脱塩された蛋白質加水分解物の製造方法
【課題】ＮＦ膜を用いた収率の高い、脱塩された蛋白質加水分解物の製造方法を提供する。
【解決手段】蛋白質加水分解物を含有する溶液をろ過処理した後、酸剤によりｐＨ４．５〜６．５に調整し、ＮａＣｌ阻止率３０〜７０％のＮＦ膜を用いて逆浸透処理を行うことを特徴とする脱塩された蛋白質加水分解物の製造方法。
【解決手段】蛋白質加水分解物を含有する溶液をろ過処理した後、酸剤によりｐＨ４．５〜６．５に調整し、ＮａＣｌ阻止率３０〜７０％のＮＦ膜を用いて逆浸透処理を行うことを特徴とする脱塩された蛋白質加水分解物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛋白質加水分解物を含有する溶液をろ過処理した後、特定の条件下で逆浸透処理を行うことで蛋白質加水分解物の収率を高めた、脱塩された蛋白質加水分解物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質加水分解物は動物や植物由来の蛋白質を加水分解したものであり、栄養源や呈味改善剤として加工食品に用いられるだけでなく、化粧品、医薬品などの皮膚外用剤など幅広い分野で利用されている。
【０００３】
蛋白質加水分解物としては、卵白蛋白質などの動物性蛋白質、大豆蛋白質、小麦蛋白質などの植物性蛋白質を酸存在下、またはアルカリ存在下で加熱して加水分解する方法や、プロテアーゼ処理で加水分解する方法が知られている。
【０００４】
蛋白質を塩酸などの酸存在下で加熱して加水分解する場合、処理後水酸化ナトリウムなどのアルカリで中和する必要があり、その結果、多量の食塩が生成することになる。また、プロテアーゼ処理の場合も、用いるプロテアーゼの種類によってはプロテアーゼ処理後に中和する必要があり、その結果、食塩が生成することになる。
【０００５】
中和により生成された食塩や元来蛋白質原料に含有されている食塩を脱塩する方法としては、イオン交換樹脂を用いる方法や電気透析処理を行う方法などが知られている。しかしながら、これらの方法による脱塩は、脱塩後の蛋白質加水分解物溶液が希釈され、その後の濃縮工程に多大な時間とコストがかかるという問題があった。
【０００６】
このような問題点を解決する方法として、ナノフィルタレーション（ＮＦ） 膜を用いた乳原料の脱塩方法が知られている（特許文献１）。しかしながら、この方法で蛋白質加水分解物の脱塩処理を行うと、乳原料よりも分子量の小さい蛋白質加水分解物がＮＦ膜から漏出してしまい、収率が低下してしまうという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平８−２６６２２１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明の目的は、ＮＦ膜を用いた収率の高い、脱塩された蛋白質加水分解物の製造方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、上記目的を達成すべく、使用原料及び各工程等、様々な諸条件について鋭意研究を重ねた結果、蛋白質加水分解物を含有する溶液をろ過処理した後、酸剤によりｐＨ４．５〜６．５に調整し、ＮａＣｌ阻止率３０〜７０％のＮＦ膜を用いて逆浸透処理を行うことで、脱塩された蛋白質加水分解物の収率を高められること見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、
（１）蛋白質加水分解物を含有する溶液をろ過処理した後、酸剤によりｐＨ４．５〜６．５に調整し、ＮａＣｌ阻止率３０〜７０％のＮＦ膜を用いて逆浸透処理を行う工程を少なくとも含む脱塩された蛋白質加水分解物の製造方法、
（２）ろ過処理時の蛋白質加水分解物を含有する溶液のｐＨが、逆浸透処理時のｐＨよりも高い（１）記載の脱塩された蛋白質加水分解物の製造方法、
（３）ろ過処理時の蛋白質加水分解物を含有する溶液のｐＨが、逆浸透処理時のｐＨよりも０．５以上高い（１）または（２）に記載の脱塩された蛋白質加水分解物の製造方法、
（４）蛋白質加水分解物の分子量が２００〜２０００である（１）乃至（３）のいずれかに記載の脱塩された蛋白質加水分解物の製造方法、
（５）酸剤が有機酸である（１）乃至（４）のいずれかに記載の脱塩された蛋白質加水分解物の製造方法、
（６）逆浸透処理を圧力０．８〜２ＭＰａの条件下で行う（１）乃至（５）のいずれかに記載の脱塩された蛋白質加水分解物の製造方法、
である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、蛋白質加水分解物を含有する溶液をろ過処理した後、特定の条件下で逆浸透処理を行うことで蛋白質加水分解物の収率を高めた、脱塩された蛋白質加水分解物の製造方法を提供でき、脱塩された蛋白質加水分解物の効率的な製造が可能となることで、商品の原価低減および更なる需要拡大が期待される。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。なお、本発明において「％」は「質量％」を意味する。
【００１３】
本発明は、脱塩された蛋白質加水分解物を製造する際に、蛋白質加水分解物の収率を高めるために、蛋白質加水分解物を含有する溶液をろ過処理した後、酸剤によりｐＨ４．５〜６．５に調整し、ＮａＣｌ阻止率３０〜７０％のＮＦ膜を用いて逆浸透処理を行う工程を少なくとも含むことを特徴とする。
【００１４】
本発明の脱塩された蛋白質加水分解物とは、処理前と比較して無機塩類の含量が低減されたものであれば良く、脱塩処理後の無機塩類の濃度を特に限定するものではないが、加工食品、化粧品及び医薬品の原料としての汎用性を高める観点から、逆浸透処理後の蛋白質加水分解物を含有する溶液のＮａ含量が逆浸透処理前のＮａ含量の７０％未満となることが好ましく、５０％未満となることがより好ましい。
