蛍光性ランタニド錯体
光誘起電子移動を蛍光制御原理とする蛍光性ランタニド錯体を提供する。センサー置換基及び錯基を有する２−キノリノール置換体とランタニドイオン（Ｌｎ３＋）とから成る錯体である。液相でこの錯体を被測定物と共存させ、該錯体の蛍光を測定する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
この発明は、２−キノリノール置換体とランタニドイオンとから成る新規な錯体に関し、より詳細には、光誘起電子移動により蛍光強度を制御できる長寿命蛍光性の２−キノリノール置換体とランタニドイオンとから成る新規な錯体に関する。
従来技術
蛍光性ランタニド錯体は長い蛍光寿命、鋭い蛍光スペクトル、大きいストークスシフトなど通常の蛍光性有機化合物とは大きく異なる蛍光特性を持つことが知られている（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｆ．Ｓ．；Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９８２，８２，５４１−５５２．；足立吟也「希土類物語 先端材料の魔術師」産業図書；足立吟也「希土類の化学」化学同人）。この蛍光の特徴を利用し、時間分解測定でその蛍光を測定することで、蛍光寿命の短い他の有機化合物の蛍光や励起散乱光を排除し、ランタニド錯体から発する蛍光のみを特異的に検出することができる。このため測定系のバックグラウンドの蛍光を抑えることが可能となるため、通常の有機化合物の蛍光を用いた蛍光検出系と比較し、Ｓ／Ｎ比の高い高感度な検出が可能となる。これまで、標識化試薬として様々な蛍光性ランタニド錯体が開発され、時間分解イムノアッセイや時間分解ＤＮＡハイブリダイゼーションにおいて用いられ、その検出感度の増大が報告されている（Ｍｏｒｔｏｎ，Ｒ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９０，６２，１８４１；Ｓｅｖｅｕｓ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈ．１９９４，２８，１４９；Ｍａｔｈｉｓ，Ｇ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．１９９３．３９．１９５３−１９５９）。このような特徴を持つ蛍光性ランタニド錯体の蛍光を制御することにより、分析対象物を高感度に感知することのできるプローブの開発が可能となる。
近年、蛍光性ランタニド錯体自身をセンサーとして利用する試みが行われ、分析対象物の有無により蛍光特性の変化するランタニド錯体の開発が行われている（ＤｅＳｉｌｖａ，Ａ．Ｐ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９７，９７，１５１５；Ｂｉｓｓｅｌｌ，Ｒ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｏｒｓ ｆｏｒ Ｉｏｎ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｌｕｌｅ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ；Ｇａｒｎｉｋ，Ａ．Ｗ．，Ｅｄ．；ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５３８；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ．１９９３；Ｃｈａｐｔｅｒ４）。その主な蛍光制御方法はランタニドの水の配位数を変化させるもの、クロモフォア自身を変化させるものに分けられる。
これまで通常の有機化合物においては、光誘起電子移動を蛍光の制御方法とする蛍光プローブが多数開発されている。光誘起電子移動は蛍光の消光機構として広く受け入れられている原理であり、それは電子供与部位から蛍光色素部位への電子移動によるものである。蛍光性ランタニド錯体の蛍光を光誘起電子移動で制御することが可能であれば、さらに光誘起電子移動を蛍光制御原理とする高感度な検出を可能とするプローブを設計し、開発することが可能となる。
光誘起電子移動により下式（化４）のようなランタニド錯体の蛍光を制御する試みはいくつか報告されている（Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．２０００，４７３−４７４；Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．１９９７，１８９１−１８９２）。
【発明が解決しようとする課題】
しかし、現在までに報告された光誘起電子移動により蛍光を制御可能とするランタニド錯体は、消光機構が十分に機能しないためバックグラウンドとなる蛍光が大きく蛍光の変化が十分に得られない、また、錯体のランタニド金属への配位が不十分であるため有機溶媒中でしか蛍光を発しないなどの欠点を持つ。これらの欠点を克服することで、実際に様々な系で実用が可能となる蛍光性ランタニド錯体を基にしたプローブの開発が可能となる。
本発明は、光誘起電子移動を蛍光制御原理とする蛍光性ランタニド錯体を提供することを目的とする。この錯体は、水中で安定にランタニドと錯生成し、水中で機能を発すること、また、蛍光の制御は完全であり消光時に全く蛍光を持たないことが求められる。
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、このような課題が、センサー置換基及び錯基を有する２−キノリノール置換体とランタニドイオンとから成る錯体により解決されることを見出し、本発明を完成させた。
即ち、本発明は、下式（化１）
で表される２−キノリノールの３〜８位のいずれか２つの位置に、下式
−ＣｎＨ２（ｎ−ｍ）−（Ｃ６Ｈ５−ｏ）（−ＮＲ１Ｒ２）ｏ
（式中、ｎは１〜５の整数、ｍは０〜２であってｎ−１以下の整数、ｏは１又は２であり、Ｒ１は、Ｈ、アルキル基、ＣＯＸ（Ｘはアルキル基又はペプチド（このペプチドの末端アミノ基が上記ＣＯと結合している。）を表す。）、又は−ＣＨ２ＣＨ２（ＮＹＣＨ２ＣＨ２）ｐＮＹ２（式中、Ｙは、それぞれ異なっていてもよく、Ｈ、アルキル基、又は下式（化２）
を表し、ｐは０〜３の整数を表す。）を表し、Ｒ２はＨ又はアルキル基を表す。）
で表されるセンサー置換基及び錯基を有する２−キノリノール置換体、並びにランタニドから成り、該ランタニドイオンが該錯基と錯体結合し、該２−キノリノール置換体と該ランタニドとのモル比が１：０．９〜１．１である蛍光性ランタニド錯体である。ここでランタニド（ｌａｎｔｈｎｉｄｅ）は５８Ｃｅ〜７１Ｌｕのいずれかの元素を意味する。
前記錯基は、下記のいずれかのキレーター（化３）
（式中、ＩＤＡはｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、ＭＩＤＡはｍｅｔｈｙｌｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、ＮＴＡはｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、ＥＤＴＡはｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、ＨＥＤＴＡは２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｙｌｅｔｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、ＨＭＤＴＡはｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、ＤＴＰＡはｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉｎｉｔｉｌｏｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、ＴＴＨＡはｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｈｅｘａｎｉｔｉｌｏｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、ＤＯＴＡは１，４，７，１０−ｔｅｔｒａａｚａｃｙｃｌｏｄｏｄｅｃａｎｅ−１，４，７，１０−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、ＤＯ３Ａは１，４，７，１０−ｔｅｔｒａａｚａｃｙｃｌｏｄｏｄｅｃａｎｅ−１，４，７−ｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、ＮＯＴＡは１，４，７−ａｚａｃｙｃｌｏｎｏｎａｎｅ−１，４，７−ｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄを意味する。）に基づくものであって、そのいずれか一つのＮ原子が−ＣＨ２（ＣＯＮＨ）ｑ−（式中、ｑは０又は１、好ましくは１を表す。）を介して前記２−キノリノールと結合することが好ましい。
キレーターとしては、（ｉ）ＤＴＰＡと（ｖｉ）ＤＯＴＡが好ましい。
２−キノリノールの７位，３位または４位にアミノ基を常法により付加し、このアミノ基を介して、カルボン酸を有するキレーターとアミド結合により、これらのキレーターと２−キノリノールを結合させることができる。
前記２−キノリノールにおけるセンサー置換基及び錯基の置換位置はそれぞれ７位、４位又は３位が好ましく、更に、前記２−キノリノールにおける前記錯基の置換位置としては順番に７位、４位、３位が好ましく、前記センサー置換基の置換位置としては順番に４位、３位、７位が好ましい。また、前記錯基は、前記２−キノリノールの７位に結合し、前記センサー置換基が前記２−キノリノールの４位又は３位に結合する、又は前記錯基が前記２−キノリノールの４位に結合し、前記センサー置換基が前記２−キノリノールの３位又は７位に結合する、又は前記錯基が前記２−キノリノールの３位に結合し、前記センサー置換基が前記２−キノリノールの４位又は７位に結合することが好ましい。
更に、前記センサー置換基において、少なくとも一つのアミノ基（−ＮＲ１Ｒ２）が２価炭化水素基（−ＣｎＨ２（ｎ−ｍ）−）に対してベンゼン環（Ｃ６Ｈ５−ｏ）のパラ位に位置し、ｏが１であり、前記アルキル基がメチル基であることが好ましく、ｎが１であり、ｍが０であることがより好ましい。
本発明の錯体は、一般的に２−キノリノール置換体とランタニドをアセトニトリル、メタノール、水など極性溶媒中で約等量混合し、１時間程度攪拌または１〜１２時間程度の加熱還流することによる作ることができる。
更に、本発明は、液相で、上記のいずれかの錯体を被測定物と共存させ、該錯体の蛍光を測定することにより、該被測定物の性質を知る方法である。
この溶媒としては、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、メタノールなど極性溶媒を用いることが好ましく、より好ましくは水を用いる。その溶媒中の、該錯体の濃度は０．１ｎＭ〜０．１ｍＭが好ましく、該被測定物の濃度は０．１ｎＭ〜０．２ｍＭが好ましい。
