経口免疫寛容を誘導するペプチド組成物およびその調製方法
【課題】経口免疫寛容を効果的に誘導するペプチド組成物およびその調製方法の提供。
【解決手段】牛乳由来のたんぱく質であるカゼインを、Ｂ細胞反応性が消失または低減され、かつＴ細胞反応性を有するペプチドが得られる条件下で酵素分解することで、経口免疫寛容を効果的に誘導するペプチド組成物およびその調製方法を提供する。
【解決手段】牛乳由来のたんぱく質であるカゼインを、Ｂ細胞反応性が消失または低減され、かつＴ細胞反応性を有するペプチドが得られる条件下で酵素分解することで、経口免疫寛容を効果的に誘導するペプチド組成物およびその調製方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、経口免疫寛容を効果的に誘導するペプチド組成物およびその調製方法に関する。より詳細には、特定の分子量以下のペプチドを有し、牛乳アレルギーの治療・予防に有用な経口免疫寛容を誘導するペプチド組成物およびその調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に生体は異種（非自己）抗原に対しては免疫反応を示すが、自己を構成する抗原に対しては免疫反応を示さない。しかし、本来は異種抗原であっても免疫反応を示さない場合があり、この現象は免疫寛容と呼ばれている。また、経口摂取して腸管を経由して体内に吸収された抗原に関しては、免疫反応における応答性が著しく低下することから、この現象は特に、経口免疫寛容と呼ばれている。
【０００３】
この経口免疫寛容の作用機序として、現在、クローナルアナジー・クローナルデリーション・アクティブサプレッションという３つの制御機構が働いているとされている。クローナルアナジーとは、免疫細胞が抗原に対して不応答化することを指し、アナジー状態になるリンパ球がＣＤ４+Ｔ細胞であることが確認されている（非特許文献１参照）。また、クローナルデリーションとは、抗原に反応するＴ細胞がアポトーシスを起こして消失する現象を指し、アクティブサプレッションにおいては、抗炎症性サイトカインであるＩＬ−１０を産生する調節性Ｔ細胞が大きな役割を果たしていることが知られている（非特許文献２参照）。従って、経口免疫寛容の作用機序にはＴ細胞が大きく関わっているとされている。さらに、近年においてはアレルギー疾患の発症には、ヘルパーＴ細胞のサブクラスと制御性Ｔ細胞とのバランスが重要であるとも言われている（非特許文献３参照）。
【０００４】
健常者においては、このようなＴ細胞を中心とした反応制御機構により経口免疫寛容が成立しているため、牛乳を摂取しても生体に不利益な免疫反応は惹起されない。しかし、牛乳アレルギー患者においてはＴ細胞による抗原に対する経口免疫寛容が成立しておらず、摂取した牛乳にアレルギーの引き金となるＢ細胞反応性が残存している場合には、様々なアレルギー症状が惹起され、アナフィラキシーショック等の重篤な症状を引き起こし死に至る場合もある。
そこで、牛乳アレルギー患者に対し、経口免疫寛容を誘導することによって牛乳アレルギーを予防・治療しようとする試みがなされており、牛乳たんぱく質加水分解物を利用したものが開示されてきた（特許文献１および２参照）。
【０００５】
しかし、牛乳たんぱく質加水分解物を利用する場合においても、経口免疫寛容を誘導するにはいくつかの問題点がある。牛乳たんぱく質加水分解物はアレルギー症状の惹起を避けるために、Ｂ細胞反応性が消失していること、または低減されていることが重要となる。牛乳たんぱく質加水分解物は、アレルゲンとなる牛乳中に含まれるβ−ラクトグロブリン（以下β−ＬＧとする）やカゼイン等の牛乳たんぱく質を酵素によって分解し、低分子のペプチドとしたものであるが、酵素反応の条件によって、Ｂ細胞反応性の消失に加えて、さらに免疫寛容を誘導するために重要なＴ細胞反応性も消失してしまうことが多いという問題があった。
【０００６】
そこで、Ｂ細胞反応性を消失または低減しつつ、Ｔ細胞反応性を維持したペプチドを得るために、ｐＨや温度、時間などの分解酵素における適度な反応条件の検討が望まれている。特に、食品添加物用の酵素は試験研究に供する目的において使用される酵素試薬とは異なり、高度に精製されておらず、様々な活性を持った複数の酵素による混合物であることが多い。したがって、ｐＨや温度などの緒条件によって各酵素の活性および酵素同士の相互作用が異なり、生じる分解物も多岐に渡るという問題がある。
特許文献１に示された牛乳たんぱく質加水分解物については、このような分解酵素の反応条件についての検討が全くなされておらず、特定の酵素反応条件で実験されていないため、効率的に経口免疫寛容を誘導するようなペプチドが得られているとは考えられない。
【０００７】
また、特許文献１および２には、経口免疫寛容を誘導したとする報告がされているが、マウスを用いた実験による結果である。一般に、経口免疫寛容の誘導されやすさに関しては動物の種類によって差があると言われており、特にマウスやラット等のげっ歯類は誘導されやすいとされている。特に、前述の様に経口免疫寛容の成立にはＴ細胞が非常に重要な役割を果たしているが、Ｔ細胞の認識する部位に関してはマウスの系統によってさえ異なることが報告されている（非特許文献４および５参照）。したがって、マウスにおいて経口免疫寛容が誘導されてもヒトで誘導されるとは限らないため、ヒトにおけるＴ細胞反応性を証明する必要があるといえる。
【０００８】
一方、本発明者らはヒトにおけるＴ細胞反応性を証明したペプチドを開発し、開示しているが（特許文献３参照）、経口免疫寛容の対象となるたんぱく質をβ−ＬＧのみに限定していたため、β−ＬＧ以外の牛乳たんぱく質に対してアレルギーを持つアレルギー患者においては利用できないという問題があった。
近年、β−ＬＧとともにカゼインも牛乳の主要なアレルゲンであるという報告（非特許文献６参照）がなされており、通常市販されている乳製品のほとんどにカゼインが含まれている。したがって、β−ＬＧのみに対して免疫寛容を誘導したとしても、カゼインに対する経口免疫寛容が誘導されていなければ、結局牛乳アレルギー患者は乳製品を摂取できないことになる。
また、カゼインの加水分解物を用いた抗アレルギー材が特許文献４に開示されているが、単純に抗原の体内への移行を防ぐだけであり、経口免疫寛容を誘導するような効果は認められておらず、カゼインに対して経口免疫寛容を誘導できる牛乳たんぱく質加水分解物は得られていない。
そこで従来法では解決できなかった、Ｂ細胞反応性を限りなく低減させ、一方でＴ細胞反応性を有し、ヒトにおいて牛乳由来のたんぱく質であるカゼインに対して経口免疫寛容を誘導できるペプチドの開発が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開平５−５０００号公報
【特許文献２】特開平７−１０１８７３号公報
【特許文献３】特開平２０−１９５６１８号公報
【特許文献４】特開平１６−９９４５７号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｈｉｒａｈａｒａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（１９９５）
【非特許文献２】清野 宏：医学のあゆみ（２００２）
【非特許文献３】齋藤 博久、化学と生物、（２００９）
【非特許文献４】Ｔｓｕｊｉ，ＮＭ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，（１９９３）
【非特許文献５】Ｔｏｔｓｕｋａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．，（１９９７）
【非特許文献６】Ｗａｌ ＪＭ， Ａｎｎ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｓｔｈｍａ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（２００４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、ＩｇＥを介してアナフィラキシーショック等の重篤な症状を引き起こすＢ細胞反応性が消失または低減され、かつ少量の抗原で長期に免疫寛容を誘導できるＴ細胞反応性を有する、ヒトにおいて牛乳アレルギー、特に牛乳由来のたんぱく質であるカゼインに対するアレルギーの治療・予防に供することのできるペプチド組成物およびその調製方法を確立し、提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するために、牛乳由来のたんぱく質であるカゼインを、たんぱく質加水分解酵素による分解処理ならびに限外ろ過膜による分画処理する方法を鋭意検討した。その結果、本発明者らは酵素活性が最も高い条件、いわゆる至適条件下で酵素反応を行うと分解が進みすぎて、Ｔ細胞反応性が減弱してしまうことを確認した。そこで、敢えて至適条件を外した条件下で適切な分解反応を調節したところ、Ｂ細胞反応性が消失または低減され、かつ免疫寛容を誘導するために重要なＴ細胞反応性を有するペプチドが得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は次の（１）〜（１１）のペプチド組成物またはその調製方法等に関する。
