絨毛伸張剤
【課題】ヒトを含む動物において、小腸の絨毛伸張を促進せしめて消化吸収を改善しうる絨毛伸張剤を提供すること。
【解決手段】乳酸菌を培養後、培地成分を水で洗浄除去し、過熱殺菌し、ヒト乳幼児や離乳期にある仔ブタに経口投与又は経鼻投与し、小腸の絨毛伸張を促進させることにより、消化吸収不良に起因する疾患を改善する。また、小腸切除した短腸症候群の患者の消化吸収を改善し、低栄養状態を改善する。前記乳酸菌としては、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）ＥＣ−１２であることが好ましい。
【解決手段】乳酸菌を培養後、培地成分を水で洗浄除去し、過熱殺菌し、ヒト乳幼児や離乳期にある仔ブタに経口投与又は経鼻投与し、小腸の絨毛伸張を促進させることにより、消化吸収不良に起因する疾患を改善する。また、小腸切除した短腸症候群の患者の消化吸収を改善し、低栄養状態を改善する。前記乳酸菌としては、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）ＥＣ−１２であることが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌、その死菌体又はそれらの処理物を有効成分とするヒトや仔ブタ等の小腸絨毛伸張剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
小腸は上から順に十二指腸・空腸・回腸と呼ばれ、このうち、胃からつながる十二指腸は後腹壁に固定されているが、空腸・回腸は腸間膜にくっついていて、かなり自由に動くことができる。この空・回腸を腸間膜小腸といい、小腸とはこの部分をさす。小腸は、消化・吸収の面で消化管の中で最も重要な器官であり、消化・吸収面積を増大するために著しい形態的分化を遂げている。小腸の形態的特徴の一つである小腸絨毛は、小腸粘膜の突出であり、単層の上皮細胞によって覆われ、さらにその細胞表面には数千に達する微絨毛という突起がある。絨毛構造は小腸における一大特徴であり、吸収機能に大きく関与している。ヒトの小腸を単に円筒と考えた場合の表面積はおよそ０．３３ｍ２であるが、輪状ヒダ数、さらに絨毛（長さ１ｍｍ、約５００万個）の形成によってその表面積はおよそ１０ｍ２に達する。また、吸収細胞１個当たり６００個の微絨毛（長さ１μｍ）の存在によって、その表面積はさらに２００ｍ２（約６００倍）にも達し、吸収効率を著しく増大せしめている。即ち、腸容積わずか１μｌが、約１ｃｍ２の吸収表面積をもつものである。腸絨毛は、回腸の末端に近づくにつれて粗になり、絨毛と絨毛との間には小腸陰窩がある。その粘膜上皮のうち、大部分は盛んに細胞分裂、増殖を繰り返しながら吸収上皮や杯細胞に分化しながら絨毛表面を上方へ移動し、古い絨毛上皮と置き換わっていく。また、腸の上皮細胞には多くの内分泌細胞が混在し、局所的、全身的に様々なホルモンを分泌する。
【０００３】
糖質、タンパク質、脂肪といった栄養素は微絨毛から吸収される。この部分には消化酵素がいつも待ちかまえており、栄養素がこの酵素にぶつかってバラバラになったところを、すばやく腸壁内に取り込むのである。微絨毛細胞の寿命は２４時間、人体でもっとも短命な細胞である。人間生存のために必要不可欠な栄養吸収の現場では、いつでもフレッシュな感度をもった細胞が必要とされているということである。ちなみに、小腸はほぼ無菌状態である。哺乳動物の肉眼病変は小腸壁の菲薄化が特徴で、腸壁を通して内容物が透けて観察され、哺乳ブタでは未消化凝固物が胃内に貯留する。ウイルスは小腸の粘膜上皮細胞で増殖し、細胞の変性壊死を起こす。小腸絨毛の萎縮により絨毛丈と陰窩長の比は約１：１まで低下することがある。腸絨毛には外部からの異物を排除する強い免疫機構があるため、絨毛の萎縮が起こると細菌が侵入（感染）しやすくなり、普段は感染力のないような細菌に感染しやすくなる原因となることもある。
【０００４】
体外環境との境界をなす消化管粘膜上皮は大量の食餌性抗原や腸内細菌叢、さらには外来性の細菌やウイルスなどの病原体に常に曝されている。消化管にはパイエル板をはじめとするリンパ組織が発達しており、腸内の微生物や食餌性高分子などの抗原を取り込んでモニターすることにより、免疫監視に重要な役割を果たしている。パイエル板を覆う上皮はＦＡＥ（follicle-associated epithelium）と呼ばれ、通常の絨毛上皮とは異なる性質を示すことが知られている。ＦＡＥにはＭ細胞と呼ばれる微絨毛の発達していない上皮細胞が点在し、トランスサイトーシスという細胞内輸送系を発達させて積極的に腸内抗原を取り込みパイエル板の免疫細胞に受け渡すことにより、免疫監視の発動に主要な役割を担うと考えられる。トランスサイトーシスをはじめとするＭ細胞の機能を理解し人為的に調節することができれば、免疫応答の制御に繋がる。しかし、Ｍ細胞はその絶対数が少なく特異的なマーカー分子も無いことから、その分子細胞生物学的解析はほとんど進んでいない。また、腸管上皮細胞のタイトジャンクションの膜分子のバリア機能（物質透過性）が、アレルギー疾患に関与している可能性も指摘されている。たとえば小児期のタイトジャンクション形成の不十分さによって、取り込まれる食物抗原の選択性が得られずアレルギー疾患症状を引き起こすとされている。
【０００５】
従来、乳酸菌と腸絨毛高さとの関連についての文献は少なく、腸絨毛上皮細胞との関係については、例えば、動物の腸絨毛上皮細胞を、乳酸菌ストレプトコッカス・フェーカリス菌体の存在下に組織培養し、腸上皮細胞内に進入した菌株のみを選択採取し、この選択した菌株を用いて常法通り乳酸菌製剤とする腸管定着性の確実な乳酸製剤の製造法（例えば、特許文献１参照）等が知られている。また、最近では、腸絨毛高さを増加し、腸吸収を促進する作用を有する、短腸症候群を処置するのに有用なＥＧＦ（上皮成長因子）産生組換え乳酸菌、具体的にはＥＧＦ産生組換えラクトコッカス・ラクチス、ＥＧＦ産生組換えラクトコッカス・カゼイが知られている（例えば、特許文献２参照）。
【０００６】
他方、乳酸菌それ自体、或いはその処理物の用途として、近年増加の一途をたどっているアレルギー性疾患の予防・治療を挙げることができる。例えば、ストレプトコッカス・フェカリス等の乳酸菌を所定の処理を施して、乳酸菌から抗アレルギー剤として有効な成分を抽出する方法（例えば、特許文献３参照）や、ストレプトコッカス属、エンテロコッカス属等に属する腸内細菌の生菌体を抗アレルギー成分とする腸内細菌叢改善組成物（例えば、特許文献４参照）や、ラクトバチルス・アシドフィルス等の乳酸菌の菌体を有効成分とするＩｇＥ抗体産生抑制剤又は抗アレルギー剤（例えば、特許文献５参照）が知られている。
【０００７】
