細胞培養基材及び細胞培養方法
【課題】 柔軟かつ強靱な細胞培養基材、さらには培養した細胞を分離回収する際に細胞の破損や基材の混入がなく、迅速に培養した細胞を回収できる細胞培養基材、及び培養した細胞の回収が容易な細胞培養方法を提供すること。
【解決手段】 水溶性有機モノマーの重合体と、水膨潤性粘土鉱物とから構成される三次元網目構造を有する高分子ヒドロゲルに放射線を照射してなる二重架橋型高分子ゲルからなり、かつ、外部環境変化にともない親水性と疎水性とが可逆的に変化することを特徴とする細胞培養基材。
【解決手段】 水溶性有機モノマーの重合体と、水膨潤性粘土鉱物とから構成される三次元網目構造を有する高分子ヒドロゲルに放射線を照射してなる二重架橋型高分子ゲルからなり、かつ、外部環境変化にともない親水性と疎水性とが可逆的に変化することを特徴とする細胞培養基材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水溶性有機モノマーの重合体と水膨潤性粘土鉱物とから構成される三次元網目構造を有する有機無機複合高分子ヒドロゲルに放射線を照射してなる二重架橋型高分子ゲルからなる細胞培養基材に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、動物組織等の細胞培養基材としては、プラスチック（例：ポリスチレン）やガラスの容器が使用されてきた。これら容器は、細胞培養を有効に行わせるために、その表面にプラズマ処理や、シリコンや細胞接着因子等のコーティングなどの表面処理が施されている。従って、これら細胞培養容器を培養基材として用いた場合には、培養・増殖した細胞が表面処理された容器表面に接着しており、細胞を単離・回収するためには、トリプシン等のタンパク質加水分解酵素や化学薬品を用いて、容器表面から剥離する必要があった。このような酵素や化学薬品により細胞を剥離する操作は工程が煩雑であるほか、雑菌やＤＮＡあるいはＲＮＡ等の不純物が混入する恐れがあった。また、細胞と基材の結合部分が切断されるだけではなく、細胞同士の結合も切断されるため、細胞が増殖している形状（例：シート状）のままで取り出すことができなかったり、細胞の性質が変化してしまう問題があった。また、複数種の細胞培養を行う際には、複数の培養液等を交換して用いる必要があるが、容器の交換が出来ないために、容器内部に各種薬品等が残留してしまい、これらが培養細胞に混入するおそれがあるなど、培養細胞の利用の点から多くの課題を抱えていた。
【０００３】
近年、細胞培養容器の表面に温度応答性ポリマーを極薄くコーティングした基材を使用して、細胞培養温度ではポリマーを疎水性状態に保持して細胞を接着させ、培養後にポリマーを低温処理して親水性状態にすることにより、細胞とポリマーとの接着性を低下させ、細胞を加水分解酵素や化学薬品を使用することなしに基材から細胞をシート状に剥離するという技術が報告されている（例えば特許文献１及び２、非特許文献１参照）。しかしながら、上記基材はポリマーの架橋度によって性能が大きく変化し、架橋が不十分な場合は、細胞を剥離する際に、細胞と共にポリマーも基材から一部剥離してしまい、細胞と基材との分離が困難であった。また架橋が十分な場合には、温度応答性の応答速度が非常に悪くなり、ポリマーを親水性にするために長時間を要する問題があり、且つ、その間、細胞も低温状態にさらされる問題があった。さらに、該基材を使用した場合には、培養した細胞を次の実験に用いる場合（例えば動物の体内に移植する場合や、他の細胞と共培養を行う場合など）、シート状となった細胞をポリマーコーティングされた容器から剥離して支持体なしで移動させる必要があり、非常に強度の弱い剥離細胞シートを強引に掴んで次の使用位置等に移動させなければならず、細胞シートが傷つきやすかったり、操作性が非常に悪いという問題を有していた。これらのことから、細胞を培養した後、汚染や損傷させることなく、短時間で完全に基材から分離させること、且つ任意の場所で細胞シートを取り出し、次の工程に移動させ用いられるようにすることなどが求められていた。
【０００４】
一方、水溶性有機高分子と層状粘土鉱物とが複合化して形成された三次元網目を有する高分子ヒドロゲルが開示されている（特許文献３参照）。該高分子化合物は優れた吸水性や極めて高い伸張性などの特徴を有し、各種分野において有用な材料であるが、細胞培養基材としての有用性は知られていなかった。
【０００５】
【特許文献１】特公平６−１０４０６１公報
【特許文献２】特開平５−１９２１３８公報
【特許文献３】特開２００２−５３６２９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、柔軟かつ強靱な細胞培養基材、さらには培養した細胞を分離回収する際に細胞の破損や基材の混入がなく、迅速に培養した細胞を回収できる細胞培養基材、及び培養した細胞の回収が容易な細胞培養方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明において使用する、水溶性有機モノマーの重合体と、水膨潤性粘土鉱物とから構成される三次元網目構造を有する高分子ヒドロゲルに放射線を照射してなる二重架橋型高分子ゲルは、その状態が外部環境変化により親水性と疎水性が可逆的に変化することにより、その表面が疎水性である状態では、その表面上で好適に細胞を培養、増殖させることができ、また親水性を示す条件下では、細胞との接着性を低下させることができるため、培養、増殖させた細胞の破損や、基材の剥離混入を生じることなく、容易かつ迅速に剥離回収することができる。また柔軟かつ強靱な材料であることから、細胞をその表面上で各種形状のシート状に培養して、その形状を保った状態で次の実験に用いることを実現できる。
【０００８】
即ち本発明は、水溶性有機モノマーの重合体と、水膨潤性粘土鉱物とから構成される三次元網目構造を有する高分子ヒドロゲルに放射線を照射してなる二重架橋型高分子ゲルであり、かつ、外部環境変化にともない親水性と疎水性とが可逆的に変化することを特徴とする細胞培養基材、該細胞培養基材上で細胞を培養する細胞培養方法、および該細胞培養基材上で細胞を培養した後、該基材を親水性を示す温度とすることで培養した細胞を該細胞培養基材から分離する細胞分離方法を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の細胞培養基材は、水溶性有機モノマーの重合体と、水膨潤性粘土鉱物とから構成される三次元網目構造を有する高分子ヒドロゲルに放射線を照射してなる二重架橋型高分子ゲルであり、かつ、外部環境変化にともない親水性と疎水性とが可逆的に変化することを特徴とするため、優れた細胞培養特性を示し、また本発明の二重架橋型高分子ゲルは優れた柔軟性と強靱さを有することから、培養した細胞を基材ごと移送する際にも形状を保持したまま、安定に培養した細胞を移送できる。さらに最初の細胞培養後に共培養を行う場合等には、培養液や薬品による汚染がなく、再度の培養を行うことが可能である。また本願発明の二重架橋型高分子ゲルは、水溶性有機モノマーの重合体と、水膨潤性粘土鉱物とから構成される三次元網目構造を有する高分子ヒドロゲルに放射線を照射することにより、該高分子ヒドロゲルの力学物性および表面の平滑性及び疎水性等を細胞の接着及び伸展に適した状態に制御出来るため、優れた培養性能を有する。さらに、放射線を照射することにより滅菌を同時に行える効果を有する。
【００１０】
親水性と疎水性とが外部環境により可逆的に変化する二重架橋型高分子ゲルからなる細胞培養基材は、疎水性条件下では細胞と優れた接着性を示すため、細胞を好適に培養、増殖させることができ、また親水性条件下では、細胞との接着性を低下させることができるため、トリプシン等のタンパク質加水分解酵素や化学薬品を使用せずに細胞を剥離でき、細胞の破損や、基材の剥離混入を生じることなく、容易に細胞の回収が可能である。さらに、疎水性から親水性、あるいは親水性から疎水性への変化が迅速であるため、温度をはじめとする外部環境を変化させる際に細胞に与える影響が少ない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の細胞培養基材は、水溶性有機モノマーの重合体と水膨潤性粘土鉱物とから構成される三次元網目構造を有する高分子ヒドロゲルに放射線を照射してなる二重架橋型高分子ゲルからなる。
【００１２】
本発明の高分子ヒドロゲルに用いる水溶性有機モノマーは、水に溶解する性質を有し、水に均一分散可能な水膨潤性の粘土鉱物と相互作用を有するものであればよく、例えば、粘土鉱物と水素結合、イオン結合、配位結合、共有結合等を形成できる官能基を有するものが好ましい。これらの官能基を有する水溶性有機モノマーとしては、具体的には、アミド基、アミノ基、エステル基、水酸基、テトラメチルアンモニウム基、シラノール基、エポキシ基などを有する水溶性有機モノマーが挙げられ、なかでもアミド基を有する水溶性有機モノマーが好ましい。また、本発明で言う水には、水と混和する有機溶媒との混合溶媒で水を主成分とするものを含む。
【００１３】
