臍帯血細胞を用いた脳損傷の処置
本発明は、臍帯血細胞を用いた、脳卒中、外傷性脳傷害、および神経変性障害の処置に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本出願は、TREATMENT OF BRAIN DAMAGE USING UMBILICAL CORD BLOOD CELLSと題された、２００８年３月２８日出願の米国仮出願第61/072,173号の優先権を主張し、その全内容が本明細書に参照として組込まれる。
【０００２】
［発明の分野］
本発明は、脳損傷を処置するための臍帯血細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
脳卒中は一般的に、脳の全てまたは一部への血液供給を遮断または低減する任意の事象をいう。米国においては、死亡の三番目の主要原因であり、成人の身体障害の主要原因である。脳卒中は、毎年およそ７５０，０００人に影響を及ぼす。脳卒中患者の３分の１は、脳卒中の発生から１週間以内に死亡する。生存者の大半には、限定するものではないが、顔面、四肢、または全身麻痺を含む、中度から重度の身体障害が残る。
【０００４】
脳卒中に伴う慢性症状を処置するための様々な試みがなされてきた。最近では、Ｇ−ＣＳＦ動員末梢血細胞が、急性および慢性の脳卒中の症状を処置することが報告されている。しかしながら、自家動員細胞治療が適切ではないであろう対象者を含む大部分の集団に好適な治療法の要望はいまだに存在する。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、その最も広範な意味において、臍帯血細胞を用いて脳損傷を処置するための方法を提供する。特に重要であるのは、臍帯血細胞を用いた慢性脳卒中および神経変性疾患の処置である。驚くべきことに、本発明によれば、臍帯血細胞を慢性脳卒中対象の脳実質内に投与すると、対象が経験した脳卒中関連の身体障害のうち少なくともいくつかが好転することが見出された。
【０００６】
したがって、一側面において、本発明は、ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、またはＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋臍帯血細胞を富化した単離臍帯血細胞集団を、脳組織損傷を処置するための有効量で、それを必要としているヒト対象の脳実質内へ投与することを含む、脳組織損傷を有する対象を処置するための方法を提供する。
【０００７】
別の側面において、本発明は、慢性脳卒中を処置するための方法であって、脳卒中を経験したヒト対象の脳へ、ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、またはＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋臍帯血細胞を富化した単離臍帯血細胞集団を、脳卒中を処置するための有効量で実質内投与することを含み、ここで単離集団を脳卒中から７日を超えて経過した後に投与する、前記方法を提供する。１つの態様において、脳卒中から１ヶ月を超えて経過した後に、集団を投与する。別の態様において、脳卒中から３ヶ月を超えて経過した後に、集団を投与する。別の態様において、脳卒中から６ヶ月を超えて経過した後に、集団を投与する。さらに別の態様では、脳卒中から１年を超えて経過した後に、集団を投与する。
【０００８】
別の側面において、本発明は、外傷性脳傷害に起因する脳組織損傷を処置するための方法を提供する。より具体的には１つの態様において、本発明は、ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、またはＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞を富化した単離臍帯血細胞集団を、外傷性脳傷害に起因する脳組織損傷を有する対象の脳実質内へ投与することによって、脳組織損傷を処置するための方法を提供する。かかる脳損傷は、外傷性脳傷害の発生から何ヶ月か（例として、少なくとも１ヶ月）または何年か経過した後に存在するものを含む。したがって、外傷性脳傷害の発生から１ヶ月を超えて、３ヶ月を超えて、６ヶ月を超えて、１年を超えて、またはそれ以上経過した後でも、対象を処置し得る（すなわち、対象に細胞を投与し得る）。
【０００９】
また別の側面において、本発明は、ＣＤ３４＋またはＣＤ１３３＋臍帯血細胞を富化した単離集団を、神経変性障害を処置するための有効量で、そのような処置を必要としているヒト対象の脳へ実質内投与することを含む、神経変性障害を有する対象を処置するための方法を提供する。神経変性障害は、限定するものではないが、パーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、ハンチントン病、ピック病、小脳変性症、および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）であり得る。
【００１０】
１つの態様において、脳組織損傷の発生またはかかる損傷の最先の観察から１ヶ月を超えて経過した後に単離集団を投与する。別の態様において、脳組織損傷の発生またはかかる損傷の最先の観察から６ヶ月を超えて経過した後に単離集団を投与する。さらに別の態様において、脳組織損傷の発生またはかかる損傷の最先の観察から１年を超えて経過した後に単離集団を投与する。
【００１１】
様々な態様を前記側面へと適用し、それらを以下に記載する。
【００１２】
１つの態様において、集団は、ＣＤ３４＋臍帯血細胞を富化したものである。関連する態様において、集団は、少なくとも７５％がＣＤ３４＋、または少なくとも９０％がＣＤ３４＋である単核細胞を含む。
【００１３】
別の態様において、集団は、ＣＤ１３３＋臍帯血細胞を富化したものである。関連する態様において、集団は、少なくとも７５％がＣＤ１３３＋、または少なくとも９０％がＣＤ１３３＋である単核細胞を含む。
【００１４】
１つの態様において、集団は、ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋臍帯血細胞を富化したものである。関連する態様において、集団は、少なくとも７５％がＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋、または少なくとも９０％がＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋である単核細胞を含む。
【００１５】
１つの態様において、対象は、少なくとも６０歳である。
【００１６】
１つの態様において、少なくとも２×１０６個の細胞を対象に投与する。別の態様において、少なくとも５×１０６個の細胞を対象に投与する。さらに別の態様において、少なくとも８×１０６個の細胞を対象に投与する。
【００１７】
１つの態様において、集団を、損傷がある皮質脊髄路に沿って３つの部位へと投与する。
【００１８】
１つの態様において、集団は、単一の臍帯血ユニット由来である。別の態様において、集団は、複数の臍帯血ユニット由来である。関連する態様において、集団は、６つの組織適合性マーカーのうち４つ未満を対象と共有する。別の態様において、集団は、６つの組織適合性マーカーのうち少なくとも４つを対象と共有する。
【００１９】
これらならびに本発明の他の側面および態様を、より詳細に本明細書に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
添付の図面は、縮尺通りに描かれていない。様々な図面に描写される同一のまたはほぼ同一の構成要素はそれぞれ、類似の番号で表される。明確にするために、全図面における全ての構成要素が標記され得るわけではない。
【００２１】
【図１Ａ】図１Ａは、実施したモデル研究の実験デザインを描いた模式図である。
【００２２】
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＣＤ３４およびＣＤ１３３を富化した細胞集団の表現型を示す一連のグラフである。
【００２３】
【図２】図２は、２つの実験群および１つの対照群におけるボディースウィングの回復を、時間の関数として示すグラフである。
【００２４】
【図３Ａ】図３Ａは、２つの実験群および１つの対照群における垂直方向の活動性（vertical activity）を、時間の関数として示すグラフである。
【００２５】
【図３Ｂ】図３Ｂは、２つの実験群および１つの対照群における垂直方向の運動の数（number of vertical movements）を、時間の関数として示すグラフである。
【００２６】
【図３Ｃ】図３Ｃは、２つの実験群および１つの対照群における垂直方向の運動の時間（vertical movement time）を、時間の関数として示すグラフである。
【００２７】
【図４】図４は、２つの実験群および１つの対照群における握力の割合を示すグラフである。
【００２８】
【図５】図５は、対照および実験動物におけるラットの脳のＰＥＴ画像である。
【００２９】
【図６】図６は、ＧＦＡＰまたはＮｅｕ−Ｎ（緑色）およびビスベンズイミド（青色）で染色した脳組織切片を示す写真である。
【００３０】
【図７】図７は、ＭＡＰ−２またはｖＷＦ（緑色）およびビスベンズイミド（青色）で染色した脳組織切片を示す画像である。
【００３１】
【図８Ａ−８Ｂ】図８Ａおよび８Ｂは、ＮＧ２（緑色）およびビスベンズイミド（青色）で染色した脳組織切片を示す画像である。
【００３２】
【図９】図９は、Ａ２Ｂ５（緑色）およびビスベンズイミド（青色）で染色した脳組織切片を示す画像である。
【００３３】
【図１０】図１０は、ＣＮＰａｓｅ（緑色）およびビスベンズイミド（青色）で染色した脳組織切片を示す画像である。
【００３４】
【図１１】図１１は、ラミニン（緑色）およびビスベンズイミド（青色）で染色した脳組織切片を示す画像である。
【００３５】
【図１２】図１２は、慢性脳卒中動物からの脳組織切片のＭＲＩ−Ｔ２スキャンおよびプルシアンブルー染色を示す。慢性脳卒中動物では皮質梗塞が認められる。注射した幹細胞は、注射の７日後に右基底核領域で認められた。これらの細胞は神経線維に沿って梗塞領域へと移動し、梗塞領域のサイズは移植の１４日後において縮小していた。
【００３６】
【図１３Ａ−１３Ｂ】図１３ＡおよびＢは、注入した色素の、再生した皮質脊髄路に沿った運搬の模式図および実際の顕微鏡写真を示す。
【００３７】
[発明の詳細な説明]
本発明は一部、臍帯血細胞が慢性脳卒中に伴う症状を好転させることが可能であるという、注目すべきおよび驚くべき知見を基礎とする。従来、脳卒中の影響の多くが、好転不能であるとみなされてきたか、または他の処置を用いても改善されてこなかったことから、これは驚くべきことである。本発明は、臍帯血細胞を用いた慢性脳卒中対象、脳卒中の発生から何年も経過後であっても、の処置を意図する。
【００３８】
本発明は一部、臍帯血細胞を脳の実質へ投与しなければならないという知見をもまた基礎とする。本発明の様々な側面および態様は、脳卒中に起因する損傷がある脳の領域への、より特定的な細胞の配置を提供する。臍帯血細胞のこれらの対象への全身投与では、どんな治療的有益性も得られなかった。
【００３９】
本発明は一部、ＣＤ３４およびＣＤ１３３などの初期造血マーカーを１種または２種以上発現する臍帯血細胞が、慢性脳卒中を処置するうえで特に有用であるという知見をもまた基礎とする。したがって本発明は、造血前駆体の表現型を有する臍帯血細胞の、慢性脳卒中対象の脳実質への投与を含む方法を提供する。造血前駆体の表現型を有する細胞とは、ＣＤ３４およびＣＤ１３３のどちらか一方もしくは両方を発現するものである。
【００４０】
本明細書で用いる場合、脳卒中とは、２４時間を超えて持続する影響を伴う、血液供給の妨害およびそれ故の対象の脳の一部または全てへの酸素量の低減をいう。脳卒中は、血栓症、塞栓症または出血によって引き起こされ得、そして虚血性脳卒中（血栓性脳卒中および塞栓性脳卒中を含み、血栓症、塞栓症、全身の低灌流などに起因する）または出血性脳卒中（脳内出血、くも膜下出血、硬膜下出血、硬膜外出血などに起因する）といわれ得る。本明細書で用いる場合、脳卒中は、熱中症（heat stroke）および一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）を除外する。熱中症は上昇した体温から生じ、その脳内臨床所見は本明細書で定義される脳卒中（すなわち、脳内酸素量の低減を伴う血液供給の妨害）のそれとは異なる。ＴＩＡはしばしば、「ミニ脳卒中」と呼ばれるが、発生から２４時間以内に完全に回復する能力のため、本明細書で定義される脳卒中と区別することができる。
【００４１】
脳卒中は、影響を受けた対象における１または２以上の症状により明らかにされる。これらの症状およびその重篤度は患者ごとに変動し得る一方で、これらは一般的に筋力低下（半身麻痺）、しびれ、知覚および／または振動覚の低減を含む。多くの例において、これらの症状は身体の片側のみに影響を及ぼす（そして通常は、脳のもう片方の側に損傷が存在する）。他の症状には、意識消失、頭痛、嘔吐、嗅覚の、味覚の、聴覚のおよび視覚の（全体的または部分的な）変化、眼瞼下垂（下垂症）、眼筋力低下、反射減退（咽頭反射、嚥下反射および光への瞳孔反応反射を含む）、顔の感覚減退および筋力低下、平衡感覚の問題、不均衡、眩暈、眼振、呼吸および／または心拍数の変化、頭を片側へ回転できなくなる胸鎖乳突筋（ＳＣＭ）の筋力低下、（突出不能および／または左右への移動不能を伴う）舌の力の低下、失語症（すなわち、言語の発話または理解の不能）、失行症（すなわち、随意運動の変化）、運動協調の変化、視野欠損、記憶障害、半側無視、性欲過剰行動（hypersexual gestrues）、膀胱および腸の制御欠如および認知機能低下（例として、認知症、支離滅裂な思考、錯乱、限られた注意持続時間、集中不能）、および歩行パターンの変化が含まれる。脳卒中特有の症状のいくつかとして、急性の顔面麻痺、腕のふらつき（arm drift）および異常発語が含まれる。患者の症状は通常、これに限定するものではないが、National Institutes of Health Stroke Scale(NIHSS)などの、予め確立されたスコアリングシステムを用いて等級付けされる。
【００４２】
脳卒中は、神経学的検査、血液試験、ならびに／またはＣＴスキャン（例として、造影剤なしのもの）、ＭＲＩスキャン、ドップラー超音波法、および動脈造影法などの医用画像技術を通じて診断される。
【００４３】
本明細書で用いる場合、急性脳卒中とは、影響を受けた対象が、脳卒中発生後直ちに（すなわち、最初の７日間以内）経験する１つまたは２つ以上の症状および／または１つまたは２つ以上のリスクをいう。対象の約３分の１がこの７日枠以内に死亡することから、死亡が主なリスクである。この期間中に経験する症状として、限定するものではないが、異常発語、腕のふらつき、意識消失、頭痛、嘔吐、眼瞼下垂（下垂症）、平衡感覚の問題および不均衡、急性の顔面麻痺などを含む、上に列挙するものの多くが含まれる。何人かの患者にとって、時宜にかなった治療介入は症状の重篤度および数を低減することを可能とする。
【００４４】
