組換えアデノウイルス迅速構築システム
【課題】組換えアデノウイルスの迅速な構築方法を提供する。
【解決手段】ウイルスゲノムを含むＤＮＡ−タンパク質複合体を、導入遺伝子を含むＰＣＲ産物と相同組換えさせることにより、ウイルスを構築する。従来の方法のように導入遺伝子の挿入断片の制限酵素処理およびリガーゼによる連結を含まないため、ウイルスゲノムと挿入断片の制限酵素認識部位の一致は不要であることから、迅速かつ高効率に組換えアデノウイルスを構築することが可能である。また、ＭｙｏＤ遺伝子を導入遺伝子として含む組換えウイルスベクターは、筋分化誘導スイッチとして有用である。
【解決手段】ウイルスゲノムを含むＤＮＡ−タンパク質複合体を、導入遺伝子を含むＰＣＲ産物と相同組換えさせることにより、ウイルスを構築する。従来の方法のように導入遺伝子の挿入断片の制限酵素処理およびリガーゼによる連結を含まないため、ウイルスゲノムと挿入断片の制限酵素認識部位の一致は不要であることから、迅速かつ高効率に組換えアデノウイルスを構築することが可能である。また、ＭｙｏＤ遺伝子を導入遺伝子として含む組換えウイルスベクターは、筋分化誘導スイッチとして有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えアデノウイルスの構築方法に関する。また、本発明の組換えアデノウイルスは、遺伝子機能解析もしくはそれらの機能を応用した細胞・遺伝子治療に用いることができる。さらに、本発明の組換えアデノウイルスは、ハイブリッドベクターとして、各種組換えウイルスベクターの作製に用いることができる。よって、本発明は、本発明の組換えアデノウイルスを含むベクターの作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えアデノウイルスは、二本鎖ＤＮＡウイルスに由来するベクターであり、接着細胞への高い遺伝子導入効率を有する。このことから、組換えアデノウイルスは遺伝子を送達する担体として、遺伝子機能解析や遺伝子治療への応用が期待されている。特に、一過性に遺伝子発現を行う性質は、分化誘導スイッチとして有用である（非特許文献１：Itoh, A., et al., J. Gene Med., 2003, Vol.5, p.929-940）。例えば、Fujiiら（非特許文献２：Brain & Development, 2006, Vol.28, p.420-425）は、アデノウイルスベクターを用いてＭｙｏＤ遺伝子を皮膚線維芽細胞に導入すると、当該細胞は筋管への変化を誘導し、そして変化した細胞は筋肉に特異的なデスミンおよびジストロフィンを発現したことを示した。
【０００３】
しかしながら、従来法にて組換えアデノウイルスを単離するためには、アデノウイルスのゲノムが３４．７ｋｂと長いため、導入遺伝子を一旦プラスミドやコスミドなどのシャトルベクターに移す必要があった。この際、３０ｋｂ以上の大きなプラスミドやコスミドは不安定で収率も低く、慎重な取り扱いが必要であった。また、構築したプラスミドやコスミドから最終的なウイルスを得るためには、さらに１〜２週間を要し、短期間に構築の成否を判定することは困難である。
【０００４】
また、ウイルス複製には末端タンパク質が重要であり、完全長アデノウイルスゲノム導入（in vitroライゲーション法）は簡便であるが、末端タンパク質がないためウイルスベクター生成効率が低下することが知られている（非特許文献３：近藤ら、ウイルス、第５７巻、第１号、pp.37-46、2007）。
【０００５】
本発明者らは、以前に５型アデノウイルスゲノムを遺伝子工学的に操作し、末端タンパク質とＥ１領域に外来遺伝子挿入部位を有するＤＮＡ−タンパク質複合体を作製した。この技術を用いることにより、ＤＮＡ−タンパク質複合体に直接ｃＤＮＡ断片をライゲーションするだけで、短期間にベクターを作製することが可能となった（非特許文献４：Okada, T., et al., Nucleic Acids Res., 1998, Vol.26, p.1947-1950）。ただし、非特許文献４に記載の技術では、ＤＮＡ−タンパク質複合体の調製の際に、セルフライゲーションを防ぎ、目的断片の挿入効率を上げるために、ホスファターゼ処理とその除去操作を要した。また、挿入するｃＤＮＡ断片の調製として、制限酵素処理と純化の作業が必要であった。この際、ベクターゲノムへの遺伝子断片の挿入には、遺伝子が大きなことから限られた酵素サイトしか使用できないため、挿入断片の配列によっては、部分消化などの工夫を要した。
【非特許文献１】Itoh, A., et al., J. Gene Med., 2003, Vol.5, p.929-940
【非特許文献２】Fujii, I., et al., Brain & Development, 2006, Vol.28, p.420-425
【非特許文献３】近藤小貴ら、ウイルス、第５７巻、第１号、pp.37-46、2007
【非特許文献４】Okada, T., et al., Nucleic Acids Res., 1998, Vol.26, p.1947-1950
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、組換えアデノウイルスの迅速な構築方法を提供することを目的とする。本発明はまた、本発明の方法に用いる導入遺伝子を含む挿入断片を調製するためのプライマーを提供することを目的とする。
【０００７】
本発明はさらに、本発明の方法により得られた組換えアデノウイルスを提供することを目的とする。特に、導入遺伝子としてＭｙｏＤ遺伝子を含む組換えアデノウイルスの、筋分化誘導スイッチとしての利用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、鋭意研究の結果、ＤＮＡ−タンパク質複合体をＰＣＲ産物と相同組換えさせることによりウイルスゲノム中に導入遺伝子を挿入し、これを２９３細胞に導入すると、高い効率で組換えウイルスが単離されることを見出し、本発明の方法を完成させた。すなわち、本発明は以下の通りである。
【０００９】
［１］ 組換えアデノウイルスを構築する方法であって、以下の工程
（１）アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体を、導入遺伝子挿入部位で切断する；
（２）導入遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製する、ここで該ＤＮＡ断片は、その５’末端および３’末端に、それぞれ前記ＤＮＡ−タンパク質複合体における導入遺伝子挿入部位の上流側および下流側の１０〜１００塩基の配列と相同な配列を有し、そしてその間に導入遺伝子の塩基配列を含む；
（３）工程（２）で調製した導入遺伝子を含むＤＮＡ断片と、工程（１）で調製した外導入遺伝子挿入部位で切断されたＤＮＡ−タンパク質複合体とを、相同組換えにより連結して、導入遺伝子が挿入されたアデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体を得る；
（４）工程（３）で得られた導入遺伝子が挿入されたアデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体をヒト２９３細胞に遺伝子導入する；
（５）工程（４）で遺伝子導入したヒト２９３細胞を培養して、組換えアデノウイルスをウイルスプラークとして得る；
を含む、前記方法。
【００１０】
［２］ 導入遺伝子を含むＤＮＡ断片の５’末端および３’末端の配列が、それぞれ、アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体における導入遺伝子挿入部位の上流側および下流側の１０〜５０塩基の配列と相同な配列である、［１］項に記載の方法。
【００１１】
［３］ 導入遺伝子を含むＤＮＡ断片の５’末端および３’末端の配列が、それぞれ、アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体における導入遺伝子挿入部位の上流側および下流側の１０〜２０塩基の配列と相同な配列である、［１］項に記載の方法。
【００１２】
［４］ 相同組換えが、リコンビナーゼおよび相同組換えの促進タンパク質の存在下で行われる、［１］ないし［３］のいずれか１項に記載の方法。
［５］ アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体が、ＡＶＣ２．ｎｕｌｌ（配列番号１）を含む、［１］ないし［３］のいずれか１項に記載の方法。
【００１３】
［６］ アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体がＡＶＣ２．ｎｕｌｌ（配列番号１）を含み、そして外来遺伝子挿入部位の上流側および下流側がそれぞれＡＶＣ２．ｎｕｌｌのマルチプルクローニングサイト中のＸｂａＩおよびＮｓｐＶ制限酵素サイトである、［５］項に記載の方法。
【００１４】
［７］ アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体がＡＶＣ２．ｎｕｌｌ（配列番号１）を含み、外来遺伝子挿入部位の上流側および下流側がそれぞれＡＶＣ２．ｎｕｌｌにおけるＣＭＶプロモーターの上流側のＰａｃＩ制限酵素サイトおよびマルチプルクローニングサイト中のＮｓｐＶ制限酵素サイトであり、そして、導入遺伝子が構造遺伝子およびそれに機能可能に連結したプロモーター配列を含む、［５］項に記載の方法。
【００１５】
［８］ アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体がＡＶＣ２．ｎｕｌｌ（配列番号１）を含み、外来遺伝子挿入部位の上流側および下流側がそれぞれＡＶＣ２．ｎｕｌｌのマルチプルクローニングサイト中のＸｂａＩおよびＮｓｐＶ制限酵素サイトであり、そして、導入遺伝子を含むＤＮＡ断片の５’末端および３’末端の配列が、それぞれ、アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体における導入遺伝子挿入部位の上流側および下流側の１５塩基の配列と相同な配列である、［５］項に記載の方法。
【００１６】
［９］ 導入遺伝子が挿入されたアデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体を構築する方法であって、以下の工程：
（１）アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体を、導入遺伝子挿入部位で切断する；
（２）導入遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製する、ここで該ＤＮＡ断片は、その５’末端および３’末端に、それぞれ前記ＤＮＡ−タンパク質複合体における導入遺伝子挿入部位の上流側および下流側の１０〜１００塩基の配列と相同な配列を有し、そしてその間に導入遺伝子の塩基配列を含む；
（３）工程（２）で調製した導入遺伝子を含むＤＮＡ断片と、工程（１）で調製した外導入遺伝子挿入部位で切断されたＤＮＡ−タンパク質複合体とを、相同組換えにより連結して、導入遺伝子が挿入されたアデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体を得る；
を含む、前記方法。
【００１７】
［１０］ 導入遺伝子を含むＤＮＡ断片の５’末端および３’末端の配列が、それぞれ、アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体における導入遺伝子挿入部位の上流側および下流側の１０〜２０塩基の配列と相同な配列である、［９］項に記載の方法。
【００１８】
［１１］ 相同組換えが、相同組換えの促進タンパク質の存在下で行われる、［９］または［１０］に記載の方法。
［１２］ 請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法に用いるための、２５塩基ないし５０塩基からなるプライマーであって、以下：
（ａ）５’−TTATCGAAATTCTAG−３’（配列番号２）を５’末端側に含み、そして３’末端側に、導入される構造遺伝子の５’末端側の１０〜３５塩基の配列を含む、プライマー；
（ｂ）５’−GACGTACGCCCTTCG−３’（配列番号３）を５’末端側に含み、そして３’末端側に、導入される構造遺伝子の３’末端側の１０〜３５塩基の配列を含む、プライマー；および