本発明における水溶性有機モノマーの重合体は、水膨潤性粘土鉱物と三次元網目構造を形成して形状が安定な高分子ヒドロゲルを形成できることが必要で、アクリル系化合物や、ビニル系化合物などが使用できる。なかでも、得られる細胞培養基材から容易に培養した細胞を分離できることから、外部環境変化にともない水溶性または水を吸湿する親水性と疎水性が可逆的に変化するものであることが有効である。特に水溶液中でのポリマーの親水性と疎水性が温度、ｐＨ、溶質濃度、溶媒組成で変化するものが好んで用いられる。具体的には、例えば温度の場合、臨界温度（Ｔｃ）以上では疎水性となる下限臨界共溶温度（Lower Critical Solution Temperature：以下ＬＣＳＴと略記する。）を持つポリマーや、Ｔｃ以上で親水性となる、上限臨界共溶温度（Upper Critical Solution Temperature：以下ＵＣＳＴと略記する。）を持つポリマーがより好んで用いられる。特に好ましくは、Ｔｃ以上で疎水性、Ｔｃ以下で親水性となるＬＣＳＴを有するものである。また、溶質濃度の場合は、例えばある温度において、溶媒中の塩化ナトリウムの濃度が一定濃度以上では疎水性となり、一定濃度以下では親水性となるポリマーも好んで用いられる。さらに、溶媒組成の場合は、例えばある温度において、溶媒中の水に対するメタノール濃度が一定以上の濃度の場合は疎水性となり、一定濃度以下では親水性となるポリマーも好んで用いられる。
【００１４】
このような重合体を与える水溶性有機モノマーの例としては、Ｎ−置換アクリルアミド誘導体、Ｎ，Ｎ−ジ置換アクリルアミド誘導体、Ｎ−置換メタクリルアミド誘導体、Ｎ，Ｎ−ジ置換メタクリルアミド誘導体などを好ましく使用することができ、具体的にはＮ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルピペリディン、Ｎ−アクリロイルピロリディンがあげられる。
【００１５】
かかる有機モノマーの重合体としては、例えば、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド）、ポリ（Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド）、ポリ（Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド）、ポリ（Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド）、ポリ（Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−テトラフルフリルメタクリルアミド）、ポリ（Ｎ−エチルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−アクリロイルピペリディン）、ポリ（Ｎ−アクリロイルピロリディン）が例示される。
【００１６】
また水溶性有機モノマーの重合体としては、以上のような単一水溶性有機モノマーからの重合体の他、これらから選ばれる複数の異なる水溶性有機モノマーを重合して得られる共重合体を用いることも有効である。また上記水溶性有機モノマーからなる重合体が好ましいが、上記水溶性有機モノマーとそれ以外の水溶性有機モノマーまたは有機溶媒可溶性有機モノマーとの共重合体も、得られた重合体が親水性及び疎水性の両方を示すものであれば使用することが出来る。共重合に用いられる有機モノマーとしては、具体的にはＮ−アルキルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミド、アクリルアミド等のアクリルアミド類、または、Ｎ−アルキルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジアルキルメタクリルアミド、メタクリルアミド等のメタクリルアミド類が挙げられる。なお、より好ましくは、Ｎ−アルキルアクリルアミドまたはＮ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミドが用いられる。アルキル基としては、炭素数が１〜４のものが好ましく選択される。その他には、アクリロイルモルフォリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルメチルホモピペラディン、Ｎ−アクリロイルメチルピペラディン等も用いることが出来る。
【００１７】
本発明の細胞培養基材に用いられる粘土鉱物は、水又は水溶液中で層間が膨潤する性質を有することが必要である。より好ましくは少なくとも一部が水中で層状に剥離して分散できるものであり、更に好ましくは水中で１ないし１０層以内の厚みに、特に好ましくは水中で１ないし３層以内の厚みに層状に剥離して均一分散できる層状粘土鉱物である。例えば、水膨潤性スメクタイトや水膨潤性雲母などを用いることができ、具体的には、ナトリウムを層間イオンとして含む水膨潤性ヘクトライト、水膨潤性モンモリロナイト、水膨潤性サポナイト、水膨潤性合成雲母が挙げられる。
【００１８】
本発明の細胞培養基材を構成する水溶性有機モノマーと粘土鉱物との比率は、用いる水溶性有機モノマーや粘土鉱物の種類により適宜選択すればよいが、ゲルの合成が容易であることや、力学物性及び均一性に優れることなどから、水溶性有機モノマー重合体に対する粘土鉱物の質量比が０．０１〜１０であることが好ましく、より好ましくは０．０３〜２、特に好ましくは０．１〜１である。かかる質量比の範囲であれば、高分子ヒドロゲルの特性が十分に発揮され、調製が容易であり、また得られる細胞培養基材がより高い強度を示す。
【００１９】
本発明の二重架橋型高分子ゲルは、放射線を照射することにより、高分子ヒドロゲル内の有機モノマーの重合体同士が架橋することにより、二重架橋型高分子ゲルとなる。放射線の照射によって、二重架橋型となることにより伸び率と引っ張り弾性率が調整され、高分子ヒドロゲルの物性が細胞培養に適した範囲に制御されるばかりでなく、高分子ヒドロゲルの滅菌を行うことが可能となる。
【００２０】
本発明の細胞培養基材は、上記有機モノマーの重合体と水膨潤性粘土鉱物とが三次元網目構造を有する高分子ヒドロゲルに放射線を照射することによって得られる二重架橋型高分子ゲルであることから、細胞を培養した後、二重架橋型高分子ゲルから細胞を剥離する際に破壊することがなく、形状を維持できる特徴を有する。また本発明の細胞培養基材に用いられる二重架橋型高分子ゲルは、細胞を培養後、次の実験位置まで移動させる必要がある場合に、培養した細胞のシートを破壊することなく移動できる。
【００２１】
また、本発明の二重架橋型高分子ゲルは、放射線照射前の高分子ヒドロゲルが有する延伸性を抑制して安定な形状を保持させたものであるが、該高分子ヒドロゲルの含水率が９０％の条件において、該高分子ヒドロゲルの有する１ｋＰａ以上の引っ張り弾性率、１０ｋＰａ以上の引っ張り強度、および５０％以上の破断伸び等の優れた力学物性を有するものである。また引っ張り弾性率が１０ｋＰａ以上、引っ張り強度が５０ｋＰａ以上、破断伸びが５０％以上であればより好ましく、引っ張り弾性率が２０ｋＰａ以上、引っ張り強度が８０ｋＰａ以上、破断伸びが１００％以上であればさらに好ましい。これらの力学物性を持つ高分子ヒドロゲルに対して、放射線照射を行うことにより、細胞培養基材に適した二重架橋型高分子ゲルが得られる。
【００２２】
該高分子ヒドロゲルは、三次元網目構造を形成する上記水溶性有機モノマーの重合体により、外部環境条件に応じて親水性と疎水性とを有する。このため、該高分子ヒドロゲルからなる細胞培養基材は細胞を好適に培養でき、かつ培養した細胞の破壊や基材の剥離混入を生じることなく、培養した細胞を容易かつ迅速に剥離回収することができる。
【００２３】
高分子ヒドロゲルの親水性と疎水性とが変化する臨界温度は、細胞を好適に培養・剥離できることから、該臨界温度は０〜５０℃程度の温度範囲にあることが好ましい。該臨界温度は、使用するモノマーの重合体が有するＵＣＳＴ、ＬＣＳＴに影響されるため、ＵＣＳＴ、ＬＣＳＴが概ね該温度範囲内にあるものを選択し、使用する水膨潤性粘土鉱物の種類や、水溶性有機モノマーと水膨潤性粘土鉱物との比率などを適宜調整することで実現できる。
【００２４】
本発明の細胞培養基材に用いられる高分子ヒドロゲルは、単独で用いられる他、金属、セラミック、プラスチック等の平滑表面または凹凸表面を有する支持体に被覆して用いられる。また、各種形状に形成が可能であり、シート状、繊維状、中空繊維状、球状で用いることができる。
【００２５】
本発明の細胞培養基材に使用する高分子ヒドロゲルは、溶媒として、水、および水と共に、水に溶解している細胞培養に適したタンパク質などを含むものをいう。
【００２６】
本発明において細胞培養基材に用いられる高分子ヒドロゲルに含まれる溶媒の量は、目的に応じて設定され一概には規定されないが、高分子ヒドロゲルが上記の力学物性を発揮するためには、好ましくは疎水性状態となっている高分子ヒドロゲル中の固形分に対する溶媒の質量比が０．１〜５０のものが用いられ、さらに好ましくは０．１〜１０のものが用いられる。これらの溶媒量は、重合時の溶媒量、または重合後に高分子ヒドロゲルを疎水性の状態に変化させる時の保持状態等により、任意に制御することが可能である。
【００２７】
本発明の細胞培養基材を使用して培養を行うことが可能な細胞は、ヒト及び動物の組織細胞であれば特に制限はなく、例えば、血管細胞、繊維芽細胞、筋肉細胞、神経細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、肝細胞、膵臓細胞、角膜細胞などが挙げられる。これらのうち、血管内皮細胞、皮膚繊維芽細胞、肝実質細胞、肝ガン細胞、軟骨細胞等が好ましく用いられる。
【００２８】
本発明の細胞培養基材の製造方法としては、例えば、水溶性有機モノマーと水膨潤性粘土鉱物と水を含む均一分散液を調製した後、水膨潤性粘土鉱物共存下で水溶性有機モノマーを重合させることにより、高分子ヒドロゲルを調製する。ここで層状に剥離した粘土鉱物が架橋剤の働きをすることにより水溶性有機モノマー重合体と粘土鉱物との三次元網目が形成される。
【００２９】
