神経誘導管
【課題】生分解性と十分な強度を有し、神経突起を促進効果が高い神経誘導管を提供する。
【解決手段】本発明のペプチドで修飾されたオリゴ乳酸及び生分解性ポリマーを主成分とすることを特徴とする神経誘導管、特にペプチドコンジュゲートがＩＫＶＡＶであることを特徴とする神経誘導管により、生分解性と十分な強度を有し、神経細胞成長促進効果が高い神経誘導管とする。
【解決手段】本発明のペプチドで修飾されたオリゴ乳酸及び生分解性ポリマーを主成分とすることを特徴とする神経誘導管、特にペプチドコンジュゲートがＩＫＶＡＶであることを特徴とする神経誘導管により、生分解性と十分な強度を有し、神経細胞成長促進効果が高い神経誘導管とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経誘導管に関する。さらに詳細には、欠損した神経組織をより効率的に再生させることができる、ペプチドで修飾されたオリゴ乳酸及び生分解性ポリマーを主成分とすることを特徴とする神経誘導管に関する。
【背景技術】
【０００２】
欠損した末梢神経組織は損傷末端同士を外科的に端端縫合することによってなされていた。しかし、損傷末端同士の間隙がある程度以上の長さの場合、端端縫合すると張力が生じ、停滞した血流によって再生過程が妨げられることが知られている。また、多くの場合は欠損した末梢神経組織の断端が傷んでおり、そうした傷んだ断端をそのまま縫合すると、傷んだ断端が瘢痕化して神経の再生が阻害されることが知られている。そのため、欠損した末梢神経組織の断端が傷んでいる場合は、その断端を切除する必要があり、端端縫合が困難となる。端端縫合が困難である場合は、自家神経移植が行われる。自家神経移植には、運動機能を損なうことのないよう、機能損失が容認できる知覚神経が用いられている。しかし、知覚神経といえども知覚障害を引き起こす可能性は十分にあり、不必要なところはない。加えて、生体に必要以上にメスを入れることが良策でないことは容易に想像できる。そこで、自家神経移植を避けるために、神経誘導管（ガイドチューブ）の開発が求められている。
【０００３】
これまでに、人工器具を用いて神経細胞増殖の足場を形成し、神経を再生させ、元の機能を回復させる方法について、種々の検討がなされてきた。しかしながら、管状体のみを用いた場合、切断された神経の両端部から若干の細胞増殖は見られるが、切断した神経が再度接合して回復することは困難であった。これは、細胞が増殖する場合、一般的に管状体の足場に付着し、そこから切断部分を埋める方向に増殖して行くが、切断部分を覆うのみでは切断端の間に空隙があり、その部分を全て埋め尽くすまでの間に細胞の増殖が止まるためである。
【０００４】
人工材料によるガイドチューブとしては、まずシリコンが検討された。シリコンチューブは生体内で比較的異物反応が少なく、動物実験のみならず、ヒトにおいても実績を上げてきた。しかし、生体親和性がなく、チューブ内壁に沿った軸索伸展は見られなかった。また、シリコンチューブでは、チューブの内部と外部とで体液交換ができない。さらに、生体吸収性がなく、長期の埋入では不快感や痛みが生じてくる。そのため、神経再生後にチューブを取り除くための二度目の手術が必要であるという問題があった。
【０００５】
より理想的なガイドチューブとして、チューブを取り除くための二度目の手術が必要ないようにするため、体内に残留することのない生体吸収性材料からなる管状体を用いて神経を再生しようとする試みがなされた（非特許文献１参照）。
【０００６】
また、生体吸収材料として合成高分子のポリグリコール酸（ｐｏｌｙ（ｇｌｙｃｏｌｉｃａｃｉｄ）：ＰＧＡ）やＰＬＡ、天然高分子のコラーゲンなどが検討された。しかし、合成高分子材料では再生が遅いといった問題や、天然高分子材料では強度が不十分といった問題があり、いずれも自家移植にはおよばず、満足できる結果は得られていない。さらに、これらを補うために、ＰＧＡとコラーゲン、ラミニンの複合化材料が開発されている（非特許文献２参照）。しかし、コラーゲン、ラミニンの異物除去は完全ではない。一方、神経再生に大きく影響するといわれているシュワン細胞をあらかじめチューブ内で培養しておいたハイブリッド型ポリ乳酸−カプロラクトン共重合体（Ｐ（ＬＡ／ＣＬ））チューブでは、良好な結果を得ている（非特許文献３参照）。
【０００７】
さらに、生体吸収性材料の管状体内部に神経細胞の増殖を誘導する足場を形成し、神経を再生させる種々の試みがなされている。例えば、管状体内部にコラーゲンの繊維束を挿入し、フィブロネクチン（ＦＮ）でコーティングしたものがある（特許文献１、非特許文献４参照）。
【非特許文献１】鈴木京子ら著、「人工臓器」、１９９８年、第２７巻、第２号、ｐ．４９０―４９４
【非特許文献２】Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ Ｋ、Ｏｈｎｉｓｈｉ Ｋ、Ｋｉｙｏｔａｎｉ Ｔ、Ｓｅｋｉｎｅ Ｔ、Ｕｅｄａ Ｈ、Ｎａｋａｍｕｒａ Ｔ、Ｅｎｄｏ Ｋ、Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｙ、「Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、２０００年６月、８６８巻、ｐ．３１５―３２８
【非特許文献３】Ｈａｄｌｏｃｋ Ｔ、Ｅｌｉｓｓｅｅｆｆ Ｊ、Ｌａｎｇｅｒ Ｒ．Ｖａｃａｎｔｉ Ｊ、Ｃｈｅｎｅｙ Ｍ、「Ａｒｃｈ Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ Ｓｕｒｇ」、１９９８年、第１２４巻、ｐ．１０８１―１０８６
【非特許文献４】島田ひろき等著、「人工臓器」、１９９３年、第２２巻、第２号、ｐ．３５９―３６３
【特許文献１】特開平５−２３７１３９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述したような、管状体内部にコラーゲンの繊維束を挿入し、フィブロネクチン（ＦＮ）でコーティングしたもの（特許文献１、非特許文献４参照）は、強度が不十分であるため、チューブ端部が縫合部で裂けやすいという恐れがあった。
【０００９】
また、上述したように、ハイブリッド型ポリ乳酸−カプロラクトン共重合体（Ｐ（ＬＡ／ＣＬ））チューブでは良好な結果を得ている（非特許文献３参照）が、自家シュワン細胞の培養には時間を要し、緊急の場合には対応できないという問題があった。
【００１０】
そこで、本発明は、生体吸収性で安全で緊急時にも即座に用いることが可能で十分な強度を有する神経誘導管を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、ペプチドで修飾されたオリゴ乳酸を用いた神経誘導管を発明するに至った。
【００１２】
即ち、本発明の第１の要旨は、ペプチドとオリゴ乳酸とがペプチド結合により結合した化合物、を含む樹脂組成物を成型してなる神経誘導管に存する。本発明の第２の要旨は、上前本発明の第１の要旨にかかる神経誘導管において、ペプチドが、少なくともＩｌｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ配列を有することを特徴とする神経誘導管に存する。また、本発明の第３の要旨は、上記本発明の第１又は第２の要旨にかかる神経誘導管において、オリゴ乳酸が、下記一般式１（ｍは１〜１００の整数を表す。）で表されることを特徴とする神経誘導管に存する。