（ｃ）５’−AGATATAGGGCATTAAT−３’（配列番号４）を５’末端側に含み、そして３’末端側に、導入される構造遺伝子に機能可能に連結したプロモーター配列の５’末端側の８〜３３塩基の配列を含む、プライマー；
からなる群より選択される、前記プライマー。
【００１９】
［１３］ ＭｙｏＤ遺伝子を導入される構造遺伝子として含む、組換えアデノウイルスベクター。
［１４］ 間葉系幹細胞の筋分化を誘導する方法であって、ＭｙｏＤ遺伝子を導入される構造遺伝子として含む組換えアデノウイルスを間葉系幹細胞に感染させることを含む、前記方法。
【００２０】
［１５］ 組換えアデノウイルスを、少なくともＭＯＩ＝２０ｐｆｕ／ｃｅｌｌで感染させる、［１５］項に記載の方法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の組換えアデノウイルス構築法により、ＤＮＡ−タンパク質複合体をＰＣＲ産物と相同組換えさせることによりウイルスゲノム中に導入遺伝子を挿入し、これを２９３細胞に導入すると、高い効率で組換えウイルスを単離することが可能になった。本発明の方法においては、ＤＮＡ−タンパク質複合体のホスファターゼ処理や、挿入断片の制限酵素処理は一切不要である。また、導入遺伝子のウイルスゲノムへの挿入の際にリガーゼを用いないため、制限酵素認識部位を一致させる必要はなく、あらゆる配列のＰＣＲ断片を自由自在にＤＮＡ−タンパク質複合体にクローニングすることが可能である。これらの特徴により、本発明の方法では、プラスミドやコスミドを用いた従来のウイルス単離方法にはない、容易な操作と短期間でのウイルス単離効果を応用することによって、迅速に目的の組換えアデノウイルスが得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
１．組換えアデノウイルスの構築方法
一態様において本発明は、組換えアデノウイルスを迅速かつ効率よく構築する方法に関する。より具体的には、本発明の組換えアデノウイルスを構築する方法は、以下の工程
（１）アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体を、導入遺伝子挿入部位で切断する；
（２）導入遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製する、ここで該ＤＮＡ断片は、その５’末端および３’末端に、それぞれ前記ＤＮＡ−タンパク質複合体における導入遺伝子挿入部位の上流側および下流側の１０〜１００塩基の配列と相同な配列を有し、そしてその間に導入遺伝子の塩基配列を含む；
（３）工程（２）で調製した導入遺伝子を含むＤＮＡ断片と、工程（１）で調製した外導入遺伝子挿入部位で切断されたＤＮＡ−タンパク質複合体とを、相同組換えにより連結して、導入遺伝子が挿入されたアデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体を得る；
（４）工程（３）で得られた導入遺伝子が挿入されたアデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体をヒト２９３細胞に遺伝子導入する；
（５）工程（４）で遺伝子導入したヒト２９３細胞を培養して、組換えアデノウイルスをウイルスプラークとして得る；
を含む方法である。本発明の方法を模式的に示したものが、図１である。
【００２３】
１−１．工程（１）〜（３）について
本明細書においてアデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体とは、アデノウイルスゲノムの末端に末端タンパク質が共有結合したＤＮＡ−タンパク質複合体をいう。アデノウイルスゲノムは二本鎖ＤＮＡであり、アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体において末端タンパク質は、二本鎖ＤＮＡそれぞれの５’末端に共有結合している。好ましい態様において、アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体を構成するアデノウイルスゲノムは、Ｅ１ａ遺伝子を欠失している。
【００２４】
本発明の方法に利用可能なアデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体の具体的なものとして、ＡＶＣ２．ｎｕｌｌ（配列番号１）を含むもの、コスミド由来の調製済みＤＮＡ−ＴＰＣ（Adenovirus Expression Vector Kit；タカラバイオ社）等が挙げられるが、これに限定されない。
【００２５】
ＡＶＣ２．ｎｕｌｌは、Okadaら（Nucleic Acid Research, 1998, 26(8):1947-1950）にその製造方法が記載されているＤＮＡ−タンパク質複合体である。具体的には、ＡＶＣ２．ｎｕｌｌ（配列番号１）は、５型アデノウイルスゲノム（Ａｄ５）のＮ末端側配列（配列番号１のヌクレオチド１−４００に相当）、ｐＤＣＭ８（Invitrogen）由来のＣＭＶ−ＩＥプロモータおよびエンハンサー、マルチプルクローニングサイト（５’−ＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ−ＰｍｅＩ−ＮｓｐＶ−ＳｕｎＩ−３’）、ｐＤＣＭ８（Invitrogen）由来のＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル化サイト（プロモータからポリアデニル化サイトまでの発現カセットは配列番号１のヌクレオチド４０１−３３２７に相当）、並びにＡｄ５のＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（Ａｄ５のＥ１ｂ／Ｅ２ｂ領域：配列番号１のヌクレオチド３３２８−６２４１に相当）からなる構築物ををＥ１ａ遺伝子領域に代えて有するアデノウイルスゲノムＤＮＡを含むＤＮＡ−タンパク質複合体である。
【００２６】
本発明の方法において、アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体における導入遺伝子挿入部位は、Ｅ１ａ遺伝子領域、Ｅ１ａ遺伝子が欠失している場合はそれに対応する領域に存在する。導入遺伝子挿入部位は、制限酵素認識サイトであっても制限酵素認識サイトでなくてもよい。好ましくは導入遺伝子挿入部位は、制限酵素認識サイトである。
【００２７】
例えば、ＡＶＣ２．ｎｕｌｌを用いる場合、Ｅ１ａ遺伝子領域と置換した構築物中の制限酵素認識サイトのいずれかを導入遺伝子挿入部位として利用することができる。具体的には、導入遺伝子を含む断片が、プロモータ配列を含まずに宿主細胞中での発現が望まれる構造遺伝子を含む場合は、ＡＶＣ２．ｎｕｌｌのマルチプルクローニングサイト中の、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＰｍｅＩ、ＮｓｐＶ、ＳｕｎＩのいずれか１つまたは２つを利用してもよい。切断後の自己再結合を防ぐため、いずれか２つであることが好ましい。より好ましい組み合わせは、ＸｂａＩとＮｓｐＶの組み合わせである。導入遺伝子を含む断片が、プロモータ配列および宿主細胞中での発現が望まれる構造遺伝子を含む場合は、ＣＭＶ−ＩＥプロモータの上流側のＰａｃＩおよびマルチプルクローニングサイト中の、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＰｍｅＩ、ＮｓｐＶ、ＳｕｎＩのいずれか１つとの組み合わせを利用してもよい。好ましいのは、ＣＭＶ−ＩＥプロモータの上流側のＰａｃＩとマルチプルクローニングサイト中のＮｓｐＶの組み合わせである。
【００２８】
本明細書において、導入遺伝子とは、ある宿主細胞中での発現が望まれる構造遺伝子を含む遺伝子を意味し、プロモーター配列を含んでいなくても、あるいはプロモーター配列が機能可能に当該構造遺伝子に連結していてもよい。ここで、ある宿主細胞中での発現が望まれる構造遺伝子を、特に導入される構造遺伝子ということがある。導入される構造遺伝子の由来に限定はなく、宿主細胞に対して内因性の遺伝子であっても外因性の遺伝子であってもよい。導入遺伝子がプロモーター配列を含む場合、当該プロモーター配列は、導入される構造遺伝子の発現が望まれる宿主細胞中で機能可能なプロモーター配列である。また、導入遺伝子のサイズは、８ｋｂ以下、７．５ｋｂ以下、７ｋｂ以下、６．５ｋｂ以下、６ｋｂ以下、５．５ｋｂ以下、５ｋｂ以下であるが、これらに限定されない。導入遺伝子のサイズの下限はない。
【００２９】
本発明の方法において、導入遺伝子を含むＤＮＡ断片は、公知の方法により調製することができる。例えば、限定されるわけではないが、導入遺伝子を含むＤＮＡをテンプレートにして、ＰＣＲ法によってＤＮＡ断片として調製することが可能である。ＰＣＲのための酵素の選択や、適切な増幅条件については、当業者が適宜決定することができる。
【００３０】
本発明の方法において、アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体への導入遺伝子を含むＤＮＡ断片の挿入には、相同組換えの手法を利用する。導入遺伝子を含むＤＮＡ断片は、その５’末端および３’末端に、それぞれアデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体における導入遺伝子挿入部位の上流側および下流側と相同な配列を有する。相同組換えは、アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体を導入遺伝子挿入部位であらかじめ切断したのち、導入遺伝子挿入部位の上流側および下流側と相同な配列を有する導入遺伝子を含むＤＮＡ断片との間で行う。
【００３１】
導入遺伝子を含むＤＮＡ断片の５’末端および３’末端の配列は、アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体における導入遺伝子挿入部位の上流側および下流側と相同な、１０〜１００塩基、１０〜７５塩基、１０〜５０配列、１０〜４０塩基、１０〜３０塩基、１０〜２０塩基、１０〜１５塩基、または１５塩基の配列であってよい。導入遺伝子挿入部位の上流側および下流側と相同な、導入遺伝子を含むＤＮＡ断片の５’末端および３’末端の配列は、上記の長さの範囲内である限り、それぞれ同じ長さであってもよく、あるいは異なる長さであってもよい。好ましくは、導入遺伝子挿入部位の上流側および下流側と相同な、導入遺伝子を含むＤＮＡ断片の５’末端および３’末端の配列がそれぞれ異なる長さである場合には、互いに、５塩基以下、４塩基以下、３塩基以下、２塩基以下、または１塩基以下の長さの違いであることが好ましい。さらに好ましくは、導入遺伝子挿入部位の上流側および下流側と相同な、導入遺伝子を含むＤＮＡ断片の５’末端および３’末端の配列は、それぞれ同じ長さである。
【００３２】
本願発明の方法において相同組換えは、リコンビナーゼおよび相同組換えの促進タンパク質の存在下で行ってもよい。本発明の方法において使用可能なリコンビナーゼは特に限定されない。相同組換えの促進タンパク質は、リコンビナーゼとの共存下において相同組換えを促進し、より相同配列の長さが短い場合でも相同組換えを可能にするタンパク質をいう。相同組換えの促進タンパク質は２種以上のタンパク質の組み合わせであってもよい。相同組換えの促進タンパク質の具体的なものとしては、大腸菌由来のＲｅｃＥおよびＲｅｃＴの組み合わせ、ファージ由来のＲｅｄαおよびＲｅｄβの組み合わせが知られている（Zhang et al., Nature Genetics, 20:123-128, 1998; Zhang et al., Nature Biotechnology 18:1314-1317, 2000; GenBank Accession No. NC_010473; GenBank Accession No. AX711994）。
このような相同組換えの促進タンパク質を伴う相同組換えの原理を利用して、より相同配列の長さが短いものについて相同組換えを行うためのキットが市販されている。本発明の方法は、そのようなキットを利用して行うことも可能である。そのようなキットには、In-FusionＴＭ PCR Cloning Kit（タカラバイオ株式会社、Clontech社）、Red/ET Recombination System Quick and Easy BAC MODIFICATION Kit（フナコシ株式会社、Gene Bridges社）等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３３】
