細胞の富化
本発明は、細胞と細胞外マトリックスを含む組織試料を、液体培地中で細胞外マトリックスから間充織幹細胞（ＭＳＣ）を遊離させるのに十分な量のコラゲナーゼで処理すること、およびその後ＭＳＣを含む培地のフラクションを分離することを含む、間充織幹細胞（ＭＳＣ）を分離し、富化する方法に関する。分離ＭＳＣは、フラクションが多くの臨床背景において直ちに使用できるような驚くほど多くの数で分離され得る。これは、種々のソースから大量の試料組織をプールすることを必要とするかまたはＭＳＣを培養下で増幅することを必要とする先行技術の手法からの前進を表す。それ故、本発明は、さらに、本発明の最初の態様の方法に従って分離された細胞の臨床使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間充織幹細胞（ＭＳＣ）の富化に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＭＳＣは、多くの学術および臨床適用において使用され得る重要な細胞とみなされる。例えばＭＳＣは、細胞に基づく治療における使用のために提案され、検討されてきた。
【０００３】
ＭＳＣは、骨、軟骨および脂肪細胞系統を含む多くの細胞型に分化するように誘導され得る万能性幹細胞であるため、有用である。ＭＳＣはインビトロで分化するように誘導して、その後「成熟」細胞として使用し得るか、または未分化形態に維持して、インサイチューで分化させ得る。ＭＳＣはまた、インビトロで接着細胞単層として増殖することができる有用な特徴を有する。
【０００４】
残念ながら、ＭＳＣは現在まで学術的および臨床的に使用が制限されてきた。このことの１つの理由は、有用な数のＭＳＣを簡単に分離するのが困難であったことである。例えば骨髄はＭＳＣのソースとして公知であり、多くの研究者たちが骨髄吸引液からそのような細胞を分離することを試みてきた。しかし、少数の細胞が分離されただけであり、このことから学会では、そのような組織中には非常の少数のＭＳＣしか存在しないと考えられるに至った。臨床的に有用な数のＭＳＣを分離するためには非現実的な容量の組織が必要とされるため、これは問題である。
【０００５】
有用な数を生成する唯一の方法は、ＭＳＣを分離し、その後数を増幅するまたは「増大させる（ｂｕｌｋ−ｕｐ）」ために、インビトロで、時として数週間、それらを培養することであった。
【０００６】
しかしそのような培養工程は多くの難点を有する。
【０００７】
第一に、培養増殖は時間がかかる。これはＭＳＣの臨床的有用性を制限する。一部の場合には、幹細胞が緊急に必要とされる。例えば臨床医が、骨折した被験者に治癒を促進するために幹細胞を投与したいと考える場合、損傷から数時間以内に適切な数の幹細胞が使用可能となることが望ましい。しかし、一般通念では、臨床医が損傷した被験者の骨髄吸引液からＭＳＣを分離し、培養で個体群を増殖させ、しばらく後に幹細胞を損傷した骨に導入すべきであると命じる。しかしながら、ＭＳＣは部分的に治癒した組織ではほとんど役に立たないと考えられる。従って、多くの細胞療法は、細胞のソースが容易に入手可能ではないため、非実用的である。
【０００８】
第二に、ＭＳＣの培養は、培養細胞において「表現型ドリフト」を導き得る。このドリフトは、培養したＭＳＣが分化し始めた場合に起こり得る。この分化は予測不能であり得、しばしば望ましくない系譜をたどり得る。あるいは、人工培養条件が、細胞をインビボのままにしておいた場合に可能な表現型へと分化するのを妨げることがある。それ故、培養細胞はインビボでの細胞と同じように成長しないことがあると認識される。これはまた、臨床および科学界が培養で増殖されたＭＳＣの価値に疑問を呈することを導く。
【０００９】
第三に、培養下のＭＳＣの操作と増殖は、その後のインビボでの機能喪失に寄与し得るＭＳＣの老化を導き得る。ＭＳＣの長期間の培養増殖はまた、遺伝的不安定性と細胞形質転換を導き得る。さらに、ＦＤＡなどの規制機関は、ＭＳＣのための細胞培養増殖手順に関する場合のように、ヒトでの治療的使用のための細胞の生成において動物製品を使用することの妥当性を疑問視してきた。
【００１０】
最後に、幹細胞集団のエクスビボでの増殖を成功裏に達成することはしばしば困難である。この困難を克服するには、幹細胞増殖を促進するために血清および増殖因子などの外因性因子を使用することがしばしば必要である。そのような因子は、コストがかかり、熟達した技術者の労力を必要とする複雑な培養条件を導き得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
それ故、インビトロで増殖する必要がないＭＳＣの迅速で便利なソースを確保することが望ましいことは認識される。しかし、現在までそのような細胞の容易に入手可能なソースは存在せず、ＭＳＣのそのようなソースを提供することが本発明の１つの目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の最初の態様によれば、
（ａ）細胞と細胞外マトリックスを含む組織試料を、液体培地中で細胞外マトリックスから間充織幹細胞（ＭＳＣ）を遊離させるのに十分な量のコラゲナーゼで処理すること、および
（ｂ）ＭＳＣを含む培地のフラクションを分離すること、
を含む、間充織幹細胞（ＭＳＣ）を富化する方法が提供される。
【００１３】
工程（ｂ）は、以下で詳細に論じるような厳密な表現型判定基準を使用してＭＳＣを分離することを含む。
【００１４】
本発明の第二の態様によれば、本発明の最初の態様に従って富化された分離間充織幹細胞（ＭＳＣ）が提供される。
【００１５】
本発明の第三の態様によれば、薬剤としての使用のための、本発明の最初の態様に従って富化された分離間充織幹細胞（ＭＳＣ）が提供される。
【００１６】
本発明の第四の態様によれば、コラゲナーゼおよび場合により、細胞を維持し、増殖させるまたは分化させるための培地を含む、間充織幹細胞（ＭＳＣ）を富化するためのキットが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
「間充織幹細胞」という用語により、我々は、接着細胞単層として増殖することができ、中胚葉系統の細胞（例えば骨、軟骨、筋肉、腱、靭帯または脂肪細胞）に分化するように誘導され得る万能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）または多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞を意味する。上述した分化のための適切な合図は、可溶性因子（増殖因子など）を含む環境因子、および幹細胞またはそれらの子孫が位置する基質によって提供され得る。万能性および多能性は、それらの従来の意味を有すると解釈され、すなわち万能性細胞は、いくつかの分化した系譜を生じるように分化することができ、一方多能性細胞は、より限られた分化潜在能を有する、すなわち同じ系譜内で多様な細胞型を生じることができる、始原細胞または前駆細胞を含み得る。
【００１８】
本発明に関連して間充織幹細胞は、骨髄腔（吸引液および海綿骨の芯を含む）、滑膜または脂肪体（以下でさらに論じる）に由来する幹細胞を含み得る。例えば本発明に関連して間充織幹細胞は、これまでに処理脂肪誘引物（ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ ｌｉｐｏａｓｐｉｒａｔｅｓ）（ＬＰＡ）から分離され、骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞、脂肪細胞およびニューロン様細胞を含む系統を生じる能力を有すると同定された型の幹細胞を含み得る。
【００１９】
本発明は、本発明者らが、驚くべき数のＭＳＣが骨髄腔、滑膜および関節脂肪体からそれぞれ富化され得ることを確認した、実施例１、２および３で述べる試験に基づく。それらは、富化工程が、本発明の最初の態様に従った比較的簡単な酵素による組織消化を含み得ることを確認した。この工程は、意外にも、表現型：ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋を有するＭＳＣの集団を生成することが認められた。Ｄ７−ＦＩＢは、線維芽細胞／上皮細胞を認識するモノクローナル抗体であり（Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｎｏｖｕｓ ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓまたはＡｂｃａｍなどの供給業者から市販されている）、ＬＮＧＦＲは、低親和性神経成長因子受容体、ＣＤ２７１である（Ｂｅｃｔｏｎ ＤｉｃｋｉｎｓｏｎまたはＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃなどの供給業者から市販されている）。
【００２０】
本発明者らは、このＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞集団がクローン化可能な万能性ＭＳＣを含むことを明らかにした。このことから本発明者らは、常套的な臨床組織材料が、種々の重要な治療、診断および研究目的のために直接使用される十分な数のＭＳＣ（約１０６の高度精製細胞）のソースとして使用し得ることを認識するに至った。従来の方法によって分離された試料は、有用な数を形成するためには、上記で論じた全ての関連する難点を伴う、増幅するまたは「増大させる」必要がある少数のＭＳＣしか生じないので、これは非常に驚くべきことであると考えられた。組織試料のコラゲナーゼ処理によって生成される驚くべき数のＭＳＣは、臨床医または科学者が、インビトロ細胞培養の人工環境に曝露することを必要とせずに使用し得る有用な数の細胞を入手できることを可能にする。
【００２１】
本発明に従ってＭＳＣが富化される組織試料は、ＭＳＣを含むことが当業者に周知である多くのソースに由来し得る。これらは、骨髄、海綿骨（どちらも同じ器官、骨髄腔の不可欠な部分として認められる）およびまた、滑膜および関節脂肪体などの軟組織を含む。本発明は、ＭＳＣがそのような組織において認められると予想されるか否かという事実には関係しない。例えば、骨髄がＭＳＣを含み、そのようなＭＳＣが骨髄吸引液から非常に少数だけ分離されることは周知である。これらの細胞は、吸引液から分離して、ＭＳＣの数を学術的または臨床的に有用な数まで培養して増幅する必要がある。本発明の発明性の根拠となる工程は、組織（例えば骨髄と海綿骨の両方を含む生検試料）から前例のない数の新鮮ＭＳＣを遊離させるためにコラゲナーゼを使用し得るという事実にある。学術的および／または臨床的に有用な数の新鮮ＭＳＣが、（ｉ）比較的小さな容積の組織中に含まれること、および（ｉｉ）酵素処理によって遊離され得ることは、先行技術からは予測できなかった。実際に、本発明に従ってＭＳＣを富化しようと試みることに対しては技術的な偏見があった。これは、当業者が、細胞の収率があまりに低いので、有用な数のＭＳＣを生成するために処理する必要がある組織の容量は非現実的であると予想していたからである。この一般的な見解は、ＭＳＣが間葉系始原細胞階層の頂点に位置するまれな細胞であるという歴史的な認識に基づくが、本発明者らは、現在のＭＳＣの定義と一致する高度の可塑性が、一部のあらかじめ拘束された前駆細胞および間葉系統の血管周囲細胞（周皮細胞）を含む多くの結合組織細胞に固有であると考える。
【００２２】
本発明の方法の工程（ｂ）は、厳密な表現型判定基準を適用することによってＭＳＣの集団を選択することを含むことが最も好ましい。技術水準によれば、（１）インビボでのＭＳＣの表現型に関する十分な知識の欠如、（２）新鮮抽出されたＭＳＣは培養増殖されたＭＳＣに比べてより高い増殖潜在能を有する（従って当業者によって予想されるよりも少ない「新鮮」細胞しか必要としないと考えられる）ので、新鮮ＭＳＣは臨床的に有用であり得ることの理解の欠如、および（３）部分的にしか精製されていないが新鮮なＭＳＣ製剤（工程（ｂ）に従って分離されたフラクションは血小板、マクロファージおよび他の増殖因子産生細胞を含み得る）は、表現型的に均一な培養操作されたＭＳＣよりも臨床的に有用であり得るという認識の欠如が存在する。
【００２３】
ＭＳＣの表現型選択／同定は、標的細胞集団に関する多くのＭＳＣマーカーを同定することに基づき得る。これらのマーカーは、表１において特定されるものを含み得る。
【００２４】
【表１】
【００２５】
本発明者らは、多くのマーカーが有用であるが、一部のマーカーは本発明に従って調製された新鮮ＭＳＣを同定するために特に有用であることを認めた。従ってＤ７−ＦＢ、ＬＮＧＦＲ（すなわちＣＤ２７１）、ＣＤ１３、ＣＤ７３およびＣＤ９０は特に有用なマーカーである。新鮮ＭＳＣを同定するための最も好ましいマーカーは、表現型：ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋を有する細胞を同定する。本発明者らは、ＬＮＧＦＲ＋が本発明に従ってＭＳＣを同定するための単一の最も重要なマーカーであると考えられる。
【００２６】
上記マーカーは、本発明の工程（ｂ）に従ってＭＳＣを分離するためならびに細胞を同定するために有用であることが認識される。例えば、以下でより詳細に論じるように、ＭＳＣ表現型についての本発明者らの知識は、螢光励起細胞選別機（ＦＡＣＳ）による選別によってＭＳＣを分離するときに利用し得る。
【００２７】
組織試料は、骨髄（ＢＭ）またはＢＭと海綿骨（ＴＢ）の両方を含むコア生検であることが好ましい。これらの組織からＭＳＣを富化する方法を、以下でより詳細におよび実施例１において述べる。本発明は、ＢＭ吸引液から回収されるＭＳＣの表現型を特性決定し、ＭＳＣの低い収率（この表現型に基づく）を明らかにする本発明者らの研究に基づく。本発明者らは、ＢＭ吸引液中の全てのＭＳＣ活性がＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞の希少な集団に限定されることを確認した。従って、ＭＳＣを分離しようとするものは、ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞を選択すべきである。実施例は、本発明者らがどのようにしてこの細胞集団の発生率とクローン原性をさらに検討したかを述べる。これらの検討の間に、本発明者らは、喜ばしい驚きと共に、表現型的に純粋なＭＳＣが間質外膜細網細胞（ＡＲＣ）と共通する多くの性質を有することを見出した。ＢＭの間質ネットワークは、ＡＲＣ、内皮細胞および周囲の血管周囲細胞、脂肪細胞、マクロファージおよび骨内膜細胞から成り、後者の細胞は骨表面の内側を覆っている。ＡＲＣは、造血−支持間質機能に関与する細胞の相互結合ネットワークを形成し、脂肪細胞および骨芽細胞の前駆細胞としてのそれらの役割が示唆されてきた。本発明者らは、ＭＳＣの活性と可塑性が、全てではないにせよ多くのＡＲＣ、血管周囲細胞、前脂肪細胞および骨内膜細胞に固有であり、これらの細胞全部が同じ間葉細胞系譜に属すると仮定した。ＡＲＣとＭＳＣの類似の表現型に関する本発明者らのデータはこの仮説を裏付けた。かなり特殊な間葉系細胞（脂肪細胞または骨芽細胞など）はインビトロでトランス分化および脱分化し得るという事実が文献に記述されている。それ故、本発明者らは、同様の工程がインビボで起こり得ることおよびこれらの間葉系譜細胞の採集（これは酵素による処理によってのみ達成され得る）は高い数の高度可塑的ＭＳＣを遊離させることを示唆した。逆に、ＢＭ吸引の間、これらの間葉系細胞はインサイチューのままであり、互いにおよび周囲の細胞外マトリックスに密接に結合している（容易に吸引されるゆるく結合した造血細胞と比較して）。本発明者らは、それ故、ＢＭ吸引液においてこれまでに認められた低い数のＭＳＣは、インビボでのそれらの実際の数を全く表していないと仮定した。従って、本発明者らは、本発明の最初の態様の方法に従って組織試料をコラゲナーゼで処理することにより、かつてないほどの数のＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞（ＭＳＣ）を組織から遊離させ得ることを認めた。このことから本発明者らは、学術的および臨床的に有用な量のＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞／ＭＳＣが小さな容量の組織から迅速におよび容易に入手できることを認識するに至った。
【００２８】
ＭＳＣはまた、他の結合組織または軟組織から本発明に従って分離することができる。これらの組織は、滑膜および関節脂肪体（それぞれ実施例２および３で述べるように）を含む。
【００２９】
本発明者らは、骨髄生検試料で使用した方法が、同じ基本的表現型と類似の機能性を有する驚くべき数のＭＳＣ（すなわちＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋）を富化するためにこれらの組織に適用し得ることを明らかにした。本発明者らはまた、異なる組織中に内在するＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞は特異的な局所分化経路に規定されると考えられ、それ故、異なる適用のために有用であり得る（すなわちＢＭ ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞は骨髄修復により適しており、一方滑膜ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞は軟骨修復適用により適する）ことを認識した。本発明者らは、滑膜および脂肪体において、ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞が血管周囲細胞（すなわち組織の血管新生および新生血管形成を支えることに関与する間葉系細胞）のトポグラフィーを有することを示した。本発明者らは、これらのＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋が血管周囲細胞と同じニッチを占め、おそらく同一で、クローン原性であり、ＢＭ ＭＳＣと類似の機能性を有することを示した。それ故、本発明の方法は、滑膜および脂肪を含む固形組織中のこの特定の血管周囲ニッチからＭＳＣを富化する手段を提供する。本発明の方法は、骨髄ＭＳＣ活性の大部分の精製を可能にし、また大部分の滑膜および脂肪体のＭＳＣ活性の精製も可能にする。
【００３０】
本発明の最初の態様の方法は、胎盤および臍帯を含むがこれらに限定されない、他の組織からの血管周囲ニッチからＭＳＣを分離するために使用できる。これらの組織ソースは、神経変性適用に特に適するＭＳＣに富むと考えられる。それ故、本発明の方法に従って胎盤または臍帯から富化されたＭＳＣは、好ましくは神経変性状態の治療において使用され得る。血管周囲分布中の分離された軟組織ＭＳＣは、ＢＭ ＭＳＣと同じ表現型を有するだけでなく、ＢＭ ＭＳＣの全ての潜在能も有すると考えられ、それ故、以下で論じる全ての適用において使用できる。
【００３１】
組織試料のソースは、富化されるＭＳＣの最終的用途に依存する。
【００３２】
好ましい組織試料は骨から、特に骨髄（ＢＭ）からである。ＢＭ試料から富化されたＭＳＣは、骨修復適用のために特に有用である。ＢＭ生検材料は多くの身体部位（例えば胸骨、大腿骨、骨盤または腸骨稜）から入手し得る。ＢＭの好ましいソースは、大腿骨頭または腸骨稜である。標本はパンチ生検によって収集し得る（例えば４ｍｍパンチ生検を使用して）。あるいは、大腿骨頭を半分に切断し、酵素消化を受けるさらに一層小さな断片を得るためにＢｏｎｅ Ｍｉｌｌ（Ｄｅ Ｐｕｙまたは他の製造業者）を用いて均質化する。自己ＢＭは、患者または志願者からの腸骨稜生検より入手でき、より多数のＭＳＣが、研究目的または同種ＭＳＣ適用のために死体ドナーの何らかの海綿骨から入手できる。
【００３３】
コラゲナーゼ処理の前に、コア生検試料または小さな組織断片は、乾燥を防ぐためにＰＢＳに（リン酸緩衝食塩水）に入れてもよい。しかし、試料をＰＢＳで何度も洗浄すべきではない。これは、骨髄（ＡＲＣ）を横断するＭＳＣおよび骨に付着したＭＳＣ（骨内膜細胞）の両方が酵素抽出のために使用可能であるように、ＢＭを保存するためである。
【００３４】
好ましい実施形態では、本発明に従った富化を実施しようとする組織試料は、骨髄由来の浮遊脂肪フラクション（ＦＦＦ）を含み得る。本発明者らは、これまでＭＳＣの分離の間に廃棄されていたこのフラクションが、ＭＳＣの驚くべき豊富なソースであることを認めた。
【００３５】
単なる例として、組織試料（単一生検として採取した）０．１ｇをコラゲナーゼ溶液（例えば２０％（ｖ／ｖ）胎仔ウシ血清（ＦＣＳ）中の０．２５％コラゲナーゼ溶液である、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからの市販のコラゲナーゼ溶液（製品番号０７９０２））０．５ｍｌに入れてもよい。
【００３６】
コラゲナーゼが多くの商業的ソース（例えばＳｔｅｍｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＣＡ）から入手し得ることは認識される。多くの異なるコラゲナーゼを使用し得る。しかし、この酵素はＩ型コラーゲンを消化するために有効であることが好ましい。
【００３７】
処理する試料からＭＳＣを遊離させるのに十分なコラゲナーゼの量が必要であることは認識される。量は、使用する試料のタイプ（例えば骨生検または脂肪体からの試料）、処理する試料の量、試料が含まれている緩衝液／溶液の容量、および酵素とのインキュベーション時間を含む、多くの因子に依存する。一般的な指針として、本発明者らは、約１００〜５００単位の酵素、より好ましくは２５０〜３７５単位の酵素が、ＢＭ生検試料、滑膜または脂肪体試料０．１ｇ（０．５ｍｌ容量中、３７０℃で３〜４時間のインキュベーション時間）からＭＳＣを遊離させるために十分であることを認めた。
【００３８】
さらに１００〜５００単位の酵素、より好ましくは２５０〜３７５単位の酵素が、ＢＭ試料０．１ｇから約１０，０００〜５０，０００ＭＳＣ、より好ましくは約２５，０００〜１５０，０００ＭＳＣ（螢光励起細胞選別機（ＦＡＣＳ）によって１００％純度に精製）を遊離させるのに十分である。同様の、さらにはより低い用量の新鮮ＭＳＣが、ＯＩを有する小児においておよび骨偽関節の治療において効果を有することが知られているので、そのような重要な数のＭＳＣが遊離され得ることは意外であり、重要である。「半純粋な」ＭＳＣだけが必要とされる場合は（例えばさらなる富化工程、例えばマイクロビーズまたは螢光励起細胞選別機（ＦＡＣＳ）による選別を用いたさらなる精製を受けていないコラゲナーゼ処理試料を傾瀉した細胞フラクション）、製剤中により多くの細胞が存在することは認識される。
【００３９】
試料のインキュベーションは、コラゲナーゼ活性のために最適の温度で実施されるべきである。これは通常約３７℃である。しかし、一部のコラゲナーゼは触媒作用のためにわずかに異なる最適温度を有しおよび／または一連の温度にわたって（例えば２０℃〜４７℃）操作し得ることが認識される。
【００４０】
本発明の最初の態様の方法の好ましい実施形態では、４ｍｍパンチ生検ＢＭ試料を０．２５％コラゲナーゼ０．５ｍｌ中に入れる。酵素を３７℃で０．５〜８時間、より好ましくは３〜４時間放置して試料を消化させ得る。
【００４１】
インキュベーションの間、生検からの細胞の遊離を観測するために試料の１時間に一度の検査および「タッピング（軽くたたくこと）」を実施し得る。細胞の遊離後、コラゲナーゼ溶液は混濁し、一方ＢＭ生検自体はより白くなり（骨を露出する）、または軟組織生検は完全に溶解する。特にＢＭ生検試料に関して、２回目の別途の１時間のコラゲナーゼ処理が、骨ライニング細胞を遊離させ、それ故、最も高い潜在的骨形成能を有するＭＳＣが特に富化された細胞フラクションを得るために好ましいと考えられる。好ましいインキュベーションの終了時に、最大細胞遊離を確実にするために最後のタッピングを実施し得る。
【００４２】
コラゲナーゼ活性は、当技術分野で公知の多くの手順（例えば希釈、ろ過または遠心分離とそれに続く傾瀉）を用いて停止し得る。コラゲナーゼ活性を停止し、工程（ｂ）に従って細胞を分離する好ましい手段は、試料を２０倍以上過剰のＰＢＳ（ｖ／ｖ）または同様の緩衝液で希釈することを含む。遊離された細胞をＰＢＳと混合し、残存する細胞を生検から溶液中に強制的に放出させるために注射器／針を使用し得る。直後に、ＰＢＳ／細胞混合物を７０ミクロンの細胞ストレーナーで篩過し、その後遠心分離（１８００ｒｐｍで５分間）のためにもう１つの遠心管に移し得る。次にコラゲナーゼ／ＰＢＳ溶液を廃棄し、細胞ペレットを、細胞計数およびその後の操作（磁気および螢光励起細胞選別機（ＦＡＣＳ）による分離）に適した培地、通常は２％ＦＣＳを含むＤＭＥＭに再懸濁する。
【００４３】
コラゲナーゼ消化および細胞分離（例えば前の項で述べたような）後、本発明者らは、表現型的に純粋なＭＳＣ集団（ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞）の割合が吸引液中より１００倍以上高いことを認めた。細胞数は遊離された全細胞の５〜１０％またはそれ以上であり得る。そのような製剤は、本発明に従って臨床的に有用である。
