試料中タンパク質の測定方法および測定キット
【課題】 測定に当たり高価な装置や器具を必要とせず、測定の操作が簡便であり、測定に要する時間が極めて短く、かつ試料中に微量に含まれるタンパク質をも測定することができる高感度な試料中のタンパク質の測定方法及び測定キットを提供する。
【解決手段】 試料中のタンパク質を測定するのに、次の各工程を含む測定方法により測定を行う。
１）試料、及びタンパク質と会合し凝集体を形成する色素を、接触させ、これにより、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる凝集体形成工程；
２）当該凝集体の形成後、当該凝集体を含む溶液の一定量を有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体に通す通流工程；及び
３）当該多孔性担体表面の色を測定する色測定工程。
また、試料中のタンパク質の測定キットであって、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素を含有する試薬、及び有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体を含むものよりなる。
【解決手段】 試料中のタンパク質を測定するのに、次の各工程を含む測定方法により測定を行う。
１）試料、及びタンパク質と会合し凝集体を形成する色素を、接触させ、これにより、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる凝集体形成工程；
２）当該凝集体の形成後、当該凝集体を含む溶液の一定量を有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体に通す通流工程；及び
３）当該多孔性担体表面の色を測定する色測定工程。
また、試料中のタンパク質の測定キットであって、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素を含有する試薬、及び有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体を含むものよりなる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に微量に含まれるタンパク質を、高感度かつ簡便に測定することができる測定方法及び測定キットに関する。
本発明は、分析化学、生命科学及び医療の分野において有用であり、特に臨床検査分野において有用なものである。
【背景技術】
【０００２】
血清又は血漿のタンパク質濃度は、脱水、網内系疾患又は慢性感染症等において高値となる。
また、血漿タンパクの漏出、栄養不良又は肝機能障害等において低値となる。
このように血清又は血漿のタンパク質濃度は、各種疾患又は各種病態に伴って変化するので、その測定は疾患の診断及び治療において重視されている。
【０００３】
また、尿中のタンパク質は、腎疾患、心疾患、血液疾患、黄だん又は高熱等において出現する。
この尿中のタンパク質を測定することも、前記疾患の診断及び治療にとって重要である。
特に、尿中の微量のアルブミンを測定することは、糖尿病性腎症などの早期発見等において、大変重要である。
【０００４】
従来の試料中のタンパク質の測定方法（測定キット）としては、まず、タンパク質と結合するとその色調を変える色素を担体に含浸させた試験片を用いる方法がある。
しかし、この試験片を用いる方法は、測定限界が１０〜２０ｍｇ／ｄＬであり、試料中に微量に含まれるタンパク質を測定することができないものであった。
また、この測定方法（測定キット）は、試料中の他の物質や非結合態色素の影響を受けて、測定誤差が生じる場合もあった。
【０００５】
また、タンパク質中の４個のペプチド結合がアルカリ溶液中で２価の銅イオンとキレート結合して紫色に発色する反応を利用するＢｉｕｒｅｔ法（ビュレット法）は、測定限界は１０ｍｇ／ｄＬであるが、測定の操作は煩雑であり、測定に時間が掛かるものであった。
【０００６】
そして、２価の銅イオンとフェノール試薬を用いるＬｏｗｒｙ法（ローリー法）は、測定限界が２．５ｍｇ／ｄＬと感度は高いが、やはり測定の操作は煩雑であり、測定に時間を要するものであった。
【０００７】
また、ピロガロールレッド・モリブデン錯体が酸性条件下でタンパク質と結合することにより青紫色に変色する反応を利用するピロガロールレッド・モリブデン錯体発色法は、測定限界が２ｍｇ／ｄＬと感度は高いが、やはり測定の操作は煩雑なものであり測定に時間が掛かるものであった。
【０００８】
また、木下らは、試料中のタンパク質をメンブランフィルタ上に濃縮し、その後フィルタをフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で蛍光染色し、洗浄後にスポットの蛍光強度を測定する方法を報告している。
しかしながら、この方法においては、タンパク質とＦＩＴＣとの反応に３０分も要し、また妨害物質を除去するために染色後には洗浄を必要とするという煩雑なものであった（非特許文献１参照。）。
【０００９】
そして、藤田らは、タンパク質と色素−金属錯体との沈殿会合体をフィルタで物理的に補集した後、水酸化ナトリウム水溶液で再溶解し、この溶液の吸光度を測定する方法を報告している。
しかしながら、この方法においては、沈殿物の目詰まりのため定量性が決して良好とは言えず、またフィルタ上の着色を観察するものではなく、再溶解液を測定するものであるため、簡易迅速な分析に適さないものであった（非特許文献２参照。）。
【００１０】
なお、尿中の微量アルブミンを測定する方法（測定試薬）として、免疫比濁法又はラテックス比濁法を測定原理とするものがある。
この方法は高感度であるが、その測定に高価な分析装置を必要とするものであり、かつ測定試薬のコストも高いものであった。
【００１１】
また、最近、タンパク質と結合するとその色調を変える色素を担体に含浸させた試験片において、測定限界が２〜３ｍｇ／ｄＬのものが出てきたが、試験片は試料を希釈することなく、直接試料を試験片に接触させ測定を行うものであるので、試料中に含まれる種々の干渉物質の影響を受け易く、特に試料が尿である場合には尿に含まれる緩衝能を有する物質によりｐＨが変動し、このｐＨの変動により色素の色調の変化が影響を受け、試料中のタンパク質の測定に誤差が生じてしまうことがあった。
【００１２】
上述した従来のタンパク質の測定方法及び測定キットは、測定限界が高くすなわち測定の感度が低いものであったり、測定の操作が煩雑であったり、測定に時間を要したり、測定に高価な分析装置を必要とするものであったり、測定試薬のコストが高いものであったり、又は試料中の干渉物質による測定結果への影響を受け易いものであった。
【００１３】
なお、本発明者らは、先に、ａ）タンパク質を含有する可能性がある試料と、タンパク質とイオン会合体を形成する色素を混合し、前記イオン会合体を沈殿させずにイオン会合体溶液を形成させる工程；ｂ）前記イオン会合体溶液を疎水性フィルタに通すことにより、前記イオン会合体溶液中に溶解した前記会合体を前記フィルタに吸着させる工程；及び、ｃ）前記フィルタ上の前記会合体を定性・定量的に分析する工程を順次行う、試料中のタンパク質の分析方法及び分析キットを開発した（特許文献１参照。）。
【００１４】
また、本発明者らは、先に、試料、タンパク質と会合体を形成する色素、及び界面活性物質を接触させる工程；前記接触後その一定量を多孔性膜上に添加する工程；並びに前記多孔性膜上の着色域を測定する工程を含む、試料中のタンパク質の測定方法及び測定キットを開発した（特許文献２参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特開平１１−３０４８０３号公報
【特許文献２】特開２００５−５５４１７号公報
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】「分析化学」、第２３巻、第１５４３頁〜第１５４４頁、１９７４年
【非特許文献２】「分析化学」、第４４巻、第７３３頁〜第７３８頁、１９９５年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の課題は、測定に当たり高価な装置、器具又は測定試薬を必要とせず、測定の操作が簡便であり、測定に要する時間が極めて短く、試料中の干渉物質による測定結果への影響を受けにくいものであり、かつ試料中に微量に含まれるタンパク質をも測定することができる高感度な試料中のタンパク質の測定方法及び測定キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、本出願人が独立行政法人科学技術振興機構から開発委託を受けたことに基づき、種々検討を行ない、本発明を完成させた。
本発明は、以下の発明を包含するものである。
（１） １）試料、及びタンパク質と会合し凝集体を形成する色素を、接触させ、これにより、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる凝集体形成工程；
２）当該凝集体の形成後、当該凝集体を含む溶液の一定量を有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体に通す通流工程；及び
３）当該多孔性担体表面の色を測定する色測定工程、を含む試料中のタンパク質の測定方法。
（２） 凝集体形成工程において、界面活性物質を共存させる、前記（１）記載の試料中のタンパク質の測定方法。
（３） タンパク質と会合し凝集体を形成する色素を含有する試薬、及び有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体を含む、試料中のタンパク質の測定キット。
（４） 界面活性物質を更に含む、前記（３）記載の試料中のタンパク質の測定キット。
（５） 前記（１）記載の測定方法に使用されるものである、前記（３）記載の試料中のタンパク質の測定キット。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定キットは、測定に当たり高価な装置、器具又は測定試薬を必要とせず、測定の操作が簡便であり、測定に要する時間が極めて短く、かつ試料中に微量に含まれるタンパク質をも測定することができる高感度な試料中のタンパク質の測定方法及び測定キットである。
【００２０】
また、本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定キットは、試料と、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素を接触させるものであり、これにより試料は希釈され、すなわち試料中の干渉物質も希釈され、当該干渉物質の濃度は低いものとなるので、本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定キットは、試料中の干渉物質による測定結果への影響を受けにくいものである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】試料中のタンパク質の測定方法及び測定キットにおける、有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体を用いることの効果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
