穀粒蛋白質含量の増加を有するコムギ植物の作出及び使用の方法
本発明は、穀粒蛋白質含量の増加を有するコムギ植物を作出する新規の方法を提供する。該方法は、除草剤耐性、コムギアセトヒドロキシ酸合成酵素大サブユニット（ＡＨＡＳＬ）蛋白質をコードする遺伝子を導入する工程を含む。本発明は、高蛋白質穀粒を産生するコムギ植物及びそれらから得られるヒト・動物用食品を更に提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、農業分野、詳細には、穀粒蛋白質含量が増加したコムギ植物を作出し、且つ使用する新規な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コムギの穀粒蛋白質含量は栄養価の向上に重要であるとともに、パンを製造するための主要な寄与因子でもある（Ｄｉｃｋ ＆ Ｙｏｕｎｇｓ（１９８８）”Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｕｒｕｍ ｗｈｅａｔ，ｓｅｍｏｌｉｎａ，ａｎｄ ｐａｓｔａ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ，”Ｉｎ：Ｄｕｒｕｍ ｗｈｅａｔ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＡＡＣＣ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ，ｐｐ．２３７− ２４８；Ｆｉｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ（１９８７）”Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｈａｒｄ，ｓｏｆｔ，ａｎｄ ｄｕｒｕｍ ｗｈｅａｔｓ”．Ｉｎ Ｅ．Ｇ．Ｈｅｙｎｅ（ｅｄ．）Ｗｈｅａｔ ａｎｄ ｗｈｅａｔ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ，Ａｇｒｏｎ．Ｍｏｎｏｇｒ．１３，２ｎｄ ｅｄ．ＡＳＡ，ＣＳＳＡ，ａｎｄ ＳＳＳＡ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ｐｐ．６７７−７４８；Ｋｈａｎ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｃｒｏｐ ＳｃＬ ４０：５１８−５２４）。コムギの穀粒蛋白質含量は、高穀粒蛋白質を有するコムギに対する品質にふさわしい価格により、コムギ栽培者にとって重要な特性でもある（Ｏｌｍｏｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１０７：１２４３−１２５１）。高穀粒蛋白質含量のための育種では多くの尽力が注がれているが、その特性及び環境との相互作用を制御する遺伝的特徴の複雑性により、その進展が遅れている。研究により、穀粒蛋白質含量に対するいくつかのＱＴＬｓが同定されている（Ｔｕｒｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｃｅｒｅａｌ Ｓｃｉ．４０：５１−６０；Ｊｏｐｐａ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．３７：１５８６−１５８；Ｐｅｒｒｅｔａｎｔ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１００：１１６７−１１７５；Ｐｒａｓａｄ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．９９：３４１−３４５；Ｇｒｏｏｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１０６：１０３２−１０４０；Ｇｒｏｏｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｃｅｒｅａｌ Ｓｃｉ．４０：９３−１００；Ｓｈｅｗｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃ．７３：３９７−４０６）。穀粒蛋白質含量の１〜２％の向上は、コムギの特定のクラス又はタイプ内では有意な増加であるとみなされた（Ｔｏｋａｔｉｌｉｄｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｆｉｅｌｄ Ｃｒｏｐｓ Ｒｅｓ．８６：３３−４２；Ｏｌｍｏｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１０７：１２４３−１２５１；Ｍｅｓｆｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ １１６：２３７−２４２）。穀粒蛋白質含量は、環境条件、例えば、土壌肥沃度、気温、窒素栄養、降雨又は温度に影響される（Ｂｈｕｌｌａｒ ＆ Ｊｅｎｎｅｒ（１９８５）Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２：３６３−３７５；Ｗａｒｄｌａｗ＆ Ｗｒｉｇｅｌｙ（１９９４）Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２１：６９５−７０３；Ｄａｎｉｅｌ ＆ Ｔｒｉｂｏｉ（２００Ｏ）Ｊ．Ｃｅｒｅａｌ Ｓｃｉ．３２：４５−５６；Ｍｅｔｈｏ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃ．７９：１８２３−１８３１）。研究では、収量に対する高蛋白質の負の作用があることも示されている（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．２５：４３０−４３５；Ｄａｙ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ８：５５５−５６６）；しかし、他の研究では両方の特性を有するコムギを育種することが可能であることを示唆している（Ｄａｙ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ８：５５５−５６６；Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９７８）”Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｌｙｓｉｎｅ ｉｎ ｗｈｅａｔ，”Ｉｎ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｉｆｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｈｅａｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，Ｎｅｗ Ｄｅｌｈｉ，Ｉｎｄｉａ，ｐｐ．８２５−８３５）。確かに、穀粒蛋白質に作用する単一遺伝子の形質又は密接に関連する形質を有することは、特に、該形質又は密接に関連する形質が迅速で費用対効果の大きい選抜を可能とする場合、パンの製造及びパンコムギの栄養価を向上する有意な利点を与えるであろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｔｕｒｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｃｅｒｅａｌ Ｓｃｉ．４０：５１−６０
【非特許文献２】Ｊｏｐｐａ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．３７：１５８６−１５８
【非特許文献３】Ｐｅｒｒｅｔａｎｔ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１００：１１６７−１１７５
【非特許文献４】Ｐｒａｓａｄ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．９９：３４１−３４５
【非特許文献５】Ｇｒｏｏｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１０６：１０３２−１０４０
【非特許文献６】Ｇｒｏｏｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｃｅｒｅａｌ Ｓｃｉ．４０：９３−１００
【非特許文献７】Ｓｈｅｗｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃ．７３：３９７−４０６
【非特許文献８】Ｔｏｋａｔｉｌｉｄｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｆｉｅｌｄ Ｃｒｏｐｓ Ｒｅｓ．８６：３３−４２
【非特許文献９】Ｏｌｍｏｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１０７：１２４３−１２５１
【非特許文献１０】Ｍｅｓｆｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ １１６：２３７−２４２
【非特許文献１１】Ｂｈｕｌｌａｒ ＆ Ｊｅｎｎｅｒ（１９８５）Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２：３６３−３７５
【非特許文献１２】Ｗａｒｄｌａｗ＆ Ｗｒｉｇｅｌｙ（１９９４）Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２１：６９５−７０３
【非特許文献１３】Ｄａｎｉｅｌ ＆ Ｔｒｉｂｏｉ（２００Ｏ）Ｊ．Ｃｅｒｅａｌ Ｓｃｉ．３２：４５−５６
【非特許文献１４】Ｍｅｔｈｏ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃ．７９：１８２３−１８３１
【非特許文献１５】Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．２５：４３０−４３５；Ｄａｙ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ８：５５５−５６６）
【非特許文献１６】Ｄａｙ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ８：５５５−５６６
【非特許文献１７】Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９７８）”Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｌｙｓｉｎｅ ｉｎ ｗｈｅａｔ，”Ｉｎ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｉｆｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｈｅａｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，Ｎｅｗ Ｄｅｌｈｉ，Ｉｎｄｉａ，ｐｐ．８２５−８３５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、穀粒蛋白質含量が増加した穀粒を産生するコムギ植物を作出する方法を提供する。本発明は、コムギ植物がコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）ＡＨＡＳＬ１Ａ蛋白質ではアミノ酸位置５７９においてセリンからアスパラギンへの置換を含むＡＨＡＳＬ１Ａ蛋白質をコードするＡＨＡＳＬ１Ａ遺伝子の少なくとも１つのコピーをそのゲノムに含むという驚くべき発見に基づく。このアミノ酸置換は、対応するセリンからアスパラギンへの置換がシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＡＨＡＳＬ１Ａ蛋白質のアミノ酸位置６５３であるため、本明細書ではＳ６５３Ｎ置換とも称される。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の方法は、Ｓ６５３Ｎ置換を含むＡＨＡＳＬ１Ａ蛋白質をコードするコムギＡＨＡＳＬ１Ａ遺伝子の少なくとも１つのコピーを植物に導入する工程を含む。このような遺伝子は、例えば、他家受粉、突然変異生成及び形質転換のような方法によって導入され得る。本発明の方法は、ＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子含むコムギ植物又はその子孫植物を生育して穀粒を産生させる工程と、コムギ植物又はその子孫植物によって産生された穀粒の蛋白質含量を定量する工程とを更に含み得る。該方法は、例えば、有効量のＡＨＡＳ阻害除草剤を植物及び／又は植物が生育しており、或いは生育される土壌若しくは他の基材に塗布することにより、コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子を含む植物を選抜する工程を更に含み得る。
【発明の効果】
【０００６】
本発明は、コムギ植物、植物器官、植物組織及び植物細胞及び高蛋白質穀粒並びに本発明のコムギ植物によって産生される高蛋白質穀粒に由来するヒト及び動物用食品を更に提供する。ヒト及び動物用食品を生産するために本発明の高蛋白質穀粒を使用する方法も提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ＢＷ２５５−２及び対照ＢＷ２５５系統のコムギ植物から調製された酵素抽出物を用いて、バリン及びロイシンによるＡＨＡＳ活性のフィードバック阻害を定量するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ研究の結果を示すグラフ表示である。ＢＷ２５５−２系統はＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ対立遺伝子に対してホモ接合性である。ＢＷ２５５はＡＨＡＳＬ１Ａ遺伝子においてホモ接合性野生型であり、ＢＷ２５５−２系統を作出するために突然変異誘発された親系統である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は、穀粒蛋白質含量が増加した穀粒を含むコムギ植物を作出し、且つ使用する方法を提供する。本発明は、植物へのＳ６５３Ｎ置換を含むＡＨＡＳＬ１Ａ蛋白質をコードするコムギＡＨＡＳＬ１Ａ遺伝子の少なくとも１つのコピーをコムギ植物に導入する工程を含む。このような遺伝子は、例えば、他家受粉、突然変異生成及び形質転換のような方法によって導入され得る。本発明の方法は、ＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子含むコムギ植物又はその子孫植物を生育して穀粒を産生させる工程と、コムギ植物又はその子孫植物によって産生された穀粒の蛋白質含量を定量する工程とを更に含み得る。本発明の方法によって作出されるコムギ植物及びその子孫植物は、コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子を欠いたコムギ植物と比べ、高穀粒蛋白質含量を含む。
【０００９】
本発明の方法は、穀粒蛋白質含量が増加した新規コムギ品種の開発に用途を見出す。本発明の方法は、容易に選抜可能な除草剤耐性特性に関連する高蛋白質コムギ特性により、選抜において強固な利点を提供するため、既存の方法と比べ、本発明の方法は、高蛋白質コムギを開発するのに必要な育種作業を大幅に低減する。更に、コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子に対する選択分子マーカーは当該技術分野において公知であり、従って、穀粒蛋白質含量が増加したコムギに対するマーカー支援育種手法に役立ち得る。米国特許出願公開第２００５／０２０８５０６号を参照されたい（参照して本明細書に組み込まれる）。高蛋白質特性の選抜の容易性によって与えられる利点に加え、穀粒蛋白質含量の増加は穀粒収量と相関しない。従って、本発明の方法は、蛋白質含量が増加した穀粒を産生するコムギ植物を提供し、これらの植物は、同様の野生型植物と比べ、１エーカー当たりで生産される穀粒蛋白質の量を増加させるのに用いられ得る。最終的に、本発明の高蛋白質特性は、更に高い穀粒蛋白質含量を有するコムギ系統を開発するため、すでに穀粒蛋白質含量が高い既存のパンコムギの胚原質と組み合わせられ得る。
【００１０】
本発明は、高蛋白質コムギ植物及びこれらの植物によって産生される高蛋白質穀粒を提供する。そのような高蛋白質穀粒はヒト及び動物用の様々な食品及び飼料品に用途を見出す。特に、本発明のコムギ植物によって産生される穀粒は、特に、パン製造に用いる高蛋白質コムギ粉の生産に用途を見出す。従って、本発明は、本発明の高蛋白質コムギ植物によって産生される穀粒を製粉する工程を含む、高蛋白質コムギ粉を作出する方法を提供する。
【００１１】
本発明の高蛋白質コムギ植物は、野生型コムギ植物と比べ、除草剤耐性の増大も含む。特に、本発明の高蛋白質コムギ植物は、野生型コムギ植物と比べ、ＡＨＡＳ酵素の活性を妨害する、少なくとも１つの除草剤に対する耐性の増大を有する。本発明の高蛋白質コムギ植物は、コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子又はポリヌクレオチドの少なくとも１つのコピーを含む。そのようなコムギＡＨＡＳＬ１Ａ蛋白質は、アミノ酸位置５７９又は等価な位置においてアスパラギンを含む。野生型ＡＨＡＳＬ１Ａ蛋白質では、位置５７９においてセリンが見出される。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）の周知のＡＨＡＳＬ１Ａ蛋白質における対応位置がアミノ酸６５３であるため、セリン579からアスパラギンへの置換を含むＡＨＡＳＬ１Ａ蛋白質をコードするＡＨＡＳＬ１Ａ遺伝子は、植物ＡＨＡＳＬ配列の確立した命名法に準拠するため、ＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子と称される。
【００１２】
本発明は、穀粒蛋白質含量の増加を有する穀粒を含むコムギ植物を作製する方法を提供する。一実施形態では、該方法は、突然変異生成により、特に、内在性コムギＡＨＡＳＬ１Ａ遺伝子を突然変異誘発してコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子を生じさせることにより、植物へのＳ６５３Ｎ置換を含むＡＨＡＳＬ１Ａ蛋白質をコードするコムギＡＨＡＳＬ１Ａ遺伝子の少なくとも１つのコピーをコムギ植物に導入する工程を含む。本発明の高蛋白質コムギ植物を作出するため、当該技術分野において公知の任意の突然変異生成法が用いられてもよい。そのような突然変異生成法は、例えば、以下の突然変異原：放射線、例えば、Ｘ線、ガンマ線（例えば、コバルト６０又はセシウム１３７）、中性子、（例えば、原子炉におけるウラン２３５による核分裂の産物）、ベータ放射線（例えば、リン３２又は炭素１４のような放射性同位体から放射される）及び紫外線（２５００〜２９００ｎｍが好ましい）並びに化学的突然変異原、例えば、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、塩基類似体（例えば、５−ブロモ−ウラシル）、関連化合物（例えば、８−エトキシカフェイン）、抗生物質（例えば、ストレプトニグリン）、アルキル化剤（例えば、硫黄マスタード、ナイトロジェンマスタード、エポキシド、エチレンアミン、スルファート、スルホナート、スルホン、ラクトン）、アジド、ヒドロキシルアミン、亜硝酸又はアクリジンの任意の１つ又はそれ以上の使用を含み得る。コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子を含むコムギ植物は、除草剤耐性突然変異を含む植物細胞を選抜し、ＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子を含む植物を選抜し、それらから植物を再生する組織培養法を用いることによっても作出され得る。例えば、米国特許第５，７７３，７０２号及び第５，８５９，３４８号を参照されたい（両方ともその全体を参照して本明細書に組み込まれる）。突然変異育種の更なる詳細については、「品種開発の原則（Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ ｏｆ Ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」Ｆｅｈｒ，１９９３ Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙに見出され得る（その開示内容は参照して本明細書に組み込まれる）。
【００１３】
一実施形態では、本発明は、コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子又はポリヌクレオチドの１，２，３，４又はそれ以上のコピーを含む高蛋白質コムギ植物を提供する。例えば、高蛋白質コムギは、天然コムギＡＨＡＳＬ１Ａ遺伝子座においてＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子の１又は２つのコピーを含み得、また、付加的或いは代替的に、天然コムギＡＨＡＳＬ１Ａプロモーター、又は、特に、登熟期間中に植物における発現を促進することが可能な別のプロモーター、例えば、種子優先或いは胚優先のプロモーター（ｓｅｅｄ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ ｏｒ ａｎ ｅｍｂｒｙｏ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）のようなプロモーターに作動可能に結合したＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎポリヌクレオチドの１，２，３又はそれ以上のコピーを含み得る。
【００１４】
本発明は、穀粒蛋白質含量の増加を有する穀粒を含むコムギ植物を作出する方法を提供する。本発明の一実施形態では、該方法は、植物細胞における発現を促進するプロモーターに作動可能に結合したヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドコンストラクトで植物細胞を形質転換する工程と、該形質転換植物細胞から形質転換植物を再生する工程とを含む。該ヌクレオチド配列は、アミノ酸位置５７９又は等価な位置においてアスパラギンを含むコムギＡＨＡＳＬ１Ａ蛋白質をコードする。コムギＡＨＡＳＬ１Ａ蛋白質をコードするヌクレオチド配列及びコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子を含むコムギ植物は過去に開示されている。ＷＯ ２００４／１０６５２９及び米国特許出願公開第２００４／０２３７１３４号 第２００４／０２４４０８０号、第２００５／００４４５９７号、第２００６／００１０５１４号及び第２００６／００９５９９２号を参照されたい；これらはすべて参照して本明細書に組み込まれる。他の実施形態では、該方法は、コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子の少なくとも１つのコピーを含むコムギ植物の別のコムギ植物との他家受粉を伴う従来の植物育種を含み、ＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子を含む親植物の除草剤耐性特徴を含む子孫植物（Ｆ１又はＦ２）を選抜する工程を更に含んでもよい。該方法は、ＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎに対してホモ接合性のコムギ系統を作出するため、Ｆ１植物の自家受粉及び次代の子孫植物（Ｆ２）の選抜を場合により含み得る。所望により、該方法は、一又はそれ以上の次世代（即ち、Ｆ２，Ｆ３，Ｆ４等）の自家受粉及びＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎに対してホモ接合性の次代の子孫植物（即ち、Ｆ３，Ｆ４，Ｆ５等）の選抜を更に含み得る。明示しない限り、或いは使用の文脈から明らかでない限り、本明細書で用いられるような「子孫」という用語は、植物の直接の子孫に限定されず、次世代の子孫を含む。
【００１５】
本発明の方法は、少なくとも１つのコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子を含むコムギ植物の使用を含む。そのようなコムギ植物には、限定されないが、特許寄託受託番号（Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ）ＰＴＡ−３９５５の基で２００２年１月１５日に米国バージニア州２０１１０−２２０９、マナッサス（Ｍａｎａｓｓａｓ）、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託されたコムギ植物、２００２年３月１９日に米国バージニア州２０１１０−２２０９、マナッサス（Ｍａｎａｓｓａｓ）、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託された特許寄託受託番号（Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ）ＰＴＡ−４１１３；及び２００２年３月２８日に米国バージニア州２０１１０−２２０９、マナッサス（Ｍａｎａｓｓａｓ）、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託された特許寄託受託番号（Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ）ＰＴＡ−４２５７；ＡＴＣＣ特許寄託受託番号（Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ）ＰＴＡ−３９５５，ＰＴＡ−４１１３及び／又はＰＴＡ−４２５７に関するコムギ植物の突然変異、組換え型若しくは遺伝子操作型の誘導体；ＡＴＣＣ特許寄託受託番号（Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ）ＰＴＡ−３９５５，ＰＴＡ−４１１３及び／又はＰＴＡ−４２５７に関する植物の任意の子孫；並びにこれらの植物の任意の１つ又はそれ以上の子孫であるコムギ植物が含まれる。ＡＴＣＣ特許寄託受託番号（Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ）ＰＴＡ−３９５５，ＰＴＡ−４１１３及びＰＴＡ−４２５７を有する任意のコムギ植物のそのような突然変異、組換え型又は遺伝子操作誘導体並びにそれらの子孫は、好ましくはＡＴＣＣ特許寄託受託番号（Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ）ＰＴＡ−３９５５，ＰＴＡ−４１１３又はＰＴＡ−４２５７を有するコムギ植物の除草剤耐性特徴を含む。ＡＴＣＣ特許寄託受託番号（Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ）ＰＴＡ−３９５５，ＰＴＡ−４１１３及びＰＴＡ−４２５７を有するコムギ植物並びにそれらの誘導体及び子孫は、米国特許出願公開第２００４／０２３７１３４号、第２００４／０２４４０８０号及び第２００６／００９５９９２号に述べられている；これらはすべて参照して本明細書に組み込まれる。
【００１６】
ＡＴＣＣ特許寄託受託番号（Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ）ＰＴＡ−３９５５，ＰＴＡ−４１１３及びＰＴＡ−４２５７を有する各コムギ系統の少なくとも２５００個の種子の寄託は、それぞれ２００２年１月３日、２００２年３月４日及び２００２年１月３日に米国バージニア州２０１１０、マナッサス（Ｍａｎａｓｓａｓ）、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）の特許寄託機関（Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）になされた。これらの寄託の各々は少なくとも３０年の期限でなされ、寄託の試料の提供に対する直近の要請の少なくとも５年後にＡＴＣＣに受理される。これらの寄託体は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）の条項に従って維持される。加えて、これらの寄託体は、試料の生存能の指標の提供を含む、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８０１−１．８０９の要求事項をすべて満たす。
【００１７】
本明細書で用いられるように、別段の記載がない限り、或いは文脈から明らかでない限り、「植物」という用語は、限定されないが、植物細胞、植物プロトプラスト、植物が再生可能な植物細胞組織培養物、植物カルス、植物塊、植物において無傷の植物細胞又は植物の部分、例えば、胚、花粉、胚珠、子葉、葉、茎、花、枝、葉柄、果実、根、根端、葯などを含む。更に、種子は植物であると理解される。
【００１８】
「高蛋白質コムギ植物」とは、本明細書で開示される方法によって作出され、本発明のコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子の少なくとも１つのコピーをそのゲノムに含まない類似コムギ植物のレベルを超えて増加した穀粒蛋白質含量レベルを有する穀粒を産生し、或いは産生することが可能なコムギ植物を意味するものとする。本発明の好ましい実施形態では、高蛋白質コムギ植物はＴｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍコムギ植物である。
【００１９】
本発明の高蛋白質コムギ植物によって産生される穀粒は、本明細書で「高蛋白質穀粒」と称される。
【００２０】
本発明の「高蛋白質特性」とは高穀粒蛋白質含量であり、コムギ植物のゲノムにおける本発明のコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子又はポリヌクレオチドの存在によるものである。そのようなＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子には、限定されないが、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ Ｌ．，Ｔ．ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ Ｌ．，Ｔ．ｔｕｒｇｉｄｕｍ Ｌ．（限定されないが、亜種ペルシャコムギ（ｃａｒｔｈｌｉｃｕｍ）、デュラム（ｄｕｒｕｍ）、ノハラフタツブコムギ（ｄｉｃｏｃｃｏｉｄｅｓ）、エンマーコムギ（ｄｉｃｏｃｃｕｍ）、ポーランドコムギ（ｐｏｌｏｎｉｃｕｍ）及びｔｕｒａｎｉｃｕｍ）及びＴ．ｓｐｅｌｔａ Ｌ．を含む、Ａゲノムを有する任意のコムギ種由来のＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子が含まれる。
【００２１】
本発明は、穀粒蛋白質含量が増加した穀粒を産生する高蛋白質コムギ植物を提供する。通常、穀粒蛋白質含量は成熟乾燥穀粒の重量パーセントとして求められる。一般に、本発明のコムギ植物によって産生される穀粒の蛋白質含量は、コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子の少なくとも１つのコピーを含まない類似対照コムギ植物より少なくとも約４，５，６又は７％高い。好ましくは、本発明のコムギ植物によって産生される穀粒の蛋白質含量は、類似対照コムギ植物より少なくとも約８，９，１０又は１１％高い。より好ましくは、本発明のコムギ植物によって産生される穀粒の蛋白質含量は、類似対照コムギ植物より少なくとも約１２，１３，１４又は１５％高い。更に好ましくは、本発明のコムギ植物によって産生される穀粒の蛋白質含量は、類似対照コムギ植物より少なくとも約１５，１６，１７又は１８％高い。更に一層好ましくは、本発明のコムギ植物によって産生される穀粒の蛋白質含量は、類似対照コムギ植物より少なくとも約１９，２０，２１又は２２％高い。最も好ましくは、本発明のコムギ植物によって産生される穀粒の蛋白質含量は、類似対照コムギ植物より少なくとも約２３％高い。
【００２２】
本発明は、穀粒蛋白質含量又は他の穀粒構成要素、例えば、含水量及び個々のアミノ酸の濃度を求めるための特定の方法に依存しない。穀粒蛋白質含量、水分及び個々のアミノ酸を求めるには、当該技術分野において公知の任意の方法を用いることができる。例えば、ＡＯＡＣインターナショナルの公定分析法（２００５）、第１８版、ＡＯＡＣインターナショナル、米国メリーランド州ゲイサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、公定法９９０．０３（粗蛋白質）、９３０．１５（水分）及び９８２．３０（アミノ酸／蛋白質効率比）を参照されたい；参照して本明細書に組み込まれる。
【００２３】
本明細書で用いられるように、植物の「誘導体」又は「誘導コムギ植物」は、本発明の高蛋白質コムギ植物の子孫又はクローンであるコムギ植物であり、高蛋白質コムギ植物から継承されたコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子の少なくとも１つのコピーを含み、別段の記載がない限り、或いは文脈から明らかでない限り、やはり本明細書で定義づけされるような高蛋白質コムギ植物である。そのような誘導体又は誘導コムギ植物には、有性及び／又は無性生殖から生じる高蛋白質コムギ植物の子孫が含まれ、従って、非トランスジェニック及びトランスジェニックコムギ植物が含まれる。
【００２４】
本発明は、除草剤耐性又は除草剤抵抗性コムギ植物である高蛋白質コムギ植物に関する。「除草剤耐性」又は「除草剤抵抗性」植物とは、通常であれば正常又は野生型植物を枯死させ、或いはその生育を阻害する濃度において少なくとも１つの除草剤に対して耐性又は抵抗性である植物であるということである。本発明の高蛋白質コムギ植物は除草剤耐性又は除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬ蛋白質、特に、ＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎを含む。「除草剤耐性ＡＨＡＳＬ蛋白質」又は「除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬ蛋白質」とは、ＡＨＡＳ活性を妨害することが知られている、少なくとも１つの除草剤の存在下、野生型ＡＨＡＳＬ蛋白質のＡＨＡＳ活性を阻害することが知られている除草剤の濃度又はレベルにおいて、そのようなＡＨＡＳＬ蛋白質が野生型ＡＨＡＳＬ蛋白質のＡＨＡＳ活性と比べ、高いＡＨＡＳ活性を示すということである。更に、そのような除草剤耐性又は除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬ蛋白質のＡＨＡＳ活性は、本明細書で「除草剤耐性」又は「除草剤抵抗性」ＡＨＡＳ活性と称される場合がある。
【００２５】
本発明では、「除草剤耐性（ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ−ｔｏｌｅｒａｎｔ）」及び「除草剤抵抗性（ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）」という用語は置き換え可能に用いられ、同意義及び同等範囲を有するものとする。同様に、「除草剤耐性（ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ−ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）」及び「除草剤抵抗性（ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）」という用語は置き換え可能に用いられ、同意義及び同等範囲を有するものとする。同様に、「イミダゾリノン抵抗性（ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）」及び「イミダゾリノン抵抗性（ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ」）という用語は置き換え可能に用いられ、それぞれ「イミダゾリノン耐性（ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ−ｔｏｌｅｒａｎｔ）」及び「イミダゾリノン耐性（ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ−ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）」という用語と同等の意味及び同等の範囲であるものとする。
【００２６】
本発明は、除草剤抵抗性コムギＡＨＡＳＬポリヌクレオチド及び除草剤抵抗性コムギＡＨＡＳＬ蛋白質、特に、コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子若しくはポリヌクレオチド及びコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ蛋白質の使用を包含する。「除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬポリヌクレオチド」とは、除草剤抵抗性ＡＨＡＳ活性を含む蛋白質をコードするポリヌクレオチドであるものとする。「除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬ蛋白質」とは、除草剤抵抗性ＡＨＡＳ活性を含む蛋白質又はポリペプチドであるものとする。
【００２７】
更に、除草剤耐性又は除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬ蛋白質をコードするヌクレオチド配列で植物又はその祖先を形質転換することにより、除草剤耐性又は除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬ蛋白質を植物に導入することができることが理解される。そのような除草剤耐性又は除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬ蛋白質は、除草剤耐性又は除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬポリヌクレオチドにコードされる。代替的には、除草剤耐性又は除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬ蛋白質は、植物又はその祖先のゲノムにおける内在性ＡＨＡＳＬ遺伝子の天然由来又は誘発突然変異の結果として植物に生じてもよい。
【００２８】
本発明は、少なくとも１つの除草剤、詳細には、ＡＨＡＳ酵素の活性を妨害する除草剤、より詳細には、イミダゾリノン系又はスルホニルウレア系除草剤に対する耐性を含む高蛋白質コムギ植物及び植物組織、植物細胞及びその穀粒を提供する。除草剤の好ましい量又は濃度は、「有効量」又は「有効濃度」である。「有効量」及び「有効濃度」とは、それぞれ、類似野生型植物、植物組織、植物細胞、小胞子又は宿主細胞を死滅させ、或いはその成長を阻害するのに十分な量及び濃度であるが、前記量では本発明の除草剤抵抗性植物、植物組織、植物細胞、小胞子及び宿主細胞を死滅させ、或いはそれらの成長を著しく阻害しない。典型的には、除草剤の有効量は、対象とする雑草を枯死させるために農業生産システムにおいて日常的に用いられる量である。そのような量は当業者には公知であり、或いは当該技術分野において公知の方法を用いて容易に求めることができる。更に、農業生産システムにおける除草剤の有効量は、例えば、下述の実施例１における小胞子培養系のような植物培養系に対する除草剤の有効量と実質的に異なり得ることが理解される。
【００２９】
本発明の除草剤は、除草剤の存在下、ＡＨＡＳ活性が低下するように、ＡＨＡＳ酵素の活性を妨害する除草剤である。そのような除草剤もまた本明細書で「ＡＨＡＳ阻害除草剤」又は単に「ＡＨＡＳ阻害剤」とも称される場合がある。本明細書で用いられるように、「ＡＨＡＳ阻害除草剤」又は「ＡＨＡＳ阻害剤」は、ＡＨＡＳ酵素の活性を妨害する単一の除草剤を意味するものではない。従って、別段の記載がない限り、或いは文脈から明らかでない限り、「ＡＨＡＳ阻害除草剤」又は「ＡＨＡＳ阻害剤」は１つの除草剤又は２，３，４若しくはそれ以上の除草剤の混合物でよく、それらの各々がＡＨＡＳ酵素の活性を妨害し得る。
【００３０】
「類似野生型コムギ植物」とは、本明細書で開示される高蛋白質穀粒及び除草剤抵抗性特性を欠いたコムギ植物とするものである。従って、「野生型」という用語の使用は、植物、植物組織、植物細胞又は他の宿主細胞がそのゲノムに組換えＤＮＡを欠き、且つ／或いは本明細書で開示されるものと異なる除草剤抵抗性特性を有さないということを示唆するものではない。
【００３１】
本発明の植物は非トランスジェニック及びトランスジェニック植物を共に含む。「非トランスジェニック植物」とは、そのゲノムに組換えＤＮＡを欠いた植物を意味するものとする。「トランスジェニック植物」とは、そのゲノムに組換えＤＮＡを含む植物を意味するものとする。そのようなトランスジェニック植物は、組換えＤＮＡを植物のゲノムに導入することによって作製され得る。そのような組換えＤＮＡがトランスジェニック植物のゲノムに組み込まれると、該植物の子孫も組換えＤＮＡを含む。少なくとも１つの祖先トランスジェニック植物の少なくとも一部分の組換えＤＮＡを含む子孫植物もトランスジェニック植物である。
【００３２】
