細胞培養容器
【課題】細胞観察時などに求められる細胞培養容器の機能に対する、接着剤又は粘着剤による妨害が少なくなるよう設計された、機能性基体を備える細胞培養容器を提供する。
【解決手段】細胞培養容器７００は、容器本体部材（２０１’，２０２）と、機能性基体２１０とを備え、機能性基体２１０の基材層５０２側の面の周縁領域と、該領域に対面する容器本体部材の表面領域とが接着剤又は粘着剤７５０を介して接合されており、基材層５０２側の面の中央領域には接着剤又は粘着剤が存在しない。好ましくは容器本体部材の、機能性基体２１０の基材層５０２側の面の周縁領域と接合される部分に包囲された部分には開口７０１が形成されており、基材層５０２側の面の中央領域は開口７０１を通じて露出している。
【解決手段】細胞培養容器７００は、容器本体部材（２０１’，２０２）と、機能性基体２１０とを備え、機能性基体２１０の基材層５０２側の面の周縁領域と、該領域に対面する容器本体部材の表面領域とが接着剤又は粘着剤７５０を介して接合されており、基材層５０２側の面の中央領域には接着剤又は粘着剤が存在しない。好ましくは容器本体部材の、機能性基体２１０の基材層５０２側の面の周縁領域と接合される部分に包囲された部分には開口７０１が形成されており、基材層５０２側の面の中央領域は開口７０１を通じて露出している。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、機能性有機化合物層を備える機能性基体が固定された細胞培養容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
温度応答性ポリマー等の機能性有機化合物層を表面に被覆した、シャーレなどの細胞培養容器が特許文献１に記載されている。この細胞培養容器を用いることにより、温度を変化させるだけで培養・増殖後の細胞を破壊することなく細胞支持体から容易に剥離して回収することができる。しかし、特許文献１に記載のように、シャーレなどの細胞培養容器に、別個にバッチ処理により表面処理をして機能性化合物層を設けることは、多くの手間を必要としており、作業性の観点からはなお改善する余地がある。
【０００３】
そこで、特許文献２等において、機能性化合物層を表面に備える、フィルム状、板状等の形状の機能性基体を別途作成し、該機能性基体を、細胞培養容器に固定する技術が提案されている。この技術によれば、細胞培養容器を個別にバッチ処理して機能性有機化合物層を設ける場合と比較して作業性が高まる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平２−２１１８６５号公報
【特許文献２】特開２０１０−９８９７９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献２等に開示されている、機能性基体を細胞培養容器に固定する従来技術では、機能性基体の基材層側の表面の全面と、容器本体部材の表面とを接着剤や粘着剤等を介して接合することが通常である（例えば特許文献２図１）。
【０００６】
しかしながら機能性基体の基材層側表面の全体に接着剤又は粘着剤が存在する場合には、種々の不都合が生じる。例えば、底板中央に開口が形成された皿形状等の細胞培養容器に、機能性基体を、基材層側表面を下側にして容器内側から前記開口を塞ぐように接着する場合において、基材層側表面の全面に接着剤又は粘着剤が存在すると、前記開口から露出した基材層側表面上の接着剤又は粘着剤に塵などが付着してしまい、培養細胞の観察の妨げとなるという問題がある。更に、開口を有していない通常の底板部材を備えた細胞培養容器に、機能性基体を、基材層側表面を下側にして接着する場合であっても、基材層側表面の全面に接着剤又は粘着剤が存在すると、容器内の培養細胞を蛍光顕微鏡により観察する際に、機能性基体の中央部下面の接着剤又は粘着剤による自家蛍光がノイズとなり観察の妨げとなるという問題がある。
【０００７】
そこで本発明は、細胞観察時などに求められる細胞培養容器の機能に対する、接着剤又は粘着剤による妨害が少なくなるよう設計された、機能性基体を備える細胞培養容器を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、機能性基体と容器本体部材とを、機能性基体の基材層側表面の一部の領域のみに接着剤又は粘着剤を配置して接合することにより、上記課題が解決することを見出した。本発明は以下の発明を包含する。
【０００９】
（１）細胞及び培地を収容するための容器部を備える細胞培養容器であって、
容器部は、
容器本体部材と、
基材層及び該基材層上に配置された機能性有機化合物層を少なくとも備える機能性基体と、
を少なくとも備え、
機能性基体が容器本体部材に、細胞及び培地を収容するための空間側に機能性有機化合物層側の面が向いた状態で固定されるように、機能性基体の基材層側の面の一部の領域と、容器本体部材の表面の、前記一部の領域と対面する領域とが、接着剤又は粘着剤を介して接合されており、
機能性基体の基材層側の面の、前記一部の領域以外の領域上には接着剤及び粘着剤が存在しない、
ことを特徴とする細胞培養容器。
（２）機能性基体の基材層側の面の前記一部の領域が、機能性基体の基材層側の面の周縁領域であり、機能性基体の基材層側の面の、前記周縁領域に包囲された領域上には接着剤及び粘着剤が存在しない、（１）の細胞培養容器。
（３）容器本体部材の、機能性基体の基材層側の面の周縁領域と接着剤又は粘着剤を介してその表面が接合される部分により包囲された部分に開口が形成されており、機能性基体の基材層側の面の前記周縁領域により包囲された領域は前記開口を通じて露出している、（２）の細胞培養容器。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係る機能性基体を備える細胞培養容器では、細胞培養容器の機能に対する、接着剤又は粘着剤による妨害が少ない。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１Ａは、本発明の細胞培養容器の一例を示す。図１ＢはＩ−Ｉ’断面図である。図１ＣはＩＩ−ＩＩ’断面図である。
【図２】図２Ａは、本発明の細胞培養容器の他の一例を示す。図２ＢはＩＩＩ−ＩＩＩ’断面図である。
【図３】図３は、容器部分部材に機能性基体を固定した後に他の部材を組み合わせて容器部を完成させる場合の一例を示す。
【図４】図４は、容器部分部材に機能性基体を固定した後に他の部材を組み合わせて容器部を完成させる場合の他の一例を示す。
【図５】図５は、機能性基体の断面図を示す。
【図６】図６Ａは、容器の一部に開口が形成されている、本発明の細胞培養容器の一例を示す。図６ＢはＩＶ−ＩＶ’断面図である。
【図７】図７Ａは、容器の一部に開口が形成されている、本発明の細胞培養容器の他の一例を示す。図７ＢはＶ−Ｖ’断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
＜細胞培養容器の形状＞
本発明において製造される細胞培養容器の全体の形状について説明する。
本発明により製造される細胞培養容器は、細胞及び培地を収容するための容器部を少なくとも備え、更に適宜蓋等を備える。
【００１３】
容器部は図１に示すように、細胞及び培地を収容するための空間が壁面により閉塞された形状であってもよいし、図２に示すように該空間の一端が開放された形状であってもよい。
【００１４】