しかしながら患者の大半は、１つまたは２つ以上のこれらの症状を長期にわたって経験し続けており、本発明が意図されるのはそれらの患者についてである。彼らの脳卒中症状は急性期を超えても存在すること（すなわち、これらが７日を超えて続くことおよび／またはこれらが脳卒中の発生後７日を超えても顕在化していること）から、これらの患者は慢性脳卒中を罹患していると考えられる（または、慢性脳卒中患者といわれる）。したがって、本明細書中に用いられる場合、慢性脳卒中とは、初期の脳卒中イベントに伴い、なおかつ７日を超えて以前に脳卒中を起こした患者において存在する、１つまたは２つ以上の症状および／あるいは１つまたは２つ以上のリスクをいう。一般的に、これらの症状の重篤度および集積は患者の能力障害をもたらす。例えば、慢性脳卒中患者は、言語を話すことまたは理解することができ得ず、（足取りの追跡から証拠付けられるように）歩くことができないかまたは歩くのが困難であり得、変化したまたは損なわれた顔面筋の制御を有し得、協調性運動または四肢の制御の欠損の結果となる、変化したまたは損なわれた総合的な筋肉制御を有し得、損なわれた視野を有し得、部分的にまたは完全に麻痺状態であり得、昏睡状態であり得る、などである。
【００４５】
本発明によると、かかる対象らは、脳実質への臍帯血細胞投与から多大な恩恵を受けることが示されている。発明者らは、このようなやり方で処置された慢性脳卒中患者が、より普通の（または正常の）足取りまたは歩行パターンから証拠付けされるように筋力機能の制御、および／またはより大きな四肢制御を取り戻すことを実証している。
【００４６】
本発明の方法は、処置の７日を超えて以前に脳卒中を起こした、および脳卒中に伴う１つまたは２つ以上の症状を経験し続ける如何なる患者にも用いることが可能である。本発明は、かかる患者を、急性期を過ぎたどの時期においてでも処置することを意図している。したがって、脳卒中発生から２週間目以内（すなわち、脳卒中の発生から８、９、１０、１１、１２、１３または１４日経過後）に患者を処置し得る。いくつかの重要な態様において、脳卒中の発生から２週間を超えて（つまり、脳卒中の発生から１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１日経過後）、３週間を超えて、または４週間を超えて経過後に患者を処置し得る。さらに、他の患者は脳卒中の発生から１、２、３、４、５または６ヶ月経過後に処置され得、他の患者は、脳卒中の発生から７、８、９、１０、１１、または１２ヶ月あるいは脳卒中の発生から１、２、３、４、５年またはそれ以上の年数を含む、６ヶ月を超える時点で処置され得る。本明細書で用いる場合、脳卒中の発生から、例えば、１年での処置は、患者が脳卒中を起こしてから最低でも１年が経過していることを意味する。これは、処置が脳卒中の１周年の日に行われるという意味ではない。本発明以前には、これらの患者の多くにおける傷害は好転不能または治療不能であるとみなされてきた。
【００４７】
本発明によって処置する患者を、その脳卒中歴（すなわち、脳卒中発生時と処置時との間の時間）および任意にその脳卒中スコアに基づいて同定可能である。脳卒中スコアとは、患者が経験する症状の重篤度の数値的表現である。ＮＩＨＳＳ，ＥＳＳ，ＥＭＳおよびバーセルインデックスはすべて、患者における脳卒中症状の重篤度を定めるスコアシステムである。ＮＩＨＳＳの場合、より低いスコアは、より少ない症状およびより軽度の障害を示す。本明細書に記載の方法は如何なる脳卒中患者を処置するのにも使用可能である一方、好ましくは、より重篤な症状を有する患者を処置するのに用いる。したがって、１つの態様において、９,１０,１１,１２,１３,１４,１５,１６，１７，１８，１９，および２０のＮＩＨＳＳスコアを有する患者を含む、９〜２０のＮＩＨＳＳスコアを有する患者を本発明によって処置する。９のＮＩＨＳＳスコアを有する患者の例としては、反射運動または自律神経性効果にのみ反応する者であり、言語不自由者（すなわち、使用可能な発話または聴解力を有しない）であり、および顔の片側または両側において完全麻痺（すなわち、顔の上側および下側における顔面運動の欠如）を有する者である。医師はおそらくこのようなスコアについて熟知しており、本明細書で提供される時期的なおよび脳卒中スコアのガイダンスを用いて、本発明による処置が可能である対象を容易に同定可能である。
【００４８】
本発明は、神経変性障害を有する対象の処置をもまた意図する。神経変性障害とは、ニューロンの進行性劣化および／または死を特徴とする障害である。例は、これに限定するものではないが、パーキンソニズム、アルツハイマー病、多発性硬化症、ハンチントン病、ピック病、クロイツフェルト・ヤコブ病、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、パーキンソン症、シャイ・ドレーガー症候群、小脳皮質萎縮症、フリードライヒ失調症、歯状核赤核の変性、マシャド・ジョセフ病、脊髄性筋萎縮、淡蒼球・橋・黒質の変性（pallidopontonigral degeneration）（ＰＰＮＤ）、淡蒼球・黒質・ルイ体の変性（pallido-nigro-luysian degeneration）（ＰＮＬＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、グアムＡＬＳ症候群（Guam-ALS syndrome）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、てんかん、虚血性脳傷害、老人性認知症、コルサコフ症候群、橋小脳の萎縮（pontocerebellar atrophy）、オリーブ橋小脳萎縮症または変性症、グルタル酸血症、びまん性レビー小体型認知症、１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）、多発脳梗塞性認知症、脳炎症、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、および淡蒼球の変性を含む。
【００４９】
本発明は、外傷性脳傷害（ＴＢＩ）に起因する慢性脳損傷を有する対象の処置をもまた意図する。
【００５０】
本発明の方法は、年齢または性別に関係なく如何なる患者においてでも実施することが可能であるが、高齢の対象が特に恩恵を受けるだろうと期待されている。本明細書で用いる場合、高齢の患者とは、６０歳以上の者を指す。好適な対象はヒト対象であることが、本明細書の内容から理解されるだろう。
【００５１】
本明細書で用いる場合、慢性脳卒中を有する対象を処置することは、１つまたは２つ以上の慢性脳卒中症状を改善、低減または完全に除去することを意味する。例として、脳卒中に起因する脳傷害の範囲を低減するために、脳卒中を有する対象を本発明によって処置する。脳傷害は、標準の医用画像技術を用いて梗塞サイズを決定することによって測定可能である。したがって、脳傷害の範囲の低減は、これらの画像技術を用いて視認される梗塞サイズの減少として測定可能である。いくつかの例において、梗塞巣（または容量）は少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％減少し得るか、または完全に消滅し得る。好ましい態様において、処置は梗塞巣を少なくとも１０％低減させる。同様に、脳傷害の範囲を決定するのに神経機能を測定する実験を用いることが可能である。ＮＩＨＳＳなどのスコアシステムをもまた、対象における処置を評価するために用いることが可能である。例として、ＮＩＨＳＳスコアにおける１、２、３、４、５、１０、１５、または２０ポイントの低減はすべて、処置の示唆となるであろう。好ましい態様において、処置は少なくとも４ポイント低減という結果となる。他の態様において、処置は０〜８のＮＩＨＳＳスコアという結果となる。
【００５２】
本発明の方法は、対象への臍帯血細胞の投与を含む。臍帯血細胞とは、臍帯の静脈および動脈から採取した細胞のことである。かかる細胞を臍帯から抽出する方法は従来技術により公知であり、公表されている（例えば、米国公開公報第20060275271号参照）。これらの細胞は、使用前に採取し凍結してもよく、または凍結せずに使用してもよい。かかる細胞の凍結方法は、従来技術により公知であり、公表されている（例えば、米国公開公報第20060275271号参照）。
【００５３】
本明細書で用いる場合、単離細胞集団とは、自然に発生または存在する環境および／または状況から物理的に分離された細胞集団のことである。したがって、一旦臍帯から臍帯血細胞を取り出せば、それは単離されたと考えられる。
【００５４】
本発明の重要な態様において、富化された細胞集団を生成するために、臍帯血細胞を分画する。本明細書で用いる場合、富化された細胞集団とは、操作以前の集団における特定の細胞型の出現頻度に比べて、その細胞型の出現頻度が増大するように操作された細胞集団のことである。富化される細胞型は操作以前の集団中に存在していたものであり、富化は、目的の細胞型の追加よりむしろ、集団からの他の細胞型の除去に起因すると理解されるべきである。本発明による特別な関心は、ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、またはＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞を富化した細胞集団にある。ＣＤ３４およびＣＤ１３３は、造血前駆細胞上（造血幹細胞上を含む）に存在することがすでに同定されている細胞表面タンパク質（またはマーカー）である。本明細書で用いる場合、ＣＤ３４＋細胞とは、その細胞表面上にＣＤ３４を発現する細胞のことである。同様に、ＣＤ１３３＋細胞とは、その細胞表面上にＣＤ１３３を発現する細胞である。ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞とは、その細胞表面上にＣＤ３４およびＣＤ１３３の両方を発現する細胞である。ＣＤ３４＋およびＣＤ１３３＋細胞はそれぞれ、全単核臍帯血細胞の約０．１％を代表する。さらに、多くのＣＤ３４＋細胞はＣＤ１３３をも発現し、その逆もまた然りというように、ＣＤ３４＋とＣＤ１３３＋細胞集団との間にはかなりの重複がある。本明細書で用いられる場合、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ１３３＋細胞、またはＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞を富化した集団とは、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ１３３＋細胞、またはＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞のそれぞれが、集団における単核臍帯血細胞の少なくとも６０％を代表する集団のことである。これらの集団は、特定の細胞型のより高い出現頻度を有してよい。例えば、これらの細胞の単核細胞分画は、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％がＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋またはＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋であり得る。例として、少なくとも７５％がＣＤ３４＋である細胞集団とは、その単核細胞の少なくとも７５％がＣＤ３４を発現する集団のことである。好適な態様において、投与される集団は、少なくとも９０％がＣＤ３４＋、少なくとも９０％がＣＤ１３３＋、または少なくとも９０％がＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋である。
【００５５】
特定の細胞型を富化した細胞集団の製造方法は、当該技術分野において知られている。細胞表面マーカーによって定義づけられる細胞集団（ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、およびＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞など）の場合、これらの方法は大抵、発現マーカーに特異的な抗体を用いる。これらの抗体は、（例として、パニング法における）プレート、（例として、カラム富化法における）カラムマトリックス、（例として、磁気分離法における）磁気ビーズなどを含む数々の固体支持体に取り付けることが可能である。次に、これらの支持体と目的の細胞集団とを接触させ、目的のマーカーを発現している細胞を抗体へ結合させ、一方で残りの未結合細胞を除去する。結合した細胞を次に、いくつもの技術（例として、酵素的、機械的、競合的結合、温度等）によって除去する。濃縮した集団は、目的の抗体と細胞とを接触させた後、抗体の存在または不在に基づいて、蛍光活性化セルソーティングを用いて細胞をソートすることによってもまた製造可能である。抗体の存在は大抵、蛍光プローブ（例として、ＦＩＴＣ）で抗体を標識化することで、または一次抗体を認識し、それ自体が蛍光プローブで標識化されている二次抗体と細胞とを接触させることで観察される。これらの方法は、他と同様に当該技術分野において知られており、当業者は容易に所望の集団を富化することができるだろう。
【００５６】
抗−ＣＤ３４抗体には、限定するわけではないが、Ｑｂｅｎｄ１０、５６３、ＨＰＣＡ−２、５８１、ＡＣ１３６およびＢｉｒｍａ Ｋ３が含まれる。抗−ＣＤ１３３抗体には、限定するわけではないが、ＡＮＣ９Ｃ５が含まれる。これらの抗体は、R&D Systems, Santa Cruz Biotechnologyなどの製造元から市販されている。
【００５７】
濃縮した単離集団を、本明細書に記載するように患者を処置するための有効量（または数）で、患者に投与する。処置に必要な細胞数は、対象が経験する症状の重篤度（例えばＮＩＨＳＳスコアから推定され得るように）、ＭＲＩなどの医用画像技術を用いて決定する梗塞サイズ（または領域）、投与集団における所望の細胞型の富化の程度、患者の年齢および／または体重などを含む因子の数に依存する。通常、１〜１０×１０６個の範囲、より好ましくは２〜８×１０６個の範囲の細胞数が患者へ投与可能だと予想される。したがって、特定の患者および投与する集団によっては、投与細胞数が約２×１０６、約３×１０６、約４×１０６、約５×１０６、約６×１０６、約７×１０６、または約８×１０６個になることが可能である。これらの量は、態様および細胞中の富化の程度によって、ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋もしくはＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞の総数、または患者への総投与単核細胞のことをいってよい。
【００５８】
投与される細胞は、単一の臍帯血ユニットにて供給され得るが、いくつかの例においては、投与する細胞数を達成するために複数の臍帯血ユニットを組み合わせなければならない。本明細書で用いる場合、臍帯血ユニットとは、単一の臍帯から採取される臍帯血の量である。典型的には、各臍帯血ユニットは、約１２０〜１５０×１０７個の単核細胞を含み、その中ではおよそ０．１％のみがＣＤ３４＋および／またはＣＤ１３３＋である。
【００５９】
