細胞増殖培地
【課題】 本発明は正常細胞を増殖させるにあたり、細胞老化を抑制し良好な増殖能を有する細胞増殖培地を提供することを課題とする。
【解決手段】 ＭＡＰキナーゼ阻害剤或いはｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤を添加することでｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質発現を抑制し正常細胞を良好に増殖させる培地。
【解決手段】 ＭＡＰキナーゼ阻害剤或いはｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤を添加することでｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質発現を抑制し正常細胞を良好に増殖させる培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は良好な増殖効果を示す新規な細胞増殖培地、該培地を用いて培養された細胞培養物および該培地を用いた細胞増殖方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
動物細胞の正常二倍体細胞は有限増殖寿命を有しており長期間培養すると細胞老化という現象がおこり、細胞増殖が停止する（非特許文献１）。この細胞老化にｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質が関与していることが知られている。ｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子は、癌抑制遺伝子のひとつでＩＮＫファミリーに属する遺伝子である。ＩＮＫファミリー遺伝子の産物は、サイクリン依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４）及びサイクリン依存性キナーゼ６（ＣＤＫ６）に結合し、Ｒｂタンパク質のリン酸化を阻止することでＧ１期からＳ期への移行を阻害し、細胞増殖を抑制する。ｐ１６ＩＮＫ４ａ蛋白質は、増殖中の正常細胞ではその発現レベルがきわめて低いが、細胞が分裂を繰り返し、分裂寿命に達すると発現レベルが著しく上昇し、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）を不活性化し、細胞周期をＧ１期で停止させることにより細胞老化に至らせることが報告されている（非特許文献２）。また、正常な初代培養細胞を用い、ｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子の発現レベルを上昇させることにより、細胞老化が起こり、増殖が停止することが報告されている（非特許文献３）。また、これらｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質の発現にはＭＡＰＫやｐ３８といったＭＡＰキナーゼが関与することが報告されている（非特許文献４、非特許文献５）。
【０００３】
一方、間葉系幹細胞は哺乳動物の骨髄、脂肪組織等に存在し、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞、神経細胞等に分化する多能性の幹細胞である。間葉系幹細胞はこのような多分化能を示すことから組織の再生過程に重要な役割を果たすと考えられており、骨、軟骨、心筋、神経等の各組織を再生するための供給細胞として注目されている。間葉系幹細胞に代表される動物細胞を移植に供する為には大量の細胞が必要となる。しかし、従来の培養方法では２０回前後の継代培養をすると上述のような細胞老化に至り、充分な数の細胞を得ることができないという問題があった。
特許文献１ではＲｂ／ＩＮＫ４ａ経路を阻害する遺伝子を細胞に導入することで係る問題の解決を図っているが、目的とする個々の細胞について遺伝子導入をする必要があり煩雑である。また、特許文献２では培地中に増殖因子を添加することで細胞寿命の延長を図っているが、この場合でもなおＲｂ／ＩＮＫ４ａ経路は保持されているため、やがて細胞老化に至る。
【０００４】
【特許文献１】特表２００２−５３０４３６号公報
【特許文献２】国際公開第０２／０２２７８８号パンフレット
【非特許文献１】Ｈａｙｆｌｉｃｋ，Ｌ． ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ２５，ｐｐ．５８５〜６２１，１９６１年
【非特許文献２】Ｈａｒａ，Ｅ． ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１６，ｐｐ．８５９〜８６７，１９９６年
【非特許文献３】Ｓｅｒｒａｎｏ，Ｍ． ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．８８，ｐｐ．５９３〜６０２，１９９７年
【非特許文献４】Ｌｉｎ，Ａ．Ｗ． ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，Ｖｏｌ．１２，ｐｐ．３００８〜３０１ ，１９９８年
【非特許文献５】Ｗａｎｇ，Ｗ． ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．２２，ｐｐ．３３８９〜３４０３，２００２年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、かかる従来の問題点を解消すべく、Ｒｂ／ＩＮＫ４ａ経路を不活性化することで優れた増殖能を有する細胞増殖培地を提供する事を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、ＭＡＰキナーゼ阻害剤、特にｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤を添加することで良好な増殖性を示す培地を作製するに至った。