【００１３】
【化１】
【００１４】
さらに、本発明の第４の要旨は、上前本発明の第１〜第３の要旨にかかる神経誘導管において、樹脂組成物が、生分解性ポリマーを含むことを特徴とする神経誘導管に存する。また、本発明の第５の要旨は、上前本発明の第１〜第４の要旨にかかる神経誘導管において、神経誘導管の内壁に沿って細胞が成長することを特徴とする神経誘導管に存する。さらに、本発明の第６の要旨は、下記一般式２で表されるオリゴ乳酸単位及び下記一般式３で表されるペプチドを含むことを特徴とする、ペプチドで修飾されたオリゴ乳酸（ｎは１〜５００の整数、ｏは１〜１０の整数を表す。Ａ及びＢはそれぞれ単結合、又は２価の有機基を表す。）に存する。
【００１５】
【化２】
【００１６】
【化３】
【００１７】
本発明の第７の要旨は、上前本発明の第６の要旨にかかるペプチドで修飾されたオリゴ乳酸を含む樹脂組成物を成型してなる成型体であり、第８の要旨は、上前本発明の第１、第４又は第５の要旨にかかる神経誘導管において、一般式３で表されるペプチドと一般式２で表されるオリゴ乳酸単位を備えるオリゴ乳酸とがペプチド結合により結合した化合物、を含む樹脂組成物を成形してなることを特徴とする神経誘導管に存する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、生体内で吸収され十分な強度を有する神経の増殖に有効な神経誘導管を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明におけるオリゴ乳酸の乳酸とは、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、Ｌ−乳酸とＤ−乳酸の任意の割合の混合物から選ばれる乳酸のことであり、オリゴ乳酸とは乳酸のオリゴマーを意味する。また、オリゴマーとは、乳酸などの単量体が複数結合した構造を有する化合物を意味する。本発明のオリゴ乳酸の場合、乳酸の単量体の結合数ｎは、通常、２以上５００以下であるが、ｎの下限値は、好ましくは３、より好ましくは５、さらに好ましくは１０である。ｎの上限値は、好ましくは１００、より好ましくは５０、さらに好ましくは２５である。ｎが５００より大きいとペプチドの効果が小さくなる。
【００２０】
また、本発明のペプチドで修飾されたオリゴ乳酸を神経誘導管に使用する場合、乳酸の単量体の結合数ｍは、通常、２以上１００以下であるが、ｍの下限値は、好ましくは３、より好ましくは５、さらに好ましくは１０である。ｍの上限値は、好ましくは５０、より好ましくは３０、さらに好ましくは２５である。ｍが１００より大きいとペプチドで修飾されたオリゴ乳酸が神経誘導管の表面に移行しにくくなり、好ましくない。
【００２１】
ペプチドで修飾されたオリゴ乳酸とは、オリゴ乳酸と複数のアミノ酸がペプチド結合により結合した化合物を意味し、アミノ酸は通常αアミノ酸である。αアミノ酸としては、例えば、Ｌ−イソロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−アロイソロイシン、Ｄ−アロイソロイシン、Ｌ−リジン、Ｄ−リジン、Ｌ−バリン、Ｄ−バリン、Ｌ−α−アラニン、Ｄ−α−アラニン、グリシン、Ｌ−ノルバリン、Ｄ−ノルバリン、Ｌ−ロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−ノルロイシン、Ｄ−ノルロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｄ−チロシンなどを挙げられるが、この中でも、Ｌ−イソロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−アロイソロイシン、Ｄ−アロイソロイシン、Ｌ−リジン、Ｄ−リジン、Ｌ−バリン、Ｄ−バリン、Ｌ−α−アラニン、Ｄ−α−アラニンが好ましく用いられる。
【００２２】
ペプチドで修飾されたオリゴ乳酸に含まれるペプチド部分は、アミノ酸配列が複数結合した構造を示す。アミノ酸配列の結合数は、通常、１以上５０以下である。アミノ酸の結合数の下限値は、好ましくは２、さらに好ましくは３であり、上限値は、好ましくは１０さらに好ましくは７である。アミノ酸結合数の最も好ましい値は５である。
【００２３】
本発明において、ペプチドで修飾されたオリゴ乳酸に含まれるペプチド部分の最も好ましい構造は、下記一般式３で表される。
【００２４】
【化４】
【００２５】
上記一般式３において、ｏは正の整数を表し、好ましくは１以上１０以下である。ｏが大きい方が、より神経細胞と接触しやすくなるという効果を得られると考えられる。しかし、上記ｍに対してｏが大きくなりすぎると水溶性が高くなり、ポリ乳酸と混合させる際にうまく混合できずに溶出してしまう虞があるため、オリゴ乳酸との親水疎水バランスを考えなければならない。
【００２６】
また、上記一般式３において、Ａ及びＢはそれぞれ、ペプチド、２価の芳香族基、２価のアルキル基、アルケニル基、酸素、硫黄、エステル、エーテル、ウレタン、などの有機基を表すが、好ましくはペプチド又は単結合であり、最も好ましくはＡ及びＢが、ともに単結合である。
【００２７】
本発明のオリゴ乳酸の合成法としては、複数の乳酸を脱水重縮合反応により合成する方法、乳酸エステルのエステル交換反応により合成する方法、ラクチドの開環反応により合成する方法などを挙げられるが、好ましくは複数の乳酸の脱水重縮合反応により合成する方法が選ばれる。
【００２８】
複数の乳酸の脱水重縮合反応によりオリゴ乳酸を合成する場合は、オリゴ乳酸を合成した後、ペプチドで修飾されたオリゴ乳酸を合成する前に、オリゴ乳酸の水酸基を不活性化させることが好ましい。不活性化させる方法としては、無水酢酸などによりアセチル化させる方法が好ましい手段として用いられる。
【００２９】
ペプチドで修飾されたオリゴ乳酸の合成方法は、末端アセチル化オリゴ乳酸にペプチドの数量体を反応させても良いし、末端アセチル化オリゴ乳酸にアミノ酸を結合させて、ペプチド連鎖を延長させていっても良いが、末端アセチル化オリゴ乳酸にペプチドの数量体を反応させる方が好ましい。
【００３０】
本発明における生分解性ポリマーとは、微生物により分解されるポリマーや生体内で分解されるポリマーを示し、例えば、ポリＬ−乳酸、ポリＤ−乳酸、ポリＤＬ−乳酸、ポリ乳酸―ポリエーテル共重合体、ポリ乳酸グリコール酸共重合体、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、ポリブチレンサクシネート、ポリエチレンサクシネート、ポリブチレンサクシネートアジペート、ポリプロピレンカーボネート、ポリパラジオキサノンなどの合成高分子や、多糖類、コラーゲン、ゼラチンなどの天然高分子や、ポリ４−ヒドロキシブチレートなどの微生物産系高分子などを挙げられる。この中でもポリＬ−乳酸、ポリＤ−乳酸、ポリＤＬ−乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸グリコール酸共重合体、ポリ乳酸―ポリエーテル共重合体が好ましく、より好ましくは、ポリＬ−乳酸、ポリＤ−乳酸、ポリ乳酸―ポリエーテル共重合体であり、さらに好ましくはポリＬ−乳酸、ポリＤ−乳酸であり、最も好ましくはポリＬ−乳酸である。