単一または複数のユニットを対象に投与するかに関係なく、いくつかの例においては、処置される対象と組織適合性のある細胞を投与することが望ましいだろう。本明細書で用いる場合、組織適合性とは、６つの主要な組織適合性マーカーのうち少なくとも４つが、移植される細胞と処置される対象とで共有されていることを意味する。本発明はもちろん、細胞および対象が同じ組織適合性マーカーのうち５つまたは６つまでもを共有する状況をもまた意図する。本発明によると、いくつかの例において、対象と４つ未満の、３つ未満の、２つ未満の組織適合性マーカーを共有する、または組織適合性マーカーを共有しない細胞もなお、その対象にとって治療上有益であり得ることが見出される。組織適合性マーカーには、クラスＩマーカーのＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃ、クラスＩＩマーカーのＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＲ、ならびに非古典的クラスＩマーカーのＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＬＡ−Ｈ、ＨＬＡ−ＪおよびＨＬＡ−Ｘ、ＭＩＣが含まれる。いくつかの態様において、６つの組織適合性マーカーは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、およびＨＬＡ−ＤＰであり得る。他の組合せもまた意図される。
【００６０】
集団を脳実質へ投与するため、合理的に可能な限り小容量の集団を投与することもまた重要である。投与容量は、数ある因子の中でもとりわけ、患者の年齢および／または体重、ならびに投与される細胞数によって変動し得る。通常、投与量は１ｍＬ未満、好ましくは０．７５ｍＬ未満、より好ましくは約０．５ｍＬまたはそれ未満である。いくつかの例においては、０．４、０．３、または０．２ｍＬを投与する。
【００６１】
細胞集団を脳実質（すなわち、脳の組織）へ投与する。これに関し、かかる投与は実質内投与といわれる。好ましくは、細胞が脳実質、好ましくは損傷領域の中および／または付近であり、損傷領域周辺部および損傷領域の境界部を含み得る、へと沈着する。
【００６２】
さらにより好ましくは、総投与集団のアリコートが、脳実質中の２つ、３つ、またはそれ以上の場所に沈着する。例として細胞は、関与したまたは影響を受けた皮質脊髄路に沿って沈着し得、それは損傷領域の向こう側に形成される１つの沈着、損傷領域の中心で形成される１つの沈着、および損傷領域と頭蓋骨との間で形成される１つの沈着を伴う。沈着領域は、定位装置を用いて決定することが可能である。注射および細胞蓄積の座標は患者間で変動するであろうが、当業者によって容易に決定可能なものだろう。
【００６３】
細胞を、例えば２６ゲージのハミルトンシリンジあるいは同等のシリンジまたはデバイスを用いて、脳実質へと投与し得る。描写目的のために、１つの態様においては、シリンジに細胞を装填し、針を、損傷がある皮質脊髄路に沿って脳実質へ、針先が損傷領域の向こう側（またはその境界）に到達するまで挿入する。細胞の約３分の１（またはシリンジバレル中の容量の同等量）を、この場所に沈着させる。針を次に、針先が損傷領域中（損傷の中心またはその付近であることが好ましいが、必ずしもそうである必要はない）の場所に到達するまで引っ込め、ここでは細胞（またはシリンジバレル中の容量）の別の３分の１を沈着させる。針を次に、針先が損傷領域の後ろ側（または境界）の場所に到達するまで再度引っ込ませる。細胞（またはシリンジバレル中の容量）の残り３分の１をこの場所に沈着させる。針を次に、各蓄積後およそ５分間所定位置で保持する。注射した容量の漏洩（および損失）を防止するために、一旦針を完全に引っ込めると入口部位を塞ぐ。これは、例としてボーンワックスを用いることで達成可能である。しかしながら本発明は、複数日間投与レジメンよりむしろ、損傷がある脳への単一の細胞移植を意図すると理解されるべきである。
【００６４】
細胞を薬学的に許容し得る担体に懸濁し、投与し、この形態は医薬組成物または製剤であると考えられる。本明細書で用いる場合、薬学的に許容し得る担体とは、ヒトへの投与に好適な１つ以上の適合性液体充填剤、希釈剤などを意味する。本明細書で用いる場合、担体とは、効能および／または投与を促進するために活性成分と組み合わされる、天然のまたは合成の有機または無機成分を意味する。医薬製剤は、これに限定するものではないが、塩状態の酢酸；塩状態のクエン酸；塩状態のホウ酸；および塩状態のリン酸を含む、好適な緩衝剤を含み得る。医薬組成物は、任意に、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールなどの好適な保存料もまた含み得る。医薬組成物の成分は、所望の薬学的効能を実質的に損なうであろう相互作用を生じないようなやり方で、細胞集団とおよび互いに混合される。医薬組成物または製剤は、それら自体が治療上有効であるかまたは投与細胞の治療効能を促進させる非細胞性剤を含む他の物質をもまた含み得る。これらの成分は、１つのバイアル中で一緒に、１キット中の別々のバイアルで、または別々のキットで提供され得る。
【００６５】
投与に好適な組成物は、細胞の無菌水性懸濁液を含み得、それは好ましくは移植患者の血液と等圧である。この水性製剤は、好適な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いる公知の方法によって処方し得る。無菌注射用製剤は、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液などの、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の無菌注射用溶液または懸濁液でもあり得る。許容可能なビヒクルおよび溶媒の中でも採用され得るものは、水、リンゲル液、および等張食塩水である。加えて、無菌の不揮発性油は、溶媒または懸濁媒体として慣習的に使用されている。この目的のために、合成モノ−またはジ−グリセリドを含む任意の無刺激性の不揮発性油を採用し得る。加えて、オレイン酸などの脂肪酸を、注射用物の調製において用い得る。経口、皮下、静脈内、筋肉内等の投与に好適な担体の処方は、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PAの中に見出すことが出来る。
【００６６】
[実施例]
材料および方法
ＣＤ３４＋／１３３＋ｈＵＣＢ（ｈＵＣＢ３４／１３３）の精製および選択
単核細胞（ＭＮＣｓ）を、ヒト全臍帯血（ｈＵＣＢＷ）（Stemcyte, USA）から調製した。ＭＮＣ層を採取して、１ｍＭ ＥＤＴＡのＰＢＳ溶液で２度洗浄した。ＣＤ３４＋およびＣＤ１３３＋ＭＮＣｓの両方を、製造者の指示書に従い、磁気ビーズ分離法（MACS; Miltenyi Biotec, Gladbach, Germany）によって、２×１０８個のＭＮＣｓから分離した。簡潔には、ＭＮＣｓを３００μＬのＰＢＳおよび５ｍＭのＥＤＴＡ中で懸濁した。これらの細胞を、ＣＤ３４およびＣＤ１３３に対する、ハプテン抱合モノクローナル抗体（Miltenyi Biotec, Gladbach, Germany）、続けてマイクロビーズに結合した抗−ハプテン抗体で、１０８個の細胞毎に１００μＬのビーズの割合で、４℃で１５分間標識した。ビーズ陽性細胞（すなわち、ＣＤ３４＋およびＣＤ１３３＋ＭＮＣｓ）を、磁界中にセットした陽性選択カラム上で富化した。ＭＡＣＳでソートした細胞のフィコエリトリン（ＰＥ）（Becton Dickinson, USA）標識化抗−ＣＤ３４および抗−ＣＤ１３３抗体（Miltenyi Biotec, Gladbach, Germany）を用いたＦＡＣＳ分析は、図１Ｂに示すように、選択した細胞の９０％±３％がＣＤ３４およびＣＤ１３３の両方に陽性であったことを示した。そして、１μｇ／ｍＬのビスベンズイミド（Hoechst 33342; Sigma, USA）で標識化し、２％ＦＢＳ（Hyclone, Road Logan, UT）を加えた３００μＬのイスコフ改変ダルベッコ培地（Gibco/Invitrogen, UK）中で再懸濁した細胞を、３７℃で５％ＣＯ２／９５％大気の加湿雰囲気下で組換サイトカインおよびエリスロポエチン（StemCell Technologies, USA）を含む３ｍｌのMethoCult GF H4434および抗生物質と１時間混合し、移植のために調製した。
【００６７】
ラット実験的脳卒中モデル。
体重およそ２５０〜３００ｇの成熟雄Sprague-Dawleyラット３０匹を、３本の血管結紮の対象とした。全ての外科的手技は、University Institutionalガイドラインに沿って、滅菌性／無菌性技術を用いて実施した。ラットを、抱水クロラール（０．４ｇ／ｋｇ）で腹腔内麻酔した。右中大脳動脈（ＭＣＡ）および両側の総頚動脈（ＣＣＡｓ）の結紮を、Chen et al.(Stroke, 1986, 17(4):738-743)に記載されたものを改変した方法によって、０日目に実施した。ＣＣＡｓを非外傷性の動脈クリップでクランプした。手術用顕微鏡の下、頬骨が側頭骨鱗部（squamosal bone）に融合するところに２×２の開頭部を穿孔した。右ＭＣＡを、１０−０ナイロン縫合糸で結紮した。麻酔をかけた動物において、皮質血流をレーザードップラー血流計（PF-5010, system, Perimed system, Perimed AB, Stockholm, Sweden）で連続的に測定した。光検出器を設置させるために、穿頭孔（直径１ｍｍ）を右前頭頭頂領域（frontoparietal region）に作った。プローブ（直径０．４５ｍｍ）を定位的に皮質（ブレグマの１．３ｍｍ後方、２．８ｍｍ側方、および硬膜の１．０ｍｍ下方）に設置した。９０分の結紮後、ＭＣＡ上の縫合糸およびＣＣＡｓ上の動脈クリップを取り外して再灌流させた。中核体温をサーミスタプローブでモニターし、麻酔中は加熱パッドで３７℃に保った。各ラットが回復した後、加熱ランプで体温を３７℃に保った。予測されたように全てのラットは、脳虚血後および如何なる細胞投与前である１日目に、顕著な身体の不均衡を発症し、虚血脳の反対側へ曲がった。
【００６８】
脳内ｈＵＣＢ３４／１３３細胞またはビヒクルで処置した実験動物。
次に、図１Ａに示すように、ラットを３つの群に振り分けた。群１には、ビヒクル単独で実験的脳卒中後１日目に投与した。群２には、ｈＵＣＢ３４／１３３細胞を実験的脳卒中後１日目に投与した。細胞を実験的脳卒中後１日目に投与するので、この群は急性脳卒中の実験モデルを表す。群３には、ｈＵＣＢ３４／１３３細胞を７日目に投与した。この群は慢性脳卒中の実験モデルを表す。細胞またはビヒクル単独は、尾状核被殻の損傷した錐体路へと定位的に注射された。３〜５μＬのＰＢＳ中で懸濁したビスベンズイミド細胞で標識化した約２×１０５個のｈＵＣＢ３４／１３３細胞を、２６ゲージのハミルトンシリンジを用いて、硬膜の３〜５ｍｍ下方にある３つの皮質領域へ注射した。その皮質部のおおよその座標は（１）ブレグマの１．０〜２．０ｍｍ前方および正中線の３．５〜４．０ｍｍ側方、（２）ブレグマの０．５〜１．５ｍｍ後方および正中線の４．０〜４．５ｍｍ側方、ならびに（３）ブレグマの３．０〜４．０ｍｍ後方および正中線の４．５〜５．０ｍｍ側方である。針を、各注射後５分間所定の位置で保持し、注射溶液の漏洩を防ぐためにボーンワックスの一片を頭蓋骨欠陥へと適用した。ビヒクル群の実験ラットは、生理食塩水で定位的に処置した。シクロスポリンＡ（１０ｍｇ／ｋｇ, ip, Novartis）の注射を各実験ラットへ毎日投与した一方で、ビヒクル対照には、同等の容量の生理食塩水を、以前に記載したように（Zhao et al., 2004）与えた。
【００６９】
結果
神経機能および他の行動アセスメント。
３つの実験群において神経機能を評価するために、行動アセスメントを脳虚血の３日前（すなわち、−３日目）、ならびに虚血傷害の１、７、１４、２１、２８および３５日後に実施した。アセスメントでは、（ａ）身体の不均衡性、（ｂ）自発運動活性、および（ｃ）握力を測定した。脳虚血後に得られたものを正規化するために、基準値試験のスコアを記録した。
【００７０】
Borlongan et al.(Neuroreport, 1998, 9(12):2837-2842)に記載されたやり方で、持ち上げボディースウィング試験（elevated body swing test）（ＥＢＳＴ）を用いて、ＭＣＡ結紮後の身体の不均衡性を定量的に評価した。最初に、各ラットを、その身体を尻尾でつるされている間の水平運動について検査した。Chang et al.(Stroke. 2003;34(2):558-564)に記載されたやり方で、虚血側と反対側への初期のヘッドスウィングの頻度を２０回の連続的なテストで計数し、正規化した。
【００７１】
自発運動活性テストにおいて、各ラットに、行動記録のために約２時間Animal Activityモニタリング(Accuscan Instruments, Inc., Columbus, OH)を受けさせた。Animal Activityモニターは、８７ｃｍ間隔を空けて離れた１６個の水平方向および８個の垂直方向の赤外線センサーを含んでいた。垂直方向のセンサーを、チャンバーの床から１０ｃｍのところに配置した。自発運動活性を、チャンバー内のラットの運動によってビームが遮断された回数として計数した。製造元のメニューオプションにおいて定義されている３つの垂直方向のパラメーター：（ｉ）垂直方向の活動性、（ｉｉ）垂直方向の時間、そして（ｉｉｉ）垂直方向の運動の数を、夜間２時間にわたって計算した。
【００７２】
行動測定スコアを、ベースラインスコアに対して全て正規化した。図２に示すように、処置から１４〜２８または３５日後、ｈＵＣＢで処置したラットが、対照ラットと比較して顕著に低減された身体の不均衡性を示すことを見出した。ｈＵＣＢ群中のラットはまた、対照ラットと比較して垂直方向の活動性（図３Ａ）、垂直方向の運動の数（図３Ｂ）、および垂直方向の運動の時間（図３Ｃ）において顕著な増加を示した。
【００７３】
握力を、Stephen(Neurosci. Lett. 1998, 264:1-4)に記載されたものの変法によって、Grip Strength Meter (TSE-Systems, Germany)を用いて分析した。簡潔には、握力比率を各前肢において測定し、虚血と反対側の２０回の引っ張りからの平均握力と同側のそれとの間の比率として計算した。加えて、握力比率で処置前のもの（「ＰｒｅＴｘ」）および処置後のもの（２８日目；「ＰｏｓｔＴｘ」）ならびにベースラインをもまた計算し、変化をベースライン値のパーセンテージとして表示する。図４に示すように、群１（対照）、２（１日目に投与）、および３（７日目に投与）の比率は約０．９５、１．８および１．９５であった。握力の結果は、ｈＵＣＢを投与したラットが未処置の対照ラットより高い握力比率を示したことを明らかにする。
【００７４】
脳代謝および解剖。
図５は、対照および処置を施した動物における、ＦＤＧ ＰＥＴスキャンでモニターした脳代謝を示す。図１２は、対照および処置を施したネズミのＭＲＩ脳スキャンを示す。
【００７５】
免疫組織化学的検査。
