細胞増殖培地
この発明は、フィーダー及び血清不存在の条件下で、霊長類胚性幹細胞を培養する方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はフィーダー細胞及び血清非添加での培養における霊長類、望ましくはヒトの胚性幹細胞（ｈＥＳ）の維持に関する。
【背景技術】
【０００２】
真核細胞、例えばある種の哺乳類の細胞の培養は今や一般的な方法となっており、ある種の細胞を増殖させうる細胞培養条件は確立している。一般的なやり方としては、哺乳類の細胞培養には通常はプラスチック製の滅菌済み容器と増殖培地を必要とする。例えば、胚性幹細胞の増殖にはフィーダー細胞と血清が必要である。フィーダー細胞の役割については正確には分かっていない。しかしながら、フィーダー細胞は細胞増殖を活性化する増殖シグナルを発信したり、かつ／または未分化状態に細胞を維持するために機能している可能性が推察されている。フィーダー細胞には、増殖出来ないように処理された（マイトマイシン又は放射線処理）線維芽細胞が一般的には使われる。一般的にネズミ由来の線維芽細胞をフィーダー細胞に使うことが多いが、他の種由来のものを使う場合もある。
【０００３】
「幹細胞」という言葉は自己再生能を有する未分化細胞でありつつ、一方で分化した細胞や組織を形成する変動能力をも保持する細胞の総括的分類を表している。幹細胞は分化全能性、多能性ないしは多分化能性である場合がある。また、分化能力を喪失した派生幹細胞が発生することもあり、これらは“無能性”幹細胞と名付けられている。分化全能性幹細胞は原型を保った生物に見いだされる全ての細胞や組織を形成する能力を有する細胞であり、この組織としては胚体外の組織（例えば胎盤）をも含むものである。分化全能性細胞はごく早期の胚（8細胞期）を構成し、原型を保った生物を形成する能力を有している。多能性細胞は原型を保った生物に見られる全ての組織を形成する能力を有しているが、原型を保った生物を作り上げることは出来ない。多分化能性細胞は限られた分化細胞や組織を形成する能力のみを有している。一般的に成体にある幹細胞は多分化能性細胞であり、これらはある種の細胞や組織のみを形成し、老化や損傷を受けた細胞や組織を補充することのできる前駆体幹細胞ないしは系統の制限された幹細胞といったものである。これらの細胞は生物に見られる全ての組織を形成することは出来ないと一般には言われているが、ある種の報告では、このような“成体”の幹細胞であっても、従来の予想以上に多様な能力を有している、ともされている。
【０００４】
多能性胚性幹細胞は主に２つの胚性組織から派生している。内細胞塊から単離される細胞は胚性幹（ES）細胞と称される。実験マウスにおいてはこれと類似した細胞が性交後８．５−１２．５日胚の腸間膜や生殖隆起から単離される始原生殖細胞より派生してくる。これらの細胞は胚性生殖（EG）細胞と呼ばれている。これら多能性細胞の各々のタイプは相互の細胞種への分化という点においては似通った発生過程での能力を有しているが、その挙動において生じうる相違（例えばインプリンティングの点において）によりこれらの細胞は互いに区別されうる。しかしながら、“多能性胚性幹細胞”という用語は内細胞塊および始原生殖細胞由来の両方の細胞を含んでいる。
【０００５】
霊長類胚性幹細胞の体外培養の確立については疑わしい点が明らかになってきている。ｈES細胞の培養系での樹立条件が確定したという表記はWO９６／２２３６２に記載されている。WO９６／２２３６２には、多能性幹細胞に関連する一連の特徴やマーカーを提示している霊長類ES細胞の持続的な増殖を実現する細胞株や培養条件が記載されている。これらには、線維芽細胞のフィーダー層上にて維持した場合の最低でも20回の継代細胞の維持、胚様体と称される細胞クラスターの形成、浮遊培養をした際における単層培養での様々な細胞種に分化しうる能力、免疫不全マウスへの注入により様々な分化細胞種からなる異種移植の奇形腫形成、そして特にＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、アルカリフォスファターゼそしてＯｃｔ４といった胚性幹細胞特異的なマーカーの発現といった記載が含まれているが、これに限られる訳ではない。ＷＯ９６／２２３６２はマウス線維芽細胞からなるフィーダー細胞と血清存在下での未分化状態の霊長類ＥＳ細胞の維持方法を開示している。
【０００６】
治療組織工学における胚性幹細胞、特にヒトＥＳ（ｈＥＳ）細胞の潜在的な利用方法について十分な立証が存在する。該細胞の多能性という性質は、ｈＥＳ細胞のいかなる細胞／組織タイプへの選択及び分化を可能とする。しかしながら、ウシ胎児血清やネズミ由来のフィーダー細胞に曝した細胞を治療に使用した場合、プリオンやウイルスといった外来因子が患者に感染する危険性が潜在的に存在することとなる。それ故、こうした危険性を最小限に止めるようにｈＥＳ細胞の細胞培養は実施されることが必要である。フィーダー細胞や血清の無い培養条件の開発は該危険性の軽減に有効である。
【０００７】
これに加えて、特定の細胞種に分化したｈＥＳ細胞は新薬や既存薬のターゲット遺伝子の同定をする上で有用である。なぜなら、該細胞は、遺伝子型として均一であり、安定かつ由来が知られているからである。また遺伝子型の明らかなES細胞株を使用することは、薬理ゲノミクスに適した方法で薬のスクリーニングや毒物研究に可能な道筋を提供することとなる。
【０００８】
霊長類ES細胞の培養における無血清条件の開発は知られている。例えば、WO０１／６６６９７では、無血清での霊長類ＥＳ細胞培養において、血清の替わりに線維芽細胞増殖因子、一般的にはヒト塩基性線維芽細胞成長因子（ｂFGF ４ｍｇ／ｍｌ）で置き換えることを開示している。本細胞培養培地にはＫｎｏｃｋＯｕｔ ＳＲｔｍ（ＷＯ９８／３０６７９に記載されており、これはそのままリファレンスとして取り込まれている）にｂＦＧＦを添加したものを含有している。しかしながら、該細胞培養は放射線照射したマウス線維芽細胞によるフィーダー細胞をも含んでいる。
【０００９】
ｈＥＳ細胞の増殖における無血清及びフィーダー細胞のない培養方法の開発はＷＯ２００６／０２９１９８に開示されている。該培養条件は高濃度のｂＦＧＦ（４０−１００ｎｇ／ｍｌ）、ガンマアミノ酪酸、ピペコリン酸やリチウムといった添加因子、そしてアミノ酸、脂質、ビタミン類やブドウ糖を含んでいる。WO２００６／０２９１９８はまたファイブロネクチン、ビトロネクチンやラミニンといったヒト蛋白より構成される細胞培養の基質を使用することも開示している。
【００１０】
更に、Ｆｕｒｕｅら（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ａｎｉｍａｌ ４１：１９−２８，２００５）は、血清およびフィーダーが無く、白血病抑制因子（ＬＩＦ）の存在下でのマウスの胚性幹細胞の増殖について開示している。これはまたＷＯ２００５／０６３９６８に記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第WO９６／２２３６２号パンフレット
【特許文献２】国際公開第WO０１／６６６９７号パンフレット
【特許文献３】国際公開第ＷＯ９８／３０６７９号パンフレット
【特許文献４】国際公開第ＷＯ２００６／０２９１９８号パンフレット
【特許文献５】国際公開第ＷＯ２００５／０６３９６８号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
もし、ウシ胎児血清やマウスフィーダー細胞といった生体にとって異物となる材料の付加を必要としない単純な培養条件を確立することが出来れば、これは大きな意義をもつ。なぜなら、該材料を使用することにより、培養下で成長する哺乳類の細胞に感染力をもつ因子（例えば、ウシ由来の産物においてはウイルスやプリオン、マウスフィーダー細胞においてはマウスのウイルス）に感染する可能性が増大するからである。本出願は、これらに替わり得るシンプルな細胞培養培地について開示しており、該培地により、血清およびフィーダーのない条件にてｈＥＳ細胞を維持することが可能となるものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の一側面としては、フィーダー細胞や血清のない細胞培養条件で、霊長類の胚性幹細胞を維持するための方法が提供されており、これは、培養容器を用い、線維芽細胞増殖因子、ヘパリンやアスコルビン酸又はリン酸化アスコルビン酸、又はこれらの誘導体を添加した細胞培養培地により霊長類胚性幹細胞を調製すること、及び、該霊長類胚性幹細胞を未分化状態で維持すること、より構成される。
【００１４】
本発明の一側面としては、フィーダー細胞や血清のない細胞培養条件で、霊長類の胚性幹細胞を維持するための方法が提供されており、これは以下の段階より構成される：
ｉ）タンパク質より成る基礎的な培養支持体にてコートした培養容器を用い、インシュリン、トランスフェリン、セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、２−メルカプトエタノール、脂肪酸除去したウシアルブミンと複合させたオレイン酸より構成され、更に線維芽細胞増殖因子、ヘパリンやアスコルビン酸又はリン酸化アスコルビン酸、又はこれらの誘導体を添加した細胞培養培地により霊長類胚性幹細胞を調製すること
及び
ｉｉ）該霊長類胚性幹細胞を未分化状態で維持すること
【００１５】
