細胞積層方法
【課題】細胞を積層させることで細胞からなる三次元構造体を構築し、生体類似組織を提供すること。
【解決手段】単基材表面に形成した単層細胞層の上方に、第１物質である細胞接着ペプチドを構造中に有する水溶性ポリマーの層及び第２物質である水溶性ポリマーの層を構築させて、更に単層細胞層を形成することを特徴とする細胞積層方法であり、好ましくは第１物質の層及び第２物質の層が交互に複数構築され、単層細胞層が結合組織細胞又は表皮細胞であり、該細胞積層方法を繰り返して複数回行って、結合組織細胞及び／又は機能細胞を複数層積層する細胞積層方法。
【解決手段】単基材表面に形成した単層細胞層の上方に、第１物質である細胞接着ペプチドを構造中に有する水溶性ポリマーの層及び第２物質である水溶性ポリマーの層を構築させて、更に単層細胞層を形成することを特徴とする細胞積層方法であり、好ましくは第１物質の層及び第２物質の層が交互に複数構築され、単層細胞層が結合組織細胞又は表皮細胞であり、該細胞積層方法を繰り返して複数回行って、結合組織細胞及び／又は機能細胞を複数層積層する細胞積層方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を用いた三次元構造体からなる細胞積層の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に細胞を生体外でプラスチックやガラスシャーレの上などで培養すると、ほとんどの細胞は、基材表面や、栄養補給のための培養液の組成を最適化することにより、生存させることができる。しかしながら、その培養形態はシャーレ上で接着伸展後、扁平な形態をとり、細胞本来の機能を消失してしまうことが多い。特に、この傾向は上皮系の機能細胞（肝実質細胞、腺上皮細胞など）において良く観察される。
こうした機能細胞の機能を保持するために種々の培養方法が開発された。代表的な培養方法として、細胞外マトリックを利用して三次元培養する方法がある。例えば、コラーゲンゲルの上や中で細胞を培養し細胞機能を維持させる方法があり、簡便に実施するためのキットなども市販されている。この技術は、生体内で細胞近傍に存在する細胞外マトリックスを処方し細胞の周辺環境を生体模倣する方法である。肝実質細胞や乳腺上皮細胞などで細胞機能の亢進が報告されている。
しかしながら、この方法はマトリックス成分のみに注目しており、実際は、同種細胞や異種細胞及び細胞外マトリックスが複雑に絡み合った構造をしており生体組織が構築できているわけではなく、一部を取り出して模倣しているだけである。それだけでも十分に価値はあるが、更に複雑な生体モデル系が必要とされている。
【０００３】
現在、細胞を組織化する方法として、例えば、二次元に培養し、増殖させたシート状の細胞を重ね合わせ、三次元化する方法等が報告されている（特許文献１〜３参照）。例えば、特許文献１の方法は、まず、温度応答性高分子により表面を被覆した支持体上で細胞を培養し、細胞を二次元に増殖させることによって単層の細胞層を調製する。続いて、この細胞層をキャリアに密着させ、前記細胞層を前記キャリアと共に前記支持体から剥離することによって細胞シートを準備する。そして、得られた複数の細胞シートを重ねあわせることにより、三次元化を行う。また、特許文献２および３の方法は、支持体上にフィブリンゲル層を形成し、前記フィブリンゲル層上で細胞を二次元に増殖させた後、前記支持体から前記フィブリンゲル層と細胞層との積層体を剥離することによって細胞シートを準備し、得られた複数の細胞シートを重ね合わせて三次元化する方法である。
しかし、上記方法で作製された細胞層は、それ自体の機械的強度が極めて弱いため、培養されたシート状態を保ったまま剥離することがなかなか困難である。また、後者の方法では、機械的強度のあるフィブリンゲル層を使用することによって、細胞層が形成されたフィブリンゲル層の剥離を容易にしているが、層厚を厚くすることによってフィブリンゲル層の機械的強度を向上させた結果、重ね合わせた細胞層と細胞層との間に、厚いフィブリン層が存在し層間のシグナル伝達にタイムラグやばらつきが生じるおそれがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−２６１５３２号公報
【特許文献２】特開２００４−２６１５３３号公報
【特許文献３】特開２００５−６０８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、細胞を積層させることで細胞からなる三次元構造体を構築し、生体類似組織を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は以下の通りである。
（１）基材表面に形成した単層細胞層の上方に、第１物質である細胞接着ペプチドを構造中に有する水溶性ポリマーの層及び第２物質である水溶性ポリマーの層を構築させて、更に単層細胞層を形成することを特徴とする細胞積層方法。
（２）第１物質の層及び第２物質の層が交互に複数構築されている（１）記載の細胞積層方法。
（３）前記単層細胞層が、結合組織細胞又は機能細胞である（１）又は（２）記載の細胞積層方法。
（４）前記結合組織細胞が、線維芽細胞、平滑筋細胞、及び間充織細胞から選ばれる少なくとも一つの細胞である（１）〜（３）いずれか記載の細胞積層方法。
（５）前記機能細胞が上皮系細胞、血管内皮細胞、及び表皮系細胞から選ばれる少なくとも一つの細胞である（１）〜（４）いずれか記載の細胞積層方法。
（６）（３）〜（５）いずれか記載の細胞積層方法を繰り返して複数回行って、結合組織細胞及び／又は機能細胞を複数層積層する細胞積層方法。
（７）前記基材が、無蛍光又は低蛍光な材質からなるプラスチックもしくはガラスである（１）〜（６）いずれか記載の細胞積層方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の細胞積層方法によれば、細胞からなる三次元構造体が構築され、生体類似組織が形成できる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明の細胞積層方法における接着層形成方法の一例を示す概略工程図
【図２】実施例及び比較例の細胞の蛍光染色の状態を示す写真
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、基材表面に形成した単層細胞層の上方に、第１物質である細胞接着ペプチドを構造中に有する水溶性ポリマーの層及び第２物質である水溶性ポリマーの層を構築させて、更に単層細胞層を形成することを特徴とする細胞積層方法であり、細胞を積層して三次元組織を製造する方法である。
【００１０】
本発明の細胞積層方法の工程としては、
（１）基材表面上に単層細胞層を形成する工程、