すなわち、本発明は：
［１］Ｒｂ／ＩＮＫ４ａ経路を不活性化する物質を含有すること特徴とする細胞増殖培地；
［２］Ｒｂ／ＩＮＫ４ａ経路を不活性化する物質がｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質の発現を抑制する物質である［１］の細胞増殖培地；
［３］ｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質の発現を抑制する物質がＭＡＰキナーゼ阻害剤である［２］の細胞増殖培地；
［４］ｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質の発現を抑制する物質がｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤である［２］の細胞増殖培地；
［５］間葉系幹細胞の増殖培地である［１］〜［４］のいずれかの細胞増殖培地；
［６］［１］〜［４］のいずれかの培地を用いて培養された細胞培養物；
［７］間葉系幹細胞の培養物である［６］の細胞培養物；
［８］Ｒｂ／ＩＮＫ４ａ経路を不活性化する物質の存在下で細胞を培養する工程を包含する細胞増殖方法；
［９］Ｒｂ／ＩＮＫ４ａ経路を不活性化する物質がｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質の発現を抑制する物質である［８］の細胞増殖方法；
［１０］ｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質の発現を抑制する物質がＭＡＰキナーゼ阻害剤である［９］の細胞増殖方法；
［１１］ｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質の発現を抑制する物質がｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤である［９］の細胞増殖方法；
［１２］細胞が間葉系幹細胞である［８］〜［１１］のいずれかの細胞増殖方法
に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明に係る細胞増殖培地を使用することで細胞老化を抑制し良好な増殖を得ることができる。特に、細胞密度が低い場合や長期培養など細胞老化に至りやすい条件下でも良好に細胞を増殖することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明において、Ｒｂ／ＩＮＫ４ａ経路とはＲａｓ活性化の刺激からＲｂタンパク質のリン酸化阻害に至る経路をいう。すなわち、増殖因子等の刺激によりＲａｓが活性化するとＲａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫ経路及びＭＫＫ３，６−ｐ３８ＭＡＰ経路の細胞内情報伝達経路が活性化され、Ｅｔｓ１／２等の転写因子の活性化によりｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質の発現が上昇する。ｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質はＣＤＫ４或いはＣＤＫ６と結合し、これらのキナーゼ活性を阻害する。これによりＲｂタンパク質のリン酸化が抑制され、転写因子Ｅ２Ｆの不活性化により細胞増殖が停止する。本発明ではこれら一連の経路を担うタンパク質を標的とし、タンパク質の酵素活性、タンパク質の発現誘導、タンパク質間の結合等をＲｂ／ＩＮＫ４ａ経路を不活性化する物質を用いて阻害することでＲｂ／ＩＮＫ４ａ経路の情報伝達経路を不活性化する。Ｒｂ／ＩＮＫ４ａ経路を不活性化する物質の標的タンパク質としては係る経路にあるものであれば特に問わないが、１つの実施態様において、本発明では、ｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質の発現を抑制する物質を添加することで上記経路の不活性化を行う。
【０００９】
ｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質の発現を抑制する物質としては特に問わないが、例えば短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ；ｓｉＲＮＡ）やＲａｓ活性阻害剤などがあげられるが、本発明ではＭＡＰキナーゼ阻害剤やｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤が好適に使用できる。これらの物質を添加することによって良好な増殖が得られるという本発明者によって得られた知見は予想外であった。なぜならＭＡＰキナーゼは様々な増殖因子などの刺激により活性化するセリン／スレオニンキナーゼとして見出されたものであり、細胞増殖において重要な役割を担っていると考えられているので、ＭＡＰキナーゼを阻害することは細胞の増殖に悪影響を及ぼす可能性があるからである。また、ｐ３８ＭＡＰキナーゼはストレス応答などに関与することは示唆されていたが、細胞増殖に関与することは知られていなかった。これらの物質は細胞内のｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質の量を低下させる効果があるが、具体的にはこれら物質を添加した培地で培養した細胞から細胞抽出液を調製し、抗ｐ１６ＩＮＫ４ａ抗体を用い定法によりウエスタンブロッティングを行うことでｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質の低下を測定することができる。