本発明は、コムギＡＨＡＳＬ１Ａ蛋白質の既知の保存領域内にある、アミノ酸位置５７９におけるアミノ酸置換を有するＡＨＡＳＬ１Ａ蛋白質を含むコムギ植物を含む。下記表４を参照されたい。そのようなアミノ酸位置は、アミノ酸が、例えば、アミノ酸配列のＮ末端に付加されるのか、或いは該Ｎ末端から除去されるのかにより、変化し得るということを当業者は理解するであろう。従って、本発明は、前述の位置又は等価な位置（例えば、「アミノ酸位置５７９又は等価な位置」）におけるアミノ酸置換を有するコムギＡＨＡＳＬ１Ａ蛋白質を包含する。「等価な位置」とは、例示のアミノ酸位置と同じ保存領域内にある位置を意味するものとする。下記表４を参照されたい。コムギＡＨＡＳＬ１Ａ蛋白質のアミノ酸５７９と等価な位置がシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＡＨＡＳＬ１Ａ蛋白質のアミノ酸６５３であるため、本発明の分野において十分に受け入れられている命名法に従うように、アミノ酸位置５７９におけるセリンからアスパラギンへの置換を有するコムギＡＨＡＳＬ１Ａ蛋白質は、本明細書ではシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＡＨＡＳＬ１Ａ蛋白質のアミノ酸配列に基づくコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ蛋白質とも称される。同様に、コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ蛋白質をコードする遺伝子又はポリヌクレオチドは、本明細書ではコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子又はコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎポリヌクレオチドと称される。
【００３３】
本発明は、ＡＨＡＳ酵素の活性を妨害する少なくとも１つの除草剤に対する耐性又は抵抗性の亢進を含む高蛋白質コムギ植物に関する。そのようなＡＨＡＳ阻害除草剤には、イミダゾリノン系除草剤、スルホニルウレア系除草剤、トリアゾロピリミジン系除草剤、ピリミジニルオキシベンゾアート系除草剤、スルホニルアミノ・カルボニルトリアゾリノン系除草剤又はこれらの混合物が含まれる。ＡＨＡＳ阻害除草剤はイミダゾリノン系除草剤であることが好ましい。本発明では、イミダゾリノン系除草剤には、限定されないが、ＰＵＲＳＵＩＴ（登録商標）（イマゼタピル）、ＣＡＤＲＥ（登録商標）（イマザピック）、ＲＡＰＴＯＲ（登録商標）（イマザモックス）、ＳＣＥＰＴＥＲ（登録商標）（イマザキン）、ＡＳＳＥＲＴ（登録商標）（イマゼタベンズ）、ＡＲＳＥＮＡＬ（登録商標）（イマザピル）、前述の任意の除草剤の誘導体及び前述の２つ若しくはそれ以上の除草剤の混合物、例えば、イマザピル／イマザモックス（ＯＤＹＳＳＥＹ（登録商標））が含まれる。より具体的には、イミダゾリノン系除草剤は、限定されないが、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−ｉｍｉｄｉａｚｏｌｉｎ−２−イル）−ニコチン酸、［２−（４−イソプロピル）−４−］［メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−３−キノリンカルボン］酸、［５−エチル−２−（４−イソプロピル−］４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−（メトキシメチル）−ニコチン酸、［２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−］イミダゾリン−２−イル）−５−メチルニコチン酸及びメチル［６−（４−イソプロピル−４−］メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｍ−トルイル酸とメチル［２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−］オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｐ−トルイル酸との混合物から選択され得る。５−エチル−２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸及び［２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−］イル）−５−（メトキシメチル）−ニコチン酸が好ましい。［２−（４−イソプロピル−４−］メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−（メトキシメチル）−ニコチン酸が特に好ましい。
【００３４】
スルホニルウレア系除草剤には、限定されないが、クロルスルフロン、メトスルフロンメチル、スルホメツロンメチル、クロリムロンエチル、チフェンスルフロンメチル、トリベヌロンメチル、ベンスルフロンメチル、ニコスルフロン、エタメツスルフロンメチル、リムスルフロン、トリフルスルフロンメチル、トリアスルフロン、プリミスルフロンメチル、シノスルフロン、アミドスルフロン（ａｍｉｄｏｓｕｌｆｉｕｏｎ）、フラザスルフロン、イマゾスルフロン、ピラゾスルフロンエチル、ハロスルフロン、アジムスルフロン、シクロスルフロン、エトキシスルフロン、フラザスルフロン、フルピルスルフロンメチル、ホラムスルフロン、ヨードスルフロン、オキサスルフロン、メソスルフロン、プロスルフロン、スルホスルフロン、トリフルオキシスルフロン、トリトスルフロン、前述の任意の除草剤の誘導体及び前述の２つ若しくはそれ以上の除草剤の混合物が含まれる。本発明のトリアゾロピリミジン系除草剤には、限定されないが、クロランスラム、ジクロスラム、フロラスラム、フルメツラム、メトスラム及びペノキススラムが含まれる。本発明のピリミジニルオキシベンゾアート系除草剤には、限定されないが、ビスピリバック、ピリチオバック、ピリミノバック、ピリベンゾキシム及びピリフタリドが含まれる。スルホニルアミノ・カルボニルトリアゾリノン系除草剤には、限定されないが、フルカルバゾン及びプロポキシカルバゾンが含まれる。
【００３５】
ピリミジニルオキシベンゾアート系除草剤はピリミジニルチオベンゾアート系除草剤と密接に関連し、米国雑草学会（Ｗｅｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）により、後者の名称の見出しを元に一般化されるものと理解される。従って、本発明の除草剤には、限定されないが、上述のピリミジニルオキシベンゾアート系除草剤を含むピリミジニルチオベンゾアート系除草剤が更に含まれる。
【００３６】
本発明は、高蛋白質コムギ植物を作出するため、コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子の少なくとも１つのコピーをコムギ植物のゲノムに導入する工程を含む、高蛋白質コムギ植物を作出する方法を提供する。本発明の一実施形態では、本発明のコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎポリヌクレオチドに作動可能に結合したプロモーターを含むポリヌクレオチドコンストラクトでコムギ植物を形質転換することにより、コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子の少なくとも１つのコピーがコムギ植物に導入される。該方法は、本発明のポリヌクレオチドコンストラクトを少なくとも１つの植物細胞に導入する工程と、そこから形質転換植物を再生する工程とを含む。該方法は、植物細胞における遺伝子発現を促進することが可能なプロモーターの使用を更に含む。好ましくは、そのようなプロモーターは、特に、蛋白質蓄積が生じることが知られている期間に、成長段階のコムギ穀粒において発現を促進するプロモーターである。そのようなプロモーターには、例えば、構成的プロモーター及び種子優先の（ｓｅｅｄ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）プロモーターが含まれる。この方法によって作出されるコムギ植物は、類似の非形質転換コムギ植物と比べ、ＡＨＡＳ活性、特に、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性の増大及び穀粒蛋白質含量の増加を含む。
【００３７】
本明細書での「ポリヌクレオチドコンストラクト」という用語の使用は、本発明を、ＤＮＡを含むポリヌクレオチドコンストラクトに限定するものではない。ポリヌクレオチドコンストラクト、特に、リボヌクレオチド及びリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドとの組合せからなるポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドも、本明細書で開示される方法において用いられてもよいということを当業者は理解するであろう。従って、本発明のポリヌクレオチドコンストラクトは、植物を形質転換するための本発明の方法において用いることが可能なポリヌクレオチドコンストラクトを包含し、これには、限定されないが、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド及びそれらの組合せからなるポリヌクレオチドコンストラクトが含まれる。そのようなデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドは天然分子及び合成類似体を含む。本発明のポリヌクレオチドコンストラクトは、一本鎖形態、二本鎖形態、ヘアピン、ステム・ループ構造などを含むがこれらに限定されない、あらゆる形態のポリヌクレオチドコンストラクトも包含する。更に、本明細書で開示される各ヌクレオチド配列は該例示ヌクレオチド配列の相補体も包含することも当業者には理解される。
【００３８】
更に、本発明のポリヌクレオチドの植物における発現のため、典型的には、該ポリヌクレオチドは対象とする植物における遺伝子発現を促進することが可能なプロモーターに作動可能に結合されることが理解される。本発明の方法は特定のプロモーターに依存しない。該方法は、当該技術分野において公知であって、対象とする植物における遺伝子発現を促進することが可能な任意のプロモーターの使用を包含する。
【００３９】
一部の実施形態では、本発明の方法は、コムギ植物における発現のための発現カセットに供されるコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎポリヌクレオチドでコムギ植物を形質転換する工程を含む。該カセットはコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎポリヌクレオチドに作動可能に結合した５’及び３’調節配列を含む。「作動可能に結合」とは、プロモーターと第二の配列との機能的結合を意味し、該プロモーター配列は該第二の配列に対応するＤＮＡ配列の転写を開始・媒介する。一般に、作動可能に結合とは、結合される核酸配列が連続的であるということであり、必要な場合、連続的に同じリーディングフレーム内に２つの蛋白質コード領域を結合する。該カセットは生物に同時形質転換される、少なくとも１つの追加遺伝子を更に含んでもよい。代替的には、該追加遺伝子は複数の発現カセットに供せられ得る。
【００４０】
そのような発現カセットは、調節領域の転写調節下となるコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎポリヌクレオチドの挿入のための複数の制限部位を備える。該発現カセットは選択マーカー遺伝子を更に含んでもよい。
【００４１】
該発現カセットは５’−３’転写方向に、植物において機能的な転写・翻訳開始領域（即ち、プロモーター）、本発明のコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎポリヌクレオチド及び転写・翻訳終止領域（即ち、終止領域）を含む。該プロモーターは植物宿主及び／又はコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎポリヌクレオチドに対して天然又は類似或いは外来性又は異種であってもよい。加えて、該プロモーターは天然配列、又は代替的には、合成配列であってもよい。該プロモーターが植物宿主に対して「外来性」又は「異種」である場合、該プロモーターが導入される天然植物に該プロモーターは見出されないということである。該プロモーターがコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎポリヌクレオチドに対して「外来性」又は「異種」である場合、該プロモーターは、作動可能に結合されるコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎポリヌクレオチドに対する天然プロモーターではないということである。本明細書で用いられるように、キメラ遺伝子は、コード配列に対して異種である転写開始領域に作動可能に結合したコード配列を含む。
【００４２】
異種プロモーターを用いてコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎポリヌクレオチドを発現させることが好ましいかもしれないが、天然プロモーター配列を用いてもよい。そのようなコンストラクトは植物又は植物細胞におけるコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ蛋白質の発現レベルを変化させ得る。従って、植物又は植物細胞の表現型が変わる。
【００４３】
該終止領域は、転写開始領域に対して天然であってもよく、作動可能に結合されるコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎポリヌクレオチドに対して天然であってもよく、植物宿主に対して天然であってもよく、或いは別の供給源に由来していてもよい（即ち、プロモーター、対象とするコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎポリヌクレオチド、植物宿主又はそれらの任意の組合せに対して外来性又は異種）。好都合な終止領域は、アグロバクテリウムツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉプラスミドから得られ、例えば、オクトピン合成酵素及びノパリン合成酵素終止領域である。Ｇｕｅｒｉｎｅａｕら（１９９Ｉ）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６２：１４１−１４４；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９９１）Ｃｅｌｌ ６４：６７１−６７４；Ｓａｎｆａｃｏｎら（１９９１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５：１４１−１４９；Ｍｏｇｅｎら（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：１２６１−１２７２；Ｍｕｎｒｏｅら（１９９０）Ｇｅｎｅ ９１：１５１−１５８；Ｂａｌｌａｓら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：７８９１−７９０３；及びＪｏｓｈｉら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１５：９６２７−９６３９も参照されたい。
【００４４】
適宜、遺伝子は形質転換植物における発現増大のために最適化されてもよい。即ち、発現向上のための植物優先（ｐｌａｎｔ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）コドンを用いて遺伝子を合成することができる。例えば、宿主優先（ｈｏｓｔ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）コドンの使用の考察については、Ｃａｍｐｂｅｌｌ及びＧｏｗｒｉ（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９２：１−１１を参照されたい。植物優先（ｐｌａｎｔ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）遺伝子を合成する方法は当該技術分野において利用可能である。例えば、米国特許第５，３８０，８３１号及び第５，４３６，３９１号並びにＭｕｒｒａｙら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：４７７−４９８を参照されたい。これらは参照して本明細書に組み込まれる。
【００４５】
更なる配列の修飾が細胞宿主における遺伝子発現を亢進させることが周知である。これらには、疑似ポリアデニリル化シグナル、エクソン・イントロンスプライス部位シグナルをコードする配列、トランスポゾン様反復配列及び遺伝子発現に有害となってもよい、他のそのような十分に特徴づけられた配列の除去が含まれる。配列のＧ−Ｃ含量は、宿主細胞に発現される既知の遺伝子を参考にして計算することにより、所定の細胞宿主に平均的なレベルに調整されてもよい。可能な場合、予測されるヘアピン二次ｍＲＮＡ構造を回避するため、配列は修飾される。
【００４６】
遺伝子発現を亢進させるためのヌクレオチド配列を植物発現ベクターに用いることもできる。これらには、トウモロコシＡｄｈＩのイントロン、イントロン１遺伝子（Ｃａｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １：１１８３−１２００，１９８７）並びにタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、トウモロコシクロロティックモットルウイルス及びアルファルファモザイクウイルス由来のリーダー配列（Ｗ配列）（Ｇａｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１５：８６９３−８７１１，１９８７及びＳｋｕｚｅｓｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：６５−７９，１９９０）が含まれる。トウモロコシのＳｈｒｕｎｋｅｎ−１遺伝子座の第一イントロンは、キメラ遺伝子コンストラクトにおける遺伝子の発現を増大させることが示されている。米国特許第５，４２４，４１２号及び第５，５９３，８７４号は遺伝子発現コンストラクトにおける特定のイントロンの使用を開示しており、Ｇａｌｌｉｅら（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０６：９２９−９３９，１９９４）も組織特異的ベースで遺伝子発現を調節するのにイントロンが有用であることを示している。ＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子の発現を更に亢進させ、或いは最適化するため、本発明の植物発現ベクターはマトリックス結合領域（ＭＡＲｓ）を含むＤＮＡ配列も含んでもよい。そのような改変発現系で形質転換された植物細胞は、次に、本発明のヌクレオチド配列の過剰発現又は構成的発現を示してもよい。
【００４７】
該発現カセットは発現カセットコンストラクトに５’リーダー配列を更に含んでもよい。そのようなリーダー配列は翻訳を促進するように作用することができる。翻訳リーダーは当該技術分野において公知であり、ピコルナウイルスリーダー、例えば、ＥＭＣＶリーダー（脳心筋炎５’非コード領域）（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６１２６−６１３０）；ポチウイルスリーダー、例えば、ＴＥＶリーダー（タバコエッチウイルス）（Ｇａｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ １６５（２ ）：２３３−２３８）、ＭＤＭＶリーダー（トウモロコシ萎縮モザイクウイルス）（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５４：９−２０）及びヒト免疫グロブリン重鎖結合蛋白質（ＢｉＰ）（Ｍａｃｅｊａｋ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５３：９０−９４）；アルファルファモザイクウイルスの外殻蛋白質ｍＲＮＡ由来の非翻訳リーダー（ＡＭＶ ＲＮＡ ４）（Ｊｏｂｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２５：６２２−６２５）；タバコモザイクウイルスリーダー（ＴＭＶ）（Ｇａｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ＲＮＡ，ｅｄ．Ｃｅｃｈ（Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２３７−２５６）；並びにトウモロコシクロロティックモットルウイルスリーダー（ＭＣＭＶ）（Ｌｏｍｍｅｌ ｅｔ ａｌ（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８１：３８２−３８５）を含む。Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａら（１９８７）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４：９６５−９６８も参照されたい。翻訳を促進することが公知の他の方法、例えば、イントロンなども用いることができる。
【００４８】
該発現カセットを調製する際、適切な配向、また、必要に応じて適切なリーディングフレームでのＤＮＡ配列を提供するため、種々のＤＮＡ断片が操作されてもよい。これを目的として、ＤＮＡ断片を結合するのにアダプター又はリンカーが用いられてもよく、或いは好都合な制限部位、余分なＤＮＡの除去、制限部位の除去などを付与するため、他の操作が関与してもよい。これを目的として、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの突然変異生成、プライマー修復、制限、アニーリング、再置換、例えば、トランスバージョン及びトランジションが関与してもよい。
【００４９】
本発明の実施において多くのプロモーターを用いることができる。プロモーターは所望の結果に基づいて選択することができる。核酸は植物における発現のための構成的、組織優先（ｔｉｓｓｕｅ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）又は他のプロモーターと結合され得る。
【００５０】
そのような構成的プロモーターには、例えば、ＷＯ ９９／４３８３８及び米国特許第６，０７２，０５０号に開示されているＲｓｙｎ７プロモーターのコアプロモーター及び他の構成的プロモーター；コアＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０−８１２）；ライスアクチン（ＭｃＥｌｒｏｙ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：１６３−１７１）；ユビキチン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：６１９−６３２及びＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５−６８９）；ｐＥＭＵ（Ｌａｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８１：５８１−５８８）；ＭＡＳ（Ｖｅｌｔｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：２７２３−２７３０）；ＡＬＳプロモーター（米国特許第５，６５９，０２６号）などが含まれる。他の構成的プロモーターには、例えば、米国特許第５，６０８，１４９号；第５，６０８，１４４号；第５，６０４，１２１号；第５，５６９，５９７号；第５，４６６，７８５号；第５，３９９，６８０号；第５，２６８，４６３号；第５，６０８，１４２号；及び第６，１７７，６１１号が含まれる。
【００５１】
組織優先の（ｔｉｓｓｕｅ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）プロモーターは、特定の植物組織内でのＡＨＡＳＬ１発現の亢進を目的とするのに用いられ得る。そのような組織優先の（ｔｉｓｓｕｅ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）プロモーターには、限定されないが、葉優先の（ｌｅａｆ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）プロモーター、根優先の（ｒｏｏｔ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）プロモーター、種子優先の（ｓｅｅｄ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）プロモーター及び茎優先の（ｓｔｅｍ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）プロモーターが含まれる。組織優先の（ｔｉｓｓｕｅ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）プロモーターには、Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｊ．１２（２）：２５５−２６５；Ｋａｗａｍａｔａら（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３８（７）：７９２−８０３；Ｈａｎｓｅｎら（１９９７）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．２５４（３）：３３７−３４３；Ｒｕｓｓｅｌｌら（１９９７）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．６（２）：１５７−１６８；Ｒｉｎｅｈａｒｔら（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（３）：１３３１−１３４１；Ｖａｎ Ｃａｍｐら（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（２）：５２５−５３５；Ｃａｎｅｖａｓｃｉｎｉら（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（２）：５１３−５２４；Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３５（５）：７７３−７７８；Ｌａｍ（１９９４）Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１８１−１９６；Ｏｒｏｚｃｏら（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２３（６）：１１２９−１１３８；Ｍａｔｓｕｏｋａら（１９９３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０（２０）：９５８６−９５９０；及びＧｕｅｖａｒａ−Ｇａｒｃｉａら（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｊ．４（３）：４９５−５０５が含まれる。そのようなプロモーターは、必要であれば微弱な発現のために改変され得る。
【００５２】
一実施形態では、対象とする核酸は発現のために葉緑体を標的とする。この方法では、対象とする核酸は葉緑体に直接挿入されず、発現カセットは、対象とする遺伝子産物を葉緑体に誘導するため、葉緑体輸送ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む葉緑体標的配列を更に含む。そのような輸送ペプチドは当該技術分野において公知である。葉緑体標的配列に関し、「作動可能に結合」とは、輸送ペプチドをコードする核酸配列（即ち、葉緑体標的配列）がコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎポリヌクレオチドに結合し、該２つの配列が連続的で同じリーディングフレーム内にあるようになるということである。例えば、Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅら（１９９１）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．９：１０４−１２６；Ｃｌａｒｋら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７５４４−１７５５０；Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａら（１９８７）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４：９６５−９６８；Ｒｏｍｅｒら（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９６：１４１４−１４２１；及びＳｈａｈら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：４７８−４８１を参照されたい。本発明のＡＨＡＳＬ１蛋白質は天然葉緑体輸送ペプチドを含むが、本発明の成熟ＡＨＡＳＬ１Ａ蛋白質をコードするヌクレオチド配列の５’末端に葉緑体標的配列を作動可能に結合することにより、当該技術分野において公知の任意の葉緑体輸送ペプチドが、本発明の成熟ＡＨＡＳＬ１Ａ蛋白質のアミノ酸配列に融合され得る。
【００５３】
葉緑体標的配列は当該技術分野において公知であり、リブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）の葉緑体小サブユニット（ｄｅ Ｃａｓｔｒｏ Ｓｉｌｖａ Ｆｉｌｈｏ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０：７６９−７８０；Ｓｃｈｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（５）：３３３５−３３４２）；５−（エノールピルビル）シキミ酸−３−リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）（Ａｒｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．Ｂｉｏｍｅｍｂ．２２（６）：７８９−８１０）；トリプトファン合成酵素（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（１１）：６０８１−６０８７）；プラストシアニン（Ｌａｗｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（３３ ）：２０３５７−２０３６３）；コリスミ酸合成酵素（Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（３６）：２７４４７−２７４５７）；及び集光性クロロフィルａ／ｂ結合蛋白質（ＬＨＢＰ）（Ｌａｍｐｐａ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４９９６−１４９９９）を含む。Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅら（１９９１）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．９：１０４−１２６；Ｃｌａｒｋら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７５４４−１７５５０；Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａら（１９８７）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４：９６５−９６８；Ｒｏｍｅｒら（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９６：１４１４−１４２１；及びＳｈａｈら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：４７８−４８１も参照されたい。
【００５４】
葉緑体の形質転換のための方法も当該技術分野において公知である。例えば、Ｓｖａｂら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：８５２６−８５３０；Ｓｖａｂ及びＭａｌｉｇａ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：９１３−９１７；Ｓｖａｂ及びＭａｌｉｇａ（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：６０１−６０６を参照されたい。該方法は、選択マーカーを含むＤＮＡのパーティクルガンによる送達及び相同組換えによる色素体ゲノムへのＤＮＡの標的化に依存する。加えて、核にコードされ、色素体へ方向づけられるＲＮＡポリメラーゼの組織優先の（ｔｉｓｓｕｅ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）発現による、色素体に運ばれるサイレントトランス遺伝子のトランス活性化により、色素体の形質転換を行うことができる。そのようなシステムは、ＭｃＢｒｉｄｅら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：７３０１−７３０５において報告されている。
【００５５】
葉緑体を標的とする対象とする核酸は、植物核とこの細胞小器官とのコドン使用の相違を考慮し、葉緑体における発現のために最適化されてもよい。このように、対象とする核酸は葉緑体優先の（ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）コドンを用いて合成されてもよい。例えば、米国特許第５，３８０，８３１号を参照されたい。これは参照して本明細書に組み込まれる。
【００５６】
本明細書で開示されるように、本発明は、ＡＨＡＳ阻害除草剤に対する抵抗性を含む高蛋白質コムギ植物を作出する方法を提供する。該コムギ植物は、コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子の少なくとも１つのコピーをそのゲノムに含む。そのような遺伝子は、内在性遺伝子又は本明細書で開示されるようなトランス遺伝子であってもよい。加えて、一部の実施形態では、所望の表現型を有するコムギ植物を作出するため、コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子は、他の除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬ１遺伝子を含む、任意の組合せの対象とするポリヌクレオチド配列を積み重ねることができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の毒素蛋白質のような抗虫活性及び／又は殺虫活性を有するポリペプチドをコードする、他の任意のポリヌクレオチドを積み重ねられてもよい（米国特許第５，３６６，８９２号；第５，７４７，４５０号；第５，７３７，５１４号；第５，７２３，７５６号；第５，５９３，８８１号；及びＧｅｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｇｅｎｅ ４８：１０９に述べられている）。生じる組合せは任意の１つの対象とするポリヌクレオチドの複数コピーも含み得る。
【００５７】
本発明の発現カセットは、形質転換細胞の選抜のための選択マーカー遺伝子を含み得る。本発明の選択マーカー遺伝子を含む選択マーカー遺伝子は、形質転換細胞又は組織の選抜のために用いられる。マーカー遺伝子には、限定されないが、抗生物質抵抗性をコードする遺伝子、例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）及びヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）をコードする遺伝子並びに除草性化合物、例えば、グルホシナートアンモニウム、ブロモキシニル、イミダゾリノン及び２，４−ジクロロフェノキシアセタート（２，４−Ｄ）に対する抵抗性を付与する遺伝子が含まれる。Ｙａｒｒａｎｔｏｎ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３：５０６−５１１；Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６３１４−６３１８；Ｙａｏら（１９９２）Ｃｅｌｌ ７１：６３−７２；Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：２４１９−２４２２；Ｔｈｅ ＯｐｅｒｏｎにおけるＢａｒｋｌｅｙら（１９８０），ｐｐ．１７７−２２０；Ｈｕら（１９８７）Ｃｅｌｌ ４８：５５５−５６６；Ｂｒｏｗｎら（１９８７）Ｃｅｌｌ ４９：６０３−６１２；Ｆｉｇｇｅら（１９８８）Ｃｅｌｌ ５２：７１３−７２２；Ｄｅｕｓｃｈｌｅら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ａｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４００−５４０４；Ｆｕｅｒｓｔら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２５４９−２５５３；Ｄｅｕｓｃｈｌｅら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：４８０−４８３；Ｇｏｓｓｅｎ（１９９３）Ｐｈ．Ｄ．論文、ハイデルベルク大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）；Ｒｅｉｎｅｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１９１７−１９２１；Ｌａｂｏｗら（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３３４３−３３５６；Ｚａｍｂｒｅｔｔｉら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：３９５２−３９５６；Ｂａｉｍら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：５０７２−５０７６；Ｗｙｂｏｒｓｋｉら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４６４７−４６５３；Ｈｉｌｌｅｎａｎｄ−Ｗｉｓｓｍａｎ（１９８９）Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．１０：１４３−１６２；Ｄｅｇｅｎｋｏｌｂら（１９９１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３５：１５９１−１５９５；Ｋｌｅｉｎｓｃｈｎｉｄｔら（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：１０９４−１１０４；Ｂｏｎｉｎ（１９９３）Ｐｈ．Ｄ．論文、ハイデルベルク大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）；Ｇｏｓｓｅｎら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７−５５５１；Ｏｌｉｖａら（１９９２）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３６：９１３−９１９；Ｈｌａｖｋａら（１９８５）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７８（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ社、ベルリン）；Ｇｉｌｌら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：７２１−７２４を全体的に参照されたい。そのような開示内容は参照して本明細書に組み込まれる。
【００５８】
上記一覧の選択マーカー遺伝子は限定的なものではない。本発明において任意の選択マーカー遺伝子を用いることができる。
【００５９】
コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドコンストラクト及び発現カセットは、ベクターにおいてコムギ植物を形質転換するのに用いられ得る。コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎポリヌクレオチドは、単独で、或いは植物における除草剤抵抗性を付与する際のＡＨＡＳ酵素の小サブユニット（ＡＨＡＳＳ）をコードするヌクレオチド配列と組合せ、ベクターにおいて用いられ得る。米国特許第６，３４８，６４３号を参照されたい；これは参照して本明細書に組み込まれる。
【００６０】
本発明は、また、蛋白質含量の増加を有する穀粒を産生するとともに除草剤抵抗性であるトランスジェニックコムギ植物を作出する方法に関し、該方法は、コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎポリヌクレオチドに作動可能に結合した、植物における発現を促進するプロモーターを含むポリヌクレオチドコンストラクトで植物を形質転換する工程を含む。
【００６１】
本発明は、また、非トランスジェニックコムギ植物、本発明の方法によって作出されるトランスジェニックコムギ植物並びにそのような非トランスジェニック及びトランスジェニックコムギ植物の後代及び他の子孫に関し、それらの植物はＡＨＡＳ酵素を妨害する除草剤、特に、イミダゾリノン系及びスルホニルウレア系除草剤に対する抵抗性の亢進又は増大を示し、蛋白質含量が増加した穀粒を産生する。
【００６２】
本発明の高蛋白質コムギ植物は、コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子の少なくとも１つのコピーに加え、１つ又はそれ以上の追加ＡＨＡＳＬポリヌクレオチドをそのゲノムに含み得る。除草剤耐性ＡＨＡＳＬ蛋白質をコードする内在性遺伝子を含むヌクレオチド配列及び除草剤耐性ＡＨＡＳＬ蛋白質をコードする内在性遺伝子を含む除草剤耐性植物は、本発明のポリヌクレオチド及び植物並びに当該技術分野において公知のポリヌクレオチド及び植物を含む。例えば、米国特許第５，０１３，６５９号、第５，７３１，１８０号、第５，７６７，３６１号、第５，５４５，８２２号、第５，７３６，６２９号、第５，７７３，７０３号、第５，７７３，７０４号、第５，９５２，５５３号及び第６，２７４，７９６号を参照されたい；これらはすべて参照して本明細書に組み込まれる。
【００６３】
