観察装置
【課題】良好な観察を行う。
【解決手段】試料に照明光を照射する照明光学系３２と、その試料からの光を集光する観察光学系３３とを有しており、試料が収納される培養容器の種類に応じて、照明光学系３２および観察光学系３３が調整される。また、絞り４２Ａの光軸方向の位置を調整することで、周辺から試料に集光する照明光の光束の光軸の、照明光の中心の光束の光軸に対する角度を変更することができ、培養容器がウェルプレートであるときには狭角度となるように調整され、培養容器がディッシュであるときには広角度となるように調整される。本発明は、例えば、インキュベータを有する培養観察装置に適用できる。
【解決手段】試料に照明光を照射する照明光学系３２と、その試料からの光を集光する観察光学系３３とを有しており、試料が収納される培養容器の種類に応じて、照明光学系３２および観察光学系３３が調整される。また、絞り４２Ａの光軸方向の位置を調整することで、周辺から試料に集光する照明光の光束の光軸の、照明光の中心の光束の光軸に対する角度を変更することができ、培養容器がウェルプレートであるときには狭角度となるように調整され、培養容器がディッシュであるときには広角度となるように調整される。本発明は、例えば、インキュベータを有する培養観察装置に適用できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、観察装置に関し、特に、良好な観察ができるようにした観察装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、体外受精（ＩＶＦ：In-vitro Fertilization）や、顕微授精（ＩＣＳＩ：Intracytoplasmic Sperm Injection）などにおいて、受精卵を培養して観察が行われる。受精卵の観察には、培地ドロップ観察方法とウェルプレートを使用した観察方法とがある。
【０００３】
培地ドロップ観察方法では、採取した受精卵を、培養容器（例えば、３５ｍｍDish）上に作られた２０μｌ程度の培地ドロップに１個ずつ入れる。培地ドロップの表面はミネラルオイルでコートされ、その状態で培養容器ごと、インキュベータと呼ばれる恒温恒湿度環境を持つ培養装置へ収容されて、培養が行われる。
【０００４】
ところで、培地ドロップ観察方法では、培養容器の培養ドロップ内に存在する受精卵を観察しようとする際に、培地ドロップの縁に受精卵が移動していたとき、培地ドロップの縁に現れる影に隠れてしまって、その受精卵を検出することができないことがある。
【０００５】
図５を参照して、培地ドロップの縁に現れる影について説明する。図５には、培養容器内の平面図と断面図が示されている。
【０００６】
培養容器１は、いわゆるディッシュからなり、その内径は約３５ｍｍである。培養容器１の底面には、２０μｌ程度の培地ドロップＤが複数個（図１０の例では８個）、培養容器１の円周に沿って均等に並べられて形成されている。
【０００７】
個々の培地ドロップＤの表面および間隔は、乾燥を防ぐために無色透明のミネラルオイルＯで満たされており、個々の培地ドロップＤの中には、共通の母体から共通の時期に採取された受精卵ａが１個ずつ入っている。個々の培地ドロップＤの直径は、約７ｍｍであり、個々の受精卵ａの直径は、約１００μｍである。また、培地ドロップＤは、培養容器１の底面に付着しているが、受精卵ａは、培地ドロップＤの内部を浮遊する可能性がある。
【０００８】
このように培地ドロップＤ内にある受精卵ａを観察する際、上側から照明光が照射され、下側に配置されている対物レンズを介して画像が撮像される。
【０００９】
このとき、培地ドロップＤとミネラルオイルＯとの屈折率の違いにより、メニスカス効果が発生する。例えば、培地ドロップＤの屈折率が１．３程度であり、ミネラルオイルＯの屈折率が1.4〜1.6程度であるとき、ミネラルオイルＯと培地ドロップＤとの境界面で、光学的に強い凹レンズ（ｆ＝−１４前後）と同じ効果が発生する。そのため、培地ドロップＤの縁近辺に入射した照明光が培地ドロップＤの外側に屈折される。これにより、培地ドロップＤの縁近辺に入射した照明光が対物レンズに入射し難くなるため、培地ドロップＤの縁の全周に影が現れる。
【００１０】
一方、培養容器１の内壁面におけるミネラルオイルＯの表面張力によっても、ミネラルオイルＯと液面との境界面で、メニスカス効果である凹レンズと同じ効果が発生してしまう。これにより、培養容器１の縁近辺に入射した照明光が対物レンズに入射し難くなるため、培地ドロップＤの培養容器１内壁面側に三日月のような形状の影（培養容器１に対する培地ドロップＤの内側と外側とで非対称な影）が現れる。
【００１１】
また、ウェルプレートを使用した観察方法では、例えば、４〜９６ウェルプレート内の穴に培地を入れ、その培地の中に受精卵を入れて培養が行われる。このとき、ウェルプレートの穴の内壁面における培地の表面張力により、ウェルプレートの穴の縁においてもメニスカス効果が発生するため、受精卵を観察する際に、この影に受精卵が隠れてしまって、観察が困難になる。
【００１２】
そこで、本願出願人は、液面やミネラルオイルＯと培地ドロップの境界面によるメニスカス効果による影響を打ち消すように位相差リングを移動させることができる位相差顕微鏡を提案している（特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開２００９−１２２３５６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
ところで、培養容器の種類によってメニスカス効果の影響が異なっており、ある種類の培養容器において良好な観察を行えるように光学系を設定しても、他の種類の培養容器では良好な観察を行うことができないことがあった。従って、培養容器の種類に依らず、良好な観察を行うことができるような観察装置が求められていた。
【００１５】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、良好な観察ができるようにするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の観察装置は、液体中に存在している試料を観察する観察装置において、前記試料にある角度範囲にわたって照明光を照射し、その試料からの光を集光する光学系と、前記試料が収納される培養容器の種類を取得する取得手段と、前記培養容器の種類に応じて、前記光学系を調整する調整手段とを備えることを特徴とする。
【００１７】
本発明の観察装置においては、液体中に存在している試料が前記液体と共に収納される培養容器の種類が取得され、培養容器の種類に応じて光学系が調整される。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の観察装置によれば、良好な観察ができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明を適用した培養観察装置が備える観察ユニットの一実施の形態の構成例を示す図である。
【図２】観察条件ごとの照明光学系および観察光学系について説明する図である。
【図３】コントロール部の処理を説明するフローチャートである。
【図４】観察処理を説明するフローチャートである。
【図５】培地ドロップの縁に現れる影について説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を適用した具体的な実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。
【００２１】
図１は、本発明を適用した培養観察装置が備える観察ユニットの一実施の形態の構成例を示す図である。
【００２２】
図１において、観察ユニット１１は、ユニット本体１２の上側にアーム部１３およびステージ１４が配設されて構成されており、アーム部１３およびステージ１４が、受精卵の培養に適した環境に保持される培養観察装置のインキュベータの内部に配置される。そして、インキュベータの内部では複数の培養容器（ディッシュまたはウェルプレート）において受精卵が培養されており、例えば、観察スケジュールに従って観察対象となった培養容器１５がロボットアームなどによりステージ１４に載置され、培養容器１５内で培養されている受精卵の観察が行われる。
【００２３】
アーム部１３は、ステージ１４の側方から上方に延びてステージ１４の上側に張り出した形状をしており、ＬＥＤ（Light Emitting Diode）光源３１および照明光学系３２を収納している。ＬＥＤ光源３１から出力される照明光は、照明光学系３２を介して培養容器１５に照射される。