【００１０】
ＭＡＰキナーゼ活性阻害剤としては特に問わないが、市販のＰＤ９８０５９、Ｕ１２４、Ｕ１２５、Ｕ１２６などが好適に使用できる。また、ｐ３８ＭＡＰキナ―ゼ阻害剤についても特に問わないが、ＳＢ２０２１９０、ＳＢ２０３５８０、ＳＢ２２００２５などが好適に使用できる。上記物質の培地中の濃度は例えば０．１〜１００μＭ、好ましくは０．５〜５０μＭ、より好ましくは１〜３０μＭで好適に使用できる。また、上記物質を添加する培地としては目的の細胞が増殖できるのであればいずれの培地も使用することができるが、例えば、ＭＦ培地、１０％牛血清含有ＤＭＥＭ、ＭＣＤＢ１５３培地などが挙げられる。
【００１１】
本発明の培地は一般の正常動物細胞に使用できるが、特に間葉系幹細胞で好適に使用できる。ここで間葉継幹細胞とは骨髄、脂肪組織、臍帯血などの生体組織に存在する細胞で、多分化能を有することを特徴とする。当該細胞は骨髄、脂肪組織、臍帯血などから採取されるが、市販のものも好適に使用される。採取される動物種は問わないが、ヒト、マウス、ブタなどが使用される。一例としては、注射等を用いヒト骨髄内から骨髄液を採取し、培養容器に付着する細胞を培養することで当該細胞を得ることができる。当該細胞は生体あるは試験管内で脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋細胞、神経細胞などの細胞に分化する能力を有する。
【００１２】
本発明に係る培地により培養された細胞培養物とは、正常動物細胞に本発明に係る培地を少なくとも１日以上接触させることにより得られた培養物をいう。よって、その前後の加工、例えば、その後に分化誘導を行い他細胞に分化したものや、移植に供したものについてもこれに含まれる。その形状については、分散状態、組織様状態を問わない。また、本発明の細胞増殖方法は、上記培地を用いて細胞を培養する工程を包含することを特徴とする。本培養方法により限界希釈化、若しくは低密度細胞下で無添加対照に比較し好ましくは１．２倍以上、より好ましくは１．５倍以上の良好な細胞増殖が認められる。
【実施例】
【００１３】
次に、本発明を具体的に実施例にて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１ ＭＡＫキナーゼ阻害剤及びｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤によるｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質の低下
Ｃａｍｂｒｅｘ社から購入したヒト間葉系幹細胞をＭＦ培地（東洋紡社製）で３〜５代継代培養し以下の実験に供した。細胞は３７℃にて５％ＣＯ２存在下で培養した。
【００１４】
培養したヒト間葉系幹細胞をＭＦ培地で１００ｍｍシャーレ（ファルコン社製）に１０００００細胞／シャーレになるよう播種した。その後、ＰＤ９８０５９（ＭＡＰキナーゼ阻害剤、メルク社製）、或いはＳＢ２０３５８０（ｐ３８キナーゼ阻害剤阻害剤、メルク社製）を最終濃度２５μＭ或いは１０μＭになるよう添加し、ヒト間葉系幹細胞を７日間培養した。培養後、ＬＩＰＡ緩衝液（アップステイト社製）により細胞抽出液を調製し、定法に従いウェスタンブロット法によりｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質の発現量を調べた。その際、抗ｐ１６ＩＮＫ４ａ抗体はＧ１７５−１２３９（ＢＤバイオサイエンス社製）、対照とする抗β−チューブリン（β−ｔｕｂｌｉｎ）抗体はＴＵＢ２．１（シグマ社製）を用いた。その結果を図１に示す。図１において、「−」は無添加対照を示す。図１に示すようにＰＤ９８０５９或いはＳＢ２０３５８０を添加した場合は添加濃度に依存してｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質の発現抑制が観察された。
【００１５】
実施例２ ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤による細胞増殖促進
培養したヒト間葉系幹細胞をＭＦ培地で６ウェルプレート（ファルコン社製）に２００細胞／ウェルになるよう播種した。その後、ＳＢ２０３５８０（ｐ３８キナーゼ阻害剤阻害剤、メルク社製）を最終濃度２．６μＭになるよう添加し、ヒト間葉系幹細胞を１０日間培養した（図２中、「添加」）。培養後、細胞を回収し、細胞数を測定した。無添加対照での細胞数を１００とした場合の相対的細胞量を計算した（図２中、「細胞量」）。その結果、図２に示すようにＳＢ２０３５８０添加の場合では１５０以上の細胞増殖が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００１６】
本発明に係る細胞増殖培地を用いることで細胞老化を抑制し良好な増殖を得ることができるので正常細胞を大量に調整することで大量に細胞を必要する細胞移植に適用でき、再生医療分野など産業界に寄与するところが大である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＰＤ９８０５９或いはＳＢ２０３５８０を最終濃度２５μＭ或いは１０μＭになるよう添加し、ヒト間葉系幹細胞を７日間培養した場合のｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク発現量及びβ−チューブリン発現量をウェスタンブロット法により観察した図である。
