組換えタンパク質の生産方法
【課題】遺伝子組換え微生物を高密度に培養し、効率良く（短時間で）組換えタンパク質を生産する方法を提供することである。特に、組換えタンパク質が酵素である場合には、高い活性を有する酵素を効率よく生産する方法を提供すること。
【解決手段】遺伝子組換え微生物を流加培養法により培養して組換えタンパク質を生産する方法であって、（ａ）初発培地が１５〜５０ｇ／Ｌの濃度で天然物由来複合培地成分を含有し、（ｂ）培養中の培地のｐＨの下限値が５．８〜６．５であり、且つ、ｐＨの上限値が「ｐＨの下限値＋０．６」以下であり、（ｃ）流加培地がグルタミン酸ナトリウムを含有することを特徴とする方法。
【解決手段】遺伝子組換え微生物を流加培養法により培養して組換えタンパク質を生産する方法であって、（ａ）初発培地が１５〜５０ｇ／Ｌの濃度で天然物由来複合培地成分を含有し、（ｂ）培養中の培地のｐＨの下限値が５．８〜６．５であり、且つ、ｐＨの上限値が「ｐＨの下限値＋０．６」以下であり、（ｃ）流加培地がグルタミン酸ナトリウムを含有することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子組換え微生物を用いた組換えタンパク質の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子組換え技術を利用して作製された遺伝子組換え微生物を培養することにより、微生物、動物又は植物等由来の様々な有用タンパク質が工業的規模で製造されている。遺伝子組換え微生物の宿主としては様々な種類の微生物が利用されているが、その中でも大腸菌は、増殖速度が速く、生化学的、遺伝子工学的、培養工学的知見等の蓄積が豊富であることなどから、組換えタンパク質生産に用いる遺伝子組換え微生物の宿主として広く利用されている。
【０００３】
また、目的タンパク質の生産性を高めるために、遺伝子組換え微生物を高密度で培養する方法が多く検討されている。遺伝子組換え微生物を培養する際には、栄養源として、炭素源、窒素源、無機物質、その他微量成分等が必要となるが、これらの栄養源は当該微生物の増殖に伴って消費され、栄養源が枯渇すると遺伝子組換え微生物の生育は停止する。従って、培地中の栄養源濃度を高くすることで、当該遺伝子組換え微生物を高密度に培養できることが期待される。
しかし、高濃度の栄養源を含有する培地で微生物を培養すると、当該微生物が生育阻害を受けたり、微生物の急激な増殖とともに酢酸などの生育阻害物質が産生されたりしてしまい、結果的には高密度培養を達成することが困難となることが多い。
この問題を解決するために、培養時間の経過に応じて連続的または断続的に培地を培養液中へ流加する流加培養が広く行われている。流加培養では、任意の培地成分を培養する微生物に好適な濃度で供給可能であるため、当該微生物を高密度で培養することが可能となる。
一方、微生物の培養において、培養中の培地のｐＨは重要な因子である。一般に、微生物にはそれぞれ生育に適したｐＨの範囲が存在するため、培養を行う際には培地のｐＨをそれぞれの微生物に適した値に制御することが必要である。例えば、有用タンパク質の生産を目的とした遺伝子組換え大腸菌の培養においても、培養中の培地のｐＨを６．８〜７．２に設定することが多く行われている（特許文献１、非特許文献１参照）。
また、培地中の栄養源の一つである窒素源としては、天然物（微生物、植物、動物乳または動物肉等）由来複合培地成分が多く用いられている。天然物由来複合培地成分は、種々の含窒素化合物をバランスよく含有するものが多く、微生物を培養する際の窒素源としての利用価値は高い。例えば、特許文献１では、窒素源として、天然物由来複合培地成分であるポリペプトンＮおよび酵母エキスを用いて、遺伝子組換え大腸菌の培養を行っている。
しかしながら、上述したような培地ｐＨ制御による培養方法、あるいは窒素源として天然物由来複合培地成分のみを含有する培地を用いた培養方法は、遺伝子組換え微生物を高密度で培養して有用タンパク質を効率よく生産するという目的の観点からは必ずしも十分な方法ではない。例えば、特許文献１では、遺伝子組換え大腸菌を比較的高密度で培養することには成功しているものの、目的有用タンパク質である酵素の活性は必ずしも高いものではない。更に、当該方法では、培養時間も比較的長時間（７１時間）に渡っており、さらなる効率的な培養方法の開発が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−２７８７９４号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２８，６３８−６４７，２００７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の主な目的は、遺伝子組換え微生物を高密度に培養し、効率良く（短時間で）組換えタンパク質を生産する方法を提供することである。特に、組換えタンパク質が酵素である場合には、高い活性を有する酵素を効率よく生産する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、培地成分と培養中の培地のｐＨを工夫することにより、遺伝子組換え微生物を短時間で高密度に培養することができ、組換えタンパク質を効率よく生産できること、特に、組換えタンパク質が酵素である場合には、高い活性を有する酵素を効率よく生産することができることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、遺伝子組換え微生物を流加培養法により培養して組換えタンパク質を生産する方法であって、
（ａ）初発培地が１５〜５０ｇ／Ｌの濃度で天然物由来複合培地成分を含有し、
（ｂ）培養中の培地のｐＨの下限値が５．８〜６．５であり、且つ、ｐＨの上限値が「ｐＨの下限値＋０．６」以下であり、
（ｃ）流加培地がグルタミン酸ナトリウムを含有すること
を特徴とする方法である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、遺伝子組換え微生物を短時間で高密度に培養することにより、組換えタンパク質を効率よく生産することができる。特に、組換えタンパク質が酵素である場合には、高い活性を有する酵素を効率よく生産することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
（１）遺伝子組換え微生物
本発明において、遺伝子組換え微生物とは、目的タンパク質をコードする遺伝子を細胞内に含有する微生物をいう。目的タンパク質とは、遺伝子組換え技術により産生される組換えタンパク質のことをいう。
当該微生物（宿主細胞）としては、目的タンパク質が発現できればその種類は限定されない。例えば、大腸菌、ロドコッカス属細菌、枯草菌、酵母、カビ等を挙げることができる。
【００１０】
大腸菌としては、大腸菌Ｋ１２株やＢ株等の野生株又は当該野生株由来の派生株であるＪＭ１０９株、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株、Ｃ６００株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、Ｗ３１１０株等を挙げることができる。ロドコッカス属細菌としては、例えばロドコッカス ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）ＡＴＣＣ １２６７４株やロドコッカス ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８）等を挙げることができる。酵母としては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）等を用いることができる。
【００１１】
これらの中でも、大腸菌及びロドコッカス属細菌が好ましく、大腸菌がより好ましい。大腸菌の中でもＷ３１１０株がより好ましい。遺伝子組換え操作を行い易く、また、細胞壁が強くないので産生された酵素を採取し易いからである。
（２）組換えタンパク質
組換えタンパク質とは、上記の遺伝子組換え微生物を用いて産生されるタンパク質をいう。本発明において、組換えタンパク質の種類は特に限定されず、大量、安価かつ効率的に生産させようとする目的タンパク質を適宜選択することができる。より詳細には、種々の酵素、ペプチド、構造タンパク質、抗体、サイトカインなどが挙げられる。これらタンパク質は、天然物あるいは自然界の生物より分離されうるアミノ酸配列を有するものに加え、該タンパク質を構成するアミノ酸配列において、意図的または非意図的なアミノ酸の欠失、付加、挿入、もしくは他のアミノ酸への置換が生じた、いわゆる変異体でもよい。目的タンパク質として選択し得る酵素の好適な例としては、例えば、産業上有用な酵素の一つであるハロヒドリンエポキシダーゼなどが挙げられる。
ハロヒドリンエポキシダーゼは、ハロヒドリンハイドロゲンハライドリアーゼ、ハロヒドリンデハロゲナーゼまたはハロアルコールデハロゲナーゼとも称され、後述するように、１，３−ジハロ−２−プロパノールをエピハロヒドリンに変換する活性およびその逆反応を触媒する活性（以下、「ハロヒドリンエポキシダーゼ活性」と称することがある）を有する酵素（ＥＣ ｎｕｍｂｅｒ： ４．５．１．−）である。
ハロヒドリンエポキシダーゼは、アミノ酸配列の相同性などから、３つのグループ（グループＡ、グループＢ及びグループＣ）に大別される（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １８３（１７），５０５８−５０６６，２００１）。
グループＡに属するハロヒドリンエポキシダーゼとしては、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ｎ−１０７４株由来のＨｈｅＡ（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８（８），１４５１−１４５７，１９９４）、アースロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）ＡＤ２株由来のＨｈｅＡＡＤ２（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １８３（１７），５０５８−５０６６，２００１）、アースロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）ＰＹ１株由来のＤｅｈ−ＰＹ１（Ｊ．Ｈｅａｌｔｈ．Ｓｃｉ．５０（６），６０５−６１２，２００４）などが挙げられる。
グループＢに属するハロヒドリンエポキシダーゼとしては、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ｎ−１０７４株由来のＨｈｅＢ（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８（８），１４５１（１９９４））、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＧＰ１株由来のＨｈｅＢＧＰ１（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １８３（１７），５０５８−５０６６，２００１）、アースロバクター エリシー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｒｉｔｈｉｉ）Ｈ１０ａ株由来のＤｅｈＡ（Ｅｎｚ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．２２，５６８−５７４，１９９８）などが挙げられる。
グループＣに属するハロヒドリンエポキシダーゼとしては、アグロバクテリウム ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）ＡＤ１株由来のＨｈｅＣ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １８３（１７），５０５８−５０６６，２００１）、アグロバクテリウム チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のＨａｌＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｖｉｅｗｅｒ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝ｐｒｏｔｅｉｎ＆ｖａｌ＝４９６００７６＃ｆｅａｔｕｒｅ＿４９６００７６）などが挙げられる。
上記のハロヒドリンエポキシダーゼは、いわゆる野生型ハロヒドリンエポキシダーゼである。本明細書中、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼとは、自然界の生物より分離されうるハロヒドリンエポキシダーゼを指し、該酵素を構成するアミノ酸配列において、意図的または非意図的なアミノ酸の欠失、付加、挿入、もしくは他のアミノ酸への置換がなく、天然由来の属性を保持したままのハロヒドリンエポキシダーゼを意味する。
上述した野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのうち、アミノ酸配列が明らかにされているものについては、米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ； Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ） により提供されるＧｅｎＢａｎｋデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ＣＭＤ＝ｓｅａｒｃｈ＆ＤＢ＝ｐｒｏｔｅｉｎ）において、以下のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．により登録されている。
Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＡＡ１４３６１（コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ｎ−１０７４株由来のＨｈｅＡのアミノ酸配列）
Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＫ９２１００（アースロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）ＡＤ２株由来のＨｈｅＡＡＤ２のアミノ酸配列）
Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＡＡ１４３６２（コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ｎ−１０７４株由来のＨｈｅＢのアミノ酸配列）
Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＫ７３１７５（マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＧＰ１株由来のＨｈｅＢＧＰ１ のアミノ酸配列）
Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＫ９２０９９（アグロバクテリウム ラジオバクターＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）ＡＤ１株由来のＨｈｅＣのアミノ酸配列）
Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＤ３４６０９（アグロバクテリウム チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のＨａｌＢのアミノ酸配列）。
本発明におけるハロヒドリンエポキシダーゼには、上記野生型ハロヒドリンエポキシダーゼに加え、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入または他のアミノ酸残基への置換が生じたハロヒドリンエポキシダーゼ（以下、「ハロヒドリンエポキシダーゼ変異体」と称することがある）をも含む。特に、ハロヒドリンエポキシダーゼ変異体のうち、酵素としての性能が向上したもの（改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ）は、本発明の方法により製造される好適なタンパク質の一例である。
改良型ハロヒドリンエポキシダーゼとしては、例えば、国際公開第２００８／１０８４６６号パンフレットに記載されているもの、すなわち、形質転換体あたりのハロヒドリンエポキシダーゼ活性、立体選択性、生成物阻害耐性、生成物蓄積能などが向上したもの等が挙げられる。これら改良型ハロヒドリンエポキシダーゼには、例えば、形質転換体あたりのハロヒドリンエポキシダーゼ活性が、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼよりも高くなる属性を有するもの、後述する基質１，３−ジハロ−２−プロパノールまたはエピハロヒドリンから、エピハロヒドリンまたは４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを生成させた場合の該生成物の光学純度が、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼにより同基質から同生成物を生成させた場合の該生成物の光学純度よりも高くなるという属性を有するもの、１，３−ジハロ−２−プロパノールまたはエピハロヒドリンからの生成物である塩化物イオンまたは４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルによる反応阻害に対する耐性が野生型ハロヒドリンエポキシダーゼよりも向上しているもの、基質１，３−ジハロ−２−プロパノールまたはエピハロヒドリンから、エピハロヒドリンまたは４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを生成させる場合に、生成物を高濃度生成および蓄積させることができるという属性を有するものなどが含まれる。
（３）遺伝子組換え微生物の作製
本発明において、遺伝子組換え微生物の作製方法は限定されず、公知の方法を使用することができる。ここでは、宿主として大腸菌を一例として記載する。
一般的に遺伝子組換え大腸菌を作製する方法としては、まず、目的タンパク質をコードする遺伝子を公知の手段により準備する。目的タンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片が取得済みであれば、そのままあるいはＰＣＲ法により増幅して用いることができる。異なるベクター上にクローニングされている場合は、目的タンパク質をコードする遺伝子部分を制限酵素を用いて切り出したり、ＰＣＲ法により増幅したりすることによって取得することができる。目的タンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片が単離されていない場合、目的タンパク質遺伝子の配列情報が明らかとなっていれば、目的タンパク質の遺伝子が含まれるような染色体ＤＮＡやＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲ法により増幅して取得することができる。
本発明において目的とするタンパク質は限定されないが、ここではハロヒドリンエポキシダーゼを一例として述べる。ハロヒドリンエポキシダーゼの場合、ＧｅｎＢａｎｋに公表されているハロヒドリンエポキシダーゼをコードする遺伝子（以下ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子と称する）、例えば、コリネバクテリウムｓｐ．（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）Ｎ−１０７４由来のハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子（ｈｈｅＢ； Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号は Ｄ９０３５０）の配列情報を基にプライマーを設計し、同菌株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことで、ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子を得ることができる。
続いて、プラスミドやファージ等のベクター上に目的タンパク質をコードする遺伝子を連結する。ベクター上には、目的タンパク質遺伝子が適切に転写、翻訳されるために必要な配列を適宜配置することが望ましい。例えば、目的タンパク質をコードする遺伝子の上流に転写プロモーターを、必要に応じて下流にターミネーターを配置したり、目的タンパク質遺伝子の上流に、ＳＤ配列を配置したりすることが好適である。
プロモーターの種類は宿主大腸菌において適切な発現を可能にするものであれば特に限定されるものではないが、例えば、トリプトファンオペロンのtrpプロモーター、ラクトースオペロンのlacプロモーター、ラムダファージ由来のPLプロモーターおよびPRプロモーターなどが挙げられ、tacプロモーター、trcプロモーターのように改変、設計された配列も利用できる。ターミネーターは必ずしも必要ではなく、その種類も特に限定されない。例えば、リポプロテインターミネーター、trpオペロンターミネーター、rrnBターミネーター等が挙げられる。
ＳＤ配列としては、大腸菌細胞内で機能する配列であれば特に限定されるものではなく、大腸菌において本来適切に発現している遺伝子のＳＤ配列や、16SリボゾームRNAの３’末端領域に相補的な配列が４塩基以上連続したコンセンサス配列等を利用することができる。ベクターに目的タンパク質遺伝子を挿入する方法としては、制限酵素を用いる方法、トポイソメラーゼを用いる方法等を利用することができる。挿入の際、必要であれば、適当なリンカー配列等を付加してもよい。
また、一般に、ベクターには目的とする遺伝子組換え大腸菌を選別するための選択マーカーが含むことができる。選択マーカーとしては、薬剤耐性遺伝子や栄養要求性相補遺伝子、資化性付与遺伝子などが挙げられ、目的や宿主に応じて選択されうる。
大腸菌で選択マーカーとして用いられる薬剤耐性遺伝子としては、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。続いて、構築した発現ベクターを大腸菌に導入する。本発明においては、このような操作を「形質転換」、得られた遺伝子組換え大腸菌を「形質転換体」と呼ぶことがある。大腸菌への発現ベクターの導入方法、すなわち形質転換の方法としては、大腸菌にＤＮＡが導入される方法であれば特に限定されるものではないが、例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
（４）遺伝子組換え微生物の培養（本培養）
（４−１）培地
培地とは、遺伝子組換え微生物の培養において生育環境を提供するものをいい、具体的には、水等の水性媒体中に炭素源、窒素源、無機塩類等を溶解したものをいう。「初発培地」とは、後述する流加培養方式によって培養を行う場合において、前培養（シード）が接種されて培養（本培養）が開始される培地をいう。「流加培地」とは、初発培地による培養を開始した後に、培養時間の経過に応じて連続的または断続的に初発培地へ継ぎ足される培地をいう。
初発培地も流加培地も滅菌して培養に使用するのが好ましい。当該培地の滅菌方法は、培地を、増殖能力のある微生物等が存在しない無菌状態にすることができる方法であれば限定されない。例えば、加圧滅菌（オートクレーブ；例えば１２１℃、２０分間の加熱滅菌）やろ過滅菌（例えば孔径０．４５μｍまたは０．２μｍのフィルターによるろ過）等による滅菌方法が挙げられる。加熱滅菌の際に培地成分同士の反応が懸念される場合には、１種類以上の培地成分を、それ以外の培地成分とは別に滅菌し、各々を滅菌後に混合してもよい。
本発明において、遺伝子組換え微生物の培養に使用する培地は、当該微生物が資化しうる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、当該微生物が短時間で高密度に培養され、組換えタンパク質を効率よく生産することができる培地であればよい。窒素源以外の各成分の量も限定されず、当業者が適宜選択することができる。
（４−１−１）初発培地
本発明の初発培地において、窒素源としては、少なくとも天然物（微生物、植物、動物乳または動物肉等）由来の複合培地成分を用い、さらに塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩；アンモニア；その他アミノ酸や窒素化合物等を用いることができる。天然物由来複合培地成分としては、例えば、ペプトン（牛乳、獣肉、魚肉あるいは大豆タンパク質等由来）、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカー等が挙げられ、これらの中でも酵母エキスが好ましい。
本発明で使用する培地は、窒素源として天然物由来複合培地成分を含有する。当該天然物由来複合培地成分の量（本培養開始時点）は、１５〜５０ｇ／Ｌ、好ましくは１８〜４０ｇ／Ｌ、より好ましくは２０〜３０ｇ／Ｌとする。天然物由来複合培地成分の量を１５ｇ／Ｌ以上とすることにより、遺伝仕組換え微生物を高密度に培養することができる。また、５０ｇ／Ｌ以下とするのは、それ以上培地に添加しても使用量に比して効果が低いからである。
炭素源としては、グルコース、ガラクトース、フラクトース、スクロース、ラフィノース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。これらの中でも、グルコース、フラクトース、ガラクトース等の糖類が好ましく、フラクトースがより好ましい。
無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。
本発明の初発培地には、必要に応じて、上記の成分以外の成分を添加することもできる。その成分や量についても当業者が適宜選択することができる。例えば、ビタミン等、培養中の培地の発泡を防ぐために消泡剤を等も添加してもよい。さらに、ベクターおよび目的遺伝子の脱落を防ぐために選択圧をかけた状態で培養してもよい。すなわち、選択マーカーが薬剤耐性遺伝子である場合には、相当する薬剤を培地に添加してもよい。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を含む遺伝子組換え微生物を培養する場合には、培地にアンピシリンを添加してもよい。
（４−１−２）流加培地
本発明では、大量の（高密度の）微生物を培養するため、培養中に（培養過程において）初発培地に流加培地を添加する。
流加培地の成分は、培養中の微生物の生育速度が十分に保たれれば限定されない。本発明においては、初発培地と同様の成分を使用することができる。例えば、炭素源、窒素源等、無機塩類、必要に応じてその他の成分を添加することができる。
流加培地の各成分の量も、培養中の微生物の生育速度が十分に保たれれば限定されず、当業者が適宜選択することができる。窒素源の濃度については、培養中の培地中の濃度が上記の濃度に保たれるように、流加培地を調製すればよい。窒素源としては、天然物由来複合培地成分を含有することが好ましく、その濃度としては５０〜３００ｇ／Ｌ、好ましくは８０〜２５０ｇ／Ｌ、より好ましくは１００〜２００ｇ／Ｌである。天然物由来複合培地成分の量を５０ｇ／Ｌ以上とすることにより、遺伝仕組換え微生物を高密度に培養することができる。また、３００ｇ／Ｌ以下とするのは、それ以上培地に添加しても使用量に比して効果が低いからである。
本発明においては、流加培地はグルタミン酸塩を必須成分とする。グルタミン酸塩を含む流加培地を培養中の培地に添加することにより、遺伝子組換え微生物の生育・増殖速度が保たれるだけでなく、活性の高い酵素が産生されるからである。
本発明で使用するグルタミン酸塩は、Ｄ体、Ｌ体又はラセミ体のいずれのものも使用することができる。また、グルタミン酸が有する２つのカルボキシル基のうちどちらか一方が塩を形成していてもよいし、両方のカルボキシル基が塩を形成していてもよい。塩としては、ナトリウム、カリウム等が例示できる。好ましくは、グルタミン酸ナトリウム（２−アミノペンタン二酸ナトリウム）であり、より好ましくは、そのＬ体のものである。
添加する流加培地中のグルタミン酸塩の濃度は、遺伝子組換え微生物の生育・増殖が十分に行われれば限定されない。例えば、流加培地に含まれる天然物由来複合成分の質量濃度に対して０．５〜１．５倍の質量濃度、好ましくは０．６〜１．４倍の質量濃度、より好ましくは０．７〜１．３倍の質量濃度とすればよい。０．５倍の質量濃度以上とするのは、微生物の生育・増殖速度が保持される効果が十分に得られるからであり、１．５倍の質量濃度以下とするのは、それ以上添加しても顕著な効果が得られにくいからである。
