細胞を磁性化するための材料及び磁気操作
ナノ粒子のうちの１つが磁気応答性エレメントを含む、正及び負に帯電したナノ粒子を含む材料であって、磁気応答性エレメントを含む前記ナノ粒子の一方を、長い天然の又は合成の分子若しくはポリマーである支持分子と組み合わせて、磁性ナノ粒子アセンブリを形成する。磁性ナノ粒子アセンブリを細胞と組み合わせると、アセンブリはそれらの細胞を磁性化する。その後、磁性ナノ粒子アセンブリを除去するために磁性化細胞を洗浄することができ、磁性化細胞を磁場において操作することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００９年９月２５日に出願の米国仮特許出願第６１／２４５８４６号の優先権を主張し、またその全体は参照することにより本明細書に組み入れられる。
【０００２】
（後援研究に関する説明）
該当なし
【０００３】
（マイクロフィッシュ添付物への言及）
該当なし
【０００４】
本発明は、ナノテクノロジー、材料、生合成、医薬、細胞生物学、及び組織工学の分野に関する。より詳細には、本開示の組成物及び方法は、細胞を磁性化する方法、並びに磁場を用いた３Ｄ細胞培養、細胞操作、及び細胞のパターン形成の方法に関する。
【背景技術】
【０００５】
細胞操作、それらの環境の制御、及びｉｎ ｖｉｖｏ若しくは天然の細胞又は組織の応答を模倣する又は引き出すための条件の促進は、精力的に研究が行われている分野である。幹細胞及び再生医療の分野においては、細胞をｉｎ ｖｉｖｏで成長する天然の条件を再現するための方法及び材料が特に必要とされている。細胞がそれらの天然の環境から除かれるときに経験する状態は、それら新しい環境に細胞が適応するための変化である恒常性をもたらし、そのため細胞の変化が誘導される。これら過程の多くは融通性のあるもの又は可逆的なものではなく、そのため、細胞はそれらの天然の状態に戻ることはできない。細胞及び組織工学がその最大の可能性を達成することができるようになるためには天然の細胞環境をもたらす及び細胞の有害な変化を最小限にする又は制御する材料及び方法が強く望まれている。
【０００６】
現在、三次元（３Ｄ）細胞培養条件を支持することができる材料が開発中である。３Ｄ細胞培養技術での大部分の研究は、フラスコの回旋、細胞が接着することができる細胞外足場の利用、細胞を懸濁するための磁場の利用、又はこれらの方法のいくつかの組み合わせのいずれかを含んでいる。
【０００７】
例えば、米国特許第２００５０５４１０１号、国際公開第２００５０１０１６２号においてＦｅｌｄｅｒは、細胞が成長することができ、かつ、３Ｄ環境において細胞を支持することができる細胞外足場を形成する、ヒドロゲル基質について記載している。これは、細胞間相互作用を迅速に促進するというよりも、細胞と相互作用する、人工の基質を導入し、そして２Ｄ培養よりは改善されるが、足場は細胞を不安定にする傾向にあり、最終産物中に残存する。さらに、細胞はマイクロキャリア上又はマイクロキャリア中で成長することができるが、細胞が周囲にある全ての細胞と接触／相互作用することができる方法では、細胞は浮遊することができない。
【０００８】
煩雑な化学及び複雑な装置を必要とすることをはじめとする、Ｆｅｌｄｅｒのマイクロキャリアの製作に関連する複雑性は、全国規模で相当なレベルにある。さらに、マイクロキャリア製作における主要な試薬の１つであるアルギマトリクス（ａｌｇｉｍａｔｒｉｘ）はエンドトキシン源となる可能性がある。浮遊の促進には浮力の制御もまた関与しているようであり、マイクロキャリア中にガラス球を注入することにより制御されるが、ここでもまた複雑性及び問題が生じる。最後に、ガス交換を達成させるため、及びマイクロキャリアの凝集を防ぐために必要な撹拌には専門のハードウェアが必要であり、細胞の撹拌にはしばしばインペラが用いられている。しかしながら、撹拌によって生じる剪断応力が細胞損傷を引き起こすことが知られている。さらに撹拌は、３Ｄ培養のいずれの磁場形状の制御にも悪影響を及ぼす。
【０００９】
米国特許第２００９１３７０１８号、国際公開第２００５００３３３２号においてＢｅｃｋｅｒは、生物材料を引きつけることができる、磁化コア粒子のコーティングを使用し、それにより生物細胞を、磁化コア粒子へと接着させ、そしてそれらを磁場において懸濁することを可能にした。細胞培養の間も細胞ではコーティングが残り、このために培養中に天然のものではない要素が混入し、おそらく細胞が不安定になる。発明者らは、最終的には除去することができる生分解性コーティングの使用について企図しているが、それについては何も開示されていないためにこの方法が有効かどうかはわからない。さらに、細胞はマイクロキャリアのコアにおいて成長するため、細胞間相互作用を促進する目的で磁気浮遊により細胞をまとめることができる、個別の細胞の浮遊が起こるとは考えられない。したがって、マイクロキャリアを使用した場合に、細胞間接触による早い（数時間時間で）３Ｄ多細胞構造のアセンブリを提示することができるかははっきりとしない。また、マイクロキャリア上で細胞を成長させることによって、特に個々の細胞を浮遊させてその後それらを磁気でまとめることによって、異なる細胞型の共培養が示されていない。最後に、このシステムは扱いにくく、かつ、スケールアップ及びハイスループットな適用には適さないものである。
【００１０】
より良い方法は、細胞を一時的に磁性化し、それらの３Ｄ培養を可能にするものであろう。例えば、米国特許第２００６０６３２５２号、国際公開第２００４０８３４１２号、国際公開第２００４０８３４１６号においてＡｋｉｒａは、リポソームの取り込みによる細胞の磁性化に、磁性陽イオンリポソーム（ＭＣＬ）を使用している。その後、磁性化した細胞を、磁力を用いてプレート底部のシート中で生育させ、そして使用のために分離する。しかしながら、細胞のシートを生産することができるが、細胞は依然としてプレート底部で成長するため、これは磁気浮遊による真の３Ｄ培養ではない。さらに、「Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ−Ｓｅｅｄｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ Ｕｓｉｎｇ Ｍａｇｎｅｔｉｔｅ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｆｏｒｃｅ ｏｎｔｏ Ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅｄ Ｂｌｏｏｄ Ｖｅｓｓｅｌｓ ｆｏｒ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」という名称の最近の出版物においてＳｈｉｍｉｚｕ及びＡｋｉｒａらは、脱細胞化血管に細胞を播種するために磁気誘導を使用している１。この研究は有望な結果を示しているが、彼らは脱細胞化するための組織の提供源としては、磁性化した細胞を使用していない。磁性化した細胞を、脱細胞化血管の再細胞化に使用しているのみである。
【００１１】
Ｓｏｕｚａによる特許出願、国際公開第２０１００３６９５７号では、磁場に応答するナノ粒子を有するバクテリオファージを含む「ヒドロゲル」と細胞とを接触させることにより、磁場において細胞を浮遊させている。具体的には、ｆｄ、ｆｌ、のような線状ファージ又はＭ１３バクテリオファージが用いられている。この方法がどのようにして機能するかについては完全には明らかにされていないが、ファージが細胞をコーティングするゲル様構造又はアセンブリを生じ、そして、どのようにかして、細胞が磁気応答性ナノ粒子を取り込む又は吸着することを補助していると理論立てられている。従って、ヒドロゲルを洗い落とした後でさえも細胞の磁気応答性は維持され、適切な磁場で浮遊させることができる。しかしながら、大部分のヒドロゲルが洗い落とされるものの、ファージの感染又は遺伝子物質が移入する可能性が残るため、ファージを使用しないで細胞への取り込み又は吸着を可能にすることができる材料の提示が望まれている。
【００１２】
本開示は、天然の細胞環境をもたらす改良された材料及び方法を提供することにより、当該分野に存在する欠点を克服するものである。これらは、ナノ粒子ベースの材料を生成するための、並びに３Ｄ培養、細胞パターン形成、及び細胞の画像化を可能にする細胞を準備するための組成物及び方法の使用を含む。
【発明の概要】
【００１３】
本明細書で使用する場合、「正に帯電したナノ粒子」又は「正のナノ粒子」は、全体に正に帯電した２００ｎｍ未満、好ましくは１００ｎｍ以下の任意の粒子と定義される。好ましくは、この粒子は非毒性であるが、しかしこのことは、粒子が細胞に残留しないので、必須ではない。
【００１４】
本明細書で使用する場合、「負に帯電したナノ粒子」又は「負のナノ粒子」は、全体的に負に帯電した、２００ｎｍ未満、好ましくは１００ｎｍ以下、最も好ましくは約２〜２５ｎｍの任意の粒子、と定義される。好ましくは、この粒子は非毒性であるが、しかしこのことは、粒子が細胞に長期間にわたって細胞に残留しないので、必須ではない
【００１５】
本明細書で使用する場合、「磁気応答性エレメント」とは、磁場に応答する任意の要素又は分子であり得る。以下に詳細に記載するように、ナノ粒子のうちの１つは磁気応答性エレメントを含む、又は磁気応答性エレメントでなければならない。
【００１６】
本明細書で使用する場合、「支持分子」とは、マット状の繊維構造又はゲルを作るようにナノ粒子と相互作用し、そのようにして、取り込みのために細胞のごく近くに磁性ナノ粒子を保持する、任意の長い分子を指す。
【００１７】
本明細書においては以下の略号を使用する：
【表１】
【００１８】
一般的に言えば、本発明は、細胞が磁気応答性エレメントを取り込む又は吸着することを可能にし、その結果、磁場をかけた場合に、細胞培養中で細胞を浮遊可能にする、新しい材料である。この材料は、正及び負に帯電したナノ粒子を含み、このうちの１つは酸化鉄のような１つ以上の磁気応答性エレメントを含まなくてはならない。これらのナノ粒子はさらに、細胞によってナノ粒子が取り込まれる又は吸着される位置のそれらを保持する、帯電したナノ粒子及び細胞を支持する機能をもつポリマー、好ましくは天然の又は細胞由来のポリマー、又はその他の長分子（本明細書においては「支持分子」と呼ばれる）と組み合わせられる。正及び負のナノ粒子の両方を含むことは、ナノ粒子の緊密な混合及び３種類の構成要素の会合の促進を可能にし、その結果、均一な分布及び良い取り込みを確実にする。支持分子は、細胞の磁気応答性エレメントの取り込みを可能にする繊維性のマット様構造として、３種類の構成要素全てと細胞とを緊密に組み合わせる。
【００１９】
インキュベート期間の後に、この材料を洗浄して除去することができる。これにより細胞を磁場において操作することが可能になる。代替の工程は、細胞数と磁性ナノ粒子の量との間の比率を上昇させることにより、磁性材料の取り込みを最適化又は調整する工程である。大量の細胞が存在する場合、それらは磁性ナノ粒子の大部分を取り込むため、特に残りの支持分子及び／又はナノ粒子が細胞にとって非毒性及び／又は有益な場合には、残った物質を洗浄する工程は必要ではない場合もある。このことは特に、支持分子が１つ以上の細胞外マトリックスタンパク質、糖タンパク質又はポリサッカライドを含む場合に事実である。磁性粒子は最終的に細胞から分離され、細胞を完全に天然の状態に残す。
【００２０】
単純な３Ｄ培養に加えて、細胞の形、パターン形成及び挙動を操作するために磁場を用いることができる。例えば、トロイダル（ワッシャー型の）磁石を使用することにより、細胞の同様の形状への会合を促進することができ、又は傾斜磁場は３Ｄ細胞培養の片側を厚くすることができる。我々はまた、生育の期間中、培養皿の底部に強力な磁石を置くことにより、固くて高密度の細胞のシートを作成した。磁場を逆にすることのみにより、その後シートを浮遊させることが可能であり、そして我々は、その後シートを３Ｄ培養中で培養し続けることができる。様々な形を組み合わせ、３Ｄ培養を継続することもまた可能であり、かくして、より複雑な形を３Ｄ培養において作出することができる。
【００２１】
磁気応答性エレメントは、例えば希土類磁石（例えば、サマリウムコバルト（ＳｍＣｏ）及びネオジム鉄ボロン（ＮｄＦｅＢ））、セラミック磁石材料（例えば、ストロンチウムフェライト）、磁性元素（例えば、鉄、コバルト、及びニッケル並びにそれらの合金及び酸化物）のような磁場に応答するであろう、任意の元素又は分子であってもよい。特に好ましいものは、磁場に応答する常磁性材料であるが、材料の会合を容易にすることを可能にするので、それらは磁石そのものではない。
【００２２】
好ましくは、そのような細胞の浮遊に用いる磁場は約３００Ｇ〜１０００Ｇである。しかしながら磁場強度は、細胞からの距離、並びに細胞によって取り込まれる又は吸着される磁気応答要素の量及び型の両方によって変わる。従って、最適な磁場強度は様々となるであろうが、経験的に容易に決定される。
【００２３】
負に帯電したナノ粒子は、電荷の安定した金属（例えば銀、銅、白金、パラジウム）を含むが、好ましくは金のナノ粒子である。
【００２４】
正に帯電したナノ粒子は、界面活性剤又はポリマーが安定化した若しくはコーティングされた合金及び／又は酸化物（例えば鉄元素、鉄−コバルト、ニッケル酸化物）を含み、好ましくは酸化鉄のナノ粒子である。
【００２５】
２つのナノ粒子のうちの１つは磁気応答性でなくてはならないが、明かにどちらの一方がこの特徴を有し得る。
【００２６】
ナノ粒子はナノ単位の大きさを有するため、約１００ｎｍである。しかしながら、大きさは約５〜２５０ｎｍ、５０〜２００ｎｍ、７５〜１５０ｎｍの間の範囲であり得るが、使用する細胞型への取り込み又は吸着を可能にするために適当な大きさである限り、それらはより小さくても又はより大きくてもよい。本明細書において我々は、磁性ナノ粒子の有効な大きさには上限があることを示し、また、複数の機能が依然として観察されるが、マイクロメーターサイズでは効果的となるには大きすぎることを示した。
【００２７】
「支持分子」は通常、緊密な混合物中にナノ粒子及び細胞を保持するのに役立つ、ポリマー又はその他の長分子である。支持分子は正に帯電したものであっても、負に帯電したものであっても、両方の電荷を有するものであっても、又は帯電していないものであってもよく、及び１つ以上の支持分子の組み合わせであってもよい。
【００２８】
そのような支持分子の例としては、ペプチド、ポリサッカライド、核酸などのような天然のポリマーが挙げられるが、合成のポリマーもまた使用することができる。特に好ましい支持分子としては、ポリ−リシン、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ＢＳＡ、ヒアルロナン、グリコサミノグリカン、アニオン性、非硫酸化グリコサミノグリカン、ゼラチン、核酸、細胞外マトリックスタンパク質混合物、マトリゲル、抗体、並びにその混合物及び誘導体が挙げられる。