Ｉ．試料中のタンパク質の測定方法
１．試料
本発明における試料としては、タンパク質を含む可能性がある試料であれば特に限定されない。
【００２３】
この試料としては、例えば、ヒト若しくは動物に由来する試料、植物に由来する試料、微生物に由来する試料、食物、飲料、飲料水、薬剤、試薬、又は環境試料等を挙げることができる。
【００２４】
ヒト若しくは動物に由来する試料は、特に限定されず、例えば、ヒト或いは動物の、血液、血清、血漿、尿、精液、髄液、唾液、汗、涙、腹水、若しくは羊水などの体液；大便などの排泄物；脳、心臓、腎臓、若しくは肝臓などの臓器；毛髪、皮膚、爪、筋肉、若しくは神経などの組織；又は細胞等を挙げることができる。
【００２５】
食物は、特に限定されず、例えば、食肉、野菜、穀物、果物、卵、水産物、又は加工食品等を挙げることができる。
【００２６】
飲料は、特に限定されず、例えば、ジュース、牛乳、茶、コーヒー、又は酒類等を挙げることができる。
【００２７】
薬剤は、特に限定されず、例えば、輸液、注射液、散剤、又は錠剤等を挙げることができる。
【００２８】
なお、本発明において測定に用いる試料は、液体である必要があるので、もし試料が液体でない場合には、抽出処理又は可溶化処理等の前処理を既知の方法に従って行い、液体試料とすればよい。
また、試料は、必要に応じて、希釈又は濃縮処理等を行ってもよい。
【００２９】
２．タンパク質と会合し凝集体を形成する色素
本発明における、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素は、静電気的引力又は疎水相互作用等によってタンパク質と会合することが可能であり、かつ、この色素と会合したタンパク質同士が凝集体を形成することが可能なものである。
このような色素であれば、特に限定されずに用いることができる。
【００３０】
このタンパク質と会合し凝集体を形成する色素としては、例えば、エリスロシンＢ、エオシンＢ、エオシンＹ、フロキシンＢ、若しくはローズベンガルなどのキサンテン系色素；クマシブリリアントブルー（ＣＢＢ）、ブロモクロロフェノールブルー、テトラブロモフェノールブルー、ブロモフェノールブルー、若しくはブロモクレゾールパープルなどのトリフェニルメタン系色素；又はバッファローブラック、アシドオレンジ１２、メチルオレンジ、オレンジＧ、若しくはアゾスルファチアゾールなどのアゾ色素等を挙げることができる。
【００３１】
このタンパク質と会合し凝集体を形成する色素としては、疎水性が高いものが好ましい。
【００３２】
また、このタンパク質と会合し凝集体を形成する色素としては、その酸解離定数（ｐＫａ）の値が測定を行おうとするタンパク質の等電点（ｐＩ）の値よりも低いものが好ましい。
【００３３】
このように、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値が、測定を行おうとするタンパク質の等電点の値よりも低い場合、前記の凝集体形成工程において当該凝集体を形成させる際のｐＨを、測定しようとするタンパク質の等電点未満のｐＨとしたときは、測定しようとするタンパク質の電荷がプラス側となり、また前記色素のマイナス電荷を保つことができ、これにより試料に含まれるタンパク質と前記色素とが会合し易くなり、これによりこのタンパク質測定の感度を高めることができるので、好ましい。
【００３４】
このタンパク質と会合し凝集体を形成する色素としては、キサンテン系色素であることが好ましく、エリスロシンＢ、エオシンＢ、エオシンＹ、フロキシンＢ若しくはローズベンガルであることがより好ましく、エリスロシンＢであることが特に好ましい。
【００３５】
このタンパク質と会合し凝集体を形成する色素は、このタンパク質と会合し凝集体を形成する色素を含有する試薬として、より好ましくは、このタンパク質と会合し凝集体を形成する色素を含有する溶液の試薬として、試料と混合し、接触させることが好ましい。
【００３６】
なお、このタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の濃度は、低すぎると測定の感度が得られず試料中のタンパク質を測定することができないので、通常、試料中のタンパク質と接触させるときの濃度で、１μＭ以上であることが好ましく、１０μＭ以上であることがより好ましく、２０μＭ以上であることが特に好ましい。
【００３７】
また、このタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の濃度は、高すぎると試料中にタンパク質が存在しなくとも当該多孔性担体の表面に発色が生じてしまい、試料中にタンパク質が存在するときとの判別が難しくなるので、通常、試料中のタンパク質と接触させるときの濃度で、５００μＭ以下であることが好ましく、１００μＭ以下であることがより好ましく、５０μＭ以下であることが特に好ましい。
【００３８】
３．有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体
本発明における有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体は、有機化合物よりなり、多数の微細な孔を有し、かつその孔径が３μｍ以上の担体であって、この担体に溶液を添加したときにその溶液を通すことができるものであれば、特に制限なく用いることができる。
【００３９】
この有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体であるが、有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体であれば、特に制限なく用いることができる。
この有機化合物としては、特に限定はないが、例えば、セルロースアセテート、セルロース混合エステル、セルロース混合エステル−混合エステル、セルロース繊維、再生セルロース、親水性強化セルロース、ニトロセルロース、強化セルロース、ポリプロピレン、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、ポリフッ化ビニリデン、親水性ポリフッ化ビニリデン、親水性ポリテトラフルオロエチレン、ポリカーボネート、ナイロン、ポリアミド、ポリエステル、ポリエステル−ポリエチレンテレフタレート、又はセルロースアセテートコートポリエステル不織布等を挙げることができる。
【００４０】
前記の多孔性担体の孔径（又は粒子保持能、若しくは保留粒子径等）は、３μｍ以上である必要がある。
有機化合物よりなり孔径が３μｍ未満の多孔性担体を用いて測定を行う場合、タンパク質を含まない試料を測定したときの当該多孔性担体の表面の着色は濃いものとなり、「試料中にタンパク質が存在する」と誤って判定されることになる。
すなわち、多孔性担体として、有機化合物よりなり孔径が３μｍ未満の多孔性担体を用いた場合には、試料中にタンパク質が存在しないことを、正しく判定することができない。
よって、有機化合物よりなる多孔性担体を用いて試料中のタンパク質の測定を行う場合、その孔径は３μｍ以上である必要がある。
【００４１】
なお、特に挙げるならば、前記の孔径は５μｍ以上のものが好ましく、８μｍ以上のものがより好ましく、１０μｍ以上のものが特に好ましい。
また、これも特に挙げるならば、孔径が２０μｍ以下のものが好ましい。
【００４２】
なお、本発明における有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体は、孔径が３μｍ以上のろ紙若しくは有機化合物よりなるフィルタ等よりなるものであっても良く、そしてこれらのろ紙若しくはフィルタ等が複数組み合わされたものであっても良く、又はこれらのろ紙若しくはフィルタ等がろ過（フィルタ）用の器具にセットされたものであっても良く、あるいはこれらのろ紙若しくはフィルタ等がハウジングに収められたものであっても良く、更には、これらのろ紙若しくはフィルタ等が有機化合物若しくは他の材質よりなるプレフィルタ等と組み合わされたものであってもよい。
【００４３】
この有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体の内、孔径が３μｍ以上のろ紙若しくは有機化合物よりなるフィルタ等よりなるものとしては、例えば、ワットマンジャパン社の製品としては、「商品名：トラックエッチ・サイクロポアメンブレン、カタログ番号：７０６１−１３１３、孔径：５．０μｍ、メンブレン：ポリエステル」、「商品名：トラックエッチ・サイクロポアメンブレン、カタログ番号：７０６２−４７１２、孔径：３．０μｍ、メンブレン：ポリカーボネート」、「商品名：トラックエッチ・サイクロポアメンブレン、カタログ番号：７０６２−２５１３、孔径：５．０μｍ、メンブレン：ポリカーボネート、厚さ：１５μｍ」、「商品名：トラックエッチ・サイクロポアメンブレン、カタログ番号：７０６０−２５１４、孔径：８．０μｍ、メンブレン：ポリカーボネート、厚さ：１２μｍ」、「商品名：トラックエッチ・サイクロポアメンブレン、カタログ番号：７０６０−２５１５、孔径：１０．０μｍ、メンブレン：ポリカーボネート」、「商品名：トラックエッチ・サイクロポアメンブレン、カタログ番号：７０６０−２５１６、孔径：１２．０μｍ、メンブレン：ポリカーボネート、厚さ：８μｍ」、「商品名：トラックエッチ・ニュークリポアメンブレン、カタログ番号：１１０６１２、孔径：３．０μｍ、メンブレン：ポリカーボネート」、「商品名：トラックエッチ・ニュークリポアメンブレン、カタログ番号：１１０６１３、孔径：５．０μｍ、メンブレン：ポリカーボネート」、「商品名：トラックエッチ・ニュークリポアメンブレン、カタログ番号：１１０６１４、孔径：８．０μｍ、メンブレン：ポリカーボネート」、「商品名：トラックエッチ・ニュークリポアメンブレン、カタログ番号：１１０６１５、孔径：１０．０μｍ、メンブレン：ポリカーボネート」、「商品名：トラックエッチ・ニュークリポアメンブレン、カタログ番号：１１０６１６、孔径：１２．０μｍ、メンブレン：ポリカーボネート」、「商品名：トラックエッチ・ニュークリポアメンブレン、カタログ番号：１５０４４６、孔径：８．０μｍ、メンブレン：ポリカーボネート・ＰＶＰフリー」、「商品名：ニトロセルロースメンブレンＷＣＮ、カタログ番号：７１９３−００２、孔径：３．０μｍ、メンブレン：ニトロセルロース、厚さ：１２５μｍ」、「商品名：ニトロセルロースメンブレンＷＣＮ、カタログ番号：７１９５−００２、孔径：５．０μｍ、メンブレン：ニトロセルロース、厚さ：１２５μｍ」、「商品名：ニトロセルロースメンブレンＡＥ９８、カタログ番号：１０４００２０６、孔径：５．０μｍ、メンブレン：ニトロセルロース、厚さ：１２５μｍ」、「商品名：ニトロセルロースメンブレンＡＥ９９、カタログ番号：１０４００１０６、孔径：８．０μｍ、メンブレン：ニトロセルロース、厚さ：１２５μｍ」、「商品名：ニトロセルロースメンブレンＡＥ１００、カタログ番号：１０４０００１２、孔径：１２．０μｍ、メンブレン：ニトロセルロース、厚さ：１２５μｍ」、又は「商品名：セルロース混合エステルメンブレンＭＥ２９、カタログ番号：１０４００７７２、孔径：３．０μｍ、メンブレン：セルロース混合エステル、厚さ：１５０μｍ」等を挙げることができる。また、アドバンテック東洋社の製品としては、「商品名：ポリカーボネートタイプメンブレンフィルター・Ｋ８００Ａ０１３Ａ、商品コード：１６１８０００１、孔径：８．００μｍ、メンブレン：ポリカーボネート、厚さ：７μｍ」、「商品名：セルロース混合エステルタイプメンブレンフィルター・Ａ５００Ａ０２５Ａ、商品コード：１０１５０００２、孔径：５．００μｍ、メンブレン：セルロース混合エステル、厚さ：１６０μｍ」、「商品名：セルロース混合エステルタイプメンブレンフィルター・Ａ３００Ａ０２５Ａ、商品コード：１０１３０００２、孔径：３．００μｍ、メンブレン：セルロース混合エステル、厚さ：１５５μｍ」、又は「商品名：セルロースアセテートタイプメンブレンフィルター・Ｃ３００Ａ０２５Ａ、商品コード：１１１３０００２、孔径：３．００μｍ、メンブレン：セルロースアセテート、厚さ：１３５μｍ」等を挙げることができる。
