【課題】組換えクローニングのための組成物および方法を提供する。
【解決手段】複数の組換え部位および/または複数のトポイソメラーゼ認識部位を有するベクターを含む組成物。2つまたはそれ以上の異なる核酸分子の同時クローニングを可能にする。いくつかの態様において分子は融合されるが、一方他の態様において分子はベクター内の別個の部位に挿入される。同一でも異なっていてもよいいくつかの分子および/または化合物（例えば、化学的化合物、薬物、タンパク質またはペプチド、脂質、核酸、炭水化物等）の組換えによる連結または結合。宿主細胞、および核酸分子を含むキット。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)1つまたは複数の組換え部位；ならびに(b)1つもしくは複数のトポイソメラーゼ認識部位および/または1つもしくは複数のトポイソメラーゼを含む、単離された核酸分子。
【請求項２】
環状分子である、請求項1記載の核酸分子。
【請求項３】
2つまたはそれ以上の組換え部位を含む、請求項1記載の核酸分子。
【請求項４】
2つまたはそれ以上の組換え部位のうちの少なくとも1つが、分子中でトポイソメラーゼ認識部位の各々の端に隣接する、請求項3記載の核酸分子。
【請求項５】
組換え部位が以下からなる群より選択される、請求項1記載の核酸分子：
(a) attB部位、
(b) attP部位、
(c) attL部位、
(d) attR部位、
(e) lox部位、
(f) psi部位、
(g) dif部位、
(h) cer部位、
(i) frt部位、
ならびに、組換えを受ける能力を保持している、組換え部位(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、または(i)の変異体、変種、および誘導体。
【請求項６】
トポイソメラーゼ認識部位がI型トポイソメラーゼによって認識および結合される、請求項1記載の核酸分子。
【請求項７】
I型トポイソメラーゼがIB型トポイソメラーゼである、請求項6記載の核酸分子。
【請求項８】
IB型トポイソメラーゼが、真核生物核I型トポイソメラーゼおよびポックスウイルストポイソメラーゼからなる群より選択される、請求項7記載の核酸分子。
【請求項９】
ポックスウイルストポイソメラーゼが、ワクシニアウイルス、ショープ線維腫ウイルス、ORFウイルス、鶏痘ウイルス、伝染性軟肬腫ウイルス、およびアムサクタ・ムーレイ（Amsacta moorei）昆虫ポックスウイルスからなる群より選択されるウイルスから産生または単離される、請求項8記載の核酸分子。
【請求項１０】
請求項1の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１１】
発現ベクターである、請求項10記載のベクター。
【請求項１２】
pcDNAGW-DT(sc)、pENTR-DT(sc)、pcDNA-DEST41、pENTR/D-TOPO、pENTR/SD/D-TOPO、pcDNA3.2/V5/GWD-TOPO、およびpcDNA6.2/V5/GWD-TOPOからなる群より選択されるベクター。
【請求項１３】
請求項1記載の単離された核酸分子を含む、宿主細胞。
【請求項１４】
請求項10記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１５】
請求項12記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１６】
以下の段階を含む、核酸分子のインビトロクローニング法：
(a)クローニングされる第1の核酸分子を入手する段階；
(b)インビトロでクローニングされる第1の核酸分子を、少なくとも1つの第1の組換え部位に隣接する少なくとも1つの第1のトポイソメラーゼ認識部位、および少なくとも1つの第2の組換え部位に隣接する少なくとも1つの第2のトポイソメラーゼ認識部位を含む、第2の核酸分子と混合する段階であって、第1と第2の組換え部位は互いにはおよび少なくとも1つのトポイソメラーゼとは組換えをしない段階；ならびに
(c)クローニングされる第1の核酸分子が第1および第2のトポイソメラーゼ認識部位の間で第2の核酸分子に挿入されるような条件下で混合物をインキュベートし、それによって第1および第2の組換え部位の間にクローニングされる第1の核酸分子を含む第1の産物分子を産生する段階。
【請求項１７】
第2の核酸分子がベクターである、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
クローニングされる第1の核酸分子が線状核酸分子である、請求項16記載の方法。
【請求項１９】
線状核酸分子が平滑末端の核酸分子である、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
クローニングされる第1の核酸分子がPCR産物である、請求項16記載の方法。
【請求項２１】
クローニングされる第1の核酸分子が、少なくとも1つのオープンリーディングフレームを含む、請求項16記載の方法。
【請求項２２】
互いに組換えをしない少なくとも1つの第3および第4の組換え部位を含む少なくとも1つの第3の核酸分子を、第1と第3の、および第2と第4の組換え部位の間での組換えに有利な条件下で第1の産物分子に接触させ、それにより少なくとも1つの第2の産物分子を産生する段階をさらに含む、請求項16記載の方法。
【請求項２３】
第3の核酸分子がベクターである、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
第1の産物分子を宿主細胞に挿入する段階をさらに含む、請求項16記載の方法。
【請求項２５】
第1の産物分子を宿主細胞に挿入する段階をさらに含む、請求項17記載の方法。
【請求項２６】