水膨潤性粘土鉱物共存下での水溶性有機モノマーおよび有機架橋剤の重合反応は例えば、過酸化物を重合開始剤として使用して重合させる方法、加熱または放射線照射などの慣用の方法を用いたラジカル重合により行わせることが出来る。ラジカル重合開始剤及び触媒としては、慣用のラジカル重合開始剤及び重合促進剤のうちから適宜選択して用いることが出来、好ましくは水に分散性を有し、系全体に均一に含まれるものを用いることができる。特に好ましくは層状に剥離した粘土鉱物と強い相互作用を有するラジカル重合開始剤である。重合開始剤としては水溶性の過酸化物、例えばペルオキソ二硫酸カリウムやペルオキソ二硫酸アンモニウム、水溶性のアゾ化合物などを好ましく使用でき、具体的には、和光純薬工業株式会社製のＶＡ−０４４、Ｖ−５０、Ｖ−５０１などが好ましく使用できる。その他、ポリエチレンオキシド鎖を有する水溶性ラジカル開始剤なども使用できる。また重合促進剤としては、３級アミン化合物であるＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンやβ−ジメチルアミノプロピオニトリルなどを好適に使用できる。
【００３０】
上記重合反応時の温度は、用いる水溶性有機モノマー、有機架橋剤、重合促進剤及び開始剤の種類などに合わせて適宜選択すればよく、例えば０℃〜１００℃の範囲に設定出来る。また、重合温度を得られる高分子ヒドロゲルのＬＣＳＴ以下（またはＵＣＳＴ以上）の温度とする場合、重合後の高分子ヒドロゲルは親水性となるが、ＬＣＳＴ以上（またはＵＣＳＴ以下）の温度にて保持することにより、親水性から疎水性の状態に変化させることが出来、細胞培養に適した状態となる。また、ＬＣＳＴ以上（またはＵＣＳＴ以下）の温度で重合を行った場合は、高分子ヒドロゲルは疎水性の状態となって得られるので、そのまま細胞培養を行うことが出来る。即ち、どちらの重合方法を用いても、細胞培養基材として用いられる高分子ゲルを得ることは可能である。但し、ＬＣＳＴ以下（またはＵＳＣＴ以上）の温度にて重合を行うと、重合により得られる高分子ヒドロゲルを疎水性の状態に変化させた時に収縮が起こるが、ＬＣＳＴ以上（またはＵＣＳＴ以下）の温度で重合を行うと、重合により得られる高分子ヒドロゲルは疎水性状態のまま保たれるため、そのまま収縮せずに、または非常に少ない収縮で胞培養を行うことが出来るので好適である。以上のことは、その他の外部環境（溶液のｐＨ、重合時の親水性または疎水性を制御するために加える塩や、添加物等の溶質濃度、水と混和する有機溶剤等の溶媒組成）を変えても行う場合も同様で、有機モノマーの重合に差し支えない限り可能である。
【００３１】
重合時間は重合促進剤、開始剤、重合温度、重合溶液量（厚み）などの重合条件によって異なり、一概に規定できないが、一般に数十秒〜十数時間の間で行える。
本発明の二重架橋型高分子ゲルを得る際に、高分子ヒドロゲルに照射する放射線としては、電子線、ガンマ線、Ｘ線、紫外線、可視光などを用いることができるが、有機モノマーの重合体の架橋反応を起こすこと、及び高分子ヒドロゲルの滅菌を十分に行うことが可能である、電子線、またはガンマ線を用いることが好ましい。放射線の線量は、有機モノマーの重合体の必要とする二重架橋の程度により任意に調節可能であるが、好ましくは１ｋＧｙ〜５０ｋＧｙの範囲であり、より好ましくは５ｋＧｙ〜２０ｋＧｙの範囲である。１ｋＧｙ以上の線量で照射することにより、高分子ヒドロゲルの内部まで架橋反応が起こるようになり、また５０ｋＧｙ以下の線量であれば、高分子ヒドロゲルの放射線照射による劣化を抑制することが可能となる。
【００３２】
本発明の高分子ヒドロゲルに、上記の線量の放射線を照射することにより得られる二重架橋型高分子ゲルは、該高分子ヒドロゲルの表面が放射線照射により、平滑性、及び表面疎水性等が細胞の接着及び伸展に適した状態に制御できるため、特に優れた細胞培養性能を有する。
【００３３】
本発明の細胞培養基材の製造においては、重合時に重合容器の形状を変化させたり、重合後のゲルを切削加工したりすることにより種々の大きさや形状をもった細胞培養基材を調製できる。例えば、繊維状、棒状、平板状、円柱状、中空状、らせん状、あるいは球状など任意の形状を有する細胞培養基材を調製することが可能である。また重合反応時に慣用の界面活性剤を共存させる等の方法で、得られる細胞培養基材を微粒子形態で製造することも可能である。また、本発明の細胞培養基材は、一般に細胞培養に用いられているプラスチック製やガラス製のシャーレ等の非親水性の支持体の上に積層して用いることが好ましい。このような積層部材は、支持体上部で重合を行い、そのまま細胞培養に使用してもよいし、他の容器で重合後、基材表面に充填して細胞培養に使用しても良い。本発明の高分子ヒドロゲルはこのような重合調製後の移動が容易である特徴を有する。
【００３４】
本発明の細胞培養基材に用いられる高分子ヒドロゲルには、その特性を改良する目的で、重合時に公知慣用の有機架橋剤を使用してもよい。使用する有機架橋剤濃度は特に限定されず、目的に応じて選択できる。使用できる有機架橋剤としては、従来から公知のＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−プロピレンビスアクリルアミド、ジ（アクリルアミドメチル）エーテル、１，２−ジアクリルアミドエチレングリコール、１，３−ジアクリロイルエチレンウレア、エチレンジアクリレート、Ｎ，Ｎ’−ジアリルタータルジアミド、Ｎ，Ｎ’−ビスアクリリルシスタミンなどの二官能性化合物や、トリアリルシアヌレート、トリアリルイソシアヌレートなどの三官能性化合物が例示できる。
【００３５】
また、本発明の細胞培養基材に用いられる高分子ヒドロゲルには、本発明の効果を損なわない範囲で添加剤として、水溶性有機モノマーの重合体以外に、高分子化合物または低分子化合物を含有させたものが含まれる。例えばコラーゲンやヒアルロン酸等の細胞接着性因子、細胞増殖因子、ヒドロキシアパタイト粒子などを添加することができる。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲がこれらの実施例にのみ限定されるものではない。
【００３７】
（実施例１）
粘土鉱物には、［Ｍｇ５．３４Ｌｉ０．６６Ｓｉ８Ｏ２０（ＯＨ）４］Ｎａ＋０．６６の組成を有する水膨潤性合成ヘクトライト（Ｒｏｃｋｗｏｏｄ Ｌｔｄ．製「ラポナイトＸＬＧ」）を真空乾燥して用いた。有機モノマーは、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（興人株式会社製：以下、ＮＩＰＡと略記。）を既知の方法により精製して、重合禁止剤を取り除いてから使用した。重合開始剤は、ペルオキソ二硫酸カリウム（関東化学株式会社製：以下、ＫＰＳと略記。）をＫＰＳ／水＝０．４０／２０（ｇ／ｇ）の割合で脱酸素した超純水中に溶解し、水溶液にして使用した。重合促進剤は、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（和光純薬工業株式会社製：以下、ＴＥＭＥＤと略記。）を使用した。超純水は、全て微粒子除去用フィルターを通した高純度窒素をあらかじめ充分にバブリングさせ、含有酸素を除去してから使用した。
【００３８】
２０℃の恒温室において、内部を窒素置換した平底ガラス容器に、超純水５７．０６ｇとテフロン（登録商標）製攪拌子を入れ、攪拌しながら１．４４ｇのラポナイトＸＬＧを加え、無色透明の溶液を調製した。これにＮＩＰＡ６．７８ｇを加え、窒素雰囲気内で撹拌溶解により、無色透明溶液を得た。次に、ＫＰＳ水溶液３ｇとＴＥＭＥＤ４８μｌを攪拌しながら無色透明溶液に加えた。この溶液をあらかじめ窒素雰囲気中に静置して容器内の酸素を除去しておいた蓋付きのポリスチレン製容器（９ｃｍ×１５ｃｍ）３枚にそれぞれ酸素にふれないようにして移した後、密栓をし、２０℃の恒温水槽中で２０時間静置して重合を行った。なお、これらの溶液調製から重合までの操作は、全てクリーンベンチ内にて行い、さらに酸素を遮断した窒素雰囲気下で行った。重合開始から２０時間後に、ポリスチレン製容器内にほぼ無色透明で均一なシート状のヒドロゲル（Ａ）が得られた。
【００３９】
次に、このシート状のヒドロゲル（Ａ）をガス遮断ポリ袋に入れて密封し、電子線照射を行った（照射装置：ＥＰＳ−８００、株式会社ＮＨＶコーポレーション）。加速電圧は７００ｋＶ、照射量は２０ｋＧｙとした。照射後のヒドロゲル（Ａ）には特に変形や変色は見られなかった。この照射後のシート状のヒドロゲル（Ａ）を、ガス遮断ポリ袋から取り出し、２０℃の超純水中で少し膨潤させ含水率９０％に調整した後、１ｃｍ×５ｃｍの大きさに切り取り、チャック部での滑りの無いようにして引っ張り試験装置（株式会社島津製作所製「卓上型万能試験機ＡＧＳ−Ｈ」）に装着し、評点間距離＝３０ｍｍ、引っ張り速度＝１００ｍｍ／分にて引っ張り試験を行った結果、引っ張り破断強度が１１０ｋＰａ、破断伸びが３３０％、弾性率が２４ｋＰａであった。
【００４０】
このガス遮断ポリ袋に密封された電子線照射後のヒドロゲル（Ａ）を、ガス遮断ポリ袋から取り出し、２０℃で２Ｌの超純水に２日間浸漬して、ヒドロゲルを膨潤させてから取り出し、次いで５０℃の超純水１Ｌに２日間浸漬して、ヒドロゲルを収縮させてから取り出した。該洗浄による精製操作を３回繰り返した後、精製したシート状のヒドロゲル（Ａ）を直径８ｃｍの大きさに切断し、細胞培養基材（Ａ）とした。それを細胞培養用ディッシュ（ベクトン・ディッキンソン・ラブウェア社製「ファルコン３００３」）の中に移し替えてから蓋をして３７℃で静置した。なお、これらのガス遮断ポリ袋からの取り出しから細胞培養ディッシュ内に細胞培養基材（Ａ）を移し替えるまでの操作は、すべてクリーンベンチ内で行った。
【００４１】
これらの操作で得られた細胞培養基材（Ａ）の表面に付着した水分をていねいに取り除いてから、該細胞培養基材（Ａ）表面の２０℃および５０℃における水の接触角を接触角測定装置（協和界面科学株式会社製「ＣＡ−Ｘ２００」）を用いて測定した。各々の温度における水の接触角は２０℃では３０°、５０℃保持状態では６５°であり、得られた細胞培養基材（Ａ）は、温度条件により親水性と疎水性の両特性を示すことが確認された。