（２）前記基材上の単層細胞層を、第１物質である細胞接着ペプチドを構造中に有する水溶性ポリマーを含有する溶液、及び第２物質である水溶性ポリマーの含有液に交互に接触させ、前記単層細胞層上に、第１物質と第２物質とが交互に積層された細胞接着層を形成する工程、
（３）細胞を培養して、細胞層を形成する工程
を含むことが好ましい。
【００１１】
本発明に使用する第１物質である細胞接着ペプチドを構造中に有する水溶性ポリマーは、細胞接着に関連する以下のペプチドを含んでいる。細胞接着ペプチドとしては、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、またはビトロネクチン等に含まれるペプチドであり、これらペプチドの長さとしては、３〜２０個、好ましくは６〜１５個のアミノ酸残基である。より具体的には、フィブロネクチンの細胞結合ドメインにあるＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列を含むペプチドであるＧｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ（ＧＲＧＤＳＰ）やＴｒｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（Ｆｉｂ（１））、代表的な細胞接着性蛋白質であるラミニンに存在するアミノ酸配列であるＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ（ＹＩＧＳＲ）、Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ（ＲＫＲＬＱＶＱＬＳＩＲＴ；ＡＧ７３）等が挙げられる。
【００１２】
本発明に使用する第１物質及び第２物質に使用する水溶性ポリマーとしては、分子内に疎水性を有する直鎖状炭素骨格とペプチドと反応しうる官能基とを有し、細胞培養表面基質に吸着することができるポリマーであることが好ましい。具体的には分子内にポリアルキレン鎖あるいは直鎖アミノ酸ポリマー（ポリグリシン、ポリアラニン、ポリバリン、ポリロイシン、ポリフェニルアラニン等）やその誘導体などの疎水性の直鎖状骨格を持ち、基材との接着性を有するポリマーで、該直鎖状骨格に直接、あるいはスペーサーを介してペプチドと反応できる反応性の官能基（反応基）とを有する疎水結合性吸着ポリマーを好適に用いることができる。代表例として、無水マレイン酸とスチレンとの交互共重合体（以下、ＭＡＳＴ（maleic anhydride / styrene copolymer）と呼ぶ）や、無水マレイン酸とメチルビニルエーテルとの交互共重合体（以下、ＭＭＡＣ（methyl vinyl ether / maleic anhydride copolymer）と呼ぶ）を挙げることができる。
【００１３】
上記のペプチドと疎水結合性吸着ポリマー（水溶性ポリマー）との反応は、ポリマー鎖のペプチドと反応しうる官能基と該ペプチドとを、カップリング剤を用いて化学結合させる。具体的には、ポリマー鎖に導入したカルボキシル基またはアミノ基と、ペプチドに含まれるアミノ基またはカルボキシル基との、水溶性カルボジイミドを用いた縮合結合、あるいはグルタルアルデヒドなどの二官能性架橋剤による架橋反応が挙げられる。
【００１４】
第１物質である細胞接着ペプチドを構造中に有する水溶性ポリマーを含有する溶液、及び第２物質である水溶性ポリマーの含有液に交互に接触させることにより基材上で培養している細胞層上に細胞接着能力を有する細胞接着層を構築することができる。
【００１５】
具体的な各含有液の溶液濃度としては、好ましくは０．０００１〜１重量％であり、より好ましくは０．０１〜０．５重量％であり、更に好ましくは０．０２〜０．１重量％である。溶液の溶媒は特に制限しないが、細胞を培養する特性から水や緩衝液等の水性溶媒があげられ、前記緩衝液としては、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液等のＴｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、クエン酸−リン酸緩衝液、グリシルグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、Ｂｒｉｔｔｏｎ-Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液、ＧＴＡ緩衝液等が使用できる。溶液のｐＨは、特に制限されないが、好ましくは３〜１１であり、より好ましくは６〜８であり、更に好ましくは７．２〜７．４である。
【００１６】
各含有液との接触方法としては、特に制限されず、例えば、各含有液に基材を浸漬する方法、基材に含有液を滴下または噴霧する方法等があげられるが、操作が容易であることから浸漬方法が好ましい。接触の条件は、特に制限されず、接触方法や使用する含有液の濃度等によって適宜決定できる。具体的には、接触時間は、特に制限されないが、好ましくは１〜１４４０分であり、より好ましくは５〜６０分、更に好ましくは１０〜１５分である。接触温度は、特に制限されないが、好ましくは４〜６０℃であり、より好ましくは２０〜４０℃、更に好ましくは３０〜３７℃である。
【００１７】
次いで、細胞接着層上に一層目と同種、または異種の細胞を播種し、1時間以上、好ましくは４時間以上静置し培養することで二層目の細胞層を構築することが可能である。
【００１８】
本発明に用いる細胞層としては、結合組織細胞又は機能細胞であることが好ましい。結合組織細胞としては、線維芽細胞、平滑筋細胞、間充織細胞等が挙げられ、機能細胞としては上皮系細胞、血管内皮細胞、表皮系細胞等が挙げられる。又、細胞積層方法を繰り返して複数回行って、結合組織細胞及び／又は機能細胞を複数層積層することができる。
【００１９】
細胞の培養条件は、特に制限されず、培養する細胞に応じて適宜決定できる。一般的な条件としては、培養温度が、好ましくは４〜６０℃であり、より好ましくは２０〜４０℃、更に好ましくは３０〜３７℃である。培養時間は、好ましくは１〜１６８時間であり、より好ましくは３〜２４時間、更に好ましくは３〜１２時間である。また、細胞培養に使用する培地も特に制限されず、細胞に応じて適宜使用でき、例えば、Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ培地 (ＤＭＥＭ)、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ培地(ＭＥＭ)、Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ培地、ＲＤＭＩ、ＧｌｕｔａＭａｘ培地、無血清培地等が使用できる。播種する細胞の密度は、特に制限されないが、例えば、０．０１×１０4〜１００×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2であり、好ましくは１×１０4〜１０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2である。