【００２４】
ユニット本体１２は、観察光学系３３、撮像部３４、および画像処理部３５を収納している。観察光学系３３は、照明光学系３２から培養容器１５に照射される照明光の光軸上に配置され、観察光学系３３を介して観察光が撮像部３４に入射し、撮像部３４は培養容器１５内の受精卵を撮像する。
【００２５】
そして、撮像部３４により撮像された画像は、画像処理部３５において画像処理が施される。例えば、観察ユニット１１では、低倍率にて観察範囲の全領域（ディッシュ内の培地ドロップ全体、または、ウェルプレートの穴の全体）を観察する処理が行われ、撮像部３４により撮像された画像を画像処理して受精卵が探索される。その後、それぞれの受精卵を高倍率で観察する処理が行われ、受精卵の状態が詳細に観察される。
【００２６】
さらに、観察ユニット１１では、培養容器１５の種類に応じて、例えば、培養容器１５がディッシュおよびウェルプレートのいずれであるかに応じて、照明光学系３２と観察光学系３３とを調整することができる。即ち、観察ユニット１１は、培養容器１５の種類を検出する検出部２１、照明光学系３２を調整する照明光学系調整部２２、観察光学系３３を調整する観察光学系調整部２３、および、検出部２１の検出結果に従って照明光学系調整部２２および観察光学系調整部２３を制御するコントロール部２４を備えている。
【００２７】
照明光学系３２は、ＬＥＤ光源３１の各点からの光束を集光するコレクタレンズ４１と、照明光学系３２の光軸方向に移動可能でかつ開口部の径が可変な絞り４２Ａ（図２）と、絞り４２が照明光学系３２の光路から退避したときに、開口絞りとなる開口絞り４３（図２）と、絞り４２又は開口絞り４３の開口部を通過した光束を集光するコンデンサレンズ４４と、高倍観察時に照明光学系３２の光路上に配置される高倍観察用コンデンサレンズ４５とからなる。
【００２８】
コレクタレンズ４１はＬＥＤ光源３１の各点からの光束を平行にする。絞り４２又は開口絞り４２を経た平行な光束はコンデンサレンズ４４又は高倍観察用コンデンサレンズ４５により集光している。この照明光学系３２は説明を簡単にするために、クリティカル照明を例示している。しかしながら、本発明は完全に光源と試料とが共役関係を有する照明光学系に限られず、光源と試料とが共役な関係となる必要は無い。
【００２９】
検出部２１は、例えば、培養容器１５に貼付されているラベルなどを読み取るセンサである。培養容器１５のラベルには、例えば、培養容器１５の種類（ディッシュまたはウェルプレート）、培養している受精卵に関する情報などが記述されており、検出部２１は、ラベルを読み取って培養容器１５の種類を取得し、コントロール部２４に供給する。
【００３０】
照明光学系調整部２２は、図２を参照して後述するように、照明光学系３２の光軸からコンデンサレンズを構成するレンズ要素の一つを光軸上から抜き差しできるようにコンデンサレンズ駆動手段２２ａを具備し、また、他にも光軸上のコレクタレンズの焦点位置に配置される絞りを切り替えたり、光軸方向に絞りを移動させたりして、照明光学系３２の調整を行う。また、観察光学系調整部２３は、図２を参照して後述するように、光軸上に配置される対物レンズを切り替えたり、位相リングまたはホフマンモジュレーション絞りなどを光軸上に挿脱したりして、観察光学系３３の調整を行う。
【００３１】
コントロール部２４は、低倍率および高倍率のどちらで観察を行うか、並びに、培養容器１５がディッシュおよびウェルプレートのいずれであるかに基づいて、照明光学系調整部２２および観察光学系調整部２３に対する制御を行い、良好な観察が行えるように照明光学系３２および観察光学系３３を調整させる。
【００３２】
図２を参照して、良好な観察が行えるように調整された照明光学系３２および観察光学系３３について説明する。
【００３３】
照明光学系３２は、コレクタレンズ４１、絞り４２Ａ、リング絞り４２Ｂ、ホフマンモジュレーション絞りであるＭＣ絞り４２Ｃ、開口絞り４３、コンデンサレンズ４４、および高倍観察用コンデンサレンズ４５を有している。照明光学系３２では、照明光学系調整部２２により、絞り４２Ａ、リング絞り４２Ｂ、またはＭＣ絞り４２Ｃのうちの、光軸上に挿入されるものが切り替え可能とされるとともに、それぞれが光軸方向に沿って移動可能とされている。
【００３４】
観察光学系３３は、対物レンズ５１Ａ乃至５１Ｄが図示されていないレボルバー機構により光軸に対して挿脱可能に具備されている。そして、対物レンズ５１Ｃと対物レンズ５１Ｄはそれぞれ、光軸を中心に位相膜がリング状に形成された位相板５２、または、ホフマンモジュレーションコントラス観察法用のモジュレータ５３を同一鏡筒内に具備している。また、レボルバー機構には、回転位置検出機構を有しており、レボルバーの回転位置に応じて、観察光学系３３の光路中にどの対物レンズが配置されているかを検出することができる。この回転位置検出機構はコントロール部２４と接続されており、回転位置検出機構の出力がコントロール部２４に供給される。
【００３５】
更に観察光学系３３は、図１に図示した第二対物レンズ５４を有しており、対物レンズ５１Ａ、５１Ｂ，５１Ｃ，５１Ｄのいずれかで集光した光束を、第二対物レンズ５４により集光することにより、試料の像を形成している。
【００３６】
また、対物レンズ５１Ａは、２倍または５倍程度の低倍率かつ高ＮＡ（Numerical Aperture：開口数）であり、対物レンズ５１Ｂは、２倍または５倍程度の低倍率かつ通常ＮＡ（例えば、ＮＡ＝0.5〜1.0程度）であり、対物レンズ５１Ｃは、高倍率かつ位相差観察用であり、対物レンズ５１Ｄは、高倍率かつホフマンモジュレーションコントラスト観察用である。また、他にも高倍率な明視野観察または暗視野観察が行える対物レンズを別途用意してもよい。観察光学系３３では、観察光学系調整部２３により、対物レンズ５１Ａ、対物レンズ５１Ｂ、および対物レンズ５１Ｃのうちの、光軸上に挿入されるものが切り替え可能とされるとともに、位相板５２およびモジュレータ５３が光軸上に挿脱可能とされている。
【００３７】
図２Ａには、観察倍率が低倍率で、かつ、培養容器１５がウェルプレート（９６ウェル）である観察条件での照明光学系３２および観察光学系３３が示されている。照明光学系３２は、ＬＥＤ光源３１と、ＬＥＤ光源３１の位置に焦点位置となるコレクタレンズ４１と、コレクタレンズ４１で集光された光束の一部を遮る絞り４２Ａと、絞り４２Ａを通過した光束を集光するコンデンサレンズ４４を有している。このとき、例えば、観察範囲の直径は約6.4ｍｍである。また、ウェルプレートの孔の深さは１０ｍｍ程度であり、かつウェルプレート中の培養液の液面までの深さは2.5ｍｍである。従って、ウェルプレートの孔の入口から液面まではおよそ7.5ｍｍとなる。
【００３８】
ところで、照明光学系の光軸に対してウェルプレートの側壁が平行であると仮定した場合、照野の各位置における照明光束の主光線の角度は、ウェルプレートの開口からウェルプレート中の培養液の液面までの間で、ウェルプレートの側壁となる部分によって蹴られないような角度で設定する必要がある。
【００３９】
このような観察条件において、絞り４２Ａの位置をコンデンサレンズ４４の光源側の焦点位置よりも、コレクタレンズ４１に近い領域内に配置する。これにより、ウェルプレートの入口に入射する各光束の主光線は、照明光学系３２の光軸に向かって収斂する方向で伝播する。そして、ウェルプレート中の培養液の液面で生ずるメニスカス効果により、その主光線は、発散する方向に屈折する。それゆえ、ウェルプレートの底では、全域にわたって照明することができる。これによりウェルプレートの側壁によって照明光束の主光線が遮られなくなる。一方、図２Ａに示すように、ウェルプレートの底を照らした各光束の主光線は、発散する方向に伝播しながら対物レンズの方に到達する。対物レンズ５１Ａでは、これらの光束を十分集光できるように低倍率かつ高ＮＡ（例えば、ＮＡ＝0.25程度）の対物レンズ５１Ａが光軸上に配置される。このように照野での一様性を確保するために、絞り４２Ａの位置が光軸方向に調整される。
【００４０】
一方、光軸から離れた位置でウェルプレート中の液面に到達する各光束のマージナルな光線もウェルプレートの側壁に遮られないようにする必要がある。マージナルな光線の角度範囲は、絞り４２Ａの開口部の大きさで調整することができる。また、対物レンズ５１Ａで外周領域を照明した照明光束の全てを集光できるようにするために、照明光学系の照明ＮＡは対物レンズ５１ＡのＮＡよりも小さくする。
【００４１】