また、エンテロコッカス属に属する菌体の酵素処理菌を主成分とする抗アレルギー剤（例えば、特許文献６参照）や、ヒトの腸内細菌群より分離された乳酸菌として、エンテロコッカス・フェカリス（ＡＤ１０１株）、ラクトバシルス・ロイテリー（ＡＤ０００２株）のうち１種類以上の菌体を含有するヒスタミン遊離抑制効果を有するＩ型アレルギー抑制剤（例えば、特許文献７参照）や、乳酸菌の菌体成分を主成分とするＴヘルパー細胞１型（Ｔｈ１）誘導剤（例えば、特許文献８参照）や、ラクトバチルス・アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）に属する乳酸菌、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）に属する乳酸菌、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される乳酸菌を有効成分として含む抗アレルギー剤（例えば、特許文献９参照）が知られている。さらに、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）等の乳酸菌、その死菌体、その処理物あるいはメガスフェラ・エルスデニ（Megasphaera elsdenii）を有効成分とする、バンコマイシン等薬剤耐性菌保菌乃至感染している家畜・家禽又は魚介類の感染防除剤（例えば、特許文献１０参照）が知られている。
【０００８】
【特許文献１】特公昭４６−３８５９２号公報
【特許文献２】特表２００５−５２９６２２号公報
【特許文献３】特開昭５７−１５４１３２号公報
【特許文献４】特開平７−２６５０６４号公報
【特許文献５】特開平９−２９５９号公報
【特許文献６】特許第３０４０７４４号公報
【特許文献７】特開２０００−９５６９７号公報
【特許文献８】特開２００３−１３７７９５号公報
【特許文献９】特開２００４−２６７２９号公報
【特許文献１０】特開２００６−８９４２１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
離乳仔ブタの消化器は、母乳から成ブタ用飼料へ移行するという急激な餌の変化と共に、離乳や環境の変化などのストレス状態にあり、このような状況下で、病原性大腸菌により下痢症状をひき起こすことがしばしば見受けられる。これは、離乳前後における仔ブタの腸管内の変化があるからであり、健康な腸絨毛は、長く伸び、これにより、腸の表面積が格段に広がって消化吸収を促進している。また、哺乳期間中は母乳中に含まれるＩｇＡ抗体が、毎回哺乳時に母乳から供給され、腸絨毛の表面を覆って、大腸菌等の病原性微生物が仔ブタの腸絨毛に付着するのを防いでいるといわれている。しかし、栄養豊富で消化のよい母乳が離乳により断ち切られ、急に成ブタ用飼料を食すると、腸粘膜での消化吸収は、その変化に追いつけず、腸絨毛は短くなって（Res Vet Sci 1986 Jan;40(1):32-40参照）、栄養成分の吸収力は低下する。この状態によって、吸収されない栄養分は大腸に至り、これら病原性微生物を含む各種の微生物の増殖をひき起こすことになる。本発明の課題は、ヒトを含む動物において、小腸の絨毛伸張を促進せしめて消化吸収を改善しうる絨毛伸張剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、先行技術のようにＥＧＦを産生する組換え乳酸菌を用いずに、ある種のエンテロコッカス・フェカリスの死菌体を離乳期の仔ブタに経口又は経鼻投与し、小腸内の絨毛の長さを、投与した群と投与しない対照群を比較したところ、該乳酸菌を投与した小腸内の絨毛の高さが、対照群と比べて有意に伸長していることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、（１）乳酸菌（但し、ＥＧＦ産生組換え乳酸菌は除く）、その死菌体及びそれらの処理物を有効成分として含有することを特徴とする動物の小腸絨毛伸張剤や、（２）乳酸菌がエンテロコッカス属に属する微生物であることを特徴とする前記（１）記載の動物の小腸絨毛伸張剤や、（３）エンテロコッカス属に属する微生物が、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）であることを特徴とする前記（２）に記載の動物の小腸絨毛伸張剤や、（４）エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）が、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）ＥＣ−１２（ＦＥＲＭ ＢＰ１０２８４）であることを特徴とする前記（３）記載の動物の小腸絨毛伸張剤や、（５）経口投与又は経鼻投与されることを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれかに記載の動物の小腸絨毛伸張剤に関する。
【００１２】
また本発明は、（６）乳酸菌（但し、ＥＧＦ産生組換え乳酸菌は除く）、その死菌体及びそれらの処理物を動物の小腸絨毛伸張剤として使用する方法や、（７）乳酸菌がエンテロコッカス属に属する微生物であることを特徴とする前記（６）記載の方法や、（８）エンテロコッカス属に属する微生物が、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）であることを特徴とする前記（７）に記載の方法や、（９）エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）が、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）ＥＣ−１２（ＦＥＲＭ ＢＰ１０２８４）であることを特徴とする前記（８）記載の方法や、（１０）経口投与又は経鼻投与されることを特徴とする前記（６）〜（９）のいずれかに記載の方法に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の小腸絨毛伸張剤は、小腸絨毛を伸張させることにより、ヒト乳幼児期又は離乳期にある仔ブタの消化吸収を改善し、消化吸収不良に起因する疾患を改善することや、小腸切除した短腸症候群の患者の消化吸収を改善し、低栄養状態を改善することが期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の小腸絨毛伸張剤としては、乳酸菌（但し、ＥＧＦ産生組換え乳酸菌は除く）、その死菌体及びそれらの処理物を有効成分とするものであれば特に制限されるものではなく、また本発明の方法としては、乳酸菌（但し、ＥＧＦ産生組換え乳酸菌は除く）、その死菌体及びそれらの処理物を動物の小腸絨毛伸張剤として使用する方法であれば特に制限されるものではなく、対象となる動物としては、ヒトの他家畜・家禽類やペット類を好適に例示することができ、家畜・家禽類としては、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギなどの家畜、ニワトリ、カモ、ダチョウ、アヒルなどの家禽を具体的に挙げることができ、ペット類としてはイヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター等を具体的に挙げることができる。また、使用方法における動物としては、家畜・家禽類やペット類を好適に例示することができる。
【００１５】
上記乳酸菌としては、エンテロコッカス属（Entrococcus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、ストレプトコッカス属（Storeptococcus）、ラクトバシラス属（Lactobacillus）、ロイコノストック属（Leuconostoc）、ペディオコッカス属（Pediococcus）、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）又はテトラジェノコッカス属（Tetragenococcus）のいずれかに属する菌が好ましく、特にエンテロコッカス属に属する菌が好ましい。