多くの植物形質転換ベクター及び植物を形質転換する方法を利用できる。例えば、Ａｎ，Ｇ．ら（１９８６）Ｐｌａｎｔ Ｐｙｓｉｏｌ．，８１：３０１−３０５；Ｆｒｙ，Ｊ．ら（１９８７）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．６：３２１−３２５；Ｂｌｏｃｋ，Ｍ．（１９８８）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ．７６：７６７−７７４；Ｃｏｕｓｉｎｓら（１９９１）Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１８：４８１−４９４；Ｃｈｅｅ，Ｐ．Ｐ．及びＳｌｉｇｈｔｏｍ，Ｊ．Ｌ．（１９９２）Ｇｅｎｅ １１８：２５５−２６０；Ｃｈｒｉｓｔｏｕら（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：２３９−２４６；Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎら（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０：３０９−３１４；Ｄｈｉｒら（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９９：８１−８８；Ｃａｓａｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１１２１２−１１２１６；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，Ｐ．（１９９３）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．−Ｐｌａｎｔ；２９Ｐ：１１９−１２４；Ｄａｖｉｅｓら（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１２：１８０−１８３；Ｄｏｎｇ，Ｊ．Ａ．及びＭｃｈｕｇｈｅｎ，Ａ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．９１：１３９−１４８；Ｆｒａｎｋｌｉｎ，Ｃ．Ｉ．及びＴｒｉｅｕ，Ｔ．Ｎ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０２：１６７；Ｇｏｌｏｖｋｉｎら（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．９０：４１−５２；Ｇｕｏ Ｃｈｉｎ Ｓｃｉ．Ｂｕｌｌ．３８：２０７２−２０７８；Ａｓａｎｏら（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１３；Ａｙｅｒｅｓ Ｎ．Ｍ．及びＰａｒｋ，Ｗ．Ｄ．（１９９４）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ．Ｓｃｉ．１３：２１９−２３９；Ｂａｒｃｅｌｏら（１９９４）Ｐｌａｎｔ．Ｊ．５：５８３−５９２；Ｂｅｃｋｅｒら（１９９４）Ｐｌａｎｔ．Ｊ．５：２９９−３０７；Ｂｏｒｋｏｗｓｋａら（１９９４）Ａｃｔａ．Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ．１６：２２５−２３０；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，Ｐ．（１９９４）Ａｇｒｏ．Ｆｏｏｄ．Ｉｎｄ．Ｈｉ Ｔｅｃｈ．５：１７−２７；Ｅａｐｅｎら（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１３：５８２−５８６；Ｈａｒｔｍａｎら（１９９４）Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：９１９９２３；Ｒｉｔａｌａら（１９９４）Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３１７−３２５；並びにＷａｎ，Ｙ．Ｃ．及びＬｅｍａｕｘ，Ｐ．Ｇ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０４：３７４８を参照されたい。
【００６４】
本発明の方法は、ポリヌクレオチドコンストラクトを植物に導入する工程を含む。「ポリヌクレオチドコンストラクトを導入する」とは、該コンストラクトが植物の細胞の内部にアクセスできるように、ポリヌクレオチドコンストラクトを植物に提示することを意味するものとする。本発明の方法は、ポリヌクレオチドコンストラクトを植物に導入するための特定の方法に依存せず、単に、ポリヌクレオチドコンストラクトが植物の少なくとも１つの細胞の内部にアクセスするということである。ポリヌクレオチドコンストラクトを植物に導入する方法は当該技術分野において公知であり、限定されないが、安定形質転換法、一過性形質転換法及びウイルス媒介法を含む。
【００６５】
「安定形質転換」とは、植物に導入されるポリヌクレオチドコンストラクトが植物のゲノムに組み込まれ、その子孫に継承されることが可能であるということである。「一過性形質転換」とは、植物に導入されるポリヌクレオチドコンストラクトが植物のゲノムに組み込まれないということである。
【００６６】
植物及び植物細胞の形質転換のため、コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎポリヌクレオチドは、標準的技法を用いて、植物又は植物細胞におけるヌクレオチド配列の発現に適した、当該技術分野において公知の任意のベクターに挿入される。ベクターの選択は、好ましい形質転換法及び形質転換される標的植物種に依存する。本発明の一実施形態では、コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎポリヌクレオチドは、植物細胞における高レベルの発現で周知の植物プロモーターに作動可能に結合され、次に、このコンストラクトはイミダゾリノン系除草剤の影響を受けやすい植物及びそれが再生した形質転換植物に導入される。該形質転換植物は、非形質転換植物を枯死させ、或いは著しく損傷するであろう、あるレベルのイミダゾリノン系除草剤への曝露に対して耐性である。この方法は如何なる植物種にも適用可能であるが、作物、特に、通常、少なくとも１つの除草剤、特に、イミダゾリノン系除草剤の存在下で生育される作物に適用される場合に最も利益がある。
【００６７】
植物発現カセットを構築し、外来性核酸を植物に導入する方法は、当該技術分野において公知であり、過去に報告されている。例えば、外来性ＤＮＡは腫瘍誘発（Ｔｉ）プラスミドベクターを用いて植物に導入され得る。外来性ＤＮＡの送達のために用いられる他の方法は、ＰＥＧ媒介プロトプラスト形質転換、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション ウィスカー並びにＤＮＡの直接取込みのためのバイオリスティックス又は微粒子銃の使用を含む。そのような方法は当該技術分野において公知である（Ｖａｓｉｌらに付与された米国特許第５，４０５，７６５号；Ｂｉｌａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅ １００：２４７−２５０；Ｓｃｈｅｉｄ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２２８：１０４−１１２；Ｇｕｅｒｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ５２：１１１−１１６；Ｎｅｕｈａｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ．７５：３０−３６；Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２７：７０−７３；Ｈｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９８０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０８：１２６５；Ｈｏｒｓｃｈ ｅｔ αｌ．，（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７：１２２９−１２３１；ＤｅＢｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ９１ ：６９４−７０１；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，ｅｄｓ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８８）及びＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｃｈｕｌｅｒ ａｎｄ Ｚｉｅｌｉｎｓｋｉ，ｅｄｓ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８９））。形質転換の方法は、形質転換される植物細胞、使用ベクターの安定性、遺伝子産物の発現レベル及び他のパラメータに依存する。
【００６８】
ヌクレオチド配列を植物細胞に導入し、続いて植物ゲノムに挿入する他の好適な方法には、Ｃｒｏｓｓｗａｙら（１９８６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：３２０−３３４のようなマイクロインジェクション；Ｒｉｇｇｓら（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：５６０２−５６０６に報告されているようなエレクトロポレーション；Ｔｏｗｎｓｅｎｄら、米国特許第５，５６３，０５５号、Ｚｈａｏら、米国特許第５，９８１，８４０号に述べられているようなアグロバクテリウム媒介形質転換；Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：２７１７−２７２２に報告されているような遺伝子直接導入；及び、例えば、Ｓａｎｆｏｒｄら、米国特許第４，９４５，０５０号；Ｔｏｍｅｓら、米国特許第５，８７９，９１８号；Ｔｏｍｅｓら、米国特許第５，８８６，２４４号；Ｂｉｄｎｅｙら、米国特許第５，９３２，７８２号；Ｔｏｍｅｓら（１９９５）「微粒子銃による無傷植物細胞へのＤＮＡ直接導入（Ｄｉｒｅｃｔ ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ Ｉｎｔａｃｔ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌｓ ｖｉａ Ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）」、植物細胞、組織及び器官の培養：基本的方法（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ）、Ｇａｍｂｏｒｇ及びＰｈｉｌｌｉｐｓ（編）（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ社、ベルリン）；ＭｃＣａｂｅら（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：９２３−９２６に述べられているような弾道粒子加速；並びにＬｅｃ１形質転換（ＷＯ ００／２８０５８）が含まれる。Ｗｅｉｓｓｉｎｇｅｒら（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：４２１−４７７；Ｓａｎｆｏｒｄら（１９８７）Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：２７−３７（タマネギ）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕら（１９８８）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８７：６７１−６７４（ダイズ）；ＭｃＣａｂｅら（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：９２３−９２６（ダイズ）；Ｆｉｎｅｒ及びＭｃＭｕｌｌｅｎ（１９９１）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２７Ｐ：１７５−１８２（ダイズ）；Ｓｉｎｇｈら（１９９８）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．９６：３１９−３２４（ダイズ）；Ｄａｔｔａら（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：７３６−７４０（コメ）；Ｋｌｅｉｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：４３０５−４３０９（トウモロコシ）；Ｋｌｅｉｎら（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：５５９−５６３（トウモロコシ）；Ｔｏｍｅｓ、米国特許第５，２４０，８５５号；Ｂｕｉｓｉｎｇら、米国特許第５，３２２，７８３号及び第５，３２４，６４６号；Ｔｏｍｅｓら（１９９５）「微粒子銃による無傷植物細胞へのＤＮＡ直接導入（Ｄｉｒｅｃｔ ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ Ｉｎｔａｃｔ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌｓ ｖｉａ Ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）」、植物細胞、組織及び器官の培養：基本的方法（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ）、Ｇａｍｂｏｒｇ（編）（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ社、ベルリン）（トウモロコシ）；Ｋｌｅｉｎら（１９８８）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：４４０−４４４（トウモロコシ）；Ｆｒｏｍｍら（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：８３３−８３９（トウモロコシ）；Ｈｏｏｙｋａａｓ−Ｖａｎ Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ（ロンドン）３１１：７６３−７６４；Ｂｏｗｅｎら、米国特許第５，７３６，３６９号（穀類）；Ｂｙｔｅｂｉｅｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：５３４５−５３４９（ユリ科）；Ｄｅ Ｗｅｔら（１９８５）、胚珠組織の実験的操作（Ｔｈｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｖｕｌｅ Ｔｉｓｓｕｅｓ）、Ｃｈａｐｍａｎら（編）（Ｌｏｎｇｍａｎ社、ニューヨーク）、ｐｐ．１９７−２０９（花粉）；Ｋａｅｐｐｌｅｒら（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ９：４１５−４１８及びＫａｅｐｐｌｅｒら（１９９２）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８４：５６０−５６６（ウィスカー媒介形質転換）；Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎら（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ４：１４９５−１５０５（エレクトロポレーション）；Ｌｉら（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １２：２５０−２５５並びにＣｈｒｉｓｔｏｕ及びＦｏｒｄ（１９９５）Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙ ７５：４０７−４１３（コメ）；Ｏｓｊｏｄａら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：７４５−７５０（アグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）によるトウモロコシ）も参照されたい。；これらはすべて参照して本明細書に組み込まれる。
【００６９】
本発明のコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎポリヌクレオチドは、植物をウイルス又はウイルス核酸に接触させることにより、植物に導入されてもよい。一般的に、そのような方法は、本発明のポリヌクレオチドコンストラクトをウイルスＤＮＡ又はＲＮＡ分子内に取り込む工程を含む。初めに、コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎポリヌクレオチドはウイルスポリ蛋白質の一部として合成されてもよく、次に、これはｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏにて蛋白質分解によって処理され、所望の組換え蛋白質を生成してもよいということが理解される。更に、本発明のプロモーターは、ウイルスＲＮＡポリメラーゼによる転写に用いられるプロモーターも包含するということが理解される。ポリヌクレオチドコンストラクトを植物に導入し、ウイルスＤＮＡ又はＲＮＡ分子を含む、そこでコードされる蛋白質を発現させる方法は当該技術分野において公知である。例えば、米国特許第５，８８９，１９１号、第５，８８９，１９０号、第５，８６６，７８５号、第５，５８９，３６７号及び第５，３１６，９３１号を参照されたい；これらは参照して本明細書に組み込まれる。
【００７０】
形質転換された細胞は従来の方法に従って植物に生育されてもよい。例えば、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋら（１９８６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５：８１−８４を参照されたい。次に、これらの植物は生育され、同じ形質転換株又は異なる株と受粉されてもよく、その結果生じる、所望の表現型特性の構成的発現を有する交配種が特定される。所望の表現型特性の発現が確実に安定に維持・継承されるように、２又は３世代が生育されてもよく、次に、所望の表現型特性の発現が確実になされているように、種子が収穫される。このように、本発明は、そのゲノムに安定に組み込まれた本発明のポリヌクレオチドコンストラクト、例えば、本発明の発現カセットを有する形質転換種子（「トランスジェニック種子」とも称する）を提供する。
【００７１】
本発明の高蛋白質コムギ植物は雑草を防除する方法に用途を見出す。従って、本発明は、本発明の高蛋白質コムギ植物近傍の雑草を防除する方法を更に提供する。該方法は、有効量の除草剤を雑草及び高蛋白質コムギ植物に塗布する工程を含み、高蛋白質コムギ植物は類似野生型コムギ植物と比べ、少なくとも１つの除草剤、特に、イミダゾリノン系又はスルホニルウレア系除草剤に対する抵抗性の増大を有する。
【００７２】
除草剤、特に、イミダゾリノン系及びスルホニルウレア系除草剤に対する抵抗性の増大を有する高蛋白質コムギ植物を提供することにより、植物の生育を亢進させ、栄養競合を低減するため、植物を雑草から防御するための多彩な製剤が用いられ得る。除草剤はそれ自体で、出芽前、出芽後、栽植前に、また、本明細書で述べる植物を取り囲む領域における雑草の栽植時防除に用いることができ、或いは他の添加剤を含むイミダゾリノン系除草剤製剤を用いることができる。除草剤は種子処理としても用いることができる。それは有効濃度又は有効量の除草剤であり、或いは有効濃度又は有効量の除草剤を含む組成物が、播種前又は播種時に直接種子に塗布され得る。イミダゾリノン系又はスルホニルウレア系除草剤製剤又は組成物に見出される添加剤には、他の除草剤、浄化剤、補助剤、展着剤、固着剤、安定剤などが含まれる。除草剤製剤は湿性又は乾燥調製物であり得、限定されないが、流動性粉末、エマルジョン及び液体濃縮物を含み得る。除草剤及び除草剤製剤は、従来の方法、例えば、噴霧、灌注、散布、被覆などに従って塗布することができる。
【００７３】
本発明は、有性生殖を含む従来の植物育種によって高蛋白質コムギ植物を作出する方法を提供する。該方法は、Ｆ１子孫を作出するため、コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子又はポリヌクレオチドの少なくとも１つのコピーをそのゲノムに含む第一の親コムギ植物を第二の親コムギ植物と交配する工程を含む。該第一の植物は本発明の任意の高蛋白質コムギ植物でよく、例えば、コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子の少なくとも１つのコピーを含むトランスジェニックコムギ植物又は及びコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子を含む非トランスジェニックコムギ植物、例えば、ＷＯ ２００４／１０６５２９並びに米国特許出願公開第２００４／０２３７１３４及び第２００４／０２４４０８０号（これらはすべて参照して本明細書に組み込まれる）に開示されているような突然変異生成によって作出されるコムギ植物を含む。該第二の親コムギ植物は、該第一の植物と交配されると、生存可能な子孫コムギ植物（即ち、種子）を産生することができる任意のコムギ植物でよい。典型的であるが必然的ではなく、該第一及び第二の親コムギ植物は同種コムギである。該方法はＦ１子孫を自家受粉させてＦ２子孫を作出する工程を更に含み得る。加えて、本発明の方法は、Ｆ１又はＦ２子孫植物の該第一又は第二の親コムギ植物と同じ系統又は遺伝子型の植物との戻し交配の第一又はそれ以降の世代を更に含み得る。或いは、第一の交配のＦ１子孫又は任意の後続交配種は、該第一又は第二の植物といずれとも異なる系統又は遺伝子型の第三のコムギ植物と交配され得る。本発明の方法は、例えば、コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子を含む子孫コムギ植物に有効量の除草剤を塗布することにより、或いはＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子を検出する標準的方法、例えば、ＰＣＲのような方法により、該第一の植物の除草剤抵抗性特性を含む植物を選抜する工程を更に含み得る。
【００７４】
本発明は、ＡＨＡＳ阻害除草剤の使用に関わる方法を提供する。これらの方法では、ＡＨＡＳ阻害除草剤は当該技術分野において公知の任意の方法によって塗布され得、これには、限定されないが、種子処理、土壌処理及び葉面処理が含まれる。
【００７５】
塗布前、ＡＨＡＳ阻害除草剤は、通例の製剤、例えば、溶液、エマルジョン、懸濁剤、粉剤、粉末、糊剤及び顆粒に変換され得る。使用形態は個々の使用目的に依存し、各場合、本発明による化合物の微細且つ均一な分布を確実にする必要がある。
【００７６】
製剤は、既知の方法（例えば、概説では、米国特許第３，０６０，０８４号、欧州特許出願７０７ ４４５号（液体濃縮物）、Ｂｒｏｗｎｉｎｇ「凝集（Ａｇｇｌｏｍｅｒａｔｉｏｎ）」、化学工学（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、１９６７年１２月４日、１４７−４８、ペリーの化学技術者ハンドブック（Ｐｅｒｒｙ’ｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒ’ｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ）、第４版、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ社、ニューヨーク、１９６３，８−５７頁及び以下参照として、ＷＯ ９１／１３５４６、米国特許第４，１７２，７１４号、米国特許第４，１４４，０５０号、米国特許第３，９２０，４４２号、米国特許第５，１８０，５８７号、米国特許第５，２３２，７０１号、米国特許第５，２０８，０３０号、英国特許第２，０９５，５５８号、米国特許第３，２９９，５６６号、Ｋｌｉｎｇｍａｎ、科学としての雑草防除（Ｗｅｅｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｓ ａ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、１９６１，Ｈａｎｃｅら、雑草防除ハンドブック（Ｗｅｅｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ）、第８版、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ社、オックスフォード、１９８９並びにＭｏｌｌｅｔ，Ｈ．，Ｇｒｕｂｅｍａｎｎ，Ａ．、配合技術（Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｗｉｌｅｙ ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ、ワインハイム（Ｗｅｉｎｈｅｉｍ）（ドイツ）、２００１，２．Ｄ．Ａ．Ｋｎｏｗｌｅｓ、農芸化学的配合の化学及び技術（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｇｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ）、Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ社、ドルドレヒト（Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ）、１９９８（ＩＳＢＮ ０−７５１４−０４４３−８）を参照されたい）、例えば、農薬の配合に好適な助剤、例えば、溶剤及び／又は担体、所望により、乳化剤、界面活性剤及び分散剤、防腐剤、消泡剤、抗凍結剤で、種子処理の配合には更に場合により着色剤及び／又は結合剤及び／又はゲル化剤で活性化合物を伸長させることによって調製される。
【００７７】
好適な溶剤例は、水、芳香族溶剤（例えば、Ｓｏｌｖｅｓｓｏ製品、キシレン）、パラフィン（例えば、鉱油留分）、アルコール（例えば、メタノール、ブタノール、ペンタノール、ベンジルアルコール）、ケトン（例えば、シクロヘキサノン、ガンマ−ブチロラクトン）、ピロリドン（ＮＭＰ，ＮＯＰ）、アセタート（グリコールジアセタート）、グリコール、脂肪酸ジメチルアミド、脂肪酸及び脂肪酸エステルである。原則として溶剤混合物も用いられてもよい。
【００７８】
好適な担体例は、研削天然鉱物（例えば、カオリン、粘土、タルク、チョーク）及び研削合成鉱物（例えば、高分散シリカ、ケイ酸塩）である。
【００７９】
好適な乳化剤は、非イオン性及びアニオン系乳化剤である（例えば、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル、アルキルスルホン酸塩及びアリールスルホン酸塩）。
【００８０】
好適な分散剤例は、リグニン−亜硫酸廃液及びメチルセルロースである。
【００８１】
用いられる好適な界面活性剤は、リグノスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、フェノールスルホン酸、ジブチルナフタレンスルホン酸、アルキルアリールスルホン酸塩、アルキル硫酸塩、アルキルスルホン酸塩、脂肪アルコールスルホン酸塩、脂肪酸及び硫酸化脂肪アルコールグリコールエーテルのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩並びにアンモニウム塩、更に、スルホン化ナフタレン及びナフタレン誘導体のホルムアルデヒドとの凝縮物、ナフタレン又はナフタレンスルホン酸のフェノール及びホルムアルデヒドとの凝縮物、ポリオキシエチレンオクチルフェノールエーテル、エトキシル化イソオクチルフェノール、オクチルフェノール、ノニルフェノール、アルキルフェノールポリグリコールエーテル、トリブチルフェニルポリグリコールエーテル、トリステアリルフェニルポリグリコールエーテル、アルキルアリールポリエーテルアルコール、アルコール及び脂肪アルコールエチレンオキシド凝縮物、エトキシル化ヒマシ油、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、エトキシル化ポリオキシプロピレン、ラウリルアルコールポリグリコールエーテルアセタール、ソルビトールエステル、リグノ亜硫酸塩廃液並びにメチルセルロースである。
【００８２】
直接噴霧可能な溶液、エマルジョン、糊剤又は油中分散液の調製に好適な物質は、中〜高沸点の鉱油留分、例えば、ケロシン又はディーゼル油、更に、コールタール油並びに植物又は動物由来油、脂肪族、環状及び芳香族炭化水素、例えば、トルエン、キシレン、パラフィン、テトラヒドロナフタレン、アルキル化ナフタレン又はそれらの誘導体、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、シクロヘキサノール、シクロヘキサノン、イソホロン、高極性溶剤、例えば、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドン又は水である。
【００８３】
抗凍結剤、例えば、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール及び殺菌剤も製剤に加えることができる。
【００８４】
好適な消泡剤は、例えば、シリコン又はステアリン酸マグネシウム系の消泡剤である。
【００８５】
好適な防腐剤は、例えば、ジクロロフェン及びエンジルアルコールヘミホルマール（ｅｎｚｙｌａｌｋｏｈｏｌｈｅｍｉｆｏｒｍａｌ）である。
【００８６】
種子処理製剤は結合剤及び場合により着色剤を更に含んでもよい。
【００８７】
処理後、活性物質の種子への付着を向上させるため、結合剤を加えることができる。好適な結合剤はブロックコポリマーＥＯ／ＰＯ界面活性剤であるが、ポリビニルアルコール（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌａｌｃｏｈｏｌｓｌ）、ポリビニルピロリドン、ポリアクリラート、ポリメタクリラート、ポリブテン、ポリイソブチレン、ポリスチレン、ポリエチレンアミン、ポリエチレンアミド、ポリエチレンイミン（Ｌｕｐａｓｏｌ（登録商標）、Ｐｏｌｙｍｉｎ（登録商標））、ポリエーテル、ポリウレタン、ポリビニルアセタート、チロース及びこれらのポリマーから得られるコポリマーでもよい。
【００８８】
場合により、製剤中に着色剤も含まれ得る。種子処理製剤に好適な着色剤又は染料は、ローダミンＢ，Ｃ．Ｉ．顔料赤色１１２，Ｃ．Ｉ．溶剤赤色１、顔料青色１５：４、顔料青色１５：３、顔料青色１５：２、顔料青色１５：１、顔料青色８０、顔料黄色１、顔料黄色１３、顔料赤色１１２、顔料赤色４８：２、顔料赤色４８：１、顔料赤色５７：１、顔料赤色５３：１、顔料橙色４３、顔料橙色３４、顔料橙色５、顔料緑色３６、顔料緑色７、顔料白色６、顔料茶色２５、塩基性紫色１０、塩基性紫色４９、酸性赤色５１、酸性赤色５２、酸性赤色１４、酸性青色９、酸性黄色２３、塩基性赤色１０、塩基性赤色１０８である。
【００８９】
好適なゲル化剤例はカラギーン（Ｓａｔｉａｇｅｌ（登録商標））である。
【００９０】
粉末、展着用の物質及び散布可能な生成物は、活性物質を固体担体と混合し、或いは同時研削することによって調製され得る。
【００９１】
顆粒、例えば、被覆顆粒、含浸顆粒及び均質顆粒は、活性化合物を固体担体に結合することによって調製され得る。固体担体例は、土類鉱物、例えば、シリカゲル、ケイ酸塩、タルク、カオリン、アタクレー（ａｔｔａｃｌａｙ）、石灰石、石灰、チョーク、赤土、黄土、粘土、白雲石、珪藻土、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、酸化マグネシウム、研削合成物質、肥料、例えば、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、ウレア及び植物由来の生成物、例えば、穀粉、樹皮粉、樹木粉及び堅果殻粉、セルロース粉末並びに他の固体担体である。
【００９２】
一般的に、該製剤は０．０１〜９５重量％、好ましくは、０．１〜９０重量％のＡＨＡＳ阻害除草剤を含む。この場合、ＡＨＡＳ阻害除草剤は９０〜１００重量％、好ましくは、９５〜１００重量％の純度にて用いられる（ＮＭＲスペクトルによる）。種子処理を目的として、それぞれの製剤は２〜１０倍希釈され、０．０１〜６０重量％の活性化合物重量、好ましくは、０．１〜４０重量％の使用可能な調製物の濃度となり得る。
【００９３】
ＡＨＡＳ阻害除草剤は、そのように、その製剤形態又はそれから調製される使用形態、例えば、直接噴霧可能な溶液、粉末、懸濁液若しくは分散液、エマルジョン、油中分散液、糊剤、散布可能な生成物、展着用の物質又は噴霧、微粒化、散布若しくは流込による顆粒の形態にて用いられ得る。その使用形態は使用目的に完全に依存する。その使用形態は、本発明に従って、各場合にＡＨＡＳ阻害除草剤の可能な限りに微細な分布を確実にすることを目的とする。
【００９４】
水性使用形態は、水を加えることにより、エマルジョン濃縮物、糊剤又は水和剤（噴霧可能な粉末、油中分散液）から調製され得る。エマルジョン、糊剤又は油中分散液を調製するため、そのような状態の、或いは油又は溶剤中に溶解された物質は、湿潤剤、粘着付与剤、分散剤又は乳化剤によって水中にて均質化され得る。しかし、活性物質、湿潤剤、粘着付与剤、分散剤又は乳化剤、並びに、適宜、溶剤又は油からなる濃縮物を調製することも可能であり、そのような濃縮物は水による希釈に適する。
【００９５】
即時使用可能な調製物中の活性化合物の濃度は、比較的広範な範囲内にて多様であり得る。概して、その濃度は０．０００１〜１０重量％、好ましくは、０．０１〜１重量％である。
【００９６】
ＡＨＡＳ阻害除草剤は超微量プロセス（ｕｌｔｒａ−ｌｏｗ−ｖｏｌｕｍｅ ｐｒｏｃｅｓｓ）（ＵＬＶ）にても良好に用いられてもよく、９５重量％超の活性化合物を含む製剤を適用し、更に、添加剤を含まない活性化合物を適用することが可能である。
【００９７】
以下は製剤例である。
【００９８】
１．葉面用途の水による希釈用の生成物。種子処理を目的として、そのような生成物は希釈され、或いは希釈されずに種子に塗布されてもよい。
Ａ）水溶性濃縮物（ＳＬ，ＬＳ）
１０重量部のＡＨＡＳ阻害除草剤が９０重量部の水又は水溶性溶剤中に溶解される。代替として湿潤剤又は他の助剤が加えられる。ＡＨＡＳ阻害除草剤は水による希釈と同時に溶解し、それにより、１０％（ｗ／ｗ）ＡＨＡＳ阻害除草剤を含む製剤が得られる。
Ｂ）分散性濃縮物（ＤＣ）
２０重量部のＡＨＡＳ阻害除草剤が、１０重量部の分散剤、例えば、ポリビニルピロリドンを加えた７０重量部のシクロヘキサノン中に溶解される。水による希釈によって分散液が得られ、それにより、２０％（ｗ／ｗ）ＡＨＡＳ阻害除草剤を含む製剤が得られる。
Ｃ）乳化性濃縮物（ＥＣ
１５重量部のＡＨＡＳ阻害除草剤が、ドデシルベンゼンスルホン酸カルシウム及びヒマシ油エトキシレート（各場合、５重量部）を加えた７重量部のキシレン中に溶解される。水による希釈によってエマルジョンが得られ、それにより、１５％（ｗ／ｗ）ＡＨＡＳ阻害除草剤を含む製剤が得られる。
Ｄ）エマルジョン（ＥＷ，ＥＯ，ＥＳ）
２５重量部のＡＨＡＳ阻害除草剤が、ドデシルベンゼンスルホン酸カルシウム及びヒマシ油エトキシレート（各場合、５重量部）を加えた３５重量部のキシレン中に溶解される。この混合物は、乳化機（例えば、Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘ）によって３０重量部の水に導入され、均質なエマルジョンになされる。水による希釈によってエマルジョンが得られ、それにより、２５％（ｗ／ｗ）ＡＨＡＳ阻害除草剤を含む製剤が得られる。
Ｅ）懸濁剤（ＳＣ，ＯＤ，ＦＳ）
攪拌ボールミルにて、２０重量部のＡＨＡＳ阻害除草剤が、１０重量部の分散剤、浸潤剤及び７０重量部の水若しくは有機溶剤を加えて粉砕され、微細なＡＨＡＳ阻害除草剤懸濁液が得られる。水による希釈によってＡＨＡＳ阻害除草剤の安定した懸濁液が得られ、それにより、２０％（ｗ／ｗ）ＡＨＡＳ阻害除草剤を含む製剤が得られる。
Ｆ）水分散性顆粒及び水溶性顆粒（ＷＧ，ＳＧ）
５０重量部のＡＨＡＳ阻害除草剤が、５０重量部の分散剤及び浸潤剤を加えて微細に粉砕され、技術的装置（例えば、押出し、噴霧塔、流動床）によって水分散性及び水溶性顆粒として作製される。水による希釈によってＡＨＡＳ阻害除草剤の安定した分散液又は溶液が得られ、それにより、５０％（ｗ／ｗ）ＡＨＡＳ阻害除草剤を含む製剤が得られる。
Ｇ）水分散性粉末及び水溶性粉末（ＷＰ，ＳＰ，ＳＳ，ＷＳ）
７５重量部のＡＨＡＳ阻害除草剤が、２５重量部の分散剤、浸潤剤及びシリカゲルを加えたローター・ステーターミルにて微細に粉砕される。水による希釈によってＡＨＡＳ阻害除草剤の安定した分散液又は溶液が得られ、それにより、７５％（ｗ／ｗ）ＡＨＡＳ阻害除草剤を含む製剤が得られる。
Ｉ）ゲル製剤（ＧＦ）
攪拌ボールミルにて、２０重量部のＡＨＡＳ阻害除草剤が、１０重量部の分散剤、１重量部のゲル化剤浸潤剤及び７０重量部の水若しくは有機溶剤を加えて粉砕され、微細なＡＨＡＳ阻害除草剤懸濁液が得られる。水による希釈によってＡＨＡＳ阻害除草剤の安定した懸濁液が得られ、それにより、２０％（ｗ／ｗ）ＡＨＡＳ阻害除草剤を含む製剤が得られる。このゲル製剤は種子処理としての使用に適する。
【００９９】
２．葉面用途の希釈されずに適用される生成物。種子処理を目的として、そのような生成物は希釈されて種子に塗布されてもよい。
Ａ）散布可能粉末（ＤＰ，ＤＳ）
５重量部のＡＨＡＳ阻害除草剤が微細に粉砕され、９５重量部の微細に粉砕されたカオリンと密に混合される。これにより、５％（ｗ／ｗ）ＡＨＡＳ阻害除草剤を有する散布可能な生成物が得られる。
Ｂ）顆粒（ＧＲ，ＦＧ，ＧＧ，ＭＧ）
０．５重量部のＡＨＡＳ阻害除草剤が微細に粉砕され、９５．５重量部の担体と結合され、それにより、０．５％（ｗ／ｗ）ＡＨＡＳ阻害除草剤を含む製剤が得られる。現行の方法は、押出し、噴霧乾燥又は流動床である。これにより、葉面用途に希釈されずに適用される顆粒が得られる。
【０１００】
従来の種子処理製剤には、例えば、流動性濃縮物ＦＳ、溶液ＬＳ、乾燥処理用粉末ＤＳ、スラリー処理用の水分散性粉末ＷＳ、水溶性粉末ＳＳ及びエマルジョンＥＳ／ＥＣ並びにゲル製剤ＧＦが含まれる。これらの製剤は希釈され、或いは希釈されずに種子に塗布され得る。種子への塗布はいずれも直接種子に播種前に行われる。
【０１０１】
好ましい実施形態では、ＦＳ製剤が種子処理に用いられる。典型的には、ＦＳ製剤は、１〜８００ｇ／ｌの活性成分、１〜２００ｇ／ｌの界面活性剤、０〜２００ｇ／ｌの抗凍結剤、０〜４００ｇ／ｌの結合剤、０〜２００ｇ／ｌの色素及び最大１リットルの溶剤、好ましくは、水を含んでもよい。
【０１０２】
種子処理では、本発明による高蛋白質コムギ植物の種子は、除草剤、好ましくは、アミドスルフロン、アジムスルフロン、ベンスルフロン、クロリムロン、クロルスルフロン、シノスルフロン、シクロスルファムロン、エタメトスルフロン、エトキシスルフロン、フラザスルフロン、フルピルスルフロン、ホラムスルフロン、ハロスルフロン、イマゾスルフロン、ヨードスルフロン、メソスルフロン、メトスルフロン、ニコスルフロン、オキサスルフロン、プリミスルフロン、プロスルフロン、ピラゾスルフロン、リムスルフロン、スルホメツロン、スルホスルフロン、チフェンスルフロン、トリアスルフロン、トリベヌロン、トリフロキシスルフロン、トリフルスルフロン、トリトスルフロン、イマザメタベンズ、イマザモックス、イマザピック、イマザピル、イマザキン、イマゼタピル、クロランスラム、ジクロスラム、フロラスラム、フルメツラム、メトスラム、ペノキススラム、ビスピリバック、ピリミノバック、プロポキシカルバゾン、フルカルバゾン、ピリベンゾキシム、ピリフタリド、ピリチオバック及びそれらの混合物のようなＡＨＡＳ阻害除草剤からなる群より選択される除草剤或いはＡＨＡＳ阻害除草剤を含む製剤で処理される。より好ましくは、本発明による高蛋白質コムギ植物の種子はイミダゾリノン系除草剤で処理される。
【０１０３】
「種子処理」という用語は、当該技術分野において公知のあらゆる好適な種子処理法、例えば、種子粉衣、種子被覆、種子消毒、浸種、種子ペレット成形を含む。
【０１０４】
本発明の一変形例に従って、本発明の更なる主題は、特に、播種機への適用による土壌を処理する方法である：組成物／製剤としてＡＨＡＳ阻害除草剤を含む、いずれもの顆粒状製剤（例えば、場合により、１つ若しくはそれ以上の固体又は液体の農薬として許容可能な担体、並びに／或いは、場合により、１つ又はそれ以上の農薬として許容可能な界面活性剤を含む顆粒状製剤）。この方法は、例えば、穀類、トウモロコシ、綿花、ヒマワリの播種床に、好都合に用いられる。
【０１０５】
本発明は、アミドスルフロン、アジムスルフロン、ベンスルフロン、クロリムロン、クロルスルフロン、シノスルフロン、シクロスルファムロン、エタメトスルフロン、エトキシスルフロン、フラザスルフロン、フルピルスルフロン、ホラムスルフロン、ハロスルフロン、イマゾスルフロン、ヨードスルフロン、メソスルフロン、メトスルフロン、ニコスルフロン、オキサスルフロン、プリミスルフロン、プロスルフロン、ピラゾスルフロン、リムスルフロン、スルホメツロン、スルホスルフロン、チフェンスルフロン、トリアスルフロン、トリベヌロン、トリフロキシスルフロン、トリフルスルフロン、トリトスルフロン、イマザメタベンズ、イマザモックス、イマザピック、イマザピル、イマザキン、イマゼタピル、クロランスラム、ジクロスラム、フロラスラム、フルメツラム、メトスラム、ペノキススラム、ビスピリバック、ピリミノバック、プロポキシカルバゾン、フルカルバゾン、ピリベンゾキシム、ピリフタリド及びピリチオバックから選択される、少なくとも１つのＡＬＳ阻害剤を含む種子処理製剤を被覆され、或いはそれを含む種子も含む。該ＡＬＳ阻害剤はイミダゾリノン系除草剤であることが好ましい。
【０１０６】
種子という用語は、あらゆる種類の種子及び植物珠芽を包含し、限定されないが、真正種子、種子片、吸枝、球茎、球根、果実、塊茎、穀粒、挿し穂、切芽（ｃｕｔ ｓｈｏｏｔｓ）などを含み、好ましい実施形態では、真正種子を意味する。
【０１０７】