【００１５】
本発明で用いる蛋白質加水分解物の蛋白質源としては、種々の動物性蛋白質または植物性蛋白質の１種または２種以上を組合せて使用することができる。例えば、動物性蛋白質としては、卵白蛋白質、乳蛋白質などが挙げられ、植物性蛋白質としては、大豆蛋白質、小麦蛋白質などが挙げられる。
【００１６】
蛋白質を加水分解する方法は、特に限定するものではないが、蛋白質をプロテアーゼ処理、酸存在下で加熱処理、アルカリ存在下で加熱処理する方法等が挙げられる。蛋白質をプロテアーゼ処理する場合、用いるプロテアーゼは、特に限定するものではないが、例えば、ペプシン、キモトリプシン、トリプシン、パンクレアチンなどの動物由来プロテアーゼ、パパイン、ブロメライン、フィシンなどの植物由来プロテアーゼ、微生物（乳酸菌、枯草菌、放線菌、カビ、酵母など）由来のエンドプロテアーゼ、エキソプロテアーゼならびにこれらの粗精製物および菌体破砕物等が挙げられ、これらの１種または２種以上を組合せて用いることができる。
【００１７】
このうち、本発明の脱塩された蛋白質加水分解物の製造方法において、プロテアーゼとして酸性プロテアーゼを使用して蛋白質を加水分解すると、処理後の中和処理により食塩が生成しやすいため、本発明に好適である。このような酸性プロテアーゼの市販品としては、例えば、商品名：ニューラーゼＡ（起源：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、天野エンザイム社製）、商品名：スミチームＡＰ（起源：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、新日本化学工業社製）、商品名：モルシンＦ（起源：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、キッコーマン社製）等が挙げられる。
【００１８】
プロテアーゼにより蛋白質を加水分解する方法としては、例えば、卵白をアスペルギルス属菌起源の酸性プロテーゼで加水分解する場合を例に挙げると、卵白をｐＨ２．５〜４．５、好ましくはｐＨ３〜４に調整し、この卵白にアスペルギルス属菌起源の酸性プロテアーゼを添加し、ゆっくりと撹拌しながら、３０〜６０℃、好ましくは３５〜５５℃にて２〜２４時間反応させればよい。
【００１９】
プロテアーゼにより蛋白質を加水分解する場合、ｐＨ、温度条件および加熱時間は、使用するプロテアーゼの種類および組合せに応じて適宜調整するのが好ましい。
【００２０】
蛋白質を酸存在下で加熱処理する場合、用いる酸剤は特に限定するものではないが、例えば塩酸、硝酸、硫酸、シュウ酸などが挙げられ、安価であり分解力が強い点から塩酸を用いることが好ましい。また、処理条件は特に限定されるものではないが、求める加水分解の程度によって任意に選択することができる。例えば、塩酸濃度０．１〜３ｍｏｌ／Ｌ、加熱温度３０〜１００℃、加熱時間１〜５０時間の範囲で適宜条件を選択すればよい。
【００２１】
蛋白質をアルカリ存在下で加熱処理する場合、用いるアルカリ剤は特に限定するものではないが、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウムなどが挙げられ、その中でも安価で入手可能な水酸化ナトリウムを用いることが好ましい。また、処理条件は特に限定されるものではないが、求める加水分解の程度によって任意に選択することができる。例えば、水酸化ナトリウム濃度０．１〜３ｍｏｌ／Ｌ、加熱温度３０〜１００℃、加熱時間１〜５０時間の範囲で適宜条件を選択すればよい。
【００２２】
プロテアーゼ処理、酸存在下で加熱処理、またはアルカリ存在下で加熱処理をした蛋白質加水分解物の平均分子量は、特に限定するものではないが、２００〜２０００が好ましく、２５０〜１５００がより好ましい。蛋白質加水分解物の平均分子量が前記値より低いと、本願発明の方法により蛋白質加水分解物を含有する溶液をろ過処理した後、逆浸透処理したとしても、蛋白質加水分解物の収率が低下する傾向にあるため好ましくない。また、蛋白質加水分解物の平均分子量が前記値よりも高いと、本願発明の方法によらなくても蛋白質加水分解物の収率は低くなり難いため好適でない。
【００２３】
得られた蛋白質加水分解物を含有する溶液をろ過処理し、不溶物を除去する。ろ過処理時の蛋白質加水分解物を含有する溶液のｐＨは、後述の逆浸透処理時のｐＨよりも高いｐＨであることが好ましく、より好ましくはｐＨの差が０．５以上、更に好ましくはｐＨの差が１〜５である。蛋白質加水分解物を含有する溶液のｐＨが逆浸透処理時のｐＨよりも低い場合、ＮＦ膜が目詰まりを起こし逆浸透処理できなくなる場合があり好ましくない。一方、ｐＨの差は大きいほど本発明の効果が得られやすいが、上記範囲よりも大きいと、生成される食塩の量が増加するため、その後の脱塩効率の観点から好ましくない。
【００２４】
具体的な、ろ過処理時の蛋白質加水分解物を含有する溶液のｐＨは、特に限定するものではないが、ｐＨ５〜９が好ましく、ｐＨ６〜８がより好ましい。蛋白質加水分解物を含有する溶液のｐＨが前記値より低く、特にｐＨが３以上５未満であると、蛋白質加水分解物が不溶化してしまい、ろ過処理時に蛋白質加水分解物の収率が低下する場合があるため好ましくない。また、蛋白質加水分解物を含有する溶液のｐＨが前記値よりも高くても、生成される食塩の量が増加するため、その後の脱塩効率の観点から好ましくない。なお、蛋白質を加水分解処理した後のｐＨが上記範囲内である場合は、ｐＨの調整を行わずにろ過処理を行えばよい。
【００２５】
本発明において、蛋白質加水分解物を含有する溶液のろ過処理の方法は、特に限定するものではないが、ケイソウ土などのろ過助剤を用いたフィルターろ過を行うことが好ましい。
【００２６】