【図２】ＳＢ２０３５８０添加した培地で１０日間培養した後のヒト間葉系幹細胞の細胞数を示す。無添加対象での細胞数を１００として計算した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は良好な増殖効果を示す新規な細胞増殖培地、該培地を用いて培養された細胞培養物および該培地を用いた細胞増殖方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
動物細胞の正常二倍体細胞は有限増殖寿命を有しており長期間培養すると細胞老化という現象がおこり、細胞増殖が停止する（非特許文献１）。この細胞老化にｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質が関与していることが知られている。ｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子は、癌抑制遺伝子のひとつでＩＮＫファミリーに属する遺伝子である。ＩＮＫファミリー遺伝子の産物は、サイクリン依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４）及びサイクリン依存性キナーゼ６（ＣＤＫ６）に結合し、Ｒｂタンパク質のリン酸化を阻止することでＧ１期からＳ期への移行を阻害し、細胞増殖を抑制する。ｐ１６ＩＮＫ４ａ蛋白質は、増殖中の正常細胞ではその発現レベルがきわめて低いが、細胞が分裂を繰り返し、分裂寿命に達すると発現レベルが著しく上昇し、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）を不活性化し、細胞周期をＧ１期で停止させることにより細胞老化に至らせることが報告されている（非特許文献２）。また、正常な初代培養細胞を用い、ｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子の発現レベルを上昇させることにより、細胞老化が起こり、増殖が停止することが報告されている（非特許文献３）。また、これらｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質の発現にはＭＡＰＫやｐ３８といったＭＡＰキナーゼが関与することが報告されている（非特許文献４、非特許文献５）。
【０００３】
一方、間葉系幹細胞は哺乳動物の骨髄、脂肪組織等に存在し、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞、神経細胞等に分化する多能性の幹細胞である。間葉系幹細胞はこのような多分化能を示すことから組織の再生過程に重要な役割を果たすと考えられており、骨、軟骨、心筋、神経等の各組織を再生するための供給細胞として注目されている。間葉系幹細胞に代表される動物細胞を移植に供する為には大量の細胞が必要となる。しかし、従来の培養方法では２０回前後の継代培養をすると上述のような細胞老化に至り、充分な数の細胞を得ることができないという問題があった。
特許文献１ではＲｂ／ＩＮＫ４ａ経路を阻害する遺伝子を細胞に導入することで係る問題の解決を図っているが、目的とする個々の細胞について遺伝子導入をする必要があり煩雑である。また、特許文献２では培地中に増殖因子を添加することで細胞寿命の延長を図っているが、この場合でもなおＲｂ／ＩＮＫ４ａ経路は保持されているため、やがて細胞老化に至る。
【０００４】
【特許文献１】特表２００２−５３０４３６号公報
【特許文献２】国際公開第０２／０２２７８８号パンフレット
【非特許文献１】Ｈａｙｆｌｉｃｋ，Ｌ． ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ２５，ｐｐ．５８５〜６２１，１９６１年
【非特許文献２】Ｈａｒａ，Ｅ． ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１６，ｐｐ．８５９〜８６７，１９９６年
【非特許文献３】Ｓｅｒｒａｎｏ，Ｍ． ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．８８，ｐｐ．５９３〜６０２，１９９７年
【非特許文献４】Ｌｉｎ，Ａ．Ｗ． ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，Ｖｏｌ．１２，ｐｐ．３００８〜３０１ ，１９９８年
【非特許文献５】Ｗａｎｇ，Ｗ． ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．２２，ｐｐ．３３８９〜３４０３，２００２年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、かかる従来の問題点を解消すべく、Ｒｂ／ＩＮＫ４ａ経路を不活性化することで優れた増殖能を有する細胞増殖培地を提供する事を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、ＭＡＰキナーゼ阻害剤、特にｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤を添加することで良好な増殖性を示す培地を作製するに至った。
すなわち、本発明は：
［１］Ｒｂ／ＩＮＫ４ａ経路を不活性化する物質を含有すること特徴とする細胞増殖培地；
［２］Ｒｂ／ＩＮＫ４ａ経路を不活性化する物質がｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質の発現を抑制する物質である［１］の細胞増殖培地；