【００１６】
上記エンテロコッカス属に属する菌としては、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・デュランス等を挙げることができ、エンテロコッカス・フェカリスＥＣ−１２が特に好ましい。上記ラクトコッカス属に属する菌としては、ラクトコッカス・ラクティス、ラクトコッカス・プランタラム、ラクトコッカス・ラフィノラクティス等を挙げることができる。上記ストレプトコッカス属に属する菌としては、ストレプトコッカス・サーモフィルス等を挙げることができる。上記ラクトバシラス属に属する菌としては、ラクトバシラス・アシドフィルス、ラクトバシラス・サリバリウス、ラクトバシラス・ブレビス、ラクトバシラス・ラムノサス、ラクトバシラス・プランタラム、ラクトバシラス・ヘルベティカス、ラクトバシラス・ファーメンタム、ラクトバシラス・パラカゼイ、ラクトバシラス・カゼイ、ラクトバシラス・デルブリュッキイ、ラクトバシラス・ロイテリ、ラクトバシラス・ガッセリ、ラクトバシラス・ジョンソニイ、ラクトバシラス・ケフィア、ラクトバシラス・ブルネリ等を挙げることができる。上記ロイコノストック属に属する菌としては、ロイコノストック・ラクティス、ロイコノストック・メセンテロイデス等を挙げることができる。上記ペディオコッカス属に属する菌としては、ペディオコッカス・ダムノサス等を挙げることができる。上記ビフィドバクテリウム属に属する菌としては、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム等を挙げることができ、特にビフィドバクテリウム・ブレーベが好ましい。テトラジェノコッカス属に属する菌としては、テトラジェノ・ハロフィルス等を挙げることができる。
【００１７】
これらの乳酸菌は、一種又は二種以上の菌種を配合して用いることができる。これらの乳酸菌等は、常法に従って任意の条件で培養することによって得ることができる。
【００１８】
本発明において乳酸菌は、生菌、その死菌体又はその処理物として用いることができる。前記死菌体としては、常法により培養、集菌した乳酸菌の菌体を洗浄し、遠心脱水し、必要に応じて洗浄・脱水を繰り返した後、蒸留水、生理食塩水等に懸濁し、この懸濁液を、例えば８０〜１１５℃で３０分〜３秒間加熱することにより得られる死菌体懸濁液やその乾燥物、又は前記死菌体懸濁液にガンマ線或いは中性子線を照射することにより得られる死菌体懸濁液やその乾燥物を挙げることができる。該死菌体懸濁液の乾燥手段としては公知の乾燥手段であれば特に制限されないが、噴霧乾燥、凍結乾燥等を例示することができる。場合によっては、加熱等による殺菌処理の前後、あるいは、乾燥処理の前後に、酵素処理、界面活性剤処理、磨砕・粉砕処理を行うこともでき、これらの処理により得られるものも、本発明の死菌体又はその処理物に含まれる。
【００１９】
本発明の小腸絨毛伸張剤としては、乳酸菌エンテロコッカス・フェカリスＥＣ−１２の死菌体又はその処理物を有効成分として含有する組成物が特に好ましい。エンテロコッカス・フェカリスＥＣ−１２は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）において２００５年２月２５日に「ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２８４」としても寄託されている。このエンテロコッカス・フェカリスＥＣ−１２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２８４）の培養方法としては、従来公知の乳酸菌の培養方法も含め特に制限されるものではないが、乳酸菌生育用培地を用い、３７℃で培養ｐＨを中性付近に維持しながら５〜１２０時間、好ましくは、１６〜２８時間培養し、生菌数約１０７〜１０１０／ｍｌ、好ましくは約１０８〜１０１０／ｍｌの培養液を得る方法を好適に例示することができる。
【００２０】
本発明の小腸絨毛伸張剤を製剤として用いる場合、デンプン、乳糖、大豆蛋白等の担体、賦形剤、結合材、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、懸濁剤等の添加剤を配合して、周知の方法で粉剤、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤等に製剤化することができる。またグルコン酸塩、ガラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖などのオリゴ糖類やセルロース、βグルカン、キトサンなどの食物繊維素材などのプレバイオテクス素材と組み合わせてもちいることもできる。かかる製剤はそのまま投与することもできるが、ベビーフード、飼料等に混じて給餌させることもできる。
さらに、本製剤を小腸術後の患者等に小腸絨毛伸張剤として、食品や食品素材に添加して用いることができる。その種類としては特に制限されず、例えば、ミネラルウォーター、スポーツ飲料、ジュース、牛乳、豆乳、酒類、コーヒー、紅茶、煎茶、ウーロン茶等の各種飲料、ヨーグルト、ドリンクヨーグルトや、プリン、クッキー、パン、ケーキ、ゼリー、煎餅などの焼き菓子、羊羹などの和菓子、冷菓、チューインガム等のパン・菓子類や、うどん、そば等の麺類や、かまぼこ、ハム、魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品や、みそ、しょう油、ドレッシング、マヨネーズ、甘味料等の調味類や、チーズ、バター等の乳製品や、豆腐、こんにゃく、その他佃煮、餃子、コロッケ、サラダ等の各種総菜を挙げることができる。
【００２１】
本発明の小腸絨毛伸張剤や使用方法における投与量や投与回数は、対象となる動物の種類、体重、日齢、月齢、病状、回復状態に応じて、適宜決定することができるが、ヒトにあっては乳幼児や小腸切除後に投与することが好ましく、ブタ等の家畜にあっては離乳期に投与することが好ましい。例えば、エンテロコッカス・フェカリスＥＣ−１２の死菌体又若しくは処理物を用いる場合、ベビーフードや飼料に０．０００１％〜０．２％、さらに望ましくは飼料に関しては０．０１％〜０．０５％含有させ、ヒト成人に対しては５０ｍｇ〜６００ｍｇ／日、通常の１日当たりの給餌量及び給餌回数とすることができる。
【００２２】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２３】
（実験目的）
仔ブタは離乳によって小腸絨毛が萎縮して消化吸収に悪影響を及ぼすため、絨毛高の萎縮予防もしくは早期回復が必要である。エンテロコッカス・フェカリスＥＣ−１２死菌体を経口又は経鼻投与した際の、小腸における絨毛高に及ぼす影響について組織学的な評価を行い、あわせて小腸組織培養中の免疫関連分子の遺伝子発現量を検討した。
【００２４】
（エンテロコッカス・フェカリスＥＣ−１２死菌体の調製）