【００３１】
本発明の神経誘導管を構成する材料のうち、ペプチドで修飾されたオリゴ乳酸及び生分解性ポリマーの合計量が占める割合は、５０質量％以上であるが、好ましくは７０質量％以上、さらに好ましくは８０質量％以上、最も好ましくは９０質量％以上である。神経誘導管を構成する材料のうち、ペプチドで修飾されたオリゴ乳酸及び生分解性ポリマー以外の材料としては、可塑剤、安定剤、生体吸収性調節剤、表面処理剤などを含んでいても良いが、好ましくは可塑剤が添加される。可塑剤としては、ポリエーテル、ポリエステルなどが挙げられる。ポリエーテルとしては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール／ポリプロピレングリコール共重合体が挙げられ、ポリエステルとしては、ポリカプロラクトンなどが挙げられる。本発明の神経誘導管を構成する材料のうち、ペプチドで修飾されたオリゴ乳酸及び生分解性ポリマーの合計量が占める割合が５０質量％未満であると、機械的強度が低下するか、又は神経成長促進作用が損なわれ好ましくない。
【００３２】
ポリ乳酸にポリエーテルを可塑剤として添加する代わりに、グリコール酸、ポリエーテル、カプロラクトンから選ばれる１つ以上の成分を共重合させても良い。この中でもポリ乳酸―ポリエーテル共重合体、ポリ乳酸―ポリグリコール酸が好ましく、ポリ乳酸―ポリエチレングリコールブロック共重合体がさらに好ましく用いられる。共重合させた場合の共重合体中に含まれる乳酸単位は、好ましくは３０質量％以上、さらに好ましくは５０質量％以上、最も好ましくは７０質量％以上である。
【００３３】
本発明の神経誘導管を構成するペプチドで修飾されたオリゴ乳酸と生分解性ポリマーの質量比率は、生分解性ポリマー１００質量部に対してペプチドで修飾されたオリゴ乳酸は通常１０質量部以下である。ペプチドで修飾されたオリゴ乳酸の上限値は好ましくは４０質量部、より好ましくは１０質量部、さらに好ましくは５質量部である。またペプチドで修飾されたオリゴ乳酸の下限値は好ましくは０．０１質量部、より好ましくは０．１質量部、さらに好ましくは１質量部である。ペプチドで修飾されたオリゴ乳酸が４０質量部より多いと、神経誘導管の強度が低下して好ましくない。またペプチドで修飾されたオリゴ乳酸が０．０１質量部より少ないと、神経細胞成長促進効果が低下し好ましくない。
【００３４】
本発明の神経誘導管は、公知の成型方法により作成することができる。成型方法の例としては、射出成型、キャスト成型、スピンコート、エレクトロスピニングを挙げられるが、低温で成型できる点で、キャスト成型、スピンコート、エレクトロスピニングが好ましく、神経誘導管の機能発現のための相分離構造を形成させるには、スピンコート及びエレクトロスピニングが好ましく用いられる。またエレクトロスピニングが製造の効率の点で最も好ましい。
【００３５】
本発明の神経誘導管は、目的の形状に成型後、物理的又は化学的表面処理、若しくは架橋等を行っても良いし、表面処理又は架橋後に目的の形状に成型しても良い。また、２種類以上の表面処理又は架橋等を併用しても良い。
【００３６】
本発明の神経誘導管は、使用する前にγ線滅菌、紫外線滅菌等公知の方法により滅菌することが好ましい。
【実施例】
【００３７】
以下に、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、これらの実施例によって限定されるものではない。
【００３８】
（実施例１）
（１）ＩＫＶＡＶペプチド合成
各オリゴペプチドの合成は全てＦｍｏｃ固相合成法により、大気下で、手合成にて行った。５量体のオリゴペプチドＩＫＶＡＶを合成するために、まず、Ｆｍｏｃ−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ（９−フルオレニルメトキシカルボニル−ＰＡＬ−ポリエチレングリコール−ポリスチレン）樹脂（以下、単に「樹脂」という。）をプラスチック空カラムに秤量し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で膨潤させた。その後、上記樹脂にＦｍｏｃ−アミノ酸を、Ｆｍｏｃ−アミノ酸（Ｖ）、Ｆｍｏｃ−アミノ酸（Ａ）、Ｆｍｏｃ−アミノ酸（Ｖ）、Ｆｍｏｃ−アミノ酸（Ｋ）、Ｆｍｏｃ−アミノ酸（Ｉ）の順で連続的に縮合させた。具体的には、Ｆｍｏｃ−アミノ酸はそれぞれ上記樹脂に対して３倍等量を用いて、Ｆｍｏｃ（保護基）の除去（脱Ｆｍｏｃ）には、２０％ピペリジン／ＤＭＦを用いた。活性化剤としては、上記樹脂に対して３倍等量のＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物（ＨＯＢｔ）、同３倍等量の２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロフォスフェート（ＨＢＴＵ）、及び同６倍等量（１．５０ｍｍｏｌ）のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を用いた。
【００３９】
オリゴペプチドＩＫＶＡＶの合成過程において、脱Ｆｍｏｃとカップリングが行われているかについては、各々の反応をカイザーテストにて確認した。脱Ｆｍｏｃでは、カイザーテストを行って陰性（黄）の場合は陽性（青）となるまで反応を繰り返し、カップリングでは、カイザーテストを行って陽性（青）の場合は陰性（黄）となるまで、反応を繰り返した。このようにして、オリゴペプチドＩＫＶＡＶを樹脂に付着させた。
【００４０】
得られたオリゴペプチドＩＫＶＡＶ付き樹脂の一部を分取し、ＤＭＦ、ＤＣＭ、メタノールの順番に洗浄し、減圧乾燥した後、８５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、並びに、スカベンジャーとして７．５％ｍ−クレゾール、及び７．５％チオアニソールでカクテル溶液を調整し、それを各カラムに加え、室温で約１時間反応させた。その後、この反応で得た反応液を遠沈管に取り出し、反応後の樹脂をＴＦＡで５回洗浄し、その洗浄液も同遠沈管に取った。そして、ＴＦＡの容積が１／１０になるまで揮発させた後、約２０倍等量のジエチルエーテルに滴下して再沈殿させた。その後、冷却遠心（８５００ｒｐｍ、０℃、２０分間）し上澄み溶液を除去した。この再沈殿を３〜６回繰り返し、減圧乾燥して粗オリゴペプチドを得た。このようにして、樹脂からオリゴペプチドＩＫＶＡＶを切り出した。
【００４１】
得られた粗オリゴペプチドをＨＰＬＣの２２０ｎｍ（ペプチド結合の吸収波長）、３００ｎｍ（Ｆｍｏｃ基の吸収波長）でモニターし、分析を行った。その結果、２２０ｎｍにメインピークが見られ、３００ｎｍでは吸収されていないことを確認した。
【００４２】
（２）オリゴ乳酸合成