容器部の好ましい実施形態の一例を図１に示す。図１Ａに示す容器部１００は、底部１０１と、底部１０１の周縁に立設された側壁部１０２と、側壁部１０２の上端部に接合された、底部１０１に対向配置される天面部１０３とを少なくとも備える。側壁部１０２の一部に通孔１０４が穿設されており、通孔１０４の周縁から容器部外側に延びる首部１０５を備える、「フラスコ型」と呼ばれる形状の容器部である。容器部１００の首部１０５には蓋１１０を係止するための係止部１０６が形成されており、該係止部を介して蓋１１０が着脱可能に装着される。容器部１００と蓋１１０とを組み合わせることによりフラスコ型の細胞培養容器１２０が形成される。
【００１５】
図１Ｂは容器部１００のＩ−Ｉ’断面図を示し、図１ＣはＩＩ−ＩＩ’断面図を示す。容器部１００の、底部１０１、側壁部１０２及び天面部１０３に包囲される部分には、細胞及び培地を収容するための空間１３０が形成されている。空間１３０に面する内壁面の一部分（図１に示す実施形態では底部１０１）には、機能性基体１４０が固定されている。
【００１６】
容器部の他の実施形態としては、図２に示すように、底部２０１と、底部２０１の周縁に立設した側壁部２０２とを備える皿状の容器部２００が挙げられる。底部２０１の、細胞及び培地を収容するための空間２２０の側の面（内底面）には機能性基体２１０が固定されている。
【００１７】
機能性基体の基材層の側の面の一部の領域と、該領域に対面する底部の表面の領域とが接着剤又は粘着剤１５０，２５０を介して接合されている。
【００１８】
本発明では、容器部のうち、機能性基体を除いた部分を「容器本体部材」と称する。例えば図１の容器部１００では、容器本体部材とは、底部１０１、側壁部１０２、天面部１０３及び首部１０５から構成される部分であり、図２の容器部２００では、容器本体部材とは、底部２０１及び側壁部２０２から構成される部分である。
【００１９】
機能性基体が接合された容器本体部材を製造するためには、容器本体部材に機能性基体を接合してもよいし、容器本体部材の一部である部材（以下「容器部分部材」と呼ぶことがある）に機能性基体を接合し、続いて容器部分部材と他の部材とを接合して容器部を完成させてもよい。このように分割して容器部を形成する点について図３及び４に沿ってより説明する。
【００２０】
図３に示すように、機能性基体の接合後に容器部１００を形成するための一実施形態では、はじめに底部１０１と側壁部１０２とからなる容器部分部材３０１の内底面に、機能性基体１４０を接合する。次いで、天面部１０３に対応する天面部材３０２を接合することにより容器部１００を形成させる。容器部分部材３０１と天面部材３０２との接合は、細胞培養の目的に応じて、必要な場合は培養液が漏出しないように液密に接合される。
【００２１】
図４に示す、機能性基体の接合後に容器部１００を形成するための他の実施形態では、はじめに底部１０１に対応する容器部分部材４０１の、完成後に空間１３０に臨む側の面に、機能性基体１４０を接合する。首部１０５を備えた側壁部１０２に対応する側壁部材４０２と、天面部１０３に対応する天面部材３０２とを接合することにより容器部１００を形成する。
複数の部材の組み合わせは図３及び４に示した形態には限定されない。
【００２２】
＜細胞培養容器の材料＞
容器本体部材及び蓋などの他の細胞培養容器の部材を形成する材料は特に限定されず、細胞培養において一般的に用いられる材料を用いることができる。例えば、ポリスチレン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリエチレンテレフタレート樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂等の樹脂材料、表面親水化処理を施した上記の少なくとも１種を含む樹脂材料、及びガラスや石英等の無機材料であることができるが、好ましくは樹脂材料である。樹脂材料としては、ポリスチレン樹脂又はポリエチレンテレフタレート樹脂であることが好ましい。
容器本体部材は、該部材を通じて容器外から培養細胞を観察することが可能な透明な材料で構成されていることが好ましい。
【００２３】
＜機能性基体＞
本発明における機能性基体１４０，２１０の厚さ方向に沿った断面は、図５に示すように、基材層５０２及び該基材層５０２上に配置された機能性有機化合物層５０１を少なくとも備える。ここで「基体」とは、所定の構造を有している限り、フィルムであってもよいし、板状体であってもよい。
【００２４】
フィルム状の機能性基体（以下「機能性フィルム」と呼ぶことがある）は、好ましくはロール状に巻き取り可能な可撓性を有するものである。可撓性の機能性フィルムは、ロール・ツー・ロール法による大量生産が容易であるため好ましい。
【００２５】
機能性基体は、典型的には、透明な機能性基体である。
機能性基体は、基材層に機能性有機化合物層を適当な方法により形成することにより製造することができる。基材層と機能性有機化合物層との間には必要に応じて１つ以上の他の層（例えば後述するプライマー層）が存在していてもよい。
【００２６】
機能性基体の形状は、固定される部材の領域の形状に応じた任意の形状であることができる。例えば、三角形、四角形（長方形、正方形、平行四辺形、菱形等）、五角形、六角形、七角形、八角形等の多角形や、円形、楕円形等の形状であることができる。
【００２７】
＜基材層＞
基材層は、最終的な機能性基体に応じて適宜選択される。機能性基体が板状であれば板状の基材層が用いられ、機能性基体がフィルム状であればフィルム状の基材層（以下「フィルム基材層」という）が用いられる。
【００２８】
基材層は、一方の表面に上述の機能性有機化合物層を形成することが可能な材料を含むものであればよく、材料の種類は特に限定されない。典型的には、基材層の材料として、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ＴＡＣ（トリアセチルセルロース）、ポリイミド（ＰＩ）、ナイロン（Ｎｙ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、中密度ポリエチレン（ＭＤＰＥ）、塩化ビニル、塩化ビニリデン、ポリフェニレンサルファイド、ポリエーテルサルフォン、ポリエチレンナフタレート、ポリプロピレン、アクリル等の樹脂材料や、ガラスや石英等の無機材料が挙げられ、樹脂材料が好ましい。
【００２９】
基材層の、機能性有機化合物層が形成される側の表面は、易接着処理された表面であることができる。「易接着処理」とは、例えば、ポリエステル、アクリル酸エステル、ポリウレタン、ポリエチレンイミン、シランカップリング剤、ペルフルオロオクタンスルホン酸（ＰＦＯＳ）等の易接着剤による処理を指す。
【００３０】
基材層の厚さは適宜選択することができる。基材層がフィルム基材層である場合、その厚さ（フィルム基材層が基材の層に加えて易接着層を備える場合は、易接着層を含むフィルム基材層の全体の厚さを指す）は特に制限は無いが、可撓性を付与する厚さであることが好ましく、例えば５〜５００μｍ、より好ましくは２０〜５００μｍ、特に好ましくは５０〜２５０μｍである。
【００３１】
＜機能性有機化合物層＞
機能性有機化合物層を構成する有機化合物としては、所望の機能を有する層であれば特に限定されないが、より好ましくは、所定の刺激によって細胞接着性から細胞非接着性へと変化することが可能な表面を有する刺激応答性ポリマーや、1つ以上のエチレングリコール単位（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）からなるエチレングリコール鎖等の親水性化合物が挙げられる。
【００３２】
機能性有機化合物層の膜厚は、例えば、０．５ｎｍ〜３００ｎｍの範囲内とするよく、なかでも１ｎｍ〜１００ｎｍの範囲内であることが好ましい。
【００３３】
以下「刺激応答性ポリマー層」及び「親水性化合物層」の好適な実施形態について説明する。
＜刺激応答性ポリマー層＞