（１）牛乳由来のたんぱく質であるカゼインをＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のアルカリ性エンド型たんぱく質分解酵素でｐＨ９．５〜１０．５、温度５０〜６０℃、反応温度２〜４時間分解する経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物。
（２）たんぱく質分解酵素の分解条件が、ｐＨ１０、温度５５℃、反応時間４時間であることを特徴とする上記（１）に記載の経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物。
（３）牛乳由来のたんぱく質であるカゼインをＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｅｕｓ由来のアルカリ性エンド型たんぱく質分解酵素でｐＨ７．５〜８．５、温度２５〜３５℃、反応時間２〜４時間分解した経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物。
（４）たんぱく質分解酵素の分解条件が、ｐＨ８．０、温度３０℃、反応時間４時間であることを特徴とする上記（３）に記載の経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物。
（５）上記（２）または（４）に記載のペプチド組成物を分子量１０，０００の限外ろ過膜で処理し、その透過物として得られることを特徴とする経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物。
（６）上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載されたペプチド組成物を有効成分として含む経口免疫寛容誘導剤。
（７）牛乳由来のたんぱく質であるカゼインをＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のアルカリ性エンド型たんぱく質分解酵素でｐＨ９．５〜１０．５、温度５０〜６０℃、反応温度２〜４時間分解する経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物の調製方法。
（８）たんぱく質分解酵素の分解条件が、ｐＨ１０、温度５５℃、反応時間４時間であることを特徴とする上記（７）に記載の経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物の調製方法。
（９）牛乳由来のたんぱく質であるカゼインをＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｅｕｓ由来のアルカリ性エンド型たんぱく質分解酵素でｐＨ７．５〜８．５、温度２５〜３５℃、反応時間２〜４時間分解した経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物の調製方法。
（１０）たんぱく質分解酵素の分解条件が、ｐＨ８．０、温度３０℃、反応時間４時間であることを特徴とする上記（９）に記載の経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物の調製方法。
（１１）上記（７）または（９）に記載のペプチド組成物の調製方法であって、さらにペプチド組成物を分子量１０，０００の限外ろ過膜で処理し、その透過物として得られることを特徴とする経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物の調製方法。
【発明の効果】
【００１４】
乳幼児に多く認められる食物アレルギーの原因のひとつとして、食品たんぱく質の一部が消化酵素の分解を受けずに腸管から吸収され、生体免疫系を刺激してアレルギーを発症させることが指摘されている。この点に関して、本発明のペプチド組成物はその平均分子量が低いため、もとの未分解の乳たんぱく質の有する抗原性が非常に低減されており、牛乳アレルギー患者の治療に用いることができる。また、本ペプチド組成物は経口免疫寛容誘導能に関しては非常に高いため、生体の有する潜在的なアレルギー防御機構を十分に活性化できる。
したがって、本発明のペプチド組成物は新しいアレルギー低減化および予防と治療を目的とした食品素材あるいは経口免疫寛容誘導材として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】分解反応前の基質カゼインならびにペプチド１含有組成物および対照サンプル１含有組成物について、Ｔ細胞反応性を、牛乳アレルギー患者血清を用いたリンパ球幼弱化反応法で検討した図である（試験例１）。
【図２】分解反応前の基質カゼインならびにペプチド４含有組成物および対照サンプル４含有組成物について、Ｔ細胞反応性を、牛乳アレルギー患者血清を用いたリンパ球幼弱化反応法で検討した図である（試験例２）。
【図３】分解反応前の基質カゼインならびにペプチド１含有組成物およびペプチド４含有組成物について、Ｂ細胞反応性を、牛乳アレルギー患者血清を用いたＩｇＥ−ウェスタンブロット法で検討した図である（試験例３）。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の「経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物」とは、カゼインをたんぱく質分解酵素で酵素分解することによって得られる、Ｂ細胞反応性が消失または低減されており、かつＴ細胞反応性を有するペプチドを含む組成物のことをいう。
本発明のペプチド組成物を得るために用いるカゼインは、牛乳由来のカゼインであればいずれのものも用いることができるが、特にカゼインを高含有する酸カゼインまたはカゼインナトリウム、およびそれらに準ずるより純度の高いものを用いることが望ましい。
【００１７】
本発明の「経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物」は、上述したカゼインをたんぱく質加水分解酵素で処理し、低分子ペプチド化することで調製することができる。
たんぱく質加水分解酵素は、ペプチド結合を加水分解する酵素であればいずれのものも用いることができるが、本発明に用いる酵素は微生物由来のアルカリ性エンド型たんぱく質分解酵素、特に微生物のＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｅｕｓ由来のアルカリ性エンド型たんぱく質分解酵素が好ましい。これらの酵素は市販のものや独自に調製したいずれの酵素も用いることができるが、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のアルカリ性エンド型たんぱく質分解酵素として、アルカラーゼ（ノボ社）やＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｅｕｓ由来のアルカリ性エンド型たんぱく質分解酵素として、プロテアーゼＰ３ＳＤ（天野エンザイム社）等を用いることができる。
【００１８】
本発明の「経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物の調製方法」として、カゼインをたんぱく質加水分解酵素で処理し、低分子ペプチド化するには、牛乳由来のたんぱく質を基質としてこれにたんぱく質加水分解酵素を加えて、所定のｐＨ、温度で必要時間加水分解することが挙げられる。