免疫蛍光染色を実施し、投与したｈＵＣＢ細胞が虚血脳においてニューロン、グリア細胞、または内皮細胞に分化することが可能であるかを決定した。共焦点顕微鏡観察を行い、細胞型特異的マーカーが外因性移植物（ビスベンズイミド標識化）と共存しているかを同定した。ラットを抱水クロラール（０．４ｇ／ｋｇ、ｉｐ）で麻酔したあと、脳を生理食塩水と共に経心腔的灌流で固定し、続けて４％パラホルムアルデヒドで灌流および浸漬して、３０％スクロース中に包埋した。一連の隣接する厚さ２０ｐｍの切片を、冠状面上の各脳から切り出した。
【００７６】
各冠状切片を、細胞型特異的抗体：グリア線維性酸性タンパク質（「ＧＦＡＰ」、アストロサイト用、１：４００、Sigma）、フォン・ウィルブランド因子（「ｖＷＦ」、内皮細胞用、１：４００、Sigma）、神経細胞核抗原（「Ｎｅｕ−Ｎ」、ニューロンの核用、１：２００、Chemicon）、微小管関連タンパク質２（「ＭＡＰ−２」、ニューロンの樹状突起用、１：２００、BM）、ＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４、１：１００、Toney Pines Biolab）、またはダブルコルチン（Ｄｃｘ、１：１００、Santa Cruz Biotechnology）と共にインキュベートし、Ｃｙ３（Jackson Irnmunoresearch PA USA、１：５００）染色した。
【００７７】
結果は、ｈＵＣＢで処置した虚血ラット脳のペナンブラにおいて、いくつかのビスベンズイミド標識化細胞（青色、自発的な細胞核の蛍光）が、ＭＡＰ−２、Ｎｅｕ−ＮおよびＧＦＡＰに対する抗体（緑色、神経細胞型特異的マーカー）と共存することを示した（図６〜１１）。
【００７８】
ｈＵＣＢ処置が血管形成をもたらすかを決定するために、ｈＵＣＢで処置したおよび対照のラットから得た脳スライスを、二重免疫蛍光染色法によって分析した。免疫蛍光染色は、上述したやり方で実施した。結果は、いくつかの外因性移植ｈＵＣＢ細胞（ビスベンゾイミド標識化）が、処置を施したラットの虚血半球の血管周囲および内皮領域のまわりで血管の表現型（ｖＷＦ＋）を示したことを示唆する（図７）。
【００７９】
皮質脊髄路に沿った細胞移動。
図１２および１３は、細胞および／または注射した色素の、再生した皮質脊髄路に沿った存在および移動を実証する。
【００８０】
要約すると、結果は、慢性脳虚血後にｈＵＣＢ細胞を脳実質内に受けたラットは、対照ラットと比較すると、大幅に改善された神経機能を示したことを示唆する。ｈＵＣＢで処置した群において、外因性移植幹細胞が、脳梗塞ゾーンへ移動して、グリア細胞（ＧＦＡＰ）、ニューロン（Ｎｅｓｔｉｎ＋、ＭＡＰ−２＋およびＮｅｕ−Ｎ＋）および血管内皮細胞（ｖＷＦ＋）へと分化し、それによって虚血脳における神経可塑性を増強しているように見受けられた。
【００８１】
本発明はその適用を、以上の記載に係るまたは図面に描写された構造の詳細および構成要素のアレンジに限定されない。本発明は、他の態様になることおよび多様な方法で実行または実施されることが可能である。また、本明細書で用いる用語および技術用語は、記載の目的であり、限定とみなされるべきではない。本明細書における、「含む（including）」、「含む（comprising）」または「有する（having）」、「含む（containing）」、「含む（involving）」、およびこれらのバリエーションの使用は、その前に列挙した項目およびこれらの同等物、ならびに追加項目をもまた包含することを意味する。
【００８２】
本発明の少なくとも一態様の諸側面を記載したことにより、当業者は様々な変化、改変、および改善を容易に想定できるだろうと理解すべきである。かかる変化、改変、および改善は、本開示の一部であることを意図し、本発明の精神および範囲の内であることを意図する。したがって、以上の記載および図面は単に例示の目的にすぎない。
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本出願は、TREATMENT OF BRAIN DAMAGE USING UMBILICAL CORD BLOOD CELLSと題された、２００８年３月２８日出願の米国仮出願第61/072,173号の優先権を主張し、その全内容が本明細書に参照として組込まれる。
【０００２】
［発明の分野］
本発明は、脳損傷を処置するための臍帯血細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
脳卒中は一般的に、脳の全てまたは一部への血液供給を遮断または低減する任意の事象をいう。米国においては、死亡の三番目の主要原因であり、成人の身体障害の主要原因である。脳卒中は、毎年およそ７５０，０００人に影響を及ぼす。脳卒中患者の３分の１は、脳卒中の発生から１週間以内に死亡する。生存者の大半には、限定するものではないが、顔面、四肢、または全身麻痺を含む、中度から重度の身体障害が残る。
【０００４】
脳卒中に伴う慢性症状を処置するための様々な試みがなされてきた。最近では、Ｇ−ＣＳＦ動員末梢血細胞が、急性および慢性の脳卒中の症状を処置することが報告されている。しかしながら、自家動員細胞治療が適切ではないであろう対象者を含む大部分の集団に好適な治療法の要望はいまだに存在する。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、その最も広範な意味において、臍帯血細胞を用いて脳損傷を処置するための方法を提供する。特に重要であるのは、臍帯血細胞を用いた慢性脳卒中および神経変性疾患の処置である。驚くべきことに、本発明によれば、臍帯血細胞を慢性脳卒中対象の脳実質内に投与すると、対象が経験した脳卒中関連の身体障害のうち少なくともいくつかが好転することが見出された。
【０００６】
したがって、一側面において、本発明は、ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、またはＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋臍帯血細胞を富化した単離臍帯血細胞集団を、脳組織損傷を処置するための有効量で、それを必要としているヒト対象の脳実質内へ投与することを含む、脳組織損傷を有する対象を処置するための方法を提供する。
【０００７】
別の側面において、本発明は、慢性脳卒中を処置するための方法であって、脳卒中を経験したヒト対象の脳へ、ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、またはＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋臍帯血細胞を富化した単離臍帯血細胞集団を、脳卒中を処置するための有効量で実質内投与することを含み、ここで単離集団を脳卒中から７日を超えて経過した後に投与する、前記方法を提供する。１つの態様において、脳卒中から１ヶ月を超えて経過した後に、集団を投与する。別の態様において、脳卒中から３ヶ月を超えて経過した後に、集団を投与する。別の態様において、脳卒中から６ヶ月を超えて経過した後に、集団を投与する。さらに別の態様では、脳卒中から１年を超えて経過した後に、集団を投与する。
【０００８】
別の側面において、本発明は、外傷性脳傷害に起因する脳組織損傷を処置するための方法を提供する。より具体的には１つの態様において、本発明は、ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、またはＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞を富化した単離臍帯血細胞集団を、外傷性脳傷害に起因する脳組織損傷を有する対象の脳実質内へ投与することによって、脳組織損傷を処置するための方法を提供する。かかる脳損傷は、外傷性脳傷害の発生から何ヶ月か（例として、少なくとも１ヶ月）または何年か経過した後に存在するものを含む。したがって、外傷性脳傷害の発生から１ヶ月を超えて、３ヶ月を超えて、６ヶ月を超えて、１年を超えて、またはそれ以上経過した後でも、対象を処置し得る（すなわち、対象に細胞を投与し得る）。
【０００９】
また別の側面において、本発明は、ＣＤ３４＋またはＣＤ１３３＋臍帯血細胞を富化した単離集団を、神経変性障害を処置するための有効量で、そのような処置を必要としているヒト対象の脳へ実質内投与することを含む、神経変性障害を有する対象を処置するための方法を提供する。神経変性障害は、限定するものではないが、パーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、ハンチントン病、ピック病、小脳変性症、および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）であり得る。
【００１０】
１つの態様において、脳組織損傷の発生またはかかる損傷の最先の観察から１ヶ月を超えて経過した後に単離集団を投与する。別の態様において、脳組織損傷の発生またはかかる損傷の最先の観察から６ヶ月を超えて経過した後に単離集団を投与する。さらに別の態様において、脳組織損傷の発生またはかかる損傷の最先の観察から１年を超えて経過した後に単離集団を投与する。
【００１１】
様々な態様を前記側面へと適用し、それらを以下に記載する。
【００１２】
１つの態様において、集団は、ＣＤ３４＋臍帯血細胞を富化したものである。関連する態様において、集団は、少なくとも７５％がＣＤ３４＋、または少なくとも９０％がＣＤ３４＋である単核細胞を含む。
【００１３】
別の態様において、集団は、ＣＤ１３３＋臍帯血細胞を富化したものである。関連する態様において、集団は、少なくとも７５％がＣＤ１３３＋、または少なくとも９０％がＣＤ１３３＋である単核細胞を含む。
【００１４】
１つの態様において、集団は、ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋臍帯血細胞を富化したものである。関連する態様において、集団は、少なくとも７５％がＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋、または少なくとも９０％がＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋である単核細胞を含む。
【００１５】
１つの態様において、対象は、少なくとも６０歳である。
【００１６】
１つの態様において、少なくとも２×１０６個の細胞を対象に投与する。別の態様において、少なくとも５×１０６個の細胞を対象に投与する。さらに別の態様において、少なくとも８×１０６個の細胞を対象に投与する。
【００１７】
１つの態様において、集団を、損傷がある皮質脊髄路に沿って３つの部位へと投与する。
【００１８】
１つの態様において、集団は、単一の臍帯血ユニット由来である。別の態様において、集団は、複数の臍帯血ユニット由来である。関連する態様において、集団は、６つの組織適合性マーカーのうち４つ未満を対象と共有する。別の態様において、集団は、６つの組織適合性マーカーのうち少なくとも４つを対象と共有する。
【００１９】
これらならびに本発明の他の側面および態様を、より詳細に本明細書に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
添付の図面は、縮尺通りに描かれていない。様々な図面に描写される同一のまたはほぼ同一の構成要素はそれぞれ、類似の番号で表される。明確にするために、全図面における全ての構成要素が標記され得るわけではない。
【００２１】
【図１Ａ】図１Ａは、実施したモデル研究の実験デザインを描いた模式図である。
【００２２】
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＣＤ３４およびＣＤ１３３を富化した細胞集団の表現型を示す一連のグラフである。
【００２３】
【図２】図２は、２つの実験群および１つの対照群におけるボディースウィングの回復を、時間の関数として示すグラフである。
【００２４】
【図３Ａ】図３Ａは、２つの実験群および１つの対照群における垂直方向の活動性（vertical activity）を、時間の関数として示すグラフである。
【００２５】
【図３Ｂ】図３Ｂは、２つの実験群および１つの対照群における垂直方向の運動の数（number of vertical movements）を、時間の関数として示すグラフである。
【００２６】
【図３Ｃ】図３Ｃは、２つの実験群および１つの対照群における垂直方向の運動の時間（vertical movement time）を、時間の関数として示すグラフである。
【００２７】
【図４】図４は、２つの実験群および１つの対照群における握力の割合を示すグラフである。
【００２８】
【図５】図５は、対照および実験動物におけるラットの脳のＰＥＴ画像である。
【００２９】
【図６】図６は、ＧＦＡＰまたはＮｅｕ−Ｎ（緑色）およびビスベンズイミド（青色）で染色した脳組織切片を示す写真である。
【００３０】
【図７】図７は、ＭＡＰ−２またはｖＷＦ（緑色）およびビスベンズイミド（青色）で染色した脳組織切片を示す画像である。
【００３１】
【図８Ａ−８Ｂ】図８Ａおよび８Ｂは、ＮＧ２（緑色）およびビスベンズイミド（青色）で染色した脳組織切片を示す画像である。
【００３２】
【図９】図９は、Ａ２Ｂ５（緑色）およびビスベンズイミド（青色）で染色した脳組織切片を示す画像である。
【００３３】
【図１０】図１０は、ＣＮＰａｓｅ（緑色）およびビスベンズイミド（青色）で染色した脳組織切片を示す画像である。
【００３４】
【図１１】図１１は、ラミニン（緑色）およびビスベンズイミド（青色）で染色した脳組織切片を示す画像である。
【００３５】
【図１２】図１２は、慢性脳卒中動物からの脳組織切片のＭＲＩ−Ｔ２スキャンおよびプルシアンブルー染色を示す。慢性脳卒中動物では皮質梗塞が認められる。注射した幹細胞は、注射の７日後に右基底核領域で認められた。これらの細胞は神経線維に沿って梗塞領域へと移動し、梗塞領域のサイズは移植の１４日後において縮小していた。
【００３６】
【図１３Ａ−１３Ｂ】図１３ＡおよびＢは、注入した色素の、再生した皮質脊髄路に沿った運搬の模式図および実際の顕微鏡写真を示す。
【００３７】
[発明の詳細な説明]
本発明は一部、臍帯血細胞が慢性脳卒中に伴う症状を好転させることが可能であるという、注目すべきおよび驚くべき知見を基礎とする。従来、脳卒中の影響の多くが、好転不能であるとみなされてきたか、または他の処置を用いても改善されてこなかったことから、これは驚くべきことである。本発明は、臍帯血細胞を用いた慢性脳卒中対象、脳卒中の発生から何年も経過後であっても、の処置を意図する。
【００３８】
本発明は一部、臍帯血細胞を脳の実質へ投与しなければならないという知見をもまた基礎とする。本発明の様々な側面および態様は、脳卒中に起因する損傷がある脳の領域への、より特定的な細胞の配置を提供する。臍帯血細胞のこれらの対象への全身投与では、どんな治療的有益性も得られなかった。
【００３９】
本発明は一部、ＣＤ３４およびＣＤ１３３などの初期造血マーカーを１種または２種以上発現する臍帯血細胞が、慢性脳卒中を処置するうえで特に有用であるという知見をもまた基礎とする。したがって本発明は、造血前駆体の表現型を有する臍帯血細胞の、慢性脳卒中対象の脳実質への投与を含む方法を提供する。造血前駆体の表現型を有する細胞とは、ＣＤ３４およびＣＤ１３３のどちらか一方もしくは両方を発現するものである。
【００４０】