【００２９】
一般的に言えば、支持分子の濃度は、負及び正に帯電したナノ粒子の濃度よりも大幅に高く、１〜１０００倍高い、１０〜５００、又は２０〜２００倍高い範囲である。しかしながら、どの細胞型を用いるか並びにどの支持分子及びナノ粒子を用いるかによって、より高い又はより少ない量にすることも可能である。ポリマーの長さが長くなるほど、取り込みのための場所にナノ粒子を保持するのに十分な構造を形成するために必要な量はより少なくなるだろう。
【００３０】
通常、ナノ粒子は非常に低い濃度で用いられる。濃度は、１０−１２〜１０−６モル濃度の範囲になり得るが、好ましくはナノモル濃度の範囲であり、かつ、支持分子の濃度は１０−９〜１０−３モル濃度であり、好ましくはマイクロモル濃度の範囲である。
【００３１】
３種類の構成要素は静電相互作用によって会合するため、ポリ−リシンのような帯電した、又は両方に帯電した支持分子が好ましい。しかしながら、構成要素及び／又は細胞の相互作用をさらに促進するために、３種類の構成要素のいずれをも官能化、誘導体化又はコーティングすることができる。従って、１つ以上の成員を、例えば、細胞表面抗原に結合する抗体を用いて、官能化、誘導体化、又はコーティングすることができる。従って、構成要素及び／又は細胞間の相互作用がさらに促進されるだろう。他の結合対には、受容体−リガンド、ビオチン−ストレプトアビジン、相補的な核酸、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、シアル酸含有分子などが含まれる。
【００３２】
コーティングは、ＰＶＰ、デキストラン、ＢＳＡ、ＰＥＧなどのような、特にナノ粒子のための、防御的又は保護的なコーティングをもまた含み得る。ナノ粒子、特に磁気応答性エレメントを含むナノ粒子を可視化のために、例えばフルオロフォア、放射性標識などを用いて、特に磁性化細胞及び組織の開発及びｉｎ ｖｉｔｒｏでの試験の段階で標識することができる。しかしながら、治療上での使用においては、そのような標識を省略することが好ましいだろう。
【００３３】
その他の実施形態において組成物は、幹細胞、癌細胞、初代細胞、哺乳類細胞、ヒト細胞、新鮮な組織から直接抽出された細胞、細菌、酵母、植物細胞、又はその混合物を含むがこれらには限定されない、その後磁場において浮遊させる又は操作する細胞を含む。
【００３４】
本開示は、１つ以上の本開示の組成物と細胞とを混合すること、及び磁場の存在下でこの混合物を培養する、パターンを形成させる、又は操作することを含む、３次元で細胞を培養する、細胞のパターンを形成する及び細胞を画像化する方法をもまた提供する。磁場は培養容器の上にあっても下にあってもよく、培養容器の近く若しくは遠くにあってもよく（例えば、より強い若しくはより弱い）、傾斜していても若しくは横になっていてもよく、又は磁場の形状は多様であり得、又はそれらの１つ以上を組み合わせたものであってもよい。このようにして、特定の目的を達成するために細胞をパターン形成させる又は移動させることができる。
【００３５】
上述したシステムについての我々の広範な研究により、先行技術の方法に対する数多くの改良点を利用可能であることがここに示された。第一に、自己会合製造化学（ｓｅｌｆ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）が方法を単純に、かつ、再現可能にし、また、磁性ナノ粒子アセンブリの製造又はそれにつづく細胞の磁性化、細胞操作又は３Ｄ培養に専門の装置を必要としない。必要とされるものは、磁場、ピペット、容器及びホットプレートのみであった。従って、この方法は大規模及びハイスループットにも応用可能である。
【００３６】
ポリ−リシンなどの支持分子が容易に合成できることから、望まれる場合には、ファージ又は細胞産物のような生物的な分子を含めずに磁性ナノ粒子アセンブリを作成することができる。それであっても、全ての構成要素が通常非毒性であることから、費用も高くなく、また作成も容易である。さらに、繊維性のマット様構造は、ナノ粒子磁気アセンブリに含めるための、追加の細胞支持分子（細胞外マトリックス要素のような）の組み込みを可能にする。
【００３７】
磁性ナノ粒子アセンブリを用いた細胞を磁性化は、一般的な培地中の細胞にアセンブリを加えることのみを含む。磁性ナノ粒子を処理して数分（５分）以内に細胞を磁性化することができ、また、付着した又は懸濁された細胞を磁性ナノ粒子アセンブリで処理することができる。磁性ナノ粒子での処理の前又は処理後に細胞を凍結保存することができるが、この方法はそれでも機能する。必要な場合には、磁性化細胞を使用する前に、磁性ナノ粒子アセンブリを洗い落とすこともでき、残った細胞は依然として浮遊する。
【００３８】
磁気浮遊によって細胞を３Ｄで浮遊させる工程及び培養することは、標準的な２Ｄでの細胞培養に必要なもの以上には、専門の又は費用のかかる装置又は方法（撹拌又は浮力の維持のためのような）のいずれをも必要とせず、また、磁気で浮遊させた３Ｄ細胞培養の形状の制御は、磁場の形状を変化させることにより達成することができる。最終的に、またおそらくは最も重要なことに、本発明は細胞の浮遊により、早い（秒及び分単位の）細胞間相互作用、及び細胞を３Ｄの多細胞のクラスターとして数分以内に会合させることを促進し、そして、磁場を操作すること及び／又は磁気により異なる細胞型の細胞を接触させることにより、複雑な培養構造を作成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】ナノ粒子アセンブリを生成するための、直接会合法の模式図である。この図では、１が負に帯電したナノ粒子、３が正に帯電したナノ粒子、及び５が支持分子であり、そして完成した磁性ナノ粒子アセンブリが７である。３つの構成要素はどの順番で組み合わせてもよいが、ここでは最初にナノ粒子を組み合わせ、次に支持分子を加えたものを示す。
【図２】変異型磁性ナノ粒子アセンブリ１９を示す模式図である。正のナノ粒子が１５、負のナノ粒子が１７であり、２１及び２３は２つの異なる支持分子、例えば、ポリ−リシン（＋電荷）及びグルタミン酸及び／又はアスパラギン酸（−電荷）塩を多く含むペプチドを表し、又は別の例としては、ラミニン及びフィブロネクチンを表す。
【図３】磁性酸化鉄及び金のナノ粒子及び右側に列挙した様々な支持分子からなる実際のナノ粒子アセンブリの吸収スペクトルである。
【図４】例示となるＦｅ０２−Ａｕ−ＰＬナノアセンブリの暗視野画像（ａ）及びハイパースペクトル画像（ｂ）である。
【図５】図５ａ〜ｄは、１０ｘに拡大した明視野及び蛍光画像を示す。ａは、ＩｇＧ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８支持分子用いた明視野画像である。ｂは同じ視野の緑色蛍光画像である。ｃはマウスＩｇＧ及び抗マウスＩｇＧＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５支持分子を用いた場合の明視野写真であり、ｄは同じ視野の赤色蛍光画像である。
【図６】図６ａ〜ｄは、ａ＝ＰＬ、ｂ＝ＣＯＬ、ｃ＝ＬＡＭ、ｄ＝ＮＴを含む、異なる組成の磁性ナノ粒子アセンブリを用いて処理した後に浮遊させている、ＨＥＫ２９３細胞の写真である。
【図７】動物由来の細胞又は体液の本発明の方法での使用を示す模式図である。
【図８】既に成長している試料に加える、本発明由来の細胞又は抽出物の繰り返し使用を示す模式図である。
【図９】本発明の方法を用いて細胞の密度及び形状を操作する、数例を示す写真である。
【図１０】磁場を非対称にすることによる、３Ｄ培養の厚さの変化を示している。
【図１１】図１０の方法の一例を示す写真である。
【図１２】細胞の磁性化のために磁気フィルムを使用する場合の模式図である。ここで、細胞は磁性ナノ粒子アセンブリと緊密に混合されず、その表面上に乗せられるのみである。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本開示は、負に帯電したナノ粒子、正に帯電したナノ粒子、及びポリマー若しくは長分子、又は金属に結合したポリマー若しくは分子を含む、組成物を提供する。以下の実施例は本発明を説明するためだけのものであり、本発明の範囲を不当に限定するものではない。
【００４１】
実施例１：磁性ナノ粒子アセンブリ
図１は、負のナノ粒子（１）及び正のナノ粒子（３）（少なくとも１つのナノ粒子は磁気を帯びている）及び支持分子（５）を組み合わせることにより、磁性ナノ粒子アセンブリ（７）を調製する一般的な模式図を示すものである。
【００４２】
ナノ粒子を別々に、水又は低イオン強度緩衝液（塩濃度＜１０ｍＭ）中、望まれるｐＨで混合することにより、ナノ粒子溶液を調製する。粒子表面の電荷は、適切なｐＨを選択することにより調節することができ、ここでｐＨが低い緩衝液（クエン酸又は炭酸緩衝液など）は通常、ナノ粒子全体の電荷を上昇させることができる。対照的に、ｐＨが高い緩衝液（ホウ酸緩衝液など）は通常、粒子全体の電荷を下げることができる。理想的には、各溶液についてのｐＨの選択により、２つの粒子間の電荷が反対になる。このことは、異なる組成のナノ粒子が一般的に異なる等電点を有することにより達成することができる。
【００４３】
例えば、酸化鉄の型に依存してｐＨが３．３〜８の範囲で変化し得る２酸化鉄ナノ粒子とは対照的に、Ａｕナノ粒子は多くの場合、クエン酸塩又は塩化物を吸着したイオン存在のために、ほとんどのｐＨ値で負に帯電する。そのため、ｐＨ４では、Ａｕナノ粒子は負に帯電すると予想され、酸化鉄ナノ粒子は正に帯電するはずである。ナノ粒子全体の電荷を決定することができる、デキストラン、ポリ−エチレングリコール、又はチオールのような分子を用いてナノ粒子をコーティングすることもまた可能である。正に帯電した、負に帯電した、両方の電荷をもつ、又は帯電していない支持分子を用いた会合を確実にするためには、、電荷の不一致が望ましい。
【００４４】
支持分子（５）溶液は通常、それらを水又は所望のｐＨ、好ましくは低イオン強度（好ましくは、塩濃度＜１０ｍＭであるが、確実に分子を溶解するために必要な場合には、塩濃度をより高くしてもよい）の緩衝液（クエン酸、リン酸、ホウ酸など）に溶解する又は混合することにより調製される。低イオン強度は通常、電荷遮蔽を低減するために望ましく、そのため、反対の電荷を有するナノ粒子及びポリマーの間の電荷相互作用を促進する。支持分子（５）の濃度は通常、ナノ粒子の濃度（１０ｎＭ〜１ｍＭの範囲であるが、他の濃度を用いることもできる）を上回るべきであり、一般には、ナノ粒子（１）及び（３）のモル濃度に対して１０倍上回るべきである。
【００４５】
さらに詳細には、支持分子は、磁性ナノ粒子の細胞への接着性の向上（ポリ−リシンなど）；細胞培養環境の改善（コラーゲン及びラミニンのような細胞外マトリックスタンパク質の使用などにより）；特定の分子（ＤＮＡ、薬剤、リガンド、標識などのような）の細胞への送達を可能にする；シグナルレポーター（蛍光標識のような）としての機能をもたらす；及び／又は、磁性ナノ粒子アセンブリの細胞／組織への生体適合性の改善（例えば、栄養の維持又は適合する免疫表面の提供などにより）、のような機能性をアセンブリにもたらすことができる。
【００４６】
図２は、負に帯電したナノ粒子（１７）及び正に帯電したナノ粒子（１５）が、２つの支持分子（２１、２３）により保持されている、磁性ナノ粒子アセンブリ（１９）を示す。支持分子対の一例としてはラミニン及びフィブロネクチンが考えられ、別の例としては抗体及び抗原も考えられる。
【００４７】
我々は様々な磁性ナノ粒子アセンブリを調製し、様々な培地中の様々な細胞を用いてその機能を試験した。表３は、試験した構成要素の種類を示す。
【表２】
【００４８】
図３は、様々なアセンブリの吸収スペクトルを示すものである。ナノ粒子と様々な支持分子の間の静電架橋のレベルを変化させることにより、異なる溶液間の消衰スペクトルの変化が生じる。ラミニン（５）、コラーゲン（７）、及びＦｕＧＥＮＥ−ＧＦＰ（２１）のスペクトルを例外として、これら全てのスペクトルは、Ａｕナノ粒子の特性吸収からもたらされる、およそ５６０ｎｍに中心をもつ、広い肩を示す。Ａｕナノ粒子スペクトルにと比較して平坦なスペクトル特性は、多分散酸化鉄ナノ粒子（通常１００ｎｍより小さい）が含まれること及びその広い消衰スペクトルによってもたらされるものである。ラミニン（５）及びコラーゲン（７）のスペクトルは、細胞外マトリックス構成要素を用いて調製したナノ粒子アセンブリについてのものである。ＦｕＧＥＮＥ−ＧＦＰ（２１）と命名したスペクトルは、ＧＦＰレポーター分子をコードしているＤＮＡプラスミドをローディングした、ＦｕＧＥＮＥ（リポソーム）を用いて調製したナノ粒子アセンブリについてのものである。（２１）のトレースにおいて、２６０ｎｍにＵＶの肩があることが、ＤＮＡプラスミドの存在を示してしている（ＤＮＡは２６０ｎｍにおいて吸光する）。
【００４９】
図４は、例示となるＦｅＯ２−Ａｕ−ＰＬナノアセンブリの暗視野画像（ａ）及びハイパースペクトル画像（ｂ）を示す。ハイパースペクトル画像処理は、暗視野での顕微鏡像と画像化した試料の散乱光（４００〜１０００ｎｍ）の波長分解スペクトルを組み合わせた、光技術である。この技術により、光散乱特性に基づいてナノ材料の特定が可能になる。単分散ナノ粒子からは１つのピークが予測されるが、ここでは、スペクトルの予想される広がりは、酸化鉄ナノ粒子及びそれらのアセンブリが含まれことによるものである。スペクトルは広がっているが、それでもなお、組織中のこれら試料を特定するために十分なスペクトル分解を提供する。従って、この方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでアセンブリをモニタリングするための方法である。
【００５０】
次に図５を参照すると、蛍光タンパク質共役体を結合体支持分子（ｂ、ｄ）として用いて調製した磁性ナノアセンブリ（ａ、ｃ）からの蛍光シグナルである。ａ及びｃの画像に示されるナノ粒子アセンブリは、図１Ａのスキームを用いることにより、金及び酸化鉄ナノ粒子、並びにＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５５５ロバ抗マウスＩｇＧ及びタンパク質マウスＩｇＧを二重支持分子として用いて生成したものである。最初に金及び酸化鉄を混合し、次にタンパク質であるマウスＩｇＧを加え、磁性ナノ粒子アセンブリを形成させた。その後、二番目の／別の工程において、蛍光を示す抗体であるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５５５ロバ抗マウスＩｇＧと共にアセンブリをインキュベートした。このようにして、磁性ナノ粒子アセンブリを標識し、その使用中に、モニタリングすることができる。