添加する流加培地の体積は、遺伝子組換え微生物の生育が十分に行われれば限定されないが、例えば、初発培地の体積の０．１倍以上１倍以下の体積とすればよく、好ましくは初発培地の体積の０．１５倍以上０．７５倍以下の体積、より好ましくは初発培地の体積の０．２倍以上０．５倍以下の体積である。０．１倍以上とするのは、遺伝仕組換え微生物を高密度に培養することができるからである。また、３００ｇ／Ｌ以下とするのは、それ以上培地に添加しても使用量に比して効果が低いからである。
（４−２）培養方法
本発明では、遺伝子組換え微生物を高密度に培養することができる。高密度とは、単位体積当たりの菌濃度が高い状態と換言される。菌濃度は、波長６３０ｎｍにおける光学密度（以下、ＯＤ６３０と称する）や、乾燥菌体重量濃度によって表される。すわなち、本発明において高密度に培養された状態とは、培養終了時における培養液のＯＤ６３０の値が５０程度以上、好ましくは７０程度以上、さらに好ましくは９０程度以上である状態をいう。あるいは、培養終了時における培養液の乾燥菌体重量濃度が２０ｇ／Ｌ程度以上、好ましくは３０ｇ／Ｌ程度以上、さらに好ましくは４０ｇ／Ｌ程度以上である状態をいう。
（４−２−１）培養方式
本発明の培養方式は、流加培養方式（Ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）である。流加培養方式とは、培養中の培地（例えば、初発培地）に培地を連続的又は断続的に流加（添加）し、培養終了時まで培地を容器から抜き取らない培養方法をいう。
流加培地を添加していく方法（ｆｅｅｄｉｎｇ ｍｏｄｅ）としては、遺伝子組換え微生物が短時間で高密度に培養され、組換えタンパク質を効率よく生産することができる方法であればいかなる方法でもよい。例えば、定流的流加法（ｃｏｎｓｔａｎｔ）、指数的流加法（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ）、段階的増加流加法（ｓｔｅｐｗｉｓｅ ｉｎｃｒｅａｓｅ）、比増殖速度制御流加法（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｒｏｗｔｈ−ｒａｔｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）、ｐＨスタット流加法（ｐＨ−ｓｔａｔ）、ＤＯスタット流加法（ＤＯ−ｓｔａｔ）、グルコース濃度制御流加法（ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ）、酢酸濃度モニタリング流加法（ａｃｅｔａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）等が挙げられる。
流加培地を添加するタイミングとしては、培養中の微生物の生育・増殖が保たれれば限定されない。例えば、初発培地中の炭素源が、８０〜９９．９％消費された時点、好ましくは８５〜９９．５％消費された時点、より好ましくは９０〜９９％消費された時点に、添加を開始すればよい。８０％以上消費された時点で流加培地を添加するのは、流加培地を添加することによる短時間で高密度に微生物を培養できる（高活性なタンパク質を効率よく得ることができる）という効果を得ることができるからである。また、９９．９％以下とするのは、それ以上炭素源が消費された状態で流加培地を添加しても、当該効果が得られないことがあるからである。
あるいは、培養が進むにつれて初発培地中の溶存酸素濃度が低下していくが、当該溶存酸素濃度が培養開始時の初期培地中の溶存酸素濃度の８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上に回復した時点で、流加培地を添加することもできる。
流加培地を添加する量及び速度は、培養中の培地中において上記の窒素源の濃度が保たれ、遺伝子組換え微生物の生育・増殖が十分に保たれれば限定されない。例えば、培地の成分の濃度を濃くすれば添加する流加培地の量は少なくて済むので好ましい。
（４−２−２）ｐＨ
培養中（本培養）の培地のｐＨは、ｐＨの下限値を５．８〜６．５、好ましくは６．０〜６．５とする。当該範囲のｐＨで培養することにより、短時間で高密度に微生物を培養できる（高活性なタンパク質を効率よく得ることができる）からである。一方、ｐＨの上限値は「ｐＨの下限値＋０．６以下」、好ましくは「ｐＨの下限値＋０．０１以上０．５８以下」、より好ましくは「ｐＨの下限値＋０．０５以上０．５５以下」である。
本発明中においてｐＨの下限値とは、培養中に制御するｐＨの下限の値であり、ｐＨがその値を下回りそうになるとアルカリを添加して上昇させればよい。また、ｐＨの上限値とは、培養中に制御するｐＨの上限の値であり、ｐＨがその値を上回りそうになると酸を添加して下降させればよい。
培養中のｐＨ制御には、無機または有機の酸、アルカリ溶液を用いることができる。酸は、無機酸の使用が好ましく、例えば、硫酸、リン酸、塩酸、硝酸などが挙げられる。アルカリとしては、水酸化ナトリウムやアンモニアなどが挙げられる。
（４−２−３）その他条件
本発明の培養の形態は、遺伝子組換え微生物が短時間で高密度に培養され、組換えタンパク質を効率よく生産することができる形態であればいかなるものでもよい。宿主として大腸菌を使用する場合は、通気攪拌培養（ジャーファーメンター）による好気的条件下での培養が好ましい。
培養温度は、遺伝子組換え微生物が十分に生育・増殖すれば限定されない。例えば、１０℃〜４５℃、好ましくは１５℃〜４０℃、より好ましくは２０℃〜３７℃とすることができる。必要に応じて培養中に温度を変更することもできる。
培養中の圧力については限定されない。大気圧で培養することもできるし、必要に応じて加圧下で培養してもよい。圧力としては、例えば、０〜０．１ＭＰａ、好ましくは０．０１〜０．０５ＭＰａを加圧した状態で培養することができる。加圧することにより、培地中の溶存酸素濃度が上昇するため、培養終了後の菌濃度や液活性がより高くなる。
培養時間は微生物が十分に高濃度に生育・増殖している限り限定されない。例えば、５〜１２０時間、好ましくは１０〜１００時間、さらに好ましくは１５〜８０時間、さらにより好ましくは２０〜６０時間程度とすればよい。また、培養の終了時期についても特には限定されないが、微生物の増殖が定常期に達してから終了すればよい。
また、本発明では、必要に応じて前培養を行うこともできる。前培養とは、遺伝子組換え微生物を高密度に培養しようとする培養（本培養）に接種するためのシード（種）を調製するための培養である。前培養を適切に行うことにより、本培養のシードとして必要な菌体量を確保することができる。前培養に用いる培地は、本培養における遺伝子組換え微生物の高密度培養を達成しうるものであれば特段限定されない。例えば、本培養の初発培地と同様の炭素源、窒素源等、無機塩類を含有することができ、必要に応じてその他の成分を添加することもできる。前培養時の培養温度やｐＨ、圧力、培養時間についても、本培養における遺伝子組換え微生物の生育を妨げる条件でなければよい。培養温度は、例えば、１０℃〜４５℃、好ましくは１５℃〜４５℃、より好ましくは２０℃〜３７℃とすればよい。培養中の培地のｐＨは、本培養と同様に酸やアルカリを用いて一定範囲の値に制御してもよいが、必ずしもその必要はなく、例えば、培地調製時に培地のｐＨを５〜９、好ましくは６〜８、より好ましくは６．５〜７．５の値に調整し、培養中はｐＨ制御をせずに培養を行ってもよい。圧力は、大気圧で培養してもよく、必要に応じて、０〜０．１ＭＰａ、好ましくは０．０１〜０．０５ＭＰａを加圧して培養を行うこともできる。培養時間は、本培養において遺伝子組換え微生物が高密度に培養されるために必要な菌体量が得られる時間とすればよく、特段限定されない。例えば、０．５〜２４時間、好ましくは１〜１２時間、より好ましくは３〜９時間とすればよい。本明細書では特に断らなければ、本培養を指すものとする。
【００１２】
（５）組換えタンパク質の取得
本発明により、遺伝子組換え微生物は高密度に培養され、多量（高濃度）のタンパク質が生産される。特に、目的タンパク質が酵素である場合は、高い活性を有するタンパク質を高収量で得ることができる。
組換えタンパク質は、遺伝子組換え微生物の菌体外に生産されてもよく、遺伝子組換え微生物の菌体内に蓄積されてもよい。組換えタンパク質が遺伝子組換え微生物の菌体外に生産される場合は、公知の方法により、必要に応じて培地から組換えタンパク質を単離・精製することができる。
また、組換えタンパク質が遺伝子組換え微生物の菌体内に蓄積される場合は、遺伝子組換え微生物を遠心分離やろ過等の公知の手段によって回収し、高圧処理、超音波処理、界面活性剤等の化学物質処理等によって菌体を破砕することにより、組換えタンパク質を得ることができる。必要に応じ、破砕された菌体を除去するなどして、組換えタンパク質をさらに単離・精製することができる。
組換えタンパク質の単離・精製には、珪藻土等を用いたろ過、疎水クロマトグラフィー（例えばｂｕｔｙｌ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）、陰イオンクロマトグラフィー（例えばＭｏｎｏ Ｑカラム）、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動等を単独で又は適宜組み合わせて行うことができる。また、組換えタンパク質は、適当な担体に保持し固定化タンパク質として使用することもできる。
（６）組換えタンパク質の使用
得られた組換えタンパク質は、所望の用途に使用することができる。特に、組換えタンパク質が酵素である場合には、当該酵素が触媒し得る反応の触媒として使用することができる。以下、ハロヒドリンエポキシダーゼを一例として、組換えタンパク質について述べる。
ハロヒドリンエポキシダーゼは、１，３−ジハロ−２−プロパノールから光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル（特開平０３−０５３８８９号公報、特開２００１−２５３９７号公報）、エピハロヒドリンから光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル（特開平０３−０５３８９０号公報）を製造することができる。
従って、本発明方法により産生された高活性のハロヒドリンエポキシダーゼを、シアン化 合物存在下、１，３−ジハロ−２−プロパノール又はエピハロヒドリンと接触させることで、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルへ変換することができる。
ここで、１、３−ジハロ−２−プロパノールとは、下記一般式（１）で示される化合物である。
【００１３】
【化１】
（式中、Ｘ１、Ｘ２はハロゲン原子）
ハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が好ましく、塩素、臭素が特に好ましい。具体的には１，３−ジフルオロ−２−プロパノール、１，３−ジクロロ−２−プロパノール（以下、「ＤＣＰ」と称することがある）、１，３−ジブロモ−２−プロパノール、１，３−ジヨード−２−プロパノール等が挙げられ、好ましくは、１，３―ジクロロ−２−プロパノール、１，３−ジブロモ−２−プロパノールである。
また、エピハロヒドリンとは、下記一般式（２）で示される化合物である。
【００１４】
【化２】
（式中、Ｘはハロゲン原子）
ハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が好ましく、塩素、臭素が特に好ましい。具体的にはエピフルオロヒドリン、エピクロロヒドリン（以下、「ＥＣＨ」と称することがある）、エピブロモヒドリン、エピヨードヒドリン等が挙げられ、特に好ましくはエピクロロヒドリン、エピブロモヒドリンである。
また、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルとは、下記一般式（３）で示される化合物である。
【００１５】
【化３】
（式中、Ｘはハロゲン原子）
ハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が好ましく、塩素、臭素が特に好ましい。具体的には４−フルオロ−３−ヒドロキシブチロニトリル、４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル（以下、「ＣＨＢＮ」と称することがある）、４−ブロモ−３−ヒドロキシブチロニトリル、４−ヨード−３−ヒドロキシブチロニトリル等が挙げられ、好ましくは、４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル、４−ブロモ−３−ヒドロキシブチロニトリルである。
なお、エピハロヒドリンは種々の医薬品や生理活性物質の合成原料として有用な物質である。例えば、（Ｒ）−エピハロヒドリンの開環シアノ化によって得られる（Ｒ）−（−）−４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルは、Ｌ−カルニチンの合成原料として有用であることが知られている（特開昭５７−１６５３５２号公報）。
シアン化合物としては、シアン化水素、シアン化カリウム、シアン化ナトリウム、シアン酸又はアセトンシアンヒドリン等の反応液中に添加した際にシアンイオン（ＣＮ−）又はシアン化水素を生じる化合物又はその溶液を用いることができる。
「ハロヒドリンエポキシダーゼ活性」は、単位時間あたりの１，３−ジハロ−２−プロパノールからのエピハロヒドリン生成量または塩化物イオン生成量を測定することにより求めることができる。エピハロヒドリン生成量は、例えば、液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィーなどによって定量することができる。また、塩化物イオン生成量は、例えば、その塩化物イオンの生成に伴って低下するｐＨをある一定の値に保つように連続的または断続的にアルカリ溶液を添加し、時間あたりに要したアルカリの量から便宜的に求めることができる。また、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼに対する抗体を作製し、ウェスタンブロットやＥＬＩＳＡ法などの免疫学的手法によっても推定することが可能である。その他、ハロヒドリンエポキシダーゼ活性が形質転換体内における発現量と比例すると仮定する場合は、ハロヒドリンエポキシダーゼ活性が既知であるサンプルと比較することなどにより、ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどの分析手段によっても間接的に推定することができる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは当業者であれば公知の方法を用いて行うことができる。