【００４４】
本発明の一部の実施形態では、本発明者らは、工程（ａ）にさらなる酵素消化を含めることによって最適ＭＳＣ製剤が調製され得ることを確認した。それ故、さらなる酵素消化の選択は、処理される組織試料によっておよびＭＳＣの最終的用途によって決定されることが認識される。例として、本発明者らは、２回目のコラゲナーゼ処理および／またはヒアルロニダーゼ処理が骨に関して最大数のＭＳＣを遊離させるために特に有用であり得ることを認めた。２回目のコラゲナーゼ処理およびヒアルロニダーゼ処理を実施するためのプロトコールは実施例の中で述べる。組織が骨であり、ＭＳＣを骨修復のために使用するときは、工程（ａ）を、２回目のコラゲナーゼ処理および／またはヒアルロニダーゼ処理を含むように適合させることが最も好ましい。
【００４５】
本発明のある実施形態によれば、工程（ｂ）を、ＭＳＣ製剤の量を改善するために適用し得るさらなる手順工程によって補足してもよく、これらは、（１）死細胞／デブリの除去および（２）ＭＳＣのさらなる富化を含み得る。
【００４６】
細胞デブリ／死細胞の除去は多くの公知の手段によって（例えばＭｉｌｔｅｎｙｉ ＢｉｏｔｅｃからのＤｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔを使用して）達成され得る。この工程は、さらなる富化が磁気ビーズを使用して実施される予定である場合に望ましい（下記参照）。しかし本発明者らは、さらなる富化工程が螢光励起細胞選別機（ＦＡＣＳ）による選別である場合にはこの細胞デブリ／死細胞の除去は必要でないことを認めた（同じく下記参照）。
【００４７】
遊離された細胞フラクションからのその後の磁気ベースのＭＳＣ富化のために、いくつかのアプローチを使用し得る。例えば本発明者らは、抗線維芽細胞マイクロビーズ（Ｄ７−ＦＩＢ抗体と直接結合した）、ＭＡＣＳｅｌｅｃｔマイクロビーズ（ＬＮＧＦＲ抗体と直接結合した）またはＣＤ２７１−ＡＰＣマイクロビーズ（全てＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｉｓｌｅｙ，ＵＫより）による陽性選択を実施した。いずれの方法も、ＭＳＣ比率のその後の１０倍以上の増加（コラゲナーゼ消化物中の全細胞の５０〜６０％まで）を導いた。ＭＳＣの表現型についての本発明者らの知識に基づき、本発明者らは、有用であり得る他のマイクロビーズは、ＣＤ７３結合またはＣＤ１０５結合（後者はＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃより市販されている）であると考える。あるいは、ＭＳＣと明確に交差反応しない慎重に選択した抗体カクテルを利用する系統陰性枯渇法（ｌｉｎｅａｇｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ）が使用できる。それ故、マイクロビーズの使用を伴う本発明の使用は、これまで可能と思われていたよりも少なくとも１０倍大きい、治療開発のためのＭＳＣの入手可能性を導き得る。
【００４８】
螢光励起細胞選別機（ＦＡＣＳ）による選別は、本発明の方法に従って生産されたＭＳＣフラクションをさらに富化するために使用し得る。９５％以上のＭＳＣ純度が螢光励起細胞選別機（ＦＡＣＳ）による選別によって容易に達成され得る。さらに、ＰＩ、７ＡＡＤまたは他の死細胞排除染色に基づき、死細胞／デブリを除去し得る。螢光励起細胞選別機（ＦＡＣＳ）による選別は、ＭＳＣ精製を１時間以内で達成することを可能にする。
【００４９】
ＭＳＣ富化はまた、細胞上の細胞表面マーカーを認識する抗体または他の物質を利用することによって達成され得ることが認識される。表２は、ＭＳＣを分離するために使用し得る抗体の例およびそれらが認識するマーカーを示す。
【００５０】
【表２】
【００５１】
ＭＳＣを含むフラクションは直ちに使用し得る。あるいはＭＳＣは、後日の使用のために従来の冷凍手法を用いて凍結してもよい。
【００５２】
本発明の最初の態様に従って精製されたＭＳＣは、一般にＭＳＣおよび幹細胞分野における学術研究者にとって極めて有用である。
【００５３】
当業者は、本発明に従った方法、細胞およびキットがまた、様々な予後および診断試験において特に有用であることを認識する。例えば血液検査室は、骨髄線維症、骨髄腫および骨髄異形成症候群を含むが、これらに限定されない疾患における間質異常をスクリーニングするための診断試験の一部としてＭＳＣ（本発明に従って）／骨髄間質支持細胞を富化し得る。骨／整形外科／リウマチ科／内分泌科および他の臨床科が、骨粗しょう症、大理石骨病、変形性関節症および骨壊死における骨芽細胞異常をスクリーニングするための診断試験の一部としてＭＳＣ／骨芽細胞前駆細胞を富化し得る。糖尿病／肥満についての診断試験は、そのような疾患における脂肪細胞発生の異常をスクリーニングするための診断試験の一部として、本発明に従って富化されたＭＳＣ／脂肪細胞前駆細胞／前脂肪細胞を利用し得る。さらに、「加齢」に関する診断および予後試験は、移植前の自家治療のための潜在能をスクリーニングする／予測するための診断試験の一部として本発明に従って富化されたＭＳＣを使用し得る。
【００５４】
本発明の方法は、骨髄微小環境の生物学を明らかにする科学者にとって特に有用である。本発明の方法は、彼らの生物学を健康状態および疾患においてエクスビボで検討することを可能にする多数の間質支持細胞を精製する方法を提供する。骨髄間質細胞／ＭＳＣは培養増幅後にかなりの変化を受け、現在のＤｅｘｔｅｒ型間質細胞培養をインビボ生物学のための信頼できない代用法にする。本発明は、正常骨髄、骨髄異形成性骨髄および悪性骨髄において骨髄微小環境をよりよく理解することを可能にする。骨髄間質をエクスビボで検討できることは、数多くの原発性骨髄疾患、例えば多発性骨髄腫および転移性骨髄疾患の増殖因子、ケモカインおよびサイトカインの支持を定義するために重要な意味を有し得る。これは、骨髄疾患のための多数の新しい治療法を導き得る。同様に、健康状態および疾患における骨髄微小環境を理解するための潜在的可能性は、骨粗しょう症を含む骨関連疾患の治療のための新しい治療法の開発にとって意味を有し得る。
【００５５】
本発明の方法は、細胞治療手法において使用し得る本発明の第三の態様に従った薬剤を生産するために使用し得る。細胞療法は、自己および同種ＭＳＣの両方を利用することができる。
【００５６】
本発明の第三の態様に従った薬剤は、本発明の最初の態様の方法に従って分離された細胞と生理的に許容される緩衝液またはスカフォールドを含むべきである。緩衝液は、ＭＳＣを生存可能状態に維持し、同時に治療される被験者への投与のために安全である無菌細胞培養培地（および好ましくは血清等の添加を必要としない規定培地）を含み得る。スカフォールドは、ＭＳＣの付着と分化を支持し、同時に治療される被験者への投与のために安全である無菌生体適合性材料を含み得る。
【００５７】
本発明の最初の態様に従って提供されるＭＳＣは、自己細胞療法が必要とされるとき特に有用である。本発明の最初の態様の方法は、臨床医が被験者から組織の試料を入手し、臨床的に有用な数のＭＳＣを遊離させるために組織をコラゲナーゼで処理して、その後治療される被験者に細胞を再導入することを可能にする。本発明の方法は、臨床医が、組織試料を採取した被験者にＭＳＣを迅速に再導入することを可能にする。例えば細胞は、試料の採取から数日以内に、採取と同日に、または臨床および支援スタッフの慎重な連携の下で数時間以内に（例えば３時間以内に）再導入され得る。これは、被験者を処置室または手術室から移動させる必要なしに組織試料を採取し、富化されたＭＳＣを再導入し得ることを意味し得る。これは、ＭＳＣを採集すること、数を増大させるためにＭＳＣを培養すること、およびその後被験者に細胞を再導入すること（通常は少なくとも数週間後に）を含む先行技術の手法に比べて重要な改善である。これは本発明の特に重要な特徴で表す。それ故、本発明の第五の態様によれば、
（ａ）被験者からＭＳＣと細胞外マトリックスを含む組織試料を得ること、
（ｂ）前記組織試料を、液体培地中で細胞外マトリックスからＭＳＣを遊離させるのに十分な量のコラゲナーゼで処理すること、
（ｃ）ＭＳＣを含む培地のフラクションを分離すること、および
（ｄ）前記被験者が細胞療法から利益を得ることを可能にする身体部位で前記フラクションを前記被験者に再導入すること、
を含む、そのような治療を必要とする被験者に細胞療法を実施する方法が提供される。
【００５８】
本発明者らは、ＭＳＣが、治療上適切な量で同じ被験者に再導入するために十分な、驚くべき数で被験者から分離され得ることを認めた。
【００５９】
ＭＳＣは、本発明の最初の態様の方法を用いることにより、本発明の第五の態様に従って富化され得ること（例えば骨髄／海綿骨から）が好ましい。
【００６０】
フラクションは、試料を入手してから２４時間以内に、好ましくは１２時間以内に、好ましくは３〜４時間以内に再導入されることが好ましい。
【００６１】
本発明の第五の態様の方法に従って使用される細胞は、前記ＭＳＣを凍結する必要がないように使用されることが好ましい。
【００６２】
本発明者らは、本発明が、以下を含むが、これらに限定されない多くの自己細胞療法レジメンに適用できることを確認した：
（１）骨修復（外傷性骨折、分節性骨欠損、頭蓋顔面再建、上顎洞底挙上術適応症、脊椎固定適応症、骨腫瘍／嚢胞適応症）
（２）軟骨修復（外傷性損傷、変形性関節症）
（３）骨格筋修復（デュシェーヌ筋ジストロフィーその他）
（４）腱修復（運動選手における外傷性損傷）
（５）靭帯修復（運動選手における外傷性損傷）
（６）半月修復（運動選手における外傷性損傷）
（７）心筋修復（心筋梗塞後および心筋症後）
（８）脊髄損傷、パーキンソン病および他の神経変性疾患
（９）免疫媒介性組織拒絶反応、移植片対宿主病および慢性関節リウマチ（免疫調節細胞療法として）
（１０）脂肪物質の再生（例えば中足骨に関連する脂肪体の再建等、または乳房に関連する脂肪組織の再生、例えば手術または事故後の乳房のリモデリングにおいて）
（１１）ＭＳＣは内皮細胞に分化し得る。従って本発明の方法は、内皮を形成することができる非常に多くの細胞が治療において必要とされ得る血管手術または虚血性血管病変のために有用である
（１２）骨粗しょう症。
【００６３】
本発明に従って調製したＭＳＣが骨修復（上記（１））において利用されることは、本発明の特に好ましい実施形態である。年間１００万例以上の整形外科手術が、置換手術、外傷、癌、変形性関節症、骨粗しょう症、先天異常または骨格欠損の結果としての骨修復を含む。大きな骨欠損の再構築は依然として骨移植を必要とするが、これは、ドナー部位の損傷、疼痛および感染や病原体伝播の潜在的危険性を含む、多くの難点を有する。骨粗しょう症では、股関節全置換手術が、転位型股関節骨折のために現在使用可能な唯一の治療である。新たな骨折の危険度を低下させる骨同化促進薬（テリパラチドおよびラネリン酸ストロンチウムなど）における新しい進歩を以ってしても、骨粗しょう症性股関節骨折の世界的な発生率は、母集団が高齢化すると共に今後５０年間に少なくとも３倍上昇すると予想される。これらの骨折を修復し、一般的に骨を治癒する新しい方法を見出すことは保健医療の緊急優先課題である。これに関して、ＭＳＣによる細胞療法は新しい解決法を提供する。
【００６４】
ＭＳＣは、胚幹細胞に関連する倫理的な問題がない成体幹細胞であり、インビボで骨を形成することが知られている。従って、ＭＳＣで（場合により骨伝導的スカフォールドおよび骨誘導的増殖因子と共に）工作される骨組織は、外傷および再建手術における骨同種移植片および自己移植片に代わる代替的戦略である。骨折治療に関して、骨癒合の割合および修復された骨の質の劇的な改善がＭＳＣの局所送達によって達成された。ＭＳＣ細胞療法はまた、骨形成不全症（ＯＩ）の非常に有用な治療である。
【００６５】
現在までこれらの公知の治療は、臨床的に有用な数を生成するために培養でのＭＳＣの増幅に基づいてきた。ＭＳＣの培養増幅はほとんど無限の細胞供給を生じるが、製造プロセスは長く、コストがかかる。これは、一般の人々（例えばイギリスにおけるＮＨＳなどの政府が資金援助する保健医療）にとってこれらの製品へのアクセスを排除するかまたはアクセスを厳密に制限する。高いコストに加えて、増幅ＭＳＣ培養は、細胞形質転換の潜在的可能性、突然変異の蓄積、細胞老化および多能性の喪失などの深刻な生物学的問題に結びつく。最後に、重要な規制上の問題が、増幅ＭＳＣの純度および骨形成「能」の評価に関してまだ存在する。例えばＣＤ７３、ＣＤ１０５および培養したＭＳＣの他の「古典的」マーカーは、現在、多能性細胞（皮膚および他のタイプの線維芽細胞で発現される）に特異的ではないことが証明されている。それ故、新しいコスト効果的でよりよく特徴付けられたＭＳＣ製品についてのニッチが存在する。
【００６６】
本発明の最初の態様の方法に従って調製されるＭＳＣはこのニッチを埋めることが認識される。本発明者らは、驚くべきことに、新鮮ＭＳＣが組織試料から臨床的に有用な数で分離され得ることを見出した。増幅ＭＳＣと異なり、新鮮分離したＭＳＣの明らかな利点は、この細胞製品が入手できる速度である。本発明の最初の態様の方法によれば、小さな海綿骨生検試料は、５時間の分離手順後に約５×１０５の純粋ＭＳＣ（ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞）を生じ得る。新鮮分離ＭＳＣの２番目の利点は、高い純度を示すそれらの完全な表現型特徴付けられたのである。３番目の利点は、骨形成についてのそれらのより高い潜在能である。
【００６７】
本発明のさらなる好ましい実施形態では、本発明に従って調製したＭＳＣは、軟骨修復において（上記（２））、特に変形性関節症（ＯＡ）を治療するために使用される。ＯＡは、関節器官不全を伴う関節破壊によって特徴づけられる疾患である。関節軟骨の喪失は、患者の小群における鍵となる主要事象であると考えられる。低分子による治療的介入処置が軟骨再生における役割は実証されていない。細胞療法を利用する軟骨修復のための現在のゴールドスタンダードは、自己軟骨細胞移植（ＡＣＩ）手順である。しかし、従来のＡＣＩは、最初の軟骨採集の時点から治療までを完了するのに数ヶ月を要し得る。これは非常に費用のかかる手順であり、その結果として使用可能性は限定されている。さらに、軟骨からの細胞は加齢と共に増殖と分化が低下し、高齢被験者でのＡＣＩ手順の成功が少ないことに寄与するので、この手順はより若い被験者にしか適さない。またこの手順は、最初に軟骨から生検を採取することを含むので、潜在的に有害である。それにもかかわらず、ＡＣＩ手順はすべての他の細胞療法を判断する基準である。最近、細胞移植を助けるためのマトリックスの使用を含むＡＣＩ関連の開発が為されたが、これらは手順のより広い制限を回避しなかった。多くの骨誘導マトリックス、増殖因子および細胞製品が既に市販されている骨再生と比較すると、軟骨修復については状況がかなり困難である。
【００６８】
それ故、関節軟骨に分化する可能性を有するＭＳＣは、ＡＣＩ手順を想起させる手法でのＯＡの治療開発のための細胞の潜在的ソースとみなし得ることが認識される。しかし、認識されているＭＳＣの希少性は、これらの細胞が、付随する感染の危険性、胎仔ウシ血清への曝露、細胞老化、効力の喪失、費用および／またはコストを伴う長期にわたる培養増幅手順を通過しなければならないことを意味する。本発明の方法は、臨床医が多数の幹細胞を迅速に入手し、速やかにこれらをＯＡ関節軟骨欠損患者に戻すことを可能にする。これは、ＯＡの治療における重大な進歩を表す。多数のＭＳＣを迅速に分離できることは、軟骨欠損がＯＡの評価のための磁気共鳴画像法の広く行き渡った使用と共にますます認識されつつあることを考慮すると、現在の状況では特に重要である。
【００６９】
本発明のさらに一層好ましい実施形態では、本発明に従って調製したＭＳＣは、骨粗しょう症の治療において利用される。本発明者らは、骨前駆細胞を含むＭＳＣ（本発明に従って調製した）の生物学および表現型が培養増幅されたＭＳＣとかなり異なることに注目した。培養増幅されたＭＳＣは、人における骨前駆細胞機能の評価のためのゴールドスタンダードを形成してきた。ＭＳＣ／骨前駆細胞の大規模精製を実施できることは、骨粗しょう症の治療経路発見のために新しい道を切り開き得る。
【００７０】
本発明のさらなる実施形態によれば、本発明者らは、ＭＳＣがまた、本発明に従って外来性ソースから分離でき、その後幹細胞療法によって治療され得る医学的状態（例えば骨折またはＯＡ）に罹患している被験者での細胞療法において利用され得ることを確認した。同種ＭＳＣは、股関節、椎骨および胸骨髄を含む様々な部位から死体ドナーより、血縁者／子孫、またはマッチする無関係なドナーから富化し得る。それ故、本発明の６番の態様によれば、
（ａ）死体またはドナーからＭＳＣと細胞外マトリックスを含む組織試料を得ること、
（ｂ）前記組織試料を、液体培地中で細胞外マトリックスからＭＳＣを遊離させるのに十分な量のコラゲナーゼで処理すること、
（ｃ）ＭＳＣを含む培地のフラクションを分離すること、および
（ｄ）被験者が細胞療法から利益を得ることを可能にする身体部位で前記フラクションを前記被験者に導入すること
を含む、そのような治療を必要とする被験者に細胞療法を実施する方法が提供される。
【００７１】
死体またはドナーは被験者と同じ種であることが認識される。被験者はヒトであることが最も好ましい。しかし、本発明者らは、ＬＮＧＦＲマーカーが多くの他の動物（例えばウシ、ウマ、ヤギおよびヒツジ）において保存されていることに注目した。それ故、同じ手順が動物（例えばイヌおよび特にウマなどの愛玩動物）において骨または軟骨修復のための細胞を入手するために使用できることが認識される。
【００７２】
富化されたＭＳＣの同種ソースは、本発明の第五の態様に関して列挙したものと同じ治療レジメン（１〜１２）において使用し得る。
【００７３】
本発明の方法に従ってＭＳＣが富化される組織は、細胞のその後の分化に関して達成されるべき所望治療特性に準拠して選択され得る。例えば本発明者らは、滑膜組織から富化されたＭＳＣが著明な軟骨形成特性を有する細胞を生じることを見出し、従って軟骨の生成を治療的に促進することが望ましい状況では、ＭＳＣを滑膜から富化することが好ましいと考えられる。
【００７４】
同様に、本発明者らは、膝蓋下脂肪体から富化されたＭＳＣが一貫して高い脂肪生成特性を有する細胞を生じることを認め、従って脂肪組織の生成を治療的に促進することが望ましい状況では、ＭＳＣを脂肪体から富化することが好ましいと考えられる。
【００７５】
本発明の第六の態様に従って富化されたＭＳＣはまた、同種ＭＳＣが、治療される被験者における遺伝的欠陥を矯正する遺伝子型を有する状況下での遺伝子治療において適用され得る。そのような細胞で治療される状態は以下を含む。
【００７６】
（ａ）骨形成不全症およびまれな軟骨形成不全症および筋肉の遺伝的疾患を含むが、これらに限定されない、骨および軟骨機能の喪失に関連する先天異常
（ｂ）骨髄腫および骨髄異形成症候群その他を含む、間質機能の喪失に関連する血液学的異常。
【００７７】
本発明のさらなる実施形態によれば、本発明の第五および第六の態様の治療レジメンは、工程（ｃ）で分離されたフラクションが、被験者に導入される（または再導入される）前に富化されたＭＳＣを遺伝的に修飾して処理されるように適合させ得る。
【００７８】
被験者からのＭＳＣ（すなわち自己ＭＳＣ）は、遺伝的に修飾されて被験者に再導入されることが好ましい。しかし、一部の臨床状況は、死体またはドナーソースからのＭＳＣが必要とされることを決定付け得ることが認識される。実際に、そのようなＭＳＣ（死体またはドナーソースからの）は所望遺伝子型を含み得る。細胞は、それ故、１つの遺伝的異常（上記で考慮されるような）を矯正するために被験者に導入され得、治療される被験者においてさらなる遺伝的影響を及ぼすために遺伝的修飾を施され得る。従って、本発明に従って富化された細胞は、遺伝的成分を有する多くの状態の治療において使用でき、これらは、上記（１）〜（９）および特に（１０）および（１１）で考慮されるものを含む。
【００７９】
本発明の第四の態様に従ったキットは、上記で論じた何らかのコラゲナーゼを含み得る。コラゲナーゼはＩ型コラーゲンを消化することが好ましい。コラゲナーゼはヒストリチクス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）（例えばＳｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｇｉｅｓ Ｉｎｃ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＣＡによって供給されるような）に由来し得る。
【００８０】
キットは、場合により、コラゲナーゼのための適切な希釈剤および緩衝液（例えばリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、場合により最終濃度２０％の胎仔ウシ血清を含む）および試料（これも、好ましくは２％胎仔牛血清を含む、ＰＢＳであるか、またはＤＭＥＭなどの生理的に許容される緩衝液であり得る）を含み得る。
【００８１】
工程（ｂ）がＭＳＣのさらなる精製を含む予定であるとき、キットは、これを実施するための試薬をさらに含むことが好ましい。従ってキットは、ＭＳＣの磁気ビーズ分離に適する試薬および装置を含み得る。従ってキットは、本明細書で論じるようにＭＡＣＳカラム、マイクロビーズ、ＭＡＣＳ緩衝液（０．１％ウシ血清アルブミンを含む）を含み得る。あるいはキットは、遊離されたＭＳＣのさらなる精製のための螢光励起細胞選別機（ＦＡＣＳ）試薬（例えば表２に列挙する抗体および緩衝液（例えばＰＢＳ））を含み得る。
【００８２】
本発明を、実施例によっておよび以下の図面を参照してさらに説明する。
【実施例１】
【００８３】
骨髄試料からの間充織幹細胞の富化
１．１ 実験材料および方法
１．１．１ 試料の収集
（ｉ）ＢＭ吸引液（２〜１０ｍｌ）を正常ドナーの後腸骨稜から得た。Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｎｙｃｏｍｅｄ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）による分離後にＢＭ単核細胞（ＭＮＣ）を収集した。浮遊脂肪フラクション（ＦＦＦ）に集中する細胞凝集物を手動で攪拌によって分散させ、遠心分離した。単房性脂肪細胞は上部に浮遊したままであったが、間質細胞はペレットに集中した。
【００８４】
（ｉｉ）ＢＭ生検材料を、同意を得た変形性関節症（ＯＡ）を有する患者の股関節形成術の間に除去された大腿骨頭から得た。大腿骨頭は外科医によって半分に切断され、ＰＢＳの入った無菌容器中で検査室に送達された。４ｍｍパンチ生検を用いて標本を収集した。あるいは、Ｂｏｎｅ Ｍｉｌｌ（Ｄｅ Ｐｕｙまたは他の製造業者）を用いて大腿骨頭を均質化し、酵素消化を受けるさらに一層小さな断片を得た。
【００８５】
１．１．２ コラゲナーゼ消化
パンチ生検試料０．１ｇを０．２５％コラゲナーゼ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）０．２５ｍｌで３〜４時間消化した。これは、酵素約２５０〜３７５単位に相当した。本発明者らは、これが細胞の回収率および生存度のために最適であることを見出した。
【００８６】
１．１．３ ＭＳＣフラクションの取扱い
好ましいインキュベーション時間の終了時に、コラゲナーゼ溶液を２０倍以上過剰のＰＢＳ（ｖ／ｖ）で希釈し、注射器／針を使用して放出された細胞をＰＢＳと混合し、残存する細胞を生検から溶液中に強制的に放出させた。直後に、ＰＢＳ／細胞混合物を７０ミクロンの細胞ストレーナーで篩過し、遠心分離（１８００ｒｐｍで５分間）のためにもう１つの遠心管に移した。次にコラゲナーゼ／ＰＢＳ溶液を廃棄し、細胞ペレットを、細胞計数およびその後の操作（磁気および螢光励起細胞選別機（ＦＡＣＳ）による分離）に適した培地、通常は２％ＦＣＳを含むＤＭＥＭに再懸濁した。
【００８７】
一部の試料から、ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞を、以前に述べられているように（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ２００２：４６：３３４９−６０）、フローサイトメトリーのために処理し、精製し、増幅し、分化させた。
【００８８】
１．２ 結果
１．２．１ 骨髄（ＢＭ）吸引液中のまれな間充織幹細胞（ＭＳＣ）がＤ７−ＦＩＢ＋ＣＤ４５ｌｏｗＬＮＧＦＲ＋表現型を有することの確認
本発明者らは、ＢＭ吸引液において全てのＭＳＣ活性がＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞の希少集団に限定されることを確認した。本発明者らはさらに、この集団の発生率とクローン原性を検討した。同じドナーに関して、４色サイトメトリーによって測定した、ＢＭ（単核細胞）ＭＮＣフラクション中のＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞の平均発生率は０．０３９±０．０３７％であり（図１、上）、同じ試料中で生じるＣＦＵ−Ｆの平均発生率０．００７±０．００６％（ｎ＝３０）に匹敵する大きさであった。