エンテロコッカス・フェカリスＥＣ−１２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２８４）をロゴサ培地で３７℃、２４時間培養した前培養液を、酵母エキス４％、ポリペプトン３％、乳糖１０％を含む液体培地に０．１（ｖ／ｖ）％接種し、ｐＨスタットを用いてｐＨ６．８〜７．０に苛性ソーダ水溶液で調整しながら、３７℃で２２〜２４時間中和培養を行なった。培養終了後、連続遠心機で菌体を分離、回収した後、水を加えて元の液量まで希釈して再度連続遠心機で菌体を分離、回収した。この操作を合計４回繰り返して菌体を洗浄した。次いで、洗浄した菌体を適量の水に懸濁し、１００℃で３０分間殺菌した後、スプレードライヤーを用いて菌体を乾燥して加熱処理菌体粉末（以下、「ＥＣ−１２乾燥粉末」という）を調製した。
【００２５】
（方法）
ＥＣ−１２乾燥粉末は予め小麦粉で１０倍希釈したプレミックスを作製しておき、ＥＣ−１２乾燥粉末を０．０５％含有するように基礎飼料ＳＤＳＮｏ．１（日本配合飼料株式会社製）に添加したものを用いた。また、対照飼料には、０．５％の市販小麦粉を基礎飼料に添加したものを用いた。被検動物として、離乳直後の仔ブタ６頭を、ＥＣ−１２乾燥粉末経口投与群（ＯＥ群）と対照群（ＯＣ群）に分け、ＯＥ群にはＥＣ−１２乾燥粉末を前記のように０．０５％（ｗ／ｗ）飼料中に添加して、ＯＣ群には前記対照試料をそれぞれ１０日間又は１１日間与えた。また、離乳直後の仔ブタ６頭をＥＣ−１２経鼻投与（ＮＥ群）群と対照群（ＮＣ群）に分け、ＮＥ群には１０ｍｇ／ｋｇ体重のＥＣ−１２乾燥粉末懸濁ＰＢＳを、ＮＣ群にはＰＢＳを左右鼻腔内に１ｍｌずつ１０日間又は１１日間毎日スプレーした。飼育後小腸を摘出し一部を切り出し、薄切標本を作製した。より具体的には、小腸２部位（空腸末端部，回腸中央部）を展開後、内容物を除去するために生理食塩水で洗浄し、発泡スチロールに伸展貼り付けた。１０％中性緩衝ホルマリンにて固定後、断面が出るように３〜５ｍｍ程の厚さに細切し、１０％中性緩衝ホルマリンで再固定した。組織をパラフィンに包埋し、４μｍ厚で薄切後，スライドガラスに貼り付け、ＨＥ染色を施した。断面全てをＣＣＤカメラにてデジタル撮影し、ＮＩＨ Ｉｍａｇｅを用いて絨毛高さ及び陰窩深さを計測した。対物マイクロメーターの目盛りを別に計測し、比率でｍｍ値を算出した。
【００２６】
また小腸粘膜固有層を採取し組織片をＲＰＭＩ１６４０培地内で３７℃で２日間培養した。このとき抗原としてＥＣ−１２乾燥粉末を用い、培養上清中のＩｇＡ及びＩｇＧ濃度と培養後の組織における各種免疫物質遺伝子発現を解析した。ＩｇＡ及びＩｇＧ濃度の測定には、Pig IgA ELISA QuantitationKit (Bethyl, Montgomery, TX, USA)及びPig IgGELISA Quantitation Kit (Bethyl)を用いた。各組織からNucleoSpinRNA II kit (Macherey-Nagel, Easton, PA, USA)を用いてｍＲＮＡを抽出し、ReverTra Ace (TOYOBO, Tokyo)を用いて逆転写を行った。ＩＦＮ−γ、ＩＬ−８（好中球活性化因子）、ＩＬ−１０（ケモカイン合成阻止因子）、ＴＮＦ−αのｍＲＮＡの発現をリアルタイムＰＣＲを用いて解析し、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨの数値で補正を行った。
【００２７】
（結果）
図１は小腸組織の模式図（Kerr,1999）、図２は小腸組織の用語（絨毛，陰窩）を説明するための図であり、図３は、仔ブタ小腸（空腸部）絨毛高に対する乳酸菌ＥＣ−１２乾燥粉末経口投与が与える影響を示す図である。図３から、ＥＣ−１２乾燥粉末経口投与により、空腸部の絨毛が伸張して高くなっていることがわかる。また、ＥＣ−１２乾燥粉末経口投与試験での回腸と空腸における絨毛高さの測定結果を表１に、ＥＣ−１２乾燥粉末経鼻投与試験での回腸と空腸における絨毛高さの測定結果を表２にそれぞれ示す。表１からわかるように、ＯＥ群ではＯＣ群と比較して小腸絨毛高が高値を示した。また、表２からわかるように、ＮＥ群でもＮＣ群と比較して小腸絨毛高が高値を示した。経口投与及び経鼻投与ともに、絨毛／陰窩比が対照と比べて大きくなっていることから、回腸と空腸における絨毛が伸張していることが確認することができた。
【００２８】
【表１】
【００２９】
【表２】
【００３０】
小腸粘膜組織の培養上清中のＩｇＡ及びＩｇＧ濃度を測定した結果、ＯＥ群とＯＣ群及びＮＥ群とＮＣ群のいずれの場合でも、小腸粘膜組織の培養によって生産される免疫グロブリン量に大きな影響はなかった。小腸粘膜固有層の組織片からＯＥ群ではＩＦＮ−γとＩＬ−８の生産が増強され、逆にＩＬ−１０は低値を示す傾向にあった。ＮＥ群では、ＴＮＦ−αの生産が亢進したが、ＩＬ−１０の生産は低値を示す傾向にあった。ＥＣ−１２乾燥粉末の投与により、小腸組織において炎症性サイトカインの生産が刺激され、それに伴って上皮細胞の増殖が刺激される可能性が示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】小腸組織の模式図（Kerr,1999）である。
【図２】小腸組織の用語（絨毛，陰窩）を説明するための図である。
【図３】仔ブタ小腸（空腸部）絨毛高に対する乳酸菌経口投与が与える影響を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌、その死菌体又はそれらの処理物を有効成分とするヒトや仔ブタ等の小腸絨毛伸張剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
小腸は上から順に十二指腸・空腸・回腸と呼ばれ、このうち、胃からつながる十二指腸は後腹壁に固定されているが、空腸・回腸は腸間膜にくっついていて、かなり自由に動くことができる。この空・回腸を腸間膜小腸といい、小腸とはこの部分をさす。小腸は、消化・吸収の面で消化管の中で最も重要な器官であり、消化・吸収面積を増大するために著しい形態的分化を遂げている。小腸の形態的特徴の一つである小腸絨毛は、小腸粘膜の突出であり、単層の上皮細胞によって覆われ、さらにその細胞表面には数千に達する微絨毛という突起がある。絨毛構造は小腸における一大特徴であり、吸収機能に大きく関与している。ヒトの小腸を単に円筒と考えた場合の表面積はおよそ０．３３ｍ２であるが、輪状ヒダ数、さらに絨毛（長さ１ｍｍ、約５００万個）の形成によってその表面積はおよそ１０ｍ２に達する。また、吸収細胞１個当たり６００個の微絨毛（長さ１μｍ）の存在によって、その表面積はさらに２００ｍ２（約６００倍）にも達し、吸収効率を著しく増大せしめている。即ち、腸容積わずか１μｌが、約１ｃｍ２の吸収表面積をもつものである。腸絨毛は、回腸の末端に近づくにつれて粗になり、絨毛と絨毛との間には小腸陰窩がある。その粘膜上皮のうち、大部分は盛んに細胞分裂、増殖を繰り返しながら吸収上皮や杯細胞に分化しながら絨毛表面を上方へ移動し、古い絨毛上皮と置き換わっていく。また、腸の上皮細胞には多くの内分泌細胞が混在し、局所的、全身的に様々なホルモンを分泌する。
【０００３】