本明細書で用いる場合、脳卒中とは、２４時間を超えて持続する影響を伴う、血液供給の妨害およびそれ故の対象の脳の一部または全てへの酸素量の低減をいう。脳卒中は、血栓症、塞栓症または出血によって引き起こされ得、そして虚血性脳卒中（血栓性脳卒中および塞栓性脳卒中を含み、血栓症、塞栓症、全身の低灌流などに起因する）または出血性脳卒中（脳内出血、くも膜下出血、硬膜下出血、硬膜外出血などに起因する）といわれ得る。本明細書で用いる場合、脳卒中は、熱中症（heat stroke）および一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）を除外する。熱中症は上昇した体温から生じ、その脳内臨床所見は本明細書で定義される脳卒中（すなわち、脳内酸素量の低減を伴う血液供給の妨害）のそれとは異なる。ＴＩＡはしばしば、「ミニ脳卒中」と呼ばれるが、発生から２４時間以内に完全に回復する能力のため、本明細書で定義される脳卒中と区別することができる。
【００４１】
脳卒中は、影響を受けた対象における１または２以上の症状により明らかにされる。これらの症状およびその重篤度は患者ごとに変動し得る一方で、これらは一般的に筋力低下（半身麻痺）、しびれ、知覚および／または振動覚の低減を含む。多くの例において、これらの症状は身体の片側のみに影響を及ぼす（そして通常は、脳のもう片方の側に損傷が存在する）。他の症状には、意識消失、頭痛、嘔吐、嗅覚の、味覚の、聴覚のおよび視覚の（全体的または部分的な）変化、眼瞼下垂（下垂症）、眼筋力低下、反射減退（咽頭反射、嚥下反射および光への瞳孔反応反射を含む）、顔の感覚減退および筋力低下、平衡感覚の問題、不均衡、眩暈、眼振、呼吸および／または心拍数の変化、頭を片側へ回転できなくなる胸鎖乳突筋（ＳＣＭ）の筋力低下、（突出不能および／または左右への移動不能を伴う）舌の力の低下、失語症（すなわち、言語の発話または理解の不能）、失行症（すなわち、随意運動の変化）、運動協調の変化、視野欠損、記憶障害、半側無視、性欲過剰行動（hypersexual gestrues）、膀胱および腸の制御欠如および認知機能低下（例として、認知症、支離滅裂な思考、錯乱、限られた注意持続時間、集中不能）、および歩行パターンの変化が含まれる。脳卒中特有の症状のいくつかとして、急性の顔面麻痺、腕のふらつき（arm drift）および異常発語が含まれる。患者の症状は通常、これに限定するものではないが、National Institutes of Health Stroke Scale(NIHSS)などの、予め確立されたスコアリングシステムを用いて等級付けされる。
【００４２】
脳卒中は、神経学的検査、血液試験、ならびに／またはＣＴスキャン（例として、造影剤なしのもの）、ＭＲＩスキャン、ドップラー超音波法、および動脈造影法などの医用画像技術を通じて診断される。
【００４３】
本明細書で用いる場合、急性脳卒中とは、影響を受けた対象が、脳卒中発生後直ちに（すなわち、最初の７日間以内）経験する１つまたは２つ以上の症状および／または１つまたは２つ以上のリスクをいう。対象の約３分の１がこの７日枠以内に死亡することから、死亡が主なリスクである。この期間中に経験する症状として、限定するものではないが、異常発語、腕のふらつき、意識消失、頭痛、嘔吐、眼瞼下垂（下垂症）、平衡感覚の問題および不均衡、急性の顔面麻痺などを含む、上に列挙するものの多くが含まれる。何人かの患者にとって、時宜にかなった治療介入は症状の重篤度および数を低減することを可能とする。
【００４４】
しかしながら患者の大半は、１つまたは２つ以上のこれらの症状を長期にわたって経験し続けており、本発明が意図されるのはそれらの患者についてである。彼らの脳卒中症状は急性期を超えても存在すること（すなわち、これらが７日を超えて続くことおよび／またはこれらが脳卒中の発生後７日を超えても顕在化していること）から、これらの患者は慢性脳卒中を罹患していると考えられる（または、慢性脳卒中患者といわれる）。したがって、本明細書中に用いられる場合、慢性脳卒中とは、初期の脳卒中イベントに伴い、なおかつ７日を超えて以前に脳卒中を起こした患者において存在する、１つまたは２つ以上の症状および／あるいは１つまたは２つ以上のリスクをいう。一般的に、これらの症状の重篤度および集積は患者の能力障害をもたらす。例えば、慢性脳卒中患者は、言語を話すことまたは理解することができ得ず、（足取りの追跡から証拠付けられるように）歩くことができないかまたは歩くのが困難であり得、変化したまたは損なわれた顔面筋の制御を有し得、協調性運動または四肢の制御の欠損の結果となる、変化したまたは損なわれた総合的な筋肉制御を有し得、損なわれた視野を有し得、部分的にまたは完全に麻痺状態であり得、昏睡状態であり得る、などである。
【００４５】
本発明によると、かかる対象らは、脳実質への臍帯血細胞投与から多大な恩恵を受けることが示されている。発明者らは、このようなやり方で処置された慢性脳卒中患者が、より普通の（または正常の）足取りまたは歩行パターンから証拠付けされるように筋力機能の制御、および／またはより大きな四肢制御を取り戻すことを実証している。
【００４６】
本発明の方法は、処置の７日を超えて以前に脳卒中を起こした、および脳卒中に伴う１つまたは２つ以上の症状を経験し続ける如何なる患者にも用いることが可能である。本発明は、かかる患者を、急性期を過ぎたどの時期においてでも処置することを意図している。したがって、脳卒中発生から２週間目以内（すなわち、脳卒中の発生から８、９、１０、１１、１２、１３または１４日経過後）に患者を処置し得る。いくつかの重要な態様において、脳卒中の発生から２週間を超えて（つまり、脳卒中の発生から１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１日経過後）、３週間を超えて、または４週間を超えて経過後に患者を処置し得る。さらに、他の患者は脳卒中の発生から１、２、３、４、５または６ヶ月経過後に処置され得、他の患者は、脳卒中の発生から７、８、９、１０、１１、または１２ヶ月あるいは脳卒中の発生から１、２、３、４、５年またはそれ以上の年数を含む、６ヶ月を超える時点で処置され得る。本明細書で用いる場合、脳卒中の発生から、例えば、１年での処置は、患者が脳卒中を起こしてから最低でも１年が経過していることを意味する。これは、処置が脳卒中の１周年の日に行われるという意味ではない。本発明以前には、これらの患者の多くにおける傷害は好転不能または治療不能であるとみなされてきた。
【００４７】
本発明によって処置する患者を、その脳卒中歴（すなわち、脳卒中発生時と処置時との間の時間）および任意にその脳卒中スコアに基づいて同定可能である。脳卒中スコアとは、患者が経験する症状の重篤度の数値的表現である。ＮＩＨＳＳ，ＥＳＳ，ＥＭＳおよびバーセルインデックスはすべて、患者における脳卒中症状の重篤度を定めるスコアシステムである。ＮＩＨＳＳの場合、より低いスコアは、より少ない症状およびより軽度の障害を示す。本明細書に記載の方法は如何なる脳卒中患者を処置するのにも使用可能である一方、好ましくは、より重篤な症状を有する患者を処置するのに用いる。したがって、１つの態様において、９,１０,１１,１２,１３,１４,１５,１６，１７，１８，１９，および２０のＮＩＨＳＳスコアを有する患者を含む、９〜２０のＮＩＨＳＳスコアを有する患者を本発明によって処置する。９のＮＩＨＳＳスコアを有する患者の例としては、反射運動または自律神経性効果にのみ反応する者であり、言語不自由者（すなわち、使用可能な発話または聴解力を有しない）であり、および顔の片側または両側において完全麻痺（すなわち、顔の上側および下側における顔面運動の欠如）を有する者である。医師はおそらくこのようなスコアについて熟知しており、本明細書で提供される時期的なおよび脳卒中スコアのガイダンスを用いて、本発明による処置が可能である対象を容易に同定可能である。
【００４８】
本発明は、神経変性障害を有する対象の処置をもまた意図する。神経変性障害とは、ニューロンの進行性劣化および／または死を特徴とする障害である。例は、これに限定するものではないが、パーキンソニズム、アルツハイマー病、多発性硬化症、ハンチントン病、ピック病、クロイツフェルト・ヤコブ病、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、パーキンソン症、シャイ・ドレーガー症候群、小脳皮質萎縮症、フリードライヒ失調症、歯状核赤核の変性、マシャド・ジョセフ病、脊髄性筋萎縮、淡蒼球・橋・黒質の変性（pallidopontonigral degeneration）（ＰＰＮＤ）、淡蒼球・黒質・ルイ体の変性（pallido-nigro-luysian degeneration）（ＰＮＬＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、グアムＡＬＳ症候群（Guam-ALS syndrome）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、てんかん、虚血性脳傷害、老人性認知症、コルサコフ症候群、橋小脳の萎縮（pontocerebellar atrophy）、オリーブ橋小脳萎縮症または変性症、グルタル酸血症、びまん性レビー小体型認知症、１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）、多発脳梗塞性認知症、脳炎症、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、および淡蒼球の変性を含む。
【００４９】
本発明は、外傷性脳傷害（ＴＢＩ）に起因する慢性脳損傷を有する対象の処置をもまた意図する。
【００５０】
本発明の方法は、年齢または性別に関係なく如何なる患者においてでも実施することが可能であるが、高齢の対象が特に恩恵を受けるだろうと期待されている。本明細書で用いる場合、高齢の患者とは、６０歳以上の者を指す。好適な対象はヒト対象であることが、本明細書の内容から理解されるだろう。
【００５１】
本明細書で用いる場合、慢性脳卒中を有する対象を処置することは、１つまたは２つ以上の慢性脳卒中症状を改善、低減または完全に除去することを意味する。例として、脳卒中に起因する脳傷害の範囲を低減するために、脳卒中を有する対象を本発明によって処置する。脳傷害は、標準の医用画像技術を用いて梗塞サイズを決定することによって測定可能である。したがって、脳傷害の範囲の低減は、これらの画像技術を用いて視認される梗塞サイズの減少として測定可能である。いくつかの例において、梗塞巣（または容量）は少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％減少し得るか、または完全に消滅し得る。好ましい態様において、処置は梗塞巣を少なくとも１０％低減させる。同様に、脳傷害の範囲を決定するのに神経機能を測定する実験を用いることが可能である。ＮＩＨＳＳなどのスコアシステムをもまた、対象における処置を評価するために用いることが可能である。例として、ＮＩＨＳＳスコアにおける１、２、３、４、５、１０、１５、または２０ポイントの低減はすべて、処置の示唆となるであろう。好ましい態様において、処置は少なくとも４ポイント低減という結果となる。他の態様において、処置は０〜８のＮＩＨＳＳスコアという結果となる。
【００５２】
本発明の方法は、対象への臍帯血細胞の投与を含む。臍帯血細胞とは、臍帯の静脈および動脈から採取した細胞のことである。かかる細胞を臍帯から抽出する方法は従来技術により公知であり、公表されている（例えば、米国公開公報第20060275271号参照）。これらの細胞は、使用前に採取し凍結してもよく、または凍結せずに使用してもよい。かかる細胞の凍結方法は、従来技術により公知であり、公表されている（例えば、米国公開公報第20060275271号参照）。
【００５３】
本明細書で用いる場合、単離細胞集団とは、自然に発生または存在する環境および／または状況から物理的に分離された細胞集団のことである。したがって、一旦臍帯から臍帯血細胞を取り出せば、それは単離されたと考えられる。
【００５４】
本発明の重要な態様において、富化された細胞集団を生成するために、臍帯血細胞を分画する。本明細書で用いる場合、富化された細胞集団とは、操作以前の集団における特定の細胞型の出現頻度に比べて、その細胞型の出現頻度が増大するように操作された細胞集団のことである。富化される細胞型は操作以前の集団中に存在していたものであり、富化は、目的の細胞型の追加よりむしろ、集団からの他の細胞型の除去に起因すると理解されるべきである。本発明による特別な関心は、ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、またはＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞を富化した細胞集団にある。ＣＤ３４およびＣＤ１３３は、造血前駆細胞上（造血幹細胞上を含む）に存在することがすでに同定されている細胞表面タンパク質（またはマーカー）である。本明細書で用いる場合、ＣＤ３４＋細胞とは、その細胞表面上にＣＤ３４を発現する細胞のことである。同様に、ＣＤ１３３＋細胞とは、その細胞表面上にＣＤ１３３を発現する細胞である。ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞とは、その細胞表面上にＣＤ３４およびＣＤ１３３の両方を発現する細胞である。ＣＤ３４＋およびＣＤ１３３＋細胞はそれぞれ、全単核臍帯血細胞の約０．１％を代表する。さらに、多くのＣＤ３４＋細胞はＣＤ１３３をも発現し、その逆もまた然りというように、ＣＤ３４＋とＣＤ１３３＋細胞集団との間にはかなりの重複がある。本明細書で用いられる場合、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ１３３＋細胞、またはＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞を富化した集団とは、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ１３３＋細胞、またはＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞のそれぞれが、集団における単核臍帯血細胞の少なくとも６０％を代表する集団のことである。これらの集団は、特定の細胞型のより高い出現頻度を有してよい。例えば、これらの細胞の単核細胞分画は、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％がＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋またはＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋であり得る。例として、少なくとも７５％がＣＤ３４＋である細胞集団とは、その単核細胞の少なくとも７５％がＣＤ３４を発現する集団のことである。好適な態様において、投与される集団は、少なくとも９０％がＣＤ３４＋、少なくとも９０％がＣＤ１３３＋、または少なくとも９０％がＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋である。
【００５５】