【００８９】
さらに、本発明者らは、これのまれな細胞集団の発生率が、Ｄ７−ＦＩＢマイクロビーズによる前富化後に約１００倍上昇する（７±６％まで、ｎ＝３８）ことを見出した（図１、中央のパネル）。この前富化工程は、Ｄ７−ＦＩＢに直接結合したマイクロビーズ（Ａｎｔｉ−Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）による正の選択（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）である。簡単に述べると、１０８ＢＭ ＭＮＣをマイクロビーズ１００μｌと共に室温で１５分間インキュベートし、その後１８００ｒｐｍ×５分間洗浄して非結合マイクロビーズを除去する。次に細胞をＭｉｎｉＭａｃｓカラム（磁石内に置いた）に適用し、非結合フラクションをＭＡＣＳ緩衝液（０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ）６ｍｌ中に収集する。その後、カラムを磁石から取り出し、結合フラクション（ＭＳＣを含む）をＭＡＣＳ緩衝液０．５〜１ｍｌ中に遊離させる。これがＭＡＣＳ分離の標準プロトコールである。
【００９０】
ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋集団を選択するための螢光励起細胞選別機（ＦＡＣＳ）による選別後、ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞集団の純度は９５％超に上昇した（図１、下のパネル）。この富化された集団について、標準ＣＦＵ−Ｆアッセイ（Ｃａｓｔｒｏ−Ｍａｌａｓｐｉｎａ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｂｌｏｏｄ ５６ ｐ２８９−３０１）において６細胞のうち１個（１７±４％、ｎ＝６）が３０以上の細胞の定義されたコロニーを形成した。
【００９１】
マッチするＣＤ４５＋細胞からはコロニーが成長しなかった。これらのデータは、ＢＭ吸引液中の全てのクローン原性ＭＳＣがまれなＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋集団内に含まれることを確認した。
【００９２】
１．２．２ インビボでのＢＭ ＭＳＣの間質特徴
本発明者らは、ＢＭ吸引液から精製したＭＳＣが、ＢＭ外膜細網細胞（ＡＲＣ）を想起させる間質形態（数多くの突起を有する星形）を示すこと、および小さな脂肪滴がそれらの細胞質に見出されることに注目した（図２Ａ）。ＢＭ生検に関して、ＡＲＣ形態を有する細胞は、インビボＭＳＣで発現されたＣＤ１０マーカーに関して陽性であった（図２Ｂ）。さらに、精製したインビボＢＭ ＭＳＣは、ＡＲＣの主要特徴である、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）に関して均一に陽性であった（図２Ｃ）。ＡＬＰに対する抗体（ＡＬＰ骨／肝アイソフォームに対する、Ｂ４−７８クローン）での染色は、全てのインビボＭＳＣでの均一な発現を明らかにした（図２Ｄ）。ＡＬＰ発現は、ＭＳＣの培養増幅後徐々に消失した（図２Ｅ）。リンパ球産生の間質支持のために非常に重要であり、ＡＲＣによって産生されることが公知のサイトカイン、ＩＬ−７の発現も、増幅後に低下した（図２Ｆ）。培養した皮膚線維芽細胞はＡＬＰについて常に陰性であり、極わずかなＩＬ−７を発現した（図２ＥおよびＦ）。
【００９３】
本発明者らは、これらのデータを合わせて考慮したとき、インビボでのＢＭ ＭＳＣはＡＲＣと一致する多くの特徴を有し、これらの特徴がインビトロ培養後に失われることを認識して驚いた。これは２つのことを示唆した。第一に、ＭＳＣの培養は表現型の変化を導くので、望ましくないと考えられる。第二に、当業者はインビボでのＭＳＣがＡＲＣ様の性質を有することを認識していない。ＡＲＣは細胞の相互結合ネットワークを形成し、酵素処理によって遊離され得る。従って本発明者らは、酵素消化を用いてＭＳＣを分離することも可能であることを認識した。本発明者らは、ＭＳＣ活性が、ＡＲＣおよびおそらく骨ライニング細胞、血管周囲細胞および前脂肪細胞などの他のこれまで見過ごされてきた細胞に存すると考える。これらは全て吸引することが不可能であり、それが、酵素消化が必要とされる理由である。
【００９４】
１．２．３ ＢＭ間質細胞凝集物からのインビボＭＳＣの酵素による遊離
ＭＳＣがＡＲＣ様の性質を有し得ることが認識されたので、本発明者らは、組織の酵素消化がＭＳＣを遊離するかどうかを検討した。本発明者らは、この着想を、変形性関節症（ＯＡ）を有する患者の股関節形成術の間に除去された大腿骨頭から得た材料で試験した。
【００９５】
ＭＳＣは、ＢＭ吸引液からの単一細胞懸濁液中の非常にまれな集団である。１０８の吸引ＢＭ ＭＮＣからの高度に純粋なＭＳＣ（ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋）の平均細胞収量は、吸引骨髄１ミリリットル当たり約２，０００ＭＳＣに等しい、１１，０００細胞（４，０００〜６３，０００の範囲、ｎ＝１４）であった。この収率は臨床的に有用であるためにはあまりに低く、有用な数の細胞を生成するためにインビトロでの増幅を必要とする。さらに、上記で指摘したように、本発明者らは、増幅工程がＭＳＣ表現型の変化を導き得ると考えられる。
【００９６】
インビボでのＢＭ ＭＳＣがＡＲＣ細胞と同じ特徴の多くを共有することが認識されたので、本発明者らは次に、１．１で述べた方法（ＡＲＣ／マトリックスネットワークを解体することができる方法に基づく）を用いた酵素による抽出の方法が、従来の骨髄吸引液ソースと異なって、固体組織生検から高い数のＭＳＣを遊離させるのに適するかどうかを試験した。
【００９７】
３時間、または３〜４時間の、生検のコラゲナーゼ処理はＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞を遊離させ、それらの細胞は、吸引液から精製されたＭＳＣと形態および表現型的に類似するが、驚くべきことに、生検試料から遊離された集団におけるそれらの細胞の割合は、吸引液中で認められるレベルよりも約１００倍高かった（ＢＭ吸引液中での０．０３９±０．０３７％生細胞、ｎ＝３０に対し、５±３％生細胞、ｎ＝８）。この上昇は、図３の上のパネルに示す螢光励起細胞選別機（ＦＡＣＳ）による結果において指示されている。
【００９８】
さらに、本発明者らは意外にも、疾患微小環境が起源であるにもかかわらず、本発明の最初の態様の方法に従って消化生検から精製されたＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞は、軟骨形成のレベルは低下していたが（正常ＢＭ対照によって生産された３±２μｇに比べて硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）／ペレットの１±１μｇ、ｎ＝４）、増殖および分化に関して正常なＭＳＣ機能を保持することを認めた。この所見は、ＯＡ患者のＢＭに由来するＭＳＣの公知の特徴と一致した。正常個人からの海綿骨生検を使用したときは、正常レベルのＭＳＣ軟骨形成が得られた（データは示していない）。
【００９９】
この試験の結果は図３の下のパネルに示され、本発明の最初の態様の方法に従って富化したＭＳＣの顕微鏡写真と螢光励起細胞選別機（ＦＡＣＳ）による分析を例示する。このパネルの左側の図に示す螢光励起細胞選別機（ＦＡＣＳ）による結果は、ＭＳＣの性質を例証するマーカーの、ゲートＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞（すなわち新鮮ＭＳＣ）での発現を示す。このパネルの右側の図に示す顕微鏡写真は、コラゲナーゼ消化によって得たＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞が３つの間葉系統に分化できることを示す。
【０１００】
消化生検から選別された高度富化ＭＳＣ（ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋）の収量は、吸引液から通常得られる収量よりも平均で５０倍（一部の場合には１００倍超）高かった（１０８の吸引ＢＭ ＭＮＣからの１１，０００細胞、４，０００〜６３，０００の範囲、ｎ＝１４に比べて、１０８総細胞当たり約５５０，０００細胞、８０，０００〜８００，０００の範囲、ｎ＝６）。平均で、０．１ｇ生検は、約２５，０００ＣＦＵ−Ｆに等しい、約１５０，０００ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＥＲ＋細胞を生じた（ｎ＝７）。遊離された細胞フラクション中のＣＦＵ−Ｆの割合はＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞の発生率と直接相関した（Ｒ＝０．８９、ｎ＝７）。それ故、本発明者らは、単一の０．１ｃｍ３（０．１ｇ重量）生検から約１０，０００ＭＳＣまたは２５，０００または１５０，０００ＭＳＣを得ることができた。本発明者らは、この収量が本方法によって誘導されるＭＳＣの直接臨床使用を可能にするのに十分なほど高いことを認識して驚いた。これらの収量は、ＢＭ吸引液１５０〜３５０ミリリットルを使用するのに等しい。
【０１０１】
実際に、本発明者らは、本発明の最初の態様の方法に従ったコラゲナーゼ消化によって遊離されるＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞の発生率（２〜９％、ｎ＝８）が非常に高いので、それらの検出、分離または治療としての使用を可能にするためにマイクロビーズによる前富化がもはや必要ではないことを見出した。他方で、従来のＢＭ吸引液からの同じＭＳＣ用量を同じ目的に使用する場合（すなわち１５０〜３５０ミリリットル）、同様のレベルの純度を確保するためにＭＳＣをかなり濃縮しなければならない。本発明は、臨床医が複雑で時間のかかる富化工程または培養での増幅を必要とせずに試料から採取したＭＳＣを迅速に利用することを可能にするので、これは本発明者らの方法がいかに有利であるかを例示する。さらに、本発明者らは、１名の患者からの１つの大腿骨頭が、本発明の方法に従って処理され、ＢＭ吸引液を使用した場合には不可能である多数の治療のために十分なＭＳＣを提供できることを立証した。
【０１０２】
１．２．３ コラゲナーゼによる二重消化を用いた高度骨形成性ＭＳＣの酵素による遊離
骨修復適用のためには、卓越した骨形成能力を有するＭＳＣの使用が望ましい。ＭＳＣ活性が骨ライニング細胞に存在し得ることが認識されたので、本発明者らは、１．１で述べた３〜４時間のコラゲナーゼ消化工程に加えて、付加的な酵素による抽出の方法が、高い骨形成能力を有するＭＳＣを遊離させるのに適することを示すことができた。図４ＡおよびＢに認められるように、本発明者らは、１．１で述べた方法を用いるコラゲナーゼ消化工程が、大部分の骨ライニング細胞を除去するが、全部ではない（平均で全ＤＮＡの約２％が骨に残る、ｎ＝３）ことを明らかにすることができた。２回目の１時間のコラゲナーゼ消化工程を１回目の消化物の収集後の生検断片で実施したとき、骨に残された細胞の割合は５倍近く低下し、回収された細胞の総収量が平均５％上昇した（ｎ＝３）。２回目の消化物のクローン原性は１回目の消化物と同様であったが（それぞれ、１２ＣＦＵ−Ｆ／５，０００遊離細胞に比べて１３ＣＦＵ−Ｆ／５，０００遊離細胞、ｎ＝３）、その骨形成能はしばしば２倍高かった（それぞれ、９０μｇ Ｃａ＋＋／５，０００遊離細胞に比べて１７０μｇ Ｃａ＋＋／５，０００遊離細胞）（図４Ｃ）。本発明者らはまた、２回目のコラゲナーゼ消化工程が、ＰＢＳ中で５０Ｕ／ｍｌの最終濃度に希釈したヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）の０．５ｍｌ溶液での１時間の処理に置き換え得ることを明らかにすることができた。コラゲナーゼ消化と同様に、ヒアルロニダーゼでの処理は、細胞振とう機にて３７℃で実施する。この処理も、遊離される総細胞の追加の５％に寄与する骨ライニング細胞を遊離させた（ｎ＝３）。コラゲナーゼまたはヒアルロニダーゼを用いて得られた、２回目の消化物中のＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞のＭＳＣマーカー表現型は、１回目の消化物のものと同様であった（ＣＤ７３＋＋＋ＣＤ１０５＋ＣＤ９０＋＋＋ＣＤ１４６＋＋、ｎ＝２）。この二重消化手順後、インサイチューで残存する唯一の残留細胞は骨の内部に位置した（骨細胞）（図４Ｄ）。
【０１０３】
それ故、骨修復適用のために骨試料を処理する好ましい方法は、２回目のコラゲナーゼ処理または代替的に、上述したようなヒアルロニダーゼ処理を実施することである。
【０１０４】
１．２．３ 浮遊脂肪凝集物からのインビボＭＳＣの酵素による遊離
正常ＢＭは浮遊脂肪フラクション（ＦＦＦ）と称される浮揚性の脂肪滴を含み、これは、ＭＳＣ富化の準備としてＢＭ ＭＮＣの調製の間に密度勾配遠心分離によって廃棄される。ＦＦＦは、高齢者（骨髄が徐々に脂肪性になるので）または一部の疾患（慢性関節リウマチまたは骨粗しょう症など）を有する人々において増加する。
【０１０５】
本発明者らは、意外にも、本発明の方法がＭＳＣ収率を高めるために吸引液に適用できることを見出した。これはＦＦＦの収集を必要とする。次にそれを、成熟脂肪細胞から間質細胞／ＡＲＣ／ＭＳＣを分離するために本発明に従ってコラゲナーゼ処理する。
【０１０６】
本発明者らは、従来の先行技術の手法を用いて正常ＢＭから収集した吸引液中の浮遊脂肪フラクション（ＦＦＦ）を分析した。同じドナーを使用した試験では、分散ＦＦＦ中のＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋表現型を有する細胞の割合は０．３±０．１％であり、それ故、対応するＭＮＣフラクション中に存在する割合（０．０３±０．００６、ｎ＝５）よりも約１０倍高かった。そこで本発明者らは、驚くべきことに、先行技術の手法によれば通常は廃棄されるＦＦＦがＭＳＣの貴重な供給源を表すことを見出した。
【０１０７】
さらに、本発明者らは、ＦＦＦ細胞をコラゲナーゼで消化したとき、生成されるＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞の割合がさらに上昇し、総生細胞の７±５％に達することを認めた（ｎ＝５）（図５、上のパネル）。この収率は、先行技術の手法に従ってＭＳＣのソースとして使用されるＭＮＣフラクションにおける収率より約２００倍高かった。ＦＦＦから遊離されるＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞は、それらのＭＮＣ対応物と比較して同様の広範な表現型を有し、増幅後も多能性であった（上述したものと同じ細胞系譜を検討した螢光励起細胞選別機（ＦＡＣＳ）による結果および形態学的試験を提示する図５の下のパネルに示すように）。ＦＦＦから富化したＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞はＡＬＰ陽性であり、それらの細胞質内に脂肪小滴を有した。これは、細胞がインビボで「前脂肪細胞」状態を有することを指示する。それらのインビボでのアルカリホスファターゼの発現は、それらの「前骨芽細胞」状態を示唆する。合わせて考慮すると、これは、個々の単一細胞に固有の多能性を示唆する。
【０１０８】
全体として見ると、これらのデータは、ＢＭ中に存在するＭＳＣの大部分が単一細胞の形態（先行技術によって示唆されるように吸引液を使用して収集されることが予想され得るタイプの）では見出されないことを示した。その代わりに、驚くべきことに、ＢＭ ＭＳＣの大部分が間質細胞ネットワークに組み込まれ、浮遊脂肪細胞を含む隣接細胞および膠原性基質と共に凝集物を形成することが認められた。
【０１０９】
本発明の最初の態様の方法（間質細胞のネットワークおよびマトリックスからＭＳＣを遊離させるためにコラゲナーゼ消化を利用する）は、先行技術の手法を用いて達成され得るよりもはるかに多くの出発集団からＭＳＣを分離し、富化するために使用し得ることがこの驚くべき所見に照らして認識される。それ故、本発明の最初の態様の方法は、ＭＳＣの高い富化が達成され得る新しい独創的な方法を提供する。
【実施例２】
【０１１０】
滑膜からの間充織幹細胞の富化
２．１ 実験材料および方法
２．１．１ 試料の収集
８つの滑膜組織ソース、即ち、１名の正常ドナー、ＲＡを有する４名の患者、ＯＡを有する１名の患者、痛風を有する１名の患者および血清反応陰性関節炎を有する１名の患者から得た試料を調べた。
【０１１１】
診断関節鏡検査中に、滑膜生検を採取した。小さな組織生検（平均４４ｍｇ）を培地（通常はＤＭＥＭ／２％ＦＣＳ）２ｍｌと共に、１５ｍｌ遠心管に入れて、実験室に運んだ。
【０１１２】
２．１．２ コラゲナーゼ消化
実験室に到着した後、培地を取り除き、生検を０．２５％コラゲナーゼ溶液に入れて、一定な回転下で３または４時間消化した。試料が完全に消化されたとき、コラゲナーゼ溶液は混濁し、細胞生検は崩壊して、完全に消失する。インキュベーション後、ＰＢＳ １０ｍｌを添加し、注射器／針を使用して残存する可能性のある組織塊を破壊した。直後に、ＰＢＳ／細胞混合物を７０ミクロンの細胞ストレーナーで篩過し、遠心分離（１８００ｒｐｍで５分間）のためにもう１つの遠心管に移した。次にコラゲナーゼ／ＰＢＳ溶液を廃棄し、細胞ペレットを、細胞計数およびその後の操作（磁気および螢光励起細胞選別機（ＦＡＣＳ）による分離）に適した培地、通常は２％ＦＣＳを含むＤＭＥＭに再懸濁した。
【０１１３】
２．１．３ 細胞選別戦略
上述したコラゲナーゼ消化手法を用いて滑膜試料から遊離された細胞を、図９に概略的に示すプロトコールを用いてＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞に関して富化した。簡単に述べると、高ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色に基づいて死細胞を廃棄し、残存する生細胞を、低いＣＤ４５発現を有するがＬＮＧＦＲの高発現を有するものを選択するために連続的に選別した。
【０１１４】
この戦略によって得られた選別細胞の線維芽細胞形態が図９の最後の画像に示されている。これらの選別されたＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞は、その後、それらの高い増殖性と一致して、培養下で増殖する細胞単層を生成することができた。
【０１１５】
２．２ 結果
２．２．１ 免疫化学およびフローサイトメトリー分析
間充織幹細胞は多くの他の組織で報告されているが、それらのインビボでのトポグラフィーおよび表現型はこれまで不明であった。本発明者らは、滑膜および関節脂肪体を含む固体組織中でのＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞のトポグラフィーを検討した。滑膜では、Ｄ７−ＦＩＢ抗体は全ての線維芽細胞を染色したのに対し、ＬＮＧＦＲは血管周囲領域内の線維芽細胞だけを染色した（図６）。
【０１１６】
ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞の血管周皮細胞様の分布を示す結果が図７に示されている。ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞は、血管の内腔に１細胞の深さの層を形成した内皮細胞（ＣＤ３１＋およびフォン・ビルブラント因子＋であることが知られる）（図７Ａに示す免疫標識）とは異なった。
【０１１７】
これに対し、固体組織中のＭＳＣが血管周皮細胞であるという認識と一致して、ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞は組織内に広がる陽性細胞のいくつかの層として血管支持体を形成した（図７Ｂ）。
【０１１８】
２．２．２ 滑膜からのＭＳＣの酵素による遊離
上記２．１で概説した方法を用いて滑膜からＭＳＣを遊離させた。
【０１１９】
本発明の最初の態様の方法に従った滑膜の酵素消化は、図８に示すように、大きな割合のＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞を生じた。ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞のこの富化は、細胞が分離された試料の健康状態には無関係であることが見出され（例えばパネル（ｉｉｉ）では痛風からの組織試料）、病気にかかっている患者からであっても、本発明の最初の態様の方法が自己ＭＳＣの治療的分離のために適切であることをさらに例証する。
【０１２０】
ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞を様々な滑膜試料から富化した（１つは正常ドナーから、４つはＲＡを有する患者から、１つはＯＡを有する患者から、１つは痛風を有する患者からおよび１つはセロネガティブ関節炎を有する１名の患者から）。疾患の性質とは無関係に、ＣＤ４５ｌｏｗＬＮＧＦＲ＋細胞は、全ての滑膜消化物において１５±９％の平均比率で、および他のデータセットでは１６±１０％の比率で存在した。
【０１２１】
全ての線維芽細胞がＤ７−ＦＩＢに関して陽性標識することを示す免疫組織化学データと一致して、ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋細胞は滑膜消化物中に高い割合で存在した（７６±２０％の平均比率、およびもう１つのデータセットでは５０±１２％）。
【０１２２】
滑膜組織のコラゲナーゼ消化物でのＬＮＧＦＲおよびＤ７−ＦＩＢの発現を明らかにする代表的実験を図８、パネル（ｉｉ）および（ｉｉｉ）に示す。特にパネル（ｉｉｉ）は、免疫組織化学データと一致して、ＣＤ４５ｌｏｗＬＮＧＦＲ＋細胞（滑膜血管周皮細胞）がＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋細胞（滑膜線維芽細胞）のフラクションを構成することを示す。表現型の共通性は、それらの共通する間葉系統の性質および両方の表現型を有する細胞におけるＭＳＣの存在の可能性を示唆する。
【０１２３】
２．２．３ 選別したＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞がＭＳＣを含むことの機能的証明
細胞単層（第４継代）を、本発明の最初の態様の方法に従って富化した滑膜組織（すなわち滑膜血管周囲細胞）からの選別ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋細胞から生成した。これらの細胞単層を、以下で述べるような骨芽細胞、脂肪細胞および軟骨細胞の分化（ｎ＝１）の機能的インビトロアッセイに供した。
【０１２４】
ｉ）骨芽細胞の分化を、１００ｎＭデキサメタゾン、０．０５ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸−２−ホスフェートおよび１０ｍＭ β−グリセロホスフェート（全てＳｉｇｍａより）によって誘導した。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）活性およびマトリックス鉱化作用を、それぞれＳｉｇｍａキット８２および１％アリザリンレッド（Ｓｉｇｍａ）を使用して検出した。Ｃａ＋＋沈着はＳｉｇｍａキット８５を用いて測定した。
【０１２５】
ｉｉ）脂肪細胞の分化を、０．５ｍＭイソブチルメチルキサンチン（Ｓｉｇｍａ）、６０μＭインドメタシン（ＩＣＮ，Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ，ＵＫ）および０．５ｍＭヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ）を添加したＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中で誘導した。脂質小胞の蓄積を、以前に述べられているように０．５％オイルレッドで視覚化した。
【０１２６】
ｉｉｉ）軟骨細胞の分化のために、２．５×１０５細胞を、高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、１００μｇ／ｍｌピルビン酸ナトリウム、４０μｇ／ｍｌプロリン、５０μｇ／ｍｌ Ｌ−アスコルビン酸−２−ホスフェート、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、Ｉ×ＩＴＳ＋、１００ｎＭデキサメタゾン（全てＳｉｇｍａより）および１０ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦ−β３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）からなる無血清培地に入れた。培地を１日おきに交換した。３週間目にペレットを採集し、凍結切片（５μｍの薄さ）を調製した。硫酸化ＧＡＧを１％トルイジンブルー（Ｓｉｇｍａ）で視覚化した。アルシアンブルー結合アッセイ（ＩＤＳ）を用いてｓＧＡＧを測定した。