【００４２】
次に、得られた細胞培養基材（Ａ）を載せた細胞培養ディッシュを用いて、細胞の培養を行った。培養する細胞は、ヒト肝上皮細胞由来のガン細胞ＨｅｐＧ２細胞株（大日本製薬株式会社製）を使用した。培養は、ウシ胎児血清（ＩＣＮ製）を１０％含有するミニマム・エッセンシャル・イーグル培地（ＳＩＧＭＡ製）（ピルビン酸（ＩＣＮ製）及び非必須アミノ酸（ＩＣＮ製）を添加剤として含有）を使用して、５％二酸化炭素含有３７℃恒温器内で行った。播種してから１週間後、このディッシュ内の細胞培養基材（Ａ）の端を一部切り取り、２０℃恒温槽内に５分間静置してから、表面を光学顕微鏡にて観察したところ、細胞が細胞培養基材（Ａ）上に接着して、また十分に増殖していたことが確認された。この培養を行った細胞培養基材（Ａ）を載せたディッシュから細胞培養基材（Ａ）を培養した細胞ごと取り出して、トリプシン−ＥＤＴＡ処理を行うことにより、各細胞を個々の状態に分離した後、トリパンブルー染色を行うことによって、生細胞数を計測したところ、培養開始時には２．０×１０６個であった細胞数が、培養後は７．９×１０７個に増加したことが確認された。
【００４３】
（実施例２）
上記実施例１で得られた細胞培養基材（Ａ）を載せた細胞培養ディッシュを用いて、細胞の培養を行った。培養する細胞は、正常ヒト皮膚繊維芽細胞（大日本製薬株式会社製）を使用した。培養は、ＣＳ−Ｃ培地（大日本製薬株式会社製）を使用して、５％二酸化炭素含有３７℃恒温器内で行った。播種してから１週間後、このディッシュ内の細胞培養基材（Ａ）の端を一部切り取り、２０℃恒温槽内に５分間静置してから、表面を光学顕微鏡にて観察したところ、細胞が細胞培養基材（Ａ）上に接着して、また十分に増殖していたことが確認された。この培養を行った細胞培養基材（Ａ）含有ディッシュから細胞培養基材（Ａ）を培養した細胞ごと取り出して、あらかじめ２０℃に保持しておいたＣＳ−Ｃ培地を含む組織培養ディッシュに移し替えた。蓋をしてから２０℃で１０分間静置後、細胞培養基材（Ａ）上に増殖した細胞をピンセットで摘むことにより、細胞をシート状に細胞培養基材（Ａ）から分離できた。この時、細胞培養基材（Ａ）に何ら損傷はなく、またシート状の細胞にも何ら付着物は見られなかった。この取り出したシート状細胞についてトリプシン−ＥＤＴＡ処理を行うことにより、各細胞を個々の状態に分離した後、トリパンブルー染色を行うことによって、生細胞数を計測したところ、培養開始時には２．５×１０６個であった細胞数が、培養後は５．８×１０７個に増加したことが確認された。
【００４４】
（実施例３）
ＸＬＧを２．４ｇ加えること、及び得られたヒドロゲルに照射する電子線の線量を１０ｋＶとすること以外は実施例１と同様にして、無色透明で均一なシート状のヒドロゲル（Ｂ）を得た。シート状のヒドロゲル（Ｂ）の引っ張り試験を実施例１と同様の方法で行ったところ、引っ張り破断強度が１９０ｋＰａ、破断伸びが１２０％、弾性率が４１．７ｋＰａであった。このシート状のヒドロゲル（Ｂ）を、作製例１と同様にして、精製を行った後、直径８ｃｍの大きさに切断して細胞培養基材（Ｂ）とした。得られた細胞培養基材（Ｂ）の表面に置ける接触角は、５０℃保持状態で６１°であった。
【００４５】
得られた細胞培養基材（Ｂ）を載せた細胞培養ディッシュを用いて、細胞の培養を行った。培養する細胞は、ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（倉敷紡績株式会社製）を使用した。培養は、血管内皮細胞基礎培地（ＨｕＭｅｄｉａ−ＥＧ２：倉敷紡績株式会社製）にＨｕＭｅｄｉａ−ＥＧ２増殖添加剤（倉敷紡績株式会社製）を添加したものを培地として使用して、５％二酸化炭素含有３７℃恒温器内で行った。細胞を播種してから１週間後、このディッシュ内のヒドロゲルシートの端を一部切り取り、２０℃恒温槽内に５分間静置してから、表面を光学顕微鏡にて観察したところ、細胞が細胞培養基材（Ｂ）上に接着して、また十分に増殖していたことが確認された。この培養を行った細胞培養基材（Ｂ）含有ディッシュから細胞培養基材（Ｂ）を培養された細胞ごと取り出して、あらかじめ２０℃に保持しておいたウシ胎児血清を１０％含有するミニマム・エッセンシャル・イーグル培地を含む組織培養ディッシュに移し替えた。蓋をしてから２０℃で１０分間静置後、細胞培養基材（Ｂ）上に増殖した細胞をピンセットで摘むことにより、細胞をシート状に細胞培養基材（Ｂ）から分離できた。この時、細胞培養基材（Ｂ）に何ら損傷はなく、またシート状の細胞にも何ら付着物は見られなかった。この取り出したシート状細胞について実施例２と同様の方法で生細胞数を計測したところ、培養開始時には１．９×１０６個であった細胞数が、培養後には３．９×１０７個に増加したことが確認された。
【００４６】
（比較例１）
細胞培養用ディッシュ「ファルコン３００３」を何も表面処理を行わずに使用して、細胞培養を行った。細胞及び培地、培養条件は実施例２と同様にして行った。培養開始から１週間後にディッシュ表面を光学顕微鏡にて観察したところ、細胞が接着して増殖していることが確認された。この培養を行ったディッシュを２０℃の恒温槽に入れて，１０分間静置後、ディッシュ上の細胞を取り出そうとしたが、全く剥離しなかった。また、公知の方法により、トリプシンを用いて培養細胞の分離を行ったところ、細胞が個々の細胞に分かれてしまい、細胞をシート状に取り出すことは不可能であった。
【００４７】
（比較例２）
粘土鉱物を用いないこと以外は作製例１と同様にして、有機架橋ヒドロゲルを重合した。有機架橋剤としては、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（和光純薬工業株式会社製）をそのまま使用した。その結果、２０℃において白色化したシート状のヒドロゲル（Ｄ）が得られた。この得られたシート状のヒドロゲル（Ｄ）を作製例１と同様にして、精製を行ってから、細胞培養用ディッシュに移し替えたが、ヒドロゲルシート（Ｄ）は非常に脆く、精製及び移し替えは困難であった。またこのヒドロゲルシート（Ｄ）の接触角は、５０℃保持状態で４９°であった。
【００４８】
次に、このヒドロゲルシート（Ｄ）含有細胞培養ディッシュを用いて、実施例１と同様の方法で細胞培養を行った。培養開始から１週間後、このディッシュ内のヒドロゲルシートの端を一部切り取り、トリパンブルーにて染色したところ、ヒドロゲルシート上に細胞が増殖していることが確認された。この培養を行ったヒドロゲルシート含有ディッシュからヒドロゲルシートを培養された細胞ごと取り出そうとしたが、細胞とヒドロゲルシートの分離途中でヒドロゲルシートが破壊してしまい、全く細胞を剥離することが出来なかった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水溶性有機モノマーの重合体と水膨潤性粘土鉱物とから構成される三次元網目構造を有する有機無機複合高分子ヒドロゲルに放射線を照射してなる二重架橋型高分子ゲルからなる細胞培養基材に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、動物組織等の細胞培養基材としては、プラスチック（例：ポリスチレン）やガラスの容器が使用されてきた。これら容器は、細胞培養を有効に行わせるために、その表面にプラズマ処理や、シリコンや細胞接着因子等のコーティングなどの表面処理が施されている。従って、これら細胞培養容器を培養基材として用いた場合には、培養・増殖した細胞が表面処理された容器表面に接着しており、細胞を単離・回収するためには、トリプシン等のタンパク質加水分解酵素や化学薬品を用いて、容器表面から剥離する必要があった。このような酵素や化学薬品により細胞を剥離する操作は工程が煩雑であるほか、雑菌やＤＮＡあるいはＲＮＡ等の不純物が混入する恐れがあった。また、細胞と基材の結合部分が切断されるだけではなく、細胞同士の結合も切断されるため、細胞が増殖している形状（例：シート状）のままで取り出すことができなかったり、細胞の性質が変化してしまう問題があった。また、複数種の細胞培養を行う際には、複数の培養液等を交換して用いる必要があるが、容器の交換が出来ないために、容器内部に各種薬品等が残留してしまい、これらが培養細胞に混入するおそれがあるなど、培養細胞の利用の点から多くの課題を抱えていた。
【０００３】
近年、細胞培養容器の表面に温度応答性ポリマーを極薄くコーティングした基材を使用して、細胞培養温度ではポリマーを疎水性状態に保持して細胞を接着させ、培養後にポリマーを低温処理して親水性状態にすることにより、細胞とポリマーとの接着性を低下させ、細胞を加水分解酵素や化学薬品を使用することなしに基材から細胞をシート状に剥離するという技術が報告されている（例えば特許文献１及び２、非特許文献１参照）。しかしながら、上記基材はポリマーの架橋度によって性能が大きく変化し、架橋が不十分な場合は、細胞を剥離する際に、細胞と共にポリマーも基材から一部剥離してしまい、細胞と基材との分離が困難であった。また架橋が十分な場合には、温度応答性の応答速度が非常に悪くなり、ポリマーを親水性にするために長時間を要する問題があり、且つ、その間、細胞も低温状態にさらされる問題があった。さらに、該基材を使用した場合には、培養した細胞を次の実験に用いる場合（例えば動物の体内に移植する場合や、他の細胞と共培養を行う場合など）、シート状となった細胞をポリマーコーティングされた容器から剥離して支持体なしで移動させる必要があり、非常に強度の弱い剥離細胞シートを強引に掴んで次の使用位置等に移動させなければならず、細胞シートが傷つきやすかったり、操作性が非常に悪いという問題を有していた。これらのことから、細胞を培養した後、汚染や損傷させることなく、短時間で完全に基材から分離させること、且つ任意の場所で細胞シートを取り出し、次の工程に移動させ用いられるようにすることなどが求められていた。