【００４４】
また、有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体の内、孔径が３μｍ以上のろ紙若しくは有機化合物よりなるフィルタ等がハウジングに収められたものとしては、例えば、ワットマンジャパン社の「商品名：ＧＤ／Ｘ シリンジフィルタ、カタログ番号：６８７０−２５５０、孔径：５．０μｍ、メンブレン：ナイロン」、「商品名：プラディスクＦＰ３０ ＣＮ−Ｓ、滅菌済み個包装、カタログ番号：１０４６２０００、孔径：５．０μｍ、メンブレン：ニトロセルロース」、「商品名：プラディスクＦＰ３０ ＣＮ、非滅菌、カタログ番号：１０４６２５２０、孔径：５．０μｍ、メンブレン：ニトロセルロース」、又は「商品名：ポリディスクＨＤ、カタログ番号：６７２８−５０５０、孔径：５．０μｍ、メンブレン：ポリプロピレン」等を挙げることができる。
【００４５】
４．界面活性物質
本発明においては、前記の凝集体形成工程において、界面活性物質を共存させることが、前記の色測定工程においてタンパク質を含有する試料における多孔性担体表面の色の発色度（濃さ）が高くなって高感度に測定が行えるようになり、かつタンパク質を含有しない試料の測定（陰性対照；又は試薬ブランク）において前記の多孔性担体表面の色の発色が無いか又はごく薄い発色にとどまり、前記の色の測定におけるタンパク質を含有する試料とタンパク質を含有しない試料との判別が容易になるという効果を生じるので、界面活性物質を共存させることが好ましい。
【００４６】
この界面活性物質としては、界面活性物質であれば、特に限定されずに用いることができる。
この界面活性物質は、天然の界面活性物質であってもよく、合成等により製造された界面活性物質であってもよい。
【００４７】
この界面活性物質としては、例えば、界面活性剤、多糖類若しくはその誘導体、又はその他の界面活性物質等を挙げることができる。
【００４８】
界面活性剤としては、例えば、非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、及び陽イオン性界面活性剤等を挙げることができる。
【００４９】
なお、この界面活性剤をより具体的に例示すると、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンフィトステロール、フィトスタノール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油若しくはポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性界面活性剤；酢酸ベタインなどの両性界面活性剤；ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩などの陰イオン性界面活性剤；アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩若しくは塩化ベンザルコニウムなどの陽イオン性界面活性剤等を挙げることができる。
【００５０】
前記の非イオン性界面活性剤の具体例として、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−４０５、又はＴｗｅｅｎ２０等を挙げることができる。
【００５１】
多糖類としては、単糖が数個以上脱水縮合して生じた糖質を挙げることができ、例えば、シクロデキストリン（ＣＤ）、デキストラン、又はヘパリン等を挙げることができる。
【００５２】
多糖類の誘導体としては、前記多糖類の水素若しくは水酸基などの官能基が、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシブチル基、グルコシル基、マルトシル基、ジエチルアミノエチル基、メチル基若しくはエチリデン基などの脂肪族炭化水素基、シクロプロピル基などの脂環式炭化水素基、フェニル基、ベンジル基若しくはベンジリデン基などの芳香族炭化水素基、メトキシ基若しくはフェノキシ基などのエーテル基、アセトキシ基若しくはベンゾイロキシ基などのエステル基、アセチル基、プロピオニル基若しくはベンゾイル基などのアシル基、スルフヒドリル基、スルホ基、スルホニル基、カルボキシル基、アミノ基、イミノ基、ニトリル基、カルボニル基、オキソ基、水酸基、又はニトロ基等で置換されたもの等を挙げることができる。
更に、多糖類の誘導体としては、前記多糖類又は前記置換体の架橋物等を挙げることができる。
【００５３】
シクロデキストリンとしては、α−シクロデキストリン（α−ＣＤ）、β−シクロデキストリン（β−ＣＤ）、γ−シクロデキストリン（γ−ＣＤ）等を挙げることができる。
また、シクロデキストリン誘導体としては、例えば、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン又はγ−シクロデキストリン等の水酸基が、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシブチル基、グルコシル基、マルトシル基、ベンジル基、若しくはスルホニル基などで置換されたもの、又はこれらのシクロデキストリン若しくはその誘導体の架橋物等を挙げることができる。
【００５４】
シクロデキストリンとしては、β−シクロデキストリン又はγ−シクロデキストリンが好ましく、シクロデキストリン誘導体としては、β−シクロデキストリン若しくはγ−シクロデキストリンの水酸基などが置換されたもの、又はβ−シクロデキストリン若しくはγ−シクロデキストリンの架橋物が好ましい。
【００５５】
デキストランサルフェイト若しくはその誘導体は、分子量が１，０００〜５，０００，０００の範囲のものが好ましく、分子量が５，０００〜１，０００，０００の範囲のものが特に好ましい。
【００５６】
その他の界面活性物質としては、例えば、ポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコールなどのポリアルキレングリコール等を挙げることができる。
このポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコール等のポリアルキレングリコールとしては、例えば、分子量２００〜４，０００，０００のものを用いることができる。分子量１，０００〜４００，０００のものがより好ましく、分子量２，０００〜４０，０００のものが特に好ましい。
【００５７】
界面活性物質としては、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−４０５若しくはＴｗｅｅｎ２０等の非イオン性界面活性剤、又はポリエチレングリコール若しくはポリプロピレングリコールなどのポリアルキレングリコール等が好ましく、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００がより好ましい。
【００５８】
なお、この界面活性物質の濃度は、低すぎるとその共存の効果が得られないので、通常は、前記凝集体形成工程において共存させるときの濃度で、０．０００１％（Ｗ／Ｖ）以上であることが好ましく、０．００１％（Ｗ／Ｖ）以上であることがより好ましく、０．００５％（Ｗ／Ｖ）以上であることが特に好ましい。
【００５９】
また、この界面活性物質の濃度は、高すぎるとそれを含む溶液の粘性が上昇する可能性があり、そうなると前記通流工程における有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体への添加等の量に誤差が生じることにもなるので、通常は、前記凝集体形成工程において共存させるときの濃度で、５％（Ｗ／Ｖ）以下であることが好ましく、１％（Ｗ／Ｖ）以下であることがより好ましく、０．１％（Ｗ／Ｖ）以下であることが特に好ましい。
【００６０】
前記の凝集体形成工程において、界面活性物質は、複数種類のものを組み合わせて共存させても良い。
【００６１】
５．ｐＨ
本発明では、前記の凝集体形成工程において、試料に含まれていたタンパク質と、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる際のｐＨは、測定しようとするタンパク質の等電点（ｐＩ）の値未満のｐＨであることが好ましい。
このように、測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨとした場合には、
測定しようとするタンパク質の電荷がプラス側となり、前記の色素と会合し易くなり、これによりこのタンパク質測定の感度を高めることができるので、好ましい。
【００６２】
なお、このタンパク質の等電点の値の例を示すと、ヒトのアルブミンはｐＨ４．８、α１−グロブリンはｐＨ２．０、γ１−グロブリンはｐＨ５．８、γ２−グロブリンはｐＨ７．４、ハプトグロブリンはｐＨ４．１、卵白アルブミンはｐＨ４．６等を挙げることができる。
よって、例えば、ヒトのアルブミンを測定しようとする場合は、前記の凝集体形成工程におけるｐＨをｐＨ４．８未満とすることが好ましい。
【００６３】
また、本発明では、前記の凝集体形成工程において、試料に含まれていたタンパク質と、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる際のｐＨは、このタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近にあることが好ましい。