特定の細胞型を富化した細胞集団の製造方法は、当該技術分野において知られている。細胞表面マーカーによって定義づけられる細胞集団（ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、およびＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞など）の場合、これらの方法は大抵、発現マーカーに特異的な抗体を用いる。これらの抗体は、（例として、パニング法における）プレート、（例として、カラム富化法における）カラムマトリックス、（例として、磁気分離法における）磁気ビーズなどを含む数々の固体支持体に取り付けることが可能である。次に、これらの支持体と目的の細胞集団とを接触させ、目的のマーカーを発現している細胞を抗体へ結合させ、一方で残りの未結合細胞を除去する。結合した細胞を次に、いくつもの技術（例として、酵素的、機械的、競合的結合、温度等）によって除去する。濃縮した集団は、目的の抗体と細胞とを接触させた後、抗体の存在または不在に基づいて、蛍光活性化セルソーティングを用いて細胞をソートすることによってもまた製造可能である。抗体の存在は大抵、蛍光プローブ（例として、ＦＩＴＣ）で抗体を標識化することで、または一次抗体を認識し、それ自体が蛍光プローブで標識化されている二次抗体と細胞とを接触させることで観察される。これらの方法は、他と同様に当該技術分野において知られており、当業者は容易に所望の集団を富化することができるだろう。
【００５６】
抗−ＣＤ３４抗体には、限定するわけではないが、Ｑｂｅｎｄ１０、５６３、ＨＰＣＡ−２、５８１、ＡＣ１３６およびＢｉｒｍａ Ｋ３が含まれる。抗−ＣＤ１３３抗体には、限定するわけではないが、ＡＮＣ９Ｃ５が含まれる。これらの抗体は、R&D Systems, Santa Cruz Biotechnologyなどの製造元から市販されている。
【００５７】
濃縮した単離集団を、本明細書に記載するように患者を処置するための有効量（または数）で、患者に投与する。処置に必要な細胞数は、対象が経験する症状の重篤度（例えばＮＩＨＳＳスコアから推定され得るように）、ＭＲＩなどの医用画像技術を用いて決定する梗塞サイズ（または領域）、投与集団における所望の細胞型の富化の程度、患者の年齢および／または体重などを含む因子の数に依存する。通常、１〜１０×１０６個の範囲、より好ましくは２〜８×１０６個の範囲の細胞数が患者へ投与可能だと予想される。したがって、特定の患者および投与する集団によっては、投与細胞数が約２×１０６、約３×１０６、約４×１０６、約５×１０６、約６×１０６、約７×１０６、または約８×１０６個になることが可能である。これらの量は、態様および細胞中の富化の程度によって、ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋もしくはＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞の総数、または患者への総投与単核細胞のことをいってよい。
【００５８】
投与される細胞は、単一の臍帯血ユニットにて供給され得るが、いくつかの例においては、投与する細胞数を達成するために複数の臍帯血ユニットを組み合わせなければならない。本明細書で用いる場合、臍帯血ユニットとは、単一の臍帯から採取される臍帯血の量である。典型的には、各臍帯血ユニットは、約１２０〜１５０×１０７個の単核細胞を含み、その中ではおよそ０．１％のみがＣＤ３４＋および／またはＣＤ１３３＋である。
【００５９】
単一または複数のユニットを対象に投与するかに関係なく、いくつかの例においては、処置される対象と組織適合性のある細胞を投与することが望ましいだろう。本明細書で用いる場合、組織適合性とは、６つの主要な組織適合性マーカーのうち少なくとも４つが、移植される細胞と処置される対象とで共有されていることを意味する。本発明はもちろん、細胞および対象が同じ組織適合性マーカーのうち５つまたは６つまでもを共有する状況をもまた意図する。本発明によると、いくつかの例において、対象と４つ未満の、３つ未満の、２つ未満の組織適合性マーカーを共有する、または組織適合性マーカーを共有しない細胞もなお、その対象にとって治療上有益であり得ることが見出される。組織適合性マーカーには、クラスＩマーカーのＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃ、クラスＩＩマーカーのＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＲ、ならびに非古典的クラスＩマーカーのＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＬＡ−Ｈ、ＨＬＡ−ＪおよびＨＬＡ−Ｘ、ＭＩＣが含まれる。いくつかの態様において、６つの組織適合性マーカーは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、およびＨＬＡ−ＤＰであり得る。他の組合せもまた意図される。
【００６０】
集団を脳実質へ投与するため、合理的に可能な限り小容量の集団を投与することもまた重要である。投与容量は、数ある因子の中でもとりわけ、患者の年齢および／または体重、ならびに投与される細胞数によって変動し得る。通常、投与量は１ｍＬ未満、好ましくは０．７５ｍＬ未満、より好ましくは約０．５ｍＬまたはそれ未満である。いくつかの例においては、０．４、０．３、または０．２ｍＬを投与する。
【００６１】
細胞集団を脳実質（すなわち、脳の組織）へ投与する。これに関し、かかる投与は実質内投与といわれる。好ましくは、細胞が脳実質、好ましくは損傷領域の中および／または付近であり、損傷領域周辺部および損傷領域の境界部を含み得る、へと沈着する。
【００６２】
さらにより好ましくは、総投与集団のアリコートが、脳実質中の２つ、３つ、またはそれ以上の場所に沈着する。例として細胞は、関与したまたは影響を受けた皮質脊髄路に沿って沈着し得、それは損傷領域の向こう側に形成される１つの沈着、損傷領域の中心で形成される１つの沈着、および損傷領域と頭蓋骨との間で形成される１つの沈着を伴う。沈着領域は、定位装置を用いて決定することが可能である。注射および細胞蓄積の座標は患者間で変動するであろうが、当業者によって容易に決定可能なものだろう。
【００６３】
細胞を、例えば２６ゲージのハミルトンシリンジあるいは同等のシリンジまたはデバイスを用いて、脳実質へと投与し得る。描写目的のために、１つの態様においては、シリンジに細胞を装填し、針を、損傷がある皮質脊髄路に沿って脳実質へ、針先が損傷領域の向こう側（またはその境界）に到達するまで挿入する。細胞の約３分の１（またはシリンジバレル中の容量の同等量）を、この場所に沈着させる。針を次に、針先が損傷領域中（損傷の中心またはその付近であることが好ましいが、必ずしもそうである必要はない）の場所に到達するまで引っ込め、ここでは細胞（またはシリンジバレル中の容量）の別の３分の１を沈着させる。針を次に、針先が損傷領域の後ろ側（または境界）の場所に到達するまで再度引っ込ませる。細胞（またはシリンジバレル中の容量）の残り３分の１をこの場所に沈着させる。針を次に、各蓄積後およそ５分間所定位置で保持する。注射した容量の漏洩（および損失）を防止するために、一旦針を完全に引っ込めると入口部位を塞ぐ。これは、例としてボーンワックスを用いることで達成可能である。しかしながら本発明は、複数日間投与レジメンよりむしろ、損傷がある脳への単一の細胞移植を意図すると理解されるべきである。
【００６４】
細胞を薬学的に許容し得る担体に懸濁し、投与し、この形態は医薬組成物または製剤であると考えられる。本明細書で用いる場合、薬学的に許容し得る担体とは、ヒトへの投与に好適な１つ以上の適合性液体充填剤、希釈剤などを意味する。本明細書で用いる場合、担体とは、効能および／または投与を促進するために活性成分と組み合わされる、天然のまたは合成の有機または無機成分を意味する。医薬製剤は、これに限定するものではないが、塩状態の酢酸；塩状態のクエン酸；塩状態のホウ酸；および塩状態のリン酸を含む、好適な緩衝剤を含み得る。医薬組成物は、任意に、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールなどの好適な保存料もまた含み得る。医薬組成物の成分は、所望の薬学的効能を実質的に損なうであろう相互作用を生じないようなやり方で、細胞集団とおよび互いに混合される。医薬組成物または製剤は、それら自体が治療上有効であるかまたは投与細胞の治療効能を促進させる非細胞性剤を含む他の物質をもまた含み得る。これらの成分は、１つのバイアル中で一緒に、１キット中の別々のバイアルで、または別々のキットで提供され得る。
【００６５】
投与に好適な組成物は、細胞の無菌水性懸濁液を含み得、それは好ましくは移植患者の血液と等圧である。この水性製剤は、好適な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いる公知の方法によって処方し得る。無菌注射用製剤は、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液などの、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の無菌注射用溶液または懸濁液でもあり得る。許容可能なビヒクルおよび溶媒の中でも採用され得るものは、水、リンゲル液、および等張食塩水である。加えて、無菌の不揮発性油は、溶媒または懸濁媒体として慣習的に使用されている。この目的のために、合成モノ−またはジ−グリセリドを含む任意の無刺激性の不揮発性油を採用し得る。加えて、オレイン酸などの脂肪酸を、注射用物の調製において用い得る。経口、皮下、静脈内、筋肉内等の投与に好適な担体の処方は、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PAの中に見出すことが出来る。
【００６６】
[実施例]
材料および方法
ＣＤ３４＋／１３３＋ｈＵＣＢ（ｈＵＣＢ３４／１３３）の精製および選択
単核細胞（ＭＮＣｓ）を、ヒト全臍帯血（ｈＵＣＢＷ）（Stemcyte, USA）から調製した。ＭＮＣ層を採取して、１ｍＭ ＥＤＴＡのＰＢＳ溶液で２度洗浄した。ＣＤ３４＋およびＣＤ１３３＋ＭＮＣｓの両方を、製造者の指示書に従い、磁気ビーズ分離法（MACS; Miltenyi Biotec, Gladbach, Germany）によって、２×１０８個のＭＮＣｓから分離した。簡潔には、ＭＮＣｓを３００μＬのＰＢＳおよび５ｍＭのＥＤＴＡ中で懸濁した。これらの細胞を、ＣＤ３４およびＣＤ１３３に対する、ハプテン抱合モノクローナル抗体（Miltenyi Biotec, Gladbach, Germany）、続けてマイクロビーズに結合した抗−ハプテン抗体で、１０８個の細胞毎に１００μＬのビーズの割合で、４℃で１５分間標識した。ビーズ陽性細胞（すなわち、ＣＤ３４＋およびＣＤ１３３＋ＭＮＣｓ）を、磁界中にセットした陽性選択カラム上で富化した。ＭＡＣＳでソートした細胞のフィコエリトリン（ＰＥ）（Becton Dickinson, USA）標識化抗−ＣＤ３４および抗−ＣＤ１３３抗体（Miltenyi Biotec, Gladbach, Germany）を用いたＦＡＣＳ分析は、図１Ｂに示すように、選択した細胞の９０％±３％がＣＤ３４およびＣＤ１３３の両方に陽性であったことを示した。そして、１μｇ／ｍＬのビスベンズイミド（Hoechst 33342; Sigma, USA）で標識化し、２％ＦＢＳ（Hyclone, Road Logan, UT）を加えた３００μＬのイスコフ改変ダルベッコ培地（Gibco/Invitrogen, UK）中で再懸濁した細胞を、３７℃で５％ＣＯ２／９５％大気の加湿雰囲気下で組換サイトカインおよびエリスロポエチン（StemCell Technologies, USA）を含む３ｍｌのMethoCult GF H4434および抗生物質と１時間混合し、移植のために調製した。
【００６７】
ラット実験的脳卒中モデル。
体重およそ２５０〜３００ｇの成熟雄Sprague-Dawleyラット３０匹を、３本の血管結紮の対象とした。全ての外科的手技は、University Institutionalガイドラインに沿って、滅菌性／無菌性技術を用いて実施した。ラットを、抱水クロラール（０．４ｇ／ｋｇ）で腹腔内麻酔した。右中大脳動脈（ＭＣＡ）および両側の総頚動脈（ＣＣＡｓ）の結紮を、Chen et al.(Stroke, 1986, 17(4):738-743)に記載されたものを改変した方法によって、０日目に実施した。ＣＣＡｓを非外傷性の動脈クリップでクランプした。手術用顕微鏡の下、頬骨が側頭骨鱗部（squamosal bone）に融合するところに２×２の開頭部を穿孔した。右ＭＣＡを、１０−０ナイロン縫合糸で結紮した。麻酔をかけた動物において、皮質血流をレーザードップラー血流計（PF-5010, system, Perimed system, Perimed AB, Stockholm, Sweden）で連続的に測定した。光検出器を設置させるために、穿頭孔（直径１ｍｍ）を右前頭頭頂領域（frontoparietal region）に作った。プローブ（直径０．４５ｍｍ）を定位的に皮質（ブレグマの１．３ｍｍ後方、２．８ｍｍ側方、および硬膜の１．０ｍｍ下方）に設置した。９０分の結紮後、ＭＣＡ上の縫合糸およびＣＣＡｓ上の動脈クリップを取り外して再灌流させた。中核体温をサーミスタプローブでモニターし、麻酔中は加熱パッドで３７℃に保った。各ラットが回復した後、加熱ランプで体温を３７℃に保った。予測されたように全てのラットは、脳虚血後および如何なる細胞投与前である１日目に、顕著な身体の不均衡を発症し、虚血脳の反対側へ曲がった。
【００６８】
脳内ｈＵＣＢ３４／１３３細胞またはビヒクルで処置した実験動物。
次に、図１Ａに示すように、ラットを３つの群に振り分けた。群１には、ビヒクル単独で実験的脳卒中後１日目に投与した。群２には、ｈＵＣＢ３４／１３３細胞を実験的脳卒中後１日目に投与した。細胞を実験的脳卒中後１日目に投与するので、この群は急性脳卒中の実験モデルを表す。群３には、ｈＵＣＢ３４／１３３細胞を７日目に投与した。この群は慢性脳卒中の実験モデルを表す。細胞またはビヒクル単独は、尾状核被殻の損傷した錐体路へと定位的に注射された。３〜５μＬのＰＢＳ中で懸濁したビスベンズイミド細胞で標識化した約２×１０５個のｈＵＣＢ３４／１３３細胞を、２６ゲージのハミルトンシリンジを用いて、硬膜の３〜５ｍｍ下方にある３つの皮質領域へ注射した。その皮質部のおおよその座標は（１）ブレグマの１．０〜２．０ｍｍ前方および正中線の３．５〜４．０ｍｍ側方、（２）ブレグマの０．５〜１．５ｍｍ後方および正中線の４．０〜４．５ｍｍ側方、ならびに（３）ブレグマの３．０〜４．０ｍｍ後方および正中線の４．５〜５．０ｍｍ側方である。針を、各注射後５分間所定の位置で保持し、注射溶液の漏洩を防ぐためにボーンワックスの一片を頭蓋骨欠陥へと適用した。ビヒクル群の実験ラットは、生理食塩水で定位的に処置した。シクロスポリンＡ（１０ｍｇ／ｋｇ, ip, Novartis）の注射を各実験ラットへ毎日投与した一方で、ビヒクル対照には、同等の容量の生理食塩水を、以前に記載したように（Zhao et al., 2004）与えた。
【００６９】
結果
神経機能および他の行動アセスメント。