一般的に、「〜を被覆される及び／又は含む」という用語は、活性成分の大部分が塗布時に繁殖生成物の表面上にあるが、塗布方法により、活性成分が多かれ少なかれ、繁殖生成物に浸透してもよいということを意味する。前記繁殖生成物が植えられる（植え直される）と、それは活性成分を吸収してもよい。
【０１０８】
ＡＨＡＳ阻害除草剤又はＡＨＡＳ阻害除草剤を含む製剤による種子処理の適用は、植物の播種前及び植物の出芽前、種子に噴霧或いは散布することによって行われる。
【０１０９】
種子処理では、対応する製剤は、有効量のＡＨＡＳ阻害除草剤又はＡＨＡＳ阻害除草剤を含む製剤で種子を処理することによって塗布される。本明細書では、概して、塗布量は、種子１００ｋｇ当たり０．１ｇ〜１０ｋｇの阻害剤（ａ．ｉ）（或いは阻害剤（ａ．ｉ）の混合物又は製剤）、好ましくは、種子１００ｋｇ当たり１ｇ〜５ｋｇ、特に、種子１００ｋｇ当たり１ｇ〜２．５ｋｇである。レタスのような特定の作物では、その量はより多い。
【０１１０】
本発明の高蛋白質コムギ植物は、望ましくない植物に対抗し、或いは雑草を防除する方法に用途を見出し、該方法は、播種前及び／又は発芽前、本発明による高蛋白質コムギ植物の種子をＡＨＡＳ阻害除草剤に接触させる工程を含む。該方法は、例えば、田畑の土壌又は温室の培養土に種子を播種する工程を更に含み得る。該方法は、特に、種子近傍における望ましくない植物に対抗し、或いは雑草を防除することに用途を見出す。
【０１１１】
望ましくない植物の防除は、雑草を枯死させ、且つ／或いは雑草の正常な成長を遅延させ、又は阻害することを意味するものと理解される。広義の雑草は望まれない場所で成長するあらゆる植物を意味するものと理解される。
【０１１２】
本発明の雑草は、例えば、双子葉及び単子葉雑草を含む。双子葉雑草は、限定されないが、Ｓｉｎａｐｉｓ属、Ｌｅｐｉｄｉｕｍ属、Ｇａｌｉｕｍ属、Ｓｔｅｌｌａｒｉａ属、Ｍａｔｒｉｃａｒｉａ属、Ａｎｔｈｅｍｉｓ属、Ｇａｌｉｎｓｏｇａ属、Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ属、Ｕｒｔｉｃａ属、Ｓｅｎｅｃｉｏ属、Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ属、Ｐｏｒｔｕｌａｃａ属、Ｘａｎｔｈｉｕｍ属、Ｃｏｎｖｏｌｖｕｌｕｓ属、Ｉｐｏｍｏｅａ属、Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ，属、Ｓｅｓｂａｎｉａ属、Ａｍｂｒｏｓｉａ属、Ｃｉｒｓｉｕｍ属、Ｃａｒｄｕｕｓ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｓｏｌａｎｕｍ属、Ｒｏｒｉｐｐａ属、Ｒｏｔａｌａ属、Ｌｉｎｄｅｒｎｉａ属、Ｌａｍｉｕｍ属、Ｖｅｒｏｎｉｃａ属、Ａｂｕｔｉｌｏｎ属、Ｅｍｅｘ属、Ｄａｔｕｒａ属、Ｖｉｏｌａ属、Ｇａｌｅｏｐｓｉｓ属、Ｐａｐａｖｅｒ属、Ｃｅｎｔａｕｒｅａ属、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ属、Ｒａｎｕｎｃｕｌｕｓ属及びＴａｒａｘａｃｕｍ属の雑草を含む。単子葉雑草は、限定されないが、Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ属、Ｓｅｔａｒｉａ属、Ｐａｎｉｃｕｍ属、Ｄｉｇｉｔａｒｉａ属、Ｐｈｌｅｕｍ属、Ｐｏａ属、Ｆｅｓｔｕｃａ属、Ｅｌｅｕｓｉｎｅ属、Ｂｒａｃｈｉａｒｉａ属、Ｌｏｌｉｕｍ属、Ｂｒｏｍｕｓ属、Ａｖｅｎａ属、Ｃｙｐｅｒｕｓ属、Ｓｏｒｇｈｕｍ属、Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ属、Ｃｙｎｏｄｏｎ属、Ｍｏｎｏｃｈｏｒｉａ属、Ｆｉｍｂｒｉｓｔｙｓｌｉｓ属、Ｓａｇｉｔｔａｒｉａ属、Ｅｌｅｏｃｈａｒｉｓ属、Ｓｃｉｒｐｕｓ属、Ｐａｓｐａｌｕｍ属、Ｉｓｃｈａｅｍｕｍ属、Ｓｐｈｅｎｏｃｌｅａ属、Ｄａｃｔｙｌｏｃｔｅｎｉｕｍ属、Ａｇｒｏｓｔｉｓ属、Ａｌｏｐｅｃｕｒｕｓ属及びＡｐｅｒａ属の雑草を含む。
【０１１３】
加えて、本発明の雑草は、例えば、望まれない場所で生育する作物を含み得る。例えば、主に大豆植物を含む田畑に自生するトウモロコシ植物は、トウモロコシ植物が大豆植物の田畑において望まれない場合、雑草とみなされ得る。
【０１１４】
冠詞“ａ（１つの）”及び“ａｎ（１つの）”は本明細書では１つ又は２つ以上（即ち、少なくとも１つ）の冠詞の文法上の対象を指すのに用いられる。例として、“ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ（１つの要素）”は１つ又はそれ以上の要素を意味する。
【０１１５】
本明細書で用いられるように、単語“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）”又は“ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む）”若しくは“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）”のような変形は、記載の要素、整数若しくは工程又は要素、整数若しくは工程の群の包含を意味するが、他の任意の要素、整数若しくは工程又は要素、整数若しくは工程の群の除外を意味するものではない。
【０１１６】
以下の実施例は例示目的で示されるものであって、限定目的で示されるものではない。
【実施例１】
【０１１７】
（穀粒蛋白質含量の増加を有するコムギ系統）
【０１１８】
標準的な突然変異生成法及び従来の植物育種法を用いてコムギ系統を作出した。突然変異生成の目的は、イミダゾリノン系除草剤に対する耐性を有するコムギ系統を開発することにあった。これらのコムギ系統におけるイミダゾリノン耐性に関与する突然変異は、グアニンからアデニンへの単一ヌクレオチド変更であり、これは、ＡＧＣからＡＡＣへのコドン変更と、ＴａＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎと命名される、ＡＨＡＳＬ（アセトヒドロキシ酸合成酵素大サブユニット）蛋白質におけるセリンからアスパラギンへの単一アミノ酸置換とをもたらす。ＡＨＡＳ酵素は分岐鎖アミノ酸であるバリン、ロイシン及びイソロイシンの生合成における第一工程を触媒し（Ｓｔｉｄｈａｍ ａｎｄ Ｓｉｎｇｈ（１９９１）”Ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ −Ａｃｅｔｏｈｙｄｒｏｘｙａｃｉｄ Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，”Ｉｎ：Ｔｈｅ Ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓ，Ｃｈ．６，Ｓｈａｎｅｒ，Ｄ．，ａｎｄ Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｓ．，ｅｄｓ．；ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，ｐｐ．７１−９０）、植物においてこれらのアミノ酸によるフィードバック調節を受ける。ＡＨＡＳ遺伝子における単一点突然変異は、突然変異ＡＨＡＳ酵素に対するこれらの除草剤の結合部位を変更することにより、イミダゾリノン系除草剤に対する耐性を付与するが、分岐鎖アミノ酸によるフィードバック調節及び該酵素の正常な生合成機能への影響を認めない（Ｎｅｗｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ，（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００：８８２−８８６）（図１）。
【０１１９】
除草剤耐性を示すコムギ系統の選抜プロセスの間、穀粒組成試験を行い、これらの試験から高穀粒蛋白質含量を見出した。これらの試験は異なる地理的位置（カリフォルニア州、ミネソタ州、ノースダコタ州、ワシントン州及びカナダ）で１９９９年から２００４年まで行った（表２）。この特性を示す５系統（ＢＷ２５５−２，ＢＷ２３８−３，Ｋ４２，Ｔｅａｌ１５Ａ及びＥｌｓａｘＥＭ２）は独立して異なる遺伝資源に由来し、独立した突然変異生成事象によるものであり、１系統（ＥｌｓａｘＥＭ２）は突然変異誘発されていたアインコーン（Ｅｉｎｋｏｒｎ）コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ）からの遺伝子移入によって得られた。
【０１２０】
パーセント蛋白価はそれらの親に比べ、ＢＷ２５５−２，ＢＷ２３８−３，Ｋ４２，Ｔｅａｌ１５Ａ及びＥｌｓａｘＥＭ２の方が高かった（表１）。数年及び複数地点での有意な増加は、それぞれの親系統と比べ、３〜１３％の範囲であり（表２）、或いはそれぞれの親と比べ、全系統の複数地点及び数年にわたり、実際の増加は０．４〜２．１％であり、平均１．３％であった。分岐状の変更アミノ酸であるバリン、イソロイシン及びロイシン並びに必須アミノ酸ンであるリシン、メチオニン、シスチン及びスレオニンのアミノ酸価は、通常、有意に高かったが、一部の例外があった（表２）。それぞれの親系統と比べ、平均増加率は６〜１１％の範囲であり（表２）、或いはそれらの親と比べ、全アミノ酸価にわたり、実際の増加率は０．０２〜０．０９％であり、平均０．０４％であった。２００３年及び２００４年に生育させた野外試験では、突然変異体ＢＷ２５５−２及びＢＷ２３８−３の穀粒収量及び試験重量値は、それら各々の親系統と有意に異なることはなかった（表３）。同様に、ＢＷ２５５−２及び親ＢＷ２５５系統に対して提示されるフィードバック阻害結果（図１）は、他の系統と同程度であり、分岐鎖アミノ酸の生合成の調節を変化させえた、フィードバック阻害に対する突然変異の影響がなかったことを示す。
【０１２１】
本実施例において提示される試験において用いられる除草剤耐性コムギ系統はＭ５世代又はそれ以降の世代であり、ＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ形質に対してホモ接合性である。
【０１２２】
【表１】
【０１２３】
【表２】
【０１２４】
【表３】
【０１２５】
イミダゾリノン系除草剤に対して抵抗性であるパンコムギ系統からの穀粒蛋白質含量、分岐鎖及び必須アミノ酸価は、それら各々の親系統と比べ、有意に増加していた。コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）ＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子を有する、独立して得られた４系統及びＴｒｉｔｉｃｕｍ ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ Ｌ．からの同じ突然変異の遺伝子移入によって得られた別の１系統はすべて、それら各々の親系統と比べ、穀粒蛋白質形質の増加を示した。これらの結果は、穀粒蛋白質の増加がコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ突然変異に起因し、また、これらのＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ系統において、親と比べ、穀粒収量の減少もフィードバック阻害反応の変化もなかったことを示す。これまでに検討したＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎコムギ系統はすべて、アスパラギン６５３に対するＡＡＣコドンを含むが、アスパラギン６５３に対するＡＡＴコドンを含むコムギ系統も蛋白質含量の増加を有する穀粒を産生することが期待される。
【０１２６】
Ｓ６５３Ｎ突然変異によって付与される穀粒蛋白質含量増加の利点は、ＡＨＡＳＬ１Ａ遺伝子のみに限定される。ＡＨＡＳＬ１Ｄ及びＡＨＡＳＬ１Ｂ相同遺伝子に生じるＳ６５３Ｎ突然変異を有するコムギ系統は、穀粒蛋白質の増加を示さなかった（データは示さない）。
【実施例２】
【０１２７】
（除草剤抵抗性コムギＡＨＡＳＬ蛋白質）
【０１２８】
本発明は、コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用を開示する。除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬポリペプチドを含む植物は過去に同定されており、除草剤抵抗性を付与するアミノ酸置換の部位であるＡＨＡＳＬポリペプチドの多くの保存領域が報告されている。Ｄｅｖｉｎｅ及びＥｂｅｒｌｅｉｎ（１９９７）「改変標的部位に基づく除草剤抵抗性の生理学的、生化学的及び分子態様（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｌｔｅｒｅｄ ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅｓ）」、除草剤活性：毒物学、生化学的及び分子生物学（Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ：Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｒｏｅら（編）、１５９−１８５頁、ＩＯＳ Ｐｒｅｓｓ社、アムステルダム；並びにＤｅｖｉｎｅ及びＳｈｕｋｌａ（２０００）Ｃｒｏｐ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ １９：８８１−８８９を参照されたい。
【０１２９】
本発明のコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ配列及び当業者には周知の方法を用いて、これらの保存領域において同定された部位にてＳ６５３Ｎ置換及び１，２，３若しくはそれ以上の追加アミノ酸置換を有する除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬポリペプチドをコードする追加ポリヌクレオチドを生成することができる。表４は、ＡＨＡＳＬ蛋白質の保存領域、これらの保存領域内の除草剤抵抗性を付与することが知られているアミノ酸置換及びコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）ＡＨＡＳＬ１蛋白質を示す。
【０１３０】
【表４】
【０１３１】
1Ｄｅｖｉｎｅ及びＥｂｅｒｌｅｉｎ（１９９７）「改変標的部位に基づく除草剤抵抗性の生理学的、生化学的及び分子態様（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｌｔｅｒｅｄ ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅｓ）」、除草剤活性：毒物学、生化学的及び分子生物学（Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ：Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｒｏｅら（編）、１５９−１８５頁、ＩＯＳ Ｐｒｅｓｓ社、アムステルダム；並びにＤｅｖｉｎｅ及びＳｈｕｋｌａ（２０００）Ｃｒｏｐ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ １９：８８１−８８９から引用の保存領域
2アミノ酸番号はシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＡＨＡＳＬポリヌクレオチドのアミノ酸配列に対応する。
3野生型コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）ＡＨＡＳＬ１のアミノ酸配列は、同じ保存領域を含む。
4Ｂｅｒｎａｓｃｏｎｉら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（２９）：１７３８１−１７３８５
5Ｗｒｉｇｈｔ及びＰｅｎｎｅｒ（１９９８）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．９６：６１２−６２０
6Ｂｏｕｔｓａｌｉｓら（１９９９）Ｐｅｓｔｉｃ．Ｓｃｉ．５５：５０７−５１６
7Ｇｕｔｔｉｅｒｉら（１９９５）Ｗｅｅｄ Ｓｃｉ．４３：１４３−１７８
8Ｇｕｔｔｉｅｒｉら（１９９２）Ｗｅｅｄ Ｓｃｉ．４０：６７０−６７８
9Ｋｏｌｋｍａｎら（２００４）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１０９：１１４７−１１５９
10Ｈａｒｔｎｅｔｔら（１９９０）「突然変異アセト乳酸合成酵素遺伝子を担持する除草剤抵抗性植物（Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｐｌａｎｔｓ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｍｕｔａｔｅｄ ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｇｅｎｅｓ）」、農薬抵抗性の管理：基礎的研究から実用的方策へ（Ｍａｎａｇｉｎｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ａｇｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｔｏ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ）、Ｇｒｅｅｎら（編）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃ．Ｓｙｍｐ．，Ｓｅｒｉｅｓ Ｎｏ．４２１、米国ワシントンＤＣ
11Ｓｉｍｐｓｏｎ（１９９８）Ｄｏｗｎ ｔｏ Ｅａｒｔｈ ５３（１）：２６−３５
12Ｗｈｉｔｅら（２００３）Ｗｅｅｄ Ｓｃｉ．５１：８４５−８５３
13Ｂｒｕｎｉａｒｄ（２００１）ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ Ｌ．）におけるイミダゾリノン抵抗性、交差抵抗性パターンの特徴及び分子マーカーの同定（Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｏｆ ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｒｏｓｓ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐａｔｔｅｒｎ，ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ Ｌ．）、米国ノースダコタ州（ＮＤ）ファーゴ（Ｆａｒｇｏ）、ノースダコタ州立大学（Ｎｏｒｔｈ Ｄａｋｏｔａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）博士号論文、１−７８頁
14Ｄｅｖｉｎｅ及びＥｂｅｒｌｅｉｎ（１９９７）「改変標的部位に基づく除草剤抵抗性の生理学的、生化学的及び分子態様（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｌｔｅｒｅｄ ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅｓ）」、除草剤活性：毒物学、生化学的及び分子生物学（Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ：Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｒｏｅら（編）、１５９−１８５頁、ＩＯＳ Ｐｒｅｓｓ社、アムステルダム
15Ｃｈａｎｇ及びＤｕｇｇｌｅｂｙ（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３３３：７６５−７７７
16Ｌｅｅら（１９９９）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４５２：３４１−３４５
【実施例３】
【０１３２】
（アリゾナ州及びカリフォルニア州での野外試験における高蛋白質コムギ系統の成績）
北半球での３地点（米国カリフォルニア州及びアリゾナ州）において、ＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３（Ａｔ）Ｎ突然変異を含む春コムギ系統（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）及び同質遺伝型非変異親系統を冬期にわたって（２００５〜２００６年）生育させた。ＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ突然変異コムギ系統が、それらの適応帯域外で下限光周期の次善な（即ち、日が短い）条件下の環境において、それらの親系統と比べて生育穀粒の増加を示すかを判断するため、各系統の穀粒蛋白質含量を測定した。
【０１３３】
（エントリー及び地点）
遺伝的に異なる２つの遺伝子型のホモ接合性ＡＨＡＳＬ１Ａ（Ｓ６５３Ｎ）突然変異体、Ｋｉｒｃｈａｕｆｆ−Ｋ４２（オーストラリアの春コムギ系統、本明細書では“Ｋ４２”とも称する）とＢＷ２３８−３（北米の春コムギ系統）とを、それらの同質遺伝型非変異親系統（それぞれ、Ｋｉｒｃｈａｕｆｆ，ＢＷ２３８）と共に、米国南西部において２００５〜２００６年の冬期にわたり、３地点において隣接する大区画の土地（単一反復（ｓｉｎｇｌｅ ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎ））で生育させた。２地点はアリゾナ州ユマ（Ｙｕｍａ）に近く、一方、第三の地点はカリフォルニア州ディヌーバ近傍であった。それらの場所に２００５年１１月に植え付け、２００６年７月に収穫した。
【０１３４】
（区画寸法及び播種量）
播種量：種子１００ｇ／３５ｍ2
区画寸法：２×１．７５ｍ×１０ｍ（一代表例）
幅１０ｍのオオムギ細帯域により、区画を分離した。
【０１３５】
（農業成績及び穀粒収穫）
すべての区画を同一の農耕法に付した。イミダゾリノン系除草剤で処理した区画はなかった。Ｋｉｒｃｈａｕｆｆ系統とＢＷ２３８系統の遺伝子型の差異を判定するため、生育習性及び成長高について区画を評価した。Ｋｉｒｃｈａｕｆｆ−Ｋ４２及びその同質遺伝型親系統Ｋｉｒｃｈａｕｆｆは、ＢＷ２３８−３系統及びその同質遺伝型親系統ＢＷ２３８より高く生育し、より少ない分蘖を示した。各地点における野外にて観察した際、ＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ突然変異を含む系統と、それら各々の同質遺伝型非変異親系統との間に農業成績の有意差は検出されなかった。表５はカリフォルニア州ディヌーバにおける全４系統の生育習性を概示する。
【０１３６】
【表５】
【０１３７】
（結果及び考察）
アリゾナ州ユマ（Ｙｕｍａ）の２地点及びカリフォルニア州ディヌーバからの穀粒試験重量、ＳＤＳ沈降価及び蛋白質含量パーセントを、それぞれ表６〜８に示す。表９は全３地点にわたる結果を概示する。穀粒蛋白質含量結果を３地点にわたって平均化すると、Ｋｉｒｃｈａｕｆｆ−Ｋ４２はその同質遺伝型親対照系統より５％高い穀粒蛋白質濃度を示した（表９）。同様に、穀粒蛋白質含量を３地点にわたって平均化すると、ＢＷ２３８−３はその同質遺伝型親対照系統より５．１％高い穀粒蛋白質濃度を示した（表９）。平均穀粒試験重量は、その非変異親系統と比べ、Ｋｉｒｃｈａｕｆｆ−Ｋ４２の方がわずかに重く、一方、ＢＷ２３８−３の穀粒試験重量はその非変異親系統と有意に異なることはなかった（表９）。グルテン力及び製パン性を予測するのに用いられるＳＤＳ沈降価も、変異ＡＨＡＳＬ１Ａ系統とそれぞれの親対照群との間で有意に異なることはなかった。
【０１３８】
これらの結果は、ＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ突然変異を含む６倍体パンコムギ系統が、それらの適応帯域外及び通常の生育季節外にて生育させた場合でも、親対照系統より高い穀粒蛋白質含量を有する穀粒を産生するということを示す。
【０１３９】
【表６】
【０１４０】
*コムギに対するＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）沈降試験は、デュラム及びパンコムギにおいてグルテン力及び製パン性を予測するための、米国穀物化学者協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｅ ｏｆ Ｃｅｒｅａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ（ＡＡＣＣ））に国際的に承認された方法である。Ｍｏｒｒｉｓら（２００７）Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃ．８７：６０７−６１５を参照されたい。
†親系統の穀粒蛋白質含量に対するＳ６５３Ｎ系統の穀粒蛋白質含量の増加パーセント。ＫｉｒｃｈａｕｆｆとＢＷ２３８は、それぞれＫ４２，ＢＷ２３８−３の親系統である。
【０１４１】
【表７】
【０１４２】
【表８】
【０１４３】
【表９】
【０１４４】
*ユマ（Ｙｕｍａ）２試験（表６及び７）及びディヌーバ試験（表８）の平均値
†標準偏差
@親系統の平均穀粒蛋白質含量に対するＳ６５３Ｎ系統の平均穀粒蛋白質含量の増加パーセント。ＫｉｒｃｈａｕｆｆとＢＷ２３８は、それぞれＫ４２，ＢＷ２３８−３の親系統である。
【実施例４】
【０１４５】
（高蛋白質コムギ系統から産生される穀粒の製パン性試験）
ＡＨＡＳＬ１Ａ突然変異体における穀粒蛋白質の増加が製パン性に影響を及ぼすかどうかを判定するため、上記実施例３において開示した野外試験における３地点のうちの２地点（１地点はカリフォルニア州ディヌーバに、１地点はアリゾナ州ユマ（Ｙｕｍａ）にある）において生育させた穀粒の試料を、独立した実験施設による多くのコムギ及び小麦粉試験方法に付した。挽き割りコムギ及び小麦粉試料を生成するため、各エントリー（ＡＨＡＳＬ１Ａ及び親同質遺伝型系統）からの穀粒試料を実験室製粉工程（Ｂｕｈｌｅｒ実験室製粉機（Ｂｕｈｌｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｆｌｏｕｒ Ｍｉｌｌ））に付した。次に、多くの標準的なコムギ品質パラメータを求めるため、コムギ及び製粉試料を多くの品質試験（含水量、蛋白質含量、灰分及びフォーリングナンバー）に付した。各試料の加工及び製パン特性を判定するため、専門的標準試験、例えば、単穀粒評価システム（Ｓｉｎｇｌｅ Ｋｅｒｎｅｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）（ＳＫＣＳ）、ファリノグラフ及びパンブレッドベーキング試験（Ｐａｎ Ｂｒｅａｄ ｂａｋｅ ｔｅｓｔ）を行った。これらの方法は、「コムギ及び小麦粉の試験方法 コムギ及び小麦粉の品質理解の指針（Ｗｈｅａｔ ａｎｄ Ｆｌｏｕｒ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ Ｗｈｅａｔ ａｎｄ Ｆｌｏｕｒ Ｑｕａｌｉｔｙ）」、（２００４）Ｗｈｅａｔ Ｍａｒｋｅｔｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．及びＮｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｅｘｐｏｒｔ Ｇｒａｉｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．、米国、に述べられている；これは参照して本明細書に組み込まれる。これらの試験の結果を以下の表１０〜１３に示す。
【０１４６】
ＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ突然変異系統はすべて、穀粒蛋白質の増加を示したが、パン焼きデータの点から、それらの親同質遺伝型系統と有意に異なる突然変異系統はなかった（表１０〜１３）。グルテン力及び製パン性を予測するのに用いられるＳＤＳ沈降価（上記実施例３を参照）も突然変異ＡＨＡＳＬ１Ａ系統とそれぞれの親対照との間で有意に異なることがなかったため、これは予期されたことであった。
【０１４７】
製パン性に影響を及ぼさずに穀粒蛋白質を増加させることができることは、小麦産業にとって望ましい特性である。従って、本発明の突然変異ＡＨＡＳＬ１Ａ系統は、蛋白質含量の増加を有すると同時に、対照コムギ系統由来の小麦粉の製パン性を維持する小麦粉の生産に有用性を見出す。突然変異ＡＨＡＳＬ１Ａコムギ系統の穀粒由来の小麦粉も、対照又は野生型コムギ系統の穀粒から製粉される小麦粉から生産される焼製品と比べ、蛋白質含量の増加を有する焼製品の生産に用途を見出す。
【０１４８】
【表１０】
【０１４９】
ＣＭＤＴＹ、品目 ＨＷＳ、硬質で白色の春コムギ 及び ＨＲＳ、硬質で赤色の春コムギ
ＬＯＣ、場所
ＰＲＯ、湿度８．５％でのコムギ中蛋白質（％）
ＭＯＩ、湿度（％）
ＴＷ、試験重量
ＴＫＷ、１０００穀粒重量（グラム）
硬質、穀粒の硬質度（−２０〜１２０の指数）
ＦＮ、フォーリングナンバー（秒）。ＦＮは下降する攪拌機（ｆａｌｌｉｎｇ ｓｔｉｒｒｅｒ）に対する小麦粉及び水ペーストの抵抗性を測定することによって定量される粘度の尺度である。
ＳＫＣＳ、単穀粒評価システム。このシステムでは、穀粒重量（ｍｇ）、穀粒径（ｍｍ）、含水量（％）及び穀粒の硬度（−２０〜１２０の指数）について、３００穀粒を個々に分析する。
【０１５０】
【表１１】
【０１５１】
ＣＭＤＴＹ、品目 ＨＷＳ、硬質で白色の春コムギ 及び ＨＲＳ、硬質で赤色の春コムギ
ＬＯＣ、場所
ＰＲＯ、湿度１４％での小麦粉中蛋白質（％）
ＭＯＩ、湿度（％）
灰分、小麦粉灰分（％）
ＡＢＳ、吸収（％）：ファリノグラフ曲線を５００ブラベンダーユニット（ＢＵ）線に集中させるのに必要な水の量
ピーク、ピーク時間（分）：水の添加時から始まり、生地が最大粘稠度に達するまでの生地の生成時間
安定性、安定時間（分）：生地が最大粘稠度を維持する時間
ＭＴＩ、耐混捏度指数（分）：混合時の生地の軟化度を示す。
【０１５２】
【表１２】
【０１５３】
ＣＭＤＴＹ、品目 ＨＷＳ、硬質で白色の春コムギ 及び ＨＲＳ、硬質で赤色の春コムギ
ＬＯＣ、場所
Ｖｏｌ ｃｃ、焼きパンブレッドの体積（立方センチメートル）
Ｖｏｌ、比体積は体積と重量との比率である。
穀粒、パンブレッドを内部の均一なパン粉粒について評点する。
触感、パンブレッドを触感について評点する。
色、小麦粉の色はミノルタ社製色彩色差計（Ｍｉｎｏｌｔａ Ｃｈｒｏｍａ Ｍｅｔｅｒ）を用いて小麦粉試料の白色度を測定することによって定量し、スケールと比較する。
ＡＢＳ、吸収
【０１５４】
【表１３】
【０１５５】
ＣＭＤＴＹ、品目 ＨＷＳ、硬質で白色の春コムギ 及び ＨＲＳ、硬質で赤色の春コムギ
ＬＯＣ、場所
【０１５６】
本明細書で言及されるすべての発行物及び特許出願は、本発明が関連する当業者のレベルを示唆するものである。すべての発行物及び特許出願は、とりわけ、そして個々に参照により組み込まれるものと示唆される場合と同程度まで、本明細書に組み込まれている。上記の発明は理解の明瞭化の目的のため、ある程度詳細に記載されているが、ある一定の変更及び修正が、添付する特許請求の範囲に記載された事項の範囲内で実施されてもよいことは明白である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、農業分野、詳細には、穀粒蛋白質含量が増加したコムギ植物を作出し、且つ使用する新規な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コムギの穀粒蛋白質含量は栄養価の向上に重要であるとともに、パンを製造するための主要な寄与因子でもある（Ｄｉｃｋ ＆ Ｙｏｕｎｇｓ（１９８８）”Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｕｒｕｍ ｗｈｅａｔ，ｓｅｍｏｌｉｎａ，ａｎｄ ｐａｓｔａ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ，”Ｉｎ：Ｄｕｒｕｍ ｗｈｅａｔ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＡＡＣＣ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ，ｐｐ．２３７− ２４８；Ｆｉｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ（１９８７）”Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｈａｒｄ，ｓｏｆｔ，ａｎｄ ｄｕｒｕｍ ｗｈｅａｔｓ”．Ｉｎ Ｅ．Ｇ．Ｈｅｙｎｅ（ｅｄ．）Ｗｈｅａｔ ａｎｄ ｗｈｅａｔ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ，Ａｇｒｏｎ．Ｍｏｎｏｇｒ．１３，２ｎｄ ｅｄ．ＡＳＡ，ＣＳＳＡ，ａｎｄ ＳＳＳＡ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ｐｐ．６７７−７４８；Ｋｈａｎ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｃｒｏｐ ＳｃＬ ４０：５１８−５２４）。コムギの穀粒蛋白質含量は、高穀粒蛋白質を有するコムギに対する品質にふさわしい価格により、コムギ栽培者にとって重要な特性でもある（Ｏｌｍｏｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１０７：１２４３−１２５１）。高穀粒蛋白質含量のための育種では多くの尽力が注がれているが、その特性及び環境との相互作用を制御する遺伝的特徴の複雑性により、その進展が遅れている。研究により、穀粒蛋白質含量に対するいくつかのＱＴＬｓが同定されている（Ｔｕｒｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｃｅｒｅａｌ Ｓｃｉ．４０：５１−６０；Ｊｏｐｐａ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．３７：１５８６−１５８；Ｐｅｒｒｅｔａｎｔ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１００：１１６７−１１７５；Ｐｒａｓａｄ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．９９：３４１−３４５；Ｇｒｏｏｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１０６：１０３２−１０４０；Ｇｒｏｏｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｃｅｒｅａｌ Ｓｃｉ．４０：９３−１００；Ｓｈｅｗｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃ．７３：３９７−４０６）。穀粒蛋白質含量の１〜２％の向上は、コムギの特定のクラス又はタイプ内では有意な増加であるとみなされた（Ｔｏｋａｔｉｌｉｄｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｆｉｅｌｄ Ｃｒｏｐｓ Ｒｅｓ．８６：３３−４２；Ｏｌｍｏｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１０７：１２４３−１２５１；Ｍｅｓｆｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ １１６：２３７−２４２）。穀粒蛋白質含量は、環境条件、例えば、土壌肥沃度、気温、窒素栄養、降雨又は温度に影響される（Ｂｈｕｌｌａｒ ＆ Ｊｅｎｎｅｒ（１９８５）Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２：３６３−３７５；Ｗａｒｄｌａｗ＆ Ｗｒｉｇｅｌｙ（１９９４）Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２１：６９５−７０３；Ｄａｎｉｅｌ ＆ Ｔｒｉｂｏｉ（２００Ｏ）Ｊ．Ｃｅｒｅａｌ Ｓｃｉ．３２：４５−５６；Ｍｅｔｈｏ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃ．７９：１８２３−１８３１）。研究では、収量に対する高蛋白質の負の作用があることも示されている（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．２５：４３０−４３５；Ｄａｙ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ８：５５５−５６６）；しかし、他の研究では両方の特性を有するコムギを育種することが可能であることを示唆している（Ｄａｙ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ８：５５５−５６６；Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９７８）”Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｌｙｓｉｎｅ ｉｎ ｗｈｅａｔ，”Ｉｎ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｉｆｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｈｅａｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，Ｎｅｗ Ｄｅｌｈｉ，Ｉｎｄｉａ，ｐｐ．８２５−８３５）。確かに、穀粒蛋白質に作用する単一遺伝子の形質又は密接に関連する形質を有することは、特に、該形質又は密接に関連する形質が迅速で費用対効果の大きい選抜を可能とする場合、パンの製造及びパンコムギの栄養価を向上する有意な利点を与えるであろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｔｕｒｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｃｅｒｅａｌ Ｓｃｉ．４０：５１−６０
【非特許文献２】Ｊｏｐｐａ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．３７：１５８６−１５８
【非特許文献３】Ｐｅｒｒｅｔａｎｔ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１００：１１６７−１１７５
【非特許文献４】Ｐｒａｓａｄ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．９９：３４１−３４５
【非特許文献５】Ｇｒｏｏｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１０６：１０３２−１０４０
【非特許文献６】Ｇｒｏｏｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｃｅｒｅａｌ Ｓｃｉ．４０：９３−１００
【非特許文献７】Ｓｈｅｗｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃ．７３：３９７−４０６
【非特許文献８】Ｔｏｋａｔｉｌｉｄｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｆｉｅｌｄ Ｃｒｏｐｓ Ｒｅｓ．８６：３３−４２
【非特許文献９】Ｏｌｍｏｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１０７：１２４３−１２５１
【非特許文献１０】Ｍｅｓｆｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ １１６：２３７−２４２
【非特許文献１１】Ｂｈｕｌｌａｒ ＆ Ｊｅｎｎｅｒ（１９８５）Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２：３６３−３７５
【非特許文献１２】Ｗａｒｄｌａｗ＆ Ｗｒｉｇｅｌｙ（１９９４）Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２１：６９５−７０３
【非特許文献１３】Ｄａｎｉｅｌ ＆ Ｔｒｉｂｏｉ（２００Ｏ）Ｊ．Ｃｅｒｅａｌ Ｓｃｉ．３２：４５−５６
【非特許文献１４】Ｍｅｔｈｏ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃ．７９：１８２３−１８３１
【非特許文献１５】Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．２５：４３０−４３５；Ｄａｙ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ８：５５５−５６６）
【非特許文献１６】Ｄａｙ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ８：５５５−５６６
【非特許文献１７】Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９７８）”Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｌｙｓｉｎｅ ｉｎ ｗｈｅａｔ，”Ｉｎ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｉｆｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｈｅａｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，Ｎｅｗ Ｄｅｌｈｉ，Ｉｎｄｉａ，ｐｐ．８２５−８３５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、穀粒蛋白質含量が増加した穀粒を産生するコムギ植物を作出する方法を提供する。本発明は、コムギ植物がコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）ＡＨＡＳＬ１Ａ蛋白質ではアミノ酸位置５７９においてセリンからアスパラギンへの置換を含むＡＨＡＳＬ１Ａ蛋白質をコードするＡＨＡＳＬ１Ａ遺伝子の少なくとも１つのコピーをそのゲノムに含むという驚くべき発見に基づく。このアミノ酸置換は、対応するセリンからアスパラギンへの置換がシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＡＨＡＳＬ１Ａ蛋白質のアミノ酸位置６５３であるため、本明細書ではＳ６５３Ｎ置換とも称される。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の方法は、Ｓ６５３Ｎ置換を含むＡＨＡＳＬ１Ａ蛋白質をコードするコムギＡＨＡＳＬ１Ａ遺伝子の少なくとも１つのコピーを植物に導入する工程を含む。このような遺伝子は、例えば、他家受粉、突然変異生成及び形質転換のような方法によって導入され得る。本発明の方法は、ＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子含むコムギ植物又はその子孫植物を生育して穀粒を産生させる工程と、コムギ植物又はその子孫植物によって産生された穀粒の蛋白質含量を定量する工程とを更に含み得る。該方法は、例えば、有効量のＡＨＡＳ阻害除草剤を植物及び／又は植物が生育しており、或いは生育される土壌若しくは他の基材に塗布することにより、コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子を含む植物を選抜する工程を更に含み得る。