乳酸モノマーを脱水重縮合反応させることによりオリゴ乳酸を合成した。具体的には、乳酸の９０％水溶液を１４５℃で３時間加熱後、１４５℃のまま減圧し、約２０ｋＰａ（１５０Ｔｏｒｒ）で３時間保持した。その後、１５５℃、約０．４ｋＰａ（３Ｔｏｒｒ）で３時間、１８５℃、約０．４ｋＰａ（３Ｔｏｒｒ）で３時間、脱水縮合反応を行った。このようにしてオリゴ乳酸を合成した後、無水酢酸によって、合成されたオリゴ乳酸の水酸基を不活性化させ、末端がアセチル化されたオリゴ乳酸（ａｃＯＬＬＡ）を得た。
【００４３】
（３）ａｃＯＬＬＡ−ＩＫＶＡＶコンジュゲート合成
（１）で合成したオリゴペプチドＩＫＶＡＶ付き樹脂の一部を分取した。その後、オリゴペプチドＩＫＶＡＶを樹脂から切り出さずに、活性化剤として、樹脂に対して５倍等量のＨＯＢｔ、同５倍等量のＨＢＴＵ、及び、同１０倍等量のＤＩＰＥＡを加え、溶媒としてＤＭＦを加え、（２）で得たａｃＯＬＬＡを同５倍等量加えて、固相上にてカップリングを行った。カップリングが行われているかどうかは、（１）と同様にカイザーテストにて陰性（黄）となったことより確認した。樹脂からの切り出し操作についても（１）と同様の方法で行った。このようにして、ａｃＯＬＬＡ−ＩＫＶＡＶを得た。
【００４４】
得られた生成物をＨＰＬＣの２２０ｎｍ（ペプチド結合の吸収波長）でモニターし、分析を行い、疎水基の導入の確認行った。
【００４５】
（４）エレクトロスピニング不織布の作製
エレクトロスピニングによって不織布を作製した。この作製方法を、図１に概略的に示す。
【００４６】
溶質に（３）で得られたａｃＯＬＬＡ−ＩＫＶＡＶ（１ｗｔ％／ポリＬ乳酸）を用い、溶媒としてヘキサフルオロイソプロピルアルコール（ＨＦＩＰ）を用いて、ポリマー溶液（２０ｗ／ｖ％）を作製した。このポリマー溶液をプラスチックシリンジ１に取り、高圧電圧供給システム２によって電圧をかけながら押し出し（１３ｋＶ、３ｍＬ／ｈ）、ターゲット３に紡糸した。ターゲット３にはステンレス製の板を用い、図１に矢印で示したように回転（１０９ｒｐｍ）させながら１０分間紡糸した。その後、２日〜３日室温で減圧乾燥した。不織布の厚さはマイクロメーターにより測定した。
【００４７】
（５）細胞播種実験
細胞播種実験はラットの後根神経節（ＤＲＧ）細胞を単離して用いた。ラットより脊柱摘出し、脊柱内部よりＤＲＧを採取した。その後、メスで神経線維を除去し、ＰＢＳ８００μＬ（Ｉｃｅ−ｃｏｌｄ）に入れ、引き続き下記の酵素処理を行った。
【００４８】
酵素処理は、２．５％Ｔｒｙｐｓｉｎを１００μＬ（ｆｉｎａｌ ０．２５％）、７０Ｕ／μＬ ＤＮａｓｅを３μＬ（ｆｉｎａｌ ２００Ｕ／ｍＬ）、１％ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅを１００μＬ（ｆｉｎａｌ ０．１％）（ｔｏｔａｌ １ｍＬ）を含む酵素液を用いて、３７℃で３０分間（２分〜３分毎にタッピング）行った。
【００４９】
次に、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ９ｍＬを添加し、ピペッティングして、セルストレーナー（４０μｍ）に通し、遠心（８００ｒｐｍ、６分）後、上清を除去した。次いで、Ｓａｔｏ ｍｅｄｉｕｍ（＋Ｆｌｕｏｒｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）を添加し、ピペッティングしてＤＲＧ細胞を単離した。
【００５０】
単離したＤＲＧ細胞を４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２播種した。サンプルとして、（３）で作製した不織布を用いた。この不織布の表裏を各３０分間ＵＶ照射して滅菌後、２４穴プレートに一枚ずつ入れ、上から滅菌済み金属リングをかぶせて固定した。３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養し、４日後に中性ホルマリン緩衝液で固定した。その後、ギムザ染色し、顕微鏡で観察した。そして、神経突起伸長細胞をカウントし、接着細胞数で割り付けた。その結果、神経突起伸張細胞率は、６５％でありａｃＯＬＬＡ−ＩＫＶＡＶコンジュゲートで修飾した神経誘導管は、神経突起の伸張を促進できることがわかった。
【００５１】
（比較例１）
実施例１の（４）においてａｃＯＬＬＡ−ＩＫＶＡＶコンジュゲート及びポリＬ乳酸のブレンド物に替えて、ポリＬ乳酸のみでエレクトロスピニングによって不織布を作製した。それ以外は実施例１と同様に細胞播種実験を行った結果、神経突起伸張細胞率は４９％であり、この神経誘導管は神経突起の伸張をあまり促進していないことがわかった。
【００５２】
（比較例２）
実施例１の（４）においてａｃＯＬＬＡ−ＩＫＶＡＶコンジュゲート及びポリＬ乳酸のブレンド物に替えて、オリゴペプチドＩＫＶＡＶ及びポリＬ乳酸のみでエレクトロスピニングによって不織布を作製した。それ以外は実施例１と同様に細胞播種実験を行った結果、神経突起伸張細胞率は４９％であり、この神経誘導管はポリＬ乳酸からなる神経誘導管と比べ、突起の伸張に関して改善が認められなかった。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】エレクトロスピニングによる不織布の作製方法を概略的に示した図である。
【符号の説明】
【００５４】
１ プラスチックシリンジ
２ 高圧電圧供給システム
３ ターゲット
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経誘導管に関する。さらに詳細には、欠損した神経組織をより効率的に再生させることができる、ペプチドで修飾されたオリゴ乳酸及び生分解性ポリマーを主成分とすることを特徴とする神経誘導管に関する。
【背景技術】
【０００２】
欠損した末梢神経組織は損傷末端同士を外科的に端端縫合することによってなされていた。しかし、損傷末端同士の間隙がある程度以上の長さの場合、端端縫合すると張力が生じ、停滞した血流によって再生過程が妨げられることが知られている。また、多くの場合は欠損した末梢神経組織の断端が傷んでおり、そうした傷んだ断端をそのまま縫合すると、傷んだ断端が瘢痕化して神経の再生が阻害されることが知られている。そのため、欠損した末梢神経組織の断端が傷んでいる場合は、その断端を切除する必要があり、端端縫合が困難となる。端端縫合が困難である場合は、自家神経移植が行われる。自家神経移植には、運動機能を損なうことのないよう、機能損失が容認できる知覚神経が用いられている。しかし、知覚神経といえども知覚障害を引き起こす可能性は十分にあり、不必要なところはない。加えて、生体に必要以上にメスを入れることが良策でないことは容易に想像できる。そこで、自家神経移植を避けるために、神経誘導管（ガイドチューブ）の開発が求められている。
【０００３】
これまでに、人工器具を用いて神経細胞増殖の足場を形成し、神経を再生させ、元の機能を回復させる方法について、種々の検討がなされてきた。しかしながら、管状体のみを用いた場合、切断された神経の両端部から若干の細胞増殖は見られるが、切断した神経が再度接合して回復することは困難であった。これは、細胞が増殖する場合、一般的に管状体の足場に付着し、そこから切断部分を埋める方向に増殖して行くが、切断部分を覆うのみでは切断端の間に空隙があり、その部分を全て埋め尽くすまでの間に細胞の増殖が止まるためである。