糖質、タンパク質、脂肪といった栄養素は微絨毛から吸収される。この部分には消化酵素がいつも待ちかまえており、栄養素がこの酵素にぶつかってバラバラになったところを、すばやく腸壁内に取り込むのである。微絨毛細胞の寿命は２４時間、人体でもっとも短命な細胞である。人間生存のために必要不可欠な栄養吸収の現場では、いつでもフレッシュな感度をもった細胞が必要とされているということである。ちなみに、小腸はほぼ無菌状態である。哺乳動物の肉眼病変は小腸壁の菲薄化が特徴で、腸壁を通して内容物が透けて観察され、哺乳ブタでは未消化凝固物が胃内に貯留する。ウイルスは小腸の粘膜上皮細胞で増殖し、細胞の変性壊死を起こす。小腸絨毛の萎縮により絨毛丈と陰窩長の比は約１：１まで低下することがある。腸絨毛には外部からの異物を排除する強い免疫機構があるため、絨毛の萎縮が起こると細菌が侵入（感染）しやすくなり、普段は感染力のないような細菌に感染しやすくなる原因となることもある。
【０００４】
体外環境との境界をなす消化管粘膜上皮は大量の食餌性抗原や腸内細菌叢、さらには外来性の細菌やウイルスなどの病原体に常に曝されている。消化管にはパイエル板をはじめとするリンパ組織が発達しており、腸内の微生物や食餌性高分子などの抗原を取り込んでモニターすることにより、免疫監視に重要な役割を果たしている。パイエル板を覆う上皮はＦＡＥ（follicle-associated epithelium）と呼ばれ、通常の絨毛上皮とは異なる性質を示すことが知られている。ＦＡＥにはＭ細胞と呼ばれる微絨毛の発達していない上皮細胞が点在し、トランスサイトーシスという細胞内輸送系を発達させて積極的に腸内抗原を取り込みパイエル板の免疫細胞に受け渡すことにより、免疫監視の発動に主要な役割を担うと考えられる。トランスサイトーシスをはじめとするＭ細胞の機能を理解し人為的に調節することができれば、免疫応答の制御に繋がる。しかし、Ｍ細胞はその絶対数が少なく特異的なマーカー分子も無いことから、その分子細胞生物学的解析はほとんど進んでいない。また、腸管上皮細胞のタイトジャンクションの膜分子のバリア機能（物質透過性）が、アレルギー疾患に関与している可能性も指摘されている。たとえば小児期のタイトジャンクション形成の不十分さによって、取り込まれる食物抗原の選択性が得られずアレルギー疾患症状を引き起こすとされている。
【０００５】
従来、乳酸菌と腸絨毛高さとの関連についての文献は少なく、腸絨毛上皮細胞との関係については、例えば、動物の腸絨毛上皮細胞を、乳酸菌ストレプトコッカス・フェーカリス菌体の存在下に組織培養し、腸上皮細胞内に進入した菌株のみを選択採取し、この選択した菌株を用いて常法通り乳酸菌製剤とする腸管定着性の確実な乳酸製剤の製造法（例えば、特許文献１参照）等が知られている。また、最近では、腸絨毛高さを増加し、腸吸収を促進する作用を有する、短腸症候群を処置するのに有用なＥＧＦ（上皮成長因子）産生組換え乳酸菌、具体的にはＥＧＦ産生組換えラクトコッカス・ラクチス、ＥＧＦ産生組換えラクトコッカス・カゼイが知られている（例えば、特許文献２参照）。
【０００６】
他方、乳酸菌それ自体、或いはその処理物の用途として、近年増加の一途をたどっているアレルギー性疾患の予防・治療を挙げることができる。例えば、ストレプトコッカス・フェカリス等の乳酸菌を所定の処理を施して、乳酸菌から抗アレルギー剤として有効な成分を抽出する方法（例えば、特許文献３参照）や、ストレプトコッカス属、エンテロコッカス属等に属する腸内細菌の生菌体を抗アレルギー成分とする腸内細菌叢改善組成物（例えば、特許文献４参照）や、ラクトバチルス・アシドフィルス等の乳酸菌の菌体を有効成分とするＩｇＥ抗体産生抑制剤又は抗アレルギー剤（例えば、特許文献５参照）が知られている。
【０００７】
また、エンテロコッカス属に属する菌体の酵素処理菌を主成分とする抗アレルギー剤（例えば、特許文献６参照）や、ヒトの腸内細菌群より分離された乳酸菌として、エンテロコッカス・フェカリス（ＡＤ１０１株）、ラクトバシルス・ロイテリー（ＡＤ０００２株）のうち１種類以上の菌体を含有するヒスタミン遊離抑制効果を有するＩ型アレルギー抑制剤（例えば、特許文献７参照）や、乳酸菌の菌体成分を主成分とするＴヘルパー細胞１型（Ｔｈ１）誘導剤（例えば、特許文献８参照）や、ラクトバチルス・アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）に属する乳酸菌、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）に属する乳酸菌、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される乳酸菌を有効成分として含む抗アレルギー剤（例えば、特許文献９参照）が知られている。さらに、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）等の乳酸菌、その死菌体、その処理物あるいはメガスフェラ・エルスデニ（Megasphaera elsdenii）を有効成分とする、バンコマイシン等薬剤耐性菌保菌乃至感染している家畜・家禽又は魚介類の感染防除剤（例えば、特許文献１０参照）が知られている。
【０００８】
【特許文献１】特公昭４６−３８５９２号公報
【特許文献２】特表２００５−５２９６２２号公報
【特許文献３】特開昭５７−１５４１３２号公報
【特許文献４】特開平７−２６５０６４号公報
【特許文献５】特開平９−２９５９号公報
【特許文献６】特許第３０４０７４４号公報
【特許文献７】特開２０００−９５６９７号公報
【特許文献８】特開２００３−１３７７９５号公報
【特許文献９】特開２００４−２６７２９号公報
【特許文献１０】特開２００６−８９４２１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
離乳仔ブタの消化器は、母乳から成ブタ用飼料へ移行するという急激な餌の変化と共に、離乳や環境の変化などのストレス状態にあり、このような状況下で、病原性大腸菌により下痢症状をひき起こすことがしばしば見受けられる。これは、離乳前後における仔ブタの腸管内の変化があるからであり、健康な腸絨毛は、長く伸び、これにより、腸の表面積が格段に広がって消化吸収を促進している。また、哺乳期間中は母乳中に含まれるＩｇＡ抗体が、毎回哺乳時に母乳から供給され、腸絨毛の表面を覆って、大腸菌等の病原性微生物が仔ブタの腸絨毛に付着するのを防いでいるといわれている。しかし、栄養豊富で消化のよい母乳が離乳により断ち切られ、急に成ブタ用飼料を食すると、腸粘膜での消化吸収は、その変化に追いつけず、腸絨毛は短くなって（Res Vet Sci 1986 Jan;40(1):32-40参照）、栄養成分の吸収力は低下する。この状態によって、吸収されない栄養分は大腸に至り、これら病原性微生物を含む各種の微生物の増殖をひき起こすことになる。