例えば、カゼインをＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のアルカリ性エンド型たんぱく質分解酵素でｐＨ９．５〜１０．５、温度５０〜６０℃、反応温度２〜４時間分解することで、Ｂ細胞反応性が消失または低減されており、かつＴ細胞反応性を有するペプチド組成物を得ることができる。この調製においては、さらに、たんぱく質分解酵素の分解条件が、基質濃度５％、ｐＨ１０．０、温度５５℃、４時間であることが望ましく、より抗原性の高い高分子物質を除去するために分子量が１０，０００の限外ろ過膜を用いて精製する事が特に望ましい。
または、カゼインをＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｅｕｓ由来のアルカリ性エンド型たんぱく質分解酵素でｐＨ７．５〜８．５、温度２５〜３５℃、反応時間２〜４時間分解することで、Ｂ細胞反応性が消失または低減されており、かつＴ細胞反応性を有するペプチド組成物を得ることができる。
この調製においては、さらに、たんぱく質分解酵素の分解条件が、基質濃度５％、ｐＨ８．０、温度３０℃、４時間であることが望ましく、より抗原性の高い高分子物質を除去するために分子量が１０，０００の限外ろ過膜を用いて精製する事が特に望ましい。
【００１９】
本発明で得られる「経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物」は、Ｂ細胞反応性が消失または低減されており、かつＴ細胞反応性を有することが、牛乳アレルギー患者Ｔ細胞において基質であるカゼインと同程度の反応性を示していること、および牛乳アレルギー患者血清を用いたＩｇＥ−ウェスタンブロット法により、ＩｇＥ反応性の消失が示されていることから確認されている。
【００２０】
従って、本発明によって得られる「経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物」は、Ｂ細胞反応性が低減しているため抗原性が低く、かつ免疫寛容誘導能は未分解の牛乳由来たんぱく質と同等に優れており、さらにペプチド態であるために耐熱性等の加工特性に優れているため、新規のアレルギー予防・治療食品素材として、単独または清涼飲料水、ミネラルウォーター、茶などの各種飲料、クッキー、ビスケット、煎餅等の菓子類、または育児用調製粉乳、パン、ゼリー、口腔清涼菓子などの食品とともに自由に使用することができる。
また、「経口免疫寛容誘導剤」の有効成分として使用することができる。本発明の「経口免疫寛容誘導剤」は、本発明によって得られる「経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物」を有効成分として含む「経口免疫寛容誘導剤」であればいずれのものも含まれる。例えば、「経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物」をそのまままたはその他の成分と組み合わせたものを、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、粉剤、溶液剤など所望する剤型に製剤化した「経口免疫寛容誘導剤」などが挙げられる。これは経口投与用食品として経口免疫寛容誘導および／またはそのための補助的処置として用いることもできる。
本発明によって得られる「経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物」は本来食品として用いることができるものであるため安全性に問題は無く、その用量も適宜で良い。
以下に実施例および試験例を示し、さらに本発明を詳細に説明する。
【実施例】
【００２１】
［試料］
本発明の実施例および比較例においては次の試料を用いた。
１．カゼイン
１）カゼインナトリウム（たんぱく質含量９０％、フォンテラ社）
２）酸カゼイン（たんぱく質含量９０％、フォンテラ社）
２．酵素
１）アルカラーゼ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来、ノボ社、表示活性 ２．４ＡＵ／ｇ）
２）プロテアーゼＰ３ＳＤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｅｕｓ由来、天野エンザイム社、たん白消化力 ３０，０００ｕ／ｇ以上）
３）プロテアーゼＮＳＤ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来、天野エンザイム社、たん白消化力 １５０，０００ｕ／ｇ以上）
４）プロテアーゼＡＳＤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来、天野エンザイム社、たん白消化力 １０，０００ｕ／ｇ以上）
５）フレーバーザイム（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来、ノボ社、表示活性 １０００ＬＡＰＵ／ｇ）
６）ニュートラーゼ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ由来、ノボ社、表示活性 ０．８ＡＵ／ｇ）
【００２２】
［実施例１］
カゼインナトリウム５ｇをイオン交換水１００ｍｌに５０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。水酸化ナトリウムにてｐＨを１０に調整した後、たんぱく質１ｇ当たりアルカラーゼ１０ｍｇを添加し、５５℃で４時間反応させた。反応終了後、１００℃で１０分間加熱し、酵素分解ペプチド組成物を得た。この酵素分解ペプチド組成物をペプチド１含有組成物とした。
［実施例２］
酸カゼイン１０ｋｇをイオン交換水１００Ｌに１００ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。水酸化ナトリウムにてｐＨを１０に調整した後、たんぱく質１ｇ当たりアルカラーゼ２０ｍｇを添加し、５５℃で２時間反応させた。反応終了後、１２０℃で３秒間加熱し、酵素分解ペプチド組成物を得た。この酵素分解ペプチド組成物をペプチド２含有組成物とした。
［実施例３］
カゼインナトリウム２５ｋｇをイオン交換水５００Ｌに５０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。水酸化ナトリウムにてｐＨを１０に調整した後、たんぱく質１ｇ当たりアルカラーゼ１０ｍｇを添加し、５５℃で４時間反応させた。反応終了後、１２０℃で３秒間加熱し、酵素分解ペプチド組成物を得た。さらに、平均分画分子量１０，０００の限外ろ過膜にて分画して保持物を得た。この酵素分解ペプチド組成物をペプチド３含有組成物とした。
［実施例４］
カゼインナトリウム５ｇをイオン交換水１００ｍｌに５０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。水酸化ナトリウムにてｐＨを８．０に調整した後、たんぱく質１ｇ当たりプロテアーゼＰ３ＳＤ１０ｍｇを添加し、３０℃で４時間反応させた。反応終了後、１００℃で１０分間煮沸し、酵素分解ペプチド組成物を得た。この酵素分解ペプチド組成物をペプチド４含有組成物とした。
［実施例５］
酸カゼイン５ｋｇをイオン交換水１００Ｌに５０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。水酸化ナトリウムにてｐＨを８．０に調整した後、たんぱく質１ｇ当たりプロテアーゼＰ３ＳＤ１０ｍｇを添加し、３０℃で２時間反応させた。反応終了後、１２０℃で３秒間加熱し、酵素分解ペプチド組成物を得た。この酵素分解ペプチド組成物をペプチド５含有組成物とした。
［実施例６］
酸カゼイン１０ｋｇをイオン交換水２００Ｌに５０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。水酸化ナトリウムにてｐＨを８．０に調整した後、たんぱく質１ｇ当たりプロテアーゼＰ３ＳＤ２０ｍｇを添加し、３０℃で４時間反応させた。反応終了後、１２０℃で３秒間加熱し、酵素分解ペプチド組成物を得た。さらに、平均分画分子量１０，０００の限外ろ過膜にて分画して保持物を得た。この酵素分解ペプチド組成物をペプチド６含有組成物とした。
【００２３】
［比較例１〜１４］
実施例１と同様に、カゼインナトリウム５ｇをイオン交換水１００ｍｌに５０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。水酸化ナトリウムにてそれぞれのｐＨに調整した後、たんぱく質１ｇ当たりアルカラーゼ１０ｍｇ、プロテアーゼＰ３ＳＤ１０ｍｇ、プロテアーゼＮＳＤ１０ｍｇ、プロテアーゼＡＳＤ１０ｍｇ、フレーバーザイム１０ｍｇまたはニュートラーゼ１０ｍｇをそれぞれ添加し、３０〜６５℃で４時間反応させた。反応終了後、１００℃で１０分間加熱し、酵素分解ペプチド組成物を得た。これをそれぞれ対照サンプル１含有組成物〜対照サンプル１４含有組成物とした。