本明細書中、「形質転換体あたりのハロヒドリンエポキシダーゼ活性」とは、「形質転換体乾燥菌体単位質量あたりのハロヒドリンエポキシダーゼ活性」を意味し、「菌体比活性」とも称する。「液活性」とは、単位溶液量あたりのハロヒドリンエポキシダーゼ活性を意味する。
ハロヒドリンエポキシダーゼを酵素として使用する際の基質濃度は、酵素安定性の観点から０．０１〜１５（Ｗ／Ｖ）％が好ましく、０．０１〜１０（Ｗ／Ｖ）％がより好ましい。また、シアン化合物の使用量は、酵素安定性の観点から基質の１〜３倍量（モル）が好ましい。
溶媒としては、水又は緩衝液を使用することができる。緩衝液としては、例えば、リン酸、ホウ酸、クエン酸、グルタル酸、リンゴ酸、マロン酸、ｏ−フタル酸、コハク酸又は酢酸等の塩等によって構成される緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、グッド緩衝液等を使用することができる。
反応温度は酵素反応が十分に進む温度であれば限定されない。例えば、５〜５０℃、より好ましくは１０〜４０℃とすればよい。反応中の反応液のｐＨも酵素反応が十分に進むｐＨであれば限定されない。例えば、４〜１０、好ましくはｐＨ６〜９とすればよい。
反応時間も限定されず、基質等の濃度、菌体濃度、その他の反応条件等によって当業者が適時選択することができる。例えば、１〜１２０時間、好ましくは５〜１００時間とすればよい。なお、本反応においては、反応の進行に伴い生成する塩素イオンを反応系内から取り除くことにより、光学純度をより一層向上させることができる。この塩素イオンの除去は、硝酸銀等の添加によって行うことができる。
反応液中に生成した組換えタンパク質は、公知の方法を用いて採取、精製することができる。例えば、生成物が４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの場合は、遠心分離により反応液から菌体を除去した後、酢酸エチル等の溶媒で抽出を行い、減圧下に溶媒を除去することにより４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルのシロップを得ることができる。これらのシロップを減圧下に蒸留することによりさらに精製することもできる。
【実施例】
【００１６】
特開２００８−２７８７９４号公報記載の方法により調製した微生物形質転換体Ｗ３１１０／ｐＳＴＫ００２−Ｔ１３３Ａ＋Ｆ１３６Ｓ＋Ｄ１９９Ｈを使用し、培養を以下のように行った。
【００１７】
＜実施例１＞
前培養
Ｗ３１１０／ｐＳＴＫ００２−Ｔ１３３ＡＦ１３６Ｓ＋Ｄ１９９Ｈのコロニーを、５００ｍＬフラスコ中に調製した１００ｍＬの前培養培地（酵母エキス ２５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム １．５ｇ／Ｌ、アンピシリンナトリウム ０．１ｇ／Ｌ；ｐＨ７．２）に植菌し、温度３７℃、回転数２１０ｒｐｍにて、６時間振とう培養を行った。
前培養培地は、アンピシリンナトリウム以外の各成分必要量を水に溶解して１００ｍＬにメスアップした後に加熱滅菌（１２１℃、２０分間）を行い、室温に冷却後、予め０．２０μｍのフィルターでろ過除菌しておいたアンピシリンナトリウム水溶液（１００ｇ／Ｌ）を無菌条件下にて１００μＬ添加して調製した。
本培養
得られた前培養液のうち１６ｍＬを、３Ｌジャーファーメンター中に調製した１．６Ｌの本培養初発培地（フルクトース ４０ｇ／Ｌ、酵母エキス ２５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム １．５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物 ２．３７５ｇ／Ｌ、硫酸マンガン五水和物 ０．２ｇ／Ｌ、塩化カルシウム二水和物 ０．０２ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛七水和物 ０．０２ｇ／Ｌ、アンピシリンナトリウム ０．１ｇ／Ｌ、プルロニックＬ−６１（株式会社ＡＤＥＫＡ 日本） ０．５ｇ／Ｌ）に植菌し、温度３７℃、回転数５００ｒｐｍ、通気量２Ｌ／ｍｉｎ、圧力０．０５ＭＰａ、ｐＨの下限値を６．０、ｐＨの上限値を「ｐＨの下限値＋０．５」である６．５とし（水酸化ナトリウム２５％水溶液及び硫酸２４％水溶液を使用）、培養を行った。
本培養初発培地は、必要量のフルクトースを水に溶解して４００ｍＬにメスアップした後に加熱滅菌（１２１℃、２０分間）したものと、フルクトース及びアンピシリンナトリウム以外の各成分必要量を水に溶解して１．２Ｌにメスアップした後に加熱滅菌（１２１℃、２０分間）したものとを無菌条件下で混合し、室温に冷却した後、予め０．２０μｍのフィルターでろ過除菌しておいたアンピシリンナトリウム水溶液（１００ｇ／Ｌ）を１．６ｍＬ添加して調製した。
流加培地の添加
培養開始約２２時間後、すなわち、フルクトースが９７．５％消費された時点（培養中の培地中の溶存酸素濃度が約１０ｐｐｍとなった時点）に、２５ｗ／ｗ％リン酸水素二カリウム水溶液を１８ｍＬ添加し１１．２５ｇ／Ｌにした後、続いて約１７ｍＬ／ｈｒの一定速度で本培養流加培地（フルクトース ３００ｇ／Ｌ、酵母エキス １８７．５ｇ／Ｌ、グルタミン酸ナトリウム １６６．８８ｇ／Ｌ）の添加を開始した。
２５％ｗ／ｗリン酸水素二カリウム水溶液は、２０ｇのリン酸水素二カリウムを６０ｇの水に溶解した後に、０．２μｍのフィルターでろ過除菌し、無菌条件下でピペットにて１８ｍＬ取り調整した。
本培養流加培地は、各成分の必要量を予め水に溶解して上記濃度となるようメスアップした後、別途予め加熱滅菌（１２１℃、２０分間）しておいた混合セルロース製フィルター（アドバンテック（株） 日本）、および加圧ろ過器を用いて無菌条件下で加圧ろ過（０．２ＭＰａ）を行い、室温に冷却して調整した。
培養中は適時サンプリングを行いながら、計４６時間培養を行った。流加培地は、培養開始２２時間後から培養終了の約４６時間後までで、合計４００ｍｌ添加した。培養中の溶存酸素濃度は、培養開始約１０時間前後において１ｐｐｍ前後にまで低下したのち１０ｐｐｍ前後まで回復した。流加培地を添加してからは再度低下して、大部分の時間は１ｐｐｍから５ｐｐｍの間で推移した。
培養のｐＨは、約１０時間前後まではほぼ６．０に保たれた後、６．０〜６．５で推移し、流加培地を添加してからは６．５に保たれた。得られた培養液について、菌濃度を測定した。菌濃度の測定は、６３０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６３０）を測定することで行った。
酵素（組換えタンパク質）の調製
培養液５ｍＬを、６，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行った。上清を除去し、得られた湿菌体５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−硫酸（ｐＨ８）を加えＯＤ６３０＝２２．６とし、均一になるよう再懸濁して菌体懸濁液を得た。得られた菌体懸濁液を、超音波破砕機ＶＰ−３００（タイテック株式会社、日本）を用いて破砕処理を行い、菌体破砕液を得た。
酵素反応
得られた菌体破砕液１ｍＬを、１５，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行った。得られた上清を粗酵素液とし、以下のようにハロヒドリンエポキシダーゼ活性を測定した。
１００ｍＬの活性測定用反応液（５０ｍＭ ＤＣＰ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−硫酸（ｐＨ８））を調製して、温度を２０℃に調整した。該反応液に、適宜希釈した粗酵素液を添加し、反応を開始した。
ハロヒドリンエポキシダーゼ活性による塩化物イオンの遊離に伴うｐＨの低下を、ｐＨ自動コントローラを用い、０．０１規定の水酸化ナトリウム水溶液を用いて、ｐＨを８に保つよう連続的に調整した。１０分間の反応の間に、ｐＨを８に保つために投入された０．０１規定の水酸化ナトリウム水溶液の量から、塩化物イオン生産量を算出し、ハロヒドリンエポキシダーゼ活性（Ｕ）を算出した。
１Ｕは上記条件下でＤＣＰから１分間あたり１μｍｏｌ塩化物イオンを脱離する酵素量に相当するものと定義した。粗酵素液の液活性から培養液換算の液活性を算出した。また、後述する比較例で得られた菌濃度及び液活性を１００％として、相対菌濃度および相対液活性を算出した。結果を表１に示す。
＜実施例２＞
本培養時のｐＨの下限値を５．８に、ｐＨの上限値を「ｐＨの下限値＋０．４」である６．２にし、ｐＨ制御に用いる酸を４０ｗ／ｗ％リン酸とする以外は、実施例１と同様な方法によって培養を実施した。得られた培養液について、実施例１と同様の方法で菌濃度、液活性を測定し、比較例で得られた菌濃度及び液活性を１００％として、相対菌濃度および相対液活性を算出した。結果を表１に示す。
【００１８】
＜実施例３＞
本培養時のｐＨの下限値を６．５に、ｐＨの上限値を「ｐＨの下限値＋０．５」である７．０にする以外は、実施例１と同様の方法によって培養を実施した。得られた培養液について、実施例１と同様の方法で菌濃度、液活性を測定し、比較例で得られた菌濃度及び液活性を１００％として、相対菌濃度および相対液活性を算出した。結果を表１に示す。
＜比較例＞
本培養時のｐＨの下限値を７．２に、ｐＨの上限値を「ｐＨの下限値＋０．３」である７．５にする以外は、実施例１と同様な方法によって培養を実施した。得られた培養液は、実施例１と同様の方法で菌濃度、液活性を測定した。結果を表１に示す。
【００１９】
【表１】
表１に示すように、ｐＨの下限値を６．０、ｐＨの上限値を６．５にして行った培養（実施例１）における菌濃度（ＯＤ６３０）は１２７であり、ｐＨの下限値を７．２、ｐＨの上限値を７．５にして行った培養（比較例）における菌濃度（ＯＤ６３０＝８０）の約１．６倍であった。また、ｐＨの下限値を５．８、ｐＨの上限値を６．２にして行った培養（実施例２）およびｐＨの下限値を６．５、ｐＨの上限値を７．０にして行った培養（実施例３）における菌濃度（ＯＤ６３０）もそれぞれ１２７及び１３１であり、比較例における菌濃度（ＯＤ６３０）の約１．６倍であった。
【００２０】
さらに、実施例１における液活性は４，３２８Ｕ／ｍｌであり、比較例における活性（１，７１１Ｕ／ｍｌ）の約２．５倍であった。また、実施例２および実施例３における液活性はそれぞれ４，５５８Ｕ／ｍｌおよび５，０２４Ｕ／ｍｌであり、それぞれ、比較例における活性の約２．７倍、約２．９倍であった。
【００２１】
以上の結果から、グルタミン酸ナトリウムを含有する培地を用い、培養中のｐＨの下限値を５．８〜６．５にし、且つ、ｐＨの上限値を「ｐＨの下限値＋０．６」以下に制御することで、遺伝子組換え大腸菌を短時間で高密度に培養することができ、工業的に有用な組換えタンパク質を効率よく生産できること、特に、組換えタンパク質が酵素である場合には、高い活性を有する酵素を効率よく生産することができることが示された。
＜試験例１＞
実施例１で得られた粗酵素液を用いた、１，３−ジハロ−２−プロパノールおよびシアン化合物からの４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの製造
実施例１で得られたＷ３１１０／ｐＳＴＫ００２−Ｔ１３３Ａ＋Ｆ１３６Ｓ＋Ｄ１９９Ｈ粗酵素液を、シアン化カリウム（ＫＣＮ）存在下、１，３−ジクロロ−２−プロパノール（ＤＣＰ）と接触させることにより、４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル（ＣＨＢＮ）を以下のように製造した。
【００２２】
反応液基本組成は表２のようにし、反応スケールは２ｍＬで行った。
【００２３】
【表２】
反応は２０℃にて３時間行った。反応終了後、以下に示す分析条件により、反応液中のＤＣＰ、ＥＣＨおよびＣＨＢＮ濃度を分析した。
反応液中のＤＣＰ、ＥＣＨおよびＣＨＢＮ濃度分析
反応液中のＤＣＰ、ＥＣＨおよびＣＨＢＮ濃度分析は、逆相系ＨＰＬＣにより、行った。逆相系ＨＰＬＣ分析条件を表３に示す。
【００２４】
【表３】
反応終了液１００μＬを、上表記載の移動層４００μＬにより希釈混合した後、上表記載の分析条件により分析を行った。予め、濃度既知のＤＣＰ、ＥＣＨおよびＣＨＢＮ溶液を用いて検量線を作成し、該検量線を用いて反応液中のＤＣＰ、ＥＣＨおよびＣＨＢＮ濃度を求めた。結果を表４に示す。
【００２５】
【表４】
シアン化合物存在化、実施例１で得られた粗酵素液を１，３−ジハロ−２−プロパノールと接触させることで、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造できることが示された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子組換え微生物を用いた組換えタンパク質の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子組換え技術を利用して作製された遺伝子組換え微生物を培養することにより、微生物、動物又は植物等由来の様々な有用タンパク質が工業的規模で製造されている。遺伝子組換え微生物の宿主としては様々な種類の微生物が利用されているが、その中でも大腸菌は、増殖速度が速く、生化学的、遺伝子工学的、培養工学的知見等の蓄積が豊富であることなどから、組換えタンパク質生産に用いる遺伝子組換え微生物の宿主として広く利用されている。
【０００３】
また、目的タンパク質の生産性を高めるために、遺伝子組換え微生物を高密度で培養する方法が多く検討されている。遺伝子組換え微生物を培養する際には、栄養源として、炭素源、窒素源、無機物質、その他微量成分等が必要となるが、これらの栄養源は当該微生物の増殖に伴って消費され、栄養源が枯渇すると遺伝子組換え微生物の生育は停止する。従って、培地中の栄養源濃度を高くすることで、当該遺伝子組換え微生物を高密度に培養できることが期待される。
しかし、高濃度の栄養源を含有する培地で微生物を培養すると、当該微生物が生育阻害を受けたり、微生物の急激な増殖とともに酢酸などの生育阻害物質が産生されたりしてしまい、結果的には高密度培養を達成することが困難となることが多い。
この問題を解決するために、培養時間の経過に応じて連続的または断続的に培地を培養液中へ流加する流加培養が広く行われている。流加培養では、任意の培地成分を培養する微生物に好適な濃度で供給可能であるため、当該微生物を高密度で培養することが可能となる。
