型としたジェノミックＰＣＲ産物の電気泳動を示す図である。
【図１５】図１５は、ＧｇマウスおよびＧｇＦＦマウスの脳における、プロサイモシンα欠損領域を示す図である。Ａ：脳に対するプロサイモシンαのＤＡＢ染色像、Ｂ：脳に対するプロサイモシンαのＤＡＢ染色像の４倍視野（Ｃｐｕ；線条体、Ｈｉｐ；海馬、Ｃｅｒｅ；小脳）、Ｃ：脳に対するプロサイモシンαのＤＡＢ染色像および蛍光染色像の２０倍視野、Ｄ：プロサイモシンαのＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ像
【図１６】図１６は、ＧｇマウスおよびＧｇＦＦマウスの脳における、神経細胞形態および神経細胞数の変化を示す図である。Ａ：脳に対するＮｉｓｓｌ染色像、Ｂ：脳に対するＮｉｓｓｌ染色像の１０倍視野（Ｃｐｕ；線条体、Ｈｉｐ；海馬、Ｃｅｒｅ；小脳）、Ｃ：脳に対するＮｉｓｓｌ染色像の２０倍視野（ＣＡ１；海馬ＣＡ１領域、ＤＧ；歯状回）
【図１７】図１７は、ＧｇマウスおよびＧｇＦＦマウスにおける自発運動量および行動速度の評価を示す図である。＊は、有意差（ｐ＜０．０５，ｖｓ Ｇｇ）を示す。Ａ：Ｏｐｅｎ ｆｉｅｌｄ試験における１０分ごとのマウスの行動軌跡（代表的な１匹を例示）、Ｂ：行動距離、Ｃ：平均行動速度、Ｄ：中心滞在時間
【図１８】図１８は、ＧｇマウスおよびＧｇＦＦマウスにおける不安様症状の評価を示す図である。Ａ：Ｍａｒｂｌｅ ｂｕｒｙｉｎｇ試験前後のビー玉の様子、Ｂ：Ｍａｒｂｌｅ ｂｕｒｙｉｎｇ試験でマウスが隠したビー玉の数、Ｃ：Ｎｏｖｅｌｔｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｈｙｐｏｐｈａｇｉａ試験でマウスがミルクを飲みに行くまでの時間、Ｄ：Ｎｏｖｅｌｔｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｈｙｐｏｐｈａｇｉａ試験でマウスが３０分間で飲んだミルクの量
【図１９】図１９は、ＧｇマウスおよびＧｇＦＦマウスの運動機能評価を示す図である。＊は、有意差（ｐ＜０．０５，ｖｓ Ｇｇ）を示す。Ａ：最初３日間のマウスのロータロッド（２０ｒｐｍ）上の滞在時間、Ｂ：４日目のマウスのロータロッド（３０ｒｐｍ）上の滞在時間、Ｃ：Ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ ｔｈｉｎ ｒｏｄ ｔｅｓｔにおけるロッド上の滞在時間、Ｄ：Ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ試験におけるマウスの歩幅、前肢両間の距離、後肢両間の距離および前後肢のかぶり
【図２０】図２０は、Ｄ１アゴニスト、Ｄ２アゴニスト投与後５時間のＧｇＦＦマウスのロータロッド上での滞在時間を示す図である。＊は、有意差（ｐ＜０．０５，ｖｓ ｖｅｈｉｃｌｅ）を示す。Ａ：ＳＫＦ３８３９３投与後のＧｇＦＦマウスのロータロッド（３０ｒｐｍ）上の滞在時間、Ｂ：プラミペキソール投与後のＧｇＦＦマウスのロータロッド（３０ｒｐｍ）上の滞在時間
【図２１】図２１は、ＧｇマウスおよびＧｇＦＦマウスのその他の行動学的解析結果を示す図である。＊は、有意差（ｐ＜０．０５，ｖｓ Ｇｇ）を示す。Ａ：１０週齢ごとのマウスの平均体重、Ｂ：Ｗｉｒｅｈａｎｇ ｔｅｓｔにおける網から落下するまでの時間、Ｃ：Ｔａｉｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｔｅｓｔにおける１分間ごとのマウスの無動時間の割合、Ｄ：Ｆｏｒｃｅｄ ｓｗｉｍ ｔｅｓｔにおける１分間ごとのマウスの無動時間の割合、Ｅ：Ｎｅｓｔ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｔｅｓｔにおける一晩経過後の未使用Ｎｅｓｔｌｅｔｓの量と巣の形状のスコア、Ｆ：Ｓｔｅｐ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｅｓｔにおける暗箱に入るまでの時間、Ｔｒａｉｎｉｎｇ；１日目、Ｔｅｓｔ；２日目
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、線条体におけるプロサイモシンα遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
【００１１】
線条体におけるプロサイモシンα遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物とは、内在性プロサイモシンαの発現が線条体において不活性化された非ヒト哺乳動物を意味し、例えば、ｌｏｘＰ配列によって挟まれたプロサイモシンα遺伝子を有する組換えＥＳ細胞から作製されるプロサイモシンα遺伝子改変非ヒト哺乳動物と線条体特異的に発現されるｃｒｅ遺伝子を有する遺伝子改変非ヒト哺乳動物との交配によって得られる、線条体におけるプロサイモシンα遺伝子がノックアウトされた非ヒト哺乳動物の他、アンチセンスもしくはＲＮＡｉ技術によりプロサイモシンα遺伝子の発現が線条体において不活性化されるノックダウン（ＫＤ）非ヒト哺乳動物なども含まれる。ここで「ノックアウト（ＫＯ）」とは、内在性遺伝子を破壊したり、除去したりすることにより完全なｍＲＮＡを産生不能にすることを意味し、他方、「ノックダウン（ＫＤ）」とは、ｍＲＮＡから蛋白質への翻訳を阻害することにより、結果的に内在性遺伝子の発現を不活性化することを意味する。以下、本発明の線条体におけるプロサイモシンα遺伝子ＫＯ／ＫＤ動物を、単に「本発明のＫＯ／ＫＤ動物」という場合がある。また、線条体において不活性化されたとは、大脳基底核の一部分である線条体においてプロサイモシンαの遺伝子発現が不活性化されていることをいい、線条体以外のその他の組織では野生型非ヒト哺乳動物と該遺伝子の発現に有意な差はない。
【００１２】
本発明で対象とし得る「非ヒト哺乳動物」は、トランスジェニック系が確立されたヒト以外の哺乳動物であれば特に制限はなく、例えば、マウス、ラット、ウシ、サル、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスターなどが挙げられる。好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター等であり、なかでも疾患モデル動物作製の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、繁殖が容易な齧歯動物がより好ましく、とりわけマウス（例えば、純系としてＣ５７ＢＬ／６系統、ＢＡＬＢ／ｃ系統、ＤＢＡ２系統など、交雑系としてＢ６Ｃ３Ｆ１系統、ＢＤＦ１系統、Ｂ６Ｄ２Ｆ１系統、ＩＣＲ系統など）およびラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ、ＳＤなど）が好ましい。
また、哺乳動物以外にもニワトリなどの鳥類を、本発明で対象とする「非ヒト哺乳動物」と同様の目的に用いることができる。
【００１３】
線条体においてプロサイモシンα遺伝子をノックアウトする具体的な手段としては、対象非ヒト哺乳動物由来のプロサイモシンα遺伝子（ゲノムＤＮＡ）を常法に従って単離し、例えば、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系やＦｌｐ−ｆｒｔ系を用いてプロサイモシンα遺伝子の全部または一部を切り出して該遺伝子を欠失させることによって、結果的に遺伝子を不活性化するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、相同組換えにより対象非ヒト哺乳動物のプロサイモシンα遺伝子座に組み込ませる方法などが好ましく用いられ得る。
【００１４】
該相同組換え体は、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）への上記ターゲッティングベクターの導入により取得することができる。
ＥＳ細胞は胚盤胞期の受精卵の内部細胞塊（ＩＣＭ）に由来し、インビトロで未分化状態を保ったまま培養維持できる細胞をいう。ＩＣＭの細胞は将来、胚本体を形成する細胞であり、生殖細胞を含むすべての組織の基になる幹細胞である。ＥＳ細胞としては、既に樹立された細胞株を用いてもよく、また、ＥｖａｎｓとＫａｕｆｍａｎの方法（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２９２巻、１５４頁、１９８１年）に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系マウス由来のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で、例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ１）から樹立されるＥＳ細胞なども良好に用いることができる。ＢＤＦ１マウスは、採卵数が多く、かつ卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これ由来のＥＳ細胞は疾患モデルマウスを作製したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスと戻し交雑することでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用いられ得る。
【００１５】
ＥＳ細胞の調製は、例えば以下のようにして行うことができる。交配後の雌非ヒト哺乳動物［例えばマウス（好ましくはＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）などの近交系マウス、Ｂ６と他の近交系とのＦ１など）を用いる場合は、約２ヶ月齢以上の雄マウスと交配させた約８〜約１０週齢程度の雌マウス（妊娠約３．５日）が好ましく用いられる］の子宮から胚盤胞期胚を採取して（あるいは桑実胚期以前の初期胚を卵管から採取した後、胚培養用培地中で上記と同様にして胚盤胞期まで培養してもよい）、適当なフィーダー細胞（例えばマウスの場合、マウス胎仔から調製される初代線維芽細胞や公知のＳＴＯ線維芽細胞株等）層上で培養すると、胚盤胞の一部の細胞が集合して将来胚に分化するＩＣＭを形成する。この内部細胞塊をトリプシン処理して単細胞を解離させ、適切な細胞密度を保ち、培地交換を行いながら、解離と継代を繰り返すことによりＥＳ細胞が得られる。
【００１６】
ＥＳ細胞は雌雄いずれを用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作製するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行うことが望ましい。ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例として挙げられる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０６個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
また、第二次セレクションは、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましい。
【００１７】
このようにして得られるＥＳ細胞株は、未分化幹細胞の性質を維持するために注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ線維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上で、分化抑制因子として知られるＬＩＦ（１〜１０，０００Ｕ／ｍｌ）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス／９５％空気または５％酸素／５％炭酸ガス／９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０．００１〜０．５％トリプシン／０．１〜５ｍＭ ＥＤＴＡ、好ましくは約０．１％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１〜３日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
【００１８】
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能である〔Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓ及びＭ．Ｈ．Ｋａｕｆｍａｎ，ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２９２巻、１５４頁、１９８１年；Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ，プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）第７８巻、７６３４頁、１９８１年；Ｔ．Ｃ．Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら，ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第８７巻、２７頁、１９８５年〕。
【００１９】
例えば、ターゲッティングベクターが、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系を用いてプロサイモシンα遺伝子の全部または一部を切り出して該遺伝子を欠失させるべく設計されたものである場合、当該ベクターは、例えば、以下のような構成をとることができる。
【００２０】
まず、相同組換えにより、内在性のプロサイモシンα遺伝子の全部または一部に改変されたプロサイモシンα遺伝子の全部または一部を含むＤＮＡ断片が挿入されるために、ターゲッティングベクターは、当該改変されたプロサイモシンα遺伝子の全部または一部を含むＤＮＡ断片の５’上流および３’下流に、それぞれ標的部位と相同な配列（５’アームおよび３’アーム）を含む必要がある（例えば、ターゲッティングベクターは、挿入される他のＤＮＡ断片の５’上流側にプロサイモシンα遺伝子の５’調節領域と相同な配列を含み、３’下流側にはプロサイモシンα遺伝子の３’非翻訳領域と相同な配列を含む）。
【００２１】
本発明におけるプロサイモシンα遺伝子としては、具体的には、対象非ヒト哺乳動物がマウスの場合、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００８９７２．２として登録されている塩基配列と同一もしくは実質的に同一な塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。また、対象非ヒト哺乳動物がラットの場合、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０２１７４０．１として登録されている塩基配列と同一もしくは実質的に同一な塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。
【００２２】
プロサイモシンα遺伝子の塩基配列と実質的に同一な塩基配列とは、例えば、該塩基配列と、約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の同一性を有する塩基配列である。本明細書における塩基配列の同一性は、例えば、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。
【００２３】
さらに、該ターゲッティングベクターは、それぞれ標的部位と相同な配列の内側であって、かつプロサイモシンα遺伝子の全部または一部を挟み込む態様で、ｌｏｘＰ配列をタンデムに有する必要がある。相同組換えによって染色体上に組み込まれた当該ＤＮＡ断片は、プロサイモシンα遺伝子の全部または一部の両端の５’側および３’側に存在するｌｏｘＰ配列にＣｒｅ蛋白質が作用することによって、該ｌｏｘＰ配列に挟み込まれたプロサイモシンα遺伝子の全部または一部が切り出され、プロサイモシンα遺伝子がノックアウトされる。
【００２４】
挿入される他のＤＮＡ断片としては特に制限はないが、薬剤耐性遺伝子やレポーター遺伝子を用いると、ターゲッティングベクターが染色体へ組み込まれたＥＳ細胞を、薬剤耐性もしくはレポーター活性を指標として選択することができる。ここで薬剤耐性遺伝子としては、例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）遺伝子などが、レポーター遺伝子としては、例えば、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）遺伝子などがそれぞれ挙げられるが、それらに限定されない。
【００２５】
薬剤耐性もしくはレポーター遺伝子は、哺乳動物細胞内で機能し得る任意のプロモーターの制御下にあることが好ましい。例えば、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、マウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）ＬＴＲ、アデノウイルス（ＡｄＶ）由来初期プロモーター等のウイルスプロモーター、並びにβ−アクチン遺伝子プロモーター、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。
【００２６】
また、ターゲッティングベクターは、薬剤耐性もしくはレポーター遺伝子の下流に、該遺伝子からのｍＲＮＡの転写を終結させる配列（ポリアデニレーション（ｐｏｌｙＡ）シグナル、ターミネーターとも呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス遺伝子由来、あるいは各種哺乳動物または鳥類の遺伝子由来のターミネーター配列を用いることができる。好ましくは、ＳＶ４０由来のターミネーターなどが用いられる。
【００２７】
通常、哺乳動物における遺伝子組換えは大部分が非相同的であり、導入されたＤＮＡは染色体の任意の位置にランダムに挿入される。したがって、薬剤耐性やレポーター遺伝子の発現を検出するなどの選択（ポジティブ選択）によっては相同組換えにより標的となる内在性プロサイモシンα遺伝子にターゲッティングされたクローンのみを効率よく選択することができず、選択されたすべてのクローンについてサザンハイブリダイゼーション法もしくはＰＣＲ法による組込み部位の確認が必要となる。そこで、ターゲッティングベクターの標的配列に相同な領域の外側に、例えば、ガンシクロビル感受性を付与する単純ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子を連結しておけば、該ベクターがランダムに挿入された細胞はＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を有するため、ガンシクロビル含有培地では生育できないが、相同組換えにより内在性プロサイモシンα遺伝子座にターゲッティングされた細胞はＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を有しないので、ガンシクロビル耐性となり選択される（ネガティブ選択）。あるいは、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の代わりに、例えばジフテリア毒素遺伝子を連結すれば、該ベクターがランダムに挿入された細胞は自身の産生する該毒素によって死滅するので、薬剤非存在下で相同組換え体を選択することもできる。
【００２８】
ＥＳ細胞へのターゲッティングベクターの導入には、リン酸カルシウム共沈殿法、電気穿孔（エレクトロポレーション）法、リポフェクション法、レトロウイルス感染法、凝集法、顕微注入（マイクロインジェクション）法、遺伝子銃（パーティクルガン）法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などのいずれも用いることができるが、上述のように、哺乳動物における遺伝子組換えは大部分が非相同的であり、相同組換え体が得られる頻度は低いので、簡便に多数の細胞を処理できること等の点からエレクトロポレーション法が一般的に選択される。エレクトロポレーションには通常の動物細胞への遺伝子導入に使用されている条件をそのまま用いればよく、例えば、対数増殖期にあるＥＳ細胞をトリプシン処理して単一細胞に分散させた後、１０６〜１０８細胞／ｍｌとなるように培地に懸濁してキュベットに移し、ターゲッティングベクターを１０〜１００μｇ添加し、２００〜６００Ｖ／ｃｍの電気パルスを印加することにより行なうことができる。
【００２９】
ターゲッティングベクターが組み込まれたＥＳ細胞は、単一細胞をフィーダー細胞上で培養して得られるコロニーから分離抽出した染色体ＤＮＡをサザンハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ法によりスクリーニングすることによっても検定することができるが、他のＤＮＡ断片として薬剤耐性遺伝子やレポーター遺伝子を使用した場合は、それらの発現を指標として細胞段階で形質転換体を選択することができる。例えば、ポジティブ選択用マーカー遺伝子としてｎｐｔＩＩ遺伝子を含むベクターを用いた場合、遺伝子導入処理後のＥＳ細胞をＧ４１８などのネオマイシン系抗生物質を含有する培地中で培養し、出現した耐性コロニーをトランスフォーマントの候補として選択する。また、ネガティブ選択用マーカー遺伝子として、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を含むベクターを用いた場合、ガンシクロビルを含有する培地中で培養し、出現した耐性コロニーを相同組換え体の候補として選択する。得られたコロニーをそれぞれ培養プレートに移してトリプシン処理、培地交換を繰り返した後、一部を培養用として残し、残りをＰＣＲもしくはサザンハイブリダイゼーションにかけて導入ＤＮＡの存在を確認する。
【００３０】
導入ＤＮＡの組み込みが確認されたＥＳ細胞を同種の非ヒト哺乳動物由来の胚内に戻すと、宿主胚のＩＣＭに組み込まれてキメラ胚が形成される。これを仮親（受胚用雌）に移植してさらに発生を続けさせることにより、プロサイモシンα遺伝子が改変されたキメラ非ヒト哺乳動物が得られる。キメラ動物の中でＥＳ細胞が将来卵や精子に分化する始原生殖細胞の形成に寄与した場合には、生殖系列キメラが得られることとなり、これを交配することによりプロサイモシンα遺伝子改変が遺伝的に固定された非ヒト哺乳動物を作製することができる。
【００３１】
キメラ胚の作製方法としては、桑実胚期までの初期胚同士を接着させて集合させる方法（集合キメラ法）と、胚盤胞の割腔内に細胞を顕微注入する方法（注入キメラ法）とがある。ＥＳ細胞によるキメラ胚の作製においては従来より後者が広く行なわれているが、最近では、８細胞期胚の透明帯内へのＥＳ細胞の注入により集合キメラを作る方法や、マイクロマニピュレーターが不要で操作が容易な方法として、ＥＳ細胞塊と透明帯を除去した８細胞期胚とを共培養して凝集させることによって集合キメラを作製する方法も行われている。
【００３２】
いずれの場合も、宿主胚は、後述する受精卵への遺伝子導入において、採卵用雌として使用され得る非ヒト哺乳動物から同様にして採取することができるが、例えばマウスの場合、キメラマウス形成へのＥＳ細胞の寄与率を毛色（コートカラー）で判定し得るように、ＥＳ細胞の由来する系統とは毛色の異なる系統のマウスから宿主胚を採取することが好ましい。例えば、ＥＳ細胞が１２９系マウス（毛色：アグーチ）由来であれば、採卵用雌としてＣ５７ＢＬ／６マウス（毛色：ブラック）やＩＣＲマウス（毛色：アルビノ）を用い、ＥＳ細胞がＣ５７ＢＬ／６もしくはＤＢＦ１マウス（毛色：ブラック）由来のものやＴＴ２細胞（Ｃ５７ＢＬ／６とＣＢＡとのＦ１（毛色：アグーチ）由来）であれば、採卵用雌としてＩＣＲマウスやＢＡＬＢ／ｃマウス（毛色：アルビノ）を用いることができる。
【００３３】
また、生殖系列キメラ形成能はＥＳ細胞と宿主胚との組み合わせに大きく依存するので、生殖系列キメラ形成能の高い組み合わせを選択することがより好ましい。例えばマウスの場合、１２９系統由来のＥＳ細胞に対してはＣ５７ＢＬ／６系統由来の宿主胚等を用いることが好ましく、Ｃ５７ＢＬ／６系統由来のＥＳ細胞に対してはＢＡＬＢ／ｃ系統由来の宿主胚等が好ましい。
【００３４】
採卵用雌マウスは約４〜約６週齢程度が好ましく、交配用の雄マウスとしては約２〜約８ヶ月齢程度の同系統のものが好ましい。交配は自然交配によってもよいが、好ましくは性腺刺激ホルモン（卵胞刺激ホルモン、次いで黄体形成ホルモン）を投与して過剰排卵を誘起した後に行なわれる。
【００３５】
胚盤注入法による場合は、胚盤胞期胚（例えばマウスの場合、交配後約３．５日）を採卵用雌の子宮から採取し（あるいは桑実胚期以前の初期胚を卵管から採取した後、胚培養用培地（後述）中で胚盤胞期まで培養してもよい）、マイクロマニピュレーターを用いて胚盤胞の割腔内にターゲッティングベクターが導入されたＥＳ細胞（約１０〜約１５個）を注入した後、偽妊娠させた受胚用雌非ヒト哺乳動物の子宮内に移植する。受胚用雌非ヒト哺乳動物は受精卵への遺伝子導入における受胚用雌として使用され得る非ヒト哺乳動物を同様に用いることができる。
【００３６】
共培養法による場合は、８細胞期胚および桑実胚（例えばマウスの場合、交配後約２．５日）を採卵用雌の卵管および子宮から採取して（あるいは８細胞期以前の初期胚を卵管から採取した後、胚培養用培地中で８細胞期または桑実胚期まで培養してもよい）酸性タイロード液中で透明帯を溶解した後、ミネラルオイルを重層した胚培養用培地の微小滴中にターゲッティングベクターが導入されたＥＳ細胞塊（細胞数約１０〜約１５個）を入れ、さらに上記８細胞期胚または桑実胚（好ましくは２個）を入れて一晩共培養する。得られた桑実胚または胚盤胞を上記と同様にして受胚用雌非ヒト哺乳動物の子宮内に移植する。
【００３７】
移植胚が首尾よく着床し受胚雌が妊娠すれば、自然分娩もしくは帝王切開によりキメラ非ヒト哺乳動物が得られる。自然分娩した受胚雌にはそのまま哺乳を継続させればよく、帝王切開により出産した場合は、産仔は別途用意した哺乳用雌（通常に交配・分娩した雌非ヒト哺乳動物）に哺乳させることができる。
【００３８】
生殖系列キメラの選択は、まずＥＳ細胞の雌雄が予め判別されている場合はＥＳ細胞と同じ性別のキメラマウスを選択し（通常は雄性ＥＳ細胞が使用されるので、雄キメラマウスが選択される）、次いで毛色等の表現型からＥＳ細胞の寄与率が高いキメラマウス（例えば、５０％以上）を選択する。例えば、１２９系マウス由来の雄性ＥＳ細胞であるＤ３細胞とＣ５７ＢＬ／６マウス由来の宿主胚とのキメラ胚から得られるキメラマウスの場合、アグーチの毛色の占める割合の高い雄マウスを選択するのが好ましい。選択されたキメラ非ヒト哺乳動物が生殖系列キメラであるか否かの確認は、適当な系統の同種動物との交雑により得られるＦ１動物の表現型に基づいて行なうことができる。例えば、上記キメラマウスの場合、アグーチはブラックに対して優性であるので、雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスと交雑すると、選択された雄マウスが生殖系列キメラであれば得られるＦ１の毛色はアグーチとなる。
【００３９】
上記のようにして得られるターゲッティングベクターが導入された生殖系列キメラ非ヒト哺乳動物（ファウンダー）は、通常、相同染色体の一方のプロサイモシンα遺伝子のみが改変されたヘテロ接合体として得られる。相同染色体の両方のプロサイモシンα遺伝子が改変されたホモ接合体を得るためには、上記のようにして得られるＦ１動物のうちヘテロ接合体の兄妹同士を交雑すればよい。ヘテロ接合体の選択は、例えばＦ１動物の尾部より分離抽出した染色体ＤＮＡをサザンハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ法によりスクリーニングすることにより検定することができる。得られるＦ２動物の１／４がホモ接合体となる。
【００４０】
ターゲッティングベクターとしてウイルスを用いる場合の別の好ましい一実施態様として、ポジティブ選択用マーカー遺伝子が５’および３’アームの間に挿入され、該アームの外側にネガティブ選択用マーカー遺伝子を含むＤＮＡを含むウイルスで、非ヒト哺乳動物のＥＳ細胞を感染させる方法が挙げられる（例えば、プロシーディングズ・オヴ・ナショナル・アカデミー・オヴ・サイエンシーズ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）第９９巻，第４号，第２１４０−２１４５頁，２００２年参照）。例えば、レトロウイルスやレンチウイルスを用いる場合、ディッシュなどの適当な培養器に細胞を播き、培養液にウイルスベクターを加えて（所望によりポリブレンを共存させてもよい）、１〜２日間培養後、上述のように選択薬剤を添加して培養を続け、ベクターが組み込まれた細胞を選択する。
【００４１】
ｌｏｘＰ配列によって挟まれたプロサイモシンα遺伝子を有する、プロサイモシンα遺伝子改変非ヒト哺乳動物は、上記した方法によって作成されうるが、すでに現存するプロサイモシンα遺伝子改変非ヒト哺乳動物を入手して用いてもよい。
【００４２】
線条体におけるプロサイモシンα遺伝子がノックアウトされた非ヒト哺乳動物は、前記のｌｏｘＰ配列によって挟まれたプロサイモシンα遺伝子を有する、プロサイモシンα遺伝子改変非ヒト哺乳動物と線条体特異的に発現されるｃｒｅ遺伝子を有する遺伝子改変非ヒト哺乳動物を交配することによって得られる。
【００４３】
線条体特異的に発現されるｃｒｅ遺伝子を導入する具体的な手段としては、Ｃｒｅ蛋白質をコードするＤＮＡを、自体公知のトランスジェニック作製技術を用いて導入し、対象非ヒト哺乳動物内で線条体特異的に発現させる方法などが挙げられる。
【００４４】