実施例１〜６および比較例１〜１４の各ペプチド含有組成物および対照サンプル含有組成物の調製条件を表１にまとめて示した。
【００２４】
【表１】
【００２５】
［試験例１］
実施例１で得られたペプチド１含有組成物ならびに比較例１の対照サンプル１含有組成物について、牛乳アレルギー患者より得られた血清を用いてリンパ球刺激試験を行い、免疫寛容誘導効果を調べた。
リンパ球刺激試験は、アレルギー患者血清より分離した末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）を用いて評価した。すなわち、ＰＢＭＣｓと対照被験物質を３７℃・５％ＣＯ2環境下で５日間培養し、培養終了１６時間にＰＢＭＣｓが細胞内に取り込んだ〔３Ｈ〕−サイミジン（１ウェル当たり ０．５μＣｉ）量を、液体シンチレーションカウンターを用いて測定した。この細胞内に取り込んだ〔３Ｈ〕−サイミジン量からＰＢＭＣｓの増殖能をＳｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ Ｉｎｄｅｘ（ＳＩ）として換算し、Ｔ細胞反応性の指標とした。培養は、９６穴マイクロプレート（ロシェ社）に１ウェル当たり２×１０5の細胞および対象被験物質（２０μｇ／ｍｌ）を加えて行った。培地にはＲＰＭＩ１６４０（三光純薬）を用いた。
その結果、図１に示すようにペプチド１含有組成物は分解反応前の基質カゼインよりやや減弱したもののＴ細胞反応性を示しており、免疫寛容誘導効果が認められた。一方、対照サンプル１含有組成物は、基質カゼインと比べて著しくＴ細胞反応性が減弱していた。
【００２６】
［試験例２］
実施例４で得られたペプチド４含有組成物ならびに比較例６の対照サンプル６含有組成物について、牛乳アレルギー患者より得られた血清を用いて試験例１と同様にリンパ球刺激試験を行い、免疫寛容誘導効果を調べた。
その結果、図２に示すようにペプチド４含有組成物は分解反応前の基質カゼインと同様のＴ細胞反応性を示しており、免疫寛容誘導効果が認められた。一方、対照サンプル６含有組成物は、基質カゼインと比べて著しくＴ細胞反応性が減弱していた。
比較例２〜５および７〜１４の対照サンプル２含有組成物〜対照サンプル５含有組成物および対照サンプル７含有組成物〜対照サンプル１４含有組成物においても、対照サンプル１含有組成物や対照サンプル６含有組成物と同様に、著しくＴ細胞が減弱していることが確認された。
【００２７】
［試験例３］
実施例１で得られたペプチド１含有組成物ならびに実施例４で得られたペプチド４含有組成物について、アナフィラキシーショックなどの即時型アレルギー症状を引き起こす可能性のあるＩｇＥに対する反応性を、ＩｇＥ−ウェスタンブロット法にて評価した。
まず、目的のたんぱく質を１５〜２５％グラジエントゲル（ＸＶ ＰＡＮＴＥＲＡ Ｇｅｌ：ＤＲＣ社）を用いて電気泳動し、ｉ−ｂｌｏｔ ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）を用いてＰＶＤＦ膜に転写した。その後、３％牛血清アルブミンを用いてブロッキングを行い、１次抗体および２次抗体でそれぞれ２時間反応させた後に発色させ、検出を行った。ＩｇＥ−ウェスタンブロットの１次抗体は、アレルギー患者血清とプロテインＧを混合した後、１５０００×ｇ にて遠心分離した上清を１０〜１００倍希釈したものを用い、２次抗体としてはＨＲＰ−標識抗ヒトＩｇＥ抗ヤギ抗体を用いた。
その結果、図３に示すように両組成物ともにＩｇＥに対する反応性は全く認められず、分解前反応前のカゼインと比べてＢ細胞反応性の著しい低減が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明のペプチド組成物は平均分子量が低いため、もとの未分解の乳たんぱく質の有する抗原性が非常に低減されており、牛乳アレルギー患者の治療に用いることができる。また、本ペプチド組成物は経口免疫寛容誘導能が非常に高く、生体の有する潜在的なアレルギー防御機構を十分に活性化できる。したがって、本発明のペプチド組成物は新しいアレルギー低減化および予防と治療を目的とした食品素材あるいは経口免疫寛容誘導材として有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、経口免疫寛容を効果的に誘導するペプチド組成物およびその調製方法に関する。より詳細には、特定の分子量以下のペプチドを有し、牛乳アレルギーの治療・予防に有用な経口免疫寛容を誘導するペプチド組成物およびその調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に生体は異種（非自己）抗原に対しては免疫反応を示すが、自己を構成する抗原に対しては免疫反応を示さない。しかし、本来は異種抗原であっても免疫反応を示さない場合があり、この現象は免疫寛容と呼ばれている。また、経口摂取して腸管を経由して体内に吸収された抗原に関しては、免疫反応における応答性が著しく低下することから、この現象は特に、経口免疫寛容と呼ばれている。
【０００３】
この経口免疫寛容の作用機序として、現在、クローナルアナジー・クローナルデリーション・アクティブサプレッションという３つの制御機構が働いているとされている。クローナルアナジーとは、免疫細胞が抗原に対して不応答化することを指し、アナジー状態になるリンパ球がＣＤ４+Ｔ細胞であることが確認されている（非特許文献１参照）。また、クローナルデリーションとは、抗原に反応するＴ細胞がアポトーシスを起こして消失する現象を指し、アクティブサプレッションにおいては、抗炎症性サイトカインであるＩＬ−１０を産生する調節性Ｔ細胞が大きな役割を果たしていることが知られている（非特許文献２参照）。従って、経口免疫寛容の作用機序にはＴ細胞が大きく関わっているとされている。さらに、近年においてはアレルギー疾患の発症には、ヘルパーＴ細胞のサブクラスと制御性Ｔ細胞とのバランスが重要であるとも言われている（非特許文献３参照）。
【０００４】
健常者においては、このようなＴ細胞を中心とした反応制御機構により経口免疫寛容が成立しているため、牛乳を摂取しても生体に不利益な免疫反応は惹起されない。しかし、牛乳アレルギー患者においてはＴ細胞による抗原に対する経口免疫寛容が成立しておらず、摂取した牛乳にアレルギーの引き金となるＢ細胞反応性が残存している場合には、様々なアレルギー症状が惹起され、アナフィラキシーショック等の重篤な症状を引き起こし死に至る場合もある。
そこで、牛乳アレルギー患者に対し、経口免疫寛容を誘導することによって牛乳アレルギーを予防・治療しようとする試みがなされており、牛乳たんぱく質加水分解物を利用したものが開示されてきた（特許文献１および２参照）。
【０００５】
しかし、牛乳たんぱく質加水分解物を利用する場合においても、経口免疫寛容を誘導するにはいくつかの問題点がある。牛乳たんぱく質加水分解物はアレルギー症状の惹起を避けるために、Ｂ細胞反応性が消失していること、または低減されていることが重要となる。牛乳たんぱく質加水分解物は、アレルゲンとなる牛乳中に含まれるβ−ラクトグロブリン（以下β−ＬＧとする）やカゼイン等の牛乳たんぱく質を酵素によって分解し、低分子のペプチドとしたものであるが、酵素反応の条件によって、Ｂ細胞反応性の消失に加えて、さらに免疫寛容を誘導するために重要なＴ細胞反応性も消失してしまうことが多いという問題があった。
【０００６】
そこで、Ｂ細胞反応性を消失または低減しつつ、Ｔ細胞反応性を維持したペプチドを得るために、ｐＨや温度、時間などの分解酵素における適度な反応条件の検討が望まれている。特に、食品添加物用の酵素は試験研究に供する目的において使用される酵素試薬とは異なり、高度に精製されておらず、様々な活性を持った複数の酵素による混合物であることが多い。したがって、ｐＨや温度などの緒条件によって各酵素の活性および酵素同士の相互作用が異なり、生じる分解物も多岐に渡るという問題がある。
特許文献１に示された牛乳たんぱく質加水分解物については、このような分解酵素の反応条件についての検討が全くなされておらず、特定の酵素反応条件で実験されていないため、効率的に経口免疫寛容を誘導するようなペプチドが得られているとは考えられない。
【０００７】