このような構成の照明光学系３２により、絞り４２Ａの光軸上の位置と絞り４２Ａの開口部の大きさを調整することにより、ウェルプレートのような細胞等の試料を載置する容器の内径に比べて液面が深い位置にあるような観察試料においても、均一な照明ができる。さらに、観察光学系３３でＮＡの大きい対物レンズに換装することにより、培養容器１５であるウェルプレートの各凹部の培地の表面において外側に向かって屈折する光を観察光学系３３に導入することができる。
【００４２】
即ち、ウェルプレートの側壁によって生ずる液面の凹面化によるメニスカス効果により、ウェルプレートの凹部の外周部に到達する照明光が更にウェルプレートの中心から放射状に屈折されても、ウェルプレートを透過した光束を受けるのに十分な開口数を持った観察光学系の対物レンズ５１Ａを採用することにより、ウェルプレートの底面である培養領域全面を同時に観察可能とする光学系となり、ウェルプレートの穴の壁面付近に影が発生することが回避される。これにより、観察対象の受精卵が影に隠れることもなく、より良好な観察を行うことができる。また、このような観察においては、培養容器１５の全領域をムラなく照明するために、コヒーレント性のある低ＮＡの照明を行うことが好ましい。
【００４３】
図２Ｂには、観察倍率が低倍率で、かつ、培養容器１５がディッシュであり、観察試料が培地ドロップである観察条件での照明光学系３２および観察光学系３３が示されている。このとき、例えば、観察範囲の直径は約6ｍｍである。
【００４４】
このような観察条件において、側方から照明光束が入射しても、ウェルプレートのように側壁によって蹴られるということが無い。そのため、培地ドロップの外周側を照明する照明光束は、コンデンサレンズ４４によって光軸に対して外側から光軸に向かうように大きく偏向して培地ドロップに入射するようにしている。そのため、低倍率かつ通常ＮＡの対物レンズ５１Ｂが使用可能となる。
【００４５】
このようなことを同じ照明光学系で達成するために、絞り４２Ａの位置が、図２Ａの観察条件（観察倍率が低倍率で、かつ、培養容器１５がウェルプレートである観察条件）のときよりも光軸方向に沿ってコレクタレンズ４１側に移動されている。
【００４６】
このような構成の照明光学系３２および観察光学系３３により、培養容器１５であるディッシュ内の培地ドロップの表面において外側から照明光束を入射することで、観察光学系３３に照明光束を導入することができる。即ち、培地ドロップとオイルの界面による凸面メニスカスをキャンセルするような光学系となり、培地ドロップの縁の近傍に影が発生することが回避される。このように培地ドロップの中心部と末端部とにおいて光量に差が生じないため、観察対象の受精卵が影に隠れることもなく、より良好な観察を行うことができる。
【００４７】
ここで、図２Ａと図２Ｂとを比較すると、絞り４２Ａを光軸方向に沿って移動させることで、周辺から試料に集光する照明光の光束の光軸（破線で示されている光軸）の、照明光の中心の光束の光軸（一点鎖線で示されている光軸）に対する角度が変更されている。即ち、培養容器１５がウェルプレートである場合（図２Ａ）、この角度は狭くなり、培養容器１５がディッシュである場合（図２Ｂ）、この角度は広くなるように調整される。
【００４８】
図２Ｃは、図２Ａ及び図２Ｂに比べ、観察倍率が高倍率で、かつ、培養容器１５がウェルプレート（９６ウェル）である場合の照明状態を図示している。また、位相差観察を行う観察条件での照明光学系３２および観察光学系３３が示されている。
【００４９】
このような観察条件において、位相差観察を行うので、通常の絞り４２Ａに換えて、位相差観察用のリング絞り４２Ｂに換装する。また、高倍率（例えば、１０倍以上）観察であるので、観察する視野は限られた視野となる。その視野に照明するだけの照野を確保すればよい。そこで、その限られた照野において、大きい照明ＮＡで照明すると良い。そこで、この図２Ｃは、より大きな照明ＮＡを達成するために、正の屈折力を持つ高倍観察用コンデンサレンズ４５を更に追加している。一方、ウェルプレートの側壁に照明光束が遮られないようにするために、図２Ａで説明したように、リング絞り４２Ｂをコレクタレンズ４１の試料側の焦点位置よりもコレクタレンズ４１側に近い位置に設定している。
【００５０】
このようにすることで、高倍率で対物レンズ５１ＣのＮＡに見合った照明ＮＡでウェルプレート１５内の液中にある試料を観察することができる。
【００５１】
図２Ｄは、図２Ａ、図２Ｂの場合に比べ、観察倍率が高倍率で、かつ、培養容器１５がディッシュである場合の照明状態を図示している。また、ホフマンモジュレーション観察を行う観察条件での照明光学系３２および観察光学系３３が示されている。
【００５２】
このような観察条件においても、位相差観察と同様にホフマンモジュレーション用のＭＣ絞り４２Ｃをコレクタレンズ４１の試料側の焦点位置よりコレクタレンズ４１に近い位置に配置する。しかし、ホフマンモジュレーションコントラスト観察法の場合、位相物体の表面の角度に応じてコントラストがつくようにした観察手法であるため、培地ドロップの界面もコントラストが付く。そこで、この培地ドロップにより試料以外の形状でコントラストが付かないような照明光束の培地ドロップへの入射角度となるように、ＭＣ絞り４２の光軸上の位置を設定する。
【００５３】
具体的には対物レンズ５１Ｄの視野を照明する光束が培地ドロップの界面で垂直入射となるような角度に設定する。このようにすることで、培地ドロップによってコントラストが付くことを防げる。また、モジュレータ５３も試料によって屈折せず直進した光束については、遮光するように遮光部（透過率：０％）を設ける。遮光部以外の部分は、場所ごとに違う透過率を有するようにモジュレータ５３を形成している。例えば、モジュレータ５３は、ＭＣ絞り４２Ｃの開口部を通過した光束が集光する箇所で８％の透過率とし、８％の透過率の箇所および遮光部以外の部分は１００％の透過率として形成されている。
【００５４】
上述のように、試料が配置された容器の種類、又は試料が配置されている環境に応じて、照明光学系又は観察光学系をセットアップする一方、観察手法によってもこのセットアップを適当なものにすることができる。
【００５５】
そのために、本発明の実施の形態では、コントロール部２４が検出部２１で培養容器１５に付けられたラベルから培養容器の種類、その培養容器がディッシュである場合に、培地ドロップがあるのか否かの情報を取得し、一方、ユーザが選んだ対物レンズの情報を回転位置検出機構から取得する。そして、コントロール部２４は、入手したこれらの情報から最適な照明状態となるように可変絞りを移動し、高倍観察用コンデンサレンズ４５を光路中に挿入するように照明光学系調整部２２を制御している。
【００５６】
これにより、培養容器の種類が変わっても培養されている領域のほぼ全てが観察できる照明条件を設定することができる。
【００５７】
次に、図３は、コントロール部２４の処理を説明するフローチャートである。
【００５８】
ステージ１４に培養容器が配置されると、ステップＳ１において、検出部２１は培養容器に付されているラベルを読み取る。そのラベルの情報から、培養容器の種類が特定される。また、培養容器がディッシュの場合、培地ドロップを観察するのか、ディッシュの中に単に培養溶液で満たされているだけなのかもラベルに記録されているので、その情報も検出部２１で読み取る。
【００５９】
次に、ステップＳ２において、観察光学系３３の光路中に配置されている対物レンズを検出するために、回転位置検出機構の位置を検出する。なお、予めコントロール部２４にレボルバー機構の回転位置情報とその位置に配置された対物レンズの倍率および種類を登録しておく。コントロール部２４は、回転位置検出機構からの出力により、選ばれた対物レンズを認識する。
【００６０】
次に、ステップＳ３において、培養容器、培養状態、ならびに観察光学系３３に配置された対物レンズに応じて、最適な照明状態となるように絞り４２Ａの位置を変更するか、絞り４２Ａからリング絞り４２Ｂに交換するか、または絞り４２Ａに替えて、ＭＣ絞り４２Ｃに交換する。その判定基準は、図２に示した通りである。図２に則して、位相差観察用またはホフマンモジュレーションコントラスト観察用のいずれかが選択されたか、それとも通常の観察手法かに応じて、絞り４２Ａをリング絞り４２ＢまたはＭＣ絞り４２Ｃに交換するか否かを判定する。
【００６１】
次に、通常の観察手法の場合、選ばれた対物レンズが高倍か低倍かに応じて、絞り４２Ａの位置を決める。
【００６２】
なお、上述の説明では、ユーザが対物レンズを選択する例を例示したが、培養容器によって、対物レンズをコントロール部２４が自動的に選択することでもよい。その処理例を図４に示す。図４は、図１の観察ユニット１１が培養容器１５内の受精卵を観察する観察処理を説明するフローチャートである。