【００５１】
図６ａ〜ｄは、図１に示した方法で生成した、異なる組成の磁性ナノ粒子アセンブリを用いて処理した後に浮遊させている細胞を示す写真である。用いた手順は以下の通りである：最初に、Ｘｍｇ／ｍｌの、直径およそ７４ｎｍのＡｕナノ粒子溶液（クエン酸還元により生成した、波長５４８ｎｍでの消衰が４．１である）６ｍｌを、ｐｉｃｏｐｕｒｅ水に溶解した、１．０ｍｇ／ｍｌの多分散酸化鉄ナノ粒子溶液３ｍｌと混合することにより、酸化鉄−Ａｕアセンブリを生成した。次に、１．０ｍｌの酸化鉄−Ａｕ混合物を、ｐｉｃｏｐｕｒｅ水に溶解した、それぞれ別々のポリ−リシン（０．０００１％）、コラーゲン（３０μｇ／ｍｌ）、ラミニン（１０μｇ／ｍｌ）、又はオリゴヌクレオチド（１μｇ／ｍｌ）溶液１．０ｍｌに素早く加えた。
【００５２】
支持分子と混合した後、溶液を一晩インキュベートした。磁性ナノ粒子アセンブリを、磁石を用いて底部に引き寄せながら、上清画分を磁気分離によって除去し、そして上清を廃棄した。未反応の過剰の試薬を除去するために、磁性ナノ粒子アセンブリを各回につき５ｍｌのｐｉｃｏｐｕｒｅ水で、２度洗浄した。その後これを５ｍｌのｐｉｃｏｐｕｒｅ水中、４℃で保存した。
【００５３】
最後に、０．５ｍｌのナノ粒子アセンブリを入れた１５ｍｌのコニカルチューブに５ｍｌのＨＥＫ２９３細胞（５０，０００細胞／ｍｌ）を注意深くピペットで加えた。この混合物をピペットでゆっくりと撹拌し、５分間インキュベートし、沈殿させた。コニカルチューブ中の細胞を５分間インキュベートして沈殿させ、その後上清を除去し（コニカルチューブ中に置いた）そして、培地と交換した。この洗浄過程を２回以上繰り返した。
【００５４】
結合していないナノ粒子よりも、ナノ粒子アセンブリに結合した細胞の方が非常に早く沈殿するため、結合していないナノ粒子は上清と共に除去された。上清の入ったコニカルチューブの底部に磁石を配置することにより、結合していないナノ粒子を上清中で視覚的に検出することができ、ナノ粒子は磁気沈降により可視化され得る。３回目の洗浄の後には、上清は遊離磁性ナノ粒子アセンブリを含んでいないようであった。細胞をその後３．５ｃｍのシャーレに移し、環状のネオジム磁石（２０ｘ（８．５ｘ４．５）ｘ７ｍｍ；磁気引力：１３ポンド）を用いて浮遊させた。どの支持分子を用いたかに関係なく、磁場をかけることにより、全ての細胞が数分以内に３Ｄ培養中に浮遊し、融着した。本明細書においては、その他の多くの支持材料について試験し、全てが機能したが、いくつかの結果についてのみを示す。
【００５５】
実施例：構成要素分子
本明細書において我々は、Ｆｅ２Ｏ３ナノ粒子のみ（＜５０ｎｍ粒子サイズ）、Ａｕ−（Ｆｅ２Ｏ３）ナノ粒子、及びＰＬ−ＡＵ−（Ｆｅ２Ｏ３）の完全な磁性ナノ粒子アセンブリについて試験することにより、磁性ナノ粒子アセンブリの様々な構成要素の重要性についてもまた実証した。
【００５６】
同一量の、又は５，０００細胞当たりおよそ１．０μｌの酸化鉄磁性ナノ粒子を含む試料を用いて細胞を処理し、５００Ｇの磁石を用いて浮遊開始直後、及び３００Ｇ又は５００Ｇの磁石を用いて磁気浮遊により７日間培養した後に顕微鏡写真を撮影した（データは示さない）。
【００５７】
初日には全ての細胞を浮遊させることができたが、特に５００Ｇの磁石を用いて培養した場合、ＰＬ−ＡＵ−（Ｆｅ２Ｏ３）を用いて処理した試料がより大きく、より集まった３Ｄ構造を示した。したがって、３種類全ての構成要素が、３Ｄ構造となるのに有効な細胞浮遊及び会合に必要である。ナノ粒子のみの場合にはより低い能力が示されたが、それでもなお、図１の実施形態のものよりも、少ない操作しか必要としないナノ粒子を用いて処理した細胞では浮遊させる及び培養させる能力には価値がある。
【００５８】
実施例：細胞への材料送達
我々はまた、磁性ナノ粒子アセンブリが材料を保持する、及び材料を細胞に送達する能力について示した。原理の証明として、ＨＥＫ２９３細胞をＧＦＰ ＤＮＡを有する磁性ナノアセンブリを用いて処理及び浮遊させ、その後、浮遊した３Ｄ細胞培養中の細胞の内部でのＧＦＰの蛍光シグナルを検出した。
【００５９】
より詳細には、ＤＮＡを有する磁性ナノアセンブリの調製方法は以下の通りであった：最初に、製造業者（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ トランスフェクション試薬）の説明に従って、２mｇのＧＦＰプラスミドＤＮＡ（ＤＮＡ）を無血清ＤＭＥＭ培地２００μｌに溶解し、ＦｕＧＥＮＥ溶液を調製した。
【００６０】
次に、６μｌのＦｕＧＥＮＥ溶液を、希釈したＤＮＡ溶液（ＦｕＧＥＮＥ−ＤＮＡ）２００μｌに直接加えた。この混合物を室温で１５分間静置した。その他に２つの試料を調製した：１つは無血清ＤＭＥＭ培地２００μｌに直接６μｌのＦｕＧＥＮＥを加えたもの（ＤＮＡなし、負の対照、本明細書においてはＦｕＧＥＮＥと呼ぶ）であり、もう１つは、無血清ＤＭＥＭ培地２００μｌに４μｇのＤＮＡを加えたものである（本明細書においてはＤＮＡと呼ぶ）。その後、Ａｕ及び酸化鉄ナノ粒子溶液（Ａｕと混合する前の酸化鉄は１ｍｇ／ｍＬ）を割合が２：１（ｖ／ｖ）、３ｍｌになるように合わせてしっかりと混合し、そして１００μｌのＦｕＧＥＮＥ−ＤＮＡ、１００μｌのＦｕＧＥＮＥ、及び１００μｌのＤＮＡに直接加えた。
【００６１】
この溶液をよく混合し、４℃で一晩インキュベートした。一晩インキュベートした後、ナノ粒子を沈殿させた。磁性酸化鉄及び金ナノ粒子からなるナノ粒子アセンブリ、並びにそれらナノ粒子を含まない上清（ナノ粒子を沈殿させた後に回収した）の消衰スペクトルを得た。それらの高いＵＶ吸収から、ＤＮＡ及び／又はＦｕＧＥＮＥが取り込まれたことが示された。上清のスペクトルは、混合した試料よりも低い吸収を示し、このことはＤＮＡ及びＦｕＧＥＮＥがナノ粒子アセンブリに取り込まれたことを示している。
【００６２】
磁性ナノ粒子アセンブリを細胞に加え、この細胞を上述のように浮遊させ、そして浮遊した細胞をその後撮影した。ＤＮＡを有する両方の系においてＧＦＰ蛍光シグナルが見られることは（データは示さない）、これらの磁性ナノ粒子アセンブリが、磁気浮遊によりこれら細胞を３Ｄで磁性化および培養している間に、ＤＮＡを保持する及びＤＮＡを細胞に送達することができる能力を示している。この結果は、磁性ナノ粒子アセンブリが細胞を磁性化すること、及びＤＮＡ又は薬剤のような機能物質を細胞に送達することの両方が可能であることを立証するものである。
【００６３】
実施例：初代細胞の浮遊
多くの場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏで初代細胞を培養することは難しいものであるが、我々は酸化鉄−Ａｕ−ＰＬを用いて初代細胞を磁性化した後に、磁気浮遊により３Ｄにおいて、それらの培養を成功させた。
【００６４】
Ａｕナノ粒子、ＰＬ、及び異なる酸化鉄ナノ粒子を含む、様々な磁性ナノ粒子アセンブリを作成した。様々な酸化鉄は、Ｆｅｒｒｉｄｅｘ−ＰＬ、酸化鉄−Ａｕ−ＰＬ（＜５０ｎｍ）、酸化鉄−Ａｕ−ＰＬ（〜５ｎｍＡｕ）、及び酸化鉄−Ａｕ−ＰＬ（＜５μｍ、マイクロ粒子の一例として）であった。Ｆｅｒｒｉｄｅｘはデキストランでコーティングされた超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯＮ）からなる。以下のものに関して特定の分子又は表面が実効電荷を持たない等電点（ｐＩ）又はｐＨは以下の通りである：ＳＰＩＯＮ、７３−５；磁鉄鋼（γ−Ｆｅ２Ｏ３）、３．３〜６．７２；及び磁鉄鋼（Ｆｅ３Ｏ４）、６．５〜６．８２。
【００６５】
異なるナノ粒子アセンブリとしては以下のものを用いた：１１．２ｍｇ／ｍＬのＦｅｒｉｄｅｘＩ．Ｖ．（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ、Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、酸化鉄（ＩＩＩ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、５４４８８４、粒子サイズ＜５０ｎｍ、Ｆｅ２Ｏ３。この製品は、主にγ形態の磁鉄鉱を含むが、天然の鉱物形態にはアルファ形態及びガンマ形態の両方が含まれる。我々はまた、酸化鉄（ＩＩ、ＩＩＩ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、３１００６９、＜５μｍ、Ｆｅ３Ｏ４、磁鉄鉱）も用いた。３種類全ての鉄試料を１ｍｇ／ｍＬになるように水に希釈して解析用溶液とした。Ｄｕｆｆら６に従って、約５ｎｍのＡｕコロイドを調製した。
【００６６】
酸化鉄−Ａｕ−ＰＬの調製には、個別に準備した、１．００ｘ１０−３〜３．１２ｘ１０−５％の範囲の濃度でポリ−Ｌ−リシン（ＰＬ）水溶液を連続して６回希釈することを含んだ。等量の、比率１：１（ｖ／ｖ）のＡｕ及び酸化鉄ナノ粒子溶液をそれぞれの希釈液に加えた。一晩インキュベートした後、ナノ粒子をそれぞれのバイアルの底部に沈殿させ、上清の半量を除去した。最も低い希釈倍率の希釈液から始め、連続希釈混合液を混ぜあわせ、次に希釈倍率が低い希釈液と順に混合していき、全ての溶液が１つのバイアル中にまとめられるまで行った。最終的なＰＬ濃度は１．２４ｘ１０−３％となった。
【００６７】
試薬を連続希釈した試料にして混合することにより、より高い希釈倍率の希釈液由来の結合しなかった試薬がアセンブリ中に組み込まれるようになる。また、多くの場合異なる希釈液は、はっきりと異なる光学的、構造的、接着、及びその他の物理的特性を示すため、異なる希釈倍率の希釈液を混合することにより、これらの特性を統合することができる。そのような特性の統合がしばしば求められる。一方この過程は、応用によって異なる、最適な条件を決定及び選択するための良好な目視検査である。例えば、１つ又は複数の希釈液はプラスチック又はピペットに対する粘着性を有する可能性がある。
【００６８】
４種類のヒト初代肺細胞（ＳＣＩＥＮＣＥＬＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ（商標）Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を酸化鉄−Ａｕ−ＰＬアセンブリを用いて処理し、その後３Ｄで培養した。この過程には、これらの細胞を単層から約８０％コンフルエンスに達するまで２Ｄの細胞培養フラスコにおいて培養することを含んだ。その後、酸化鉄−Ａｕ−ＰＬ溶液をフラスコ中の細胞に加え（濃度範囲は１．５６〜１３．００μＬ／ｃｍ２）、細胞とインキュベートした。インキュベート時間はおよそ一晩（又は約１２時間）とした。その後初代細胞をＰＢＳで洗浄した（結合しなかった酸化鉄−Ａｕ−ＰＬを除去した）。最後に細胞をトリプシン消化により分離して３．５ｃｍシャーレに移し、最終的に、環状のネオジム磁石（２０ｘ（８．５ｘ４．５）ｘ７ｍｍ；磁気引力：１３ポンド）を用いて浮遊させた。
【００６９】
細胞本来の接触が接着した細胞を用いた場合にさえも、異なる形態及び大きさの酸化鉄を用いて調製された４種類全ての型のナノアセンブリは細胞に付着し、細胞を容易に浮遊させることができた（データは示さない）。しかしながら、より大きな酸化鉄（＜５μｍ、Ｆｅ３Ｏ４、磁鉄鉱）を用いて調製したアセンブリは、その他のものが形成するほど大きくて凝集した細胞構造を形成しなかった。このことは、細胞が取り込むことができる磁気応答性エレメントの大きさには上限があることを示している。ここで、細胞中に容易には侵入しないより大きな酸化鉄粒子があることにより小さい細胞クラスターが生じる可能性が高く、そのため、細胞はあまり磁性化されず、そのようなより大きなサイズの粒子は細胞表面を覆い、細胞間相互作用を妨害又は損なう可能性もまたある。
【００７０】
実施例：ｅｘ ｖｉｖｏでの細胞浮遊
図７を参照すると、血液、血清、血漿、又は凝集していない組織細胞（４３）を含むがこれらには限定されない、動物又はヒトから採取した任意の細胞（４１）をナノ粒子（４５）と混合し、その後、それらを共に３０秒から４８時間インキュベートする。インキュベートの間に、この試料（４３）及びナノ粒子（４３）は、ナノ粒子アセンブリ（４７）を形成するように、試料及びナノ粒子中に含まれる任意のタンパク質、ＤＮＡ又はポリサッカライドと静電的に相互作用する。次にこの磁性ナノ粒子アセンブリ（４７）を磁力、遠心分離、及び／又は沈降により分離させる。この過程で上清を混合物から分離し、そして残った磁性化細胞を操作するために磁石を用いる。
【００７１】
さらに図７を参照すると、このナノ粒子アセンブリは、血液又はその他の試料（４３）中に含まれる任意のタンパク質、ＤＮＡ又はポリサッカライド間の相互作用により生成される。相互作用の種類には、静電的な性質による相互作用、共有（チオール官能基及び／又はその他の架橋剤）、短距離、及び／又は特異的及び非特異的な性質の疎水性（一般に架橋分子を介した）相互作用が含まれるがこれらには限定されない。例えば、ｐＨを操作することにより静電的な相互作用を可能にする及び／又は制御することができ、ここで異なる等電点を有するタンパク質が、それらに対応するナノ粒子の表面電荷と相互作用する。
【００７２】
さらに、細胞成長を支持する又はアセンブリ中の様々な構成要素をさらに架橋するために、追加の支持分子をアセンブリに加えることもまた可能である。この種の架橋は、抗体又はその他の分子（例えばペプチド又はタンパク質タグ）を用いて、最初の試料（４３）又は磁性ナノ粒子アセンブリ（４７）を変化させ、アセンブリ中の特定の分子を濃縮する／捕捉することにより達成することができる。
【００７３】
本明細書において記載した実施形態は、最終的な細胞を治療で用いる場合に生じるいずれの免疫反応をも低減するために、天然のタンパク質を用いてナノ粒子アセンブリを調製するために有効であり得る。このことは、異物の影響を遮蔽するために、ナノ粒子アセンブリの調製に血清、血液、又はその他の体組織若しくは体液を使用することができ得ることから、自己細胞を用いる治療用の細胞培養について対応する場合に有効であり得る。
【００７４】
実施例：凍結磁性化細胞
本明細書において我々は、磁性化した際に細胞を凍結し、その後融解して３Ｄ培養に用いることができることを示した。上述の方法により、細胞を磁性ナノ粒子アセンブリと混合する。過剰の磁性ナノ粒子アセンブリをその後除去し、標準的な方法に従い、細胞を洗浄及び凍結保存する。その後細胞を融解し、３Ｄ培養系において培養する。この方法により、研究及び治療で使用するための磁性化細胞の調製及び商品化が可能になるため、これは非常に便利である。