【発明の効果】
【０００６】
本発明は、コムギ植物、植物器官、植物組織及び植物細胞及び高蛋白質穀粒並びに本発明のコムギ植物によって産生される高蛋白質穀粒に由来するヒト及び動物用食品を更に提供する。ヒト及び動物用食品を生産するために本発明の高蛋白質穀粒を使用する方法も提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ＢＷ２５５−２及び対照ＢＷ２５５系統のコムギ植物から調製された酵素抽出物を用いて、バリン及びロイシンによるＡＨＡＳ活性のフィードバック阻害を定量するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ研究の結果を示すグラフ表示である。ＢＷ２５５−２系統はＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ対立遺伝子に対してホモ接合性である。ＢＷ２５５はＡＨＡＳＬ１Ａ遺伝子においてホモ接合性野生型であり、ＢＷ２５５−２系統を作出するために突然変異誘発された親系統である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は、穀粒蛋白質含量が増加した穀粒を含むコムギ植物を作出し、且つ使用する方法を提供する。本発明は、植物へのＳ６５３Ｎ置換を含むＡＨＡＳＬ１Ａ蛋白質をコードするコムギＡＨＡＳＬ１Ａ遺伝子の少なくとも１つのコピーをコムギ植物に導入する工程を含む。このような遺伝子は、例えば、他家受粉、突然変異生成及び形質転換のような方法によって導入され得る。本発明の方法は、ＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子含むコムギ植物又はその子孫植物を生育して穀粒を産生させる工程と、コムギ植物又はその子孫植物によって産生された穀粒の蛋白質含量を定量する工程とを更に含み得る。本発明の方法によって作出されるコムギ植物及びその子孫植物は、コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子を欠いたコムギ植物と比べ、高穀粒蛋白質含量を含む。
【０００９】
本発明の方法は、穀粒蛋白質含量が増加した新規コムギ品種の開発に用途を見出す。本発明の方法は、容易に選抜可能な除草剤耐性特性に関連する高蛋白質コムギ特性により、選抜において強固な利点を提供するため、既存の方法と比べ、本発明の方法は、高蛋白質コムギを開発するのに必要な育種作業を大幅に低減する。更に、コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子に対する選択分子マーカーは当該技術分野において公知であり、従って、穀粒蛋白質含量が増加したコムギに対するマーカー支援育種手法に役立ち得る。米国特許出願公開第２００５／０２０８５０６号を参照されたい（参照して本明細書に組み込まれる）。高蛋白質特性の選抜の容易性によって与えられる利点に加え、穀粒蛋白質含量の増加は穀粒収量と相関しない。従って、本発明の方法は、蛋白質含量が増加した穀粒を産生するコムギ植物を提供し、これらの植物は、同様の野生型植物と比べ、１エーカー当たりで生産される穀粒蛋白質の量を増加させるのに用いられ得る。最終的に、本発明の高蛋白質特性は、更に高い穀粒蛋白質含量を有するコムギ系統を開発するため、すでに穀粒蛋白質含量が高い既存のパンコムギの胚原質と組み合わせられ得る。
【００１０】
本発明は、高蛋白質コムギ植物及びこれらの植物によって産生される高蛋白質穀粒を提供する。そのような高蛋白質穀粒はヒト及び動物用の様々な食品及び飼料品に用途を見出す。特に、本発明のコムギ植物によって産生される穀粒は、特に、パン製造に用いる高蛋白質コムギ粉の生産に用途を見出す。従って、本発明は、本発明の高蛋白質コムギ植物によって産生される穀粒を製粉する工程を含む、高蛋白質コムギ粉を作出する方法を提供する。
【００１１】
本発明の高蛋白質コムギ植物は、野生型コムギ植物と比べ、除草剤耐性の増大も含む。特に、本発明の高蛋白質コムギ植物は、野生型コムギ植物と比べ、ＡＨＡＳ酵素の活性を妨害する、少なくとも１つの除草剤に対する耐性の増大を有する。本発明の高蛋白質コムギ植物は、コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子又はポリヌクレオチドの少なくとも１つのコピーを含む。そのようなコムギＡＨＡＳＬ１Ａ蛋白質は、アミノ酸位置５７９又は等価な位置においてアスパラギンを含む。野生型ＡＨＡＳＬ１Ａ蛋白質では、位置５７９においてセリンが見出される。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）の周知のＡＨＡＳＬ１Ａ蛋白質における対応位置がアミノ酸６５３であるため、セリン579からアスパラギンへの置換を含むＡＨＡＳＬ１Ａ蛋白質をコードするＡＨＡＳＬ１Ａ遺伝子は、植物ＡＨＡＳＬ配列の確立した命名法に準拠するため、ＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子と称される。
【００１２】
本発明は、穀粒蛋白質含量の増加を有する穀粒を含むコムギ植物を作製する方法を提供する。一実施形態では、該方法は、突然変異生成により、特に、内在性コムギＡＨＡＳＬ１Ａ遺伝子を突然変異誘発してコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子を生じさせることにより、植物へのＳ６５３Ｎ置換を含むＡＨＡＳＬ１Ａ蛋白質をコードするコムギＡＨＡＳＬ１Ａ遺伝子の少なくとも１つのコピーをコムギ植物に導入する工程を含む。本発明の高蛋白質コムギ植物を作出するため、当該技術分野において公知の任意の突然変異生成法が用いられてもよい。そのような突然変異生成法は、例えば、以下の突然変異原：放射線、例えば、Ｘ線、ガンマ線（例えば、コバルト６０又はセシウム１３７）、中性子、（例えば、原子炉におけるウラン２３５による核分裂の産物）、ベータ放射線（例えば、リン３２又は炭素１４のような放射性同位体から放射される）及び紫外線（２５００〜２９００ｎｍが好ましい）並びに化学的突然変異原、例えば、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、塩基類似体（例えば、５−ブロモ−ウラシル）、関連化合物（例えば、８−エトキシカフェイン）、抗生物質（例えば、ストレプトニグリン）、アルキル化剤（例えば、硫黄マスタード、ナイトロジェンマスタード、エポキシド、エチレンアミン、スルファート、スルホナート、スルホン、ラクトン）、アジド、ヒドロキシルアミン、亜硝酸又はアクリジンの任意の１つ又はそれ以上の使用を含み得る。コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子を含むコムギ植物は、除草剤耐性突然変異を含む植物細胞を選抜し、ＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子を含む植物を選抜し、それらから植物を再生する組織培養法を用いることによっても作出され得る。例えば、米国特許第５，７７３，７０２号及び第５，８５９，３４８号を参照されたい（両方ともその全体を参照して本明細書に組み込まれる）。突然変異育種の更なる詳細については、「品種開発の原則（Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ ｏｆ Ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」Ｆｅｈｒ，１９９３ Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙに見出され得る（その開示内容は参照して本明細書に組み込まれる）。
【００１３】
一実施形態では、本発明は、コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子又はポリヌクレオチドの１，２，３，４又はそれ以上のコピーを含む高蛋白質コムギ植物を提供する。例えば、高蛋白質コムギは、天然コムギＡＨＡＳＬ１Ａ遺伝子座においてＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子の１又は２つのコピーを含み得、また、付加的或いは代替的に、天然コムギＡＨＡＳＬ１Ａプロモーター、又は、特に、登熟期間中に植物における発現を促進することが可能な別のプロモーター、例えば、種子優先或いは胚優先のプロモーター（ｓｅｅｄ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ ｏｒ ａｎ ｅｍｂｒｙｏ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）のようなプロモーターに作動可能に結合したＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎポリヌクレオチドの１，２，３又はそれ以上のコピーを含み得る。
【００１４】
本発明は、穀粒蛋白質含量の増加を有する穀粒を含むコムギ植物を作出する方法を提供する。本発明の一実施形態では、該方法は、植物細胞における発現を促進するプロモーターに作動可能に結合したヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドコンストラクトで植物細胞を形質転換する工程と、該形質転換植物細胞から形質転換植物を再生する工程とを含む。該ヌクレオチド配列は、アミノ酸位置５７９又は等価な位置においてアスパラギンを含むコムギＡＨＡＳＬ１Ａ蛋白質をコードする。コムギＡＨＡＳＬ１Ａ蛋白質をコードするヌクレオチド配列及びコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子を含むコムギ植物は過去に開示されている。ＷＯ ２００４／１０６５２９及び米国特許出願公開第２００４／０２３７１３４号 第２００４／０２４４０８０号、第２００５／００４４５９７号、第２００６／００１０５１４号及び第２００６／００９５９９２号を参照されたい；これらはすべて参照して本明細書に組み込まれる。他の実施形態では、該方法は、コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子の少なくとも１つのコピーを含むコムギ植物の別のコムギ植物との他家受粉を伴う従来の植物育種を含み、ＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子を含む親植物の除草剤耐性特徴を含む子孫植物（Ｆ１又はＦ２）を選抜する工程を更に含んでもよい。該方法は、ＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎに対してホモ接合性のコムギ系統を作出するため、Ｆ１植物の自家受粉及び次代の子孫植物（Ｆ２）の選抜を場合により含み得る。所望により、該方法は、一又はそれ以上の次世代（即ち、Ｆ２，Ｆ３，Ｆ４等）の自家受粉及びＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎに対してホモ接合性の次代の子孫植物（即ち、Ｆ３，Ｆ４，Ｆ５等）の選抜を更に含み得る。明示しない限り、或いは使用の文脈から明らかでない限り、本明細書で用いられるような「子孫」という用語は、植物の直接の子孫に限定されず、次世代の子孫を含む。
【００１５】
本発明の方法は、少なくとも１つのコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子を含むコムギ植物の使用を含む。そのようなコムギ植物には、限定されないが、特許寄託受託番号（Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ）ＰＴＡ−３９５５の基で２００２年１月１５日に米国バージニア州２０１１０−２２０９、マナッサス（Ｍａｎａｓｓａｓ）、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託されたコムギ植物、２００２年３月１９日に米国バージニア州２０１１０−２２０９、マナッサス（Ｍａｎａｓｓａｓ）、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託された特許寄託受託番号（Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ）ＰＴＡ−４１１３；及び２００２年３月２８日に米国バージニア州２０１１０−２２０９、マナッサス（Ｍａｎａｓｓａｓ）、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託された特許寄託受託番号（Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ）ＰＴＡ−４２５７；ＡＴＣＣ特許寄託受託番号（Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ）ＰＴＡ−３９５５，ＰＴＡ−４１１３及び／又はＰＴＡ−４２５７に関するコムギ植物の突然変異、組換え型若しくは遺伝子操作型の誘導体；ＡＴＣＣ特許寄託受託番号（Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ）ＰＴＡ−３９５５，ＰＴＡ−４１１３及び／又はＰＴＡ−４２５７に関する植物の任意の子孫；並びにこれらの植物の任意の１つ又はそれ以上の子孫であるコムギ植物が含まれる。ＡＴＣＣ特許寄託受託番号（Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ）ＰＴＡ−３９５５，ＰＴＡ−４１１３及びＰＴＡ−４２５７を有する任意のコムギ植物のそのような突然変異、組換え型又は遺伝子操作誘導体並びにそれらの子孫は、好ましくはＡＴＣＣ特許寄託受託番号（Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ）ＰＴＡ−３９５５，ＰＴＡ−４１１３又はＰＴＡ−４２５７を有するコムギ植物の除草剤耐性特徴を含む。ＡＴＣＣ特許寄託受託番号（Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ）ＰＴＡ−３９５５，ＰＴＡ−４１１３及びＰＴＡ−４２５７を有するコムギ植物並びにそれらの誘導体及び子孫は、米国特許出願公開第２００４／０２３７１３４号、第２００４／０２４４０８０号及び第２００６／００９５９９２号に述べられている；これらはすべて参照して本明細書に組み込まれる。
【００１６】
ＡＴＣＣ特許寄託受託番号（Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ）ＰＴＡ−３９５５，ＰＴＡ−４１１３及びＰＴＡ−４２５７を有する各コムギ系統の少なくとも２５００個の種子の寄託は、それぞれ２００２年１月３日、２００２年３月４日及び２００２年１月３日に米国バージニア州２０１１０、マナッサス（Ｍａｎａｓｓａｓ）、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）の特許寄託機関（Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）になされた。これらの寄託の各々は少なくとも３０年の期限でなされ、寄託の試料の提供に対する直近の要請の少なくとも５年後にＡＴＣＣに受理される。これらの寄託体は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）の条項に従って維持される。加えて、これらの寄託体は、試料の生存能の指標の提供を含む、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８０１−１．８０９の要求事項をすべて満たす。
【００１７】
本明細書で用いられるように、別段の記載がない限り、或いは文脈から明らかでない限り、「植物」という用語は、限定されないが、植物細胞、植物プロトプラスト、植物が再生可能な植物細胞組織培養物、植物カルス、植物塊、植物において無傷の植物細胞又は植物の部分、例えば、胚、花粉、胚珠、子葉、葉、茎、花、枝、葉柄、果実、根、根端、葯などを含む。更に、種子は植物であると理解される。
【００１８】
「高蛋白質コムギ植物」とは、本明細書で開示される方法によって作出され、本発明のコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子の少なくとも１つのコピーをそのゲノムに含まない類似コムギ植物のレベルを超えて増加した穀粒蛋白質含量レベルを有する穀粒を産生し、或いは産生することが可能なコムギ植物を意味するものとする。本発明の好ましい実施形態では、高蛋白質コムギ植物はＴｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍコムギ植物である。
【００１９】
本発明の高蛋白質コムギ植物によって産生される穀粒は、本明細書で「高蛋白質穀粒」と称される。
【００２０】
本発明の「高蛋白質特性」とは高穀粒蛋白質含量であり、コムギ植物のゲノムにおける本発明のコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子又はポリヌクレオチドの存在によるものである。そのようなＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子には、限定されないが、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ Ｌ．，Ｔ．ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ Ｌ．，Ｔ．ｔｕｒｇｉｄｕｍ Ｌ．（限定されないが、亜種ペルシャコムギ（ｃａｒｔｈｌｉｃｕｍ）、デュラム（ｄｕｒｕｍ）、ノハラフタツブコムギ（ｄｉｃｏｃｃｏｉｄｅｓ）、エンマーコムギ（ｄｉｃｏｃｃｕｍ）、ポーランドコムギ（ｐｏｌｏｎｉｃｕｍ）及びｔｕｒａｎｉｃｕｍ）及びＴ．ｓｐｅｌｔａ Ｌ．を含む、Ａゲノムを有する任意のコムギ種由来のＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子が含まれる。
【００２１】
本発明は、穀粒蛋白質含量が増加した穀粒を産生する高蛋白質コムギ植物を提供する。通常、穀粒蛋白質含量は成熟乾燥穀粒の重量パーセントとして求められる。一般に、本発明のコムギ植物によって産生される穀粒の蛋白質含量は、コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子の少なくとも１つのコピーを含まない類似対照コムギ植物より少なくとも約４，５，６又は７％高い。好ましくは、本発明のコムギ植物によって産生される穀粒の蛋白質含量は、類似対照コムギ植物より少なくとも約８，９，１０又は１１％高い。より好ましくは、本発明のコムギ植物によって産生される穀粒の蛋白質含量は、類似対照コムギ植物より少なくとも約１２，１３，１４又は１５％高い。更に好ましくは、本発明のコムギ植物によって産生される穀粒の蛋白質含量は、類似対照コムギ植物より少なくとも約１５，１６，１７又は１８％高い。更に一層好ましくは、本発明のコムギ植物によって産生される穀粒の蛋白質含量は、類似対照コムギ植物より少なくとも約１９，２０，２１又は２２％高い。最も好ましくは、本発明のコムギ植物によって産生される穀粒の蛋白質含量は、類似対照コムギ植物より少なくとも約２３％高い。
【００２２】
本発明は、穀粒蛋白質含量又は他の穀粒構成要素、例えば、含水量及び個々のアミノ酸の濃度を求めるための特定の方法に依存しない。穀粒蛋白質含量、水分及び個々のアミノ酸を求めるには、当該技術分野において公知の任意の方法を用いることができる。例えば、ＡＯＡＣインターナショナルの公定分析法（２００５）、第１８版、ＡＯＡＣインターナショナル、米国メリーランド州ゲイサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、公定法９９０．０３（粗蛋白質）、９３０．１５（水分）及び９８２．３０（アミノ酸／蛋白質効率比）を参照されたい；参照して本明細書に組み込まれる。
【００２３】
本明細書で用いられるように、植物の「誘導体」又は「誘導コムギ植物」は、本発明の高蛋白質コムギ植物の子孫又はクローンであるコムギ植物であり、高蛋白質コムギ植物から継承されたコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子の少なくとも１つのコピーを含み、別段の記載がない限り、或いは文脈から明らかでない限り、やはり本明細書で定義づけされるような高蛋白質コムギ植物である。そのような誘導体又は誘導コムギ植物には、有性及び／又は無性生殖から生じる高蛋白質コムギ植物の子孫が含まれ、従って、非トランスジェニック及びトランスジェニックコムギ植物が含まれる。
【００２４】
本発明は、除草剤耐性又は除草剤抵抗性コムギ植物である高蛋白質コムギ植物に関する。「除草剤耐性」又は「除草剤抵抗性」植物とは、通常であれば正常又は野生型植物を枯死させ、或いはその生育を阻害する濃度において少なくとも１つの除草剤に対して耐性又は抵抗性である植物であるということである。本発明の高蛋白質コムギ植物は除草剤耐性又は除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬ蛋白質、特に、ＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎを含む。「除草剤耐性ＡＨＡＳＬ蛋白質」又は「除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬ蛋白質」とは、ＡＨＡＳ活性を妨害することが知られている、少なくとも１つの除草剤の存在下、野生型ＡＨＡＳＬ蛋白質のＡＨＡＳ活性を阻害することが知られている除草剤の濃度又はレベルにおいて、そのようなＡＨＡＳＬ蛋白質が野生型ＡＨＡＳＬ蛋白質のＡＨＡＳ活性と比べ、高いＡＨＡＳ活性を示すということである。更に、そのような除草剤耐性又は除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬ蛋白質のＡＨＡＳ活性は、本明細書で「除草剤耐性」又は「除草剤抵抗性」ＡＨＡＳ活性と称される場合がある。
【００２５】
本発明では、「除草剤耐性（ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ−ｔｏｌｅｒａｎｔ）」及び「除草剤抵抗性（ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）」という用語は置き換え可能に用いられ、同意義及び同等範囲を有するものとする。同様に、「除草剤耐性（ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ−ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）」及び「除草剤抵抗性（ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）」という用語は置き換え可能に用いられ、同意義及び同等範囲を有するものとする。同様に、「イミダゾリノン抵抗性（ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）」及び「イミダゾリノン抵抗性（ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ」）という用語は置き換え可能に用いられ、それぞれ「イミダゾリノン耐性（ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ−ｔｏｌｅｒａｎｔ）」及び「イミダゾリノン耐性（ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ−ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）」という用語と同等の意味及び同等の範囲であるものとする。
【００２６】
本発明は、除草剤抵抗性コムギＡＨＡＳＬポリヌクレオチド及び除草剤抵抗性コムギＡＨＡＳＬ蛋白質、特に、コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子若しくはポリヌクレオチド及びコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ蛋白質の使用を包含する。「除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬポリヌクレオチド」とは、除草剤抵抗性ＡＨＡＳ活性を含む蛋白質をコードするポリヌクレオチドであるものとする。「除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬ蛋白質」とは、除草剤抵抗性ＡＨＡＳ活性を含む蛋白質又はポリペプチドであるものとする。
【００２７】
更に、除草剤耐性又は除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬ蛋白質をコードするヌクレオチド配列で植物又はその祖先を形質転換することにより、除草剤耐性又は除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬ蛋白質を植物に導入することができることが理解される。そのような除草剤耐性又は除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬ蛋白質は、除草剤耐性又は除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬポリヌクレオチドにコードされる。代替的には、除草剤耐性又は除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬ蛋白質は、植物又はその祖先のゲノムにおける内在性ＡＨＡＳＬ遺伝子の天然由来又は誘発突然変異の結果として植物に生じてもよい。
【００２８】
本発明は、少なくとも１つの除草剤、詳細には、ＡＨＡＳ酵素の活性を妨害する除草剤、より詳細には、イミダゾリノン系又はスルホニルウレア系除草剤に対する耐性を含む高蛋白質コムギ植物及び植物組織、植物細胞及びその穀粒を提供する。除草剤の好ましい量又は濃度は、「有効量」又は「有効濃度」である。「有効量」及び「有効濃度」とは、それぞれ、類似野生型植物、植物組織、植物細胞、小胞子又は宿主細胞を死滅させ、或いはその成長を阻害するのに十分な量及び濃度であるが、前記量では本発明の除草剤抵抗性植物、植物組織、植物細胞、小胞子及び宿主細胞を死滅させ、或いはそれらの成長を著しく阻害しない。典型的には、除草剤の有効量は、対象とする雑草を枯死させるために農業生産システムにおいて日常的に用いられる量である。そのような量は当業者には公知であり、或いは当該技術分野において公知の方法を用いて容易に求めることができる。更に、農業生産システムにおける除草剤の有効量は、例えば、下述の実施例１における小胞子培養系のような植物培養系に対する除草剤の有効量と実質的に異なり得ることが理解される。
【００２９】
本発明の除草剤は、除草剤の存在下、ＡＨＡＳ活性が低下するように、ＡＨＡＳ酵素の活性を妨害する除草剤である。そのような除草剤もまた本明細書で「ＡＨＡＳ阻害除草剤」又は単に「ＡＨＡＳ阻害剤」とも称される場合がある。本明細書で用いられるように、「ＡＨＡＳ阻害除草剤」又は「ＡＨＡＳ阻害剤」は、ＡＨＡＳ酵素の活性を妨害する単一の除草剤を意味するものではない。従って、別段の記載がない限り、或いは文脈から明らかでない限り、「ＡＨＡＳ阻害除草剤」又は「ＡＨＡＳ阻害剤」は１つの除草剤又は２，３，４若しくはそれ以上の除草剤の混合物でよく、それらの各々がＡＨＡＳ酵素の活性を妨害し得る。
【００３０】
「類似野生型コムギ植物」とは、本明細書で開示される高蛋白質穀粒及び除草剤抵抗性特性を欠いたコムギ植物とするものである。従って、「野生型」という用語の使用は、植物、植物組織、植物細胞又は他の宿主細胞がそのゲノムに組換えＤＮＡを欠き、且つ／或いは本明細書で開示されるものと異なる除草剤抵抗性特性を有さないということを示唆するものではない。
【００３１】
本発明の植物は非トランスジェニック及びトランスジェニック植物を共に含む。「非トランスジェニック植物」とは、そのゲノムに組換えＤＮＡを欠いた植物を意味するものとする。「トランスジェニック植物」とは、そのゲノムに組換えＤＮＡを含む植物を意味するものとする。そのようなトランスジェニック植物は、組換えＤＮＡを植物のゲノムに導入することによって作製され得る。そのような組換えＤＮＡがトランスジェニック植物のゲノムに組み込まれると、該植物の子孫も組換えＤＮＡを含む。少なくとも１つの祖先トランスジェニック植物の少なくとも一部分の組換えＤＮＡを含む子孫植物もトランスジェニック植物である。
【００３２】
本発明は、コムギＡＨＡＳＬ１Ａ蛋白質の既知の保存領域内にある、アミノ酸位置５７９におけるアミノ酸置換を有するＡＨＡＳＬ１Ａ蛋白質を含むコムギ植物を含む。下記表４を参照されたい。そのようなアミノ酸位置は、アミノ酸が、例えば、アミノ酸配列のＮ末端に付加されるのか、或いは該Ｎ末端から除去されるのかにより、変化し得るということを当業者は理解するであろう。従って、本発明は、前述の位置又は等価な位置（例えば、「アミノ酸位置５７９又は等価な位置」）におけるアミノ酸置換を有するコムギＡＨＡＳＬ１Ａ蛋白質を包含する。「等価な位置」とは、例示のアミノ酸位置と同じ保存領域内にある位置を意味するものとする。下記表４を参照されたい。コムギＡＨＡＳＬ１Ａ蛋白質のアミノ酸５７９と等価な位置がシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＡＨＡＳＬ１Ａ蛋白質のアミノ酸６５３であるため、本発明の分野において十分に受け入れられている命名法に従うように、アミノ酸位置５７９におけるセリンからアスパラギンへの置換を有するコムギＡＨＡＳＬ１Ａ蛋白質は、本明細書ではシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＡＨＡＳＬ１Ａ蛋白質のアミノ酸配列に基づくコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ蛋白質とも称される。同様に、コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ蛋白質をコードする遺伝子又はポリヌクレオチドは、本明細書ではコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子又はコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎポリヌクレオチドと称される。
【００３３】
本発明は、ＡＨＡＳ酵素の活性を妨害する少なくとも１つの除草剤に対する耐性又は抵抗性の亢進を含む高蛋白質コムギ植物に関する。そのようなＡＨＡＳ阻害除草剤には、イミダゾリノン系除草剤、スルホニルウレア系除草剤、トリアゾロピリミジン系除草剤、ピリミジニルオキシベンゾアート系除草剤、スルホニルアミノ・カルボニルトリアゾリノン系除草剤又はこれらの混合物が含まれる。ＡＨＡＳ阻害除草剤はイミダゾリノン系除草剤であることが好ましい。本発明では、イミダゾリノン系除草剤には、限定されないが、ＰＵＲＳＵＩＴ（登録商標）（イマゼタピル）、ＣＡＤＲＥ（登録商標）（イマザピック）、ＲＡＰＴＯＲ（登録商標）（イマザモックス）、ＳＣＥＰＴＥＲ（登録商標）（イマザキン）、ＡＳＳＥＲＴ（登録商標）（イマゼタベンズ）、ＡＲＳＥＮＡＬ（登録商標）（イマザピル）、前述の任意の除草剤の誘導体及び前述の２つ若しくはそれ以上の除草剤の混合物、例えば、イマザピル／イマザモックス（ＯＤＹＳＳＥＹ（登録商標））が含まれる。より具体的には、イミダゾリノン系除草剤は、限定されないが、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−ｉｍｉｄｉａｚｏｌｉｎ−２−イル）−ニコチン酸、［２−（４−イソプロピル）−４−］［メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−３−キノリンカルボン］酸、［５−エチル−２−（４−イソプロピル−］４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−（メトキシメチル）−ニコチン酸、［２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−］イミダゾリン−２−イル）−５−メチルニコチン酸及びメチル［６−（４−イソプロピル−４−］メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｍ−トルイル酸とメチル［２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−］オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｐ−トルイル酸との混合物から選択され得る。５−エチル−２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸及び［２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−］イル）−５−（メトキシメチル）−ニコチン酸が好ましい。［２−（４−イソプロピル−４−］メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−（メトキシメチル）−ニコチン酸が特に好ましい。
【００３４】
スルホニルウレア系除草剤には、限定されないが、クロルスルフロン、メトスルフロンメチル、スルホメツロンメチル、クロリムロンエチル、チフェンスルフロンメチル、トリベヌロンメチル、ベンスルフロンメチル、ニコスルフロン、エタメツスルフロンメチル、リムスルフロン、トリフルスルフロンメチル、トリアスルフロン、プリミスルフロンメチル、シノスルフロン、アミドスルフロン（ａｍｉｄｏｓｕｌｆｉｕｏｎ）、フラザスルフロン、イマゾスルフロン、ピラゾスルフロンエチル、ハロスルフロン、アジムスルフロン、シクロスルフロン、エトキシスルフロン、フラザスルフロン、フルピルスルフロンメチル、ホラムスルフロン、ヨードスルフロン、オキサスルフロン、メソスルフロン、プロスルフロン、スルホスルフロン、トリフルオキシスルフロン、トリトスルフロン、前述の任意の除草剤の誘導体及び前述の２つ若しくはそれ以上の除草剤の混合物が含まれる。本発明のトリアゾロピリミジン系除草剤には、限定されないが、クロランスラム、ジクロスラム、フロラスラム、フルメツラム、メトスラム及びペノキススラムが含まれる。本発明のピリミジニルオキシベンゾアート系除草剤には、限定されないが、ビスピリバック、ピリチオバック、ピリミノバック、ピリベンゾキシム及びピリフタリドが含まれる。スルホニルアミノ・カルボニルトリアゾリノン系除草剤には、限定されないが、フルカルバゾン及びプロポキシカルバゾンが含まれる。
【００３５】
ピリミジニルオキシベンゾアート系除草剤はピリミジニルチオベンゾアート系除草剤と密接に関連し、米国雑草学会（Ｗｅｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）により、後者の名称の見出しを元に一般化されるものと理解される。従って、本発明の除草剤には、限定されないが、上述のピリミジニルオキシベンゾアート系除草剤を含むピリミジニルチオベンゾアート系除草剤が更に含まれる。
【００３６】
本発明は、高蛋白質コムギ植物を作出するため、コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子の少なくとも１つのコピーをコムギ植物のゲノムに導入する工程を含む、高蛋白質コムギ植物を作出する方法を提供する。本発明の一実施形態では、本発明のコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎポリヌクレオチドに作動可能に結合したプロモーターを含むポリヌクレオチドコンストラクトでコムギ植物を形質転換することにより、コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子の少なくとも１つのコピーがコムギ植物に導入される。該方法は、本発明のポリヌクレオチドコンストラクトを少なくとも１つの植物細胞に導入する工程と、そこから形質転換植物を再生する工程とを含む。該方法は、植物細胞における遺伝子発現を促進することが可能なプロモーターの使用を更に含む。好ましくは、そのようなプロモーターは、特に、蛋白質蓄積が生じることが知られている期間に、成長段階のコムギ穀粒において発現を促進するプロモーターである。そのようなプロモーターには、例えば、構成的プロモーター及び種子優先の（ｓｅｅｄ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）プロモーターが含まれる。この方法によって作出されるコムギ植物は、類似の非形質転換コムギ植物と比べ、ＡＨＡＳ活性、特に、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性の増大及び穀粒蛋白質含量の増加を含む。
【００３７】
本明細書での「ポリヌクレオチドコンストラクト」という用語の使用は、本発明を、ＤＮＡを含むポリヌクレオチドコンストラクトに限定するものではない。ポリヌクレオチドコンストラクト、特に、リボヌクレオチド及びリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドとの組合せからなるポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドも、本明細書で開示される方法において用いられてもよいということを当業者は理解するであろう。従って、本発明のポリヌクレオチドコンストラクトは、植物を形質転換するための本発明の方法において用いることが可能なポリヌクレオチドコンストラクトを包含し、これには、限定されないが、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド及びそれらの組合せからなるポリヌクレオチドコンストラクトが含まれる。そのようなデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドは天然分子及び合成類似体を含む。本発明のポリヌクレオチドコンストラクトは、一本鎖形態、二本鎖形態、ヘアピン、ステム・ループ構造などを含むがこれらに限定されない、あらゆる形態のポリヌクレオチドコンストラクトも包含する。更に、本明細書で開示される各ヌクレオチド配列は該例示ヌクレオチド配列の相補体も包含することも当業者には理解される。
【００３８】
更に、本発明のポリヌクレオチドの植物における発現のため、典型的には、該ポリヌクレオチドは対象とする植物における遺伝子発現を促進することが可能なプロモーターに作動可能に結合されることが理解される。本発明の方法は特定のプロモーターに依存しない。該方法は、当該技術分野において公知であって、対象とする植物における遺伝子発現を促進することが可能な任意のプロモーターの使用を包含する。
【００３９】
一部の実施形態では、本発明の方法は、コムギ植物における発現のための発現カセットに供されるコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎポリヌクレオチドでコムギ植物を形質転換する工程を含む。該カセットはコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎポリヌクレオチドに作動可能に結合した５’及び３’調節配列を含む。「作動可能に結合」とは、プロモーターと第二の配列との機能的結合を意味し、該プロモーター配列は該第二の配列に対応するＤＮＡ配列の転写を開始・媒介する。一般に、作動可能に結合とは、結合される核酸配列が連続的であるということであり、必要な場合、連続的に同じリーディングフレーム内に２つの蛋白質コード領域を結合する。該カセットは生物に同時形質転換される、少なくとも１つの追加遺伝子を更に含んでもよい。代替的には、該追加遺伝子は複数の発現カセットに供せられ得る。
【００４０】
そのような発現カセットは、調節領域の転写調節下となるコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎポリヌクレオチドの挿入のための複数の制限部位を備える。該発現カセットは選択マーカー遺伝子を更に含んでもよい。
【００４１】
該発現カセットは５’−３’転写方向に、植物において機能的な転写・翻訳開始領域（即ち、プロモーター）、本発明のコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎポリヌクレオチド及び転写・翻訳終止領域（即ち、終止領域）を含む。該プロモーターは植物宿主及び／又はコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎポリヌクレオチドに対して天然又は類似或いは外来性又は異種であってもよい。加えて、該プロモーターは天然配列、又は代替的には、合成配列であってもよい。該プロモーターが植物宿主に対して「外来性」又は「異種」である場合、該プロモーターが導入される天然植物に該プロモーターは見出されないということである。該プロモーターがコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎポリヌクレオチドに対して「外来性」又は「異種」である場合、該プロモーターは、作動可能に結合されるコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎポリヌクレオチドに対する天然プロモーターではないということである。本明細書で用いられるように、キメラ遺伝子は、コード配列に対して異種である転写開始領域に作動可能に結合したコード配列を含む。