本出願による開示は霊長類、特にヒトの多能性胚性幹細胞及び胎児性奇形癌（ＥＣ）細胞として知られる奇形癌由来の幹細胞を包含する。“多能性胚性幹細胞”とは内細胞塊及び始原生殖細胞（ＥＧ）由来の両細胞に関連する。また、可能性として、体細胞又は胚体外性の分化細胞、又はより限られた幹細胞を早期胎児由来のＥＳ細胞に類似した多能性状態へ再プログラミングすることも含まれる。該再プログラミングを実現する方法としては、分化細胞由来の体細胞核を徐核した卵に移転し、これを胎児として、ＥＳ細胞株が派生する未分化胚芽細胞の段階まで発生させるべく刺激を加えることによるものが挙げられている。また、細胞融合を用いる実験では、ＥＣ細胞やＥＳ細胞の細胞質も体細胞やその他の際病種をＥＳ様状態に再プログラミングする能力を有していることを示している。
【００１６】
該発明の好ましい方法としては、上述の細胞として安定な核型を有するものを用いる。
【００１７】
該発明の更に好ましい方法としては、アスコルビン酸はリン酸化アスコルビン酸を用いる。
【００１８】
アスコルビン酸及びリン酸化アスコルビン酸の機能的な誘導体は技術的に知られている。例としては、ＥＰ１６６６４８４の内容はリファレンスとしてまるごと組み込まれており、これには、熱や酸化に対してより高い安定性を示すアスコルビン酸の安定な誘導体が記載されている。
【００１９】
該発明の好ましい方法としては、上述の霊長類胚性幹細胞は多能性ヒト胚性幹細胞である。
【００２０】
該発明の好ましい具体例としては、該霊長類胚性幹細胞は細胞培養を通じて、少なくとも内胚葉、中胚葉および外胚葉組織への分化能を維持している。
【００２１】
該発明の更に好ましい方法としては、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）は以下の因子よりなるグループから選択される：ｂＦＧＦ／ＦＧＦ−２，以下酸性ＦＧＦ／ＦＧＦ−１，ｂＦＧＦ，ＦＧＦ−４，ＦＧＦ−９，ＦＧＦ−１７又はＦＧＦ−１８。
【００２２】
該発明の好ましい方法としては、該線維芽増殖因子はｂＦＧＦであり、好ましくは、ｂＦＧＦは１−５０ｎｇ／ｍｌの間（特に好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ）の濃度で供される。
【００２３】
好ましくは、線維芽細胞増殖因子は組み換え体によるものである。
【００２４】
該発明のさらに好ましい方法としては、リン酸化アスコルビン酸は１０−３００μｇ／ｍｌの濃度（特に好ましくはおよそ１００μｇ／ｍｌ）で供される。
【００２５】
該発明のさらに好ましい方法としては、２−エタノールアミンは０．０５−２．０μｇ／ｍｌの濃度（特に好ましくはおよそ０．６μｇ／ｍｌ）で供される。
【００２６】
該発明のさらに好ましい方法としては、オレイン酸は３−１５μｇ／ｍｌの濃度（特に好ましくはおよそ９．５μｇ／ｍｌ）で供される。
【００２７】
該発明のさらに好ましい方法としては、へパリンは１０−５００ｎｇ／ｍｌの濃度（特に好ましくはおよそ１００ｎｇ／ｍｌ）で供され、該へパリンはヘパリン硫酸塩であることが好ましい。
【００２８】
該発明の好ましい方法としては、上記のタンパク性細胞培養支持体はコラーゲンを基礎とする。
【００２９】
該発明のさらに好ましい方法としては、コラーゲンを基礎とした該細胞培養支持体はＩ型コラーゲンより成り、好ましくは組み換え体Ｉ型コラーゲンである。
【００３０】
該発明の上記に替わりうる好ましい方法としては、上記細胞培養支持体は以下の種類よりなるグループから選択される組み換え体ヒトタンパクより構成される：コラーゲンＩ、コラーゲンＶＩ、ファイブロネクチン、ラミニンおよびビトロネクチン。
【００３１】
該発明の好ましい方法としては、上述の細胞支持体は以下の種類よりなるグループから選択される少なくとも２種類の組み換え体タンパクより構成される：コラーゲンＩ、コラーゲンＶＩ、ファイブロネクチン、ラミニンおよびビトロネクチン。
【００３２】
該発明の好ましい方法としては、上記細胞支持体は組み換え体タンパクであるコラーゲンＩ、コラーゲンＶＩ、ファイブロネクチン、ラミニンおよびビトロネクチンより構成される。
【００３３】
該発明の好ましい方法としては、上記細胞培養支持体はＭａｔｒｉｇｅｌｔｍである。
【００３４】
該発明の好ましい方法としては、上記霊長類胚性幹細胞は、細胞培養容器にＥＤＴAを添加後、継代されている。
【００３５】
該発明の上記に替わりうる好ましい方法としては、上記霊長類胚性幹細胞はコラゲナーゼ、好ましくはコラゲナーゼＩＶの添加後、継代される。
【００３６】
該発明の上記に替わりうる好ましい方法としては、上記霊長類胚性幹細胞はディスパーゼの添加後、継代される。
【００３７】
該発明の上記に替わりうる好ましい方法としては、上記霊長類胚性幹細胞はトリプシン／ＥＤＴA，好ましくは組み換え体トリプシンの添加後、継代される。
【００３８】
該発明のさらに好ましい方法としては、上記霊長類胚性幹細胞はクローン化されている。
【００３９】
該発明の好ましい方法としては、該細胞培養培地は緩衝剤試薬ＨＥＰESを含んでいない。
【００４０】
本発明のさらなる側面としては、フィーダー細胞や血清のない細胞培養条件で、霊長類の胚性幹細胞を少なくとも１細胞種に分化させるための方法が提供されており、これは以下の段階より構成される：
ｉ）タンパク質より成る基礎的な培養支持体にてコートした培養容器を用い、インシュリン、トランスフェリン、セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、２−メルカプトエタノール、脂肪酸除去したウシアルブミンと複合させたオレイン酸より構成され、更に線維芽細胞増殖因子やヘパリンを添加した細胞培養培地により霊長類胚性幹細胞を調製すること
及び
ｉｉ）少なくとも１細胞種への該霊長類胚性幹細胞の分化を誘導する因子を添加すること。
【００４１】
該発明の好ましい方法としては、上記霊長類胚性幹細胞はヒト多能性胚性幹細胞である。
【００４２】
該発明の好ましい方法としては、該細胞種は神経細胞である。
【００４３】
該発明の上記に替わりうる方法としては、該細胞種は上皮細胞である。
【００４４】
該発明の好ましい方法としては、上記タンパク質より成る基礎的な細胞培養支持体はラミニンである。
【００４５】
本発明のさらなる側面としては、細胞培養物が提供されており、これは、タンパク質をベースとする培養支持体上の霊長類胚性幹細胞、及びインシュリン、トランスフェリン、セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、２−メルカプトエタノール、脂肪酸除去したウシアルブミンと複合させたオレイン酸を含む細胞培養培地を含み、更に線維芽細胞増殖因子、ヘパリン及びアスコルビン酸又はリン酸化アスコルビン酸、又はこれらの誘導体が添加されている。
【００４６】
該発明の好ましい実施例としては、該霊長類胚性幹細胞は多能性ヒト胚性幹細胞である。
【００４７】
本発明のさらなる側面としては、細胞培養物が提供されており、これは霊長類胚性幹細胞より構成されている。該細胞培養物は、タンパク質をベースとする培養支持体上の霊長類胚性幹細胞、及びインシュリン、トランスフェリン、セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、２−メルカプトエタノール、脂肪酸除去したウシアルブミンと複合させたオレイン酸を含む細胞培養培地を含み、更に線維芽細胞増殖因子及びヘパリンが添加されており、さらに該霊長類胚性幹細胞の少なくとも１細胞種への分化を誘導させる少なくとも１種類の因子を含むことにより特徴づけられている。
【００４８】
該発明の好ましい実施例としては、上記霊長類胚性幹細胞は多能性ヒト胚性幹細胞である。
【００４９】
本発明のさらなる側面としては、細胞培養容器が提供されており、これは、インシュリン、トランスフェリン、セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、２−メルカプトエタノール、脂肪酸除去したウシアルブミンと複合させたオレイン酸を含み、更に線維芽細胞増殖因子、ヘパリンやアスコルビン酸又はリン酸化アスコルビン酸、又はこれらの誘導体を添加した細胞培養培地を含んでいる。
【００５０】
該発明の好ましい実施例としては、上記細胞培養容器はさらに霊長類胚性幹細胞を含み、好ましくは、多能性ヒト胚性幹細胞である。
【００５１】
該発明のさらに好ましい実施例としては、上記容器はペトリ皿、細胞培養瓶またはフラスコ、複数穴プレートよりなるグループから選択される。「容器」とは霊長類胚性幹細胞培養を行うのに適した何らかの装置として解釈される。
【００５２】
本発明のさらなる側面としては、細胞培養培地容器が提供されており、これは、インシュリン、トランスフェリン、セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、２−メルカプトエタノール、脂肪酸除去したウシアルブミンと複合させたオレイン酸より構成され、更に線維芽細胞増殖因子、ヘパリンやアスコルビン酸又はリン酸化アスコルビン酸、又はこれらの誘導体を添加した細胞培養培地を含んでいる。
【００５３】
本発明のさらなる側面としては、細胞培養容器を提供しており、これは、インシュリン、トランスフェリン、セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、２−メルカプトエタノール、脂肪酸除去したウシアルブミンと複合させたオレイン酸より構成され、更に線維芽細胞増殖因子やヘパリンを添加した細胞培養培地を含んでいる。