機能性有機化合物層は、刺激応答性ポリマー層であることが特に好ましい。刺激応答性ポリマー層とは、所定の刺激によって表面の細胞の接着度合いが変化するポリマーを含む層である。刺激応答性ポリマーとしては、温度応答性ポリマー、ｐＨ応答性ポリマー、イオン応答性ポリマー、光応答性ポリマーなどを挙げることができる。なかでも温度応答性ポリマーが、刺激の付与が容易であることから好ましい。
【００３４】
温度応答性ポリマーとして、例えば、細胞を培養する温度では細胞接着性を示し、作製した細胞シートの剥離する時の温度では細胞非接着性を示すものを用いるとよい。例えば、温度応答性ポリマーは、臨界溶解温度未満の温度では周囲の水に対する親和性が向上し、ポリマーが水を取り込んで膨潤して表面に細胞を接着しにくくする性質（細胞非接着性）を示し、同温度以上の温度ではポリマーから水が脱離することでポリマーが収縮して表面に細胞を接着しやすくする性質（細胞接着性）を示すものを用いるとよい。このような臨界溶解温度は、下限臨界溶解温度と呼ばれる。下限臨界溶解温度Ｔが０℃〜８０℃、さらに好ましくは０℃〜５０℃である温度応答性ポリマーを用いるとよい。Ｔが０℃〜８０℃であると、細胞を安定的に培養できるからである。
【００３５】
好適な温度応答性ポリマーとしてはアクリル系ポリマー又はメタクリル系ポリマーが挙げられる。具体的に好適な温度応答性ポリマーとしては、例えばポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド(Ｔ＝３２℃)、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド(Ｔ＝２１℃)、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド(Ｔ＝３２℃)、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド(Ｔ＝約３５℃)、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド(Ｔ＝約２８℃)、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（Ｔ＝約３５℃）、及びポリ−Ｎ,Ｎ−ジエチルアクリルアミド(Ｔ＝３２℃)等が挙げられる。
【００３６】
これらのポリマーを形成するためのモノマーとしては、放射線照射によって重合し得るモノマーを用いることができる。モノマーとしては例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体、及びビニルエーテル誘導体等が挙げられ、これらの１種以上を使用してよい。モノマーが一種類単独で使用された場合、基材上に形成されるポリマーはホモポリマーとなり、モノマーが複数種一緒に使用された場合、基材上に形成されるポリマーはヘテロポリマーとなるが、どちらの形態も本発明に包含される。
【００３７】
また、増殖細胞の種類によってＴを調節する必要がある場合や、被覆物質と細胞培養支持体との相互作用を高める必要が生じた場合や、細胞支持体の親水・疎水性のバランスを調整する必要がある場合などには、上記以外の他のモノマー類を更に加えて共重合してよい。更に本発明に使用する上記ポリマーとその他のポリマーとのグラフト又はブロック共重合体、あるいは本発明のポリマーと他のポリマーとの混合物を用いてもよい。また、ポリマー本来の性質が損なわれない範囲で架橋することも可能である。
【００３８】
ｐＨ応答性ポリマー及びイオン応答性ポリマーは作製しようとする細胞シートに適したものを適宜選択することができる。
【００３９】
刺激応答性ポリマー層は、重合して目的の刺激応答性ポリマーを形成するモノマーと、該モノマーを溶解しうる有機溶媒と含む塗布用組成物を調製し、これを慣用の塗布方法に従って、基材層の表面に塗布して塗膜を形成し、次に、該塗膜に放射線照射等の適当な手段により塗膜中のモノマーを重合してポリマーを形成するとともに、基材層の表面とポリマーとの間にグラフト化反応を生じさせることにより形成することができる。
【００４０】
＜親水性化合物層＞
機能性有機化合物層の他の実施形態として、1つ以上のエチレングリコール単位からなるエチレングリコール鎖（複数のエチレングリコール単位からなるエチレングリコール鎖は、「ポリエチレングリコール鎖」ということができる）等の親水性化合物の層が挙げられる。
【００４１】
エチレングリコール鎖の末端は水酸基により封鎖された形態であってもよいし、エチレングリコール鎖の末端に生体関連物質等の他の物質が共有結合により連結された形態であってもよい。
【００４２】
末端が水酸基により封鎖されたエチレングリコール鎖を含む層は、細胞が接着し難い親水性の表面を提供することができる。
【００４３】
エチレングリコール鎖の末端に共有結合されうる生体関連物質としては、抗原、抗体、DNA、RNA、ペプチド、ホルモン、酵素、サイトカイン、糖鎖、脂質、補酵素、酵素阻害剤、細胞、その他の機能を有するタンパク質が含まれる。更に、このような生体関連物質と親和性を有する低分子化合物、及び高分子化合物も生体関連物質の範囲に含まれる。
【００４４】
エチレングリコール鎖等の親水性化合物の層を、樹脂製の基材層の表面に固定化するためには、予め、樹脂製の基材層の表面に、該表面に物理的に吸着可能であって、エチレングリコール鎖の末端の水酸基と反応して共有結合を形成可能な官能基を側鎖に含むポリシロキサンを含むプライマー層を設ける。ポリシロキサンの側鎖上の官能基としては、グリシジル基又はエポキシ基が好ましい。プライマー層は、基材層の表面に、所望の側鎖を有するシラノール化合物を適用し、該表面上で縮合重合してポリシロキサンに変換することにより形成することができる。
【００４５】
次いで、プライマー層の官能基と、エチレングリコール又はエチレングリコール単位が２以上繰り返されたポリエチレングリコールの水酸基とを反応させて共有結合を形成し、エチレングリコール鎖を固定化する。このとき、触媒量の濃硫酸を含むエチレングリコール又はポリエチレングリコールをプライマー層に接触させる。
末端が水酸基により封鎖されたエチレングリコール鎖を含む層はこのようにして形成される。
【００４６】
更に、必要に応じて、エチレングリコール鎖の一端に、他の物質との共有結合を形成することが可能な、少なくとも１つの官能基を直接的又は間接的に連結させる。官能基の導入方法は特に限定されない。
【００４７】
＜機能性基体と容器本体部材との接合＞
本発明では、機能性基体が容器本体部材に、細胞及び培地を収容するための空間側に機能性有機化合物層側の面が向いた状態で固定されるように、機能性基体の基材層側の面の一部の領域と、容器本体部材の表面の、前記一部の領域と対面する領域とが、接着剤又は粘着剤を介して接合されていること、並びに、機能性基体の基材層側の面の、前記一部の領域以外の領域上には接着剤及び粘着剤が存在しないことを特徴とする。
【００４８】
本発明において「接着剤」及び「粘着剤」はそれぞれ機能性基体の基材層と容器本体部とを接合可能なものであれば特に限定されないが、具体的には接着剤としてはポリアクリル酸エステル系接着剤、シアノアクリレート系接着剤、、ポリエステル系接着剤、ポリアミド系接着剤、ポリイミド系接着剤、エポキシ系接着剤、ポリウレタン系接着剤、メタクリル系接着剤、ゴム系接着剤、シリコーン系接着剤、無機系接着剤等の接着剤などが例示でき、粘着剤としてはアクリル系粘着剤や、ウレタン系粘着剤、シリコーン系粘着剤、ゴム系粘着剤が例示できる。
【００４９】