例えば、加水分解酵素等を測定対象として本発明の錯体を用いると、この測定対象により該錯体のセンサー部分が分解され、その結果錯体の蛍光強度に変化を及ぼしたり、あるいは本発明の錯体のセンサー部がＣａ２＋，Ｚｎ２＋，Ｈ＋と配位結合することにより該錯体の蛍光強度に変化を及ぼしたり、あるいは本発明の錯体のセンサー部がＮＯや一重項酸素などと化学反応することにより該錯体の蛍光強度に変化を及ぼしたりするため、本発明の錯体はこれら測定対象のプローブとして機能する。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明の錯体の構成を示す。
第２図は、本発明の錯体のセンサー機能の原理を示す。ａはセンサー部がが電子供与性の高いもの、ｂはセンサー部が電子供与性の低いものの場合を示す。
第３図は、本発明の錯体の反応機構の例を示す。１）は、カスパーゼ等の加水分解酵素と反応する反応基をＰＥＴセンサー部分に取り込んだ例、２）は、亜鉛イオンと配位結合する反応基をＰＥＴセンサー部分に取り込んだ例、３）は、水素イオンが付加する反応基をＰＥＴセンサー部分に取り込んだ例、４）は、一酸化窒素と反応する反応基をＰＥＴセンサー部分に取り込んだ例を示す。
第４図は、製造例１〜３で製造した化合物８，１１，１５の合成経路を示す。
第５図は、製造例１〜３で製造した化合物８，１１，１５の合成経路を示す。
第６図は、製造例１〜３で製造した化合物８，１１，１５の合成経路を示す。
第７図は、ＤＴＰＡ−ｃｓ１２４のユウロピウム（ＩＩＩ）錯体の吸収スペクトルを示す。
第８図は、化合物８のユウロピウム（ＩＩＩ）錯体の吸収スペクトルを示す。
第９図は、化合物１１のユウロピウム（ＩＩＩ）錯体の吸収スペクトルを示す。
第１０図は、化合物１５のユウロピウム（ＩＩＩ）錯体の吸収スペクトルを示す。
第１１図は、化合物８（上）、１１（中）及び１５（下）のテルビウム（ＩＩＩ）錯体の蛍光スペクトルを示す。
第１２図は、化合物８（上）、１１（中）及び１５（下）のユウロピウム（ＩＩＩ）錯体の蛍光スペクトルを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明の錯体は、第１図に示すように、センサー置換基から成るセンサー部分と、錯基を含む２−キノリノール置換体とランタニドから成る蛍光団から成る。
この錯体を測定対象と液相、特に水中で、共存させ、測定対象がセンサー部のアミノ基と反応すると、この錯体の蛍光に変化が起こるため、これを観察することにより、測定対象の性質を知ることが可能となる。
例えば、アミノ基が電子供与性の高いもの（例えば、センサー部がアニリン）の場合には第２図（ａ）の左に示すように蛍光団から蛍光の発光が無いが、このような反応により、このアミノ基が電子供与性の低いもの（例えば、アセトアニリド）へ変化すると、第２図（ａ）の右に示すように、蛍光団において蛍光が発光するようになる。逆の場合には、第２図（ｂ）に示すように測定対象との反応により蛍光が消える。このような蛍光を調べることにより、本発明の錯体と測定対象との相互作用を知ることが可能になる（このようなＰＥＴセンサーの原理についてはＤｅＳｉｌｖａ，Ａ．Ｐ ｅｔ ａｌ．１９９７，９７，１５１５を参照されたい）。
このような原理に基づいて、本発明の錯体をプローブとして応用する例として以下の例を挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。各例の反応機構を第３図に示す。
１）カスパーゼ等の加水分解酵素と反応する反応基（ペプチド：ＤＥＶＤ）をＰＥＴセンサー部分に取り込んだ例
カスパーゼ等の加水分解酵素の特異的検出が可能となる。カスパーゼ等の加水分解酵素の細胞内生成を可視化することができる。この応用はアポトーシス等の生命現象のメカニズム解析に非常に有効である。カスパーゼ等の加水分解酵素の活性測定に応用でき，カスパーゼ等の加水分解酵素の阻害剤のハイスループットスクリーニングにも応用できる。
従来有機蛍光プローブに応用した例はないが、本発明の錯体は蛍光強度の変化を確実に起こすことができるので応用対象となる。
２）亜鉛イオンと配位結合する反応基をＰＥＴセンサー部分に取り込んだ例
Ｚｎ２＋の特異的検出が可能となる。Ｚｎ２＋の細胞内生成を可視化することができる。
Ｚｎ２＋測定を有機蛍光プローブに応用した例にはＨｉｒａｎｏ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０００，１２２，１２３９９．がある。
３）水素イオンが付加する反応基をＰＥＴセンサー部分に取り込んだ例
ｐＨの変化を長寿命蛍光の強度変化として測定することが可能となる。ｐＨの変化測定を有機蛍光プローブに応用した例にはＳｅｌｉｎｇｅｒ，Ｂ．Ｋ．；Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．１９７７，３０，２０８７がある。
４）一酸化窒素と反応する反応基をＰＥＴセンサー部分に取り込んだ例
ＮＯの特異的検出が可能となる。ＮＯの細胞内生成を可視化することができる。ＮＯ合成酵素の活性測定に応用でき、ＮＯ合成酵素の阻害剤のハイスループットスクリーニングにも応用できる。
ＮＯとの反応を有機蛍光プローブに応用した例には、Ｋｏｊｉｍａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９８，７０，２４４６がある。
【発明の効果】
従来通常の有機化合物に対してＰＥＴ機構を用いた蛍光の制御は行われていたが、本発明の錯体はランタニド錯体へのＰＥＴ制御により従来の有機化合物と比較して約１００万倍程度寿命の長い蛍光を制御できる点が新規である。このため，時間分解蛍光測定が可能となりより精度の高い測定が可能となる。現在までにランタニド錯体を用いて時間分解測定を行った例はあるが，長寿命蛍光の強度を測定対象との反応で制御した例は存在しなかった。本発明は測定対象に応じて長寿命蛍光測定を行うことができる初めての例であり、本発明の錯体はより幅広い応用が期待できる。
以下、実施例にて本発明を例証するが、本発明を限定することを意図するものではない。
本実施例では、ランタニドイオン（Ｌｎ３＋）と１対１の安定な錯体を形成するＤＴＰＡをキレーターとし、２−キノリノール誘導体であるｃｓ１２４を蛍光団とする下式（化５）
で表されるＤＴＰＡ−ｃｓ１２４を基本骨格とした。これにＰＥＴセンサーを組み込んだランタニド錯体のデザイン、合成を行った。ＰＥＴセンサーとしては電子供与性の高いアニリンと電子供与性の低いアセトアニリドを選択した。
電子供与性の高いＰＥＴセンサーからは蛍光団への電子移動が起きるため蛍光を発しない。しかし、電子供与性の低いＰＥＴセンサーからは電子移動が起こらないために蛍光を持つと考えられる。
実施例で用いる各化合物を合成した。その合成経路を第４〜６図に示す。各化合物番号は、第４〜６図中の化合物番号に対応している。
製造例１
この製造例では化合物８を合成した。
４−ニトロフェニル酢酸（４４０２ｍｇ，２４．３ｍｍｏｌ）を塩化チオニル（２０ｍｌ）、ジクロロメタン（２０ｍｌ）に溶解し、２時間加熱還流した。塩化チオニルを減圧下で留去し、固体を得た。この固体をジクロロメタン（３０ｍｌ）に溶解した後、その溶液を、メルドラム酸（３４９９ｍｇ，２４．３ｍｍｏｌ）とＮ．Ｎ−ジエチルイソプロピルアミン（５８４０ｍｇ，４９．８ｍｍｏｌ）を溶解したジクロロメタン（２０ｍｌ）溶液に氷冷下一時間かけて滴下し、この溶液をさらに２時間室温で撹拌した。この反応液に０．１Ｎ塩酸（５０ｍｌ）を加え、ジクロロメタンで抽出した。この反応液を減圧下で留去し得られた固体をエタノール（１００ｍｌ）に溶解し、２時間加熱還流した。この反応液を減圧下で留去し、４℃で一晩放置し固体を得た。これをエタノールで再結晶し化合物２（５２９８ｍｇ，２１．１ｍｍｏｌ）を得た。黄色結晶。収率８７％。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：１．２９（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１），３．５２（ｓ，２Ｈ），４．００（ｓ，２Ｈ），４．２１（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．１），７．４１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８），８．２１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８），１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５ＭＨｚ）：１４．１，４８．９，４９．０，６１．７，１２３．８，１３０．１，１３０．５，１４０．６，１６６．８，１９８．８
ＭＳ（ＥＩ）：２５１
化合物２（５２９７ｍｇ，２１．１ｍｇ）とｍ−フェニレンジアミン（２２９０ｍｇ，２１．２ｍｍｏｌ）を混合し、１４０度で１２時間加熱した。得られた固体にメタノールを加え、析出した黄色固体を桐山ロートで濾取し、化合物３（１８７６ｍｇ，６．３４ｍｍｏｌ）を得た。黄色固体。収率３０％。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００ＭＨｚ）４．１５（ｓ，２Ｈ），５．７５（ｂｒ，２Ｈ），５．９１（ｓ，１Ｈ），６．３５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１），６．３９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４，２．１），７．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４），７．５５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８），８．１５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８），１１．２４（ｓ，１Ｈ）１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，７５ＭＨｚ）３７．０，９６．８，１０９．２，１１０．６，１１５．５，１２３．６，１２５．７，１２９．９，１４１．３，１４６．１，１４７．３，１４９．２，１５１．１，１６２．３
ＭＳ（ＥＩ）：２９５
化合物３（２９５ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）と９−フルオレニルメチルオキシカルボニルクロリド（２９７ｍｇ，１．２３ｍｍｏｌ）をジオキサン（４０ｍｌ）、０．５Ｎ炭酸ナトリウム水溶液（２０ｍｌ）に溶解し室温で１２時間撹拌した。反応液に水を加え、生じた固体を桐山漏斗で濾取し、この固体をメタノール、水で順次洗浄した。この固体をエタノールで再結晶し、化合物４（４１０ｍｇ，０．７９ｍｍｏｌ）を得た。無色結晶。収率７９％。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００ＭＨｚ）