【００６３】
例えば、予め設定された観察スケジュールに従って、ステージ１４に培養容器１５が載置されると処理が開始され、ステップＳ１１において、検出部２１は、培養容器１５の種類を取得してコントロール部２４に供給し、コントロール部２４は、培養容器１５が、ディッシュおよびウェルプレートのいずれであるか判定する。
【００６４】
ステップＳ１１において、コントロール部２４が、培養容器１５はディッシュであると判定した場合、処理はステップＳ１２に進む。
【００６５】
ステップＳ１２において、コントロール部２４は、観察倍率が低倍率で、かつ、培養容器１５がディッシュである観察条件に応じた構成となるように、照明光学系調整部２２および観察光学系調整部２３に対する制御を行う。これにより、例えば、図２Ｂに示したように、照明光学系調整部２２が照明光学系３２に対する調整を行い、観察光学系調整部２３が観察光学系３３に対する調整を行う。即ち、培地ドロップによる凸面メニスカスをキャンセルするような光学系に調整される。
【００６６】
ステップＳ１２の処理後、処理はステップＳ１３に進み、観察ユニット１１では、低倍率での観察が行われ、培地ドロップ内の受精卵が探索される。このとき、メニスカス効果によって影が発生することが回避されるので、受精卵を容易に探索することができる。そして、培地ドロップ内における受精卵の位置を把握すると、処理はステップＳ１４に進む。
【００６７】
ステップＳ１４において、コントロール部２４は、観察倍率が高倍率で、かつ、培養容器１５がディッシュである観察条件に応じた構成となるように、照明光学系調整部２２および観察光学系調整部２３に対する制御を行う。これにより、例えば、図２Ｄに示したように、照明光学系調整部２２が照明光学系３２に対する調整を行い、観察光学系調整部２３が観察光学系３３に対する調整を行う。即ち、ＭＣ絞り４２Ｃ、高倍観察用コンデンサレンズ４５、およびモジュレータ５３が追加された光学系に調整される。
【００６８】
ステップＳ１４の処理後、処理はステップＳ１５に進み、観察ユニット１１では、高倍率での観察が行われ、受精卵の詳細な観察が行われる。ステップＳ１５の処理後、処理は終了される。
【００６９】
一方、ステップＳ１１において、コントロール部２４が、培養容器１５はウェルプレートであると判定した場合、処理はステップＳ１６に進む。
【００７０】
ステップＳ１６において、コントロール部２４は、観察倍率が低倍率で、かつ、培養容器１５がウェルプレートである観察条件に応じた構成となるように、照明光学系調整部２２および観察光学系調整部２３に対する制御を行う。これにより、例えば、図２Ａに示したように、照明光学系調整部２２が照明光学系３２に対する調整を行い、観察光学系調整部２３が観察光学系３３に対する調整を行う。即ち、ウェルプレートの穴による凹面メニスカスをキャンセルするような光学系に調整される。
【００７１】
ステップＳ１６の処理後、処理はステップＳ１７に進み、観察ユニット１１では、低倍率での観察が行われ、培地ドロップ内の受精卵が探索される。このとき、メニスカス効果によって影が発生することが回避されるので、受精卵を容易に探索することができる。また、ウェルプレートごとにメニスカスのＲ面形状が変わることによって像質劣化の影響が異なるため、絞り４２Ａの位置を調整することにより、像質劣化の影響が低減されるように調整する。そして、培地ドロップ内における受精卵の位置を把握すると、処理はステップＳ１８に進む。
【００７２】
ステップＳ１８において、コントロール部２４は、観察倍率が高倍率で、かつ、培養容器１５がウェルプレートである観察条件に応じた構成となるように、照明光学系調整部２２および観察光学系調整部２３に対する制御を行う。これにより、例えば、図２Ｃに示したように、照明光学系調整部２２が照明光学系３２に対する調整を行い、観察光学系調整部２３が観察光学系３３に対する調整を行う。即ち、リング絞り４２Ｂ、高倍観察用コンデンサレンズ４５、および位相板５２が追加された光学系に調整される。
【００７３】
ステップＳ１８の処理後、処理はステップＳ１９に進み、観察ユニット１１では、高倍率での観察が行われ、受精卵の詳細な観察が行われる。ステップＳ１９の処理後、処理は終了される。
【００７４】
以上のように、観察ユニット１１では、培養容器１５がディッシュおよびウェルプレートのいずれであるかに従って、それぞれの培養容器１５に適した光学系となるように照明光学系３２および観察光学系３３が調整されるので、培養容器１５の種類に依らず良好な観察を行うことができる。即ち、観察領域の全領域で受精卵の認識が可能であり、かつ、コントラストの高い像質を確保することができる。
【００７５】
また、例えば、絞り４２Ａを光軸方向に沿って移動可能とすることで、液面の曲率が諸条件によって変動しても、その変動に対応した照明を行うことができる。
【００７６】
また、例えば、位相差観察を行う際に、観察位置が培地ドロップの端末であるとき、リング絞り４２Ｂを光軸に対して直交する方向へ移動させることで、メニスカス効果によるリング絞り４２Ｂと位相板５２との位置関係を補正することが可能である。なお、このような補正に関しては、本願出願人が出願済みの特開２００９−１２２３５６号公報で詳細に説明されている。
【００７７】
また、コントロール部２４が、培地ドロップの中心座標を記憶しておき、リング絞り４２Ｂを光軸に対して直交する方向へ移動させる際に、培地ドロップの末端部分を観察するときに、位置の差分に対応した移動量で、リング絞り４２Ｂが自動的に移動するように構成することができる。また、培養容器１５の種類によってメニスカス形状に微妙な差異が発生するが、そのような差異に対して、リング絞り４２Ｂの位置を光軸方向に調整することによって対応することができる。
【００７８】
なお、本実施の形態においては、受精卵を観察するための光学系について説明したが、本発明は、通常の細胞観察にも適用することができる。また、例えば、微分干渉観察法、暗視野観察法、偏光観察法などが適用されてもよい。
【００７９】
また、検出部２１としては、培養容器１５のラベルを読み取るような構成のほか、例えば、ユーザが入力した培養容器１５の種類を取得するような構成にしてもよい。
【００８０】
なお、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。
【符号の説明】
【００８１】
１１ 観察ユニット， １２ ユニット本体， １３ アーム部， １４ ステージ， １５ 培養容器， ２１ 検出部， ２２ 照明光学系調整部， ２３ 観察光学系調整部， ２４ コントロール部， ３１ ＬＥＤ光源， ３２ 照明光学系， ３３ 観察光学系， ３４ 撮像部， ３５ 画像処理部， ４１ コレクタレンズ， ４２Ａ 絞り， ４２Ｂ リング絞り， ４２Ｃ ＭＣ絞り， ４３ 開口絞り， ４４ コンデンサレンズ， ４５ 高倍観察用コンデンサレンズ， ５１Ａ乃至５１Ｄ 対物レンズ， ５２ 位相板， ５３ モジュレータ， ５４ 第二対物レンズ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、観察装置に関し、特に、良好な観察ができるようにした観察装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、体外受精（ＩＶＦ：In-vitro Fertilization）や、顕微授精（ＩＣＳＩ：Intracytoplasmic Sperm Injection）などにおいて、受精卵を培養して観察が行われる。受精卵の観察には、培地ドロップ観察方法とウェルプレートを使用した観察方法とがある。
【０００３】
培地ドロップ観察方法では、採取した受精卵を、培養容器（例えば、３５ｍｍDish）上に作られた２０μｌ程度の培地ドロップに１個ずつ入れる。培地ドロップの表面はミネラルオイルでコートされ、その状態で培養容器ごと、インキュベータと呼ばれる恒温恒湿度環境を持つ培養装置へ収容されて、培養が行われる。
【０００４】
ところで、培地ドロップ観察方法では、培養容器の培養ドロップ内に存在する受精卵を観察しようとする際に、培地ドロップの縁に受精卵が移動していたとき、培地ドロップの縁に現れる影に隠れてしまって、その受精卵を検出することができないことがある。
【０００５】
図５を参照して、培地ドロップの縁に現れる影について説明する。図５には、培養容器内の平面図と断面図が示されている。
【０００６】