本発明では機能性基体の基材層側の面の一部の領域と、容器本体部材の表面の、前記一部の領域と対面する領域とが、接着剤又は粘着剤を介して接合されていること、並びに、機能性基体の基材層側の面の、前記一部の領域以外の領域上には接着剤及び粘着剤が存在しないことを特徴とする。
【００５０】
ここで、「一部の領域」とは、特に限定されないが、好ましくは枚葉状の機能性基体において、基材層側の面の周縁領域である。このとき、当該周縁領域に包囲される、基材層側の面の領域（中央領域）には接着剤及び粘着剤が存在しない。
【００５１】
具体的には、図１に示すフラスコ型細胞培養容器では、容器部１００において、底部１０１の容器内面の略全体を覆う形状の機能性基体１４０の基材層５０２側の面（下面）の周縁領域と、該領域に対面する底部１０１の表面領域とが、接着剤又は粘着剤の層１５０を介して接合している。機能性基体１４０の基材層５０２側の面の、周縁領域に包囲される中央領域には、接着剤及び粘着剤は存在しない。同様に、図２に示す皿型細胞培養容器においても、容器部２００において、底部２０１の容器内側面の略全体を覆う形状の機能性基体２１０の基材層５０２側の面（下面）の周縁領域と、該領域に対面する底部２０１の表面領域とが、接着剤又は粘着剤の層２５０を介して接合している。機能性基体２１０の基材層５０２側の面の、周縁領域に包囲される中央領域には、接着剤及び粘着剤は存在しない。図１及び２に例示する構成により、培養細胞を観察する際に主に観察される中央領域において接着剤又は粘着剤に起因する障害（例えば蛍光顕微鏡観察時における接着剤又は粘着剤に起因する自家蛍光）がなく、精度の高い観察を行うことが可能となる。機能性基体１４０，２１０の基材層５０２側の面の周縁領域と底部１０１、２０１との間に設けられる接着剤又は粘着剤の層１５０、２５０は、機能性基体１４０，２１０の周方向に沿って連続的に全周にわたって形成されていてもよいし、機能性基体１４０，２１０の周方向に沿って断続的に形成されていてもよい。
【００５２】
なお、図１、２では、説明のために、接着剤又は粘着剤の層１５０、２５０の厚さを強調して描写しており、機能性基体１４０，２１０の基材層５０２側の面の中央領域と、底部１０１、２０１の対向する表面との間に空隙が形成されているように描写している。しかしながら、接着剤又は粘着剤の層１５０、２５０が、機能性基体１４０，２１０と比較して非常に薄い層である場合や、機能性基体１４０，２１０が可撓性を有する場合には、機能性基体１４０，２１０の基材層５０２側の面の中央領域と底部１０１、２０１の表面とは接触している。
【００５３】
本発明の他の実施形態では、図６、７に示すように、容器本体部材の、機能性基体の基材層側の面の周縁領域と接着剤又は粘着剤を介してその表面が接合される部分により包囲された部分に開口が形成されている。このとき、機能性基体の基材層側の面の前記周縁領域により包囲された領域は前記開口を通じて露出している。
【００５４】
開口を有する実施形態に係るフラスコ型容器は、例えば図６Ａに示すように、厚さ方向に貫通した開口６０１が中央部に形成された、開口６０１を包囲する周縁部を備える底部１０１’と、底部１０１’の周縁に立設された側壁部１０２とを備える容器部分部材６００に、機能性基体１４０を固定し、天面部１０３に対応する天面部材３０２を組み合わせることにより製造することができる。図６Ｂは、容器部分部材６００に、機能性基体１４０を固定した状態の中間製品における断面図を示す。このとき、機能性基体１４０の、基材層５０２側の面の周縁領域と、該領域に対面する底部１０１’の周縁部の表面とが接着剤又は粘着剤の層６５０を介して接合される。機能性基体１４０の基材層５０２側の面の中央領域は開口６０１を通じて容器外に露出している。露出する基材層５０２の表面上には接着剤及び粘着剤が存在していないため、塵の付着などの問題が回避できる。底部中央に開口が形成され、該開口が機能性基体により覆われた容器部を備えた細胞培養容器は、機能性基体１４０と底部との間に気泡が入らない等の利点を有する。
【００５５】
開口を有する実施形態に係る皿状細胞培養容器は、例えば図７Ａに示すように、厚さ方向に貫通した開口７０１が中央部に形成された、開口７０１を包囲する周縁部を備える底部２０１’と、底部２０１’の周縁に立設された側壁部２０２とを備える容器部７００を備える。図７Ｂは、容器部７００の断面図を示す。機能性基体２１０の、基材層５０２側の面の周縁領域と、底部２０１’の表面の周縁領域とが接着剤又は粘着剤の層７５０を介して接合される。機能性基体２１０の基材層５０２側の面の中央領域は開口７０１を通じて容器外に露出している。露出する基材層５０２の表面上には接着剤及び粘着剤が存在していない。
【００５６】
本発明において、機能性基体と容器本体部材又は容器部分部材とを接着剤又は粘着剤により接合する手順は特に限定されず、（１）基材層側表面の所定の一部領域に、予め接着剤又は粘着剤の層が形成された機能性基体を用意し、該機能性基体と容器本体部材又は容器部分部材とを接合する；（２）表面の所定の一部領域に予め接着剤又は粘着剤の層が形成された容器本体部材又は容器部分部材を用意し、機能性基体と該容器本体部材又は容器部分部材とを接合する；（３）機能性基体と容器本体部材又は容器部分部材とを用意し、機能性基体の基材層側表面、及び、容器本体部材又は容器部分部材の表面の少なくとも一方の所定の一部領域に、接着剤又は粘着剤を適用し、それを介して両者を接合する、等のいずれの手順で接合してもよい。
【００５７】
また、上記（１）で用いられる、基材層側表面の所定の一部領域に、予め接着剤又は粘着剤の層が形成された機能性基体を製造する場合においても、機能性有機化合物層の形成と、接着剤又は粘着剤の層の形成の順序は限定されない。例えば、（４）所定の一部領域に接着剤又は粘着剤の層が形成され、必要に応じ接着剤又は粘着剤の層の表面が剥離シートにより保護された基材を用意し、該基材の、接着剤又は粘着剤の層が形成されていない側の面に機能性有機化合物層を積層してもよいし、（５）基材の一方の表面に機能性有機化合物層を積層した後、基材の他方の表面の所定の一部領域に接着剤又は粘着剤の層を形成し、必要に応じ接着剤又は粘着剤の層の表面を保護してもよい。上記（４）で用いられる「所定の一部領域に接着剤又は粘着剤の層が形成され、必要に応じ接着剤又は粘着剤の層の表面が剥離シートにより保護された基材」は独自に製造してもよいし、市販品を購入してもよい。
【符号の説明】
【００５８】
１００，２００・・・容器部
１０１〜１０６，２０１〜２０２・・・容器本体部材
１５０，２５０，６５０，７５０・・・接着剤又は粘着剤
１４０，２１０・・・機能性基体
５０２・・・基材層
５０１・・・機能性有機化合物層
６０１，７０１・・・開口
【技術分野】
【０００１】
本発明は、機能性有機化合物層を備える機能性基体が固定された細胞培養容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
温度応答性ポリマー等の機能性有機化合物層を表面に被覆した、シャーレなどの細胞培養容器が特許文献１に記載されている。この細胞培養容器を用いることにより、温度を変化させるだけで培養・増殖後の細胞を破壊することなく細胞支持体から容易に剥離して回収することができる。しかし、特許文献１に記載のように、シャーレなどの細胞培養容器に、別個にバッチ処理により表面処理をして機能性化合物層を設けることは、多くの手間を必要としており、作業性の観点からはなお改善する余地がある。
【０００３】
そこで、特許文献２等において、機能性化合物層を表面に備える、フィルム状、板状等の形状の機能性基体を別途作成し、該機能性基体を、細胞培養容器に固定する技術が提案されている。この技術によれば、細胞培養容器を個別にバッチ処理して機能性有機化合物層を設ける場合と比較して作業性が高まる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平２−２１１８６５号公報