Ｃｒｅ蛋白質をコードするＤＮＡとしては、バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ蛋白質もしくはそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡであってよい。Ｃｒｅ蛋白質をコードするＤＮＡとしては、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＹＰ＿００６４７２．１として登録されているアミノ酸配列をコードするＤＮＡが挙げられる。「実質的に同一のアミノ酸配列」としては、前記アミノ酸配列と約９０％以上、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。アミノ酸配列の同一性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）にて計算することができる。
実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質としては、前記アミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列からなる蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質が好ましい。実質的に同質の活性としては、例えば、ｌｏｘＰ配列結合作用、ｌｏｘＰに挟まれたＤＮＡ配列の切り出し作用などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が定性的に同等であることを示す。したがって、ｌｏｘＰ配列結合作用、ｌｏｘＰに挟まれたＤＮＡ配列の切り出し作用などの活性が同等であることが好ましいが、これらの活性の程度（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）や蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。また、Ｃｒｅ蛋白質をコードするＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＣ＿００５８５６．１として登録されている塩基配列に含まれるＤＮＡが用いられ得る。
【００４５】
Ｃｒｅ蛋白質をコードするＤＮＡは、バクテリオファージＰ１に由来するＤＮＡまたはＲＮＡの全てあるいは一部を用いて公知の方法により調製されたｃＤＮＡを原料として用い、公知のｃｒｅ遺伝子配列をもとに作製したオリゴヌクレオチドをプローブもしくはプライマーとして、ハイブリダイゼーション法もしくはＰＣＲ法などにより単離することができる。
【００４６】
本発明の線条体特異的に発現されるｃｒｅ遺伝子を有する遺伝子改変非ヒト哺乳動物は、Ｃｒｅ蛋白質をコードするＤＮＡを「線条体において特異的に発現可能な状態で」保持している。したがって、当該ＤＮＡを対象動物に導入するにあたっては、当該ＤＮＡを対象動物の線条体においてのみ機能し得るプロモーターの下流に連結した発現カセットを含む形態（例、発現ベクターなど）で用いる必要がある。
【００４７】
Ｃｒｅ蛋白質をコードするＤＮＡを担持するベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウイルスなどのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルスなどの動物もしくは昆虫ウイルスなどが用いられる。なかでも、プラスミド（好ましくは大腸菌由来、枯草菌由来または酵母由来、特に大腸菌由来のプラスミド）や、動物ウイルス（好ましくはレトロウイルス、レンチウイルス）が好ましい。
【００４８】
Ｃｒｅ蛋白質の遺伝子発現調節を行うプロモーターとしては、対象非ヒト哺乳動物の線条体において機能し得るプロモーターである必要があり、そのようなプロモーターとしては、例えば、Ｇ蛋白質γ７サブユニット遺伝子（Ｇｎｇ７）プロモーター、Ｄｉｓｔａｌ−ｌｅｓｓ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ５／６（Ｄｌｘ５／６）プロモーター、Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅプロモーター等が挙げられ、その中でも線条体に特異的に高発現するプロモーターとして、Ｇ蛋白質γ７サブユニット遺伝子（Ｇｎｇ７）プロモーターが特に好ましく用いられる。
【００４９】
Ｃｒｅ蛋白質をコードするＤＮＡの下流には、非ヒト哺乳動物において目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結させる配列（ポリアデニレーション（ｐｏｌｙＡ）シグナル、ターミネーターとも呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス遺伝子由来、あるいは各種哺乳動物または鳥類の遺伝子由来のターミネーター配列を用いて、効率よい導入遺伝子の発現を達成することができる。好ましくは、シミアンウイルスのＳＶ４０ターミネーターなどが用いられる。その他、目的の遺伝子をさらに高発現させる目的で、各遺伝子のスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核遺伝子のイントロンの一部を、プロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流に連結することも目的により可能である。
【００５０】
また、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を用いて非ヒト哺乳動物を作製する場合、上記のベクターは、導入ＤＮＡが安定に組み込まれたクローンを選択するための選択マーカー遺伝子（例：ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子）をさらに含むことが好ましい。さらに、相同組換えにより宿主染色体の特定の部位に導入ＤＮＡを組み込むこと（即ち、ノックイン動物の作製）を意図する場合には、上記のベクターは、ランダムな挿入を排除するために、標的部位と相同なＤＮＡ配列の外側に単純ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子やジフテリア毒素遺伝子をネガティブ選択マーカー遺伝子としてさらに含むことが好ましい。
【００５１】
上記のプロモーター、Ｃｒｅ蛋白質をコードするＤＮＡ、ターミネーターなどは、適当な制限酵素およびＤＮＡリガーゼ等を用いた通常の遺伝子工学的手法により、上記のベクター中に正しい配置で、即ち非ヒト哺乳動物においてＣｒｅ蛋白質を発現可能な配置で、挿入することができる。
【００５２】
Ｃｒｅ蛋白質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを細胞に導入する方法としては、標的細胞に応じて自体公知の方法が適宜用いられる。例えば、受精卵などの初期胚への導入については、マイクロインジェクション法が用いられる。また、ＥＳ細胞への導入については、リン酸カルシウム共沈殿法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、レトロウイルス感染法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などが用いられ得る。あるいは、ベクターとしてレトロウイルスやレンチウイルスなどを用いる場合には、初期胚やＥＳ細胞にウイルスを添加して１〜２日培養し、該細胞を該ウイルスに感染させることにより、簡便に遺伝子導入を達成し得る場合がある。ＥＳ細胞からの個体再生（ファウンダーの樹立）、継代（ホモ接合体の作製）等は、本発明のプロサイモシンα遺伝子改変非ヒト哺乳動物において上記した方法と同様の方法により行うことができる。
【００５３】
好ましい一実施態様においては、Ｃｒｅ蛋白質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターは、マイクロインジェクション法により対象となる非ヒト哺乳動物の初期胚に導入される。
【００５４】
対象非ヒト哺乳動物の初期胚は、同種の非ヒト哺乳動物の雌雄を交配させて得られる体内受精卵を採取するか、あるいは同種の非ヒト哺乳動物の雌雄からそれぞれ採取した卵と精子を体外受精させることにより得ることができる。
用いる非ヒト哺乳動物の齢や飼育条件等は動物種によってそれぞれ異なるが、例えばマウス（好ましくはＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）などの近交系マウス、Ｂ６と他の近交系とのＦ１など）を用いる場合は、雌が約４〜約６週齢、雄が約２〜約８ヶ月齢程度のものが好ましく、また、約１２時間明期条件（例えば７：００−１９：００）で約１週間飼育したものが好ましい。
【００５５】
体内受精は自然交配によってもよいが、性周期の調節と１個体から多数の初期胚を得ることを目的として、雌非ヒト哺乳動物に性腺刺激ホルモンを投与して過剰排卵を誘起した後、雄非ヒト哺乳動物と交配させる方法が好ましい。雌非ヒト哺乳動物の排卵誘発法としては、例えば初めに卵胞刺激ホルモン（妊馬血清性性腺刺激ホルモン、一般にＰＭＳＧと略する）、次いで黄体形成ホルモン（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、一般にｈＣＧと略する）を、例えば腹腔内注射などにより投与する方法が好ましいが、好ましいホルモンの投与量、投与間隔は非ヒト哺乳動物の種類によりそれぞれ異なる。例えば、非ヒト哺乳動物がマウス（好ましくはＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）などの近交系マウス、Ｂ６と他の近交系とのＦ１など）の場合は、通常、卵胞刺激ホルモン投与後、約４８時間後に黄体形成ホルモンを投与し、直ちに雄マウスと交配させることにより受精卵を得る方法が好ましく、卵胞刺激ホルモンの投与量は約２０〜約５０ＩＵ／個体、好ましくは約３０ＩＵ／個体、黄体形成ホルモンの投与量は約０〜約１０ＩＵ／個体、好ましくは約５ＩＵ／個体である。
【００５６】
一定時間経過後、膣栓の検査等により交配を確認した雌非ヒト哺乳動物の腹腔を開き、卵管から受精卵を取り出して胚培養用培地（例：Ｍ１６培地、修正Ｗｈｉｔｔｅｎ培地、ＢＷＷ培地、Ｍ２培地、ＷＭ−ＨＥＰＥＳ培地、ＢＷＷ−ＨＥＰＥＳ培地等）中で洗って卵丘細胞を除き、微小滴培養法等により５％炭酸ガス／９５％大気下でＤＮＡ顕微注入まで培養する。直ちに顕微注入を行わない場合、採取した受精卵を緩慢法または超急速法等で凍結保存することも可能である。
【００５７】
一方、体外受精の場合は、採卵用雌非ヒト哺乳動物（体内受精の場合と同様のものが好ましく用いられる）に上記と同様に卵胞刺激ホルモンおよび黄体形成ホルモンを投与して排卵を誘発させた後、卵子を採取して受精用培地（例：ＴＹＨ培地）中で体外受精時まで微小滴培養法等により５％炭酸ガス／９５％大気下で培養する。他方、同種の雄非ヒト哺乳動物（体内受精の場合と同様のものが好ましく用いられる）から精巣上体尾部を取り出し、精子塊を採取して受精用培地中で前培養する。前培養終了後の精子を卵子を含む受精用培地に添加し、微小滴培養法等により５％炭酸ガス／９５％大気下で培養した後、２個の前核を有する受精卵を顕微鏡下で選抜する。直ちにＤＮＡの顕微注入を行わない場合は、得られた受精卵を緩慢法または超急速法等で凍結保存することも可能である。
【００５８】
受精卵へのＤＮＡの顕微注入は、マイクロマニピュレーター等の公知の装置を用いて常法に従って実施することができる。簡潔に言えば、胚培養用培地の微小滴中に入れた受精卵をホールディングピペットで吸引して固定し、インジェクションピペットを用いてＤＮＡ溶液を雄性もしくは雌性前核、好ましくは雄性前核内に直接注入する。導入ＤＮＡはＣｓＣｌ密度勾配超遠心または陰イオン交換樹脂カラム等で高度に精製したものを用いることが好ましい。また、導入ＤＮＡは制限酵素を用いてベクター部分を切断し、直鎖状にしておくことが好ましい。
【００５９】
ＤＮＡ導入後の受精卵は胚培養用培地中で微小滴培養法等により５％炭酸ガス／９５％大気下で１細胞期〜胚盤胞期まで培養した後、偽妊娠させた受胚用雌非ヒト哺乳動物の卵管または子宮内に移植される。受胚用雌非ヒト哺乳動物は移植される初期胚が由来する動物と同種のものであればよく、例えば、マウス初期胚を移植する場合は、ＩＣＲ系の雌マウス（好ましくは約８〜約１０週齢）などが好ましく用いられる。受胚用雌非ヒト哺乳動物を偽妊娠状態にする方法としては、例えば、同種の精管切除（結紮）雄非ヒト哺乳動物（例えば、マウスの場合、ＩＣＲ系の雄マウス（好ましくは約２ヶ月齢以上））と交配させて、膣栓の存在が確認されたものを選択する方法が知られている。
【００６０】
受胚用雌は自然排卵のものを用いてもよいし、あるいは精管切除（結紮）雄との交配に先立って、黄体形成ホルモン放出ホルモン（一般にＬＨＲＨと略する）もしくはその類縁体を投与し、受精能を誘起させたものを用いてもよい。ＬＨＲＨ類縁体としては、例えば、［３，５−ＤｉＩ−Ｔｙｒ５］−ＬＨ−ＲＨ、［Ｇｌｎ８］−ＬＨ−ＲＨ、［Ｄ−Ａｌａ６］−ＬＨ−ＲＨ、［ｄｅｓ−Ｇｌｙ１０］−ＬＨ−ＲＨ、［Ｄ−Ｈｉｓ（Ｂｚｌ）６］−ＬＨ−ＲＨおよびそれらのＥｔｈｙｌａｍｉｄｅなどが挙げられる。ＬＨＲＨもしくはその類縁体の投与量、ならびにその投与後に雄非ヒト哺乳動物と交配させる時期は、非ヒト哺乳動物の種類によりそれぞれ異なる。例えば、非ヒト哺乳動物がマウス（好ましくはＩＣＲ系のマウスなど）の場合には、通常、ＬＨＲＨもしくはその類縁体を投与した後、約４日目に雄マウスと交配させることが好ましく、ＬＨＲＨあるいはその類縁体の投与量は、通常、約１０〜６０μｇ／個体、好ましくは約４０μｇ／個体である。
【００６１】
通常、移植される初期胚が桑実胚期以後の場合は受胚用雌の子宮に、それより前（例えば、１細胞期〜８細胞期胚）であれば卵管に胚移植される。受胚用雌は、移植胚の発生段階に応じて偽妊娠からある日数が経過したものが適宜使用される。例えばマウスの場合、２細胞期胚を移植するには偽妊娠後約０．５日の雌マウスが、胚盤胞期胚を移植するには偽妊娠後約２．５日の雌マウスが好ましい。受胚用雌を麻酔（好ましくはＡｖｅｒｔｉｎ、ネンブタール等が使用される）後、切開して卵巣を引き出し、胚培養用培地に懸濁した初期胚（約５〜約１０個）を胚移植用ピペットを用いて、卵管腹腔口もしくは子宮角の卵管接合部付近に注入する。
【００６２】
移植胚が首尾よく着床し受胚雌が妊娠すれば、自然分娩もしくは帝王切開により仔非ヒト哺乳動物が得られる。自然分娩した受胚雌にはそのまま哺乳を継続させればよく、帝王切開により出産した場合は、産仔は別途用意した哺乳用雌（例えばマウスの場合、通常に交配・分娩した雌マウス（好ましくはＩＣＲ系の雌マウス等））に哺乳させることができる。
【００６３】
受精卵細胞段階におけるＣｒｅ蛋白質をコードするＤＮＡの導入は、導入ＤＮＡが対象非ヒト哺乳動物の生殖系列細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。導入ＤＮＡが染色体ＤＮＡに組み込まれているか否かは、例えば、産仔の尾部より分離抽出した染色体ＤＮＡをサザンハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ法によりスクリーニングすることにより検定することができる。上記のようにして得られる仔非ヒト哺乳動物（Ｆ０）の生殖系列細胞においてＣｒｅ蛋白質をコードするＤＮＡが存在することは、その後代（Ｆ１）の動物全てが、その生殖系列細胞および体細胞のすべてにＣｒｅ蛋白質をコードするＤＮＡが存在することを意味する。
通常、Ｆ０動物は相同染色体の一方にのみ導入ＤＮＡを有するヘテロ接合体として得られる。また、個々のＦ０個体は相同組換えによらない限り異なる染色体上にランダムに挿入される。相同染色体の両方に導入ＤＮＡを有するホモ接合体を得るためには、Ｆ０動物と非トランスジェニック動物とを交雑してＦ１動物を作製し、相同染色体の一方にのみ導入ＤＮＡを有するヘテロ接合体の兄妹同士を交雑すればよい。１遺伝子座にのみ導入ＤＮＡが組み込まれていれば、得られるＦ２動物の１／４がホモ接合体となる。
【００６４】
ベクターとしてウイルスを用いる場合の別の好ましい一実施態様として、上記プロサイモシンα遺伝子改変非ヒト哺乳動物の場合と同様に、Ｃｒｅ蛋白質をコードするＤＮＡを含むウイルスで、非ヒト哺乳動物の初期胚もしくはＥＳ細胞を感染させる方法が挙げられる。細胞として受精卵を用いる場合は、感染に先立って透明帯を除いておくことが好ましい。ウイルスベクターを感染させて１〜２日間培養後、初期胚であれば、上述のように偽妊娠させた受胚用雌非ヒト哺乳動物の卵管または子宮内に移植し、ＥＳ細胞であれば、上述のように選択薬剤を添加して培養を続け、ベクターが組み込まれた細胞を選択する。
【００６５】
さらに、プロシーディングズ・オヴ・ナショナル・アカデミー・オヴ・サイエンシーズ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）第９８巻，第１３０９０−１３０９５頁，２００１年に記載されるように、雄非ヒト哺乳動物から採取した精原細胞をＳＴＯフィーダー細胞と共培養する間にウイルスベクターに感染させた後、雄性不妊非ヒト哺乳動物の精細管に注入して雌非ヒト哺乳動物と交配させることにより、効率よくＣｒｅ蛋白質をコードするＤＮＡのへテロ非ヒト哺乳動物（＋／−）産仔を得ることができる。
【００６６】
線条体特異的に発現されるＣｒｅ遺伝子を有する遺伝子改変非ヒト哺乳動物は、上記した方法によって作成されうるが、すでに現存する遺伝子改変非ヒト哺乳動物を入手して用いてもよい。
【００６７】
線条体特異的に発現されるＣｒｅ遺伝子を有する遺伝子改変非ヒト哺乳動物と前記のｌｏｘＰ配列によって挟まれたプロサイモシンα遺伝子を有する、プロサイモシンα遺伝子改変非ヒト哺乳動物とを交雑する場合、ホモ接合体同士を交雑することが望ましい。例えば、線条体特異的に発現されるｃｒｅ遺伝子を有する遺伝子改変非ヒト哺乳動物としてＧｎｇ７−Ｃｒｅ（＋／＋）マウスと、ｌｏｘＰ配列によって挟まれたプロサイモシンα遺伝子を有する、プロサイモシンα遺伝子改変非ヒト哺乳動物として、ＰｒｏＴａ ｆｌｏｘ（＋／＋）マウスとを交雑して得られるＦ１は、全個体がＧｎｇ７−Ｃｒｅ（＋／−）×ＰｒｏＴａ ｆｌｏｘ（＋／−）である。このＦ１個体同士を交雑することにより、１／８の確率でＧｎｇ７−Ｃｒｅ（＋／−）×ＰｒｏＴａ ｆｌｏｘ（＋／＋）が得られる。そこで、得られたＧｎｇ７−Ｃｒｅ（＋／−）×ＰｒｏＴａ ｆｌｏｘ（＋／＋）雄マウスに対し、ＰｒｏＴａ ｆｌｏｘ（＋／＋）雌マウスを交雑することで、1/2の高確率でＧｎｇ７−Ｃｒｅ（＋／−）×ＰｒｏＴａ ｆｌｏｘ（＋／＋）を効率的に得ることができる。上記交雑方式においてプロサイモシンα遺伝子がホモノックアウトされた影響が母体に与える影響を考慮し、雄がＧｎｇ７−Ｃｒｅ（＋／−）×ＰｒｏＴａ ｆｌｏｘ（＋／＋）で雌がＰｒｏＴａ ｆｌｏｘ（＋／＋）となるように交雑することが最も好ましい。プロサイモシンα遺伝子は線条体においてホモノックアウトされていることが好ましい。従って、線条体におけるプロサイモシンα遺伝子がノックアウトされた非ヒト哺乳動物としては、Ｇ蛋白質γ７サブユニット遺伝子プロモーターにより発現制御されたｃｒｅ遺伝子を有し、かつｌｏｘＰ配列に挟まれたプロサイモシンα遺伝子をホモ接合型で有する非ヒト哺乳動物が好ましく挙げられる。
【００６８】
線条体におけるプロサイモシンα遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物には、アンチセンスもしくはＲＮＡｉ技術によりプロサイモシンα遺伝子の発現が線条体において不活性化される条件付ノックダウン（ＫＤ）非ヒト哺乳動物も含まれる。
【００６９】
線条体においてプロサイモシンα遺伝子をノックダウンする具体的な手段としては、プロサイモシンαのアンチセンスＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡ（ｓｈＲＮＡを含む）をコードするＤＮＡを、自体公知のトランスジェニック作製技術を用いて導入し、対象非ヒト哺乳動物内で線条体特異的に発現させる方法などが挙げられる。
【００７０】
目的のポリヌクレオチドの標的領域と相補的な塩基配列を含むＤＮＡ、即ち、目的のポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるＤＮＡは、該目的のポリヌクレオチドに対して「アンチセンス」であるということができる。
プロサイモシンαをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に、相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンスＤＮＡとしては、プロサイモシンαをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有し、該ポリヌクレオチドの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスＤＮＡであってもよい。
【００７１】
プロサイモシンαをコードするポリヌクレオチドに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、該ポリヌクレオチドの相補鎖の塩基配列と、オーバーラップする領域に関して、約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列である。本明細書における塩基配列の相同性は、例えば、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。
特に、プロサイモシンαをコードするポリヌクレオチドの相補鎖の全塩基配列のうち、（ａ）翻訳阻害を指向したアンチセンスＤＮＡの場合は、プロサイモシンα蛋白質のＮ末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスＤＮＡが、（ｂ）ＲＮａｓｅＨによるＲＮＡ分解を指向するアンチセンスＤＮＡの場合は、イントロンを含むプロサイモシンαをコードするポリヌクレオチドの全塩基配列の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスＤＮＡがそれぞれ好適である。
【００７２】
具体的には、対象非ヒト哺乳動物がマウスの場合、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００８９７２．２として登録されている塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部を含むアンチセンスＤＮＡ、好ましくは、該塩基配列に相補的な塩基配列またはその一部を含むアンチセンスＤＮＡなどが挙げられる。また、対象非ヒト哺乳動物がラットの場合、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０２１７４０．１で表される塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部を含むアンチセンスＤＮＡ、好ましくは、該塩基配列に相補的な塩基配列またはその一部を含むアンチセンスＤＮＡなどが挙げられる。
【００７３】
プロサイモシンαをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンスＤＮＡ（以下、「本発明のアンチセンスＤＮＡ」ともいう）は、クローン化した、あるいは決定されたプロサイモシンαをコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。かかるアンチセンスＤＮＡは、プロサイモシンα遺伝子の複製または発現を阻害することができる。即ち、本発明のアンチセンスＤＮＡは、プロサイモシンα遺伝子から転写されるＲＮＡ（ｍＲＮＡまたは初期転写産物）とハイブリダイズすることができ、ｍＲＮＡの合成（プロセッシング）または機能（蛋白質への翻訳）を阻害することができる。
【００７４】
本発明のアンチセンスＤＮＡの標的領域は、アンチセンスＤＮＡがハイブリダイズすることにより、結果としてプロサイモシンα蛋白質への翻訳が阻害されるものであればその長さに特に制限はなく、該蛋白質をコードするｍＲＮＡの全配列であっても部分配列であってもよく、短いもので約１０塩基程度、長いものでｍＲＮＡまたは初期転写産物の全配列が挙げられる。具体的には、プロサイモシンα遺伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、翻訳開始コドン、蛋白質コード領域、ＯＲＦ翻訳終止コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域または３’端ヘアピンループなどが、アンチセンスＤＮＡの好ましい標的領域として選択しうるが、プロサイモシンα遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。例えば、該遺伝子のイントロン部分を標的領域とすることもできる。
さらに、本発明のアンチセンスＤＮＡは、プロサイモシンαのｍＲＮＡもしくは初期転写産物とハイブリダイズして蛋白質への翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖ＤＮＡであるプロサイモシンα遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、ＲＮＡの転写を阻害し得るものであってもよい。あるいはＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを形成してＲＮａｓｅＨによる分解を誘導するものであってもよい。
【００７５】
プロサイモシンαをコードするｍＲＮＡもしくは初期転写産物を、コード領域の内部（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）で特異的に切断し得るリボザイムをコードするＤＮＡもまた、本発明のアンチセンスＤＮＡに包含され得る。リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性ＲＮＡに見られるセルフスプライシングＲＮＡがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約４０塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約１０塩基程度）をｍＲＮＡの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的ｍＲＮＡのみを特異的に切断することが可能である。このタイプのリボザイムは、ＲＮＡのみを基質とするので、ゲノムＤＮＡを攻撃することがないというさらなる利点を有する。プロサイモシンα ｍＲＮＡが自身で二本鎖構造をとる場合には、ＲＮＡヘリカーゼと特異的に結合し得るウイルス核酸由来のＲＮＡモチーフを連結したハイブリッドリボザイムを用いることにより、標的配列を一本鎖にすることができる［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８（１０）：５５７２−５５７７（２００１）］。さらに、転写産物の細胞質への移行を促進するために、ｔＲＮＡを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２９（１３）：２７８０−２７８８（２００１）］。
【００７６】
本明細書においては、プロサイモシンαのｍＲＮＡもしくは初期転写産物のコード領域内の部分配列（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）に相同なオリゴＲＮＡとその相補鎖とからなる二本鎖ＲＮＡ、いわゆる短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もまた、本発明のＫＤ動物作製のために用いることができる。ｓｉＲＮＡを細胞内に導入するとそのＲＮＡに相同なｍＲＮＡが分解される、いわゆるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、この現象が動物細胞でも広く起こることが確認されて以来［Ｎａｔｕｒｅ，４１１（６８３６）：４９４−４９８（２００１）］、リボザイムの代替技術として汎用されている。ｓｉＲＮＡは標的となるｍＲＮＡの塩基配列情報に基づいて、市販のソフトウェア（例：ＲＮＡｉ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて適宜設計することができる。
【００７７】
本発明のアンチセンスオリゴＤＮＡ及びリボザイムは、プロサイモシンαのｃＤＮＡ配列もしくはゲノミックＤＮＡ配列に基づいてｍＲＮＡもしくは初期転写産物の標的配列を決定し、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。合成されたアンチセンスオリゴＤＮＡまたはリボザイムは、必要に応じて適当なリンカー（アダプター）配列を介して発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、アンチセンスオリゴＲＮＡまたはリボザイムをコードするＤＮＡ発現ベクターを調製することができる。ここで用いられ得る発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウイルスなどのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルスなどの動物もしくは昆虫ウイルスなどが用いられる。なかでも、プラスミド（好ましくは大腸菌由来、枯草菌由来または酵母由来、特に大腸菌由来のプラスミド）や、動物ウイルス（好ましくはレトロウイルス、レンチウイルス）が好ましく例示される。
【００７８】
また、本発明のアンチセンスオリゴＤＮＡを発現させるプロモーターは、線条体特異的に発現するプロモーターである必要がある。そのようなプロモーターとしては、例えば、Ｇ蛋白質γ７サブユニット遺伝子（Ｇｎｇ７）プロモーターが挙げられる。