次いで、ろ過処理した蛋白質加水分解物を含有する溶液を酸剤によりｐＨ４．５〜６．５、好ましくはｐＨ４．８〜６に調整した後、逆浸透処理を行う。蛋白質加水分解物を含有する溶液のｐＨが前記値より低いと、用いる蛋白質の種類によってはＮＦ膜が目詰まりを起こし逆浸透処理できなくなる場合があるためである。また、蛋白質加水分解物を含有する溶液のｐＨが前記値よりも高いと、蛋白質加水分解物の収率が低下する傾向にあるためである。
【００２７】
蛋白質加水分解物を含有する溶液のｐＨ調整に使用する酸剤としては、特に限定するものではないが、有機酸としては、例えば、クエン酸、グルコン酸、酢酸、酒石酸、コハク酸、リンゴ酸等、無機酸としては、例えば塩酸、硫酸、リン酸等が挙げられ、これらの１種または２種以上を適宜選択して使用すると良い。その中でも有機酸を用いると蛋白質加水分解物の収率を高めることができ好ましく、クエン酸、グルコン酸を用いるとより好ましい。
【００２８】
本発明は、上述のｐＨ調整をした蛋白質加水分解物を含有する溶液をＮａＣｌ阻止率３０〜７０％のＮＦ膜を用いて逆浸透処理を行う。
【００２９】
ＮＦ膜とは、ろ過膜の一種であって孔の大きさが２ｎｍ以下である逆浸透膜の中で、イオンや塩類などの阻止率が概ね７０％以下と低いものをいう。本発明で用いるＮＦ膜の構造および材質は、特に限定されるものではないが、構造としては、例えば、中空糸膜、スパイラル膜、チューブラー膜等が挙げられ、材質としては、例えば、ポリスルホン、芳香族ポリアミド、酢酸セルロース、ポリビニルアルコール等が挙げられ、これらを適宜選択して使用すると良い。
【００３０】
本発明で用いるＮＦ膜は、ＮａＣｌ阻止率が３０〜７０％であり、好ましくは４０〜７０％である。ＮＦ膜のＮａＣｌ阻止率が前記値より低いと、蛋白質加水分解物の収率が低下する傾向にあるためである。また、ＮＦ膜のＮａＣｌ阻止率が前記値よりも高いと、脱塩効率が低下するためである。なお、ＮＦ膜のＮａＣｌ阻止率は下記の式で求められる。
【００３１】
阻止率（％）＝（１−透過液中のＮａＣｌ濃度／原料液中のＮａＣｌ濃度）×１００
【００３２】
逆浸透処理する際の蛋白質加水分解物の濃度は、特に限定するものではないが、０．２〜１２％が好ましく、０．４〜１０％がより好ましい。蛋白質加水分解物の濃度が前記値より低いと、処理時間が長くなるため好ましくない。また、蛋白質加水分解物の濃度が前記値よりも高いと、蛋白質加水分解物の収率が低下する傾向にあるため好ましくない。
【００３３】
逆浸透処理時の圧力条件は特に限定するものではないが、０．８〜２ＭＰａが好ましく、１．３〜１．８ＭＰａがより好ましい。逆浸透処理時の圧力が前記値より低いと、蛋白質加水分解物の収率が低下する傾向にあるため好ましくない。また、逆浸透処理時の圧力が前記値より高くても、蛋白質加水分解物の収率が低下する傾向にあるため好ましくない。
【００３４】
また、逆浸透処理における、逆浸透処理時の温度は常法に従って任意に設定することができるが、蛋白質加水分解物の収率、脱塩の効率、およびＮＦ膜の耐熱性を考慮して、１０℃〜５０℃で処理することが好ましい。
【００３５】
以上の工程により本発明の脱塩された蛋白質加水分解物が得られるが、必要に応じて更にろ過処理を行い、スプレードライなどで乾燥してもよい。
【００３６】
本発明の逆浸透処理を行うことで、逆浸透処理時の蛋白質加水分解物の収率を高めることができるが、本発明では、逆浸透処理後の膜透過液の蛋白質濃度、つまり逆浸透処理によって漏出した蛋白質の濃度を測定することによって、蛋白質加水分解物の収率を測定する。逆浸透処理後の膜透過液の蛋白質濃度は、低いほど、蛋白質加水分解物の収率が高くなるため好ましいが、０．０５％未満が好ましく、０．０２％未満がより好ましい。
【００３７】
以下、本発明について、実施例及び試験例に基づき具体的に説明する。なお、本発明は、これらに限定するものではない。
【実施例】
【００３８】
［実施例１］
乾燥卵白１ｋｇを清水２５Ｌに溶解し、１０％塩酸を用いてｐＨ３．５に調整した。次いで、酸性プロテアーゼ（ニューラーゼＡ、天野エンザイム社製）１０ｇを添加し、４０℃で１２時間プロテアーゼ処理を行った後、水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨ７．０に調整し、８５℃で１０分加熱することでプロテアーゼを失活させた。この液にケイソウ土１５０ｇを加え、撹拌ろ過を行って不溶物を除去した。得られた蛋白質加水分解物の平均分子量をＴＮＢＳ法に従い測定したところ、平均分子量は３００であった。また、得られた蛋白質加水分解物を含有する溶液のＮａ含量をＩＰＣ発光分析装置（ＶＩＳＴＡ−ＰＲＯ、バリアン・テクノロジーズ・ジャパン・リミテッド社製）を用いて測定したところ、固形分１００ｇあたり３３７ｍｇであった。
次いで、得られたろ液に水を加え蛋白質加水分解物の濃度を２％に調整した後、クエン酸を用いてｐＨ５．０に調整した後、ＮａＣｌ阻止率４５％のＮＦ膜を用いて圧力１．５ＭＰａで逆浸透処理を行い、濃縮液を回収することで脱塩された蛋白質加水分解物を得た。
【００３９】
逆浸透処理後の蛋白質加水分解物を含有する溶液のＮａ含量を上述の発光分析装置で測定したところ、固形分１００ｇあたり１５５ｍｇ（逆浸透処理前のＮａ含量の約４６％）であり、充分に脱塩されたものであった。
また、逆浸透処理後の膜透過液の蛋白質濃度を測定したところ、０．０１３％であり、蛋白質加水分解物の漏出は少なく、蛋白質加水分解物の収率は高いものであった。
【００４０】
［試験例１］
実施例１の脱塩された蛋白質加水分解物の製造方法において、ろ過処理時の蛋白質加水分解物を含有する溶液のｐＨと、逆浸透時の蛋白質加水分解物を含有する溶液のｐＨを表１に示すように変更した以外は実施例１と同様の方法で脱塩された蛋白質加水分解物を得た。なお、サンプルＮｏ．７は、水酸化ナトリウムを用いて逆浸透処理時のｐＨを調整した。