【特許文献２】特開２０１０−９８９７９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献２等に開示されている、機能性基体を細胞培養容器に固定する従来技術では、機能性基体の基材層側の表面の全面と、容器本体部材の表面とを接着剤や粘着剤等を介して接合することが通常である（例えば特許文献２図１）。
【０００６】
しかしながら機能性基体の基材層側表面の全体に接着剤又は粘着剤が存在する場合には、種々の不都合が生じる。例えば、底板中央に開口が形成された皿形状等の細胞培養容器に、機能性基体を、基材層側表面を下側にして容器内側から前記開口を塞ぐように接着する場合において、基材層側表面の全面に接着剤又は粘着剤が存在すると、前記開口から露出した基材層側表面上の接着剤又は粘着剤に塵などが付着してしまい、培養細胞の観察の妨げとなるという問題がある。更に、開口を有していない通常の底板部材を備えた細胞培養容器に、機能性基体を、基材層側表面を下側にして接着する場合であっても、基材層側表面の全面に接着剤又は粘着剤が存在すると、容器内の培養細胞を蛍光顕微鏡により観察する際に、機能性基体の中央部下面の接着剤又は粘着剤による自家蛍光がノイズとなり観察の妨げとなるという問題がある。
【０００７】
そこで本発明は、細胞観察時などに求められる細胞培養容器の機能に対する、接着剤又は粘着剤による妨害が少なくなるよう設計された、機能性基体を備える細胞培養容器を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、機能性基体と容器本体部材とを、機能性基体の基材層側表面の一部の領域のみに接着剤又は粘着剤を配置して接合することにより、上記課題が解決することを見出した。本発明は以下の発明を包含する。
【０００９】
（１）細胞及び培地を収容するための容器部を備える細胞培養容器であって、
容器部は、
容器本体部材と、
基材層及び該基材層上に配置された機能性有機化合物層を少なくとも備える機能性基体と、
を少なくとも備え、
機能性基体が容器本体部材に、細胞及び培地を収容するための空間側に機能性有機化合物層側の面が向いた状態で固定されるように、機能性基体の基材層側の面の一部の領域と、容器本体部材の表面の、前記一部の領域と対面する領域とが、接着剤又は粘着剤を介して接合されており、
機能性基体の基材層側の面の、前記一部の領域以外の領域上には接着剤及び粘着剤が存在しない、
ことを特徴とする細胞培養容器。
（２）機能性基体の基材層側の面の前記一部の領域が、機能性基体の基材層側の面の周縁領域であり、機能性基体の基材層側の面の、前記周縁領域に包囲された領域上には接着剤及び粘着剤が存在しない、（１）の細胞培養容器。
（３）容器本体部材の、機能性基体の基材層側の面の周縁領域と接着剤又は粘着剤を介してその表面が接合される部分により包囲された部分に開口が形成されており、機能性基体の基材層側の面の前記周縁領域により包囲された領域は前記開口を通じて露出している、（２）の細胞培養容器。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係る機能性基体を備える細胞培養容器では、細胞培養容器の機能に対する、接着剤又は粘着剤による妨害が少ない。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１Ａは、本発明の細胞培養容器の一例を示す。図１ＢはＩ−Ｉ’断面図である。図１ＣはＩＩ−ＩＩ’断面図である。
【図２】図２Ａは、本発明の細胞培養容器の他の一例を示す。図２ＢはＩＩＩ−ＩＩＩ’断面図である。
【図３】図３は、容器部分部材に機能性基体を固定した後に他の部材を組み合わせて容器部を完成させる場合の一例を示す。
【図４】図４は、容器部分部材に機能性基体を固定した後に他の部材を組み合わせて容器部を完成させる場合の他の一例を示す。
【図５】図５は、機能性基体の断面図を示す。
【図６】図６Ａは、容器の一部に開口が形成されている、本発明の細胞培養容器の一例を示す。図６ＢはＩＶ−ＩＶ’断面図である。
【図７】図７Ａは、容器の一部に開口が形成されている、本発明の細胞培養容器の他の一例を示す。図７ＢはＶ−Ｖ’断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
＜細胞培養容器の形状＞
本発明において製造される細胞培養容器の全体の形状について説明する。
本発明により製造される細胞培養容器は、細胞及び培地を収容するための容器部を少なくとも備え、更に適宜蓋等を備える。
【００１３】
容器部は図１に示すように、細胞及び培地を収容するための空間が壁面により閉塞された形状であってもよいし、図２に示すように該空間の一端が開放された形状であってもよい。
【００１４】
容器部の好ましい実施形態の一例を図１に示す。図１Ａに示す容器部１００は、底部１０１と、底部１０１の周縁に立設された側壁部１０２と、側壁部１０２の上端部に接合された、底部１０１に対向配置される天面部１０３とを少なくとも備える。側壁部１０２の一部に通孔１０４が穿設されており、通孔１０４の周縁から容器部外側に延びる首部１０５を備える、「フラスコ型」と呼ばれる形状の容器部である。容器部１００の首部１０５には蓋１１０を係止するための係止部１０６が形成されており、該係止部を介して蓋１１０が着脱可能に装着される。容器部１００と蓋１１０とを組み合わせることによりフラスコ型の細胞培養容器１２０が形成される。
【００１５】
図１Ｂは容器部１００のＩ−Ｉ’断面図を示し、図１ＣはＩＩ−ＩＩ’断面図を示す。容器部１００の、底部１０１、側壁部１０２及び天面部１０３に包囲される部分には、細胞及び培地を収容するための空間１３０が形成されている。空間１３０に面する内壁面の一部分（図１に示す実施形態では底部１０１）には、機能性基体１４０が固定されている。
【００１６】
容器部の他の実施形態としては、図２に示すように、底部２０１と、底部２０１の周縁に立設した側壁部２０２とを備える皿状の容器部２００が挙げられる。底部２０１の、細胞及び培地を収容するための空間２２０の側の面（内底面）には機能性基体２１０が固定されている。
【００１７】
機能性基体の基材層の側の面の一部の領域と、該領域に対面する底部の表面の領域とが接着剤又は粘着剤１５０，２５０を介して接合されている。
【００１８】
本発明では、容器部のうち、機能性基体を除いた部分を「容器本体部材」と称する。例えば図１の容器部１００では、容器本体部材とは、底部１０１、側壁部１０２、天面部１０３及び首部１０５から構成される部分であり、図２の容器部２００では、容器本体部材とは、底部２０１及び側壁部２０２から構成される部分である。
【００１９】
機能性基体が接合された容器本体部材を製造するためには、容器本体部材に機能性基体を接合してもよいし、容器本体部材の一部である部材（以下「容器部分部材」と呼ぶことがある）に機能性基体を接合し、続いて容器部分部材と他の部材とを接合して容器部を完成させてもよい。このように分割して容器部を形成する点について図３及び４に沿ってより説明する。
【００２０】
図３に示すように、機能性基体の接合後に容器部１００を形成するための一実施形態では、はじめに底部１０１と側壁部１０２とからなる容器部分部材３０１の内底面に、機能性基体１４０を接合する。次いで、天面部１０３に対応する天面部材３０２を接合することにより容器部１００を形成させる。容器部分部材３０１と天面部材３０２との接合は、細胞培養の目的に応じて、必要な場合は培養液が漏出しないように液密に接合される。
【００２１】