【００２０】
細胞接着層の形成及び細胞接着層上での細胞層の構築の工程を繰り返すことで、多層化した細胞組織を得ることができる。
【００２１】
本発明に使用する基材としては、例えば、プラスチック、合成ゴム、無機物および金属等を使用した細胞培養基質が挙げられるが、特に成型性に優れているプラスチックが好ましい。
プラスチックとしては、熱可塑性樹脂または熱硬化性樹脂のいずれの樹脂も使用することができ、熱可塑性樹脂としては、例えば、アクリル樹脂、ポリ塩化ビニル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリメチルペンテン樹脂、フッ素樹脂またはポリカーボネート等が、熱硬化性樹脂としては、例えば、フェノール樹脂、尿素樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂またはシリコン樹脂等が例示されるが、特に透明性の高さからポリスチレン樹脂が好ましい。特に無蛍光又は低蛍光な材質であることが好ましく、自己蛍光の低さからフッ素樹脂も好適に用いることができる。
【００２２】
また、基材への細胞の接着性を向上させるために、コラーゲンＩ型、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン等の細胞接着因子のコーティングや、細胞接着ペプチドを構造内に含む水溶性ポリマーをコーティングすること好ましい。水溶性の合成ポリマー化合物を使用することで培養系から動物由来物質を排除することが可能である。
【００２３】
本発明の細胞積層方法によれば、単層の細胞層を形成する工程と、前記細胞層を第１物質含有液と第２物質含有液とに交互に接触させる工程とを繰り返し行うのみで、接着層を介して連続的に細胞層を高さ方向（ｚ軸方向）に積層できる。このため、単層の細胞シートの剥離や、剥離した細胞シートの重ね合わせが不要であり、優れた再現性・効率で、極めて簡便に三次元組織を製造できる。
また、本発明の方法は、工程が単純であり、所望の領域に細胞層と接着層の形成ができることから、例えば、どのような形状の表面において細胞を積層でき、複雑な形状の三次元組織も製造可能である。例えば、血管のように中空形状の三次元組織の場合には、リング状の基材表面に、細胞層の形成と接着層の形成とを交互に繰り返すことで、中心軸方向に細胞層を連続的に積層できるため、従来のように細胞層の貼り合せ等を行うことなく、円筒状（中空形状）の三次元組織を得ることも可能である。つまり、細胞層の形成と接着層を形成する平面領域を設定することで、どのような断面形状（Ｘ-Ｙ平面）の組織でも形成可能である。また、例えば、人工血管の内表面へ、第１物質含有液と第２物質含有液とを交互に流すことで、前記内表面へ細胞外マトリックスを形成し、さらに、細胞溶液を流しながら人工血管を回転させることで、細胞を接着させることができる。この工程を繰り返すことで、人工血管等の管状構造の内表面に細胞層を幾重にも形成できる。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例および比較例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
《実施例１》
（１） ポリマー塗布
すべての操作は無菌操作を前提とする。遠沈管に１０μｇ／ｍＬでＭＡＳＴ−Ｆｉｂ（１）を水−エタノール溶媒（体積比１：１）に溶かした溶液を用意する。３０ｍｍφ細胞培養用シートであるセルデスク（住友ベークライト製ＭＳ−９２３０２）を市販の滅菌済み３５ｍｍφシャーレに入れ、この溶液を０．５ｍＬ分注しセルデスクを浸漬させて、4時間静置した。その後、純水３ｍＬを加えた３５ｍｍφシャーレにセルデスクを入れて洗浄した後、室温で乾燥させた。
【００２５】
（２）１層目細胞培養
フラスコで培養したＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ラット由来線維芽細胞）を０．２５％トリプシン溶液で剥がし、回収した細胞を１０％ウシ胎児血清含有のダルベッコ改変イーグル培養液（Ｄ−ＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、１１８８５−０８４）に分散し、遠心分離により細胞を洗浄、１０％ＦＢＳ含有Ｄ―ＭＥＭで再分散した。細胞分散液を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、上記（１）のコートしたセルデスク上に１ｍＬ加え、３７℃のＣＯ２インキュベーターで２４時間培養を行った。
【００２６】
（３）ポリマー積層塗布
塗布のための溶液Ａとして、３５ｍｍφシャーレに２ｍＬの１０μｇ／ｍＬのＭＡＳＴ−Ｆｉｂ（１）の０．１ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）を準備。同じく溶液Ｂとして３５ｍｍφシャーレに２ｍＬの１０μｇ／ｍＬのＭＡＳＴの０．１ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）を入れたものを準備した。また、洗浄用に３５φシャーレに０．０１ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）を３ｍＬ入れたものを準備した。
（２）で細胞を培養したセルデスクを、洗浄用トリス緩衝液で洗浄した後、まずＭＡＳＴ−Ｆｉｂ（１）溶液に１分間浸漬させ細胞表面にＭＡＳＴ−Ｆｉｂ（１）の層を構築した。１分後、洗浄液にセルデスクを入れ１分間浸漬洗浄させた。次にＭＡＳＴ溶液に１分間浸漬しＭＡＳＴ層を構築させた。次に洗浄液に１分間浸漬させた。この操作を繰り返し、ＭＡＳＴ−Ｆｉｂ（１）とＭＡＳＴの交互に９層積層させた。（図１）
【００２７】
（４）細胞積層
フラスコで培養したＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ラット由来線維芽細胞、ＤＳファーマバイオメディカル）を０．２５％トリプシン溶液で剥がし、回収した細胞を１０％ウシ胎児血清含有のダルベッコ改変イーグル培養液（Ｄ−ＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、１１８８５−０８４）に分散し、遠心分離により細胞を洗浄、１０％ＦＢＳ含有Ｄ―ＭＥＭで再分散した。細胞分散液を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、上記のセルデスク上に１ｍＬ加え、３７℃のＣＯ２インキュベーターで２４時間培養を行った。