【００７５】
以下の方法を用いた。フラスコ中で、Ｔ−２５ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）を８０％コンフルエンスに達するまで生育させ、２００μｌの酸化鉄−Ａｕ−ＰＬで処理した。その後、約１２時間インキュベートした。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し（結合しなかった酸化鉄−Ａｕ−ＰＬを除去した）、トリプシン処理し、２つのバイアルに分注し、ＤＭＳＯを含む培地中に入れ、−８０℃で凍結した。翌日、長期間の保存用に、それらを液体窒素デュワー瓶の中に移した。
【００７６】
８１日後、３７℃の水浴中で２分、１つのバイアルを融解した。バイアルの中身を７．５ｍＬの培地で再懸濁した後、細胞を直径３５ｍｍの３つのシャーレに分注し、１０００Ｇの磁石を各シャーレの上に置いた。細胞を凍結保存から回収し、磁気浮遊による３Ｄにおいて数日間培養した。これらの細胞を用いて、十分に浮遊させた３Ｄ培養を成長させることができた。初代平滑筋細胞、初代線維芽細胞、膠芽腫細胞（ＬＮ２９９）、及び肝癌（Ｈ４ＩＩＥ癌細胞、肝細胞癌）を用いた同様の方法をもまた成功させた。したがって、その後の使用のために、磁性化細胞を予め調製することが可能である。
【００７７】
実施例：繰り返し処理
我々は又、細胞又は細胞抽出物を既にある３Ｄ培養に加えることにより、複数回の細胞浮遊を行うこともできる。このようにして、３Ｄ培養が成長するにつれ、培養中に様々な細胞又は細胞産物を濃縮することができる。
【００７８】
図８では、細胞（５１）を磁性ナノ粒子アセンブリ（５３）に加え、そして細胞を磁性化するために、この細胞と磁性ナノ粒子アセンブリを共にインキュベート（５５）する。次に、磁石（６１）を用いてこの磁性化細胞を浮遊させる（５９）。その後、細胞を４時間、一晩、又は数日間浮遊させておき（細胞型によって異なる）、細胞の浮遊を解除し、培地をｐｉｃｏｐｕｒｅ水（７３）と交換し、及び凍結融解により細胞を溶解した（７５）（細胞を液体窒素中に少なくとも１０分間おく）。あるいは、磁石（６１）を用いて細胞を培養シャーレ（６５）の底部に引きつけることもでき、この場合、この工程を１〜４回繰り返すことができる。その後、細胞（６７）若しくは細胞抽出物（６９）又は異なる細胞（７１）のいずれかを別の試料の中に戻し入れ、そして３Ｄ培養の工程を継続させることができる。写真は示されていないが、これらの手順は首尾よく示されている。
【００７９】
実施例：成形された培養物 我々はまた、磁場を変化させることにより、３Ｄ細胞培養の形を様々にすることができることを示した。プレートの底部に細胞を引きつける強力な磁石を用いると、密度の高い、良好に形成された細胞のシートが作られる（示されていない）。これを、その後磁場を反転することにより浮遊させることができる。我々はまた、磁石を傾斜させることにより、片側が厚くなった３Ｄ培養を作出した。トロイダル磁石の使用により、ドーナツ型の培養を作出した。
【００８０】
図９ａ〜ｅは例えば、磁場の強度または磁石とシャーレの距離を変化させることにより、細胞を異なった程度で圧縮することができる、または環状の磁石を用いてドーナッツ形が形成される、細胞培養のいくつかの例を示す。図１０及び図１１は、磁場を傾斜させることにより、片側が厚く形成された３Ｄ培養を示す。
【００８１】
我々はまた、そのようなドーナツ型又はシート上の細胞培養を重ねて、最終的にはより複雑な構造を形成することができると予測する。例えば、ディスクを重ねることにより、管様構造を作出することができるだろう。ディスクを重ね、その後一方又は両方の端にシートを被せることで区画を作出することができ、この区画を同じ又は異なる細胞型で充填することができるだろう。このようにして、より複雑な組織操作を達成することが可能である。
【００８２】
我々はまた、磁場を用いて細胞を移動させることができる。そのような移動は３Ｄ培養の特性及び組成に影響を及ぼし得る。細胞にヒドロゲル（磁性ナノ粒子アセンブリとしても知られている）を播種した場合には、永久磁石の動きによる、又は電磁石により生成される磁場の変化による、磁場の垂直及び／又は水平方向への移動は細胞が細胞培養プレートに直接接着することを防ぐ。この移動の回数は例えば、１Ｈｚ（１分間当たり６０回）から０．００１Ｈｚの範囲になるだろう。さらに、異なる細胞型は移動するゲルと非常に異なって相互作用をする可能性がある。垂直及び／又は水平方向への移動を組み合わせることにより、移動している材料の固さは、移動しているゲルに様々に接着する細胞の型をさらに決定するだろう。磁石に揺れる動きを加えることにより、この方法の変型を作り上げることができるだろう。この方法は、磁気浮遊による３Ｄ細胞培養を含むがこれらには限定されない磁気操作のために、細胞を調製する、分離する、及び識別するための有効な代替法である。
【００８３】
実施例：表面接触
上述の実施形態において我々は、この構成要素の緊密な混合物を提供するように、磁性ナノ粒子アセンブリと細胞を混合した。しかしながら、我々はまた、緊密な混合は必要ではなく、単に磁性ナノ粒子アセンブリに隣接するだけで、細胞は磁性ナノ粒子を取り込むであろうことを示した。このことは、細胞が磁性ナノ粒子アセンブリ材料を含まないことが必要な場合に有益である。
【００８４】
図１２は、磁性ナノ粒子アセンブリ（２００）を磁場に曝露する方法を図示するものである。これは、磁性ナノ粒子アセンブリを濃縮又は圧縮して、更に高密度の磁性フィルムにする効果がある。細胞（４００）をこのフィルム上に加えることができ、そして細胞は重力により、フィルム上に自然に沈殿するだろう。このフィルムへの接近により、細胞が磁性化されるだろう。その後細胞をフィルムから容易に浮遊及び分離することができ、そして３Ｄ培養中で細胞を浮遊させ、成長させることができる。我々はこの概念を様々な支持分子を用いて試験し、これが機能することを示した。
【００８５】
本明細書において開示及び請求する全ての組成物及び／又は方法は、本開示を考慮して、不当な実験を行うことなく作成及び実施することができる。本発明の組成物及び方法を好ましい実施形態の観点から記載してきたが、本発明の概念、精神及び範囲から逸脱することなく、組成物及び／又は方法並びに本明細書において記載した方法の工程及び工程の順序に変更を加えてもよいことは当業者には明らかであろう。より特定的には、同じ又は同様な結果が達成される限りは、本明細書において記載した薬剤と化学的に及び生理学的の両方に関連した特定の薬剤と置き換えてもよいことが明かだろう。そのような全ての類似した置換及び変更は当業者には明かであり、かつ、添付の請求項によって定義される本発明の精神、範囲及び概念の範囲内であると見なされる。
【００８６】
以下の参考文献、参照することによりその全体が本明細書に組み入れられる。
（１）Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｋ．；Ｉｔｏ，Ａ．；Ａｒｉｎｏｂｅ，Ｍ．；Ｍｕｒａｓｅ，Ｙ．；Ｉｗａｔａ，Ｙ．；Ｎａｒｉｔａ，Ｙ．；Ｋａｇａｍｉ，Ｈ．；Ｕｅｄａ，Ｍ．；Ｈｏｎｄａ，Ｈ． Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．２００７，１０３，４７２−８．
（２）Ｋｏｓｍｕｌｓｋｉ，Ｍ．；Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｓｕｒｆａｃｅｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ２００１．
（３）Ｍａｈｍｏｕｄｉ，Ｍ．；Ｓｉｍｃｈｉ，Ａ．；Ｉｍａｎｉ，Ｍ． Ｊ． Ｉｒａｎ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ２０１０， ７， Ｓｌ−Ｓ２７．
（４）Ｂａｃｒｉ，Ｊ．−Ｃ．；Ｐｅｒｚｙｎｓｋｉ，Ｒ．；Ｓａｌｉｎ，Ｄ．；Ｃａｂｕｉｌ，Ｖ．；Ｍａｓｓａｒｔ，Ｒ． Ｊ． Ｍａｇｎ． Ｍａｇｎ． Ｍａｔｅｒ． １９９０， ８５， ２７−３２．
（５）Ｄｏｕｚｉｅｃｈ−Ｅｙｒｏｌｌｅｓ，Ｌ．；Ｍａｒｃｈａｉｓ，Ｈ．；Ｈｅｒｖｅ，Ｋ．；Ｍｕｎｎｉｅｒ，Ｅ．；Ｓｏｕｃｅ，Ｍ．；Ｌｉｎａｓｓｉｅｒ，Ｃ．；Ｄｕｂｏｉｓ，Ｐ．；Ｃｈｏｕｒｐａ，Ｉ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｎａｎｏｍｅｄ． ２００７， ２， ５４１−５５０．
（６）Ｄｕｆｆ，Ｄ．Ｇ．；Ｂａｉｋｅｒ，Ａ．；Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｐ．Ｐ． Ｌａｎｇｍｕｉｒ １９９３， ９， ２３０１−２３０９．
米国特許第２００５０５４１０１号、国際公開第２００５０１０１６２号
米国特許第２００９１３７０１８号、国際公開第２００５００３３３２号
米国特許第２００６０６３２５２号、国際公開第２００４０８３４１２号、国際公開第２００４０８３４１６号
国際公開第２０１００３６９５７号
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００９年９月２５日に出願の米国仮特許出願第６１／２４５８４６号の優先権を主張し、またその全体は参照することにより本明細書に組み入れられる。
【０００２】
（後援研究に関する説明）
該当なし
【０００３】
（マイクロフィッシュ添付物への言及）
該当なし
【０００４】
本発明は、ナノテクノロジー、材料、生合成、医薬、細胞生物学、及び組織工学の分野に関する。より詳細には、本開示の組成物及び方法は、細胞を磁性化する方法、並びに磁場を用いた３Ｄ細胞培養、細胞操作、及び細胞のパターン形成の方法に関する。
【背景技術】
【０００５】
細胞操作、それらの環境の制御、及びｉｎ ｖｉｖｏ若しくは天然の細胞又は組織の応答を模倣する又は引き出すための条件の促進は、精力的に研究が行われている分野である。幹細胞及び再生医療の分野においては、細胞をｉｎ ｖｉｖｏで成長する天然の条件を再現するための方法及び材料が特に必要とされている。細胞がそれらの天然の環境から除かれるときに経験する状態は、それら新しい環境に細胞が適応するための変化である恒常性をもたらし、そのため細胞の変化が誘導される。これら過程の多くは融通性のあるもの又は可逆的なものではなく、そのため、細胞はそれらの天然の状態に戻ることはできない。細胞及び組織工学がその最大の可能性を達成することができるようになるためには天然の細胞環境をもたらす及び細胞の有害な変化を最小限にする又は制御する材料及び方法が強く望まれている。
【０００６】
現在、三次元（３Ｄ）細胞培養条件を支持することができる材料が開発中である。３Ｄ細胞培養技術での大部分の研究は、フラスコの回旋、細胞が接着することができる細胞外足場の利用、細胞を懸濁するための磁場の利用、又はこれらの方法のいくつかの組み合わせのいずれかを含んでいる。
【０００７】
例えば、米国特許第２００５０５４１０１号、国際公開第２００５０１０１６２号においてＦｅｌｄｅｒは、細胞が成長することができ、かつ、３Ｄ環境において細胞を支持することができる細胞外足場を形成する、ヒドロゲル基質について記載している。これは、細胞間相互作用を迅速に促進するというよりも、細胞と相互作用する、人工の基質を導入し、そして２Ｄ培養よりは改善されるが、足場は細胞を不安定にする傾向にあり、最終産物中に残存する。さらに、細胞はマイクロキャリア上又はマイクロキャリア中で成長することができるが、細胞が周囲にある全ての細胞と接触／相互作用することができる方法では、細胞は浮遊することができない。
【０００８】
煩雑な化学及び複雑な装置を必要とすることをはじめとする、Ｆｅｌｄｅｒのマイクロキャリアの製作に関連する複雑性は、全国規模で相当なレベルにある。さらに、マイクロキャリア製作における主要な試薬の１つであるアルギマトリクス（ａｌｇｉｍａｔｒｉｘ）はエンドトキシン源となる可能性がある。浮遊の促進には浮力の制御もまた関与しているようであり、マイクロキャリア中にガラス球を注入することにより制御されるが、ここでもまた複雑性及び問題が生じる。最後に、ガス交換を達成させるため、及びマイクロキャリアの凝集を防ぐために必要な撹拌には専門のハードウェアが必要であり、細胞の撹拌にはしばしばインペラが用いられている。しかしながら、撹拌によって生じる剪断応力が細胞損傷を引き起こすことが知られている。さらに撹拌は、３Ｄ培養のいずれの磁場形状の制御にも悪影響を及ぼす。
【０００９】
米国特許第２００９１３７０１８号、国際公開第２００５００３３３２号においてＢｅｃｋｅｒは、生物材料を引きつけることができる、磁化コア粒子のコーティングを使用し、それにより生物細胞を、磁化コア粒子へと接着させ、そしてそれらを磁場において懸濁することを可能にした。細胞培養の間も細胞ではコーティングが残り、このために培養中に天然のものではない要素が混入し、おそらく細胞が不安定になる。発明者らは、最終的には除去することができる生分解性コーティングの使用について企図しているが、それについては何も開示されていないためにこの方法が有効かどうかはわからない。さらに、細胞はマイクロキャリアのコアにおいて成長するため、細胞間相互作用を促進する目的で磁気浮遊により細胞をまとめることができる、個別の細胞の浮遊が起こるとは考えられない。したがって、マイクロキャリアを使用した場合に、細胞間接触による早い（数時間時間で）３Ｄ多細胞構造のアセンブリを提示することができるかははっきりとしない。また、マイクロキャリア上で細胞を成長させることによって、特に個々の細胞を浮遊させてその後それらを磁気でまとめることによって、異なる細胞型の共培養が示されていない。最後に、このシステムは扱いにくく、かつ、スケールアップ及びハイスループットな適用には適さないものである。
【００１０】