【００５４】
本明細書の記載およびクレームを通して、「含む」と「含有する」という言葉及び「含んでいる」や「含有している」といったこれらの言葉の派生語は、「含んでいるが、それに限定されない」ことを意味し、他の部分、添加物、成分、完全体または段階を除外することを意図しないし、除外しない。
【００５５】
本明細書の記載およびクレームを通して、前後関係より単数と複数が区別される場合でなければ、単数形の表記は複数形の場合をも意味している。特に不定冠詞が使われている箇所においては、前後関係より単数と複数が区別さえる場合でなければ、本明細書では単数のみならず複数をも意図しているものとして理解するべきである。
【００５６】
本発明の特定の局面、実施例または例示と関連する特徴、完全体、特性、化合物、化学成分や群（グループ）は、それと両立しえない場合を除いて、ここに記載された他のいかなる局面、実施例または例示にも当てはめうるものとして理解するべきである。
【００５７】
本発明の実施例は例示のみにより、および以下の図を参照して記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図１はｂＦＧＦのヒト胚性幹細胞増殖への効果を示している。
【図２】図２はｂＦＧＦとヘパリンのヒト胚性幹細胞増殖と形態への効果を示している。
【図３】図３はフィーダー非存在下で培養された細胞におけるヒト胚性幹細胞マーカーの発現を示している。
【図４】図４は様々な培地でのヒト胚性幹細胞の増殖を示している。
【図５】図５はフィーダー非存在条件でのヒト胚性幹細胞株ＨＵＥSの増殖曲線を示している。
【図６】図６はフィーダー非存在条件でのヒト胚性幹細胞株Ｓｈｅｆ１の増殖曲線を示している。
【００５９】
表１はフィーダー非存在条件でヒト胚性幹細胞を培養するための細胞培養培地組成の要約を示している。
【実施例】
【００６０】
ヒト胚性幹細胞のフィーダー非存在培養における材料と方法
ｈＥＳＦ９は表１に明示されている。Ｈｅｓｆ５培地はＨｅｓｆ９培地と、ウシアルブミンと複合させたオレイン酸、リン酸化アスコルビン酸、ｂＦＧＦ及びヘパリン硫酸塩を添加することを除いて同一のものである。
【００６１】
Ａ．試薬
１．ヒト未分化胚性幹細胞を培養しているＴ２５フラスコ
２．ｈＥＳＦ９培地：ＨＥＰES不含で、インシュリン、トランスフェリン、セレン酸ナトリウム、２−メルカプトエタノール、２−エタノールアミン、ウシアルブミンと複合させたオレイン酸、リン酸化アスコルビン酸、ｂＦＧＦ及びヘパリン硫酸塩という９種の因子を添加したＥＳＦ基礎培地
３．ＥＤＴＡ溶液
４．１型コラーゲン（新田ゼラチン社．大阪、日本）
【００６２】
Ｂ．手順
１．Ｔ２５フラスコ（ｃｏｒｎｉｎｇ社）を１００μｇ／ｃｍ２１型コラーゲンにてコートする。
２．ＥＳ細胞コロニーはＤｕｌｂｅｃｃｏのＣａ２＋およびＭｇ２+不含リン酸緩衝生理食塩水に溶解した０．４５ｍＭから０．５ｍＭ ＤＥＴＡ４Ｎａ（シグマ社）により遊離させる（該細胞は単細胞レベルまでは分離させず、ＥＤＴA濃度は細胞株に依存する）。
３．ｈＥＳＦ９培地にて細胞を回収。
４．該細胞懸濁液を３分８００ｒｐｍの条件で沈降。
５．該細胞をｈＥＳＦ培地にて再懸濁。
６．該細胞懸濁液を３分８００ｒｐｍの条件で沈降。
７．該細胞をｈＥＳＦ培地にて再懸濁。
８．該細胞を１００μｇ／ｃｍ２Ｉ型コラーゲンによってコートした２５ｃｍ２フラスコ上にｈＥＳF9培地中にて播種する。
９．３７度、１０％ＣＯ２の多湿環境下にて培養。
【００６３】
神経への分化方法
Ａ．試薬
１．ヒト未分化胚性幹細胞を培養しているＴ２５フラスコ
２．ｈＥＳＦ９培地
２．ｈＥＳＦ５培地：ＨＥＰES不含で、インシュリン、トランスフェリン、セレン酸ナトリウム、２−メルカプトエタノール、２−エタノールアミンという５種の因子を添加したＥＳＦ基礎培地
３．ＥＤＴＡ溶液
４．ラミニン（Ｓｉｇｍａ社）
５．ｂＦＧＦとヘパリン
【００６４】
Ｂ．手順
１．プラスチック製培養皿を５μｇ／ｃｍ２ラミニンにてコートする。
２．未分化ＥＳ細胞をＤＥＴＡ溶液により回収する。
３．該細胞をラミニンにてコートした培養皿上に１０ｎｇ／ｍｌｂＦＧFおよび１００ｎｇ／ｍｌへパリンを添加したｈＥＳF５培地中にて播種する。
選択肢として、該細胞をラミニンにてコートした培養皿上にｈＥＳF９培地中にて播種し、翌日該培地を１０ｎｇ／ｍｌｂＦＧFおよび１００ｎｇ／ｍｌへパリンを添加したｈＥＳF５培地に交換する。
４．３７度、５％ＣＯ２の多湿環境下にて１日間インキュベート。
５．翌日、１０ｎｇ／ｍｌｂＦＧFを該培養に添加。
６．培養開始後２〜４日目に培地をｈＥＳＦ５培地に交換。
７．２日おきに該培地を新たなｈＥＳＦ５培地に交換。
Ｐ１２
８．培養開始後７〜１０日目に神経細胞が出現。
【００６５】
上皮様細胞への分化
Ａ．試薬
１．ヒト未分化胚性幹細胞を培養しているＴ２５フラスコ
２．ｈＥＳＦ９培地
２．ＦＡ−ＢＳＡ添加ｈＥＳＦ５培地：ＨＥＰES不含で、インシュリン、トランスフェリン、セレン酸ナトリウム、２−メルカプトエタノール、２−エタノールアミンという５種の因子と０．５ｍｇ／ｍｌ脂肪酸を除去したウシアルブミン（ＦＡ−BSA）を添加したＥＳＦ基礎培地
３．ＥＤＴＡ溶液
４．ラミニン（Ｓｉｇｍａ社）
５．ＢＭＰ４
【００６６】
Ｂ．手順
１．プラスチック製培養皿を５μｇ／ｃｍ２ラミニンにてコートする。
２．未分化ＥＳ細胞をＤＥＴＡ溶液により回収する。
３．該細胞をラミニンにてコートした培養皿上にＦＡ−ＢＳＡおよび１０ｎｇ／ｍｌＢＭＰ４を添加したｈＥＳF５培地中にて播種する。
４．２日おきに該培地を新たなＦＡ−ＢＳＡおよび１０ｎｇ／ｍｌＢＭＰ４を添加したｈＥＳＦ５培地に交換。
８．培養開始後３日目に上皮様細胞が出現。
【００６７】
【表１】
【技術分野】
【０００１】
本発明はフィーダー細胞及び血清非添加での培養における霊長類、望ましくはヒトの胚性幹細胞（ｈＥＳ）の維持に関する。
【背景技術】
【０００２】
真核細胞、例えばある種の哺乳類の細胞の培養は今や一般的な方法となっており、ある種の細胞を増殖させうる細胞培養条件は確立している。一般的なやり方としては、哺乳類の細胞培養には通常はプラスチック製の滅菌済み容器と増殖培地を必要とする。例えば、胚性幹細胞の増殖にはフィーダー細胞と血清が必要である。フィーダー細胞の役割については正確には分かっていない。しかしながら、フィーダー細胞は細胞増殖を活性化する増殖シグナルを発信したり、かつ／または未分化状態に細胞を維持するために機能している可能性が推察されている。フィーダー細胞には、増殖出来ないように処理された（マイトマイシン又は放射線処理）線維芽細胞が一般的には使われる。一般的にネズミ由来の線維芽細胞をフィーダー細胞に使うことが多いが、他の種由来のものを使う場合もある。
【０００３】
「幹細胞」という言葉は自己再生能を有する未分化細胞でありつつ、一方で分化した細胞や組織を形成する変動能力をも保持する細胞の総括的分類を表している。幹細胞は分化全能性、多能性ないしは多分化能性である場合がある。また、分化能力を喪失した派生幹細胞が発生することもあり、これらは“無能性”幹細胞と名付けられている。分化全能性幹細胞は原型を保った生物に見いだされる全ての細胞や組織を形成する能力を有する細胞であり、この組織としては胚体外の組織（例えば胎盤）をも含むものである。分化全能性細胞はごく早期の胚（8細胞期）を構成し、原型を保った生物を形成する能力を有している。多能性細胞は原型を保った生物に見られる全ての組織を形成する能力を有しているが、原型を保った生物を作り上げることは出来ない。多分化能性細胞は限られた分化細胞や組織を形成する能力のみを有している。一般的に成体にある幹細胞は多分化能性細胞であり、これらはある種の細胞や組織のみを形成し、老化や損傷を受けた細胞や組織を補充することのできる前駆体幹細胞ないしは系統の制限された幹細胞といったものである。これらの細胞は生物に見られる全ての組織を形成することは出来ないと一般には言われているが、ある種の報告では、このような“成体”の幹細胞であっても、従来の予想以上に多様な能力を有している、ともされている。
【０００４】
多能性胚性幹細胞は主に２つの胚性組織から派生している。内細胞塊から単離される細胞は胚性幹（ES）細胞と称される。実験マウスにおいてはこれと類似した細胞が性交後８．５−１２．５日胚の腸間膜や生殖隆起から単離される始原生殖細胞より派生してくる。これらの細胞は胚性生殖（EG）細胞と呼ばれている。これら多能性細胞の各々のタイプは相互の細胞種への分化という点においては似通った発生過程での能力を有しているが、その挙動において生じうる相違（例えばインプリンティングの点において）によりこれらの細胞は互いに区別されうる。しかしながら、“多能性胚性幹細胞”という用語は内細胞塊および始原生殖細胞由来の両方の細胞を含んでいる。
【０００５】
霊長類胚性幹細胞の体外培養の確立については疑わしい点が明らかになってきている。ｈES細胞の培養系での樹立条件が確定したという表記はWO９６／２２３６２に記載されている。WO９６／２２３６２には、多能性幹細胞に関連する一連の特徴やマーカーを提示している霊長類ES細胞の持続的な増殖を実現する細胞株や培養条件が記載されている。これらには、線維芽細胞のフィーダー層上にて維持した場合の最低でも20回の継代細胞の維持、胚様体と称される細胞クラスターの形成、浮遊培養をした際における単層培養での様々な細胞種に分化しうる能力、免疫不全マウスへの注入により様々な分化細胞種からなる異種移植の奇形腫形成、そして特にＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、アルカリフォスファターゼそしてＯｃｔ４といった胚性幹細胞特異的なマーカーの発現といった記載が含まれているが、これに限られる訳ではない。ＷＯ９６／２２３６２はマウス線維芽細胞からなるフィーダー細胞と血清存在下での未分化状態の霊長類ＥＳ細胞の維持方法を開示している。