次いで、逆浸透処理後の膜透過液の蛋白質濃度を測定し、蛋白質加水分解物の収率を下記の評価基準で評価した。なお、得られた逆浸透処理後の蛋白質加水分解物を含有する溶液のＮａ含量は逆浸透処理前のＮａ含量の５０％未満であり、充分に脱塩されていた。
【００４１】
「逆浸透処理後の蛋白質加水分解物の収率」の評価
ランク：基準
Ａ：逆浸透処理後の膜透過液の蛋白質濃度が０．０２％未満であり、蛋白質加水分解物の収率は充分に高いものであった
Ｂ：逆浸透処理後の膜透過液の蛋白質濃度が０．０２％以上０．０５％未満であり、蛋白質加水分解物の収率は問題ない程度に高いものであった
Ｃ：逆浸透処理後の膜透過液の蛋白質濃度が０．０５％以上であり、蛋白質加水分解物の収率は高いものではなかった
Ｄ：ＮＦ膜が目詰まりを起こし、逆浸透処理できなかった。
【００４２】
【表１】
【００４３】
表１より、ろ過処理時の蛋白質加水分解物を含有する溶液のｐＨが、逆浸透処理時のｐＨよりも高く、逆浸透処理時のｐＨを４．５〜６．５に調整して得られた脱塩された蛋白質加水分解物は、蛋白質加水分解物の収率が高く、ろ過処理時の蛋白質加水分解物を含有する溶液のｐＨが、逆浸透処理時のｐＨよりも０．５以上高く、逆浸透処理時のｐＨを４．８〜６に調整して得られた脱塩された蛋白質加水分解物は、蛋白質加水分解物の収率がより高いことが理解できる。
【００４４】
［試験例２］
実施例１の脱塩された蛋白質加水分解物の製造方法における逆浸透処理前のｐＨ調整において、用いる酸剤の種類を表２に示すように変更した以外は実施例１と同様の方法で脱塩された蛋白質加水分解物を得た。次いで、逆浸透処理後の膜透過液の蛋白質濃度を測定し、蛋白質加水分解物の収率を試験例１と同様の評価基準で評価した。なお、得られた逆浸透処理後の蛋白質加水分解物を含有する溶液のＮａ含量は逆浸透処理前のＮａ含量の５０％未満であり、充分に脱塩されていた。
【００４５】
【表２】
【００４６】
表２より、有機酸（クエン酸、酢酸、グルコン酸）を用いて逆浸透処理時の蛋白質加水分解物を含有する溶液のｐＨを４．５〜６．５に調整して得られた脱塩された蛋白質加水分解物は、無機酸（塩酸）を用いたものより蛋白質加水分解物の収率が高いことが理解できる。また、有機酸の中でもクエン酸、グルコン酸を用いて逆浸透処理時の蛋白質加水分解物を含有する溶液のｐＨを４．５〜６．５に調整して得られた脱塩された蛋白質加水分解物は、充分に収率が高いことが理解できる。
【００４７】
［試験例３］
実施例１の脱塩された蛋白質加水分解物の製造方法において、用いるＮＦ膜の種類、逆浸透処理時の圧力を表３に示すように変更した以外は実施例１と同様の方法で脱塩された蛋白質加水分解物を得た。次いで、逆浸透処理後の膜透過液の蛋白質濃度を測定し、蛋白質加水分解物の収率を試験例１と同様の評価基準で評価した。なお、得られた逆浸透処理後の蛋白質加水分解物を含有する溶液のＮａ含量は逆浸透処理前のＮａ含量の５０％未満であり、充分に脱塩されていた。
【００４８】
【表３】
【００４９】
表３より、ＮａＣｌ阻止率が３０〜７０％のＮＦ膜を用いて、圧力が０．８〜２ＭＰａの条件で逆浸透処理することで得られた、脱塩された蛋白質加水分解物は、蛋白質加水分解物の収率が高いことが理解できる。また、圧力が１．３〜１．８ＭＰａの条件で逆浸透処理することで得られた、脱塩された蛋白質加水分解物は、蛋白質加水分解物の収率がより高いことが理解できる。
【００５０】
［実施例２］
分離大豆蛋白質１ｋｇに１．５ｍｏｌ／Ｌ塩酸溶液１０Ｌを加え、９０℃で２時間処理した。次いで水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨ７．０に調整し、この液にケイソウ土１５０ｇを加え、撹拌ろ過を行って不溶物を除去した。得られた蛋白質加水分解物の平均分子量をＴＮＢＳ法に従い測定したところ、平均分子量は１０００であった。
次いで、得られたろ液を実施例１と同様の方法で逆浸透処理を行い、濃縮液を回収することで脱塩された蛋白質加水分解物を得た。
【００５１】
逆浸透処理後の膜透過液の蛋白質濃度を測定したところ、０．０１８％であり、蛋白質加水分解物の漏出は少なく、蛋白質加水分解物の収率は高いものであった。なお、得られた逆浸透処理後の蛋白質加水分解物を含有する溶液のＮａ含量は逆浸透処理前のＮａ含量の５０％未満であり、充分に脱塩されていた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛋白質加水分解物を含有する溶液をろ過処理した後、特定の条件下で逆浸透処理を行うことで蛋白質加水分解物の収率を高めた、脱塩された蛋白質加水分解物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質加水分解物は動物や植物由来の蛋白質を加水分解したものであり、栄養源や呈味改善剤として加工食品に用いられるだけでなく、化粧品、医薬品などの皮膚外用剤など幅広い分野で利用されている。
【０００３】
蛋白質加水分解物としては、卵白蛋白質などの動物性蛋白質、大豆蛋白質、小麦蛋白質などの植物性蛋白質を酸存在下、またはアルカリ存在下で加熱して加水分解する方法や、プロテアーゼ処理で加水分解する方法が知られている。
【０００４】
蛋白質を塩酸などの酸存在下で加熱して加水分解する場合、処理後水酸化ナトリウムなどのアルカリで中和する必要があり、その結果、多量の食塩が生成することになる。また、プロテアーゼ処理の場合も、用いるプロテアーゼの種類によってはプロテアーゼ処理後に中和する必要があり、その結果、食塩が生成することになる。
【０００５】
中和により生成された食塩や元来蛋白質原料に含有されている食塩を脱塩する方法としては、イオン交換樹脂を用いる方法や電気透析処理を行う方法などが知られている。しかしながら、これらの方法による脱塩は、脱塩後の蛋白質加水分解物溶液が希釈され、その後の濃縮工程に多大な時間とコストがかかるという問題があった。