【０１２７】
３週間の分化後、本発明に従って滑膜組織から遊離させたＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞に由来する培養物は、脂肪細胞、骨芽細胞および軟骨細胞表現型へと成功裏に分化した。この試験の結果を図９に示し、培養細胞によって実現された表現型を示す顕微鏡写真を提示している。
【０１２８】
選別した滑膜ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞に由来する細胞の多能性を、標準プラスチック付着法によって培養物を生成した、ＢＭ（ｎ＝５）または滑膜（ｎ＝５）由来の培養物と比較した。生じた脂肪細胞の割合は同様であり（それぞれ３０％対３３±１５％および２２±１５％）、生産されたカルシウムの量（骨芽細胞形成を指示する）は同じ範囲内であった（それぞれ１００μｇ／皿対８０±３７μｇおよび１２１±４７μｇ／皿）。軟骨細胞形成は、特に、非常に強力であり、生産されたプロテオグリカン（ＧＡＧ）の量は対照培養物を上回った（それぞれ９μｇ／ペレット対２．６±１．９μｇおよび２．２±１．４μｇ／ペレット）。
【０１２９】
データセットを、滑膜に関してｎ＝１５で比較できるように拡大した。同様の結果が得られ、この場合、生産されたプロテオグリカン（ＧＡＧ）の量は対照培養物を上回った（それぞれ９μｇ／ペレット対２．６±１．９μｇおよび１．８±１．７μｇ／ペレット）。
【０１３０】
全体として、ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋フラクションは全消化物の軟骨細胞形成活性の３分の２超を含み、その１／３だけが残留フラクション中に残った。これらのデータは、滑膜ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞（滑膜血管周皮細胞）が、対照培養物に匹敵するＭＳＣ活性を含み、軟骨細胞形成活性に関して特異的に富化されたことを示した。
【０１３１】
２．２．４ 本発明に従って富化した滑膜ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋集団内のＭＳＣの存在の単細胞レベルでの確認
本発明者らは、本発明に従って滑膜組織から遊離させた個々の細胞のクローン形成能を検討した（ｎ＝３ドナー、全てＲＡを有する）。
【０１３２】
ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋細胞（滑膜線維芽細胞）を、図９に概略的に示すプロトコールを用いて螢光励起細胞選別機（ＦＡＣＳ）による選別によって精製した。平均して、このプロトコールによって選別された接着細胞の１０％が１２〜１３細胞分裂を受けることができたが、これらの２５％（または全接着ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋細胞の２．５％）だけが高度に増殖性であった（２０〜２２細胞分裂を受けることができる）。
【０１３３】
加えて、１つの滑膜組織（ＲＡ）のコラゲナーゼ消化によって遊離される細胞を、ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋集団（滑膜血管周皮細胞）を選択するために選別した。この実験では、全接着ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞の４％が高度増殖性であり、クローン原性であった（２０〜２２細胞分裂を受けることができる）。３つの単一ＭＳＣ由来クローン全てが三分化能性であった（図１０）。
【０１３４】
これらの実験は、本発明に従ったコラゲナーゼ消化によって滑膜組織から遊離された滑膜線維芽細胞と滑膜血管周皮細胞の両方の集団内に、高度にクローン原性で多能性のＭＳＣが存在したこと、およびそれらが血管周皮細胞フラクション（ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞）において数的に富化されたことを示した。さらに、これらの結果は、富化された滑膜血管周囲ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞が軟骨前駆細胞の特に良好なソースであることを示す。
【０１３５】
１つの小さな４４ｍｇ生検から入手し得る滑膜血管周皮細胞の細胞収量は、平均して４００，０００細胞であった（ｎ＝８）。この量は、小さな限局性軟骨欠損（標準自家軟骨細胞移植（ＡＣＩ）手順のために現在使用される細胞密度は１０６細胞／ｃｍ２である）の治療のために十分である。滑膜線維芽細胞または全滑膜組織消化物を使用する場合は、１つの小さな生検を使用してはるかに大きな軟骨欠損が治療できる（１０ｃｍ２まで）。滑膜組織は再生のための高い能力を有し、滑膜のいくつかの生検またはより大きな部分の収集は、ＯＡおよびＲＡで見られるような非常に大きな軟骨欠損の治療を可能にする。滑膜血管周囲細胞の高い増殖活性およびクローン形成活性は、従来のＡＣＩ標準と比較して、はるかに小さな細胞播種密度（例えば初期細胞数）を使用し得ることを示唆する。
【実施例３】
【０１３６】
ＭＳＣは膝蓋下脂肪体中に存在する
関節脂肪体中のＭＳＣ（ＬＮＧＦＲ＋免疫標識によって指示される）は、図１１および１２Ａに例示するように、滑膜中のそのような細胞のトポグラフィーに類似した血管周囲トポグラフィーを有した。
【０１３７】
膝蓋下脂肪体（予備実験ではｎ＝４であり、ｎ＝６に拡大した、全ての患者がＯＡを有した）を本発明に従ってコラゲナーゼ消化に供した。フローサイトメトリーデータは、脂肪体血管周皮細胞（ＣＤ４５ｌｏｗＬＮＧＦＲ＋細胞）が脂肪体線維芽細胞（ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋細胞）のフラクションに寄与することを確認した（図１２Ｂ）。フローサイトメトリーは、ＣＤ４５ｌｏｗＬＮＧＦＲ＋細胞の平均比率が予備実験（ｎ＝４）では２０±１２％であり、ｎ＝６のときにはさらに良好である（３７±９）ことを指示した。
【０１３８】
そのような消化物中のＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋細胞（線維芽細胞）の割合もフローサイトメトリーによって検討し、その結果は、（滑膜試験からのデータと一致して）これらの細胞が消化物のより大きな割合を構成する（６０±１２％（ｎ＝４）および５１±１７％（ｎ＝６））ことを指示した。本発明者らが分析した滑膜消化物と比較して、脂肪体における線維芽細胞の割合は同様である（それぞれ５０％対５１％）が、血管周皮細胞（ＣＤ４５ｌｏｗＬＮＧＦＲ＋細胞）の割合は２倍高かった（それぞれ３７％対１６％）。これは、細胞収率に関して、脂肪体がＭＳＣの選択のために特に有用な組織ソースであり得ることを示唆した。
【０１３９】
脂肪体消化物からＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞（血管周皮細胞）を精製するため、本発明者らは、ＭＡＣＳｅｌｅｃｔ Ａｎｔｉ−ＬＮＧＦＲマイクロビーズ（図１２Ｃ）によるマイクロビーズベースの技術を使用した。ＭＡＣＳｅｌｅｃｔ Ａｎｔｉ−ＬＮＧＦＲマイクロビーズはＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃより入手可能である。選択プロトコールは、Ｄ７−ＦＩＢマイクロビーズに関して述べたものと全く同じである（上記参照）。
【０１４０】
この磁気ソーティング手順後の細胞純度（ｎ＝４）は、直接螢光励起細胞選別機（ＦＡＣＳ）による選別によって得られるものより低かった（約６０〜７０％純度対９５％）（図２０Ｃ）。しかし、本発明者らは、これは実際の純度そのものではなく純度を評価する方法の限界によるものであると考える。これらの限界にもかかわらず、コラゲナーゼ消化物からの脂肪体由来のＣＤ４５ｌｏｗＬＮＧＦＲ＋血管周皮細胞のクローン原性は、滑膜由来のＣＤ４５ｌｏｗＬＮＧＦＲ＋細胞のものと同様であった（総接着ＣＤ４５ｌｏｗＬＮＧＦＲ＋細胞の４％）。選別した脂肪体血管周皮細胞由来のコロニーを図１２Ｃに示す。
【０１４１】
選別した脂肪体由来のＣＤ４５ｌｏｗＬＮＧＦＲ＋血管周皮細胞は、培養増幅前であってもある程度の多能性を有した。遊離／選別細胞の数が分化アッセイにおけるインビトロ試験のために十分であったので、これを評価することができた。
【０１４２】
これらのアッセイの結果を表３に示すが、表３は、
ｉ）コラゲナーゼ消化物によって生産されたＣＤ４５ｌｏｗＬＮＧＦＲ＋細胞、および
ｉｉ）コラゲナーゼ消化物によって生産されたＣＤ４５ｌｏｗＬＮＧＦＲ−細胞、
ｉｉｉ）培養下での増幅（標準方法）後の対照脂肪体由来のプラスチック接着細胞
の性質を比較する。
【０１４３】
上記（ｉｉｉ）からの細胞は、標準増幅プロトコールを用いて入手した。簡単に述べると、脂肪体を標準プロトコールに従って消化した。５×１０５〜１０６細胞を小さな２５ｃｍ２フラスコに接種し、集密に達するまで培養した。集密細胞をトリプシン処理し、さらに２つのフラスコに分けて集密まで培養した。増幅した細胞（第１継代）を、上述したように多能性を試験するために使用した。
【０１４４】
【表３】
【０１４５】
表３に見られるように、脂肪体由来のＣＤ４５ｌｏｗＬＮＧＦＲ＋細胞はＣＤ４５ｌｏｗＬＮＧＦＲ−細胞よりも軟骨形成性であった。平均して、対照培養脂肪体由来ＭＳＣは新鮮ＣＤ４５ｌｏｗＬＮＧＦＲ＋細胞よりも高い軟骨細胞を生産した（それぞれ９±７対２．４±４．４、ｎ＝６およびｎ＝４）。治療的に投与した、本発明に従って富化したＭＳＣから患者において誘導される分化細胞が、本明細書で同定される高いおよび有益な軟骨形成特性を提供することは当業者に認識される。
【０１４６】
１つの小さな３０ｍｇ生検から入手できる脂肪体血管周皮細胞の細胞収量は平均して７００，０００細胞であった（ｎ＝２）。この量は、小さな限局性軟骨欠損（標準自家軟骨細胞移植（ＡＣＩ）手順のために現在使用される細胞密度は１０６細胞／ｃｍ２である）の治療のために十分である。組織１ｇから入手し得る脂肪体血管周皮細胞の細胞収量は、平均で２３×１０６細胞であった（ｎ＝２）。全脂肪体から入手し得る脂肪体血管周皮細胞の細胞収量は、平均で５００×１０６細胞であった（ｎ＝２）。これは、ＯＡおよびＲＡで見られるような非常に大きな軟骨欠損の治療を可能にする。これは、同種環境での脂肪体の使用を可能にし、数多くの治療のために軟骨形成性フラクションを提供する。
【０１４７】
全体でこれらの結果は、関節脂肪体に存在するＣＤ４５ｌｏｗＬＮＧＦＲ＋細胞が、
ｉ）血管周囲細胞、
ｉｉ）クローン原性、および
ｉｉｉ）多能性
であることを明らかにした。
【０１４８】
これらの性質はすべて、間充織幹細胞を含むというこれらの細胞の同定と一致する。
【０１４９】
本発明の富化方法を使用して、これらの細胞を、インビトロ培養増幅への再選別を行わずに直接それらの多能性を試験するのに十分な数（１０６細胞超）で精製することが可能であった。この方法による富化のための細胞のソースである膝蓋下脂肪体の使用は、この組織の大きなサイズおよび脂肪体中に存在するＣＤ４５ｌｏｗＬＮＧＦＲ＋細胞の比較的高い割合の故に、特に好ましい。これの性質は、膝蓋下脂肪体を、本発明の最初の態様の方法を利用して未操作ＭＳＣを得るための卓越したソースにする。そのような富化細胞は組織工学適用に特に適している。
【０１５０】
要約すると、これらのデータは、
（１）初めて、新鮮選別された細胞集団を、多能性に関して増幅細胞と比較し、ＭＳＣ活性を有することが示された、
（２）ＣＤ４５ｌｏｗＬＮＧＦＲ＋細胞は、ＣＤ４５ｌｏｗＬＮＧＦＲ−細胞よりも軟骨形成性および骨形成性であった（従ってＣＤ４５ｌｏｗＬＮＧＦＲ＋は、本発明の最初の態様の工程（ｂ）における選択のための好ましい表現型であった）、および
（３）新鮮細胞の脂肪生成活性は増幅細胞と同様であり、それ故、身体の一部から簡単に脂肪を収集し、消化して、他の部分に細胞を注入／移植することができる。培養下で細胞を増幅することは、それらの脂肪生成能を改善するために必要ではない。
【図面の簡単な説明】
【０１５１】
【図１】実施例１で述べた、骨髄（ＢＭ）から分離したＭＳＣの多重パラメータフローサイトメトリーの結果を示す。
【図２Ａ】骨髄（ＢＭ）中および増幅後のＭＳＣの組織学的分析を示す。
【図２Ｂ】骨髄（ＢＭ）中および増幅後のＭＳＣの組織学的分析を示す。
【図２Ｃ】骨髄（ＢＭ）中および増幅後のＭＳＣの組織学的分析を示す。
【図２Ｄ】分離したＭＳＣによるアルカリホスファターゼの発現のフローサイトメトリー分析の結果である。
【図２Ｅ】骨髄（ＢＭ）中および増幅後のＭＳＣの組織学的分析を示す。
【図２Ｆ】実施例１で述べる、経時的なインビボおよび培養細胞によるＩＬ−７およびＩＬ−７Ｒ発現のレベルの変化を示す棒グラフである。
【図３】上下のパネルを含む。図３の上のパネルは、本発明の方法による骨髄試料の富化後に生産される高い割合のＭＳＣを指示する螢光励起細胞選別機（ＦＡＣＳ）によるデータを示す。図３の下のパネルは、本発明に従って富化されたこれらのＢＭ ＭＳＣが、ＭＳＣ表現型を有し、それらの多能性状態と一致して様々な異なる細胞系譜を生じ得ることを示すフローサイトメトリーデータおよび顕微鏡写真を提示する。
【図４】より高い骨形成能を有する骨ライニング細胞／細胞フラクションの分離のためのコラゲナーゼ消化手順の有用性をさらに示す。ＡおよびＢは、コラゲナーゼ消化工程の前（左）および後（右）のＢＭ腔の走査型電子顕微鏡（Ａ）および蛍光共焦点顕微鏡（Ｂ）画像であり、全部ではないが、大部分の骨ライニング細胞の除去を示す。（Ｂ）の右側パネルは、骨表面（カラー画像で緑色カルセイン染色で示されている）での細胞の減少（カラー画像で、左側と比較して右側ではＤＡＰＩ染色された青色細胞がより少ない）を示す。（Ｃ）は、１回目のコラゲナーゼ消化（左側）と比較して２回目のコラゲナーゼ消化（右側）におけるＣＦＵ−骨芽細胞の高い数をより濃い色として示す（骨原性前駆細胞、アリザリンレッド染色）。２回目の消化は残存骨ライニング細胞を除去し、残っている唯一の細胞は、骨自体の中に捕捉され、それ故、酵素にアクセスできない骨細胞である（Ｄ）（一部の領域での重複（ｆｕｓｓｉｎｅｓｓ）は、骨細胞が異なる平面に位置することを指示する）。
【図５】上下のパネルを含む。図５の上のパネルは、骨髄試料に由来する浮遊脂肪断片の本発明に従った富化後に驚くべき高い比率のＭＳＣが生産されることを指示する螢光励起細胞選別機（ＦＡＣＳ）によるデータを示す。図５の下のパネルは、本発明に従ってＦＦＦから富化されたこれらのＭＳＣが、ＭＳＣ表現型を有し、それらの多能性状態を維持しながら様々な異なる細胞系譜を生じさせ得ることを示すフローサイトメトリーデータおよび顕微鏡写真を提示する。
【図６】実施例２で論じるように、Ｄ７−ＦＩＢ抗体が全ての線維芽細胞を染色したのに対し、ＬＮＧＦＲは血管周囲領域内の線維芽細胞だけを染色したことを示す組織切片の写真である。
【図７】実施例２で述べる、組織試料における血管ライニングの内皮細胞と血管に関連するＭＳＣの分布を対比する組織学的切片の写真を示す。
【図８】実施例２において滑膜から富化したＭＳＣにおけるＬＮＧＦＲの発現を指示する、実施例２の代表的実験を示す。パネル（ｉ）は、死細胞／死にかけている細胞をＰＩゲーティングによって除去した痛風滑膜組織の一次消化物を示す。細胞の大部分は非造血細胞であり、小さな割合のリンパ球（２％）およびより多数の単球／マクロファージ（ＭＭ）（９％）と共に、それらのＣＤ４５／ＳＳＣプロフィールに基づいて同定された。ＭＭは、マクロファージでの発現と一致して、低いＣＤ１４を有する。パネル（ｉｉ）は、ＣＤ１３による二重標識を示し、全ての滑膜組織線維芽細胞（ＣＤ３１＋）が、もう１つの線維芽細胞マーカーであるＤ７−ＦＩＢを発現すること（Ａ）、ＣＤ３１＋細胞が、低レベルの、推定上のＭＳＣマーカー、ＣＤ１６６（ＡＬＣＡＭ）を均一に発現すること（Ｂ）、ＢＭ ＭＳＣのマーカー、ＬＮＧＦＲも滑膜組織線維芽細胞（ＣＤ１３＋）によって発現され、非常に明るい細胞からあまり明るくない細胞まで、様々な陽性度を示すこと（Ｃ）を明らかにする。（Ｄ）は対照染色である。パネル（ｉｉｉ）は、Ｄ７−ＦＩＢによる二重染色を示し、ＢＭ ＭＳＣのマーカー、ＬＮＧＦＲが滑膜組織線維芽細胞（Ｄ７−ＦＩＢ＋）で発現され、非常に明るい細胞からあまり明るくない細胞まで、様々な陽性度を示すことを明らかにする（左のパネル）。ＬＮＧＦＲは滑膜組織内皮細胞（ＣＤ３１＋）で発現されず、免疫組織化学データを確認した。
【図９】実施例２においてＭＳＣを分離するための選別戦略を示し、またこの富化戦略によって生産される細胞の形態を示す。
【図１０】実施例２で論じるように、滑膜から分離したＭＳＣおよびインビトロ培養後のＭＳＣの分化を示す、培養物および軟骨形成性ペレットを横断する組織切片の写真である。
【図１１】実施例３で論じるように、脂肪体中のＬＮＧＦＲ＋細胞が血管周囲トポグラフィーを有することを示す組織学的切片の写真である。
【図１２】実施例３で論じるように、脂肪体中のＬＮＧＦＲ＋細胞が血管周囲トポグラフィーを有することを示す組織学的切片の写真であり、さらに、脂肪体ＭＳＣについての表現型と選別戦略を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間充織幹細胞（ＭＳＣ）の富化に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＭＳＣは、多くの学術および臨床適用において使用され得る重要な細胞とみなされる。例えばＭＳＣは、細胞に基づく治療における使用のために提案され、検討されてきた。
【０００３】
ＭＳＣは、骨、軟骨および脂肪細胞系統を含む多くの細胞型に分化するように誘導され得る万能性幹細胞であるため、有用である。ＭＳＣはインビトロで分化するように誘導して、その後「成熟」細胞として使用し得るか、または未分化形態に維持して、インサイチューで分化させ得る。ＭＳＣはまた、インビトロで接着細胞単層として増殖することができる有用な特徴を有する。
【０００４】
残念ながら、ＭＳＣは現在まで学術的および臨床的に使用が制限されてきた。このことの１つの理由は、有用な数のＭＳＣを簡単に分離するのが困難であったことである。例えば骨髄はＭＳＣのソースとして公知であり、多くの研究者たちが骨髄吸引液からそのような細胞を分離することを試みてきた。しかし、少数の細胞が分離されただけであり、このことから学会では、そのような組織中には非常の少数のＭＳＣしか存在しないと考えられるに至った。臨床的に有用な数のＭＳＣを分離するためには非現実的な容量の組織が必要とされるため、これは問題である。
【０００５】
有用な数を生成する唯一の方法は、ＭＳＣを分離し、その後数を増幅するまたは「増大させる（ｂｕｌｋ−ｕｐ）」ために、インビトロで、時として数週間、それらを培養することであった。
【０００６】
しかしそのような培養工程は多くの難点を有する。
【０００７】
第一に、培養増殖は時間がかかる。これはＭＳＣの臨床的有用性を制限する。一部の場合には、幹細胞が緊急に必要とされる。例えば臨床医が、骨折した被験者に治癒を促進するために幹細胞を投与したいと考える場合、損傷から数時間以内に適切な数の幹細胞が使用可能となることが望ましい。しかし、一般通念では、臨床医が損傷した被験者の骨髄吸引液からＭＳＣを分離し、培養で個体群を増殖させ、しばらく後に幹細胞を損傷した骨に導入すべきであると命じる。しかしながら、ＭＳＣは部分的に治癒した組織ではほとんど役に立たないと考えられる。従って、多くの細胞療法は、細胞のソースが容易に入手可能ではないため、非実用的である。
【０００８】
第二に、ＭＳＣの培養は、培養細胞において「表現型ドリフト」を導き得る。このドリフトは、培養したＭＳＣが分化し始めた場合に起こり得る。この分化は予測不能であり得、しばしば望ましくない系譜をたどり得る。あるいは、人工培養条件が、細胞をインビボのままにしておいた場合に可能な表現型へと分化するのを妨げることがある。それ故、培養細胞はインビボでの細胞と同じように成長しないことがあると認識される。これはまた、臨床および科学界が培養で増殖されたＭＳＣの価値に疑問を呈することを導く。
【０００９】
第三に、培養下のＭＳＣの操作と増殖は、その後のインビボでの機能喪失に寄与し得るＭＳＣの老化を導き得る。ＭＳＣの長期間の培養増殖はまた、遺伝的不安定性と細胞形質転換を導き得る。さらに、ＦＤＡなどの規制機関は、ＭＳＣのための細胞培養増殖手順に関する場合のように、ヒトでの治療的使用のための細胞の生成において動物製品を使用することの妥当性を疑問視してきた。
【００１０】
最後に、幹細胞集団のエクスビボでの増殖を成功裏に達成することはしばしば困難である。この困難を克服するには、幹細胞増殖を促進するために血清および増殖因子などの外因性因子を使用することがしばしば必要である。そのような因子は、コストがかかり、熟達した技術者の労力を必要とする複雑な培養条件を導き得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
それ故、インビトロで増殖する必要がないＭＳＣの迅速で便利なソースを確保することが望ましいことは認識される。しかし、現在までそのような細胞の容易に入手可能なソースは存在せず、ＭＳＣのそのようなソースを提供することが本発明の１つの目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の最初の態様によれば、
（ａ）細胞と細胞外マトリックスを含む組織試料を、液体培地中で細胞外マトリックスから間充織幹細胞（ＭＳＣ）を遊離させるのに十分な量のコラゲナーゼで処理すること、および
（ｂ）ＭＳＣを含む培地のフラクションを分離すること、
を含む、間充織幹細胞（ＭＳＣ）を富化する方法が提供される。
【００１３】
工程（ｂ）は、以下で詳細に論じるような厳密な表現型判定基準を使用してＭＳＣを分離することを含む。
【００１４】
本発明の第二の態様によれば、本発明の最初の態様に従って富化された分離間充織幹細胞（ＭＳＣ）が提供される。
【００１５】
本発明の第三の態様によれば、薬剤としての使用のための、本発明の最初の態様に従って富化された分離間充織幹細胞（ＭＳＣ）が提供される。
【００１６】
本発明の第四の態様によれば、コラゲナーゼおよび場合により、細胞を維持し、増殖させるまたは分化させるための培地を含む、間充織幹細胞（ＭＳＣ）を富化するためのキットが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
「間充織幹細胞」という用語により、我々は、接着細胞単層として増殖することができ、中胚葉系統の細胞（例えば骨、軟骨、筋肉、腱、靭帯または脂肪細胞）に分化するように誘導され得る万能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）または多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞を意味する。上述した分化のための適切な合図は、可溶性因子（増殖因子など）を含む環境因子、および幹細胞またはそれらの子孫が位置する基質によって提供され得る。万能性および多能性は、それらの従来の意味を有すると解釈され、すなわち万能性細胞は、いくつかの分化した系譜を生じるように分化することができ、一方多能性細胞は、より限られた分化潜在能を有する、すなわち同じ系譜内で多様な細胞型を生じることができる、始原細胞または前駆細胞を含み得る。
【００１８】
本発明に関連して間充織幹細胞は、骨髄腔（吸引液および海綿骨の芯を含む）、滑膜または脂肪体（以下でさらに論じる）に由来する幹細胞を含み得る。例えば本発明に関連して間充織幹細胞は、これまでに処理脂肪誘引物（ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ ｌｉｐｏａｓｐｉｒａｔｅｓ）（ＬＰＡ）から分離され、骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞、脂肪細胞およびニューロン様細胞を含む系統を生じる能力を有すると同定された型の幹細胞を含み得る。
【００１９】