【０００４】
人工材料によるガイドチューブとしては、まずシリコンが検討された。シリコンチューブは生体内で比較的異物反応が少なく、動物実験のみならず、ヒトにおいても実績を上げてきた。しかし、生体親和性がなく、チューブ内壁に沿った軸索伸展は見られなかった。また、シリコンチューブでは、チューブの内部と外部とで体液交換ができない。さらに、生体吸収性がなく、長期の埋入では不快感や痛みが生じてくる。そのため、神経再生後にチューブを取り除くための二度目の手術が必要であるという問題があった。
【０００５】
より理想的なガイドチューブとして、チューブを取り除くための二度目の手術が必要ないようにするため、体内に残留することのない生体吸収性材料からなる管状体を用いて神経を再生しようとする試みがなされた（非特許文献１参照）。
【０００６】
また、生体吸収材料として合成高分子のポリグリコール酸（ｐｏｌｙ（ｇｌｙｃｏｌｉｃａｃｉｄ）：ＰＧＡ）やＰＬＡ、天然高分子のコラーゲンなどが検討された。しかし、合成高分子材料では再生が遅いといった問題や、天然高分子材料では強度が不十分といった問題があり、いずれも自家移植にはおよばず、満足できる結果は得られていない。さらに、これらを補うために、ＰＧＡとコラーゲン、ラミニンの複合化材料が開発されている（非特許文献２参照）。しかし、コラーゲン、ラミニンの異物除去は完全ではない。一方、神経再生に大きく影響するといわれているシュワン細胞をあらかじめチューブ内で培養しておいたハイブリッド型ポリ乳酸−カプロラクトン共重合体（Ｐ（ＬＡ／ＣＬ））チューブでは、良好な結果を得ている（非特許文献３参照）。
【０００７】
さらに、生体吸収性材料の管状体内部に神経細胞の増殖を誘導する足場を形成し、神経を再生させる種々の試みがなされている。例えば、管状体内部にコラーゲンの繊維束を挿入し、フィブロネクチン（ＦＮ）でコーティングしたものがある（特許文献１、非特許文献４参照）。
【非特許文献１】鈴木京子ら著、「人工臓器」、１９９８年、第２７巻、第２号、ｐ．４９０―４９４
【非特許文献２】Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ Ｋ、Ｏｈｎｉｓｈｉ Ｋ、Ｋｉｙｏｔａｎｉ Ｔ、Ｓｅｋｉｎｅ Ｔ、Ｕｅｄａ Ｈ、Ｎａｋａｍｕｒａ Ｔ、Ｅｎｄｏ Ｋ、Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｙ、「Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、２０００年６月、８６８巻、ｐ．３１５―３２８
【非特許文献３】Ｈａｄｌｏｃｋ Ｔ、Ｅｌｉｓｓｅｅｆｆ Ｊ、Ｌａｎｇｅｒ Ｒ．Ｖａｃａｎｔｉ Ｊ、Ｃｈｅｎｅｙ Ｍ、「Ａｒｃｈ Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ Ｓｕｒｇ」、１９９８年、第１２４巻、ｐ．１０８１―１０８６
【非特許文献４】島田ひろき等著、「人工臓器」、１９９３年、第２２巻、第２号、ｐ．３５９―３６３
【特許文献１】特開平５−２３７１３９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述したような、管状体内部にコラーゲンの繊維束を挿入し、フィブロネクチン（ＦＮ）でコーティングしたもの（特許文献１、非特許文献４参照）は、強度が不十分であるため、チューブ端部が縫合部で裂けやすいという恐れがあった。
【０００９】
また、上述したように、ハイブリッド型ポリ乳酸−カプロラクトン共重合体（Ｐ（ＬＡ／ＣＬ））チューブでは良好な結果を得ている（非特許文献３参照）が、自家シュワン細胞の培養には時間を要し、緊急の場合には対応できないという問題があった。
【００１０】
そこで、本発明は、生体吸収性で安全で緊急時にも即座に用いることが可能で十分な強度を有する神経誘導管を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、ペプチドで修飾されたオリゴ乳酸を用いた神経誘導管を発明するに至った。
【００１２】
即ち、本発明の第１の要旨は、ペプチドとオリゴ乳酸とがペプチド結合により結合した化合物、を含む樹脂組成物を成型してなる神経誘導管に存する。本発明の第２の要旨は、上前本発明の第１の要旨にかかる神経誘導管において、ペプチドが、少なくともＩｌｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ配列を有することを特徴とする神経誘導管に存する。また、本発明の第３の要旨は、上記本発明の第１又は第２の要旨にかかる神経誘導管において、オリゴ乳酸が、下記一般式１（ｍは１〜１００の整数を表す。）で表されることを特徴とする神経誘導管に存する。
【００１３】
【化１】
【００１４】
さらに、本発明の第４の要旨は、上前本発明の第１〜第３の要旨にかかる神経誘導管において、樹脂組成物が、生分解性ポリマーを含むことを特徴とする神経誘導管に存する。また、本発明の第５の要旨は、上前本発明の第１〜第４の要旨にかかる神経誘導管において、神経誘導管の内壁に沿って細胞が成長することを特徴とする神経誘導管に存する。さらに、本発明の第６の要旨は、下記一般式２で表されるオリゴ乳酸単位及び下記一般式３で表されるペプチドを含むことを特徴とする、ペプチドで修飾されたオリゴ乳酸（ｎは１〜５００の整数、ｏは１〜１０の整数を表す。Ａ及びＢはそれぞれ単結合、又は２価の有機基を表す。）に存する。
【００１５】
【化２】
【００１６】
【化３】
【００１７】
本発明の第７の要旨は、上前本発明の第６の要旨にかかるペプチドで修飾されたオリゴ乳酸を含む樹脂組成物を成型してなる成型体であり、第８の要旨は、上前本発明の第１、第４又は第５の要旨にかかる神経誘導管において、一般式３で表されるペプチドと一般式２で表されるオリゴ乳酸単位を備えるオリゴ乳酸とがペプチド結合により結合した化合物、を含む樹脂組成物を成形してなることを特徴とする神経誘導管に存する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、生体内で吸収され十分な強度を有する神経の増殖に有効な神経誘導管を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明におけるオリゴ乳酸の乳酸とは、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、Ｌ−乳酸とＤ−乳酸の任意の割合の混合物から選ばれる乳酸のことであり、オリゴ乳酸とは乳酸のオリゴマーを意味する。また、オリゴマーとは、乳酸などの単量体が複数結合した構造を有する化合物を意味する。本発明のオリゴ乳酸の場合、乳酸の単量体の結合数ｎは、通常、２以上５００以下であるが、ｎの下限値は、好ましくは３、より好ましくは５、さらに好ましくは１０である。ｎの上限値は、好ましくは１００、より好ましくは５０、さらに好ましくは２５である。ｎが５００より大きいとペプチドの効果が小さくなる。
【００２０】