４．２９−４．３３（ｍ，３Ｈ），４．４８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．８），６．２０（ｓ，１Ｈ，ｋ），７．１２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７），７．３１−７．４４（ｍ，４Ｈ），７．５５−７．６２（ｍ，３Ｈ），７．６６（ｓ，１Ｈ），７．７４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５），７．８９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５），８．１７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．７），１０．０２（ｓ，１Ｈ），１１．６５（ｓ，１Ｈ）１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，７５ＭＨｚ）３６．８，４６．５，６５．８，１０３．６，１１３．０，１１３．９，１１９．７，１２０．２，１２３．６，１２５．１，１２５．５，１２７．１，１２７．７，１３０．０，１４０．０，１４０．８，１４１．１，１４３．７，１４６．２，１４６．８，１４８．９，１５３．２，１６１．９
ＭＳ（ＦＡＢ）：５１８
化合物４（３８５ｍｇ，０．７４ｍｍｏｌ）と鉄粉（２７３ｍｇ，４．９６ｍｍｏｌ）をエタノール（４０ｍｌ）、酢酸（２０ｍｌ）に溶解し、２時間加熱還流した。反応液をセライト濾過した後、反応液を減圧下で留去し得られた固体をシリカゲルクロマトグラムで精製し鉄を除き、化合物５（２００ｍｇ）を混合物として得た。この混合物である化合物５（２００ｍｇ）をジオキサン（４０ｍｌ）、０．５Ｎ炭酸ナトリウム水溶液（２０ｍｌ）に溶解し、反応液に炭酸ジブチル（３００μｌ）を加え、室温で１２時間撹拌した。この反応液に水を加え、これを酢酸エチルで抽出し、抽出液を減圧下で留去した。得られた固体をシリカゲルクロマトグラムで精製し、化合物６（１１１ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ）を得た。白色固体。収率３６％（２工程）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００ＭＨｚ）１．５２（ｓ，９Ｈ），４．０９（ｓ，２Ｈ），４．３８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．６），４．５５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．６），６．１５（ｓ，１Ｈ），７．１７−７．２３（ｍ，３Ｈ），７．３９−７．５１（ｍ，６Ｈ），７．６８−７．７１（ｍ，２Ｈ），７．８２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６），７．９７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６），９．３４（ｓ，１Ｈ），１０．０７（ｓ，１Ｈ），１１．６４（ｓ，１Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，７５ＭＨｚ）２８．１，３６．７，４６．６，６５．８，７８．９，１０３．６，１１２．９，１１４．１，１１８．３，１１９．０，１２０．２，１２５．２，１２５．５，１２７．１，１２７．７，１２９．１ １３１．７，１３７．９，１４０．０，１４０．８，１４０．９，１４３．７，１５０．５，１５２．８，１５３．３，１６２．１
ＭＳ（ＦＡＢ）５８８
化合物６（１０４ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）に溶解し、ピペリジン（１ｍｌ）を加え、室温で２時間撹拌する。反応液を減圧下で留去し、得られた固体をシリカゲルクロマトグラムで精製し、化合物７（６３ｍｇ，０．１７ｍｍｏｌ）を得た。淡黄色固体。収率９７％。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００ＭＨｚ）１．３９（ｓ，９Ｈ），３．８７（ｓ，２Ｈ），５．６６（ｓ，２Ｈ），５．７４（ｓ，１Ｈ），６．２８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０），６．３２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．６ ２．０），７．０６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４），７．２８−７．３３（ｍ，３Ｈ），９．２０（ｓ，１Ｈ），１１．１１（ｓ，１Ｈ）１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，７５ＭＨｚ）２８．１，３６．８，７８．９，９６．８，１０９．４，１１０．４，
１１４．９，１１８．２，１２５．７，１２９．０，１３２．２，１３７．８，１４１．１，１５０．７，１５０．９，１５２．８，１６２．４
ＭＳ（ＦＡＢ）３６６
無水ＤＴＰＡ（４４ｍｇ，０．１２ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）に溶解し、トリエチルアミン（４００μｌ）を加える。さらにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）に溶解した化合物７（３７ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）を２０分、反応液に滴下する。室温で２時間撹拌後、水４ｍｌを加え、反応液を減圧下で留去する。得られた固体にトリフルオロ酢酸（５ｍｌ）を加え、室温で１時間撹拌する。反応液を減圧下で留去し得られた固体を高速液体クロマトグラフィーで精製し、化合物８（１９ｍｇ，０．０３ｍｍｏｌ）を得た。無色固体。収率３０％。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，３００ＭＨｚ）３．０５−３．３０（ｍ，４Ｈ），３．３５−３．６０（ｍ，１２Ｈ），４．１９（ｓ，２Ｈ），４．２９（ｓ，２Ｈ），６．１２（ｓ，１Ｈ），７．２２−７．３３（ｍ，５Ｈ，），７．６８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．９），７．９４（ｓ，１Ｈ），
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，７５ＭＨｚ）
ＭＳ（ＦＡＢ）６４１
製造例２
この製造例では化合物１１を合成した。
製造例１に示した化合物６の合成と同様に、化合物４（２０９ｍｇ，０．４１ｍｍｏｌ）から混合物である化合物５（１７２ｍｇ）を得た。これを酢酸（５０ｍｌ）に溶解し、無水酢酸（１０ｍｌ）を加える。３０分間加熱環流し、反応液を減圧下で留去する。得られた固体をシリカゲルクロマトグラムで精製し、化合物９（１６９ｍｇ，０．３２ｍｍｏｌ）を得た。白色固体。収率７９％。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００ＭＨｚ）２．００（ｓ，３Ｈ），３．９５（ｓ，２Ｈ），５．７１（ｓ，２Ｈ），５．８１（ｓ，１Ｈ），６．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１），６．３９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６ ２．１），７．１６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４），７．３７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６），７．４８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４），９．８６（ｓ，１Ｈ），１１．１６（ｓ，１Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，７５ＭＨｚ）１７１．３，１６８．１，１６２．１，１５３．２，１５０．３，１４３．７，１４０．９，１４０．８，１４０．０，１３７．８，１３２．８，１２９．１，１２７．７，１２７．１，１２５．５，１２５．２，１２０．２，１１９．２，１１４．１，１１２．９，１０３．６，６５．８，４６．６，３６．７，２４．０ ＦＡＢＭＳ（Ｍ＋１）
化合物９（１６７ｍｇ，０．３２ｍｍｏｌ）から化合物７の合成法と同様に化合物１０（９４ｍｇ，０．３１ｍｍｏｌ）を得た。淡黄色固体。収率９７％。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００ＭＨｚ），２．００（ｓ，３Ｈ），４．０４（ｓ，２Ｈ），４．３１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．９），４．４７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．９），６．０９（ｓ，１Ｈ），７．１４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４），７．１８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．７），７．３１−７．４４（ｍ，４Ｈ），７．６３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．７），７．６１−７．６５（ｍ，２Ｈ，７．７５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６），７．９０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５），９．８９（ｓ，１Ｈ），１０．００（ｓ，１Ｈ），１１．５７（ｓ，１Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，７５ＭＨｚ）１６８．１，１６２．４，１５０．９，１５０．６，１４１．１，１３７．６，１３３．２，１２９．０，１２５．７，１１９．１，１１４．９，１１０．４，１０９．４，９６．８，３６．８，２３．９ ＦＡＢＭＳ（Ｍ＋１）３０８