第2の産物分子を宿主細胞に挿入する段階をさらに含む、請求項22記載の方法。
【請求項２７】
第2の産物分子を宿主細胞に挿入する段階をさらに含む、請求項23記載の方法。
【請求項２８】
ベクターが発現ベクターである、請求項17記載の方法。
【請求項２９】
ベクターが発現ベクターである、請求項23記載の方法。
【請求項３０】
第2の核酸分子が、選択可能マーカー、クローニング部位、制限酵素部位、プロモーター、オペレーター、オペロン、複製開始点、および遺伝子または部分的遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つのさらなる核酸配列を含む、請求項16記載の方法。
【請求項３１】
第3の核酸分子が、選択可能マーカー、クローニング部位、制限酵素部位、プロモーター、オペレーター、オペロン、複製開始点、および遺伝子または部分的遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つのさらなる核酸配列を含む、請求項22記載の方法。
【請求項３２】
第1および第2の組換え部位が、以下からなる群より選択される、請求項16記載の方法：
(a) attB部位、
(b) attP部位、
(c) attL部位、
(d) attR部位、
(e) lox部位、
(f) psi部位、
(g) dif部位、
(h) cer部位、
(i) frt部位、
ならびに、組換えを受ける能力を保持している、組換え部位(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、または(i)の変異体、変種、および誘導体。
【請求項３３】
第3および第4の組換え部位が、以下からなる群より選択される、請求項22記載の方法
(a) attB部位、
(b) attP部位、
(c) attL部位、
(d) attR部位、
(e) lox部位、
(f) psi部位、
(g) dif部位、
(h) cer部位、
(i) frt部位、
ならびに、組換えを受ける能力を保持している、組換え部位(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、または(i)の変異体、変種、および誘導体。
【請求項３４】
lox部位が、loxP部位およびloxP511部位からなる群より選択される、請求項32記載の方法。
【請求項３５】
lox部位が、loxP部位およびloxP511部位からなる群より選択される、請求項33記載の方法。
【請求項３６】
トポイソメラーゼがI型トポイソメラーゼである、請求項16記載の方法。
【請求項３７】
I型トポイソメラーゼがIB型トポイソメラーゼである、請求項36記載の核酸分子。
【請求項３８】
IB型トポイソメラーゼが、真核生物核I型トポイソメラーゼおよびポックスウイルストポイソメラーゼからなる群より選択される、請求項37記載の核酸分子。
【請求項３９】
ポックスウイルストポイソメラーゼが、ワクシニアウイルス、ショープ線維腫ウイルス、ORFウイルス、鶏痘ウイルス、伝染性軟肬腫ウイルス、およびアムサクタ・ムーレイ（Amsacta moorei）昆虫ポックスウイルスからなる群より選択されるウイルスから産生または単離される、請求項38記載の核酸分子。
【請求項４０】
産物核酸分子および第3の核酸分子が、少なくとも1つの組換えタンパク質の存在下で結合される、請求項22記載の方法。
【請求項４１】
組換えタンパク質が、以下からなる群より選択される、請求項40記載の方法：
(a) Cre;
(b) Int;
(c) IHF;
(d) Xis;
(e) Fis;
(f) Hin;
(g) Gin;
(h) Cin;
(i) Tn3 リゾルバーゼ;
(j) TndX;
(k) XerC; および
(l) XerD。
【請求項４２】
組み換えタンパク質がCreである、請求項40記載の方法。
【請求項４３】
組み換えタンパク質が、Int、Xis、IHF、およびFisからなる群より選択される、請求項40記載の方法。
【請求項４４】
請求項1の単離された核酸分子を含む、キット。
【請求項４５】
1つまたは複数のトポイソメラーゼ、1つまたは複数の組み換えタンパク質、1つまたは複数のベクター、1つまたは複数のポリメラーゼ活性を持つポリペプチド、および1つまたは複数の宿主細胞からなる群より選択される1つまたは複数の成分をさらに含む、請求項44記載のキット。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８Ａ】

【図８Ｂ】

【図９Ａ】

【図９Ｂ】

【図９Ｃ】

【図９Ｄ】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２Ａ】

【図２２Ｂ】

【図２３Ａ】

【図２３Ｂ】

【図２４Ａ】

【図２４Ｂ】

【図２４Ｃ】

【図２５Ａ】

【図２５Ｂ】

【図２５Ｃ】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０Ａ】

【図３０Ｂ】

【図３０Ｃ】

【図３１】

【図３２】

【図３３】

【図３４】

【図３５】

【図３６】

【図３７】

【図３８】

【図３９】

【図４０】

【公開番号】特開２００９−２１９４９７（Ｐ２００９−２１９４９７Ａ）
【公開日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１２５９１８（Ｐ２００９−１２５９１８）
【出願日】平成２１年５月２６日（２００９．５．２６）
【分割の表示】特願２００２−５４８０９０（Ｐ２００２−５４８０９０）の分割
【原出願日】平成１３年１２月７日（２００１．１２．７）
【出願人】（５０２２２１２８２）ライフ　テクノロジーズ　コーポレーション (113)
【Ｆターム（参考）】