より良い方法は、細胞を一時的に磁性化し、それらの３Ｄ培養を可能にするものであろう。例えば、米国特許第２００６０６３２５２号、国際公開第２００４０８３４１２号、国際公開第２００４０８３４１６号においてＡｋｉｒａは、リポソームの取り込みによる細胞の磁性化に、磁性陽イオンリポソーム（ＭＣＬ）を使用している。その後、磁性化した細胞を、磁力を用いてプレート底部のシート中で生育させ、そして使用のために分離する。しかしながら、細胞のシートを生産することができるが、細胞は依然としてプレート底部で成長するため、これは磁気浮遊による真の３Ｄ培養ではない。さらに、「Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ−Ｓｅｅｄｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ Ｕｓｉｎｇ Ｍａｇｎｅｔｉｔｅ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｆｏｒｃｅ ｏｎｔｏ Ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅｄ Ｂｌｏｏｄ Ｖｅｓｓｅｌｓ ｆｏｒ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」という名称の最近の出版物においてＳｈｉｍｉｚｕ及びＡｋｉｒａらは、脱細胞化血管に細胞を播種するために磁気誘導を使用している１。この研究は有望な結果を示しているが、彼らは脱細胞化するための組織の提供源としては、磁性化した細胞を使用していない。磁性化した細胞を、脱細胞化血管の再細胞化に使用しているのみである。
【００１１】
Ｓｏｕｚａによる特許出願、国際公開第２０１００３６９５７号では、磁場に応答するナノ粒子を有するバクテリオファージを含む「ヒドロゲル」と細胞とを接触させることにより、磁場において細胞を浮遊させている。具体的には、ｆｄ、ｆｌ、のような線状ファージ又はＭ１３バクテリオファージが用いられている。この方法がどのようにして機能するかについては完全には明らかにされていないが、ファージが細胞をコーティングするゲル様構造又はアセンブリを生じ、そして、どのようにかして、細胞が磁気応答性ナノ粒子を取り込む又は吸着することを補助していると理論立てられている。従って、ヒドロゲルを洗い落とした後でさえも細胞の磁気応答性は維持され、適切な磁場で浮遊させることができる。しかしながら、大部分のヒドロゲルが洗い落とされるものの、ファージの感染又は遺伝子物質が移入する可能性が残るため、ファージを使用しないで細胞への取り込み又は吸着を可能にすることができる材料の提示が望まれている。
【００１２】
本開示は、天然の細胞環境をもたらす改良された材料及び方法を提供することにより、当該分野に存在する欠点を克服するものである。これらは、ナノ粒子ベースの材料を生成するための、並びに３Ｄ培養、細胞パターン形成、及び細胞の画像化を可能にする細胞を準備するための組成物及び方法の使用を含む。
【発明の概要】
【００１３】
本明細書で使用する場合、「正に帯電したナノ粒子」又は「正のナノ粒子」は、全体に正に帯電した２００ｎｍ未満、好ましくは１００ｎｍ以下の任意の粒子と定義される。好ましくは、この粒子は非毒性であるが、しかしこのことは、粒子が細胞に残留しないので、必須ではない。
【００１４】
本明細書で使用する場合、「負に帯電したナノ粒子」又は「負のナノ粒子」は、全体的に負に帯電した、２００ｎｍ未満、好ましくは１００ｎｍ以下、最も好ましくは約２〜２５ｎｍの任意の粒子、と定義される。好ましくは、この粒子は非毒性であるが、しかしこのことは、粒子が細胞に長期間にわたって細胞に残留しないので、必須ではない
【００１５】
本明細書で使用する場合、「磁気応答性エレメント」とは、磁場に応答する任意の要素又は分子であり得る。以下に詳細に記載するように、ナノ粒子のうちの１つは磁気応答性エレメントを含む、又は磁気応答性エレメントでなければならない。
【００１６】
本明細書で使用する場合、「支持分子」とは、マット状の繊維構造又はゲルを作るようにナノ粒子と相互作用し、そのようにして、取り込みのために細胞のごく近くに磁性ナノ粒子を保持する、任意の長い分子を指す。
【００１７】
本明細書においては以下の略号を使用する：
【表１】
【００１８】
一般的に言えば、本発明は、細胞が磁気応答性エレメントを取り込む又は吸着することを可能にし、その結果、磁場をかけた場合に、細胞培養中で細胞を浮遊可能にする、新しい材料である。この材料は、正及び負に帯電したナノ粒子を含み、このうちの１つは酸化鉄のような１つ以上の磁気応答性エレメントを含まなくてはならない。これらのナノ粒子はさらに、細胞によってナノ粒子が取り込まれる又は吸着される位置のそれらを保持する、帯電したナノ粒子及び細胞を支持する機能をもつポリマー、好ましくは天然の又は細胞由来のポリマー、又はその他の長分子（本明細書においては「支持分子」と呼ばれる）と組み合わせられる。正及び負のナノ粒子の両方を含むことは、ナノ粒子の緊密な混合及び３種類の構成要素の会合の促進を可能にし、その結果、均一な分布及び良い取り込みを確実にする。支持分子は、細胞の磁気応答性エレメントの取り込みを可能にする繊維性のマット様構造として、３種類の構成要素全てと細胞とを緊密に組み合わせる。
【００１９】
インキュベート期間の後に、この材料を洗浄して除去することができる。これにより細胞を磁場において操作することが可能になる。代替の工程は、細胞数と磁性ナノ粒子の量との間の比率を上昇させることにより、磁性材料の取り込みを最適化又は調整する工程である。大量の細胞が存在する場合、それらは磁性ナノ粒子の大部分を取り込むため、特に残りの支持分子及び／又はナノ粒子が細胞にとって非毒性及び／又は有益な場合には、残った物質を洗浄する工程は必要ではない場合もある。このことは特に、支持分子が１つ以上の細胞外マトリックスタンパク質、糖タンパク質又はポリサッカライドを含む場合に事実である。磁性粒子は最終的に細胞から分離され、細胞を完全に天然の状態に残す。
【００２０】
単純な３Ｄ培養に加えて、細胞の形、パターン形成及び挙動を操作するために磁場を用いることができる。例えば、トロイダル（ワッシャー型の）磁石を使用することにより、細胞の同様の形状への会合を促進することができ、又は傾斜磁場は３Ｄ細胞培養の片側を厚くすることができる。我々はまた、生育の期間中、培養皿の底部に強力な磁石を置くことにより、固くて高密度の細胞のシートを作成した。磁場を逆にすることのみにより、その後シートを浮遊させることが可能であり、そして我々は、その後シートを３Ｄ培養中で培養し続けることができる。様々な形を組み合わせ、３Ｄ培養を継続することもまた可能であり、かくして、より複雑な形を３Ｄ培養において作出することができる。
【００２１】
磁気応答性エレメントは、例えば希土類磁石（例えば、サマリウムコバルト（ＳｍＣｏ）及びネオジム鉄ボロン（ＮｄＦｅＢ））、セラミック磁石材料（例えば、ストロンチウムフェライト）、磁性元素（例えば、鉄、コバルト、及びニッケル並びにそれらの合金及び酸化物）のような磁場に応答するであろう、任意の元素又は分子であってもよい。特に好ましいものは、磁場に応答する常磁性材料であるが、材料の会合を容易にすることを可能にするので、それらは磁石そのものではない。
【００２２】
好ましくは、そのような細胞の浮遊に用いる磁場は約３００Ｇ〜１０００Ｇである。しかしながら磁場強度は、細胞からの距離、並びに細胞によって取り込まれる又は吸着される磁気応答要素の量及び型の両方によって変わる。従って、最適な磁場強度は様々となるであろうが、経験的に容易に決定される。
【００２３】
負に帯電したナノ粒子は、電荷の安定した金属（例えば銀、銅、白金、パラジウム）を含むが、好ましくは金のナノ粒子である。
【００２４】
正に帯電したナノ粒子は、界面活性剤又はポリマーが安定化した若しくはコーティングされた合金及び／又は酸化物（例えば鉄元素、鉄−コバルト、ニッケル酸化物）を含み、好ましくは酸化鉄のナノ粒子である。
【００２５】
２つのナノ粒子のうちの１つは磁気応答性でなくてはならないが、明かにどちらの一方がこの特徴を有し得る。
【００２６】
ナノ粒子はナノ単位の大きさを有するため、約１００ｎｍである。しかしながら、大きさは約５〜２５０ｎｍ、５０〜２００ｎｍ、７５〜１５０ｎｍの間の範囲であり得るが、使用する細胞型への取り込み又は吸着を可能にするために適当な大きさである限り、それらはより小さくても又はより大きくてもよい。本明細書において我々は、磁性ナノ粒子の有効な大きさには上限があることを示し、また、複数の機能が依然として観察されるが、マイクロメーターサイズでは効果的となるには大きすぎることを示した。
【００２７】
「支持分子」は通常、緊密な混合物中にナノ粒子及び細胞を保持するのに役立つ、ポリマー又はその他の長分子である。支持分子は正に帯電したものであっても、負に帯電したものであっても、両方の電荷を有するものであっても、又は帯電していないものであってもよく、及び１つ以上の支持分子の組み合わせであってもよい。
【００２８】
そのような支持分子の例としては、ペプチド、ポリサッカライド、核酸などのような天然のポリマーが挙げられるが、合成のポリマーもまた使用することができる。特に好ましい支持分子としては、ポリ−リシン、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ＢＳＡ、ヒアルロナン、グリコサミノグリカン、アニオン性、非硫酸化グリコサミノグリカン、ゼラチン、核酸、細胞外マトリックスタンパク質混合物、マトリゲル、抗体、並びにその混合物及び誘導体が挙げられる。
【００２９】
一般的に言えば、支持分子の濃度は、負及び正に帯電したナノ粒子の濃度よりも大幅に高く、１〜１０００倍高い、１０〜５００、又は２０〜２００倍高い範囲である。しかしながら、どの細胞型を用いるか並びにどの支持分子及びナノ粒子を用いるかによって、より高い又はより少ない量にすることも可能である。ポリマーの長さが長くなるほど、取り込みのための場所にナノ粒子を保持するのに十分な構造を形成するために必要な量はより少なくなるだろう。
【００３０】
通常、ナノ粒子は非常に低い濃度で用いられる。濃度は、１０−１２〜１０−６モル濃度の範囲になり得るが、好ましくはナノモル濃度の範囲であり、かつ、支持分子の濃度は１０−９〜１０−３モル濃度であり、好ましくはマイクロモル濃度の範囲である。
【００３１】
３種類の構成要素は静電相互作用によって会合するため、ポリ−リシンのような帯電した、又は両方に帯電した支持分子が好ましい。しかしながら、構成要素及び／又は細胞の相互作用をさらに促進するために、３種類の構成要素のいずれをも官能化、誘導体化又はコーティングすることができる。従って、１つ以上の成員を、例えば、細胞表面抗原に結合する抗体を用いて、官能化、誘導体化、又はコーティングすることができる。従って、構成要素及び／又は細胞間の相互作用がさらに促進されるだろう。他の結合対には、受容体−リガンド、ビオチン−ストレプトアビジン、相補的な核酸、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、シアル酸含有分子などが含まれる。
【００３２】
コーティングは、ＰＶＰ、デキストラン、ＢＳＡ、ＰＥＧなどのような、特にナノ粒子のための、防御的又は保護的なコーティングをもまた含み得る。ナノ粒子、特に磁気応答性エレメントを含むナノ粒子を可視化のために、例えばフルオロフォア、放射性標識などを用いて、特に磁性化細胞及び組織の開発及びｉｎ ｖｉｔｒｏでの試験の段階で標識することができる。しかしながら、治療上での使用においては、そのような標識を省略することが好ましいだろう。
【００３３】
その他の実施形態において組成物は、幹細胞、癌細胞、初代細胞、哺乳類細胞、ヒト細胞、新鮮な組織から直接抽出された細胞、細菌、酵母、植物細胞、又はその混合物を含むがこれらには限定されない、その後磁場において浮遊させる又は操作する細胞を含む。
【００３４】
本開示は、１つ以上の本開示の組成物と細胞とを混合すること、及び磁場の存在下でこの混合物を培養する、パターンを形成させる、又は操作することを含む、３次元で細胞を培養する、細胞のパターンを形成する及び細胞を画像化する方法をもまた提供する。磁場は培養容器の上にあっても下にあってもよく、培養容器の近く若しくは遠くにあってもよく（例えば、より強い若しくはより弱い）、傾斜していても若しくは横になっていてもよく、又は磁場の形状は多様であり得、又はそれらの１つ以上を組み合わせたものであってもよい。このようにして、特定の目的を達成するために細胞をパターン形成させる又は移動させることができる。
【００３５】
上述したシステムについての我々の広範な研究により、先行技術の方法に対する数多くの改良点を利用可能であることがここに示された。第一に、自己会合製造化学（ｓｅｌｆ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）が方法を単純に、かつ、再現可能にし、また、磁性ナノ粒子アセンブリの製造又はそれにつづく細胞の磁性化、細胞操作又は３Ｄ培養に専門の装置を必要としない。必要とされるものは、磁場、ピペット、容器及びホットプレートのみであった。従って、この方法は大規模及びハイスループットにも応用可能である。
【００３６】
ポリ−リシンなどの支持分子が容易に合成できることから、望まれる場合には、ファージ又は細胞産物のような生物的な分子を含めずに磁性ナノ粒子アセンブリを作成することができる。それであっても、全ての構成要素が通常非毒性であることから、費用も高くなく、また作成も容易である。さらに、繊維性のマット様構造は、ナノ粒子磁気アセンブリに含めるための、追加の細胞支持分子（細胞外マトリックス要素のような）の組み込みを可能にする。
【００３７】
磁性ナノ粒子アセンブリを用いた細胞を磁性化は、一般的な培地中の細胞にアセンブリを加えることのみを含む。磁性ナノ粒子を処理して数分（５分）以内に細胞を磁性化することができ、また、付着した又は懸濁された細胞を磁性ナノ粒子アセンブリで処理することができる。磁性ナノ粒子での処理の前又は処理後に細胞を凍結保存することができるが、この方法はそれでも機能する。必要な場合には、磁性化細胞を使用する前に、磁性ナノ粒子アセンブリを洗い落とすこともでき、残った細胞は依然として浮遊する。
【００３８】
磁気浮遊によって細胞を３Ｄで浮遊させる工程及び培養することは、標準的な２Ｄでの細胞培養に必要なもの以上には、専門の又は費用のかかる装置又は方法（撹拌又は浮力の維持のためのような）のいずれをも必要とせず、また、磁気で浮遊させた３Ｄ細胞培養の形状の制御は、磁場の形状を変化させることにより達成することができる。最終的に、またおそらくは最も重要なことに、本発明は細胞の浮遊により、早い（秒及び分単位の）細胞間相互作用、及び細胞を３Ｄの多細胞のクラスターとして数分以内に会合させることを促進し、そして、磁場を操作すること及び／又は磁気により異なる細胞型の細胞を接触させることにより、複雑な培養構造を作成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】ナノ粒子アセンブリを生成するための、直接会合法の模式図である。この図では、１が負に帯電したナノ粒子、３が正に帯電したナノ粒子、及び５が支持分子であり、そして完成した磁性ナノ粒子アセンブリが７である。３つの構成要素はどの順番で組み合わせてもよいが、ここでは最初にナノ粒子を組み合わせ、次に支持分子を加えたものを示す。