（３）、（４）の作業を繰り返し、３日かけて、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を３層積層したセルデスクを準備した。
【００２８】
（５）血管内皮細胞積層
ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を３層積層させたセルデスク上のＮＩＨ／３Ｔ３上に（３）に従って、ＭＡＳＴ−ＦｉＢ（１）とＭＡＳＴの交互に９層積層させた。
フラスコでセミコンフレントまで培養したヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、クラボウ、ＫＥ−４１０９）の培地を除去、血清無添加のＤ−ＭＥＭに細胞染色用蛍光色素ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｏｒｅｎｇｅ（ＬＯＮＺＡ製、ＰＡ―１２）をジメチルスルホキシドで０．５μｍｏＬ／Ｌに調製したものを１０００倍希釈した物を加え、３７℃炭酸ガス培養器で４５分培養し細胞染色する。
上記細胞を０．２５％トリプシン溶液で剥がし、回収した細胞を１０％ウシ胎児血清含有のダルベッコ改変イーグル培養液（Ｄ−ＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、１１８８５−０８４）に分散し、遠心分離により細胞を洗浄、１０％ＦＢＳ含有Ｄ―ＭＥＭで再分散した。細胞分散液を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、上記のセルデスク上に１ｍＬ加え、３７℃のＣＯ２インキュベーターで２４時間培養を行い、蛍光染色を行った。
【００２９】
《比較例１》
（１）ポリマー塗布
すべての操作は無菌操作を前提とする。遠沈管に１０μｇ／ｍＬでＭＡｓｔ−Ｆｉｂ（１）を水−エタノール溶媒（体積比１：１）に溶かしたものを用意する。３０ｍｍφ細胞培養用シートであるセルデスク（住友ベークライト製ＭＳ−９２３０２）を市販の滅菌済み３５ｍｍφシャーレにいれ、この溶液を０．５ｍＬ分注しセルデスクを浸漬させて、4時間静置した。その後、純水３ｍＬを加えた３５ｍｍφシャーレにセルデスクを入れて洗浄した後、室温で乾燥させた。
【００３０】
（２）１層目細胞培養
フラスコで培養したＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ラット由来線維芽細胞）を０．２５％トリプシン溶液で剥がし、回収した細胞を１０％ウシ胎児血清含有のダルベッコ改変イーグル培養液（Ｄ−ＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、１１８８５−０８４）に分散し、遠心分離により細胞を洗浄、１０％ＦＢＳ含有Ｄ―ＭＥＭで再分散した。細胞分散液を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、上記（１）のコートしたセルデスク上に１ｍＬ加え、３７℃のＣＯ２インキュベーターで２４時間培養を行った。
【００３１】
（３） ２層目細胞培養
フラスコで培養したＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ラット由来線維芽細胞、ＤＳファーマバイオメディカル）を０．２５％トリプシン溶液で剥がし、回収した細胞を１０％ウシ胎児血清含有のダルベッコ改変イーグル培養液（Ｄ−ＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、１１８８５−０８４）に分散し、遠心分離により細胞を洗浄、１０％ＦＢＳ含有Ｄ―ＭＥＭで再分散した。細胞分散液を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、中間のポリマー層を形成させずに、直接（２）のセルデスク上に１ｍＬ加え、３７℃のＣＯ２インキュベーターで２４時間培養を行った。
【００３２】
（４）細胞積層
（２）の操作を繰り返してＮＩＨ／３Ｔ３細胞を３層積層させる操作を繰り返した。
【００３３】
（５）血管内皮細胞積層
フラスコでセミコンフレントまで培養したヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、クラボウ、ＫＥ−４１０９）の培地を除去、血清無添加のＤ−ＭＥＭに細胞染色用蛍光色素ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｏｒｅｎｇｅ（ＬＯＮＺＡ製、ＰＡ―１２）をジメチルスルホキシドで０．５μｍｏＬ／Ｌに調製したものを１０００倍希釈した物を加え、３７℃炭酸ガス培養器で４５分培養し細胞染色した。
上記細胞を０．２５％トリプシン溶液で剥がし、回収した細胞を１０％ウシ胎児血清含有のダルベッコ改変イーグル培養液（Ｄ−ＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、１１８８５−０８４）に分散し、遠心分離により細胞を洗浄、１０％ＦＢＳ含有Ｄ―ＭＥＭで再分散した。細胞分散液を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、上記（３）のセルデスク上に１ｍＬ加え、３７℃のＣＯ２インキュベーターで２４時間培養を行い、蛍光染色を行った。
【００３４】
実施例１、比較例２の結果を図２に示す。
実施例１では蛍光染色された細胞が観察されているのに対し、比較例１では蛍光を示す細胞が全く観察されていない。この結果より、本発明の方法によって細胞の積層が可能であることが証明された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を用いた三次元構造体からなる細胞積層の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に細胞を生体外でプラスチックやガラスシャーレの上などで培養すると、ほとんどの細胞は、基材表面や、栄養補給のための培養液の組成を最適化することにより、生存させることができる。しかしながら、その培養形態はシャーレ上で接着伸展後、扁平な形態をとり、細胞本来の機能を消失してしまうことが多い。特に、この傾向は上皮系の機能細胞（肝実質細胞、腺上皮細胞など）において良く観察される。
こうした機能細胞の機能を保持するために種々の培養方法が開発された。代表的な培養方法として、細胞外マトリックを利用して三次元培養する方法がある。例えば、コラーゲンゲルの上や中で細胞を培養し細胞機能を維持させる方法があり、簡便に実施するためのキットなども市販されている。この技術は、生体内で細胞近傍に存在する細胞外マトリックスを処方し細胞の周辺環境を生体模倣する方法である。肝実質細胞や乳腺上皮細胞などで細胞機能の亢進が報告されている。