無水ＤＴＰＡ（４３ｍｇ，０．１２ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）に溶解し、トリエチルアミン（４００μｌ）を加える。さらにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）に溶解した化合物１０（３１ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）を２０分、反応液に滴下する。室温で２時間撹拌後、水４ｍｌを加え、反応液を減圧下で留去する。得られた固体を高速液体クロマトグラフィーで精製し、化合物１１（３０ｍｇ，０．０４ｍｍｏｌ）を得た。無色固体。収率４０％。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，３００ＭＨｚ）３．０５−３．３０（ｍ，４Ｈ），３．４０−３．６５（ｍ，１２Ｈ），４．０９（ｓ，２Ｈ），４．３６（ｓ，２Ｈ），６．２０（ｓ，１Ｈ），７．１０−７．１８（ｍ，３Ｈ），８．２５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．３），７．６７（ｓ，１Ｈ，Ｊ＝８．０），７．９７（ｓ，１Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，７５ＭＨｚ） ＦＡＢＭＳ（Ｍ＋１）６８３
製造例３
この製造例では化合物１５を合成した。
ジクロロメタン（３０ｍｌ）に溶解したフェニルアセチルクロリド（化合物１２，２３１９ｍｇ，１５．０ｍｍｏｌ）をメルドラム酸（２１６０ｍｇ，１４．９ｍｍｏｌ）とＮ．Ｎ−ジエチルイソプロピルアミン（３８７７ｍｇ，３０．０ｍｍｏｌ）を溶解したジクロロメタン（３０ｍｌ）に氷冷下一時間かけて滴下し、この溶液をさらに２時間室温で撹拌した。この反応液に０．１Ｎ塩酸を５０ｍｌ加え、ジクロロメタンで抽出した。この反応液を減圧下で留去し得られた固体をエタノール（１００ｍｌ）に溶解し、２時間加熱還流した。この反応液を減圧下で留去して、化合物１２（２７３７ｍｇ，１３．３ｍｍｏｌ）を得た。淡黄色液体。収率８８％。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００ＭＨｚ）１．１６（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝６．９），３．６４（ｃ，２Ｈ），３．８５（ｓ，２Ｈ），４．０６（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝６．９），７．００−７．４１（ｍ，５Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５ＭＨｚ）２００．３，１６６．９，１３３．０，１２９．３，１２８．５，１２７．０，６１．１，４９．７，４８．０，１３．８
ＭＳ（ＥＩ）：２５１
化合物１３（１２００ｍｇ，０．１７ｍｍｏｌ）から化合物３の合成法と同様に化合物１４（５５５ｍｇ，２．２２ｍｍｏｌ）を得た。淡黄色固体。収率３８％。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００ＭＨｚ）４．０１（ｓ，２Ｈ），５．７３（ｓ，２Ｈ），５．８３（ｓ，１Ｈ）６．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１），６．３８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７ ２．１），７．１７−７．３２（ｍ，５Ｈ），７．４１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．７），１１．１８（ｓ，１Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，７５ＭＨｚ）１６２．４，１５１．０，１５０．５，１４１．２，１３８．８，１２８．８，１２８．４，１２６．３，１２５．７，１１５．１，１１５．０，１１０．４，１０９．５，９６．９，３７．３，ＦＡＢＭＳ（Ｍ＋１）２５１
化合物１４（３８ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）から化合物１１の合成法と同様に化合物１５（３７ｍｇ，０．０６ｍｍｏｌ）を得た。無色固体。収率４０％。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，３００ＭＨｚ）３．０５−３．３０（ｍ，４Ｈ），３．３５−３．６０（ｍ，１２Ｈ），４．１３（ｓ，２Ｈ），４．３５（ｓ，２Ｈ），６．１８（ｓ，１Ｈ），７．１２−７．２３（ｍ，６Ｈ），７．６８（ｓ，１Ｈ），７．９６（ｓ，１Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，７５ＭＨｚ） ＦＡＢＭＳ（Ｍ＋１）６２６
以下の実施例では、製造例１〜３で得た化合物８、１１及び１５を用いて錯体を作り、その蛍光特性を評価した。
【実施例１〜３】
化合物８、１１及び１５をジメチルスルホキシドに溶解し、１０ｍＭのｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎを作製した。また、塩化テルビウム（ＩＩＩ）６水和物をジメチルスルホキシドに溶解し、１０ｍＭのｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎを作製した。作製した化合物８、１１及び１５の各溶液に、等量の塩化テルビウム（ＩＩＩ）６水和物の溶液を添加し、室温で３０分放置して、化合物８、１１及び１５のテルビウム（ＩＩＩ）錯体作製した。これを１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈し、８μＭとしその蛍光を測定した。
【実施例４〜６】
化合物８、１１及び１５をジメチルスルホキシドに溶解し、１０ｍＭのｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎを作製した。また、塩化ユウロピウム（ＩＩＩ）６水和物をジメチルスルホキシドに溶解し、１０ｍＭのｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎを作製した。作製した化合物８、１１及び１５の各溶液に、等量の塩化ユウロピウム（ＩＩＩ）６水和物の溶液を添加し、室温で３０分放置して、化合物８、１１及び１５のユウロピウム（ＩＩＩ）錯体を作製した。これを１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈し、８μＭとしその蛍光を測定した。
これらユウロピウム（ＩＩＩ）錯体及びＤＴＰＡ−ｃｓ１２４のユウロピウム（ＩＩＩ）錯体の吸収スペクトル（５μＭ ｉｎ １００ｍＭ ＨＥＰＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４））を第７〜１０図に示す。
蛍光は時間分解測定により測定した。いずれの錯体についても励起波長３３０ｎｍ、Ｄｅｌａｙ Ｔｉｍｅ ０．０５ｍｓ、Ｇａｔｅ Ｔｉｍｅ １．００ｍｓとしてその蛍光を測定した。また、蛍光寿命は励起波長３３０ｎｍ、蛍光波長は各テルビウム錯体は５４５ｎｍ、各ユウロピウム錯体は６１５ｎｍとして測定した（各８μＭ ｉｎ １００ｍＭ ＨＥＰＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４））。
化合物８，１１，１５のテルビウム（ＩＩＩ）錯体の蛍光スペクトル第１１図に示し、その蛍光寿命と水配位数を表１に示す。
また、化合物８，１１，１５のユウロピウム（ＩＩＩ）錯体の蛍光スペクトル第１２図に示し、その蛍光寿命と水配位数を表２に示す。
化合物１５のテルビウム（ＩＩＩ）錯体、ユウロピウム（ＩＩＩ）錯体はいずれも強い蛍光を持つ。その蛍光強度はＤＴＰＡ−ｃｓ１２４のテルビウム（ＩＩＩ）錯体、ユウロピウム（ＩＩＩ）錯体とほぼ同等であった。また、蛍光寿命にも変化は見られなかった。カルボスチリルの４位のベンジル基への変化は蛍光特性に変化を与えなかった。
化合物１１のテルビウム（ＩＩＩ）錯体、ユウロピウム（ＩＩＩ）錯体はいずれも強い蛍光を持つ。しかし、化合物８のテルビウム（ＩＩＩ）錯体、ユウロピウム（ＩＩＩ）錯体はいずれも蛍光を全く持たず、蛍光寿命は測定できなかった。カルボスチリルの４位の置換基の電子密度が上昇することで、４位置換基からカルボスチリルへの光誘起電子移動が生じ、化合物８のテルビウム（ＩＩＩ）錯体、ユウロピウム（ＩＩＩ）錯体は蛍光を全く発しなかった。
これによりテルビウム（ＩＩＩ）錯体、ユウロピウム（ＩＩＩ）錯体をはじめとするランタニド錯体の蛍光を制御することが可能となることが示された。この錯体は水中で安定に錯体を生成し、蛍光の制御が完全であり、水中で機能することが明らかとなった。この結果から、光誘起電子移動による電子供与部位を適切な分析対象物のセンサーとし、電子供与能が変化するならば、さまざまな分析対象物に対して高感度に感知できるプローブの開発が可能となることがわかる。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【技術分野】
この発明は、２−キノリノール置換体とランタニドイオンとから成る新規な錯体に関し、より詳細には、光誘起電子移動により蛍光強度を制御できる長寿命蛍光性の２−キノリノール置換体とランタニドイオンとから成る新規な錯体に関する。
従来技術
蛍光性ランタニド錯体は長い蛍光寿命、鋭い蛍光スペクトル、大きいストークスシフトなど通常の蛍光性有機化合物とは大きく異なる蛍光特性を持つことが知られている（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｆ．Ｓ．；Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９８２，８２，５４１−５５２．；足立吟也「希土類物語 先端材料の魔術師」産業図書；足立吟也「希土類の化学」化学同人）。この蛍光の特徴を利用し、時間分解測定でその蛍光を測定することで、蛍光寿命の短い他の有機化合物の蛍光や励起散乱光を排除し、ランタニド錯体から発する蛍光のみを特異的に検出することができる。このため測定系のバックグラウンドの蛍光を抑えることが可能となるため、通常の有機化合物の蛍光を用いた蛍光検出系と比較し、Ｓ／Ｎ比の高い高感度な検出が可能となる。これまで、標識化試薬として様々な蛍光性ランタニド錯体が開発され、時間分解イムノアッセイや時間分解ＤＮＡハイブリダイゼーションにおいて用いられ、その検出感度の増大が報告されている（Ｍｏｒｔｏｎ，Ｒ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９０，６２，１８４１；Ｓｅｖｅｕｓ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈ．１９９４，２８，１４９；Ｍａｔｈｉｓ，Ｇ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．１９９３．３９．１９５３−１９５９）。このような特徴を持つ蛍光性ランタニド錯体の蛍光を制御することにより、分析対象物を高感度に感知することのできるプローブの開発が可能となる。