１−２．工程（４）および（５）
アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体と導入遺伝子を含むＤＮＡ断片との相同組換えにより、導入遺伝子が曽遊されたアデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体を得た後、これをヒト２９３細胞に遺伝子導入する。遺伝子導入には、公知の遺伝子導入方法、例えば、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム法、ヌクレオフェクション等を使用することができるが、これらに限定されない。
【００３４】
その後、遺伝子導入したヒト２９３細胞を培養して、組換えアデノウイルスをウイルスプラークとして得る。培養条件は、特に限定されないが、ヒト２９３細胞の培養条件として通常用いられる条件で行う。
【００３５】
２．導入遺伝子が挿入されたアデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体を構築する方法
別の態様において、上記の組換えアデノウイルスを構築する方法における工程（１）ないし（３）を含む、導入遺伝子が挿入されたアデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体を構築する方法もまた、本発明の範囲内である。
【００３６】
３．プライマー
好ましい態様において、本発明の方法におけるアデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体はＡＶＣ２．ｎｕｌｌであり、導入遺伝子を含む断片がプロモータ配列を含まずに宿主細胞中での発現が望まれる構造遺伝子を含み、導入遺伝子挿入部位としてＡＶＣ２．ｎｕｌｌのマルチプルクローニングサイト中ＸｂａＩとＮｓｐＶの組み合わせを利用する。この場合、導入遺伝子を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ法により調製するためのプライマーは、２５塩基ないし５０塩基からなるプライマーであって、以下：
５’−TTATCGAAATTCTAG−３’（配列番号２）を５’末端側に含み、そして３’末端側に、導入される構造遺伝子の５’末端側の１０〜３５塩基、好ましくは１５〜３５塩基、１５〜３０塩基、１５〜２５塩基、の配列を含む、プライマー；および、
５’−GACGTACGCCCTTCG−３’（配列番号３）を５’末端側に含み、そして３’末端側に、導入される構造遺伝子の３’末端側の１０〜３５塩基、好ましくは１５〜３５塩基、１５〜３０塩基、１５〜２５塩基、の配列を含む、プライマー；
であってよい。
【００３７】
別の好ましい態様において、本発明の方法におけるアデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体はＡＶＣ２．ｎｕｌｌであり、導入遺伝子を含む断片がプロモータ配列が機能可能に連結された宿主細胞中での発現が望まれる構造遺伝子を含み、導入遺伝子挿入部位としてＡＶＣ２．ｎｕｌｌのＣＭＶ−ＩＥプロモータの上流側のＰａｃＩとマルチプルクローニングサイト中のＮｓｐＶの組み合わせを利用する。この場合、導入遺伝子を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ法により調製するためのプライマーは、２５塩基ないし５０塩基からなるプライマーであって、以下：
５’−AGATATAGGGCATTAAT−３’（配列番号４）を５’末端側に含み、そして３’末端側に、導入される構造遺伝子に機能可能に連結したプロモーター配列の５’末端側の８〜３３塩基、好ましくは１０〜３０塩基、１５〜３０塩基、１５〜２５塩基、の配列を含む、プライマー；および
５’−GACGTACGCCCTTCG−３’（配列番号３）を５’末端側に含み、そして３’末端側に、導入される構造遺伝子の３’末端側の１０〜３５塩基、好ましくは１５〜３５塩基、１５〜３０塩基、１５〜２５塩基、の配列を含む、プライマー；
であってよい。
【００３８】
４．筋分化誘導スイッチとしてのＭｙｏＤ遺伝子を含む組換えアデノウイルスベクター
本発明者らは、導入遺伝子としてＭｙｏＤ遺伝子が挿入された組換えアデノウイルスを、本願発明の方法に従って構築した。得られた組換えアデノウイルスを、宿主細胞にＭｙｏＤ遺伝子を導入するための組換えアデノウイルスベクターとして用いて、ＳＤラット由来間葉系幹細胞に感染させた。感染させた間葉系幹細胞を培養したところ、筋分化マーカーであるミオゲニンおよびα−アクチニンの発現と筋管形成を確認した。このことから、本発明者らはＭｙｏＤ遺伝子を導入遺伝子として含む組換えアデノウイルスベクターを間葉系幹細胞に感染させることにより、間葉系幹細胞の筋分化を誘導できることを見出した。アデノウイルスベクターは一過性に遺伝子発現を行う性質を有するため、本発明のＭｙｏＤ遺伝子を導入遺伝子として含む組換えアデノウイルスベクターは、間葉系幹細胞における筋分化誘導スイッチとして利用可能である。
【００３９】
また、ｉＰＳ細胞や線維芽細胞等においても利用可能である。
よって、本発明の別の態様は、ＭｙｏＤ遺伝子を導入遺伝子として含む組換えアデノウイルスベクターを間葉系幹細胞に感染させることを含む、間葉系幹細胞、ｉＰＳ細胞、または線維芽細胞を誘導する方法に関する。上記の方法において、組換えアデノウイルスベクターを感染させる条件は特に限定されないが、下限は少なくともＭＯＩ＝５ｐｆｕ／細胞、１０ｐｆｕ／細胞、１５ｐｆｕ／細胞、２０ｐｆｕ／細胞から選択されてよく、上限はMＯＩ＝１０００ｐｆｕ／細胞以下、７５０ｐｆｕ／細胞以下、５００ｐｆｕ／細胞以下、４００ｐｆｕ／細胞以下から選択されてよい。
【００４０】
細胞の培養は、当業者に公知の条件で行うことができ、また当業者は適宜培養条件を調製することができる。例えば、間葉系幹細胞の培養条件は、特に限定されないが、１０％ウシ胎仔血清入りＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）中、３７℃、５％ＣＯ２の条件などが挙げられる。
【００４１】
間葉系幹細胞の筋分化は、筋分化マーカーであるミオゲニン、α−アクチニン、Ｐａｘ３、Ｐａｘ７、Ｍｙｆ５、ＭＲＦ４、デスミンおよびミオシン重鎖からなる群より選択されるマーカーの発現をモニタリングし、当該筋分化マーカーの発現を確認することにより検出することができる。筋分化マーカーの発現の検出は、当該技術分野において公知の免疫染色および電子顕微鏡での観察により行うことができる。
【００４２】
あるいは、間葉系幹細胞の筋分化は、上記の筋分化マーカーの検出と共にまたは別個に、筋管形成をモニタリングすることにより行うことができる。筋管形成のモニタリングは、チューブ状に細長くなった細胞が複数、望ましくは３個以上、の核を有していることを顕微鏡下で観察することにより行うことができる。
【００４３】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４４】
実施例１：ウイルスベクターの構築
（１）ＤＮＡ−タンパク質複合体の調製
ＤＮＡ−タンパク質複合体の骨格として、ＣＭＶプロモーター、およびｐｏｌｙＡ配列をアデノウイルスゲノムのＥ１領域の一部（Ｅ１ａからＥ１ｂの一部にかけての領域）に挿入した、組換えアデノウイルスＡＶＣ２．ｎｕｌｌ（配列番号１）を用いた。Okada, T., et al.（Nucleic Acids Res., 1998, Vol.26, p.1947-1950）に記載の方法に従い、ＤＮＡ−タンパク質複合体を調製した。これに制限酵素ＸｂａＩおよびＮｓｐＶによる処理を加え、発現遺伝子断片が挿入可能なＤＮＡ−タンパク質複合体を作製した。
【００４５】
（２）遺伝子断片の調製
ＡＶＣ２．ｎｕｌｌのＤＮＡ−タンパク質複合体に挿入する遺伝子断片を以下の手順で調製した。ＡＶＣ２．ｎｕｌｌにおいて導入遺伝子を挿入する部位、すなわちマルチプルクローニングサイト中のＸｂａＩおよびＮｓｐＶの外側１５塩基の塩基配列は５’−ttatcgaaattctag−３’（上流側：配列番号２）および５’−gacgtacgcccttcg−３’（下流側：配列番号３）である。これらの配列に相同な配列を導入遺伝子の両端に隣接して含む挿入断片を、ＰＣＲ法にて増幅した。この際、遺伝子変異が生じない様に、正確性と効率の高い高忠実度ＤＮＡポリメラーゼとして、PrimeSTAR（登録商標）HS（タカラバイオ株式会社）を用いた。ＰＣＲの条件は、９８℃、１０秒；５５℃、１５秒；６８℃、１分；のサイクルを３０サイクル、とした。ＰＣＲ産物を、QIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン社、カタログ番号28704）にて精製し挿入断片として使用した。導入遺伝子としてＥＧＦＰ遺伝子及びＭｙｏＤ遺伝子を用いた。
【００４６】
（ｉ）ＥＧＦＰ遺伝子
ＥＧＦＰ遺伝子（配列番号５）のｃＤＮＡを含むプラスミド（pEGFP-N1 Vector（クロンテック社、カタログ番号632318）を鋳型として、次のプライマーを用いてＰＣＲ法にて挿入遺伝子断片を増幅した。ＰＣＲ産物の両端にＡＶＣ２．ｎｕｌｌにおいて導入遺伝子を挿入する部位の配列に相同な１５塩基対の配列をアダプターとして含む様に、プライマーを設計した。大文字部分はＥＧＦＰ遺伝子の塩基配列である。
５’−ＡＶＣ２．ＸｂａＩ．ＥＧＦＰ（配列番号６）
５’−ttatcgaaattctagacgccaccATGGTGAGCAAGGGCG−３’
３’−ＡＶＣ２．ＮｓｐＶ．ＥＧＦＰ（配列番号７）
５’−gacgtacgcccttcgaaTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC−３’
（ｉｉ）ＭｙｏＤ遺伝子
ＥＧＦＰ遺伝子の場合と同様に、マウスＭｙｏＤ遺伝子（配列番号８）のｃＤＮＡを含むプラスミドを鋳型として、次のプライマーを用いてＰＣＲ法にて挿入遺伝子断片を増幅した。大文字部分はＭｙｏＤ遺伝子の塩基配列である。
５’−ＡＶＣ２．ＸｂａＩ．ｍＭｙｏＤ（配列番号９）
５’−ttatcgaaattctagaATGGAGCTTCTATCGCCGCCAC−３’
３’−ＡＶＣ２．ＮｓｐＶ．ｍＭｙｏＤ（配列番号１０）
５’−gacgtacgcccttcgaaTCAAAGCACCTGATAAATCGC−３’
（３）遺伝子断片の挿入
In-FusionＴＭPCR Cloning Kit（タカラバイオ株式会社）を用い、アダプター付きＰＣＲ産物をＤＮＡ−タンパク質複合体に挿入した。具体的には、ＰＣＲ産物およびＤＮＡ−タンパク質複合体を、モル比で２：１となるように混合し、さらに相同組換えに必要な酵素とバッファーを混合し、３７℃で１５分間反応させた。
【００４７】
（４）ウイルスプラークの単離（２９３細胞への遺伝子導入操作）
外来遺伝子のｃＤＮＡ断片を挿入したＤＮＡ−タンパク質複合体を含む上記反応液１０μＬにＴＥバッファー４０μＬを加え、反応を停止させた。このうち１０μＬを分取し、キャリアとなるプラスミドＤＮＡ２．５μｇと混合した後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ−Ｉ培地（インビトロジェン社）５００μＬに添加した。ここに、LipofectamineＴＭ LTX Reagent（インビトロジェン社）７μＬを混合後、室温で３０分静置した。この反応液を、６穴プレートに撒いたヒト２９３細胞に加え、５％ＣＯ２インキュベータ内にて３７℃で培養した。経時的に細胞を観察し、遺伝子導入３日後にウイルスプラークの出現を確認した。図１中の蛍光顕微鏡観察写真は、ＥＧＦＰ遺伝子発現ベクターの作製に伴うプラークの出現を示している。
【００４８】
（５）組換えウイルス構築の確認
組換えウイルスが構築の確認を、以下に記載するようにｃＤＮＡ断片が挿入されたことの確認、および当該組換えウイルスを細胞に感染させた際に導入遺伝子が発現することの確認、により行った。
【００４９】
（５−１）ｃＤＮＡ断片挿入の確認
外来遺伝子のｃＤＮＡ断片の挿入を、上記（４）で得られたウイルスプラークのＰＣＲにより確認した（図２Ａ）。具体的には、軟寒天培地で覆われたウイルスプラークを採取し、これを２９３細胞に感染させて細胞内でウイルスを複製させた後、細胞を回収した。凍結融解を３回反復し、３０００×ｇで１０分間遠心し、ウイルスを含む上清を採取した。このサンプルを０．１％ＳＤＳを含むＴＥバッファーで懸濁し、これを鋳型としてＰＣＲ反応を行った。
【００５０】