【０００６】
このような問題点を解決する方法として、ナノフィルタレーション（ＮＦ） 膜を用いた乳原料の脱塩方法が知られている（特許文献１）。しかしながら、この方法で蛋白質加水分解物の脱塩処理を行うと、乳原料よりも分子量の小さい蛋白質加水分解物がＮＦ膜から漏出してしまい、収率が低下してしまうという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平８−２６６２２１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明の目的は、ＮＦ膜を用いた収率の高い、脱塩された蛋白質加水分解物の製造方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、上記目的を達成すべく、使用原料及び各工程等、様々な諸条件について鋭意研究を重ねた結果、蛋白質加水分解物を含有する溶液をろ過処理した後、酸剤によりｐＨ４．５〜６．５に調整し、ＮａＣｌ阻止率３０〜７０％のＮＦ膜を用いて逆浸透処理を行うことで、脱塩された蛋白質加水分解物の収率を高められること見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、
（１）蛋白質加水分解物を含有する溶液をろ過処理した後、酸剤によりｐＨ４．５〜６．５に調整し、ＮａＣｌ阻止率３０〜７０％のＮＦ膜を用いて逆浸透処理を行う工程を少なくとも含む脱塩された蛋白質加水分解物の製造方法、
（２）ろ過処理時の蛋白質加水分解物を含有する溶液のｐＨが、逆浸透処理時のｐＨよりも高い（１）記載の脱塩された蛋白質加水分解物の製造方法、
（３）ろ過処理時の蛋白質加水分解物を含有する溶液のｐＨが、逆浸透処理時のｐＨよりも０．５以上高い（１）または（２）に記載の脱塩された蛋白質加水分解物の製造方法、
（４）蛋白質加水分解物の分子量が２００〜２０００である（１）乃至（３）のいずれかに記載の脱塩された蛋白質加水分解物の製造方法、
（５）酸剤が有機酸である（１）乃至（４）のいずれかに記載の脱塩された蛋白質加水分解物の製造方法、
（６）逆浸透処理を圧力０．８〜２ＭＰａの条件下で行う（１）乃至（５）のいずれかに記載の脱塩された蛋白質加水分解物の製造方法、
である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、蛋白質加水分解物を含有する溶液をろ過処理した後、特定の条件下で逆浸透処理を行うことで蛋白質加水分解物の収率を高めた、脱塩された蛋白質加水分解物の製造方法を提供でき、脱塩された蛋白質加水分解物の効率的な製造が可能となることで、商品の原価低減および更なる需要拡大が期待される。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。なお、本発明において「％」は「質量％」を意味する。
【００１３】
本発明は、脱塩された蛋白質加水分解物を製造する際に、蛋白質加水分解物の収率を高めるために、蛋白質加水分解物を含有する溶液をろ過処理した後、酸剤によりｐＨ４．５〜６．５に調整し、ＮａＣｌ阻止率３０〜７０％のＮＦ膜を用いて逆浸透処理を行う工程を少なくとも含むことを特徴とする。
【００１４】
本発明の脱塩された蛋白質加水分解物とは、処理前と比較して無機塩類の含量が低減されたものであれば良く、脱塩処理後の無機塩類の濃度を特に限定するものではないが、加工食品、化粧品及び医薬品の原料としての汎用性を高める観点から、逆浸透処理後の蛋白質加水分解物を含有する溶液のＮａ含量が逆浸透処理前のＮａ含量の７０％未満となることが好ましく、５０％未満となることがより好ましい。
【００１５】
本発明で用いる蛋白質加水分解物の蛋白質源としては、種々の動物性蛋白質または植物性蛋白質の１種または２種以上を組合せて使用することができる。例えば、動物性蛋白質としては、卵白蛋白質、乳蛋白質などが挙げられ、植物性蛋白質としては、大豆蛋白質、小麦蛋白質などが挙げられる。
【００１６】
蛋白質を加水分解する方法は、特に限定するものではないが、蛋白質をプロテアーゼ処理、酸存在下で加熱処理、アルカリ存在下で加熱処理する方法等が挙げられる。蛋白質をプロテアーゼ処理する場合、用いるプロテアーゼは、特に限定するものではないが、例えば、ペプシン、キモトリプシン、トリプシン、パンクレアチンなどの動物由来プロテアーゼ、パパイン、ブロメライン、フィシンなどの植物由来プロテアーゼ、微生物（乳酸菌、枯草菌、放線菌、カビ、酵母など）由来のエンドプロテアーゼ、エキソプロテアーゼならびにこれらの粗精製物および菌体破砕物等が挙げられ、これらの１種または２種以上を組合せて用いることができる。
【００１７】
このうち、本発明の脱塩された蛋白質加水分解物の製造方法において、プロテアーゼとして酸性プロテアーゼを使用して蛋白質を加水分解すると、処理後の中和処理により食塩が生成しやすいため、本発明に好適である。このような酸性プロテアーゼの市販品としては、例えば、商品名：ニューラーゼＡ（起源：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、天野エンザイム社製）、商品名：スミチームＡＰ（起源：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、新日本化学工業社製）、商品名：モルシンＦ（起源：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、キッコーマン社製）等が挙げられる。
【００１８】