【００７９】
より長いアンチセンスＲＮＡ（例えば、プロサイモシンαｍＲＮＡの相補鎖全長など）をコードするＤＮＡ発現ベクターは、常法によりクローニングしたプロサイモシンαｃＤＮＡを、必要に応じて適当なリンカー（アダプター）配列を介して発現ベクターのプロモーターの下流に逆方向に挿入することにより調製することができる。
【００８０】
一方、ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡは、センス鎖またはアンチセンス鎖をコードするＤＮＡとして別個に合成し、それぞれを適当な発現ベクター中に挿入することにより調製することができる。この場合、該ベクターが導入された動物細胞内で、センス鎖とアンチセンス鎖がそれぞれ転写されてアニーリングすることにより、ｓｉＲＮＡが形成される。ｓｈＲＮＡは、センス鎖とアンチセンス鎖との間に、適当なループ構造を形成しうる長さの塩基（例えば１５から２５塩基程度）を挿入したユニットを、適当な発現ベクター中に挿入することにより調製することができる。この場合、該発現ベクターを導入された動物細胞内で転写されたｓｈＲＮＡは、自身でループを形成した後に、内在の酵素ダイサー（ｄｉｃｅｒ）などによってプロセシングされることにより成熟ｓｉＲＮＡが形成される。ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを発現するベクターのプロモーターとしては、線条体特異的に発現するプロモーターである必要がある。そのようなプロモーターは、Ｇ蛋白質γ７サブユニット遺伝子（Ｇｎｇ７）プロモーターが挙げられる。
【００８１】
プロサイモシンαのアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、もしくはｍｉＲＮＡをコードするＤＮＡを含む発現ベクターを細胞に導入する方法、該ＤＮＡが導入された受精卵などの初期胚、ＥＳ細胞からの個体再生（ファウンダーの樹立）、継代（ホモ接合体の作製）等は前記したＣｒｅ蛋白質をコードするＤＮＡを用いて線条体特異的に発現されるＣｒｅ遺伝子を有する遺伝子改変非ヒト哺乳動物を作成する方法と同様の方法を用いることができる。
【００８２】
本発明の線条体においてプロサイモシンα遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物は、対応する野生型動物と比較して、以下の特性：
（１）脳虚血処置に対して脆弱である、
（２）運動性が劣る、
（３）加齢によって、上記（１）および／または（２）の症状を自然発症する、および
（４）ドパミンＤ２受容体アゴニスト、ドパミン代謝阻害剤、ＮＭＤＡ受容体拮抗剤またはドパミンＤ１受容体アゴニストによって上記（１）、（２）または（３）の症状が改善する、
を有する。これらの表現型は、従来公知のハンチントン病モデルマウスとしてのハンチンチントランスジェニックマウスやハンチンチンノックインマウスの表現型と一致する部分もあるが、それらのマウスは、線条体全体の神経細胞が傷害されているため、上記の表現型の進行が早く、より重篤であり、実際のハンチントン病の病態を正確に再現していない。また、本発明の線条体においてプロサイモシンα遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物は、運動性異常を示すことからジストニア（ｄｙｓｔｏｎｉａ）症状を示すモデルマウスの表現型とも一致する。ここでジストニアは、虚血性疾患に由来して発症するもの（二次性ジストニア）であってよく、虚血性疾患としては脳梗塞（脳血栓、脳塞栓）が挙げられる。
【００８３】
脳虚血処置に対して脆弱であるとは、例えば、本発明の非ヒト哺乳動物の中大脳動脈を結紮することによって、対応する野生型動物と比較して生存率が低下することをいう。運動性が劣るとは、中大脳動脈の結紮の有無に関わらず、対応する野生型動物と比較して運動機能、運動協調性が劣ることをいう。また、本発明の非ヒト哺乳動物は加齢によって、脳虚血処置に対する脆弱性および運動性が劣る症状を自然発症する。例えば、Ｇｎｇ ｃｒｅ／＋；ＰｒｏＴａ ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスであれば、約１０週齢で対応する野生型マウスと比べて、上記の症状が現れ、週齢が進むにつれて重篤化し、約２０週齢においては野生型マウスと比較して顕著な症状の差が確認できる。これら症状は、興奮性ドパミンＤ１受容体を発現する線条体ＧＡＢＡ神経において機能的プロモサイモシンαを欠失しており、神経保護作用を喪失していることに起因することが示唆される。さらに、本発明の非ヒト哺乳動物は、興奮性ドパミンＤ１受容体の作用の補完効果が期待できるドパミンＤ２受容体アゴニスト、ドパミン代謝阻害剤、グルタミン酸からの神経細胞保護効果が期待されるＮＭＤＡ受容体拮抗剤または抑制性ドパミンＤ２受容体の作用の補完効果が期待できるドパミンＤ１受容体アゴニストを投与されることによって、前記した症状に改善が見られる特徴を有する。ここで、ドパミンＤ２受容体アゴニストとしては、プラミペキソール、ペルゴリド、カベルゴリン、タリペキソール、ロビニロール等が挙げられる。また、ドパミン代謝阻害剤としては、セレギリン、エンタカルボン、ドパミン遊離作用を有するアマンタジン、ドパミンの前駆体であるＬ−ドーパ、プロドラッグとしてのＬ−ドーパ、ドロキシドパ、ドパミン合成酵素の発現上昇などに関連するゾニサミドなども挙げられる。ＮＭＤＡ受容体拮抗剤としては、メマンチン、ＣＰ−１０１６０６（ＩＵＰＡＣ名：（１Ｓ，２Ｓ）−１−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｐｈｅｎｙｌｐｉｐｅｒｉｄｉｎｏ）−１−ｐｒｏｐａｎｏｌ）などが挙げられる。ドパミンＤ１受容体アゴニストとしては、ＳＫＦ３８３９３（ＳＫＦ３８３９３ ＨＣｌ，（±）−１−ｐｈｅｎｙｌ−２，３，４，５−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−１Ｈ−３−ｂｅｎｚａｚｅｐｉｎｅ−７，８−ｄｉｏｌ ＨＣｌ）、ＳＫＦ８１２９７(６Ｃｈｌｏｒｏ１ｐｈｅｎｙｌ２，３，４，５ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ１Ｈ３ｂｅｎｚａｚｅｐｉｎｅ７，８ｄｉｏｌ)、Ｄｏｘａｎｔｈｒｉｎｅなどが挙げられる。
【００８４】
これらの知見に基づけば、プロサイモシンαの線条体における発現不全は、線条核神経の機能低下を通じて神経変性疾患の発症・進展に関与するだけでなく、ジストニアの発症・進展にも深く関与していることが強く示唆される。したがって、本発明の非ヒト哺乳動物は、被験物質を適用し、（１）脳虚血処置に対する生存率および／または（２）運動性を測定することを特徴とする、神経変性疾患または虚血性疾患によるジストニアの治療／予防薬のスクリーニング方法を提供する。さらに、前記の通り、本発明の非ヒト哺乳動物は、加齢とともに脳虚血処置に対する脆弱性および運動性が劣る症状を自然発症し、特に脳虚血処置なしであっても生存率が低下する可能性がある。従って、週齢が進んだ本発明の非ヒト哺乳動物は、被験物質を適用し、（１）生存率および／または（２）運動性を測定することを特徴とする、神経変性疾患または虚血性疾患によるジストニアの治療／予防薬のスクリーニング方法も提供する。週齢は、約１０週齢以上、好ましくは約２０週齢以上である。
【００８５】
具体的には、該スクリーニング方法では、本発明の非ヒト哺乳動物に被験物質を投与する。被験物質としては、公知の合成化合物、ペプチド、蛋白質、ＤＮＡライブラリーなどの他に、例えば哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど）の組織抽出物、細胞培養上清などが用いられ、好ましくは、ドパミンＤ２受容体アゴニスト、ドパミン代謝阻害剤、ＮＭＤＡ受容体拮抗剤またはドパミンＤ１受容体アゴニストが用いられうる。ドパミンＤ２受容体アゴニスト、ドパミン代謝阻害剤、ＮＭＤＡ受容体拮抗剤またはドパミンＤ１受容体アゴニストとしては前記したものが例示される。被験物質の脳虚血処置に対する生存率調節作用および／または運動性調節作用は、それぞれ自体公知の方法、例えば、後記実施例において用いられる方法などに準じて測定することができる。また、測定された結果、被験物質を非投与の本発明の非ヒト哺乳動物に比して脳虚血処置に対する生存率および／または運動性を改善させる被験物質が好ましく選択される。
【００８６】
該スクリーニング法により選択された、脳虚血処置に対する生存率調節作用および／または運動性調節作用を有する被験物質が予防・治療可能な疾患として、神経変性疾患（例えば、ハンチントン病、アルツハイマー、パーキンソン病、神経症（例えば、鬱、不安等）、ジストニア、進行性核上性麻痺、筋萎縮性側索硬化症、線条体黒質変性症、Ｓｈｙ−Ｄｒａｇｅｒ症候群、オリーブ橋小脳萎縮症などが挙げられる。さらに該被験物質は運動性障害の改善を目的として虚血性疾患に由来するジストニアの予防・治療も可能である。
【００８７】
神経変性疾患等の治療／予防薬は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。該治療／予防薬は、生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。これら製剤における有効成分量は後述する投与量を考慮して適宜選択される。
【００８８】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。
【００８９】
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。
【００９０】
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
【００９１】
神経変性疾患等の治療／予防薬の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより異なるが、例えば、神経変性疾患の治療目的で経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇ）においては、一日につき約０．１ｍｇ〜約１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜約５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜約２０ｍｇである。非経口投与の場合、当該治療／予防薬の投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、神経変性疾患の治療目的で注射剤として成人（体重６０ｋｇ）に投与する場合、一日につき約０．０１〜約３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜約２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜約１０ｍｇ程度である。投与対象がヒト以外の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【実施例】
【００９２】
以下において、実施例および参考例により本発明をより具体的に説明するが、この発明はこれらに限定されるものではない。
【００９３】
実施例１ 遺伝子組み換えマウスの作成
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系雄性マウス（野生型マウス）に加え、線条体に特異的に発現するＧｎｇ７のプロモーターにより制御された相同組換え酵素（Ｃｒｅ）を発現するＴＧマウス（Ｇｎｇ７−Ｃｒｅ（＋／−）雄性マウス）、さらにはＧｎｇ７−Ｃｒｅ（＋／−）とＦｌｏｘｅｄプロサイモシンα遺伝子組み換えマウスを交配させたコンディショナル遺伝子欠損マウス（Ｇｎｇ ｃｒｅ／＋；ＰｒｏＴａ ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ雄性マウス）を実験に用いた。両マウスは若齢マウスとして８−１６週齢、高齢マウスとして２０−３０週齢ともに体重：２０−３５ｇの個体を使用した。飼育条件は恒温（２２±２℃）、恒湿（５５±５％）とし、一般実験用の固形飼料（ＭＦ、オリエンタル酵母、東京）、水道水を自由に摂取させた。すべての実験は長崎大学動物実験規則で定める方法に準じて行った。Ｇｎｇ７−Ｃｒｅ（＋／＋）雄性マウスは東京大学大学院 医学系研究科分子神経生物学教室三品昌美教授より、Ｆｌｏｘｅｄプロサイモシンα遺伝子組み換えマウスは大塚製薬株式会社から譲渡された。
マウスプロサイモシンα遺伝子の野生型アリルの構造は図１上段に示すとおりである。また、Ｆｌｏｘｅｄプロサイモシンα遺伝子組み換えマウスの有するＦｌｏｘｅｄアリルは、エキソン１と２の間、およびエキソン３と４の間にｌｏｘＰ配列が相互にタンデムになるようにそれぞれ挿入されており（図１、中段）、Ｃｒｅ蛋白質がｌｏｘＰ配列に作用することによって、２つのｌｏｘＰ配列に挟まれたエキソン２および３を含む配列が欠失する（図１、下段）。なお、Ｃｒｅ蛋白質は、線条体特異的発現プロモーターであるＧｎｇ７プロモーター下流に連結され、上記のコンディショナルマウスは線条体において特異的にプロサイモシンα遺伝子が機能不全となる。本実施例においては、特に別途記載が無い限り、ＷＴは野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／Ｊ６）を、ＧｇはＧｎｇ７−Ｃｒｅ（＋／−）マウスつまりＧｎｇ７プロモーター下流にｃｒｅ遺伝子をヘテロ接合型となるように挿入したマウスを、ＧｇＦＦはＧｎｇ７発現領域である大脳基底核の線条体領域特異的にｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムでプロサイモシンαを欠損させたマウスを示す。
【００９４】
実施例２ 虚血による線条体におけるプロサイモシンα欠損の若齢マウスの病態
８−１６週齢のＷＴ、ＧｇおよびＧｇＦＦマウスを１５分間左中大脳動脈を閉塞することで、一過性の脳虚血状態を引き起こした軽度脳卒中モデルの病態を評価した（図２、３）。ＧｇＦＦマウスの対照群にはＧｇマウスを用いた。
ｔＭＣＡＯ処置後の一過性中大脳動脈閉塞モデルの生存率を経時的に評価した結果、ＷＴマウスでは、生存率は５日間にわたり無変化であった（図２Ｂ）。また、Ｇｇマウスでも４日目において９０％以上の生存率を示した（図３Ｂ）。しかし、ＧｇＦＦマウスでは生存率を大幅に低下させ、処置後２日において、すでに生存率６０パーセント以下に低下した（図３Ｂ）。Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｉｏ（％）は、ｔＭＣＡＯ実施前に測定した値を１００％とし日数経過による生存率を百分率で示した。
また、ｔＭＣＡＯ処置後の一過性中大脳動脈閉塞モデルの運動機能障害を経日的に評価した結果、ＷＴマウスとＧｇマウスでは微弱な運動障害しか観察されなかった（図２Ｃ、３Ｃ）。しかし、ＧｇＦＦマウスでは４ポイントにも及ぶ障害が観察された（図３Ｃ）。本願の実施例において、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｃｏｒｅは次に示す１〜５の臨床スコアで表される。１：右前肢の麻痺、２：一方向性の動き、３：体勢を保てず一方向に傾く、４：自発運動の消失、５：死。
さらに、ｔＭＣＡＯ処置後の一過性中大脳動脈閉塞モデルの運動機能を経日的に評価した結果、ＧｇＦＦマウスはＧｇマウスに比して、滞在時間が短くなる傾向が見られた（図３Ｄ）。ロータロッドの回転速度は、脳卒中病態モデルマウスで実施可能な６ｒｐｍにて行った。
【００９５】
実施例３ 虚血による線条体におけるプロサイモシンα欠損の若齢マウスの病態に対するドパミンＤ２受容体アゴニストの症状改善効果
実施例２と同様に、８−１６週齢のＷＴ、ＧｇおよびＧｇＦＦマウスを１５分間左中大脳動脈を閉塞することで、一過性の脳虚血状態を引き起こした軽度脳卒中モデルに対して、プラミペキソールによる生存率、運動機能障害の改善効果を評価した（図４、５）。１５分間のｔＭＣＡＯ処置を施したＧｇＦＦマウスに０．０１ｍｇ／ｋｇプラミペキソールを腹腔内投与した際の症状改善効果を経過観察した結果をｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｉｏ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｃｏｒｅおよびＬａｔｅｎｃｙ ｔｏ ｆａｌｌで示す。対照群には同じく１５分間のｔＭＣＡＯ処置を施したＷＴマウス、Ｇｇマウスを用いた。ＰＰＸはプラミペキソールを示す。
その結果、ＷＴマウスでは投与群と非投与群に差は見られなかったが、ＧｇＦＦマウスでは、投与群において生存率が７５パーセントに改善した（図４Ｂ）。また、運動機能障害についても、ＧｇＦＦマウスの投与群において顕著に改善した（図５Ｃ）。さらに、運動機能について、６ｒｐｍと１２ｒｐｍの両条件下で、ＷＴマウスに比較してＧｇＦＦマウスの運動機能は低下していたが、プラミペキソールの腹腔内投与により改善が認められた（図５Ｂ、Ｃ）。
【００９６】
実施例４ 虚血による線条体におけるプロサイモシンα欠損の若齢マウスの病態に対するセレギリンの症状改善効果
実施例２と同様に、８−１６週齢のＷＴ、ＧｇおよびＧｇＦＦマウスを１５分間左中大脳動脈を閉塞することで、一過性の脳虚血状態を引き起こした軽度脳卒中モデルに対して、セレギリンによる生存率、運動機能障害の改善効果を評価した（図６、７）。１５分間のｔＭＣＡＯ処置を施したＧｇＦＦマウスに１０ｍｇ／ｋｇセレギリンを腹腔内投与した際の症状改善効果を経過観察した結果をｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｉｏ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｃｏｒｅおよびＬａｔｅｎｃｙ ｔｏ ｆａｌｌで示す。対照群には同じく１５分間のｔＭＣＡＯ処置を施したＷＴマウス、Ｇｇマウスを用いた。
その結果、ＧｇＦＦマウスでは、投与群において生存率が顕著に改善した（図６Ｂ）。また、運動機能障害についても、ＧｇＦＦマウスの投与群において顕著に改善した（図６Ｃ）。さらに、運動機能について、６ｒｐｍと１２ｒｐｍの両条件下で、非投与群に比べて、ＧｇＦＦマウスの運動機能は、セレギリンの腹腔内投与により改善が認められた（図７Ｂ、Ｃ）。
【００９７】
本発明者は、上記実施例において主に週齢８−１６の若齢マウスを対象に解析を行った。そこで、週齢の進んだ加齢マウスについても解析を行った。
【００９８】
実施例５ 線条体におけるプロサイモシンα欠損マウスの週齢依存的な抱擁反射行動または運動機能低下の進行
大脳基底核の線条体領域特異的にプロサイモシンαを欠損したマウスで週齢依存的なＣｌａｓｐｉｎｇ ｒｅｆｌｅｘ（抱擁反射）症状の発症ならびに運動機能の低下に関する評価を行った（図８）。Ｃｌａｓｐｉｎｇ ｓｃｏｒｅは異常がない場合０、前肢同士もしくは後肢同士を結ぶ行動を１、前後肢を結び抱え込む行動を２として判定した。その結果、ＷＴマウスおよびＧｇマウスは異常が確認できなかったが、１０週齢および２０週齢のＧｇＦＦマウスのＣｌａｓｐｉｎｇ ｓｃｏｒｅは、有意に高いことが確認できた（図８Ａ、Ｂ、Ｃ）。
また、運動機能の評価について、マウスを回転式のロッド上で歩行させ、ロッドに滞在できる時間を測定（ロータロッド法）することで評価した。ロッド上を歩行するには全身の各部位をコントロールしバランスをとる必要があるため、本試験は協調運動性の評価法として用いられている。マウス用ロータロッド（ＭＫ−６１０Ａ；室町器械）を最大滞在時間を６０秒間、ロッドの回転速度を３０ｒｐｍ、４０ｒｐｍの条件下で試験を行った。本実施例において本試験を行う前には、２０ｒｐｍの回転速度で６０秒間の訓練試行を１時間の間隔をあけて１日につき４回、３日間連続で行った。３０ｒｐｍはロータロッド回転速度１分毎３０回転すること、４０ｒｐｍは１分毎４０回転することを示す。その結果、ＧｇＦＦマウスのロータロッド上での滞在時間は、ＷＴマウスおよびＧｇマウスに比して有意に短いことが確認できた（図８Ｄ、Ｅ）。
【００９９】
実施例６ 線条体におけるプロサイモシンα欠損の高齢マウスの抱擁反射行動または運動機能低下に対するドパミンＤ２受容体アゴニストの症状改善効果
Ｃｌａｓｐｉｎｇ ｒｅｆｌｅｘおよび運動機能低下を示すＧｇＦＦマウスおよびコントロールとしてのＧｇマウスに対し、ドパミンＤ２受容体のアゴニストであるプラミペキソール０．０１ｍｇ／ｋｇを腹腔内に投与し、急性（２４時間以内）の症状改善効果を評価した（図９）。Ｐｒｅはプラミペキソール投与前、１ｈｒはプラミペキソール投与１時間後を、以下５ｈｒは５時間後、２４ｈｒは２４時間後を示す。なお、本願実施例で用いられるプラミペキソールは塩酸プラミペキソール（ビ・シフロール ０．１２５ｍｇ錠、日本ベーリンガーインゲルハイム）を乳棒、乳鉢を用いて粉砕し、生理食塩水に溶解した後、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを７．０に調整して用いた。各種マウスへは２７ゲージの注射針を用いて腹腔内に投与した。投与５時間後において、ＧｇＦＦマウスの上記の症状が緩和される傾向が観察された。
また、ＧｇＦＦマウスおよびＧｇマウスに対し、慢性的にプラミペキソールを０．０１ ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与した場合の症状改善効果についても、プラミペキソールの投与方法以外は原則的に上記と同様の方法に従って評価した（図１０）。Ｐｒｅ値はプラミペキソール投与前の測定値であり、プラミペキソールは投与１日目から７日目まで毎日投与し、投与してから２４時間後に投与１日後の値を測定、以下１日おきに７日目までｃｌａｓｐｉｎｇ ｓｃｏｒｅの判定ならびにロータロッドによる運動機能評価を行った（図１０Ａ）。その結果、ＧｇＦＦマウスのＣｌａｓｐｉｎｇ ｓｃｏｒｅは、投与前に比して経日的に改善する傾向が確認できた（図１０Ｂ）。また、ＧｇＦＦマウスのロータロッド上での滞在時間は、投与前に比して経日的に長くなる傾向が確認できた（図１０Ｃ、Ｄ）。
【０１００】
実施例７ 線条体におけるプロサイモシンα欠損の高齢マウスの抱擁反射行動または運動機能低下に対するセレギリンの症状改善効果
ＧｇＦＦマウスに対し、ドパミン代謝に関わるＭＡＯ−Ｂの阻害剤であるセレギリン１０ｍｇ／ｋｇを腹腔内に投与し、急性（２４時間以内）の症状改善効果を評価した（図１１）。セレギリンは、モノアミン酸化酵素阻害剤（ＭＡＯＩ）のひとつで、選択的にＭＡＯ−Ｂを阻害しドーパミンの分解を防ぐことで、結果的に脳内ドーパミン量を増加させる薬剤である。Ｐｒｅはセレギリン投与前、１ｈｒはセレギリン投与１時間後を、以下５ｈｒは５時間後、２４ｈｒは２４時間後を示す。その結果、ＧｇＦＦマウスのＣｌａｓｐｉｎｇ ｓｃｏｒｅは、投与前に比して改善する傾向が確認できた（図１１Ｂ）。また、ＧｇＦＦマウスのロータロッド上での滞在時間は、投与前に比して経時的に長くなる傾向が確認できた（図１１Ｃ、Ｄ）。
【０１０１】
実施例８ 線条体におけるプロサイモシンα欠損の高齢マウスの抱擁反射行動または運動機能低下に対するメマンチンの症状改善効果
ＧｇＦＦマウスに対し、グルタミン酸過剰による細胞死を抑制するＮＭＤＡ受容体拮抗作用を有するメマンチン１０ｍｇ／ｋｇを腹腔内に投与し、急性（２４時間以内）の症状改善効果を評価した（図１２）。Ｐｒｅはメマンチン投与前、１ｈｒはメマンチン投与１時間後を、以下５ｈｒは５時間後、２４ｈｒは２４時間後を示す。投与２４時間後において、ＧｇＦＦマウスの運動機能は最も回復が見られた。
ＧｇＦＦマウスに対し、慢性的にメマンチンを１０ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与した場合の症状改善効果を示す。Ｐｒｅ値はメマンチン投与前の測定値であり、メマンチンは投与１日目から７日目まで毎日投与し、投与してから２４時間後に投与１日後の値を測定、以下１日おきに７日目までｃｌａｓｐｉｎｇ ｓｃｏｒｅの判定ならびにロータロッドによる運動機能評価を評価した（図１３）。Ｐｒｅ値はメマンチン投与前の測定値であり、メマンチンは投与１日目から７日目まで毎日投与し、投与してから２４時間後に投与１日後の値を測定、以下１日おきに７日目までｃｌａｓｐｉｎｇ ｓｃｏｒｅの判定ならびにロータロッドによる運動機能評価を行った（図１３Ａ）。結果として、慢性投与によって顕著に症状が回復することが確認できた。
【０１０２】
実施例９ プロサイモシンα欠損の高齢マウスのジェノタイピング
週齢２０−３０のＧｇＦＦおよびＧｇの耳片を５０μｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（２０×ＳＳＣ ５００μｌ，５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ ｐＨ８．０ ２００μｌ，５００ｍＭ ＥＤＴＡ ｐｈ８．０ ４００μｌ，１０％ＳＤＳ １．０ｍｌ，１ｍｇ／ｍｌ ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ ５００μｌ，ＤＷ ７．４ｍｌ）に入れ、６０℃でＯｖｅｒｎｉｇｈｔすることによりＤＮＡを抽出した。ＭａｎｇｏＭｉｘ ２ｘマスターミックス（ＢＩＯＬＩＮＥ）を用い、遺伝子型をＰＣＲ法により判定した（図１４）。プライマーとＰＣＲ条件は以下のものを用いた。
ＧｇＦＦ；
５’−ＴＣＣＴＴＧＧＣＴＴＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＡＡＧ−３’ （配列番号１）
５’−ＴＣＡＣＣＴＧＧＡＧＡＡＴＣＡＡＴＣＡＡＧＧＣ−３’ （配列番号２）
９４℃ １８０ｓ→９４℃ ３０ｓ→６０℃ ３０ｓ→７２℃ ３０ｓ→７２℃ ３００ｓ→４℃ ∞（下線部を４０ｃｙｃｌｅ）
Ｇｇ；
５’−ＧＧＣＧＡＣＧＴＴＧＴＴＡＧＴＡＣＣＴＧＡＣ−３’ （配列番号３）
５’−ＡＴＣＣＣＴＧＡＡＣＡＴＧＴＣＣＡＴＣＡＧＧＴＴＣ−３’ （配列番号４）
５’−ＴＡＴＡＧＧＴＡＣＣＣＡＧＡＡＧＴＧＡＡＴＴＣＧＧＴＴＣＧＣ−３’ （配列番号５）
９５℃ １２０ｓ→９５℃ ３０ｓ→６０℃ ２０ｓ→７２℃ ３０ｓ→７２℃ ３００ｓ→４℃ ∞（下線部を３５ｃｙｃｌｅ）
【０１０３】
実施例１０ プロサイモシンα欠損の高齢マウスのプロサイモシンα欠損領域
週齢２０−３０のＧｇＦＦマウスまたはＧｇマウスについて、ペントバルビタール麻酔下で開腹開胸後、心臓の右心耳に切れ目をいれ、左心室からＫ＋ ｆｒｅｅ ＰＢＳを灌流、脱血させた後、４％パラホルムアルデヒド／０．１Ｍ ＰＢで灌流固定した。脳を摘出し、２５％ｓｕｃｒｏｓｅ／Ｋ＋ ｆｒｅｅ ＰＢＳに浸漬して４℃で一晩放置した。Ｏ．Ｃ．Ｔ． Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Ｓａｋｕｒａ）で包埋し、エタノール／ドライアイスにより、組織を急速凍結させた。クリオスタット（ＣＭ１９００、ライカマイクロシステムズ株式会社）を用いて、厚さ３０ μｍの脳切片を作製した。組織切片をＰＢＳＴ（０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ｉｎ Ｋ＋ ｆｒｅｅ ＰＢＳ）で洗浄後１％ Ｈ２Ｏ２に３０分置換し、内因性ペルオキシダーゼを分解した。ＰＢＳＴで洗浄後（以後毎ステップＰＢＳＴ洗浄表記なし）、ブロッキング反応として２％ＢＳＡ／２％ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ｓｅｒｕｍ（ｃａｐｐｅｌ ５５４３５、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）／ＰＢＳＴ溶液で室温にて１時間反応させた。１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ溶液にて１：１０００に希釈した抗プロサイモシンα抗体（ＮＴ ２Ｆ１１、ＡＬＥＸＩＳ Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を４℃にてｏｖｅｒ ｎｉｇｈｔ後、Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ α−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（１：５００ Ｚｙｍａｘ）ｉｎ １％ＢＳＡ／ＰＢＳＴに１時間置換した。次に３０分前に作成したｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣ液（Ａ液１５μｌ、Ｂ液１５μｌ ｉｎ １％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ ２０００μｌ）に１時間置換しシグナル増強を行った。２０ｍｇ／ｍＬ ＤＡＢ ｓｏｌｕｔｉｏｎを１０ｍｌのＰＢＳに溶解し１％ＣｏＣｌ２ ２５０μＬ，１％ＮｉＳＯ４ ２００μＬを少量ずつ加えながら混ぜ３．３μｌの３０％Ｈ２Ｏ２（Ｗａｋｏ）を入れた溶液に約５分置換し、シランコートされたスライドグラス（松波硝子工業株式会社）に張り付け風乾後アルコール脱水、キシレン透徹を行い、Ｐｅｒｍｏｕｎｔ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で封入後、蛍光位相差顕微鏡（ＢＺ−８０００、株式会社キーエンス）で観察した。蛍光染色時は３０μｍ切片作製、ＰＢＳＴで洗浄後、５０％ＭｅＯＨ １０分、１００％ＭｅＯＨ １０分浸漬し、ＰＢＳＴで洗浄後にブロッキング反応を行った。二次抗体にはａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ４８８ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（１：３００ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅ）ｉｎ １％ＢＳＡ／ＰＢＳＴで２時間反応させた。