培養容器１は、いわゆるディッシュからなり、その内径は約３５ｍｍである。培養容器１の底面には、２０μｌ程度の培地ドロップＤが複数個（図１０の例では８個）、培養容器１の円周に沿って均等に並べられて形成されている。
【０００７】
個々の培地ドロップＤの表面および間隔は、乾燥を防ぐために無色透明のミネラルオイルＯで満たされており、個々の培地ドロップＤの中には、共通の母体から共通の時期に採取された受精卵ａが１個ずつ入っている。個々の培地ドロップＤの直径は、約７ｍｍであり、個々の受精卵ａの直径は、約１００μｍである。また、培地ドロップＤは、培養容器１の底面に付着しているが、受精卵ａは、培地ドロップＤの内部を浮遊する可能性がある。
【０００８】
このように培地ドロップＤ内にある受精卵ａを観察する際、上側から照明光が照射され、下側に配置されている対物レンズを介して画像が撮像される。
【０００９】
このとき、培地ドロップＤとミネラルオイルＯとの屈折率の違いにより、メニスカス効果が発生する。例えば、培地ドロップＤの屈折率が１．３程度であり、ミネラルオイルＯの屈折率が1.4〜1.6程度であるとき、ミネラルオイルＯと培地ドロップＤとの境界面で、光学的に強い凹レンズ（ｆ＝−１４前後）と同じ効果が発生する。そのため、培地ドロップＤの縁近辺に入射した照明光が培地ドロップＤの外側に屈折される。これにより、培地ドロップＤの縁近辺に入射した照明光が対物レンズに入射し難くなるため、培地ドロップＤの縁の全周に影が現れる。
【００１０】
一方、培養容器１の内壁面におけるミネラルオイルＯの表面張力によっても、ミネラルオイルＯと液面との境界面で、メニスカス効果である凹レンズと同じ効果が発生してしまう。これにより、培養容器１の縁近辺に入射した照明光が対物レンズに入射し難くなるため、培地ドロップＤの培養容器１内壁面側に三日月のような形状の影（培養容器１に対する培地ドロップＤの内側と外側とで非対称な影）が現れる。
【００１１】
また、ウェルプレートを使用した観察方法では、例えば、４〜９６ウェルプレート内の穴に培地を入れ、その培地の中に受精卵を入れて培養が行われる。このとき、ウェルプレートの穴の内壁面における培地の表面張力により、ウェルプレートの穴の縁においてもメニスカス効果が発生するため、受精卵を観察する際に、この影に受精卵が隠れてしまって、観察が困難になる。
【００１２】
そこで、本願出願人は、液面やミネラルオイルＯと培地ドロップの境界面によるメニスカス効果による影響を打ち消すように位相差リングを移動させることができる位相差顕微鏡を提案している（特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開２００９−１２２３５６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
ところで、培養容器の種類によってメニスカス効果の影響が異なっており、ある種類の培養容器において良好な観察を行えるように光学系を設定しても、他の種類の培養容器では良好な観察を行うことができないことがあった。従って、培養容器の種類に依らず、良好な観察を行うことができるような観察装置が求められていた。
【００１５】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、良好な観察ができるようにするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の観察装置は、液体中に存在している試料を観察する観察装置において、前記試料にある角度範囲にわたって照明光を照射し、その試料からの光を集光する光学系と、前記試料が収納される培養容器の種類を取得する取得手段と、前記培養容器の種類に応じて、前記光学系を調整する調整手段とを備えることを特徴とする。
【００１７】
本発明の観察装置においては、液体中に存在している試料が前記液体と共に収納される培養容器の種類が取得され、培養容器の種類に応じて光学系が調整される。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の観察装置によれば、良好な観察ができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明を適用した培養観察装置が備える観察ユニットの一実施の形態の構成例を示す図である。
【図２】観察条件ごとの照明光学系および観察光学系について説明する図である。
【図３】コントロール部の処理を説明するフローチャートである。
【図４】観察処理を説明するフローチャートである。
【図５】培地ドロップの縁に現れる影について説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を適用した具体的な実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。
【００２１】
図１は、本発明を適用した培養観察装置が備える観察ユニットの一実施の形態の構成例を示す図である。
【００２２】
図１において、観察ユニット１１は、ユニット本体１２の上側にアーム部１３およびステージ１４が配設されて構成されており、アーム部１３およびステージ１４が、受精卵の培養に適した環境に保持される培養観察装置のインキュベータの内部に配置される。そして、インキュベータの内部では複数の培養容器（ディッシュまたはウェルプレート）において受精卵が培養されており、例えば、観察スケジュールに従って観察対象となった培養容器１５がロボットアームなどによりステージ１４に載置され、培養容器１５内で培養されている受精卵の観察が行われる。
【００２３】
アーム部１３は、ステージ１４の側方から上方に延びてステージ１４の上側に張り出した形状をしており、ＬＥＤ（Light Emitting Diode）光源３１および照明光学系３２を収納している。ＬＥＤ光源３１から出力される照明光は、照明光学系３２を介して培養容器１５に照射される。
【００２４】
ユニット本体１２は、観察光学系３３、撮像部３４、および画像処理部３５を収納している。観察光学系３３は、照明光学系３２から培養容器１５に照射される照明光の光軸上に配置され、観察光学系３３を介して観察光が撮像部３４に入射し、撮像部３４は培養容器１５内の受精卵を撮像する。
【００２５】
そして、撮像部３４により撮像された画像は、画像処理部３５において画像処理が施される。例えば、観察ユニット１１では、低倍率にて観察範囲の全領域（ディッシュ内の培地ドロップ全体、または、ウェルプレートの穴の全体）を観察する処理が行われ、撮像部３４により撮像された画像を画像処理して受精卵が探索される。その後、それぞれの受精卵を高倍率で観察する処理が行われ、受精卵の状態が詳細に観察される。
【００２６】
さらに、観察ユニット１１では、培養容器１５の種類に応じて、例えば、培養容器１５がディッシュおよびウェルプレートのいずれであるかに応じて、照明光学系３２と観察光学系３３とを調整することができる。即ち、観察ユニット１１は、培養容器１５の種類を検出する検出部２１、照明光学系３２を調整する照明光学系調整部２２、観察光学系３３を調整する観察光学系調整部２３、および、検出部２１の検出結果に従って照明光学系調整部２２および観察光学系調整部２３を制御するコントロール部２４を備えている。
【００２７】
照明光学系３２は、ＬＥＤ光源３１の各点からの光束を集光するコレクタレンズ４１と、照明光学系３２の光軸方向に移動可能でかつ開口部の径が可変な絞り４２Ａ（図２）と、絞り４２が照明光学系３２の光路から退避したときに、開口絞りとなる開口絞り４３（図２）と、絞り４２又は開口絞り４３の開口部を通過した光束を集光するコンデンサレンズ４４と、高倍観察時に照明光学系３２の光路上に配置される高倍観察用コンデンサレンズ４５とからなる。
【００２８】
コレクタレンズ４１はＬＥＤ光源３１の各点からの光束を平行にする。絞り４２又は開口絞り４２を経た平行な光束はコンデンサレンズ４４又は高倍観察用コンデンサレンズ４５により集光している。この照明光学系３２は説明を簡単にするために、クリティカル照明を例示している。しかしながら、本発明は完全に光源と試料とが共役関係を有する照明光学系に限られず、光源と試料とが共役な関係となる必要は無い。
【００２９】
検出部２１は、例えば、培養容器１５に貼付されているラベルなどを読み取るセンサである。培養容器１５のラベルには、例えば、培養容器１５の種類（ディッシュまたはウェルプレート）、培養している受精卵に関する情報などが記述されており、検出部２１は、ラベルを読み取って培養容器１５の種類を取得し、コントロール部２４に供給する。
【００３０】