ＥＧＦＰ遺伝子の挿入の確認には、以下のプライマー対：
５’−ttatcgaaattctagacgccaccATGGTGAGCAAGGGCG−３’（配列番号６）、および
５’−gacgtacgcccttcgaaTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC−３’（配列番号７）
と共に、ＤＮＡポリメラーゼとして、PrimeSTAR（登録商標）HS（タカラバイオ株式会社）を用い、９８℃、１０秒；５５℃、１５秒；６８℃、１分；のサイクルを３０サイクル、の条件でＰＣＲ反応を行った。
【００５１】
ＭｙｏＤ遺伝子の挿入の確認には、以下のプライマー対：
５’−CGCCGCCGCCTGAGCAAAGT−３’（配列番号１１）、および
５’−GGTCTGGGTTCCCTGTTCTGTGT−３’（配列番号１２）
と共に、ＤＮＡポリメラーゼとして、PrimeSTAR（登録商標）HS（タカラバイオ株式会社）を用い、９８℃、１０秒；６３℃、１５秒；６８℃、１分；のサイクルを３０サイクル、の条件でＰＣＲ反応を行った。
【００５２】
得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により評価した。ＥＧＦＰ遺伝子の挿入は７６０ｂｐのバンドとして、ＭｙｏＤ遺伝子の挿入は５３４ｂｐのバンドとして確認された。
【００５３】
（５−２）導入遺伝子発現の確認
得られた組換えアデノウイルスのクローンを用いて、２９３細胞への感染を行った。感染した２９３細胞の溶解物についてウェスタンブロッティング解析によりＥＧＦＰまたはＭｙｏＤ（図２Ｂ）の発現を確認した。
【００５４】
以上の実験により、本発明の方法により組換えウイルスが構築できたことが確認された。
実施例２：組換えウイルスベクターの機能解析（間葉系幹細胞の分化誘導）
ＭｙｏＤ遺伝子を導入遺伝子として有する組換えアデノウイルスをＡＶＣ２ＭｙｏＤとした。精製した組換えアデノウイルスＡＶＣ２ＭｙｏＤを、ＭＯＩ＝１、２０、４００ｐｆｕ／細胞の条件にて、２時間、ＳＤラット骨髄由来の間葉系幹細胞に感染させ、その後培養した。感染時の培養条件は、２％ウシ胎仔血清入りＤＭＥＭ培地中、３７℃、５％ＣＯ２であり、感染後の培養条件は２％ウシ胎仔血清入りＤＭＥＭ培地中、３７℃、５％ＣＯ２であった。
【００５５】
感染４日後に免疫染色にて筋分化マーカーであるミオゲニン（赤）およびα−アクチニン（緑）の発現と筋管形成を確認した（図３）。特にＭＯＩ＝２０ｐｆｕ／細胞以上の条件で感染させた場合に、筋分化している傾向が顕著に現れた。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明の組換えアデノウイルスを構築する方法は、高い効率で組換えアデノウイルスを取得することが可能であるため、組換えアデノウイルスを利用した遺伝子の機能スクリーニングや疾患関連遺伝子の探索の効率化に貢献する。すなわち、従来は組換えアデノウイルスを得るために多くの時間がかかっていたが、本発明の方法では短時間で準備することが可能である。このため、導入遺伝子を有する組換えアデノウイルスを容易に準備することができ、組換えアデノウイルスを利用する各種の実験を効率よく進めることが可能である。具体的には、目的遺伝子あるいはその一部を増幅したＰＣＲ産物の機能解析実験、幹細胞への遺伝子導入による分化に関連する遺伝子の機能解析実験、および機能を欠失した疾患モデル細胞へ治療タンパク質遺伝子を有する組換えアデノウイルスを感染させることによる治療タンパク質の効果予測スクリーニング実験、等の効率化に貢献する。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、従来の方法および本願発明の方法を模式的に示した図、ならびにＥＧＦＰ遺伝子を挿入したＤＮＡ−タンパク質複合体の２９３細胞への遺伝子導入に伴うプラークの出現を示す蛍光顕微鏡観察写真である。
【図２】図２Ａは、導入遺伝子（ＭｙｏＤ遺伝子）のｃＤＮＡ断片のＡＶＣ２．ｎｕｌｌへの挿入をウイルスプラークのＰＣＲにより確認した結果を示すゲル電気泳動写真である。Ｍ：サイズマーカー、ＰＣ：ポジティブコントロール、ＮＣ：ネガティブコントロール（２９３細胞）、Ｂ：ＤＮＡ−タンパク質複合体（ＡＶＣ２．ｎｕｌｌ）、１：クローン＃１、２：クローン＃２。図２Ｂは、ＭｙｏＤ遺伝子を挿入した組換えアデノウイルスのクローン＃１および＃２を用いて、２９３細胞への感染を行い、ウェスタンブロッティング解析にてＭｙｏＤの発現を確認したゲル電気泳動写真である。ＮＣ：ネガティブコントロール（２９３細胞）、１：クローン＃１、２：クローン＃２。
【図３】図３は、ＭｙｏＤ遺伝子を導入遺伝子として有する組換アデノウイルスＡＶＣ２ＭｙｏＤを、ＭＯＩ＝１、２０、４００ｐｆｕ／細胞の条件にて２時間、ＳＤラット由来の間葉系幹細胞に感染させ、４日後に免疫染色を行った結果を示す電子顕微鏡写真である。赤色：ミオゲニン、緑色：α−アクチニン、青色：ＤＡＰＩ染色。
【配列表フリーテキスト】
【００５８】
配列番号１： ＡＶＣ２．ｎｕｌｌのＤＮＡ配列
配列番号２： プライマー
配列番号３： プライマー
配列番号４： プライマー
配列番号５： ＥＧＦＰをコードするＤＮＡ
配列番号６： プライマー ５’−ＡＶＣ２．ＸｂａＩ．ＥＧＦＰ
配列番号７： プライマー ３’−ＡＶＣ２．ＮｓｐＶ．ＥＧＦＰ
配列番号８： マウスＭｙｏＤをコードするＤＮＡ
配列番号９： プライマー ５’−ＡＶＣ２．ＸｂａＩ．ｍＭｙｏＤ
配列番号１０： プライマー ３’−ＡＶＣ２．ＮｓｐＶ．ｍＭｙｏＤ
配列番号１１： プライマー
配列番号１２： プライマー
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えアデノウイルスの構築方法に関する。また、本発明の組換えアデノウイルスは、遺伝子機能解析もしくはそれらの機能を応用した細胞・遺伝子治療に用いることができる。さらに、本発明の組換えアデノウイルスは、ハイブリッドベクターとして、各種組換えウイルスベクターの作製に用いることができる。よって、本発明は、本発明の組換えアデノウイルスを含むベクターの作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えアデノウイルスは、二本鎖ＤＮＡウイルスに由来するベクターであり、接着細胞への高い遺伝子導入効率を有する。このことから、組換えアデノウイルスは遺伝子を送達する担体として、遺伝子機能解析や遺伝子治療への応用が期待されている。特に、一過性に遺伝子発現を行う性質は、分化誘導スイッチとして有用である（非特許文献１：Itoh, A., et al., J. Gene Med., 2003, Vol.5, p.929-940）。例えば、Fujiiら（非特許文献２：Brain & Development, 2006, Vol.28, p.420-425）は、アデノウイルスベクターを用いてＭｙｏＤ遺伝子を皮膚線維芽細胞に導入すると、当該細胞は筋管への変化を誘導し、そして変化した細胞は筋肉に特異的なデスミンおよびジストロフィンを発現したことを示した。
【０００３】
しかしながら、従来法にて組換えアデノウイルスを単離するためには、アデノウイルスのゲノムが３４．７ｋｂと長いため、導入遺伝子を一旦プラスミドやコスミドなどのシャトルベクターに移す必要があった。この際、３０ｋｂ以上の大きなプラスミドやコスミドは不安定で収率も低く、慎重な取り扱いが必要であった。また、構築したプラスミドやコスミドから最終的なウイルスを得るためには、さらに１〜２週間を要し、短期間に構築の成否を判定することは困難である。
【０００４】
また、ウイルス複製には末端タンパク質が重要であり、完全長アデノウイルスゲノム導入（in vitroライゲーション法）は簡便であるが、末端タンパク質がないためウイルスベクター生成効率が低下することが知られている（非特許文献３：近藤ら、ウイルス、第５７巻、第１号、pp.37-46、2007）。
【０００５】
本発明者らは、以前に５型アデノウイルスゲノムを遺伝子工学的に操作し、末端タンパク質とＥ１領域に外来遺伝子挿入部位を有するＤＮＡ−タンパク質複合体を作製した。この技術を用いることにより、ＤＮＡ−タンパク質複合体に直接ｃＤＮＡ断片をライゲーションするだけで、短期間にベクターを作製することが可能となった（非特許文献４：Okada, T., et al., Nucleic Acids Res., 1998, Vol.26, p.1947-1950）。ただし、非特許文献４に記載の技術では、ＤＮＡ−タンパク質複合体の調製の際に、セルフライゲーションを防ぎ、目的断片の挿入効率を上げるために、ホスファターゼ処理とその除去操作を要した。また、挿入するｃＤＮＡ断片の調製として、制限酵素処理と純化の作業が必要であった。この際、ベクターゲノムへの遺伝子断片の挿入には、遺伝子が大きなことから限られた酵素サイトしか使用できないため、挿入断片の配列によっては、部分消化などの工夫を要した。
【非特許文献１】Itoh, A., et al., J. Gene Med., 2003, Vol.5, p.929-940
【非特許文献２】Fujii, I., et al., Brain & Development, 2006, Vol.28, p.420-425
【非特許文献３】近藤小貴ら、ウイルス、第５７巻、第１号、pp.37-46、2007
【非特許文献４】Okada, T., et al., Nucleic Acids Res., 1998, Vol.26, p.1947-1950
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、組換えアデノウイルスの迅速な構築方法を提供することを目的とする。本発明はまた、本発明の方法に用いる導入遺伝子を含む挿入断片を調製するためのプライマーを提供することを目的とする。
【０００７】
本発明はさらに、本発明の方法により得られた組換えアデノウイルスを提供することを目的とする。特に、導入遺伝子としてＭｙｏＤ遺伝子を含む組換えアデノウイルスの、筋分化誘導スイッチとしての利用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、鋭意研究の結果、ＤＮＡ−タンパク質複合体をＰＣＲ産物と相同組換えさせることによりウイルスゲノム中に導入遺伝子を挿入し、これを２９３細胞に導入すると、高い効率で組換えウイルスが単離されることを見出し、本発明の方法を完成させた。すなわち、本発明は以下の通りである。
【０００９】
［１］ 組換えアデノウイルスを構築する方法であって、以下の工程
（１）アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体を、導入遺伝子挿入部位で切断する；
（２）導入遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製する、ここで該ＤＮＡ断片は、その５’末端および３’末端に、それぞれ前記ＤＮＡ−タンパク質複合体における導入遺伝子挿入部位の上流側および下流側の１０〜１００塩基の配列と相同な配列を有し、そしてその間に導入遺伝子の塩基配列を含む；
（３）工程（２）で調製した導入遺伝子を含むＤＮＡ断片と、工程（１）で調製した外導入遺伝子挿入部位で切断されたＤＮＡ−タンパク質複合体とを、相同組換えにより連結して、導入遺伝子が挿入されたアデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体を得る；
（４）工程（３）で得られた導入遺伝子が挿入されたアデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体をヒト２９３細胞に遺伝子導入する；
（５）工程（４）で遺伝子導入したヒト２９３細胞を培養して、組換えアデノウイルスをウイルスプラークとして得る；
を含む、前記方法。
【００１０】
［２］ 導入遺伝子を含むＤＮＡ断片の５’末端および３’末端の配列が、それぞれ、アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体における導入遺伝子挿入部位の上流側および下流側の１０〜５０塩基の配列と相同な配列である、［１］項に記載の方法。
【００１１】
［３］ 導入遺伝子を含むＤＮＡ断片の５’末端および３’末端の配列が、それぞれ、アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体における導入遺伝子挿入部位の上流側および下流側の１０〜２０塩基の配列と相同な配列である、［１］項に記載の方法。