本発明者は、Ｇｎｇ７は主に線条体に発現が多く、海馬、小脳にも発現していることをＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲによってこれまでに確認している。週齢２０−３０のＧｇＦＦマウスの３０μｍ脳切片を用いてプロサイモシンαの免疫組織化学を行った所、線条体、海馬、小脳での顕著な発現低下を観察した（図１５Ａ，Ｂ）。ＤＡＢ染色および蛍光染色の２０倍視野の写真からは、線条体で７〜８割の細胞でプロサイモシンαが欠損していること、歯状回の内側ではＧｇＦＦマウスでも発現が残っていること、小脳ではプルキンエ細胞層ではプロサイモシンα発現が残っており、主に顆粒細胞層でプロサイモシンα欠損が起こっていることが分かった（図１５Ｃ）。
また、線条体におけるプロサイモシンαの発現をイムノブロット法で確認した。週齢２０−３０のＧｇＦＦマウスまたはＧｇマウスを断頭したのち氷上でマウスの脳組織を摘出しＰＢＳで洗浄した。マウス用ブレインスライサ（室町機械）で５００μｍの厚さにスライスしカミソリで線条体、海馬、小脳の各部位を切り出し、ＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）５ｍｌ，１０％ＳＤＳ １０ｍｌ，１００％ｇｌｙｃｅｒｏｌ ５ｍｌをＭＱで５０ｍｌにメスアップ）１００μｌの入ったエッペンチューブに入れる。Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ（Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ）で超音波破砕した後、１５０００ｒｐｍにて１０分遠心後上清を回収しＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅｇｅｎｔ（ＢＩＯ−ＲＡＤ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてタンパク定量を行った。１レーン当たり２０μｇのタンパク質を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで３０ｍＡ，３００Ｖの条件でＤｙｅがゲル下端に来るまで泳動を行う。ゲルのタンパク質をニトロセルロースメンブレンにセミドライ式で１００ｍＡ，３０Ｖの条件で９０分間転写する。５％スキムミルク，２％Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ／ＴＢＳＴ（ＴＢＳ，０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で１時間ブロッキングを行った。一次抗体をブロッキングに用いたＢｕｆｆｅｒにて１０００倍に希釈し一晩反応させる。ＴＢＳＴで３回洗浄後、ＨＲＰ標識した２次抗体をブロッキングに用いたＢｕｆｆｅｒにて２０００倍に希釈し２時間反応させた。ＴＢＳＴで３回洗浄後した。Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅおよびＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｄｕｒａｔｉｏｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にて化学発光させシグナルを検出した。一次抗体には抗プロサイモシンα抗体（１：１０００； ＡＬＥＸＩＳ）および抗β−ｔｕｂｕｌｉｎ抗体（１：１０００； Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用い、二次抗体にはＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（１：２０００；Ｐｒｏｍｅｇａ）およびＨＲＰ標識抗ラビットＩｇＧ抗体（１：２０００；Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。
その結果、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔでも線条体、海馬、小脳でのプロサイモシンα発現減少の結果を得た（図１５Ｄ）。
【０１０４】
実施例１１ プロサイモシンα欠損の高齢マウスの神経細胞形態および神経細胞数
本発明者はこれまでにプロサイモシンαが虚血ストレス時に神経細胞を保護する作用を有することをｉｎ ｖｉｔｒｏ，ｉｎ ｖｉｖｏともに明らかとしてきた。そこで前記実施例１０のＧｇＦＦマウスにおいてプロサイモシンαの発現低下していた領域において、神経細胞の形態や細胞数に変化があるかをＮｉｓｓｌ染色により確認した。Ｎｉｓｓｌ染色は神経細胞を可視化する標準的な組織学的方法として用いられており、神経細胞形質および樹状突起中の粗面小胞体由来のリボソームＲＮＡから構成されるＮｉｓｓｌ物質を染色する。損傷を受けた場合、神経細胞体内に再分布し、神経細胞死のマーカーとしても用いられている。免疫染色と同様に３０μｍの脳切片を作製し、シランコートされたスライドグラスに張り付け風乾後、ＰＢＳＴで洗浄した。ＭＱに１０秒程度浸漬後、水浴で３７℃に温めておいたｃｒｅｓｙｌ ｖｉｏｌｅｔ溶液（２．５ｇ ｃｒｅｓｙｌｅｃｈｔ ｖｉｏｌｅｔ，３００ｍｌ Ｈ２Ｏ，３０ｍｌ １Ｍ ＮａＯＡｃ，１７０ｍｌ １Ｍ ＡｃＯＨをｍｉｘし７日間スターラーで撹拌）に１５〜３０分浸漬し染色する。ＭＱで洗浄後、アルコール脱水、キシレン透徹を行い、Ｐｅｒｍｏｕｎｔで封入後、顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ）で観察した。
その結果、ＧｇＦＦマウスでは線条体、海馬、小脳において顕著な神経細胞死や脱落、神経細胞層の配列の乱れは観察されなかった（図１６Ａ，Ｂ，Ｃ）。
【０１０５】
実施例１２ プロサイモシンα欠損の高齢マウスにおける自発運動量および行動速度の評価
２０−３０週齢のマウスを用いて新規環境下での自発運動機能をＯｐｅｎ ｆｉｅｌｄ ｔｅｓｔにて評価した。約５０ｌｘの部屋に試験３０分前にマウスを入れておき環境に適応させた。縦７０ｃｍ×横７０ｃｍ×高さ３０ｃｍのアクリル箱の隅からマウスを入れ３０分間、Ｖｉｄｅｏ ｔｒａｃｋｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｒｏｍａｃｈｉ Ｋｉｋａｉ）を用いてＰＣにて解析を行った。箱を８×８に分画した際の中心４×４区画での行動時間を不安様行動の指標として測定した。Ｏｐｅｎ ｆｉｅｌｄ試験において、２０−３０週齢のＧｇＦＦマウスは顕著な自発行動量の低下を認めた（図１７Ａ，Ｂ）。また行動速度にも低下がみられ、中心滞在時間の低下も観察された（図１７Ｃ，Ｄ）。
これらの結果より、ＧｇＦＦマウスは週齢依存的な運動機能障害または、不安様行動の促進がみられることが明らかとなった。
【０１０６】
実施例１３ プロサイモシンα欠損の高齢マウスにおける不安様症状の評価
さらに、２０−３０週齢のＧｇＦＦマウスは不安行動が促進しているか否かを調べるため、他の不安行動の試験であるＭａｒｂｌｅ ｂｕｒｙｉｎｇ ｔｅｓｔおよびＮｏｖｅｌｔｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｈｙｐｏｐｈａｇｉａ ｔｅｓｔを行った。
Ｍａｒｂｌｅ ｂｕｒｙｉｎｇ ｔｅｓｔは、無害なガラス玉を床敷きで覆い隠そうとするマウスの行動が、不合理と認識しつつ繰り返される強迫性障害患者の脅迫行為と見かけ上類似していることから、強迫性障害に関連した不安様行動試験として認知されつつある試験である。抗不安薬の投与により隠すビー玉の数が低下することが報告されている。縦２８ｃｍ×横４５ｃｍ×高さ２０ｃｍのアクリルケージに床敷を５ｃｍ入れ、１７ｍｍの青色ビー玉を等間隔に５×５個置く。ケージを薄暗い所に置き、マウスをケージに入れた。３０分後マウスを回収し、２／３以上床敷に埋められたビー玉の数をカウントした。この試験においてＧｇＦＦマウスが隠したビー玉の数は、Ｇｇマウスと有意な差はなかったが、若干の低下傾向にあり、運動機能低下が観察された（図１８Ａ，Ｂ）。
Ｎｏｖｅｌｔｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｈｙｐｏｐｈａｇｉａ ｔｅｓｔは、コンデンスミルクをＨｏｍｅｃａｇｅ（ＨＣ）で飲む群と、新規環境（Ｎｏｖｅｌｔｙ；Ｎ）で飲む群で、飲みに行くまでの時間と飲んだミルクの量を比較し、不安行動を評価する試験である。不安行動が亢進しているマウスは新規環境でミルクを飲みに行くまでの時間が増加し、飲む量も減少するとされている。まずグループ飼いしたマウスを約５０ｌｘの薄暗い部屋に入れ、５ｍｌの２５％コンデンスミルクを３０分間自由に摂取できるようにした。これを１日１回３日間繰り返して、ミルクの味を覚えさせた。４日目は、３日間と同様に薄暗い部屋のＨｏｍｅｃａｇｅでミルクを飲めるマウス（Ｈｏｍｅｃａｇｅ群）と、１０００ｌｘの明るく照らされた床敷のない透明ケージでミルクを飲めるマウス（Ｎｏｖｅｌｔｙ群）の２群に分けて実験を行った。どちらの群も１匹ずつ３０分間試行し、ミルクを初めて飲むまでの時間と、５分毎のミルクを飲んだ量を測定した。この試験においてＧｇＦＦマウスはＨＣ群、Ｎ群ともにミルクを飲みに行くまでの時間、飲む量のどちらも有意な差はなかった（図１８Ｃ，Ｄ）。
これらの結果からＧｇＦＦマウスは不安様行動の亢進はみられないことが明らかとなった。
【０１０７】
実施例１４ プロサイモシンα欠損の高齢マウスにおける運動機能評価
これまでの試験において２０−３０週齢のＧｇＦＦマウスは自発行動量の低下がみられることが明らかとなった。そこで、ＧｇＦＦマウスの運動機能を詳細に調べるため若齢マウスと同様にロータロッド試験、さらにＳｔａｔｉｏｎａｒｙ ｔｈｉｎ ｒｏｄ試験、Ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ試験を行った。
ロータロッド試験においてＧｇＦＦマウスはＧｇマウスと比べ、２０ｒｐｍの低速で回るロータ上を歩くことを覚える訓練１回目から落ちる時間が顕著に早かった。またＧｇＦＦマウスは訓練３日間の間に少しずつ上達は見られるが、Ｇｇマウスと同等の運動機能にはならなかった（図１９Ａ）。４日目により高速の３０ｒｐｍで試験したところ、訓練の結果と同様にロータ上から落下するまでの時間は短かった（図１９Ｂ）。
さらに、バランス感覚を調べるため、止まった細い棒上から落ちるまでの時間を調べるＳｔａｔｉｏｎａｒｙ ｔｈｉｎ ｒｏｄ試験を行った。１．５ｃｍ ｄｉａｍｅｔｅｒ，５０ｃｍ ｌｏｎｇの滑らかなステンレス棒を地面から４０ｃｍの高さに水平に設置し、マウスの怪我防止のため、マウスを棒の中心に乗せ、落下するまでの時間を測定した。最大滞在時間を６０秒とし、１時間の間隔をあけて６試行行った。その結果、ＧｇＦＦマウスはＧｇマウスと同様に６回の試行において徐々に棒上に乗れるようになり、有意な差はなかった（図１９Ｃ）。
また歩行機能を調べるＦｏｏｔｐｒｉｎｔ試験では、マウスの前肢および後肢足底をそれぞれ赤および黒インクで塗布し、幅４８ｍｍ、長さ６５０ｍｍ、高さ２３０ｍｍの通路上を歩行させた。その際、マウスが暗い場所を好む性質を利用し、後ろからライトで照らして前進させた。歩き始めと歩き終わりを除いた３歩の平均値で以下のパラメータを解析し、歩行機能を評価した。その結果、ＧｇＦＦマウスに異常な歩行様式はみられず、歩幅（Ｓｔｒｉｄｅ ｌｅｎｇｔｈ：片前肢から同前肢までの距離で左右の平均）、前肢両間の距離（Ｆｏｒｅｐａｗ ｂａｓｅ：左右の前肢間の距離）、後肢両間の距離（Ｈｉｎｄｐａｗ ｂａｓｅ：左右の後肢間の距離）、前後肢のかぶり（Ｆｏｒｅｐａｗ／Ｈｉｎｄｐａｗ ｏｖｅｒｌａｐ：片前肢と後肢の距離で左右の平均）の４項目すべてでＧｇマウスと有意な差はなかった（図１９Ｄ）。
これらの結果より、２０−３０週齢のＧｇＦＦマウスは通常の歩行やバランスといった顕著な運動機能障害はないが、ロータロッド試験のような高度な運動協調性に異常があることが示唆された。
【０１０８】
実施例１５ プロサイモシンα欠損の加齢マウスにおける運動機能障害に対するＤ１，Ｄ２アゴニスト投与の効果
これまでの結果からＧｇＦＦマウスは運動機能障害を自然発症することが明らかとなった。そこで、ＧｇＦＦマウスと同様に線条体が病態となっているパーキンソン病で用いられているドパミンアゴニストを用いてＧｇＦＦマウスの運動機能障害が治療できるか検討した。
Ｄ１アゴニストであるＳＫＦ３８３９３ ３０ｍｇ／ｋｇの腹腔内投与５時間後では、ロータロッド試験における運動機能障害の有意な改善を認めた（図２０Ａ）。しかしＤ２アゴニストのパラミペキソールの投与では最大容量の１ｍｇ／ｋｇでも改善効果はみられなかった（図２０Ｂ）。
この結果から、Ｇｎｇ７発現細胞でプロサイモシンαが欠損することはドパミン作動性神経細胞のバランスになんらかの影響を与えていることが示唆された。
【０１０９】
実施例１６ プロサイモシンα欠損の高齢マウスの行動学的解析
さらに、ＧｇＦＦマウスに関して、以下の点についても検証を行った。
（１）体重
体重に関しては若齢において有意な差は確認されなかったが、週齢を重ねるごとに体重増加の程度が対照群と比較し低下し、２９週齢まででＧｇマウスと差はないが、３０−３９週齢で有意な体重の低下がみられた（図２１Ａ）。
（２）握力
筋力の評価としてＷｉｒｅｈａｎｇ ｔｅｓｔを行った。１ｃｍ角の格子状の網の上にマウスを乗せ、上下逆さにして３０ｃｍの高さに固定する。マウスが落ちるまでの時間を測定し、最大１８０秒とした。握力を測定するＷｉｒｅｈａｎｇ試験に関してはＧｇマウスがほぼ最大潜時の１８０秒間落ちないのに対して、ＧｇＦＦマウスは２０秒程度落下が早かった（図２１Ｂ）。
（３）うつ様症状
うつ様症状の評価にはＴａｉｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｔｅｓｔおよびＰｏｒｓｏｌｔ ｆｏｒｃｅｄ ｓｗｉｍ ｔｅｓｔを行った。
Ｔａｉｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｔｅｓｔでは、マウスの尾を木の棒の先にテープで固定し、高さ３０ｃｍのところに吊るした。無動になるまでの時間と１分毎の無動時間を６分間測定した。その結果、ＧｇＦＦマウスは全体６分間を通して有意な無動時間の低下を示し、前半３分間は特に顕著であった（図２１Ｃ）。
また、Ｐｏｒｓｏｌｔ ｆｏｒｃｅｄ ｓｗｉｍ ｔｅｓｔでは、直径２０ｃｍ高さ３０ｃｍのアクリル円柱状容器に２５±１℃の水を２０ｃｍ入れた。マウスをその容器に入れ、無動になるまでの時間と１分毎の無動時間を６分間測定した。測定後マウスを回収し、キムタオルで水分をふきとった。その結果、ＧｇマウスとＧｇＦＦマウスに有意な差はなかった（図２１Ｄ）。
（４）社会性
自己の周辺環境への配慮や社会性を調べるため、Ｎｅｓｔ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｔｅｓｔを行った。明暗サイクル（明期８：００〜２０：００／暗期２０：００〜８：００）の暗期１時間前（１９：００）にマウスを１匹ずつ大ケージに分け、Ｎｅｓｔｌｅｔ ２．５ｇ（Ａｎｃａｒｅ）を入れた。翌朝巣の形状を以下の基準でスコアリングし、未使用のＮｅｓｔｌｅｔの量を量った。
Ｓｃｏｒｅ１．Ｎｅｓｔｌｅｔの９０％が未使用。
Ｓｃｏｒｅ２．Ｎｅｓｔｌｅｔの５０−９０％が未使用。
Ｓｃｏｒｅ３．Ｎｅｓｔｌｅｔの５０％以上使用。隅に９０％以上Ｎｅｓｔｌｅｔを集めていない。巣らしきものがない。
Ｓｃｏｒｅ４．Ｎｅｓｔｌｅｔの９０％以上使用し、隅に集めている。平坦な巣がある。
Ｓｃｏｒｅ５．Ｎｅｓｔｌｅｔの９０％以上使用し、くぼみのある完全な巣がある。
その結果、巣として使わなかったＮｅｓｔｌｅｔｓの量と巣の形状のスコアリングは、ＧｇＦＦマウスはどちらの項目でもＧｇマウスと差がなく、社会性に異常はないことが明らかとなった（図２１Ｅ）。
（５）学習機能
学習機能の評価にはＳｔｅｐ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｅｓｔを用いた。１日目の電流を覚えさせる訓練ではＧｇマウスとＧｇＦＦマウスに有意な差はなかったことから、両群に同じ条件付けができたと考えられる。しかし２日目の試験ではＧｇＦＦマウスは電流がかかる暗箱にＧｇマウスよりも早く入ってしまい、学習機能の低下が示唆された（図２１Ｆ）。
【産業上の利用可能性】
【０１１０】
本発明において、ハンチントン病を含む神経変性疾患のモデルマウスとして線条体におけるプロサイモシンα遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物の作成に成功したことによって、該疾患の発症機構などの研究に寄与することができる。また、該非ヒト哺乳動物は該疾患の新規予防／治療薬のスクリーニングに利用可能である。
本出願は、日本で出願された特願２０１１−１１９６５１（出願日：平成２３年５月２７日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、線条体におけるプロサイモシンα遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物などに関する。
【背景技術】
【０００２】
中枢神経系の神経細胞が変性・脱落することで起こる神経変性疾患は、それぞれの疾患ごとに特定の部位が傷害されることが知られている。そのなかで、運動機能を制御、調節する錐体外路の主要な構成部位である大脳基底核の神経細胞が傷害されるものにパーキンソン病、ハンチントン病が挙げられる。前者は黒質緻密部から線条体へ投射するドパミン作動性神経（非特許文献１）、後者は線条体から淡蒼球や黒質網様層へ投射するＧＡＢＡ作動性神経の変性が原因とされている（非特許文献２）。両者はともに難治度、重症度が高い疾患として特定疾患治療研究事業の対象に指定されており、さらなる原因の究明と治療薬の開発が期待されている。ハンチントン病は白人で１万人に１人弱、その他の人種ではその数分の一に発症する、優勢遺伝性の疾患である。特に父親由来の原因遺伝子を持つ場合、症状が重篤となることが知られている。その症状は、異常不随意運動や姿勢異常といったジストニアと呼ばれる運動症状に加えて、うつや痴呆などの精神症状が見られる。ハンチントン病の新薬の開発が試みられ複数の物質が候補に挙げられているものの、現在のところ有効性は確立されていない状態である（非特許文献３）。
ハンチントン病の症状のうちジストニアについては、経験的にＬ−ＤＯＰＡ製剤が投与されてきた（非特許文献４）。しかしながら、Ｌ−ＤＯＰＡ製剤は有効性に優れる反面、作用持続時間が短く、長期使用で効果の変動（ｗｅａｒｉｎｇ ｏｆｆ，ｏｎ−ｏｆｆ）やジスキネジアなどの症状を生じるため患者のＱＯＬ低下の原因となる。そのため、Ｌ−ＤＯＰＡ製剤に次ぐ効果を有し、作用持続時間が長いドパミンアゴニストが注目されるようになった。現在、我が国では６種類のドパミンアゴニストが臨床で使用されているが、なかでもプラミペキソールはハンチントン病における筋剛直に対し治療効果を示すとの報告があり（非特許文献５）、有効性の確立に期待が集まっている。
【０００３】
このような状況下、ハンチントン病に対する治療薬の評価・スクリーニングを目的として、これまでにいくつかのハンチントン病様モデル動物が確立されてきた。最初に報告されたハンチントン病様モデルマウスは、ハンチントン病患者の持つハンチントン病遺伝子のｅｘｏｎ１を導入したＲ６／２マウスであり、神経細胞死までは観察されないものの、脳重量の減少、筋肉量の低下、カロリー摂取量の増加、排尿頻度の増加、寿命の大幅な短縮、クラスピング、振戦などの症状を呈することが報告されている（非特許文献６）。しかし、該ハンチントン病様モデル動物は平均１０−１２週齢で死亡してしまうため、長期的に薬物の効果を検討することは困難であった。また、その症状は運動障害以外にも多岐に渡るため特異的な機能解析が難しいという問題点があった。これらの問題を解決すべく開発された、神経細胞死を誘発しないモデルマウスとしては、ヒトのハンチンチン病患者より得られたＣＡＧリピート配列をノックインしたマウスが報告されている（非特許文献７、８）が、運動症状の改善を狙う新たな薬物の検討に適したモデルのニーズが高まっていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｌａｎｇ，Ａ．Ｅ．ａｎｄ Ａ．Ｍ．Ｌｏｚａｎｏ，Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｓｅｃｏｎｄ ｏｆ ｔｗｏ ｐａｒｔｓ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，１９９８．３３９（１６）：ｐ．１１３０−４３．
【非特許文献２】Ｋｅｌｌｙ，Ｃ．Ｍ．，Ｓ．Ｂ．Ｄｕｎｎｅｔｔ，ａｎｄ Ａ．Ｅ．Ｒｏｓｓｅｒ，Ｍｅｄｉｕｍ ｓｐｉｎｙ ｎｅｕｒｏｎｓ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ，２００９．３７（Ｐｔ１）：ｐ．３２３−８．
【非特許文献３】Ｗａｌｋｅｒ，Ｆ．Ｏ．，Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｌａｎｃｅｔ，２００７．３６９（９５５７）：ｐ．２１８−２８．
【非特許文献４】Ｓｅｇａｗａ，Ｍ．，Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｄｙｓｔｏｎｉａ ｗｉｔｈ ｍａｒｋｅｄ ｄｉｕｒｎａｌ ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ．Ｂｒａｉｎ Ｄｅｖ．
【非特許文献５】Ｂｏｎｅｌｌｉ，Ｒ．Ｍ．ａｎｄ Ｇ．Ｋ．Ｗｅｎｎｉｎｇ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ：ａｎ ｅｖｉｄｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ｒｅｖｉｅｗ．Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ，２００６．１２（２１）：ｐ．２７０１−２０．
【非特許文献６】Ｌａｕｒａ Ｍａｎｇｉａｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．８７，１９９６：ｐ．４９３−５０６．
【非特許文献７】Ｌｉｌｉａｎａ Ｂ．Ｍｅｎａｌｌｅｄ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４６５，２００３：ｐ．１１−２６．
【非特許文献８】Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ Ｊ．Ｓｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１２，Ｎｏ．１３，２００３：ｐ．１５５５−１５６７．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、線条体におけるプロサイモシンα遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物および該動物を用いたハンチントン病を含む神経変性疾患の予防／治療薬のスクリーニング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は以前に、虚血ストレスによって誘導される神経性ネクローシス細胞死を抑制する核タンパク質としてプロサイモシンαを見出した（Ｕｅｄａ Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．１７６（６），８５３−８６２，２００７）。そこで本発明者は、興奮性ドパミン受容体を持つ線条体のＧＡＢＡ神経において、線条体特異的に発現するＧ蛋白質γ７サブユニット遺伝子（Ｇｎｇ７）プロモーターの下流にｃｒｅ蛋白質遺伝子を連結することで、ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムを利用して、プロサイモシンαが線条体において発現不全となったコンディショナルノックアウトマウスを作成した。該マウスは、線条体ＧＡＢＡ神経において機能的プロサイモシンαを欠失しており、虚血ストレス時の神経保護作用を喪失している。発明者は週齢の若い該マウスの虚血処置時の表現型を評価すると共に、ドパミンＤ２受容体のアゴニストであるプラミペキソール、ドパミン代謝阻害剤であるセレギリンの該マウスに対する効果の検討を行った。その結果、該マウスは公知のハンチントン病モデルマウスに見られるような特徴を有することが確認された。また、その症状は、ドパミンＤ２受容体アゴニスト、ドパミン代謝阻害剤またはＮＭＤＡ受容体拮抗剤の投与によって改善されることを見出した。さらに、発明者は週齢を重ねた該マウスの表現型についても評価し、ドパミンＤ１受容体アゴニストであるＳＫＦ３８３９３の効果の検討を行った。その結果、加齢によって虚血処置時と類似の症状を自然発症すると共に、該症状は、ドパミンＤ１受容体アゴニストによって改善されることを見出した。
本発明者は、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、
［１］線条体においてプロサイモシンα遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物であって、対応する野生型動物と比較して、
（１）脳虚血処置に対して脆弱である、
（２）運動性が劣る、
（３）加齢によって、上記（１）および（２）の症状を自然発症する、および
（４）ドパミンＤ２受容体アゴニスト、ドパミン代謝阻害剤、ＮＭＤＡ受容体拮抗剤またはドパミンＤ１受容体アゴニストによって上記（１）、（２）および（３）の症状が改善する、
ことを特徴とする動物；
［２］Ｇ蛋白質γ７サブユニット遺伝子プロモーターにより発現制御されたｃｒｅ遺伝子を有し、かつｌｏｘＰ配列に挟まれたプロサイモシンα遺伝子をホモ接合型で有する、上記［１］に記載の動物；
［３］ドパミンＤ２受容体アゴニストがプラミペキソール、ペルゴリド、カベルゴリン、タリペキソールまたはロビニロールである、上記［１］に記載の動物；
［４］ドパミン代謝阻害剤がセレギリン、エンタカルボン、ドアマンタジン、Ｌ−ドーパ、ドロキシドパまたはゾニサミドである、上記［１］に記載の動物；
［５］ＮＭＤＡ受容体拮抗剤がメマンチンまたはＣＰ−１０１６０６である、上記［１］に記載の動物；
［６］ドパミンＤ１受容体アゴニストがＳＫＦ３８３９３である、上記［１］に記載の動物；
［７］動物がマウスまたはラットである、上記［１］に記載の動物；
［８］上記［１］に記載の動物に試験化合物を適用し、（１）脳虚血処置に対する生存率および／または（２）運動性を測定することを特徴とする、神経変性疾患または虚血性疾患由来のジストニアの治療／予防薬のスクリーニング方法；
［９］上記［１］に記載の動物であって、週齢が進んだ該動物に試験化合物を適用し、（１）生存率および／または（２）運動性を測定することを特徴とする、神経変性疾患または虚血性疾患由来のジストニアの治療／予防薬のスクリーニング方法；
［１０］試験化合物がドパミンＤ２受容体アゴニストである、上記［８］または［９］に記載のスクリーニング方法；
［１１］試験化合物がドパミン代謝阻害剤である、上記［８］または［９］に記載のスクリーニング方法；
［１２］試験化合物がＮＭＤＡ受容体拮抗剤である、上記［８］または［９］に記載のスクリーニング方法；
［１３］試験化合物がドパミンＤ１受容体アゴニストである、上記［８］または［９］に記載のスクリーニング方法；
［１４］神経変性疾患がハンチントン病である、上記［８］または［９］に記載のスクリーニング方法；
などを提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の線条体におけるプロサイモシンα遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物によれば、ハンチントン病を含む神経変性疾患の新規予防／治療薬をスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、マウスのプロサイモシンα遺伝子の野生型アリル、Ｆｌｏｘｅｄアリルおよび欠失アリルの構造を示す図である。
【図２】図２は、ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｍｉｄｄｌｅ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ａｒｔｅｒｙ Ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ（ｔＭＣＡＯ）処置を１５分間実施後における、ＷＴマウスの病態を示す図である。Ａ：ＷＴマウスに対するｔＭＣＡＯ処置と試験実施のタイムスケジュール、Ｂ：ＷＴマウスの生存率、Ｃ：ＷＴマウスのＣｌｉｎｉｃａｌ ｓｃｏｒｅ、Ｄ：ＷＴマウスのロータロッド（６ｒｐｍ）上の滞在時間。
【図３】図３は、ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｍｉｄｄｌｅ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ａｒｔｅｒｙ Ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ（ｔＭＣＡＯ）処置を１５分間実施後における、ＧｇマウスおよびＧｇＦＦマウスの病態を示す図である。＊は、有意差（ｐ＜０．０５，Ｇｇ ｖｓ ＧｇＦＦ）を示す。Ａ：ＧｇマウスおよびＧｇＦＦマウスに対するｔＭＣＡＯ処置と試験実施のタイムスケジュール、Ｂ：ＧｇマウスおよびＧｇＦＦマウスの生存率、Ｃ：ＧｇマウスおよびＧｇＦＦマウスのＣｌｉｎｉｃａｌ ｓｃｏｒｅ、Ｄ：ＧｇマウスおよびＧｇＦＦマウスのロータロッド（６ｒｐｍ）上の滞在時間。