近年、蛍光性ランタニド錯体自身をセンサーとして利用する試みが行われ、分析対象物の有無により蛍光特性の変化するランタニド錯体の開発が行われている（ＤｅＳｉｌｖａ，Ａ．Ｐ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９７，９７，１５１５；Ｂｉｓｓｅｌｌ，Ｒ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｏｒｓ ｆｏｒ Ｉｏｎ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｌｕｌｅ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ；Ｇａｒｎｉｋ，Ａ．Ｗ．，Ｅｄ．；ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５３８；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ．１９９３；Ｃｈａｐｔｅｒ４）。その主な蛍光制御方法はランタニドの水の配位数を変化させるもの、クロモフォア自身を変化させるものに分けられる。
これまで通常の有機化合物においては、光誘起電子移動を蛍光の制御方法とする蛍光プローブが多数開発されている。光誘起電子移動は蛍光の消光機構として広く受け入れられている原理であり、それは電子供与部位から蛍光色素部位への電子移動によるものである。蛍光性ランタニド錯体の蛍光を光誘起電子移動で制御することが可能であれば、さらに光誘起電子移動を蛍光制御原理とする高感度な検出を可能とするプローブを設計し、開発することが可能となる。
光誘起電子移動により下式（化４）のようなランタニド錯体の蛍光を制御する試みはいくつか報告されている（Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．２０００，４７３−４７４；Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．１９９７，１８９１−１８９２）。
【発明が解決しようとする課題】
しかし、現在までに報告された光誘起電子移動により蛍光を制御可能とするランタニド錯体は、消光機構が十分に機能しないためバックグラウンドとなる蛍光が大きく蛍光の変化が十分に得られない、また、錯体のランタニド金属への配位が不十分であるため有機溶媒中でしか蛍光を発しないなどの欠点を持つ。これらの欠点を克服することで、実際に様々な系で実用が可能となる蛍光性ランタニド錯体を基にしたプローブの開発が可能となる。
本発明は、光誘起電子移動を蛍光制御原理とする蛍光性ランタニド錯体を提供することを目的とする。この錯体は、水中で安定にランタニドと錯生成し、水中で機能を発すること、また、蛍光の制御は完全であり消光時に全く蛍光を持たないことが求められる。
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、このような課題が、センサー置換基及び錯基を有する２−キノリノール置換体とランタニドイオンとから成る錯体により解決されることを見出し、本発明を完成させた。
即ち、本発明は、下式（化１）
で表される２−キノリノールの３〜８位のいずれか２つの位置に、下式
−ＣｎＨ２（ｎ−ｍ）−（Ｃ６Ｈ５−ｏ）（−ＮＲ１Ｒ２）ｏ
（式中、ｎは１〜５の整数、ｍは０〜２であってｎ−１以下の整数、ｏは１又は２であり、Ｒ１は、Ｈ、アルキル基、ＣＯＸ（Ｘはアルキル基又はペプチド（このペプチドの末端アミノ基が上記ＣＯと結合している。）を表す。）、又は−ＣＨ２ＣＨ２（ＮＹＣＨ２ＣＨ２）ｐＮＹ２（式中、Ｙは、それぞれ異なっていてもよく、Ｈ、アルキル基、又は下式（化２）
を表し、ｐは０〜３の整数を表す。）を表し、Ｒ２はＨ又はアルキル基を表す。）
で表されるセンサー置換基及び錯基を有する２−キノリノール置換体、並びにランタニドから成り、該ランタニドイオンが該錯基と錯体結合し、該２−キノリノール置換体と該ランタニドとのモル比が１：０．９〜１．１である蛍光性ランタニド錯体である。ここでランタニド（ｌａｎｔｈｎｉｄｅ）は５８Ｃｅ〜７１Ｌｕのいずれかの元素を意味する。
前記錯基は、下記のいずれかのキレーター（化３）
（式中、ＩＤＡはｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、ＭＩＤＡはｍｅｔｈｙｌｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、ＮＴＡはｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、ＥＤＴＡはｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、ＨＥＤＴＡは２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｙｌｅｔｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、ＨＭＤＴＡはｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、ＤＴＰＡはｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉｎｉｔｉｌｏｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、ＴＴＨＡはｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｈｅｘａｎｉｔｉｌｏｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、ＤＯＴＡは１，４，７，１０−ｔｅｔｒａａｚａｃｙｃｌｏｄｏｄｅｃａｎｅ−１，４，７，１０−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、ＤＯ３Ａは１，４，７，１０−ｔｅｔｒａａｚａｃｙｃｌｏｄｏｄｅｃａｎｅ−１，４，７−ｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、ＮＯＴＡは１，４，７−ａｚａｃｙｃｌｏｎｏｎａｎｅ−１，４，７−ｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄを意味する。）に基づくものであって、そのいずれか一つのＮ原子が−ＣＨ２（ＣＯＮＨ）ｑ−（式中、ｑは０又は１、好ましくは１を表す。）を介して前記２−キノリノールと結合することが好ましい。
キレーターとしては、（ｉ）ＤＴＰＡと（ｖｉ）ＤＯＴＡが好ましい。
２−キノリノールの７位，３位または４位にアミノ基を常法により付加し、このアミノ基を介して、カルボン酸を有するキレーターとアミド結合により、これらのキレーターと２−キノリノールを結合させることができる。
前記２−キノリノールにおけるセンサー置換基及び錯基の置換位置はそれぞれ７位、４位又は３位が好ましく、更に、前記２−キノリノールにおける前記錯基の置換位置としては順番に７位、４位、３位が好ましく、前記センサー置換基の置換位置としては順番に４位、３位、７位が好ましい。また、前記錯基は、前記２−キノリノールの７位に結合し、前記センサー置換基が前記２−キノリノールの４位又は３位に結合する、又は前記錯基が前記２−キノリノールの４位に結合し、前記センサー置換基が前記２−キノリノールの３位又は７位に結合する、又は前記錯基が前記２−キノリノールの３位に結合し、前記センサー置換基が前記２−キノリノールの４位又は７位に結合することが好ましい。
更に、前記センサー置換基において、少なくとも一つのアミノ基（−ＮＲ１Ｒ２）が２価炭化水素基（−ＣｎＨ２（ｎ−ｍ）−）に対してベンゼン環（Ｃ６Ｈ５−ｏ）のパラ位に位置し、ｏが１であり、前記アルキル基がメチル基であることが好ましく、ｎが１であり、ｍが０であることがより好ましい。
本発明の錯体は、一般的に２−キノリノール置換体とランタニドをアセトニトリル、メタノール、水など極性溶媒中で約等量混合し、１時間程度攪拌または１〜１２時間程度の加熱還流することによる作ることができる。
更に、本発明は、液相で、上記のいずれかの錯体を被測定物と共存させ、該錯体の蛍光を測定することにより、該被測定物の性質を知る方法である。
この溶媒としては、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、メタノールなど極性溶媒を用いることが好ましく、より好ましくは水を用いる。その溶媒中の、該錯体の濃度は０．１ｎＭ〜０．１ｍＭが好ましく、該被測定物の濃度は０．１ｎＭ〜０．２ｍＭが好ましい。
例えば、加水分解酵素等を測定対象として本発明の錯体を用いると、この測定対象により該錯体のセンサー部分が分解され、その結果錯体の蛍光強度に変化を及ぼしたり、あるいは本発明の錯体のセンサー部がＣａ２＋，Ｚｎ２＋，Ｈ＋と配位結合することにより該錯体の蛍光強度に変化を及ぼしたり、あるいは本発明の錯体のセンサー部がＮＯや一重項酸素などと化学反応することにより該錯体の蛍光強度に変化を及ぼしたりするため、本発明の錯体はこれら測定対象のプローブとして機能する。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明の錯体の構成を示す。
第２図は、本発明の錯体のセンサー機能の原理を示す。ａはセンサー部がが電子供与性の高いもの、ｂはセンサー部が電子供与性の低いものの場合を示す。
第３図は、本発明の錯体の反応機構の例を示す。１）は、カスパーゼ等の加水分解酵素と反応する反応基をＰＥＴセンサー部分に取り込んだ例、２）は、亜鉛イオンと配位結合する反応基をＰＥＴセンサー部分に取り込んだ例、３）は、水素イオンが付加する反応基をＰＥＴセンサー部分に取り込んだ例、４）は、一酸化窒素と反応する反応基をＰＥＴセンサー部分に取り込んだ例を示す。
第４図は、製造例１〜３で製造した化合物８，１１，１５の合成経路を示す。
第５図は、製造例１〜３で製造した化合物８，１１，１５の合成経路を示す。
第６図は、製造例１〜３で製造した化合物８，１１，１５の合成経路を示す。
第７図は、ＤＴＰＡ−ｃｓ１２４のユウロピウム（ＩＩＩ）錯体の吸収スペクトルを示す。
第８図は、化合物８のユウロピウム（ＩＩＩ）錯体の吸収スペクトルを示す。
第９図は、化合物１１のユウロピウム（ＩＩＩ）錯体の吸収スペクトルを示す。
第１０図は、化合物１５のユウロピウム（ＩＩＩ）錯体の吸収スペクトルを示す。
第１１図は、化合物８（上）、１１（中）及び１５（下）のテルビウム（ＩＩＩ）錯体の蛍光スペクトルを示す。
第１２図は、化合物８（上）、１１（中）及び１５（下）のユウロピウム（ＩＩＩ）錯体の蛍光スペクトルを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明の錯体は、第１図に示すように、センサー置換基から成るセンサー部分と、錯基を含む２−キノリノール置換体とランタニドから成る蛍光団から成る。
この錯体を測定対象と液相、特に水中で、共存させ、測定対象がセンサー部のアミノ基と反応すると、この錯体の蛍光に変化が起こるため、これを観察することにより、測定対象の性質を知ることが可能となる。