【０００６】
治療組織工学における胚性幹細胞、特にヒトＥＳ（ｈＥＳ）細胞の潜在的な利用方法について十分な立証が存在する。該細胞の多能性という性質は、ｈＥＳ細胞のいかなる細胞／組織タイプへの選択及び分化を可能とする。しかしながら、ウシ胎児血清やネズミ由来のフィーダー細胞に曝した細胞を治療に使用した場合、プリオンやウイルスといった外来因子が患者に感染する危険性が潜在的に存在することとなる。それ故、こうした危険性を最小限に止めるようにｈＥＳ細胞の細胞培養は実施されることが必要である。フィーダー細胞や血清の無い培養条件の開発は該危険性の軽減に有効である。
【０００７】
これに加えて、特定の細胞種に分化したｈＥＳ細胞は新薬や既存薬のターゲット遺伝子の同定をする上で有用である。なぜなら、該細胞は、遺伝子型として均一であり、安定かつ由来が知られているからである。また遺伝子型の明らかなES細胞株を使用することは、薬理ゲノミクスに適した方法で薬のスクリーニングや毒物研究に可能な道筋を提供することとなる。
【０００８】
霊長類ES細胞の培養における無血清条件の開発は知られている。例えば、WO０１／６６６９７では、無血清での霊長類ＥＳ細胞培養において、血清の替わりに線維芽細胞増殖因子、一般的にはヒト塩基性線維芽細胞成長因子（ｂFGF ４ｍｇ／ｍｌ）で置き換えることを開示している。本細胞培養培地にはＫｎｏｃｋＯｕｔ ＳＲｔｍ（ＷＯ９８／３０６７９に記載されており、これはそのままリファレンスとして取り込まれている）にｂＦＧＦを添加したものを含有している。しかしながら、該細胞培養は放射線照射したマウス線維芽細胞によるフィーダー細胞をも含んでいる。
【０００９】
ｈＥＳ細胞の増殖における無血清及びフィーダー細胞のない培養方法の開発はＷＯ２００６／０２９１９８に開示されている。該培養条件は高濃度のｂＦＧＦ（４０−１００ｎｇ／ｍｌ）、ガンマアミノ酪酸、ピペコリン酸やリチウムといった添加因子、そしてアミノ酸、脂質、ビタミン類やブドウ糖を含んでいる。WO２００６／０２９１９８はまたファイブロネクチン、ビトロネクチンやラミニンといったヒト蛋白より構成される細胞培養の基質を使用することも開示している。
【００１０】
更に、Ｆｕｒｕｅら（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ａｎｉｍａｌ ４１：１９−２８，２００５）は、血清およびフィーダーが無く、白血病抑制因子（ＬＩＦ）の存在下でのマウスの胚性幹細胞の増殖について開示している。これはまたＷＯ２００５／０６３９６８に記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第WO９６／２２３６２号パンフレット
【特許文献２】国際公開第WO０１／６６６９７号パンフレット
【特許文献３】国際公開第ＷＯ９８／３０６７９号パンフレット
【特許文献４】国際公開第ＷＯ２００６／０２９１９８号パンフレット
【特許文献５】国際公開第ＷＯ２００５／０６３９６８号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
もし、ウシ胎児血清やマウスフィーダー細胞といった生体にとって異物となる材料の付加を必要としない単純な培養条件を確立することが出来れば、これは大きな意義をもつ。なぜなら、該材料を使用することにより、培養下で成長する哺乳類の細胞に感染力をもつ因子（例えば、ウシ由来の産物においてはウイルスやプリオン、マウスフィーダー細胞においてはマウスのウイルス）に感染する可能性が増大するからである。本出願は、これらに替わり得るシンプルな細胞培養培地について開示しており、該培地により、血清およびフィーダーのない条件にてｈＥＳ細胞を維持することが可能となるものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の一側面としては、フィーダー細胞や血清のない細胞培養条件で、霊長類の胚性幹細胞を維持するための方法が提供されており、これは、培養容器を用い、線維芽細胞増殖因子、ヘパリンやアスコルビン酸又はリン酸化アスコルビン酸、又はこれらの誘導体を添加した細胞培養培地により霊長類胚性幹細胞を調製すること、及び、該霊長類胚性幹細胞を未分化状態で維持すること、より構成される。
【００１４】
本発明の一側面としては、フィーダー細胞や血清のない細胞培養条件で、霊長類の胚性幹細胞を維持するための方法が提供されており、これは以下の段階より構成される：
ｉ）タンパク質より成る基礎的な培養支持体にてコートした培養容器を用い、インシュリン、トランスフェリン、セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、２−メルカプトエタノール、脂肪酸除去したウシアルブミンと複合させたオレイン酸より構成され、更に線維芽細胞増殖因子、ヘパリンやアスコルビン酸又はリン酸化アスコルビン酸、又はこれらの誘導体を添加した細胞培養培地により霊長類胚性幹細胞を調製すること
及び
ｉｉ）該霊長類胚性幹細胞を未分化状態で維持すること
【００１５】
本出願による開示は霊長類、特にヒトの多能性胚性幹細胞及び胎児性奇形癌（ＥＣ）細胞として知られる奇形癌由来の幹細胞を包含する。“多能性胚性幹細胞”とは内細胞塊及び始原生殖細胞（ＥＧ）由来の両細胞に関連する。また、可能性として、体細胞又は胚体外性の分化細胞、又はより限られた幹細胞を早期胎児由来のＥＳ細胞に類似した多能性状態へ再プログラミングすることも含まれる。該再プログラミングを実現する方法としては、分化細胞由来の体細胞核を徐核した卵に移転し、これを胎児として、ＥＳ細胞株が派生する未分化胚芽細胞の段階まで発生させるべく刺激を加えることによるものが挙げられている。また、細胞融合を用いる実験では、ＥＣ細胞やＥＳ細胞の細胞質も体細胞やその他の際病種をＥＳ様状態に再プログラミングする能力を有していることを示している。
【００１６】
該発明の好ましい方法としては、上述の細胞として安定な核型を有するものを用いる。
【００１７】
該発明の更に好ましい方法としては、アスコルビン酸はリン酸化アスコルビン酸を用いる。
【００１８】
アスコルビン酸及びリン酸化アスコルビン酸の機能的な誘導体は技術的に知られている。例としては、ＥＰ１６６６４８４の内容はリファレンスとしてまるごと組み込まれており、これには、熱や酸化に対してより高い安定性を示すアスコルビン酸の安定な誘導体が記載されている。
【００１９】
該発明の好ましい方法としては、上述の霊長類胚性幹細胞は多能性ヒト胚性幹細胞である。
【００２０】
該発明の好ましい具体例としては、該霊長類胚性幹細胞は細胞培養を通じて、少なくとも内胚葉、中胚葉および外胚葉組織への分化能を維持している。
【００２１】
該発明の更に好ましい方法としては、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）は以下の因子よりなるグループから選択される：ｂＦＧＦ／ＦＧＦ−２，以下酸性ＦＧＦ／ＦＧＦ−１，ｂＦＧＦ，ＦＧＦ−４，ＦＧＦ−９，ＦＧＦ−１７又はＦＧＦ−１８。
【００２２】
該発明の好ましい方法としては、該線維芽増殖因子はｂＦＧＦであり、好ましくは、ｂＦＧＦは１−５０ｎｇ／ｍｌの間（特に好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ）の濃度で供される。
【００２３】
好ましくは、線維芽細胞増殖因子は組み換え体によるものである。
【００２４】
該発明のさらに好ましい方法としては、リン酸化アスコルビン酸は１０−３００μｇ／ｍｌの濃度（特に好ましくはおよそ１００μｇ／ｍｌ）で供される。
【００２５】
該発明のさらに好ましい方法としては、２−エタノールアミンは０．０５−２．０μｇ／ｍｌの濃度（特に好ましくはおよそ０．６μｇ／ｍｌ）で供される。
【００２６】
該発明のさらに好ましい方法としては、オレイン酸は３−１５μｇ／ｍｌの濃度（特に好ましくはおよそ９．５μｇ／ｍｌ）で供される。
【００２７】
該発明のさらに好ましい方法としては、へパリンは１０−５００ｎｇ／ｍｌの濃度（特に好ましくはおよそ１００ｎｇ／ｍｌ）で供され、該へパリンはヘパリン硫酸塩であることが好ましい。
【００２８】
該発明の好ましい方法としては、上記のタンパク性細胞培養支持体はコラーゲンを基礎とする。
【００２９】
該発明のさらに好ましい方法としては、コラーゲンを基礎とした該細胞培養支持体はＩ型コラーゲンより成り、好ましくは組み換え体Ｉ型コラーゲンである。
【００３０】
該発明の上記に替わりうる好ましい方法としては、上記細胞培養支持体は以下の種類よりなるグループから選択される組み換え体ヒトタンパクより構成される：コラーゲンＩ、コラーゲンＶＩ、ファイブロネクチン、ラミニンおよびビトロネクチン。
【００３１】
該発明の好ましい方法としては、上述の細胞支持体は以下の種類よりなるグループから選択される少なくとも２種類の組み換え体タンパクより構成される：コラーゲンＩ、コラーゲンＶＩ、ファイブロネクチン、ラミニンおよびビトロネクチン。