また、本発明のペプチドで修飾されたオリゴ乳酸を神経誘導管に使用する場合、乳酸の単量体の結合数ｍは、通常、２以上１００以下であるが、ｍの下限値は、好ましくは３、より好ましくは５、さらに好ましくは１０である。ｍの上限値は、好ましくは５０、より好ましくは３０、さらに好ましくは２５である。ｍが１００より大きいとペプチドで修飾されたオリゴ乳酸が神経誘導管の表面に移行しにくくなり、好ましくない。
【００２１】
ペプチドで修飾されたオリゴ乳酸とは、オリゴ乳酸と複数のアミノ酸がペプチド結合により結合した化合物を意味し、アミノ酸は通常αアミノ酸である。αアミノ酸としては、例えば、Ｌ−イソロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−アロイソロイシン、Ｄ−アロイソロイシン、Ｌ−リジン、Ｄ−リジン、Ｌ−バリン、Ｄ−バリン、Ｌ−α−アラニン、Ｄ−α−アラニン、グリシン、Ｌ−ノルバリン、Ｄ−ノルバリン、Ｌ−ロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−ノルロイシン、Ｄ−ノルロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｄ−チロシンなどを挙げられるが、この中でも、Ｌ−イソロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−アロイソロイシン、Ｄ−アロイソロイシン、Ｌ−リジン、Ｄ−リジン、Ｌ−バリン、Ｄ−バリン、Ｌ−α−アラニン、Ｄ−α−アラニンが好ましく用いられる。
【００２２】
ペプチドで修飾されたオリゴ乳酸に含まれるペプチド部分は、アミノ酸配列が複数結合した構造を示す。アミノ酸配列の結合数は、通常、１以上５０以下である。アミノ酸の結合数の下限値は、好ましくは２、さらに好ましくは３であり、上限値は、好ましくは１０さらに好ましくは７である。アミノ酸結合数の最も好ましい値は５である。
【００２３】
本発明において、ペプチドで修飾されたオリゴ乳酸に含まれるペプチド部分の最も好ましい構造は、下記一般式３で表される。
【００２４】
【化４】
【００２５】
上記一般式３において、ｏは正の整数を表し、好ましくは１以上１０以下である。ｏが大きい方が、より神経細胞と接触しやすくなるという効果を得られると考えられる。しかし、上記ｍに対してｏが大きくなりすぎると水溶性が高くなり、ポリ乳酸と混合させる際にうまく混合できずに溶出してしまう虞があるため、オリゴ乳酸との親水疎水バランスを考えなければならない。
【００２６】
また、上記一般式３において、Ａ及びＢはそれぞれ、ペプチド、２価の芳香族基、２価のアルキル基、アルケニル基、酸素、硫黄、エステル、エーテル、ウレタン、などの有機基を表すが、好ましくはペプチド又は単結合であり、最も好ましくはＡ及びＢが、ともに単結合である。
【００２７】
本発明のオリゴ乳酸の合成法としては、複数の乳酸を脱水重縮合反応により合成する方法、乳酸エステルのエステル交換反応により合成する方法、ラクチドの開環反応により合成する方法などを挙げられるが、好ましくは複数の乳酸の脱水重縮合反応により合成する方法が選ばれる。
【００２８】
複数の乳酸の脱水重縮合反応によりオリゴ乳酸を合成する場合は、オリゴ乳酸を合成した後、ペプチドで修飾されたオリゴ乳酸を合成する前に、オリゴ乳酸の水酸基を不活性化させることが好ましい。不活性化させる方法としては、無水酢酸などによりアセチル化させる方法が好ましい手段として用いられる。
【００２９】
ペプチドで修飾されたオリゴ乳酸の合成方法は、末端アセチル化オリゴ乳酸にペプチドの数量体を反応させても良いし、末端アセチル化オリゴ乳酸にアミノ酸を結合させて、ペプチド連鎖を延長させていっても良いが、末端アセチル化オリゴ乳酸にペプチドの数量体を反応させる方が好ましい。
【００３０】
本発明における生分解性ポリマーとは、微生物により分解されるポリマーや生体内で分解されるポリマーを示し、例えば、ポリＬ−乳酸、ポリＤ−乳酸、ポリＤＬ−乳酸、ポリ乳酸―ポリエーテル共重合体、ポリ乳酸グリコール酸共重合体、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、ポリブチレンサクシネート、ポリエチレンサクシネート、ポリブチレンサクシネートアジペート、ポリプロピレンカーボネート、ポリパラジオキサノンなどの合成高分子や、多糖類、コラーゲン、ゼラチンなどの天然高分子や、ポリ４−ヒドロキシブチレートなどの微生物産系高分子などを挙げられる。この中でもポリＬ−乳酸、ポリＤ−乳酸、ポリＤＬ−乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸グリコール酸共重合体、ポリ乳酸―ポリエーテル共重合体が好ましく、より好ましくは、ポリＬ−乳酸、ポリＤ−乳酸、ポリ乳酸―ポリエーテル共重合体であり、さらに好ましくはポリＬ−乳酸、ポリＤ−乳酸であり、最も好ましくはポリＬ−乳酸である。
【００３１】
本発明の神経誘導管を構成する材料のうち、ペプチドで修飾されたオリゴ乳酸及び生分解性ポリマーの合計量が占める割合は、５０質量％以上であるが、好ましくは７０質量％以上、さらに好ましくは８０質量％以上、最も好ましくは９０質量％以上である。神経誘導管を構成する材料のうち、ペプチドで修飾されたオリゴ乳酸及び生分解性ポリマー以外の材料としては、可塑剤、安定剤、生体吸収性調節剤、表面処理剤などを含んでいても良いが、好ましくは可塑剤が添加される。可塑剤としては、ポリエーテル、ポリエステルなどが挙げられる。ポリエーテルとしては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール／ポリプロピレングリコール共重合体が挙げられ、ポリエステルとしては、ポリカプロラクトンなどが挙げられる。本発明の神経誘導管を構成する材料のうち、ペプチドで修飾されたオリゴ乳酸及び生分解性ポリマーの合計量が占める割合が５０質量％未満であると、機械的強度が低下するか、又は神経成長促進作用が損なわれ好ましくない。
【００３２】
ポリ乳酸にポリエーテルを可塑剤として添加する代わりに、グリコール酸、ポリエーテル、カプロラクトンから選ばれる１つ以上の成分を共重合させても良い。この中でもポリ乳酸―ポリエーテル共重合体、ポリ乳酸―ポリグリコール酸が好ましく、ポリ乳酸―ポリエチレングリコールブロック共重合体がさらに好ましく用いられる。共重合させた場合の共重合体中に含まれる乳酸単位は、好ましくは３０質量％以上、さらに好ましくは５０質量％以上、最も好ましくは７０質量％以上である。
【００３３】
本発明の神経誘導管を構成するペプチドで修飾されたオリゴ乳酸と生分解性ポリマーの質量比率は、生分解性ポリマー１００質量部に対してペプチドで修飾されたオリゴ乳酸は通常１０質量部以下である。ペプチドで修飾されたオリゴ乳酸の上限値は好ましくは４０質量部、より好ましくは１０質量部、さらに好ましくは５質量部である。またペプチドで修飾されたオリゴ乳酸の下限値は好ましくは０．０１質量部、より好ましくは０．１質量部、さらに好ましくは１質量部である。ペプチドで修飾されたオリゴ乳酸が４０質量部より多いと、神経誘導管の強度が低下して好ましくない。またペプチドで修飾されたオリゴ乳酸が０．０１質量部より少ないと、神経細胞成長促進効果が低下し好ましくない。