これは、より好ましくは前記の凝集体形成工程においてタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値の±２の範囲内のｐＨとすることであり、特に好ましくはタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値の±１．５の範囲内のｐＨとすることであり、更に好ましくはこのタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値の±１の範囲内のｐＨとすることである。
【００６４】
このように、前記の凝集体形成工程において、ｐＨを前記のようにタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近にすることにより、前記色素のマイナス電荷を保つことができ、これにより試料に含まれるタンパク質と会合し易くなり、これによりこのタンパク質測定の感度を高めることができるので、好ましい。
【００６５】
なお、このタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の例を示すと、エリスロシンＢはｐＫａ３．２、エオシンＢはｐＫａ２．２、エオシンＹはｐＫａ２．８、及びローズベンガルはｐＫａ３．５１等である。
【００６６】
よって、例えば、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素としてエリスロシンＢを用いる場合には、前記の凝集体形成工程におけるｐＨを、エリスロシンＢの酸解離定数（ｐＫａ）３．２の付近のｐＨとすることが好ましく、ｐＨ１．２〜ｐＨ５．２の範囲内のｐＨとすることがより好ましく、ｐＨ１．７〜ｐＨ４．７の範囲内のｐＨとすることが特に好ましく、ｐＨ２．２〜ｐＨ４．２の範囲内のｐＨとすることが更に好ましい。
【００６７】
また、例えば、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素としてエオシンＢを用いる場合には、前記の凝集体形成工程におけるｐＨを、エオシンＢの酸解離定数（ｐＫａ）２．２の付近のｐＨとすることが好ましく、ｐＨ１．２〜ｐＨ４．２の範囲内のｐＨとすることがより好ましく、ｐＨ１．４〜ｐＨ３．７の範囲内のｐＨとすることが特に好ましく、ｐＨ１．７〜ｐＨ３．２の範囲内のｐＨとすることが更に好ましい。
【００６８】
そして、例えば、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素としてエオシンＹを用いる場合には、前記の凝集体形成工程におけるｐＨを、エオシンＹの酸解離定数（ｐＫａ）２．８の付近のｐＨとすることが好ましく、ｐＨ１．２〜ｐＨ４．８の範囲内のｐＨとすることがより好ましく、ｐＨ１．５〜ｐＨ４．３の範囲内のｐＨとすることが特に好ましく、ｐＨ１．８〜ｐＨ３．８の範囲内のｐＨとすることが更に好ましい。
【００６９】
そして、例えば、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素としてローズベンガルを用いる場合には、前記の凝集体形成工程におけるｐＨを、ローズベンガルの酸解離定数（ｐＫａ）３．５１の付近のｐＨとすることが好ましく、ｐＨ１．５〜ｐＨ５．５の範囲内のｐＨとすることがより好ましく、ｐＨ２．０〜ｐＨ５．０の範囲内のｐＨとすることが特に好ましく、ｐＨ２．５〜ｐＨ４．５の範囲内のｐＨとすることが更に好ましい。
【００７０】
以上のことより、前記の凝集体形成工程においては、ｐＨを、測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨとし、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨとすることが特に好ましい。
【００７１】
例えば、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素としてエリスロシンＢを用い、試料中のヒトのアルブミンを測定しようとする場合は、前記の凝集体形成工程において、ヒトのアルブミンの等電点であるｐＨ４．８未満のｐＨであって、かつエリスロシンＢの酸解離定数（ｐＫａ）３．２の付近のｐＨとすることが好ましく、ｐＨ１．２以上かつｐＨ４．８未満の範囲内のｐＨとすることがより好ましく、ｐＨ１．７〜ｐＨ４．５の範囲内のｐＨとすることが特に好ましく、ｐＨ２．２〜ｐＨ４．２の範囲内のｐＨとすることが更に好ましい。
【００７２】
また、例えば、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素としてエオシンＢを用い、試料中のヒトのアルブミンを測定しようとする場合は、前記の凝集体形成工程において、ヒトのアルブミンの等電点であるｐＨ４．８未満のｐＨであって、かつエオシンＢの酸解離定数（ｐＫａ）２．２の付近のｐＨとすることが好ましく、ｐＨ１．２〜ｐＨ４．２の範囲内のｐＨとすることがより好ましく、ｐＨ１．４〜ｐＨ３．７の範囲内のｐＨとすることが特に好ましく、ｐＨ１．７〜ｐＨ３．２の範囲内のｐＨとすることが更に好ましい。
【００７３】
そして、例えば、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素としてエオシンＹを用い、試料中のヒトのアルブミンを測定しようとする場合は、前記の凝集体形成工程において、ヒトのアルブミンの等電点であるｐＨ４．８未満のｐＨであって、かつエオシンＹの酸解離定数（ｐＫａ）２．８の付近のｐＨとすることが好ましく、ｐＨ１．２以上かつｐＨ４．８未満の範囲内のｐＨとすることがより好ましく、ｐＨ１．５〜ｐＨ４．３の範囲内のｐＨとすることが特に好ましく、ｐＨ１．８〜ｐＨ３．８の範囲内のｐＨとすることが更に好ましい。
【００７４】
そして、例えば、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素としてローズベンガルを用い、試料中のヒトのアルブミンを測定しようとする場合は、前記の凝集体形成工程において、ヒトのアルブミンの等電点であるｐＨ４．８未満のｐＨであって、かつローズベンガルの酸解離定数（ｐＫａ）３．５１の付近のｐＨとすることが好ましく、ｐＨ１．５以上かつｐＨ４．８未満の範囲内のｐＨとすることがより好ましく、ｐＨ２．０〜ｐＨ４．６５の範囲内のｐＨとすることが特に好ましく、ｐＨ２．５〜ｐＨ４．５の範囲内のｐＨとすることが更に好ましい。
【００７５】
なお、前記の凝集体形成工程においては、そのｐＨが低すぎると、例えばｐＨ１未満であると、タンパク質が変性や不溶化されるので好ましくない。
【００７６】
そして、前記の凝集体形成工程において、試料に含まれていたタンパク質と、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる際のｐＨを前記の通りのｐＨとするには、このｐＨとなるような緩衝剤（これらのｐＨ域に緩衝能がある緩衝剤）を用いることが好ましい。
この緩衝剤としては、既知の緩衝剤を用いることができる。
【００７７】
例えば、緩衝剤として、グリシン（ｐＫａ１：２．３５）、リン酸（ｐＫａ１：２．１５）、フタル酸（ｐＫａ１：２．９５、ｐＫａ２：５．４１）、クエン酸（ｐＫａ１：３．１３、ｐＫａ２：４．７６）、バルビツール酸（ｐＫａ１：４．０４）、コハク酸（ｐＫａ１：４．２１、ｐＫａ２：５．６４）、酢酸（ｐＫａ２：４．７６）、及び種々のグッド緩衝剤等を挙げることができる。
【００７８】
６．測定操作
本発明における試料中のタンパク質の測定方法の測定操作について、以下説明を行う。
（１）凝集体形成工程
試料、及びタンパク質と会合し凝集体を形成する色素を、接触させ、これにより、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる凝集体形成工程であるが、前記の試料と、前記のタンパク質と会合し凝集体を形成する色素を、接触させることができれば、どのような方法でもよい。
この接触により、試料中に含まれるタンパク質と、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素とを、会合させ、これら会合した「タンパク質−タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」の凝集体が形成される。
このときの濃度については、前記の通りである。
【００７９】
なお、前記の通り、この凝集体形成工程においては、界面活性物質を共存させることが好ましい。
【００８０】
この凝集体形成工程において、前記の凝集体を形成させるために、試料、及びタンパク質と会合し凝集体を形成する色素を接触させる時間であるが、これは特には限定はなく、適宜設定すれば良い。
【００８１】
なお、通常は、この凝集体形成工程において、試料と、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素とを接触させて、直ちに、次の通流工程を実施することができるが、この試料と、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素を接触させる時間としては、２秒間以上接触させることが好ましく、５秒間以上であることがより好ましく、１０秒間以上であることが特に好ましく、２０秒間以上であることが更に好ましい。
【００８２】
なお、この凝集体形成工程において、前記の凝集体を形成させるために、試料、及びタンパク質と会合し凝集体を形成する色素を接触させる際の温度であるが、特に限定はない。
但し、温度が高すぎるとタンパク質が変性する可能性があるので、６０℃以下が好ましく、５０℃以下がより好ましく、４０℃以下が特に好ましく、３０℃以下が更に好ましい。
【００８３】
また、この凝集体形成工程において、試料、及びタンパク質と会合し凝集体を形成する色素を接触させる際の温度が低すぎると、タンパク質が変性したり、タンパク質と当該色素との会合及び凝集体形成の反応に時間が掛かる可能性があるので、５℃以上が好ましく、１０℃以上がより好ましく、１５℃以上が特に好ましく、２０℃以上が更に好ましい。
【００８４】
なお、試料、及びタンパク質と会合し凝集体を形成する色素を、接触させ、これにより、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる凝集体形成工程は１段階で行ってもよいが、２段階以上の複数段階で行ってもよい。
【００８５】
この凝集体形成工程を１段階で行う場合、例えば、次の態様により実施することができる。
【００８６】
（ａ） 「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」を含有する試薬と、試料とを混合し、接触させ、これにより、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる。
【００８７】