図４に示す、機能性基体の接合後に容器部１００を形成するための他の実施形態では、はじめに底部１０１に対応する容器部分部材４０１の、完成後に空間１３０に臨む側の面に、機能性基体１４０を接合する。首部１０５を備えた側壁部１０２に対応する側壁部材４０２と、天面部１０３に対応する天面部材３０２とを接合することにより容器部１００を形成する。
複数の部材の組み合わせは図３及び４に示した形態には限定されない。
【００２２】
＜細胞培養容器の材料＞
容器本体部材及び蓋などの他の細胞培養容器の部材を形成する材料は特に限定されず、細胞培養において一般的に用いられる材料を用いることができる。例えば、ポリスチレン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリエチレンテレフタレート樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂等の樹脂材料、表面親水化処理を施した上記の少なくとも１種を含む樹脂材料、及びガラスや石英等の無機材料であることができるが、好ましくは樹脂材料である。樹脂材料としては、ポリスチレン樹脂又はポリエチレンテレフタレート樹脂であることが好ましい。
容器本体部材は、該部材を通じて容器外から培養細胞を観察することが可能な透明な材料で構成されていることが好ましい。
【００２３】
＜機能性基体＞
本発明における機能性基体１４０，２１０の厚さ方向に沿った断面は、図５に示すように、基材層５０２及び該基材層５０２上に配置された機能性有機化合物層５０１を少なくとも備える。ここで「基体」とは、所定の構造を有している限り、フィルムであってもよいし、板状体であってもよい。
【００２４】
フィルム状の機能性基体（以下「機能性フィルム」と呼ぶことがある）は、好ましくはロール状に巻き取り可能な可撓性を有するものである。可撓性の機能性フィルムは、ロール・ツー・ロール法による大量生産が容易であるため好ましい。
【００２５】
機能性基体は、典型的には、透明な機能性基体である。
機能性基体は、基材層に機能性有機化合物層を適当な方法により形成することにより製造することができる。基材層と機能性有機化合物層との間には必要に応じて１つ以上の他の層（例えば後述するプライマー層）が存在していてもよい。
【００２６】
機能性基体の形状は、固定される部材の領域の形状に応じた任意の形状であることができる。例えば、三角形、四角形（長方形、正方形、平行四辺形、菱形等）、五角形、六角形、七角形、八角形等の多角形や、円形、楕円形等の形状であることができる。
【００２７】
＜基材層＞
基材層は、最終的な機能性基体に応じて適宜選択される。機能性基体が板状であれば板状の基材層が用いられ、機能性基体がフィルム状であればフィルム状の基材層（以下「フィルム基材層」という）が用いられる。
【００２８】
基材層は、一方の表面に上述の機能性有機化合物層を形成することが可能な材料を含むものであればよく、材料の種類は特に限定されない。典型的には、基材層の材料として、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ＴＡＣ（トリアセチルセルロース）、ポリイミド（ＰＩ）、ナイロン（Ｎｙ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、中密度ポリエチレン（ＭＤＰＥ）、塩化ビニル、塩化ビニリデン、ポリフェニレンサルファイド、ポリエーテルサルフォン、ポリエチレンナフタレート、ポリプロピレン、アクリル等の樹脂材料や、ガラスや石英等の無機材料が挙げられ、樹脂材料が好ましい。
【００２９】
基材層の、機能性有機化合物層が形成される側の表面は、易接着処理された表面であることができる。「易接着処理」とは、例えば、ポリエステル、アクリル酸エステル、ポリウレタン、ポリエチレンイミン、シランカップリング剤、ペルフルオロオクタンスルホン酸（ＰＦＯＳ）等の易接着剤による処理を指す。
【００３０】
基材層の厚さは適宜選択することができる。基材層がフィルム基材層である場合、その厚さ（フィルム基材層が基材の層に加えて易接着層を備える場合は、易接着層を含むフィルム基材層の全体の厚さを指す）は特に制限は無いが、可撓性を付与する厚さであることが好ましく、例えば５〜５００μｍ、より好ましくは２０〜５００μｍ、特に好ましくは５０〜２５０μｍである。
【００３１】
＜機能性有機化合物層＞
機能性有機化合物層を構成する有機化合物としては、所望の機能を有する層であれば特に限定されないが、より好ましくは、所定の刺激によって細胞接着性から細胞非接着性へと変化することが可能な表面を有する刺激応答性ポリマーや、1つ以上のエチレングリコール単位（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）からなるエチレングリコール鎖等の親水性化合物が挙げられる。
【００３２】
機能性有機化合物層の膜厚は、例えば、０．５ｎｍ〜３００ｎｍの範囲内とするよく、なかでも１ｎｍ〜１００ｎｍの範囲内であることが好ましい。
【００３３】
以下「刺激応答性ポリマー層」及び「親水性化合物層」の好適な実施形態について説明する。
＜刺激応答性ポリマー層＞
機能性有機化合物層は、刺激応答性ポリマー層であることが特に好ましい。刺激応答性ポリマー層とは、所定の刺激によって表面の細胞の接着度合いが変化するポリマーを含む層である。刺激応答性ポリマーとしては、温度応答性ポリマー、ｐＨ応答性ポリマー、イオン応答性ポリマー、光応答性ポリマーなどを挙げることができる。なかでも温度応答性ポリマーが、刺激の付与が容易であることから好ましい。
【００３４】
温度応答性ポリマーとして、例えば、細胞を培養する温度では細胞接着性を示し、作製した細胞シートの剥離する時の温度では細胞非接着性を示すものを用いるとよい。例えば、温度応答性ポリマーは、臨界溶解温度未満の温度では周囲の水に対する親和性が向上し、ポリマーが水を取り込んで膨潤して表面に細胞を接着しにくくする性質（細胞非接着性）を示し、同温度以上の温度ではポリマーから水が脱離することでポリマーが収縮して表面に細胞を接着しやすくする性質（細胞接着性）を示すものを用いるとよい。このような臨界溶解温度は、下限臨界溶解温度と呼ばれる。下限臨界溶解温度Ｔが０℃〜８０℃、さらに好ましくは０℃〜５０℃である温度応答性ポリマーを用いるとよい。Ｔが０℃〜８０℃であると、細胞を安定的に培養できるからである。
【００３５】
好適な温度応答性ポリマーとしてはアクリル系ポリマー又はメタクリル系ポリマーが挙げられる。具体的に好適な温度応答性ポリマーとしては、例えばポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド(Ｔ＝３２℃)、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド(Ｔ＝２１℃)、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド(Ｔ＝３２℃)、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド(Ｔ＝約３５℃)、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド(Ｔ＝約２８℃)、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（Ｔ＝約３５℃）、及びポリ−Ｎ,Ｎ−ジエチルアクリルアミド(Ｔ＝３２℃)等が挙げられる。
【００３６】