本発明は、本発明者らが、驚くべき数のＭＳＣが骨髄腔、滑膜および関節脂肪体からそれぞれ富化され得ることを確認した、実施例１、２および３で述べる試験に基づく。それらは、富化工程が、本発明の最初の態様に従った比較的簡単な酵素による組織消化を含み得ることを確認した。この工程は、意外にも、表現型：ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋を有するＭＳＣの集団を生成することが認められた。Ｄ７−ＦＩＢは、線維芽細胞／上皮細胞を認識するモノクローナル抗体であり（Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｎｏｖｕｓ ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓまたはＡｂｃａｍなどの供給業者から市販されている）、ＬＮＧＦＲは、低親和性神経成長因子受容体、ＣＤ２７１である（Ｂｅｃｔｏｎ ＤｉｃｋｉｎｓｏｎまたはＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃなどの供給業者から市販されている）。
【００２０】
本発明者らは、このＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞集団がクローン化可能な万能性ＭＳＣを含むことを明らかにした。このことから本発明者らは、常套的な臨床組織材料が、種々の重要な治療、診断および研究目的のために直接使用される十分な数のＭＳＣ（約１０６の高度精製細胞）のソースとして使用し得ることを認識するに至った。従来の方法によって分離された試料は、有用な数を形成するためには、上記で論じた全ての関連する難点を伴う、増幅するまたは「増大させる」必要がある少数のＭＳＣしか生じないので、これは非常に驚くべきことであると考えられた。組織試料のコラゲナーゼ処理によって生成される驚くべき数のＭＳＣは、臨床医または科学者が、インビトロ細胞培養の人工環境に曝露することを必要とせずに使用し得る有用な数の細胞を入手できることを可能にする。
【００２１】
本発明に従ってＭＳＣが富化される組織試料は、ＭＳＣを含むことが当業者に周知である多くのソースに由来し得る。これらは、骨髄、海綿骨（どちらも同じ器官、骨髄腔の不可欠な部分として認められる）およびまた、滑膜および関節脂肪体などの軟組織を含む。本発明は、ＭＳＣがそのような組織において認められると予想されるか否かという事実には関係しない。例えば、骨髄がＭＳＣを含み、そのようなＭＳＣが骨髄吸引液から非常に少数だけ分離されることは周知である。これらの細胞は、吸引液から分離して、ＭＳＣの数を学術的または臨床的に有用な数まで培養して増幅する必要がある。本発明の発明性の根拠となる工程は、組織（例えば骨髄と海綿骨の両方を含む生検試料）から前例のない数の新鮮ＭＳＣを遊離させるためにコラゲナーゼを使用し得るという事実にある。学術的および／または臨床的に有用な数の新鮮ＭＳＣが、（ｉ）比較的小さな容積の組織中に含まれること、および（ｉｉ）酵素処理によって遊離され得ることは、先行技術からは予測できなかった。実際に、本発明に従ってＭＳＣを富化しようと試みることに対しては技術的な偏見があった。これは、当業者が、細胞の収率があまりに低いので、有用な数のＭＳＣを生成するために処理する必要がある組織の容量は非現実的であると予想していたからである。この一般的な見解は、ＭＳＣが間葉系始原細胞階層の頂点に位置するまれな細胞であるという歴史的な認識に基づくが、本発明者らは、現在のＭＳＣの定義と一致する高度の可塑性が、一部のあらかじめ拘束された前駆細胞および間葉系統の血管周囲細胞（周皮細胞）を含む多くの結合組織細胞に固有であると考える。
【００２２】
本発明の方法の工程（ｂ）は、厳密な表現型判定基準を適用することによってＭＳＣの集団を選択することを含むことが最も好ましい。技術水準によれば、（１）インビボでのＭＳＣの表現型に関する十分な知識の欠如、（２）新鮮抽出されたＭＳＣは培養増殖されたＭＳＣに比べてより高い増殖潜在能を有する（従って当業者によって予想されるよりも少ない「新鮮」細胞しか必要としないと考えられる）ので、新鮮ＭＳＣは臨床的に有用であり得ることの理解の欠如、および（３）部分的にしか精製されていないが新鮮なＭＳＣ製剤（工程（ｂ）に従って分離されたフラクションは血小板、マクロファージおよび他の増殖因子産生細胞を含み得る）は、表現型的に均一な培養操作されたＭＳＣよりも臨床的に有用であり得るという認識の欠如が存在する。
【００２３】
ＭＳＣの表現型選択／同定は、標的細胞集団に関する多くのＭＳＣマーカーを同定することに基づき得る。これらのマーカーは、表１において特定されるものを含み得る。
【００２４】
【表１】
【００２５】
本発明者らは、多くのマーカーが有用であるが、一部のマーカーは本発明に従って調製された新鮮ＭＳＣを同定するために特に有用であることを認めた。従ってＤ７−ＦＢ、ＬＮＧＦＲ（すなわちＣＤ２７１）、ＣＤ１３、ＣＤ７３およびＣＤ９０は特に有用なマーカーである。新鮮ＭＳＣを同定するための最も好ましいマーカーは、表現型：ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋を有する細胞を同定する。本発明者らは、ＬＮＧＦＲ＋が本発明に従ってＭＳＣを同定するための単一の最も重要なマーカーであると考えられる。
【００２６】
上記マーカーは、本発明の工程（ｂ）に従ってＭＳＣを分離するためならびに細胞を同定するために有用であることが認識される。例えば、以下でより詳細に論じるように、ＭＳＣ表現型についての本発明者らの知識は、螢光励起細胞選別機（ＦＡＣＳ）による選別によってＭＳＣを分離するときに利用し得る。
【００２７】
組織試料は、骨髄（ＢＭ）またはＢＭと海綿骨（ＴＢ）の両方を含むコア生検であることが好ましい。これらの組織からＭＳＣを富化する方法を、以下でより詳細におよび実施例１において述べる。本発明は、ＢＭ吸引液から回収されるＭＳＣの表現型を特性決定し、ＭＳＣの低い収率（この表現型に基づく）を明らかにする本発明者らの研究に基づく。本発明者らは、ＢＭ吸引液中の全てのＭＳＣ活性がＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞の希少な集団に限定されることを確認した。従って、ＭＳＣを分離しようとするものは、ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞を選択すべきである。実施例は、本発明者らがどのようにしてこの細胞集団の発生率とクローン原性をさらに検討したかを述べる。これらの検討の間に、本発明者らは、喜ばしい驚きと共に、表現型的に純粋なＭＳＣが間質外膜細網細胞（ＡＲＣ）と共通する多くの性質を有することを見出した。ＢＭの間質ネットワークは、ＡＲＣ、内皮細胞および周囲の血管周囲細胞、脂肪細胞、マクロファージおよび骨内膜細胞から成り、後者の細胞は骨表面の内側を覆っている。ＡＲＣは、造血−支持間質機能に関与する細胞の相互結合ネットワークを形成し、脂肪細胞および骨芽細胞の前駆細胞としてのそれらの役割が示唆されてきた。本発明者らは、ＭＳＣの活性と可塑性が、全てではないにせよ多くのＡＲＣ、血管周囲細胞、前脂肪細胞および骨内膜細胞に固有であり、これらの細胞全部が同じ間葉細胞系譜に属すると仮定した。ＡＲＣとＭＳＣの類似の表現型に関する本発明者らのデータはこの仮説を裏付けた。かなり特殊な間葉系細胞（脂肪細胞または骨芽細胞など）はインビトロでトランス分化および脱分化し得るという事実が文献に記述されている。それ故、本発明者らは、同様の工程がインビボで起こり得ることおよびこれらの間葉系譜細胞の採集（これは酵素による処理によってのみ達成され得る）は高い数の高度可塑的ＭＳＣを遊離させることを示唆した。逆に、ＢＭ吸引の間、これらの間葉系細胞はインサイチューのままであり、互いにおよび周囲の細胞外マトリックスに密接に結合している（容易に吸引されるゆるく結合した造血細胞と比較して）。本発明者らは、それ故、ＢＭ吸引液においてこれまでに認められた低い数のＭＳＣは、インビボでのそれらの実際の数を全く表していないと仮定した。従って、本発明者らは、本発明の最初の態様の方法に従って組織試料をコラゲナーゼで処理することにより、かつてないほどの数のＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞（ＭＳＣ）を組織から遊離させ得ることを認めた。このことから本発明者らは、学術的および臨床的に有用な量のＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞／ＭＳＣが小さな容量の組織から迅速におよび容易に入手できることを認識するに至った。
【００２８】
ＭＳＣはまた、他の結合組織または軟組織から本発明に従って分離することができる。これらの組織は、滑膜および関節脂肪体（それぞれ実施例２および３で述べるように）を含む。
【００２９】
本発明者らは、骨髄生検試料で使用した方法が、同じ基本的表現型と類似の機能性を有する驚くべき数のＭＳＣ（すなわちＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋）を富化するためにこれらの組織に適用し得ることを明らかにした。本発明者らはまた、異なる組織中に内在するＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞は特異的な局所分化経路に規定されると考えられ、それ故、異なる適用のために有用であり得る（すなわちＢＭ ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞は骨髄修復により適しており、一方滑膜ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞は軟骨修復適用により適する）ことを認識した。本発明者らは、滑膜および脂肪体において、ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞が血管周囲細胞（すなわち組織の血管新生および新生血管形成を支えることに関与する間葉系細胞）のトポグラフィーを有することを示した。本発明者らは、これらのＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋が血管周囲細胞と同じニッチを占め、おそらく同一で、クローン原性であり、ＢＭ ＭＳＣと類似の機能性を有することを示した。それ故、本発明の方法は、滑膜および脂肪を含む固形組織中のこの特定の血管周囲ニッチからＭＳＣを富化する手段を提供する。本発明の方法は、骨髄ＭＳＣ活性の大部分の精製を可能にし、また大部分の滑膜および脂肪体のＭＳＣ活性の精製も可能にする。
【００３０】
本発明の最初の態様の方法は、胎盤および臍帯を含むがこれらに限定されない、他の組織からの血管周囲ニッチからＭＳＣを分離するために使用できる。これらの組織ソースは、神経変性適用に特に適するＭＳＣに富むと考えられる。それ故、本発明の方法に従って胎盤または臍帯から富化されたＭＳＣは、好ましくは神経変性状態の治療において使用され得る。血管周囲分布中の分離された軟組織ＭＳＣは、ＢＭ ＭＳＣと同じ表現型を有するだけでなく、ＢＭ ＭＳＣの全ての潜在能も有すると考えられ、それ故、以下で論じる全ての適用において使用できる。
【００３１】
組織試料のソースは、富化されるＭＳＣの最終的用途に依存する。
【００３２】
好ましい組織試料は骨から、特に骨髄（ＢＭ）からである。ＢＭ試料から富化されたＭＳＣは、骨修復適用のために特に有用である。ＢＭ生検材料は多くの身体部位（例えば胸骨、大腿骨、骨盤または腸骨稜）から入手し得る。ＢＭの好ましいソースは、大腿骨頭または腸骨稜である。標本はパンチ生検によって収集し得る（例えば４ｍｍパンチ生検を使用して）。あるいは、大腿骨頭を半分に切断し、酵素消化を受けるさらに一層小さな断片を得るためにＢｏｎｅ Ｍｉｌｌ（Ｄｅ Ｐｕｙまたは他の製造業者）を用いて均質化する。自己ＢＭは、患者または志願者からの腸骨稜生検より入手でき、より多数のＭＳＣが、研究目的または同種ＭＳＣ適用のために死体ドナーの何らかの海綿骨から入手できる。
【００３３】
コラゲナーゼ処理の前に、コア生検試料または小さな組織断片は、乾燥を防ぐためにＰＢＳに（リン酸緩衝食塩水）に入れてもよい。しかし、試料をＰＢＳで何度も洗浄すべきではない。これは、骨髄（ＡＲＣ）を横断するＭＳＣおよび骨に付着したＭＳＣ（骨内膜細胞）の両方が酵素抽出のために使用可能であるように、ＢＭを保存するためである。
【００３４】
好ましい実施形態では、本発明に従った富化を実施しようとする組織試料は、骨髄由来の浮遊脂肪フラクション（ＦＦＦ）を含み得る。本発明者らは、これまでＭＳＣの分離の間に廃棄されていたこのフラクションが、ＭＳＣの驚くべき豊富なソースであることを認めた。
【００３５】
単なる例として、組織試料（単一生検として採取した）０．１ｇをコラゲナーゼ溶液（例えば２０％（ｖ／ｖ）胎仔ウシ血清（ＦＣＳ）中の０．２５％コラゲナーゼ溶液である、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからの市販のコラゲナーゼ溶液（製品番号０７９０２））０．５ｍｌに入れてもよい。
【００３６】
コラゲナーゼが多くの商業的ソース（例えばＳｔｅｍｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＣＡ）から入手し得ることは認識される。多くの異なるコラゲナーゼを使用し得る。しかし、この酵素はＩ型コラーゲンを消化するために有効であることが好ましい。
【００３７】
処理する試料からＭＳＣを遊離させるのに十分なコラゲナーゼの量が必要であることは認識される。量は、使用する試料のタイプ（例えば骨生検または脂肪体からの試料）、処理する試料の量、試料が含まれている緩衝液／溶液の容量、および酵素とのインキュベーション時間を含む、多くの因子に依存する。一般的な指針として、本発明者らは、約１００〜５００単位の酵素、より好ましくは２５０〜３７５単位の酵素が、ＢＭ生検試料、滑膜または脂肪体試料０．１ｇ（０．５ｍｌ容量中、３７０℃で３〜４時間のインキュベーション時間）からＭＳＣを遊離させるために十分であることを認めた。
【００３８】
さらに１００〜５００単位の酵素、より好ましくは２５０〜３７５単位の酵素が、ＢＭ試料０．１ｇから約１０，０００〜５０，０００ＭＳＣ、より好ましくは約２５，０００〜１５０，０００ＭＳＣ（螢光励起細胞選別機（ＦＡＣＳ）によって１００％純度に精製）を遊離させるのに十分である。同様の、さらにはより低い用量の新鮮ＭＳＣが、ＯＩを有する小児においておよび骨偽関節の治療において効果を有することが知られているので、そのような重要な数のＭＳＣが遊離され得ることは意外であり、重要である。「半純粋な」ＭＳＣだけが必要とされる場合は（例えばさらなる富化工程、例えばマイクロビーズまたは螢光励起細胞選別機（ＦＡＣＳ）による選別を用いたさらなる精製を受けていないコラゲナーゼ処理試料を傾瀉した細胞フラクション）、製剤中により多くの細胞が存在することは認識される。
【００３９】
試料のインキュベーションは、コラゲナーゼ活性のために最適の温度で実施されるべきである。これは通常約３７℃である。しかし、一部のコラゲナーゼは触媒作用のためにわずかに異なる最適温度を有しおよび／または一連の温度にわたって（例えば２０℃〜４７℃）操作し得ることが認識される。
【００４０】
本発明の最初の態様の方法の好ましい実施形態では、４ｍｍパンチ生検ＢＭ試料を０．２５％コラゲナーゼ０．５ｍｌ中に入れる。酵素を３７℃で０．５〜８時間、より好ましくは３〜４時間放置して試料を消化させ得る。
【００４１】
インキュベーションの間、生検からの細胞の遊離を観測するために試料の１時間に一度の検査および「タッピング（軽くたたくこと）」を実施し得る。細胞の遊離後、コラゲナーゼ溶液は混濁し、一方ＢＭ生検自体はより白くなり（骨を露出する）、または軟組織生検は完全に溶解する。特にＢＭ生検試料に関して、２回目の別途の１時間のコラゲナーゼ処理が、骨ライニング細胞を遊離させ、それ故、最も高い潜在的骨形成能を有するＭＳＣが特に富化された細胞フラクションを得るために好ましいと考えられる。好ましいインキュベーションの終了時に、最大細胞遊離を確実にするために最後のタッピングを実施し得る。
【００４２】
コラゲナーゼ活性は、当技術分野で公知の多くの手順（例えば希釈、ろ過または遠心分離とそれに続く傾瀉）を用いて停止し得る。コラゲナーゼ活性を停止し、工程（ｂ）に従って細胞を分離する好ましい手段は、試料を２０倍以上過剰のＰＢＳ（ｖ／ｖ）または同様の緩衝液で希釈することを含む。遊離された細胞をＰＢＳと混合し、残存する細胞を生検から溶液中に強制的に放出させるために注射器／針を使用し得る。直後に、ＰＢＳ／細胞混合物を７０ミクロンの細胞ストレーナーで篩過し、その後遠心分離（１８００ｒｐｍで５分間）のためにもう１つの遠心管に移し得る。次にコラゲナーゼ／ＰＢＳ溶液を廃棄し、細胞ペレットを、細胞計数およびその後の操作（磁気および螢光励起細胞選別機（ＦＡＣＳ）による分離）に適した培地、通常は２％ＦＣＳを含むＤＭＥＭに再懸濁する。
【００４３】
コラゲナーゼ消化および細胞分離（例えば前の項で述べたような）後、本発明者らは、表現型的に純粋なＭＳＣ集団（ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞）の割合が吸引液中より１００倍以上高いことを認めた。細胞数は遊離された全細胞の５〜１０％またはそれ以上であり得る。そのような製剤は、本発明に従って臨床的に有用である。
【００４４】
本発明の一部の実施形態では、本発明者らは、工程（ａ）にさらなる酵素消化を含めることによって最適ＭＳＣ製剤が調製され得ることを確認した。それ故、さらなる酵素消化の選択は、処理される組織試料によっておよびＭＳＣの最終的用途によって決定されることが認識される。例として、本発明者らは、２回目のコラゲナーゼ処理および／またはヒアルロニダーゼ処理が骨に関して最大数のＭＳＣを遊離させるために特に有用であり得ることを認めた。２回目のコラゲナーゼ処理およびヒアルロニダーゼ処理を実施するためのプロトコールは実施例の中で述べる。組織が骨であり、ＭＳＣを骨修復のために使用するときは、工程（ａ）を、２回目のコラゲナーゼ処理および／またはヒアルロニダーゼ処理を含むように適合させることが最も好ましい。
【００４５】
本発明のある実施形態によれば、工程（ｂ）を、ＭＳＣ製剤の量を改善するために適用し得るさらなる手順工程によって補足してもよく、これらは、（１）死細胞／デブリの除去および（２）ＭＳＣのさらなる富化を含み得る。
【００４６】
細胞デブリ／死細胞の除去は多くの公知の手段によって（例えばＭｉｌｔｅｎｙｉ ＢｉｏｔｅｃからのＤｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔを使用して）達成され得る。この工程は、さらなる富化が磁気ビーズを使用して実施される予定である場合に望ましい（下記参照）。しかし本発明者らは、さらなる富化工程が螢光励起細胞選別機（ＦＡＣＳ）による選別である場合にはこの細胞デブリ／死細胞の除去は必要でないことを認めた（同じく下記参照）。
【００４７】
遊離された細胞フラクションからのその後の磁気ベースのＭＳＣ富化のために、いくつかのアプローチを使用し得る。例えば本発明者らは、抗線維芽細胞マイクロビーズ（Ｄ７−ＦＩＢ抗体と直接結合した）、ＭＡＣＳｅｌｅｃｔマイクロビーズ（ＬＮＧＦＲ抗体と直接結合した）またはＣＤ２７１−ＡＰＣマイクロビーズ（全てＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｉｓｌｅｙ，ＵＫより）による陽性選択を実施した。いずれの方法も、ＭＳＣ比率のその後の１０倍以上の増加（コラゲナーゼ消化物中の全細胞の５０〜６０％まで）を導いた。ＭＳＣの表現型についての本発明者らの知識に基づき、本発明者らは、有用であり得る他のマイクロビーズは、ＣＤ７３結合またはＣＤ１０５結合（後者はＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃより市販されている）であると考える。あるいは、ＭＳＣと明確に交差反応しない慎重に選択した抗体カクテルを利用する系統陰性枯渇法（ｌｉｎｅａｇｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ）が使用できる。それ故、マイクロビーズの使用を伴う本発明の使用は、これまで可能と思われていたよりも少なくとも１０倍大きい、治療開発のためのＭＳＣの入手可能性を導き得る。
【００４８】
螢光励起細胞選別機（ＦＡＣＳ）による選別は、本発明の方法に従って生産されたＭＳＣフラクションをさらに富化するために使用し得る。９５％以上のＭＳＣ純度が螢光励起細胞選別機（ＦＡＣＳ）による選別によって容易に達成され得る。さらに、ＰＩ、７ＡＡＤまたは他の死細胞排除染色に基づき、死細胞／デブリを除去し得る。螢光励起細胞選別機（ＦＡＣＳ）による選別は、ＭＳＣ精製を１時間以内で達成することを可能にする。
【００４９】
ＭＳＣ富化はまた、細胞上の細胞表面マーカーを認識する抗体または他の物質を利用することによって達成され得ることが認識される。表２は、ＭＳＣを分離するために使用し得る抗体の例およびそれらが認識するマーカーを示す。
【００５０】
【表２】
【００５１】
ＭＳＣを含むフラクションは直ちに使用し得る。あるいはＭＳＣは、後日の使用のために従来の冷凍手法を用いて凍結してもよい。
【００５２】
本発明の最初の態様に従って精製されたＭＳＣは、一般にＭＳＣおよび幹細胞分野における学術研究者にとって極めて有用である。
【００５３】
当業者は、本発明に従った方法、細胞およびキットがまた、様々な予後および診断試験において特に有用であることを認識する。例えば血液検査室は、骨髄線維症、骨髄腫および骨髄異形成症候群を含むが、これらに限定されない疾患における間質異常をスクリーニングするための診断試験の一部としてＭＳＣ（本発明に従って）／骨髄間質支持細胞を富化し得る。骨／整形外科／リウマチ科／内分泌科および他の臨床科が、骨粗しょう症、大理石骨病、変形性関節症および骨壊死における骨芽細胞異常をスクリーニングするための診断試験の一部としてＭＳＣ／骨芽細胞前駆細胞を富化し得る。糖尿病／肥満についての診断試験は、そのような疾患における脂肪細胞発生の異常をスクリーニングするための診断試験の一部として、本発明に従って富化されたＭＳＣ／脂肪細胞前駆細胞／前脂肪細胞を利用し得る。さらに、「加齢」に関する診断および予後試験は、移植前の自家治療のための潜在能をスクリーニングする／予測するための診断試験の一部として本発明に従って富化されたＭＳＣを使用し得る。
【００５４】
本発明の方法は、骨髄微小環境の生物学を明らかにする科学者にとって特に有用である。本発明の方法は、彼らの生物学を健康状態および疾患においてエクスビボで検討することを可能にする多数の間質支持細胞を精製する方法を提供する。骨髄間質細胞／ＭＳＣは培養増幅後にかなりの変化を受け、現在のＤｅｘｔｅｒ型間質細胞培養をインビボ生物学のための信頼できない代用法にする。本発明は、正常骨髄、骨髄異形成性骨髄および悪性骨髄において骨髄微小環境をよりよく理解することを可能にする。骨髄間質をエクスビボで検討できることは、数多くの原発性骨髄疾患、例えば多発性骨髄腫および転移性骨髄疾患の増殖因子、ケモカインおよびサイトカインの支持を定義するために重要な意味を有し得る。これは、骨髄疾患のための多数の新しい治療法を導き得る。同様に、健康状態および疾患における骨髄微小環境を理解するための潜在的可能性は、骨粗しょう症を含む骨関連疾患の治療のための新しい治療法の開発にとって意味を有し得る。
【００５５】
本発明の方法は、細胞治療手法において使用し得る本発明の第三の態様に従った薬剤を生産するために使用し得る。細胞療法は、自己および同種ＭＳＣの両方を利用することができる。
【００５６】
本発明の第三の態様に従った薬剤は、本発明の最初の態様の方法に従って分離された細胞と生理的に許容される緩衝液またはスカフォールドを含むべきである。緩衝液は、ＭＳＣを生存可能状態に維持し、同時に治療される被験者への投与のために安全である無菌細胞培養培地（および好ましくは血清等の添加を必要としない規定培地）を含み得る。スカフォールドは、ＭＳＣの付着と分化を支持し、同時に治療される被験者への投与のために安全である無菌生体適合性材料を含み得る。
【００５７】
本発明の最初の態様に従って提供されるＭＳＣは、自己細胞療法が必要とされるとき特に有用である。本発明の最初の態様の方法は、臨床医が被験者から組織の試料を入手し、臨床的に有用な数のＭＳＣを遊離させるために組織をコラゲナーゼで処理して、その後治療される被験者に細胞を再導入することを可能にする。本発明の方法は、臨床医が、組織試料を採取した被験者にＭＳＣを迅速に再導入することを可能にする。例えば細胞は、試料の採取から数日以内に、採取と同日に、または臨床および支援スタッフの慎重な連携の下で数時間以内に（例えば３時間以内に）再導入され得る。これは、被験者を処置室または手術室から移動させる必要なしに組織試料を採取し、富化されたＭＳＣを再導入し得ることを意味し得る。これは、ＭＳＣを採集すること、数を増大させるためにＭＳＣを培養すること、およびその後被験者に細胞を再導入すること（通常は少なくとも数週間後に）を含む先行技術の手法に比べて重要な改善である。これは本発明の特に重要な特徴で表す。それ故、本発明の第五の態様によれば、
（ａ）被験者からＭＳＣと細胞外マトリックスを含む組織試料を得ること、
（ｂ）前記組織試料を、液体培地中で細胞外マトリックスからＭＳＣを遊離させるのに十分な量のコラゲナーゼで処理すること、