（ｂ） 「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」を含有し、そのｐＨが「測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨ」である試薬と、試料とを混合し、接触させ、これにより、測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨにおいて、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる。
【００８８】
（ｃ） 「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」及び「界面活性物質」を含有する試薬と、試料とを混合し、接触させ、これにより、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる。又は、
【００８９】
（ｄ） 「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」及び「界面活性物質」を含有し、そのｐＨが「測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨ」である試薬と、試料とを混合し、接触させ、これにより、測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨにおいて、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる。
【００９０】
また、この凝集体形成工程を２段階以上の複数段階で行う場合、例えば、次の態様により実施することができる。
【００９１】
（Ａ） 第１段階： 「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」を含有する試薬と、試料とを混合し、接触させる。
第２段階： 第１段階の混合液に、「緩衝剤」を含有する試薬〔そのｐＨが測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨであるもの〕を混合し、この混合液のｐＨを「測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨ」とし、このｐＨにおいて、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる。
【００９２】
（Ｂ） 第１段階： 「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」及び「界面活性物質」を含有する試薬と、試料とを混合し、接触させる。
第２段階： 第１段階の混合液に、「緩衝剤」を含有する試薬〔そのｐＨが測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨであるもの〕を混合し、この混合液のｐＨを「測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨ」とし、このｐＨにおいて、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる。
【００９３】
（Ｃ） 第１段階： 「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」を含有する試薬と、試料とを混合し、接触させる。
第２段階： 第１段階の混合液に、「界面活性物質」及び「緩衝剤」を含有する試薬〔そのｐＨが測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨであるもの〕を混合し、この混合液のｐＨを「測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨ」とし、このｐＨにおいて、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる。
【００９４】
（Ｄ） 第１段階： 「緩衝剤」を含有する試薬〔そのｐＨが測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨであるもの〕と、試料とを混合する。
第２段階： 第１段階の混合液に、「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」を含有する試薬を混合し、この混合液において、「測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨ」で、試料及び「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」を接触させ、これにより、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる。
【００９５】
（Ｅ） 第１段階： 「緩衝剤」及び「界面活性物質」を含有する試薬〔そのｐＨが測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨであるもの〕と、試料とを混合する。
第２段階： 第１段階の混合液に、「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」を含有する試薬を混合し、この混合液において、「測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨ」で、試料及び「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」を接触させ、これにより、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる。
【００９６】
（Ｆ） 第１段階： 「緩衝剤」を含有する試薬〔そのｐＨが測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨであるもの〕と、試料とを混合する。
第２段階： 第１段階の混合液に、「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」及び「界面活性物質」を含有する試薬を混合し、この混合液において、「測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨ」で、試料及び「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」を接触させ、これにより、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる。
【００９７】
（Ｇ） 第１段階： 「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」を含有する試薬と、試料とを混合し、接触させる。
第２段階： 第１段階の混合液に、「界面活性物質」を含有する試薬を混合する。
第３段階： 第２段階の混合液に、「緩衝剤」を含有する試薬〔そのｐＨが測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨであるもの〕を混合し、この混合液のｐＨを「測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨ」とし、このｐＨにおいて、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる。
【００９８】
（Ｈ） 第１段階： 「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」を含有する試薬と、試料とを混合し、接触させる。
第２段階： 第１段階の混合液に、「緩衝剤」を含有する試薬〔そのｐＨが測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨであるもの〕を混合する。
第３段階： 第２段階の混合液に、「界面活性物質」を含有する試薬を混合し、この混合液において、「測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨ」で、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる。
【００９９】
（Ｉ） 第１段階： 「界面活性物質」を含有する試薬と、試料とを混合する。
第２段階： 第１段階の混合液に、「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」を含有する試薬を混合し、接触させる。
第３段階： 第２段階の混合液に、「緩衝剤」を含有する試薬〔そのｐＨが測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨであるもの〕を混合し、この混合液のｐＨを「測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨ」とし、このｐＨにおいて、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる。
【０１００】
（Ｊ） 第１段階： 「界面活性物質」を含有する試薬と、試料とを混合する。
第２段階： 第１段階の混合液に、「緩衝剤」を含有する試薬〔そのｐＨが測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨであるもの〕を混合する。
第３段階： 第２段階の混合液に、「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」を含有する試薬を混合し、接触させ、この混合液において、「測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨ」で、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる。
【０１０１】
（Ｋ） 第１段階： 「緩衝剤」を含有する試薬〔そのｐＨが測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨであるもの〕と、試料とを混合する。
第２段階： 第１段階の混合液に、「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」を含有する試薬を混合し、接触させる。
第３段階： 第２段階の混合液に、「界面活性物質」を含有する試薬を混合し、この混合液において、「測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨ」で、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる。
【０１０２】
（Ｌ） 第１段階： 「緩衝剤」を含有する試薬〔そのｐＨが測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨであるもの〕と、試料とを混合する。
第２段階： 第１段階の混合液に、「界面活性物質」を含有する試薬を混合する。