【００１２】
［４］ 相同組換えが、リコンビナーゼおよび相同組換えの促進タンパク質の存在下で行われる、［１］ないし［３］のいずれか１項に記載の方法。
［５］ アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体が、ＡＶＣ２．ｎｕｌｌ（配列番号１）を含む、［１］ないし［３］のいずれか１項に記載の方法。
【００１３】
［６］ アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体がＡＶＣ２．ｎｕｌｌ（配列番号１）を含み、そして外来遺伝子挿入部位の上流側および下流側がそれぞれＡＶＣ２．ｎｕｌｌのマルチプルクローニングサイト中のＸｂａＩおよびＮｓｐＶ制限酵素サイトである、［５］項に記載の方法。
【００１４】
［７］ アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体がＡＶＣ２．ｎｕｌｌ（配列番号１）を含み、外来遺伝子挿入部位の上流側および下流側がそれぞれＡＶＣ２．ｎｕｌｌにおけるＣＭＶプロモーターの上流側のＰａｃＩ制限酵素サイトおよびマルチプルクローニングサイト中のＮｓｐＶ制限酵素サイトであり、そして、導入遺伝子が構造遺伝子およびそれに機能可能に連結したプロモーター配列を含む、［５］項に記載の方法。
【００１５】
［８］ アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体がＡＶＣ２．ｎｕｌｌ（配列番号１）を含み、外来遺伝子挿入部位の上流側および下流側がそれぞれＡＶＣ２．ｎｕｌｌのマルチプルクローニングサイト中のＸｂａＩおよびＮｓｐＶ制限酵素サイトであり、そして、導入遺伝子を含むＤＮＡ断片の５’末端および３’末端の配列が、それぞれ、アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体における導入遺伝子挿入部位の上流側および下流側の１５塩基の配列と相同な配列である、［５］項に記載の方法。
【００１６】
［９］ 導入遺伝子が挿入されたアデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体を構築する方法であって、以下の工程：
（１）アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体を、導入遺伝子挿入部位で切断する；
（２）導入遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製する、ここで該ＤＮＡ断片は、その５’末端および３’末端に、それぞれ前記ＤＮＡ−タンパク質複合体における導入遺伝子挿入部位の上流側および下流側の１０〜１００塩基の配列と相同な配列を有し、そしてその間に導入遺伝子の塩基配列を含む；
（３）工程（２）で調製した導入遺伝子を含むＤＮＡ断片と、工程（１）で調製した外導入遺伝子挿入部位で切断されたＤＮＡ−タンパク質複合体とを、相同組換えにより連結して、導入遺伝子が挿入されたアデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体を得る；
を含む、前記方法。
【００１７】
［１０］ 導入遺伝子を含むＤＮＡ断片の５’末端および３’末端の配列が、それぞれ、アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体における導入遺伝子挿入部位の上流側および下流側の１０〜２０塩基の配列と相同な配列である、［９］項に記載の方法。
【００１８】
［１１］ 相同組換えが、相同組換えの促進タンパク質の存在下で行われる、［９］または［１０］に記載の方法。
［１２］ 請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法に用いるための、２５塩基ないし５０塩基からなるプライマーであって、以下：
（ａ）５’−TTATCGAAATTCTAG−３’（配列番号２）を５’末端側に含み、そして３’末端側に、導入される構造遺伝子の５’末端側の１０〜３５塩基の配列を含む、プライマー；
（ｂ）５’−GACGTACGCCCTTCG−３’（配列番号３）を５’末端側に含み、そして３’末端側に、導入される構造遺伝子の３’末端側の１０〜３５塩基の配列を含む、プライマー；および
（ｃ）５’−AGATATAGGGCATTAAT−３’（配列番号４）を５’末端側に含み、そして３’末端側に、導入される構造遺伝子に機能可能に連結したプロモーター配列の５’末端側の８〜３３塩基の配列を含む、プライマー；
からなる群より選択される、前記プライマー。
【００１９】
［１３］ ＭｙｏＤ遺伝子を導入される構造遺伝子として含む、組換えアデノウイルスベクター。
［１４］ 間葉系幹細胞の筋分化を誘導する方法であって、ＭｙｏＤ遺伝子を導入される構造遺伝子として含む組換えアデノウイルスを間葉系幹細胞に感染させることを含む、前記方法。
【００２０】
［１５］ 組換えアデノウイルスを、少なくともＭＯＩ＝２０ｐｆｕ／ｃｅｌｌで感染させる、［１５］項に記載の方法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の組換えアデノウイルス構築法により、ＤＮＡ−タンパク質複合体をＰＣＲ産物と相同組換えさせることによりウイルスゲノム中に導入遺伝子を挿入し、これを２９３細胞に導入すると、高い効率で組換えウイルスを単離することが可能になった。本発明の方法においては、ＤＮＡ−タンパク質複合体のホスファターゼ処理や、挿入断片の制限酵素処理は一切不要である。また、導入遺伝子のウイルスゲノムへの挿入の際にリガーゼを用いないため、制限酵素認識部位を一致させる必要はなく、あらゆる配列のＰＣＲ断片を自由自在にＤＮＡ−タンパク質複合体にクローニングすることが可能である。これらの特徴により、本発明の方法では、プラスミドやコスミドを用いた従来のウイルス単離方法にはない、容易な操作と短期間でのウイルス単離効果を応用することによって、迅速に目的の組換えアデノウイルスが得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
１．組換えアデノウイルスの構築方法
一態様において本発明は、組換えアデノウイルスを迅速かつ効率よく構築する方法に関する。より具体的には、本発明の組換えアデノウイルスを構築する方法は、以下の工程
（１）アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体を、導入遺伝子挿入部位で切断する；
（２）導入遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製する、ここで該ＤＮＡ断片は、その５’末端および３’末端に、それぞれ前記ＤＮＡ−タンパク質複合体における導入遺伝子挿入部位の上流側および下流側の１０〜１００塩基の配列と相同な配列を有し、そしてその間に導入遺伝子の塩基配列を含む；
（３）工程（２）で調製した導入遺伝子を含むＤＮＡ断片と、工程（１）で調製した外導入遺伝子挿入部位で切断されたＤＮＡ−タンパク質複合体とを、相同組換えにより連結して、導入遺伝子が挿入されたアデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体を得る；
（４）工程（３）で得られた導入遺伝子が挿入されたアデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体をヒト２９３細胞に遺伝子導入する；
（５）工程（４）で遺伝子導入したヒト２９３細胞を培養して、組換えアデノウイルスをウイルスプラークとして得る；
を含む方法である。本発明の方法を模式的に示したものが、図１である。
【００２３】
１−１．工程（１）〜（３）について
本明細書においてアデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体とは、アデノウイルスゲノムの末端に末端タンパク質が共有結合したＤＮＡ−タンパク質複合体をいう。アデノウイルスゲノムは二本鎖ＤＮＡであり、アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体において末端タンパク質は、二本鎖ＤＮＡそれぞれの５’末端に共有結合している。好ましい態様において、アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体を構成するアデノウイルスゲノムは、Ｅ１ａ遺伝子を欠失している。
【００２４】
本発明の方法に利用可能なアデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体の具体的なものとして、ＡＶＣ２．ｎｕｌｌ（配列番号１）を含むもの、コスミド由来の調製済みＤＮＡ−ＴＰＣ（Adenovirus Expression Vector Kit；タカラバイオ社）等が挙げられるが、これに限定されない。
【００２５】
ＡＶＣ２．ｎｕｌｌは、Okadaら（Nucleic Acid Research, 1998, 26(8):1947-1950）にその製造方法が記載されているＤＮＡ−タンパク質複合体である。具体的には、ＡＶＣ２．ｎｕｌｌ（配列番号１）は、５型アデノウイルスゲノム（Ａｄ５）のＮ末端側配列（配列番号１のヌクレオチド１−４００に相当）、ｐＤＣＭ８（Invitrogen）由来のＣＭＶ−ＩＥプロモータおよびエンハンサー、マルチプルクローニングサイト（５’−ＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ−ＰｍｅＩ−ＮｓｐＶ−ＳｕｎＩ−３’）、ｐＤＣＭ８（Invitrogen）由来のＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル化サイト（プロモータからポリアデニル化サイトまでの発現カセットは配列番号１のヌクレオチド４０１−３３２７に相当）、並びにＡｄ５のＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（Ａｄ５のＥ１ｂ／Ｅ２ｂ領域：配列番号１のヌクレオチド３３２８−６２４１に相当）からなる構築物ををＥ１ａ遺伝子領域に代えて有するアデノウイルスゲノムＤＮＡを含むＤＮＡ−タンパク質複合体である。
【００２６】
本発明の方法において、アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体における導入遺伝子挿入部位は、Ｅ１ａ遺伝子領域、Ｅ１ａ遺伝子が欠失している場合はそれに対応する領域に存在する。導入遺伝子挿入部位は、制限酵素認識サイトであっても制限酵素認識サイトでなくてもよい。好ましくは導入遺伝子挿入部位は、制限酵素認識サイトである。
【００２７】
例えば、ＡＶＣ２．ｎｕｌｌを用いる場合、Ｅ１ａ遺伝子領域と置換した構築物中の制限酵素認識サイトのいずれかを導入遺伝子挿入部位として利用することができる。具体的には、導入遺伝子を含む断片が、プロモータ配列を含まずに宿主細胞中での発現が望まれる構造遺伝子を含む場合は、ＡＶＣ２．ｎｕｌｌのマルチプルクローニングサイト中の、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＰｍｅＩ、ＮｓｐＶ、ＳｕｎＩのいずれか１つまたは２つを利用してもよい。切断後の自己再結合を防ぐため、いずれか２つであることが好ましい。より好ましい組み合わせは、ＸｂａＩとＮｓｐＶの組み合わせである。導入遺伝子を含む断片が、プロモータ配列および宿主細胞中での発現が望まれる構造遺伝子を含む場合は、ＣＭＶ−ＩＥプロモータの上流側のＰａｃＩおよびマルチプルクローニングサイト中の、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＰｍｅＩ、ＮｓｐＶ、ＳｕｎＩのいずれか１つとの組み合わせを利用してもよい。好ましいのは、ＣＭＶ−ＩＥプロモータの上流側のＰａｃＩとマルチプルクローニングサイト中のＮｓｐＶの組み合わせである。
【００２８】
本明細書において、導入遺伝子とは、ある宿主細胞中での発現が望まれる構造遺伝子を含む遺伝子を意味し、プロモーター配列を含んでいなくても、あるいはプロモーター配列が機能可能に当該構造遺伝子に連結していてもよい。ここで、ある宿主細胞中での発現が望まれる構造遺伝子を、特に導入される構造遺伝子ということがある。導入される構造遺伝子の由来に限定はなく、宿主細胞に対して内因性の遺伝子であっても外因性の遺伝子であってもよい。導入遺伝子がプロモーター配列を含む場合、当該プロモーター配列は、導入される構造遺伝子の発現が望まれる宿主細胞中で機能可能なプロモーター配列である。また、導入遺伝子のサイズは、８ｋｂ以下、７．５ｋｂ以下、７ｋｂ以下、６．５ｋｂ以下、６ｋｂ以下、５．５ｋｂ以下、５ｋｂ以下であるが、これらに限定されない。導入遺伝子のサイズの下限はない。