（ｃ）ＭＳＣを含む培地のフラクションを分離すること、および
（ｄ）前記被験者が細胞療法から利益を得ることを可能にする身体部位で前記フラクションを前記被験者に再導入すること、
を含む、そのような治療を必要とする被験者に細胞療法を実施する方法が提供される。
【００５８】
本発明者らは、ＭＳＣが、治療上適切な量で同じ被験者に再導入するために十分な、驚くべき数で被験者から分離され得ることを認めた。
【００５９】
ＭＳＣは、本発明の最初の態様の方法を用いることにより、本発明の第五の態様に従って富化され得ること（例えば骨髄／海綿骨から）が好ましい。
【００６０】
フラクションは、試料を入手してから２４時間以内に、好ましくは１２時間以内に、好ましくは３〜４時間以内に再導入されることが好ましい。
【００６１】
本発明の第五の態様の方法に従って使用される細胞は、前記ＭＳＣを凍結する必要がないように使用されることが好ましい。
【００６２】
本発明者らは、本発明が、以下を含むが、これらに限定されない多くの自己細胞療法レジメンに適用できることを確認した：
（１）骨修復（外傷性骨折、分節性骨欠損、頭蓋顔面再建、上顎洞底挙上術適応症、脊椎固定適応症、骨腫瘍／嚢胞適応症）
（２）軟骨修復（外傷性損傷、変形性関節症）
（３）骨格筋修復（デュシェーヌ筋ジストロフィーその他）
（４）腱修復（運動選手における外傷性損傷）
（５）靭帯修復（運動選手における外傷性損傷）
（６）半月修復（運動選手における外傷性損傷）
（７）心筋修復（心筋梗塞後および心筋症後）
（８）脊髄損傷、パーキンソン病および他の神経変性疾患
（９）免疫媒介性組織拒絶反応、移植片対宿主病および慢性関節リウマチ（免疫調節細胞療法として）
（１０）脂肪物質の再生（例えば中足骨に関連する脂肪体の再建等、または乳房に関連する脂肪組織の再生、例えば手術または事故後の乳房のリモデリングにおいて）
（１１）ＭＳＣは内皮細胞に分化し得る。従って本発明の方法は、内皮を形成することができる非常に多くの細胞が治療において必要とされ得る血管手術または虚血性血管病変のために有用である
（１２）骨粗しょう症。
【００６３】
本発明に従って調製したＭＳＣが骨修復（上記（１））において利用されることは、本発明の特に好ましい実施形態である。年間１００万例以上の整形外科手術が、置換手術、外傷、癌、変形性関節症、骨粗しょう症、先天異常または骨格欠損の結果としての骨修復を含む。大きな骨欠損の再構築は依然として骨移植を必要とするが、これは、ドナー部位の損傷、疼痛および感染や病原体伝播の潜在的危険性を含む、多くの難点を有する。骨粗しょう症では、股関節全置換手術が、転位型股関節骨折のために現在使用可能な唯一の治療である。新たな骨折の危険度を低下させる骨同化促進薬（テリパラチドおよびラネリン酸ストロンチウムなど）における新しい進歩を以ってしても、骨粗しょう症性股関節骨折の世界的な発生率は、母集団が高齢化すると共に今後５０年間に少なくとも３倍上昇すると予想される。これらの骨折を修復し、一般的に骨を治癒する新しい方法を見出すことは保健医療の緊急優先課題である。これに関して、ＭＳＣによる細胞療法は新しい解決法を提供する。
【００６４】
ＭＳＣは、胚幹細胞に関連する倫理的な問題がない成体幹細胞であり、インビボで骨を形成することが知られている。従って、ＭＳＣで（場合により骨伝導的スカフォールドおよび骨誘導的増殖因子と共に）工作される骨組織は、外傷および再建手術における骨同種移植片および自己移植片に代わる代替的戦略である。骨折治療に関して、骨癒合の割合および修復された骨の質の劇的な改善がＭＳＣの局所送達によって達成された。ＭＳＣ細胞療法はまた、骨形成不全症（ＯＩ）の非常に有用な治療である。
【００６５】
現在までこれらの公知の治療は、臨床的に有用な数を生成するために培養でのＭＳＣの増幅に基づいてきた。ＭＳＣの培養増幅はほとんど無限の細胞供給を生じるが、製造プロセスは長く、コストがかかる。これは、一般の人々（例えばイギリスにおけるＮＨＳなどの政府が資金援助する保健医療）にとってこれらの製品へのアクセスを排除するかまたはアクセスを厳密に制限する。高いコストに加えて、増幅ＭＳＣ培養は、細胞形質転換の潜在的可能性、突然変異の蓄積、細胞老化および多能性の喪失などの深刻な生物学的問題に結びつく。最後に、重要な規制上の問題が、増幅ＭＳＣの純度および骨形成「能」の評価に関してまだ存在する。例えばＣＤ７３、ＣＤ１０５および培養したＭＳＣの他の「古典的」マーカーは、現在、多能性細胞（皮膚および他のタイプの線維芽細胞で発現される）に特異的ではないことが証明されている。それ故、新しいコスト効果的でよりよく特徴付けられたＭＳＣ製品についてのニッチが存在する。
【００６６】
本発明の最初の態様の方法に従って調製されるＭＳＣはこのニッチを埋めることが認識される。本発明者らは、驚くべきことに、新鮮ＭＳＣが組織試料から臨床的に有用な数で分離され得ることを見出した。増幅ＭＳＣと異なり、新鮮分離したＭＳＣの明らかな利点は、この細胞製品が入手できる速度である。本発明の最初の態様の方法によれば、小さな海綿骨生検試料は、５時間の分離手順後に約５×１０５の純粋ＭＳＣ（ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞）を生じ得る。新鮮分離ＭＳＣの２番目の利点は、高い純度を示すそれらの完全な表現型特徴付けられたのである。３番目の利点は、骨形成についてのそれらのより高い潜在能である。
【００６７】
本発明のさらなる好ましい実施形態では、本発明に従って調製したＭＳＣは、軟骨修復において（上記（２））、特に変形性関節症（ＯＡ）を治療するために使用される。ＯＡは、関節器官不全を伴う関節破壊によって特徴づけられる疾患である。関節軟骨の喪失は、患者の小群における鍵となる主要事象であると考えられる。低分子による治療的介入処置が軟骨再生における役割は実証されていない。細胞療法を利用する軟骨修復のための現在のゴールドスタンダードは、自己軟骨細胞移植（ＡＣＩ）手順である。しかし、従来のＡＣＩは、最初の軟骨採集の時点から治療までを完了するのに数ヶ月を要し得る。これは非常に費用のかかる手順であり、その結果として使用可能性は限定されている。さらに、軟骨からの細胞は加齢と共に増殖と分化が低下し、高齢被験者でのＡＣＩ手順の成功が少ないことに寄与するので、この手順はより若い被験者にしか適さない。またこの手順は、最初に軟骨から生検を採取することを含むので、潜在的に有害である。それにもかかわらず、ＡＣＩ手順はすべての他の細胞療法を判断する基準である。最近、細胞移植を助けるためのマトリックスの使用を含むＡＣＩ関連の開発が為されたが、これらは手順のより広い制限を回避しなかった。多くの骨誘導マトリックス、増殖因子および細胞製品が既に市販されている骨再生と比較すると、軟骨修復については状況がかなり困難である。
【００６８】
それ故、関節軟骨に分化する可能性を有するＭＳＣは、ＡＣＩ手順を想起させる手法でのＯＡの治療開発のための細胞の潜在的ソースとみなし得ることが認識される。しかし、認識されているＭＳＣの希少性は、これらの細胞が、付随する感染の危険性、胎仔ウシ血清への曝露、細胞老化、効力の喪失、費用および／またはコストを伴う長期にわたる培養増幅手順を通過しなければならないことを意味する。本発明の方法は、臨床医が多数の幹細胞を迅速に入手し、速やかにこれらをＯＡ関節軟骨欠損患者に戻すことを可能にする。これは、ＯＡの治療における重大な進歩を表す。多数のＭＳＣを迅速に分離できることは、軟骨欠損がＯＡの評価のための磁気共鳴画像法の広く行き渡った使用と共にますます認識されつつあることを考慮すると、現在の状況では特に重要である。
【００６９】
本発明のさらに一層好ましい実施形態では、本発明に従って調製したＭＳＣは、骨粗しょう症の治療において利用される。本発明者らは、骨前駆細胞を含むＭＳＣ（本発明に従って調製した）の生物学および表現型が培養増幅されたＭＳＣとかなり異なることに注目した。培養増幅されたＭＳＣは、人における骨前駆細胞機能の評価のためのゴールドスタンダードを形成してきた。ＭＳＣ／骨前駆細胞の大規模精製を実施できることは、骨粗しょう症の治療経路発見のために新しい道を切り開き得る。
【００７０】
本発明のさらなる実施形態によれば、本発明者らは、ＭＳＣがまた、本発明に従って外来性ソースから分離でき、その後幹細胞療法によって治療され得る医学的状態（例えば骨折またはＯＡ）に罹患している被験者での細胞療法において利用され得ることを確認した。同種ＭＳＣは、股関節、椎骨および胸骨髄を含む様々な部位から死体ドナーより、血縁者／子孫、またはマッチする無関係なドナーから富化し得る。それ故、本発明の６番の態様によれば、
（ａ）死体またはドナーからＭＳＣと細胞外マトリックスを含む組織試料を得ること、
（ｂ）前記組織試料を、液体培地中で細胞外マトリックスからＭＳＣを遊離させるのに十分な量のコラゲナーゼで処理すること、
（ｃ）ＭＳＣを含む培地のフラクションを分離すること、および
（ｄ）被験者が細胞療法から利益を得ることを可能にする身体部位で前記フラクションを前記被験者に導入すること
を含む、そのような治療を必要とする被験者に細胞療法を実施する方法が提供される。
【００７１】
死体またはドナーは被験者と同じ種であることが認識される。被験者はヒトであることが最も好ましい。しかし、本発明者らは、ＬＮＧＦＲマーカーが多くの他の動物（例えばウシ、ウマ、ヤギおよびヒツジ）において保存されていることに注目した。それ故、同じ手順が動物（例えばイヌおよび特にウマなどの愛玩動物）において骨または軟骨修復のための細胞を入手するために使用できることが認識される。
【００７２】
富化されたＭＳＣの同種ソースは、本発明の第五の態様に関して列挙したものと同じ治療レジメン（１〜１２）において使用し得る。
【００７３】
本発明の方法に従ってＭＳＣが富化される組織は、細胞のその後の分化に関して達成されるべき所望治療特性に準拠して選択され得る。例えば本発明者らは、滑膜組織から富化されたＭＳＣが著明な軟骨形成特性を有する細胞を生じることを見出し、従って軟骨の生成を治療的に促進することが望ましい状況では、ＭＳＣを滑膜から富化することが好ましいと考えられる。
【００７４】
同様に、本発明者らは、膝蓋下脂肪体から富化されたＭＳＣが一貫して高い脂肪生成特性を有する細胞を生じることを認め、従って脂肪組織の生成を治療的に促進することが望ましい状況では、ＭＳＣを脂肪体から富化することが好ましいと考えられる。
【００７５】
本発明の第六の態様に従って富化されたＭＳＣはまた、同種ＭＳＣが、治療される被験者における遺伝的欠陥を矯正する遺伝子型を有する状況下での遺伝子治療において適用され得る。そのような細胞で治療される状態は以下を含む。
【００７６】
（ａ）骨形成不全症およびまれな軟骨形成不全症および筋肉の遺伝的疾患を含むが、これらに限定されない、骨および軟骨機能の喪失に関連する先天異常
（ｂ）骨髄腫および骨髄異形成症候群その他を含む、間質機能の喪失に関連する血液学的異常。
【００７７】
本発明のさらなる実施形態によれば、本発明の第五および第六の態様の治療レジメンは、工程（ｃ）で分離されたフラクションが、被験者に導入される（または再導入される）前に富化されたＭＳＣを遺伝的に修飾して処理されるように適合させ得る。
【００７８】
被験者からのＭＳＣ（すなわち自己ＭＳＣ）は、遺伝的に修飾されて被験者に再導入されることが好ましい。しかし、一部の臨床状況は、死体またはドナーソースからのＭＳＣが必要とされることを決定付け得ることが認識される。実際に、そのようなＭＳＣ（死体またはドナーソースからの）は所望遺伝子型を含み得る。細胞は、それ故、１つの遺伝的異常（上記で考慮されるような）を矯正するために被験者に導入され得、治療される被験者においてさらなる遺伝的影響を及ぼすために遺伝的修飾を施され得る。従って、本発明に従って富化された細胞は、遺伝的成分を有する多くの状態の治療において使用でき、これらは、上記（１）〜（９）および特に（１０）および（１１）で考慮されるものを含む。
【００７９】
本発明の第四の態様に従ったキットは、上記で論じた何らかのコラゲナーゼを含み得る。コラゲナーゼはＩ型コラーゲンを消化することが好ましい。コラゲナーゼはヒストリチクス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）（例えばＳｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｇｉｅｓ Ｉｎｃ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＣＡによって供給されるような）に由来し得る。
【００８０】
キットは、場合により、コラゲナーゼのための適切な希釈剤および緩衝液（例えばリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、場合により最終濃度２０％の胎仔ウシ血清を含む）および試料（これも、好ましくは２％胎仔牛血清を含む、ＰＢＳであるか、またはＤＭＥＭなどの生理的に許容される緩衝液であり得る）を含み得る。
【００８１】
工程（ｂ）がＭＳＣのさらなる精製を含む予定であるとき、キットは、これを実施するための試薬をさらに含むことが好ましい。従ってキットは、ＭＳＣの磁気ビーズ分離に適する試薬および装置を含み得る。従ってキットは、本明細書で論じるようにＭＡＣＳカラム、マイクロビーズ、ＭＡＣＳ緩衝液（０．１％ウシ血清アルブミンを含む）を含み得る。あるいはキットは、遊離されたＭＳＣのさらなる精製のための螢光励起細胞選別機（ＦＡＣＳ）試薬（例えば表２に列挙する抗体および緩衝液（例えばＰＢＳ））を含み得る。
【００８２】
本発明を、実施例によっておよび以下の図面を参照してさらに説明する。
【実施例１】
【００８３】
骨髄試料からの間充織幹細胞の富化
１．１ 実験材料および方法
１．１．１ 試料の収集
（ｉ）ＢＭ吸引液（２〜１０ｍｌ）を正常ドナーの後腸骨稜から得た。Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｎｙｃｏｍｅｄ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）による分離後にＢＭ単核細胞（ＭＮＣ）を収集した。浮遊脂肪フラクション（ＦＦＦ）に集中する細胞凝集物を手動で攪拌によって分散させ、遠心分離した。単房性脂肪細胞は上部に浮遊したままであったが、間質細胞はペレットに集中した。
【００８４】
（ｉｉ）ＢＭ生検材料を、同意を得た変形性関節症（ＯＡ）を有する患者の股関節形成術の間に除去された大腿骨頭から得た。大腿骨頭は外科医によって半分に切断され、ＰＢＳの入った無菌容器中で検査室に送達された。４ｍｍパンチ生検を用いて標本を収集した。あるいは、Ｂｏｎｅ Ｍｉｌｌ（Ｄｅ Ｐｕｙまたは他の製造業者）を用いて大腿骨頭を均質化し、酵素消化を受けるさらに一層小さな断片を得た。
【００８５】
１．１．２ コラゲナーゼ消化
パンチ生検試料０．１ｇを０．２５％コラゲナーゼ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）０．２５ｍｌで３〜４時間消化した。これは、酵素約２５０〜３７５単位に相当した。本発明者らは、これが細胞の回収率および生存度のために最適であることを見出した。
【００８６】
１．１．３ ＭＳＣフラクションの取扱い
好ましいインキュベーション時間の終了時に、コラゲナーゼ溶液を２０倍以上過剰のＰＢＳ（ｖ／ｖ）で希釈し、注射器／針を使用して放出された細胞をＰＢＳと混合し、残存する細胞を生検から溶液中に強制的に放出させた。直後に、ＰＢＳ／細胞混合物を７０ミクロンの細胞ストレーナーで篩過し、遠心分離（１８００ｒｐｍで５分間）のためにもう１つの遠心管に移した。次にコラゲナーゼ／ＰＢＳ溶液を廃棄し、細胞ペレットを、細胞計数およびその後の操作（磁気および螢光励起細胞選別機（ＦＡＣＳ）による分離）に適した培地、通常は２％ＦＣＳを含むＤＭＥＭに再懸濁した。
【００８７】
一部の試料から、ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞を、以前に述べられているように（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ２００２：４６：３３４９−６０）、フローサイトメトリーのために処理し、精製し、増幅し、分化させた。
【００８８】
１．２ 結果
１．２．１ 骨髄（ＢＭ）吸引液中のまれな間充織幹細胞（ＭＳＣ）がＤ７−ＦＩＢ＋ＣＤ４５ｌｏｗＬＮＧＦＲ＋表現型を有することの確認
本発明者らは、ＢＭ吸引液において全てのＭＳＣ活性がＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞の希少集団に限定されることを確認した。本発明者らはさらに、この集団の発生率とクローン原性を検討した。同じドナーに関して、４色サイトメトリーによって測定した、ＢＭ（単核細胞）ＭＮＣフラクション中のＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞の平均発生率は０．０３９±０．０３７％であり（図１、上）、同じ試料中で生じるＣＦＵ−Ｆの平均発生率０．００７±０．００６％（ｎ＝３０）に匹敵する大きさであった。
【００８９】
さらに、本発明者らは、これのまれな細胞集団の発生率が、Ｄ７−ＦＩＢマイクロビーズによる前富化後に約１００倍上昇する（７±６％まで、ｎ＝３８）ことを見出した（図１、中央のパネル）。この前富化工程は、Ｄ７−ＦＩＢに直接結合したマイクロビーズ（Ａｎｔｉ−Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）による正の選択（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）である。簡単に述べると、１０８ＢＭ ＭＮＣをマイクロビーズ１００μｌと共に室温で１５分間インキュベートし、その後１８００ｒｐｍ×５分間洗浄して非結合マイクロビーズを除去する。次に細胞をＭｉｎｉＭａｃｓカラム（磁石内に置いた）に適用し、非結合フラクションをＭＡＣＳ緩衝液（０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ）６ｍｌ中に収集する。その後、カラムを磁石から取り出し、結合フラクション（ＭＳＣを含む）をＭＡＣＳ緩衝液０．５〜１ｍｌ中に遊離させる。これがＭＡＣＳ分離の標準プロトコールである。
【００９０】
ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋集団を選択するための螢光励起細胞選別機（ＦＡＣＳ）による選別後、ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞集団の純度は９５％超に上昇した（図１、下のパネル）。この富化された集団について、標準ＣＦＵ−Ｆアッセイ（Ｃａｓｔｒｏ−Ｍａｌａｓｐｉｎａ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｂｌｏｏｄ ５６ ｐ２８９−３０１）において６細胞のうち１個（１７±４％、ｎ＝６）が３０以上の細胞の定義されたコロニーを形成した。
【００９１】
マッチするＣＤ４５＋細胞からはコロニーが成長しなかった。これらのデータは、ＢＭ吸引液中の全てのクローン原性ＭＳＣがまれなＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋集団内に含まれることを確認した。
【００９２】
１．２．２ インビボでのＢＭ ＭＳＣの間質特徴
本発明者らは、ＢＭ吸引液から精製したＭＳＣが、ＢＭ外膜細網細胞（ＡＲＣ）を想起させる間質形態（数多くの突起を有する星形）を示すこと、および小さな脂肪滴がそれらの細胞質に見出されることに注目した（図２Ａ）。ＢＭ生検に関して、ＡＲＣ形態を有する細胞は、インビボＭＳＣで発現されたＣＤ１０マーカーに関して陽性であった（図２Ｂ）。さらに、精製したインビボＢＭ ＭＳＣは、ＡＲＣの主要特徴である、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）に関して均一に陽性であった（図２Ｃ）。ＡＬＰに対する抗体（ＡＬＰ骨／肝アイソフォームに対する、Ｂ４−７８クローン）での染色は、全てのインビボＭＳＣでの均一な発現を明らかにした（図２Ｄ）。ＡＬＰ発現は、ＭＳＣの培養増幅後徐々に消失した（図２Ｅ）。リンパ球産生の間質支持のために非常に重要であり、ＡＲＣによって産生されることが公知のサイトカイン、ＩＬ−７の発現も、増幅後に低下した（図２Ｆ）。培養した皮膚線維芽細胞はＡＬＰについて常に陰性であり、極わずかなＩＬ−７を発現した（図２ＥおよびＦ）。
【００９３】
本発明者らは、これらのデータを合わせて考慮したとき、インビボでのＢＭ ＭＳＣはＡＲＣと一致する多くの特徴を有し、これらの特徴がインビトロ培養後に失われることを認識して驚いた。これは２つのことを示唆した。第一に、ＭＳＣの培養は表現型の変化を導くので、望ましくないと考えられる。第二に、当業者はインビボでのＭＳＣがＡＲＣ様の性質を有することを認識していない。ＡＲＣは細胞の相互結合ネットワークを形成し、酵素処理によって遊離され得る。従って本発明者らは、酵素消化を用いてＭＳＣを分離することも可能であることを認識した。本発明者らは、ＭＳＣ活性が、ＡＲＣおよびおそらく骨ライニング細胞、血管周囲細胞および前脂肪細胞などの他のこれまで見過ごされてきた細胞に存すると考える。これらは全て吸引することが不可能であり、それが、酵素消化が必要とされる理由である。
【００９４】
１．２．３ ＢＭ間質細胞凝集物からのインビボＭＳＣの酵素による遊離
ＭＳＣがＡＲＣ様の性質を有し得ることが認識されたので、本発明者らは、組織の酵素消化がＭＳＣを遊離するかどうかを検討した。本発明者らは、この着想を、変形性関節症（ＯＡ）を有する患者の股関節形成術の間に除去された大腿骨頭から得た材料で試験した。
【００９５】
ＭＳＣは、ＢＭ吸引液からの単一細胞懸濁液中の非常にまれな集団である。１０８の吸引ＢＭ ＭＮＣからの高度に純粋なＭＳＣ（ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋）の平均細胞収量は、吸引骨髄１ミリリットル当たり約２，０００ＭＳＣに等しい、１１，０００細胞（４，０００〜６３，０００の範囲、ｎ＝１４）であった。この収率は臨床的に有用であるためにはあまりに低く、有用な数の細胞を生成するためにインビトロでの増幅を必要とする。さらに、上記で指摘したように、本発明者らは、増幅工程がＭＳＣ表現型の変化を導き得ると考えられる。
【００９６】
インビボでのＢＭ ＭＳＣがＡＲＣ細胞と同じ特徴の多くを共有することが認識されたので、本発明者らは次に、１．１で述べた方法（ＡＲＣ／マトリックスネットワークを解体することができる方法に基づく）を用いた酵素による抽出の方法が、従来の骨髄吸引液ソースと異なって、固体組織生検から高い数のＭＳＣを遊離させるのに適するかどうかを試験した。
【００９７】
３時間、または３〜４時間の、生検のコラゲナーゼ処理はＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞を遊離させ、それらの細胞は、吸引液から精製されたＭＳＣと形態および表現型的に類似するが、驚くべきことに、生検試料から遊離された集団におけるそれらの細胞の割合は、吸引液中で認められるレベルよりも約１００倍高かった（ＢＭ吸引液中での０．０３９±０．０３７％生細胞、ｎ＝３０に対し、５±３％生細胞、ｎ＝８）。この上昇は、図３の上のパネルに示す螢光励起細胞選別機（ＦＡＣＳ）による結果において指示されている。
【００９８】
さらに、本発明者らは意外にも、疾患微小環境が起源であるにもかかわらず、本発明の最初の態様の方法に従って消化生検から精製されたＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞は、軟骨形成のレベルは低下していたが（正常ＢＭ対照によって生産された３±２μｇに比べて硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）／ペレットの１±１μｇ、ｎ＝４）、増殖および分化に関して正常なＭＳＣ機能を保持することを認めた。この所見は、ＯＡ患者のＢＭに由来するＭＳＣの公知の特徴と一致した。正常個人からの海綿骨生検を使用したときは、正常レベルのＭＳＣ軟骨形成が得られた（データは示していない）。
【００９９】
この試験の結果は図３の下のパネルに示され、本発明の最初の態様の方法に従って富化したＭＳＣの顕微鏡写真と螢光励起細胞選別機（ＦＡＣＳ）による分析を例示する。このパネルの左側の図に示す螢光励起細胞選別機（ＦＡＣＳ）による結果は、ＭＳＣの性質を例証するマーカーの、ゲートＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞（すなわち新鮮ＭＳＣ）での発現を示す。このパネルの右側の図に示す顕微鏡写真は、コラゲナーゼ消化によって得たＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞が３つの間葉系統に分化できることを示す。
【０１００】