第３段階： 第２段階の混合液に、「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」を含有する試薬を混合し、接触させ、この混合液において、「測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨ」で、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる。
【０１０３】
（Ｍ） 第１段階： 「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」を含有する試薬と、「界面活性物質」を含有する試薬とを混合する。
第２段階： 第１段階の混合液に、試料を混合し、接触させる。
第３段階： 第２段階の混合液に、「緩衝剤」を含有する試薬〔そのｐＨが測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨであるもの〕を混合し、この混合液のｐＨを「測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨ」とし、このｐＨにおいて、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる。
【０１０４】
（Ｎ） 第１段階： 「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」を含有する試薬と、「緩衝剤」を含有する試薬〔そのｐＨが測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨであるもの〕を混合する。
第２段階： 第１段階の混合液に、試料を混合し、接触させる。
第３段階： 第２段階の混合液に、「界面活性物質」を含有する試薬を混合し、この混合液において、「測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨ」で、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる。
【０１０５】
（Ｏ） 第１段階： 「界面活性物質」を含有する試薬と、「緩衝剤」を含有する試薬〔そのｐＨが測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨであるもの〕を混合する。
第２段階： 第１段階の混合液に、試料を混合する。
第３段階： 第２段階の混合液に、「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」を含有する試薬を混合し、接触させ、この混合液において、「測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨ」で、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる。
【０１０６】
（Ｐ） 第１段階： 「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」を含有する試薬と、「界面活性物質」を含有する試薬とを混合する。
第２段階： 第１段階の混合液に、「緩衝剤」を含有する試薬〔そのｐＨが測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨであるもの〕を混合する。
第３段階： 第２段階の混合液に、試料を混合し、接触させ、この混合液において、「測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨ」で、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる。
【０１０７】
（Ｑ） 第１段階： 「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」を含有する試薬と、「緩衝剤」を含有する試薬〔そのｐＨが測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨであるもの〕を混合する。
第２段階： 第１段階の混合液に、「界面活性物質」を含有する試薬を混合する。
第３段階： 第２段階の混合液に、試料を混合し、接触させ、この混合液において、「測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨ」で、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる。
【０１０８】
（Ｒ） 第１段階： 「界面活性物質」を含有する試薬と、「緩衝剤」を含有する試薬〔そのｐＨが測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨであるもの〕を混合する。
第２段階： 第１段階の混合液に、「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」を含有する試薬を混合する。
第３段階： 第２段階の混合液に、試料を混合し、接触させ、この混合液において、「測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨ」で、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる。
【０１０９】
なお、前記の凝集体形成工程を２段階以上の複数段階で行う場合、最後の段階で、混合液のｐＨを「測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨ」とすることが好ましい。
【０１１０】
（２）通流工程
前記の凝集体形成工程における当該凝集体の形成後、当該凝集体を含む溶液の一定量を有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体に通す通流工程であるが、当該凝集体を含む溶液の一定量を、前記の有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体に通すことができれば、特に限定はなく、どのような方法でもよい。
この当該凝集体を含む溶液を通すことにより、当該凝集体が有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体に捕捉される。
【０１１１】
なお、前記の当該凝集体を含む溶液の一定量を有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体に通すとき、当該一定量がごく微量の場合は、この有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体の内部に保持されるが、この保持の最大量を超えた場合は、この有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体の内部を通り、添加した側の反対側より流れ出る。
【０１１２】
ところで、前記の有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体に通す前記の当該凝集体を含む溶液の一定量であるが、この添加量は、量が多い程、前記の有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体に捕捉される前記の当該凝集体の量が多くなり、その結果、より低い濃度のタンパク質までも測定できるようになり、測定が高感度となるので好ましい。
【０１１３】
前記の一定量は、通常は、０．１ｍＬ以上であることが好ましく、０．５ｍＬ以上であることがより好ましく、２ｍＬ以上であることが特に好ましく、５ｍＬ以上であることが更に好ましい。
【０１１４】
なお、前記の一定量の上限は特にはないが、強いて言えば、用いる有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体に捕捉される物質の捕捉最大量（上限）に達するまでの量である。
【０１１５】
この通流工程において、当該凝集体を含む溶液の一定量を有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体に通すことであるが、これには特に限定はない。
【０１１６】
例えば、当該凝集体を含む溶液を有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体に添加等して、圧力又は吸引力を加えずに重力により当該凝集体を含む溶液をこの多孔性担体に通してもよい。
【０１１７】
また、当該凝集体を含む溶液を有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体に添加、注入又は吸い込む等し、加圧したり、又は吸引して、当該凝集体を含む溶液をこの多孔性担体に通してもよい。
【０１１８】
あるいは、有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体がシリンジに接続できるハウジングに収められたシリンジフィルタである場合（例えば、ワットマンジャパン社の「ＧＤ／Ｘ シリンジフィルタ」等の場合）、当該凝集体を含む溶液をシリンジの中に入れ、このシリンジと前記シリンジフィルタとを接続し、このシリンジのピストン部分を押すことにより、当該凝集体を含む溶液が押し出されて、このシリンジフィルタの有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体に当該凝集体を含む溶液を通すことができる。
【０１１９】
また、有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体がシリンジに接続できるハウジングに収められたシリンジフィルタである場合（例えば、ワットマンジャパン社の「ＧＤ／Ｘ シリンジフィルタ」等の場合）、シリンジと前記シリンジフィルタとを接続し、前記シリンジフィルタのこのシリンジを接続した側とは反対側のもう一方の口部を、当該凝集体を含む溶液に接触させ、そして、このシリンジのピストン部分を引くことにより、当該凝集体を含む溶液をこのシリンジ内に吸引し、これによりこのシリンジフィルタの有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体に当該凝集体を含む溶液を通すことができる。
【０１２０】
（３）色測定工程
前記の通流工程において当該凝集体を含む溶液の一定量を通した有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体の表面の色、すなわち当該多孔性担体の表面の色をこの色測定工程において測定することは、当該多孔性担体表面の色を測定することができれば、特に限定はなく、どのような方法でもよい。
【０１２１】