【００２９】
本発明の方法において、導入遺伝子を含むＤＮＡ断片は、公知の方法により調製することができる。例えば、限定されるわけではないが、導入遺伝子を含むＤＮＡをテンプレートにして、ＰＣＲ法によってＤＮＡ断片として調製することが可能である。ＰＣＲのための酵素の選択や、適切な増幅条件については、当業者が適宜決定することができる。
【００３０】
本発明の方法において、アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体への導入遺伝子を含むＤＮＡ断片の挿入には、相同組換えの手法を利用する。導入遺伝子を含むＤＮＡ断片は、その５’末端および３’末端に、それぞれアデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体における導入遺伝子挿入部位の上流側および下流側と相同な配列を有する。相同組換えは、アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体を導入遺伝子挿入部位であらかじめ切断したのち、導入遺伝子挿入部位の上流側および下流側と相同な配列を有する導入遺伝子を含むＤＮＡ断片との間で行う。
【００３１】
導入遺伝子を含むＤＮＡ断片の５’末端および３’末端の配列は、アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体における導入遺伝子挿入部位の上流側および下流側と相同な、１０〜１００塩基、１０〜７５塩基、１０〜５０配列、１０〜４０塩基、１０〜３０塩基、１０〜２０塩基、１０〜１５塩基、または１５塩基の配列であってよい。導入遺伝子挿入部位の上流側および下流側と相同な、導入遺伝子を含むＤＮＡ断片の５’末端および３’末端の配列は、上記の長さの範囲内である限り、それぞれ同じ長さであってもよく、あるいは異なる長さであってもよい。好ましくは、導入遺伝子挿入部位の上流側および下流側と相同な、導入遺伝子を含むＤＮＡ断片の５’末端および３’末端の配列がそれぞれ異なる長さである場合には、互いに、５塩基以下、４塩基以下、３塩基以下、２塩基以下、または１塩基以下の長さの違いであることが好ましい。さらに好ましくは、導入遺伝子挿入部位の上流側および下流側と相同な、導入遺伝子を含むＤＮＡ断片の５’末端および３’末端の配列は、それぞれ同じ長さである。
【００３２】
本願発明の方法において相同組換えは、リコンビナーゼおよび相同組換えの促進タンパク質の存在下で行ってもよい。本発明の方法において使用可能なリコンビナーゼは特に限定されない。相同組換えの促進タンパク質は、リコンビナーゼとの共存下において相同組換えを促進し、より相同配列の長さが短い場合でも相同組換えを可能にするタンパク質をいう。相同組換えの促進タンパク質は２種以上のタンパク質の組み合わせであってもよい。相同組換えの促進タンパク質の具体的なものとしては、大腸菌由来のＲｅｃＥおよびＲｅｃＴの組み合わせ、ファージ由来のＲｅｄαおよびＲｅｄβの組み合わせが知られている（Zhang et al., Nature Genetics, 20:123-128, 1998; Zhang et al., Nature Biotechnology 18:1314-1317, 2000; GenBank Accession No. NC_010473; GenBank Accession No. AX711994）。
このような相同組換えの促進タンパク質を伴う相同組換えの原理を利用して、より相同配列の長さが短いものについて相同組換えを行うためのキットが市販されている。本発明の方法は、そのようなキットを利用して行うことも可能である。そのようなキットには、In-FusionＴＭ PCR Cloning Kit（タカラバイオ株式会社、Clontech社）、Red/ET Recombination System Quick and Easy BAC MODIFICATION Kit（フナコシ株式会社、Gene Bridges社）等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３３】
１−２．工程（４）および（５）
アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体と導入遺伝子を含むＤＮＡ断片との相同組換えにより、導入遺伝子が曽遊されたアデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体を得た後、これをヒト２９３細胞に遺伝子導入する。遺伝子導入には、公知の遺伝子導入方法、例えば、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム法、ヌクレオフェクション等を使用することができるが、これらに限定されない。
【００３４】
その後、遺伝子導入したヒト２９３細胞を培養して、組換えアデノウイルスをウイルスプラークとして得る。培養条件は、特に限定されないが、ヒト２９３細胞の培養条件として通常用いられる条件で行う。
【００３５】
２．導入遺伝子が挿入されたアデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体を構築する方法
別の態様において、上記の組換えアデノウイルスを構築する方法における工程（１）ないし（３）を含む、導入遺伝子が挿入されたアデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体を構築する方法もまた、本発明の範囲内である。
【００３６】
３．プライマー
好ましい態様において、本発明の方法におけるアデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体はＡＶＣ２．ｎｕｌｌであり、導入遺伝子を含む断片がプロモータ配列を含まずに宿主細胞中での発現が望まれる構造遺伝子を含み、導入遺伝子挿入部位としてＡＶＣ２．ｎｕｌｌのマルチプルクローニングサイト中ＸｂａＩとＮｓｐＶの組み合わせを利用する。この場合、導入遺伝子を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ法により調製するためのプライマーは、２５塩基ないし５０塩基からなるプライマーであって、以下：
５’−TTATCGAAATTCTAG−３’（配列番号２）を５’末端側に含み、そして３’末端側に、導入される構造遺伝子の５’末端側の１０〜３５塩基、好ましくは１５〜３５塩基、１５〜３０塩基、１５〜２５塩基、の配列を含む、プライマー；および、
５’−GACGTACGCCCTTCG−３’（配列番号３）を５’末端側に含み、そして３’末端側に、導入される構造遺伝子の３’末端側の１０〜３５塩基、好ましくは１５〜３５塩基、１５〜３０塩基、１５〜２５塩基、の配列を含む、プライマー；
であってよい。
【００３７】
別の好ましい態様において、本発明の方法におけるアデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体はＡＶＣ２．ｎｕｌｌであり、導入遺伝子を含む断片がプロモータ配列が機能可能に連結された宿主細胞中での発現が望まれる構造遺伝子を含み、導入遺伝子挿入部位としてＡＶＣ２．ｎｕｌｌのＣＭＶ−ＩＥプロモータの上流側のＰａｃＩとマルチプルクローニングサイト中のＮｓｐＶの組み合わせを利用する。この場合、導入遺伝子を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ法により調製するためのプライマーは、２５塩基ないし５０塩基からなるプライマーであって、以下：
５’−AGATATAGGGCATTAAT−３’（配列番号４）を５’末端側に含み、そして３’末端側に、導入される構造遺伝子に機能可能に連結したプロモーター配列の５’末端側の８〜３３塩基、好ましくは１０〜３０塩基、１５〜３０塩基、１５〜２５塩基、の配列を含む、プライマー；および
５’−GACGTACGCCCTTCG−３’（配列番号３）を５’末端側に含み、そして３’末端側に、導入される構造遺伝子の３’末端側の１０〜３５塩基、好ましくは１５〜３５塩基、１５〜３０塩基、１５〜２５塩基、の配列を含む、プライマー；
であってよい。
【００３８】
４．筋分化誘導スイッチとしてのＭｙｏＤ遺伝子を含む組換えアデノウイルスベクター
本発明者らは、導入遺伝子としてＭｙｏＤ遺伝子が挿入された組換えアデノウイルスを、本願発明の方法に従って構築した。得られた組換えアデノウイルスを、宿主細胞にＭｙｏＤ遺伝子を導入するための組換えアデノウイルスベクターとして用いて、ＳＤラット由来間葉系幹細胞に感染させた。感染させた間葉系幹細胞を培養したところ、筋分化マーカーであるミオゲニンおよびα−アクチニンの発現と筋管形成を確認した。このことから、本発明者らはＭｙｏＤ遺伝子を導入遺伝子として含む組換えアデノウイルスベクターを間葉系幹細胞に感染させることにより、間葉系幹細胞の筋分化を誘導できることを見出した。アデノウイルスベクターは一過性に遺伝子発現を行う性質を有するため、本発明のＭｙｏＤ遺伝子を導入遺伝子として含む組換えアデノウイルスベクターは、間葉系幹細胞における筋分化誘導スイッチとして利用可能である。
【００３９】
また、ｉＰＳ細胞や線維芽細胞等においても利用可能である。
よって、本発明の別の態様は、ＭｙｏＤ遺伝子を導入遺伝子として含む組換えアデノウイルスベクターを間葉系幹細胞に感染させることを含む、間葉系幹細胞、ｉＰＳ細胞、または線維芽細胞を誘導する方法に関する。上記の方法において、組換えアデノウイルスベクターを感染させる条件は特に限定されないが、下限は少なくともＭＯＩ＝５ｐｆｕ／細胞、１０ｐｆｕ／細胞、１５ｐｆｕ／細胞、２０ｐｆｕ／細胞から選択されてよく、上限はMＯＩ＝１０００ｐｆｕ／細胞以下、７５０ｐｆｕ／細胞以下、５００ｐｆｕ／細胞以下、４００ｐｆｕ／細胞以下から選択されてよい。
【００４０】
細胞の培養は、当業者に公知の条件で行うことができ、また当業者は適宜培養条件を調製することができる。例えば、間葉系幹細胞の培養条件は、特に限定されないが、１０％ウシ胎仔血清入りＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）中、３７℃、５％ＣＯ２の条件などが挙げられる。
【００４１】
間葉系幹細胞の筋分化は、筋分化マーカーであるミオゲニン、α−アクチニン、Ｐａｘ３、Ｐａｘ７、Ｍｙｆ５、ＭＲＦ４、デスミンおよびミオシン重鎖からなる群より選択されるマーカーの発現をモニタリングし、当該筋分化マーカーの発現を確認することにより検出することができる。筋分化マーカーの発現の検出は、当該技術分野において公知の免疫染色および電子顕微鏡での観察により行うことができる。
【００４２】
あるいは、間葉系幹細胞の筋分化は、上記の筋分化マーカーの検出と共にまたは別個に、筋管形成をモニタリングすることにより行うことができる。筋管形成のモニタリングは、チューブ状に細長くなった細胞が複数、望ましくは３個以上、の核を有していることを顕微鏡下で観察することにより行うことができる。
【００４３】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４４】
実施例１：ウイルスベクターの構築
（１）ＤＮＡ−タンパク質複合体の調製
ＤＮＡ−タンパク質複合体の骨格として、ＣＭＶプロモーター、およびｐｏｌｙＡ配列をアデノウイルスゲノムのＥ１領域の一部（Ｅ１ａからＥ１ｂの一部にかけての領域）に挿入した、組換えアデノウイルスＡＶＣ２．ｎｕｌｌ（配列番号１）を用いた。Okada, T., et al.（Nucleic Acids Res., 1998, Vol.26, p.1947-1950）に記載の方法に従い、ＤＮＡ−タンパク質複合体を調製した。これに制限酵素ＸｂａＩおよびＮｓｐＶによる処理を加え、発現遺伝子断片が挿入可能なＤＮＡ−タンパク質複合体を作製した。
【００４５】
（２）遺伝子断片の調製