【０００４】
一方、水溶性有機高分子と層状粘土鉱物とが複合化して形成された三次元網目を有する高分子ヒドロゲルが開示されている（特許文献３参照）。該高分子化合物は優れた吸水性や極めて高い伸張性などの特徴を有し、各種分野において有用な材料であるが、細胞培養基材としての有用性は知られていなかった。
【０００５】
【特許文献１】特公平６−１０４０６１公報
【特許文献２】特開平５−１９２１３８公報
【特許文献３】特開２００２−５３６２９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、柔軟かつ強靱な細胞培養基材、さらには培養した細胞を分離回収する際に細胞の破損や基材の混入がなく、迅速に培養した細胞を回収できる細胞培養基材、及び培養した細胞の回収が容易な細胞培養方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明において使用する、水溶性有機モノマーの重合体と、水膨潤性粘土鉱物とから構成される三次元網目構造を有する高分子ヒドロゲルに放射線を照射してなる二重架橋型高分子ゲルは、その状態が外部環境変化により親水性と疎水性が可逆的に変化することにより、その表面が疎水性である状態では、その表面上で好適に細胞を培養、増殖させることができ、また親水性を示す条件下では、細胞との接着性を低下させることができるため、培養、増殖させた細胞の破損や、基材の剥離混入を生じることなく、容易かつ迅速に剥離回収することができる。また柔軟かつ強靱な材料であることから、細胞をその表面上で各種形状のシート状に培養して、その形状を保った状態で次の実験に用いることを実現できる。
【０００８】
即ち本発明は、水溶性有機モノマーの重合体と、水膨潤性粘土鉱物とから構成される三次元網目構造を有する高分子ヒドロゲルに放射線を照射してなる二重架橋型高分子ゲルであり、かつ、外部環境変化にともない親水性と疎水性とが可逆的に変化することを特徴とする細胞培養基材、該細胞培養基材上で細胞を培養する細胞培養方法、および該細胞培養基材上で細胞を培養した後、該基材を親水性を示す温度とすることで培養した細胞を該細胞培養基材から分離する細胞分離方法を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の細胞培養基材は、水溶性有機モノマーの重合体と、水膨潤性粘土鉱物とから構成される三次元網目構造を有する高分子ヒドロゲルに放射線を照射してなる二重架橋型高分子ゲルであり、かつ、外部環境変化にともない親水性と疎水性とが可逆的に変化することを特徴とするため、優れた細胞培養特性を示し、また本発明の二重架橋型高分子ゲルは優れた柔軟性と強靱さを有することから、培養した細胞を基材ごと移送する際にも形状を保持したまま、安定に培養した細胞を移送できる。さらに最初の細胞培養後に共培養を行う場合等には、培養液や薬品による汚染がなく、再度の培養を行うことが可能である。また本願発明の二重架橋型高分子ゲルは、水溶性有機モノマーの重合体と、水膨潤性粘土鉱物とから構成される三次元網目構造を有する高分子ヒドロゲルに放射線を照射することにより、該高分子ヒドロゲルの力学物性および表面の平滑性及び疎水性等を細胞の接着及び伸展に適した状態に制御出来るため、優れた培養性能を有する。さらに、放射線を照射することにより滅菌を同時に行える効果を有する。
【００１０】
親水性と疎水性とが外部環境により可逆的に変化する二重架橋型高分子ゲルからなる細胞培養基材は、疎水性条件下では細胞と優れた接着性を示すため、細胞を好適に培養、増殖させることができ、また親水性条件下では、細胞との接着性を低下させることができるため、トリプシン等のタンパク質加水分解酵素や化学薬品を使用せずに細胞を剥離でき、細胞の破損や、基材の剥離混入を生じることなく、容易に細胞の回収が可能である。さらに、疎水性から親水性、あるいは親水性から疎水性への変化が迅速であるため、温度をはじめとする外部環境を変化させる際に細胞に与える影響が少ない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の細胞培養基材は、水溶性有機モノマーの重合体と水膨潤性粘土鉱物とから構成される三次元網目構造を有する高分子ヒドロゲルに放射線を照射してなる二重架橋型高分子ゲルからなる。
【００１２】
本発明の高分子ヒドロゲルに用いる水溶性有機モノマーは、水に溶解する性質を有し、水に均一分散可能な水膨潤性の粘土鉱物と相互作用を有するものであればよく、例えば、粘土鉱物と水素結合、イオン結合、配位結合、共有結合等を形成できる官能基を有するものが好ましい。これらの官能基を有する水溶性有機モノマーとしては、具体的には、アミド基、アミノ基、エステル基、水酸基、テトラメチルアンモニウム基、シラノール基、エポキシ基などを有する水溶性有機モノマーが挙げられ、なかでもアミド基を有する水溶性有機モノマーが好ましい。また、本発明で言う水には、水と混和する有機溶媒との混合溶媒で水を主成分とするものを含む。
【００１３】
本発明における水溶性有機モノマーの重合体は、水膨潤性粘土鉱物と三次元網目構造を形成して形状が安定な高分子ヒドロゲルを形成できることが必要で、アクリル系化合物や、ビニル系化合物などが使用できる。なかでも、得られる細胞培養基材から容易に培養した細胞を分離できることから、外部環境変化にともない水溶性または水を吸湿する親水性と疎水性が可逆的に変化するものであることが有効である。特に水溶液中でのポリマーの親水性と疎水性が温度、ｐＨ、溶質濃度、溶媒組成で変化するものが好んで用いられる。具体的には、例えば温度の場合、臨界温度（Ｔｃ）以上では疎水性となる下限臨界共溶温度（Lower Critical Solution Temperature：以下ＬＣＳＴと略記する。）を持つポリマーや、Ｔｃ以上で親水性となる、上限臨界共溶温度（Upper Critical Solution Temperature：以下ＵＣＳＴと略記する。）を持つポリマーがより好んで用いられる。特に好ましくは、Ｔｃ以上で疎水性、Ｔｃ以下で親水性となるＬＣＳＴを有するものである。また、溶質濃度の場合は、例えばある温度において、溶媒中の塩化ナトリウムの濃度が一定濃度以上では疎水性となり、一定濃度以下では親水性となるポリマーも好んで用いられる。さらに、溶媒組成の場合は、例えばある温度において、溶媒中の水に対するメタノール濃度が一定以上の濃度の場合は疎水性となり、一定濃度以下では親水性となるポリマーも好んで用いられる。
【００１４】
このような重合体を与える水溶性有機モノマーの例としては、Ｎ−置換アクリルアミド誘導体、Ｎ，Ｎ−ジ置換アクリルアミド誘導体、Ｎ−置換メタクリルアミド誘導体、Ｎ，Ｎ−ジ置換メタクリルアミド誘導体などを好ましく使用することができ、具体的にはＮ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルピペリディン、Ｎ−アクリロイルピロリディンがあげられる。
【００１５】
かかる有機モノマーの重合体としては、例えば、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド）、ポリ（Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド）、ポリ（Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド）、ポリ（Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド）、ポリ（Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−テトラフルフリルメタクリルアミド）、ポリ（Ｎ−エチルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−アクリロイルピペリディン）、ポリ（Ｎ−アクリロイルピロリディン）が例示される。
【００１６】
また水溶性有機モノマーの重合体としては、以上のような単一水溶性有機モノマーからの重合体の他、これらから選ばれる複数の異なる水溶性有機モノマーを重合して得られる共重合体を用いることも有効である。また上記水溶性有機モノマーからなる重合体が好ましいが、上記水溶性有機モノマーとそれ以外の水溶性有機モノマーまたは有機溶媒可溶性有機モノマーとの共重合体も、得られた重合体が親水性及び疎水性の両方を示すものであれば使用することが出来る。共重合に用いられる有機モノマーとしては、具体的にはＮ−アルキルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミド、アクリルアミド等のアクリルアミド類、または、Ｎ−アルキルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジアルキルメタクリルアミド、メタクリルアミド等のメタクリルアミド類が挙げられる。なお、より好ましくは、Ｎ−アルキルアクリルアミドまたはＮ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミドが用いられる。アルキル基としては、炭素数が１〜４のものが好ましく選択される。その他には、アクリロイルモルフォリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルメチルホモピペラディン、Ｎ−アクリロイルメチルピペラディン等も用いることが出来る。
【００１７】