照明光学系調整部２２は、図２を参照して後述するように、照明光学系３２の光軸からコンデンサレンズを構成するレンズ要素の一つを光軸上から抜き差しできるようにコンデンサレンズ駆動手段２２ａを具備し、また、他にも光軸上のコレクタレンズの焦点位置に配置される絞りを切り替えたり、光軸方向に絞りを移動させたりして、照明光学系３２の調整を行う。また、観察光学系調整部２３は、図２を参照して後述するように、光軸上に配置される対物レンズを切り替えたり、位相リングまたはホフマンモジュレーション絞りなどを光軸上に挿脱したりして、観察光学系３３の調整を行う。
【００３１】
コントロール部２４は、低倍率および高倍率のどちらで観察を行うか、並びに、培養容器１５がディッシュおよびウェルプレートのいずれであるかに基づいて、照明光学系調整部２２および観察光学系調整部２３に対する制御を行い、良好な観察が行えるように照明光学系３２および観察光学系３３を調整させる。
【００３２】
図２を参照して、良好な観察が行えるように調整された照明光学系３２および観察光学系３３について説明する。
【００３３】
照明光学系３２は、コレクタレンズ４１、絞り４２Ａ、リング絞り４２Ｂ、ホフマンモジュレーション絞りであるＭＣ絞り４２Ｃ、開口絞り４３、コンデンサレンズ４４、および高倍観察用コンデンサレンズ４５を有している。照明光学系３２では、照明光学系調整部２２により、絞り４２Ａ、リング絞り４２Ｂ、またはＭＣ絞り４２Ｃのうちの、光軸上に挿入されるものが切り替え可能とされるとともに、それぞれが光軸方向に沿って移動可能とされている。
【００３４】
観察光学系３３は、対物レンズ５１Ａ乃至５１Ｄが図示されていないレボルバー機構により光軸に対して挿脱可能に具備されている。そして、対物レンズ５１Ｃと対物レンズ５１Ｄはそれぞれ、光軸を中心に位相膜がリング状に形成された位相板５２、または、ホフマンモジュレーションコントラス観察法用のモジュレータ５３を同一鏡筒内に具備している。また、レボルバー機構には、回転位置検出機構を有しており、レボルバーの回転位置に応じて、観察光学系３３の光路中にどの対物レンズが配置されているかを検出することができる。この回転位置検出機構はコントロール部２４と接続されており、回転位置検出機構の出力がコントロール部２４に供給される。
【００３５】
更に観察光学系３３は、図１に図示した第二対物レンズ５４を有しており、対物レンズ５１Ａ、５１Ｂ，５１Ｃ，５１Ｄのいずれかで集光した光束を、第二対物レンズ５４により集光することにより、試料の像を形成している。
【００３６】
また、対物レンズ５１Ａは、２倍または５倍程度の低倍率かつ高ＮＡ（Numerical Aperture：開口数）であり、対物レンズ５１Ｂは、２倍または５倍程度の低倍率かつ通常ＮＡ（例えば、ＮＡ＝0.5〜1.0程度）であり、対物レンズ５１Ｃは、高倍率かつ位相差観察用であり、対物レンズ５１Ｄは、高倍率かつホフマンモジュレーションコントラスト観察用である。また、他にも高倍率な明視野観察または暗視野観察が行える対物レンズを別途用意してもよい。観察光学系３３では、観察光学系調整部２３により、対物レンズ５１Ａ、対物レンズ５１Ｂ、および対物レンズ５１Ｃのうちの、光軸上に挿入されるものが切り替え可能とされるとともに、位相板５２およびモジュレータ５３が光軸上に挿脱可能とされている。
【００３７】
図２Ａには、観察倍率が低倍率で、かつ、培養容器１５がウェルプレート（９６ウェル）である観察条件での照明光学系３２および観察光学系３３が示されている。照明光学系３２は、ＬＥＤ光源３１と、ＬＥＤ光源３１の位置に焦点位置となるコレクタレンズ４１と、コレクタレンズ４１で集光された光束の一部を遮る絞り４２Ａと、絞り４２Ａを通過した光束を集光するコンデンサレンズ４４を有している。このとき、例えば、観察範囲の直径は約6.4ｍｍである。また、ウェルプレートの孔の深さは１０ｍｍ程度であり、かつウェルプレート中の培養液の液面までの深さは2.5ｍｍである。従って、ウェルプレートの孔の入口から液面まではおよそ7.5ｍｍとなる。
【００３８】
ところで、照明光学系の光軸に対してウェルプレートの側壁が平行であると仮定した場合、照野の各位置における照明光束の主光線の角度は、ウェルプレートの開口からウェルプレート中の培養液の液面までの間で、ウェルプレートの側壁となる部分によって蹴られないような角度で設定する必要がある。
【００３９】
このような観察条件において、絞り４２Ａの位置をコンデンサレンズ４４の光源側の焦点位置よりも、コレクタレンズ４１に近い領域内に配置する。これにより、ウェルプレートの入口に入射する各光束の主光線は、照明光学系３２の光軸に向かって収斂する方向で伝播する。そして、ウェルプレート中の培養液の液面で生ずるメニスカス効果により、その主光線は、発散する方向に屈折する。それゆえ、ウェルプレートの底では、全域にわたって照明することができる。これによりウェルプレートの側壁によって照明光束の主光線が遮られなくなる。一方、図２Ａに示すように、ウェルプレートの底を照らした各光束の主光線は、発散する方向に伝播しながら対物レンズの方に到達する。対物レンズ５１Ａでは、これらの光束を十分集光できるように低倍率かつ高ＮＡ（例えば、ＮＡ＝0.25程度）の対物レンズ５１Ａが光軸上に配置される。このように照野での一様性を確保するために、絞り４２Ａの位置が光軸方向に調整される。
【００４０】
一方、光軸から離れた位置でウェルプレート中の液面に到達する各光束のマージナルな光線もウェルプレートの側壁に遮られないようにする必要がある。マージナルな光線の角度範囲は、絞り４２Ａの開口部の大きさで調整することができる。また、対物レンズ５１Ａで外周領域を照明した照明光束の全てを集光できるようにするために、照明光学系の照明ＮＡは対物レンズ５１ＡのＮＡよりも小さくする。
【００４１】
このような構成の照明光学系３２により、絞り４２Ａの光軸上の位置と絞り４２Ａの開口部の大きさを調整することにより、ウェルプレートのような細胞等の試料を載置する容器の内径に比べて液面が深い位置にあるような観察試料においても、均一な照明ができる。さらに、観察光学系３３でＮＡの大きい対物レンズに換装することにより、培養容器１５であるウェルプレートの各凹部の培地の表面において外側に向かって屈折する光を観察光学系３３に導入することができる。
【００４２】
即ち、ウェルプレートの側壁によって生ずる液面の凹面化によるメニスカス効果により、ウェルプレートの凹部の外周部に到達する照明光が更にウェルプレートの中心から放射状に屈折されても、ウェルプレートを透過した光束を受けるのに十分な開口数を持った観察光学系の対物レンズ５１Ａを採用することにより、ウェルプレートの底面である培養領域全面を同時に観察可能とする光学系となり、ウェルプレートの穴の壁面付近に影が発生することが回避される。これにより、観察対象の受精卵が影に隠れることもなく、より良好な観察を行うことができる。また、このような観察においては、培養容器１５の全領域をムラなく照明するために、コヒーレント性のある低ＮＡの照明を行うことが好ましい。
【００４３】
図２Ｂには、観察倍率が低倍率で、かつ、培養容器１５がディッシュであり、観察試料が培地ドロップである観察条件での照明光学系３２および観察光学系３３が示されている。このとき、例えば、観察範囲の直径は約6ｍｍである。
【００４４】
このような観察条件において、側方から照明光束が入射しても、ウェルプレートのように側壁によって蹴られるということが無い。そのため、培地ドロップの外周側を照明する照明光束は、コンデンサレンズ４４によって光軸に対して外側から光軸に向かうように大きく偏向して培地ドロップに入射するようにしている。そのため、低倍率かつ通常ＮＡの対物レンズ５１Ｂが使用可能となる。
【００４５】
このようなことを同じ照明光学系で達成するために、絞り４２Ａの位置が、図２Ａの観察条件（観察倍率が低倍率で、かつ、培養容器１５がウェルプレートである観察条件）のときよりも光軸方向に沿ってコレクタレンズ４１側に移動されている。
【００４６】
このような構成の照明光学系３２および観察光学系３３により、培養容器１５であるディッシュ内の培地ドロップの表面において外側から照明光束を入射することで、観察光学系３３に照明光束を導入することができる。即ち、培地ドロップとオイルの界面による凸面メニスカスをキャンセルするような光学系となり、培地ドロップの縁の近傍に影が発生することが回避される。このように培地ドロップの中心部と末端部とにおいて光量に差が生じないため、観察対象の受精卵が影に隠れることもなく、より良好な観察を行うことができる。
【００４７】