ＡＶＣ２．ｎｕｌｌのＤＮＡ−タンパク質複合体に挿入する遺伝子断片を以下の手順で調製した。ＡＶＣ２．ｎｕｌｌにおいて導入遺伝子を挿入する部位、すなわちマルチプルクローニングサイト中のＸｂａＩおよびＮｓｐＶの外側１５塩基の塩基配列は５’−ttatcgaaattctag−３’（上流側：配列番号２）および５’−gacgtacgcccttcg−３’（下流側：配列番号３）である。これらの配列に相同な配列を導入遺伝子の両端に隣接して含む挿入断片を、ＰＣＲ法にて増幅した。この際、遺伝子変異が生じない様に、正確性と効率の高い高忠実度ＤＮＡポリメラーゼとして、PrimeSTAR（登録商標）HS（タカラバイオ株式会社）を用いた。ＰＣＲの条件は、９８℃、１０秒；５５℃、１５秒；６８℃、１分；のサイクルを３０サイクル、とした。ＰＣＲ産物を、QIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン社、カタログ番号28704）にて精製し挿入断片として使用した。導入遺伝子としてＥＧＦＰ遺伝子及びＭｙｏＤ遺伝子を用いた。
【００４６】
（ｉ）ＥＧＦＰ遺伝子
ＥＧＦＰ遺伝子（配列番号５）のｃＤＮＡを含むプラスミド（pEGFP-N1 Vector（クロンテック社、カタログ番号632318）を鋳型として、次のプライマーを用いてＰＣＲ法にて挿入遺伝子断片を増幅した。ＰＣＲ産物の両端にＡＶＣ２．ｎｕｌｌにおいて導入遺伝子を挿入する部位の配列に相同な１５塩基対の配列をアダプターとして含む様に、プライマーを設計した。大文字部分はＥＧＦＰ遺伝子の塩基配列である。
５’−ＡＶＣ２．ＸｂａＩ．ＥＧＦＰ（配列番号６）
５’−ttatcgaaattctagacgccaccATGGTGAGCAAGGGCG−３’
３’−ＡＶＣ２．ＮｓｐＶ．ＥＧＦＰ（配列番号７）
５’−gacgtacgcccttcgaaTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC−３’
（ｉｉ）ＭｙｏＤ遺伝子
ＥＧＦＰ遺伝子の場合と同様に、マウスＭｙｏＤ遺伝子（配列番号８）のｃＤＮＡを含むプラスミドを鋳型として、次のプライマーを用いてＰＣＲ法にて挿入遺伝子断片を増幅した。大文字部分はＭｙｏＤ遺伝子の塩基配列である。
５’−ＡＶＣ２．ＸｂａＩ．ｍＭｙｏＤ（配列番号９）
５’−ttatcgaaattctagaATGGAGCTTCTATCGCCGCCAC−３’
３’−ＡＶＣ２．ＮｓｐＶ．ｍＭｙｏＤ（配列番号１０）
５’−gacgtacgcccttcgaaTCAAAGCACCTGATAAATCGC−３’
（３）遺伝子断片の挿入
In-FusionＴＭPCR Cloning Kit（タカラバイオ株式会社）を用い、アダプター付きＰＣＲ産物をＤＮＡ−タンパク質複合体に挿入した。具体的には、ＰＣＲ産物およびＤＮＡ−タンパク質複合体を、モル比で２：１となるように混合し、さらに相同組換えに必要な酵素とバッファーを混合し、３７℃で１５分間反応させた。
【００４７】
（４）ウイルスプラークの単離（２９３細胞への遺伝子導入操作）
外来遺伝子のｃＤＮＡ断片を挿入したＤＮＡ−タンパク質複合体を含む上記反応液１０μＬにＴＥバッファー４０μＬを加え、反応を停止させた。このうち１０μＬを分取し、キャリアとなるプラスミドＤＮＡ２．５μｇと混合した後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ−Ｉ培地（インビトロジェン社）５００μＬに添加した。ここに、LipofectamineＴＭ LTX Reagent（インビトロジェン社）７μＬを混合後、室温で３０分静置した。この反応液を、６穴プレートに撒いたヒト２９３細胞に加え、５％ＣＯ２インキュベータ内にて３７℃で培養した。経時的に細胞を観察し、遺伝子導入３日後にウイルスプラークの出現を確認した。図１中の蛍光顕微鏡観察写真は、ＥＧＦＰ遺伝子発現ベクターの作製に伴うプラークの出現を示している。
【００４８】
（５）組換えウイルス構築の確認
組換えウイルスが構築の確認を、以下に記載するようにｃＤＮＡ断片が挿入されたことの確認、および当該組換えウイルスを細胞に感染させた際に導入遺伝子が発現することの確認、により行った。
【００４９】
（５−１）ｃＤＮＡ断片挿入の確認
外来遺伝子のｃＤＮＡ断片の挿入を、上記（４）で得られたウイルスプラークのＰＣＲにより確認した（図２Ａ）。具体的には、軟寒天培地で覆われたウイルスプラークを採取し、これを２９３細胞に感染させて細胞内でウイルスを複製させた後、細胞を回収した。凍結融解を３回反復し、３０００×ｇで１０分間遠心し、ウイルスを含む上清を採取した。このサンプルを０．１％ＳＤＳを含むＴＥバッファーで懸濁し、これを鋳型としてＰＣＲ反応を行った。
【００５０】
ＥＧＦＰ遺伝子の挿入の確認には、以下のプライマー対：
５’−ttatcgaaattctagacgccaccATGGTGAGCAAGGGCG−３’（配列番号６）、および
５’−gacgtacgcccttcgaaTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC−３’（配列番号７）
と共に、ＤＮＡポリメラーゼとして、PrimeSTAR（登録商標）HS（タカラバイオ株式会社）を用い、９８℃、１０秒；５５℃、１５秒；６８℃、１分；のサイクルを３０サイクル、の条件でＰＣＲ反応を行った。
【００５１】
ＭｙｏＤ遺伝子の挿入の確認には、以下のプライマー対：
５’−CGCCGCCGCCTGAGCAAAGT−３’（配列番号１１）、および
５’−GGTCTGGGTTCCCTGTTCTGTGT−３’（配列番号１２）
と共に、ＤＮＡポリメラーゼとして、PrimeSTAR（登録商標）HS（タカラバイオ株式会社）を用い、９８℃、１０秒；６３℃、１５秒；６８℃、１分；のサイクルを３０サイクル、の条件でＰＣＲ反応を行った。
【００５２】
得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により評価した。ＥＧＦＰ遺伝子の挿入は７６０ｂｐのバンドとして、ＭｙｏＤ遺伝子の挿入は５３４ｂｐのバンドとして確認された。
【００５３】
（５−２）導入遺伝子発現の確認
得られた組換えアデノウイルスのクローンを用いて、２９３細胞への感染を行った。感染した２９３細胞の溶解物についてウェスタンブロッティング解析によりＥＧＦＰまたはＭｙｏＤ（図２Ｂ）の発現を確認した。
【００５４】
以上の実験により、本発明の方法により組換えウイルスが構築できたことが確認された。
実施例２：組換えウイルスベクターの機能解析（間葉系幹細胞の分化誘導）
ＭｙｏＤ遺伝子を導入遺伝子として有する組換えアデノウイルスをＡＶＣ２ＭｙｏＤとした。精製した組換えアデノウイルスＡＶＣ２ＭｙｏＤを、ＭＯＩ＝１、２０、４００ｐｆｕ／細胞の条件にて、２時間、ＳＤラット骨髄由来の間葉系幹細胞に感染させ、その後培養した。感染時の培養条件は、２％ウシ胎仔血清入りＤＭＥＭ培地中、３７℃、５％ＣＯ２であり、感染後の培養条件は２％ウシ胎仔血清入りＤＭＥＭ培地中、３７℃、５％ＣＯ２であった。
【００５５】
感染４日後に免疫染色にて筋分化マーカーであるミオゲニン（赤）およびα−アクチニン（緑）の発現と筋管形成を確認した（図３）。特にＭＯＩ＝２０ｐｆｕ／細胞以上の条件で感染させた場合に、筋分化している傾向が顕著に現れた。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明の組換えアデノウイルスを構築する方法は、高い効率で組換えアデノウイルスを取得することが可能であるため、組換えアデノウイルスを利用した遺伝子の機能スクリーニングや疾患関連遺伝子の探索の効率化に貢献する。すなわち、従来は組換えアデノウイルスを得るために多くの時間がかかっていたが、本発明の方法では短時間で準備することが可能である。このため、導入遺伝子を有する組換えアデノウイルスを容易に準備することができ、組換えアデノウイルスを利用する各種の実験を効率よく進めることが可能である。具体的には、目的遺伝子あるいはその一部を増幅したＰＣＲ産物の機能解析実験、幹細胞への遺伝子導入による分化に関連する遺伝子の機能解析実験、および機能を欠失した疾患モデル細胞へ治療タンパク質遺伝子を有する組換えアデノウイルスを感染させることによる治療タンパク質の効果予測スクリーニング実験、等の効率化に貢献する。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、従来の方法および本願発明の方法を模式的に示した図、ならびにＥＧＦＰ遺伝子を挿入したＤＮＡ−タンパク質複合体の２９３細胞への遺伝子導入に伴うプラークの出現を示す蛍光顕微鏡観察写真である。
【図２】図２Ａは、導入遺伝子（ＭｙｏＤ遺伝子）のｃＤＮＡ断片のＡＶＣ２．ｎｕｌｌへの挿入をウイルスプラークのＰＣＲにより確認した結果を示すゲル電気泳動写真である。Ｍ：サイズマーカー、ＰＣ：ポジティブコントロール、ＮＣ：ネガティブコントロール（２９３細胞）、Ｂ：ＤＮＡ−タンパク質複合体（ＡＶＣ２．ｎｕｌｌ）、１：クローン＃１、２：クローン＃２。図２Ｂは、ＭｙｏＤ遺伝子を挿入した組換えアデノウイルスのクローン＃１および＃２を用いて、２９３細胞への感染を行い、ウェスタンブロッティング解析にてＭｙｏＤの発現を確認したゲル電気泳動写真である。ＮＣ：ネガティブコントロール（２９３細胞）、１：クローン＃１、２：クローン＃２。
【図３】図３は、ＭｙｏＤ遺伝子を導入遺伝子として有する組換アデノウイルスＡＶＣ２ＭｙｏＤを、ＭＯＩ＝１、２０、４００ｐｆｕ／細胞の条件にて２時間、ＳＤラット由来の間葉系幹細胞に感染させ、４日後に免疫染色を行った結果を示す電子顕微鏡写真である。赤色：ミオゲニン、緑色：α−アクチニン、青色：ＤＡＰＩ染色。
【配列表フリーテキスト】
【００５８】
配列番号１： ＡＶＣ２．ｎｕｌｌのＤＮＡ配列
配列番号２： プライマー
配列番号３： プライマー
配列番号４： プライマー
配列番号５： ＥＧＦＰをコードするＤＮＡ
配列番号６： プライマー ５’−ＡＶＣ２．ＸｂａＩ．ＥＧＦＰ
配列番号７： プライマー ３’−ＡＶＣ２．ＮｓｐＶ．ＥＧＦＰ
配列番号８： マウスＭｙｏＤをコードするＤＮＡ
配列番号９： プライマー ５’−ＡＶＣ２．ＸｂａＩ．ｍＭｙｏＤ
配列番号１０： プライマー ３’−ＡＶＣ２．ＮｓｐＶ．ｍＭｙｏＤ
配列番号１１： プライマー
配列番号１２： プライマー
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えアデノウイルスを構築する方法であって、以下の工程
（１）アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体を、導入遺伝子挿入部位で切断する；
（２）導入遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製する、ここで該ＤＮＡ断片は、その５’末端および３’末端に、それぞれ前記ＤＮＡ−タンパク質複合体における導入遺伝子挿入部位の上流側および下流側の１０〜１００塩基の配列と相同な配列を有し、そしてその間に導入遺伝子の塩基配列を含む；
（３）工程（２）で調製した導入遺伝子を含むＤＮＡ断片と、工程（１）で調製した外導入遺伝子挿入部位で切断されたＤＮＡ−タンパク質複合体とを、相同組換えにより連結して、導入遺伝子が挿入されたアデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体を得る；
（４）工程（３）で得られた導入遺伝子が挿入されたアデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体をヒト２９３細胞に遺伝子導入する；
（５）工程（４）で遺伝子導入したヒト２９３細胞を培養して、組換えアデノウイルスをウイルスプラークとして得る；
を含む、前記方法。
【請求項２】
導入遺伝子を含むＤＮＡ断片の５’末端および３’末端の配列が、それぞれ、アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体における導入遺伝子挿入部位の上流側および下流側の１０〜５０塩基の配列と相同な配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
導入遺伝子を含むＤＮＡ断片の５’末端および３’末端の配列が、それぞれ、アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体における導入遺伝子挿入部位の上流側および下流側の１０〜２０塩基の配列と相同な配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