本発明の細胞培養基材に用いられる粘土鉱物は、水又は水溶液中で層間が膨潤する性質を有することが必要である。より好ましくは少なくとも一部が水中で層状に剥離して分散できるものであり、更に好ましくは水中で１ないし１０層以内の厚みに、特に好ましくは水中で１ないし３層以内の厚みに層状に剥離して均一分散できる層状粘土鉱物である。例えば、水膨潤性スメクタイトや水膨潤性雲母などを用いることができ、具体的には、ナトリウムを層間イオンとして含む水膨潤性ヘクトライト、水膨潤性モンモリロナイト、水膨潤性サポナイト、水膨潤性合成雲母が挙げられる。
【００１８】
本発明の細胞培養基材を構成する水溶性有機モノマーと粘土鉱物との比率は、用いる水溶性有機モノマーや粘土鉱物の種類により適宜選択すればよいが、ゲルの合成が容易であることや、力学物性及び均一性に優れることなどから、水溶性有機モノマー重合体に対する粘土鉱物の質量比が０．０１〜１０であることが好ましく、より好ましくは０．０３〜２、特に好ましくは０．１〜１である。かかる質量比の範囲であれば、高分子ヒドロゲルの特性が十分に発揮され、調製が容易であり、また得られる細胞培養基材がより高い強度を示す。
【００１９】
本発明の二重架橋型高分子ゲルは、放射線を照射することにより、高分子ヒドロゲル内の有機モノマーの重合体同士が架橋することにより、二重架橋型高分子ゲルとなる。放射線の照射によって、二重架橋型となることにより伸び率と引っ張り弾性率が調整され、高分子ヒドロゲルの物性が細胞培養に適した範囲に制御されるばかりでなく、高分子ヒドロゲルの滅菌を行うことが可能となる。
【００２０】
本発明の細胞培養基材は、上記有機モノマーの重合体と水膨潤性粘土鉱物とが三次元網目構造を有する高分子ヒドロゲルに放射線を照射することによって得られる二重架橋型高分子ゲルであることから、細胞を培養した後、二重架橋型高分子ゲルから細胞を剥離する際に破壊することがなく、形状を維持できる特徴を有する。また本発明の細胞培養基材に用いられる二重架橋型高分子ゲルは、細胞を培養後、次の実験位置まで移動させる必要がある場合に、培養した細胞のシートを破壊することなく移動できる。
【００２１】
また、本発明の二重架橋型高分子ゲルは、放射線照射前の高分子ヒドロゲルが有する延伸性を抑制して安定な形状を保持させたものであるが、該高分子ヒドロゲルの含水率が９０％の条件において、該高分子ヒドロゲルの有する１ｋＰａ以上の引っ張り弾性率、１０ｋＰａ以上の引っ張り強度、および５０％以上の破断伸び等の優れた力学物性を有するものである。また引っ張り弾性率が１０ｋＰａ以上、引っ張り強度が５０ｋＰａ以上、破断伸びが５０％以上であればより好ましく、引っ張り弾性率が２０ｋＰａ以上、引っ張り強度が８０ｋＰａ以上、破断伸びが１００％以上であればさらに好ましい。これらの力学物性を持つ高分子ヒドロゲルに対して、放射線照射を行うことにより、細胞培養基材に適した二重架橋型高分子ゲルが得られる。
【００２２】
該高分子ヒドロゲルは、三次元網目構造を形成する上記水溶性有機モノマーの重合体により、外部環境条件に応じて親水性と疎水性とを有する。このため、該高分子ヒドロゲルからなる細胞培養基材は細胞を好適に培養でき、かつ培養した細胞の破壊や基材の剥離混入を生じることなく、培養した細胞を容易かつ迅速に剥離回収することができる。
【００２３】
高分子ヒドロゲルの親水性と疎水性とが変化する臨界温度は、細胞を好適に培養・剥離できることから、該臨界温度は０〜５０℃程度の温度範囲にあることが好ましい。該臨界温度は、使用するモノマーの重合体が有するＵＣＳＴ、ＬＣＳＴに影響されるため、ＵＣＳＴ、ＬＣＳＴが概ね該温度範囲内にあるものを選択し、使用する水膨潤性粘土鉱物の種類や、水溶性有機モノマーと水膨潤性粘土鉱物との比率などを適宜調整することで実現できる。
【００２４】
本発明の細胞培養基材に用いられる高分子ヒドロゲルは、単独で用いられる他、金属、セラミック、プラスチック等の平滑表面または凹凸表面を有する支持体に被覆して用いられる。また、各種形状に形成が可能であり、シート状、繊維状、中空繊維状、球状で用いることができる。
【００２５】
本発明の細胞培養基材に使用する高分子ヒドロゲルは、溶媒として、水、および水と共に、水に溶解している細胞培養に適したタンパク質などを含むものをいう。
【００２６】
本発明において細胞培養基材に用いられる高分子ヒドロゲルに含まれる溶媒の量は、目的に応じて設定され一概には規定されないが、高分子ヒドロゲルが上記の力学物性を発揮するためには、好ましくは疎水性状態となっている高分子ヒドロゲル中の固形分に対する溶媒の質量比が０．１〜５０のものが用いられ、さらに好ましくは０．１〜１０のものが用いられる。これらの溶媒量は、重合時の溶媒量、または重合後に高分子ヒドロゲルを疎水性の状態に変化させる時の保持状態等により、任意に制御することが可能である。
【００２７】
本発明の細胞培養基材を使用して培養を行うことが可能な細胞は、ヒト及び動物の組織細胞であれば特に制限はなく、例えば、血管細胞、繊維芽細胞、筋肉細胞、神経細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、肝細胞、膵臓細胞、角膜細胞などが挙げられる。これらのうち、血管内皮細胞、皮膚繊維芽細胞、肝実質細胞、肝ガン細胞、軟骨細胞等が好ましく用いられる。
【００２８】
本発明の細胞培養基材の製造方法としては、例えば、水溶性有機モノマーと水膨潤性粘土鉱物と水を含む均一分散液を調製した後、水膨潤性粘土鉱物共存下で水溶性有機モノマーを重合させることにより、高分子ヒドロゲルを調製する。ここで層状に剥離した粘土鉱物が架橋剤の働きをすることにより水溶性有機モノマー重合体と粘土鉱物との三次元網目が形成される。
【００２９】
水膨潤性粘土鉱物共存下での水溶性有機モノマーおよび有機架橋剤の重合反応は例えば、過酸化物を重合開始剤として使用して重合させる方法、加熱または放射線照射などの慣用の方法を用いたラジカル重合により行わせることが出来る。ラジカル重合開始剤及び触媒としては、慣用のラジカル重合開始剤及び重合促進剤のうちから適宜選択して用いることが出来、好ましくは水に分散性を有し、系全体に均一に含まれるものを用いることができる。特に好ましくは層状に剥離した粘土鉱物と強い相互作用を有するラジカル重合開始剤である。重合開始剤としては水溶性の過酸化物、例えばペルオキソ二硫酸カリウムやペルオキソ二硫酸アンモニウム、水溶性のアゾ化合物などを好ましく使用でき、具体的には、和光純薬工業株式会社製のＶＡ−０４４、Ｖ−５０、Ｖ−５０１などが好ましく使用できる。その他、ポリエチレンオキシド鎖を有する水溶性ラジカル開始剤なども使用できる。また重合促進剤としては、３級アミン化合物であるＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンやβ−ジメチルアミノプロピオニトリルなどを好適に使用できる。
【００３０】
上記重合反応時の温度は、用いる水溶性有機モノマー、有機架橋剤、重合促進剤及び開始剤の種類などに合わせて適宜選択すればよく、例えば０℃〜１００℃の範囲に設定出来る。また、重合温度を得られる高分子ヒドロゲルのＬＣＳＴ以下（またはＵＣＳＴ以上）の温度とする場合、重合後の高分子ヒドロゲルは親水性となるが、ＬＣＳＴ以上（またはＵＣＳＴ以下）の温度にて保持することにより、親水性から疎水性の状態に変化させることが出来、細胞培養に適した状態となる。また、ＬＣＳＴ以上（またはＵＣＳＴ以下）の温度で重合を行った場合は、高分子ヒドロゲルは疎水性の状態となって得られるので、そのまま細胞培養を行うことが出来る。即ち、どちらの重合方法を用いても、細胞培養基材として用いられる高分子ゲルを得ることは可能である。但し、ＬＣＳＴ以下（またはＵＳＣＴ以上）の温度にて重合を行うと、重合により得られる高分子ヒドロゲルを疎水性の状態に変化させた時に収縮が起こるが、ＬＣＳＴ以上（またはＵＣＳＴ以下）の温度で重合を行うと、重合により得られる高分子ヒドロゲルは疎水性状態のまま保たれるため、そのまま収縮せずに、または非常に少ない収縮で胞培養を行うことが出来るので好適である。以上のことは、その他の外部環境（溶液のｐＨ、重合時の親水性または疎水性を制御するために加える塩や、添加物等の溶質濃度、水と混和する有機溶剤等の溶媒組成）を変えても行う場合も同様で、有機モノマーの重合に差し支えない限り可能である。
【００３１】
重合時間は重合促進剤、開始剤、重合温度、重合溶液量（厚み）などの重合条件によって異なり、一概に規定できないが、一般に数十秒〜十数時間の間で行える。
本発明の二重架橋型高分子ゲルを得る際に、高分子ヒドロゲルに照射する放射線としては、電子線、ガンマ線、Ｘ線、紫外線、可視光などを用いることができるが、有機モノマーの重合体の架橋反応を起こすこと、及び高分子ヒドロゲルの滅菌を十分に行うことが可能である、電子線、またはガンマ線を用いることが好ましい。放射線の線量は、有機モノマーの重合体の必要とする二重架橋の程度により任意に調節可能であるが、好ましくは１ｋＧｙ〜５０ｋＧｙの範囲であり、より好ましくは５ｋＧｙ〜２０ｋＧｙの範囲である。１ｋＧｙ以上の線量で照射することにより、高分子ヒドロゲルの内部まで架橋反応が起こるようになり、また５０ｋＧｙ以下の線量であれば、高分子ヒドロゲルの放射線照射による劣化を抑制することが可能となる。
【００３２】
本発明の高分子ヒドロゲルに、上記の線量の放射線を照射することにより得られる二重架橋型高分子ゲルは、該高分子ヒドロゲルの表面が放射線照射により、平滑性、及び表面疎水性等が細胞の接着及び伸展に適した状態に制御できるため、特に優れた細胞培養性能を有する。
【００３３】