本発明の課題は、ヒトを含む動物において、小腸の絨毛伸張を促進せしめて消化吸収を改善しうる絨毛伸張剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、先行技術のようにＥＧＦを産生する組換え乳酸菌を用いずに、ある種のエンテロコッカス・フェカリスの死菌体を離乳期の仔ブタに経口又は経鼻投与し、小腸内の絨毛の長さを、投与した群と投与しない対照群を比較したところ、該乳酸菌を投与した小腸内の絨毛の高さが、対照群と比べて有意に伸長していることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、（１）乳酸菌（但し、ＥＧＦ産生組換え乳酸菌は除く）、その死菌体及びそれらの処理物を有効成分として含有することを特徴とする動物の小腸絨毛伸張剤や、（２）乳酸菌がエンテロコッカス属に属する微生物であることを特徴とする前記（１）記載の動物の小腸絨毛伸張剤や、（３）エンテロコッカス属に属する微生物が、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）であることを特徴とする前記（２）に記載の動物の小腸絨毛伸張剤や、（４）エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）が、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）ＥＣ−１２（ＦＥＲＭ ＢＰ１０２８４）であることを特徴とする前記（３）記載の動物の小腸絨毛伸張剤や、（５）経口投与又は経鼻投与されることを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれかに記載の動物の小腸絨毛伸張剤に関する。
【００１２】
また本発明は、（６）乳酸菌（但し、ＥＧＦ産生組換え乳酸菌は除く）、その死菌体及びそれらの処理物を動物の小腸絨毛伸張剤として使用する方法や、（７）乳酸菌がエンテロコッカス属に属する微生物であることを特徴とする前記（６）記載の方法や、（８）エンテロコッカス属に属する微生物が、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）であることを特徴とする前記（７）に記載の方法や、（９）エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）が、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）ＥＣ−１２（ＦＥＲＭ ＢＰ１０２８４）であることを特徴とする前記（８）記載の方法や、（１０）経口投与又は経鼻投与されることを特徴とする前記（６）〜（９）のいずれかに記載の方法に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の小腸絨毛伸張剤は、小腸絨毛を伸張させることにより、ヒト乳幼児期又は離乳期にある仔ブタの消化吸収を改善し、消化吸収不良に起因する疾患を改善することや、小腸切除した短腸症候群の患者の消化吸収を改善し、低栄養状態を改善することが期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の小腸絨毛伸張剤としては、乳酸菌（但し、ＥＧＦ産生組換え乳酸菌は除く）、その死菌体及びそれらの処理物を有効成分とするものであれば特に制限されるものではなく、また本発明の方法としては、乳酸菌（但し、ＥＧＦ産生組換え乳酸菌は除く）、その死菌体及びそれらの処理物を動物の小腸絨毛伸張剤として使用する方法であれば特に制限されるものではなく、対象となる動物としては、ヒトの他家畜・家禽類やペット類を好適に例示することができ、家畜・家禽類としては、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギなどの家畜、ニワトリ、カモ、ダチョウ、アヒルなどの家禽を具体的に挙げることができ、ペット類としてはイヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター等を具体的に挙げることができる。また、使用方法における動物としては、家畜・家禽類やペット類を好適に例示することができる。
【００１５】
上記乳酸菌としては、エンテロコッカス属（Entrococcus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、ストレプトコッカス属（Storeptococcus）、ラクトバシラス属（Lactobacillus）、ロイコノストック属（Leuconostoc）、ペディオコッカス属（Pediococcus）、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）又はテトラジェノコッカス属（Tetragenococcus）のいずれかに属する菌が好ましく、特にエンテロコッカス属に属する菌が好ましい。
【００１６】
上記エンテロコッカス属に属する菌としては、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・デュランス等を挙げることができ、エンテロコッカス・フェカリスＥＣ−１２が特に好ましい。上記ラクトコッカス属に属する菌としては、ラクトコッカス・ラクティス、ラクトコッカス・プランタラム、ラクトコッカス・ラフィノラクティス等を挙げることができる。上記ストレプトコッカス属に属する菌としては、ストレプトコッカス・サーモフィルス等を挙げることができる。上記ラクトバシラス属に属する菌としては、ラクトバシラス・アシドフィルス、ラクトバシラス・サリバリウス、ラクトバシラス・ブレビス、ラクトバシラス・ラムノサス、ラクトバシラス・プランタラム、ラクトバシラス・ヘルベティカス、ラクトバシラス・ファーメンタム、ラクトバシラス・パラカゼイ、ラクトバシラス・カゼイ、ラクトバシラス・デルブリュッキイ、ラクトバシラス・ロイテリ、ラクトバシラス・ガッセリ、ラクトバシラス・ジョンソニイ、ラクトバシラス・ケフィア、ラクトバシラス・ブルネリ等を挙げることができる。上記ロイコノストック属に属する菌としては、ロイコノストック・ラクティス、ロイコノストック・メセンテロイデス等を挙げることができる。上記ペディオコッカス属に属する菌としては、ペディオコッカス・ダムノサス等を挙げることができる。上記ビフィドバクテリウム属に属する菌としては、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム等を挙げることができ、特にビフィドバクテリウム・ブレーベが好ましい。テトラジェノコッカス属に属する菌としては、テトラジェノ・ハロフィルス等を挙げることができる。
【００１７】
これらの乳酸菌は、一種又は二種以上の菌種を配合して用いることができる。これらの乳酸菌等は、常法に従って任意の条件で培養することによって得ることができる。
【００１８】
本発明において乳酸菌は、生菌、その死菌体又はその処理物として用いることができる。前記死菌体としては、常法により培養、集菌した乳酸菌の菌体を洗浄し、遠心脱水し、必要に応じて洗浄・脱水を繰り返した後、蒸留水、生理食塩水等に懸濁し、この懸濁液を、例えば８０〜１１５℃で３０分〜３秒間加熱することにより得られる死菌体懸濁液やその乾燥物、又は前記死菌体懸濁液にガンマ線或いは中性子線を照射することにより得られる死菌体懸濁液やその乾燥物を挙げることができる。該死菌体懸濁液の乾燥手段としては公知の乾燥手段であれば特に制限されないが、噴霧乾燥、凍結乾燥等を例示することができる。場合によっては、加熱等による殺菌処理の前後、あるいは、乾燥処理の前後に、酵素処理、界面活性剤処理、磨砕・粉砕処理を行うこともでき、これらの処理により得られるものも、本発明の死菌体又はその処理物に含まれる。
【００１９】