この当該多孔性担体表面の色の測定であるが、前記の通流工程において当該凝集体を含む溶液の一定量を通した有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体の表面に生じる色は、試料中にタンパク質が存在しない場合には、着色が無いか、又は着色が薄いものである。
【０１２２】
これに対して、試料中にタンパク質が存在する場合には、有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体の表面の着色が濃いものとなるので、この当該多孔性担体表面の色を測定することにより、試料中にタンパク質が存在するか否かを判別することができる。
すなわち、この色測定工程において、当該多孔性担体表面の色を測定し、着色が無いか、又は着色が薄いものである場合は、試料中にタンパク質が存在しない又は一定濃度（カットオフ値）未満であると判定する。（すなわち、「陰性」と判定する。）
また、当該多孔性担体表面の色を測定し、着色が濃いものである場合は、試料中にタンパク質が存在する又は一定濃度（カットオフ値）以上であると判定する。（すなわち、「陽性」と判定する。）
【０１２３】
そして、前記の当該多孔性担体表面の色の測定であるが、これは目視により行ってもよく、又は、デンシトメーター、スポットメーター、若しくはＣＣＤ装置等の装置を用いて測定を行ってもよい。
【０１２４】
また、タンパク質を含まない試料（陰性対照試料又は試薬ブランク試料）及び／又はタンパク質を含む試料（陽性対照試料）を測定して得られた前記の当該多孔性担体表面の色の濃さと、試料を測定して得られた前記の当該多孔性担体表面の色の濃さとを比較して、試料中のタンパク質の存在の判定を行ってもよい。
【０１２５】
なお、試料中に含まれていたタンパク質の濃度を定量測定する場合は、タンパク質を含まない試料（陰性対照試料又は試薬ブランク試料）及び／又はタンパク質濃度が既知の試料（標準試料）の一濃度又は複数濃度のものを測定して得られた前記の当該多孔性担体表面の色の濃さと、タンパク質濃度が未知の試料を測定して得られた前記の当該多孔性担体表面の色の濃さとを比較（又は比例計算等して算出）すること等により定量値を求めることができる。
【０１２６】
前記の通流工程において当該凝集体を含む溶液の一定量を有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体に通した後、この色測定工程において当該多孔性担体表面の色を測定するまでの時間は、用いる有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体の種類、面積及び厚さ、当該凝集体を含む溶液の当該一定量の量若しくは粘度、又は加圧若しくは吸引の有無等の条件により異なるので一概に言うことは出来ない。
【０１２７】
しかしながら、通常は、前記の当該凝集体を含む溶液の一定量を有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体に通して、時間を置かず直ちに当該多孔性担体表面の色を測定することができる。
【０１２８】
なお、この当該多孔性担体表面の着色は安定ではあるが、当該凝集体を含む溶液の一定量を有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体に通した後６時間以内に当該多孔性担体表面の色を測定することが好ましい。
【０１２９】
ＩＩ．試料中のタンパク質の測定キット
本発明の試料中のタンパク質の測定キットは、少なくとも、「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素を含有する試薬」、及び「有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体」を含むものである。
【０１３０】
１．試薬
本発明の試料中のタンパク質の測定キットは、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素を含有する試薬を含む。
【０１３１】
（１）タンパク質と会合し凝集体を形成する色素
本発明の試料中のタンパク質の測定キットにおける、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素を含有する試薬において、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素は、前記「Ｉ．試料中のタンパク質の測定方法」の「２．タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」等において詳述した通りである。
【０１３２】
このタンパク質と会合し凝集体を形成する色素を前記試薬に含有させる濃度は、低すぎると測定の感度が得られず試料中のタンパク質を測定することができないので、通常、試料中のタンパク質と接触させるときの濃度が１μＭ以上となるように前記試薬に含有させることが好ましく、試料中のタンパク質と接触させるときの濃度が１０μＭ以上となるように前記試薬に含有させることがより好ましく、試料中のタンパク質と接触させるときの濃度が２０μＭ以上となるように前記試薬に含有させることが特に好ましい。
【０１３３】
また、このタンパク質と会合し凝集体を形成する色素を前記試薬に含有させる濃度は、高すぎると試料中にタンパク質が存在しなくとも前記の当該多孔性担体の表面に発色が生じてしまい、試料中にタンパク質が存在するときとの判別が難しくなるので、通常、試料中のタンパク質と接触させるときの濃度が５００μＭ以下となるように前記試薬に含有させることが好ましく、試料中のタンパク質と接触させるときの濃度が１００μＭ以下となるように前記試薬に含有させることがより好ましく、試料中のタンパク質と接触させるときの濃度が５０μＭ以下となるように前記試薬に含有させることが特に好ましい。
【０１３４】
（２）界面活性物質
本発明の試料中のタンパク質の測定キットに含まれる、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素を含有する試薬又は他の試薬に、界面活性物質を含有させてもよい。
タンパク質と会合し凝集体を形成する色素を含有する試薬又は他の試薬に、界面活性物質を含有させることにより、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素を含有する試薬（及び当該他の試薬）と試料との混合液を有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体に通した後のこの多孔性担体表面の色の発色度（濃さ）が、タンパク質を含む試料においては、この発色度（濃さ）が高くなって高感度に測定が行えるようになり、かつタンパク質を含有しない試料の測定（陰性対照；又は試薬ブランク）において前記の多孔性担体表面の色の発色が無いか又はごく薄い発色にとどまり、前記の色の測定におけるタンパク質を含有する試料とタンパク質を含有しない試料との判別が容易になるという効果を生じるので、本発明の試料中のタンパク質の測定キットに含まれる「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素を含有する試薬」又は「その他の試薬」に、界面活性物質を含有させることが好ましい。
なお、この界面活性物質については、前記「Ｉ．試料中のタンパク質の測定方法」の「４．界面活性物質」等において詳述した通りである。
【０１３５】
この界面活性物質の濃度は低すぎると、これを含有させることの効果が得られないので、通常は、界面活性物質、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素、及び試料中のタンパク質を接触させる時の濃度が０．０００１％（Ｗ／Ｖ）以上となるように前記試薬に含有させることが好ましく、当該接触時の濃度が０．００１％（Ｗ／Ｖ）以上となるように前記試薬に含有させることがより好ましく、当該接触時の濃度が０．００５％（Ｗ／Ｖ）以上となるように前記試薬に含有させることが特に好ましい。
【０１３６】
また、この界面活性物質の濃度は、高すぎるとそれを含む溶液の粘性が上昇する可能性があり、そうなると有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体への、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素を含有する試薬等と試料との混合液の添加等の量に誤差が生じることにもなるので、通常は、界面活性物質、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素、及び試料中のタンパク質を接触させる時の濃度が５％（Ｗ／Ｖ）以下となるように界面活性物質を前記試薬に含有させることが好ましく、当該接触時の濃度が１％（Ｗ／Ｖ）以下となるように前記試薬に含有させることがより好ましく、当該接触時の濃度が０．１％（Ｗ／Ｖ）以下となるように前記試薬に含有させることが特に好ましい。
【０１３７】
（３）ｐＨ
本発明では、試料に含まれていたタンパク質と、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる際のｐＨは、測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであることが好ましい。
このように、測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨとした場合には、
測定しようとするタンパク質の電荷がプラス側となり、前記の色素と会合し易くなり、これによりこのタンパク質測定の感度を高めることができるので、好ましい。
【０１３８】
よって、試料に含まれていたタンパク質と、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる際のｐＨが、測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨとなるように、本発明の試料中のタンパク質の測定キットに含まれる試薬のｐＨを設定することが好ましい。
【０１３９】
また、本発明では、試料に含まれていたタンパク質と、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる際のｐＨは、このタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近にあることが好ましい。
これは、より好ましくは前記の凝集体形成時において、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値の±２の範囲内のｐＨとすることであり、特に好ましくはタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値の±１．５の範囲内のｐＨとすることであり、更に好ましくはこのタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値の±１の範囲内のｐＨとすることである。
【０１４０】