［３］ｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質の発現を抑制する物質がＭＡＰキナーゼ阻害剤である［２］の細胞増殖培地；
［４］ｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質の発現を抑制する物質がｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤である［２］の細胞増殖培地；
［５］間葉系幹細胞の増殖培地である［１］〜［４］のいずれかの細胞増殖培地；
［６］［１］〜［４］のいずれかの培地を用いて培養された細胞培養物；
［７］間葉系幹細胞の培養物である［６］の細胞培養物；
［８］Ｒｂ／ＩＮＫ４ａ経路を不活性化する物質の存在下で細胞を培養する工程を包含する細胞増殖方法；
［９］Ｒｂ／ＩＮＫ４ａ経路を不活性化する物質がｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質の発現を抑制する物質である［８］の細胞増殖方法；
［１０］ｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質の発現を抑制する物質がＭＡＰキナーゼ阻害剤である［９］の細胞増殖方法；
［１１］ｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質の発現を抑制する物質がｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤である［９］の細胞増殖方法；
［１２］細胞が間葉系幹細胞である［８］〜［１１］のいずれかの細胞増殖方法
に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明に係る細胞増殖培地を使用することで細胞老化を抑制し良好な増殖を得ることができる。特に、細胞密度が低い場合や長期培養など細胞老化に至りやすい条件下でも良好に細胞を増殖することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明において、Ｒｂ／ＩＮＫ４ａ経路とはＲａｓ活性化の刺激からＲｂタンパク質のリン酸化阻害に至る経路をいう。すなわち、増殖因子等の刺激によりＲａｓが活性化するとＲａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫ経路及びＭＫＫ３，６−ｐ３８ＭＡＰ経路の細胞内情報伝達経路が活性化され、Ｅｔｓ１／２等の転写因子の活性化によりｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質の発現が上昇する。ｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質はＣＤＫ４或いはＣＤＫ６と結合し、これらのキナーゼ活性を阻害する。これによりＲｂタンパク質のリン酸化が抑制され、転写因子Ｅ２Ｆの不活性化により細胞増殖が停止する。本発明ではこれら一連の経路を担うタンパク質を標的とし、タンパク質の酵素活性、タンパク質の発現誘導、タンパク質間の結合等をＲｂ／ＩＮＫ４ａ経路を不活性化する物質を用いて阻害することでＲｂ／ＩＮＫ４ａ経路の情報伝達経路を不活性化する。Ｒｂ／ＩＮＫ４ａ経路を不活性化する物質の標的タンパク質としては係る経路にあるものであれば特に問わないが、１つの実施態様において、本発明では、ｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質の発現を抑制する物質を添加することで上記経路の不活性化を行う。
【０００９】
ｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質の発現を抑制する物質としては特に問わないが、例えば短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ；ｓｉＲＮＡ）やＲａｓ活性阻害剤などがあげられるが、本発明ではＭＡＰキナーゼ阻害剤やｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤が好適に使用できる。これらの物質を添加することによって良好な増殖が得られるという本発明者によって得られた知見は予想外であった。なぜならＭＡＰキナーゼは様々な増殖因子などの刺激により活性化するセリン／スレオニンキナーゼとして見出されたものであり、細胞増殖において重要な役割を担っていると考えられているので、ＭＡＰキナーゼを阻害することは細胞の増殖に悪影響を及ぼす可能性があるからである。また、ｐ３８ＭＡＰキナーゼはストレス応答などに関与することは示唆されていたが、細胞増殖に関与することは知られていなかった。これらの物質は細胞内のｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質の量を低下させる効果があるが、具体的にはこれら物質を添加した培地で培養した細胞から細胞抽出液を調製し、抗ｐ１６ＩＮＫ４ａ抗体を用い定法によりウエスタンブロッティングを行うことでｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質の低下を測定することができる。
【００１０】
ＭＡＰキナーゼ活性阻害剤としては特に問わないが、市販のＰＤ９８０５９、Ｕ１２４、Ｕ１２５、Ｕ１２６などが好適に使用できる。また、ｐ３８ＭＡＰキナ―ゼ阻害剤についても特に問わないが、ＳＢ２０２１９０、ＳＢ２０３５８０、ＳＢ２２００２５などが好適に使用できる。上記物質の培地中の濃度は例えば０．１〜１００μＭ、好ましくは０．５〜５０μＭ、より好ましくは１〜３０μＭで好適に使用できる。また、上記物質を添加する培地としては目的の細胞が増殖できるのであればいずれの培地も使用することができるが、例えば、ＭＦ培地、１０％牛血清含有ＤＭＥＭ、ＭＣＤＢ１５３培地などが挙げられる。