本発明の小腸絨毛伸張剤としては、乳酸菌エンテロコッカス・フェカリスＥＣ−１２の死菌体又はその処理物を有効成分として含有する組成物が特に好ましい。エンテロコッカス・フェカリスＥＣ−１２は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）において２００５年２月２５日に「ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２８４」としても寄託されている。このエンテロコッカス・フェカリスＥＣ−１２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２８４）の培養方法としては、従来公知の乳酸菌の培養方法も含め特に制限されるものではないが、乳酸菌生育用培地を用い、３７℃で培養ｐＨを中性付近に維持しながら５〜１２０時間、好ましくは、１６〜２８時間培養し、生菌数約１０７〜１０１０／ｍｌ、好ましくは約１０８〜１０１０／ｍｌの培養液を得る方法を好適に例示することができる。
【００２０】
本発明の小腸絨毛伸張剤を製剤として用いる場合、デンプン、乳糖、大豆蛋白等の担体、賦形剤、結合材、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、懸濁剤等の添加剤を配合して、周知の方法で粉剤、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤等に製剤化することができる。またグルコン酸塩、ガラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖などのオリゴ糖類やセルロース、βグルカン、キトサンなどの食物繊維素材などのプレバイオテクス素材と組み合わせてもちいることもできる。かかる製剤はそのまま投与することもできるが、ベビーフード、飼料等に混じて給餌させることもできる。
さらに、本製剤を小腸術後の患者等に小腸絨毛伸張剤として、食品や食品素材に添加して用いることができる。その種類としては特に制限されず、例えば、ミネラルウォーター、スポーツ飲料、ジュース、牛乳、豆乳、酒類、コーヒー、紅茶、煎茶、ウーロン茶等の各種飲料、ヨーグルト、ドリンクヨーグルトや、プリン、クッキー、パン、ケーキ、ゼリー、煎餅などの焼き菓子、羊羹などの和菓子、冷菓、チューインガム等のパン・菓子類や、うどん、そば等の麺類や、かまぼこ、ハム、魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品や、みそ、しょう油、ドレッシング、マヨネーズ、甘味料等の調味類や、チーズ、バター等の乳製品や、豆腐、こんにゃく、その他佃煮、餃子、コロッケ、サラダ等の各種総菜を挙げることができる。
【００２１】
本発明の小腸絨毛伸張剤や使用方法における投与量や投与回数は、対象となる動物の種類、体重、日齢、月齢、病状、回復状態に応じて、適宜決定することができるが、ヒトにあっては乳幼児や小腸切除後に投与することが好ましく、ブタ等の家畜にあっては離乳期に投与することが好ましい。例えば、エンテロコッカス・フェカリスＥＣ−１２の死菌体又若しくは処理物を用いる場合、ベビーフードや飼料に０．０００１％〜０．２％、さらに望ましくは飼料に関しては０．０１％〜０．０５％含有させ、ヒト成人に対しては５０ｍｇ〜６００ｍｇ／日、通常の１日当たりの給餌量及び給餌回数とすることができる。
【００２２】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２３】
（実験目的）
仔ブタは離乳によって小腸絨毛が萎縮して消化吸収に悪影響を及ぼすため、絨毛高の萎縮予防もしくは早期回復が必要である。エンテロコッカス・フェカリスＥＣ−１２死菌体を経口又は経鼻投与した際の、小腸における絨毛高に及ぼす影響について組織学的な評価を行い、あわせて小腸組織培養中の免疫関連分子の遺伝子発現量を検討した。
【００２４】
（エンテロコッカス・フェカリスＥＣ−１２死菌体の調製）
エンテロコッカス・フェカリスＥＣ−１２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２８４）をロゴサ培地で３７℃、２４時間培養した前培養液を、酵母エキス４％、ポリペプトン３％、乳糖１０％を含む液体培地に０．１（ｖ／ｖ）％接種し、ｐＨスタットを用いてｐＨ６．８〜７．０に苛性ソーダ水溶液で調整しながら、３７℃で２２〜２４時間中和培養を行なった。培養終了後、連続遠心機で菌体を分離、回収した後、水を加えて元の液量まで希釈して再度連続遠心機で菌体を分離、回収した。この操作を合計４回繰り返して菌体を洗浄した。次いで、洗浄した菌体を適量の水に懸濁し、１００℃で３０分間殺菌した後、スプレードライヤーを用いて菌体を乾燥して加熱処理菌体粉末（以下、「ＥＣ−１２乾燥粉末」という）を調製した。
【００２５】
（方法）
ＥＣ−１２乾燥粉末は予め小麦粉で１０倍希釈したプレミックスを作製しておき、ＥＣ−１２乾燥粉末を０．０５％含有するように基礎飼料ＳＤＳＮｏ．１（日本配合飼料株式会社製）に添加したものを用いた。また、対照飼料には、０．５％の市販小麦粉を基礎飼料に添加したものを用いた。被検動物として、離乳直後の仔ブタ６頭を、ＥＣ−１２乾燥粉末経口投与群（ＯＥ群）と対照群（ＯＣ群）に分け、ＯＥ群にはＥＣ−１２乾燥粉末を前記のように０．０５％（ｗ／ｗ）飼料中に添加して、ＯＣ群には前記対照試料をそれぞれ１０日間又は１１日間与えた。また、離乳直後の仔ブタ６頭をＥＣ−１２経鼻投与（ＮＥ群）群と対照群（ＮＣ群）に分け、ＮＥ群には１０ｍｇ／ｋｇ体重のＥＣ−１２乾燥粉末懸濁ＰＢＳを、ＮＣ群にはＰＢＳを左右鼻腔内に１ｍｌずつ１０日間又は１１日間毎日スプレーした。飼育後小腸を摘出し一部を切り出し、薄切標本を作製した。より具体的には、小腸２部位（空腸末端部，回腸中央部）を展開後、内容物を除去するために生理食塩水で洗浄し、発泡スチロールに伸展貼り付けた。１０％中性緩衝ホルマリンにて固定後、断面が出るように３〜５ｍｍ程の厚さに細切し、１０％中性緩衝ホルマリンで再固定した。組織をパラフィンに包埋し、４μｍ厚で薄切後，スライドガラスに貼り付け、ＨＥ染色を施した。断面全てをＣＣＤカメラにてデジタル撮影し、ＮＩＨ Ｉｍａｇｅを用いて絨毛高さ及び陰窩深さを計測した。対物マイクロメーターの目盛りを別に計測し、比率でｍｍ値を算出した。
【００２６】
また小腸粘膜固有層を採取し組織片をＲＰＭＩ１６４０培地内で３７℃で２日間培養した。このとき抗原としてＥＣ−１２乾燥粉末を用い、培養上清中のＩｇＡ及びＩｇＧ濃度と培養後の組織における各種免疫物質遺伝子発現を解析した。ＩｇＡ及びＩｇＧ濃度の測定には、Pig IgA ELISA QuantitationKit (Bethyl, Montgomery, TX, USA)及びPig IgGELISA Quantitation Kit (Bethyl)を用いた。各組織からNucleoSpinRNA II kit (Macherey-Nagel, Easton, PA, USA)を用いてｍＲＮＡを抽出し、ReverTra Ace (TOYOBO, Tokyo)を用いて逆転写を行った。ＩＦＮ−γ、ＩＬ−８（好中球活性化因子）、ＩＬ−１０（ケモカイン合成阻止因子）、ＴＮＦ−αのｍＲＮＡの発現をリアルタイムＰＣＲを用いて解析し、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨの数値で補正を行った。