一方、微生物の培養において、培養中の培地のｐＨは重要な因子である。一般に、微生物にはそれぞれ生育に適したｐＨの範囲が存在するため、培養を行う際には培地のｐＨをそれぞれの微生物に適した値に制御することが必要である。例えば、有用タンパク質の生産を目的とした遺伝子組換え大腸菌の培養においても、培養中の培地のｐＨを６．８〜７．２に設定することが多く行われている（特許文献１、非特許文献１参照）。
また、培地中の栄養源の一つである窒素源としては、天然物（微生物、植物、動物乳または動物肉等）由来複合培地成分が多く用いられている。天然物由来複合培地成分は、種々の含窒素化合物をバランスよく含有するものが多く、微生物を培養する際の窒素源としての利用価値は高い。例えば、特許文献１では、窒素源として、天然物由来複合培地成分であるポリペプトンＮおよび酵母エキスを用いて、遺伝子組換え大腸菌の培養を行っている。
しかしながら、上述したような培地ｐＨ制御による培養方法、あるいは窒素源として天然物由来複合培地成分のみを含有する培地を用いた培養方法は、遺伝子組換え微生物を高密度で培養して有用タンパク質を効率よく生産するという目的の観点からは必ずしも十分な方法ではない。例えば、特許文献１では、遺伝子組換え大腸菌を比較的高密度で培養することには成功しているものの、目的有用タンパク質である酵素の活性は必ずしも高いものではない。更に、当該方法では、培養時間も比較的長時間（７１時間）に渡っており、さらなる効率的な培養方法の開発が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−２７８７９４号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２８，６３８−６４７，２００７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の主な目的は、遺伝子組換え微生物を高密度に培養し、効率良く（短時間で）組換えタンパク質を生産する方法を提供することである。特に、組換えタンパク質が酵素である場合には、高い活性を有する酵素を効率よく生産する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、培地成分と培養中の培地のｐＨを工夫することにより、遺伝子組換え微生物を短時間で高密度に培養することができ、組換えタンパク質を効率よく生産できること、特に、組換えタンパク質が酵素である場合には、高い活性を有する酵素を効率よく生産することができることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、遺伝子組換え微生物を流加培養法により培養して組換えタンパク質を生産する方法であって、
（ａ）初発培地が１５〜５０ｇ／Ｌの濃度で天然物由来複合培地成分を含有し、
（ｂ）培養中の培地のｐＨの下限値が５．８〜６．５であり、且つ、ｐＨの上限値が「ｐＨの下限値＋０．６」以下であり、
（ｃ）流加培地がグルタミン酸ナトリウムを含有すること
を特徴とする方法である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、遺伝子組換え微生物を短時間で高密度に培養することにより、組換えタンパク質を効率よく生産することができる。特に、組換えタンパク質が酵素である場合には、高い活性を有する酵素を効率よく生産することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
（１）遺伝子組換え微生物
本発明において、遺伝子組換え微生物とは、目的タンパク質をコードする遺伝子を細胞内に含有する微生物をいう。目的タンパク質とは、遺伝子組換え技術により産生される組換えタンパク質のことをいう。
当該微生物（宿主細胞）としては、目的タンパク質が発現できればその種類は限定されない。例えば、大腸菌、ロドコッカス属細菌、枯草菌、酵母、カビ等を挙げることができる。
【００１０】
大腸菌としては、大腸菌Ｋ１２株やＢ株等の野生株又は当該野生株由来の派生株であるＪＭ１０９株、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株、Ｃ６００株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、Ｗ３１１０株等を挙げることができる。ロドコッカス属細菌としては、例えばロドコッカス ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）ＡＴＣＣ １２６７４株やロドコッカス ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８）等を挙げることができる。酵母としては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）等を用いることができる。
【００１１】
これらの中でも、大腸菌及びロドコッカス属細菌が好ましく、大腸菌がより好ましい。大腸菌の中でもＷ３１１０株がより好ましい。遺伝子組換え操作を行い易く、また、細胞壁が強くないので産生された酵素を採取し易いからである。
（２）組換えタンパク質
組換えタンパク質とは、上記の遺伝子組換え微生物を用いて産生されるタンパク質をいう。本発明において、組換えタンパク質の種類は特に限定されず、大量、安価かつ効率的に生産させようとする目的タンパク質を適宜選択することができる。より詳細には、種々の酵素、ペプチド、構造タンパク質、抗体、サイトカインなどが挙げられる。これらタンパク質は、天然物あるいは自然界の生物より分離されうるアミノ酸配列を有するものに加え、該タンパク質を構成するアミノ酸配列において、意図的または非意図的なアミノ酸の欠失、付加、挿入、もしくは他のアミノ酸への置換が生じた、いわゆる変異体でもよい。目的タンパク質として選択し得る酵素の好適な例としては、例えば、産業上有用な酵素の一つであるハロヒドリンエポキシダーゼなどが挙げられる。
ハロヒドリンエポキシダーゼは、ハロヒドリンハイドロゲンハライドリアーゼ、ハロヒドリンデハロゲナーゼまたはハロアルコールデハロゲナーゼとも称され、後述するように、１，３−ジハロ−２−プロパノールをエピハロヒドリンに変換する活性およびその逆反応を触媒する活性（以下、「ハロヒドリンエポキシダーゼ活性」と称することがある）を有する酵素（ＥＣ ｎｕｍｂｅｒ： ４．５．１．−）である。
ハロヒドリンエポキシダーゼは、アミノ酸配列の相同性などから、３つのグループ（グループＡ、グループＢ及びグループＣ）に大別される（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １８３（１７），５０５８−５０６６，２００１）。
グループＡに属するハロヒドリンエポキシダーゼとしては、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ｎ−１０７４株由来のＨｈｅＡ（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８（８），１４５１−１４５７，１９９４）、アースロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）ＡＤ２株由来のＨｈｅＡＡＤ２（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １８３（１７），５０５８−５０６６，２００１）、アースロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）ＰＹ１株由来のＤｅｈ−ＰＹ１（Ｊ．Ｈｅａｌｔｈ．Ｓｃｉ．５０（６），６０５−６１２，２００４）などが挙げられる。
グループＢに属するハロヒドリンエポキシダーゼとしては、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ｎ−１０７４株由来のＨｈｅＢ（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８（８），１４５１（１９９４））、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＧＰ１株由来のＨｈｅＢＧＰ１（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １８３（１７），５０５８−５０６６，２００１）、アースロバクター エリシー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｒｉｔｈｉｉ）Ｈ１０ａ株由来のＤｅｈＡ（Ｅｎｚ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．２２，５６８−５７４，１９９８）などが挙げられる。
グループＣに属するハロヒドリンエポキシダーゼとしては、アグロバクテリウム ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）ＡＤ１株由来のＨｈｅＣ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １８３（１７），５０５８−５０６６，２００１）、アグロバクテリウム チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のＨａｌＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｖｉｅｗｅｒ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝ｐｒｏｔｅｉｎ＆ｖａｌ＝４９６００７６＃ｆｅａｔｕｒｅ＿４９６００７６）などが挙げられる。
上記のハロヒドリンエポキシダーゼは、いわゆる野生型ハロヒドリンエポキシダーゼである。本明細書中、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼとは、自然界の生物より分離されうるハロヒドリンエポキシダーゼを指し、該酵素を構成するアミノ酸配列において、意図的または非意図的なアミノ酸の欠失、付加、挿入、もしくは他のアミノ酸への置換がなく、天然由来の属性を保持したままのハロヒドリンエポキシダーゼを意味する。
上述した野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのうち、アミノ酸配列が明らかにされているものについては、米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ； Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ） により提供されるＧｅｎＢａｎｋデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ＣＭＤ＝ｓｅａｒｃｈ＆ＤＢ＝ｐｒｏｔｅｉｎ）において、以下のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．により登録されている。
Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＡＡ１４３６１（コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ｎ−１０７４株由来のＨｈｅＡのアミノ酸配列）
Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＫ９２１００（アースロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）ＡＤ２株由来のＨｈｅＡＡＤ２のアミノ酸配列）
Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＡＡ１４３６２（コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ｎ−１０７４株由来のＨｈｅＢのアミノ酸配列）
Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＫ７３１７５（マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＧＰ１株由来のＨｈｅＢＧＰ１ のアミノ酸配列）
Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＫ９２０９９（アグロバクテリウム ラジオバクターＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）ＡＤ１株由来のＨｈｅＣのアミノ酸配列）
Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＤ３４６０９（アグロバクテリウム チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のＨａｌＢのアミノ酸配列）。
本発明におけるハロヒドリンエポキシダーゼには、上記野生型ハロヒドリンエポキシダーゼに加え、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入または他のアミノ酸残基への置換が生じたハロヒドリンエポキシダーゼ（以下、「ハロヒドリンエポキシダーゼ変異体」と称することがある）をも含む。特に、ハロヒドリンエポキシダーゼ変異体のうち、酵素としての性能が向上したもの（改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ）は、本発明の方法により製造される好適なタンパク質の一例である。
改良型ハロヒドリンエポキシダーゼとしては、例えば、国際公開第２００８／１０８４６６号パンフレットに記載されているもの、すなわち、形質転換体あたりのハロヒドリンエポキシダーゼ活性、立体選択性、生成物阻害耐性、生成物蓄積能などが向上したもの等が挙げられる。これら改良型ハロヒドリンエポキシダーゼには、例えば、形質転換体あたりのハロヒドリンエポキシダーゼ活性が、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼよりも高くなる属性を有するもの、後述する基質１，３−ジハロ−２−プロパノールまたはエピハロヒドリンから、エピハロヒドリンまたは４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを生成させた場合の該生成物の光学純度が、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼにより同基質から同生成物を生成させた場合の該生成物の光学純度よりも高くなるという属性を有するもの、１，３−ジハロ−２−プロパノールまたはエピハロヒドリンからの生成物である塩化物イオンまたは４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルによる反応阻害に対する耐性が野生型ハロヒドリンエポキシダーゼよりも向上しているもの、基質１，３−ジハロ−２−プロパノールまたはエピハロヒドリンから、エピハロヒドリンまたは４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを生成させる場合に、生成物を高濃度生成および蓄積させることができるという属性を有するものなどが含まれる。