例えば、アミノ基が電子供与性の高いもの（例えば、センサー部がアニリン）の場合には第２図（ａ）の左に示すように蛍光団から蛍光の発光が無いが、このような反応により、このアミノ基が電子供与性の低いもの（例えば、アセトアニリド）へ変化すると、第２図（ａ）の右に示すように、蛍光団において蛍光が発光するようになる。逆の場合には、第２図（ｂ）に示すように測定対象との反応により蛍光が消える。このような蛍光を調べることにより、本発明の錯体と測定対象との相互作用を知ることが可能になる（このようなＰＥＴセンサーの原理についてはＤｅＳｉｌｖａ，Ａ．Ｐ ｅｔ ａｌ．１９９７，９７，１５１５を参照されたい）。
このような原理に基づいて、本発明の錯体をプローブとして応用する例として以下の例を挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。各例の反応機構を第３図に示す。
１）カスパーゼ等の加水分解酵素と反応する反応基（ペプチド：ＤＥＶＤ）をＰＥＴセンサー部分に取り込んだ例
カスパーゼ等の加水分解酵素の特異的検出が可能となる。カスパーゼ等の加水分解酵素の細胞内生成を可視化することができる。この応用はアポトーシス等の生命現象のメカニズム解析に非常に有効である。カスパーゼ等の加水分解酵素の活性測定に応用でき，カスパーゼ等の加水分解酵素の阻害剤のハイスループットスクリーニングにも応用できる。
従来有機蛍光プローブに応用した例はないが、本発明の錯体は蛍光強度の変化を確実に起こすことができるので応用対象となる。
２）亜鉛イオンと配位結合する反応基をＰＥＴセンサー部分に取り込んだ例
Ｚｎ２＋の特異的検出が可能となる。Ｚｎ２＋の細胞内生成を可視化することができる。
Ｚｎ２＋測定を有機蛍光プローブに応用した例にはＨｉｒａｎｏ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０００，１２２，１２３９９．がある。
３）水素イオンが付加する反応基をＰＥＴセンサー部分に取り込んだ例
ｐＨの変化を長寿命蛍光の強度変化として測定することが可能となる。ｐＨの変化測定を有機蛍光プローブに応用した例にはＳｅｌｉｎｇｅｒ，Ｂ．Ｋ．；Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．１９７７，３０，２０８７がある。
４）一酸化窒素と反応する反応基をＰＥＴセンサー部分に取り込んだ例
ＮＯの特異的検出が可能となる。ＮＯの細胞内生成を可視化することができる。ＮＯ合成酵素の活性測定に応用でき、ＮＯ合成酵素の阻害剤のハイスループットスクリーニングにも応用できる。
ＮＯとの反応を有機蛍光プローブに応用した例には、Ｋｏｊｉｍａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９８，７０，２４４６がある。
【発明の効果】
従来通常の有機化合物に対してＰＥＴ機構を用いた蛍光の制御は行われていたが、本発明の錯体はランタニド錯体へのＰＥＴ制御により従来の有機化合物と比較して約１００万倍程度寿命の長い蛍光を制御できる点が新規である。このため，時間分解蛍光測定が可能となりより精度の高い測定が可能となる。現在までにランタニド錯体を用いて時間分解測定を行った例はあるが，長寿命蛍光の強度を測定対象との反応で制御した例は存在しなかった。本発明は測定対象に応じて長寿命蛍光測定を行うことができる初めての例であり、本発明の錯体はより幅広い応用が期待できる。
以下、実施例にて本発明を例証するが、本発明を限定することを意図するものではない。
本実施例では、ランタニドイオン（Ｌｎ３＋）と１対１の安定な錯体を形成するＤＴＰＡをキレーターとし、２−キノリノール誘導体であるｃｓ１２４を蛍光団とする下式（化５）
で表されるＤＴＰＡ−ｃｓ１２４を基本骨格とした。これにＰＥＴセンサーを組み込んだランタニド錯体のデザイン、合成を行った。ＰＥＴセンサーとしては電子供与性の高いアニリンと電子供与性の低いアセトアニリドを選択した。
電子供与性の高いＰＥＴセンサーからは蛍光団への電子移動が起きるため蛍光を発しない。しかし、電子供与性の低いＰＥＴセンサーからは電子移動が起こらないために蛍光を持つと考えられる。
実施例で用いる各化合物を合成した。その合成経路を第４〜６図に示す。各化合物番号は、第４〜６図中の化合物番号に対応している。
製造例１
この製造例では化合物８を合成した。
４−ニトロフェニル酢酸（４４０２ｍｇ，２４．３ｍｍｏｌ）を塩化チオニル（２０ｍｌ）、ジクロロメタン（２０ｍｌ）に溶解し、２時間加熱還流した。塩化チオニルを減圧下で留去し、固体を得た。この固体をジクロロメタン（３０ｍｌ）に溶解した後、その溶液を、メルドラム酸（３４９９ｍｇ，２４．３ｍｍｏｌ）とＮ．Ｎ−ジエチルイソプロピルアミン（５８４０ｍｇ，４９．８ｍｍｏｌ）を溶解したジクロロメタン（２０ｍｌ）溶液に氷冷下一時間かけて滴下し、この溶液をさらに２時間室温で撹拌した。この反応液に０．１Ｎ塩酸（５０ｍｌ）を加え、ジクロロメタンで抽出した。この反応液を減圧下で留去し得られた固体をエタノール（１００ｍｌ）に溶解し、２時間加熱還流した。この反応液を減圧下で留去し、４℃で一晩放置し固体を得た。これをエタノールで再結晶し化合物２（５２９８ｍｇ，２１．１ｍｍｏｌ）を得た。黄色結晶。収率８７％。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：１．２９（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１），３．５２（ｓ，２Ｈ），４．００（ｓ，２Ｈ），４．２１（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．１），７．４１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８），８．２１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８），１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５ＭＨｚ）：１４．１，４８．９，４９．０，６１．７，１２３．８，１３０．１，１３０．５，１４０．６，１６６．８，１９８．８
ＭＳ（ＥＩ）：２５１
化合物２（５２９７ｍｇ，２１．１ｍｇ）とｍ−フェニレンジアミン（２２９０ｍｇ，２１．２ｍｍｏｌ）を混合し、１４０度で１２時間加熱した。得られた固体にメタノールを加え、析出した黄色固体を桐山ロートで濾取し、化合物３（１８７６ｍｇ，６．３４ｍｍｏｌ）を得た。黄色固体。収率３０％。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００ＭＨｚ）４．１５（ｓ，２Ｈ），５．７５（ｂｒ，２Ｈ），５．９１（ｓ，１Ｈ），６．３５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１），６．３９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４，２．１），７．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４），７．５５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８），８．１５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８），１１．２４（ｓ，１Ｈ）１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，７５ＭＨｚ）３７．０，９６．８，１０９．２，１１０．６，１１５．５，１２３．６，１２５．７，１２９．９，１４１．３，１４６．１，１４７．３，１４９．２，１５１．１，１６２．３
ＭＳ（ＥＩ）：２９５
化合物３（２９５ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）と９−フルオレニルメチルオキシカルボニルクロリド（２９７ｍｇ，１．２３ｍｍｏｌ）をジオキサン（４０ｍｌ）、０．５Ｎ炭酸ナトリウム水溶液（２０ｍｌ）に溶解し室温で１２時間撹拌した。反応液に水を加え、生じた固体を桐山漏斗で濾取し、この固体をメタノール、水で順次洗浄した。この固体をエタノールで再結晶し、化合物４（４１０ｍｇ，０．７９ｍｍｏｌ）を得た。無色結晶。収率７９％。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００ＭＨｚ）
４．２９−４．３３（ｍ，３Ｈ），４．４８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．８），６．２０（ｓ，１Ｈ，ｋ），７．１２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７），７．３１−７．４４（ｍ，４Ｈ），７．５５−７．６２（ｍ，３Ｈ），７．６６（ｓ，１Ｈ），７．７４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５），７．８９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５），８．１７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．７），１０．０２（ｓ，１Ｈ），１１．６５（ｓ，１Ｈ）１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，７５ＭＨｚ）３６．８，４６．５，６５．８，１０３．６，１１３．０，１１３．９，１１９．７，１２０．２，１２３．６，１２５．１，１２５．５，１２７．１，１２７．７，１３０．０，１４０．０，１４０．８，１４１．１，１４３．７，１４６．２，１４６．８，１４８．９，１５３．２，１６１．９
ＭＳ（ＦＡＢ）：５１８
化合物４（３８５ｍｇ，０．７４ｍｍｏｌ）と鉄粉（２７３ｍｇ，４．９６ｍｍｏｌ）をエタノール（４０ｍｌ）、酢酸（２０ｍｌ）に溶解し、２時間加熱還流した。反応液をセライト濾過した後、反応液を減圧下で留去し得られた固体をシリカゲルクロマトグラムで精製し鉄を除き、化合物５（２００ｍｇ）を混合物として得た。この混合物である化合物５（２００ｍｇ）をジオキサン（４０ｍｌ）、０．５Ｎ炭酸ナトリウム水溶液（２０ｍｌ）に溶解し、反応液に炭酸ジブチル（３００μｌ）を加え、室温で１２時間撹拌した。この反応液に水を加え、これを酢酸エチルで抽出し、抽出液を減圧下で留去した。得られた固体をシリカゲルクロマトグラムで精製し、化合物６（１１１ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ）を得た。白色固体。収率３６％（２工程）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００ＭＨｚ）１．５２（ｓ，９Ｈ），４．０９（ｓ，２Ｈ），４．３８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．６），４．５５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．６），６．１５（ｓ，１Ｈ），７．１７−７．２３（ｍ，３Ｈ），７．３９−７．５１（ｍ，６Ｈ），７．６８−７．７１（ｍ，２Ｈ），７．８２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６），７．９７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６），９．３４（ｓ，１Ｈ），１０．０７（ｓ，１Ｈ），１１．６４（ｓ，１Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，７５ＭＨｚ）２８．１，３６．７，４６．６，６５．８，７８．９，１０３．６，１１２．９，１１４．１，１１８．３，１１９．０，１２０．２，１２５．２，１２５．５，１２７．１，１２７．７，１２９．１ １３１．７，１３７．９，１４０．０，１４０．８，１４０．９，１４３．７，１５０．５，１５２．８，１５３．３，１６２．１