しかしながら、この方法はマトリックス成分のみに注目しており、実際は、同種細胞や異種細胞及び細胞外マトリックスが複雑に絡み合った構造をしており生体組織が構築できているわけではなく、一部を取り出して模倣しているだけである。それだけでも十分に価値はあるが、更に複雑な生体モデル系が必要とされている。
【０００３】
現在、細胞を組織化する方法として、例えば、二次元に培養し、増殖させたシート状の細胞を重ね合わせ、三次元化する方法等が報告されている（特許文献１〜３参照）。例えば、特許文献１の方法は、まず、温度応答性高分子により表面を被覆した支持体上で細胞を培養し、細胞を二次元に増殖させることによって単層の細胞層を調製する。続いて、この細胞層をキャリアに密着させ、前記細胞層を前記キャリアと共に前記支持体から剥離することによって細胞シートを準備する。そして、得られた複数の細胞シートを重ねあわせることにより、三次元化を行う。また、特許文献２および３の方法は、支持体上にフィブリンゲル層を形成し、前記フィブリンゲル層上で細胞を二次元に増殖させた後、前記支持体から前記フィブリンゲル層と細胞層との積層体を剥離することによって細胞シートを準備し、得られた複数の細胞シートを重ね合わせて三次元化する方法である。
しかし、上記方法で作製された細胞層は、それ自体の機械的強度が極めて弱いため、培養されたシート状態を保ったまま剥離することがなかなか困難である。また、後者の方法では、機械的強度のあるフィブリンゲル層を使用することによって、細胞層が形成されたフィブリンゲル層の剥離を容易にしているが、層厚を厚くすることによってフィブリンゲル層の機械的強度を向上させた結果、重ね合わせた細胞層と細胞層との間に、厚いフィブリン層が存在し層間のシグナル伝達にタイムラグやばらつきが生じるおそれがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−２６１５３２号公報
【特許文献２】特開２００４−２６１５３３号公報
【特許文献３】特開２００５−６０８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、細胞を積層させることで細胞からなる三次元構造体を構築し、生体類似組織を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は以下の通りである。
（１）基材表面に形成した単層細胞層の上方に、第１物質である細胞接着ペプチドを構造中に有する水溶性ポリマーの層及び第２物質である水溶性ポリマーの層を構築させて、更に単層細胞層を形成することを特徴とする細胞積層方法。
（２）第１物質の層及び第２物質の層が交互に複数構築されている（１）記載の細胞積層方法。
（３）前記単層細胞層が、結合組織細胞又は機能細胞である（１）又は（２）記載の細胞積層方法。
（４）前記結合組織細胞が、線維芽細胞、平滑筋細胞、及び間充織細胞から選ばれる少なくとも一つの細胞である（１）〜（３）いずれか記載の細胞積層方法。
（５）前記機能細胞が上皮系細胞、血管内皮細胞、及び表皮系細胞から選ばれる少なくとも一つの細胞である（１）〜（４）いずれか記載の細胞積層方法。
（６）（３）〜（５）いずれか記載の細胞積層方法を繰り返して複数回行って、結合組織細胞及び／又は機能細胞を複数層積層する細胞積層方法。
（７）前記基材が、無蛍光又は低蛍光な材質からなるプラスチックもしくはガラスである（１）〜（６）いずれか記載の細胞積層方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の細胞積層方法によれば、細胞からなる三次元構造体が構築され、生体類似組織が形成できる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明の細胞積層方法における接着層形成方法の一例を示す概略工程図
【図２】実施例及び比較例の細胞の蛍光染色の状態を示す写真
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、基材表面に形成した単層細胞層の上方に、第１物質である細胞接着ペプチドを構造中に有する水溶性ポリマーの層及び第２物質である水溶性ポリマーの層を構築させて、更に単層細胞層を形成することを特徴とする細胞積層方法であり、細胞を積層して三次元組織を製造する方法である。
【００１０】
本発明の細胞積層方法の工程としては、
（１）基材表面上に単層細胞層を形成する工程、
（２）前記基材上の単層細胞層を、第１物質である細胞接着ペプチドを構造中に有する水溶性ポリマーを含有する溶液、及び第２物質である水溶性ポリマーの含有液に交互に接触させ、前記単層細胞層上に、第１物質と第２物質とが交互に積層された細胞接着層を形成する工程、
（３）細胞を培養して、細胞層を形成する工程
を含むことが好ましい。
【００１１】
本発明に使用する第１物質である細胞接着ペプチドを構造中に有する水溶性ポリマーは、細胞接着に関連する以下のペプチドを含んでいる。細胞接着ペプチドとしては、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、またはビトロネクチン等に含まれるペプチドであり、これらペプチドの長さとしては、３〜２０個、好ましくは６〜１５個のアミノ酸残基である。より具体的には、フィブロネクチンの細胞結合ドメインにあるＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列を含むペプチドであるＧｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ（ＧＲＧＤＳＰ）やＴｒｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（Ｆｉｂ（１））、代表的な細胞接着性蛋白質であるラミニンに存在するアミノ酸配列であるＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ（ＹＩＧＳＲ）、Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ（ＲＫＲＬＱＶＱＬＳＩＲＴ；ＡＧ７３）等が挙げられる。
【００１２】