（３）遺伝子組換え微生物の作製
本発明において、遺伝子組換え微生物の作製方法は限定されず、公知の方法を使用することができる。ここでは、宿主として大腸菌を一例として記載する。
一般的に遺伝子組換え大腸菌を作製する方法としては、まず、目的タンパク質をコードする遺伝子を公知の手段により準備する。目的タンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片が取得済みであれば、そのままあるいはＰＣＲ法により増幅して用いることができる。異なるベクター上にクローニングされている場合は、目的タンパク質をコードする遺伝子部分を制限酵素を用いて切り出したり、ＰＣＲ法により増幅したりすることによって取得することができる。目的タンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片が単離されていない場合、目的タンパク質遺伝子の配列情報が明らかとなっていれば、目的タンパク質の遺伝子が含まれるような染色体ＤＮＡやＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲ法により増幅して取得することができる。
本発明において目的とするタンパク質は限定されないが、ここではハロヒドリンエポキシダーゼを一例として述べる。ハロヒドリンエポキシダーゼの場合、ＧｅｎＢａｎｋに公表されているハロヒドリンエポキシダーゼをコードする遺伝子（以下ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子と称する）、例えば、コリネバクテリウムｓｐ．（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）Ｎ−１０７４由来のハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子（ｈｈｅＢ； Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号は Ｄ９０３５０）の配列情報を基にプライマーを設計し、同菌株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことで、ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子を得ることができる。
続いて、プラスミドやファージ等のベクター上に目的タンパク質をコードする遺伝子を連結する。ベクター上には、目的タンパク質遺伝子が適切に転写、翻訳されるために必要な配列を適宜配置することが望ましい。例えば、目的タンパク質をコードする遺伝子の上流に転写プロモーターを、必要に応じて下流にターミネーターを配置したり、目的タンパク質遺伝子の上流に、ＳＤ配列を配置したりすることが好適である。
プロモーターの種類は宿主大腸菌において適切な発現を可能にするものであれば特に限定されるものではないが、例えば、トリプトファンオペロンのtrpプロモーター、ラクトースオペロンのlacプロモーター、ラムダファージ由来のPLプロモーターおよびPRプロモーターなどが挙げられ、tacプロモーター、trcプロモーターのように改変、設計された配列も利用できる。ターミネーターは必ずしも必要ではなく、その種類も特に限定されない。例えば、リポプロテインターミネーター、trpオペロンターミネーター、rrnBターミネーター等が挙げられる。
ＳＤ配列としては、大腸菌細胞内で機能する配列であれば特に限定されるものではなく、大腸菌において本来適切に発現している遺伝子のＳＤ配列や、16SリボゾームRNAの３’末端領域に相補的な配列が４塩基以上連続したコンセンサス配列等を利用することができる。ベクターに目的タンパク質遺伝子を挿入する方法としては、制限酵素を用いる方法、トポイソメラーゼを用いる方法等を利用することができる。挿入の際、必要であれば、適当なリンカー配列等を付加してもよい。
また、一般に、ベクターには目的とする遺伝子組換え大腸菌を選別するための選択マーカーが含むことができる。選択マーカーとしては、薬剤耐性遺伝子や栄養要求性相補遺伝子、資化性付与遺伝子などが挙げられ、目的や宿主に応じて選択されうる。
大腸菌で選択マーカーとして用いられる薬剤耐性遺伝子としては、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。続いて、構築した発現ベクターを大腸菌に導入する。本発明においては、このような操作を「形質転換」、得られた遺伝子組換え大腸菌を「形質転換体」と呼ぶことがある。大腸菌への発現ベクターの導入方法、すなわち形質転換の方法としては、大腸菌にＤＮＡが導入される方法であれば特に限定されるものではないが、例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
（４）遺伝子組換え微生物の培養（本培養）
（４−１）培地
培地とは、遺伝子組換え微生物の培養において生育環境を提供するものをいい、具体的には、水等の水性媒体中に炭素源、窒素源、無機塩類等を溶解したものをいう。「初発培地」とは、後述する流加培養方式によって培養を行う場合において、前培養（シード）が接種されて培養（本培養）が開始される培地をいう。「流加培地」とは、初発培地による培養を開始した後に、培養時間の経過に応じて連続的または断続的に初発培地へ継ぎ足される培地をいう。
初発培地も流加培地も滅菌して培養に使用するのが好ましい。当該培地の滅菌方法は、培地を、増殖能力のある微生物等が存在しない無菌状態にすることができる方法であれば限定されない。例えば、加圧滅菌（オートクレーブ；例えば１２１℃、２０分間の加熱滅菌）やろ過滅菌（例えば孔径０．４５μｍまたは０．２μｍのフィルターによるろ過）等による滅菌方法が挙げられる。加熱滅菌の際に培地成分同士の反応が懸念される場合には、１種類以上の培地成分を、それ以外の培地成分とは別に滅菌し、各々を滅菌後に混合してもよい。
本発明において、遺伝子組換え微生物の培養に使用する培地は、当該微生物が資化しうる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、当該微生物が短時間で高密度に培養され、組換えタンパク質を効率よく生産することができる培地であればよい。窒素源以外の各成分の量も限定されず、当業者が適宜選択することができる。
（４−１−１）初発培地
本発明の初発培地において、窒素源としては、少なくとも天然物（微生物、植物、動物乳または動物肉等）由来の複合培地成分を用い、さらに塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩；アンモニア；その他アミノ酸や窒素化合物等を用いることができる。天然物由来複合培地成分としては、例えば、ペプトン（牛乳、獣肉、魚肉あるいは大豆タンパク質等由来）、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカー等が挙げられ、これらの中でも酵母エキスが好ましい。
本発明で使用する培地は、窒素源として天然物由来複合培地成分を含有する。当該天然物由来複合培地成分の量（本培養開始時点）は、１５〜５０ｇ／Ｌ、好ましくは１８〜４０ｇ／Ｌ、より好ましくは２０〜３０ｇ／Ｌとする。天然物由来複合培地成分の量を１５ｇ／Ｌ以上とすることにより、遺伝仕組換え微生物を高密度に培養することができる。また、５０ｇ／Ｌ以下とするのは、それ以上培地に添加しても使用量に比して効果が低いからである。
炭素源としては、グルコース、ガラクトース、フラクトース、スクロース、ラフィノース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。これらの中でも、グルコース、フラクトース、ガラクトース等の糖類が好ましく、フラクトースがより好ましい。
無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。
本発明の初発培地には、必要に応じて、上記の成分以外の成分を添加することもできる。その成分や量についても当業者が適宜選択することができる。例えば、ビタミン等、培養中の培地の発泡を防ぐために消泡剤を等も添加してもよい。さらに、ベクターおよび目的遺伝子の脱落を防ぐために選択圧をかけた状態で培養してもよい。すなわち、選択マーカーが薬剤耐性遺伝子である場合には、相当する薬剤を培地に添加してもよい。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を含む遺伝子組換え微生物を培養する場合には、培地にアンピシリンを添加してもよい。
（４−１−２）流加培地
本発明では、大量の（高密度の）微生物を培養するため、培養中に（培養過程において）初発培地に流加培地を添加する。
流加培地の成分は、培養中の微生物の生育速度が十分に保たれれば限定されない。本発明においては、初発培地と同様の成分を使用することができる。例えば、炭素源、窒素源等、無機塩類、必要に応じてその他の成分を添加することができる。
流加培地の各成分の量も、培養中の微生物の生育速度が十分に保たれれば限定されず、当業者が適宜選択することができる。窒素源の濃度については、培養中の培地中の濃度が上記の濃度に保たれるように、流加培地を調製すればよい。窒素源としては、天然物由来複合培地成分を含有することが好ましく、その濃度としては５０〜３００ｇ／Ｌ、好ましくは８０〜２５０ｇ／Ｌ、より好ましくは１００〜２００ｇ／Ｌである。天然物由来複合培地成分の量を５０ｇ／Ｌ以上とすることにより、遺伝仕組換え微生物を高密度に培養することができる。また、３００ｇ／Ｌ以下とするのは、それ以上培地に添加しても使用量に比して効果が低いからである。
本発明においては、流加培地はグルタミン酸塩を必須成分とする。グルタミン酸塩を含む流加培地を培養中の培地に添加することにより、遺伝子組換え微生物の生育・増殖速度が保たれるだけでなく、活性の高い酵素が産生されるからである。
本発明で使用するグルタミン酸塩は、Ｄ体、Ｌ体又はラセミ体のいずれのものも使用することができる。また、グルタミン酸が有する２つのカルボキシル基のうちどちらか一方が塩を形成していてもよいし、両方のカルボキシル基が塩を形成していてもよい。塩としては、ナトリウム、カリウム等が例示できる。好ましくは、グルタミン酸ナトリウム（２−アミノペンタン二酸ナトリウム）であり、より好ましくは、そのＬ体のものである。
添加する流加培地中のグルタミン酸塩の濃度は、遺伝子組換え微生物の生育・増殖が十分に行われれば限定されない。例えば、流加培地に含まれる天然物由来複合成分の質量濃度に対して０．５〜１．５倍の質量濃度、好ましくは０．６〜１．４倍の質量濃度、より好ましくは０．７〜１．３倍の質量濃度とすればよい。０．５倍の質量濃度以上とするのは、微生物の生育・増殖速度が保持される効果が十分に得られるからであり、１．５倍の質量濃度以下とするのは、それ以上添加しても顕著な効果が得られにくいからである。
添加する流加培地の体積は、遺伝子組換え微生物の生育が十分に行われれば限定されないが、例えば、初発培地の体積の０．１倍以上１倍以下の体積とすればよく、好ましくは初発培地の体積の０．１５倍以上０．７５倍以下の体積、より好ましくは初発培地の体積の０．２倍以上０．５倍以下の体積である。０．１倍以上とするのは、遺伝仕組換え微生物を高密度に培養することができるからである。また、３００ｇ／Ｌ以下とするのは、それ以上培地に添加しても使用量に比して効果が低いからである。
（４−２）培養方法
本発明では、遺伝子組換え微生物を高密度に培養することができる。高密度とは、単位体積当たりの菌濃度が高い状態と換言される。菌濃度は、波長６３０ｎｍにおける光学密度（以下、ＯＤ６３０と称する）や、乾燥菌体重量濃度によって表される。すわなち、本発明において高密度に培養された状態とは、培養終了時における培養液のＯＤ６３０の値が５０程度以上、好ましくは７０程度以上、さらに好ましくは９０程度以上である状態をいう。あるいは、培養終了時における培養液の乾燥菌体重量濃度が２０ｇ／Ｌ程度以上、好ましくは３０ｇ／Ｌ程度以上、さらに好ましくは４０ｇ／Ｌ程度以上である状態をいう。
（４−２−１）培養方式
本発明の培養方式は、流加培養方式（Ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）である。流加培養方式とは、培養中の培地（例えば、初発培地）に培地を連続的又は断続的に流加（添加）し、培養終了時まで培地を容器から抜き取らない培養方法をいう。
流加培地を添加していく方法（ｆｅｅｄｉｎｇ ｍｏｄｅ）としては、遺伝子組換え微生物が短時間で高密度に培養され、組換えタンパク質を効率よく生産することができる方法であればいかなる方法でもよい。例えば、定流的流加法（ｃｏｎｓｔａｎｔ）、指数的流加法（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ）、段階的増加流加法（ｓｔｅｐｗｉｓｅ ｉｎｃｒｅａｓｅ）、比増殖速度制御流加法（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｒｏｗｔｈ−ｒａｔｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）、ｐＨスタット流加法（ｐＨ−ｓｔａｔ）、ＤＯスタット流加法（ＤＯ−ｓｔａｔ）、グルコース濃度制御流加法（ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ）、酢酸濃度モニタリング流加法（ａｃｅｔａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）等が挙げられる。
流加培地を添加するタイミングとしては、培養中の微生物の生育・増殖が保たれれば限定されない。例えば、初発培地中の炭素源が、８０〜９９．９％消費された時点、好ましくは８５〜９９．５％消費された時点、より好ましくは９０〜９９％消費された時点に、添加を開始すればよい。８０％以上消費された時点で流加培地を添加するのは、流加培地を添加することによる短時間で高密度に微生物を培養できる（高活性なタンパク質を効率よく得ることができる）という効果を得ることができるからである。また、９９．９％以下とするのは、それ以上炭素源が消費された状態で流加培地を添加しても、当該効果が得られないことがあるからである。