【図４】図４は、プラミペキソールを投与され、ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｍｉｄｄｌｅ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ａｒｔｅｒｙ Ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ（ｔＭＣＡＯ）処置を１５分間実施後における、各種マウスの病態を示す図である。Ａ：各種マウスに対するプラミペキソールを投与、ｔＭＣＡＯ処置および試験実施のタイムスケジュール、Ｂ：各種マウスの生存率、Ｃ：各種マウスのＣｌｉｎｉｃａｌ ｓｃｏｒｅ。
【図５】図５は、プラミペキソールを投与され、ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｍｉｄｄｌｅ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ａｒｔｅｒｙ Ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ（ｔＭＣＡＯ）処置を１５分間実施後における、ＷＴマウスおよびＧｇＦＦマウスの病態を示す図である。＊＊は、有意差（ｐ＜０．０１，ｉｓｃｈｅｍｉａ ｖｓ ｉｓｃｈｅｍｉａ＋ＰＰＸ）を示す。Ａ：ＷＴマウスおよびＧｇＦＦマウスに対するプラミペキソールを投与、ｔＭＣＡＯ処置および試験実施のタイムスケジュール、Ｂ：ＷＴマウスおよびＧｇＦＦマウスのロータロッド（６ｒｐｍ）上の滞在時間、Ｃ：ＷＴマウスおよびＧｇＦＦマウスのロータロッド（１２ｒｐｍ）上の滞在時間。
【図６】図６は、セレギリンを投与され、ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｍｉｄｄｌｅ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ａｒｔｅｒｙ Ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ（ｔＭＣＡＯ）処置を１５分間実施後における、各種マウスの病態を示す図である。Ａ：各種マウスに対するセレギリンを投与、ｔＭＣＡＯ処置および試験実施のタイムスケジュール、Ｂ：各種マウスの生存率、Ｃ：各種マウスのＣｌｉｎｉｃａｌ ｓｃｏｒｅ。
【図７】図７は、セレギリンを投与され、ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｍｉｄｄｌｅ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ａｒｔｅｒｙ Ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ（ｔＭＣＡＯ）処置を１５分間実施後における、ＧｇＦＦマウスの病態を示す図である。Ａ：ＧｇＦＦマウスに対するセレギリンを投与、ｔＭＣＡＯ処置および試験実施のタイムスケジュール、Ｂ：ＧｇＦＦマウスのロータロッド（６ｒｐｍ）上の滞在時間、Ｃ：ＧｇＦＦマウスのロータロッド（１２ｒｐｍ）上の滞在時間。
【図８】図８は、ＷＴマウス、ＧｇマウスおよびＧｇＦＦマウスのｃｌａｓｐｉｎｇ ｓｃｏｒｅ、ロータロッド上での滞在時間を示す図である。＊＊は、有意差（ｐ＜０．０１，Ｇｇ ｖｓ ＧｇＦＦ）、＃は、（ｐ＜０．０５，ＷＴ ｖｓ ＧｇＦＦ）、＃＃は、（ｐ＜０．０５，ＷＴ ｖｓ ＧｇＦＦ）を示す。Ａ：１０週齢の各種マウスのｃｌａｓｐｉｎｇ ｓｃｏｒｅ、Ｂ：２０週齢の各種マウスのｃｌａｓｐｉｎｇ ｓｃｏｒｅ、Ｃ：各種マウスの抱擁反射の写真像、Ｄ：１０週齢の各種マウスのロータロッド（３０ｒｐｍ）上の滞在時間、Ｅ：１０週齢の各種マウスのロータロッド（４０ｒｐｍ）上の滞在時間、Ｆ：２０週齢の各種マウスのロータロッド（３０ｒｐｍ）上の滞在時間、Ｇ：２０週齢の各種マウスのロータロッド（４０ｒｐｍ）上の滞在時間。
【図９】図９は、プラミペキソール投与後２４時間以内のＧｇマウスおよびＧｇＦＦマウスのｃｌａｓｐｉｎｇ ｓｃｏｒｅ、ロータロッド上での滞在時間を示す図である。Ａ：ＧｇマウスおよびＧｇＦＦマウスのｃｌａｓｐｉｎｇ ｓｃｏｒｅ、Ｂ：ＧｇマウスおよびＧｇＦＦマウスのロータロッド（３０ｒｐｍ）上の滞在時間、Ｃ：ＧｇマウスおよびＧｇＦＦマウスのロータロッド（４０ｒｐｍ）上の滞在時間。
【図１０】図１０は、プラミペキソール投与後７日目までのＷＴマウス、ＧｇマウスおよびＧｇＦＦマウスのｃｌａｓｐｉｎｇ ｓｃｏｒｅ、ロータロッド上での滞在時間を示す図である。Ａ：ＧｇマウスおよびＧｇＦＦマウスに対するプラミペキソール投与と試験実施のタイムスケジュール、Ｂ：ＧｇマウスおよびＧｇＦＦマウスのｃｌａｓｐｉｎｇ ｓｃｏｒｅ、Ｃ：ＧｇマウスおよびＧｇＦＦマウスのロータロッド（３０ｒｐｍ）上の滞在時間、Ｄ：ＧｇマウスおよびＧｇＦＦマウスのロータロッド（４０ｒｐｍ）上の滞在時間。
【図１１】図１１は、セレギリン投与後２４時間以内のＧｇＦＦマウスのｃｌａｓｐｉｎｇ ｓｃｏｒｅ、ロータロッド上での滞在時間を示す図である。Ａ：ＧｇＦＦマウスに対するセレギリン投与と試験実施のタイムスケジュール、Ｂ：ＧｇＦＦマウスのｃｌａｓｐｉｎｇ ｓｃｏｒｅ、Ｃ：ＧｇＦＦマウスのロータロッド（３０ｒｐｍ）上の滞在時間、Ｄ：ＧｇＦＦマウスのロータロッド（４０ｒｐｍ）上の滞在時間。
【図１２】図１２は、メマンチン投与後２４時間以内のＧｇＦＦマウスのｃｌａｓｐｉｎｇ ｓｃｏｒｅ、ロータロッド上での滞在時間を示す図である。Ａ：ＧｇＦＦマウスに対するメマンチン投与と試験実施のタイムスケジュール、Ｂ：ＧｇＦＦマウスのｃｌａｓｐｉｎｇ ｓｃｏｒｅ、Ｃ：ＧｇＦＦマウスのロータロッド（３０ｒｐｍ）上の滞在時間、Ｄ：ＧｇＦＦマウスのロータロッド（４０ｒｐｍ）上の滞在時間。
【図１３】図１３は、メマンチン投与後７日目までのＧｇＦＦマウスのｃｌａｓｐｉｎｇ ｓｃｏｒｅ、ロータロッド上での滞在時間を示す図である。Ａ：ＧｇＦＦマウスに対するメマンチン投与と試験実施のタイムスケジュール、Ｂ：ＧｇＦＦマウスのｃｌａｓｐｉｎｇ ｓｃｏｒｅ、Ｃ：ＧｇＦＦマウスのロータロッド（３０ｒｐｍ）上の滞在時間、Ｄ：ＧｇＦＦマウスのロータロッド（４０ｒｐｍ）上の滞在時間。
【図１４】図１４は、ＧｇＦＦマウス由来のゲノムを鋳型としたジェノミックＰＣＲ産物の電気泳動を示す図である。
【図１５】図１５は、ＧｇマウスおよびＧｇＦＦマウスの脳における、プロサイモシンα欠損領域を示す図である。Ａ：脳に対するプロサイモシンαのＤＡＢ染色像、Ｂ：脳に対するプロサイモシンαのＤＡＢ染色像の４倍視野（Ｃｐｕ；線条体、Ｈｉｐ；海馬、Ｃｅｒｅ；小脳）、Ｃ：脳に対するプロサイモシンαのＤＡＢ染色像および蛍光染色像の２０倍視野、Ｄ：プロサイモシンαのＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ像
【図１６】図１６は、ＧｇマウスおよびＧｇＦＦマウスの脳における、神経細胞形態および神経細胞数の変化を示す図である。Ａ：脳に対するＮｉｓｓｌ染色像、Ｂ：脳に対するＮｉｓｓｌ染色像の１０倍視野（Ｃｐｕ；線条体、Ｈｉｐ；海馬、Ｃｅｒｅ；小脳）、Ｃ：脳に対するＮｉｓｓｌ染色像の２０倍視野（ＣＡ１；海馬ＣＡ１領域、ＤＧ；歯状回）
【図１７】図１７は、ＧｇマウスおよびＧｇＦＦマウスにおける自発運動量および行動速度の評価を示す図である。＊は、有意差（ｐ＜０．０５，ｖｓ Ｇｇ）を示す。Ａ：Ｏｐｅｎ ｆｉｅｌｄ試験における１０分ごとのマウスの行動軌跡（代表的な１匹を例示）、Ｂ：行動距離、Ｃ：平均行動速度、Ｄ：中心滞在時間
【図１８】図１８は、ＧｇマウスおよびＧｇＦＦマウスにおける不安様症状の評価を示す図である。Ａ：Ｍａｒｂｌｅ ｂｕｒｙｉｎｇ試験前後のビー玉の様子、Ｂ：Ｍａｒｂｌｅ ｂｕｒｙｉｎｇ試験でマウスが隠したビー玉の数、Ｃ：Ｎｏｖｅｌｔｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｈｙｐｏｐｈａｇｉａ試験でマウスがミルクを飲みに行くまでの時間、Ｄ：Ｎｏｖｅｌｔｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｈｙｐｏｐｈａｇｉａ試験でマウスが３０分間で飲んだミルクの量
【図１９】図１９は、ＧｇマウスおよびＧｇＦＦマウスの運動機能評価を示す図である。＊は、有意差（ｐ＜０．０５，ｖｓ Ｇｇ）を示す。Ａ：最初３日間のマウスのロータロッド（２０ｒｐｍ）上の滞在時間、Ｂ：４日目のマウスのロータロッド（３０ｒｐｍ）上の滞在時間、Ｃ：Ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ ｔｈｉｎ ｒｏｄ ｔｅｓｔにおけるロッド上の滞在時間、Ｄ：Ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ試験におけるマウスの歩幅、前肢両間の距離、後肢両間の距離および前後肢のかぶり
【図２０】図２０は、Ｄ１アゴニスト、Ｄ２アゴニスト投与後５時間のＧｇＦＦマウスのロータロッド上での滞在時間を示す図である。＊は、有意差（ｐ＜０．０５，ｖｓ ｖｅｈｉｃｌｅ）を示す。Ａ：ＳＫＦ３８３９３投与後のＧｇＦＦマウスのロータロッド（３０ｒｐｍ）上の滞在時間、Ｂ：プラミペキソール投与後のＧｇＦＦマウスのロータロッド（３０ｒｐｍ）上の滞在時間
【図２１】図２１は、ＧｇマウスおよびＧｇＦＦマウスのその他の行動学的解析結果を示す図である。＊は、有意差（ｐ＜０．０５，ｖｓ Ｇｇ）を示す。Ａ：１０週齢ごとのマウスの平均体重、Ｂ：Ｗｉｒｅｈａｎｇ ｔｅｓｔにおける網から落下するまでの時間、Ｃ：Ｔａｉｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｔｅｓｔにおける１分間ごとのマウスの無動時間の割合、Ｄ：Ｆｏｒｃｅｄ ｓｗｉｍ ｔｅｓｔにおける１分間ごとのマウスの無動時間の割合、Ｅ：Ｎｅｓｔ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｔｅｓｔにおける一晩経過後の未使用Ｎｅｓｔｌｅｔｓの量と巣の形状のスコア、Ｆ：Ｓｔｅｐ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｅｓｔにおける暗箱に入るまでの時間、Ｔｒａｉｎｉｎｇ；１日目、Ｔｅｓｔ；２日目
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、線条体におけるプロサイモシンα遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
【００１１】
線条体におけるプロサイモシンα遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物とは、内在性プロサイモシンαの発現が線条体において不活性化された非ヒト哺乳動物を意味し、例えば、ｌｏｘＰ配列によって挟まれたプロサイモシンα遺伝子を有する組換えＥＳ細胞から作製されるプロサイモシンα遺伝子改変非ヒト哺乳動物と線条体特異的に発現されるｃｒｅ遺伝子を有する遺伝子改変非ヒト哺乳動物との交配によって得られる、線条体におけるプロサイモシンα遺伝子がノックアウトされた非ヒト哺乳動物の他、アンチセンスもしくはＲＮＡｉ技術によりプロサイモシンα遺伝子の発現が線条体において不活性化されるノックダウン（ＫＤ）非ヒト哺乳動物なども含まれる。ここで「ノックアウト（ＫＯ）」とは、内在性遺伝子を破壊したり、除去したりすることにより完全なｍＲＮＡを産生不能にすることを意味し、他方、「ノックダウン（ＫＤ）」とは、ｍＲＮＡから蛋白質への翻訳を阻害することにより、結果的に内在性遺伝子の発現を不活性化することを意味する。以下、本発明の線条体におけるプロサイモシンα遺伝子ＫＯ／ＫＤ動物を、単に「本発明のＫＯ／ＫＤ動物」という場合がある。また、線条体において不活性化されたとは、大脳基底核の一部分である線条体においてプロサイモシンαの遺伝子発現が不活性化されていることをいい、線条体以外のその他の組織では野生型非ヒト哺乳動物と該遺伝子の発現に有意な差はない。
【００１２】
本発明で対象とし得る「非ヒト哺乳動物」は、トランスジェニック系が確立されたヒト以外の哺乳動物であれば特に制限はなく、例えば、マウス、ラット、ウシ、サル、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスターなどが挙げられる。好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター等であり、なかでも疾患モデル動物作製の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、繁殖が容易な齧歯動物がより好ましく、とりわけマウス（例えば、純系としてＣ５７ＢＬ／６系統、ＢＡＬＢ／ｃ系統、ＤＢＡ２系統など、交雑系としてＢ６Ｃ３Ｆ１系統、ＢＤＦ１系統、Ｂ６Ｄ２Ｆ１系統、ＩＣＲ系統など）およびラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ、ＳＤなど）が好ましい。
また、哺乳動物以外にもニワトリなどの鳥類を、本発明で対象とする「非ヒト哺乳動物」と同様の目的に用いることができる。
【００１３】
線条体においてプロサイモシンα遺伝子をノックアウトする具体的な手段としては、対象非ヒト哺乳動物由来のプロサイモシンα遺伝子（ゲノムＤＮＡ）を常法に従って単離し、例えば、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系やＦｌｐ−ｆｒｔ系を用いてプロサイモシンα遺伝子の全部または一部を切り出して該遺伝子を欠失させることによって、結果的に遺伝子を不活性化するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、相同組換えにより対象非ヒト哺乳動物のプロサイモシンα遺伝子座に組み込ませる方法などが好ましく用いられ得る。
【００１４】
該相同組換え体は、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）への上記ターゲッティングベクターの導入により取得することができる。
ＥＳ細胞は胚盤胞期の受精卵の内部細胞塊（ＩＣＭ）に由来し、インビトロで未分化状態を保ったまま培養維持できる細胞をいう。ＩＣＭの細胞は将来、胚本体を形成する細胞であり、生殖細胞を含むすべての組織の基になる幹細胞である。ＥＳ細胞としては、既に樹立された細胞株を用いてもよく、また、ＥｖａｎｓとＫａｕｆｍａｎの方法（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２９２巻、１５４頁、１９８１年）に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系マウス由来のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で、例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ１）から樹立されるＥＳ細胞なども良好に用いることができる。ＢＤＦ１マウスは、採卵数が多く、かつ卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これ由来のＥＳ細胞は疾患モデルマウスを作製したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスと戻し交雑することでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用いられ得る。
【００１５】
ＥＳ細胞の調製は、例えば以下のようにして行うことができる。交配後の雌非ヒト哺乳動物［例えばマウス（好ましくはＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）などの近交系マウス、Ｂ６と他の近交系とのＦ１など）を用いる場合は、約２ヶ月齢以上の雄マウスと交配させた約８〜約１０週齢程度の雌マウス（妊娠約３．５日）が好ましく用いられる］の子宮から胚盤胞期胚を採取して（あるいは桑実胚期以前の初期胚を卵管から採取した後、胚培養用培地中で上記と同様にして胚盤胞期まで培養してもよい）、適当なフィーダー細胞（例えばマウスの場合、マウス胎仔から調製される初代線維芽細胞や公知のＳＴＯ線維芽細胞株等）層上で培養すると、胚盤胞の一部の細胞が集合して将来胚に分化するＩＣＭを形成する。この内部細胞塊をトリプシン処理して単細胞を解離させ、適切な細胞密度を保ち、培地交換を行いながら、解離と継代を繰り返すことによりＥＳ細胞が得られる。
【００１６】
ＥＳ細胞は雌雄いずれを用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作製するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行うことが望ましい。ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例として挙げられる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０６個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
また、第二次セレクションは、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましい。
【００１７】
このようにして得られるＥＳ細胞株は、未分化幹細胞の性質を維持するために注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ線維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上で、分化抑制因子として知られるＬＩＦ（１〜１０，０００Ｕ／ｍｌ）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス／９５％空気または５％酸素／５％炭酸ガス／９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０．００１〜０．５％トリプシン／０．１〜５ｍＭ ＥＤＴＡ、好ましくは約０．１％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１〜３日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
【００１８】
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能である〔Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓ及びＭ．Ｈ．Ｋａｕｆｍａｎ，ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２９２巻、１５４頁、１９８１年；Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ，プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）第７８巻、７６３４頁、１９８１年；Ｔ．Ｃ．Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら，ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第８７巻、２７頁、１９８５年〕。
【００１９】
例えば、ターゲッティングベクターが、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系を用いてプロサイモシンα遺伝子の全部または一部を切り出して該遺伝子を欠失させるべく設計されたものである場合、当該ベクターは、例えば、以下のような構成をとることができる。
【００２０】
まず、相同組換えにより、内在性のプロサイモシンα遺伝子の全部または一部に改変されたプロサイモシンα遺伝子の全部または一部を含むＤＮＡ断片が挿入されるために、ターゲッティングベクターは、当該改変されたプロサイモシンα遺伝子の全部または一部を含むＤＮＡ断片の５’上流および３’下流に、それぞれ標的部位と相同な配列（５’アームおよび３’アーム）を含む必要がある（例えば、ターゲッティングベクターは、挿入される他のＤＮＡ断片の５’上流側にプロサイモシンα遺伝子の５’調節領域と相同な配列を含み、３’下流側にはプロサイモシンα遺伝子の３’非翻訳領域と相同な配列を含む）。
【００２１】
本発明におけるプロサイモシンα遺伝子としては、具体的には、対象非ヒト哺乳動物がマウスの場合、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００８９７２．２として登録されている塩基配列と同一もしくは実質的に同一な塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。また、対象非ヒト哺乳動物がラットの場合、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０２１７４０．１として登録されている塩基配列と同一もしくは実質的に同一な塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。
【００２２】
プロサイモシンα遺伝子の塩基配列と実質的に同一な塩基配列とは、例えば、該塩基配列と、約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の同一性を有する塩基配列である。本明細書における塩基配列の同一性は、例えば、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。
【００２３】
さらに、該ターゲッティングベクターは、それぞれ標的部位と相同な配列の内側であって、かつプロサイモシンα遺伝子の全部または一部を挟み込む態様で、ｌｏｘＰ配列をタンデムに有する必要がある。相同組換えによって染色体上に組み込まれた当該ＤＮＡ断片は、プロサイモシンα遺伝子の全部または一部の両端の５’側および３’側に存在するｌｏｘＰ配列にＣｒｅ蛋白質が作用することによって、該ｌｏｘＰ配列に挟み込まれたプロサイモシンα遺伝子の全部または一部が切り出され、プロサイモシンα遺伝子がノックアウトされる。
【００２４】
挿入される他のＤＮＡ断片としては特に制限はないが、薬剤耐性遺伝子やレポーター遺伝子を用いると、ターゲッティングベクターが染色体へ組み込まれたＥＳ細胞を、薬剤耐性もしくはレポーター活性を指標として選択することができる。ここで薬剤耐性遺伝子としては、例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）遺伝子などが、レポーター遺伝子としては、例えば、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）遺伝子などがそれぞれ挙げられるが、それらに限定されない。
【００２５】
薬剤耐性もしくはレポーター遺伝子は、哺乳動物細胞内で機能し得る任意のプロモーターの制御下にあることが好ましい。例えば、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、マウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）ＬＴＲ、アデノウイルス（ＡｄＶ）由来初期プロモーター等のウイルスプロモーター、並びにβ−アクチン遺伝子プロモーター、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。
【００２６】
また、ターゲッティングベクターは、薬剤耐性もしくはレポーター遺伝子の下流に、該遺伝子からのｍＲＮＡの転写を終結させる配列（ポリアデニレーション（ｐｏｌｙＡ）シグナル、ターミネーターとも呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス遺伝子由来、あるいは各種哺乳動物または鳥類の遺伝子由来のターミネーター配列を用いることができる。好ましくは、ＳＶ４０由来のターミネーターなどが用いられる。
【００２７】
通常、哺乳動物における遺伝子組換えは大部分が非相同的であり、導入されたＤＮＡは染色体の任意の位置にランダムに挿入される。したがって、薬剤耐性やレポーター遺伝子の発現を検出するなどの選択（ポジティブ選択）によっては相同組換えにより標的となる内在性プロサイモシンα遺伝子にターゲッティングされたクローンのみを効率よく選択することができず、選択されたすべてのクローンについてサザンハイブリダイゼーション法もしくはＰＣＲ法による組込み部位の確認が必要となる。そこで、ターゲッティングベクターの標的配列に相同な領域の外側に、例えば、ガンシクロビル感受性を付与する単純ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子を連結しておけば、該ベクターがランダムに挿入された細胞はＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を有するため、ガンシクロビル含有培地では生育できないが、相同組換えにより内在性プロサイモシンα遺伝子座にターゲッティングされた細胞はＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を有しないので、ガンシクロビル耐性となり選択される（ネガティブ選択）。あるいは、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の代わりに、例えばジフテリア毒素遺伝子を連結すれば、該ベクターがランダムに挿入された細胞は自身の産生する該毒素によって死滅するので、薬剤非存在下で相同組換え体を選択することもできる。
【００２８】
ＥＳ細胞へのターゲッティングベクターの導入には、リン酸カルシウム共沈殿法、電気穿孔（エレクトロポレーション）法、リポフェクション法、レトロウイルス感染法、凝集法、顕微注入（マイクロインジェクション）法、遺伝子銃（パーティクルガン）法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などのいずれも用いることができるが、上述のように、哺乳動物における遺伝子組換えは大部分が非相同的であり、相同組換え体が得られる頻度は低いので、簡便に多数の細胞を処理できること等の点からエレクトロポレーション法が一般的に選択される。エレクトロポレーションには通常の動物細胞への遺伝子導入に使用されている条件をそのまま用いればよく、例えば、対数増殖期にあるＥＳ細胞をトリプシン処理して単一細胞に分散させた後、１０６〜１０８細胞／ｍｌとなるように培地に懸濁してキュベットに移し、ターゲッティングベクターを１０〜１００μｇ添加し、２００〜６００Ｖ／ｃｍの電気パルスを印加することにより行なうことができる。
【００２９】
ターゲッティングベクターが組み込まれたＥＳ細胞は、単一細胞をフィーダー細胞上で培養して得られるコロニーから分離抽出した染色体ＤＮＡをサザンハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ法によりスクリーニングすることによっても検定することができるが、他のＤＮＡ断片として薬剤耐性遺伝子やレポーター遺伝子を使用した場合は、それらの発現を指標として細胞段階で形質転換体を選択することができる。例えば、ポジティブ選択用マーカー遺伝子としてｎｐｔＩＩ遺伝子を含むベクターを用いた場合、遺伝子導入処理後のＥＳ細胞をＧ４１８などのネオマイシン系抗生物質を含有する培地中で培養し、出現した耐性コロニーをトランスフォーマントの候補として選択する。また、ネガティブ選択用マーカー遺伝子として、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を含むベクターを用いた場合、ガンシクロビルを含有する培地中で培養し、出現した耐性コロニーを相同組換え体の候補として選択する。得られたコロニーをそれぞれ培養プレートに移してトリプシン処理、培地交換を繰り返した後、一部を培養用として残し、残りをＰＣＲもしくはサザンハイブリダイゼーションにかけて導入ＤＮＡの存在を確認する。
【００３０】
導入ＤＮＡの組み込みが確認されたＥＳ細胞を同種の非ヒト哺乳動物由来の胚内に戻すと、宿主胚のＩＣＭに組み込まれてキメラ胚が形成される。これを仮親（受胚用雌）に移植してさらに発生を続けさせることにより、プロサイモシンα遺伝子が改変されたキメラ非ヒト哺乳動物が得られる。キメラ動物の中でＥＳ細胞が将来卵や精子に分化する始原生殖細胞の形成に寄与した場合には、生殖系列キメラが得られることとなり、これを交配することによりプロサイモシンα遺伝子改変が遺伝的に固定された非ヒト哺乳動物を作製することができる。
【００３１】
キメラ胚の作製方法としては、桑実胚期までの初期胚同士を接着させて集合させる方法（集合キメラ法）と、胚盤胞の割腔内に細胞を顕微注入する方法（注入キメラ法）とがある。ＥＳ細胞によるキメラ胚の作製においては従来より後者が広く行なわれているが、最近では、８細胞期胚の透明帯内へのＥＳ細胞の注入により集合キメラを作る方法や、マイクロマニピュレーターが不要で操作が容易な方法として、ＥＳ細胞塊と透明帯を除去した８細胞期胚とを共培養して凝集させることによって集合キメラを作製する方法も行われている。
【００３２】
いずれの場合も、宿主胚は、後述する受精卵への遺伝子導入において、採卵用雌として使用され得る非ヒト哺乳動物から同様にして採取することができるが、例えばマウスの場合、キメラマウス形成へのＥＳ細胞の寄与率を毛色（コートカラー）で判定し得るように、ＥＳ細胞の由来する系統とは毛色の異なる系統のマウスから宿主胚を採取することが好ましい。例えば、ＥＳ細胞が１２９系マウス（毛色：アグーチ）由来であれば、採卵用雌としてＣ５７ＢＬ／６マウス（毛色：ブラック）やＩＣＲマウス（毛色：アルビノ）を用い、ＥＳ細胞がＣ５７ＢＬ／６もしくはＤＢＦ１マウス（毛色：ブラック）由来のものやＴＴ２細胞（Ｃ５７ＢＬ／６とＣＢＡとのＦ１（毛色：アグーチ）由来）であれば、採卵用雌としてＩＣＲマウスやＢＡＬＢ／ｃマウス（毛色：アルビノ）を用いることができる。