【００４２】
異種プロモーターを用いてコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎポリヌクレオチドを発現させることが好ましいかもしれないが、天然プロモーター配列を用いてもよい。そのようなコンストラクトは植物又は植物細胞におけるコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ蛋白質の発現レベルを変化させ得る。従って、植物又は植物細胞の表現型が変わる。
【００４３】
該終止領域は、転写開始領域に対して天然であってもよく、作動可能に結合されるコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎポリヌクレオチドに対して天然であってもよく、植物宿主に対して天然であってもよく、或いは別の供給源に由来していてもよい（即ち、プロモーター、対象とするコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎポリヌクレオチド、植物宿主又はそれらの任意の組合せに対して外来性又は異種）。好都合な終止領域は、アグロバクテリウムツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉプラスミドから得られ、例えば、オクトピン合成酵素及びノパリン合成酵素終止領域である。Ｇｕｅｒｉｎｅａｕら（１９９Ｉ）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６２：１４１−１４４；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９９１）Ｃｅｌｌ ６４：６７１−６７４；Ｓａｎｆａｃｏｎら（１９９１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５：１４１−１４９；Ｍｏｇｅｎら（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：１２６１−１２７２；Ｍｕｎｒｏｅら（１９９０）Ｇｅｎｅ ９１：１５１−１５８；Ｂａｌｌａｓら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：７８９１−７９０３；及びＪｏｓｈｉら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１５：９６２７−９６３９も参照されたい。
【００４４】
適宜、遺伝子は形質転換植物における発現増大のために最適化されてもよい。即ち、発現向上のための植物優先（ｐｌａｎｔ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）コドンを用いて遺伝子を合成することができる。例えば、宿主優先（ｈｏｓｔ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）コドンの使用の考察については、Ｃａｍｐｂｅｌｌ及びＧｏｗｒｉ（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９２：１−１１を参照されたい。植物優先（ｐｌａｎｔ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）遺伝子を合成する方法は当該技術分野において利用可能である。例えば、米国特許第５，３８０，８３１号及び第５，４３６，３９１号並びにＭｕｒｒａｙら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：４７７−４９８を参照されたい。これらは参照して本明細書に組み込まれる。
【００４５】
更なる配列の修飾が細胞宿主における遺伝子発現を亢進させることが周知である。これらには、疑似ポリアデニリル化シグナル、エクソン・イントロンスプライス部位シグナルをコードする配列、トランスポゾン様反復配列及び遺伝子発現に有害となってもよい、他のそのような十分に特徴づけられた配列の除去が含まれる。配列のＧ−Ｃ含量は、宿主細胞に発現される既知の遺伝子を参考にして計算することにより、所定の細胞宿主に平均的なレベルに調整されてもよい。可能な場合、予測されるヘアピン二次ｍＲＮＡ構造を回避するため、配列は修飾される。
【００４６】
遺伝子発現を亢進させるためのヌクレオチド配列を植物発現ベクターに用いることもできる。これらには、トウモロコシＡｄｈＩのイントロン、イントロン１遺伝子（Ｃａｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １：１１８３−１２００，１９８７）並びにタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、トウモロコシクロロティックモットルウイルス及びアルファルファモザイクウイルス由来のリーダー配列（Ｗ配列）（Ｇａｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１５：８６９３−８７１１，１９８７及びＳｋｕｚｅｓｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：６５−７９，１９９０）が含まれる。トウモロコシのＳｈｒｕｎｋｅｎ−１遺伝子座の第一イントロンは、キメラ遺伝子コンストラクトにおける遺伝子の発現を増大させることが示されている。米国特許第５，４２４，４１２号及び第５，５９３，８７４号は遺伝子発現コンストラクトにおける特定のイントロンの使用を開示しており、Ｇａｌｌｉｅら（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０６：９２９−９３９，１９９４）も組織特異的ベースで遺伝子発現を調節するのにイントロンが有用であることを示している。ＡＨＡＳ小サブユニット遺伝子の発現を更に亢進させ、或いは最適化するため、本発明の植物発現ベクターはマトリックス結合領域（ＭＡＲｓ）を含むＤＮＡ配列も含んでもよい。そのような改変発現系で形質転換された植物細胞は、次に、本発明のヌクレオチド配列の過剰発現又は構成的発現を示してもよい。
【００４７】
該発現カセットは発現カセットコンストラクトに５’リーダー配列を更に含んでもよい。そのようなリーダー配列は翻訳を促進するように作用することができる。翻訳リーダーは当該技術分野において公知であり、ピコルナウイルスリーダー、例えば、ＥＭＣＶリーダー（脳心筋炎５’非コード領域）（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６１２６−６１３０）；ポチウイルスリーダー、例えば、ＴＥＶリーダー（タバコエッチウイルス）（Ｇａｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ １６５（２ ）：２３３−２３８）、ＭＤＭＶリーダー（トウモロコシ萎縮モザイクウイルス）（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５４：９−２０）及びヒト免疫グロブリン重鎖結合蛋白質（ＢｉＰ）（Ｍａｃｅｊａｋ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５３：９０−９４）；アルファルファモザイクウイルスの外殻蛋白質ｍＲＮＡ由来の非翻訳リーダー（ＡＭＶ ＲＮＡ ４）（Ｊｏｂｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２５：６２２−６２５）；タバコモザイクウイルスリーダー（ＴＭＶ）（Ｇａｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ＲＮＡ，ｅｄ．Ｃｅｃｈ（Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２３７−２５６）；並びにトウモロコシクロロティックモットルウイルスリーダー（ＭＣＭＶ）（Ｌｏｍｍｅｌ ｅｔ ａｌ（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８１：３８２−３８５）を含む。Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａら（１９８７）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４：９６５−９６８も参照されたい。翻訳を促進することが公知の他の方法、例えば、イントロンなども用いることができる。
【００４８】
該発現カセットを調製する際、適切な配向、また、必要に応じて適切なリーディングフレームでのＤＮＡ配列を提供するため、種々のＤＮＡ断片が操作されてもよい。これを目的として、ＤＮＡ断片を結合するのにアダプター又はリンカーが用いられてもよく、或いは好都合な制限部位、余分なＤＮＡの除去、制限部位の除去などを付与するため、他の操作が関与してもよい。これを目的として、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの突然変異生成、プライマー修復、制限、アニーリング、再置換、例えば、トランスバージョン及びトランジションが関与してもよい。
【００４９】
本発明の実施において多くのプロモーターを用いることができる。プロモーターは所望の結果に基づいて選択することができる。核酸は植物における発現のための構成的、組織優先（ｔｉｓｓｕｅ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）又は他のプロモーターと結合され得る。
【００５０】
そのような構成的プロモーターには、例えば、ＷＯ ９９／４３８３８及び米国特許第６，０７２，０５０号に開示されているＲｓｙｎ７プロモーターのコアプロモーター及び他の構成的プロモーター；コアＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０−８１２）；ライスアクチン（ＭｃＥｌｒｏｙ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：１６３−１７１）；ユビキチン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：６１９−６３２及びＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５−６８９）；ｐＥＭＵ（Ｌａｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８１：５８１−５８８）；ＭＡＳ（Ｖｅｌｔｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：２７２３−２７３０）；ＡＬＳプロモーター（米国特許第５，６５９，０２６号）などが含まれる。他の構成的プロモーターには、例えば、米国特許第５，６０８，１４９号；第５，６０８，１４４号；第５，６０４，１２１号；第５，５６９，５９７号；第５，４６６，７８５号；第５，３９９，６８０号；第５，２６８，４６３号；第５，６０８，１４２号；及び第６，１７７，６１１号が含まれる。
【００５１】
組織優先の（ｔｉｓｓｕｅ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）プロモーターは、特定の植物組織内でのＡＨＡＳＬ１発現の亢進を目的とするのに用いられ得る。そのような組織優先の（ｔｉｓｓｕｅ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）プロモーターには、限定されないが、葉優先の（ｌｅａｆ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）プロモーター、根優先の（ｒｏｏｔ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）プロモーター、種子優先の（ｓｅｅｄ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）プロモーター及び茎優先の（ｓｔｅｍ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）プロモーターが含まれる。組織優先の（ｔｉｓｓｕｅ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）プロモーターには、Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｊ．１２（２）：２５５−２６５；Ｋａｗａｍａｔａら（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３８（７）：７９２−８０３；Ｈａｎｓｅｎら（１９９７）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．２５４（３）：３３７−３４３；Ｒｕｓｓｅｌｌら（１９９７）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．６（２）：１５７−１６８；Ｒｉｎｅｈａｒｔら（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（３）：１３３１−１３４１；Ｖａｎ Ｃａｍｐら（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（２）：５２５−５３５；Ｃａｎｅｖａｓｃｉｎｉら（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（２）：５１３−５２４；Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３５（５）：７７３−７７８；Ｌａｍ（１９９４）Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１８１−１９６；Ｏｒｏｚｃｏら（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２３（６）：１１２９−１１３８；Ｍａｔｓｕｏｋａら（１９９３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０（２０）：９５８６−９５９０；及びＧｕｅｖａｒａ−Ｇａｒｃｉａら（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｊ．４（３）：４９５−５０５が含まれる。そのようなプロモーターは、必要であれば微弱な発現のために改変され得る。
【００５２】
一実施形態では、対象とする核酸は発現のために葉緑体を標的とする。この方法では、対象とする核酸は葉緑体に直接挿入されず、発現カセットは、対象とする遺伝子産物を葉緑体に誘導するため、葉緑体輸送ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む葉緑体標的配列を更に含む。そのような輸送ペプチドは当該技術分野において公知である。葉緑体標的配列に関し、「作動可能に結合」とは、輸送ペプチドをコードする核酸配列（即ち、葉緑体標的配列）がコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎポリヌクレオチドに結合し、該２つの配列が連続的で同じリーディングフレーム内にあるようになるということである。例えば、Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅら（１９９１）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．９：１０４−１２６；Ｃｌａｒｋら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７５４４−１７５５０；Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａら（１９８７）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４：９６５−９６８；Ｒｏｍｅｒら（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９６：１４１４−１４２１；及びＳｈａｈら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：４７８−４８１を参照されたい。本発明のＡＨＡＳＬ１蛋白質は天然葉緑体輸送ペプチドを含むが、本発明の成熟ＡＨＡＳＬ１Ａ蛋白質をコードするヌクレオチド配列の５’末端に葉緑体標的配列を作動可能に結合することにより、当該技術分野において公知の任意の葉緑体輸送ペプチドが、本発明の成熟ＡＨＡＳＬ１Ａ蛋白質のアミノ酸配列に融合され得る。
【００５３】
葉緑体標的配列は当該技術分野において公知であり、リブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）の葉緑体小サブユニット（ｄｅ Ｃａｓｔｒｏ Ｓｉｌｖａ Ｆｉｌｈｏ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０：７６９−７８０；Ｓｃｈｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（５）：３３３５−３３４２）；５−（エノールピルビル）シキミ酸−３−リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）（Ａｒｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．Ｂｉｏｍｅｍｂ．２２（６）：７８９−８１０）；トリプトファン合成酵素（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（１１）：６０８１−６０８７）；プラストシアニン（Ｌａｗｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（３３ ）：２０３５７−２０３６３）；コリスミ酸合成酵素（Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（３６）：２７４４７−２７４５７）；及び集光性クロロフィルａ／ｂ結合蛋白質（ＬＨＢＰ）（Ｌａｍｐｐａ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４９９６−１４９９９）を含む。Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅら（１９９１）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．９：１０４−１２６；Ｃｌａｒｋら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７５４４−１７５５０；Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａら（１９８７）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４：９６５−９６８；Ｒｏｍｅｒら（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９６：１４１４−１４２１；及びＳｈａｈら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：４７８−４８１も参照されたい。
【００５４】
葉緑体の形質転換のための方法も当該技術分野において公知である。例えば、Ｓｖａｂら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：８５２６−８５３０；Ｓｖａｂ及びＭａｌｉｇａ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：９１３−９１７；Ｓｖａｂ及びＭａｌｉｇａ（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：６０１−６０６を参照されたい。該方法は、選択マーカーを含むＤＮＡのパーティクルガンによる送達及び相同組換えによる色素体ゲノムへのＤＮＡの標的化に依存する。加えて、核にコードされ、色素体へ方向づけられるＲＮＡポリメラーゼの組織優先の（ｔｉｓｓｕｅ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）発現による、色素体に運ばれるサイレントトランス遺伝子のトランス活性化により、色素体の形質転換を行うことができる。そのようなシステムは、ＭｃＢｒｉｄｅら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：７３０１−７３０５において報告されている。
【００５５】
葉緑体を標的とする対象とする核酸は、植物核とこの細胞小器官とのコドン使用の相違を考慮し、葉緑体における発現のために最適化されてもよい。このように、対象とする核酸は葉緑体優先の（ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）コドンを用いて合成されてもよい。例えば、米国特許第５，３８０，８３１号を参照されたい。これは参照して本明細書に組み込まれる。
【００５６】
本明細書で開示されるように、本発明は、ＡＨＡＳ阻害除草剤に対する抵抗性を含む高蛋白質コムギ植物を作出する方法を提供する。該コムギ植物は、コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子の少なくとも１つのコピーをそのゲノムに含む。そのような遺伝子は、内在性遺伝子又は本明細書で開示されるようなトランス遺伝子であってもよい。加えて、一部の実施形態では、所望の表現型を有するコムギ植物を作出するため、コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子は、他の除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬ１遺伝子を含む、任意の組合せの対象とするポリヌクレオチド配列を積み重ねることができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の毒素蛋白質のような抗虫活性及び／又は殺虫活性を有するポリペプチドをコードする、他の任意のポリヌクレオチドを積み重ねられてもよい（米国特許第５，３６６，８９２号；第５，７４７，４５０号；第５，７３７，５１４号；第５，７２３，７５６号；第５，５９３，８８１号；及びＧｅｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｇｅｎｅ ４８：１０９に述べられている）。生じる組合せは任意の１つの対象とするポリヌクレオチドの複数コピーも含み得る。
【００５７】
本発明の発現カセットは、形質転換細胞の選抜のための選択マーカー遺伝子を含み得る。本発明の選択マーカー遺伝子を含む選択マーカー遺伝子は、形質転換細胞又は組織の選抜のために用いられる。マーカー遺伝子には、限定されないが、抗生物質抵抗性をコードする遺伝子、例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）及びヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）をコードする遺伝子並びに除草性化合物、例えば、グルホシナートアンモニウム、ブロモキシニル、イミダゾリノン及び２，４−ジクロロフェノキシアセタート（２，４−Ｄ）に対する抵抗性を付与する遺伝子が含まれる。Ｙａｒｒａｎｔｏｎ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３：５０６−５１１；Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６３１４−６３１８；Ｙａｏら（１９９２）Ｃｅｌｌ ７１：６３−７２；Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：２４１９−２４２２；Ｔｈｅ ＯｐｅｒｏｎにおけるＢａｒｋｌｅｙら（１９８０），ｐｐ．１７７−２２０；Ｈｕら（１９８７）Ｃｅｌｌ ４８：５５５−５６６；Ｂｒｏｗｎら（１９８７）Ｃｅｌｌ ４９：６０３−６１２；Ｆｉｇｇｅら（１９８８）Ｃｅｌｌ ５２：７１３−７２２；Ｄｅｕｓｃｈｌｅら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ａｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４００−５４０４；Ｆｕｅｒｓｔら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２５４９−２５５３；Ｄｅｕｓｃｈｌｅら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：４８０−４８３；Ｇｏｓｓｅｎ（１９９３）Ｐｈ．Ｄ．論文、ハイデルベルク大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）；Ｒｅｉｎｅｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１９１７−１９２１；Ｌａｂｏｗら（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３３４３−３３５６；Ｚａｍｂｒｅｔｔｉら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：３９５２−３９５６；Ｂａｉｍら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：５０７２−５０７６；Ｗｙｂｏｒｓｋｉら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４６４７−４６５３；Ｈｉｌｌｅｎａｎｄ−Ｗｉｓｓｍａｎ（１９８９）Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．１０：１４３−１６２；Ｄｅｇｅｎｋｏｌｂら（１９９１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３５：１５９１−１５９５；Ｋｌｅｉｎｓｃｈｎｉｄｔら（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：１０９４−１１０４；Ｂｏｎｉｎ（１９９３）Ｐｈ．Ｄ．論文、ハイデルベルク大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）；Ｇｏｓｓｅｎら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７−５５５１；Ｏｌｉｖａら（１９９２）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３６：９１３−９１９；Ｈｌａｖｋａら（１９８５）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７８（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ社、ベルリン）；Ｇｉｌｌら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：７２１−７２４を全体的に参照されたい。そのような開示内容は参照して本明細書に組み込まれる。
【００５８】
上記一覧の選択マーカー遺伝子は限定的なものではない。本発明において任意の選択マーカー遺伝子を用いることができる。
【００５９】
コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドコンストラクト及び発現カセットは、ベクターにおいてコムギ植物を形質転換するのに用いられ得る。コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎポリヌクレオチドは、単独で、或いは植物における除草剤抵抗性を付与する際のＡＨＡＳ酵素の小サブユニット（ＡＨＡＳＳ）をコードするヌクレオチド配列と組合せ、ベクターにおいて用いられ得る。米国特許第６，３４８，６４３号を参照されたい；これは参照して本明細書に組み込まれる。
【００６０】
本発明は、また、蛋白質含量の増加を有する穀粒を産生するとともに除草剤抵抗性であるトランスジェニックコムギ植物を作出する方法に関し、該方法は、コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎポリヌクレオチドに作動可能に結合した、植物における発現を促進するプロモーターを含むポリヌクレオチドコンストラクトで植物を形質転換する工程を含む。
【００６１】
本発明は、また、非トランスジェニックコムギ植物、本発明の方法によって作出されるトランスジェニックコムギ植物並びにそのような非トランスジェニック及びトランスジェニックコムギ植物の後代及び他の子孫に関し、それらの植物はＡＨＡＳ酵素を妨害する除草剤、特に、イミダゾリノン系及びスルホニルウレア系除草剤に対する抵抗性の亢進又は増大を示し、蛋白質含量が増加した穀粒を産生する。
【００６２】
本発明の高蛋白質コムギ植物は、コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子の少なくとも１つのコピーに加え、１つ又はそれ以上の追加ＡＨＡＳＬポリヌクレオチドをそのゲノムに含み得る。除草剤耐性ＡＨＡＳＬ蛋白質をコードする内在性遺伝子を含むヌクレオチド配列及び除草剤耐性ＡＨＡＳＬ蛋白質をコードする内在性遺伝子を含む除草剤耐性植物は、本発明のポリヌクレオチド及び植物並びに当該技術分野において公知のポリヌクレオチド及び植物を含む。例えば、米国特許第５，０１３，６５９号、第５，７３１，１８０号、第５，７６７，３６１号、第５，５４５，８２２号、第５，７３６，６２９号、第５，７７３，７０３号、第５，７７３，７０４号、第５，９５２，５５３号及び第６，２７４，７９６号を参照されたい；これらはすべて参照して本明細書に組み込まれる。
【００６３】
多くの植物形質転換ベクター及び植物を形質転換する方法を利用できる。例えば、Ａｎ，Ｇ．ら（１９８６）Ｐｌａｎｔ Ｐｙｓｉｏｌ．，８１：３０１−３０５；Ｆｒｙ，Ｊ．ら（１９８７）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．６：３２１−３２５；Ｂｌｏｃｋ，Ｍ．（１９８８）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ．７６：７６７−７７４；Ｃｏｕｓｉｎｓら（１９９１）Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１８：４８１−４９４；Ｃｈｅｅ，Ｐ．Ｐ．及びＳｌｉｇｈｔｏｍ，Ｊ．Ｌ．（１９９２）Ｇｅｎｅ １１８：２５５−２６０；Ｃｈｒｉｓｔｏｕら（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：２３９−２４６；Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎら（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０：３０９−３１４；Ｄｈｉｒら（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９９：８１−８８；Ｃａｓａｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１１２１２−１１２１６；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，Ｐ．（１９９３）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．−Ｐｌａｎｔ；２９Ｐ：１１９−１２４；Ｄａｖｉｅｓら（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１２：１８０−１８３；Ｄｏｎｇ，Ｊ．Ａ．及びＭｃｈｕｇｈｅｎ，Ａ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．９１：１３９−１４８；Ｆｒａｎｋｌｉｎ，Ｃ．Ｉ．及びＴｒｉｅｕ，Ｔ．Ｎ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０２：１６７；Ｇｏｌｏｖｋｉｎら（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．９０：４１−５２；Ｇｕｏ Ｃｈｉｎ Ｓｃｉ．Ｂｕｌｌ．３８：２０７２−２０７８；Ａｓａｎｏら（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１３；Ａｙｅｒｅｓ Ｎ．Ｍ．及びＰａｒｋ，Ｗ．Ｄ．（１９９４）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ．Ｓｃｉ．１３：２１９−２３９；Ｂａｒｃｅｌｏら（１９９４）Ｐｌａｎｔ．Ｊ．５：５８３−５９２；Ｂｅｃｋｅｒら（１９９４）Ｐｌａｎｔ．Ｊ．５：２９９−３０７；Ｂｏｒｋｏｗｓｋａら（１９９４）Ａｃｔａ．Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ．１６：２２５−２３０；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，Ｐ．（１９９４）Ａｇｒｏ．Ｆｏｏｄ．Ｉｎｄ．Ｈｉ Ｔｅｃｈ．５：１７−２７；Ｅａｐｅｎら（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１３：５８２−５８６；Ｈａｒｔｍａｎら（１９９４）Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：９１９９２３；Ｒｉｔａｌａら（１９９４）Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３１７−３２５；並びにＷａｎ，Ｙ．Ｃ．及びＬｅｍａｕｘ，Ｐ．Ｇ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０４：３７４８を参照されたい。
【００６４】
本発明の方法は、ポリヌクレオチドコンストラクトを植物に導入する工程を含む。「ポリヌクレオチドコンストラクトを導入する」とは、該コンストラクトが植物の細胞の内部にアクセスできるように、ポリヌクレオチドコンストラクトを植物に提示することを意味するものとする。本発明の方法は、ポリヌクレオチドコンストラクトを植物に導入するための特定の方法に依存せず、単に、ポリヌクレオチドコンストラクトが植物の少なくとも１つの細胞の内部にアクセスするということである。ポリヌクレオチドコンストラクトを植物に導入する方法は当該技術分野において公知であり、限定されないが、安定形質転換法、一過性形質転換法及びウイルス媒介法を含む。
【００６５】
「安定形質転換」とは、植物に導入されるポリヌクレオチドコンストラクトが植物のゲノムに組み込まれ、その子孫に継承されることが可能であるということである。「一過性形質転換」とは、植物に導入されるポリヌクレオチドコンストラクトが植物のゲノムに組み込まれないということである。
【００６６】
植物及び植物細胞の形質転換のため、コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎポリヌクレオチドは、標準的技法を用いて、植物又は植物細胞におけるヌクレオチド配列の発現に適した、当該技術分野において公知の任意のベクターに挿入される。ベクターの選択は、好ましい形質転換法及び形質転換される標的植物種に依存する。本発明の一実施形態では、コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎポリヌクレオチドは、植物細胞における高レベルの発現で周知の植物プロモーターに作動可能に結合され、次に、このコンストラクトはイミダゾリノン系除草剤の影響を受けやすい植物及びそれが再生した形質転換植物に導入される。該形質転換植物は、非形質転換植物を枯死させ、或いは著しく損傷するであろう、あるレベルのイミダゾリノン系除草剤への曝露に対して耐性である。この方法は如何なる植物種にも適用可能であるが、作物、特に、通常、少なくとも１つの除草剤、特に、イミダゾリノン系除草剤の存在下で生育される作物に適用される場合に最も利益がある。
【００６７】
植物発現カセットを構築し、外来性核酸を植物に導入する方法は、当該技術分野において公知であり、過去に報告されている。例えば、外来性ＤＮＡは腫瘍誘発（Ｔｉ）プラスミドベクターを用いて植物に導入され得る。外来性ＤＮＡの送達のために用いられる他の方法は、ＰＥＧ媒介プロトプラスト形質転換、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション ウィスカー並びにＤＮＡの直接取込みのためのバイオリスティックス又は微粒子銃の使用を含む。そのような方法は当該技術分野において公知である（Ｖａｓｉｌらに付与された米国特許第５，４０５，７６５号；Ｂｉｌａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅ １００：２４７−２５０；Ｓｃｈｅｉｄ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２２８：１０４−１１２；Ｇｕｅｒｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ５２：１１１−１１６；Ｎｅｕｈａｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ．７５：３０−３６；Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２７：７０−７３；Ｈｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９８０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０８：１２６５；Ｈｏｒｓｃｈ ｅｔ αｌ．，（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７：１２２９−１２３１；ＤｅＢｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ９１ ：６９４−７０１；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，ｅｄｓ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８８）及びＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｃｈｕｌｅｒ ａｎｄ Ｚｉｅｌｉｎｓｋｉ，ｅｄｓ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８９））。形質転換の方法は、形質転換される植物細胞、使用ベクターの安定性、遺伝子産物の発現レベル及び他のパラメータに依存する。
【００６８】