あるいは、培養が進むにつれて初発培地中の溶存酸素濃度が低下していくが、当該溶存酸素濃度が培養開始時の初期培地中の溶存酸素濃度の８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上に回復した時点で、流加培地を添加することもできる。
流加培地を添加する量及び速度は、培養中の培地中において上記の窒素源の濃度が保たれ、遺伝子組換え微生物の生育・増殖が十分に保たれれば限定されない。例えば、培地の成分の濃度を濃くすれば添加する流加培地の量は少なくて済むので好ましい。
（４−２−２）ｐＨ
培養中（本培養）の培地のｐＨは、ｐＨの下限値を５．８〜６．５、好ましくは６．０〜６．５とする。当該範囲のｐＨで培養することにより、短時間で高密度に微生物を培養できる（高活性なタンパク質を効率よく得ることができる）からである。一方、ｐＨの上限値は「ｐＨの下限値＋０．６以下」、好ましくは「ｐＨの下限値＋０．０１以上０．５８以下」、より好ましくは「ｐＨの下限値＋０．０５以上０．５５以下」である。
本発明中においてｐＨの下限値とは、培養中に制御するｐＨの下限の値であり、ｐＨがその値を下回りそうになるとアルカリを添加して上昇させればよい。また、ｐＨの上限値とは、培養中に制御するｐＨの上限の値であり、ｐＨがその値を上回りそうになると酸を添加して下降させればよい。
培養中のｐＨ制御には、無機または有機の酸、アルカリ溶液を用いることができる。酸は、無機酸の使用が好ましく、例えば、硫酸、リン酸、塩酸、硝酸などが挙げられる。アルカリとしては、水酸化ナトリウムやアンモニアなどが挙げられる。
（４−２−３）その他条件
本発明の培養の形態は、遺伝子組換え微生物が短時間で高密度に培養され、組換えタンパク質を効率よく生産することができる形態であればいかなるものでもよい。宿主として大腸菌を使用する場合は、通気攪拌培養（ジャーファーメンター）による好気的条件下での培養が好ましい。
培養温度は、遺伝子組換え微生物が十分に生育・増殖すれば限定されない。例えば、１０℃〜４５℃、好ましくは１５℃〜４０℃、より好ましくは２０℃〜３７℃とすることができる。必要に応じて培養中に温度を変更することもできる。
培養中の圧力については限定されない。大気圧で培養することもできるし、必要に応じて加圧下で培養してもよい。圧力としては、例えば、０〜０．１ＭＰａ、好ましくは０．０１〜０．０５ＭＰａを加圧した状態で培養することができる。加圧することにより、培地中の溶存酸素濃度が上昇するため、培養終了後の菌濃度や液活性がより高くなる。
培養時間は微生物が十分に高濃度に生育・増殖している限り限定されない。例えば、５〜１２０時間、好ましくは１０〜１００時間、さらに好ましくは１５〜８０時間、さらにより好ましくは２０〜６０時間程度とすればよい。また、培養の終了時期についても特には限定されないが、微生物の増殖が定常期に達してから終了すればよい。
また、本発明では、必要に応じて前培養を行うこともできる。前培養とは、遺伝子組換え微生物を高密度に培養しようとする培養（本培養）に接種するためのシード（種）を調製するための培養である。前培養を適切に行うことにより、本培養のシードとして必要な菌体量を確保することができる。前培養に用いる培地は、本培養における遺伝子組換え微生物の高密度培養を達成しうるものであれば特段限定されない。例えば、本培養の初発培地と同様の炭素源、窒素源等、無機塩類を含有することができ、必要に応じてその他の成分を添加することもできる。前培養時の培養温度やｐＨ、圧力、培養時間についても、本培養における遺伝子組換え微生物の生育を妨げる条件でなければよい。培養温度は、例えば、１０℃〜４５℃、好ましくは１５℃〜４５℃、より好ましくは２０℃〜３７℃とすればよい。培養中の培地のｐＨは、本培養と同様に酸やアルカリを用いて一定範囲の値に制御してもよいが、必ずしもその必要はなく、例えば、培地調製時に培地のｐＨを５〜９、好ましくは６〜８、より好ましくは６．５〜７．５の値に調整し、培養中はｐＨ制御をせずに培養を行ってもよい。圧力は、大気圧で培養してもよく、必要に応じて、０〜０．１ＭＰａ、好ましくは０．０１〜０．０５ＭＰａを加圧して培養を行うこともできる。培養時間は、本培養において遺伝子組換え微生物が高密度に培養されるために必要な菌体量が得られる時間とすればよく、特段限定されない。例えば、０．５〜２４時間、好ましくは１〜１２時間、より好ましくは３〜９時間とすればよい。本明細書では特に断らなければ、本培養を指すものとする。
【００１２】
（５）組換えタンパク質の取得
本発明により、遺伝子組換え微生物は高密度に培養され、多量（高濃度）のタンパク質が生産される。特に、目的タンパク質が酵素である場合は、高い活性を有するタンパク質を高収量で得ることができる。
組換えタンパク質は、遺伝子組換え微生物の菌体外に生産されてもよく、遺伝子組換え微生物の菌体内に蓄積されてもよい。組換えタンパク質が遺伝子組換え微生物の菌体外に生産される場合は、公知の方法により、必要に応じて培地から組換えタンパク質を単離・精製することができる。
また、組換えタンパク質が遺伝子組換え微生物の菌体内に蓄積される場合は、遺伝子組換え微生物を遠心分離やろ過等の公知の手段によって回収し、高圧処理、超音波処理、界面活性剤等の化学物質処理等によって菌体を破砕することにより、組換えタンパク質を得ることができる。必要に応じ、破砕された菌体を除去するなどして、組換えタンパク質をさらに単離・精製することができる。
組換えタンパク質の単離・精製には、珪藻土等を用いたろ過、疎水クロマトグラフィー（例えばｂｕｔｙｌ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）、陰イオンクロマトグラフィー（例えばＭｏｎｏ Ｑカラム）、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動等を単独で又は適宜組み合わせて行うことができる。また、組換えタンパク質は、適当な担体に保持し固定化タンパク質として使用することもできる。
（６）組換えタンパク質の使用
得られた組換えタンパク質は、所望の用途に使用することができる。特に、組換えタンパク質が酵素である場合には、当該酵素が触媒し得る反応の触媒として使用することができる。以下、ハロヒドリンエポキシダーゼを一例として、組換えタンパク質について述べる。
ハロヒドリンエポキシダーゼは、１，３−ジハロ−２−プロパノールから光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル（特開平０３−０５３８８９号公報、特開２００１−２５３９７号公報）、エピハロヒドリンから光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル（特開平０３−０５３８９０号公報）を製造することができる。
従って、本発明方法により産生された高活性のハロヒドリンエポキシダーゼを、シアン化 合物存在下、１，３−ジハロ−２−プロパノール又はエピハロヒドリンと接触させることで、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルへ変換することができる。
ここで、１、３−ジハロ−２−プロパノールとは、下記一般式（１）で示される化合物である。
【００１３】
【化１】
（式中、Ｘ１、Ｘ２はハロゲン原子）
ハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が好ましく、塩素、臭素が特に好ましい。具体的には１，３−ジフルオロ−２−プロパノール、１，３−ジクロロ−２−プロパノール（以下、「ＤＣＰ」と称することがある）、１，３−ジブロモ−２−プロパノール、１，３−ジヨード−２−プロパノール等が挙げられ、好ましくは、１，３―ジクロロ−２−プロパノール、１，３−ジブロモ−２−プロパノールである。
また、エピハロヒドリンとは、下記一般式（２）で示される化合物である。
【００１４】
【化２】
（式中、Ｘはハロゲン原子）
ハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が好ましく、塩素、臭素が特に好ましい。具体的にはエピフルオロヒドリン、エピクロロヒドリン（以下、「ＥＣＨ」と称することがある）、エピブロモヒドリン、エピヨードヒドリン等が挙げられ、特に好ましくはエピクロロヒドリン、エピブロモヒドリンである。
また、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルとは、下記一般式（３）で示される化合物である。
【００１５】
【化３】
（式中、Ｘはハロゲン原子）
ハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が好ましく、塩素、臭素が特に好ましい。具体的には４−フルオロ−３−ヒドロキシブチロニトリル、４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル（以下、「ＣＨＢＮ」と称することがある）、４−ブロモ−３−ヒドロキシブチロニトリル、４−ヨード−３−ヒドロキシブチロニトリル等が挙げられ、好ましくは、４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル、４−ブロモ−３−ヒドロキシブチロニトリルである。
なお、エピハロヒドリンは種々の医薬品や生理活性物質の合成原料として有用な物質である。例えば、（Ｒ）−エピハロヒドリンの開環シアノ化によって得られる（Ｒ）−（−）−４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルは、Ｌ−カルニチンの合成原料として有用であることが知られている（特開昭５７−１６５３５２号公報）。
シアン化合物としては、シアン化水素、シアン化カリウム、シアン化ナトリウム、シアン酸又はアセトンシアンヒドリン等の反応液中に添加した際にシアンイオン（ＣＮ−）又はシアン化水素を生じる化合物又はその溶液を用いることができる。
「ハロヒドリンエポキシダーゼ活性」は、単位時間あたりの１，３−ジハロ−２−プロパノールからのエピハロヒドリン生成量または塩化物イオン生成量を測定することにより求めることができる。エピハロヒドリン生成量は、例えば、液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィーなどによって定量することができる。また、塩化物イオン生成量は、例えば、その塩化物イオンの生成に伴って低下するｐＨをある一定の値に保つように連続的または断続的にアルカリ溶液を添加し、時間あたりに要したアルカリの量から便宜的に求めることができる。また、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼに対する抗体を作製し、ウェスタンブロットやＥＬＩＳＡ法などの免疫学的手法によっても推定することが可能である。その他、ハロヒドリンエポキシダーゼ活性が形質転換体内における発現量と比例すると仮定する場合は、ハロヒドリンエポキシダーゼ活性が既知であるサンプルと比較することなどにより、ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどの分析手段によっても間接的に推定することができる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは当業者であれば公知の方法を用いて行うことができる。
本明細書中、「形質転換体あたりのハロヒドリンエポキシダーゼ活性」とは、「形質転換体乾燥菌体単位質量あたりのハロヒドリンエポキシダーゼ活性」を意味し、「菌体比活性」とも称する。「液活性」とは、単位溶液量あたりのハロヒドリンエポキシダーゼ活性を意味する。
ハロヒドリンエポキシダーゼを酵素として使用する際の基質濃度は、酵素安定性の観点から０．０１〜１５（Ｗ／Ｖ）％が好ましく、０．０１〜１０（Ｗ／Ｖ）％がより好ましい。また、シアン化合物の使用量は、酵素安定性の観点から基質の１〜３倍量（モル）が好ましい。
溶媒としては、水又は緩衝液を使用することができる。緩衝液としては、例えば、リン酸、ホウ酸、クエン酸、グルタル酸、リンゴ酸、マロン酸、ｏ−フタル酸、コハク酸又は酢酸等の塩等によって構成される緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、グッド緩衝液等を使用することができる。
反応温度は酵素反応が十分に進む温度であれば限定されない。例えば、５〜５０℃、より好ましくは１０〜４０℃とすればよい。反応中の反応液のｐＨも酵素反応が十分に進むｐＨであれば限定されない。例えば、４〜１０、好ましくはｐＨ６〜９とすればよい。
反応時間も限定されず、基質等の濃度、菌体濃度、その他の反応条件等によって当業者が適時選択することができる。例えば、１〜１２０時間、好ましくは５〜１００時間とすればよい。なお、本反応においては、反応の進行に伴い生成する塩素イオンを反応系内から取り除くことにより、光学純度をより一層向上させることができる。この塩素イオンの除去は、硝酸銀等の添加によって行うことができる。
反応液中に生成した組換えタンパク質は、公知の方法を用いて採取、精製することができる。例えば、生成物が４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの場合は、遠心分離により反応液から菌体を除去した後、酢酸エチル等の溶媒で抽出を行い、減圧下に溶媒を除去することにより４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルのシロップを得ることができる。これらのシロップを減圧下に蒸留することによりさらに精製することもできる。
【実施例】
【００１６】
特開２００８−２７８７９４号公報記載の方法により調製した微生物形質転換体Ｗ３１１０／ｐＳＴＫ００２−Ｔ１３３Ａ＋Ｆ１３６Ｓ＋Ｄ１９９Ｈを使用し、培養を以下のように行った。
【００１７】
＜実施例１＞
前培養
Ｗ３１１０／ｐＳＴＫ００２−Ｔ１３３ＡＦ１３６Ｓ＋Ｄ１９９Ｈのコロニーを、５００ｍＬフラスコ中に調製した１００ｍＬの前培養培地（酵母エキス ２５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム １．５ｇ／Ｌ、アンピシリンナトリウム ０．１ｇ／Ｌ；ｐＨ７．２）に植菌し、温度３７℃、回転数２１０ｒｐｍにて、６時間振とう培養を行った。