【００３３】
また、生殖系列キメラ形成能はＥＳ細胞と宿主胚との組み合わせに大きく依存するので、生殖系列キメラ形成能の高い組み合わせを選択することがより好ましい。例えばマウスの場合、１２９系統由来のＥＳ細胞に対してはＣ５７ＢＬ／６系統由来の宿主胚等を用いることが好ましく、Ｃ５７ＢＬ／６系統由来のＥＳ細胞に対してはＢＡＬＢ／ｃ系統由来の宿主胚等が好ましい。
【００３４】
採卵用雌マウスは約４〜約６週齢程度が好ましく、交配用の雄マウスとしては約２〜約８ヶ月齢程度の同系統のものが好ましい。交配は自然交配によってもよいが、好ましくは性腺刺激ホルモン（卵胞刺激ホルモン、次いで黄体形成ホルモン）を投与して過剰排卵を誘起した後に行なわれる。
【００３５】
胚盤注入法による場合は、胚盤胞期胚（例えばマウスの場合、交配後約３．５日）を採卵用雌の子宮から採取し（あるいは桑実胚期以前の初期胚を卵管から採取した後、胚培養用培地（後述）中で胚盤胞期まで培養してもよい）、マイクロマニピュレーターを用いて胚盤胞の割腔内にターゲッティングベクターが導入されたＥＳ細胞（約１０〜約１５個）を注入した後、偽妊娠させた受胚用雌非ヒト哺乳動物の子宮内に移植する。受胚用雌非ヒト哺乳動物は受精卵への遺伝子導入における受胚用雌として使用され得る非ヒト哺乳動物を同様に用いることができる。
【００３６】
共培養法による場合は、８細胞期胚および桑実胚（例えばマウスの場合、交配後約２．５日）を採卵用雌の卵管および子宮から採取して（あるいは８細胞期以前の初期胚を卵管から採取した後、胚培養用培地中で８細胞期または桑実胚期まで培養してもよい）酸性タイロード液中で透明帯を溶解した後、ミネラルオイルを重層した胚培養用培地の微小滴中にターゲッティングベクターが導入されたＥＳ細胞塊（細胞数約１０〜約１５個）を入れ、さらに上記８細胞期胚または桑実胚（好ましくは２個）を入れて一晩共培養する。得られた桑実胚または胚盤胞を上記と同様にして受胚用雌非ヒト哺乳動物の子宮内に移植する。
【００３７】
移植胚が首尾よく着床し受胚雌が妊娠すれば、自然分娩もしくは帝王切開によりキメラ非ヒト哺乳動物が得られる。自然分娩した受胚雌にはそのまま哺乳を継続させればよく、帝王切開により出産した場合は、産仔は別途用意した哺乳用雌（通常に交配・分娩した雌非ヒト哺乳動物）に哺乳させることができる。
【００３８】
生殖系列キメラの選択は、まずＥＳ細胞の雌雄が予め判別されている場合はＥＳ細胞と同じ性別のキメラマウスを選択し（通常は雄性ＥＳ細胞が使用されるので、雄キメラマウスが選択される）、次いで毛色等の表現型からＥＳ細胞の寄与率が高いキメラマウス（例えば、５０％以上）を選択する。例えば、１２９系マウス由来の雄性ＥＳ細胞であるＤ３細胞とＣ５７ＢＬ／６マウス由来の宿主胚とのキメラ胚から得られるキメラマウスの場合、アグーチの毛色の占める割合の高い雄マウスを選択するのが好ましい。選択されたキメラ非ヒト哺乳動物が生殖系列キメラであるか否かの確認は、適当な系統の同種動物との交雑により得られるＦ１動物の表現型に基づいて行なうことができる。例えば、上記キメラマウスの場合、アグーチはブラックに対して優性であるので、雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスと交雑すると、選択された雄マウスが生殖系列キメラであれば得られるＦ１の毛色はアグーチとなる。
【００３９】
上記のようにして得られるターゲッティングベクターが導入された生殖系列キメラ非ヒト哺乳動物（ファウンダー）は、通常、相同染色体の一方のプロサイモシンα遺伝子のみが改変されたヘテロ接合体として得られる。相同染色体の両方のプロサイモシンα遺伝子が改変されたホモ接合体を得るためには、上記のようにして得られるＦ１動物のうちヘテロ接合体の兄妹同士を交雑すればよい。ヘテロ接合体の選択は、例えばＦ１動物の尾部より分離抽出した染色体ＤＮＡをサザンハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ法によりスクリーニングすることにより検定することができる。得られるＦ２動物の１／４がホモ接合体となる。
【００４０】
ターゲッティングベクターとしてウイルスを用いる場合の別の好ましい一実施態様として、ポジティブ選択用マーカー遺伝子が５’および３’アームの間に挿入され、該アームの外側にネガティブ選択用マーカー遺伝子を含むＤＮＡを含むウイルスで、非ヒト哺乳動物のＥＳ細胞を感染させる方法が挙げられる（例えば、プロシーディングズ・オヴ・ナショナル・アカデミー・オヴ・サイエンシーズ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）第９９巻，第４号，第２１４０−２１４５頁，２００２年参照）。例えば、レトロウイルスやレンチウイルスを用いる場合、ディッシュなどの適当な培養器に細胞を播き、培養液にウイルスベクターを加えて（所望によりポリブレンを共存させてもよい）、１〜２日間培養後、上述のように選択薬剤を添加して培養を続け、ベクターが組み込まれた細胞を選択する。
【００４１】
ｌｏｘＰ配列によって挟まれたプロサイモシンα遺伝子を有する、プロサイモシンα遺伝子改変非ヒト哺乳動物は、上記した方法によって作成されうるが、すでに現存するプロサイモシンα遺伝子改変非ヒト哺乳動物を入手して用いてもよい。
【００４２】
線条体におけるプロサイモシンα遺伝子がノックアウトされた非ヒト哺乳動物は、前記のｌｏｘＰ配列によって挟まれたプロサイモシンα遺伝子を有する、プロサイモシンα遺伝子改変非ヒト哺乳動物と線条体特異的に発現されるｃｒｅ遺伝子を有する遺伝子改変非ヒト哺乳動物を交配することによって得られる。
【００４３】
線条体特異的に発現されるｃｒｅ遺伝子を導入する具体的な手段としては、Ｃｒｅ蛋白質をコードするＤＮＡを、自体公知のトランスジェニック作製技術を用いて導入し、対象非ヒト哺乳動物内で線条体特異的に発現させる方法などが挙げられる。
【００４４】
Ｃｒｅ蛋白質をコードするＤＮＡとしては、バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ蛋白質もしくはそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡであってよい。Ｃｒｅ蛋白質をコードするＤＮＡとしては、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＹＰ＿００６４７２．１として登録されているアミノ酸配列をコードするＤＮＡが挙げられる。「実質的に同一のアミノ酸配列」としては、前記アミノ酸配列と約９０％以上、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。アミノ酸配列の同一性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）にて計算することができる。
実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質としては、前記アミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列からなる蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質が好ましい。実質的に同質の活性としては、例えば、ｌｏｘＰ配列結合作用、ｌｏｘＰに挟まれたＤＮＡ配列の切り出し作用などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が定性的に同等であることを示す。したがって、ｌｏｘＰ配列結合作用、ｌｏｘＰに挟まれたＤＮＡ配列の切り出し作用などの活性が同等であることが好ましいが、これらの活性の程度（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）や蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。また、Ｃｒｅ蛋白質をコードするＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＣ＿００５８５６．１として登録されている塩基配列に含まれるＤＮＡが用いられ得る。
【００４５】
Ｃｒｅ蛋白質をコードするＤＮＡは、バクテリオファージＰ１に由来するＤＮＡまたはＲＮＡの全てあるいは一部を用いて公知の方法により調製されたｃＤＮＡを原料として用い、公知のｃｒｅ遺伝子配列をもとに作製したオリゴヌクレオチドをプローブもしくはプライマーとして、ハイブリダイゼーション法もしくはＰＣＲ法などにより単離することができる。
【００４６】
本発明の線条体特異的に発現されるｃｒｅ遺伝子を有する遺伝子改変非ヒト哺乳動物は、Ｃｒｅ蛋白質をコードするＤＮＡを「線条体において特異的に発現可能な状態で」保持している。したがって、当該ＤＮＡを対象動物に導入するにあたっては、当該ＤＮＡを対象動物の線条体においてのみ機能し得るプロモーターの下流に連結した発現カセットを含む形態（例、発現ベクターなど）で用いる必要がある。
【００４７】
Ｃｒｅ蛋白質をコードするＤＮＡを担持するベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウイルスなどのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルスなどの動物もしくは昆虫ウイルスなどが用いられる。なかでも、プラスミド（好ましくは大腸菌由来、枯草菌由来または酵母由来、特に大腸菌由来のプラスミド）や、動物ウイルス（好ましくはレトロウイルス、レンチウイルス）が好ましい。
【００４８】
Ｃｒｅ蛋白質の遺伝子発現調節を行うプロモーターとしては、対象非ヒト哺乳動物の線条体において機能し得るプロモーターである必要があり、そのようなプロモーターとしては、例えば、Ｇ蛋白質γ７サブユニット遺伝子（Ｇｎｇ７）プロモーター、Ｄｉｓｔａｌ−ｌｅｓｓ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ５／６（Ｄｌｘ５／６）プロモーター、Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅプロモーター等が挙げられ、その中でも線条体に特異的に高発現するプロモーターとして、Ｇ蛋白質γ７サブユニット遺伝子（Ｇｎｇ７）プロモーターが特に好ましく用いられる。
【００４９】
Ｃｒｅ蛋白質をコードするＤＮＡの下流には、非ヒト哺乳動物において目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結させる配列（ポリアデニレーション（ｐｏｌｙＡ）シグナル、ターミネーターとも呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス遺伝子由来、あるいは各種哺乳動物または鳥類の遺伝子由来のターミネーター配列を用いて、効率よい導入遺伝子の発現を達成することができる。好ましくは、シミアンウイルスのＳＶ４０ターミネーターなどが用いられる。その他、目的の遺伝子をさらに高発現させる目的で、各遺伝子のスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核遺伝子のイントロンの一部を、プロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流に連結することも目的により可能である。
【００５０】
また、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を用いて非ヒト哺乳動物を作製する場合、上記のベクターは、導入ＤＮＡが安定に組み込まれたクローンを選択するための選択マーカー遺伝子（例：ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子）をさらに含むことが好ましい。さらに、相同組換えにより宿主染色体の特定の部位に導入ＤＮＡを組み込むこと（即ち、ノックイン動物の作製）を意図する場合には、上記のベクターは、ランダムな挿入を排除するために、標的部位と相同なＤＮＡ配列の外側に単純ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子やジフテリア毒素遺伝子をネガティブ選択マーカー遺伝子としてさらに含むことが好ましい。
【００５１】
上記のプロモーター、Ｃｒｅ蛋白質をコードするＤＮＡ、ターミネーターなどは、適当な制限酵素およびＤＮＡリガーゼ等を用いた通常の遺伝子工学的手法により、上記のベクター中に正しい配置で、即ち非ヒト哺乳動物においてＣｒｅ蛋白質を発現可能な配置で、挿入することができる。
【００５２】
Ｃｒｅ蛋白質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを細胞に導入する方法としては、標的細胞に応じて自体公知の方法が適宜用いられる。例えば、受精卵などの初期胚への導入については、マイクロインジェクション法が用いられる。また、ＥＳ細胞への導入については、リン酸カルシウム共沈殿法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、レトロウイルス感染法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などが用いられ得る。あるいは、ベクターとしてレトロウイルスやレンチウイルスなどを用いる場合には、初期胚やＥＳ細胞にウイルスを添加して１〜２日培養し、該細胞を該ウイルスに感染させることにより、簡便に遺伝子導入を達成し得る場合がある。ＥＳ細胞からの個体再生（ファウンダーの樹立）、継代（ホモ接合体の作製）等は、本発明のプロサイモシンα遺伝子改変非ヒト哺乳動物において上記した方法と同様の方法により行うことができる。
【００５３】
好ましい一実施態様においては、Ｃｒｅ蛋白質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターは、マイクロインジェクション法により対象となる非ヒト哺乳動物の初期胚に導入される。
【００５４】
対象非ヒト哺乳動物の初期胚は、同種の非ヒト哺乳動物の雌雄を交配させて得られる体内受精卵を採取するか、あるいは同種の非ヒト哺乳動物の雌雄からそれぞれ採取した卵と精子を体外受精させることにより得ることができる。
用いる非ヒト哺乳動物の齢や飼育条件等は動物種によってそれぞれ異なるが、例えばマウス（好ましくはＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）などの近交系マウス、Ｂ６と他の近交系とのＦ１など）を用いる場合は、雌が約４〜約６週齢、雄が約２〜約８ヶ月齢程度のものが好ましく、また、約１２時間明期条件（例えば７：００−１９：００）で約１週間飼育したものが好ましい。
【００５５】
体内受精は自然交配によってもよいが、性周期の調節と１個体から多数の初期胚を得ることを目的として、雌非ヒト哺乳動物に性腺刺激ホルモンを投与して過剰排卵を誘起した後、雄非ヒト哺乳動物と交配させる方法が好ましい。雌非ヒト哺乳動物の排卵誘発法としては、例えば初めに卵胞刺激ホルモン（妊馬血清性性腺刺激ホルモン、一般にＰＭＳＧと略する）、次いで黄体形成ホルモン（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、一般にｈＣＧと略する）を、例えば腹腔内注射などにより投与する方法が好ましいが、好ましいホルモンの投与量、投与間隔は非ヒト哺乳動物の種類によりそれぞれ異なる。例えば、非ヒト哺乳動物がマウス（好ましくはＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）などの近交系マウス、Ｂ６と他の近交系とのＦ１など）の場合は、通常、卵胞刺激ホルモン投与後、約４８時間後に黄体形成ホルモンを投与し、直ちに雄マウスと交配させることにより受精卵を得る方法が好ましく、卵胞刺激ホルモンの投与量は約２０〜約５０ＩＵ／個体、好ましくは約３０ＩＵ／個体、黄体形成ホルモンの投与量は約０〜約１０ＩＵ／個体、好ましくは約５ＩＵ／個体である。
【００５６】
一定時間経過後、膣栓の検査等により交配を確認した雌非ヒト哺乳動物の腹腔を開き、卵管から受精卵を取り出して胚培養用培地（例：Ｍ１６培地、修正Ｗｈｉｔｔｅｎ培地、ＢＷＷ培地、Ｍ２培地、ＷＭ−ＨＥＰＥＳ培地、ＢＷＷ−ＨＥＰＥＳ培地等）中で洗って卵丘細胞を除き、微小滴培養法等により５％炭酸ガス／９５％大気下でＤＮＡ顕微注入まで培養する。直ちに顕微注入を行わない場合、採取した受精卵を緩慢法または超急速法等で凍結保存することも可能である。
【００５７】
一方、体外受精の場合は、採卵用雌非ヒト哺乳動物（体内受精の場合と同様のものが好ましく用いられる）に上記と同様に卵胞刺激ホルモンおよび黄体形成ホルモンを投与して排卵を誘発させた後、卵子を採取して受精用培地（例：ＴＹＨ培地）中で体外受精時まで微小滴培養法等により５％炭酸ガス／９５％大気下で培養する。他方、同種の雄非ヒト哺乳動物（体内受精の場合と同様のものが好ましく用いられる）から精巣上体尾部を取り出し、精子塊を採取して受精用培地中で前培養する。前培養終了後の精子を卵子を含む受精用培地に添加し、微小滴培養法等により５％炭酸ガス／９５％大気下で培養した後、２個の前核を有する受精卵を顕微鏡下で選抜する。直ちにＤＮＡの顕微注入を行わない場合は、得られた受精卵を緩慢法または超急速法等で凍結保存することも可能である。
【００５８】
受精卵へのＤＮＡの顕微注入は、マイクロマニピュレーター等の公知の装置を用いて常法に従って実施することができる。簡潔に言えば、胚培養用培地の微小滴中に入れた受精卵をホールディングピペットで吸引して固定し、インジェクションピペットを用いてＤＮＡ溶液を雄性もしくは雌性前核、好ましくは雄性前核内に直接注入する。導入ＤＮＡはＣｓＣｌ密度勾配超遠心または陰イオン交換樹脂カラム等で高度に精製したものを用いることが好ましい。また、導入ＤＮＡは制限酵素を用いてベクター部分を切断し、直鎖状にしておくことが好ましい。
【００５９】
ＤＮＡ導入後の受精卵は胚培養用培地中で微小滴培養法等により５％炭酸ガス／９５％大気下で１細胞期〜胚盤胞期まで培養した後、偽妊娠させた受胚用雌非ヒト哺乳動物の卵管または子宮内に移植される。受胚用雌非ヒト哺乳動物は移植される初期胚が由来する動物と同種のものであればよく、例えば、マウス初期胚を移植する場合は、ＩＣＲ系の雌マウス（好ましくは約８〜約１０週齢）などが好ましく用いられる。受胚用雌非ヒト哺乳動物を偽妊娠状態にする方法としては、例えば、同種の精管切除（結紮）雄非ヒト哺乳動物（例えば、マウスの場合、ＩＣＲ系の雄マウス（好ましくは約２ヶ月齢以上））と交配させて、膣栓の存在が確認されたものを選択する方法が知られている。
【００６０】
受胚用雌は自然排卵のものを用いてもよいし、あるいは精管切除（結紮）雄との交配に先立って、黄体形成ホルモン放出ホルモン（一般にＬＨＲＨと略する）もしくはその類縁体を投与し、受精能を誘起させたものを用いてもよい。ＬＨＲＨ類縁体としては、例えば、［３，５−ＤｉＩ−Ｔｙｒ５］−ＬＨ−ＲＨ、［Ｇｌｎ８］−ＬＨ−ＲＨ、［Ｄ−Ａｌａ６］−ＬＨ−ＲＨ、［ｄｅｓ−Ｇｌｙ１０］−ＬＨ−ＲＨ、［Ｄ−Ｈｉｓ（Ｂｚｌ）６］−ＬＨ−ＲＨおよびそれらのＥｔｈｙｌａｍｉｄｅなどが挙げられる。ＬＨＲＨもしくはその類縁体の投与量、ならびにその投与後に雄非ヒト哺乳動物と交配させる時期は、非ヒト哺乳動物の種類によりそれぞれ異なる。例えば、非ヒト哺乳動物がマウス（好ましくはＩＣＲ系のマウスなど）の場合には、通常、ＬＨＲＨもしくはその類縁体を投与した後、約４日目に雄マウスと交配させることが好ましく、ＬＨＲＨあるいはその類縁体の投与量は、通常、約１０〜６０μｇ／個体、好ましくは約４０μｇ／個体である。
【００６１】
通常、移植される初期胚が桑実胚期以後の場合は受胚用雌の子宮に、それより前（例えば、１細胞期〜８細胞期胚）であれば卵管に胚移植される。受胚用雌は、移植胚の発生段階に応じて偽妊娠からある日数が経過したものが適宜使用される。例えばマウスの場合、２細胞期胚を移植するには偽妊娠後約０．５日の雌マウスが、胚盤胞期胚を移植するには偽妊娠後約２．５日の雌マウスが好ましい。受胚用雌を麻酔（好ましくはＡｖｅｒｔｉｎ、ネンブタール等が使用される）後、切開して卵巣を引き出し、胚培養用培地に懸濁した初期胚（約５〜約１０個）を胚移植用ピペットを用いて、卵管腹腔口もしくは子宮角の卵管接合部付近に注入する。
【００６２】
移植胚が首尾よく着床し受胚雌が妊娠すれば、自然分娩もしくは帝王切開により仔非ヒト哺乳動物が得られる。自然分娩した受胚雌にはそのまま哺乳を継続させればよく、帝王切開により出産した場合は、産仔は別途用意した哺乳用雌（例えばマウスの場合、通常に交配・分娩した雌マウス（好ましくはＩＣＲ系の雌マウス等））に哺乳させることができる。
【００６３】
受精卵細胞段階におけるＣｒｅ蛋白質をコードするＤＮＡの導入は、導入ＤＮＡが対象非ヒト哺乳動物の生殖系列細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。導入ＤＮＡが染色体ＤＮＡに組み込まれているか否かは、例えば、産仔の尾部より分離抽出した染色体ＤＮＡをサザンハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ法によりスクリーニングすることにより検定することができる。上記のようにして得られる仔非ヒト哺乳動物（Ｆ０）の生殖系列細胞においてＣｒｅ蛋白質をコードするＤＮＡが存在することは、その後代（Ｆ１）の動物全てが、その生殖系列細胞および体細胞のすべてにＣｒｅ蛋白質をコードするＤＮＡが存在することを意味する。
通常、Ｆ０動物は相同染色体の一方にのみ導入ＤＮＡを有するヘテロ接合体として得られる。また、個々のＦ０個体は相同組換えによらない限り異なる染色体上にランダムに挿入される。相同染色体の両方に導入ＤＮＡを有するホモ接合体を得るためには、Ｆ０動物と非トランスジェニック動物とを交雑してＦ１動物を作製し、相同染色体の一方にのみ導入ＤＮＡを有するヘテロ接合体の兄妹同士を交雑すればよい。１遺伝子座にのみ導入ＤＮＡが組み込まれていれば、得られるＦ２動物の１／４がホモ接合体となる。
【００６４】
ベクターとしてウイルスを用いる場合の別の好ましい一実施態様として、上記プロサイモシンα遺伝子改変非ヒト哺乳動物の場合と同様に、Ｃｒｅ蛋白質をコードするＤＮＡを含むウイルスで、非ヒト哺乳動物の初期胚もしくはＥＳ細胞を感染させる方法が挙げられる。細胞として受精卵を用いる場合は、感染に先立って透明帯を除いておくことが好ましい。ウイルスベクターを感染させて１〜２日間培養後、初期胚であれば、上述のように偽妊娠させた受胚用雌非ヒト哺乳動物の卵管または子宮内に移植し、ＥＳ細胞であれば、上述のように選択薬剤を添加して培養を続け、ベクターが組み込まれた細胞を選択する。
【００６５】
さらに、プロシーディングズ・オヴ・ナショナル・アカデミー・オヴ・サイエンシーズ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）第９８巻，第１３０９０−１３０９５頁，２００１年に記載されるように、雄非ヒト哺乳動物から採取した精原細胞をＳＴＯフィーダー細胞と共培養する間にウイルスベクターに感染させた後、雄性不妊非ヒト哺乳動物の精細管に注入して雌非ヒト哺乳動物と交配させることにより、効率よくＣｒｅ蛋白質をコードするＤＮＡのへテロ非ヒト哺乳動物（＋／−）産仔を得ることができる。
【００６６】
線条体特異的に発現されるＣｒｅ遺伝子を有する遺伝子改変非ヒト哺乳動物は、上記した方法によって作成されうるが、すでに現存する遺伝子改変非ヒト哺乳動物を入手して用いてもよい。
【００６７】
線条体特異的に発現されるＣｒｅ遺伝子を有する遺伝子改変非ヒト哺乳動物と前記のｌｏｘＰ配列によって挟まれたプロサイモシンα遺伝子を有する、プロサイモシンα遺伝子改変非ヒト哺乳動物とを交雑する場合、ホモ接合体同士を交雑することが望ましい。例えば、線条体特異的に発現されるｃｒｅ遺伝子を有する遺伝子改変非ヒト哺乳動物としてＧｎｇ７−Ｃｒｅ（＋／＋）マウスと、ｌｏｘＰ配列によって挟まれたプロサイモシンα遺伝子を有する、プロサイモシンα遺伝子改変非ヒト哺乳動物として、ＰｒｏＴａ ｆｌｏｘ（＋／＋）マウスとを交雑して得られるＦ１は、全個体がＧｎｇ７−Ｃｒｅ（＋／−）×ＰｒｏＴａ ｆｌｏｘ（＋／−）である。このＦ１個体同士を交雑することにより、１／８の確率でＧｎｇ７−Ｃｒｅ（＋／−）×ＰｒｏＴａ ｆｌｏｘ（＋／＋）が得られる。そこで、得られたＧｎｇ７−Ｃｒｅ（＋／−）×ＰｒｏＴａ ｆｌｏｘ（＋／＋）雄マウスに対し、ＰｒｏＴａ ｆｌｏｘ（＋／＋）雌マウスを交雑することで、1/2の高確率でＧｎｇ７−Ｃｒｅ（＋／−）×ＰｒｏＴａ ｆｌｏｘ（＋／＋）を効率的に得ることができる。上記交雑方式においてプロサイモシンα遺伝子がホモノックアウトされた影響が母体に与える影響を考慮し、雄がＧｎｇ７−Ｃｒｅ（＋／−）×ＰｒｏＴａ ｆｌｏｘ（＋／＋）で雌がＰｒｏＴａ ｆｌｏｘ（＋／＋）となるように交雑することが最も好ましい。プロサイモシンα遺伝子は線条体においてホモノックアウトされていることが好ましい。従って、線条体におけるプロサイモシンα遺伝子がノックアウトされた非ヒト哺乳動物としては、Ｇ蛋白質γ７サブユニット遺伝子プロモーターにより発現制御されたｃｒｅ遺伝子を有し、かつｌｏｘＰ配列に挟まれたプロサイモシンα遺伝子をホモ接合型で有する非ヒト哺乳動物が好ましく挙げられる。
【００６８】
線条体におけるプロサイモシンα遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物には、アンチセンスもしくはＲＮＡｉ技術によりプロサイモシンα遺伝子の発現が線条体において不活性化される条件付ノックダウン（ＫＤ）非ヒト哺乳動物も含まれる。
【００６９】
線条体においてプロサイモシンα遺伝子をノックダウンする具体的な手段としては、プロサイモシンαのアンチセンスＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡ（ｓｈＲＮＡを含む）をコードするＤＮＡを、自体公知のトランスジェニック作製技術を用いて導入し、対象非ヒト哺乳動物内で線条体特異的に発現させる方法などが挙げられる。
【００７０】
目的のポリヌクレオチドの標的領域と相補的な塩基配列を含むＤＮＡ、即ち、目的のポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるＤＮＡは、該目的のポリヌクレオチドに対して「アンチセンス」であるということができる。
プロサイモシンαをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に、相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンスＤＮＡとしては、プロサイモシンαをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有し、該ポリヌクレオチドの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスＤＮＡであってもよい。
【００７１】
プロサイモシンαをコードするポリヌクレオチドに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、該ポリヌクレオチドの相補鎖の塩基配列と、オーバーラップする領域に関して、約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列である。本明細書における塩基配列の相同性は、例えば、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。
特に、プロサイモシンαをコードするポリヌクレオチドの相補鎖の全塩基配列のうち、（ａ）翻訳阻害を指向したアンチセンスＤＮＡの場合は、プロサイモシンα蛋白質のＮ末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスＤＮＡが、（ｂ）ＲＮａｓｅＨによるＲＮＡ分解を指向するアンチセンスＤＮＡの場合は、イントロンを含むプロサイモシンαをコードするポリヌクレオチドの全塩基配列の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスＤＮＡがそれぞれ好適である。
【００７２】
具体的には、対象非ヒト哺乳動物がマウスの場合、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００８９７２．２として登録されている塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部を含むアンチセンスＤＮＡ、好ましくは、該塩基配列に相補的な塩基配列またはその一部を含むアンチセンスＤＮＡなどが挙げられる。また、対象非ヒト哺乳動物がラットの場合、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０２１７４０．１で表される塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部を含むアンチセンスＤＮＡ、好ましくは、該塩基配列に相補的な塩基配列またはその一部を含むアンチセンスＤＮＡなどが挙げられる。
【００７３】
プロサイモシンαをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンスＤＮＡ（以下、「本発明のアンチセンスＤＮＡ」ともいう）は、クローン化した、あるいは決定されたプロサイモシンαをコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。かかるアンチセンスＤＮＡは、プロサイモシンα遺伝子の複製または発現を阻害することができる。即ち、本発明のアンチセンスＤＮＡは、プロサイモシンα遺伝子から転写されるＲＮＡ（ｍＲＮＡまたは初期転写産物）とハイブリダイズすることができ、ｍＲＮＡの合成（プロセッシング）または機能（蛋白質への翻訳）を阻害することができる。