また、特許文献１および２には、経口免疫寛容を誘導したとする報告がされているが、マウスを用いた実験による結果である。一般に、経口免疫寛容の誘導されやすさに関しては動物の種類によって差があると言われており、特にマウスやラット等のげっ歯類は誘導されやすいとされている。特に、前述の様に経口免疫寛容の成立にはＴ細胞が非常に重要な役割を果たしているが、Ｔ細胞の認識する部位に関してはマウスの系統によってさえ異なることが報告されている（非特許文献４および５参照）。したがって、マウスにおいて経口免疫寛容が誘導されてもヒトで誘導されるとは限らないため、ヒトにおけるＴ細胞反応性を証明する必要があるといえる。
【０００８】
一方、本発明者らはヒトにおけるＴ細胞反応性を証明したペプチドを開発し、開示しているが（特許文献３参照）、経口免疫寛容の対象となるたんぱく質をβ−ＬＧのみに限定していたため、β−ＬＧ以外の牛乳たんぱく質に対してアレルギーを持つアレルギー患者においては利用できないという問題があった。
近年、β−ＬＧとともにカゼインも牛乳の主要なアレルゲンであるという報告（非特許文献６参照）がなされており、通常市販されている乳製品のほとんどにカゼインが含まれている。したがって、β−ＬＧのみに対して免疫寛容を誘導したとしても、カゼインに対する経口免疫寛容が誘導されていなければ、結局牛乳アレルギー患者は乳製品を摂取できないことになる。
また、カゼインの加水分解物を用いた抗アレルギー材が特許文献４に開示されているが、単純に抗原の体内への移行を防ぐだけであり、経口免疫寛容を誘導するような効果は認められておらず、カゼインに対して経口免疫寛容を誘導できる牛乳たんぱく質加水分解物は得られていない。
そこで従来法では解決できなかった、Ｂ細胞反応性を限りなく低減させ、一方でＴ細胞反応性を有し、ヒトにおいて牛乳由来のたんぱく質であるカゼインに対して経口免疫寛容を誘導できるペプチドの開発が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開平５−５０００号公報
【特許文献２】特開平７−１０１８７３号公報
【特許文献３】特開平２０−１９５６１８号公報
【特許文献４】特開平１６−９９４５７号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｈｉｒａｈａｒａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（１９９５）
【非特許文献２】清野 宏：医学のあゆみ（２００２）
【非特許文献３】齋藤 博久、化学と生物、（２００９）
【非特許文献４】Ｔｓｕｊｉ，ＮＭ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，（１９９３）
【非特許文献５】Ｔｏｔｓｕｋａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．，（１９９７）
【非特許文献６】Ｗａｌ ＪＭ， Ａｎｎ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｓｔｈｍａ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（２００４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、ＩｇＥを介してアナフィラキシーショック等の重篤な症状を引き起こすＢ細胞反応性が消失または低減され、かつ少量の抗原で長期に免疫寛容を誘導できるＴ細胞反応性を有する、ヒトにおいて牛乳アレルギー、特に牛乳由来のたんぱく質であるカゼインに対するアレルギーの治療・予防に供することのできるペプチド組成物およびその調製方法を確立し、提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するために、牛乳由来のたんぱく質であるカゼインを、たんぱく質加水分解酵素による分解処理ならびに限外ろ過膜による分画処理する方法を鋭意検討した。その結果、本発明者らは酵素活性が最も高い条件、いわゆる至適条件下で酵素反応を行うと分解が進みすぎて、Ｔ細胞反応性が減弱してしまうことを確認した。そこで、敢えて至適条件を外した条件下で適切な分解反応を調節したところ、Ｂ細胞反応性が消失または低減され、かつ免疫寛容を誘導するために重要なＴ細胞反応性を有するペプチドが得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は次の（１）〜（１１）のペプチド組成物またはその調製方法等に関する。
（１）牛乳由来のたんぱく質であるカゼインをＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のアルカリ性エンド型たんぱく質分解酵素でｐＨ９．５〜１０．５、温度５０〜６０℃、反応温度２〜４時間分解する経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物。
（２）たんぱく質分解酵素の分解条件が、ｐＨ１０、温度５５℃、反応時間４時間であることを特徴とする上記（１）に記載の経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物。
（３）牛乳由来のたんぱく質であるカゼインをＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｅｕｓ由来のアルカリ性エンド型たんぱく質分解酵素でｐＨ７．５〜８．５、温度２５〜３５℃、反応時間２〜４時間分解した経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物。
（４）たんぱく質分解酵素の分解条件が、ｐＨ８．０、温度３０℃、反応時間４時間であることを特徴とする上記（３）に記載の経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物。
（５）上記（２）または（４）に記載のペプチド組成物を分子量１０，０００の限外ろ過膜で処理し、その透過物として得られることを特徴とする経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物。
（６）上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載されたペプチド組成物を有効成分として含む経口免疫寛容誘導剤。
（７）牛乳由来のたんぱく質であるカゼインをＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のアルカリ性エンド型たんぱく質分解酵素でｐＨ９．５〜１０．５、温度５０〜６０℃、反応温度２〜４時間分解する経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物の調製方法。
（８）たんぱく質分解酵素の分解条件が、ｐＨ１０、温度５５℃、反応時間４時間であることを特徴とする上記（７）に記載の経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物の調製方法。
（９）牛乳由来のたんぱく質であるカゼインをＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｅｕｓ由来のアルカリ性エンド型たんぱく質分解酵素でｐＨ７．５〜８．５、温度２５〜３５℃、反応時間２〜４時間分解した経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物の調製方法。
（１０）たんぱく質分解酵素の分解条件が、ｐＨ８．０、温度３０℃、反応時間４時間であることを特徴とする上記（９）に記載の経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物の調製方法。
（１１）上記（７）または（９）に記載のペプチド組成物の調製方法であって、さらにペプチド組成物を分子量１０，０００の限外ろ過膜で処理し、その透過物として得られることを特徴とする経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物の調製方法。
【発明の効果】
【００１４】
乳幼児に多く認められる食物アレルギーの原因のひとつとして、食品たんぱく質の一部が消化酵素の分解を受けずに腸管から吸収され、生体免疫系を刺激してアレルギーを発症させることが指摘されている。この点に関して、本発明のペプチド組成物はその平均分子量が低いため、もとの未分解の乳たんぱく質の有する抗原性が非常に低減されており、牛乳アレルギー患者の治療に用いることができる。また、本ペプチド組成物は経口免疫寛容誘導能に関しては非常に高いため、生体の有する潜在的なアレルギー防御機構を十分に活性化できる。