【００２７】
（結果）
図１は小腸組織の模式図（Kerr,1999）、図２は小腸組織の用語（絨毛，陰窩）を説明するための図であり、図３は、仔ブタ小腸（空腸部）絨毛高に対する乳酸菌ＥＣ−１２乾燥粉末経口投与が与える影響を示す図である。図３から、ＥＣ−１２乾燥粉末経口投与により、空腸部の絨毛が伸張して高くなっていることがわかる。また、ＥＣ−１２乾燥粉末経口投与試験での回腸と空腸における絨毛高さの測定結果を表１に、ＥＣ−１２乾燥粉末経鼻投与試験での回腸と空腸における絨毛高さの測定結果を表２にそれぞれ示す。表１からわかるように、ＯＥ群ではＯＣ群と比較して小腸絨毛高が高値を示した。また、表２からわかるように、ＮＥ群でもＮＣ群と比較して小腸絨毛高が高値を示した。経口投与及び経鼻投与ともに、絨毛／陰窩比が対照と比べて大きくなっていることから、回腸と空腸における絨毛が伸張していることが確認することができた。
【００２８】
【表１】
【００２９】
【表２】
【００３０】
小腸粘膜組織の培養上清中のＩｇＡ及びＩｇＧ濃度を測定した結果、ＯＥ群とＯＣ群及びＮＥ群とＮＣ群のいずれの場合でも、小腸粘膜組織の培養によって生産される免疫グロブリン量に大きな影響はなかった。小腸粘膜固有層の組織片からＯＥ群ではＩＦＮ−γとＩＬ−８の生産が増強され、逆にＩＬ−１０は低値を示す傾向にあった。ＮＥ群では、ＴＮＦ−αの生産が亢進したが、ＩＬ−１０の生産は低値を示す傾向にあった。ＥＣ−１２乾燥粉末の投与により、小腸組織において炎症性サイトカインの生産が刺激され、それに伴って上皮細胞の増殖が刺激される可能性が示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】小腸組織の模式図（Kerr,1999）である。
【図２】小腸組織の用語（絨毛，陰窩）を説明するための図である。
【図３】仔ブタ小腸（空腸部）絨毛高に対する乳酸菌経口投与が与える影響を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸菌（但し、ＥＧＦ産生組換え乳酸菌は除く）、その死菌体及びそれらの処理物を有効成分として含有することを特徴とする動物の小腸絨毛伸張剤。
【請求項２】
乳酸菌がエンテロコッカス属に属する微生物であることを特徴とする請求項１記載の動物の小腸絨毛伸張剤。
【請求項３】
エンテロコッカス属に属する微生物が、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）であることを特徴とする請求項２に記載の動物の小腸絨毛伸張剤。
【請求項４】
エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）が、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）ＥＣ−１２（ＦＥＲＭ ＢＰ１０２８４）であることを特徴とする請求項３記載の動物の小腸絨毛伸張剤。
【請求項５】
経口投与又は経鼻投与されることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の動物の小腸絨毛伸張剤。
【請求項６】
乳酸菌（但し、ＥＧＦ産生組換え乳酸菌は除く）、その死菌体及びそれらの処理物を動物の小腸絨毛伸張剤として使用する方法。
【請求項７】
乳酸菌がエンテロコッカス属に属する微生物であることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
エンテロコッカス属に属する微生物が、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）が、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）ＥＣ−１２（ＦＥＲＭ ＢＰ１０２８４）であることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
経口投与又は経鼻投与されることを特徴とする請求項６〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１】
乳酸菌（但し、ＥＧＦ産生組換え乳酸菌は除く）、その死菌体及びそれらの処理物を有効成分として含有することを特徴とする動物の小腸絨毛伸張剤。
【請求項２】
乳酸菌がエンテロコッカス属に属する微生物であることを特徴とする請求項１記載の動物の小腸絨毛伸張剤。
【請求項３】
エンテロコッカス属に属する微生物が、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）であることを特徴とする請求項２に記載の動物の小腸絨毛伸張剤。
【請求項４】
エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）が、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）ＥＣ−１２（ＦＥＲＭ ＢＰ１０２８４）であることを特徴とする請求項３記載の動物の小腸絨毛伸張剤。
【請求項５】
経口投与又は経鼻投与されることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の動物の小腸絨毛伸張剤。
【請求項６】
乳酸菌（但し、ＥＧＦ産生組換え乳酸菌は除く）、その死菌体及びそれらの処理物を動物の小腸絨毛伸張剤として使用する方法。
【請求項７】
乳酸菌がエンテロコッカス属に属する微生物であることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
エンテロコッカス属に属する微生物が、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）が、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）ＥＣ−１２（ＦＥＲＭ ＢＰ１０２８４）であることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
経口投与又は経鼻投与されることを特徴とする請求項６〜９のいずれかに記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００８−２５５０８０（Ｐ２００８−２５５０８０Ａ）
【公開日】平成２０年１０月２３日（２００８．１０．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１０２１２３（Ｐ２００７−１０２１２３）
【出願日】平成１９年４月９日（２００７．４．９）
【出願人】（３９１００３９１２）コンビ株式会社 (165)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月２３日（２００８．１０．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月９日（２００７．４．９）
【出願人】（３９１００３９１２）コンビ株式会社 (165)
【Ｆターム（参考）】
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