プロテアーゼにより蛋白質を加水分解する方法としては、例えば、卵白をアスペルギルス属菌起源の酸性プロテーゼで加水分解する場合を例に挙げると、卵白をｐＨ２．５〜４．５、好ましくはｐＨ３〜４に調整し、この卵白にアスペルギルス属菌起源の酸性プロテアーゼを添加し、ゆっくりと撹拌しながら、３０〜６０℃、好ましくは３５〜５５℃にて２〜２４時間反応させればよい。
【００１９】
プロテアーゼにより蛋白質を加水分解する場合、ｐＨ、温度条件および加熱時間は、使用するプロテアーゼの種類および組合せに応じて適宜調整するのが好ましい。
【００２０】
蛋白質を酸存在下で加熱処理する場合、用いる酸剤は特に限定するものではないが、例えば塩酸、硝酸、硫酸、シュウ酸などが挙げられ、安価であり分解力が強い点から塩酸を用いることが好ましい。また、処理条件は特に限定されるものではないが、求める加水分解の程度によって任意に選択することができる。例えば、塩酸濃度０．１〜３ｍｏｌ／Ｌ、加熱温度３０〜１００℃、加熱時間１〜５０時間の範囲で適宜条件を選択すればよい。
【００２１】
蛋白質をアルカリ存在下で加熱処理する場合、用いるアルカリ剤は特に限定するものではないが、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウムなどが挙げられ、その中でも安価で入手可能な水酸化ナトリウムを用いることが好ましい。また、処理条件は特に限定されるものではないが、求める加水分解の程度によって任意に選択することができる。例えば、水酸化ナトリウム濃度０．１〜３ｍｏｌ／Ｌ、加熱温度３０〜１００℃、加熱時間１〜５０時間の範囲で適宜条件を選択すればよい。
【００２２】
プロテアーゼ処理、酸存在下で加熱処理、またはアルカリ存在下で加熱処理をした蛋白質加水分解物の平均分子量は、特に限定するものではないが、２００〜２０００が好ましく、２５０〜１５００がより好ましい。蛋白質加水分解物の平均分子量が前記値より低いと、本願発明の方法により蛋白質加水分解物を含有する溶液をろ過処理した後、逆浸透処理したとしても、蛋白質加水分解物の収率が低下する傾向にあるため好ましくない。また、蛋白質加水分解物の平均分子量が前記値よりも高いと、本願発明の方法によらなくても蛋白質加水分解物の収率は低くなり難いため好適でない。
【００２３】
得られた蛋白質加水分解物を含有する溶液をろ過処理し、不溶物を除去する。ろ過処理時の蛋白質加水分解物を含有する溶液のｐＨは、後述の逆浸透処理時のｐＨよりも高いｐＨであることが好ましく、より好ましくはｐＨの差が０．５以上、更に好ましくはｐＨの差が１〜５である。蛋白質加水分解物を含有する溶液のｐＨが逆浸透処理時のｐＨよりも低い場合、ＮＦ膜が目詰まりを起こし逆浸透処理できなくなる場合があり好ましくない。一方、ｐＨの差は大きいほど本発明の効果が得られやすいが、上記範囲よりも大きいと、生成される食塩の量が増加するため、その後の脱塩効率の観点から好ましくない。
【００２４】
具体的な、ろ過処理時の蛋白質加水分解物を含有する溶液のｐＨは、特に限定するものではないが、ｐＨ５〜９が好ましく、ｐＨ６〜８がより好ましい。蛋白質加水分解物を含有する溶液のｐＨが前記値より低く、特にｐＨが３以上５未満であると、蛋白質加水分解物が不溶化してしまい、ろ過処理時に蛋白質加水分解物の収率が低下する場合があるため好ましくない。また、蛋白質加水分解物を含有する溶液のｐＨが前記値よりも高くても、生成される食塩の量が増加するため、その後の脱塩効率の観点から好ましくない。なお、蛋白質を加水分解処理した後のｐＨが上記範囲内である場合は、ｐＨの調整を行わずにろ過処理を行えばよい。
【００２５】
本発明において、蛋白質加水分解物を含有する溶液のろ過処理の方法は、特に限定するものではないが、ケイソウ土などのろ過助剤を用いたフィルターろ過を行うことが好ましい。
【００２６】
次いで、ろ過処理した蛋白質加水分解物を含有する溶液を酸剤によりｐＨ４．５〜６．５、好ましくはｐＨ４．８〜６に調整した後、逆浸透処理を行う。蛋白質加水分解物を含有する溶液のｐＨが前記値より低いと、用いる蛋白質の種類によってはＮＦ膜が目詰まりを起こし逆浸透処理できなくなる場合があるためである。また、蛋白質加水分解物を含有する溶液のｐＨが前記値よりも高いと、蛋白質加水分解物の収率が低下する傾向にあるためである。
【００２７】
蛋白質加水分解物を含有する溶液のｐＨ調整に使用する酸剤としては、特に限定するものではないが、有機酸としては、例えば、クエン酸、グルコン酸、酢酸、酒石酸、コハク酸、リンゴ酸等、無機酸としては、例えば塩酸、硫酸、リン酸等が挙げられ、これらの１種または２種以上を適宜選択して使用すると良い。その中でも有機酸を用いると蛋白質加水分解物の収率を高めることができ好ましく、クエン酸、グルコン酸を用いるとより好ましい。
【００２８】
本発明は、上述のｐＨ調整をした蛋白質加水分解物を含有する溶液をＮａＣｌ阻止率３０〜７０％のＮＦ膜を用いて逆浸透処理を行う。
【００２９】
ＮＦ膜とは、ろ過膜の一種であって孔の大きさが２ｎｍ以下である逆浸透膜の中で、イオンや塩類などの阻止率が概ね７０％以下と低いものをいう。本発明で用いるＮＦ膜の構造および材質は、特に限定されるものではないが、構造としては、例えば、中空糸膜、スパイラル膜、チューブラー膜等が挙げられ、材質としては、例えば、ポリスルホン、芳香族ポリアミド、酢酸セルロース、ポリビニルアルコール等が挙げられ、これらを適宜選択して使用すると良い。
【００３０】
本発明で用いるＮＦ膜は、ＮａＣｌ阻止率が３０〜７０％であり、好ましくは４０〜７０％である。ＮＦ膜のＮａＣｌ阻止率が前記値より低いと、蛋白質加水分解物の収率が低下する傾向にあるためである。また、ＮＦ膜のＮａＣｌ阻止率が前記値よりも高いと、脱塩効率が低下するためである。なお、ＮＦ膜のＮａＣｌ阻止率は下記の式で求められる。
【００３１】
阻止率（％）＝（１−透過液中のＮａＣｌ濃度／原料液中のＮａＣｌ濃度）×１００