ヌクレオチド配列を植物細胞に導入し、続いて植物ゲノムに挿入する他の好適な方法には、Ｃｒｏｓｓｗａｙら（１９８６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：３２０−３３４のようなマイクロインジェクション；Ｒｉｇｇｓら（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：５６０２−５６０６に報告されているようなエレクトロポレーション；Ｔｏｗｎｓｅｎｄら、米国特許第５，５６３，０５５号、Ｚｈａｏら、米国特許第５，９８１，８４０号に述べられているようなアグロバクテリウム媒介形質転換；Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：２７１７−２７２２に報告されているような遺伝子直接導入；及び、例えば、Ｓａｎｆｏｒｄら、米国特許第４，９４５，０５０号；Ｔｏｍｅｓら、米国特許第５，８７９，９１８号；Ｔｏｍｅｓら、米国特許第５，８８６，２４４号；Ｂｉｄｎｅｙら、米国特許第５，９３２，７８２号；Ｔｏｍｅｓら（１９９５）「微粒子銃による無傷植物細胞へのＤＮＡ直接導入（Ｄｉｒｅｃｔ ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ Ｉｎｔａｃｔ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌｓ ｖｉａ Ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）」、植物細胞、組織及び器官の培養：基本的方法（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ）、Ｇａｍｂｏｒｇ及びＰｈｉｌｌｉｐｓ（編）（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ社、ベルリン）；ＭｃＣａｂｅら（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：９２３−９２６に述べられているような弾道粒子加速；並びにＬｅｃ１形質転換（ＷＯ ００／２８０５８）が含まれる。Ｗｅｉｓｓｉｎｇｅｒら（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：４２１−４７７；Ｓａｎｆｏｒｄら（１９８７）Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：２７−３７（タマネギ）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕら（１９８８）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８７：６７１−６７４（ダイズ）；ＭｃＣａｂｅら（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：９２３−９２６（ダイズ）；Ｆｉｎｅｒ及びＭｃＭｕｌｌｅｎ（１９９１）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２７Ｐ：１７５−１８２（ダイズ）；Ｓｉｎｇｈら（１９９８）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．９６：３１９−３２４（ダイズ）；Ｄａｔｔａら（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：７３６−７４０（コメ）；Ｋｌｅｉｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：４３０５−４３０９（トウモロコシ）；Ｋｌｅｉｎら（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：５５９−５６３（トウモロコシ）；Ｔｏｍｅｓ、米国特許第５，２４０，８５５号；Ｂｕｉｓｉｎｇら、米国特許第５，３２２，７８３号及び第５，３２４，６４６号；Ｔｏｍｅｓら（１９９５）「微粒子銃による無傷植物細胞へのＤＮＡ直接導入（Ｄｉｒｅｃｔ ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ Ｉｎｔａｃｔ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌｓ ｖｉａ Ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）」、植物細胞、組織及び器官の培養：基本的方法（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ）、Ｇａｍｂｏｒｇ（編）（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ社、ベルリン）（トウモロコシ）；Ｋｌｅｉｎら（１９８８）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：４４０−４４４（トウモロコシ）；Ｆｒｏｍｍら（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：８３３−８３９（トウモロコシ）；Ｈｏｏｙｋａａｓ−Ｖａｎ Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ（ロンドン）３１１：７６３−７６４；Ｂｏｗｅｎら、米国特許第５，７３６，３６９号（穀類）；Ｂｙｔｅｂｉｅｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：５３４５−５３４９（ユリ科）；Ｄｅ Ｗｅｔら（１９８５）、胚珠組織の実験的操作（Ｔｈｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｖｕｌｅ Ｔｉｓｓｕｅｓ）、Ｃｈａｐｍａｎら（編）（Ｌｏｎｇｍａｎ社、ニューヨーク）、ｐｐ．１９７−２０９（花粉）；Ｋａｅｐｐｌｅｒら（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ９：４１５−４１８及びＫａｅｐｐｌｅｒら（１９９２）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８４：５６０−５６６（ウィスカー媒介形質転換）；Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎら（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ４：１４９５−１５０５（エレクトロポレーション）；Ｌｉら（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １２：２５０−２５５並びにＣｈｒｉｓｔｏｕ及びＦｏｒｄ（１９９５）Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙ ７５：４０７−４１３（コメ）；Ｏｓｊｏｄａら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：７４５−７５０（アグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）によるトウモロコシ）も参照されたい。；これらはすべて参照して本明細書に組み込まれる。
【００６９】
本発明のコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎポリヌクレオチドは、植物をウイルス又はウイルス核酸に接触させることにより、植物に導入されてもよい。一般的に、そのような方法は、本発明のポリヌクレオチドコンストラクトをウイルスＤＮＡ又はＲＮＡ分子内に取り込む工程を含む。初めに、コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎポリヌクレオチドはウイルスポリ蛋白質の一部として合成されてもよく、次に、これはｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏにて蛋白質分解によって処理され、所望の組換え蛋白質を生成してもよいということが理解される。更に、本発明のプロモーターは、ウイルスＲＮＡポリメラーゼによる転写に用いられるプロモーターも包含するということが理解される。ポリヌクレオチドコンストラクトを植物に導入し、ウイルスＤＮＡ又はＲＮＡ分子を含む、そこでコードされる蛋白質を発現させる方法は当該技術分野において公知である。例えば、米国特許第５，８８９，１９１号、第５，８８９，１９０号、第５，８６６，７８５号、第５，５８９，３６７号及び第５，３１６，９３１号を参照されたい；これらは参照して本明細書に組み込まれる。
【００７０】
形質転換された細胞は従来の方法に従って植物に生育されてもよい。例えば、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋら（１９８６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５：８１−８４を参照されたい。次に、これらの植物は生育され、同じ形質転換株又は異なる株と受粉されてもよく、その結果生じる、所望の表現型特性の構成的発現を有する交配種が特定される。所望の表現型特性の発現が確実に安定に維持・継承されるように、２又は３世代が生育されてもよく、次に、所望の表現型特性の発現が確実になされているように、種子が収穫される。このように、本発明は、そのゲノムに安定に組み込まれた本発明のポリヌクレオチドコンストラクト、例えば、本発明の発現カセットを有する形質転換種子（「トランスジェニック種子」とも称する）を提供する。
【００７１】
本発明の高蛋白質コムギ植物は雑草を防除する方法に用途を見出す。従って、本発明は、本発明の高蛋白質コムギ植物近傍の雑草を防除する方法を更に提供する。該方法は、有効量の除草剤を雑草及び高蛋白質コムギ植物に塗布する工程を含み、高蛋白質コムギ植物は類似野生型コムギ植物と比べ、少なくとも１つの除草剤、特に、イミダゾリノン系又はスルホニルウレア系除草剤に対する抵抗性の増大を有する。
【００７２】
除草剤、特に、イミダゾリノン系及びスルホニルウレア系除草剤に対する抵抗性の増大を有する高蛋白質コムギ植物を提供することにより、植物の生育を亢進させ、栄養競合を低減するため、植物を雑草から防御するための多彩な製剤が用いられ得る。除草剤はそれ自体で、出芽前、出芽後、栽植前に、また、本明細書で述べる植物を取り囲む領域における雑草の栽植時防除に用いることができ、或いは他の添加剤を含むイミダゾリノン系除草剤製剤を用いることができる。除草剤は種子処理としても用いることができる。それは有効濃度又は有効量の除草剤であり、或いは有効濃度又は有効量の除草剤を含む組成物が、播種前又は播種時に直接種子に塗布され得る。イミダゾリノン系又はスルホニルウレア系除草剤製剤又は組成物に見出される添加剤には、他の除草剤、浄化剤、補助剤、展着剤、固着剤、安定剤などが含まれる。除草剤製剤は湿性又は乾燥調製物であり得、限定されないが、流動性粉末、エマルジョン及び液体濃縮物を含み得る。除草剤及び除草剤製剤は、従来の方法、例えば、噴霧、灌注、散布、被覆などに従って塗布することができる。
【００７３】
本発明は、有性生殖を含む従来の植物育種によって高蛋白質コムギ植物を作出する方法を提供する。該方法は、Ｆ１子孫を作出するため、コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子又はポリヌクレオチドの少なくとも１つのコピーをそのゲノムに含む第一の親コムギ植物を第二の親コムギ植物と交配する工程を含む。該第一の植物は本発明の任意の高蛋白質コムギ植物でよく、例えば、コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子の少なくとも１つのコピーを含むトランスジェニックコムギ植物又は及びコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子を含む非トランスジェニックコムギ植物、例えば、ＷＯ ２００４／１０６５２９並びに米国特許出願公開第２００４／０２３７１３４及び第２００４／０２４４０８０号（これらはすべて参照して本明細書に組み込まれる）に開示されているような突然変異生成によって作出されるコムギ植物を含む。該第二の親コムギ植物は、該第一の植物と交配されると、生存可能な子孫コムギ植物（即ち、種子）を産生することができる任意のコムギ植物でよい。典型的であるが必然的ではなく、該第一及び第二の親コムギ植物は同種コムギである。該方法はＦ１子孫を自家受粉させてＦ２子孫を作出する工程を更に含み得る。加えて、本発明の方法は、Ｆ１又はＦ２子孫植物の該第一又は第二の親コムギ植物と同じ系統又は遺伝子型の植物との戻し交配の第一又はそれ以降の世代を更に含み得る。或いは、第一の交配のＦ１子孫又は任意の後続交配種は、該第一又は第二の植物といずれとも異なる系統又は遺伝子型の第三のコムギ植物と交配され得る。本発明の方法は、例えば、コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子を含む子孫コムギ植物に有効量の除草剤を塗布することにより、或いはＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子を検出する標準的方法、例えば、ＰＣＲのような方法により、該第一の植物の除草剤抵抗性特性を含む植物を選抜する工程を更に含み得る。
【００７４】
本発明は、ＡＨＡＳ阻害除草剤の使用に関わる方法を提供する。これらの方法では、ＡＨＡＳ阻害除草剤は当該技術分野において公知の任意の方法によって塗布され得、これには、限定されないが、種子処理、土壌処理及び葉面処理が含まれる。
【００７５】
塗布前、ＡＨＡＳ阻害除草剤は、通例の製剤、例えば、溶液、エマルジョン、懸濁剤、粉剤、粉末、糊剤及び顆粒に変換され得る。使用形態は個々の使用目的に依存し、各場合、本発明による化合物の微細且つ均一な分布を確実にする必要がある。
【００７６】
製剤は、既知の方法（例えば、概説では、米国特許第３，０６０，０８４号、欧州特許出願７０７ ４４５号（液体濃縮物）、Ｂｒｏｗｎｉｎｇ「凝集（Ａｇｇｌｏｍｅｒａｔｉｏｎ）」、化学工学（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、１９６７年１２月４日、１４７−４８、ペリーの化学技術者ハンドブック（Ｐｅｒｒｙ’ｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒ’ｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ）、第４版、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ社、ニューヨーク、１９６３，８−５７頁及び以下参照として、ＷＯ ９１／１３５４６、米国特許第４，１７２，７１４号、米国特許第４，１４４，０５０号、米国特許第３，９２０，４４２号、米国特許第５，１８０，５８７号、米国特許第５，２３２，７０１号、米国特許第５，２０８，０３０号、英国特許第２，０９５，５５８号、米国特許第３，２９９，５６６号、Ｋｌｉｎｇｍａｎ、科学としての雑草防除（Ｗｅｅｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｓ ａ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、１９６１，Ｈａｎｃｅら、雑草防除ハンドブック（Ｗｅｅｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ）、第８版、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ社、オックスフォード、１９８９並びにＭｏｌｌｅｔ，Ｈ．，Ｇｒｕｂｅｍａｎｎ，Ａ．、配合技術（Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｗｉｌｅｙ ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ、ワインハイム（Ｗｅｉｎｈｅｉｍ）（ドイツ）、２００１，２．Ｄ．Ａ．Ｋｎｏｗｌｅｓ、農芸化学的配合の化学及び技術（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｇｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ）、Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ社、ドルドレヒト（Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ）、１９９８（ＩＳＢＮ ０−７５１４−０４４３−８）を参照されたい）、例えば、農薬の配合に好適な助剤、例えば、溶剤及び／又は担体、所望により、乳化剤、界面活性剤及び分散剤、防腐剤、消泡剤、抗凍結剤で、種子処理の配合には更に場合により着色剤及び／又は結合剤及び／又はゲル化剤で活性化合物を伸長させることによって調製される。
【００７７】
好適な溶剤例は、水、芳香族溶剤（例えば、Ｓｏｌｖｅｓｓｏ製品、キシレン）、パラフィン（例えば、鉱油留分）、アルコール（例えば、メタノール、ブタノール、ペンタノール、ベンジルアルコール）、ケトン（例えば、シクロヘキサノン、ガンマ−ブチロラクトン）、ピロリドン（ＮＭＰ，ＮＯＰ）、アセタート（グリコールジアセタート）、グリコール、脂肪酸ジメチルアミド、脂肪酸及び脂肪酸エステルである。原則として溶剤混合物も用いられてもよい。
【００７８】
好適な担体例は、研削天然鉱物（例えば、カオリン、粘土、タルク、チョーク）及び研削合成鉱物（例えば、高分散シリカ、ケイ酸塩）である。
【００７９】
好適な乳化剤は、非イオン性及びアニオン系乳化剤である（例えば、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル、アルキルスルホン酸塩及びアリールスルホン酸塩）。
【００８０】
好適な分散剤例は、リグニン−亜硫酸廃液及びメチルセルロースである。
【００８１】
用いられる好適な界面活性剤は、リグノスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、フェノールスルホン酸、ジブチルナフタレンスルホン酸、アルキルアリールスルホン酸塩、アルキル硫酸塩、アルキルスルホン酸塩、脂肪アルコールスルホン酸塩、脂肪酸及び硫酸化脂肪アルコールグリコールエーテルのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩並びにアンモニウム塩、更に、スルホン化ナフタレン及びナフタレン誘導体のホルムアルデヒドとの凝縮物、ナフタレン又はナフタレンスルホン酸のフェノール及びホルムアルデヒドとの凝縮物、ポリオキシエチレンオクチルフェノールエーテル、エトキシル化イソオクチルフェノール、オクチルフェノール、ノニルフェノール、アルキルフェノールポリグリコールエーテル、トリブチルフェニルポリグリコールエーテル、トリステアリルフェニルポリグリコールエーテル、アルキルアリールポリエーテルアルコール、アルコール及び脂肪アルコールエチレンオキシド凝縮物、エトキシル化ヒマシ油、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、エトキシル化ポリオキシプロピレン、ラウリルアルコールポリグリコールエーテルアセタール、ソルビトールエステル、リグノ亜硫酸塩廃液並びにメチルセルロースである。
【００８２】
直接噴霧可能な溶液、エマルジョン、糊剤又は油中分散液の調製に好適な物質は、中〜高沸点の鉱油留分、例えば、ケロシン又はディーゼル油、更に、コールタール油並びに植物又は動物由来油、脂肪族、環状及び芳香族炭化水素、例えば、トルエン、キシレン、パラフィン、テトラヒドロナフタレン、アルキル化ナフタレン又はそれらの誘導体、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、シクロヘキサノール、シクロヘキサノン、イソホロン、高極性溶剤、例えば、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドン又は水である。
【００８３】
抗凍結剤、例えば、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール及び殺菌剤も製剤に加えることができる。
【００８４】
好適な消泡剤は、例えば、シリコン又はステアリン酸マグネシウム系の消泡剤である。
【００８５】
好適な防腐剤は、例えば、ジクロロフェン及びエンジルアルコールヘミホルマール（ｅｎｚｙｌａｌｋｏｈｏｌｈｅｍｉｆｏｒｍａｌ）である。
【００８６】
種子処理製剤は結合剤及び場合により着色剤を更に含んでもよい。
【００８７】
処理後、活性物質の種子への付着を向上させるため、結合剤を加えることができる。好適な結合剤はブロックコポリマーＥＯ／ＰＯ界面活性剤であるが、ポリビニルアルコール（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌａｌｃｏｈｏｌｓｌ）、ポリビニルピロリドン、ポリアクリラート、ポリメタクリラート、ポリブテン、ポリイソブチレン、ポリスチレン、ポリエチレンアミン、ポリエチレンアミド、ポリエチレンイミン（Ｌｕｐａｓｏｌ（登録商標）、Ｐｏｌｙｍｉｎ（登録商標））、ポリエーテル、ポリウレタン、ポリビニルアセタート、チロース及びこれらのポリマーから得られるコポリマーでもよい。
【００８８】
場合により、製剤中に着色剤も含まれ得る。種子処理製剤に好適な着色剤又は染料は、ローダミンＢ，Ｃ．Ｉ．顔料赤色１１２，Ｃ．Ｉ．溶剤赤色１、顔料青色１５：４、顔料青色１５：３、顔料青色１５：２、顔料青色１５：１、顔料青色８０、顔料黄色１、顔料黄色１３、顔料赤色１１２、顔料赤色４８：２、顔料赤色４８：１、顔料赤色５７：１、顔料赤色５３：１、顔料橙色４３、顔料橙色３４、顔料橙色５、顔料緑色３６、顔料緑色７、顔料白色６、顔料茶色２５、塩基性紫色１０、塩基性紫色４９、酸性赤色５１、酸性赤色５２、酸性赤色１４、酸性青色９、酸性黄色２３、塩基性赤色１０、塩基性赤色１０８である。
【００８９】
好適なゲル化剤例はカラギーン（Ｓａｔｉａｇｅｌ（登録商標））である。
【００９０】
粉末、展着用の物質及び散布可能な生成物は、活性物質を固体担体と混合し、或いは同時研削することによって調製され得る。
【００９１】
顆粒、例えば、被覆顆粒、含浸顆粒及び均質顆粒は、活性化合物を固体担体に結合することによって調製され得る。固体担体例は、土類鉱物、例えば、シリカゲル、ケイ酸塩、タルク、カオリン、アタクレー（ａｔｔａｃｌａｙ）、石灰石、石灰、チョーク、赤土、黄土、粘土、白雲石、珪藻土、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、酸化マグネシウム、研削合成物質、肥料、例えば、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、ウレア及び植物由来の生成物、例えば、穀粉、樹皮粉、樹木粉及び堅果殻粉、セルロース粉末並びに他の固体担体である。
【００９２】
一般的に、該製剤は０．０１〜９５重量％、好ましくは、０．１〜９０重量％のＡＨＡＳ阻害除草剤を含む。この場合、ＡＨＡＳ阻害除草剤は９０〜１００重量％、好ましくは、９５〜１００重量％の純度にて用いられる（ＮＭＲスペクトルによる）。種子処理を目的として、それぞれの製剤は２〜１０倍希釈され、０．０１〜６０重量％の活性化合物重量、好ましくは、０．１〜４０重量％の使用可能な調製物の濃度となり得る。
【００９３】
ＡＨＡＳ阻害除草剤は、そのように、その製剤形態又はそれから調製される使用形態、例えば、直接噴霧可能な溶液、粉末、懸濁液若しくは分散液、エマルジョン、油中分散液、糊剤、散布可能な生成物、展着用の物質又は噴霧、微粒化、散布若しくは流込による顆粒の形態にて用いられ得る。その使用形態は使用目的に完全に依存する。その使用形態は、本発明に従って、各場合にＡＨＡＳ阻害除草剤の可能な限りに微細な分布を確実にすることを目的とする。
【００９４】
水性使用形態は、水を加えることにより、エマルジョン濃縮物、糊剤又は水和剤（噴霧可能な粉末、油中分散液）から調製され得る。エマルジョン、糊剤又は油中分散液を調製するため、そのような状態の、或いは油又は溶剤中に溶解された物質は、湿潤剤、粘着付与剤、分散剤又は乳化剤によって水中にて均質化され得る。しかし、活性物質、湿潤剤、粘着付与剤、分散剤又は乳化剤、並びに、適宜、溶剤又は油からなる濃縮物を調製することも可能であり、そのような濃縮物は水による希釈に適する。
【００９５】
即時使用可能な調製物中の活性化合物の濃度は、比較的広範な範囲内にて多様であり得る。概して、その濃度は０．０００１〜１０重量％、好ましくは、０．０１〜１重量％である。
【００９６】
ＡＨＡＳ阻害除草剤は超微量プロセス（ｕｌｔｒａ−ｌｏｗ−ｖｏｌｕｍｅ ｐｒｏｃｅｓｓ）（ＵＬＶ）にても良好に用いられてもよく、９５重量％超の活性化合物を含む製剤を適用し、更に、添加剤を含まない活性化合物を適用することが可能である。
【００９７】
以下は製剤例である。
【００９８】
１．葉面用途の水による希釈用の生成物。種子処理を目的として、そのような生成物は希釈され、或いは希釈されずに種子に塗布されてもよい。
Ａ）水溶性濃縮物（ＳＬ，ＬＳ）
１０重量部のＡＨＡＳ阻害除草剤が９０重量部の水又は水溶性溶剤中に溶解される。代替として湿潤剤又は他の助剤が加えられる。ＡＨＡＳ阻害除草剤は水による希釈と同時に溶解し、それにより、１０％（ｗ／ｗ）ＡＨＡＳ阻害除草剤を含む製剤が得られる。
Ｂ）分散性濃縮物（ＤＣ）
２０重量部のＡＨＡＳ阻害除草剤が、１０重量部の分散剤、例えば、ポリビニルピロリドンを加えた７０重量部のシクロヘキサノン中に溶解される。水による希釈によって分散液が得られ、それにより、２０％（ｗ／ｗ）ＡＨＡＳ阻害除草剤を含む製剤が得られる。
Ｃ）乳化性濃縮物（ＥＣ
１５重量部のＡＨＡＳ阻害除草剤が、ドデシルベンゼンスルホン酸カルシウム及びヒマシ油エトキシレート（各場合、５重量部）を加えた７重量部のキシレン中に溶解される。水による希釈によってエマルジョンが得られ、それにより、１５％（ｗ／ｗ）ＡＨＡＳ阻害除草剤を含む製剤が得られる。
Ｄ）エマルジョン（ＥＷ，ＥＯ，ＥＳ）
２５重量部のＡＨＡＳ阻害除草剤が、ドデシルベンゼンスルホン酸カルシウム及びヒマシ油エトキシレート（各場合、５重量部）を加えた３５重量部のキシレン中に溶解される。この混合物は、乳化機（例えば、Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘ）によって３０重量部の水に導入され、均質なエマルジョンになされる。水による希釈によってエマルジョンが得られ、それにより、２５％（ｗ／ｗ）ＡＨＡＳ阻害除草剤を含む製剤が得られる。
Ｅ）懸濁剤（ＳＣ，ＯＤ，ＦＳ）
攪拌ボールミルにて、２０重量部のＡＨＡＳ阻害除草剤が、１０重量部の分散剤、浸潤剤及び７０重量部の水若しくは有機溶剤を加えて粉砕され、微細なＡＨＡＳ阻害除草剤懸濁液が得られる。水による希釈によってＡＨＡＳ阻害除草剤の安定した懸濁液が得られ、それにより、２０％（ｗ／ｗ）ＡＨＡＳ阻害除草剤を含む製剤が得られる。
Ｆ）水分散性顆粒及び水溶性顆粒（ＷＧ，ＳＧ）
５０重量部のＡＨＡＳ阻害除草剤が、５０重量部の分散剤及び浸潤剤を加えて微細に粉砕され、技術的装置（例えば、押出し、噴霧塔、流動床）によって水分散性及び水溶性顆粒として作製される。水による希釈によってＡＨＡＳ阻害除草剤の安定した分散液又は溶液が得られ、それにより、５０％（ｗ／ｗ）ＡＨＡＳ阻害除草剤を含む製剤が得られる。
Ｇ）水分散性粉末及び水溶性粉末（ＷＰ，ＳＰ，ＳＳ，ＷＳ）
７５重量部のＡＨＡＳ阻害除草剤が、２５重量部の分散剤、浸潤剤及びシリカゲルを加えたローター・ステーターミルにて微細に粉砕される。水による希釈によってＡＨＡＳ阻害除草剤の安定した分散液又は溶液が得られ、それにより、７５％（ｗ／ｗ）ＡＨＡＳ阻害除草剤を含む製剤が得られる。
Ｉ）ゲル製剤（ＧＦ）
攪拌ボールミルにて、２０重量部のＡＨＡＳ阻害除草剤が、１０重量部の分散剤、１重量部のゲル化剤浸潤剤及び７０重量部の水若しくは有機溶剤を加えて粉砕され、微細なＡＨＡＳ阻害除草剤懸濁液が得られる。水による希釈によってＡＨＡＳ阻害除草剤の安定した懸濁液が得られ、それにより、２０％（ｗ／ｗ）ＡＨＡＳ阻害除草剤を含む製剤が得られる。このゲル製剤は種子処理としての使用に適する。
【００９９】
２．葉面用途の希釈されずに適用される生成物。種子処理を目的として、そのような生成物は希釈されて種子に塗布されてもよい。
Ａ）散布可能粉末（ＤＰ，ＤＳ）
５重量部のＡＨＡＳ阻害除草剤が微細に粉砕され、９５重量部の微細に粉砕されたカオリンと密に混合される。これにより、５％（ｗ／ｗ）ＡＨＡＳ阻害除草剤を有する散布可能な生成物が得られる。
Ｂ）顆粒（ＧＲ，ＦＧ，ＧＧ，ＭＧ）
０．５重量部のＡＨＡＳ阻害除草剤が微細に粉砕され、９５．５重量部の担体と結合され、それにより、０．５％（ｗ／ｗ）ＡＨＡＳ阻害除草剤を含む製剤が得られる。現行の方法は、押出し、噴霧乾燥又は流動床である。これにより、葉面用途に希釈されずに適用される顆粒が得られる。
【０１００】
従来の種子処理製剤には、例えば、流動性濃縮物ＦＳ、溶液ＬＳ、乾燥処理用粉末ＤＳ、スラリー処理用の水分散性粉末ＷＳ、水溶性粉末ＳＳ及びエマルジョンＥＳ／ＥＣ並びにゲル製剤ＧＦが含まれる。これらの製剤は希釈され、或いは希釈されずに種子に塗布され得る。種子への塗布はいずれも直接種子に播種前に行われる。
【０１０１】
好ましい実施形態では、ＦＳ製剤が種子処理に用いられる。典型的には、ＦＳ製剤は、１〜８００ｇ／ｌの活性成分、１〜２００ｇ／ｌの界面活性剤、０〜２００ｇ／ｌの抗凍結剤、０〜４００ｇ／ｌの結合剤、０〜２００ｇ／ｌの色素及び最大１リットルの溶剤、好ましくは、水を含んでもよい。
【０１０２】
種子処理では、本発明による高蛋白質コムギ植物の種子は、除草剤、好ましくは、アミドスルフロン、アジムスルフロン、ベンスルフロン、クロリムロン、クロルスルフロン、シノスルフロン、シクロスルファムロン、エタメトスルフロン、エトキシスルフロン、フラザスルフロン、フルピルスルフロン、ホラムスルフロン、ハロスルフロン、イマゾスルフロン、ヨードスルフロン、メソスルフロン、メトスルフロン、ニコスルフロン、オキサスルフロン、プリミスルフロン、プロスルフロン、ピラゾスルフロン、リムスルフロン、スルホメツロン、スルホスルフロン、チフェンスルフロン、トリアスルフロン、トリベヌロン、トリフロキシスルフロン、トリフルスルフロン、トリトスルフロン、イマザメタベンズ、イマザモックス、イマザピック、イマザピル、イマザキン、イマゼタピル、クロランスラム、ジクロスラム、フロラスラム、フルメツラム、メトスラム、ペノキススラム、ビスピリバック、ピリミノバック、プロポキシカルバゾン、フルカルバゾン、ピリベンゾキシム、ピリフタリド、ピリチオバック及びそれらの混合物のようなＡＨＡＳ阻害除草剤からなる群より選択される除草剤或いはＡＨＡＳ阻害除草剤を含む製剤で処理される。より好ましくは、本発明による高蛋白質コムギ植物の種子はイミダゾリノン系除草剤で処理される。
【０１０３】
「種子処理」という用語は、当該技術分野において公知のあらゆる好適な種子処理法、例えば、種子粉衣、種子被覆、種子消毒、浸種、種子ペレット成形を含む。
【０１０４】
本発明の一変形例に従って、本発明の更なる主題は、特に、播種機への適用による土壌を処理する方法である：組成物／製剤としてＡＨＡＳ阻害除草剤を含む、いずれもの顆粒状製剤（例えば、場合により、１つ若しくはそれ以上の固体又は液体の農薬として許容可能な担体、並びに／或いは、場合により、１つ又はそれ以上の農薬として許容可能な界面活性剤を含む顆粒状製剤）。この方法は、例えば、穀類、トウモロコシ、綿花、ヒマワリの播種床に、好都合に用いられる。
【０１０５】
本発明は、アミドスルフロン、アジムスルフロン、ベンスルフロン、クロリムロン、クロルスルフロン、シノスルフロン、シクロスルファムロン、エタメトスルフロン、エトキシスルフロン、フラザスルフロン、フルピルスルフロン、ホラムスルフロン、ハロスルフロン、イマゾスルフロン、ヨードスルフロン、メソスルフロン、メトスルフロン、ニコスルフロン、オキサスルフロン、プリミスルフロン、プロスルフロン、ピラゾスルフロン、リムスルフロン、スルホメツロン、スルホスルフロン、チフェンスルフロン、トリアスルフロン、トリベヌロン、トリフロキシスルフロン、トリフルスルフロン、トリトスルフロン、イマザメタベンズ、イマザモックス、イマザピック、イマザピル、イマザキン、イマゼタピル、クロランスラム、ジクロスラム、フロラスラム、フルメツラム、メトスラム、ペノキススラム、ビスピリバック、ピリミノバック、プロポキシカルバゾン、フルカルバゾン、ピリベンゾキシム、ピリフタリド及びピリチオバックから選択される、少なくとも１つのＡＬＳ阻害剤を含む種子処理製剤を被覆され、或いはそれを含む種子も含む。該ＡＬＳ阻害剤はイミダゾリノン系除草剤であることが好ましい。
【０１０６】
種子という用語は、あらゆる種類の種子及び植物珠芽を包含し、限定されないが、真正種子、種子片、吸枝、球茎、球根、果実、塊茎、穀粒、挿し穂、切芽（ｃｕｔ ｓｈｏｏｔｓ）などを含み、好ましい実施形態では、真正種子を意味する。
【０１０７】
一般的に、「〜を被覆される及び／又は含む」という用語は、活性成分の大部分が塗布時に繁殖生成物の表面上にあるが、塗布方法により、活性成分が多かれ少なかれ、繁殖生成物に浸透してもよいということを意味する。前記繁殖生成物が植えられる（植え直される）と、それは活性成分を吸収してもよい。
【０１０８】
ＡＨＡＳ阻害除草剤又はＡＨＡＳ阻害除草剤を含む製剤による種子処理の適用は、植物の播種前及び植物の出芽前、種子に噴霧或いは散布することによって行われる。
【０１０９】
種子処理では、対応する製剤は、有効量のＡＨＡＳ阻害除草剤又はＡＨＡＳ阻害除草剤を含む製剤で種子を処理することによって塗布される。本明細書では、概して、塗布量は、種子１００ｋｇ当たり０．１ｇ〜１０ｋｇの阻害剤（ａ．ｉ）（或いは阻害剤（ａ．ｉ）の混合物又は製剤）、好ましくは、種子１００ｋｇ当たり１ｇ〜５ｋｇ、特に、種子１００ｋｇ当たり１ｇ〜２．５ｋｇである。レタスのような特定の作物では、その量はより多い。
【０１１０】
本発明の高蛋白質コムギ植物は、望ましくない植物に対抗し、或いは雑草を防除する方法に用途を見出し、該方法は、播種前及び／又は発芽前、本発明による高蛋白質コムギ植物の種子をＡＨＡＳ阻害除草剤に接触させる工程を含む。該方法は、例えば、田畑の土壌又は温室の培養土に種子を播種する工程を更に含み得る。該方法は、特に、種子近傍における望ましくない植物に対抗し、或いは雑草を防除することに用途を見出す。
【０１１１】
望ましくない植物の防除は、雑草を枯死させ、且つ／或いは雑草の正常な成長を遅延させ、又は阻害することを意味するものと理解される。広義の雑草は望まれない場所で成長するあらゆる植物を意味するものと理解される。
【０１１２】
本発明の雑草は、例えば、双子葉及び単子葉雑草を含む。双子葉雑草は、限定されないが、Ｓｉｎａｐｉｓ属、Ｌｅｐｉｄｉｕｍ属、Ｇａｌｉｕｍ属、Ｓｔｅｌｌａｒｉａ属、Ｍａｔｒｉｃａｒｉａ属、Ａｎｔｈｅｍｉｓ属、Ｇａｌｉｎｓｏｇａ属、Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ属、Ｕｒｔｉｃａ属、Ｓｅｎｅｃｉｏ属、Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ属、Ｐｏｒｔｕｌａｃａ属、Ｘａｎｔｈｉｕｍ属、Ｃｏｎｖｏｌｖｕｌｕｓ属、Ｉｐｏｍｏｅａ属、Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ，属、Ｓｅｓｂａｎｉａ属、Ａｍｂｒｏｓｉａ属、Ｃｉｒｓｉｕｍ属、Ｃａｒｄｕｕｓ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｓｏｌａｎｕｍ属、Ｒｏｒｉｐｐａ属、Ｒｏｔａｌａ属、Ｌｉｎｄｅｒｎｉａ属、Ｌａｍｉｕｍ属、Ｖｅｒｏｎｉｃａ属、Ａｂｕｔｉｌｏｎ属、Ｅｍｅｘ属、Ｄａｔｕｒａ属、Ｖｉｏｌａ属、Ｇａｌｅｏｐｓｉｓ属、Ｐａｐａｖｅｒ属、Ｃｅｎｔａｕｒｅａ属、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ属、Ｒａｎｕｎｃｕｌｕｓ属及びＴａｒａｘａｃｕｍ属の雑草を含む。単子葉雑草は、限定されないが、Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ属、Ｓｅｔａｒｉａ属、Ｐａｎｉｃｕｍ属、Ｄｉｇｉｔａｒｉａ属、Ｐｈｌｅｕｍ属、Ｐｏａ属、Ｆｅｓｔｕｃａ属、Ｅｌｅｕｓｉｎｅ属、Ｂｒａｃｈｉａｒｉａ属、Ｌｏｌｉｕｍ属、Ｂｒｏｍｕｓ属、Ａｖｅｎａ属、Ｃｙｐｅｒｕｓ属、Ｓｏｒｇｈｕｍ属、Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ属、Ｃｙｎｏｄｏｎ属、Ｍｏｎｏｃｈｏｒｉａ属、Ｆｉｍｂｒｉｓｔｙｓｌｉｓ属、Ｓａｇｉｔｔａｒｉａ属、Ｅｌｅｏｃｈａｒｉｓ属、Ｓｃｉｒｐｕｓ属、Ｐａｓｐａｌｕｍ属、Ｉｓｃｈａｅｍｕｍ属、Ｓｐｈｅｎｏｃｌｅａ属、Ｄａｃｔｙｌｏｃｔｅｎｉｕｍ属、Ａｇｒｏｓｔｉｓ属、Ａｌｏｐｅｃｕｒｕｓ属及びＡｐｅｒａ属の雑草を含む。
【０１１３】
加えて、本発明の雑草は、例えば、望まれない場所で生育する作物を含み得る。例えば、主に大豆植物を含む田畑に自生するトウモロコシ植物は、トウモロコシ植物が大豆植物の田畑において望まれない場合、雑草とみなされ得る。
【０１１４】
冠詞“ａ（１つの）”及び“ａｎ（１つの）”は本明細書では１つ又は２つ以上（即ち、少なくとも１つ）の冠詞の文法上の対象を指すのに用いられる。例として、“ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ（１つの要素）”は１つ又はそれ以上の要素を意味する。
【０１１５】
本明細書で用いられるように、単語“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）”又は“ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む）”若しくは“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）”のような変形は、記載の要素、整数若しくは工程又は要素、整数若しくは工程の群の包含を意味するが、他の任意の要素、整数若しくは工程又は要素、整数若しくは工程の群の除外を意味するものではない。
【０１１６】
以下の実施例は例示目的で示されるものであって、限定目的で示されるものではない。
【実施例１】
【０１１７】
（穀粒蛋白質含量の増加を有するコムギ系統）
【０１１８】
標準的な突然変異生成法及び従来の植物育種法を用いてコムギ系統を作出した。突然変異生成の目的は、イミダゾリノン系除草剤に対する耐性を有するコムギ系統を開発することにあった。これらのコムギ系統におけるイミダゾリノン耐性に関与する突然変異は、グアニンからアデニンへの単一ヌクレオチド変更であり、これは、ＡＧＣからＡＡＣへのコドン変更と、ＴａＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎと命名される、ＡＨＡＳＬ（アセトヒドロキシ酸合成酵素大サブユニット）蛋白質におけるセリンからアスパラギンへの単一アミノ酸置換とをもたらす。ＡＨＡＳ酵素は分岐鎖アミノ酸であるバリン、ロイシン及びイソロイシンの生合成における第一工程を触媒し（Ｓｔｉｄｈａｍ ａｎｄ Ｓｉｎｇｈ（１９９１）”Ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ −Ａｃｅｔｏｈｙｄｒｏｘｙａｃｉｄ Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，”Ｉｎ：Ｔｈｅ Ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓ，Ｃｈ．６，Ｓｈａｎｅｒ，Ｄ．，ａｎｄ Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｓ．，ｅｄｓ．；ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，ｐｐ．７１−９０）、植物においてこれらのアミノ酸によるフィードバック調節を受ける。ＡＨＡＳ遺伝子における単一点突然変異は、突然変異ＡＨＡＳ酵素に対するこれらの除草剤の結合部位を変更することにより、イミダゾリノン系除草剤に対する耐性を付与するが、分岐鎖アミノ酸によるフィードバック調節及び該酵素の正常な生合成機能への影響を認めない（Ｎｅｗｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ，（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００：８８２−８８６）（図１）。
【０１１９】
除草剤耐性を示すコムギ系統の選抜プロセスの間、穀粒組成試験を行い、これらの試験から高穀粒蛋白質含量を見出した。これらの試験は異なる地理的位置（カリフォルニア州、ミネソタ州、ノースダコタ州、ワシントン州及びカナダ）で１９９９年から２００４年まで行った（表２）。この特性を示す５系統（ＢＷ２５５−２，ＢＷ２３８−３，Ｋ４２，Ｔｅａｌ１５Ａ及びＥｌｓａｘＥＭ２）は独立して異なる遺伝資源に由来し、独立した突然変異生成事象によるものであり、１系統（ＥｌｓａｘＥＭ２）は突然変異誘発されていたアインコーン（Ｅｉｎｋｏｒｎ）コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ）からの遺伝子移入によって得られた。
【０１２０】
パーセント蛋白価はそれらの親に比べ、ＢＷ２５５−２，ＢＷ２３８−３，Ｋ４２，Ｔｅａｌ１５Ａ及びＥｌｓａｘＥＭ２の方が高かった（表１）。数年及び複数地点での有意な増加は、それぞれの親系統と比べ、３〜１３％の範囲であり（表２）、或いはそれぞれの親と比べ、全系統の複数地点及び数年にわたり、実際の増加は０．４〜２．１％であり、平均１．３％であった。分岐状の変更アミノ酸であるバリン、イソロイシン及びロイシン並びに必須アミノ酸ンであるリシン、メチオニン、シスチン及びスレオニンのアミノ酸価は、通常、有意に高かったが、一部の例外があった（表２）。それぞれの親系統と比べ、平均増加率は６〜１１％の範囲であり（表２）、或いはそれらの親と比べ、全アミノ酸価にわたり、実際の増加率は０．０２〜０．０９％であり、平均０．０４％であった。２００３年及び２００４年に生育させた野外試験では、突然変異体ＢＷ２５５−２及びＢＷ２３８−３の穀粒収量及び試験重量値は、それら各々の親系統と有意に異なることはなかった（表３）。同様に、ＢＷ２５５−２及び親ＢＷ２５５系統に対して提示されるフィードバック阻害結果（図１）は、他の系統と同程度であり、分岐鎖アミノ酸の生合成の調節を変化させえた、フィードバック阻害に対する突然変異の影響がなかったことを示す。
【０１２１】
本実施例において提示される試験において用いられる除草剤耐性コムギ系統はＭ５世代又はそれ以降の世代であり、ＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ形質に対してホモ接合性である。
【０１２２】
【表１】
【０１２３】
【表２】
【０１２４】
【表３】
【０１２５】
イミダゾリノン系除草剤に対して抵抗性であるパンコムギ系統からの穀粒蛋白質含量、分岐鎖及び必須アミノ酸価は、それら各々の親系統と比べ、有意に増加していた。コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）ＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子を有する、独立して得られた４系統及びＴｒｉｔｉｃｕｍ ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ Ｌ．からの同じ突然変異の遺伝子移入によって得られた別の１系統はすべて、それら各々の親系統と比べ、穀粒蛋白質形質の増加を示した。これらの結果は、穀粒蛋白質の増加がコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ突然変異に起因し、また、これらのＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ系統において、親と比べ、穀粒収量の減少もフィードバック阻害反応の変化もなかったことを示す。これまでに検討したＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎコムギ系統はすべて、アスパラギン６５３に対するＡＡＣコドンを含むが、アスパラギン６５３に対するＡＡＴコドンを含むコムギ系統も蛋白質含量の増加を有する穀粒を産生することが期待される。
【０１２６】
Ｓ６５３Ｎ突然変異によって付与される穀粒蛋白質含量増加の利点は、ＡＨＡＳＬ１Ａ遺伝子のみに限定される。ＡＨＡＳＬ１Ｄ及びＡＨＡＳＬ１Ｂ相同遺伝子に生じるＳ６５３Ｎ突然変異を有するコムギ系統は、穀粒蛋白質の増加を示さなかった（データは示さない）。
【実施例２】
【０１２７】
（除草剤抵抗性コムギＡＨＡＳＬ蛋白質）