本発明に使用する第１物質及び第２物質に使用する水溶性ポリマーとしては、分子内に疎水性を有する直鎖状炭素骨格とペプチドと反応しうる官能基とを有し、細胞培養表面基質に吸着することができるポリマーであることが好ましい。具体的には分子内にポリアルキレン鎖あるいは直鎖アミノ酸ポリマー（ポリグリシン、ポリアラニン、ポリバリン、ポリロイシン、ポリフェニルアラニン等）やその誘導体などの疎水性の直鎖状骨格を持ち、基材との接着性を有するポリマーで、該直鎖状骨格に直接、あるいはスペーサーを介してペプチドと反応できる反応性の官能基（反応基）とを有する疎水結合性吸着ポリマーを好適に用いることができる。代表例として、無水マレイン酸とスチレンとの交互共重合体（以下、ＭＡＳＴ（maleic anhydride / styrene copolymer）と呼ぶ）や、無水マレイン酸とメチルビニルエーテルとの交互共重合体（以下、ＭＭＡＣ（methyl vinyl ether / maleic anhydride copolymer）と呼ぶ）を挙げることができる。
【００１３】
上記のペプチドと疎水結合性吸着ポリマー（水溶性ポリマー）との反応は、ポリマー鎖のペプチドと反応しうる官能基と該ペプチドとを、カップリング剤を用いて化学結合させる。具体的には、ポリマー鎖に導入したカルボキシル基またはアミノ基と、ペプチドに含まれるアミノ基またはカルボキシル基との、水溶性カルボジイミドを用いた縮合結合、あるいはグルタルアルデヒドなどの二官能性架橋剤による架橋反応が挙げられる。
【００１４】
第１物質である細胞接着ペプチドを構造中に有する水溶性ポリマーを含有する溶液、及び第２物質である水溶性ポリマーの含有液に交互に接触させることにより基材上で培養している細胞層上に細胞接着能力を有する細胞接着層を構築することができる。
【００１５】
具体的な各含有液の溶液濃度としては、好ましくは０．０００１〜１重量％であり、より好ましくは０．０１〜０．５重量％であり、更に好ましくは０．０２〜０．１重量％である。溶液の溶媒は特に制限しないが、細胞を培養する特性から水や緩衝液等の水性溶媒があげられ、前記緩衝液としては、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液等のＴｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、クエン酸−リン酸緩衝液、グリシルグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、Ｂｒｉｔｔｏｎ-Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液、ＧＴＡ緩衝液等が使用できる。溶液のｐＨは、特に制限されないが、好ましくは３〜１１であり、より好ましくは６〜８であり、更に好ましくは７．２〜７．４である。
【００１６】
各含有液との接触方法としては、特に制限されず、例えば、各含有液に基材を浸漬する方法、基材に含有液を滴下または噴霧する方法等があげられるが、操作が容易であることから浸漬方法が好ましい。接触の条件は、特に制限されず、接触方法や使用する含有液の濃度等によって適宜決定できる。具体的には、接触時間は、特に制限されないが、好ましくは１〜１４４０分であり、より好ましくは５〜６０分、更に好ましくは１０〜１５分である。接触温度は、特に制限されないが、好ましくは４〜６０℃であり、より好ましくは２０〜４０℃、更に好ましくは３０〜３７℃である。
【００１７】
次いで、細胞接着層上に一層目と同種、または異種の細胞を播種し、1時間以上、好ましくは４時間以上静置し培養することで二層目の細胞層を構築することが可能である。
【００１８】
本発明に用いる細胞層としては、結合組織細胞又は機能細胞であることが好ましい。結合組織細胞としては、線維芽細胞、平滑筋細胞、間充織細胞等が挙げられ、機能細胞としては上皮系細胞、血管内皮細胞、表皮系細胞等が挙げられる。又、細胞積層方法を繰り返して複数回行って、結合組織細胞及び／又は機能細胞を複数層積層することができる。
【００１９】
細胞の培養条件は、特に制限されず、培養する細胞に応じて適宜決定できる。一般的な条件としては、培養温度が、好ましくは４〜６０℃であり、より好ましくは２０〜４０℃、更に好ましくは３０〜３７℃である。培養時間は、好ましくは１〜１６８時間であり、より好ましくは３〜２４時間、更に好ましくは３〜１２時間である。また、細胞培養に使用する培地も特に制限されず、細胞に応じて適宜使用でき、例えば、Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ培地 (ＤＭＥＭ)、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ培地(ＭＥＭ)、Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ培地、ＲＤＭＩ、ＧｌｕｔａＭａｘ培地、無血清培地等が使用できる。播種する細胞の密度は、特に制限されないが、例えば、０．０１×１０4〜１００×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2であり、好ましくは１×１０4〜１０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2である。
【００２０】
細胞接着層の形成及び細胞接着層上での細胞層の構築の工程を繰り返すことで、多層化した細胞組織を得ることができる。
【００２１】
本発明に使用する基材としては、例えば、プラスチック、合成ゴム、無機物および金属等を使用した細胞培養基質が挙げられるが、特に成型性に優れているプラスチックが好ましい。
プラスチックとしては、熱可塑性樹脂または熱硬化性樹脂のいずれの樹脂も使用することができ、熱可塑性樹脂としては、例えば、アクリル樹脂、ポリ塩化ビニル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリメチルペンテン樹脂、フッ素樹脂またはポリカーボネート等が、熱硬化性樹脂としては、例えば、フェノール樹脂、尿素樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂またはシリコン樹脂等が例示されるが、特に透明性の高さからポリスチレン樹脂が好ましい。特に無蛍光又は低蛍光な材質であることが好ましく、自己蛍光の低さからフッ素樹脂も好適に用いることができる。
【００２２】
また、基材への細胞の接着性を向上させるために、コラーゲンＩ型、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン等の細胞接着因子のコーティングや、細胞接着ペプチドを構造内に含む水溶性ポリマーをコーティングすること好ましい。水溶性の合成ポリマー化合物を使用することで培養系から動物由来物質を排除することが可能である。
【００２３】
本発明の細胞積層方法によれば、単層の細胞層を形成する工程と、前記細胞層を第１物質含有液と第２物質含有液とに交互に接触させる工程とを繰り返し行うのみで、接着層を介して連続的に細胞層を高さ方向（ｚ軸方向）に積層できる。このため、単層の細胞シートの剥離や、剥離した細胞シートの重ね合わせが不要であり、優れた再現性・効率で、極めて簡便に三次元組織を製造できる。