【図２】変異型磁性ナノ粒子アセンブリ１９を示す模式図である。正のナノ粒子が１５、負のナノ粒子が１７であり、２１及び２３は２つの異なる支持分子、例えば、ポリ−リシン（＋電荷）及びグルタミン酸及び／又はアスパラギン酸（−電荷）塩を多く含むペプチドを表し、又は別の例としては、ラミニン及びフィブロネクチンを表す。
【図３】磁性酸化鉄及び金のナノ粒子及び右側に列挙した様々な支持分子からなる実際のナノ粒子アセンブリの吸収スペクトルである。
【図４】例示となるＦｅ０２−Ａｕ−ＰＬナノアセンブリの暗視野画像（ａ）及びハイパースペクトル画像（ｂ）である。
【図５】図５ａ〜ｄは、１０ｘに拡大した明視野及び蛍光画像を示す。ａは、ＩｇＧ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８支持分子用いた明視野画像である。ｂは同じ視野の緑色蛍光画像である。ｃはマウスＩｇＧ及び抗マウスＩｇＧＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５支持分子を用いた場合の明視野写真であり、ｄは同じ視野の赤色蛍光画像である。
【図６】図６ａ〜ｄは、ａ＝ＰＬ、ｂ＝ＣＯＬ、ｃ＝ＬＡＭ、ｄ＝ＮＴを含む、異なる組成の磁性ナノ粒子アセンブリを用いて処理した後に浮遊させている、ＨＥＫ２９３細胞の写真である。
【図７】動物由来の細胞又は体液の本発明の方法での使用を示す模式図である。
【図８】既に成長している試料に加える、本発明由来の細胞又は抽出物の繰り返し使用を示す模式図である。
【図９】本発明の方法を用いて細胞の密度及び形状を操作する、数例を示す写真である。
【図１０】磁場を非対称にすることによる、３Ｄ培養の厚さの変化を示している。
【図１１】図１０の方法の一例を示す写真である。
【図１２】細胞の磁性化のために磁気フィルムを使用する場合の模式図である。ここで、細胞は磁性ナノ粒子アセンブリと緊密に混合されず、その表面上に乗せられるのみである。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本開示は、負に帯電したナノ粒子、正に帯電したナノ粒子、及びポリマー若しくは長分子、又は金属に結合したポリマー若しくは分子を含む、組成物を提供する。以下の実施例は本発明を説明するためだけのものであり、本発明の範囲を不当に限定するものではない。
【００４１】
実施例１：磁性ナノ粒子アセンブリ
図１は、負のナノ粒子（１）及び正のナノ粒子（３）（少なくとも１つのナノ粒子は磁気を帯びている）及び支持分子（５）を組み合わせることにより、磁性ナノ粒子アセンブリ（７）を調製する一般的な模式図を示すものである。
【００４２】
ナノ粒子を別々に、水又は低イオン強度緩衝液（塩濃度＜１０ｍＭ）中、望まれるｐＨで混合することにより、ナノ粒子溶液を調製する。粒子表面の電荷は、適切なｐＨを選択することにより調節することができ、ここでｐＨが低い緩衝液（クエン酸又は炭酸緩衝液など）は通常、ナノ粒子全体の電荷を上昇させることができる。対照的に、ｐＨが高い緩衝液（ホウ酸緩衝液など）は通常、粒子全体の電荷を下げることができる。理想的には、各溶液についてのｐＨの選択により、２つの粒子間の電荷が反対になる。このことは、異なる組成のナノ粒子が一般的に異なる等電点を有することにより達成することができる。
【００４３】
例えば、酸化鉄の型に依存してｐＨが３．３〜８の範囲で変化し得る２酸化鉄ナノ粒子とは対照的に、Ａｕナノ粒子は多くの場合、クエン酸塩又は塩化物を吸着したイオン存在のために、ほとんどのｐＨ値で負に帯電する。そのため、ｐＨ４では、Ａｕナノ粒子は負に帯電すると予想され、酸化鉄ナノ粒子は正に帯電するはずである。ナノ粒子全体の電荷を決定することができる、デキストラン、ポリ−エチレングリコール、又はチオールのような分子を用いてナノ粒子をコーティングすることもまた可能である。正に帯電した、負に帯電した、両方の電荷をもつ、又は帯電していない支持分子を用いた会合を確実にするためには、、電荷の不一致が望ましい。
【００４４】
支持分子（５）溶液は通常、それらを水又は所望のｐＨ、好ましくは低イオン強度（好ましくは、塩濃度＜１０ｍＭであるが、確実に分子を溶解するために必要な場合には、塩濃度をより高くしてもよい）の緩衝液（クエン酸、リン酸、ホウ酸など）に溶解する又は混合することにより調製される。低イオン強度は通常、電荷遮蔽を低減するために望ましく、そのため、反対の電荷を有するナノ粒子及びポリマーの間の電荷相互作用を促進する。支持分子（５）の濃度は通常、ナノ粒子の濃度（１０ｎＭ〜１ｍＭの範囲であるが、他の濃度を用いることもできる）を上回るべきであり、一般には、ナノ粒子（１）及び（３）のモル濃度に対して１０倍上回るべきである。
【００４５】
さらに詳細には、支持分子は、磁性ナノ粒子の細胞への接着性の向上（ポリ−リシンなど）；細胞培養環境の改善（コラーゲン及びラミニンのような細胞外マトリックスタンパク質の使用などにより）；特定の分子（ＤＮＡ、薬剤、リガンド、標識などのような）の細胞への送達を可能にする；シグナルレポーター（蛍光標識のような）としての機能をもたらす；及び／又は、磁性ナノ粒子アセンブリの細胞／組織への生体適合性の改善（例えば、栄養の維持又は適合する免疫表面の提供などにより）、のような機能性をアセンブリにもたらすことができる。
【００４６】
図２は、負に帯電したナノ粒子（１７）及び正に帯電したナノ粒子（１５）が、２つの支持分子（２１、２３）により保持されている、磁性ナノ粒子アセンブリ（１９）を示す。支持分子対の一例としてはラミニン及びフィブロネクチンが考えられ、別の例としては抗体及び抗原も考えられる。
【００４７】
我々は様々な磁性ナノ粒子アセンブリを調製し、様々な培地中の様々な細胞を用いてその機能を試験した。表３は、試験した構成要素の種類を示す。
【表２】
【００４８】
図３は、様々なアセンブリの吸収スペクトルを示すものである。ナノ粒子と様々な支持分子の間の静電架橋のレベルを変化させることにより、異なる溶液間の消衰スペクトルの変化が生じる。ラミニン（５）、コラーゲン（７）、及びＦｕＧＥＮＥ−ＧＦＰ（２１）のスペクトルを例外として、これら全てのスペクトルは、Ａｕナノ粒子の特性吸収からもたらされる、およそ５６０ｎｍに中心をもつ、広い肩を示す。Ａｕナノ粒子スペクトルにと比較して平坦なスペクトル特性は、多分散酸化鉄ナノ粒子（通常１００ｎｍより小さい）が含まれること及びその広い消衰スペクトルによってもたらされるものである。ラミニン（５）及びコラーゲン（７）のスペクトルは、細胞外マトリックス構成要素を用いて調製したナノ粒子アセンブリについてのものである。ＦｕＧＥＮＥ−ＧＦＰ（２１）と命名したスペクトルは、ＧＦＰレポーター分子をコードしているＤＮＡプラスミドをローディングした、ＦｕＧＥＮＥ（リポソーム）を用いて調製したナノ粒子アセンブリについてのものである。（２１）のトレースにおいて、２６０ｎｍにＵＶの肩があることが、ＤＮＡプラスミドの存在を示してしている（ＤＮＡは２６０ｎｍにおいて吸光する）。
【００４９】
図４は、例示となるＦｅＯ２−Ａｕ−ＰＬナノアセンブリの暗視野画像（ａ）及びハイパースペクトル画像（ｂ）を示す。ハイパースペクトル画像処理は、暗視野での顕微鏡像と画像化した試料の散乱光（４００〜１０００ｎｍ）の波長分解スペクトルを組み合わせた、光技術である。この技術により、光散乱特性に基づいてナノ材料の特定が可能になる。単分散ナノ粒子からは１つのピークが予測されるが、ここでは、スペクトルの予想される広がりは、酸化鉄ナノ粒子及びそれらのアセンブリが含まれことによるものである。スペクトルは広がっているが、それでもなお、組織中のこれら試料を特定するために十分なスペクトル分解を提供する。従って、この方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでアセンブリをモニタリングするための方法である。
【００５０】
次に図５を参照すると、蛍光タンパク質共役体を結合体支持分子（ｂ、ｄ）として用いて調製した磁性ナノアセンブリ（ａ、ｃ）からの蛍光シグナルである。ａ及びｃの画像に示されるナノ粒子アセンブリは、図１Ａのスキームを用いることにより、金及び酸化鉄ナノ粒子、並びにＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５５５ロバ抗マウスＩｇＧ及びタンパク質マウスＩｇＧを二重支持分子として用いて生成したものである。最初に金及び酸化鉄を混合し、次にタンパク質であるマウスＩｇＧを加え、磁性ナノ粒子アセンブリを形成させた。その後、二番目の／別の工程において、蛍光を示す抗体であるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５５５ロバ抗マウスＩｇＧと共にアセンブリをインキュベートした。このようにして、磁性ナノ粒子アセンブリを標識し、その使用中に、モニタリングすることができる。
【００５１】
図６ａ〜ｄは、図１に示した方法で生成した、異なる組成の磁性ナノ粒子アセンブリを用いて処理した後に浮遊させている細胞を示す写真である。用いた手順は以下の通りである：最初に、Ｘｍｇ／ｍｌの、直径およそ７４ｎｍのＡｕナノ粒子溶液（クエン酸還元により生成した、波長５４８ｎｍでの消衰が４．１である）６ｍｌを、ｐｉｃｏｐｕｒｅ水に溶解した、１．０ｍｇ／ｍｌの多分散酸化鉄ナノ粒子溶液３ｍｌと混合することにより、酸化鉄−Ａｕアセンブリを生成した。次に、１．０ｍｌの酸化鉄−Ａｕ混合物を、ｐｉｃｏｐｕｒｅ水に溶解した、それぞれ別々のポリ−リシン（０．０００１％）、コラーゲン（３０μｇ／ｍｌ）、ラミニン（１０μｇ／ｍｌ）、又はオリゴヌクレオチド（１μｇ／ｍｌ）溶液１．０ｍｌに素早く加えた。
【００５２】
支持分子と混合した後、溶液を一晩インキュベートした。磁性ナノ粒子アセンブリを、磁石を用いて底部に引き寄せながら、上清画分を磁気分離によって除去し、そして上清を廃棄した。未反応の過剰の試薬を除去するために、磁性ナノ粒子アセンブリを各回につき５ｍｌのｐｉｃｏｐｕｒｅ水で、２度洗浄した。その後これを５ｍｌのｐｉｃｏｐｕｒｅ水中、４℃で保存した。
【００５３】
最後に、０．５ｍｌのナノ粒子アセンブリを入れた１５ｍｌのコニカルチューブに５ｍｌのＨＥＫ２９３細胞（５０，０００細胞／ｍｌ）を注意深くピペットで加えた。この混合物をピペットでゆっくりと撹拌し、５分間インキュベートし、沈殿させた。コニカルチューブ中の細胞を５分間インキュベートして沈殿させ、その後上清を除去し（コニカルチューブ中に置いた）そして、培地と交換した。この洗浄過程を２回以上繰り返した。
【００５４】
結合していないナノ粒子よりも、ナノ粒子アセンブリに結合した細胞の方が非常に早く沈殿するため、結合していないナノ粒子は上清と共に除去された。上清の入ったコニカルチューブの底部に磁石を配置することにより、結合していないナノ粒子を上清中で視覚的に検出することができ、ナノ粒子は磁気沈降により可視化され得る。３回目の洗浄の後には、上清は遊離磁性ナノ粒子アセンブリを含んでいないようであった。細胞をその後３．５ｃｍのシャーレに移し、環状のネオジム磁石（２０ｘ（８．５ｘ４．５）ｘ７ｍｍ；磁気引力：１３ポンド）を用いて浮遊させた。どの支持分子を用いたかに関係なく、磁場をかけることにより、全ての細胞が数分以内に３Ｄ培養中に浮遊し、融着した。本明細書においては、その他の多くの支持材料について試験し、全てが機能したが、いくつかの結果についてのみを示す。
【００５５】
実施例：構成要素分子
本明細書において我々は、Ｆｅ２Ｏ３ナノ粒子のみ（＜５０ｎｍ粒子サイズ）、Ａｕ−（Ｆｅ２Ｏ３）ナノ粒子、及びＰＬ−ＡＵ−（Ｆｅ２Ｏ３）の完全な磁性ナノ粒子アセンブリについて試験することにより、磁性ナノ粒子アセンブリの様々な構成要素の重要性についてもまた実証した。
【００５６】
同一量の、又は５，０００細胞当たりおよそ１．０μｌの酸化鉄磁性ナノ粒子を含む試料を用いて細胞を処理し、５００Ｇの磁石を用いて浮遊開始直後、及び３００Ｇ又は５００Ｇの磁石を用いて磁気浮遊により７日間培養した後に顕微鏡写真を撮影した（データは示さない）。
【００５７】
初日には全ての細胞を浮遊させることができたが、特に５００Ｇの磁石を用いて培養した場合、ＰＬ−ＡＵ−（Ｆｅ２Ｏ３）を用いて処理した試料がより大きく、より集まった３Ｄ構造を示した。したがって、３種類全ての構成要素が、３Ｄ構造となるのに有効な細胞浮遊及び会合に必要である。ナノ粒子のみの場合にはより低い能力が示されたが、それでもなお、図１の実施形態のものよりも、少ない操作しか必要としないナノ粒子を用いて処理した細胞では浮遊させる及び培養させる能力には価値がある。
【００５８】
実施例：細胞への材料送達
我々はまた、磁性ナノ粒子アセンブリが材料を保持する、及び材料を細胞に送達する能力について示した。原理の証明として、ＨＥＫ２９３細胞をＧＦＰ ＤＮＡを有する磁性ナノアセンブリを用いて処理及び浮遊させ、その後、浮遊した３Ｄ細胞培養中の細胞の内部でのＧＦＰの蛍光シグナルを検出した。
【００５９】
より詳細には、ＤＮＡを有する磁性ナノアセンブリの調製方法は以下の通りであった：最初に、製造業者（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ トランスフェクション試薬）の説明に従って、２mｇのＧＦＰプラスミドＤＮＡ（ＤＮＡ）を無血清ＤＭＥＭ培地２００μｌに溶解し、ＦｕＧＥＮＥ溶液を調製した。
【００６０】
次に、６μｌのＦｕＧＥＮＥ溶液を、希釈したＤＮＡ溶液（ＦｕＧＥＮＥ−ＤＮＡ）２００μｌに直接加えた。この混合物を室温で１５分間静置した。その他に２つの試料を調製した：１つは無血清ＤＭＥＭ培地２００μｌに直接６μｌのＦｕＧＥＮＥを加えたもの（ＤＮＡなし、負の対照、本明細書においてはＦｕＧＥＮＥと呼ぶ）であり、もう１つは、無血清ＤＭＥＭ培地２００μｌに４μｇのＤＮＡを加えたものである（本明細書においてはＤＮＡと呼ぶ）。その後、Ａｕ及び酸化鉄ナノ粒子溶液（Ａｕと混合する前の酸化鉄は１ｍｇ／ｍＬ）を割合が２：１（ｖ／ｖ）、３ｍｌになるように合わせてしっかりと混合し、そして１００μｌのＦｕＧＥＮＥ−ＤＮＡ、１００μｌのＦｕＧＥＮＥ、及び１００μｌのＤＮＡに直接加えた。
【００６１】
この溶液をよく混合し、４℃で一晩インキュベートした。一晩インキュベートした後、ナノ粒子を沈殿させた。磁性酸化鉄及び金ナノ粒子からなるナノ粒子アセンブリ、並びにそれらナノ粒子を含まない上清（ナノ粒子を沈殿させた後に回収した）の消衰スペクトルを得た。それらの高いＵＶ吸収から、ＤＮＡ及び／又はＦｕＧＥＮＥが取り込まれたことが示された。上清のスペクトルは、混合した試料よりも低い吸収を示し、このことはＤＮＡ及びＦｕＧＥＮＥがナノ粒子アセンブリに取り込まれたことを示している。