消化生検から選別された高度富化ＭＳＣ（ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋）の収量は、吸引液から通常得られる収量よりも平均で５０倍（一部の場合には１００倍超）高かった（１０８の吸引ＢＭ ＭＮＣからの１１，０００細胞、４，０００〜６３，０００の範囲、ｎ＝１４に比べて、１０８総細胞当たり約５５０，０００細胞、８０，０００〜８００，０００の範囲、ｎ＝６）。平均で、０．１ｇ生検は、約２５，０００ＣＦＵ−Ｆに等しい、約１５０，０００ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＥＲ＋細胞を生じた（ｎ＝７）。遊離された細胞フラクション中のＣＦＵ−Ｆの割合はＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞の発生率と直接相関した（Ｒ＝０．８９、ｎ＝７）。それ故、本発明者らは、単一の０．１ｃｍ３（０．１ｇ重量）生検から約１０，０００ＭＳＣまたは２５，０００または１５０，０００ＭＳＣを得ることができた。本発明者らは、この収量が本方法によって誘導されるＭＳＣの直接臨床使用を可能にするのに十分なほど高いことを認識して驚いた。これらの収量は、ＢＭ吸引液１５０〜３５０ミリリットルを使用するのに等しい。
【０１０１】
実際に、本発明者らは、本発明の最初の態様の方法に従ったコラゲナーゼ消化によって遊離されるＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞の発生率（２〜９％、ｎ＝８）が非常に高いので、それらの検出、分離または治療としての使用を可能にするためにマイクロビーズによる前富化がもはや必要ではないことを見出した。他方で、従来のＢＭ吸引液からの同じＭＳＣ用量を同じ目的に使用する場合（すなわち１５０〜３５０ミリリットル）、同様のレベルの純度を確保するためにＭＳＣをかなり濃縮しなければならない。本発明は、臨床医が複雑で時間のかかる富化工程または培養での増幅を必要とせずに試料から採取したＭＳＣを迅速に利用することを可能にするので、これは本発明者らの方法がいかに有利であるかを例示する。さらに、本発明者らは、１名の患者からの１つの大腿骨頭が、本発明の方法に従って処理され、ＢＭ吸引液を使用した場合には不可能である多数の治療のために十分なＭＳＣを提供できることを立証した。
【０１０２】
１．２．３ コラゲナーゼによる二重消化を用いた高度骨形成性ＭＳＣの酵素による遊離
骨修復適用のためには、卓越した骨形成能力を有するＭＳＣの使用が望ましい。ＭＳＣ活性が骨ライニング細胞に存在し得ることが認識されたので、本発明者らは、１．１で述べた３〜４時間のコラゲナーゼ消化工程に加えて、付加的な酵素による抽出の方法が、高い骨形成能力を有するＭＳＣを遊離させるのに適することを示すことができた。図４ＡおよびＢに認められるように、本発明者らは、１．１で述べた方法を用いるコラゲナーゼ消化工程が、大部分の骨ライニング細胞を除去するが、全部ではない（平均で全ＤＮＡの約２％が骨に残る、ｎ＝３）ことを明らかにすることができた。２回目の１時間のコラゲナーゼ消化工程を１回目の消化物の収集後の生検断片で実施したとき、骨に残された細胞の割合は５倍近く低下し、回収された細胞の総収量が平均５％上昇した（ｎ＝３）。２回目の消化物のクローン原性は１回目の消化物と同様であったが（それぞれ、１２ＣＦＵ−Ｆ／５，０００遊離細胞に比べて１３ＣＦＵ−Ｆ／５，０００遊離細胞、ｎ＝３）、その骨形成能はしばしば２倍高かった（それぞれ、９０μｇ Ｃａ＋＋／５，０００遊離細胞に比べて１７０μｇ Ｃａ＋＋／５，０００遊離細胞）（図４Ｃ）。本発明者らはまた、２回目のコラゲナーゼ消化工程が、ＰＢＳ中で５０Ｕ／ｍｌの最終濃度に希釈したヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）の０．５ｍｌ溶液での１時間の処理に置き換え得ることを明らかにすることができた。コラゲナーゼ消化と同様に、ヒアルロニダーゼでの処理は、細胞振とう機にて３７℃で実施する。この処理も、遊離される総細胞の追加の５％に寄与する骨ライニング細胞を遊離させた（ｎ＝３）。コラゲナーゼまたはヒアルロニダーゼを用いて得られた、２回目の消化物中のＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞のＭＳＣマーカー表現型は、１回目の消化物のものと同様であった（ＣＤ７３＋＋＋ＣＤ１０５＋ＣＤ９０＋＋＋ＣＤ１４６＋＋、ｎ＝２）。この二重消化手順後、インサイチューで残存する唯一の残留細胞は骨の内部に位置した（骨細胞）（図４Ｄ）。
【０１０３】
それ故、骨修復適用のために骨試料を処理する好ましい方法は、２回目のコラゲナーゼ処理または代替的に、上述したようなヒアルロニダーゼ処理を実施することである。
【０１０４】
１．２．３ 浮遊脂肪凝集物からのインビボＭＳＣの酵素による遊離
正常ＢＭは浮遊脂肪フラクション（ＦＦＦ）と称される浮揚性の脂肪滴を含み、これは、ＭＳＣ富化の準備としてＢＭ ＭＮＣの調製の間に密度勾配遠心分離によって廃棄される。ＦＦＦは、高齢者（骨髄が徐々に脂肪性になるので）または一部の疾患（慢性関節リウマチまたは骨粗しょう症など）を有する人々において増加する。
【０１０５】
本発明者らは、意外にも、本発明の方法がＭＳＣ収率を高めるために吸引液に適用できることを見出した。これはＦＦＦの収集を必要とする。次にそれを、成熟脂肪細胞から間質細胞／ＡＲＣ／ＭＳＣを分離するために本発明に従ってコラゲナーゼ処理する。
【０１０６】
本発明者らは、従来の先行技術の手法を用いて正常ＢＭから収集した吸引液中の浮遊脂肪フラクション（ＦＦＦ）を分析した。同じドナーを使用した試験では、分散ＦＦＦ中のＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋表現型を有する細胞の割合は０．３±０．１％であり、それ故、対応するＭＮＣフラクション中に存在する割合（０．０３±０．００６、ｎ＝５）よりも約１０倍高かった。そこで本発明者らは、驚くべきことに、先行技術の手法によれば通常は廃棄されるＦＦＦがＭＳＣの貴重な供給源を表すことを見出した。
【０１０７】
さらに、本発明者らは、ＦＦＦ細胞をコラゲナーゼで消化したとき、生成されるＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞の割合がさらに上昇し、総生細胞の７±５％に達することを認めた（ｎ＝５）（図５、上のパネル）。この収率は、先行技術の手法に従ってＭＳＣのソースとして使用されるＭＮＣフラクションにおける収率より約２００倍高かった。ＦＦＦから遊離されるＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞は、それらのＭＮＣ対応物と比較して同様の広範な表現型を有し、増幅後も多能性であった（上述したものと同じ細胞系譜を検討した螢光励起細胞選別機（ＦＡＣＳ）による結果および形態学的試験を提示する図５の下のパネルに示すように）。ＦＦＦから富化したＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞はＡＬＰ陽性であり、それらの細胞質内に脂肪小滴を有した。これは、細胞がインビボで「前脂肪細胞」状態を有することを指示する。それらのインビボでのアルカリホスファターゼの発現は、それらの「前骨芽細胞」状態を示唆する。合わせて考慮すると、これは、個々の単一細胞に固有の多能性を示唆する。
【０１０８】
全体として見ると、これらのデータは、ＢＭ中に存在するＭＳＣの大部分が単一細胞の形態（先行技術によって示唆されるように吸引液を使用して収集されることが予想され得るタイプの）では見出されないことを示した。その代わりに、驚くべきことに、ＢＭ ＭＳＣの大部分が間質細胞ネットワークに組み込まれ、浮遊脂肪細胞を含む隣接細胞および膠原性基質と共に凝集物を形成することが認められた。
【０１０９】
本発明の最初の態様の方法（間質細胞のネットワークおよびマトリックスからＭＳＣを遊離させるためにコラゲナーゼ消化を利用する）は、先行技術の手法を用いて達成され得るよりもはるかに多くの出発集団からＭＳＣを分離し、富化するために使用し得ることがこの驚くべき所見に照らして認識される。それ故、本発明の最初の態様の方法は、ＭＳＣの高い富化が達成され得る新しい独創的な方法を提供する。
【実施例２】
【０１１０】
滑膜からの間充織幹細胞の富化
２．１ 実験材料および方法
２．１．１ 試料の収集
８つの滑膜組織ソース、即ち、１名の正常ドナー、ＲＡを有する４名の患者、ＯＡを有する１名の患者、痛風を有する１名の患者および血清反応陰性関節炎を有する１名の患者から得た試料を調べた。
【０１１１】
診断関節鏡検査中に、滑膜生検を採取した。小さな組織生検（平均４４ｍｇ）を培地（通常はＤＭＥＭ／２％ＦＣＳ）２ｍｌと共に、１５ｍｌ遠心管に入れて、実験室に運んだ。
【０１１２】
２．１．２ コラゲナーゼ消化
実験室に到着した後、培地を取り除き、生検を０．２５％コラゲナーゼ溶液に入れて、一定な回転下で３または４時間消化した。試料が完全に消化されたとき、コラゲナーゼ溶液は混濁し、細胞生検は崩壊して、完全に消失する。インキュベーション後、ＰＢＳ １０ｍｌを添加し、注射器／針を使用して残存する可能性のある組織塊を破壊した。直後に、ＰＢＳ／細胞混合物を７０ミクロンの細胞ストレーナーで篩過し、遠心分離（１８００ｒｐｍで５分間）のためにもう１つの遠心管に移した。次にコラゲナーゼ／ＰＢＳ溶液を廃棄し、細胞ペレットを、細胞計数およびその後の操作（磁気および螢光励起細胞選別機（ＦＡＣＳ）による分離）に適した培地、通常は２％ＦＣＳを含むＤＭＥＭに再懸濁した。
【０１１３】
２．１．３ 細胞選別戦略
上述したコラゲナーゼ消化手法を用いて滑膜試料から遊離された細胞を、図９に概略的に示すプロトコールを用いてＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞に関して富化した。簡単に述べると、高ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色に基づいて死細胞を廃棄し、残存する生細胞を、低いＣＤ４５発現を有するがＬＮＧＦＲの高発現を有するものを選択するために連続的に選別した。
【０１１４】
この戦略によって得られた選別細胞の線維芽細胞形態が図９の最後の画像に示されている。これらの選別されたＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞は、その後、それらの高い増殖性と一致して、培養下で増殖する細胞単層を生成することができた。
【０１１５】
２．２ 結果
２．２．１ 免疫化学およびフローサイトメトリー分析
間充織幹細胞は多くの他の組織で報告されているが、それらのインビボでのトポグラフィーおよび表現型はこれまで不明であった。本発明者らは、滑膜および関節脂肪体を含む固体組織中でのＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞のトポグラフィーを検討した。滑膜では、Ｄ７−ＦＩＢ抗体は全ての線維芽細胞を染色したのに対し、ＬＮＧＦＲは血管周囲領域内の線維芽細胞だけを染色した（図６）。
【０１１６】
ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞の血管周皮細胞様の分布を示す結果が図７に示されている。ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞は、血管の内腔に１細胞の深さの層を形成した内皮細胞（ＣＤ３１＋およびフォン・ビルブラント因子＋であることが知られる）（図７Ａに示す免疫標識）とは異なった。
【０１１７】
これに対し、固体組織中のＭＳＣが血管周皮細胞であるという認識と一致して、ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞は組織内に広がる陽性細胞のいくつかの層として血管支持体を形成した（図７Ｂ）。
【０１１８】
２．２．２ 滑膜からのＭＳＣの酵素による遊離
上記２．１で概説した方法を用いて滑膜からＭＳＣを遊離させた。
【０１１９】
本発明の最初の態様の方法に従った滑膜の酵素消化は、図８に示すように、大きな割合のＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞を生じた。ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞のこの富化は、細胞が分離された試料の健康状態には無関係であることが見出され（例えばパネル（ｉｉｉ）では痛風からの組織試料）、病気にかかっている患者からであっても、本発明の最初の態様の方法が自己ＭＳＣの治療的分離のために適切であることをさらに例証する。
【０１２０】
ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞を様々な滑膜試料から富化した（１つは正常ドナーから、４つはＲＡを有する患者から、１つはＯＡを有する患者から、１つは痛風を有する患者からおよび１つはセロネガティブ関節炎を有する１名の患者から）。疾患の性質とは無関係に、ＣＤ４５ｌｏｗＬＮＧＦＲ＋細胞は、全ての滑膜消化物において１５±９％の平均比率で、および他のデータセットでは１６±１０％の比率で存在した。
【０１２１】
全ての線維芽細胞がＤ７−ＦＩＢに関して陽性標識することを示す免疫組織化学データと一致して、ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋細胞は滑膜消化物中に高い割合で存在した（７６±２０％の平均比率、およびもう１つのデータセットでは５０±１２％）。
【０１２２】
滑膜組織のコラゲナーゼ消化物でのＬＮＧＦＲおよびＤ７−ＦＩＢの発現を明らかにする代表的実験を図８、パネル（ｉｉ）および（ｉｉｉ）に示す。特にパネル（ｉｉｉ）は、免疫組織化学データと一致して、ＣＤ４５ｌｏｗＬＮＧＦＲ＋細胞（滑膜血管周皮細胞）がＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋細胞（滑膜線維芽細胞）のフラクションを構成することを示す。表現型の共通性は、それらの共通する間葉系統の性質および両方の表現型を有する細胞におけるＭＳＣの存在の可能性を示唆する。
【０１２３】
２．２．３ 選別したＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞がＭＳＣを含むことの機能的証明
細胞単層（第４継代）を、本発明の最初の態様の方法に従って富化した滑膜組織（すなわち滑膜血管周囲細胞）からの選別ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋細胞から生成した。これらの細胞単層を、以下で述べるような骨芽細胞、脂肪細胞および軟骨細胞の分化（ｎ＝１）の機能的インビトロアッセイに供した。
【０１２４】
ｉ）骨芽細胞の分化を、１００ｎＭデキサメタゾン、０．０５ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸−２−ホスフェートおよび１０ｍＭ β−グリセロホスフェート（全てＳｉｇｍａより）によって誘導した。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）活性およびマトリックス鉱化作用を、それぞれＳｉｇｍａキット８２および１％アリザリンレッド（Ｓｉｇｍａ）を使用して検出した。Ｃａ＋＋沈着はＳｉｇｍａキット８５を用いて測定した。
【０１２５】
ｉｉ）脂肪細胞の分化を、０．５ｍＭイソブチルメチルキサンチン（Ｓｉｇｍａ）、６０μＭインドメタシン（ＩＣＮ，Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ，ＵＫ）および０．５ｍＭヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ）を添加したＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中で誘導した。脂質小胞の蓄積を、以前に述べられているように０．５％オイルレッドで視覚化した。
【０１２６】
ｉｉｉ）軟骨細胞の分化のために、２．５×１０５細胞を、高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、１００μｇ／ｍｌピルビン酸ナトリウム、４０μｇ／ｍｌプロリン、５０μｇ／ｍｌ Ｌ−アスコルビン酸−２−ホスフェート、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、Ｉ×ＩＴＳ＋、１００ｎＭデキサメタゾン（全てＳｉｇｍａより）および１０ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦ−β３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）からなる無血清培地に入れた。培地を１日おきに交換した。３週間目にペレットを採集し、凍結切片（５μｍの薄さ）を調製した。硫酸化ＧＡＧを１％トルイジンブルー（Ｓｉｇｍａ）で視覚化した。アルシアンブルー結合アッセイ（ＩＤＳ）を用いてｓＧＡＧを測定した。
【０１２７】
３週間の分化後、本発明に従って滑膜組織から遊離させたＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞に由来する培養物は、脂肪細胞、骨芽細胞および軟骨細胞表現型へと成功裏に分化した。この試験の結果を図９に示し、培養細胞によって実現された表現型を示す顕微鏡写真を提示している。
【０１２８】
選別した滑膜ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞に由来する細胞の多能性を、標準プラスチック付着法によって培養物を生成した、ＢＭ（ｎ＝５）または滑膜（ｎ＝５）由来の培養物と比較した。生じた脂肪細胞の割合は同様であり（それぞれ３０％対３３±１５％および２２±１５％）、生産されたカルシウムの量（骨芽細胞形成を指示する）は同じ範囲内であった（それぞれ１００μｇ／皿対８０±３７μｇおよび１２１±４７μｇ／皿）。軟骨細胞形成は、特に、非常に強力であり、生産されたプロテオグリカン（ＧＡＧ）の量は対照培養物を上回った（それぞれ９μｇ／ペレット対２．６±１．９μｇおよび２．２±１．４μｇ／ペレット）。
【０１２９】
データセットを、滑膜に関してｎ＝１５で比較できるように拡大した。同様の結果が得られ、この場合、生産されたプロテオグリカン（ＧＡＧ）の量は対照培養物を上回った（それぞれ９μｇ／ペレット対２．６±１．９μｇおよび１．８±１．７μｇ／ペレット）。
【０１３０】
全体として、ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋フラクションは全消化物の軟骨細胞形成活性の３分の２超を含み、その１／３だけが残留フラクション中に残った。これらのデータは、滑膜ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞（滑膜血管周皮細胞）が、対照培養物に匹敵するＭＳＣ活性を含み、軟骨細胞形成活性に関して特異的に富化されたことを示した。
【０１３１】
２．２．４ 本発明に従って富化した滑膜ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋集団内のＭＳＣの存在の単細胞レベルでの確認
本発明者らは、本発明に従って滑膜組織から遊離させた個々の細胞のクローン形成能を検討した（ｎ＝３ドナー、全てＲＡを有する）。
【０１３２】
ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋細胞（滑膜線維芽細胞）を、図９に概略的に示すプロトコールを用いて螢光励起細胞選別機（ＦＡＣＳ）による選別によって精製した。平均して、このプロトコールによって選別された接着細胞の１０％が１２〜１３細胞分裂を受けることができたが、これらの２５％（または全接着ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋細胞の２．５％）だけが高度に増殖性であった（２０〜２２細胞分裂を受けることができる）。
【０１３３】
加えて、１つの滑膜組織（ＲＡ）のコラゲナーゼ消化によって遊離される細胞を、ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋集団（滑膜血管周皮細胞）を選択するために選別した。この実験では、全接着ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞の４％が高度増殖性であり、クローン原性であった（２０〜２２細胞分裂を受けることができる）。３つの単一ＭＳＣ由来クローン全てが三分化能性であった（図１０）。
【０１３４】
これらの実験は、本発明に従ったコラゲナーゼ消化によって滑膜組織から遊離された滑膜線維芽細胞と滑膜血管周皮細胞の両方の集団内に、高度にクローン原性で多能性のＭＳＣが存在したこと、およびそれらが血管周皮細胞フラクション（ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞）において数的に富化されたことを示した。さらに、これらの結果は、富化された滑膜血管周囲ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞が軟骨前駆細胞の特に良好なソースであることを示す。
【０１３５】
１つの小さな４４ｍｇ生検から入手し得る滑膜血管周皮細胞の細胞収量は、平均して４００，０００細胞であった（ｎ＝８）。この量は、小さな限局性軟骨欠損（標準自家軟骨細胞移植（ＡＣＩ）手順のために現在使用される細胞密度は１０６細胞／ｃｍ２である）の治療のために十分である。滑膜線維芽細胞または全滑膜組織消化物を使用する場合は、１つの小さな生検を使用してはるかに大きな軟骨欠損が治療できる（１０ｃｍ２まで）。滑膜組織は再生のための高い能力を有し、滑膜のいくつかの生検またはより大きな部分の収集は、ＯＡおよびＲＡで見られるような非常に大きな軟骨欠損の治療を可能にする。滑膜血管周囲細胞の高い増殖活性およびクローン形成活性は、従来のＡＣＩ標準と比較して、はるかに小さな細胞播種密度（例えば初期細胞数）を使用し得ることを示唆する。
【実施例３】
【０１３６】
ＭＳＣは膝蓋下脂肪体中に存在する
関節脂肪体中のＭＳＣ（ＬＮＧＦＲ＋免疫標識によって指示される）は、図１１および１２Ａに例示するように、滑膜中のそのような細胞のトポグラフィーに類似した血管周囲トポグラフィーを有した。
【０１３７】
膝蓋下脂肪体（予備実験ではｎ＝４であり、ｎ＝６に拡大した、全ての患者がＯＡを有した）を本発明に従ってコラゲナーゼ消化に供した。フローサイトメトリーデータは、脂肪体血管周皮細胞（ＣＤ４５ｌｏｗＬＮＧＦＲ＋細胞）が脂肪体線維芽細胞（ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋細胞）のフラクションに寄与することを確認した（図１２Ｂ）。フローサイトメトリーは、ＣＤ４５ｌｏｗＬＮＧＦＲ＋細胞の平均比率が予備実験（ｎ＝４）では２０±１２％であり、ｎ＝６のときにはさらに良好である（３７±９）ことを指示した。
【０１３８】
そのような消化物中のＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋細胞（線維芽細胞）の割合もフローサイトメトリーによって検討し、その結果は、（滑膜試験からのデータと一致して）これらの細胞が消化物のより大きな割合を構成する（６０±１２％（ｎ＝４）および５１±１７％（ｎ＝６））ことを指示した。本発明者らが分析した滑膜消化物と比較して、脂肪体における線維芽細胞の割合は同様である（それぞれ５０％対５１％）が、血管周皮細胞（ＣＤ４５ｌｏｗＬＮＧＦＲ＋細胞）の割合は２倍高かった（それぞれ３７％対１６％）。これは、細胞収率に関して、脂肪体がＭＳＣの選択のために特に有用な組織ソースであり得ることを示唆した。
【０１３９】
脂肪体消化物からＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋細胞（血管周皮細胞）を精製するため、本発明者らは、ＭＡＣＳｅｌｅｃｔ Ａｎｔｉ−ＬＮＧＦＲマイクロビーズ（図１２Ｃ）によるマイクロビーズベースの技術を使用した。ＭＡＣＳｅｌｅｃｔ Ａｎｔｉ−ＬＮＧＦＲマイクロビーズはＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃより入手可能である。選択プロトコールは、Ｄ７−ＦＩＢマイクロビーズに関して述べたものと全く同じである（上記参照）。
【０１４０】