また、本発明の方法は、工程が単純であり、所望の領域に細胞層と接着層の形成ができることから、例えば、どのような形状の表面において細胞を積層でき、複雑な形状の三次元組織も製造可能である。例えば、血管のように中空形状の三次元組織の場合には、リング状の基材表面に、細胞層の形成と接着層の形成とを交互に繰り返すことで、中心軸方向に細胞層を連続的に積層できるため、従来のように細胞層の貼り合せ等を行うことなく、円筒状（中空形状）の三次元組織を得ることも可能である。つまり、細胞層の形成と接着層を形成する平面領域を設定することで、どのような断面形状（Ｘ-Ｙ平面）の組織でも形成可能である。また、例えば、人工血管の内表面へ、第１物質含有液と第２物質含有液とを交互に流すことで、前記内表面へ細胞外マトリックスを形成し、さらに、細胞溶液を流しながら人工血管を回転させることで、細胞を接着させることができる。この工程を繰り返すことで、人工血管等の管状構造の内表面に細胞層を幾重にも形成できる。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例および比較例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
《実施例１》
（１） ポリマー塗布
すべての操作は無菌操作を前提とする。遠沈管に１０μｇ／ｍＬでＭＡＳＴ−Ｆｉｂ（１）を水−エタノール溶媒（体積比１：１）に溶かした溶液を用意する。３０ｍｍφ細胞培養用シートであるセルデスク（住友ベークライト製ＭＳ−９２３０２）を市販の滅菌済み３５ｍｍφシャーレに入れ、この溶液を０．５ｍＬ分注しセルデスクを浸漬させて、4時間静置した。その後、純水３ｍＬを加えた３５ｍｍφシャーレにセルデスクを入れて洗浄した後、室温で乾燥させた。
【００２５】
（２）１層目細胞培養
フラスコで培養したＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ラット由来線維芽細胞）を０．２５％トリプシン溶液で剥がし、回収した細胞を１０％ウシ胎児血清含有のダルベッコ改変イーグル培養液（Ｄ−ＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、１１８８５−０８４）に分散し、遠心分離により細胞を洗浄、１０％ＦＢＳ含有Ｄ―ＭＥＭで再分散した。細胞分散液を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、上記（１）のコートしたセルデスク上に１ｍＬ加え、３７℃のＣＯ２インキュベーターで２４時間培養を行った。
【００２６】
（３）ポリマー積層塗布
塗布のための溶液Ａとして、３５ｍｍφシャーレに２ｍＬの１０μｇ／ｍＬのＭＡＳＴ−Ｆｉｂ（１）の０．１ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）を準備。同じく溶液Ｂとして３５ｍｍφシャーレに２ｍＬの１０μｇ／ｍＬのＭＡＳＴの０．１ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）を入れたものを準備した。また、洗浄用に３５φシャーレに０．０１ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）を３ｍＬ入れたものを準備した。
（２）で細胞を培養したセルデスクを、洗浄用トリス緩衝液で洗浄した後、まずＭＡＳＴ−Ｆｉｂ（１）溶液に１分間浸漬させ細胞表面にＭＡＳＴ−Ｆｉｂ（１）の層を構築した。１分後、洗浄液にセルデスクを入れ１分間浸漬洗浄させた。次にＭＡＳＴ溶液に１分間浸漬しＭＡＳＴ層を構築させた。次に洗浄液に１分間浸漬させた。この操作を繰り返し、ＭＡＳＴ−Ｆｉｂ（１）とＭＡＳＴの交互に９層積層させた。（図１）
【００２７】
（４）細胞積層
フラスコで培養したＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ラット由来線維芽細胞、ＤＳファーマバイオメディカル）を０．２５％トリプシン溶液で剥がし、回収した細胞を１０％ウシ胎児血清含有のダルベッコ改変イーグル培養液（Ｄ−ＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、１１８８５−０８４）に分散し、遠心分離により細胞を洗浄、１０％ＦＢＳ含有Ｄ―ＭＥＭで再分散した。細胞分散液を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、上記のセルデスク上に１ｍＬ加え、３７℃のＣＯ２インキュベーターで２４時間培養を行った。
（３）、（４）の作業を繰り返し、３日かけて、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を３層積層したセルデスクを準備した。
【００２８】
（５）血管内皮細胞積層
ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を３層積層させたセルデスク上のＮＩＨ／３Ｔ３上に（３）に従って、ＭＡＳＴ−ＦｉＢ（１）とＭＡＳＴの交互に９層積層させた。
フラスコでセミコンフレントまで培養したヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、クラボウ、ＫＥ−４１０９）の培地を除去、血清無添加のＤ−ＭＥＭに細胞染色用蛍光色素ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｏｒｅｎｇｅ（ＬＯＮＺＡ製、ＰＡ―１２）をジメチルスルホキシドで０．５μｍｏＬ／Ｌに調製したものを１０００倍希釈した物を加え、３７℃炭酸ガス培養器で４５分培養し細胞染色する。
上記細胞を０．２５％トリプシン溶液で剥がし、回収した細胞を１０％ウシ胎児血清含有のダルベッコ改変イーグル培養液（Ｄ−ＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、１１８８５−０８４）に分散し、遠心分離により細胞を洗浄、１０％ＦＢＳ含有Ｄ―ＭＥＭで再分散した。細胞分散液を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、上記のセルデスク上に１ｍＬ加え、３７℃のＣＯ２インキュベーターで２４時間培養を行い、蛍光染色を行った。
【００２９】
《比較例１》
（１）ポリマー塗布
すべての操作は無菌操作を前提とする。遠沈管に１０μｇ／ｍＬでＭＡｓｔ−Ｆｉｂ（１）を水−エタノール溶媒（体積比１：１）に溶かしたものを用意する。３０ｍｍφ細胞培養用シートであるセルデスク（住友ベークライト製ＭＳ−９２３０２）を市販の滅菌済み３５ｍｍφシャーレにいれ、この溶液を０．５ｍＬ分注しセルデスクを浸漬させて、4時間静置した。その後、純水３ｍＬを加えた３５ｍｍφシャーレにセルデスクを入れて洗浄した後、室温で乾燥させた。