【００３２】
該発明の好ましい方法としては、上記細胞支持体は組み換え体タンパクであるコラーゲンＩ、コラーゲンＶＩ、ファイブロネクチン、ラミニンおよびビトロネクチンより構成される。
【００３３】
該発明の好ましい方法としては、上記細胞培養支持体はＭａｔｒｉｇｅｌｔｍである。
【００３４】
該発明の好ましい方法としては、上記霊長類胚性幹細胞は、細胞培養容器にＥＤＴAを添加後、継代されている。
【００３５】
該発明の上記に替わりうる好ましい方法としては、上記霊長類胚性幹細胞はコラゲナーゼ、好ましくはコラゲナーゼＩＶの添加後、継代される。
【００３６】
該発明の上記に替わりうる好ましい方法としては、上記霊長類胚性幹細胞はディスパーゼの添加後、継代される。
【００３７】
該発明の上記に替わりうる好ましい方法としては、上記霊長類胚性幹細胞はトリプシン／ＥＤＴA，好ましくは組み換え体トリプシンの添加後、継代される。
【００３８】
該発明のさらに好ましい方法としては、上記霊長類胚性幹細胞はクローン化されている。
【００３９】
該発明の好ましい方法としては、該細胞培養培地は緩衝剤試薬ＨＥＰESを含んでいない。
【００４０】
本発明のさらなる側面としては、フィーダー細胞や血清のない細胞培養条件で、霊長類の胚性幹細胞を少なくとも１細胞種に分化させるための方法が提供されており、これは以下の段階より構成される：
ｉ）タンパク質より成る基礎的な培養支持体にてコートした培養容器を用い、インシュリン、トランスフェリン、セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、２−メルカプトエタノール、脂肪酸除去したウシアルブミンと複合させたオレイン酸より構成され、更に線維芽細胞増殖因子やヘパリンを添加した細胞培養培地により霊長類胚性幹細胞を調製すること
及び
ｉｉ）少なくとも１細胞種への該霊長類胚性幹細胞の分化を誘導する因子を添加すること。
【００４１】
該発明の好ましい方法としては、上記霊長類胚性幹細胞はヒト多能性胚性幹細胞である。
【００４２】
該発明の好ましい方法としては、該細胞種は神経細胞である。
【００４３】
該発明の上記に替わりうる方法としては、該細胞種は上皮細胞である。
【００４４】
該発明の好ましい方法としては、上記タンパク質より成る基礎的な細胞培養支持体はラミニンである。
【００４５】
本発明のさらなる側面としては、細胞培養物が提供されており、これは、タンパク質をベースとする培養支持体上の霊長類胚性幹細胞、及びインシュリン、トランスフェリン、セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、２−メルカプトエタノール、脂肪酸除去したウシアルブミンと複合させたオレイン酸を含む細胞培養培地を含み、更に線維芽細胞増殖因子、ヘパリン及びアスコルビン酸又はリン酸化アスコルビン酸、又はこれらの誘導体が添加されている。
【００４６】
該発明の好ましい実施例としては、該霊長類胚性幹細胞は多能性ヒト胚性幹細胞である。
【００４７】
本発明のさらなる側面としては、細胞培養物が提供されており、これは霊長類胚性幹細胞より構成されている。該細胞培養物は、タンパク質をベースとする培養支持体上の霊長類胚性幹細胞、及びインシュリン、トランスフェリン、セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、２−メルカプトエタノール、脂肪酸除去したウシアルブミンと複合させたオレイン酸を含む細胞培養培地を含み、更に線維芽細胞増殖因子及びヘパリンが添加されており、さらに該霊長類胚性幹細胞の少なくとも１細胞種への分化を誘導させる少なくとも１種類の因子を含むことにより特徴づけられている。
【００４８】
該発明の好ましい実施例としては、上記霊長類胚性幹細胞は多能性ヒト胚性幹細胞である。
【００４９】
本発明のさらなる側面としては、細胞培養容器が提供されており、これは、インシュリン、トランスフェリン、セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、２−メルカプトエタノール、脂肪酸除去したウシアルブミンと複合させたオレイン酸を含み、更に線維芽細胞増殖因子、ヘパリンやアスコルビン酸又はリン酸化アスコルビン酸、又はこれらの誘導体を添加した細胞培養培地を含んでいる。
【００５０】
該発明の好ましい実施例としては、上記細胞培養容器はさらに霊長類胚性幹細胞を含み、好ましくは、多能性ヒト胚性幹細胞である。
【００５１】
該発明のさらに好ましい実施例としては、上記容器はペトリ皿、細胞培養瓶またはフラスコ、複数穴プレートよりなるグループから選択される。「容器」とは霊長類胚性幹細胞培養を行うのに適した何らかの装置として解釈される。
【００５２】
本発明のさらなる側面としては、細胞培養培地容器が提供されており、これは、インシュリン、トランスフェリン、セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、２−メルカプトエタノール、脂肪酸除去したウシアルブミンと複合させたオレイン酸より構成され、更に線維芽細胞増殖因子、ヘパリンやアスコルビン酸又はリン酸化アスコルビン酸、又はこれらの誘導体を添加した細胞培養培地を含んでいる。
【００５３】
本発明のさらなる側面としては、細胞培養容器を提供しており、これは、インシュリン、トランスフェリン、セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、２−メルカプトエタノール、脂肪酸除去したウシアルブミンと複合させたオレイン酸より構成され、更に線維芽細胞増殖因子やヘパリンを添加した細胞培養培地を含んでいる。
【００５４】
本明細書の記載およびクレームを通して、「含む」と「含有する」という言葉及び「含んでいる」や「含有している」といったこれらの言葉の派生語は、「含んでいるが、それに限定されない」ことを意味し、他の部分、添加物、成分、完全体または段階を除外することを意図しないし、除外しない。
【００５５】
本明細書の記載およびクレームを通して、前後関係より単数と複数が区別される場合でなければ、単数形の表記は複数形の場合をも意味している。特に不定冠詞が使われている箇所においては、前後関係より単数と複数が区別さえる場合でなければ、本明細書では単数のみならず複数をも意図しているものとして理解するべきである。
【００５６】
本発明の特定の局面、実施例または例示と関連する特徴、完全体、特性、化合物、化学成分や群（グループ）は、それと両立しえない場合を除いて、ここに記載された他のいかなる局面、実施例または例示にも当てはめうるものとして理解するべきである。
【００５７】
本発明の実施例は例示のみにより、および以下の図を参照して記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図１はｂＦＧＦのヒト胚性幹細胞増殖への効果を示している。
【図２】図２はｂＦＧＦとヘパリンのヒト胚性幹細胞増殖と形態への効果を示している。
【図３】図３はフィーダー非存在下で培養された細胞におけるヒト胚性幹細胞マーカーの発現を示している。
【図４】図４は様々な培地でのヒト胚性幹細胞の増殖を示している。
【図５】図５はフィーダー非存在条件でのヒト胚性幹細胞株ＨＵＥSの増殖曲線を示している。
【図６】図６はフィーダー非存在条件でのヒト胚性幹細胞株Ｓｈｅｆ１の増殖曲線を示している。
【００５９】
表１はフィーダー非存在条件でヒト胚性幹細胞を培養するための細胞培養培地組成の要約を示している。
【実施例】
【００６０】
ヒト胚性幹細胞のフィーダー非存在培養における材料と方法
ｈＥＳＦ９は表１に明示されている。Ｈｅｓｆ５培地はＨｅｓｆ９培地と、ウシアルブミンと複合させたオレイン酸、リン酸化アスコルビン酸、ｂＦＧＦ及びヘパリン硫酸塩を添加することを除いて同一のものである。
【００６１】
Ａ．試薬
１．ヒト未分化胚性幹細胞を培養しているＴ２５フラスコ
２．ｈＥＳＦ９培地：ＨＥＰES不含で、インシュリン、トランスフェリン、セレン酸ナトリウム、２−メルカプトエタノール、２−エタノールアミン、ウシアルブミンと複合させたオレイン酸、リン酸化アスコルビン酸、ｂＦＧＦ及びヘパリン硫酸塩という９種の因子を添加したＥＳＦ基礎培地
３．ＥＤＴＡ溶液
４．１型コラーゲン（新田ゼラチン社．大阪、日本）
【００６２】
Ｂ．手順
１．Ｔ２５フラスコ（ｃｏｒｎｉｎｇ社）を１００μｇ／ｃｍ２１型コラーゲンにてコートする。
２．ＥＳ細胞コロニーはＤｕｌｂｅｃｃｏのＣａ２＋およびＭｇ２+不含リン酸緩衝生理食塩水に溶解した０．４５ｍＭから０．５ｍＭ ＤＥＴＡ４Ｎａ（シグマ社）により遊離させる（該細胞は単細胞レベルまでは分離させず、ＥＤＴA濃度は細胞株に依存する）。
３．ｈＥＳＦ９培地にて細胞を回収。
４．該細胞懸濁液を３分８００ｒｐｍの条件で沈降。
５．該細胞をｈＥＳＦ培地にて再懸濁。
６．該細胞懸濁液を３分８００ｒｐｍの条件で沈降。
７．該細胞をｈＥＳＦ培地にて再懸濁。
８．該細胞を１００μｇ／ｃｍ２Ｉ型コラーゲンによってコートした２５ｃｍ２フラスコ上にｈＥＳF9培地中にて播種する。
９．３７度、１０％ＣＯ２の多湿環境下にて培養。
【００６３】
神経への分化方法
Ａ．試薬
１．ヒト未分化胚性幹細胞を培養しているＴ２５フラスコ
２．ｈＥＳＦ９培地
２．ｈＥＳＦ５培地：ＨＥＰES不含で、インシュリン、トランスフェリン、セレン酸ナトリウム、２−メルカプトエタノール、２−エタノールアミンという５種の因子を添加したＥＳＦ基礎培地