本発明の細胞培養基材の製造においては、重合時に重合容器の形状を変化させたり、重合後のゲルを切削加工したりすることにより種々の大きさや形状をもった細胞培養基材を調製できる。例えば、繊維状、棒状、平板状、円柱状、中空状、らせん状、あるいは球状など任意の形状を有する細胞培養基材を調製することが可能である。また重合反応時に慣用の界面活性剤を共存させる等の方法で、得られる細胞培養基材を微粒子形態で製造することも可能である。また、本発明の細胞培養基材は、一般に細胞培養に用いられているプラスチック製やガラス製のシャーレ等の非親水性の支持体の上に積層して用いることが好ましい。このような積層部材は、支持体上部で重合を行い、そのまま細胞培養に使用してもよいし、他の容器で重合後、基材表面に充填して細胞培養に使用しても良い。本発明の高分子ヒドロゲルはこのような重合調製後の移動が容易である特徴を有する。
【００３４】
本発明の細胞培養基材に用いられる高分子ヒドロゲルには、その特性を改良する目的で、重合時に公知慣用の有機架橋剤を使用してもよい。使用する有機架橋剤濃度は特に限定されず、目的に応じて選択できる。使用できる有機架橋剤としては、従来から公知のＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−プロピレンビスアクリルアミド、ジ（アクリルアミドメチル）エーテル、１，２−ジアクリルアミドエチレングリコール、１，３−ジアクリロイルエチレンウレア、エチレンジアクリレート、Ｎ，Ｎ’−ジアリルタータルジアミド、Ｎ，Ｎ’−ビスアクリリルシスタミンなどの二官能性化合物や、トリアリルシアヌレート、トリアリルイソシアヌレートなどの三官能性化合物が例示できる。
【００３５】
また、本発明の細胞培養基材に用いられる高分子ヒドロゲルには、本発明の効果を損なわない範囲で添加剤として、水溶性有機モノマーの重合体以外に、高分子化合物または低分子化合物を含有させたものが含まれる。例えばコラーゲンやヒアルロン酸等の細胞接着性因子、細胞増殖因子、ヒドロキシアパタイト粒子などを添加することができる。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲がこれらの実施例にのみ限定されるものではない。
【００３７】
（実施例１）
粘土鉱物には、［Ｍｇ５．３４Ｌｉ０．６６Ｓｉ８Ｏ２０（ＯＨ）４］Ｎａ＋０．６６の組成を有する水膨潤性合成ヘクトライト（Ｒｏｃｋｗｏｏｄ Ｌｔｄ．製「ラポナイトＸＬＧ」）を真空乾燥して用いた。有機モノマーは、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（興人株式会社製：以下、ＮＩＰＡと略記。）を既知の方法により精製して、重合禁止剤を取り除いてから使用した。重合開始剤は、ペルオキソ二硫酸カリウム（関東化学株式会社製：以下、ＫＰＳと略記。）をＫＰＳ／水＝０．４０／２０（ｇ／ｇ）の割合で脱酸素した超純水中に溶解し、水溶液にして使用した。重合促進剤は、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（和光純薬工業株式会社製：以下、ＴＥＭＥＤと略記。）を使用した。超純水は、全て微粒子除去用フィルターを通した高純度窒素をあらかじめ充分にバブリングさせ、含有酸素を除去してから使用した。
【００３８】
２０℃の恒温室において、内部を窒素置換した平底ガラス容器に、超純水５７．０６ｇとテフロン（登録商標）製攪拌子を入れ、攪拌しながら１．４４ｇのラポナイトＸＬＧを加え、無色透明の溶液を調製した。これにＮＩＰＡ６．７８ｇを加え、窒素雰囲気内で撹拌溶解により、無色透明溶液を得た。次に、ＫＰＳ水溶液３ｇとＴＥＭＥＤ４８μｌを攪拌しながら無色透明溶液に加えた。この溶液をあらかじめ窒素雰囲気中に静置して容器内の酸素を除去しておいた蓋付きのポリスチレン製容器（９ｃｍ×１５ｃｍ）３枚にそれぞれ酸素にふれないようにして移した後、密栓をし、２０℃の恒温水槽中で２０時間静置して重合を行った。なお、これらの溶液調製から重合までの操作は、全てクリーンベンチ内にて行い、さらに酸素を遮断した窒素雰囲気下で行った。重合開始から２０時間後に、ポリスチレン製容器内にほぼ無色透明で均一なシート状のヒドロゲル（Ａ）が得られた。
【００３９】
次に、このシート状のヒドロゲル（Ａ）をガス遮断ポリ袋に入れて密封し、電子線照射を行った（照射装置：ＥＰＳ−８００、株式会社ＮＨＶコーポレーション）。加速電圧は７００ｋＶ、照射量は２０ｋＧｙとした。照射後のヒドロゲル（Ａ）には特に変形や変色は見られなかった。この照射後のシート状のヒドロゲル（Ａ）を、ガス遮断ポリ袋から取り出し、２０℃の超純水中で少し膨潤させ含水率９０％に調整した後、１ｃｍ×５ｃｍの大きさに切り取り、チャック部での滑りの無いようにして引っ張り試験装置（株式会社島津製作所製「卓上型万能試験機ＡＧＳ−Ｈ」）に装着し、評点間距離＝３０ｍｍ、引っ張り速度＝１００ｍｍ／分にて引っ張り試験を行った結果、引っ張り破断強度が１１０ｋＰａ、破断伸びが３３０％、弾性率が２４ｋＰａであった。
【００４０】
このガス遮断ポリ袋に密封された電子線照射後のヒドロゲル（Ａ）を、ガス遮断ポリ袋から取り出し、２０℃で２Ｌの超純水に２日間浸漬して、ヒドロゲルを膨潤させてから取り出し、次いで５０℃の超純水１Ｌに２日間浸漬して、ヒドロゲルを収縮させてから取り出した。該洗浄による精製操作を３回繰り返した後、精製したシート状のヒドロゲル（Ａ）を直径８ｃｍの大きさに切断し、細胞培養基材（Ａ）とした。それを細胞培養用ディッシュ（ベクトン・ディッキンソン・ラブウェア社製「ファルコン３００３」）の中に移し替えてから蓋をして３７℃で静置した。なお、これらのガス遮断ポリ袋からの取り出しから細胞培養ディッシュ内に細胞培養基材（Ａ）を移し替えるまでの操作は、すべてクリーンベンチ内で行った。
【００４１】
これらの操作で得られた細胞培養基材（Ａ）の表面に付着した水分をていねいに取り除いてから、該細胞培養基材（Ａ）表面の２０℃および５０℃における水の接触角を接触角測定装置（協和界面科学株式会社製「ＣＡ−Ｘ２００」）を用いて測定した。各々の温度における水の接触角は２０℃では３０°、５０℃保持状態では６５°であり、得られた細胞培養基材（Ａ）は、温度条件により親水性と疎水性の両特性を示すことが確認された。
【００４２】
次に、得られた細胞培養基材（Ａ）を載せた細胞培養ディッシュを用いて、細胞の培養を行った。培養する細胞は、ヒト肝上皮細胞由来のガン細胞ＨｅｐＧ２細胞株（大日本製薬株式会社製）を使用した。培養は、ウシ胎児血清（ＩＣＮ製）を１０％含有するミニマム・エッセンシャル・イーグル培地（ＳＩＧＭＡ製）（ピルビン酸（ＩＣＮ製）及び非必須アミノ酸（ＩＣＮ製）を添加剤として含有）を使用して、５％二酸化炭素含有３７℃恒温器内で行った。播種してから１週間後、このディッシュ内の細胞培養基材（Ａ）の端を一部切り取り、２０℃恒温槽内に５分間静置してから、表面を光学顕微鏡にて観察したところ、細胞が細胞培養基材（Ａ）上に接着して、また十分に増殖していたことが確認された。この培養を行った細胞培養基材（Ａ）を載せたディッシュから細胞培養基材（Ａ）を培養した細胞ごと取り出して、トリプシン−ＥＤＴＡ処理を行うことにより、各細胞を個々の状態に分離した後、トリパンブルー染色を行うことによって、生細胞数を計測したところ、培養開始時には２．０×１０６個であった細胞数が、培養後は７．９×１０７個に増加したことが確認された。
【００４３】
（実施例２）
上記実施例１で得られた細胞培養基材（Ａ）を載せた細胞培養ディッシュを用いて、細胞の培養を行った。培養する細胞は、正常ヒト皮膚繊維芽細胞（大日本製薬株式会社製）を使用した。培養は、ＣＳ−Ｃ培地（大日本製薬株式会社製）を使用して、５％二酸化炭素含有３７℃恒温器内で行った。播種してから１週間後、このディッシュ内の細胞培養基材（Ａ）の端を一部切り取り、２０℃恒温槽内に５分間静置してから、表面を光学顕微鏡にて観察したところ、細胞が細胞培養基材（Ａ）上に接着して、また十分に増殖していたことが確認された。この培養を行った細胞培養基材（Ａ）含有ディッシュから細胞培養基材（Ａ）を培養した細胞ごと取り出して、あらかじめ２０℃に保持しておいたＣＳ−Ｃ培地を含む組織培養ディッシュに移し替えた。蓋をしてから２０℃で１０分間静置後、細胞培養基材（Ａ）上に増殖した細胞をピンセットで摘むことにより、細胞をシート状に細胞培養基材（Ａ）から分離できた。この時、細胞培養基材（Ａ）に何ら損傷はなく、またシート状の細胞にも何ら付着物は見られなかった。この取り出したシート状細胞についてトリプシン−ＥＤＴＡ処理を行うことにより、各細胞を個々の状態に分離した後、トリパンブルー染色を行うことによって、生細胞数を計測したところ、培養開始時には２．５×１０６個であった細胞数が、培養後は５．８×１０７個に増加したことが確認された。
【００４４】
（実施例３）
ＸＬＧを２．４ｇ加えること、及び得られたヒドロゲルに照射する電子線の線量を１０ｋＶとすること以外は実施例１と同様にして、無色透明で均一なシート状のヒドロゲル（Ｂ）を得た。シート状のヒドロゲル（Ｂ）の引っ張り試験を実施例１と同様の方法で行ったところ、引っ張り破断強度が１９０ｋＰａ、破断伸びが１２０％、弾性率が４１．７ｋＰａであった。このシート状のヒドロゲル（Ｂ）を、作製例１と同様にして、精製を行った後、直径８ｃｍの大きさに切断して細胞培養基材（Ｂ）とした。得られた細胞培養基材（Ｂ）の表面に置ける接触角は、５０℃保持状態で６１°であった。
【００４５】