【００７４】
本発明のアンチセンスＤＮＡの標的領域は、アンチセンスＤＮＡがハイブリダイズすることにより、結果としてプロサイモシンα蛋白質への翻訳が阻害されるものであればその長さに特に制限はなく、該蛋白質をコードするｍＲＮＡの全配列であっても部分配列であってもよく、短いもので約１０塩基程度、長いものでｍＲＮＡまたは初期転写産物の全配列が挙げられる。具体的には、プロサイモシンα遺伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、翻訳開始コドン、蛋白質コード領域、ＯＲＦ翻訳終止コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域または３’端ヘアピンループなどが、アンチセンスＤＮＡの好ましい標的領域として選択しうるが、プロサイモシンα遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。例えば、該遺伝子のイントロン部分を標的領域とすることもできる。
さらに、本発明のアンチセンスＤＮＡは、プロサイモシンαのｍＲＮＡもしくは初期転写産物とハイブリダイズして蛋白質への翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖ＤＮＡであるプロサイモシンα遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、ＲＮＡの転写を阻害し得るものであってもよい。あるいはＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを形成してＲＮａｓｅＨによる分解を誘導するものであってもよい。
【００７５】
プロサイモシンαをコードするｍＲＮＡもしくは初期転写産物を、コード領域の内部（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）で特異的に切断し得るリボザイムをコードするＤＮＡもまた、本発明のアンチセンスＤＮＡに包含され得る。リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性ＲＮＡに見られるセルフスプライシングＲＮＡがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約４０塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約１０塩基程度）をｍＲＮＡの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的ｍＲＮＡのみを特異的に切断することが可能である。このタイプのリボザイムは、ＲＮＡのみを基質とするので、ゲノムＤＮＡを攻撃することがないというさらなる利点を有する。プロサイモシンα ｍＲＮＡが自身で二本鎖構造をとる場合には、ＲＮＡヘリカーゼと特異的に結合し得るウイルス核酸由来のＲＮＡモチーフを連結したハイブリッドリボザイムを用いることにより、標的配列を一本鎖にすることができる［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８（１０）：５５７２−５５７７（２００１）］。さらに、転写産物の細胞質への移行を促進するために、ｔＲＮＡを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２９（１３）：２７８０−２７８８（２００１）］。
【００７６】
本明細書においては、プロサイモシンαのｍＲＮＡもしくは初期転写産物のコード領域内の部分配列（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）に相同なオリゴＲＮＡとその相補鎖とからなる二本鎖ＲＮＡ、いわゆる短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もまた、本発明のＫＤ動物作製のために用いることができる。ｓｉＲＮＡを細胞内に導入するとそのＲＮＡに相同なｍＲＮＡが分解される、いわゆるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、この現象が動物細胞でも広く起こることが確認されて以来［Ｎａｔｕｒｅ，４１１（６８３６）：４９４−４９８（２００１）］、リボザイムの代替技術として汎用されている。ｓｉＲＮＡは標的となるｍＲＮＡの塩基配列情報に基づいて、市販のソフトウェア（例：ＲＮＡｉ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて適宜設計することができる。
【００７７】
本発明のアンチセンスオリゴＤＮＡ及びリボザイムは、プロサイモシンαのｃＤＮＡ配列もしくはゲノミックＤＮＡ配列に基づいてｍＲＮＡもしくは初期転写産物の標的配列を決定し、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。合成されたアンチセンスオリゴＤＮＡまたはリボザイムは、必要に応じて適当なリンカー（アダプター）配列を介して発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、アンチセンスオリゴＲＮＡまたはリボザイムをコードするＤＮＡ発現ベクターを調製することができる。ここで用いられ得る発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウイルスなどのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルスなどの動物もしくは昆虫ウイルスなどが用いられる。なかでも、プラスミド（好ましくは大腸菌由来、枯草菌由来または酵母由来、特に大腸菌由来のプラスミド）や、動物ウイルス（好ましくはレトロウイルス、レンチウイルス）が好ましく例示される。
【００７８】
また、本発明のアンチセンスオリゴＤＮＡを発現させるプロモーターは、線条体特異的に発現するプロモーターである必要がある。そのようなプロモーターとしては、例えば、Ｇ蛋白質γ７サブユニット遺伝子（Ｇｎｇ７）プロモーターが挙げられる。
【００７９】
より長いアンチセンスＲＮＡ（例えば、プロサイモシンαｍＲＮＡの相補鎖全長など）をコードするＤＮＡ発現ベクターは、常法によりクローニングしたプロサイモシンαｃＤＮＡを、必要に応じて適当なリンカー（アダプター）配列を介して発現ベクターのプロモーターの下流に逆方向に挿入することにより調製することができる。
【００８０】
一方、ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡは、センス鎖またはアンチセンス鎖をコードするＤＮＡとして別個に合成し、それぞれを適当な発現ベクター中に挿入することにより調製することができる。この場合、該ベクターが導入された動物細胞内で、センス鎖とアンチセンス鎖がそれぞれ転写されてアニーリングすることにより、ｓｉＲＮＡが形成される。ｓｈＲＮＡは、センス鎖とアンチセンス鎖との間に、適当なループ構造を形成しうる長さの塩基（例えば１５から２５塩基程度）を挿入したユニットを、適当な発現ベクター中に挿入することにより調製することができる。この場合、該発現ベクターを導入された動物細胞内で転写されたｓｈＲＮＡは、自身でループを形成した後に、内在の酵素ダイサー（ｄｉｃｅｒ）などによってプロセシングされることにより成熟ｓｉＲＮＡが形成される。ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを発現するベクターのプロモーターとしては、線条体特異的に発現するプロモーターである必要がある。そのようなプロモーターは、Ｇ蛋白質γ７サブユニット遺伝子（Ｇｎｇ７）プロモーターが挙げられる。
【００８１】
プロサイモシンαのアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、もしくはｍｉＲＮＡをコードするＤＮＡを含む発現ベクターを細胞に導入する方法、該ＤＮＡが導入された受精卵などの初期胚、ＥＳ細胞からの個体再生（ファウンダーの樹立）、継代（ホモ接合体の作製）等は前記したＣｒｅ蛋白質をコードするＤＮＡを用いて線条体特異的に発現されるＣｒｅ遺伝子を有する遺伝子改変非ヒト哺乳動物を作成する方法と同様の方法を用いることができる。
【００８２】
本発明の線条体においてプロサイモシンα遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物は、対応する野生型動物と比較して、以下の特性：
（１）脳虚血処置に対して脆弱である、
（２）運動性が劣る、
（３）加齢によって、上記（１）および／または（２）の症状を自然発症する、および
（４）ドパミンＤ２受容体アゴニスト、ドパミン代謝阻害剤、ＮＭＤＡ受容体拮抗剤またはドパミンＤ１受容体アゴニストによって上記（１）、（２）または（３）の症状が改善する、
を有する。これらの表現型は、従来公知のハンチントン病モデルマウスとしてのハンチンチントランスジェニックマウスやハンチンチンノックインマウスの表現型と一致する部分もあるが、それらのマウスは、線条体全体の神経細胞が傷害されているため、上記の表現型の進行が早く、より重篤であり、実際のハンチントン病の病態を正確に再現していない。また、本発明の線条体においてプロサイモシンα遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物は、運動性異常を示すことからジストニア（ｄｙｓｔｏｎｉａ）症状を示すモデルマウスの表現型とも一致する。ここでジストニアは、虚血性疾患に由来して発症するもの（二次性ジストニア）であってよく、虚血性疾患としては脳梗塞（脳血栓、脳塞栓）が挙げられる。
【００８３】
脳虚血処置に対して脆弱であるとは、例えば、本発明の非ヒト哺乳動物の中大脳動脈を結紮することによって、対応する野生型動物と比較して生存率が低下することをいう。運動性が劣るとは、中大脳動脈の結紮の有無に関わらず、対応する野生型動物と比較して運動機能、運動協調性が劣ることをいう。また、本発明の非ヒト哺乳動物は加齢によって、脳虚血処置に対する脆弱性および運動性が劣る症状を自然発症する。例えば、Ｇｎｇ ｃｒｅ／＋；ＰｒｏＴａ ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスであれば、約１０週齢で対応する野生型マウスと比べて、上記の症状が現れ、週齢が進むにつれて重篤化し、約２０週齢においては野生型マウスと比較して顕著な症状の差が確認できる。これら症状は、興奮性ドパミンＤ１受容体を発現する線条体ＧＡＢＡ神経において機能的プロモサイモシンαを欠失しており、神経保護作用を喪失していることに起因することが示唆される。さらに、本発明の非ヒト哺乳動物は、興奮性ドパミンＤ１受容体の作用の補完効果が期待できるドパミンＤ２受容体アゴニスト、ドパミン代謝阻害剤、グルタミン酸からの神経細胞保護効果が期待されるＮＭＤＡ受容体拮抗剤または抑制性ドパミンＤ２受容体の作用の補完効果が期待できるドパミンＤ１受容体アゴニストを投与されることによって、前記した症状に改善が見られる特徴を有する。ここで、ドパミンＤ２受容体アゴニストとしては、プラミペキソール、ペルゴリド、カベルゴリン、タリペキソール、ロビニロール等が挙げられる。また、ドパミン代謝阻害剤としては、セレギリン、エンタカルボン、ドパミン遊離作用を有するアマンタジン、ドパミンの前駆体であるＬ−ドーパ、プロドラッグとしてのＬ−ドーパ、ドロキシドパ、ドパミン合成酵素の発現上昇などに関連するゾニサミドなども挙げられる。ＮＭＤＡ受容体拮抗剤としては、メマンチン、ＣＰ−１０１６０６（ＩＵＰＡＣ名：（１Ｓ，２Ｓ）−１−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｐｈｅｎｙｌｐｉｐｅｒｉｄｉｎｏ）−１−ｐｒｏｐａｎｏｌ）などが挙げられる。ドパミンＤ１受容体アゴニストとしては、ＳＫＦ３８３９３（ＳＫＦ３８３９３ ＨＣｌ，（±）−１−ｐｈｅｎｙｌ−２，３，４，５−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−１Ｈ−３−ｂｅｎｚａｚｅｐｉｎｅ−７，８−ｄｉｏｌ ＨＣｌ）、ＳＫＦ８１２９７(６Ｃｈｌｏｒｏ１ｐｈｅｎｙｌ２，３，４，５ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ１Ｈ３ｂｅｎｚａｚｅｐｉｎｅ７，８ｄｉｏｌ)、Ｄｏｘａｎｔｈｒｉｎｅなどが挙げられる。
【００８４】
これらの知見に基づけば、プロサイモシンαの線条体における発現不全は、線条核神経の機能低下を通じて神経変性疾患の発症・進展に関与するだけでなく、ジストニアの発症・進展にも深く関与していることが強く示唆される。したがって、本発明の非ヒト哺乳動物は、被験物質を適用し、（１）脳虚血処置に対する生存率および／または（２）運動性を測定することを特徴とする、神経変性疾患または虚血性疾患によるジストニアの治療／予防薬のスクリーニング方法を提供する。さらに、前記の通り、本発明の非ヒト哺乳動物は、加齢とともに脳虚血処置に対する脆弱性および運動性が劣る症状を自然発症し、特に脳虚血処置なしであっても生存率が低下する可能性がある。従って、週齢が進んだ本発明の非ヒト哺乳動物は、被験物質を適用し、（１）生存率および／または（２）運動性を測定することを特徴とする、神経変性疾患または虚血性疾患によるジストニアの治療／予防薬のスクリーニング方法も提供する。週齢は、約１０週齢以上、好ましくは約２０週齢以上である。
【００８５】
具体的には、該スクリーニング方法では、本発明の非ヒト哺乳動物に被験物質を投与する。被験物質としては、公知の合成化合物、ペプチド、蛋白質、ＤＮＡライブラリーなどの他に、例えば哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど）の組織抽出物、細胞培養上清などが用いられ、好ましくは、ドパミンＤ２受容体アゴニスト、ドパミン代謝阻害剤、ＮＭＤＡ受容体拮抗剤またはドパミンＤ１受容体アゴニストが用いられうる。ドパミンＤ２受容体アゴニスト、ドパミン代謝阻害剤、ＮＭＤＡ受容体拮抗剤またはドパミンＤ１受容体アゴニストとしては前記したものが例示される。被験物質の脳虚血処置に対する生存率調節作用および／または運動性調節作用は、それぞれ自体公知の方法、例えば、後記実施例において用いられる方法などに準じて測定することができる。また、測定された結果、被験物質を非投与の本発明の非ヒト哺乳動物に比して脳虚血処置に対する生存率および／または運動性を改善させる被験物質が好ましく選択される。
【００８６】
該スクリーニング法により選択された、脳虚血処置に対する生存率調節作用および／または運動性調節作用を有する被験物質が予防・治療可能な疾患として、神経変性疾患（例えば、ハンチントン病、アルツハイマー、パーキンソン病、神経症（例えば、鬱、不安等）、ジストニア、進行性核上性麻痺、筋萎縮性側索硬化症、線条体黒質変性症、Ｓｈｙ−Ｄｒａｇｅｒ症候群、オリーブ橋小脳萎縮症などが挙げられる。さらに該被験物質は運動性障害の改善を目的として虚血性疾患に由来するジストニアの予防・治療も可能である。
【００８７】
神経変性疾患等の治療／予防薬は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。該治療／予防薬は、生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。これら製剤における有効成分量は後述する投与量を考慮して適宜選択される。
【００８８】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。
【００８９】
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。
【００９０】
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
【００９１】
神経変性疾患等の治療／予防薬の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより異なるが、例えば、神経変性疾患の治療目的で経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇ）においては、一日につき約０．１ｍｇ〜約１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜約５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜約２０ｍｇである。非経口投与の場合、当該治療／予防薬の投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、神経変性疾患の治療目的で注射剤として成人（体重６０ｋｇ）に投与する場合、一日につき約０．０１〜約３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜約２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜約１０ｍｇ程度である。投与対象がヒト以外の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【実施例】
【００９２】
以下において、実施例および参考例により本発明をより具体的に説明するが、この発明はこれらに限定されるものではない。
【００９３】
実施例１ 遺伝子組み換えマウスの作成
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系雄性マウス（野生型マウス）に加え、線条体に特異的に発現するＧｎｇ７のプロモーターにより制御された相同組換え酵素（Ｃｒｅ）を発現するＴＧマウス（Ｇｎｇ７−Ｃｒｅ（＋／−）雄性マウス）、さらにはＧｎｇ７−Ｃｒｅ（＋／−）とＦｌｏｘｅｄプロサイモシンα遺伝子組み換えマウスを交配させたコンディショナル遺伝子欠損マウス（Ｇｎｇ ｃｒｅ／＋；ＰｒｏＴａ ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ雄性マウス）を実験に用いた。両マウスは若齢マウスとして８−１６週齢、高齢マウスとして２０−３０週齢ともに体重：２０−３５ｇの個体を使用した。飼育条件は恒温（２２±２℃）、恒湿（５５±５％）とし、一般実験用の固形飼料（ＭＦ、オリエンタル酵母、東京）、水道水を自由に摂取させた。すべての実験は長崎大学動物実験規則で定める方法に準じて行った。Ｇｎｇ７−Ｃｒｅ（＋／＋）雄性マウスは東京大学大学院 医学系研究科分子神経生物学教室三品昌美教授より、Ｆｌｏｘｅｄプロサイモシンα遺伝子組み換えマウスは大塚製薬株式会社から譲渡された。
マウスプロサイモシンα遺伝子の野生型アリルの構造は図１上段に示すとおりである。また、Ｆｌｏｘｅｄプロサイモシンα遺伝子組み換えマウスの有するＦｌｏｘｅｄアリルは、エキソン１と２の間、およびエキソン３と４の間にｌｏｘＰ配列が相互にタンデムになるようにそれぞれ挿入されており（図１、中段）、Ｃｒｅ蛋白質がｌｏｘＰ配列に作用することによって、２つのｌｏｘＰ配列に挟まれたエキソン２および３を含む配列が欠失する（図１、下段）。なお、Ｃｒｅ蛋白質は、線条体特異的発現プロモーターであるＧｎｇ７プロモーター下流に連結され、上記のコンディショナルマウスは線条体において特異的にプロサイモシンα遺伝子が機能不全となる。本実施例においては、特に別途記載が無い限り、ＷＴは野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／Ｊ６）を、ＧｇはＧｎｇ７−Ｃｒｅ（＋／−）マウスつまりＧｎｇ７プロモーター下流にｃｒｅ遺伝子をヘテロ接合型となるように挿入したマウスを、ＧｇＦＦはＧｎｇ７発現領域である大脳基底核の線条体領域特異的にｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムでプロサイモシンαを欠損させたマウスを示す。
【００９４】
実施例２ 虚血による線条体におけるプロサイモシンα欠損の若齢マウスの病態
８−１６週齢のＷＴ、ＧｇおよびＧｇＦＦマウスを１５分間左中大脳動脈を閉塞することで、一過性の脳虚血状態を引き起こした軽度脳卒中モデルの病態を評価した（図２、３）。ＧｇＦＦマウスの対照群にはＧｇマウスを用いた。
ｔＭＣＡＯ処置後の一過性中大脳動脈閉塞モデルの生存率を経時的に評価した結果、ＷＴマウスでは、生存率は５日間にわたり無変化であった（図２Ｂ）。また、Ｇｇマウスでも４日目において９０％以上の生存率を示した（図３Ｂ）。しかし、ＧｇＦＦマウスでは生存率を大幅に低下させ、処置後２日において、すでに生存率６０パーセント以下に低下した（図３Ｂ）。Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｉｏ（％）は、ｔＭＣＡＯ実施前に測定した値を１００％とし日数経過による生存率を百分率で示した。
また、ｔＭＣＡＯ処置後の一過性中大脳動脈閉塞モデルの運動機能障害を経日的に評価した結果、ＷＴマウスとＧｇマウスでは微弱な運動障害しか観察されなかった（図２Ｃ、３Ｃ）。しかし、ＧｇＦＦマウスでは４ポイントにも及ぶ障害が観察された（図３Ｃ）。本願の実施例において、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｃｏｒｅは次に示す１〜５の臨床スコアで表される。１：右前肢の麻痺、２：一方向性の動き、３：体勢を保てず一方向に傾く、４：自発運動の消失、５：死。
さらに、ｔＭＣＡＯ処置後の一過性中大脳動脈閉塞モデルの運動機能を経日的に評価した結果、ＧｇＦＦマウスはＧｇマウスに比して、滞在時間が短くなる傾向が見られた（図３Ｄ）。ロータロッドの回転速度は、脳卒中病態モデルマウスで実施可能な６ｒｐｍにて行った。
【００９５】
実施例３ 虚血による線条体におけるプロサイモシンα欠損の若齢マウスの病態に対するドパミンＤ２受容体アゴニストの症状改善効果
実施例２と同様に、８−１６週齢のＷＴ、ＧｇおよびＧｇＦＦマウスを１５分間左中大脳動脈を閉塞することで、一過性の脳虚血状態を引き起こした軽度脳卒中モデルに対して、プラミペキソールによる生存率、運動機能障害の改善効果を評価した（図４、５）。１５分間のｔＭＣＡＯ処置を施したＧｇＦＦマウスに０．０１ｍｇ／ｋｇプラミペキソールを腹腔内投与した際の症状改善効果を経過観察した結果をｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｉｏ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｃｏｒｅおよびＬａｔｅｎｃｙ ｔｏ ｆａｌｌで示す。対照群には同じく１５分間のｔＭＣＡＯ処置を施したＷＴマウス、Ｇｇマウスを用いた。ＰＰＸはプラミペキソールを示す。
その結果、ＷＴマウスでは投与群と非投与群に差は見られなかったが、ＧｇＦＦマウスでは、投与群において生存率が７５パーセントに改善した（図４Ｂ）。また、運動機能障害についても、ＧｇＦＦマウスの投与群において顕著に改善した（図５Ｃ）。さらに、運動機能について、６ｒｐｍと１２ｒｐｍの両条件下で、ＷＴマウスに比較してＧｇＦＦマウスの運動機能は低下していたが、プラミペキソールの腹腔内投与により改善が認められた（図５Ｂ、Ｃ）。
【００９６】
実施例４ 虚血による線条体におけるプロサイモシンα欠損の若齢マウスの病態に対するセレギリンの症状改善効果
実施例２と同様に、８−１６週齢のＷＴ、ＧｇおよびＧｇＦＦマウスを１５分間左中大脳動脈を閉塞することで、一過性の脳虚血状態を引き起こした軽度脳卒中モデルに対して、セレギリンによる生存率、運動機能障害の改善効果を評価した（図６、７）。１５分間のｔＭＣＡＯ処置を施したＧｇＦＦマウスに１０ｍｇ／ｋｇセレギリンを腹腔内投与した際の症状改善効果を経過観察した結果をｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｉｏ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｃｏｒｅおよびＬａｔｅｎｃｙ ｔｏ ｆａｌｌで示す。対照群には同じく１５分間のｔＭＣＡＯ処置を施したＷＴマウス、Ｇｇマウスを用いた。
その結果、ＧｇＦＦマウスでは、投与群において生存率が顕著に改善した（図６Ｂ）。また、運動機能障害についても、ＧｇＦＦマウスの投与群において顕著に改善した（図６Ｃ）。さらに、運動機能について、６ｒｐｍと１２ｒｐｍの両条件下で、非投与群に比べて、ＧｇＦＦマウスの運動機能は、セレギリンの腹腔内投与により改善が認められた（図７Ｂ、Ｃ）。
【００９７】
本発明者は、上記実施例において主に週齢８−１６の若齢マウスを対象に解析を行った。そこで、週齢の進んだ加齢マウスについても解析を行った。
【００９８】
実施例５ 線条体におけるプロサイモシンα欠損マウスの週齢依存的な抱擁反射行動または運動機能低下の進行
大脳基底核の線条体領域特異的にプロサイモシンαを欠損したマウスで週齢依存的なＣｌａｓｐｉｎｇ ｒｅｆｌｅｘ（抱擁反射）症状の発症ならびに運動機能の低下に関する評価を行った（図８）。Ｃｌａｓｐｉｎｇ ｓｃｏｒｅは異常がない場合０、前肢同士もしくは後肢同士を結ぶ行動を１、前後肢を結び抱え込む行動を２として判定した。その結果、ＷＴマウスおよびＧｇマウスは異常が確認できなかったが、１０週齢および２０週齢のＧｇＦＦマウスのＣｌａｓｐｉｎｇ ｓｃｏｒｅは、有意に高いことが確認できた（図８Ａ、Ｂ、Ｃ）。
また、運動機能の評価について、マウスを回転式のロッド上で歩行させ、ロッドに滞在できる時間を測定（ロータロッド法）することで評価した。ロッド上を歩行するには全身の各部位をコントロールしバランスをとる必要があるため、本試験は協調運動性の評価法として用いられている。マウス用ロータロッド（ＭＫ−６１０Ａ；室町器械）を最大滞在時間を６０秒間、ロッドの回転速度を３０ｒｐｍ、４０ｒｐｍの条件下で試験を行った。本実施例において本試験を行う前には、２０ｒｐｍの回転速度で６０秒間の訓練試行を１時間の間隔をあけて１日につき４回、３日間連続で行った。３０ｒｐｍはロータロッド回転速度１分毎３０回転すること、４０ｒｐｍは１分毎４０回転することを示す。その結果、ＧｇＦＦマウスのロータロッド上での滞在時間は、ＷＴマウスおよびＧｇマウスに比して有意に短いことが確認できた（図８Ｄ、Ｅ）。
【００９９】
実施例６ 線条体におけるプロサイモシンα欠損の高齢マウスの抱擁反射行動または運動機能低下に対するドパミンＤ２受容体アゴニストの症状改善効果
Ｃｌａｓｐｉｎｇ ｒｅｆｌｅｘおよび運動機能低下を示すＧｇＦＦマウスおよびコントロールとしてのＧｇマウスに対し、ドパミンＤ２受容体のアゴニストであるプラミペキソール０．０１ｍｇ／ｋｇを腹腔内に投与し、急性（２４時間以内）の症状改善効果を評価した（図９）。Ｐｒｅはプラミペキソール投与前、１ｈｒはプラミペキソール投与１時間後を、以下５ｈｒは５時間後、２４ｈｒは２４時間後を示す。なお、本願実施例で用いられるプラミペキソールは塩酸プラミペキソール（ビ・シフロール ０．１２５ｍｇ錠、日本ベーリンガーインゲルハイム）を乳棒、乳鉢を用いて粉砕し、生理食塩水に溶解した後、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを７．０に調整して用いた。各種マウスへは２７ゲージの注射針を用いて腹腔内に投与した。投与５時間後において、ＧｇＦＦマウスの上記の症状が緩和される傾向が観察された。
また、ＧｇＦＦマウスおよびＧｇマウスに対し、慢性的にプラミペキソールを０．０１ ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与した場合の症状改善効果についても、プラミペキソールの投与方法以外は原則的に上記と同様の方法に従って評価した（図１０）。Ｐｒｅ値はプラミペキソール投与前の測定値であり、プラミペキソールは投与１日目から７日目まで毎日投与し、投与してから２４時間後に投与１日後の値を測定、以下１日おきに７日目までｃｌａｓｐｉｎｇ ｓｃｏｒｅの判定ならびにロータロッドによる運動機能評価を行った（図１０Ａ）。その結果、ＧｇＦＦマウスのＣｌａｓｐｉｎｇ ｓｃｏｒｅは、投与前に比して経日的に改善する傾向が確認できた（図１０Ｂ）。また、ＧｇＦＦマウスのロータロッド上での滞在時間は、投与前に比して経日的に長くなる傾向が確認できた（図１０Ｃ、Ｄ）。
【０１００】
実施例７ 線条体におけるプロサイモシンα欠損の高齢マウスの抱擁反射行動または運動機能低下に対するセレギリンの症状改善効果
ＧｇＦＦマウスに対し、ドパミン代謝に関わるＭＡＯ−Ｂの阻害剤であるセレギリン１０ｍｇ／ｋｇを腹腔内に投与し、急性（２４時間以内）の症状改善効果を評価した（図１１）。セレギリンは、モノアミン酸化酵素阻害剤（ＭＡＯＩ）のひとつで、選択的にＭＡＯ−Ｂを阻害しドーパミンの分解を防ぐことで、結果的に脳内ドーパミン量を増加させる薬剤である。Ｐｒｅはセレギリン投与前、１ｈｒはセレギリン投与１時間後を、以下５ｈｒは５時間後、２４ｈｒは２４時間後を示す。その結果、ＧｇＦＦマウスのＣｌａｓｐｉｎｇ ｓｃｏｒｅは、投与前に比して改善する傾向が確認できた（図１１Ｂ）。また、ＧｇＦＦマウスのロータロッド上での滞在時間は、投与前に比して経時的に長くなる傾向が確認できた（図１１Ｃ、Ｄ）。
【０１０１】
実施例８ 線条体におけるプロサイモシンα欠損の高齢マウスの抱擁反射行動または運動機能低下に対するメマンチンの症状改善効果
ＧｇＦＦマウスに対し、グルタミン酸過剰による細胞死を抑制するＮＭＤＡ受容体拮抗作用を有するメマンチン１０ｍｇ／ｋｇを腹腔内に投与し、急性（２４時間以内）の症状改善効果を評価した（図１２）。Ｐｒｅはメマンチン投与前、１ｈｒはメマンチン投与１時間後を、以下５ｈｒは５時間後、２４ｈｒは２４時間後を示す。投与２４時間後において、ＧｇＦＦマウスの運動機能は最も回復が見られた。