この磁気ソーティング手順後の細胞純度（ｎ＝４）は、直接螢光励起細胞選別機（ＦＡＣＳ）による選別によって得られるものより低かった（約６０〜７０％純度対９５％）（図２０Ｃ）。しかし、本発明者らは、これは実際の純度そのものではなく純度を評価する方法の限界によるものであると考える。これらの限界にもかかわらず、コラゲナーゼ消化物からの脂肪体由来のＣＤ４５ｌｏｗＬＮＧＦＲ＋血管周皮細胞のクローン原性は、滑膜由来のＣＤ４５ｌｏｗＬＮＧＦＲ＋細胞のものと同様であった（総接着ＣＤ４５ｌｏｗＬＮＧＦＲ＋細胞の４％）。選別した脂肪体血管周皮細胞由来のコロニーを図１２Ｃに示す。
【０１４１】
選別した脂肪体由来のＣＤ４５ｌｏｗＬＮＧＦＲ＋血管周皮細胞は、培養増幅前であってもある程度の多能性を有した。遊離／選別細胞の数が分化アッセイにおけるインビトロ試験のために十分であったので、これを評価することができた。
【０１４２】
これらのアッセイの結果を表３に示すが、表３は、
ｉ）コラゲナーゼ消化物によって生産されたＣＤ４５ｌｏｗＬＮＧＦＲ＋細胞、および
ｉｉ）コラゲナーゼ消化物によって生産されたＣＤ４５ｌｏｗＬＮＧＦＲ−細胞、
ｉｉｉ）培養下での増幅（標準方法）後の対照脂肪体由来のプラスチック接着細胞
の性質を比較する。
【０１４３】
上記（ｉｉｉ）からの細胞は、標準増幅プロトコールを用いて入手した。簡単に述べると、脂肪体を標準プロトコールに従って消化した。５×１０５〜１０６細胞を小さな２５ｃｍ２フラスコに接種し、集密に達するまで培養した。集密細胞をトリプシン処理し、さらに２つのフラスコに分けて集密まで培養した。増幅した細胞（第１継代）を、上述したように多能性を試験するために使用した。
【０１４４】
【表３】
【０１４５】
表３に見られるように、脂肪体由来のＣＤ４５ｌｏｗＬＮＧＦＲ＋細胞はＣＤ４５ｌｏｗＬＮＧＦＲ−細胞よりも軟骨形成性であった。平均して、対照培養脂肪体由来ＭＳＣは新鮮ＣＤ４５ｌｏｗＬＮＧＦＲ＋細胞よりも高い軟骨細胞を生産した（それぞれ９±７対２．４±４．４、ｎ＝６およびｎ＝４）。治療的に投与した、本発明に従って富化したＭＳＣから患者において誘導される分化細胞が、本明細書で同定される高いおよび有益な軟骨形成特性を提供することは当業者に認識される。
【０１４６】
１つの小さな３０ｍｇ生検から入手できる脂肪体血管周皮細胞の細胞収量は平均して７００，０００細胞であった（ｎ＝２）。この量は、小さな限局性軟骨欠損（標準自家軟骨細胞移植（ＡＣＩ）手順のために現在使用される細胞密度は１０６細胞／ｃｍ２である）の治療のために十分である。組織１ｇから入手し得る脂肪体血管周皮細胞の細胞収量は、平均で２３×１０６細胞であった（ｎ＝２）。全脂肪体から入手し得る脂肪体血管周皮細胞の細胞収量は、平均で５００×１０６細胞であった（ｎ＝２）。これは、ＯＡおよびＲＡで見られるような非常に大きな軟骨欠損の治療を可能にする。これは、同種環境での脂肪体の使用を可能にし、数多くの治療のために軟骨形成性フラクションを提供する。
【０１４７】
全体でこれらの結果は、関節脂肪体に存在するＣＤ４５ｌｏｗＬＮＧＦＲ＋細胞が、
ｉ）血管周囲細胞、
ｉｉ）クローン原性、および
ｉｉｉ）多能性
であることを明らかにした。
【０１４８】
これらの性質はすべて、間充織幹細胞を含むというこれらの細胞の同定と一致する。
【０１４９】
本発明の富化方法を使用して、これらの細胞を、インビトロ培養増幅への再選別を行わずに直接それらの多能性を試験するのに十分な数（１０６細胞超）で精製することが可能であった。この方法による富化のための細胞のソースである膝蓋下脂肪体の使用は、この組織の大きなサイズおよび脂肪体中に存在するＣＤ４５ｌｏｗＬＮＧＦＲ＋細胞の比較的高い割合の故に、特に好ましい。これの性質は、膝蓋下脂肪体を、本発明の最初の態様の方法を利用して未操作ＭＳＣを得るための卓越したソースにする。そのような富化細胞は組織工学適用に特に適している。
【０１５０】
要約すると、これらのデータは、
（１）初めて、新鮮選別された細胞集団を、多能性に関して増幅細胞と比較し、ＭＳＣ活性を有することが示された、
（２）ＣＤ４５ｌｏｗＬＮＧＦＲ＋細胞は、ＣＤ４５ｌｏｗＬＮＧＦＲ−細胞よりも軟骨形成性および骨形成性であった（従ってＣＤ４５ｌｏｗＬＮＧＦＲ＋は、本発明の最初の態様の工程（ｂ）における選択のための好ましい表現型であった）、および
（３）新鮮細胞の脂肪生成活性は増幅細胞と同様であり、それ故、身体の一部から簡単に脂肪を収集し、消化して、他の部分に細胞を注入／移植することができる。培養下で細胞を増幅することは、それらの脂肪生成能を改善するために必要ではない。
【図面の簡単な説明】
【０１５１】
【図１】実施例１で述べた、骨髄（ＢＭ）から分離したＭＳＣの多重パラメータフローサイトメトリーの結果を示す。
【図２Ａ】骨髄（ＢＭ）中および増幅後のＭＳＣの組織学的分析を示す。
【図２Ｂ】骨髄（ＢＭ）中および増幅後のＭＳＣの組織学的分析を示す。
【図２Ｃ】骨髄（ＢＭ）中および増幅後のＭＳＣの組織学的分析を示す。
【図２Ｄ】分離したＭＳＣによるアルカリホスファターゼの発現のフローサイトメトリー分析の結果である。
【図２Ｅ】骨髄（ＢＭ）中および増幅後のＭＳＣの組織学的分析を示す。
【図２Ｆ】実施例１で述べる、経時的なインビボおよび培養細胞によるＩＬ−７およびＩＬ−７Ｒ発現のレベルの変化を示す棒グラフである。
【図３】上下のパネルを含む。図３の上のパネルは、本発明の方法による骨髄試料の富化後に生産される高い割合のＭＳＣを指示する螢光励起細胞選別機（ＦＡＣＳ）によるデータを示す。図３の下のパネルは、本発明に従って富化されたこれらのＢＭ ＭＳＣが、ＭＳＣ表現型を有し、それらの多能性状態と一致して様々な異なる細胞系譜を生じ得ることを示すフローサイトメトリーデータおよび顕微鏡写真を提示する。
【図４】より高い骨形成能を有する骨ライニング細胞／細胞フラクションの分離のためのコラゲナーゼ消化手順の有用性をさらに示す。ＡおよびＢは、コラゲナーゼ消化工程の前（左）および後（右）のＢＭ腔の走査型電子顕微鏡（Ａ）および蛍光共焦点顕微鏡（Ｂ）画像であり、全部ではないが、大部分の骨ライニング細胞の除去を示す。（Ｂ）の右側パネルは、骨表面（カラー画像で緑色カルセイン染色で示されている）での細胞の減少（カラー画像で、左側と比較して右側ではＤＡＰＩ染色された青色細胞がより少ない）を示す。（Ｃ）は、１回目のコラゲナーゼ消化（左側）と比較して２回目のコラゲナーゼ消化（右側）におけるＣＦＵ−骨芽細胞の高い数をより濃い色として示す（骨原性前駆細胞、アリザリンレッド染色）。２回目の消化は残存骨ライニング細胞を除去し、残っている唯一の細胞は、骨自体の中に捕捉され、それ故、酵素にアクセスできない骨細胞である（Ｄ）（一部の領域での重複（ｆｕｓｓｉｎｅｓｓ）は、骨細胞が異なる平面に位置することを指示する）。
【図５】上下のパネルを含む。図５の上のパネルは、骨髄試料に由来する浮遊脂肪断片の本発明に従った富化後に驚くべき高い比率のＭＳＣが生産されることを指示する螢光励起細胞選別機（ＦＡＣＳ）によるデータを示す。図５の下のパネルは、本発明に従ってＦＦＦから富化されたこれらのＭＳＣが、ＭＳＣ表現型を有し、それらの多能性状態を維持しながら様々な異なる細胞系譜を生じさせ得ることを示すフローサイトメトリーデータおよび顕微鏡写真を提示する。
【図６】実施例２で論じるように、Ｄ７−ＦＩＢ抗体が全ての線維芽細胞を染色したのに対し、ＬＮＧＦＲは血管周囲領域内の線維芽細胞だけを染色したことを示す組織切片の写真である。
【図７】実施例２で述べる、組織試料における血管ライニングの内皮細胞と血管に関連するＭＳＣの分布を対比する組織学的切片の写真を示す。
【図８】実施例２において滑膜から富化したＭＳＣにおけるＬＮＧＦＲの発現を指示する、実施例２の代表的実験を示す。パネル（ｉ）は、死細胞／死にかけている細胞をＰＩゲーティングによって除去した痛風滑膜組織の一次消化物を示す。細胞の大部分は非造血細胞であり、小さな割合のリンパ球（２％）およびより多数の単球／マクロファージ（ＭＭ）（９％）と共に、それらのＣＤ４５／ＳＳＣプロフィールに基づいて同定された。ＭＭは、マクロファージでの発現と一致して、低いＣＤ１４を有する。パネル（ｉｉ）は、ＣＤ１３による二重標識を示し、全ての滑膜組織線維芽細胞（ＣＤ３１＋）が、もう１つの線維芽細胞マーカーであるＤ７−ＦＩＢを発現すること（Ａ）、ＣＤ３１＋細胞が、低レベルの、推定上のＭＳＣマーカー、ＣＤ１６６（ＡＬＣＡＭ）を均一に発現すること（Ｂ）、ＢＭ ＭＳＣのマーカー、ＬＮＧＦＲも滑膜組織線維芽細胞（ＣＤ１３＋）によって発現され、非常に明るい細胞からあまり明るくない細胞まで、様々な陽性度を示すこと（Ｃ）を明らかにする。（Ｄ）は対照染色である。パネル（ｉｉｉ）は、Ｄ７−ＦＩＢによる二重染色を示し、ＢＭ ＭＳＣのマーカー、ＬＮＧＦＲが滑膜組織線維芽細胞（Ｄ７−ＦＩＢ＋）で発現され、非常に明るい細胞からあまり明るくない細胞まで、様々な陽性度を示すことを明らかにする（左のパネル）。ＬＮＧＦＲは滑膜組織内皮細胞（ＣＤ３１＋）で発現されず、免疫組織化学データを確認した。
【図９】実施例２においてＭＳＣを分離するための選別戦略を示し、またこの富化戦略によって生産される細胞の形態を示す。
【図１０】実施例２で論じるように、滑膜から分離したＭＳＣおよびインビトロ培養後のＭＳＣの分化を示す、培養物および軟骨形成性ペレットを横断する組織切片の写真である。
【図１１】実施例３で論じるように、脂肪体中のＬＮＧＦＲ＋細胞が血管周囲トポグラフィーを有することを示す組織学的切片の写真である。
【図１２】実施例３で論じるように、脂肪体中のＬＮＧＦＲ＋細胞が血管周囲トポグラフィーを有することを示す組織学的切片の写真であり、さらに、脂肪体ＭＳＣについての表現型と選別戦略を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）細胞と細胞外マトリックスとを含む組織試料を、液体培地中で細胞外マトリックスから間充織幹細胞（ＭＳＣ）を遊離させるのに十分な量のコラゲナーゼで処理する工程、および
（ｂ）間充織幹細胞（ＭＳＣ）を含む培地のフラクションを分離する工程
を含む、間充織幹細胞（ＭＳＣ）を分離し、富化する方法。
【請求項２】
前記組織試料が骨髄から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料が、胎盤、胸骨または大腿骨からのパンチ生検である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記組織試料が浮遊脂肪フラクション（ＦＦＦ）を含む、請求項１から３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５】
前記組織試料が、骨髄穿刺液、滑膜および脂肪体を含む群より選択された組織から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記試料を、０．２５％コラゲナーゼを含む緩衝液中に入れる、請求項１から５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
前記試料をコラゲナーゼで３〜４時間の間処理する、請求項１から６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８】
ＭＳＣを含む前記フラクションが、単一細胞を含むフラクションを分離するために、固体を除去し、そして、液体培地を遠心分離することによって得られる、請求項１から７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９】
工程（ａ）が２回の別々のコラゲナーゼ消化を含む、請求項１から８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０】
工程（ａ）がヒアルロニダーゼ消化をさらに含む、請求項１から９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】
前記組織試料が骨であり、前記間充織幹細胞（ＭＳＣ）が骨修復用である、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｂ）が、さらなる富化工程をさらに含む、請求項１から１１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１３】
前記さらなる富化工程が磁気ビーズを使用する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記さらなる富化工程が、螢光励起細胞選別機（ＦＡＣＳ）による選別を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記さらなる富化工程が、表１で特定されたマーカーのうちの１つによって特徴づけられる表現型を有する間充織幹細胞（ＭＳＣ）を分離することに基づく、請求項１２から１４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１６】
前記表現型が、ＣＤ４５ｌｏｗＬＮＧＦＲ＋、ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋またはＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１つによって特定された方法に従って富化された分離間充織幹細胞（ＭＳＣ）。
【請求項１８】
薬剤としての使用のための、請求項１７に記載の分離間充織幹細胞（ＭＳＣ）。
【請求項１９】
細胞療法における使用のための、請求項１８に記載の薬剤。
【請求項２０】
前記間充織幹細胞（ＭＳＣ）が、遺伝子治療における使用のために遺伝的に操作されている、請求項１８または１９に記載の薬剤。
【請求項２１】
コラゲナーゼを含む間充織幹細胞（ＭＳＣ）を富化するためのキット。
【請求項２２】
（ａ）間充織幹細胞（ＭＳＣ）と細胞外マトリックスとを含む組織試料を被験者から得る工程、
（ｂ）前記組織試料を、液体培地中で細胞外マトリックスから間充織幹細胞（ＭＳＣ）を遊離させるのに十分な量のコラゲナーゼで処理する工程、
（ｃ）間充織幹細胞（ＭＳＣ）を含む培地のフラクションを分離する工程、および
（ｄ）細胞療法から利益を得ることを可能にする身体部位で前記フラクションを前記被験者に再導入する工程
を含む、治療を必要とする被験者に細胞療法を実施する方法。
【請求項２３】
（ａ）間充織幹細胞（ＭＳＣ）と細胞外マトリックスとを含む組織試料を死体またはドナーから得る工程、
（ｂ）前記組織試料を、液体培地中で細胞外マトリックスから間充織幹細胞（ＭＳＣ）を遊離させるのに十分な量のコラゲナーゼで処理する工程、
（ｃ）間充織幹細胞（ＭＳＣ）を含む培地のフラクションを分離する工程、および
（ｄ）細胞療法から利益を得ることを可能にする身体部位で前記フラクションを前記被験者に導入する工程
を含む、治療を必要とする被験者に細胞療法を実施する方法。
【請求項２４】
前記間充織幹細胞（ＭＳＣ）を遺伝的に操作するさらなる工程を含む、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞療法が、骨修復、軟骨修復、骨格筋修復、腱修復、靭帯修復、半月修復、心筋修復、脊髄損傷、パーキンソン病および他の神経変性疾患、免疫媒介性組織拒絶反応、対宿主性移植片病、慢性関節リウマチ、脂肪物質の再生、血管修復または虚血性血管病変または骨粗しょう症を含む群より選択される状態を臨床的に管理することを目的とする、請求項２２〜２４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２６】
骨を修復するための、請求項２２から２４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２７】
軟骨を修復するための、請求項２２から２４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２８】
変形性関節症を治療するための、請求項２２から２４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２９】
骨粗しょう症を治療するための、請求項２２から２４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３０】
請求項２５〜２９のいずれか１つによって特定された状態の治療のための、請求項１９によって定義される薬剤の使用。
【請求項１】
（ａ）細胞と細胞外マトリックスとを含む組織試料を、液体培地中で細胞外マトリックスから間充織幹細胞（ＭＳＣ）を遊離させるのに十分な量のコラゲナーゼで処理する工程、および
（ｂ）間充織幹細胞（ＭＳＣ）を含む培地のフラクションを分離する工程
を含む、間充織幹細胞（ＭＳＣ）を分離し、富化する方法。
【請求項２】
前記組織試料が骨髄から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料が、胎盤、胸骨または大腿骨からのパンチ生検である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記組織試料が浮遊脂肪フラクション（ＦＦＦ）を含む、請求項１から３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５】
前記組織試料が、骨髄穿刺液、滑膜および脂肪体を含む群より選択された組織から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記試料を、０．２５％コラゲナーゼを含む緩衝液中に入れる、請求項１から５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
前記試料をコラゲナーゼで３〜４時間の間処理する、請求項１から６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８】
ＭＳＣを含む前記フラクションが、単一細胞を含むフラクションを分離するために、固体を除去し、そして、液体培地を遠心分離することによって得られる、請求項１から７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９】
工程（ａ）が２回の別々のコラゲナーゼ消化を含む、請求項１から８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０】
工程（ａ）がヒアルロニダーゼ消化をさらに含む、請求項１から９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】
前記組織試料が骨であり、前記間充織幹細胞（ＭＳＣ）が骨修復用である、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｂ）が、さらなる富化工程をさらに含む、請求項１から１１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１３】
前記さらなる富化工程が磁気ビーズを使用する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記さらなる富化工程が、螢光励起細胞選別機（ＦＡＣＳ）による選別を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記さらなる富化工程が、表１で特定されたマーカーのうちの１つによって特徴づけられる表現型を有する間充織幹細胞（ＭＳＣ）を分離することに基づく、請求項１２から１４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１６】
前記表現型が、ＣＤ４５ｌｏｗＬＮＧＦＲ＋、ＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋ＬＮＧＦＲ＋またはＣＤ４５ｌｏｗＤ７−ＦＩＢ＋である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１つによって特定された方法に従って富化された分離間充織幹細胞（ＭＳＣ）。
【請求項１８】
薬剤としての使用のための、請求項１７に記載の分離間充織幹細胞（ＭＳＣ）。
【請求項１９】
細胞療法における使用のための、請求項１８に記載の薬剤。
【請求項２０】
前記間充織幹細胞（ＭＳＣ）が、遺伝子治療における使用のために遺伝的に操作されている、請求項１８または１９に記載の薬剤。
【請求項２１】
コラゲナーゼを含む間充織幹細胞（ＭＳＣ）を富化するためのキット。
【請求項２２】
（ａ）間充織幹細胞（ＭＳＣ）と細胞外マトリックスとを含む組織試料を被験者から得る工程、
（ｂ）前記組織試料を、液体培地中で細胞外マトリックスから間充織幹細胞（ＭＳＣ）を遊離させるのに十分な量のコラゲナーゼで処理する工程、
（ｃ）間充織幹細胞（ＭＳＣ）を含む培地のフラクションを分離する工程、および
（ｄ）細胞療法から利益を得ることを可能にする身体部位で前記フラクションを前記被験者に再導入する工程
を含む、治療を必要とする被験者に細胞療法を実施する方法。
【請求項２３】
（ａ）間充織幹細胞（ＭＳＣ）と細胞外マトリックスとを含む組織試料を死体またはドナーから得る工程、
（ｂ）前記組織試料を、液体培地中で細胞外マトリックスから間充織幹細胞（ＭＳＣ）を遊離させるのに十分な量のコラゲナーゼで処理する工程、
（ｃ）間充織幹細胞（ＭＳＣ）を含む培地のフラクションを分離する工程、および
（ｄ）細胞療法から利益を得ることを可能にする身体部位で前記フラクションを前記被験者に導入する工程
を含む、治療を必要とする被験者に細胞療法を実施する方法。
【請求項２４】
前記間充織幹細胞（ＭＳＣ）を遺伝的に操作するさらなる工程を含む、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞療法が、骨修復、軟骨修復、骨格筋修復、腱修復、靭帯修復、半月修復、心筋修復、脊髄損傷、パーキンソン病および他の神経変性疾患、免疫媒介性組織拒絶反応、対宿主性移植片病、慢性関節リウマチ、脂肪物質の再生、血管修復または虚血性血管病変または骨粗しょう症を含む群より選択される状態を臨床的に管理することを目的とする、請求項２２〜２４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２６】
骨を修復するための、請求項２２から２４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２７】
軟骨を修復するための、請求項２２から２４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２８】
変形性関節症を治療するための、請求項２２から２４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２９】
骨粗しょう症を治療するための、請求項２２から２４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３０】
請求項２５〜２９のいずれか１つによって特定された状態の治療のための、請求項１９によって定義される薬剤の使用。
【図１】
【図２】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２００９−５２３４３８（Ｐ２００９−５２３４３８Ａ）
【公表日】平成２１年６月２５日（２００９．６．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５０８３２（Ｐ２００８−５５０８３２）
【出願日】平成１９年１月１７日（２００７．１．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００７／０００１０７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０８３０９３
【国際公開日】平成１９年７月２６日（２００７．７．２６）
【出願人】（５０５０２０２１５）ユニヴァーシティ・オブ・リーズ (3)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＬＥＥＤＳ
【住所又は居所原語表記】Ｌｅｅｄｓ ＬＳ２ ９ＪＴ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年６月２５日（２００９．６．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１月１７日（２００７．１．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００７／０００１０７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０８３０９３
【国際公開日】平成１９年７月２６日（２００７．７．２６）
【出願人】（５０５０２０２１５）ユニヴァーシティ・オブ・リーズ (3)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＬＥＥＤＳ
【住所又は居所原語表記】Ｌｅｅｄｓ ＬＳ２ ９ＪＴ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ
【Ｆターム（参考）】
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