３．ＥＤＴＡ溶液
４．ラミニン（Ｓｉｇｍａ社）
５．ｂＦＧＦとヘパリン
【００６４】
Ｂ．手順
１．プラスチック製培養皿を５μｇ／ｃｍ２ラミニンにてコートする。
２．未分化ＥＳ細胞をＤＥＴＡ溶液により回収する。
３．該細胞をラミニンにてコートした培養皿上に１０ｎｇ／ｍｌｂＦＧFおよび１００ｎｇ／ｍｌへパリンを添加したｈＥＳF５培地中にて播種する。
選択肢として、該細胞をラミニンにてコートした培養皿上にｈＥＳF９培地中にて播種し、翌日該培地を１０ｎｇ／ｍｌｂＦＧFおよび１００ｎｇ／ｍｌへパリンを添加したｈＥＳF５培地に交換する。
４．３７度、５％ＣＯ２の多湿環境下にて１日間インキュベート。
５．翌日、１０ｎｇ／ｍｌｂＦＧFを該培養に添加。
６．培養開始後２〜４日目に培地をｈＥＳＦ５培地に交換。
７．２日おきに該培地を新たなｈＥＳＦ５培地に交換。
Ｐ１２
８．培養開始後７〜１０日目に神経細胞が出現。
【００６５】
上皮様細胞への分化
Ａ．試薬
１．ヒト未分化胚性幹細胞を培養しているＴ２５フラスコ
２．ｈＥＳＦ９培地
２．ＦＡ−ＢＳＡ添加ｈＥＳＦ５培地：ＨＥＰES不含で、インシュリン、トランスフェリン、セレン酸ナトリウム、２−メルカプトエタノール、２−エタノールアミンという５種の因子と０．５ｍｇ／ｍｌ脂肪酸を除去したウシアルブミン（ＦＡ−BSA）を添加したＥＳＦ基礎培地
３．ＥＤＴＡ溶液
４．ラミニン（Ｓｉｇｍａ社）
５．ＢＭＰ４
【００６６】
Ｂ．手順
１．プラスチック製培養皿を５μｇ／ｃｍ２ラミニンにてコートする。
２．未分化ＥＳ細胞をＤＥＴＡ溶液により回収する。
３．該細胞をラミニンにてコートした培養皿上にＦＡ−ＢＳＡおよび１０ｎｇ／ｍｌＢＭＰ４を添加したｈＥＳF５培地中にて播種する。
４．２日おきに該培地を新たなＦＡ−ＢＳＡおよび１０ｎｇ／ｍｌＢＭＰ４を添加したｈＥＳＦ５培地に交換。
８．培養開始後３日目に上皮様細胞が出現。
【００６７】
【表１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維芽細胞増殖因子、ヘパリンやアスコルビン酸又はリン酸化アスコルビン酸、又はこれらの誘導体を添加した細胞培養培地により構成された細胞培養容器において霊長類胚性幹細胞を調製すること、及び、該霊長類胚性幹細胞を未分化状態で維持すること、より構成される、フィーダー細胞や血清のない細胞培養条件で、霊長類の胚性幹細胞を維持するための方法。
【請求項２】
以下の工程ｉ）及びｉｉ）：
ｉ）タンパク質より成る基礎的な培養支持体にてコートした培養容器を用い、該培養容器の中でインシュリン、トランスフェリン、セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、２−メルカプトエタノール、脂肪酸除去したウシアルブミンと複合させたオレイン酸より構成され、更に線維芽細胞増殖因子、ヘパリンやアスコルビン酸又はリン酸化アスコルビン酸、又はこれらの誘導体を添加した細胞培養培地により霊長類胚性幹細胞を調製する工程、及び
ｉｉ）該霊長類胚性幹細胞を未分化状態で維持する工程、
より構成される、フィーダー細胞や血清のない細胞培養条件で、霊長類の胚性幹細胞を維持するための方法。
【請求項３】
前記霊長類胚性幹細胞が安定な核型である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記アスコルビン酸がリン酸化アスコルビン酸である請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記霊長類胚性幹細胞が多能性ヒト単細胞である請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記霊長類胚性幹細胞が細胞培養を通じて少なくとも内胚葉、中胚葉そして外胚葉組織に分化する特徴を維持している請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）がａＦＧＦ，ｂＦＧＦ，ＦＧＦ−４，ＦＧＦ−９，ＦＧＦ−１７またはＦＧＦ−１８より形成されるグループから選択される請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記線維芽細胞増殖因子が１〜１００ｎｇ／ｍｌの間の濃度で供されている請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記線維芽細胞増殖因子が約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で供されている請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記線維芽細胞増殖因子がｂＦＧFである請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記線維芽細胞増殖因子が組み換え体である請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記アスコルビン酸またはリン酸化アスコルビン酸、またはこれらの誘導体が０．０１〜０．２ｍｇ／ｍｌの濃度で供されている請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記アスコルビン酸またはリン酸化アスコルビン酸、またはこれらの誘導体がおよそ０．１ｍｇ／ｍｌで供されている請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記２−エタノールアミンが０．１〜１．０ｍｇ／ｍｌ濃度で供されている請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記２−エタノールアミンがおよそ０．６ｍｇ／ｍｌで供されている請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記オレイン酸が３〜１５μｇ／ｍｌの濃度で供されている請求項１から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記オレイン酸がおよそ９．５μｇ／ｍｌで供されている請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ヘパリンが１０〜５００ｎｇ／ｍｌの濃度で供されている請求項１から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記ヘパリンがおよそ１００ｎｇ／ｍｌで供されている請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ヘパリンがヘパリンナトリウム塩である請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記タンパク質性の細胞培養支持体がコラーゲンを材料とするものである請求項１から２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記コラーゲンを原料とする細胞培養支持体がＩ型コラーゲンよりなる請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｉ型コラーゲンが組み換え体Ｉ型コラーゲンである請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞培養支持体がＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ファイブロネクチン、ラミニンおよびビトロネクチンよりなる群から選択された組み換え体ヒトタンパクよりなる請求項１から２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞支持体がＩＶ型コラーゲン、ファイブロネクチン、ラミニンおよびビトロネクチンよりなる群から選択される少なくとも２種類の組み換え体タンパクよりなる請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞支持体が組み換え体タンパクであるＩＶ型コラーゲン、ファイブロネクチン、ラミニンおよびビトロネクチンよりなる請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記タンパク性細胞培養支持体がＭａｔｒｉｇｅｌｔｍである請求項１から２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記霊長類の胚性幹細胞がＥＤＴAの培養容器への添加後に継代される請求項１から２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記霊長類の胚性幹細胞がコラゲナーゼ、好ましくはＩＶ型コラゲナーゼの添加後に継代される請求項１から２７のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記霊長類の胚性幹細胞がディスパーゼの添加後に継代される請求項１から２７のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記霊長類の胚性幹細胞がトリプシン／ＥＤＴA，好ましくは組み換え体トリプシンの添加後に継代される請求項１から２７のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記霊長類の胚性幹細胞がクローンである請求項１から３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞培養培地が緩衝物質ＨＥＰＥＳを含んでいない請求項１から３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