ここで、図２Ａと図２Ｂとを比較すると、絞り４２Ａを光軸方向に沿って移動させることで、周辺から試料に集光する照明光の光束の光軸（破線で示されている光軸）の、照明光の中心の光束の光軸（一点鎖線で示されている光軸）に対する角度が変更されている。即ち、培養容器１５がウェルプレートである場合（図２Ａ）、この角度は狭くなり、培養容器１５がディッシュである場合（図２Ｂ）、この角度は広くなるように調整される。
【００４８】
図２Ｃは、図２Ａ及び図２Ｂに比べ、観察倍率が高倍率で、かつ、培養容器１５がウェルプレート（９６ウェル）である場合の照明状態を図示している。また、位相差観察を行う観察条件での照明光学系３２および観察光学系３３が示されている。
【００４９】
このような観察条件において、位相差観察を行うので、通常の絞り４２Ａに換えて、位相差観察用のリング絞り４２Ｂに換装する。また、高倍率（例えば、１０倍以上）観察であるので、観察する視野は限られた視野となる。その視野に照明するだけの照野を確保すればよい。そこで、その限られた照野において、大きい照明ＮＡで照明すると良い。そこで、この図２Ｃは、より大きな照明ＮＡを達成するために、正の屈折力を持つ高倍観察用コンデンサレンズ４５を更に追加している。一方、ウェルプレートの側壁に照明光束が遮られないようにするために、図２Ａで説明したように、リング絞り４２Ｂをコレクタレンズ４１の試料側の焦点位置よりもコレクタレンズ４１側に近い位置に設定している。
【００５０】
このようにすることで、高倍率で対物レンズ５１ＣのＮＡに見合った照明ＮＡでウェルプレート１５内の液中にある試料を観察することができる。
【００５１】
図２Ｄは、図２Ａ、図２Ｂの場合に比べ、観察倍率が高倍率で、かつ、培養容器１５がディッシュである場合の照明状態を図示している。また、ホフマンモジュレーション観察を行う観察条件での照明光学系３２および観察光学系３３が示されている。
【００５２】
このような観察条件においても、位相差観察と同様にホフマンモジュレーション用のＭＣ絞り４２Ｃをコレクタレンズ４１の試料側の焦点位置よりコレクタレンズ４１に近い位置に配置する。しかし、ホフマンモジュレーションコントラスト観察法の場合、位相物体の表面の角度に応じてコントラストがつくようにした観察手法であるため、培地ドロップの界面もコントラストが付く。そこで、この培地ドロップにより試料以外の形状でコントラストが付かないような照明光束の培地ドロップへの入射角度となるように、ＭＣ絞り４２の光軸上の位置を設定する。
【００５３】
具体的には対物レンズ５１Ｄの視野を照明する光束が培地ドロップの界面で垂直入射となるような角度に設定する。このようにすることで、培地ドロップによってコントラストが付くことを防げる。また、モジュレータ５３も試料によって屈折せず直進した光束については、遮光するように遮光部（透過率：０％）を設ける。遮光部以外の部分は、場所ごとに違う透過率を有するようにモジュレータ５３を形成している。例えば、モジュレータ５３は、ＭＣ絞り４２Ｃの開口部を通過した光束が集光する箇所で８％の透過率とし、８％の透過率の箇所および遮光部以外の部分は１００％の透過率として形成されている。
【００５４】
上述のように、試料が配置された容器の種類、又は試料が配置されている環境に応じて、照明光学系又は観察光学系をセットアップする一方、観察手法によってもこのセットアップを適当なものにすることができる。
【００５５】
そのために、本発明の実施の形態では、コントロール部２４が検出部２１で培養容器１５に付けられたラベルから培養容器の種類、その培養容器がディッシュである場合に、培地ドロップがあるのか否かの情報を取得し、一方、ユーザが選んだ対物レンズの情報を回転位置検出機構から取得する。そして、コントロール部２４は、入手したこれらの情報から最適な照明状態となるように可変絞りを移動し、高倍観察用コンデンサレンズ４５を光路中に挿入するように照明光学系調整部２２を制御している。
【００５６】
これにより、培養容器の種類が変わっても培養されている領域のほぼ全てが観察できる照明条件を設定することができる。
【００５７】
次に、図３は、コントロール部２４の処理を説明するフローチャートである。
【００５８】
ステージ１４に培養容器が配置されると、ステップＳ１において、検出部２１は培養容器に付されているラベルを読み取る。そのラベルの情報から、培養容器の種類が特定される。また、培養容器がディッシュの場合、培地ドロップを観察するのか、ディッシュの中に単に培養溶液で満たされているだけなのかもラベルに記録されているので、その情報も検出部２１で読み取る。
【００５９】
次に、ステップＳ２において、観察光学系３３の光路中に配置されている対物レンズを検出するために、回転位置検出機構の位置を検出する。なお、予めコントロール部２４にレボルバー機構の回転位置情報とその位置に配置された対物レンズの倍率および種類を登録しておく。コントロール部２４は、回転位置検出機構からの出力により、選ばれた対物レンズを認識する。
【００６０】
次に、ステップＳ３において、培養容器、培養状態、ならびに観察光学系３３に配置された対物レンズに応じて、最適な照明状態となるように絞り４２Ａの位置を変更するか、絞り４２Ａからリング絞り４２Ｂに交換するか、または絞り４２Ａに替えて、ＭＣ絞り４２Ｃに交換する。その判定基準は、図２に示した通りである。図２に則して、位相差観察用またはホフマンモジュレーションコントラスト観察用のいずれかが選択されたか、それとも通常の観察手法かに応じて、絞り４２Ａをリング絞り４２ＢまたはＭＣ絞り４２Ｃに交換するか否かを判定する。
【００６１】
次に、通常の観察手法の場合、選ばれた対物レンズが高倍か低倍かに応じて、絞り４２Ａの位置を決める。
【００６２】
なお、上述の説明では、ユーザが対物レンズを選択する例を例示したが、培養容器によって、対物レンズをコントロール部２４が自動的に選択することでもよい。その処理例を図４に示す。図４は、図１の観察ユニット１１が培養容器１５内の受精卵を観察する観察処理を説明するフローチャートである。
【００６３】
例えば、予め設定された観察スケジュールに従って、ステージ１４に培養容器１５が載置されると処理が開始され、ステップＳ１１において、検出部２１は、培養容器１５の種類を取得してコントロール部２４に供給し、コントロール部２４は、培養容器１５が、ディッシュおよびウェルプレートのいずれであるか判定する。
【００６４】
ステップＳ１１において、コントロール部２４が、培養容器１５はディッシュであると判定した場合、処理はステップＳ１２に進む。
【００６５】
ステップＳ１２において、コントロール部２４は、観察倍率が低倍率で、かつ、培養容器１５がディッシュである観察条件に応じた構成となるように、照明光学系調整部２２および観察光学系調整部２３に対する制御を行う。これにより、例えば、図２Ｂに示したように、照明光学系調整部２２が照明光学系３２に対する調整を行い、観察光学系調整部２３が観察光学系３３に対する調整を行う。即ち、培地ドロップによる凸面メニスカスをキャンセルするような光学系に調整される。
【００６６】
ステップＳ１２の処理後、処理はステップＳ１３に進み、観察ユニット１１では、低倍率での観察が行われ、培地ドロップ内の受精卵が探索される。このとき、メニスカス効果によって影が発生することが回避されるので、受精卵を容易に探索することができる。そして、培地ドロップ内における受精卵の位置を把握すると、処理はステップＳ１４に進む。
【００６７】
ステップＳ１４において、コントロール部２４は、観察倍率が高倍率で、かつ、培養容器１５がディッシュである観察条件に応じた構成となるように、照明光学系調整部２２および観察光学系調整部２３に対する制御を行う。これにより、例えば、図２Ｄに示したように、照明光学系調整部２２が照明光学系３２に対する調整を行い、観察光学系調整部２３が観察光学系３３に対する調整を行う。即ち、ＭＣ絞り４２Ｃ、高倍観察用コンデンサレンズ４５、およびモジュレータ５３が追加された光学系に調整される。
【００６８】
ステップＳ１４の処理後、処理はステップＳ１５に進み、観察ユニット１１では、高倍率での観察が行われ、受精卵の詳細な観察が行われる。ステップＳ１５の処理後、処理は終了される。
【００６９】
一方、ステップＳ１１において、コントロール部２４が、培養容器１５はウェルプレートであると判定した場合、処理はステップＳ１６に進む。
【００７０】
ステップＳ１６において、コントロール部２４は、観察倍率が低倍率で、かつ、培養容器１５がウェルプレートである観察条件に応じた構成となるように、照明光学系調整部２２および観察光学系調整部２３に対する制御を行う。これにより、例えば、図２Ａに示したように、照明光学系調整部２２が照明光学系３２に対する調整を行い、観察光学系調整部２３が観察光学系３３に対する調整を行う。即ち、ウェルプレートの穴による凹面メニスカスをキャンセルするような光学系に調整される。