したがって、本発明のペプチド組成物は新しいアレルギー低減化および予防と治療を目的とした食品素材あるいは経口免疫寛容誘導材として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】分解反応前の基質カゼインならびにペプチド１含有組成物および対照サンプル１含有組成物について、Ｔ細胞反応性を、牛乳アレルギー患者血清を用いたリンパ球幼弱化反応法で検討した図である（試験例１）。
【図２】分解反応前の基質カゼインならびにペプチド４含有組成物および対照サンプル４含有組成物について、Ｔ細胞反応性を、牛乳アレルギー患者血清を用いたリンパ球幼弱化反応法で検討した図である（試験例２）。
【図３】分解反応前の基質カゼインならびにペプチド１含有組成物およびペプチド４含有組成物について、Ｂ細胞反応性を、牛乳アレルギー患者血清を用いたＩｇＥ−ウェスタンブロット法で検討した図である（試験例３）。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の「経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物」とは、カゼインをたんぱく質分解酵素で酵素分解することによって得られる、Ｂ細胞反応性が消失または低減されており、かつＴ細胞反応性を有するペプチドを含む組成物のことをいう。
本発明のペプチド組成物を得るために用いるカゼインは、牛乳由来のカゼインであればいずれのものも用いることができるが、特にカゼインを高含有する酸カゼインまたはカゼインナトリウム、およびそれらに準ずるより純度の高いものを用いることが望ましい。
【００１７】
本発明の「経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物」は、上述したカゼインをたんぱく質加水分解酵素で処理し、低分子ペプチド化することで調製することができる。
たんぱく質加水分解酵素は、ペプチド結合を加水分解する酵素であればいずれのものも用いることができるが、本発明に用いる酵素は微生物由来のアルカリ性エンド型たんぱく質分解酵素、特に微生物のＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｅｕｓ由来のアルカリ性エンド型たんぱく質分解酵素が好ましい。これらの酵素は市販のものや独自に調製したいずれの酵素も用いることができるが、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のアルカリ性エンド型たんぱく質分解酵素として、アルカラーゼ（ノボ社）やＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｅｕｓ由来のアルカリ性エンド型たんぱく質分解酵素として、プロテアーゼＰ３ＳＤ（天野エンザイム社）等を用いることができる。
【００１８】
本発明の「経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物の調製方法」として、カゼインをたんぱく質加水分解酵素で処理し、低分子ペプチド化するには、牛乳由来のたんぱく質を基質としてこれにたんぱく質加水分解酵素を加えて、所定のｐＨ、温度で必要時間加水分解することが挙げられる。
例えば、カゼインをＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のアルカリ性エンド型たんぱく質分解酵素でｐＨ９．５〜１０．５、温度５０〜６０℃、反応温度２〜４時間分解することで、Ｂ細胞反応性が消失または低減されており、かつＴ細胞反応性を有するペプチド組成物を得ることができる。この調製においては、さらに、たんぱく質分解酵素の分解条件が、基質濃度５％、ｐＨ１０．０、温度５５℃、４時間であることが望ましく、より抗原性の高い高分子物質を除去するために分子量が１０，０００の限外ろ過膜を用いて精製する事が特に望ましい。
または、カゼインをＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｅｕｓ由来のアルカリ性エンド型たんぱく質分解酵素でｐＨ７．５〜８．５、温度２５〜３５℃、反応時間２〜４時間分解することで、Ｂ細胞反応性が消失または低減されており、かつＴ細胞反応性を有するペプチド組成物を得ることができる。
この調製においては、さらに、たんぱく質分解酵素の分解条件が、基質濃度５％、ｐＨ８．０、温度３０℃、４時間であることが望ましく、より抗原性の高い高分子物質を除去するために分子量が１０，０００の限外ろ過膜を用いて精製する事が特に望ましい。
【００１９】
本発明で得られる「経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物」は、Ｂ細胞反応性が消失または低減されており、かつＴ細胞反応性を有することが、牛乳アレルギー患者Ｔ細胞において基質であるカゼインと同程度の反応性を示していること、および牛乳アレルギー患者血清を用いたＩｇＥ−ウェスタンブロット法により、ＩｇＥ反応性の消失が示されていることから確認されている。
【００２０】
従って、本発明によって得られる「経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物」は、Ｂ細胞反応性が低減しているため抗原性が低く、かつ免疫寛容誘導能は未分解の牛乳由来たんぱく質と同等に優れており、さらにペプチド態であるために耐熱性等の加工特性に優れているため、新規のアレルギー予防・治療食品素材として、単独または清涼飲料水、ミネラルウォーター、茶などの各種飲料、クッキー、ビスケット、煎餅等の菓子類、または育児用調製粉乳、パン、ゼリー、口腔清涼菓子などの食品とともに自由に使用することができる。
また、「経口免疫寛容誘導剤」の有効成分として使用することができる。本発明の「経口免疫寛容誘導剤」は、本発明によって得られる「経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物」を有効成分として含む「経口免疫寛容誘導剤」であればいずれのものも含まれる。例えば、「経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物」をそのまままたはその他の成分と組み合わせたものを、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、粉剤、溶液剤など所望する剤型に製剤化した「経口免疫寛容誘導剤」などが挙げられる。これは経口投与用食品として経口免疫寛容誘導および／またはそのための補助的処置として用いることもできる。
本発明によって得られる「経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物」は本来食品として用いることができるものであるため安全性に問題は無く、その用量も適宜で良い。
以下に実施例および試験例を示し、さらに本発明を詳細に説明する。
【実施例】
【００２１】
［試料］
本発明の実施例および比較例においては次の試料を用いた。
１．カゼイン
１）カゼインナトリウム（たんぱく質含量９０％、フォンテラ社）
２）酸カゼイン（たんぱく質含量９０％、フォンテラ社）
２．酵素
１）アルカラーゼ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来、ノボ社、表示活性 ２．４ＡＵ／ｇ）
２）プロテアーゼＰ３ＳＤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｅｕｓ由来、天野エンザイム社、たん白消化力 ３０，０００ｕ／ｇ以上）
３）プロテアーゼＮＳＤ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来、天野エンザイム社、たん白消化力 １５０，０００ｕ／ｇ以上）
４）プロテアーゼＡＳＤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来、天野エンザイム社、たん白消化力 １０，０００ｕ／ｇ以上）
５）フレーバーザイム（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来、ノボ社、表示活性 １０００ＬＡＰＵ／ｇ）
６）ニュートラーゼ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ由来、ノボ社、表示活性 ０．８ＡＵ／ｇ）