これらのポリマーを形成するためのモノマーとしては、放射線照射によって重合し得るモノマーを用いることができる。モノマーとしては例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体、及びビニルエーテル誘導体等が挙げられ、これらの１種以上を使用してよい。モノマーが一種類単独で使用された場合、基材上に形成されるポリマーはホモポリマーとなり、モノマーが複数種一緒に使用された場合、基材上に形成されるポリマーはヘテロポリマーとなるが、どちらの形態も本発明に包含される。
【００３７】
また、増殖細胞の種類によってＴを調節する必要がある場合や、被覆物質と細胞培養支持体との相互作用を高める必要が生じた場合や、細胞支持体の親水・疎水性のバランスを調整する必要がある場合などには、上記以外の他のモノマー類を更に加えて共重合してよい。更に本発明に使用する上記ポリマーとその他のポリマーとのグラフト又はブロック共重合体、あるいは本発明のポリマーと他のポリマーとの混合物を用いてもよい。また、ポリマー本来の性質が損なわれない範囲で架橋することも可能である。
【００３８】
ｐＨ応答性ポリマー及びイオン応答性ポリマーは作製しようとする細胞シートに適したものを適宜選択することができる。
【００３９】
刺激応答性ポリマー層は、重合して目的の刺激応答性ポリマーを形成するモノマーと、該モノマーを溶解しうる有機溶媒と含む塗布用組成物を調製し、これを慣用の塗布方法に従って、基材層の表面に塗布して塗膜を形成し、次に、該塗膜に放射線照射等の適当な手段により塗膜中のモノマーを重合してポリマーを形成するとともに、基材層の表面とポリマーとの間にグラフト化反応を生じさせることにより形成することができる。
【００４０】
＜親水性化合物層＞
機能性有機化合物層の他の実施形態として、1つ以上のエチレングリコール単位からなるエチレングリコール鎖（複数のエチレングリコール単位からなるエチレングリコール鎖は、「ポリエチレングリコール鎖」ということができる）等の親水性化合物の層が挙げられる。
【００４１】
エチレングリコール鎖の末端は水酸基により封鎖された形態であってもよいし、エチレングリコール鎖の末端に生体関連物質等の他の物質が共有結合により連結された形態であってもよい。
【００４２】
末端が水酸基により封鎖されたエチレングリコール鎖を含む層は、細胞が接着し難い親水性の表面を提供することができる。
【００４３】
エチレングリコール鎖の末端に共有結合されうる生体関連物質としては、抗原、抗体、DNA、RNA、ペプチド、ホルモン、酵素、サイトカイン、糖鎖、脂質、補酵素、酵素阻害剤、細胞、その他の機能を有するタンパク質が含まれる。更に、このような生体関連物質と親和性を有する低分子化合物、及び高分子化合物も生体関連物質の範囲に含まれる。
【００４４】
エチレングリコール鎖等の親水性化合物の層を、樹脂製の基材層の表面に固定化するためには、予め、樹脂製の基材層の表面に、該表面に物理的に吸着可能であって、エチレングリコール鎖の末端の水酸基と反応して共有結合を形成可能な官能基を側鎖に含むポリシロキサンを含むプライマー層を設ける。ポリシロキサンの側鎖上の官能基としては、グリシジル基又はエポキシ基が好ましい。プライマー層は、基材層の表面に、所望の側鎖を有するシラノール化合物を適用し、該表面上で縮合重合してポリシロキサンに変換することにより形成することができる。
【００４５】
次いで、プライマー層の官能基と、エチレングリコール又はエチレングリコール単位が２以上繰り返されたポリエチレングリコールの水酸基とを反応させて共有結合を形成し、エチレングリコール鎖を固定化する。このとき、触媒量の濃硫酸を含むエチレングリコール又はポリエチレングリコールをプライマー層に接触させる。
末端が水酸基により封鎖されたエチレングリコール鎖を含む層はこのようにして形成される。
【００４６】
更に、必要に応じて、エチレングリコール鎖の一端に、他の物質との共有結合を形成することが可能な、少なくとも１つの官能基を直接的又は間接的に連結させる。官能基の導入方法は特に限定されない。
【００４７】
＜機能性基体と容器本体部材との接合＞
本発明では、機能性基体が容器本体部材に、細胞及び培地を収容するための空間側に機能性有機化合物層側の面が向いた状態で固定されるように、機能性基体の基材層側の面の一部の領域と、容器本体部材の表面の、前記一部の領域と対面する領域とが、接着剤又は粘着剤を介して接合されていること、並びに、機能性基体の基材層側の面の、前記一部の領域以外の領域上には接着剤及び粘着剤が存在しないことを特徴とする。
【００４８】
本発明において「接着剤」及び「粘着剤」はそれぞれ機能性基体の基材層と容器本体部とを接合可能なものであれば特に限定されないが、具体的には接着剤としてはポリアクリル酸エステル系接着剤、シアノアクリレート系接着剤、、ポリエステル系接着剤、ポリアミド系接着剤、ポリイミド系接着剤、エポキシ系接着剤、ポリウレタン系接着剤、メタクリル系接着剤、ゴム系接着剤、シリコーン系接着剤、無機系接着剤等の接着剤などが例示でき、粘着剤としてはアクリル系粘着剤や、ウレタン系粘着剤、シリコーン系粘着剤、ゴム系粘着剤が例示できる。
【００４９】
本発明では機能性基体の基材層側の面の一部の領域と、容器本体部材の表面の、前記一部の領域と対面する領域とが、接着剤又は粘着剤を介して接合されていること、並びに、機能性基体の基材層側の面の、前記一部の領域以外の領域上には接着剤及び粘着剤が存在しないことを特徴とする。
【００５０】
ここで、「一部の領域」とは、特に限定されないが、好ましくは枚葉状の機能性基体において、基材層側の面の周縁領域である。このとき、当該周縁領域に包囲される、基材層側の面の領域（中央領域）には接着剤及び粘着剤が存在しない。
【００５１】
具体的には、図１に示すフラスコ型細胞培養容器では、容器部１００において、底部１０１の容器内面の略全体を覆う形状の機能性基体１４０の基材層５０２側の面（下面）の周縁領域と、該領域に対面する底部１０１の表面領域とが、接着剤又は粘着剤の層１５０を介して接合している。機能性基体１４０の基材層５０２側の面の、周縁領域に包囲される中央領域には、接着剤及び粘着剤は存在しない。同様に、図２に示す皿型細胞培養容器においても、容器部２００において、底部２０１の容器内側面の略全体を覆う形状の機能性基体２１０の基材層５０２側の面（下面）の周縁領域と、該領域に対面する底部２０１の表面領域とが、接着剤又は粘着剤の層２５０を介して接合している。機能性基体２１０の基材層５０２側の面の、周縁領域に包囲される中央領域には、接着剤及び粘着剤は存在しない。図１及び２に例示する構成により、培養細胞を観察する際に主に観察される中央領域において接着剤又は粘着剤に起因する障害（例えば蛍光顕微鏡観察時における接着剤又は粘着剤に起因する自家蛍光）がなく、精度の高い観察を行うことが可能となる。機能性基体１４０，２１０の基材層５０２側の面の周縁領域と底部１０１、２０１との間に設けられる接着剤又は粘着剤の層１５０、２５０は、機能性基体１４０，２１０の周方向に沿って連続的に全周にわたって形成されていてもよいし、機能性基体１４０，２１０の周方向に沿って断続的に形成されていてもよい。
【００５２】
なお、図１、２では、説明のために、接着剤又は粘着剤の層１５０、２５０の厚さを強調して描写しており、機能性基体１４０，２１０の基材層５０２側の面の中央領域と、底部１０１、２０１の対向する表面との間に空隙が形成されているように描写している。しかしながら、接着剤又は粘着剤の層１５０、２５０が、機能性基体１４０，２１０と比較して非常に薄い層である場合や、機能性基体１４０，２１０が可撓性を有する場合には、機能性基体１４０，２１０の基材層５０２側の面の中央領域と底部１０１、２０１の表面とは接触している。
【００５３】