【００３０】
（２）１層目細胞培養
フラスコで培養したＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ラット由来線維芽細胞）を０．２５％トリプシン溶液で剥がし、回収した細胞を１０％ウシ胎児血清含有のダルベッコ改変イーグル培養液（Ｄ−ＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、１１８８５−０８４）に分散し、遠心分離により細胞を洗浄、１０％ＦＢＳ含有Ｄ―ＭＥＭで再分散した。細胞分散液を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、上記（１）のコートしたセルデスク上に１ｍＬ加え、３７℃のＣＯ２インキュベーターで２４時間培養を行った。
【００３１】
（３） ２層目細胞培養
フラスコで培養したＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ラット由来線維芽細胞、ＤＳファーマバイオメディカル）を０．２５％トリプシン溶液で剥がし、回収した細胞を１０％ウシ胎児血清含有のダルベッコ改変イーグル培養液（Ｄ−ＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、１１８８５−０８４）に分散し、遠心分離により細胞を洗浄、１０％ＦＢＳ含有Ｄ―ＭＥＭで再分散した。細胞分散液を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、中間のポリマー層を形成させずに、直接（２）のセルデスク上に１ｍＬ加え、３７℃のＣＯ２インキュベーターで２４時間培養を行った。
【００３２】
（４）細胞積層
（２）の操作を繰り返してＮＩＨ／３Ｔ３細胞を３層積層させる操作を繰り返した。
【００３３】
（５）血管内皮細胞積層
フラスコでセミコンフレントまで培養したヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、クラボウ、ＫＥ−４１０９）の培地を除去、血清無添加のＤ−ＭＥＭに細胞染色用蛍光色素ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｏｒｅｎｇｅ（ＬＯＮＺＡ製、ＰＡ―１２）をジメチルスルホキシドで０．５μｍｏＬ／Ｌに調製したものを１０００倍希釈した物を加え、３７℃炭酸ガス培養器で４５分培養し細胞染色した。
上記細胞を０．２５％トリプシン溶液で剥がし、回収した細胞を１０％ウシ胎児血清含有のダルベッコ改変イーグル培養液（Ｄ−ＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、１１８８５−０８４）に分散し、遠心分離により細胞を洗浄、１０％ＦＢＳ含有Ｄ―ＭＥＭで再分散した。細胞分散液を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、上記（３）のセルデスク上に１ｍＬ加え、３７℃のＣＯ２インキュベーターで２４時間培養を行い、蛍光染色を行った。
【００３４】
実施例１、比較例２の結果を図２に示す。
実施例１では蛍光染色された細胞が観察されているのに対し、比較例１では蛍光を示す細胞が全く観察されていない。この結果より、本発明の方法によって細胞の積層が可能であることが証明された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材表面に形成した単層細胞層の上方に、第１物質である細胞接着ペプチドを構造中に有する水溶性ポリマーの層及び第２物質である水溶性ポリマーの層を構築させて、更に単層細胞層を形成することを特徴とする細胞積層方法。
【請求項２】
第１物質の層及び第２物質の層が交互に複数構築されている請求項１記載の細胞積層方法。
【請求項３】
前記単層細胞層が、結合組織細胞又は機能細胞である請求項１又は２記載の細胞積層方法。
【請求項４】
前記結合組織細胞が、線維芽細胞、平滑筋細胞、及び間充織細胞から選ばれる少なくとも一つの細胞である請求項１〜３いずれか記載の細胞積層方法。
【請求項５】
前記機能細胞が上皮系細胞、血管内皮細胞、及び表皮系細胞から選ばれる少なくとも一つの細胞である請求項１〜４いずれか記載の細胞積層方法。
【請求項６】
請求項３〜５いずれか記載の細胞積層方法を繰り返して複数回行って、結合組織細胞及び／又は機能細胞を複数層積層する細胞積層方法。
【請求項７】
前記基材が、無蛍光又は低蛍光な材質からなるプラスチックもしくはガラスである請求項1〜６いずれか記載の細胞積層方法。
【請求項１】
基材表面に形成した単層細胞層の上方に、第１物質である細胞接着ペプチドを構造中に有する水溶性ポリマーの層及び第２物質である水溶性ポリマーの層を構築させて、更に単層細胞層を形成することを特徴とする細胞積層方法。
【請求項２】
第１物質の層及び第２物質の層が交互に複数構築されている請求項１記載の細胞積層方法。
【請求項３】
前記単層細胞層が、結合組織細胞又は機能細胞である請求項１又は２記載の細胞積層方法。
【請求項４】
前記結合組織細胞が、線維芽細胞、平滑筋細胞、及び間充織細胞から選ばれる少なくとも一つの細胞である請求項１〜３いずれか記載の細胞積層方法。
【請求項５】
前記機能細胞が上皮系細胞、血管内皮細胞、及び表皮系細胞から選ばれる少なくとも一つの細胞である請求項１〜４いずれか記載の細胞積層方法。
【請求項６】
請求項３〜５いずれか記載の細胞積層方法を繰り返して複数回行って、結合組織細胞及び／又は機能細胞を複数層積層する細胞積層方法。
【請求項７】
前記基材が、無蛍光又は低蛍光な材質からなるプラスチックもしくはガラスである請求項1〜６いずれか記載の細胞積層方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１０−２２０５７０（Ｐ２０１０−２２０５７０Ａ）
【公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−７３２０８（Ｐ２００９−７３２０８）
【出願日】平成２１年３月２５日（２００９．３．２５）
【出願人】（０００００２１４１）住友ベークライト株式会社 (2,927)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月２５日（２００９．３．２５）
【出願人】（０００００２１４１）住友ベークライト株式会社 (2,927)
【Ｆターム（参考）】
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