【０１２８】
本発明は、コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用を開示する。除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬポリペプチドを含む植物は過去に同定されており、除草剤抵抗性を付与するアミノ酸置換の部位であるＡＨＡＳＬポリペプチドの多くの保存領域が報告されている。Ｄｅｖｉｎｅ及びＥｂｅｒｌｅｉｎ（１９９７）「改変標的部位に基づく除草剤抵抗性の生理学的、生化学的及び分子態様（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｌｔｅｒｅｄ ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅｓ）」、除草剤活性：毒物学、生化学的及び分子生物学（Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ：Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｒｏｅら（編）、１５９−１８５頁、ＩＯＳ Ｐｒｅｓｓ社、アムステルダム；並びにＤｅｖｉｎｅ及びＳｈｕｋｌａ（２０００）Ｃｒｏｐ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ １９：８８１−８８９を参照されたい。
【０１２９】
本発明のコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ配列及び当業者には周知の方法を用いて、これらの保存領域において同定された部位にてＳ６５３Ｎ置換及び１，２，３若しくはそれ以上の追加アミノ酸置換を有する除草剤抵抗性ＡＨＡＳＬポリペプチドをコードする追加ポリヌクレオチドを生成することができる。表４は、ＡＨＡＳＬ蛋白質の保存領域、これらの保存領域内の除草剤抵抗性を付与することが知られているアミノ酸置換及びコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）ＡＨＡＳＬ１蛋白質を示す。
【０１３０】
【表４】
【０１３１】
1Ｄｅｖｉｎｅ及びＥｂｅｒｌｅｉｎ（１９９７）「改変標的部位に基づく除草剤抵抗性の生理学的、生化学的及び分子態様（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｌｔｅｒｅｄ ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅｓ）」、除草剤活性：毒物学、生化学的及び分子生物学（Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ：Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｒｏｅら（編）、１５９−１８５頁、ＩＯＳ Ｐｒｅｓｓ社、アムステルダム；並びにＤｅｖｉｎｅ及びＳｈｕｋｌａ（２０００）Ｃｒｏｐ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ １９：８８１−８８９から引用の保存領域
2アミノ酸番号はシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＡＨＡＳＬポリヌクレオチドのアミノ酸配列に対応する。
3野生型コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）ＡＨＡＳＬ１のアミノ酸配列は、同じ保存領域を含む。
4Ｂｅｒｎａｓｃｏｎｉら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（２９）：１７３８１−１７３８５
5Ｗｒｉｇｈｔ及びＰｅｎｎｅｒ（１９９８）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．９６：６１２−６２０
6Ｂｏｕｔｓａｌｉｓら（１９９９）Ｐｅｓｔｉｃ．Ｓｃｉ．５５：５０７−５１６
7Ｇｕｔｔｉｅｒｉら（１９９５）Ｗｅｅｄ Ｓｃｉ．４３：１４３−１７８
8Ｇｕｔｔｉｅｒｉら（１９９２）Ｗｅｅｄ Ｓｃｉ．４０：６７０−６７８
9Ｋｏｌｋｍａｎら（２００４）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１０９：１１４７−１１５９
10Ｈａｒｔｎｅｔｔら（１９９０）「突然変異アセト乳酸合成酵素遺伝子を担持する除草剤抵抗性植物（Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｐｌａｎｔｓ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｍｕｔａｔｅｄ ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｇｅｎｅｓ）」、農薬抵抗性の管理：基礎的研究から実用的方策へ（Ｍａｎａｇｉｎｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ａｇｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｔｏ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ）、Ｇｒｅｅｎら（編）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃ．Ｓｙｍｐ．，Ｓｅｒｉｅｓ Ｎｏ．４２１、米国ワシントンＤＣ
11Ｓｉｍｐｓｏｎ（１９９８）Ｄｏｗｎ ｔｏ Ｅａｒｔｈ ５３（１）：２６−３５
12Ｗｈｉｔｅら（２００３）Ｗｅｅｄ Ｓｃｉ．５１：８４５−８５３
13Ｂｒｕｎｉａｒｄ（２００１）ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ Ｌ．）におけるイミダゾリノン抵抗性、交差抵抗性パターンの特徴及び分子マーカーの同定（Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｏｆ ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｒｏｓｓ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐａｔｔｅｒｎ，ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ Ｌ．）、米国ノースダコタ州（ＮＤ）ファーゴ（Ｆａｒｇｏ）、ノースダコタ州立大学（Ｎｏｒｔｈ Ｄａｋｏｔａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）博士号論文、１−７８頁
14Ｄｅｖｉｎｅ及びＥｂｅｒｌｅｉｎ（１９９７）「改変標的部位に基づく除草剤抵抗性の生理学的、生化学的及び分子態様（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｌｔｅｒｅｄ ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅｓ）」、除草剤活性：毒物学、生化学的及び分子生物学（Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ：Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｒｏｅら（編）、１５９−１８５頁、ＩＯＳ Ｐｒｅｓｓ社、アムステルダム
15Ｃｈａｎｇ及びＤｕｇｇｌｅｂｙ（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３３３：７６５−７７７
16Ｌｅｅら（１９９９）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４５２：３４１−３４５
【実施例３】
【０１３２】
（アリゾナ州及びカリフォルニア州での野外試験における高蛋白質コムギ系統の成績）
北半球での３地点（米国カリフォルニア州及びアリゾナ州）において、ＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３（Ａｔ）Ｎ突然変異を含む春コムギ系統（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）及び同質遺伝型非変異親系統を冬期にわたって（２００５〜２００６年）生育させた。ＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ突然変異コムギ系統が、それらの適応帯域外で下限光周期の次善な（即ち、日が短い）条件下の環境において、それらの親系統と比べて生育穀粒の増加を示すかを判断するため、各系統の穀粒蛋白質含量を測定した。
【０１３３】
（エントリー及び地点）
遺伝的に異なる２つの遺伝子型のホモ接合性ＡＨＡＳＬ１Ａ（Ｓ６５３Ｎ）突然変異体、Ｋｉｒｃｈａｕｆｆ−Ｋ４２（オーストラリアの春コムギ系統、本明細書では“Ｋ４２”とも称する）とＢＷ２３８−３（北米の春コムギ系統）とを、それらの同質遺伝型非変異親系統（それぞれ、Ｋｉｒｃｈａｕｆｆ，ＢＷ２３８）と共に、米国南西部において２００５〜２００６年の冬期にわたり、３地点において隣接する大区画の土地（単一反復（ｓｉｎｇｌｅ ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎ））で生育させた。２地点はアリゾナ州ユマ（Ｙｕｍａ）に近く、一方、第三の地点はカリフォルニア州ディヌーバ近傍であった。それらの場所に２００５年１１月に植え付け、２００６年７月に収穫した。
【０１３４】
（区画寸法及び播種量）
播種量：種子１００ｇ／３５ｍ2
区画寸法：２×１．７５ｍ×１０ｍ（一代表例）
幅１０ｍのオオムギ細帯域により、区画を分離した。
【０１３５】
（農業成績及び穀粒収穫）
すべての区画を同一の農耕法に付した。イミダゾリノン系除草剤で処理した区画はなかった。Ｋｉｒｃｈａｕｆｆ系統とＢＷ２３８系統の遺伝子型の差異を判定するため、生育習性及び成長高について区画を評価した。Ｋｉｒｃｈａｕｆｆ−Ｋ４２及びその同質遺伝型親系統Ｋｉｒｃｈａｕｆｆは、ＢＷ２３８−３系統及びその同質遺伝型親系統ＢＷ２３８より高く生育し、より少ない分蘖を示した。各地点における野外にて観察した際、ＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ突然変異を含む系統と、それら各々の同質遺伝型非変異親系統との間に農業成績の有意差は検出されなかった。表５はカリフォルニア州ディヌーバにおける全４系統の生育習性を概示する。
【０１３６】
【表５】
【０１３７】
（結果及び考察）
アリゾナ州ユマ（Ｙｕｍａ）の２地点及びカリフォルニア州ディヌーバからの穀粒試験重量、ＳＤＳ沈降価及び蛋白質含量パーセントを、それぞれ表６〜８に示す。表９は全３地点にわたる結果を概示する。穀粒蛋白質含量結果を３地点にわたって平均化すると、Ｋｉｒｃｈａｕｆｆ−Ｋ４２はその同質遺伝型親対照系統より５％高い穀粒蛋白質濃度を示した（表９）。同様に、穀粒蛋白質含量を３地点にわたって平均化すると、ＢＷ２３８−３はその同質遺伝型親対照系統より５．１％高い穀粒蛋白質濃度を示した（表９）。平均穀粒試験重量は、その非変異親系統と比べ、Ｋｉｒｃｈａｕｆｆ−Ｋ４２の方がわずかに重く、一方、ＢＷ２３８−３の穀粒試験重量はその非変異親系統と有意に異なることはなかった（表９）。グルテン力及び製パン性を予測するのに用いられるＳＤＳ沈降価も、変異ＡＨＡＳＬ１Ａ系統とそれぞれの親対照群との間で有意に異なることはなかった。
【０１３８】
これらの結果は、ＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ突然変異を含む６倍体パンコムギ系統が、それらの適応帯域外及び通常の生育季節外にて生育させた場合でも、親対照系統より高い穀粒蛋白質含量を有する穀粒を産生するということを示す。
【０１３９】
【表６】
【０１４０】
*コムギに対するＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）沈降試験は、デュラム及びパンコムギにおいてグルテン力及び製パン性を予測するための、米国穀物化学者協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｅ ｏｆ Ｃｅｒｅａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ（ＡＡＣＣ））に国際的に承認された方法である。Ｍｏｒｒｉｓら（２００７）Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃ．８７：６０７−６１５を参照されたい。
†親系統の穀粒蛋白質含量に対するＳ６５３Ｎ系統の穀粒蛋白質含量の増加パーセント。ＫｉｒｃｈａｕｆｆとＢＷ２３８は、それぞれＫ４２，ＢＷ２３８−３の親系統である。
【０１４１】
【表７】
【０１４２】
【表８】
【０１４３】
【表９】
【０１４４】
*ユマ（Ｙｕｍａ）２試験（表６及び７）及びディヌーバ試験（表８）の平均値
†標準偏差
@親系統の平均穀粒蛋白質含量に対するＳ６５３Ｎ系統の平均穀粒蛋白質含量の増加パーセント。ＫｉｒｃｈａｕｆｆとＢＷ２３８は、それぞれＫ４２，ＢＷ２３８−３の親系統である。
【実施例４】
【０１４５】
（高蛋白質コムギ系統から産生される穀粒の製パン性試験）
ＡＨＡＳＬ１Ａ突然変異体における穀粒蛋白質の増加が製パン性に影響を及ぼすかどうかを判定するため、上記実施例３において開示した野外試験における３地点のうちの２地点（１地点はカリフォルニア州ディヌーバに、１地点はアリゾナ州ユマ（Ｙｕｍａ）にある）において生育させた穀粒の試料を、独立した実験施設による多くのコムギ及び小麦粉試験方法に付した。挽き割りコムギ及び小麦粉試料を生成するため、各エントリー（ＡＨＡＳＬ１Ａ及び親同質遺伝型系統）からの穀粒試料を実験室製粉工程（Ｂｕｈｌｅｒ実験室製粉機（Ｂｕｈｌｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｆｌｏｕｒ Ｍｉｌｌ））に付した。次に、多くの標準的なコムギ品質パラメータを求めるため、コムギ及び製粉試料を多くの品質試験（含水量、蛋白質含量、灰分及びフォーリングナンバー）に付した。各試料の加工及び製パン特性を判定するため、専門的標準試験、例えば、単穀粒評価システム（Ｓｉｎｇｌｅ Ｋｅｒｎｅｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）（ＳＫＣＳ）、ファリノグラフ及びパンブレッドベーキング試験（Ｐａｎ Ｂｒｅａｄ ｂａｋｅ ｔｅｓｔ）を行った。これらの方法は、「コムギ及び小麦粉の試験方法 コムギ及び小麦粉の品質理解の指針（Ｗｈｅａｔ ａｎｄ Ｆｌｏｕｒ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ Ｗｈｅａｔ ａｎｄ Ｆｌｏｕｒ Ｑｕａｌｉｔｙ）」、（２００４）Ｗｈｅａｔ Ｍａｒｋｅｔｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．及びＮｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｅｘｐｏｒｔ Ｇｒａｉｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．、米国、に述べられている；これは参照して本明細書に組み込まれる。これらの試験の結果を以下の表１０〜１３に示す。
【０１４６】
ＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ突然変異系統はすべて、穀粒蛋白質の増加を示したが、パン焼きデータの点から、それらの親同質遺伝型系統と有意に異なる突然変異系統はなかった（表１０〜１３）。グルテン力及び製パン性を予測するのに用いられるＳＤＳ沈降価（上記実施例３を参照）も突然変異ＡＨＡＳＬ１Ａ系統とそれぞれの親対照との間で有意に異なることがなかったため、これは予期されたことであった。
【０１４７】
製パン性に影響を及ぼさずに穀粒蛋白質を増加させることができることは、小麦産業にとって望ましい特性である。従って、本発明の突然変異ＡＨＡＳＬ１Ａ系統は、蛋白質含量の増加を有すると同時に、対照コムギ系統由来の小麦粉の製パン性を維持する小麦粉の生産に有用性を見出す。突然変異ＡＨＡＳＬ１Ａコムギ系統の穀粒由来の小麦粉も、対照又は野生型コムギ系統の穀粒から製粉される小麦粉から生産される焼製品と比べ、蛋白質含量の増加を有する焼製品の生産に用途を見出す。
【０１４８】
【表１０】
【０１４９】
ＣＭＤＴＹ、品目 ＨＷＳ、硬質で白色の春コムギ 及び ＨＲＳ、硬質で赤色の春コムギ
ＬＯＣ、場所
ＰＲＯ、湿度８．５％でのコムギ中蛋白質（％）
ＭＯＩ、湿度（％）
ＴＷ、試験重量
ＴＫＷ、１０００穀粒重量（グラム）
硬質、穀粒の硬質度（−２０〜１２０の指数）
ＦＮ、フォーリングナンバー（秒）。ＦＮは下降する攪拌機（ｆａｌｌｉｎｇ ｓｔｉｒｒｅｒ）に対する小麦粉及び水ペーストの抵抗性を測定することによって定量される粘度の尺度である。
ＳＫＣＳ、単穀粒評価システム。このシステムでは、穀粒重量（ｍｇ）、穀粒径（ｍｍ）、含水量（％）及び穀粒の硬度（−２０〜１２０の指数）について、３００穀粒を個々に分析する。
【０１５０】
【表１１】
【０１５１】
ＣＭＤＴＹ、品目 ＨＷＳ、硬質で白色の春コムギ 及び ＨＲＳ、硬質で赤色の春コムギ
ＬＯＣ、場所
ＰＲＯ、湿度１４％での小麦粉中蛋白質（％）
ＭＯＩ、湿度（％）
灰分、小麦粉灰分（％）
ＡＢＳ、吸収（％）：ファリノグラフ曲線を５００ブラベンダーユニット（ＢＵ）線に集中させるのに必要な水の量
ピーク、ピーク時間（分）：水の添加時から始まり、生地が最大粘稠度に達するまでの生地の生成時間
安定性、安定時間（分）：生地が最大粘稠度を維持する時間
ＭＴＩ、耐混捏度指数（分）：混合時の生地の軟化度を示す。
【０１５２】
【表１２】
【０１５３】
ＣＭＤＴＹ、品目 ＨＷＳ、硬質で白色の春コムギ 及び ＨＲＳ、硬質で赤色の春コムギ
ＬＯＣ、場所
Ｖｏｌ ｃｃ、焼きパンブレッドの体積（立方センチメートル）
Ｖｏｌ、比体積は体積と重量との比率である。
穀粒、パンブレッドを内部の均一なパン粉粒について評点する。
触感、パンブレッドを触感について評点する。
色、小麦粉の色はミノルタ社製色彩色差計（Ｍｉｎｏｌｔａ Ｃｈｒｏｍａ Ｍｅｔｅｒ）を用いて小麦粉試料の白色度を測定することによって定量し、スケールと比較する。
ＡＢＳ、吸収
【０１５４】
【表１３】
【０１５５】
ＣＭＤＴＹ、品目 ＨＷＳ、硬質で白色の春コムギ 及び ＨＲＳ、硬質で赤色の春コムギ
ＬＯＣ、場所
【０１５６】
本明細書で言及されるすべての発行物及び特許出願は、本発明が関連する当業者のレベルを示唆するものである。すべての発行物及び特許出願は、とりわけ、そして個々に参照により組み込まれるものと示唆される場合と同程度まで、本明細書に組み込まれている。上記の発明は理解の明瞭化の目的のため、ある程度詳細に記載されているが、ある一定の変更及び修正が、添付する特許請求の範囲に記載された事項の範囲内で実施されてもよいことは明白である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高蛋白質コムギ植物を作出する方法であって、
（ａ）少なくとも１つのコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子のコピーをコムギ植物に導入する工程、
（ｂ）穀粒を産生するため、前記ＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子を含む前記コムギ植物又はその子孫植物を生育する工程、
（ｃ）前記コムギ植物又はその子孫植物によって産生される穀粒の蛋白質含量を定量する工程、
を含み、前記コムギ植物又はその子孫植物が、前記コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子を欠いたコムギ植物によって産生される穀粒と比べ、増大した蛋白質レベルを有する穀粒を産生する方法。
【請求項２】
前記コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子が、アミノ酸位置５７９又は等価な位置においてアスパラギンを含むＡＨＡＳＬ１Ａ蛋白質をコードする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子が、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）又はヒトツブコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ）ＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子を含むコムギ植物を選抜する工程を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記選抜工程が、前記コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子が導入された後、前記コムギ植物にＡＨＡＳ阻害除草剤を適用する工程を含む請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子が、他家受粉によって前記高蛋白質コムギ植物に導入される請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記他家受粉が、少なくとも１つのＦ１子孫を作出するため、第一の親コムギ植物を第二の親コムギ植物と交配させる工程を含み、前記第一の親コムギ植物が、少なくとも１つの前記ＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子のコピーを含み、前記高蛋白質コムギ植物が、前記第一の親コムギ植物及び前記第二の親コムギ植物の子孫である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記第一の親コムギ植物が、
（ａ）アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）特許寄託受託番号（Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ）ＰＴＡ−３９５５，ＰＴＡ−４１１３又はＰＴＡ−４２５７を有するコムギ植物；
（ｂ）ＡＴＣＣ特許寄託受託番号（Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ）ＰＴＡ−３９５５，ＰＴＡ−４１１３又はＰＴＡ−４２５７を有する前記コムギ植物の突然変異、組換え型又は遺伝子操作誘導体；
（ｃ）ＡＴＣＣ特許寄託受託番号（Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ）ＰＴＡ−３９５５，ＰＴＡ−４１１３又はＰＴＡ−４２５７を有する前記植物の任意の子孫；並びに
（ｄ）任意の１つ又はそれ以上のこれらの植物の子孫であるコムギ植物
からなる群より選択される請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第一の親コムギ植物が、ＡＴＣＣ特許寄託受託番号（Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ）ＰＴＡ−３９５５，ＰＴＡ−４１１３又はＰＴＡ−４２５７を有する前記コムギ植物の除草剤抵抗性特性を含む請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記第一の親コムギ植物が前記交配に対する花粉ドナーであり、前記第二の親コムギ植物が花粉アクセプターであり、前記Ｆ１子孫が前記第二の親コムギ植物において作出される請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記第二の親コムギ植物が前記交配に対する花粉ドナーであり、前記第一の親コムギ植物が花粉アクセプターであり、前記Ｆ１子孫が前記第一の親コムギ植物において作出される請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
ＡＨＡＳ阻害除草剤に対する抵抗性が増大したコムギ植物を選抜するために、前記高蛋白質コムギ植物を、有効量のＡＨＡＳ阻害除草剤を前記Ｆ１子孫に適用することによって選抜する請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記第一の親コムギ植物が、前記ＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子に対してヘテロ接合性又はホモ接合性である請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
前記交配によって作出された前記Ｆ１子孫を、Ｆ２子孫を作出するため、生育し、自家受粉できるようにする請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
前記高蛋白質コムギ植物を、ＡＨＡＳ阻害除草剤に対する抵抗性が増大した、少なくとも１つのコムギ植物を選抜するために、有効量のＡＨＡＳ阻害除草剤を前記Ｆ２子孫に適用することによって前記Ｆ２子孫から選抜する請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子を、突然変異生成によって前記高蛋白質コムギ植物に導入し、有効量のＡＨＡＳ阻害除草剤に対する抵抗性を有するコムギ植物を選抜する請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
更に、前記ＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子を含むコムギ植物を選抜する工程を含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子を、形質転換によって前記高蛋白質コムギ植物に導入する請求項1に記載の方法であって、
形質転換コムギ細胞を作出するために、植物細胞における発現を促進するプロモーターに作動可能に結合したコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドコンストラクトを、コムギ植物の少なくとも１つの細胞に導入する工程、
前記形質転換コムギ細胞を形質転換コムギ植物に再生する工程、
を含み、
前記形質転換コムギ植物が前記高蛋白質コムギ植物である方法。
【請求項１９】
ＡＨＡＳ阻害除草剤に対する抵抗性の増大を含む形質転換コムギ細胞を選抜するため、有効量のＡＨＡＳ阻害除草剤を前記形質転換コムギ細胞に適用する工程を更に含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記プロモーターが、構成的プロモーター及び種子優先の（ｓｅｅｄ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）プロモーターからなる群より選択される請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記高蛋白質コムギ植物が、イミダゾリノン系除草剤、スルホニルウレア系除草剤、トリアゾロピリミジン系除草剤、ピリミジニルオキシベンゾアート系除草剤及びスルホニルアミノ・カルボニルトリアゾリノン系除草剤からなる群より選択される、少なくとも１種のＡＨＡＳ阻害除草剤に対する抵抗性の亢進を有する請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記イミダゾリノン系除草剤が、［２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−）イミダゾリン−２−イル］−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル）−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル］−３−キノリンカルボン酸、［５−エチル−２−（４−イソプロピル−４−メチル−）−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル］−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−（メトキシメチル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−メチルニコチン酸及びメチル６−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｍ−トルイル酸とメチル［２−（４−）イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル］−ｐ−トルイル酸との混合物並びにそれらの混合物からなる群選択される請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記高蛋白質コムギ植物の種が、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）である請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法によって作出される高蛋白質コムギ植物。
【請求項２５】
請求項２４に記載の高蛋白質コムギ植物によって産生される高蛋白質穀粒。
【請求項２６】
請求項２５に記載の高蛋白質穀粒を含むヒト又は動物用の食品。
【請求項２７】
請求項２５に記載の高蛋白質穀粒を製粉する工程を含む、高蛋白質小麦粉を生産する方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法によって生成される高蛋白質小麦粉。
【請求項２９】
請求項２８に記載の高蛋白質小麦粉を含む、ヒト又は動物用の食品。
【請求項１】
高蛋白質コムギ植物を作出する方法であって、
（ａ）少なくとも１つのコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子のコピーをコムギ植物に導入する工程、
（ｂ）穀粒を産生するため、前記ＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子を含む前記コムギ植物又はその子孫植物を生育する工程、
（ｃ）前記コムギ植物又はその子孫植物によって産生される穀粒の蛋白質含量を定量する工程、
を含み、前記コムギ植物又はその子孫植物が、前記コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子を欠いたコムギ植物によって産生される穀粒と比べ、増大した蛋白質レベルを有する穀粒を産生する方法。
【請求項２】
前記コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子が、アミノ酸位置５７９又は等価な位置においてアスパラギンを含むＡＨＡＳＬ１Ａ蛋白質をコードする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子が、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）又はヒトツブコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ）ＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子を含むコムギ植物を選抜する工程を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記選抜工程が、前記コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子が導入された後、前記コムギ植物にＡＨＡＳ阻害除草剤を適用する工程を含む請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子が、他家受粉によって前記高蛋白質コムギ植物に導入される請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記他家受粉が、少なくとも１つのＦ１子孫を作出するため、第一の親コムギ植物を第二の親コムギ植物と交配させる工程を含み、前記第一の親コムギ植物が、少なくとも１つの前記ＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子のコピーを含み、前記高蛋白質コムギ植物が、前記第一の親コムギ植物及び前記第二の親コムギ植物の子孫である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記第一の親コムギ植物が、
（ａ）アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）特許寄託受託番号（Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ）ＰＴＡ−３９５５，ＰＴＡ−４１１３又はＰＴＡ−４２５７を有するコムギ植物；
（ｂ）ＡＴＣＣ特許寄託受託番号（Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ）ＰＴＡ−３９５５，ＰＴＡ−４１１３又はＰＴＡ−４２５７を有する前記コムギ植物の突然変異、組換え型又は遺伝子操作誘導体；
（ｃ）ＡＴＣＣ特許寄託受託番号（Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ）ＰＴＡ−３９５５，ＰＴＡ−４１１３又はＰＴＡ−４２５７を有する前記植物の任意の子孫；並びに
（ｄ）任意の１つ又はそれ以上のこれらの植物の子孫であるコムギ植物
からなる群より選択される請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第一の親コムギ植物が、ＡＴＣＣ特許寄託受託番号（Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ）ＰＴＡ−３９５５，ＰＴＡ−４１１３又はＰＴＡ−４２５７を有する前記コムギ植物の除草剤抵抗性特性を含む請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記第一の親コムギ植物が前記交配に対する花粉ドナーであり、前記第二の親コムギ植物が花粉アクセプターであり、前記Ｆ１子孫が前記第二の親コムギ植物において作出される請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記第二の親コムギ植物が前記交配に対する花粉ドナーであり、前記第一の親コムギ植物が花粉アクセプターであり、前記Ｆ１子孫が前記第一の親コムギ植物において作出される請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
ＡＨＡＳ阻害除草剤に対する抵抗性が増大したコムギ植物を選抜するために、前記高蛋白質コムギ植物を、有効量のＡＨＡＳ阻害除草剤を前記Ｆ１子孫に適用することによって選抜する請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記第一の親コムギ植物が、前記ＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子に対してヘテロ接合性又はホモ接合性である請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
前記交配によって作出された前記Ｆ１子孫を、Ｆ２子孫を作出するため、生育し、自家受粉できるようにする請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
前記高蛋白質コムギ植物を、ＡＨＡＳ阻害除草剤に対する抵抗性が増大した、少なくとも１つのコムギ植物を選抜するために、有効量のＡＨＡＳ阻害除草剤を前記Ｆ２子孫に適用することによって前記Ｆ２子孫から選抜する請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子を、突然変異生成によって前記高蛋白質コムギ植物に導入し、有効量のＡＨＡＳ阻害除草剤に対する抵抗性を有するコムギ植物を選抜する請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
更に、前記ＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子を含むコムギ植物を選抜する工程を含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記コムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎ遺伝子を、形質転換によって前記高蛋白質コムギ植物に導入する請求項1に記載の方法であって、
形質転換コムギ細胞を作出するために、植物細胞における発現を促進するプロモーターに作動可能に結合したコムギＡＨＡＳＬ１Ａ Ｓ６５３Ｎポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドコンストラクトを、コムギ植物の少なくとも１つの細胞に導入する工程、
前記形質転換コムギ細胞を形質転換コムギ植物に再生する工程、
を含み、
前記形質転換コムギ植物が前記高蛋白質コムギ植物である方法。
【請求項１９】
ＡＨＡＳ阻害除草剤に対する抵抗性の増大を含む形質転換コムギ細胞を選抜するため、有効量のＡＨＡＳ阻害除草剤を前記形質転換コムギ細胞に適用する工程を更に含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記プロモーターが、構成的プロモーター及び種子優先の（ｓｅｅｄ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）プロモーターからなる群より選択される請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記高蛋白質コムギ植物が、イミダゾリノン系除草剤、スルホニルウレア系除草剤、トリアゾロピリミジン系除草剤、ピリミジニルオキシベンゾアート系除草剤及びスルホニルアミノ・カルボニルトリアゾリノン系除草剤からなる群より選択される、少なくとも１種のＡＨＡＳ阻害除草剤に対する抵抗性の亢進を有する請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記イミダゾリノン系除草剤が、［２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−）イミダゾリン−２−イル］−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル）−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル］−３−キノリンカルボン酸、［５−エチル−２−（４−イソプロピル−４−メチル−）−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル］−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−（メトキシメチル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−メチルニコチン酸及びメチル６−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｍ−トルイル酸とメチル［２−（４−）イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル］−ｐ−トルイル酸との混合物並びにそれらの混合物からなる群選択される請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記高蛋白質コムギ植物の種が、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）である請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法によって作出される高蛋白質コムギ植物。
【請求項２５】
請求項２４に記載の高蛋白質コムギ植物によって産生される高蛋白質穀粒。
【請求項２６】
請求項２５に記載の高蛋白質穀粒を含むヒト又は動物用の食品。
【請求項２７】
請求項２５に記載の高蛋白質穀粒を製粉する工程を含む、高蛋白質小麦粉を生産する方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法によって生成される高蛋白質小麦粉。
【請求項２９】
請求項２８に記載の高蛋白質小麦粉を含む、ヒト又は動物用の食品。
【図１】
【公表番号】特表２００９−５３８６３２（Ｐ２００９−５３８６３２Ａ）
【公表日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１３４５２（Ｐ２００９−５１３４５２）
【出願日】平成１９年５月３１日（２００７．５．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７００７０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１４０４５１
【国際公開日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【出願人】（５０８３５２２４１）ビーエーエスエフ、アグロケミカル、プロダクツ、ベスローテン、フェンノートシャップ (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月３１日（２００７．５．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７００７０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１４０４５１
【国際公開日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【出願人】（５０８３５２２４１）ビーエーエスエフ、アグロケミカル、プロダクツ、ベスローテン、フェンノートシャップ (1)
【Ｆターム（参考）】
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