【００２２】
［実施例１］
カゼインナトリウム５ｇをイオン交換水１００ｍｌに５０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。水酸化ナトリウムにてｐＨを１０に調整した後、たんぱく質１ｇ当たりアルカラーゼ１０ｍｇを添加し、５５℃で４時間反応させた。反応終了後、１００℃で１０分間加熱し、酵素分解ペプチド組成物を得た。この酵素分解ペプチド組成物をペプチド１含有組成物とした。
［実施例２］
酸カゼイン１０ｋｇをイオン交換水１００Ｌに１００ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。水酸化ナトリウムにてｐＨを１０に調整した後、たんぱく質１ｇ当たりアルカラーゼ２０ｍｇを添加し、５５℃で２時間反応させた。反応終了後、１２０℃で３秒間加熱し、酵素分解ペプチド組成物を得た。この酵素分解ペプチド組成物をペプチド２含有組成物とした。
［実施例３］
カゼインナトリウム２５ｋｇをイオン交換水５００Ｌに５０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。水酸化ナトリウムにてｐＨを１０に調整した後、たんぱく質１ｇ当たりアルカラーゼ１０ｍｇを添加し、５５℃で４時間反応させた。反応終了後、１２０℃で３秒間加熱し、酵素分解ペプチド組成物を得た。さらに、平均分画分子量１０，０００の限外ろ過膜にて分画して保持物を得た。この酵素分解ペプチド組成物をペプチド３含有組成物とした。
［実施例４］
カゼインナトリウム５ｇをイオン交換水１００ｍｌに５０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。水酸化ナトリウムにてｐＨを８．０に調整した後、たんぱく質１ｇ当たりプロテアーゼＰ３ＳＤ１０ｍｇを添加し、３０℃で４時間反応させた。反応終了後、１００℃で１０分間煮沸し、酵素分解ペプチド組成物を得た。この酵素分解ペプチド組成物をペプチド４含有組成物とした。
［実施例５］
酸カゼイン５ｋｇをイオン交換水１００Ｌに５０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。水酸化ナトリウムにてｐＨを８．０に調整した後、たんぱく質１ｇ当たりプロテアーゼＰ３ＳＤ１０ｍｇを添加し、３０℃で２時間反応させた。反応終了後、１２０℃で３秒間加熱し、酵素分解ペプチド組成物を得た。この酵素分解ペプチド組成物をペプチド５含有組成物とした。
［実施例６］
酸カゼイン１０ｋｇをイオン交換水２００Ｌに５０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。水酸化ナトリウムにてｐＨを８．０に調整した後、たんぱく質１ｇ当たりプロテアーゼＰ３ＳＤ２０ｍｇを添加し、３０℃で４時間反応させた。反応終了後、１２０℃で３秒間加熱し、酵素分解ペプチド組成物を得た。さらに、平均分画分子量１０，０００の限外ろ過膜にて分画して保持物を得た。この酵素分解ペプチド組成物をペプチド６含有組成物とした。
【００２３】
［比較例１〜１４］
実施例１と同様に、カゼインナトリウム５ｇをイオン交換水１００ｍｌに５０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。水酸化ナトリウムにてそれぞれのｐＨに調整した後、たんぱく質１ｇ当たりアルカラーゼ１０ｍｇ、プロテアーゼＰ３ＳＤ１０ｍｇ、プロテアーゼＮＳＤ１０ｍｇ、プロテアーゼＡＳＤ１０ｍｇ、フレーバーザイム１０ｍｇまたはニュートラーゼ１０ｍｇをそれぞれ添加し、３０〜６５℃で４時間反応させた。反応終了後、１００℃で１０分間加熱し、酵素分解ペプチド組成物を得た。これをそれぞれ対照サンプル１含有組成物〜対照サンプル１４含有組成物とした。
実施例１〜６および比較例１〜１４の各ペプチド含有組成物および対照サンプル含有組成物の調製条件を表１にまとめて示した。
【００２４】
【表１】
【００２５】
［試験例１］
実施例１で得られたペプチド１含有組成物ならびに比較例１の対照サンプル１含有組成物について、牛乳アレルギー患者より得られた血清を用いてリンパ球刺激試験を行い、免疫寛容誘導効果を調べた。
リンパ球刺激試験は、アレルギー患者血清より分離した末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）を用いて評価した。すなわち、ＰＢＭＣｓと対照被験物質を３７℃・５％ＣＯ2環境下で５日間培養し、培養終了１６時間にＰＢＭＣｓが細胞内に取り込んだ〔３Ｈ〕−サイミジン（１ウェル当たり ０．５μＣｉ）量を、液体シンチレーションカウンターを用いて測定した。この細胞内に取り込んだ〔３Ｈ〕−サイミジン量からＰＢＭＣｓの増殖能をＳｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ Ｉｎｄｅｘ（ＳＩ）として換算し、Ｔ細胞反応性の指標とした。培養は、９６穴マイクロプレート（ロシェ社）に１ウェル当たり２×１０5の細胞および対象被験物質（２０μｇ／ｍｌ）を加えて行った。培地にはＲＰＭＩ１６４０（三光純薬）を用いた。
その結果、図１に示すようにペプチド１含有組成物は分解反応前の基質カゼインよりやや減弱したもののＴ細胞反応性を示しており、免疫寛容誘導効果が認められた。一方、対照サンプル１含有組成物は、基質カゼインと比べて著しくＴ細胞反応性が減弱していた。
【００２６】
［試験例２］
実施例４で得られたペプチド４含有組成物ならびに比較例６の対照サンプル６含有組成物について、牛乳アレルギー患者より得られた血清を用いて試験例１と同様にリンパ球刺激試験を行い、免疫寛容誘導効果を調べた。
その結果、図２に示すようにペプチド４含有組成物は分解反応前の基質カゼインと同様のＴ細胞反応性を示しており、免疫寛容誘導効果が認められた。一方、対照サンプル６含有組成物は、基質カゼインと比べて著しくＴ細胞反応性が減弱していた。
比較例２〜５および７〜１４の対照サンプル２含有組成物〜対照サンプル５含有組成物および対照サンプル７含有組成物〜対照サンプル１４含有組成物においても、対照サンプル１含有組成物や対照サンプル６含有組成物と同様に、著しくＴ細胞が減弱していることが確認された。
【００２７】
［試験例３］
実施例１で得られたペプチド１含有組成物ならびに実施例４で得られたペプチド４含有組成物について、アナフィラキシーショックなどの即時型アレルギー症状を引き起こす可能性のあるＩｇＥに対する反応性を、ＩｇＥ−ウェスタンブロット法にて評価した。
まず、目的のたんぱく質を１５〜２５％グラジエントゲル（ＸＶ ＰＡＮＴＥＲＡ Ｇｅｌ：ＤＲＣ社）を用いて電気泳動し、ｉ−ｂｌｏｔ ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）を用いてＰＶＤＦ膜に転写した。その後、３％牛血清アルブミンを用いてブロッキングを行い、１次抗体および２次抗体でそれぞれ２時間反応させた後に発色させ、検出を行った。ＩｇＥ−ウェスタンブロットの１次抗体は、アレルギー患者血清とプロテインＧを混合した後、１５０００×ｇ にて遠心分離した上清を１０〜１００倍希釈したものを用い、２次抗体としてはＨＲＰ−標識抗ヒトＩｇＥ抗ヤギ抗体を用いた。
その結果、図３に示すように両組成物ともにＩｇＥに対する反応性は全く認められず、分解前反応前のカゼインと比べてＢ細胞反応性の著しい低減が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明のペプチド組成物は平均分子量が低いため、もとの未分解の乳たんぱく質の有する抗原性が非常に低減されており、牛乳アレルギー患者の治療に用いることができる。また、本ペプチド組成物は経口免疫寛容誘導能が非常に高く、生体の有する潜在的なアレルギー防御機構を十分に活性化できる。したがって、本発明のペプチド組成物は新しいアレルギー低減化および予防と治療を目的とした食品素材あるいは経口免疫寛容誘導材として有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
牛乳由来のたんぱく質であるカゼインをＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のアルカリ性エンド型たんぱく質分解酵素でｐＨ９．５〜１０．５、温度５０〜６０℃、反応温度２〜４時間分解する経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物。
【請求項２】