前培養培地は、アンピシリンナトリウム以外の各成分必要量を水に溶解して１００ｍＬにメスアップした後に加熱滅菌（１２１℃、２０分間）を行い、室温に冷却後、予め０．２０μｍのフィルターでろ過除菌しておいたアンピシリンナトリウム水溶液（１００ｇ／Ｌ）を無菌条件下にて１００μＬ添加して調製した。
本培養
得られた前培養液のうち１６ｍＬを、３Ｌジャーファーメンター中に調製した１．６Ｌの本培養初発培地（フルクトース ４０ｇ／Ｌ、酵母エキス ２５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム １．５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物 ２．３７５ｇ／Ｌ、硫酸マンガン五水和物 ０．２ｇ／Ｌ、塩化カルシウム二水和物 ０．０２ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛七水和物 ０．０２ｇ／Ｌ、アンピシリンナトリウム ０．１ｇ／Ｌ、プルロニックＬ−６１（株式会社ＡＤＥＫＡ 日本） ０．５ｇ／Ｌ）に植菌し、温度３７℃、回転数５００ｒｐｍ、通気量２Ｌ／ｍｉｎ、圧力０．０５ＭＰａ、ｐＨの下限値を６．０、ｐＨの上限値を「ｐＨの下限値＋０．５」である６．５とし（水酸化ナトリウム２５％水溶液及び硫酸２４％水溶液を使用）、培養を行った。
本培養初発培地は、必要量のフルクトースを水に溶解して４００ｍＬにメスアップした後に加熱滅菌（１２１℃、２０分間）したものと、フルクトース及びアンピシリンナトリウム以外の各成分必要量を水に溶解して１．２Ｌにメスアップした後に加熱滅菌（１２１℃、２０分間）したものとを無菌条件下で混合し、室温に冷却した後、予め０．２０μｍのフィルターでろ過除菌しておいたアンピシリンナトリウム水溶液（１００ｇ／Ｌ）を１．６ｍＬ添加して調製した。
流加培地の添加
培養開始約２２時間後、すなわち、フルクトースが９７．５％消費された時点（培養中の培地中の溶存酸素濃度が約１０ｐｐｍとなった時点）に、２５ｗ／ｗ％リン酸水素二カリウム水溶液を１８ｍＬ添加し１１．２５ｇ／Ｌにした後、続いて約１７ｍＬ／ｈｒの一定速度で本培養流加培地（フルクトース ３００ｇ／Ｌ、酵母エキス １８７．５ｇ／Ｌ、グルタミン酸ナトリウム １６６．８８ｇ／Ｌ）の添加を開始した。
２５％ｗ／ｗリン酸水素二カリウム水溶液は、２０ｇのリン酸水素二カリウムを６０ｇの水に溶解した後に、０．２μｍのフィルターでろ過除菌し、無菌条件下でピペットにて１８ｍＬ取り調整した。
本培養流加培地は、各成分の必要量を予め水に溶解して上記濃度となるようメスアップした後、別途予め加熱滅菌（１２１℃、２０分間）しておいた混合セルロース製フィルター（アドバンテック（株） 日本）、および加圧ろ過器を用いて無菌条件下で加圧ろ過（０．２ＭＰａ）を行い、室温に冷却して調整した。
培養中は適時サンプリングを行いながら、計４６時間培養を行った。流加培地は、培養開始２２時間後から培養終了の約４６時間後までで、合計４００ｍｌ添加した。培養中の溶存酸素濃度は、培養開始約１０時間前後において１ｐｐｍ前後にまで低下したのち１０ｐｐｍ前後まで回復した。流加培地を添加してからは再度低下して、大部分の時間は１ｐｐｍから５ｐｐｍの間で推移した。
培養のｐＨは、約１０時間前後まではほぼ６．０に保たれた後、６．０〜６．５で推移し、流加培地を添加してからは６．５に保たれた。得られた培養液について、菌濃度を測定した。菌濃度の測定は、６３０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６３０）を測定することで行った。
酵素（組換えタンパク質）の調製
培養液５ｍＬを、６，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行った。上清を除去し、得られた湿菌体５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−硫酸（ｐＨ８）を加えＯＤ６３０＝２２．６とし、均一になるよう再懸濁して菌体懸濁液を得た。得られた菌体懸濁液を、超音波破砕機ＶＰ−３００（タイテック株式会社、日本）を用いて破砕処理を行い、菌体破砕液を得た。
酵素反応
得られた菌体破砕液１ｍＬを、１５，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行った。得られた上清を粗酵素液とし、以下のようにハロヒドリンエポキシダーゼ活性を測定した。
１００ｍＬの活性測定用反応液（５０ｍＭ ＤＣＰ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−硫酸（ｐＨ８））を調製して、温度を２０℃に調整した。該反応液に、適宜希釈した粗酵素液を添加し、反応を開始した。
ハロヒドリンエポキシダーゼ活性による塩化物イオンの遊離に伴うｐＨの低下を、ｐＨ自動コントローラを用い、０．０１規定の水酸化ナトリウム水溶液を用いて、ｐＨを８に保つよう連続的に調整した。１０分間の反応の間に、ｐＨを８に保つために投入された０．０１規定の水酸化ナトリウム水溶液の量から、塩化物イオン生産量を算出し、ハロヒドリンエポキシダーゼ活性（Ｕ）を算出した。
１Ｕは上記条件下でＤＣＰから１分間あたり１μｍｏｌ塩化物イオンを脱離する酵素量に相当するものと定義した。粗酵素液の液活性から培養液換算の液活性を算出した。また、後述する比較例で得られた菌濃度及び液活性を１００％として、相対菌濃度および相対液活性を算出した。結果を表１に示す。
＜実施例２＞
本培養時のｐＨの下限値を５．８に、ｐＨの上限値を「ｐＨの下限値＋０．４」である６．２にし、ｐＨ制御に用いる酸を４０ｗ／ｗ％リン酸とする以外は、実施例１と同様な方法によって培養を実施した。得られた培養液について、実施例１と同様の方法で菌濃度、液活性を測定し、比較例で得られた菌濃度及び液活性を１００％として、相対菌濃度および相対液活性を算出した。結果を表１に示す。
【００１８】
＜実施例３＞
本培養時のｐＨの下限値を６．５に、ｐＨの上限値を「ｐＨの下限値＋０．５」である７．０にする以外は、実施例１と同様の方法によって培養を実施した。得られた培養液について、実施例１と同様の方法で菌濃度、液活性を測定し、比較例で得られた菌濃度及び液活性を１００％として、相対菌濃度および相対液活性を算出した。結果を表１に示す。
＜比較例＞
本培養時のｐＨの下限値を７．２に、ｐＨの上限値を「ｐＨの下限値＋０．３」である７．５にする以外は、実施例１と同様な方法によって培養を実施した。得られた培養液は、実施例１と同様の方法で菌濃度、液活性を測定した。結果を表１に示す。
【００１９】
【表１】
表１に示すように、ｐＨの下限値を６．０、ｐＨの上限値を６．５にして行った培養（実施例１）における菌濃度（ＯＤ６３０）は１２７であり、ｐＨの下限値を７．２、ｐＨの上限値を７．５にして行った培養（比較例）における菌濃度（ＯＤ６３０＝８０）の約１．６倍であった。また、ｐＨの下限値を５．８、ｐＨの上限値を６．２にして行った培養（実施例２）およびｐＨの下限値を６．５、ｐＨの上限値を７．０にして行った培養（実施例３）における菌濃度（ＯＤ６３０）もそれぞれ１２７及び１３１であり、比較例における菌濃度（ＯＤ６３０）の約１．６倍であった。
【００２０】
さらに、実施例１における液活性は４，３２８Ｕ／ｍｌであり、比較例における活性（１，７１１Ｕ／ｍｌ）の約２．５倍であった。また、実施例２および実施例３における液活性はそれぞれ４，５５８Ｕ／ｍｌおよび５，０２４Ｕ／ｍｌであり、それぞれ、比較例における活性の約２．７倍、約２．９倍であった。
【００２１】
以上の結果から、グルタミン酸ナトリウムを含有する培地を用い、培養中のｐＨの下限値を５．８〜６．５にし、且つ、ｐＨの上限値を「ｐＨの下限値＋０．６」以下に制御することで、遺伝子組換え大腸菌を短時間で高密度に培養することができ、工業的に有用な組換えタンパク質を効率よく生産できること、特に、組換えタンパク質が酵素である場合には、高い活性を有する酵素を効率よく生産することができることが示された。
＜試験例１＞
実施例１で得られた粗酵素液を用いた、１，３−ジハロ−２−プロパノールおよびシアン化合物からの４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの製造
実施例１で得られたＷ３１１０／ｐＳＴＫ００２−Ｔ１３３Ａ＋Ｆ１３６Ｓ＋Ｄ１９９Ｈ粗酵素液を、シアン化カリウム（ＫＣＮ）存在下、１，３−ジクロロ−２−プロパノール（ＤＣＰ）と接触させることにより、４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル（ＣＨＢＮ）を以下のように製造した。
【００２２】
反応液基本組成は表２のようにし、反応スケールは２ｍＬで行った。
【００２３】
【表２】
反応は２０℃にて３時間行った。反応終了後、以下に示す分析条件により、反応液中のＤＣＰ、ＥＣＨおよびＣＨＢＮ濃度を分析した。
反応液中のＤＣＰ、ＥＣＨおよびＣＨＢＮ濃度分析
反応液中のＤＣＰ、ＥＣＨおよびＣＨＢＮ濃度分析は、逆相系ＨＰＬＣにより、行った。逆相系ＨＰＬＣ分析条件を表３に示す。
【００２４】
【表３】
反応終了液１００μＬを、上表記載の移動層４００μＬにより希釈混合した後、上表記載の分析条件により分析を行った。予め、濃度既知のＤＣＰ、ＥＣＨおよびＣＨＢＮ溶液を用いて検量線を作成し、該検量線を用いて反応液中のＤＣＰ、ＥＣＨおよびＣＨＢＮ濃度を求めた。結果を表４に示す。
【００２５】
【表４】
シアン化合物存在化、実施例１で得られた粗酵素液を１，３−ジハロ−２−プロパノールと接触させることで、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造できることが示された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子組換え微生物を流加培養法により培養して組換えタンパク質を生産する方法であって、
（ａ）初発培地が１５〜５０ｇ／Ｌの濃度で天然物由来複合培地成分を含有し、
（ｂ）培養中の培地のｐＨの下限値が５．８〜６．５であり、且つ、ｐＨの上限値が「ｐＨの下限値＋０．６」以下であり、
（ｃ）流加培地がグルタミン酸ナトリウムを含有すること
を特徴とする方法。
【請求項２】
流加培地が５０〜３００ｇ／Ｌの濃度で天然物由来複合培地成分を含有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
流加培地中のグルタミン酸ナトリウムの質量濃度が、天然物由来複合培地成分の質量濃度の０．５倍〜１．５倍である請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
添加する流加培地の体積が初発培地の体積の０．１倍〜１倍である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
初発培地中の炭素源が８０〜９９．９％消費された時点で流加培地の添加を始める、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
遺伝子組換え微生物の宿主が大腸菌である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
組換えタンパク質がハロヒドリンエポキシダーゼである、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
シアン化合物存在下、１，３−ジハロ−２−プロパノール又はエピハロヒドリンを請求項１〜７のいずれかに記載の方法で得られた組換えタンパク質に接触させる工程を含む、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの製造方法。
【請求項１】
遺伝子組換え微生物を流加培養法により培養して組換えタンパク質を生産する方法であって、
（ａ）初発培地が１５〜５０ｇ／Ｌの濃度で天然物由来複合培地成分を含有し、
（ｂ）培養中の培地のｐＨの下限値が５．８〜６．５であり、且つ、ｐＨの上限値が「ｐＨの下限値＋０．６」以下であり、
（ｃ）流加培地がグルタミン酸ナトリウムを含有すること
を特徴とする方法。
【請求項２】
流加培地が５０〜３００ｇ／Ｌの濃度で天然物由来複合培地成分を含有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
流加培地中のグルタミン酸ナトリウムの質量濃度が、天然物由来複合培地成分の質量濃度の０．５倍〜１．５倍である請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
添加する流加培地の体積が初発培地の体積の０．１倍〜１倍である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
初発培地中の炭素源が８０〜９９．９％消費された時点で流加培地の添加を始める、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
遺伝子組換え微生物の宿主が大腸菌である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
組換えタンパク質がハロヒドリンエポキシダーゼである、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
シアン化合物存在下、１，３−ジハロ−２−プロパノール又はエピハロヒドリンを請求項１〜７のいずれかに記載の方法で得られた組換えタンパク質に接触させる工程を含む、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの製造方法。
【公開番号】特開２０１１−２０５９７９（Ｐ２０１１−２０５９７９Ａ）
【公開日】平成２３年１０月２０日（２０１１．１０．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−７７４３９（Ｐ２０１０−７７４３９）
【出願日】平成２２年３月３０日（２０１０．３．３０）
【出願人】（０００００６０３５）三菱レイヨン株式会社 (2,875)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月２０日（２０１１．１０．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月３０日（２０１０．３．３０）
【出願人】（０００００６０３５）三菱レイヨン株式会社 (2,875)
【Ｆターム（参考）】
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