【００３２】
逆浸透処理する際の蛋白質加水分解物の濃度は、特に限定するものではないが、０．２〜１２％が好ましく、０．４〜１０％がより好ましい。蛋白質加水分解物の濃度が前記値より低いと、処理時間が長くなるため好ましくない。また、蛋白質加水分解物の濃度が前記値よりも高いと、蛋白質加水分解物の収率が低下する傾向にあるため好ましくない。
【００３３】
逆浸透処理時の圧力条件は特に限定するものではないが、０．８〜２ＭＰａが好ましく、１．３〜１．８ＭＰａがより好ましい。逆浸透処理時の圧力が前記値より低いと、蛋白質加水分解物の収率が低下する傾向にあるため好ましくない。また、逆浸透処理時の圧力が前記値より高くても、蛋白質加水分解物の収率が低下する傾向にあるため好ましくない。
【００３４】
また、逆浸透処理における、逆浸透処理時の温度は常法に従って任意に設定することができるが、蛋白質加水分解物の収率、脱塩の効率、およびＮＦ膜の耐熱性を考慮して、１０℃〜５０℃で処理することが好ましい。
【００３５】
以上の工程により本発明の脱塩された蛋白質加水分解物が得られるが、必要に応じて更にろ過処理を行い、スプレードライなどで乾燥してもよい。
【００３６】
本発明の逆浸透処理を行うことで、逆浸透処理時の蛋白質加水分解物の収率を高めることができるが、本発明では、逆浸透処理後の膜透過液の蛋白質濃度、つまり逆浸透処理によって漏出した蛋白質の濃度を測定することによって、蛋白質加水分解物の収率を測定する。逆浸透処理後の膜透過液の蛋白質濃度は、低いほど、蛋白質加水分解物の収率が高くなるため好ましいが、０．０５％未満が好ましく、０．０２％未満がより好ましい。
【００３７】
以下、本発明について、実施例及び試験例に基づき具体的に説明する。なお、本発明は、これらに限定するものではない。
【実施例】
【００３８】
［実施例１］
乾燥卵白１ｋｇを清水２５Ｌに溶解し、１０％塩酸を用いてｐＨ３．５に調整した。次いで、酸性プロテアーゼ（ニューラーゼＡ、天野エンザイム社製）１０ｇを添加し、４０℃で１２時間プロテアーゼ処理を行った後、水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨ７．０に調整し、８５℃で１０分加熱することでプロテアーゼを失活させた。この液にケイソウ土１５０ｇを加え、撹拌ろ過を行って不溶物を除去した。得られた蛋白質加水分解物の平均分子量をＴＮＢＳ法に従い測定したところ、平均分子量は３００であった。また、得られた蛋白質加水分解物を含有する溶液のＮａ含量をＩＰＣ発光分析装置（ＶＩＳＴＡ−ＰＲＯ、バリアン・テクノロジーズ・ジャパン・リミテッド社製）を用いて測定したところ、固形分１００ｇあたり３３７ｍｇであった。
次いで、得られたろ液に水を加え蛋白質加水分解物の濃度を２％に調整した後、クエン酸を用いてｐＨ５．０に調整した後、ＮａＣｌ阻止率４５％のＮＦ膜を用いて圧力１．５ＭＰａで逆浸透処理を行い、濃縮液を回収することで脱塩された蛋白質加水分解物を得た。
【００３９】
逆浸透処理後の蛋白質加水分解物を含有する溶液のＮａ含量を上述の発光分析装置で測定したところ、固形分１００ｇあたり１５５ｍｇ（逆浸透処理前のＮａ含量の約４６％）であり、充分に脱塩されたものであった。
また、逆浸透処理後の膜透過液の蛋白質濃度を測定したところ、０．０１３％であり、蛋白質加水分解物の漏出は少なく、蛋白質加水分解物の収率は高いものであった。
【００４０】
［試験例１］
実施例１の脱塩された蛋白質加水分解物の製造方法において、ろ過処理時の蛋白質加水分解物を含有する溶液のｐＨと、逆浸透時の蛋白質加水分解物を含有する溶液のｐＨを表１に示すように変更した以外は実施例１と同様の方法で脱塩された蛋白質加水分解物を得た。なお、サンプルＮｏ．７は、水酸化ナトリウムを用いて逆浸透処理時のｐＨを調整した。
次いで、逆浸透処理後の膜透過液の蛋白質濃度を測定し、蛋白質加水分解物の収率を下記の評価基準で評価した。なお、得られた逆浸透処理後の蛋白質加水分解物を含有する溶液のＮａ含量は逆浸透処理前のＮａ含量の５０％未満であり、充分に脱塩されていた。
【００４１】
「逆浸透処理後の蛋白質加水分解物の収率」の評価
ランク：基準
Ａ：逆浸透処理後の膜透過液の蛋白質濃度が０．０２％未満であり、蛋白質加水分解物の収率は充分に高いものであった
Ｂ：逆浸透処理後の膜透過液の蛋白質濃度が０．０２％以上０．０５％未満であり、蛋白質加水分解物の収率は問題ない程度に高いものであった
Ｃ：逆浸透処理後の膜透過液の蛋白質濃度が０．０５％以上であり、蛋白質加水分解物の収率は高いものではなかった
Ｄ：ＮＦ膜が目詰まりを起こし、逆浸透処理できなかった。
【００４２】
【表１】
【００４３】
表１より、ろ過処理時の蛋白質加水分解物を含有する溶液のｐＨが、逆浸透処理時のｐＨよりも高く、逆浸透処理時のｐＨを４．５〜６．５に調整して得られた脱塩された蛋白質加水分解物は、蛋白質加水分解物の収率が高く、ろ過処理時の蛋白質加水分解物を含有する溶液のｐＨが、逆浸透処理時のｐＨよりも０．５以上高く、逆浸透処理時のｐＨを４．８〜６に調整して得られた脱塩された蛋白質加水分解物は、蛋白質加水分解物の収率がより高いことが理解できる。
【００４４】
［試験例２］
実施例１の脱塩された蛋白質加水分解物の製造方法における逆浸透処理前のｐＨ調整において、用いる酸剤の種類を表２に示すように変更した以外は実施例１と同様の方法で脱塩された蛋白質加水分解物を得た。次いで、逆浸透処理後の膜透過液の蛋白質濃度を測定し、蛋白質加水分解物の収率を試験例１と同様の評価基準で評価した。なお、得られた逆浸透処理後の蛋白質加水分解物を含有する溶液のＮａ含量は逆浸透処理前のＮａ含量の５０％未満であり、充分に脱塩されていた。
【００４５】
【表２】
【００４６】