たんぱく質分解酵素の分解条件が、ｐＨ１０、温度５５℃、反応時間４時間であることを特徴とする請求項１に記載の経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物。
【請求項３】
牛乳由来のたんぱく質であるカゼインをＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｅｕｓ 由来のアルカリ性エンド型たんぱく質分解酵素でｐＨ７．５〜８．５、温度２５〜３５℃、反応時間２〜４時間分解した経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物。
【請求項４】
たんぱく質分解酵素の分解条件が、ｐＨ８．０、温度３０℃、反応時間４時間であることを特徴とする請求項３に記載の経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物。
【請求項５】
請求項２または４に記載のペプチド組成物を分子量１０，０００の限外ろ過膜で処理し、その透過物として得られることを特徴とする経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載されたペプチド組成物を有効成分として含む経口免疫寛容誘導剤。
【請求項７】
牛乳由来のたんぱく質であるカゼインをＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のアルカリ性エンド型たんぱく質分解酵素でｐＨ９．５〜１０．５、温度５０〜６０℃、反応温度２〜４時間分解する経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物の調製方法。
【請求項８】
たんぱく質分解酵素の分解条件が、ｐＨ１０、温度５５℃、反応時間４時間であることを特徴とする請求項７に記載の経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物の調製方法。
【請求項９】
牛乳由来のたんぱく質であるカゼインをＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｅｕｓ 由来のアルカリ性エンド型たんぱく質分解酵素でｐＨ７．５〜８．５、温度２５〜３５℃、反応時間２〜４時間分解した経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物の調製方法。
【請求項１０】
たんぱく質分解酵素の分解条件が、ｐＨ８．０、温度３０℃、反応時間４時間であることを特徴とする請求項９に記載の経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物の調製方法。
【請求項１１】
請求項７または９に記載のペプチド組成物の調製方法であって、さらにペプチド組成物を分子量１０，０００の限外ろ過膜で処理し、その透過物として得られることを特徴とする経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物の調製方法。
【請求項１】
牛乳由来のたんぱく質であるカゼインをＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のアルカリ性エンド型たんぱく質分解酵素でｐＨ９．５〜１０．５、温度５０〜６０℃、反応温度２〜４時間分解する経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物。
【請求項２】
たんぱく質分解酵素の分解条件が、ｐＨ１０、温度５５℃、反応時間４時間であることを特徴とする請求項１に記載の経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物。
【請求項３】
牛乳由来のたんぱく質であるカゼインをＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｅｕｓ 由来のアルカリ性エンド型たんぱく質分解酵素でｐＨ７．５〜８．５、温度２５〜３５℃、反応時間２〜４時間分解した経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物。
【請求項４】
たんぱく質分解酵素の分解条件が、ｐＨ８．０、温度３０℃、反応時間４時間であることを特徴とする請求項３に記載の経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物。
【請求項５】
請求項２または４に記載のペプチド組成物を分子量１０，０００の限外ろ過膜で処理し、その透過物として得られることを特徴とする経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載されたペプチド組成物を有効成分として含む経口免疫寛容誘導剤。
【請求項７】
牛乳由来のたんぱく質であるカゼインをＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のアルカリ性エンド型たんぱく質分解酵素でｐＨ９．５〜１０．５、温度５０〜６０℃、反応温度２〜４時間分解する経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物の調製方法。
【請求項８】
たんぱく質分解酵素の分解条件が、ｐＨ１０、温度５５℃、反応時間４時間であることを特徴とする請求項７に記載の経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物の調製方法。
【請求項９】
牛乳由来のたんぱく質であるカゼインをＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｅｕｓ 由来のアルカリ性エンド型たんぱく質分解酵素でｐＨ７．５〜８．５、温度２５〜３５℃、反応時間２〜４時間分解した経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物の調製方法。
【請求項１０】
たんぱく質分解酵素の分解条件が、ｐＨ８．０、温度３０℃、反応時間４時間であることを特徴とする請求項９に記載の経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物の調製方法。
【請求項１１】
請求項７または９に記載のペプチド組成物の調製方法であって、さらにペプチド組成物を分子量１０，０００の限外ろ過膜で処理し、その透過物として得られることを特徴とする経口免疫寛容誘導能を有するペプチド組成物の調製方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１１−１７３８００（Ｐ２０１１−１７３８００Ａ）
【公開日】平成２３年９月８日（２０１１．９．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−３６９８２（Ｐ２０１０−３６９８２）
【出願日】平成２２年２月２３日（２０１０．２．２３）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２１年度、独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 「平成２１年度生物系産業創出のための異分野融合研究支援事業」（産業技術力強化法第１９条の適用を受けるもの）
【出願人】（５０７０４２６４８）ビーンスターク・スノー株式会社 (6)
【出願人】（３０４０１９３９９）国立大学法人岐阜大学 (289)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月８日（２０１１．９．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月２３日（２０１０．２．２３）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２１年度、独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 「平成２１年度生物系産業創出のための異分野融合研究支援事業」（産業技術力強化法第１９条の適用を受けるもの）
【出願人】（５０７０４２６４８）ビーンスターク・スノー株式会社 (6)
【出願人】（３０４０１９３９９）国立大学法人岐阜大学 (289)
【Ｆターム（参考）】
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