３つの実験群において神経機能を評価するために、行動アセスメントを脳虚血の３日前（すなわち、−３日目）、ならびに虚血傷害の１、７、１４、２１、２８および３５日後に実施した。アセスメントでは、（ａ）身体の不均衡性、（ｂ）自発運動活性、および（ｃ）握力を測定した。脳虚血後に得られたものを正規化するために、基準値試験のスコアを記録した。
【００７０】
Borlongan et al.(Neuroreport, 1998, 9(12):2837-2842)に記載されたやり方で、持ち上げボディースウィング試験（elevated body swing test）（ＥＢＳＴ）を用いて、ＭＣＡ結紮後の身体の不均衡性を定量的に評価した。最初に、各ラットを、その身体を尻尾でつるされている間の水平運動について検査した。Chang et al.(Stroke. 2003;34(2):558-564)に記載されたやり方で、虚血側と反対側への初期のヘッドスウィングの頻度を２０回の連続的なテストで計数し、正規化した。
【００７１】
自発運動活性テストにおいて、各ラットに、行動記録のために約２時間Animal Activityモニタリング(Accuscan Instruments, Inc., Columbus, OH)を受けさせた。Animal Activityモニターは、８７ｃｍ間隔を空けて離れた１６個の水平方向および８個の垂直方向の赤外線センサーを含んでいた。垂直方向のセンサーを、チャンバーの床から１０ｃｍのところに配置した。自発運動活性を、チャンバー内のラットの運動によってビームが遮断された回数として計数した。製造元のメニューオプションにおいて定義されている３つの垂直方向のパラメーター：（ｉ）垂直方向の活動性、（ｉｉ）垂直方向の時間、そして（ｉｉｉ）垂直方向の運動の数を、夜間２時間にわたって計算した。
【００７２】
行動測定スコアを、ベースラインスコアに対して全て正規化した。図２に示すように、処置から１４〜２８または３５日後、ｈＵＣＢで処置したラットが、対照ラットと比較して顕著に低減された身体の不均衡性を示すことを見出した。ｈＵＣＢ群中のラットはまた、対照ラットと比較して垂直方向の活動性（図３Ａ）、垂直方向の運動の数（図３Ｂ）、および垂直方向の運動の時間（図３Ｃ）において顕著な増加を示した。
【００７３】
握力を、Stephen(Neurosci. Lett. 1998, 264:1-4)に記載されたものの変法によって、Grip Strength Meter (TSE-Systems, Germany)を用いて分析した。簡潔には、握力比率を各前肢において測定し、虚血と反対側の２０回の引っ張りからの平均握力と同側のそれとの間の比率として計算した。加えて、握力比率で処置前のもの（「ＰｒｅＴｘ」）および処置後のもの（２８日目；「ＰｏｓｔＴｘ」）ならびにベースラインをもまた計算し、変化をベースライン値のパーセンテージとして表示する。図４に示すように、群１（対照）、２（１日目に投与）、および３（７日目に投与）の比率は約０．９５、１．８および１．９５であった。握力の結果は、ｈＵＣＢを投与したラットが未処置の対照ラットより高い握力比率を示したことを明らかにする。
【００７４】
脳代謝および解剖。
図５は、対照および処置を施した動物における、ＦＤＧ ＰＥＴスキャンでモニターした脳代謝を示す。図１２は、対照および処置を施したネズミのＭＲＩ脳スキャンを示す。
【００７５】
免疫組織化学的検査。
免疫蛍光染色を実施し、投与したｈＵＣＢ細胞が虚血脳においてニューロン、グリア細胞、または内皮細胞に分化することが可能であるかを決定した。共焦点顕微鏡観察を行い、細胞型特異的マーカーが外因性移植物（ビスベンズイミド標識化）と共存しているかを同定した。ラットを抱水クロラール（０．４ｇ／ｋｇ、ｉｐ）で麻酔したあと、脳を生理食塩水と共に経心腔的灌流で固定し、続けて４％パラホルムアルデヒドで灌流および浸漬して、３０％スクロース中に包埋した。一連の隣接する厚さ２０ｐｍの切片を、冠状面上の各脳から切り出した。
【００７６】
各冠状切片を、細胞型特異的抗体：グリア線維性酸性タンパク質（「ＧＦＡＰ」、アストロサイト用、１：４００、Sigma）、フォン・ウィルブランド因子（「ｖＷＦ」、内皮細胞用、１：４００、Sigma）、神経細胞核抗原（「Ｎｅｕ−Ｎ」、ニューロンの核用、１：２００、Chemicon）、微小管関連タンパク質２（「ＭＡＰ−２」、ニューロンの樹状突起用、１：２００、BM）、ＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４、１：１００、Toney Pines Biolab）、またはダブルコルチン（Ｄｃｘ、１：１００、Santa Cruz Biotechnology）と共にインキュベートし、Ｃｙ３（Jackson Irnmunoresearch PA USA、１：５００）染色した。
【００７７】
結果は、ｈＵＣＢで処置した虚血ラット脳のペナンブラにおいて、いくつかのビスベンズイミド標識化細胞（青色、自発的な細胞核の蛍光）が、ＭＡＰ−２、Ｎｅｕ−ＮおよびＧＦＡＰに対する抗体（緑色、神経細胞型特異的マーカー）と共存することを示した（図６〜１１）。
【００７８】
ｈＵＣＢ処置が血管形成をもたらすかを決定するために、ｈＵＣＢで処置したおよび対照のラットから得た脳スライスを、二重免疫蛍光染色法によって分析した。免疫蛍光染色は、上述したやり方で実施した。結果は、いくつかの外因性移植ｈＵＣＢ細胞（ビスベンゾイミド標識化）が、処置を施したラットの虚血半球の血管周囲および内皮領域のまわりで血管の表現型（ｖＷＦ＋）を示したことを示唆する（図７）。
【００７９】
皮質脊髄路に沿った細胞移動。
図１２および１３は、細胞および／または注射した色素の、再生した皮質脊髄路に沿った存在および移動を実証する。
【００８０】
要約すると、結果は、慢性脳虚血後にｈＵＣＢ細胞を脳実質内に受けたラットは、対照ラットと比較すると、大幅に改善された神経機能を示したことを示唆する。ｈＵＣＢで処置した群において、外因性移植幹細胞が、脳梗塞ゾーンへ移動して、グリア細胞（ＧＦＡＰ）、ニューロン（Ｎｅｓｔｉｎ＋、ＭＡＰ−２＋およびＮｅｕ−Ｎ＋）および血管内皮細胞（ｖＷＦ＋）へと分化し、それによって虚血脳における神経可塑性を増強しているように見受けられた。
【００８１】
本発明はその適用を、以上の記載に係るまたは図面に描写された構造の詳細および構成要素のアレンジに限定されない。本発明は、他の態様になることおよび多様な方法で実行または実施されることが可能である。また、本明細書で用いる用語および技術用語は、記載の目的であり、限定とみなされるべきではない。本明細書における、「含む（including）」、「含む（comprising）」または「有する（having）」、「含む（containing）」、「含む（involving）」、およびこれらのバリエーションの使用は、その前に列挙した項目およびこれらの同等物、ならびに追加項目をもまた包含することを意味する。
【００８２】
本発明の少なくとも一態様の諸側面を記載したことにより、当業者は様々な変化、改変、および改善を容易に想定できるだろうと理解すべきである。かかる変化、改変、および改善は、本開示の一部であることを意図し、本発明の精神および範囲の内であることを意図する。したがって、以上の記載および図面は単に例示の目的にすぎない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
慢性脳卒中を処置するための方法であって、脳卒中を経験したヒト対象の脳へ、ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、またはＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞を富化した単離臍帯血細胞集団を実質内投与することを含み、ここで前記単離臍帯血細胞集団を脳卒中から７日を超えて経過した後に投与する、前記方法。
【請求項２】
単離臍帯血細胞集団が、ＣＤ３４＋臍帯血細胞を富化したものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
単離臍帯血細胞集団が、ＣＤ１３３＋臍帯血細胞を富化したものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
単離臍帯血細胞集団が、ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋両方の臍帯血細胞を富化したものである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
単離臍帯血細胞集団が、少なくとも７５％がＣＤ３４＋である単核細胞を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
単離臍帯血細胞集団が、少なくとも９０％がＣＤ３４＋である単核細胞を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
単離臍帯血細胞集団が、少なくとも７５％がＣＤ１３３＋である単核細胞を含む、請求項１または３に記載の方法。
【請求項８】
単離臍帯血細胞集団が、少なくとも９０％がＣＤ１３３＋である単核細胞を含む、請求項１または３に記載の方法。
【請求項９】
単離臍帯血細胞集団が、少なくとも７５％がＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋である単核細胞を含む、請求項１または４に記載の方法。
【請求項１０】
単離臍帯血細胞集団が、少なくとも９０％がＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋である単核細胞を含む、請求項１または４に記載の方法。
【請求項１１】
対象が、少なくとも６０歳である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも２×１０６個の細胞を対象へ投与する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも５×１０６個の細胞を対象へ投与する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも８×１０６個の細胞を対象へ投与する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
単離臍帯血細胞集団を、脳卒中から１ヶ月を超えて経過した後に投与する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
単離臍帯血細胞集団を、脳卒中から６ヶ月を超えて経過した後に投与する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
単離臍帯血細胞集団を、脳卒中から１年を超えて経過した後に投与する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
単離臍帯血細胞集団を、損傷がある皮質脊髄路に沿って３つの部位へと投与する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
単離臍帯血細胞集団が、単一の臍帯血ユニット由来である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
単離臍帯血細胞集団が、複数の臍帯血ユニット由来である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
単離臍帯血細胞集団が、６つの組織適合性マーカーのうち４つ未満を対象と共有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
単離臍帯血細胞集団が、６つの組織適合性マーカーのうち少なくとも４つを対象と共有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
脳組織損傷を経験したヒト対象の脳へ、ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、またはＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋臍帯血細胞を富化した単離臍帯血細胞集団を実質内投与することを含む、脳組織損傷を処置するための方法。
【請求項２４】
単離臍帯血細胞集団が、ＣＤ３４＋臍帯血細胞を富化したものである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
単離臍帯血細胞集団が、ＣＤ１３３＋臍帯血細胞を富化したものである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
単離臍帯血細胞集団が、ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋臍帯血細胞を富化したものである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
単離臍帯血細胞集団が、少なくとも７５％がＣＤ３４＋である単核細胞を含む、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２８】
単離臍帯血細胞集団が、少なくとも９０％がＣＤ３４＋である単核細胞を含む、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２９】
単離臍帯血細胞集団が、少なくとも７５％がＣＤ１３３＋である単核細胞を含む、請求項２３または２５に記載の方法。
【請求項３０】
単離臍帯血細胞集団が、少なくとも９０％がＣＤ１３３＋である単核細胞を含む、請求項２３または２５に記載の方法。
【請求項３１】
単離臍帯血細胞集団が、少なくとも７５％がＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋である単核細胞を含む、請求項２３または２６に記載の方法。
【請求項３２】
単離臍帯血細胞集団が、少なくとも９０％がＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋である単核細胞を含む、請求項２３または２６に記載の方法。
【請求項３３】
対象が少なくとも６０歳である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３４】
少なくとも２×１０６個の細胞を対象へ投与する、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも５×１０６個の細胞を対象へ投与する、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
少なくとも８×１０６個の細胞を対象へ投与する、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
単離臍帯血細胞集団を、脳組織損傷から１ヶ月を超えて経過した後に投与する、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
単離臍帯血細胞集団を、脳組織損傷から６ヶ月を超えて経過した後に投与する、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
単離臍帯血細胞集団を、脳組織損傷から１年を超えて経過した後に投与する、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