ＧｇＦＦマウスに対し、慢性的にメマンチンを１０ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与した場合の症状改善効果を示す。Ｐｒｅ値はメマンチン投与前の測定値であり、メマンチンは投与１日目から７日目まで毎日投与し、投与してから２４時間後に投与１日後の値を測定、以下１日おきに７日目までｃｌａｓｐｉｎｇ ｓｃｏｒｅの判定ならびにロータロッドによる運動機能評価を評価した（図１３）。Ｐｒｅ値はメマンチン投与前の測定値であり、メマンチンは投与１日目から７日目まで毎日投与し、投与してから２４時間後に投与１日後の値を測定、以下１日おきに７日目までｃｌａｓｐｉｎｇ ｓｃｏｒｅの判定ならびにロータロッドによる運動機能評価を行った（図１３Ａ）。結果として、慢性投与によって顕著に症状が回復することが確認できた。
【０１０２】
実施例９ プロサイモシンα欠損の高齢マウスのジェノタイピング
週齢２０−３０のＧｇＦＦおよびＧｇの耳片を５０μｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（２０×ＳＳＣ ５００μｌ，５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ ｐＨ８．０ ２００μｌ，５００ｍＭ ＥＤＴＡ ｐｈ８．０ ４００μｌ，１０％ＳＤＳ １．０ｍｌ，１ｍｇ／ｍｌ ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ ５００μｌ，ＤＷ ７．４ｍｌ）に入れ、６０℃でＯｖｅｒｎｉｇｈｔすることによりＤＮＡを抽出した。ＭａｎｇｏＭｉｘ ２ｘマスターミックス（ＢＩＯＬＩＮＥ）を用い、遺伝子型をＰＣＲ法により判定した（図１４）。プライマーとＰＣＲ条件は以下のものを用いた。
ＧｇＦＦ；
５’−ＴＣＣＴＴＧＧＣＴＴＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＡＡＧ−３’ （配列番号１）
５’−ＴＣＡＣＣＴＧＧＡＧＡＡＴＣＡＡＴＣＡＡＧＧＣ−３’ （配列番号２）
９４℃ １８０ｓ→９４℃ ３０ｓ→６０℃ ３０ｓ→７２℃ ３０ｓ→７２℃ ３００ｓ→４℃ ∞（下線部を４０ｃｙｃｌｅ）
Ｇｇ；
５’−ＧＧＣＧＡＣＧＴＴＧＴＴＡＧＴＡＣＣＴＧＡＣ−３’ （配列番号３）
５’−ＡＴＣＣＣＴＧＡＡＣＡＴＧＴＣＣＡＴＣＡＧＧＴＴＣ−３’ （配列番号４）
５’−ＴＡＴＡＧＧＴＡＣＣＣＡＧＡＡＧＴＧＡＡＴＴＣＧＧＴＴＣＧＣ−３’ （配列番号５）
９５℃ １２０ｓ→９５℃ ３０ｓ→６０℃ ２０ｓ→７２℃ ３０ｓ→７２℃ ３００ｓ→４℃ ∞（下線部を３５ｃｙｃｌｅ）
【０１０３】
実施例１０ プロサイモシンα欠損の高齢マウスのプロサイモシンα欠損領域
週齢２０−３０のＧｇＦＦマウスまたはＧｇマウスについて、ペントバルビタール麻酔下で開腹開胸後、心臓の右心耳に切れ目をいれ、左心室からＫ＋ ｆｒｅｅ ＰＢＳを灌流、脱血させた後、４％パラホルムアルデヒド／０．１Ｍ ＰＢで灌流固定した。脳を摘出し、２５％ｓｕｃｒｏｓｅ／Ｋ＋ ｆｒｅｅ ＰＢＳに浸漬して４℃で一晩放置した。Ｏ．Ｃ．Ｔ． Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Ｓａｋｕｒａ）で包埋し、エタノール／ドライアイスにより、組織を急速凍結させた。クリオスタット（ＣＭ１９００、ライカマイクロシステムズ株式会社）を用いて、厚さ３０ μｍの脳切片を作製した。組織切片をＰＢＳＴ（０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ｉｎ Ｋ＋ ｆｒｅｅ ＰＢＳ）で洗浄後１％ Ｈ２Ｏ２に３０分置換し、内因性ペルオキシダーゼを分解した。ＰＢＳＴで洗浄後（以後毎ステップＰＢＳＴ洗浄表記なし）、ブロッキング反応として２％ＢＳＡ／２％ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ｓｅｒｕｍ（ｃａｐｐｅｌ ５５４３５、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）／ＰＢＳＴ溶液で室温にて１時間反応させた。１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ溶液にて１：１０００に希釈した抗プロサイモシンα抗体（ＮＴ ２Ｆ１１、ＡＬＥＸＩＳ Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を４℃にてｏｖｅｒ ｎｉｇｈｔ後、Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ α−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（１：５００ Ｚｙｍａｘ）ｉｎ １％ＢＳＡ／ＰＢＳＴに１時間置換した。次に３０分前に作成したｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣ液（Ａ液１５μｌ、Ｂ液１５μｌ ｉｎ １％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ ２０００μｌ）に１時間置換しシグナル増強を行った。２０ｍｇ／ｍＬ ＤＡＢ ｓｏｌｕｔｉｏｎを１０ｍｌのＰＢＳに溶解し１％ＣｏＣｌ２ ２５０μＬ，１％ＮｉＳＯ４ ２００μＬを少量ずつ加えながら混ぜ３．３μｌの３０％Ｈ２Ｏ２（Ｗａｋｏ）を入れた溶液に約５分置換し、シランコートされたスライドグラス（松波硝子工業株式会社）に張り付け風乾後アルコール脱水、キシレン透徹を行い、Ｐｅｒｍｏｕｎｔ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で封入後、蛍光位相差顕微鏡（ＢＺ−８０００、株式会社キーエンス）で観察した。蛍光染色時は３０μｍ切片作製、ＰＢＳＴで洗浄後、５０％ＭｅＯＨ １０分、１００％ＭｅＯＨ １０分浸漬し、ＰＢＳＴで洗浄後にブロッキング反応を行った。二次抗体にはａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ４８８ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（１：３００ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅ）ｉｎ １％ＢＳＡ／ＰＢＳＴで２時間反応させた。
本発明者は、Ｇｎｇ７は主に線条体に発現が多く、海馬、小脳にも発現していることをＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲによってこれまでに確認している。週齢２０−３０のＧｇＦＦマウスの３０μｍ脳切片を用いてプロサイモシンαの免疫組織化学を行った所、線条体、海馬、小脳での顕著な発現低下を観察した（図１５Ａ，Ｂ）。ＤＡＢ染色および蛍光染色の２０倍視野の写真からは、線条体で７〜８割の細胞でプロサイモシンαが欠損していること、歯状回の内側ではＧｇＦＦマウスでも発現が残っていること、小脳ではプルキンエ細胞層ではプロサイモシンα発現が残っており、主に顆粒細胞層でプロサイモシンα欠損が起こっていることが分かった（図１５Ｃ）。
また、線条体におけるプロサイモシンαの発現をイムノブロット法で確認した。週齢２０−３０のＧｇＦＦマウスまたはＧｇマウスを断頭したのち氷上でマウスの脳組織を摘出しＰＢＳで洗浄した。マウス用ブレインスライサ（室町機械）で５００μｍの厚さにスライスしカミソリで線条体、海馬、小脳の各部位を切り出し、ＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）５ｍｌ，１０％ＳＤＳ １０ｍｌ，１００％ｇｌｙｃｅｒｏｌ ５ｍｌをＭＱで５０ｍｌにメスアップ）１００μｌの入ったエッペンチューブに入れる。Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ（Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ）で超音波破砕した後、１５０００ｒｐｍにて１０分遠心後上清を回収しＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅｇｅｎｔ（ＢＩＯ−ＲＡＤ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてタンパク定量を行った。１レーン当たり２０μｇのタンパク質を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで３０ｍＡ，３００Ｖの条件でＤｙｅがゲル下端に来るまで泳動を行う。ゲルのタンパク質をニトロセルロースメンブレンにセミドライ式で１００ｍＡ，３０Ｖの条件で９０分間転写する。５％スキムミルク，２％Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ／ＴＢＳＴ（ＴＢＳ，０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で１時間ブロッキングを行った。一次抗体をブロッキングに用いたＢｕｆｆｅｒにて１０００倍に希釈し一晩反応させる。ＴＢＳＴで３回洗浄後、ＨＲＰ標識した２次抗体をブロッキングに用いたＢｕｆｆｅｒにて２０００倍に希釈し２時間反応させた。ＴＢＳＴで３回洗浄後した。Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅおよびＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｄｕｒａｔｉｏｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にて化学発光させシグナルを検出した。一次抗体には抗プロサイモシンα抗体（１：１０００； ＡＬＥＸＩＳ）および抗β−ｔｕｂｕｌｉｎ抗体（１：１０００； Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用い、二次抗体にはＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（１：２０００；Ｐｒｏｍｅｇａ）およびＨＲＰ標識抗ラビットＩｇＧ抗体（１：２０００；Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。
その結果、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔでも線条体、海馬、小脳でのプロサイモシンα発現減少の結果を得た（図１５Ｄ）。
【０１０４】
実施例１１ プロサイモシンα欠損の高齢マウスの神経細胞形態および神経細胞数
本発明者はこれまでにプロサイモシンαが虚血ストレス時に神経細胞を保護する作用を有することをｉｎ ｖｉｔｒｏ，ｉｎ ｖｉｖｏともに明らかとしてきた。そこで前記実施例１０のＧｇＦＦマウスにおいてプロサイモシンαの発現低下していた領域において、神経細胞の形態や細胞数に変化があるかをＮｉｓｓｌ染色により確認した。Ｎｉｓｓｌ染色は神経細胞を可視化する標準的な組織学的方法として用いられており、神経細胞形質および樹状突起中の粗面小胞体由来のリボソームＲＮＡから構成されるＮｉｓｓｌ物質を染色する。損傷を受けた場合、神経細胞体内に再分布し、神経細胞死のマーカーとしても用いられている。免疫染色と同様に３０μｍの脳切片を作製し、シランコートされたスライドグラスに張り付け風乾後、ＰＢＳＴで洗浄した。ＭＱに１０秒程度浸漬後、水浴で３７℃に温めておいたｃｒｅｓｙｌ ｖｉｏｌｅｔ溶液（２．５ｇ ｃｒｅｓｙｌｅｃｈｔ ｖｉｏｌｅｔ，３００ｍｌ Ｈ２Ｏ，３０ｍｌ １Ｍ ＮａＯＡｃ，１７０ｍｌ １Ｍ ＡｃＯＨをｍｉｘし７日間スターラーで撹拌）に１５〜３０分浸漬し染色する。ＭＱで洗浄後、アルコール脱水、キシレン透徹を行い、Ｐｅｒｍｏｕｎｔで封入後、顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ）で観察した。
その結果、ＧｇＦＦマウスでは線条体、海馬、小脳において顕著な神経細胞死や脱落、神経細胞層の配列の乱れは観察されなかった（図１６Ａ，Ｂ，Ｃ）。
【０１０５】
実施例１２ プロサイモシンα欠損の高齢マウスにおける自発運動量および行動速度の評価
２０−３０週齢のマウスを用いて新規環境下での自発運動機能をＯｐｅｎ ｆｉｅｌｄ ｔｅｓｔにて評価した。約５０ｌｘの部屋に試験３０分前にマウスを入れておき環境に適応させた。縦７０ｃｍ×横７０ｃｍ×高さ３０ｃｍのアクリル箱の隅からマウスを入れ３０分間、Ｖｉｄｅｏ ｔｒａｃｋｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｒｏｍａｃｈｉ Ｋｉｋａｉ）を用いてＰＣにて解析を行った。箱を８×８に分画した際の中心４×４区画での行動時間を不安様行動の指標として測定した。Ｏｐｅｎ ｆｉｅｌｄ試験において、２０−３０週齢のＧｇＦＦマウスは顕著な自発行動量の低下を認めた（図１７Ａ，Ｂ）。また行動速度にも低下がみられ、中心滞在時間の低下も観察された（図１７Ｃ，Ｄ）。
これらの結果より、ＧｇＦＦマウスは週齢依存的な運動機能障害または、不安様行動の促進がみられることが明らかとなった。
【０１０６】
実施例１３ プロサイモシンα欠損の高齢マウスにおける不安様症状の評価
さらに、２０−３０週齢のＧｇＦＦマウスは不安行動が促進しているか否かを調べるため、他の不安行動の試験であるＭａｒｂｌｅ ｂｕｒｙｉｎｇ ｔｅｓｔおよびＮｏｖｅｌｔｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｈｙｐｏｐｈａｇｉａ ｔｅｓｔを行った。
Ｍａｒｂｌｅ ｂｕｒｙｉｎｇ ｔｅｓｔは、無害なガラス玉を床敷きで覆い隠そうとするマウスの行動が、不合理と認識しつつ繰り返される強迫性障害患者の脅迫行為と見かけ上類似していることから、強迫性障害に関連した不安様行動試験として認知されつつある試験である。抗不安薬の投与により隠すビー玉の数が低下することが報告されている。縦２８ｃｍ×横４５ｃｍ×高さ２０ｃｍのアクリルケージに床敷を５ｃｍ入れ、１７ｍｍの青色ビー玉を等間隔に５×５個置く。ケージを薄暗い所に置き、マウスをケージに入れた。３０分後マウスを回収し、２／３以上床敷に埋められたビー玉の数をカウントした。この試験においてＧｇＦＦマウスが隠したビー玉の数は、Ｇｇマウスと有意な差はなかったが、若干の低下傾向にあり、運動機能低下が観察された（図１８Ａ，Ｂ）。
Ｎｏｖｅｌｔｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｈｙｐｏｐｈａｇｉａ ｔｅｓｔは、コンデンスミルクをＨｏｍｅｃａｇｅ（ＨＣ）で飲む群と、新規環境（Ｎｏｖｅｌｔｙ；Ｎ）で飲む群で、飲みに行くまでの時間と飲んだミルクの量を比較し、不安行動を評価する試験である。不安行動が亢進しているマウスは新規環境でミルクを飲みに行くまでの時間が増加し、飲む量も減少するとされている。まずグループ飼いしたマウスを約５０ｌｘの薄暗い部屋に入れ、５ｍｌの２５％コンデンスミルクを３０分間自由に摂取できるようにした。これを１日１回３日間繰り返して、ミルクの味を覚えさせた。４日目は、３日間と同様に薄暗い部屋のＨｏｍｅｃａｇｅでミルクを飲めるマウス（Ｈｏｍｅｃａｇｅ群）と、１０００ｌｘの明るく照らされた床敷のない透明ケージでミルクを飲めるマウス（Ｎｏｖｅｌｔｙ群）の２群に分けて実験を行った。どちらの群も１匹ずつ３０分間試行し、ミルクを初めて飲むまでの時間と、５分毎のミルクを飲んだ量を測定した。この試験においてＧｇＦＦマウスはＨＣ群、Ｎ群ともにミルクを飲みに行くまでの時間、飲む量のどちらも有意な差はなかった（図１８Ｃ，Ｄ）。
これらの結果からＧｇＦＦマウスは不安様行動の亢進はみられないことが明らかとなった。
【０１０７】
実施例１４ プロサイモシンα欠損の高齢マウスにおける運動機能評価
これまでの試験において２０−３０週齢のＧｇＦＦマウスは自発行動量の低下がみられることが明らかとなった。そこで、ＧｇＦＦマウスの運動機能を詳細に調べるため若齢マウスと同様にロータロッド試験、さらにＳｔａｔｉｏｎａｒｙ ｔｈｉｎ ｒｏｄ試験、Ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ試験を行った。
ロータロッド試験においてＧｇＦＦマウスはＧｇマウスと比べ、２０ｒｐｍの低速で回るロータ上を歩くことを覚える訓練１回目から落ちる時間が顕著に早かった。またＧｇＦＦマウスは訓練３日間の間に少しずつ上達は見られるが、Ｇｇマウスと同等の運動機能にはならなかった（図１９Ａ）。４日目により高速の３０ｒｐｍで試験したところ、訓練の結果と同様にロータ上から落下するまでの時間は短かった（図１９Ｂ）。
さらに、バランス感覚を調べるため、止まった細い棒上から落ちるまでの時間を調べるＳｔａｔｉｏｎａｒｙ ｔｈｉｎ ｒｏｄ試験を行った。１．５ｃｍ ｄｉａｍｅｔｅｒ，５０ｃｍ ｌｏｎｇの滑らかなステンレス棒を地面から４０ｃｍの高さに水平に設置し、マウスの怪我防止のため、マウスを棒の中心に乗せ、落下するまでの時間を測定した。最大滞在時間を６０秒とし、１時間の間隔をあけて６試行行った。その結果、ＧｇＦＦマウスはＧｇマウスと同様に６回の試行において徐々に棒上に乗れるようになり、有意な差はなかった（図１９Ｃ）。
また歩行機能を調べるＦｏｏｔｐｒｉｎｔ試験では、マウスの前肢および後肢足底をそれぞれ赤および黒インクで塗布し、幅４８ｍｍ、長さ６５０ｍｍ、高さ２３０ｍｍの通路上を歩行させた。その際、マウスが暗い場所を好む性質を利用し、後ろからライトで照らして前進させた。歩き始めと歩き終わりを除いた３歩の平均値で以下のパラメータを解析し、歩行機能を評価した。その結果、ＧｇＦＦマウスに異常な歩行様式はみられず、歩幅（Ｓｔｒｉｄｅ ｌｅｎｇｔｈ：片前肢から同前肢までの距離で左右の平均）、前肢両間の距離（Ｆｏｒｅｐａｗ ｂａｓｅ：左右の前肢間の距離）、後肢両間の距離（Ｈｉｎｄｐａｗ ｂａｓｅ：左右の後肢間の距離）、前後肢のかぶり（Ｆｏｒｅｐａｗ／Ｈｉｎｄｐａｗ ｏｖｅｒｌａｐ：片前肢と後肢の距離で左右の平均）の４項目すべてでＧｇマウスと有意な差はなかった（図１９Ｄ）。
これらの結果より、２０−３０週齢のＧｇＦＦマウスは通常の歩行やバランスといった顕著な運動機能障害はないが、ロータロッド試験のような高度な運動協調性に異常があることが示唆された。
【０１０８】
実施例１５ プロサイモシンα欠損の加齢マウスにおける運動機能障害に対するＤ１，Ｄ２アゴニスト投与の効果
これまでの結果からＧｇＦＦマウスは運動機能障害を自然発症することが明らかとなった。そこで、ＧｇＦＦマウスと同様に線条体が病態となっているパーキンソン病で用いられているドパミンアゴニストを用いてＧｇＦＦマウスの運動機能障害が治療できるか検討した。
Ｄ１アゴニストであるＳＫＦ３８３９３ ３０ｍｇ／ｋｇの腹腔内投与５時間後では、ロータロッド試験における運動機能障害の有意な改善を認めた（図２０Ａ）。しかしＤ２アゴニストのパラミペキソールの投与では最大容量の１ｍｇ／ｋｇでも改善効果はみられなかった（図２０Ｂ）。
この結果から、Ｇｎｇ７発現細胞でプロサイモシンαが欠損することはドパミン作動性神経細胞のバランスになんらかの影響を与えていることが示唆された。
【０１０９】
実施例１６ プロサイモシンα欠損の高齢マウスの行動学的解析
さらに、ＧｇＦＦマウスに関して、以下の点についても検証を行った。
（１）体重
体重に関しては若齢において有意な差は確認されなかったが、週齢を重ねるごとに体重増加の程度が対照群と比較し低下し、２９週齢まででＧｇマウスと差はないが、３０−３９週齢で有意な体重の低下がみられた（図２１Ａ）。
（２）握力
筋力の評価としてＷｉｒｅｈａｎｇ ｔｅｓｔを行った。１ｃｍ角の格子状の網の上にマウスを乗せ、上下逆さにして３０ｃｍの高さに固定する。マウスが落ちるまでの時間を測定し、最大１８０秒とした。握力を測定するＷｉｒｅｈａｎｇ試験に関してはＧｇマウスがほぼ最大潜時の１８０秒間落ちないのに対して、ＧｇＦＦマウスは２０秒程度落下が早かった（図２１Ｂ）。
（３）うつ様症状
うつ様症状の評価にはＴａｉｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｔｅｓｔおよびＰｏｒｓｏｌｔ ｆｏｒｃｅｄ ｓｗｉｍ ｔｅｓｔを行った。
Ｔａｉｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｔｅｓｔでは、マウスの尾を木の棒の先にテープで固定し、高さ３０ｃｍのところに吊るした。無動になるまでの時間と１分毎の無動時間を６分間測定した。その結果、ＧｇＦＦマウスは全体６分間を通して有意な無動時間の低下を示し、前半３分間は特に顕著であった（図２１Ｃ）。
また、Ｐｏｒｓｏｌｔ ｆｏｒｃｅｄ ｓｗｉｍ ｔｅｓｔでは、直径２０ｃｍ高さ３０ｃｍのアクリル円柱状容器に２５±１℃の水を２０ｃｍ入れた。マウスをその容器に入れ、無動になるまでの時間と１分毎の無動時間を６分間測定した。測定後マウスを回収し、キムタオルで水分をふきとった。その結果、ＧｇマウスとＧｇＦＦマウスに有意な差はなかった（図２１Ｄ）。
（４）社会性
自己の周辺環境への配慮や社会性を調べるため、Ｎｅｓｔ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｔｅｓｔを行った。明暗サイクル（明期８：００〜２０：００／暗期２０：００〜８：００）の暗期１時間前（１９：００）にマウスを１匹ずつ大ケージに分け、Ｎｅｓｔｌｅｔ ２．５ｇ（Ａｎｃａｒｅ）を入れた。翌朝巣の形状を以下の基準でスコアリングし、未使用のＮｅｓｔｌｅｔの量を量った。
Ｓｃｏｒｅ１．Ｎｅｓｔｌｅｔの９０％が未使用。
Ｓｃｏｒｅ２．Ｎｅｓｔｌｅｔの５０−９０％が未使用。
Ｓｃｏｒｅ３．Ｎｅｓｔｌｅｔの５０％以上使用。隅に９０％以上Ｎｅｓｔｌｅｔを集めていない。巣らしきものがない。
Ｓｃｏｒｅ４．Ｎｅｓｔｌｅｔの９０％以上使用し、隅に集めている。平坦な巣がある。
Ｓｃｏｒｅ５．Ｎｅｓｔｌｅｔの９０％以上使用し、くぼみのある完全な巣がある。
その結果、巣として使わなかったＮｅｓｔｌｅｔｓの量と巣の形状のスコアリングは、ＧｇＦＦマウスはどちらの項目でもＧｇマウスと差がなく、社会性に異常はないことが明らかとなった（図２１Ｅ）。
（５）学習機能
学習機能の評価にはＳｔｅｐ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｅｓｔを用いた。１日目の電流を覚えさせる訓練ではＧｇマウスとＧｇＦＦマウスに有意な差はなかったことから、両群に同じ条件付けができたと考えられる。しかし２日目の試験ではＧｇＦＦマウスは電流がかかる暗箱にＧｇマウスよりも早く入ってしまい、学習機能の低下が示唆された（図２１Ｆ）。
【産業上の利用可能性】
【０１１０】
本発明において、ハンチントン病を含む神経変性疾患のモデルマウスとして線条体におけるプロサイモシンα遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物の作成に成功したことによって、該疾患の発症機構などの研究に寄与することができる。また、該非ヒト哺乳動物は該疾患の新規予防／治療薬のスクリーニングに利用可能である。
本出願は、日本で出願された特願２０１１−１１９６５１（出願日：平成２３年５月２７日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
線条体においてプロサイモシンα遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物であって、対応する野生型動物と比較して、
（１）脳虚血処置に対して脆弱である、
（２）運動性が劣る、
（３）加齢によって、上記（１）および（２）の症状を自然発症する、および
（４）ドパミンＤ２受容体アゴニスト、ドパミン代謝阻害剤、ＮＭＤＡ受容体拮抗剤またはドパミンＤ１受容体アゴニストによって上記（１）、（２）および（３）の症状が改善する、
ことを特徴とする動物。
【請求項２】
Ｇ蛋白質γ７サブユニット遺伝子プロモーターにより発現制御されたｃｒｅ遺伝子を有し、かつｌｏｘＰ配列に挟まれたプロサイモシンα遺伝子をホモ接合型で有する、請求項１記載の動物。
【請求項３】
ドパミンＤ２受容体アゴニストがプラミペキソール、ペルゴリド、カベルゴリン、タリペキソールまたはロビニロールである、請求項１に記載の動物。
【請求項４】
ドパミン代謝阻害剤がセレギリン、エンタカルボン、ドアマンタジン、Ｌ−ドーパ、ドロキシドパまたはゾニサミドである、請求項１に記載の動物。
【請求項５】
ＮＭＤＡ受容体拮抗剤がメマンチンまたはＣＰ−１０１６０６である、請求項１に記載の動物。
【請求項６】
ドパミンＤ１受容体アゴニストがＳＫＦ３８３９３である、請求項１に記載の動物。
【請求項７】
動物がマウスまたはラットである、請求項１に記載の動物。
【請求項８】
請求項１記載の動物に試験化合物を適用し、（１）脳虚血処置に対する生存率および／または（２）運動性を測定することを特徴とする、神経変性疾患または虚血性疾患由来のジストニアの治療／予防薬のスクリーニング方法。
【請求項９】
請求項１記載の動物であって、週齢が進んだ該動物に試験化合物を適用し、（１）生存率および／または（２）運動性を測定することを特徴とする、神経変性疾患または虚血性疾患由来のジストニアの治療／予防薬のスクリーニング方法。
【請求項１０】
試験化合物がドパミンＤ２受容体アゴニストである、請求項８または９に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
試験化合物がドパミン代謝阻害剤である、請求項８または９に記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
試験化合物がＮＭＤＡ受容体拮抗剤である、請求項８または９に記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
試験化合物がドパミンＤ１受容体アゴニストである、請求項８または９に記載のスクリーニング方法。
【請求項１４】
神経変性疾患がハンチントン病である、請求項８または９に記載のスクリーニング方法。
【請求項１】
線条体においてプロサイモシンα遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物であって、対応する野生型動物と比較して、
（１）脳虚血処置に対して脆弱である、
（２）運動性が劣る、
（３）加齢によって、上記（１）および（２）の症状を自然発症する、および
（４）ドパミンＤ２受容体アゴニスト、ドパミン代謝阻害剤、ＮＭＤＡ受容体拮抗剤またはドパミンＤ１受容体アゴニストによって上記（１）、（２）および（３）の症状が改善する、
ことを特徴とする動物。
【請求項２】
Ｇ蛋白質γ７サブユニット遺伝子プロモーターにより発現制御されたｃｒｅ遺伝子を有し、かつｌｏｘＰ配列に挟まれたプロサイモシンα遺伝子をホモ接合型で有する、請求項１記載の動物。
【請求項３】
ドパミンＤ２受容体アゴニストがプラミペキソール、ペルゴリド、カベルゴリン、タリペキソールまたはロビニロールである、請求項１に記載の動物。
【請求項４】
ドパミン代謝阻害剤がセレギリン、エンタカルボン、ドアマンタジン、Ｌ−ドーパ、ドロキシドパまたはゾニサミドである、請求項１に記載の動物。
【請求項５】
ＮＭＤＡ受容体拮抗剤がメマンチンまたはＣＰ−１０１６０６である、請求項１に記載の動物。
【請求項６】
ドパミンＤ１受容体アゴニストがＳＫＦ３８３９３である、請求項１に記載の動物。
【請求項７】
動物がマウスまたはラットである、請求項１に記載の動物。
【請求項８】
請求項１記載の動物に試験化合物を適用し、（１）脳虚血処置に対する生存率および／または（２）運動性を測定することを特徴とする、神経変性疾患または虚血性疾患由来のジストニアの治療／予防薬のスクリーニング方法。
【請求項９】
請求項１記載の動物であって、週齢が進んだ該動物に試験化合物を適用し、（１）生存率および／または（２）運動性を測定することを特徴とする、神経変性疾患または虚血性疾患由来のジストニアの治療／予防薬のスクリーニング方法。
【請求項１０】
試験化合物がドパミンＤ２受容体アゴニストである、請求項８または９に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
試験化合物がドパミン代謝阻害剤である、請求項８または９に記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
試験化合物がＮＭＤＡ受容体拮抗剤である、請求項８または９に記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
試験化合物がドパミンＤ１受容体アゴニストである、請求項８または９に記載のスクリーニング方法。
【請求項１４】
神経変性疾患がハンチントン病である、請求項８または９に記載のスクリーニング方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２０】
【図８】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２０】
【図８】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２１】
【公開番号】特開２０１３−９６６２（Ｐ２０１３−９６６２Ａ）
【公開日】平成２５年１月１７日（２０１３．１．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−２６６３６（Ｐ２０１２−２６６３６）
【出願日】平成２４年２月９日（２０１２．２．９）
【出願人】（５０４２０５５２１）国立大学法人 長崎大学 (226)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年１月１７日（２０１３．１．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年２月９日（２０１２．２．９）
【出願人】（５０４２０５５２１）国立大学法人 長崎大学 (226)
【Ｆターム（参考）】
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