ＭＳ（ＦＡＢ）５８８
化合物６（１０４ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）に溶解し、ピペリジン（１ｍｌ）を加え、室温で２時間撹拌する。反応液を減圧下で留去し、得られた固体をシリカゲルクロマトグラムで精製し、化合物７（６３ｍｇ，０．１７ｍｍｏｌ）を得た。淡黄色固体。収率９７％。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００ＭＨｚ）１．３９（ｓ，９Ｈ），３．８７（ｓ，２Ｈ），５．６６（ｓ，２Ｈ），５．７４（ｓ，１Ｈ），６．２８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０），６．３２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．６ ２．０），７．０６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４），７．２８−７．３３（ｍ，３Ｈ），９．２０（ｓ，１Ｈ），１１．１１（ｓ，１Ｈ）１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，７５ＭＨｚ）２８．１，３６．８，７８．９，９６．８，１０９．４，１１０．４，
１１４．９，１１８．２，１２５．７，１２９．０，１３２．２，１３７．８，１４１．１，１５０．７，１５０．９，１５２．８，１６２．４
ＭＳ（ＦＡＢ）３６６
無水ＤＴＰＡ（４４ｍｇ，０．１２ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）に溶解し、トリエチルアミン（４００μｌ）を加える。さらにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）に溶解した化合物７（３７ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）を２０分、反応液に滴下する。室温で２時間撹拌後、水４ｍｌを加え、反応液を減圧下で留去する。得られた固体にトリフルオロ酢酸（５ｍｌ）を加え、室温で１時間撹拌する。反応液を減圧下で留去し得られた固体を高速液体クロマトグラフィーで精製し、化合物８（１９ｍｇ，０．０３ｍｍｏｌ）を得た。無色固体。収率３０％。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，３００ＭＨｚ）３．０５−３．３０（ｍ，４Ｈ），３．３５−３．６０（ｍ，１２Ｈ），４．１９（ｓ，２Ｈ），４．２９（ｓ，２Ｈ），６．１２（ｓ，１Ｈ），７．２２−７．３３（ｍ，５Ｈ，），７．６８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．９），７．９４（ｓ，１Ｈ），
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，７５ＭＨｚ）
ＭＳ（ＦＡＢ）６４１
製造例２
この製造例では化合物１１を合成した。
製造例１に示した化合物６の合成と同様に、化合物４（２０９ｍｇ，０．４１ｍｍｏｌ）から混合物である化合物５（１７２ｍｇ）を得た。これを酢酸（５０ｍｌ）に溶解し、無水酢酸（１０ｍｌ）を加える。３０分間加熱環流し、反応液を減圧下で留去する。得られた固体をシリカゲルクロマトグラムで精製し、化合物９（１６９ｍｇ，０．３２ｍｍｏｌ）を得た。白色固体。収率７９％。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００ＭＨｚ）２．００（ｓ，３Ｈ），３．９５（ｓ，２Ｈ），５．７１（ｓ，２Ｈ），５．８１（ｓ，１Ｈ），６．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１），６．３９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６ ２．１），７．１６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４），７．３７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６），７．４８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４），９．８６（ｓ，１Ｈ），１１．１６（ｓ，１Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，７５ＭＨｚ）１７１．３，１６８．１，１６２．１，１５３．２，１５０．３，１４３．７，１４０．９，１４０．８，１４０．０，１３７．８，１３２．８，１２９．１，１２７．７，１２７．１，１２５．５，１２５．２，１２０．２，１１９．２，１１４．１，１１２．９，１０３．６，６５．８，４６．６，３６．７，２４．０ ＦＡＢＭＳ（Ｍ＋１）
化合物９（１６７ｍｇ，０．３２ｍｍｏｌ）から化合物７の合成法と同様に化合物１０（９４ｍｇ，０．３１ｍｍｏｌ）を得た。淡黄色固体。収率９７％。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００ＭＨｚ），２．００（ｓ，３Ｈ），４．０４（ｓ，２Ｈ），４．３１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．９），４．４７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．９），６．０９（ｓ，１Ｈ），７．１４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４），７．１８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．７），７．３１−７．４４（ｍ，４Ｈ），７．６３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．７），７．６１−７．６５（ｍ，２Ｈ，７．７５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６），７．９０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５），９．８９（ｓ，１Ｈ），１０．００（ｓ，１Ｈ），１１．５７（ｓ，１Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，７５ＭＨｚ）１６８．１，１６２．４，１５０．９，１５０．６，１４１．１，１３７．６，１３３．２，１２９．０，１２５．７，１１９．１，１１４．９，１１０．４，１０９．４，９６．８，３６．８，２３．９ ＦＡＢＭＳ（Ｍ＋１）３０８
無水ＤＴＰＡ（４３ｍｇ，０．１２ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）に溶解し、トリエチルアミン（４００μｌ）を加える。さらにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）に溶解した化合物１０（３１ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）を２０分、反応液に滴下する。室温で２時間撹拌後、水４ｍｌを加え、反応液を減圧下で留去する。得られた固体を高速液体クロマトグラフィーで精製し、化合物１１（３０ｍｇ，０．０４ｍｍｏｌ）を得た。無色固体。収率４０％。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，３００ＭＨｚ）３．０５−３．３０（ｍ，４Ｈ），３．４０−３．６５（ｍ，１２Ｈ），４．０９（ｓ，２Ｈ），４．３６（ｓ，２Ｈ），６．２０（ｓ，１Ｈ），７．１０−７．１８（ｍ，３Ｈ），８．２５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．３），７．６７（ｓ，１Ｈ，Ｊ＝８．０），７．９７（ｓ，１Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，７５ＭＨｚ） ＦＡＢＭＳ（Ｍ＋１）６８３
製造例３
この製造例では化合物１５を合成した。
ジクロロメタン（３０ｍｌ）に溶解したフェニルアセチルクロリド（化合物１２，２３１９ｍｇ，１５．０ｍｍｏｌ）をメルドラム酸（２１６０ｍｇ，１４．９ｍｍｏｌ）とＮ．Ｎ−ジエチルイソプロピルアミン（３８７７ｍｇ，３０．０ｍｍｏｌ）を溶解したジクロロメタン（３０ｍｌ）に氷冷下一時間かけて滴下し、この溶液をさらに２時間室温で撹拌した。この反応液に０．１Ｎ塩酸を５０ｍｌ加え、ジクロロメタンで抽出した。この反応液を減圧下で留去し得られた固体をエタノール（１００ｍｌ）に溶解し、２時間加熱還流した。この反応液を減圧下で留去して、化合物１２（２７３７ｍｇ，１３．３ｍｍｏｌ）を得た。淡黄色液体。収率８８％。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００ＭＨｚ）１．１６（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝６．９），３．６４（ｃ，２Ｈ），３．８５（ｓ，２Ｈ），４．０６（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝６．９），７．００−７．４１（ｍ，５Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５ＭＨｚ）２００．３，１６６．９，１３３．０，１２９．３，１２８．５，１２７．０，６１．１，４９．７，４８．０，１３．８
ＭＳ（ＥＩ）：２５１
化合物１３（１２００ｍｇ，０．１７ｍｍｏｌ）から化合物３の合成法と同様に化合物１４（５５５ｍｇ，２．２２ｍｍｏｌ）を得た。淡黄色固体。収率３８％。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００ＭＨｚ）４．０１（ｓ，２Ｈ），５．７３（ｓ，２Ｈ），５．８３（ｓ，１Ｈ）６．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１），６．３８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７ ２．１），７．１７−７．３２（ｍ，５Ｈ），７．４１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．７），１１．１８（ｓ，１Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，７５ＭＨｚ）１６２．４，１５１．０，１５０．５，１４１．２，１３８．８，１２８．８，１２８．４，１２６．３，１２５．７，１１５．１，１１５．０，１１０．４，１０９．５，９６．９，３７．３，ＦＡＢＭＳ（Ｍ＋１）２５１