【００１１】
本発明の培地は一般の正常動物細胞に使用できるが、特に間葉系幹細胞で好適に使用できる。ここで間葉継幹細胞とは骨髄、脂肪組織、臍帯血などの生体組織に存在する細胞で、多分化能を有することを特徴とする。当該細胞は骨髄、脂肪組織、臍帯血などから採取されるが、市販のものも好適に使用される。採取される動物種は問わないが、ヒト、マウス、ブタなどが使用される。一例としては、注射等を用いヒト骨髄内から骨髄液を採取し、培養容器に付着する細胞を培養することで当該細胞を得ることができる。当該細胞は生体あるは試験管内で脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋細胞、神経細胞などの細胞に分化する能力を有する。
【００１２】
本発明に係る培地により培養された細胞培養物とは、正常動物細胞に本発明に係る培地を少なくとも１日以上接触させることにより得られた培養物をいう。よって、その前後の加工、例えば、その後に分化誘導を行い他細胞に分化したものや、移植に供したものについてもこれに含まれる。その形状については、分散状態、組織様状態を問わない。また、本発明の細胞増殖方法は、上記培地を用いて細胞を培養する工程を包含することを特徴とする。本培養方法により限界希釈化、若しくは低密度細胞下で無添加対照に比較し好ましくは１．２倍以上、より好ましくは１．５倍以上の良好な細胞増殖が認められる。
【実施例】
【００１３】
次に、本発明を具体的に実施例にて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１ ＭＡＫキナーゼ阻害剤及びｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤によるｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質の低下
Ｃａｍｂｒｅｘ社から購入したヒト間葉系幹細胞をＭＦ培地（東洋紡社製）で３〜５代継代培養し以下の実験に供した。細胞は３７℃にて５％ＣＯ２存在下で培養した。
【００１４】
培養したヒト間葉系幹細胞をＭＦ培地で１００ｍｍシャーレ（ファルコン社製）に１０００００細胞／シャーレになるよう播種した。その後、ＰＤ９８０５９（ＭＡＰキナーゼ阻害剤、メルク社製）、或いはＳＢ２０３５８０（ｐ３８キナーゼ阻害剤阻害剤、メルク社製）を最終濃度２５μＭ或いは１０μＭになるよう添加し、ヒト間葉系幹細胞を７日間培養した。培養後、ＬＩＰＡ緩衝液（アップステイト社製）により細胞抽出液を調製し、定法に従いウェスタンブロット法によりｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質の発現量を調べた。その際、抗ｐ１６ＩＮＫ４ａ抗体はＧ１７５−１２３９（ＢＤバイオサイエンス社製）、対照とする抗β−チューブリン（β−ｔｕｂｌｉｎ）抗体はＴＵＢ２．１（シグマ社製）を用いた。その結果を図１に示す。図１において、「−」は無添加対照を示す。図１に示すようにＰＤ９８０５９或いはＳＢ２０３５８０を添加した場合は添加濃度に依存してｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質の発現抑制が観察された。
【００１５】
実施例２ ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤による細胞増殖促進
培養したヒト間葉系幹細胞をＭＦ培地で６ウェルプレート（ファルコン社製）に２００細胞／ウェルになるよう播種した。その後、ＳＢ２０３５８０（ｐ３８キナーゼ阻害剤阻害剤、メルク社製）を最終濃度２．６μＭになるよう添加し、ヒト間葉系幹細胞を１０日間培養した（図２中、「添加」）。培養後、細胞を回収し、細胞数を測定した。無添加対照での細胞数を１００とした場合の相対的細胞量を計算した（図２中、「細胞量」）。その結果、図２に示すようにＳＢ２０３５８０添加の場合では１５０以上の細胞増殖が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００１６】
本発明に係る細胞増殖培地を用いることで細胞老化を抑制し良好な増殖を得ることができるので正常細胞を大量に調整することで大量に細胞を必要する細胞移植に適用でき、再生医療分野など産業界に寄与するところが大である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＰＤ９８０５９或いはＳＢ２０３５８０を最終濃度２５μＭ或いは１０μＭになるよう添加し、ヒト間葉系幹細胞を７日間培養した場合のｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク発現量及びβ−チューブリン発現量をウェスタンブロット法により観察した図である。
【図２】ＳＢ２０３５８０添加した培地で１０日間培養した後のヒト間葉系幹細胞の細胞数を示す。無添加対象での細胞数を１００として計算した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｒｂ／ＩＮＫ４ａ経路を不活性化する物質を含有すること特徴とする細胞増殖培地。
【請求項２】
Ｒｂ／ＩＮＫ４ａ経路を不活性化する物質がｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質の発現を抑制する物質である請求項１記載の細胞増殖培地。
【請求項３】
ｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質の発現を抑制する物質がＭＡＰキナーゼ阻害剤である請求項２記載の細胞増殖培地。
【請求項４】
ｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質の発現を抑制する物質がｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤である請求項２記載の細胞増殖培地。
【請求項５】
間葉系幹細胞の増殖培地である請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞増殖培地。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の培地を用いて培養された細胞培養物。
【請求項７】
間葉系幹細胞の培養物である請求項６記載の細胞培養物。
【請求項８】
Ｒｂ／ＩＮＫ４ａ経路を不活性化する物質の存在下で細胞を培養する工程を包含する細胞増殖方法。
【請求項９】
Ｒｂ／ＩＮＫ４ａ経路を不活性化する物質がｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質の発現を抑制する物質である請求項８記載の細胞増殖方法。
【請求項１０】
ｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質の発現を抑制する物質がＭＡＰキナーゼ阻害剤である請求項９記載の細胞増殖方法。
【請求項１１】
ｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質の発現を抑制する物質がｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤である請求項９記載の細胞増殖方法。
【請求項１２】
細胞が間葉系幹細胞である請求項８〜１１のいずれか１項に記載の細胞増殖方法。
【請求項１】
Ｒｂ／ＩＮＫ４ａ経路を不活性化する物質を含有すること特徴とする細胞増殖培地。
【請求項２】
Ｒｂ／ＩＮＫ４ａ経路を不活性化する物質がｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質の発現を抑制する物質である請求項１記載の細胞増殖培地。
【請求項３】
ｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質の発現を抑制する物質がＭＡＰキナーゼ阻害剤である請求項２記載の細胞増殖培地。
【請求項４】
ｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質の発現を抑制する物質がｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤である請求項２記載の細胞増殖培地。
【請求項５】
間葉系幹細胞の増殖培地である請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞増殖培地。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の培地を用いて培養された細胞培養物。
【請求項７】
間葉系幹細胞の培養物である請求項６記載の細胞培養物。
【請求項８】
Ｒｂ／ＩＮＫ４ａ経路を不活性化する物質の存在下で細胞を培養する工程を包含する細胞増殖方法。
【請求項９】
Ｒｂ／ＩＮＫ４ａ経路を不活性化する物質がｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質の発現を抑制する物質である請求項８記載の細胞増殖方法。
【請求項１０】
ｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質の発現を抑制する物質がＭＡＰキナーゼ阻害剤である請求項９記載の細胞増殖方法。
【請求項１１】
ｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質の発現を抑制する物質がｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤である請求項９記載の細胞増殖方法。
【請求項１２】
細胞が間葉系幹細胞である請求項８〜１１のいずれか１項に記載の細胞増殖方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００６−３２５４４４（Ｐ２００６−３２５４４４Ａ）
【公開日】平成１８年１２月７日（２００６．１２．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１５１２２９（Ｐ２００５−１５１２２９）
【出願日】平成１７年５月２４日（２００５．５．２４）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【出願人】（５０２１９６０５０）国立成育医療センター総長 (8)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１２月７日（２００６．１２．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月２４日（２００５．５．２４）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【出願人】（５０２１９６０５０）国立成育医療センター総長 (8)
【Ｆターム（参考）】
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