以下の工程ｉ）及びｉｉ）：
ｉ）タンパク質より成る基礎的な培養支持体にてコートした培養容器を用い、インシュリン、トランスフェリン、セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、２−メルカプトエタノール、脂肪酸除去したウシアルブミンと複合させたオレイン酸より構成され、更に線維芽細胞増殖因子及びヘパリンを添加した細胞培養培地により霊長類胚性幹細胞を調製する工程、及び
ｉｉ）少なくとも１細胞種への該霊長類胚性幹細胞の分化を誘導する因子を添加する工程、
より構成される、フィーダー細胞や血清のない細胞培養条件で、霊長類の胚性幹細胞を少なくとも１細胞種に分化させるための方法。
【請求項３５】
前記霊長類の胚性幹細胞がヒト多能性胚性幹細胞である請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞種が神経細胞である請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞種が上皮細胞である請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記タンパク質より成る基礎的な培養支持体がラミニンである請求項３４から３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
タンパク質をベースとする培養支持体上の霊長類胚性幹細胞、及び、インシュリン、トランスフェリン、セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、２−メルカプトエタノール、脂肪酸除去したウシアルブミンと複合させたオレイン酸を含む細胞培養培地を含み、該細胞培養培地に、更に線維芽細胞増殖因子、ヘパリン及びアスコルビン酸又はリン酸化アスコルビン酸、又はこれらの誘導体を添加されている細胞培養物。
【請求項４０】
前記霊長類の胚性幹細胞が多能性ヒト胚性幹細胞である請求項３９に記載の細胞培養物。
【請求項４１】
タンパク質をベースとする培養支持体上の霊長類胚性幹細胞、及び、インシュリン、トランスフェリン、セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、２−メルカプトエタノール、脂肪酸除去したウシアルブミンと複合させたオレイン酸を含む細胞培養培地を含み、該細胞培養培地に、更に線維芽細胞増殖因子、ヘパリン及びアスコルビン酸又はリン酸化アスコルビン酸、又はこれらの誘導体を添加されており、当該培地が、さらに霊長類胚性幹細胞の少なくとも１細胞種への分化を誘導させる少なくとも１種類の因子を含む細胞培養物。
【請求項４２】
前記霊長類の胚性幹細胞が多能性ヒト胚性幹細胞である請求項４１に記載の細胞培養物。
【請求項４３】
インシュリン、トランスフェリン、セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、２−メルカプトエタノール、脂肪酸除去したウシアルブミンと複合させたオレイン酸を含み、更に線維芽細胞増殖因子、ヘパリン及びアスコルビン酸又はリン酸化アスコルビン酸、又はこれらの誘導体を添加した細胞培養培地を含んでなる細胞培養容器。
【請求項４４】
前記細胞培養容器がさらに霊長類の胚性幹細胞を含む請求項４３に記載の細胞培養容器。
【請求項４５】
前記霊長類の胚性幹細胞が霊長類の胚性幹細胞が多能性ヒト胚性幹細胞である請求項４３または４４に記載の細胞培養培地容器。
【請求項４６】
前記容器が、ペトリ皿、細胞培養瓶またはフラスコ、複数穴プレートよりなる群から選択される請求項４３から４５のいずれかに記載の細胞培養容器。
【請求項４７】
インシュリン、トランスフェリン、セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、２−メルカプトエタノール、脂肪酸除去したウシアルブミンと複合させたオレイン酸を含み、更に線維芽細胞増殖因子、ヘパリン及びアスコルビン酸又はリン酸化アスコルビン酸、又はこれらの誘導体を添加した細胞培養培地を含む細胞培養培地容器。
【請求項４８】
インシュリン、トランスフェリン、セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、２−メルカプトエタノール、脂肪酸除去したウシアルブミンと複合させたオレイン酸を含み、更に線維芽細胞増殖因子及びヘパリンを添加した細胞培養培地を含む細胞培養培地容器。
【請求項１】
線維芽細胞増殖因子、ヘパリンやアスコルビン酸又はリン酸化アスコルビン酸、又はこれらの誘導体を添加した細胞培養培地により構成された細胞培養容器において霊長類胚性幹細胞を調製すること、及び、該霊長類胚性幹細胞を未分化状態で維持すること、より構成される、フィーダー細胞や血清のない細胞培養条件で、霊長類の胚性幹細胞を維持するための方法。
【請求項２】
以下の工程ｉ）及びｉｉ）：
ｉ）タンパク質より成る基礎的な培養支持体にてコートした培養容器を用い、該培養容器の中でインシュリン、トランスフェリン、セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、２−メルカプトエタノール、脂肪酸除去したウシアルブミンと複合させたオレイン酸より構成され、更に線維芽細胞増殖因子、ヘパリンやアスコルビン酸又はリン酸化アスコルビン酸、又はこれらの誘導体を添加した細胞培養培地により霊長類胚性幹細胞を調製する工程、及び
ｉｉ）該霊長類胚性幹細胞を未分化状態で維持する工程、
より構成される、フィーダー細胞や血清のない細胞培養条件で、霊長類の胚性幹細胞を維持するための方法。
【請求項３】
前記霊長類胚性幹細胞が安定な核型である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記アスコルビン酸がリン酸化アスコルビン酸である請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記霊長類胚性幹細胞が多能性ヒト単細胞である請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記霊長類胚性幹細胞が細胞培養を通じて少なくとも内胚葉、中胚葉そして外胚葉組織に分化する特徴を維持している請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）がａＦＧＦ，ｂＦＧＦ，ＦＧＦ−４，ＦＧＦ−９，ＦＧＦ−１７またはＦＧＦ−１８より形成されるグループから選択される請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記線維芽細胞増殖因子が１〜１００ｎｇ／ｍｌの間の濃度で供されている請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記線維芽細胞増殖因子が約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で供されている請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記線維芽細胞増殖因子がｂＦＧFである請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記線維芽細胞増殖因子が組み換え体である請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記アスコルビン酸またはリン酸化アスコルビン酸、またはこれらの誘導体が０．０１〜０．２ｍｇ／ｍｌの濃度で供されている請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記アスコルビン酸またはリン酸化アスコルビン酸、またはこれらの誘導体がおよそ０．１ｍｇ／ｍｌで供されている請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記２−エタノールアミンが０．１〜１．０ｍｇ／ｍｌ濃度で供されている請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記２−エタノールアミンがおよそ０．６ｍｇ／ｍｌで供されている請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記オレイン酸が３〜１５μｇ／ｍｌの濃度で供されている請求項１から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記オレイン酸がおよそ９．