【００６２】
磁性ナノ粒子アセンブリを細胞に加え、この細胞を上述のように浮遊させ、そして浮遊した細胞をその後撮影した。ＤＮＡを有する両方の系においてＧＦＰ蛍光シグナルが見られることは（データは示さない）、これらの磁性ナノ粒子アセンブリが、磁気浮遊によりこれら細胞を３Ｄで磁性化および培養している間に、ＤＮＡを保持する及びＤＮＡを細胞に送達することができる能力を示している。この結果は、磁性ナノ粒子アセンブリが細胞を磁性化すること、及びＤＮＡ又は薬剤のような機能物質を細胞に送達することの両方が可能であることを立証するものである。
【００６３】
実施例：初代細胞の浮遊
多くの場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏで初代細胞を培養することは難しいものであるが、我々は酸化鉄−Ａｕ−ＰＬを用いて初代細胞を磁性化した後に、磁気浮遊により３Ｄにおいて、それらの培養を成功させた。
【００６４】
Ａｕナノ粒子、ＰＬ、及び異なる酸化鉄ナノ粒子を含む、様々な磁性ナノ粒子アセンブリを作成した。様々な酸化鉄は、Ｆｅｒｒｉｄｅｘ−ＰＬ、酸化鉄−Ａｕ−ＰＬ（＜５０ｎｍ）、酸化鉄−Ａｕ−ＰＬ（〜５ｎｍＡｕ）、及び酸化鉄−Ａｕ−ＰＬ（＜５μｍ、マイクロ粒子の一例として）であった。Ｆｅｒｒｉｄｅｘはデキストランでコーティングされた超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯＮ）からなる。以下のものに関して特定の分子又は表面が実効電荷を持たない等電点（ｐＩ）又はｐＨは以下の通りである：ＳＰＩＯＮ、７３−５；磁鉄鋼（γ−Ｆｅ２Ｏ３）、３．３〜６．７２；及び磁鉄鋼（Ｆｅ３Ｏ４）、６．５〜６．８２。
【００６５】
異なるナノ粒子アセンブリとしては以下のものを用いた：１１．２ｍｇ／ｍＬのＦｅｒｉｄｅｘＩ．Ｖ．（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ、Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、酸化鉄（ＩＩＩ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、５４４８８４、粒子サイズ＜５０ｎｍ、Ｆｅ２Ｏ３。この製品は、主にγ形態の磁鉄鉱を含むが、天然の鉱物形態にはアルファ形態及びガンマ形態の両方が含まれる。我々はまた、酸化鉄（ＩＩ、ＩＩＩ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、３１００６９、＜５μｍ、Ｆｅ３Ｏ４、磁鉄鉱）も用いた。３種類全ての鉄試料を１ｍｇ／ｍＬになるように水に希釈して解析用溶液とした。Ｄｕｆｆら６に従って、約５ｎｍのＡｕコロイドを調製した。
【００６６】
酸化鉄−Ａｕ−ＰＬの調製には、個別に準備した、１．００ｘ１０−３〜３．１２ｘ１０−５％の範囲の濃度でポリ−Ｌ−リシン（ＰＬ）水溶液を連続して６回希釈することを含んだ。等量の、比率１：１（ｖ／ｖ）のＡｕ及び酸化鉄ナノ粒子溶液をそれぞれの希釈液に加えた。一晩インキュベートした後、ナノ粒子をそれぞれのバイアルの底部に沈殿させ、上清の半量を除去した。最も低い希釈倍率の希釈液から始め、連続希釈混合液を混ぜあわせ、次に希釈倍率が低い希釈液と順に混合していき、全ての溶液が１つのバイアル中にまとめられるまで行った。最終的なＰＬ濃度は１．２４ｘ１０−３％となった。
【００６７】
試薬を連続希釈した試料にして混合することにより、より高い希釈倍率の希釈液由来の結合しなかった試薬がアセンブリ中に組み込まれるようになる。また、多くの場合異なる希釈液は、はっきりと異なる光学的、構造的、接着、及びその他の物理的特性を示すため、異なる希釈倍率の希釈液を混合することにより、これらの特性を統合することができる。そのような特性の統合がしばしば求められる。一方この過程は、応用によって異なる、最適な条件を決定及び選択するための良好な目視検査である。例えば、１つ又は複数の希釈液はプラスチック又はピペットに対する粘着性を有する可能性がある。
【００６８】
４種類のヒト初代肺細胞（ＳＣＩＥＮＣＥＬＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ（商標）Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を酸化鉄−Ａｕ−ＰＬアセンブリを用いて処理し、その後３Ｄで培養した。この過程には、これらの細胞を単層から約８０％コンフルエンスに達するまで２Ｄの細胞培養フラスコにおいて培養することを含んだ。その後、酸化鉄−Ａｕ−ＰＬ溶液をフラスコ中の細胞に加え（濃度範囲は１．５６〜１３．００μＬ／ｃｍ２）、細胞とインキュベートした。インキュベート時間はおよそ一晩（又は約１２時間）とした。その後初代細胞をＰＢＳで洗浄した（結合しなかった酸化鉄−Ａｕ−ＰＬを除去した）。最後に細胞をトリプシン消化により分離して３．５ｃｍシャーレに移し、最終的に、環状のネオジム磁石（２０ｘ（８．５ｘ４．５）ｘ７ｍｍ；磁気引力：１３ポンド）を用いて浮遊させた。
【００６９】
細胞本来の接触が接着した細胞を用いた場合にさえも、異なる形態及び大きさの酸化鉄を用いて調製された４種類全ての型のナノアセンブリは細胞に付着し、細胞を容易に浮遊させることができた（データは示さない）。しかしながら、より大きな酸化鉄（＜５μｍ、Ｆｅ３Ｏ４、磁鉄鉱）を用いて調製したアセンブリは、その他のものが形成するほど大きくて凝集した細胞構造を形成しなかった。このことは、細胞が取り込むことができる磁気応答性エレメントの大きさには上限があることを示している。ここで、細胞中に容易には侵入しないより大きな酸化鉄粒子があることにより小さい細胞クラスターが生じる可能性が高く、そのため、細胞はあまり磁性化されず、そのようなより大きなサイズの粒子は細胞表面を覆い、細胞間相互作用を妨害又は損なう可能性もまたある。
【００７０】
実施例：ｅｘ ｖｉｖｏでの細胞浮遊
図７を参照すると、血液、血清、血漿、又は凝集していない組織細胞（４３）を含むがこれらには限定されない、動物又はヒトから採取した任意の細胞（４１）をナノ粒子（４５）と混合し、その後、それらを共に３０秒から４８時間インキュベートする。インキュベートの間に、この試料（４３）及びナノ粒子（４３）は、ナノ粒子アセンブリ（４７）を形成するように、試料及びナノ粒子中に含まれる任意のタンパク質、ＤＮＡ又はポリサッカライドと静電的に相互作用する。次にこの磁性ナノ粒子アセンブリ（４７）を磁力、遠心分離、及び／又は沈降により分離させる。この過程で上清を混合物から分離し、そして残った磁性化細胞を操作するために磁石を用いる。
【００７１】
さらに図７を参照すると、このナノ粒子アセンブリは、血液又はその他の試料（４３）中に含まれる任意のタンパク質、ＤＮＡ又はポリサッカライド間の相互作用により生成される。相互作用の種類には、静電的な性質による相互作用、共有（チオール官能基及び／又はその他の架橋剤）、短距離、及び／又は特異的及び非特異的な性質の疎水性（一般に架橋分子を介した）相互作用が含まれるがこれらには限定されない。例えば、ｐＨを操作することにより静電的な相互作用を可能にする及び／又は制御することができ、ここで異なる等電点を有するタンパク質が、それらに対応するナノ粒子の表面電荷と相互作用する。
【００７２】
さらに、細胞成長を支持する又はアセンブリ中の様々な構成要素をさらに架橋するために、追加の支持分子をアセンブリに加えることもまた可能である。この種の架橋は、抗体又はその他の分子（例えばペプチド又はタンパク質タグ）を用いて、最初の試料（４３）又は磁性ナノ粒子アセンブリ（４７）を変化させ、アセンブリ中の特定の分子を濃縮する／捕捉することにより達成することができる。
【００７３】
本明細書において記載した実施形態は、最終的な細胞を治療で用いる場合に生じるいずれの免疫反応をも低減するために、天然のタンパク質を用いてナノ粒子アセンブリを調製するために有効であり得る。このことは、異物の影響を遮蔽するために、ナノ粒子アセンブリの調製に血清、血液、又はその他の体組織若しくは体液を使用することができ得ることから、自己細胞を用いる治療用の細胞培養について対応する場合に有効であり得る。
【００７４】
実施例：凍結磁性化細胞
本明細書において我々は、磁性化した際に細胞を凍結し、その後融解して３Ｄ培養に用いることができることを示した。上述の方法により、細胞を磁性ナノ粒子アセンブリと混合する。過剰の磁性ナノ粒子アセンブリをその後除去し、標準的な方法に従い、細胞を洗浄及び凍結保存する。その後細胞を融解し、３Ｄ培養系において培養する。この方法により、研究及び治療で使用するための磁性化細胞の調製及び商品化が可能になるため、これは非常に便利である。
【００７５】
以下の方法を用いた。フラスコ中で、Ｔ−２５ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）を８０％コンフルエンスに達するまで生育させ、２００μｌの酸化鉄−Ａｕ−ＰＬで処理した。その後、約１２時間インキュベートした。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し（結合しなかった酸化鉄−Ａｕ−ＰＬを除去した）、トリプシン処理し、２つのバイアルに分注し、ＤＭＳＯを含む培地中に入れ、−８０℃で凍結した。翌日、長期間の保存用に、それらを液体窒素デュワー瓶の中に移した。
【００７６】
８１日後、３７℃の水浴中で２分、１つのバイアルを融解した。バイアルの中身を７．５ｍＬの培地で再懸濁した後、細胞を直径３５ｍｍの３つのシャーレに分注し、１０００Ｇの磁石を各シャーレの上に置いた。細胞を凍結保存から回収し、磁気浮遊による３Ｄにおいて数日間培養した。これらの細胞を用いて、十分に浮遊させた３Ｄ培養を成長させることができた。初代平滑筋細胞、初代線維芽細胞、膠芽腫細胞（ＬＮ２９９）、及び肝癌（Ｈ４ＩＩＥ癌細胞、肝細胞癌）を用いた同様の方法をもまた成功させた。したがって、その後の使用のために、磁性化細胞を予め調製することが可能である。
【００７７】
実施例：繰り返し処理
我々は又、細胞又は細胞抽出物を既にある３Ｄ培養に加えることにより、複数回の細胞浮遊を行うこともできる。このようにして、３Ｄ培養が成長するにつれ、培養中に様々な細胞又は細胞産物を濃縮することができる。
【００７８】
図８では、細胞（５１）を磁性ナノ粒子アセンブリ（５３）に加え、そして細胞を磁性化するために、この細胞と磁性ナノ粒子アセンブリを共にインキュベート（５５）する。次に、磁石（６１）を用いてこの磁性化細胞を浮遊させる（５９）。その後、細胞を４時間、一晩、又は数日間浮遊させておき（細胞型によって異なる）、細胞の浮遊を解除し、培地をｐｉｃｏｐｕｒｅ水（７３）と交換し、及び凍結融解により細胞を溶解した（７５）（細胞を液体窒素中に少なくとも１０分間おく）。あるいは、磁石（６１）を用いて細胞を培養シャーレ（６５）の底部に引きつけることもでき、この場合、この工程を１〜４回繰り返すことができる。その後、細胞（６７）若しくは細胞抽出物（６９）又は異なる細胞（７１）のいずれかを別の試料の中に戻し入れ、そして３Ｄ培養の工程を継続させることができる。写真は示されていないが、これらの手順は首尾よく示されている。
【００７９】
実施例：成形された培養物 我々はまた、磁場を変化させることにより、３Ｄ細胞培養の形を様々にすることができることを示した。プレートの底部に細胞を引きつける強力な磁石を用いると、密度の高い、良好に形成された細胞のシートが作られる（示されていない）。これを、その後磁場を反転することにより浮遊させることができる。我々はまた、磁石を傾斜させることにより、片側が厚くなった３Ｄ培養を作出した。トロイダル磁石の使用により、ドーナツ型の培養を作出した。
【００８０】
図９ａ〜ｅは例えば、磁場の強度または磁石とシャーレの距離を変化させることにより、細胞を異なった程度で圧縮することができる、または環状の磁石を用いてドーナッツ形が形成される、細胞培養のいくつかの例を示す。図１０及び図１１は、磁場を傾斜させることにより、片側が厚く形成された３Ｄ培養を示す。
【００８１】
我々はまた、そのようなドーナツ型又はシート上の細胞培養を重ねて、最終的にはより複雑な構造を形成することができると予測する。例えば、ディスクを重ねることにより、管様構造を作出することができるだろう。ディスクを重ね、その後一方又は両方の端にシートを被せることで区画を作出することができ、この区画を同じ又は異なる細胞型で充填することができるだろう。このようにして、より複雑な組織操作を達成することが可能である。
【００８２】
我々はまた、磁場を用いて細胞を移動させることができる。そのような移動は３Ｄ培養の特性及び組成に影響を及ぼし得る。細胞にヒドロゲル（磁性ナノ粒子アセンブリとしても知られている）を播種した場合には、永久磁石の動きによる、又は電磁石により生成される磁場の変化による、磁場の垂直及び／又は水平方向への移動は細胞が細胞培養プレートに直接接着することを防ぐ。この移動の回数は例えば、１Ｈｚ（１分間当たり６０回）から０．００１Ｈｚの範囲になるだろう。さらに、異なる細胞型は移動するゲルと非常に異なって相互作用をする可能性がある。垂直及び／又は水平方向への移動を組み合わせることにより、移動している材料の固さは、移動しているゲルに様々に接着する細胞の型をさらに決定するだろう。磁石に揺れる動きを加えることにより、この方法の変型を作り上げることができるだろう。この方法は、磁気浮遊による３Ｄ細胞培養を含むがこれらには限定されない磁気操作のために、細胞を調製する、分離する、及び識別するための有効な代替法である。
【００８３】
実施例：表面接触
上述の実施形態において我々は、この構成要素の緊密な混合物を提供するように、磁性ナノ粒子アセンブリと細胞を混合した。しかしながら、我々はまた、緊密な混合は必要ではなく、単に磁性ナノ粒子アセンブリに隣接するだけで、細胞は磁性ナノ粒子を取り込むであろうことを示した。このことは、細胞が磁性ナノ粒子アセンブリ材料を含まないことが必要な場合に有益である。
【００８４】
図１２は、磁性ナノ粒子アセンブリ（２００）を磁場に曝露する方法を図示するものである。これは、磁性ナノ粒子アセンブリを濃縮又は圧縮して、更に高密度の磁性フィルムにする効果がある。細胞（４００）をこのフィルム上に加えることができ、そして細胞は重力により、フィルム上に自然に沈殿するだろう。このフィルムへの接近により、細胞が磁性化されるだろう。その後細胞をフィルムから容易に浮遊及び分離することができ、そして３Ｄ培養中で細胞を浮遊させ、成長させることができる。我々はこの概念を様々な支持分子を用いて試験し、これが機能することを示した。