得られた細胞培養基材（Ｂ）を載せた細胞培養ディッシュを用いて、細胞の培養を行った。培養する細胞は、ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（倉敷紡績株式会社製）を使用した。培養は、血管内皮細胞基礎培地（ＨｕＭｅｄｉａ−ＥＧ２：倉敷紡績株式会社製）にＨｕＭｅｄｉａ−ＥＧ２増殖添加剤（倉敷紡績株式会社製）を添加したものを培地として使用して、５％二酸化炭素含有３７℃恒温器内で行った。細胞を播種してから１週間後、このディッシュ内のヒドロゲルシートの端を一部切り取り、２０℃恒温槽内に５分間静置してから、表面を光学顕微鏡にて観察したところ、細胞が細胞培養基材（Ｂ）上に接着して、また十分に増殖していたことが確認された。この培養を行った細胞培養基材（Ｂ）含有ディッシュから細胞培養基材（Ｂ）を培養された細胞ごと取り出して、あらかじめ２０℃に保持しておいたウシ胎児血清を１０％含有するミニマム・エッセンシャル・イーグル培地を含む組織培養ディッシュに移し替えた。蓋をしてから２０℃で１０分間静置後、細胞培養基材（Ｂ）上に増殖した細胞をピンセットで摘むことにより、細胞をシート状に細胞培養基材（Ｂ）から分離できた。この時、細胞培養基材（Ｂ）に何ら損傷はなく、またシート状の細胞にも何ら付着物は見られなかった。この取り出したシート状細胞について実施例２と同様の方法で生細胞数を計測したところ、培養開始時には１．９×１０６個であった細胞数が、培養後には３．９×１０７個に増加したことが確認された。
【００４６】
（比較例１）
細胞培養用ディッシュ「ファルコン３００３」を何も表面処理を行わずに使用して、細胞培養を行った。細胞及び培地、培養条件は実施例２と同様にして行った。培養開始から１週間後にディッシュ表面を光学顕微鏡にて観察したところ、細胞が接着して増殖していることが確認された。この培養を行ったディッシュを２０℃の恒温槽に入れて，１０分間静置後、ディッシュ上の細胞を取り出そうとしたが、全く剥離しなかった。また、公知の方法により、トリプシンを用いて培養細胞の分離を行ったところ、細胞が個々の細胞に分かれてしまい、細胞をシート状に取り出すことは不可能であった。
【００４７】
（比較例２）
粘土鉱物を用いないこと以外は作製例１と同様にして、有機架橋ヒドロゲルを重合した。有機架橋剤としては、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（和光純薬工業株式会社製）をそのまま使用した。その結果、２０℃において白色化したシート状のヒドロゲル（Ｄ）が得られた。この得られたシート状のヒドロゲル（Ｄ）を作製例１と同様にして、精製を行ってから、細胞培養用ディッシュに移し替えたが、ヒドロゲルシート（Ｄ）は非常に脆く、精製及び移し替えは困難であった。またこのヒドロゲルシート（Ｄ）の接触角は、５０℃保持状態で４９°であった。
【００４８】
次に、このヒドロゲルシート（Ｄ）含有細胞培養ディッシュを用いて、実施例１と同様の方法で細胞培養を行った。培養開始から１週間後、このディッシュ内のヒドロゲルシートの端を一部切り取り、トリパンブルーにて染色したところ、ヒドロゲルシート上に細胞が増殖していることが確認された。この培養を行ったヒドロゲルシート含有ディッシュからヒドロゲルシートを培養された細胞ごと取り出そうとしたが、細胞とヒドロゲルシートの分離途中でヒドロゲルシートが破壊してしまい、全く細胞を剥離することが出来なかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶性有機モノマーの重合体と、水膨潤性粘土鉱物とから構成される三次元網目構造を有する高分子ヒドロゲルに放射線を照射してなる二重架橋型高分子ゲルからなり、かつ、外部環境変化にともない親水性と疎水性とが可逆的に変化することを特徴とする細胞培養基材。
【請求項２】
前記二重架橋型高分子ゲルが、一定の温度を境界にして親水性と疎水性とが可逆的に変化する二重架橋型高分子ゲルである請求項１に記載の細胞培養基材。
【請求項３】
前記水溶性有機モノマーの重合体が、下限臨界共溶温度を有する請求項１又は２に記載の細胞培養基材。
【請求項４】
前記水溶性有機モノマーが、Ｎ−置換アクリルアミド誘導体、Ｎ，Ｎ−ジ置換アクリルアミド誘導体、Ｎ−置換メタクリルアミド誘導体、Ｎ，Ｎ−ジ置換メタクリルアミド誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項３に記載の細胞培養基材。
【請求項５】
前記水溶性有機モノマーが、Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−シクロプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−エトキシエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルピペリディン、Ｎ−アクリロイルピロリディンからなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項３に記載の細胞培養基材。
【請求項６】
前記水膨潤性粘土鉱物が、水膨潤性のヘクトライト、水膨潤性のモンモリロナイト、水膨潤性のサポナイト、水膨潤性の合成雲母からなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項１〜５のいずれかに記載の細胞培養基材。
【請求項７】
前記二重架橋型高分子ゲルが、含水率９０％の条件において、１ｋＰａ以上の引っ張り弾性率、２０ｋＰａ以上の引っ張り強度、および５０％以上の破断伸びを有する二重架橋高分子ゲルである請求項１〜６のいずれかに記載の細胞培養基材。
【請求項８】
前記放射線が、ガンマ線、及び電子線から選ばれる少なくとも一種である請求項１〜７のいずれかに記載の細胞培養基材。
【請求項９】
前記放射線の照射線量が１ｋＧｙ〜５０ｋＧｙの範囲にある請求項１〜８のいずれかに記載の細胞培養基材。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の細胞培養基材を使用して、該細胞培養基材が疎水性を示す温度で細胞を培養した後、該細胞培養基材の温度を下げ、該細胞培養基材が親水性を示す温度とすることにより培養した細胞を該細胞培養基材から分離する細胞培養方法。
【請求項１】
水溶性有機モノマーの重合体と、水膨潤性粘土鉱物とから構成される三次元網目構造を有する高分子ヒドロゲルに放射線を照射してなる二重架橋型高分子ゲルからなり、かつ、外部環境変化にともない親水性と疎水性とが可逆的に変化することを特徴とする細胞培養基材。
【請求項２】
前記二重架橋型高分子ゲルが、一定の温度を境界にして親水性と疎水性とが可逆的に変化する二重架橋型高分子ゲルである請求項１に記載の細胞培養基材。
【請求項３】
前記水溶性有機モノマーの重合体が、下限臨界共溶温度を有する請求項１又は２に記載の細胞培養基材。
【請求項４】
前記水溶性有機モノマーが、Ｎ−置換アクリルアミド誘導体、Ｎ，Ｎ−ジ置換アクリルアミド誘導体、Ｎ−置換メタクリルアミド誘導体、Ｎ，Ｎ−ジ置換メタクリルアミド誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項３に記載の細胞培養基材。
【請求項５】
前記水溶性有機モノマーが、Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−シクロプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−エトキシエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルピペリディン、Ｎ−アクリロイルピロリディンからなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項３に記載の細胞培養基材。
【請求項６】
前記水膨潤性粘土鉱物が、水膨潤性のヘクトライト、水膨潤性のモンモリロナイト、水膨潤性のサポナイト、水膨潤性の合成雲母からなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項１〜５のいずれかに記載の細胞培養基材。
【請求項７】
前記二重架橋型高分子ゲルが、含水率９０％の条件において、１ｋＰａ以上の引っ張り弾性率、２０ｋＰａ以上の引っ張り強度、および５０％以上の破断伸びを有する二重架橋高分子ゲルである請求項１〜６のいずれかに記載の細胞培養基材。
【請求項８】
前記放射線が、ガンマ線、及び電子線から選ばれる少なくとも一種である請求項１〜７のいずれかに記載の細胞培養基材。
【請求項９】
前記放射線の照射線量が１ｋＧｙ〜５０ｋＧｙの範囲にある請求項１〜８のいずれかに記載の細胞培養基材。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の細胞培養基材を使用して、該細胞培養基材が疎水性を示す温度で細胞を培養した後、該細胞培養基材の温度を下げ、該細胞培養基材が親水性を示す温度とすることにより培養した細胞を該細胞培養基材から分離する細胞培養方法。
【公開番号】特開２００６−２９６２５７（Ｐ２００６−２９６２５７Ａ）
【公開日】平成１８年１１月２日（２００６．１１．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１２０８８６（Ｐ２００５−１２０８８６）
【出願日】平成１７年４月１９日（２００５．４．１９）
【出願人】（０００１７３７５１）財団法人川村理化学研究所 (206)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１１月２日（２００６．１１．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年４月１９日（２００５．４．１９）
【出願人】（０００１７３７５１）財団法人川村理化学研究所 (206)
【Ｆターム（参考）】
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