５μｇ／ｍｌで供されている請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ヘパリンが１０〜５００ｎｇ／ｍｌの濃度で供されている請求項１から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記ヘパリンがおよそ１００ｎｇ／ｍｌで供されている請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ヘパリンがヘパリンナトリウム塩である請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記タンパク質性の細胞培養支持体がコラーゲンを材料とするものである請求項１から２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記コラーゲンを原料とする細胞培養支持体がＩ型コラーゲンよりなる請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｉ型コラーゲンが組み換え体Ｉ型コラーゲンである請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞培養支持体がＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ファイブロネクチン、ラミニンおよびビトロネクチンよりなる群から選択された組み換え体ヒトタンパクよりなる請求項１から２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞支持体がＩＶ型コラーゲン、ファイブロネクチン、ラミニンおよびビトロネクチンよりなる群から選択される少なくとも２種類の組み換え体タンパクよりなる請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞支持体が組み換え体タンパクであるＩＶ型コラーゲン、ファイブロネクチン、ラミニンおよびビトロネクチンよりなる請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記タンパク性細胞培養支持体がＭａｔｒｉｇｅｌｔｍである請求項１から２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記霊長類の胚性幹細胞がＥＤＴAの培養容器への添加後に継代される請求項１から２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記霊長類の胚性幹細胞がコラゲナーゼ、好ましくはＩＶ型コラゲナーゼの添加後に継代される請求項１から２７のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記霊長類の胚性幹細胞がディスパーゼの添加後に継代される請求項１から２７のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記霊長類の胚性幹細胞がトリプシン／ＥＤＴA，好ましくは組み換え体トリプシンの添加後に継代される請求項１から２７のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記霊長類の胚性幹細胞がクローンである請求項１から３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞培養培地が緩衝物質ＨＥＰＥＳを含んでいない請求項１から３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
以下の工程ｉ）及びｉｉ）：
ｉ）タンパク質より成る基礎的な培養支持体にてコートした培養容器を用い、インシュリン、トランスフェリン、セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、２−メルカプトエタノール、脂肪酸除去したウシアルブミンと複合させたオレイン酸より構成され、更に線維芽細胞増殖因子及びヘパリンを添加した細胞培養培地により霊長類胚性幹細胞を調製する工程、及び
ｉｉ）少なくとも１細胞種への該霊長類胚性幹細胞の分化を誘導する因子を添加する工程、
より構成される、フィーダー細胞や血清のない細胞培養条件で、霊長類の胚性幹細胞を少なくとも１細胞種に分化させるための方法。
【請求項３５】
前記霊長類の胚性幹細胞がヒト多能性胚性幹細胞である請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞種が神経細胞である請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞種が上皮細胞である請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記タンパク質より成る基礎的な培養支持体がラミニンである請求項３４から３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
タンパク質をベースとする培養支持体上の霊長類胚性幹細胞、及び、インシュリン、トランスフェリン、セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、２−メルカプトエタノール、脂肪酸除去したウシアルブミンと複合させたオレイン酸を含む細胞培養培地を含み、該細胞培養培地に、更に線維芽細胞増殖因子、ヘパリン及びアスコルビン酸又はリン酸化アスコルビン酸、又はこれらの誘導体を添加されている細胞培養物。
【請求項４０】
前記霊長類の胚性幹細胞が多能性ヒト胚性幹細胞である請求項３９に記載の細胞培養物。
【請求項４１】
タンパク質をベースとする培養支持体上の霊長類胚性幹細胞、及び、インシュリン、トランスフェリン、セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、２−メルカプトエタノール、脂肪酸除去したウシアルブミンと複合させたオレイン酸を含む細胞培養培地を含み、該細胞培養培地に、更に線維芽細胞増殖因子、ヘパリン及びアスコルビン酸又はリン酸化アスコルビン酸、又はこれらの誘導体を添加されており、当該培地が、さらに霊長類胚性幹細胞の少なくとも１細胞種への分化を誘導させる少なくとも１種類の因子を含む細胞培養物。
【請求項４２】
前記霊長類の胚性幹細胞が多能性ヒト胚性幹細胞である請求項４１に記載の細胞培養物。
【請求項４３】
インシュリン、トランスフェリン、セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、２−メルカプトエタノール、脂肪酸除去したウシアルブミンと複合させたオレイン酸を含み、更に線維芽細胞増殖因子、ヘパリン及びアスコルビン酸又はリン酸化アスコルビン酸、又はこれらの誘導体を添加した細胞培養培地を含んでなる細胞培養容器。
【請求項４４】
前記細胞培養容器がさらに霊長類の胚性幹細胞を含む請求項４３に記載の細胞培養容器。
【請求項４５】
前記霊長類の胚性幹細胞が霊長類の胚性幹細胞が多能性ヒト胚性幹細胞である請求項４３または４４に記載の細胞培養培地容器。
【請求項４６】
前記容器が、ペトリ皿、細胞培養瓶またはフラスコ、複数穴プレートよりなる群から選択される請求項４３から４５のいずれかに記載の細胞培養容器。
【請求項４７】
インシュリン、トランスフェリン、セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、２−メルカプトエタノール、脂肪酸除去したウシアルブミンと複合させたオレイン酸を含み、更に線維芽細胞増殖因子、ヘパリン及びアスコルビン酸又はリン酸化アスコルビン酸、又はこれらの誘導体を添加した細胞培養培地を含む細胞培養培地容器。
【請求項４８】
インシュリン、トランスフェリン、セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、２−メルカプトエタノール、脂肪酸除去したウシアルブミンと複合させたオレイン酸を含み、更に線維芽細胞増殖因子及びヘパリンを添加した細胞培養培地を含む細胞培養培地容器。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００９−５４２２４７（Ｐ２００９−５４２２４７Ａ）
【公表日】平成２１年１２月３日（２００９．１２．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１８９５８（Ｐ２００９−５１８９５８）
【出願日】平成１９年７月１０日（２００７．７．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００７／００２５８４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／００７０８２
【国際公開日】平成２０年１月１７日（２００８．１．１７）
【出願人】（５０００８５７６９）ユニヴァーシティー オヴ シェフィールド (7)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１２月３日（２００９．１２．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年７月１０日（２００７．７．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００７／００２５８４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／００７０８２
【国際公開日】平成２０年１月１７日（２００８．１．１７）
【出願人】（５０００８５７６９）ユニヴァーシティー オヴ シェフィールド (7)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]