【００８５】
本明細書において開示及び請求する全ての組成物及び／又は方法は、本開示を考慮して、不当な実験を行うことなく作成及び実施することができる。本発明の組成物及び方法を好ましい実施形態の観点から記載してきたが、本発明の概念、精神及び範囲から逸脱することなく、組成物及び／又は方法並びに本明細書において記載した方法の工程及び工程の順序に変更を加えてもよいことは当業者には明らかであろう。より特定的には、同じ又は同様な結果が達成される限りは、本明細書において記載した薬剤と化学的に及び生理学的の両方に関連した特定の薬剤と置き換えてもよいことが明かだろう。そのような全ての類似した置換及び変更は当業者には明かであり、かつ、添付の請求項によって定義される本発明の精神、範囲及び概念の範囲内であると見なされる。
【００８６】
以下の参考文献、参照することによりその全体が本明細書に組み入れられる。
（１）Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｋ．；Ｉｔｏ，Ａ．；Ａｒｉｎｏｂｅ，Ｍ．；Ｍｕｒａｓｅ，Ｙ．；Ｉｗａｔａ，Ｙ．；Ｎａｒｉｔａ，Ｙ．；Ｋａｇａｍｉ，Ｈ．；Ｕｅｄａ，Ｍ．；Ｈｏｎｄａ，Ｈ． Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．２００７，１０３，４７２−８．
（２）Ｋｏｓｍｕｌｓｋｉ，Ｍ．；Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｓｕｒｆａｃｅｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ２００１．
（３）Ｍａｈｍｏｕｄｉ，Ｍ．；Ｓｉｍｃｈｉ，Ａ．；Ｉｍａｎｉ，Ｍ． Ｊ． Ｉｒａｎ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ２０１０， ７， Ｓｌ−Ｓ２７．
（４）Ｂａｃｒｉ，Ｊ．−Ｃ．；Ｐｅｒｚｙｎｓｋｉ，Ｒ．；Ｓａｌｉｎ，Ｄ．；Ｃａｂｕｉｌ，Ｖ．；Ｍａｓｓａｒｔ，Ｒ． Ｊ． Ｍａｇｎ． Ｍａｇｎ． Ｍａｔｅｒ． １９９０， ８５， ２７−３２．
（５）Ｄｏｕｚｉｅｃｈ−Ｅｙｒｏｌｌｅｓ，Ｌ．；Ｍａｒｃｈａｉｓ，Ｈ．；Ｈｅｒｖｅ，Ｋ．；Ｍｕｎｎｉｅｒ，Ｅ．；Ｓｏｕｃｅ，Ｍ．；Ｌｉｎａｓｓｉｅｒ，Ｃ．；Ｄｕｂｏｉｓ，Ｐ．；Ｃｈｏｕｒｐａ，Ｉ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｎａｎｏｍｅｄ． ２００７， ２， ５４１−５５０．
（６）Ｄｕｆｆ，Ｄ．Ｇ．；Ｂａｉｋｅｒ，Ａ．；Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｐ．Ｐ． Ｌａｎｇｍｕｉｒ １９９３， ９， ２３０１−２３０９．
米国特許第２００５０５４１０１号、国際公開第２００５０１０１６２号
米国特許第２００９１３７０１８号、国際公開第２００５００３３３２号
米国特許第２００６０６３２５２号、国際公開第２００４０８３４１２号、国際公開第２００４０８３４１６号
国際公開第２０１００３６９５７号
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を磁性化するための組成物であって、
ａ）負に帯電したナノ粒子；
ｂ）正に帯電したナノ粒子；及び
ｃ）支持分子、
を含み、ここで前記負に帯電したナノ粒子又は正に帯電したナノ粒子のうちの１つが磁気応答性エレメントを含み、かつ、緊密な混合状態で前記支持分子が前記負に帯電したナノ粒子及び前記正に帯電したナノ粒子を保持する組成物。
【請求項２】
前記負に帯電したナノ粒子が金のナノ粒子である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記正に帯電したナノ粒子が酸化鉄のナノ粒子である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記支持分子がペプチド、ポリサッカリド、核酸、ポリマー又はその組み合わせを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記支持分子が、ポリ−リシン、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ＢＳＡ、ヒアルロナン、グリコサミノグリカン、アニオン性の非硫酸化グリコサミノグリカン、ゼラチン、核酸、細胞外マトリックスタンパク質、細胞抽出物、抗体又はその混合物若しくは誘導体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記支持分子がポリ−リシンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記細胞が動物の組織又は体液から得られたものであり、かつ、前記支持分子が前記組織又は体液により提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
さらに細胞を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
ａ）前記支持分子がペプチド、ポリサッカライド、核酸、ポリマー、ポリ−リシン、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ＢＳＡ、ヒアルロナン、グリコサミノグリカン、アニオン性非硫酸化グリコサミノグリカン、ゼラチン、核酸、細胞外マトリックスタンパク質混合物、抗体、又はその混合物若しくは誘導体を含み、
ｂ）前記負に帯電したナノ粒子が金のナノ粒子であり、及び
ｃ）前記正に帯電したナノ粒子が酸化鉄のナノ粒子である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
さらに細胞を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１に記載の組成物と細胞を接触させること、及び該細胞が磁性化するまで１〜１２時間インキュベートすること、及び磁性化した前記細胞を、前記細胞を移動させるのに十分な磁場にかけることを含む、細胞を移動させる方法。
【請求項１２】
前記磁場が非対称である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が懸濁されている又は接着している、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
細胞懸濁液と請求項８に記載の組成物とを混合することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記磁性化細胞を、前記細胞を移動させるのに十分な磁場にかける前に、前記組成物を除去するために前記細胞を洗浄することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
標的分子を加えた請求項１に記載の組成物と細胞懸濁液とを接触させること、前記細胞が磁性化し、前記標的が前記細胞に送達されるまで１〜１２時間インキュベートすること、及び磁性化した前記細胞を３Ｄ培養するために、磁場を磁性化した前記細胞にかけることを含む、３Ｄ培養用に標的分子を細胞に送達する方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の組成物とインキュベートすることにより作成される磁性化細胞を含む組成物。
【請求項１８】
請求項９に記載の組成物とインキュベートすることにより作成される磁性化細胞を含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記細胞が凍結している、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
前記細胞が凍結している、請求項１８に記載の組成物。
【請求項１】
細胞を磁性化するための組成物であって、
ａ）負に帯電したナノ粒子；
ｂ）正に帯電したナノ粒子；及び
ｃ）支持分子、
を含み、ここで前記負に帯電したナノ粒子又は正に帯電したナノ粒子のうちの１つが磁気応答性エレメントを含み、かつ、緊密な混合状態で前記支持分子が前記負に帯電したナノ粒子及び前記正に帯電したナノ粒子を保持する組成物。
【請求項２】
前記負に帯電したナノ粒子が金のナノ粒子である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記正に帯電したナノ粒子が酸化鉄のナノ粒子である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記支持分子がペプチド、ポリサッカリド、核酸、ポリマー又はその組み合わせを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記支持分子が、ポリ−リシン、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ＢＳＡ、ヒアルロナン、グリコサミノグリカン、アニオン性の非硫酸化グリコサミノグリカン、ゼラチン、核酸、細胞外マトリックスタンパク質、細胞抽出物、抗体又はその混合物若しくは誘導体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記支持分子がポリ−リシンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記細胞が動物の組織又は体液から得られたものであり、かつ、前記支持分子が前記組織又は体液により提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
さらに細胞を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
ａ）前記支持分子がペプチド、ポリサッカライド、核酸、ポリマー、ポリ−リシン、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ＢＳＡ、ヒアルロナン、グリコサミノグリカン、アニオン性非硫酸化グリコサミノグリカン、ゼラチン、核酸、細胞外マトリックスタンパク質混合物、抗体、又はその混合物若しくは誘導体を含み、
ｂ）前記負に帯電したナノ粒子が金のナノ粒子であり、及び
ｃ）前記正に帯電したナノ粒子が酸化鉄のナノ粒子である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
さらに細胞を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１に記載の組成物と細胞を接触させること、及び該細胞が磁性化するまで１〜１２時間インキュベートすること、及び磁性化した前記細胞を、前記細胞を移動させるのに十分な磁場にかけることを含む、細胞を移動させる方法。
【請求項１２】
前記磁場が非対称である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が懸濁されている又は接着している、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
細胞懸濁液と請求項８に記載の組成物とを混合することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記磁性化細胞を、前記細胞を移動させるのに十分な磁場にかける前に、前記組成物を除去するために前記細胞を洗浄することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
標的分子を加えた請求項１に記載の組成物と細胞懸濁液とを接触させること、前記細胞が磁性化し、前記標的が前記細胞に送達されるまで１〜１２時間インキュベートすること、及び磁性化した前記細胞を３Ｄ培養するために、磁場を磁性化した前記細胞にかけることを含む、３Ｄ培養用に標的分子を細胞に送達する方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の組成物とインキュベートすることにより作成される磁性化細胞を含む組成物。
【請求項１８】
請求項９に記載の組成物とインキュベートすることにより作成される磁性化細胞を含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記細胞が凍結している、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
前記細胞が凍結している、請求項１８に記載の組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２０１３−５０５７２８（Ｐ２０１３−５０５７２８Ａ）
【公表日】平成２５年２月２１日（２０１３．２．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３１１０５（Ｐ２０１２−５３１１０５）
【出願日】平成２２年９月２７日（２０１０．９．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５０４４５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０３８３７０
【国際公開日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【出願人】（５１２０７１３０７）エヌ３ディー バイオサイエンスィズ，インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年２月２１日（２０１３．２．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月２７日（２０１０．９．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５０４４５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０３８３７０
【国際公開日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【出願人】（５１２０７１３０７）エヌ３ディー バイオサイエンスィズ，インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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