化合物１４（３８ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）から化合物１１の合成法と同様に化合物１５（３７ｍｇ，０．０６ｍｍｏｌ）を得た。無色固体。収率４０％。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，３００ＭＨｚ）３．０５−３．３０（ｍ，４Ｈ），３．３５−３．６０（ｍ，１２Ｈ），４．１３（ｓ，２Ｈ），４．３５（ｓ，２Ｈ），６．１８（ｓ，１Ｈ），７．１２−７．２３（ｍ，６Ｈ），７．６８（ｓ，１Ｈ），７．９６（ｓ，１Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，７５ＭＨｚ） ＦＡＢＭＳ（Ｍ＋１）６２６
以下の実施例では、製造例１〜３で得た化合物８、１１及び１５を用いて錯体を作り、その蛍光特性を評価した。
【実施例１〜３】
化合物８、１１及び１５をジメチルスルホキシドに溶解し、１０ｍＭのｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎを作製した。また、塩化テルビウム（ＩＩＩ）６水和物をジメチルスルホキシドに溶解し、１０ｍＭのｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎを作製した。作製した化合物８、１１及び１５の各溶液に、等量の塩化テルビウム（ＩＩＩ）６水和物の溶液を添加し、室温で３０分放置して、化合物８、１１及び１５のテルビウム（ＩＩＩ）錯体作製した。これを１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈し、８μＭとしその蛍光を測定した。
【実施例４〜６】
化合物８、１１及び１５をジメチルスルホキシドに溶解し、１０ｍＭのｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎを作製した。また、塩化ユウロピウム（ＩＩＩ）６水和物をジメチルスルホキシドに溶解し、１０ｍＭのｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎを作製した。作製した化合物８、１１及び１５の各溶液に、等量の塩化ユウロピウム（ＩＩＩ）６水和物の溶液を添加し、室温で３０分放置して、化合物８、１１及び１５のユウロピウム（ＩＩＩ）錯体を作製した。これを１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈し、８μＭとしその蛍光を測定した。
これらユウロピウム（ＩＩＩ）錯体及びＤＴＰＡ−ｃｓ１２４のユウロピウム（ＩＩＩ）錯体の吸収スペクトル（５μＭ ｉｎ １００ｍＭ ＨＥＰＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４））を第７〜１０図に示す。
蛍光は時間分解測定により測定した。いずれの錯体についても励起波長３３０ｎｍ、Ｄｅｌａｙ Ｔｉｍｅ ０．０５ｍｓ、Ｇａｔｅ Ｔｉｍｅ １．００ｍｓとしてその蛍光を測定した。また、蛍光寿命は励起波長３３０ｎｍ、蛍光波長は各テルビウム錯体は５４５ｎｍ、各ユウロピウム錯体は６１５ｎｍとして測定した（各８μＭ ｉｎ １００ｍＭ ＨＥＰＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４））。
化合物８，１１，１５のテルビウム（ＩＩＩ）錯体の蛍光スペクトル第１１図に示し、その蛍光寿命と水配位数を表１に示す。
また、化合物８，１１，１５のユウロピウム（ＩＩＩ）錯体の蛍光スペクトル第１２図に示し、その蛍光寿命と水配位数を表２に示す。
化合物１５のテルビウム（ＩＩＩ）錯体、ユウロピウム（ＩＩＩ）錯体はいずれも強い蛍光を持つ。その蛍光強度はＤＴＰＡ−ｃｓ１２４のテルビウム（ＩＩＩ）錯体、ユウロピウム（ＩＩＩ）錯体とほぼ同等であった。また、蛍光寿命にも変化は見られなかった。カルボスチリルの４位のベンジル基への変化は蛍光特性に変化を与えなかった。
化合物１１のテルビウム（ＩＩＩ）錯体、ユウロピウム（ＩＩＩ）錯体はいずれも強い蛍光を持つ。しかし、化合物８のテルビウム（ＩＩＩ）錯体、ユウロピウム（ＩＩＩ）錯体はいずれも蛍光を全く持たず、蛍光寿命は測定できなかった。カルボスチリルの４位の置換基の電子密度が上昇することで、４位置換基からカルボスチリルへの光誘起電子移動が生じ、化合物８のテルビウム（ＩＩＩ）錯体、ユウロピウム（ＩＩＩ）錯体は蛍光を全く発しなかった。
これによりテルビウム（ＩＩＩ）錯体、ユウロピウム（ＩＩＩ）錯体をはじめとするランタニド錯体の蛍光を制御することが可能となることが示された。この錯体は水中で安定に錯体を生成し、蛍光の制御が完全であり、水中で機能することが明らかとなった。この結果から、光誘起電子移動による電子供与部位を適切な分析対象物のセンサーとし、電子供与能が変化するならば、さまざまな分析対象物に対して高感度に感知できるプローブの開発が可能となることがわかる。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下式（化１）
で表される２−キノリノールの３〜８位のいずれか２つの位置に、下式
−ＣｎＨ２（ｎ−ｍ）−（Ｃ６Ｈ５−ｏ）（−ＮＲ１Ｒ２）ｏ
（式中、ｎは１〜５の整数、ｍは０〜２であってｎ−１以下の整数、ｏは１又は２であり、Ｒ１は、Ｈ、アルキル基、−ＣＯＸ（Ｘはアルキル基又はペプチドを表す。）、又は−ＣＨ２ＣＨ２（ＮＹＣＨ２ＣＨ２）ｐＮＹ２（式中、Ｙは、それぞれ異なっていてもよく、Ｈ、アルキル基、又は下式（化２）
を表し、ｐは０〜３の整数を表す。）を表し、Ｒ２はＨ又はアルキル基を表す。）で表されるセンサー置換基及び錯基を有する２−キノリノール置換体、並びにランタニドから成り、該ランタニドイオンが該錯基と錯体結合し、該２−キノリノール置換体と該ランタニドとのモル比が１：０．９〜１．１である蛍光性ランタニド錯体。
【請求項２】
前記錯基が下記のいずれかのキレーター（化３）
に基づくものであって、そのいずれか一つのＮ原子が−ＣＨ２（ＣＯＮＨ）ｑ−（式中、ｑは０又は１を表す。）を介して前記２−キノリノールと結合する請求項１に記載の錯体。
【請求項３】
前記錯基が前記２−キノリノールの７位に結合し、前記センサー置換基が前記２−キノリノールの４位又は３位に結合する、又は前記錯基が前記２−キノリノールの４位に結合し、前記センサー置換基が前記２−キノリノールの３位又は７位に結合する、又は前記錯基が前記２−キノリノールの３位に結合し、前記センサー置換基が前記２−キノリノールの４位又は７位に結合する請求項１又は２に記載の錯体。
【請求項４】
前記センサー置換基において、少なくとも一つのアミノ基（−ＮＲ１Ｒ２）が２価炭化水素基（−ＣｎＨ２（ｎ−ｍ）−）に対してベンゼン環（Ｃ６Ｈ５−ｏ）のパラ位に位置し、ｏが１であり、前記アルキル基がメチル基であることが好ましく、ｎが１であり、ｍが０である請求項１〜３のいずれか一項に記載の錯体。
【請求項５】
ｎが１であり、ｍが０である請求項１〜４のいずれか一項に記載の錯体。
【請求項６】
液相で請求項１〜３のいずれか一項に記載の錯体を被測定物と共存させ、該錯体の蛍光を測定することにより、該被測定物の性質を知る方法。
【請求項１】
下式（化１）
で表される２−キノリノールの３〜８位のいずれか２つの位置に、下式
−ＣｎＨ２（ｎ−ｍ）−（Ｃ６Ｈ５−ｏ）（−ＮＲ１Ｒ２）ｏ
（式中、ｎは１〜５の整数、ｍは０〜２であってｎ−１以下の整数、ｏは１又は２であり、Ｒ１は、Ｈ、アルキル基、−ＣＯＸ（Ｘはアルキル基又はペプチドを表す。）、又は−ＣＨ２ＣＨ２（ＮＹＣＨ２ＣＨ２）ｐＮＹ２（式中、Ｙは、それぞれ異なっていてもよく、Ｈ、アルキル基、又は下式（化２）
を表し、ｐは０〜３の整数を表す。）を表し、Ｒ２はＨ又はアルキル基を表す。）で表されるセンサー置換基及び錯基を有する２−キノリノール置換体、並びにランタニドから成り、該ランタニドイオンが該錯基と錯体結合し、該２−キノリノール置換体と該ランタニドとのモル比が１：０．９〜１．１である蛍光性ランタニド錯体。
【請求項２】
前記錯基が下記のいずれかのキレーター（化３）
に基づくものであって、そのいずれか一つのＮ原子が−ＣＨ２（ＣＯＮＨ）ｑ−（式中、ｑは０又は１を表す。）を介して前記２−キノリノールと結合する請求項１に記載の錯体。
【請求項３】
前記錯基が前記２−キノリノールの７位に結合し、前記センサー置換基が前記２−キノリノールの４位又は３位に結合する、又は前記錯基が前記２−キノリノールの４位に結合し、前記センサー置換基が前記２−キノリノールの３位又は７位に結合する、又は前記錯基が前記２−キノリノールの３位に結合し、前記センサー置換基が前記２−キノリノールの４位又は７位に結合する請求項１又は２に記載の錯体。
【請求項４】
前記センサー置換基において、少なくとも一つのアミノ基（−ＮＲ１Ｒ２）が２価炭化水素基（−ＣｎＨ２（ｎ−ｍ）−）に対してベンゼン環（Ｃ６Ｈ５−ｏ）のパラ位に位置し、ｏが１であり、前記アルキル基がメチル基であることが好ましく、ｎが１であり、ｍが０である請求項１〜３のいずれか一項に記載の錯体。
【請求項５】
ｎが１であり、ｍが０である請求項１〜４のいずれか一項に記載の錯体。
【請求項６】
液相で請求項１〜３のいずれか一項に記載の錯体を被測定物と共存させ、該錯体の蛍光を測定することにより、該被測定物の性質を知る方法。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７４２５４
【国際公開日】平成１６年９月２日（２００４．９．２）
【発行日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０２６９９（Ｐ２００５−５０２６９９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００１６８０
【国際出願日】平成１６年２月１７日（２００４．２．１７）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年９月２日（２００４．９．２）
【発行日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００１６８０
【国際出願日】平成１６年２月１７日（２００４．２．１７）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
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