相同組換えが、リコンビナーゼおよび相同組換えの促進タンパク質の存在下で行われる、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体が、ＡＶＣ２．ｎｕｌｌ（配列番号１）を含む、請求項１ないし３いずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体がＡＶＣ２．ｎｕｌｌ（配列番号１）を含み、そして外来遺伝子挿入部位の上流側および下流側がそれぞれＡＶＣ２．ｎｕｌｌのマルチプルクローニングサイト中のＸｂａＩおよびＮｓｐＶ制限酵素サイトである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体がＡＶＣ２．ｎｕｌｌ（配列番号１）を含み、外来遺伝子挿入部位の上流側および下流側がそれぞれＡＶＣ２．ｎｕｌｌにおけるＣＭＶプロモーターの上流側のＰａｃＩ制限酵素サイトおよびマルチプルクローニングサイト中のＮｓｐＶ制限酵素サイトであり、そして、導入遺伝子が構造遺伝子およびそれに機能可能に連結したプロモーター配列を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体がＡＶＣ２．ｎｕｌｌ（配列番号１）を含み、外来遺伝子挿入部位の上流側および下流側がそれぞれＡＶＣ２．ｎｕｌｌのマルチプルクローニングサイト中のＸｂａＩおよびＮｓｐＶ制限酵素サイトであり、そして、導入遺伝子を含むＤＮＡ断片の５’末端および３’末端の配列が、それぞれ、アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体における導入遺伝子挿入部位の上流側および下流側の１５塩基の配列と相同な配列である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
導入遺伝子が挿入されたアデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体を構築する方法であって、以下の工程：
（１）アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体を、導入遺伝子挿入部位で切断する；
（２）導入遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製する、ここで該ＤＮＡ断片は、その５’末端および３’末端に、それぞれ前記ＤＮＡ−タンパク質複合体における導入遺伝子挿入部位の上流側および下流側の１０〜１００塩基の配列と相同な配列を有し、そしてその間に導入遺伝子の塩基配列を含む；
（３）工程（２）で調製した導入遺伝子を含むＤＮＡ断片と、工程（１）で調製した外導入遺伝子挿入部位で切断されたＤＮＡ−タンパク質複合体とを、相同組換えにより連結して、導入遺伝子が挿入されたアデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体を得る；
を含む、前記方法。
【請求項１０】
導入遺伝子を含むＤＮＡ断片の５’末端および３’末端の配列が、それぞれ、アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体における導入遺伝子挿入部位の上流側および下流側の１０〜２０塩基の配列と相同な配列である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
相同組換えが、相同組換えの促進タンパク質の存在下で行われる、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法に用いるための、２５塩基ないし５０塩基からなるプライマーであって、以下：
（ａ）５’−TTATCGAAATTCTAG−３’（配列番号２）を５’末端側に含み、そして３’末端側に、導入される構造遺伝子の５’末端側の１０〜３５塩基の配列を含む、プライマー；
（ｂ）５’−GACGTACGCCCTTCG−３’（配列番号３）を５’末端側に含み、そして３’末端側に、導入される構造遺伝子の３’末端側の１０〜３５塩基の配列を含む、プライマー；および
（ｃ）５’−AGATATAGGGCATTAAT−３’（配列番号４）を５’末端側に含み、そして３’末端側に、導入される構造遺伝子に機能可能に連結したプロモーター配列の５’末端側の８〜３３塩基の配列を含む、プライマー；
からなる群より選択される、前記プライマー。
【請求項１３】
ＭｙｏＤ遺伝子を導入される構造遺伝子として含む、組換えアデノウイルスベクター。
【請求項１４】
間葉系幹細胞の筋分化を誘導する方法であって、ＭｙｏＤ遺伝子を導入される構造遺伝子として含む組換えアデノウイルスを間葉系幹細胞に感染させることを含む、前記方法。
【請求項１５】
組換えアデノウイルスを、少なくともＭＯＩ＝２０ｐｆｕ／ｃｅｌｌで感染させる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１】
組換えアデノウイルスを構築する方法であって、以下の工程
（１）アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体を、導入遺伝子挿入部位で切断する；
（２）導入遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製する、ここで該ＤＮＡ断片は、その５’末端および３’末端に、それぞれ前記ＤＮＡ−タンパク質複合体における導入遺伝子挿入部位の上流側および下流側の１０〜１００塩基の配列と相同な配列を有し、そしてその間に導入遺伝子の塩基配列を含む；
（３）工程（２）で調製した導入遺伝子を含むＤＮＡ断片と、工程（１）で調製した外導入遺伝子挿入部位で切断されたＤＮＡ−タンパク質複合体とを、相同組換えにより連結して、導入遺伝子が挿入されたアデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体を得る；
（４）工程（３）で得られた導入遺伝子が挿入されたアデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体をヒト２９３細胞に遺伝子導入する；
（５）工程（４）で遺伝子導入したヒト２９３細胞を培養して、組換えアデノウイルスをウイルスプラークとして得る；
を含む、前記方法。
【請求項２】
導入遺伝子を含むＤＮＡ断片の５’末端および３’末端の配列が、それぞれ、アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体における導入遺伝子挿入部位の上流側および下流側の１０〜５０塩基の配列と相同な配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
導入遺伝子を含むＤＮＡ断片の５’末端および３’末端の配列が、それぞれ、アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体における導入遺伝子挿入部位の上流側および下流側の１０〜２０塩基の配列と相同な配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
相同組換えが、リコンビナーゼおよび相同組換えの促進タンパク質の存在下で行われる、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体が、ＡＶＣ２．ｎｕｌｌ（配列番号１）を含む、請求項１ないし３いずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体がＡＶＣ２．ｎｕｌｌ（配列番号１）を含み、そして外来遺伝子挿入部位の上流側および下流側がそれぞれＡＶＣ２．ｎｕｌｌのマルチプルクローニングサイト中のＸｂａＩおよびＮｓｐＶ制限酵素サイトである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体がＡＶＣ２．ｎｕｌｌ（配列番号１）を含み、外来遺伝子挿入部位の上流側および下流側がそれぞれＡＶＣ２．ｎｕｌｌにおけるＣＭＶプロモーターの上流側のＰａｃＩ制限酵素サイトおよびマルチプルクローニングサイト中のＮｓｐＶ制限酵素サイトであり、そして、導入遺伝子が構造遺伝子およびそれに機能可能に連結したプロモーター配列を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体がＡＶＣ２．ｎｕｌｌ（配列番号１）を含み、外来遺伝子挿入部位の上流側および下流側がそれぞれＡＶＣ２．ｎｕｌｌのマルチプルクローニングサイト中のＸｂａＩおよびＮｓｐＶ制限酵素サイトであり、そして、導入遺伝子を含むＤＮＡ断片の５’末端および３’末端の配列が、それぞれ、アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体における導入遺伝子挿入部位の上流側および下流側の１５塩基の配列と相同な配列である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
導入遺伝子が挿入されたアデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体を構築する方法であって、以下の工程：
（１）アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体を、導入遺伝子挿入部位で切断する；
（２）導入遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製する、ここで該ＤＮＡ断片は、その５’末端および３’末端に、それぞれ前記ＤＮＡ−タンパク質複合体における導入遺伝子挿入部位の上流側および下流側の１０〜１００塩基の配列と相同な配列を有し、そしてその間に導入遺伝子の塩基配列を含む；
（３）工程（２）で調製した導入遺伝子を含むＤＮＡ断片と、工程（１）で調製した外導入遺伝子挿入部位で切断されたＤＮＡ−タンパク質複合体とを、相同組換えにより連結して、導入遺伝子が挿入されたアデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体を得る；
を含む、前記方法。
【請求項１０】
導入遺伝子を含むＤＮＡ断片の５’末端および３’末端の配列が、それぞれ、アデノウイルスＤＮＡ−タンパク質複合体における導入遺伝子挿入部位の上流側および下流側の１０〜２０塩基の配列と相同な配列である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
相同組換えが、相同組換えの促進タンパク質の存在下で行われる、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法に用いるための、２５塩基ないし５０塩基からなるプライマーであって、以下：
（ａ）５’−TTATCGAAATTCTAG−３’（配列番号２）を５’末端側に含み、そして３’末端側に、導入される構造遺伝子の５’末端側の１０〜３５塩基の配列を含む、プライマー；
（ｂ）５’−GACGTACGCCCTTCG−３’（配列番号３）を５’末端側に含み、そして３’末端側に、導入される構造遺伝子の３’末端側の１０〜３５塩基の配列を含む、プライマー；および
（ｃ）５’−AGATATAGGGCATTAAT−３’（配列番号４）を５’末端側に含み、そして３’末端側に、導入される構造遺伝子に機能可能に連結したプロモーター配列の５’末端側の８〜３３塩基の配列を含む、プライマー；
からなる群より選択される、前記プライマー。
【請求項１３】
ＭｙｏＤ遺伝子を導入される構造遺伝子として含む、組換えアデノウイルスベクター。
【請求項１４】
間葉系幹細胞の筋分化を誘導する方法であって、ＭｙｏＤ遺伝子を導入される構造遺伝子として含む組換えアデノウイルスを間葉系幹細胞に感染させることを含む、前記方法。
【請求項１５】
組換えアデノウイルスを、少なくともＭＯＩ＝２０ｐｆｕ／ｃｅｌｌで感染させる、請求項１４に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１０−１４８４４０（Ｐ２０１０−１４８４４０Ａ）
【公開日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３３０８３８（Ｐ２００８−３３０８３８）
【出願日】平成２０年１２月２５日（２００８．１２．２５）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月２５日（２００８．１２．２５）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
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