【００３４】
本発明の神経誘導管は、公知の成型方法により作成することができる。成型方法の例としては、射出成型、キャスト成型、スピンコート、エレクトロスピニングを挙げられるが、低温で成型できる点で、キャスト成型、スピンコート、エレクトロスピニングが好ましく、神経誘導管の機能発現のための相分離構造を形成させるには、スピンコート及びエレクトロスピニングが好ましく用いられる。またエレクトロスピニングが製造の効率の点で最も好ましい。
【００３５】
本発明の神経誘導管は、目的の形状に成型後、物理的又は化学的表面処理、若しくは架橋等を行っても良いし、表面処理又は架橋後に目的の形状に成型しても良い。また、２種類以上の表面処理又は架橋等を併用しても良い。
【００３６】
本発明の神経誘導管は、使用する前にγ線滅菌、紫外線滅菌等公知の方法により滅菌することが好ましい。
【実施例】
【００３７】
以下に、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、これらの実施例によって限定されるものではない。
【００３８】
（実施例１）
（１）ＩＫＶＡＶペプチド合成
各オリゴペプチドの合成は全てＦｍｏｃ固相合成法により、大気下で、手合成にて行った。５量体のオリゴペプチドＩＫＶＡＶを合成するために、まず、Ｆｍｏｃ−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ（９−フルオレニルメトキシカルボニル−ＰＡＬ−ポリエチレングリコール−ポリスチレン）樹脂（以下、単に「樹脂」という。）をプラスチック空カラムに秤量し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で膨潤させた。その後、上記樹脂にＦｍｏｃ−アミノ酸を、Ｆｍｏｃ−アミノ酸（Ｖ）、Ｆｍｏｃ−アミノ酸（Ａ）、Ｆｍｏｃ−アミノ酸（Ｖ）、Ｆｍｏｃ−アミノ酸（Ｋ）、Ｆｍｏｃ−アミノ酸（Ｉ）の順で連続的に縮合させた。具体的には、Ｆｍｏｃ−アミノ酸はそれぞれ上記樹脂に対して３倍等量を用いて、Ｆｍｏｃ（保護基）の除去（脱Ｆｍｏｃ）には、２０％ピペリジン／ＤＭＦを用いた。活性化剤としては、上記樹脂に対して３倍等量のＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物（ＨＯＢｔ）、同３倍等量の２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロフォスフェート（ＨＢＴＵ）、及び同６倍等量（１．５０ｍｍｏｌ）のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を用いた。
【００３９】
オリゴペプチドＩＫＶＡＶの合成過程において、脱Ｆｍｏｃとカップリングが行われているかについては、各々の反応をカイザーテストにて確認した。脱Ｆｍｏｃでは、カイザーテストを行って陰性（黄）の場合は陽性（青）となるまで反応を繰り返し、カップリングでは、カイザーテストを行って陽性（青）の場合は陰性（黄）となるまで、反応を繰り返した。このようにして、オリゴペプチドＩＫＶＡＶを樹脂に付着させた。
【００４０】
得られたオリゴペプチドＩＫＶＡＶ付き樹脂の一部を分取し、ＤＭＦ、ＤＣＭ、メタノールの順番に洗浄し、減圧乾燥した後、８５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、並びに、スカベンジャーとして７．５％ｍ−クレゾール、及び７．５％チオアニソールでカクテル溶液を調整し、それを各カラムに加え、室温で約１時間反応させた。その後、この反応で得た反応液を遠沈管に取り出し、反応後の樹脂をＴＦＡで５回洗浄し、その洗浄液も同遠沈管に取った。そして、ＴＦＡの容積が１／１０になるまで揮発させた後、約２０倍等量のジエチルエーテルに滴下して再沈殿させた。その後、冷却遠心（８５００ｒｐｍ、０℃、２０分間）し上澄み溶液を除去した。この再沈殿を３〜６回繰り返し、減圧乾燥して粗オリゴペプチドを得た。このようにして、樹脂からオリゴペプチドＩＫＶＡＶを切り出した。
【００４１】
得られた粗オリゴペプチドをＨＰＬＣの２２０ｎｍ（ペプチド結合の吸収波長）、３００ｎｍ（Ｆｍｏｃ基の吸収波長）でモニターし、分析を行った。その結果、２２０ｎｍにメインピークが見られ、３００ｎｍでは吸収されていないことを確認した。
【００４２】
（２）オリゴ乳酸合成
乳酸モノマーを脱水重縮合反応させることによりオリゴ乳酸を合成した。具体的には、乳酸の９０％水溶液を１４５℃で３時間加熱後、１４５℃のまま減圧し、約２０ｋＰａ（１５０Ｔｏｒｒ）で３時間保持した。その後、１５５℃、約０．４ｋＰａ（３Ｔｏｒｒ）で３時間、１８５℃、約０．４ｋＰａ（３Ｔｏｒｒ）で３時間、脱水縮合反応を行った。このようにしてオリゴ乳酸を合成した後、無水酢酸によって、合成されたオリゴ乳酸の水酸基を不活性化させ、末端がアセチル化されたオリゴ乳酸（ａｃＯＬＬＡ）を得た。
【００４３】
（３）ａｃＯＬＬＡ−ＩＫＶＡＶコンジュゲート合成
（１）で合成したオリゴペプチドＩＫＶＡＶ付き樹脂の一部を分取した。その後、オリゴペプチドＩＫＶＡＶを樹脂から切り出さずに、活性化剤として、樹脂に対して５倍等量のＨＯＢｔ、同５倍等量のＨＢＴＵ、及び、同１０倍等量のＤＩＰＥＡを加え、溶媒としてＤＭＦを加え、（２）で得たａｃＯＬＬＡを同５倍等量加えて、固相上にてカップリングを行った。カップリングが行われているかどうかは、（１）と同様にカイザーテストにて陰性（黄）となったことより確認した。樹脂からの切り出し操作についても（１）と同様の方法で行った。このようにして、ａｃＯＬＬＡ−ＩＫＶＡＶを得た。
【００４４】
得られた生成物をＨＰＬＣの２２０ｎｍ（ペプチド結合の吸収波長）でモニターし、分析を行い、疎水基の導入の確認行った。
【００４５】
（４）エレクトロスピニング不織布の作製
エレクトロスピニングによって不織布を作製した。この作製方法を、図１に概略的に示す。
【００４６】
溶質に（３）で得られたａｃＯＬＬＡ−ＩＫＶＡＶ（１ｗｔ％／ポリＬ乳酸）を用い、溶媒としてヘキサフルオロイソプロピルアルコール（ＨＦＩＰ）を用いて、ポリマー溶液（２０ｗ／ｖ％）を作製した。このポリマー溶液をプラスチックシリンジ１に取り、高圧電圧供給システム２によって電圧をかけながら押し出し（１３ｋＶ、３ｍＬ／ｈ）、ターゲット３に紡糸した。ターゲット３にはステンレス製の板を用い、図１に矢印で示したように回転（１０９ｒｐｍ）させながら１０分間紡糸した。その後、２日〜３日室温で減圧乾燥した。不織布の厚さはマイクロメーターにより測定した。
【００４７】
（５）細胞播種実験
細胞播種実験はラットの後根神経節（ＤＲＧ）細胞を単離して用いた。ラットより脊柱摘出し、脊柱内部よりＤＲＧを採取した。その後、メスで神経線維を除去し、ＰＢＳ８００μＬ（Ｉｃｅ−ｃｏｌｄ）に入れ、引き続き下記の酵素処理を行った。
【００４８】
酵素処理は、２．５％Ｔｒｙｐｓｉｎを１００μＬ（ｆｉｎａｌ ０．２５％）、７０Ｕ／μＬ ＤＮａｓｅを３μＬ（ｆｉｎａｌ ２００Ｕ／ｍＬ）、１％ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅを１００μＬ（ｆｉｎａｌ ０．１％）（ｔｏｔａｌ １ｍＬ）を含む酵素液を用いて、３７℃で３０分間（２分〜３分毎にタッピング）行った。