【００７１】
ステップＳ１６の処理後、処理はステップＳ１７に進み、観察ユニット１１では、低倍率での観察が行われ、培地ドロップ内の受精卵が探索される。このとき、メニスカス効果によって影が発生することが回避されるので、受精卵を容易に探索することができる。また、ウェルプレートごとにメニスカスのＲ面形状が変わることによって像質劣化の影響が異なるため、絞り４２Ａの位置を調整することにより、像質劣化の影響が低減されるように調整する。そして、培地ドロップ内における受精卵の位置を把握すると、処理はステップＳ１８に進む。
【００７２】
ステップＳ１８において、コントロール部２４は、観察倍率が高倍率で、かつ、培養容器１５がウェルプレートである観察条件に応じた構成となるように、照明光学系調整部２２および観察光学系調整部２３に対する制御を行う。これにより、例えば、図２Ｃに示したように、照明光学系調整部２２が照明光学系３２に対する調整を行い、観察光学系調整部２３が観察光学系３３に対する調整を行う。即ち、リング絞り４２Ｂ、高倍観察用コンデンサレンズ４５、および位相板５２が追加された光学系に調整される。
【００７３】
ステップＳ１８の処理後、処理はステップＳ１９に進み、観察ユニット１１では、高倍率での観察が行われ、受精卵の詳細な観察が行われる。ステップＳ１９の処理後、処理は終了される。
【００７４】
以上のように、観察ユニット１１では、培養容器１５がディッシュおよびウェルプレートのいずれであるかに従って、それぞれの培養容器１５に適した光学系となるように照明光学系３２および観察光学系３３が調整されるので、培養容器１５の種類に依らず良好な観察を行うことができる。即ち、観察領域の全領域で受精卵の認識が可能であり、かつ、コントラストの高い像質を確保することができる。
【００７５】
また、例えば、絞り４２Ａを光軸方向に沿って移動可能とすることで、液面の曲率が諸条件によって変動しても、その変動に対応した照明を行うことができる。
【００７６】
また、例えば、位相差観察を行う際に、観察位置が培地ドロップの端末であるとき、リング絞り４２Ｂを光軸に対して直交する方向へ移動させることで、メニスカス効果によるリング絞り４２Ｂと位相板５２との位置関係を補正することが可能である。なお、このような補正に関しては、本願出願人が出願済みの特開２００９−１２２３５６号公報で詳細に説明されている。
【００７７】
また、コントロール部２４が、培地ドロップの中心座標を記憶しておき、リング絞り４２Ｂを光軸に対して直交する方向へ移動させる際に、培地ドロップの末端部分を観察するときに、位置の差分に対応した移動量で、リング絞り４２Ｂが自動的に移動するように構成することができる。また、培養容器１５の種類によってメニスカス形状に微妙な差異が発生するが、そのような差異に対して、リング絞り４２Ｂの位置を光軸方向に調整することによって対応することができる。
【００７８】
なお、本実施の形態においては、受精卵を観察するための光学系について説明したが、本発明は、通常の細胞観察にも適用することができる。また、例えば、微分干渉観察法、暗視野観察法、偏光観察法などが適用されてもよい。
【００７９】
また、検出部２１としては、培養容器１５のラベルを読み取るような構成のほか、例えば、ユーザが入力した培養容器１５の種類を取得するような構成にしてもよい。
【００８０】
なお、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。
【符号の説明】
【００８１】
１１ 観察ユニット， １２ ユニット本体， １３ アーム部， １４ ステージ， １５ 培養容器， ２１ 検出部， ２２ 照明光学系調整部， ２３ 観察光学系調整部， ２４ コントロール部， ３１ ＬＥＤ光源， ３２ 照明光学系， ３３ 観察光学系， ３４ 撮像部， ３５ 画像処理部， ４１ コレクタレンズ， ４２Ａ 絞り， ４２Ｂ リング絞り， ４２Ｃ ＭＣ絞り， ４３ 開口絞り， ４４ コンデンサレンズ， ４５ 高倍観察用コンデンサレンズ， ５１Ａ乃至５１Ｄ 対物レンズ， ５２ 位相板， ５３ モジュレータ， ５４ 第二対物レンズ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養容器中に液体と共に収容された試料に照明光を照射し、その試料からの光を集光する光学系と、
前記試料が収納される培養容器の種類を取得する取得手段と、
前記培養容器の種類に応じて、前記光学系による前記試料への照明状態を調整する調整手段と
を備えることを特徴とする観察装置。
【請求項２】
前記光学系は、前記試料に照明光を照射するための照明光学系を含み、
前記照明光学系は、前記照明光学系の光軸から離れた位置から前記試料に到達する照明光の光束の主光線の、前記照明光学系の光軸に対する角度を変更する変更手段を有しており、
前記調整手段は、前記培養容器に応じて、前記変更手段を制御する
ことを特徴とする請求項１に記載の観察装置。
【請求項３】
前記変更手段は、前記照明光学系に配置された絞り部材を前記照明光学系の光軸方向に移動させる絞り部材駆動手段
を備えたことを特徴とする請求項２に記載の観察装置。
【請求項４】
前記光学系は、更に前記照明光学系で照明された前記試料の像を結像する観察光学系を有し、
前記観察光学系は、複数の対物レンズを保持可能とする対物レンズ交換機構に保持されたいずれか一つの対物レンズを含み、
前記調整手段は、前記培養容器に応じて、前記対物レンズ交換機構に保持された複数の対物レンズのうち一つを選択して、前記選択された対物レンズが前記観察光学系の光軸上に配置されるように前記対物レンズ交換機構を制御する
ことを特徴とする請求項３に記載の観察装置。
【請求項５】
前記調整手段は、更に前記対物レンズに応じて、前記変更手段を制御する
ことを特徴とする請求項４に記載の観察装置。
【請求項１】
培養容器中に液体と共に収容された試料に照明光を照射し、その試料からの光を集光する光学系と、
前記試料が収納される培養容器の種類を取得する取得手段と、
前記培養容器の種類に応じて、前記光学系による前記試料への照明状態を調整する調整手段と
を備えることを特徴とする観察装置。
【請求項２】
前記光学系は、前記試料に照明光を照射するための照明光学系を含み、
前記照明光学系は、前記照明光学系の光軸から離れた位置から前記試料に到達する照明光の光束の主光線の、前記照明光学系の光軸に対する角度を変更する変更手段を有しており、
前記調整手段は、前記培養容器に応じて、前記変更手段を制御する
ことを特徴とする請求項１に記載の観察装置。
【請求項３】
前記変更手段は、前記照明光学系に配置された絞り部材を前記照明光学系の光軸方向に移動させる絞り部材駆動手段
を備えたことを特徴とする請求項２に記載の観察装置。
【請求項４】
前記光学系は、更に前記照明光学系で照明された前記試料の像を結像する観察光学系を有し、
前記観察光学系は、複数の対物レンズを保持可能とする対物レンズ交換機構に保持されたいずれか一つの対物レンズを含み、
前記調整手段は、前記培養容器に応じて、前記対物レンズ交換機構に保持された複数の対物レンズのうち一つを選択して、前記選択された対物レンズが前記観察光学系の光軸上に配置されるように前記対物レンズ交換機構を制御する
ことを特徴とする請求項３に記載の観察装置。
【請求項５】
前記調整手段は、更に前記対物レンズに応じて、前記変更手段を制御する
ことを特徴とする請求項４に記載の観察装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１２−１４７７３９（Ｐ２０１２−１４７７３９Ａ）
【公開日】平成２４年８月９日（２０１２．８．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−９９８４（Ｐ２０１１−９９８４）
【出願日】平成２３年１月２０日（２０１１．１．２０）
【出願人】（０００００４１１２）株式会社ニコン (12,601)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年８月９日（２０１２．８．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月２０日（２０１１．１．２０）
【出願人】（０００００４１１２）株式会社ニコン (12,601)
【Ｆターム（参考）】
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