表２より、有機酸（クエン酸、酢酸、グルコン酸）を用いて逆浸透処理時の蛋白質加水分解物を含有する溶液のｐＨを４．５〜６．５に調整して得られた脱塩された蛋白質加水分解物は、無機酸（塩酸）を用いたものより蛋白質加水分解物の収率が高いことが理解できる。また、有機酸の中でもクエン酸、グルコン酸を用いて逆浸透処理時の蛋白質加水分解物を含有する溶液のｐＨを４．５〜６．５に調整して得られた脱塩された蛋白質加水分解物は、充分に収率が高いことが理解できる。
【００４７】
［試験例３］
実施例１の脱塩された蛋白質加水分解物の製造方法において、用いるＮＦ膜の種類、逆浸透処理時の圧力を表３に示すように変更した以外は実施例１と同様の方法で脱塩された蛋白質加水分解物を得た。次いで、逆浸透処理後の膜透過液の蛋白質濃度を測定し、蛋白質加水分解物の収率を試験例１と同様の評価基準で評価した。なお、得られた逆浸透処理後の蛋白質加水分解物を含有する溶液のＮａ含量は逆浸透処理前のＮａ含量の５０％未満であり、充分に脱塩されていた。
【００４８】
【表３】
【００４９】
表３より、ＮａＣｌ阻止率が３０〜７０％のＮＦ膜を用いて、圧力が０．８〜２ＭＰａの条件で逆浸透処理することで得られた、脱塩された蛋白質加水分解物は、蛋白質加水分解物の収率が高いことが理解できる。また、圧力が１．３〜１．８ＭＰａの条件で逆浸透処理することで得られた、脱塩された蛋白質加水分解物は、蛋白質加水分解物の収率がより高いことが理解できる。
【００５０】
［実施例２］
分離大豆蛋白質１ｋｇに１．５ｍｏｌ／Ｌ塩酸溶液１０Ｌを加え、９０℃で２時間処理した。次いで水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨ７．０に調整し、この液にケイソウ土１５０ｇを加え、撹拌ろ過を行って不溶物を除去した。得られた蛋白質加水分解物の平均分子量をＴＮＢＳ法に従い測定したところ、平均分子量は１０００であった。
次いで、得られたろ液を実施例１と同様の方法で逆浸透処理を行い、濃縮液を回収することで脱塩された蛋白質加水分解物を得た。
【００５１】
逆浸透処理後の膜透過液の蛋白質濃度を測定したところ、０．０１８％であり、蛋白質加水分解物の漏出は少なく、蛋白質加水分解物の収率は高いものであった。なお、得られた逆浸透処理後の蛋白質加水分解物を含有する溶液のＮａ含量は逆浸透処理前のＮａ含量の５０％未満であり、充分に脱塩されていた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質加水分解物を含有する溶液をろ過処理した後、酸剤によりｐＨ４．５〜６．５に調整し、ＮａＣｌ阻止率３０〜７０％のＮＦ膜を用いて逆浸透処理を行う工程を少なくとも含むことを特徴とする脱塩された蛋白質加水分解物の製造方法。
【請求項２】
ろ過処理時の蛋白質加水分解物を含有する溶液のｐＨが、逆浸透処理時のｐＨよりも高いことを特徴とする請求項１記載の脱塩された蛋白質加水分解物の製造方法。
【請求項３】
ろ過処理時の蛋白質加水分解物を含有する溶液のｐＨが、逆浸透処理時のｐＨよりも０．５以上高いことを特徴とする請求項１または２に記載の脱塩された蛋白質加水分解物の製造方法。
【請求項４】
蛋白質加水分解物の分子量が２００〜２０００であるである請求項１乃至３のいずれかに記載の脱塩された蛋白質加水分解物の製造方法。
【請求項５】
酸剤が有機酸である請求項１乃至４のいずれかに記載の脱塩された蛋白質加水分解物の製造方法。
【請求項６】
逆浸透処理を圧力０．８〜２ＭＰａの条件下で行うことを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の脱塩された蛋白質加水分解物の製造方法。
【請求項１】
蛋白質加水分解物を含有する溶液をろ過処理した後、酸剤によりｐＨ４．５〜６．５に調整し、ＮａＣｌ阻止率３０〜７０％のＮＦ膜を用いて逆浸透処理を行う工程を少なくとも含むことを特徴とする脱塩された蛋白質加水分解物の製造方法。
【請求項２】
ろ過処理時の蛋白質加水分解物を含有する溶液のｐＨが、逆浸透処理時のｐＨよりも高いことを特徴とする請求項１記載の脱塩された蛋白質加水分解物の製造方法。
【請求項３】
ろ過処理時の蛋白質加水分解物を含有する溶液のｐＨが、逆浸透処理時のｐＨよりも０．５以上高いことを特徴とする請求項１または２に記載の脱塩された蛋白質加水分解物の製造方法。
【請求項４】
蛋白質加水分解物の分子量が２００〜２０００であるである請求項１乃至３のいずれかに記載の脱塩された蛋白質加水分解物の製造方法。
【請求項５】
酸剤が有機酸である請求項１乃至４のいずれかに記載の脱塩された蛋白質加水分解物の製造方法。
【請求項６】
逆浸透処理を圧力０．８〜２ＭＰａの条件下で行うことを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の脱塩された蛋白質加水分解物の製造方法。
【公開番号】特開２０１１−１０１６２７（Ｐ２０１１−１０１６２７Ａ）
【公開日】平成２３年５月２６日（２０１１．５．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２５８３０３（Ｐ２００９−２５８３０３）
【出願日】平成２１年１１月１１日（２００９．１１．１１）
【出願人】（０００００１４２１）キユーピー株式会社 (657)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年５月２６日（２０１１．５．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月１１日（２００９．１１．１１）
【出願人】（０００００１４２１）キユーピー株式会社 (657)
【Ｆターム（参考）】
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