【００４９】
次に、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ９ｍＬを添加し、ピペッティングして、セルストレーナー（４０μｍ）に通し、遠心（８００ｒｐｍ、６分）後、上清を除去した。次いで、Ｓａｔｏ ｍｅｄｉｕｍ（＋Ｆｌｕｏｒｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）を添加し、ピペッティングしてＤＲＧ細胞を単離した。
【００５０】
単離したＤＲＧ細胞を４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２播種した。サンプルとして、（３）で作製した不織布を用いた。この不織布の表裏を各３０分間ＵＶ照射して滅菌後、２４穴プレートに一枚ずつ入れ、上から滅菌済み金属リングをかぶせて固定した。３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養し、４日後に中性ホルマリン緩衝液で固定した。その後、ギムザ染色し、顕微鏡で観察した。そして、神経突起伸長細胞をカウントし、接着細胞数で割り付けた。その結果、神経突起伸張細胞率は、６５％でありａｃＯＬＬＡ−ＩＫＶＡＶコンジュゲートで修飾した神経誘導管は、神経突起の伸張を促進できることがわかった。
【００５１】
（比較例１）
実施例１の（４）においてａｃＯＬＬＡ−ＩＫＶＡＶコンジュゲート及びポリＬ乳酸のブレンド物に替えて、ポリＬ乳酸のみでエレクトロスピニングによって不織布を作製した。それ以外は実施例１と同様に細胞播種実験を行った結果、神経突起伸張細胞率は４９％であり、この神経誘導管は神経突起の伸張をあまり促進していないことがわかった。
【００５２】
（比較例２）
実施例１の（４）においてａｃＯＬＬＡ−ＩＫＶＡＶコンジュゲート及びポリＬ乳酸のブレンド物に替えて、オリゴペプチドＩＫＶＡＶ及びポリＬ乳酸のみでエレクトロスピニングによって不織布を作製した。それ以外は実施例１と同様に細胞播種実験を行った結果、神経突起伸張細胞率は４９％であり、この神経誘導管はポリＬ乳酸からなる神経誘導管と比べ、突起の伸張に関して改善が認められなかった。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】エレクトロスピニングによる不織布の作製方法を概略的に示した図である。
【符号の説明】
【００５４】
１ プラスチックシリンジ
２ 高圧電圧供給システム
３ ターゲット
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドとオリゴ乳酸とがペプチド結合により結合した化合物、を含む樹脂組成物を成型してなる神経誘導管。
【請求項２】
前記ペプチドが、少なくともＩｌｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ配列を有することを特徴とする、請求項１に記載の神経誘導管。
【請求項３】
前記オリゴ乳酸が、下記一般式１（ｍは１〜１００の整数を表す。）で表されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の神経誘導管。
【化１】
【請求項４】
前記樹脂組成物が、生分解性ポリマーを含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の神経誘導管。
【請求項５】
管の内壁に神経細胞が沿って成長することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の神経誘導管。
【請求項６】
下記一般式２で表されるオリゴ乳酸単位及び下記一般式３で表されるペプチドを含むことを特徴とする、ペプチドで修飾されたオリゴ乳酸（ｎは１〜５００の整数、ｏは１〜１０の整数を表す。Ａ及びＢはそれぞれ単結合、又は２価の有機基を表す。）。
【化２】
【化３】
【請求項７】
請求項６に記載のペプチドで修飾されたオリゴ乳酸を含む樹脂組成物を成型してなる成型体。
【請求項８】
前記一般式３で表される前記ペプチドと前記一般式２で表される前記オリゴ乳酸単位を備える前記オリゴ乳酸とがペプチド結合により結合した前記化合物、を含む前記樹脂組成物を成形してなることを特徴とする、請求項１、４又は５のいずれか１項に記載の神経誘導管。
【請求項１】
ペプチドとオリゴ乳酸とがペプチド結合により結合した化合物、を含む樹脂組成物を成型してなる神経誘導管。
【請求項２】
前記ペプチドが、少なくともＩｌｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ配列を有することを特徴とする、請求項１に記載の神経誘導管。
【請求項３】
前記オリゴ乳酸が、下記一般式１（ｍは１〜１００の整数を表す。）で表されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の神経誘導管。
【化１】
【請求項４】
前記樹脂組成物が、生分解性ポリマーを含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の神経誘導管。
【請求項５】
管の内壁に神経細胞が沿って成長することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の神経誘導管。
【請求項６】
下記一般式２で表されるオリゴ乳酸単位及び下記一般式３で表されるペプチドを含むことを特徴とする、ペプチドで修飾されたオリゴ乳酸（ｎは１〜５００の整数、ｏは１〜１０の整数を表す。Ａ及びＢはそれぞれ単結合、又は２価の有機基を表す。）。
【化２】
【化３】
【請求項７】
請求項６に記載のペプチドで修飾されたオリゴ乳酸を含む樹脂組成物を成型してなる成型体。
【請求項８】
前記一般式３で表される前記ペプチドと前記一般式２で表される前記オリゴ乳酸単位を備える前記オリゴ乳酸とがペプチド結合により結合した前記化合物、を含む前記樹脂組成物を成形してなることを特徴とする、請求項１、４又は５のいずれか１項に記載の神経誘導管。
【図１】
【公開番号】特開２００９−６６２２７（Ｐ２００９−６６２２７Ａ）
【公開日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２３８４３４（Ｐ２００７−２３８４３４）
【出願日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【出願人】（５９１１０８８８０）国立循環器病センター総長 (159)
【出願人】（０００００５９６８）三菱化学株式会社 (4,356)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【出願人】（５９１１０８８８０）国立循環器病センター総長 (159)
【出願人】（０００００５９６８）三菱化学株式会社 (4,356)
【Ｆターム（参考）】
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