単離臍帯血細胞集団を、損傷がある皮質脊髄路に沿って３つの部位へと投与する、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
単離臍帯血細胞集団が、単一の臍帯血ユニット由来である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
単離臍帯血細胞集団が、複数の臍帯血ユニット由来である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
単離臍帯血細胞集団が、６つの組織適合性マーカーのうち４つ未満を対象と共有する、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
単離臍帯血細胞集団が、６つの組織適合性マーカーのうち少なくとも４つを対象と共有する、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
脳組織損傷が、パーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、またはハンチントン病に起因するものである、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
脳組織損傷を処置するための方法であって、外傷性脳傷害に起因する脳組織損傷を有するヒト対象の脳へ、ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、またはＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋臍帯血細胞を富化した単離臍帯血細胞集団を実質内投与することを含み、ここで前記細胞を外傷性脳傷害の発生から１ヶ月を超えて経過した後に投与する、前記方法。
【請求項１】
慢性脳卒中を処置するための方法であって、脳卒中を経験したヒト対象の脳へ、ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、またはＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞を富化した単離臍帯血細胞集団を実質内投与することを含み、ここで前記単離臍帯血細胞集団を脳卒中から７日を超えて経過した後に投与する、前記方法。
【請求項２】
単離臍帯血細胞集団が、ＣＤ３４＋臍帯血細胞を富化したものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
単離臍帯血細胞集団が、ＣＤ１３３＋臍帯血細胞を富化したものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
単離臍帯血細胞集団が、ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋両方の臍帯血細胞を富化したものである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
単離臍帯血細胞集団が、少なくとも７５％がＣＤ３４＋である単核細胞を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
単離臍帯血細胞集団が、少なくとも９０％がＣＤ３４＋である単核細胞を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
単離臍帯血細胞集団が、少なくとも７５％がＣＤ１３３＋である単核細胞を含む、請求項１または３に記載の方法。
【請求項８】
単離臍帯血細胞集団が、少なくとも９０％がＣＤ１３３＋である単核細胞を含む、請求項１または３に記載の方法。
【請求項９】
単離臍帯血細胞集団が、少なくとも７５％がＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋である単核細胞を含む、請求項１または４に記載の方法。
【請求項１０】
単離臍帯血細胞集団が、少なくとも９０％がＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋である単核細胞を含む、請求項１または４に記載の方法。
【請求項１１】
対象が、少なくとも６０歳である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも２×１０６個の細胞を対象へ投与する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも５×１０６個の細胞を対象へ投与する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも８×１０６個の細胞を対象へ投与する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
単離臍帯血細胞集団を、脳卒中から１ヶ月を超えて経過した後に投与する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
単離臍帯血細胞集団を、脳卒中から６ヶ月を超えて経過した後に投与する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
単離臍帯血細胞集団を、脳卒中から１年を超えて経過した後に投与する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
単離臍帯血細胞集団を、損傷がある皮質脊髄路に沿って３つの部位へと投与する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
単離臍帯血細胞集団が、単一の臍帯血ユニット由来である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
単離臍帯血細胞集団が、複数の臍帯血ユニット由来である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
単離臍帯血細胞集団が、６つの組織適合性マーカーのうち４つ未満を対象と共有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
単離臍帯血細胞集団が、６つの組織適合性マーカーのうち少なくとも４つを対象と共有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
脳組織損傷を経験したヒト対象の脳へ、ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、またはＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋臍帯血細胞を富化した単離臍帯血細胞集団を実質内投与することを含む、脳組織損傷を処置するための方法。
【請求項２４】
単離臍帯血細胞集団が、ＣＤ３４＋臍帯血細胞を富化したものである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
単離臍帯血細胞集団が、ＣＤ１３３＋臍帯血細胞を富化したものである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
単離臍帯血細胞集団が、ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋臍帯血細胞を富化したものである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
単離臍帯血細胞集団が、少なくとも７５％がＣＤ３４＋である単核細胞を含む、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２８】
単離臍帯血細胞集団が、少なくとも９０％がＣＤ３４＋である単核細胞を含む、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２９】
単離臍帯血細胞集団が、少なくとも７５％がＣＤ１３３＋である単核細胞を含む、請求項２３または２５に記載の方法。
【請求項３０】
単離臍帯血細胞集団が、少なくとも９０％がＣＤ１３３＋である単核細胞を含む、請求項２３または２５に記載の方法。
【請求項３１】
単離臍帯血細胞集団が、少なくとも７５％がＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋である単核細胞を含む、請求項２３または２６に記載の方法。
【請求項３２】
単離臍帯血細胞集団が、少なくとも９０％がＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋である単核細胞を含む、請求項２３または２６に記載の方法。
【請求項３３】
対象が少なくとも６０歳である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３４】
少なくとも２×１０６個の細胞を対象へ投与する、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも５×１０６個の細胞を対象へ投与する、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
少なくとも８×１０６個の細胞を対象へ投与する、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
単離臍帯血細胞集団を、脳組織損傷から１ヶ月を超えて経過した後に投与する、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
単離臍帯血細胞集団を、脳組織損傷から６ヶ月を超えて経過した後に投与する、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
単離臍帯血細胞集団を、脳組織損傷から１年を超えて経過した後に投与する、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
単離臍帯血細胞集団を、損傷がある皮質脊髄路に沿って３つの部位へと投与する、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
単離臍帯血細胞集団が、単一の臍帯血ユニット由来である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
単離臍帯血細胞集団が、複数の臍帯血ユニット由来である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
単離臍帯血細胞集団が、６つの組織適合性マーカーのうち４つ未満を対象と共有する、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
単離臍帯血細胞集団が、６つの組織適合性マーカーのうち少なくとも４つを対象と共有する、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
脳組織損傷が、パーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、またはハンチントン病に起因するものである、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
脳組織損傷を処置するための方法であって、外傷性脳傷害に起因する脳組織損傷を有するヒト対象の脳へ、ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、またはＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋臍帯血細胞を富化した単離臍帯血細胞集団を実質内投与することを含み、ここで前記細胞を外傷性脳傷害の発生から１ヶ月を超えて経過した後に投与する、前記方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ−８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ−１３Ｂ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ−８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ−１３Ｂ】
【公表番号】特表２０１１−５１５４７０（Ｐ２０１１−５１５４７０Ａ）
【公表日】平成２３年５月１９日（２０１１．５．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０１８２０（Ｐ２０１１−５０１８２０）
【出願日】平成２１年３月２６日（２００９．３．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００１９１５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１２０３６８
【国際公開日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【出願人】（５１０２５７７２１）ステムサイト インコーポレーテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＳＴＥＭＣＹＴＥ，ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】１５８９ Ｗｅｓｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐａｒｋ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｃｏｖｉｎａ，ＣＡ ９１７２２，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年５月１９日（２０１１．５．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月２６日（２００９．３．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００１９１５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１２０３６８
【国際公開日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【出願人】（５１０２５７７２１）ステムサイト インコーポレーテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＳＴＥＭＣＹＴＥ，ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】１５８９ Ｗｅｓｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐａｒｋ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｃｏｖｉｎａ，ＣＡ ９１７２２，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]