本発明の他の実施形態では、図６、７に示すように、容器本体部材の、機能性基体の基材層側の面の周縁領域と接着剤又は粘着剤を介してその表面が接合される部分により包囲された部分に開口が形成されている。このとき、機能性基体の基材層側の面の前記周縁領域により包囲された領域は前記開口を通じて露出している。
【００５４】
開口を有する実施形態に係るフラスコ型容器は、例えば図６Ａに示すように、厚さ方向に貫通した開口６０１が中央部に形成された、開口６０１を包囲する周縁部を備える底部１０１’と、底部１０１’の周縁に立設された側壁部１０２とを備える容器部分部材６００に、機能性基体１４０を固定し、天面部１０３に対応する天面部材３０２を組み合わせることにより製造することができる。図６Ｂは、容器部分部材６００に、機能性基体１４０を固定した状態の中間製品における断面図を示す。このとき、機能性基体１４０の、基材層５０２側の面の周縁領域と、該領域に対面する底部１０１’の周縁部の表面とが接着剤又は粘着剤の層６５０を介して接合される。機能性基体１４０の基材層５０２側の面の中央領域は開口６０１を通じて容器外に露出している。露出する基材層５０２の表面上には接着剤及び粘着剤が存在していないため、塵の付着などの問題が回避できる。底部中央に開口が形成され、該開口が機能性基体により覆われた容器部を備えた細胞培養容器は、機能性基体１４０と底部との間に気泡が入らない等の利点を有する。
【００５５】
開口を有する実施形態に係る皿状細胞培養容器は、例えば図７Ａに示すように、厚さ方向に貫通した開口７０１が中央部に形成された、開口７０１を包囲する周縁部を備える底部２０１’と、底部２０１’の周縁に立設された側壁部２０２とを備える容器部７００を備える。図７Ｂは、容器部７００の断面図を示す。機能性基体２１０の、基材層５０２側の面の周縁領域と、底部２０１’の表面の周縁領域とが接着剤又は粘着剤の層７５０を介して接合される。機能性基体２１０の基材層５０２側の面の中央領域は開口７０１を通じて容器外に露出している。露出する基材層５０２の表面上には接着剤及び粘着剤が存在していない。
【００５６】
本発明において、機能性基体と容器本体部材又は容器部分部材とを接着剤又は粘着剤により接合する手順は特に限定されず、（１）基材層側表面の所定の一部領域に、予め接着剤又は粘着剤の層が形成された機能性基体を用意し、該機能性基体と容器本体部材又は容器部分部材とを接合する；（２）表面の所定の一部領域に予め接着剤又は粘着剤の層が形成された容器本体部材又は容器部分部材を用意し、機能性基体と該容器本体部材又は容器部分部材とを接合する；（３）機能性基体と容器本体部材又は容器部分部材とを用意し、機能性基体の基材層側表面、及び、容器本体部材又は容器部分部材の表面の少なくとも一方の所定の一部領域に、接着剤又は粘着剤を適用し、それを介して両者を接合する、等のいずれの手順で接合してもよい。
【００５７】
また、上記（１）で用いられる、基材層側表面の所定の一部領域に、予め接着剤又は粘着剤の層が形成された機能性基体を製造する場合においても、機能性有機化合物層の形成と、接着剤又は粘着剤の層の形成の順序は限定されない。例えば、（４）所定の一部領域に接着剤又は粘着剤の層が形成され、必要に応じ接着剤又は粘着剤の層の表面が剥離シートにより保護された基材を用意し、該基材の、接着剤又は粘着剤の層が形成されていない側の面に機能性有機化合物層を積層してもよいし、（５）基材の一方の表面に機能性有機化合物層を積層した後、基材の他方の表面の所定の一部領域に接着剤又は粘着剤の層を形成し、必要に応じ接着剤又は粘着剤の層の表面を保護してもよい。上記（４）で用いられる「所定の一部領域に接着剤又は粘着剤の層が形成され、必要に応じ接着剤又は粘着剤の層の表面が剥離シートにより保護された基材」は独自に製造してもよいし、市販品を購入してもよい。
【符号の説明】
【００５８】
１００，２００・・・容器部
１０１〜１０６，２０１〜２０２・・・容器本体部材
１５０，２５０，６５０，７５０・・・接着剤又は粘着剤
１４０，２１０・・・機能性基体
５０２・・・基材層
５０１・・・機能性有機化合物層
６０１，７０１・・・開口
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞及び培地を収容するための容器部を備える細胞培養容器であって、
容器部は、
容器本体部材と、
基材層及び該基材層上に配置された機能性有機化合物層を少なくとも備える機能性基体と、
を少なくとも備え、
機能性基体が容器本体部材に、細胞及び培地を収容するための空間側に機能性有機化合物層側の面が向いた状態で固定されるように、機能性基体の基材層側の面の一部の領域と、容器本体部材の表面の、前記一部の領域と対面する領域とが、接着剤又は粘着剤を介して接合されており、
機能性基体の基材層側の面の、前記一部の領域以外の領域上には接着剤及び粘着剤が存在しない、
ことを特徴とする細胞培養容器。
【請求項２】
機能性基体の基材層側の面の前記一部の領域が、機能性基体の基材層側の面の周縁領域であり、機能性基体の基材層側の面の、前記周縁領域に包囲された領域上には接着剤及び粘着剤が存在しない、請求項１の細胞培養容器。
【請求項３】
容器本体部材の、機能性基体の基材層側の面の周縁領域と接着剤又は粘着剤を介してその表面が接合される部分により包囲された部分に開口が形成されており、機能性基体の基材層側の面の前記周縁領域により包囲された領域は前記開口を通じて露出している、請求項２の細胞培養容器。
【請求項１】
細胞及び培地を収容するための容器部を備える細胞培養容器であって、
容器部は、
容器本体部材と、
基材層及び該基材層上に配置された機能性有機化合物層を少なくとも備える機能性基体と、
を少なくとも備え、
機能性基体が容器本体部材に、細胞及び培地を収容するための空間側に機能性有機化合物層側の面が向いた状態で固定されるように、機能性基体の基材層側の面の一部の領域と、容器本体部材の表面の、前記一部の領域と対面する領域とが、接着剤又は粘着剤を介して接合されており、
機能性基体の基材層側の面の、前記一部の領域以外の領域上には接着剤及び粘着剤が存在しない、
ことを特徴とする細胞培養容器。
【請求項２】
機能性基体の基材層側の面の前記一部の領域が、機能性基体の基材層側の面の周縁領域であり、機能性基体の基材層側の面の、前記周縁領域に包囲された領域上には接着剤及び粘着剤が存在しない、請求項１の細胞培養容器。
【請求項３】
容器本体部材の、機能性基体の基材層側の面の周縁領域と接着剤又は粘着剤を介してその表面が接合される部分により包囲された部分に開口が形成されており、機能性基体の基材層側の面の前記周縁領域により包囲された領域は前記開口を通じて露出している、請求項２の細胞培養容器。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１３−９９２８６（Ｐ２０１３−９９２８６Ａ）
【公開日】平成２５年５月２３日（２０１３．５．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２４４９４４（Ｐ２０１１−２４４９４４）
【出願日】平成２３年１１月８日（２０１１．１１．８）
【出願人】（０００００２８９７）大日本印刷株式会社 (14,506)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年５月２３日（２０１３．５．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１１月８日（２０１１．１１．８）
【出願人】（０００００２８９７）大日本印刷株式会社 (14,506)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]