このように、前記の凝集体形成時において、ｐＨを前記のようにタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近にすることにより、前記色素のマイナス電荷を保つことができ、これにより試料に含まれるタンパク質と会合し易くなり、これによりこのタンパク質測定の感度を高めることができるので、好ましい。
【０１４１】
よって、前記の凝集体形成時において、ｐＨを前記のようにタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近となるように、本発明の試料中のタンパク質の測定キットに含まれる試薬のｐＨを設定することが好ましい。
【０１４２】
以上のことより、前記の凝集体形成時においては、ｐＨを、測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨとし、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨとすることが特に好ましい。
【０１４３】
よって、前記の凝集体形成時において、ｐＨを、測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨとし、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨとなるように、本発明の試料中のタンパク質の測定キットに含まれる試薬のｐＨを設定することが特に好ましい。
【０１４４】
なお、前記の凝集体形成時においては、そのｐＨが低すぎると、例えばｐＨ１未満であると、タンパク質が変性や不溶化されるので好ましくない。
【０１４５】
よって、前記の凝集体形成時において、ｐＨを、低くなりすぎないように、例えばｐＨ１未満とならないように、本発明の試料中のタンパク質の測定キットに含まれる試薬のｐＨを設定することが好ましい。
【０１４６】
なお、前記の凝集体形成時において、試料に含まれていたタンパク質と、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる際のｐＨを前記の通りのｐＨとするには、このｐＨとなるような緩衝剤（これらのｐＨ域に緩衝能がある緩衝剤）を用いることが好ましい。
【０１４７】
この緩衝剤としては、既知の緩衝剤を用いることができる。
例えば、緩衝剤として、グリシン（ｐＫａ１：２．３５）、リン酸（ｐＫａ１：２．１５）、フタル酸（ｐＫａ１：２．９５、ｐＫａ２：５．４１）、クエン酸（ｐＫａ１：３．１３、ｐＫａ２：４．７６）、バルビツール酸（ｐＫａ１：４．０４）、コハク酸（ｐＫａ１：４．２１、ｐＫａ２：５．６４）、酢酸（ｐＫａ２：４．７６）、及び種々のグッド緩衝剤等を挙げることができる。
【０１４８】
よって、前記の凝集体形成時において、ｐＨを前記の通りとするため、当該ｐＨとなるような緩衝剤（これらのｐＨ域に緩衝能がある緩衝剤）を、本発明の試料中のタンパク質の測定キットに含まれる試薬に含有させることが好ましい。
【０１４９】
なお、このｐＨの他の事項については、前記「Ｉ．試料中のタンパク質の測定方法」の「５．ｐＨ」等において詳述した通りである。
【０１５０】
（４）試薬の構成
本発明の試料中のタンパク質の測定キットは、一つの試薬を含むものであってもよいし、又は二つ以上の複数の試薬を含むものであってもよい。
一つの試薬のみを含むものである場合、当該試薬は、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素を含有する試薬である。
また、二つ以上の複数の試薬を含むものである場合、当該複数の試薬は、その一つ又は二つ以上の試薬がタンパク質と会合し凝集体を形成する色素を含有するものである。
【０１５１】
更に、本発明の試料中のタンパク質の測定キットは、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素以外の成分を含有する試薬を含むものであってもよい。
本発明の試料中のタンパク質の測定キットは、例えば、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素を含有する試薬、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素及び界面活性物質を含有する試薬、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素及び緩衝剤を含有する試薬、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素、界面活性物質及び緩衝剤を含有する試薬、界面活性物質を含有する試薬、緩衝剤を含有する試薬、界面活性物質及び緩衝剤を含有する試薬、又は試料希釈液よりなる試薬等を含むものであってもよい。
なお、本発明の試料中のタンパク質の測定キットに含まれる試薬の態様は、前記「Ｉ．試料中のタンパク質の測定方法」の「６．測定操作」の「（１）凝集体形成工程」等に記載した通りのもの等である。
【０１５２】
（５）その他の試薬成分
本発明における、本発明の試料中のタンパク質の測定キットに含まれる試薬には、必要に応じて、例えば、塩；アジ化ナトリウム、抗生物質若しくは合成抗菌剤などの防腐剤；糖類などの安定化剤；反応活性化剤；試料中に含まれる測定妨害物質の消去若しくは影響抑制に関わる物質；又は他の試薬成分等を適宜含有させることができる。
【０１５３】
なお、前記の塩としては、例えば、陽イオン及び陰イオンよりなる化合物等を挙げることができる。
【０１５４】
この陽イオンとしては、正の電荷を有するイオンであれば、特に限定されず用いることができる。
この陽イオンとしては、１価の陽イオンであってもよく、又は２価以上の多価の陽イオンであってもよい。
そして、この陽イオンとしては、例えば、金属イオン、アンモニウムイオン、又はその他の陽イオン等を挙げることができる。
【０１５５】
この金属イオンとしては、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、遷移金属イオン、又はその他の金属イオン等を挙げることができる。
【０１５６】
アルカリ金属イオンとしては、例えば、リチウムイオン、ナトリウムイオン、又はカリウムイオン等を挙げることができる。
【０１５７】
アルカリ土類金属イオンとしては、例えば、ベリリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、又はバリウムイオン等を挙げることができる。
【０１５８】
遷移金属イオンとしては、例えば、マンガンイオン、鉄イオン、コバルトイオン、ニッケルイオン、又は銅イオン等を挙げることができる。
【０１５９】
その他の金属イオンとしては、例えば、亜鉛イオン、又はアルミニウムイオン等を挙げることができる。
【０１６０】
アンモニウムイオンとしては、例えば、一級のアンモニウムイオン、二級のアンモニウムイオン、三級のアンモニウムイオン、又は四級のアンモニウムイオン等を挙げることができる。
【０１６１】
その他の陽イオンとしては、例えば、炭素原子、ケイ素原子、ホウ素原子、窒素原子（アンモニウムイオン以外の場合において）、リン原子、若しくは硫黄原子などが正の電荷を帯びている原子、又は原子団等を挙げることができる。
【０１６２】
この具体的な例としては、炭素原子が正の電荷を帯びているコリンイオン等を挙げることができる。
【０１６３】
なお、この陽イオンとしては、１価の陽イオンが好ましい。
【０１６４】
そして、この１価の陽イオンとしては、アルカリ金属イオンが好ましい。特に、ナトリウムイオンが好ましい。
【０１６５】
なお、この陽イオンとしては、１種類のものだけを用いてもよいし、又は複数種類のものを同時に用いてもよい。
【０１６６】
また、陰イオンとしては、負の電荷を有するイオンであれば、特に限定されず用いることができる。
【０１６７】
この陰イオンとしては、１価の陰イオンであってもよく、又は２価以上の多価の陰イオンであってもよい。
【０１６８】
そして、この陰イオンとしては、例えば、ハロゲンイオン、有機化合物よりなる酸基、又はその他の無機化合物よりなる酸基等を挙げることができる。
【０１６９】
ハロゲンイオンとしては、例えば、フッ素イオン、塩素イオン、臭素イオン、又はヨウ素イオン等を挙げることができる。
【０１７０】
有機化合物よりなる酸基としては、例えば、酢酸イオン、クエン酸イオン、グルコン酸イオン、又はシュウ酸イオン等を挙げることができる。
【０１７１】
その他の無機化合物よりなる酸基としては、例えば、硫酸イオン、亜硫酸イオン、二亜硫酸イオン、亜二チオン酸イオン、チオ亜硫酸イオン、硝酸イオン、亜硝酸イオン、次亜硝酸イオン、ペルオキソ亜硝酸イオン、リン酸イオン、亜リン酸イオン、二亜リン酸イオン、次亜リン酸イオン、二リン酸イオン、ホウ酸イオン、炭酸イオン、シアン酸イオン、イソシアン酸イオン、又はケイ酸イオン等を挙げることができる。
【０１７２】
なお、この陰イオンとしては、１価の陰イオンが好ましい。
【０１７３】
そして、この１価の陰イオンとしては、ハロゲンイオンが好ましい。特に、塩素イオンが好ましい。
【０１７４】
また、この陰イオンとしては、１種類のものだけを用いてもよいし、又は複数種類のものを同時に用いてもよい。
【０１７５】
２．多孔性担体
本発明の試料中のタンパク質の測定キットにおける「有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体」は、有機化合物よりなり、多数の微細な孔を有し、かつその孔径が３μｍ以上の担体であって、この担体に溶液を添加したときにその溶液を通すことができるものであれば、特に制限なく用いることができる。
なお、この「有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体」については、前記「Ｉ．試料中のタンパク質の測定方法」の「３．有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体」等において詳述した通りである。
【０１７６】
３．他の物
本発明の試料中のタンパク質の測定キットには、必要に応じて、「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素を含有する試薬」、及び「有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体」以外の物を含めることができる。
【０１７７】
この物としては、例えば、「陰性対照試料（試薬ブランク試料）」、「陽性対照試料」、「標準物質（標準試料）」、「測定結果（当該多孔性担体表面の色）の対照表」等を挙げることができる。
【０１７８】
４．試料中のタンパク質の測定
本発明の試料中のタンパク質の測定キットは、前記の本発明の「試料中のタンパク質の測定方法」に適したものである。
本発明の試料中のタンパク質の測定キットを用いて、本発明の「試料中のタンパク質の測定方法」に従い、試料中のタンパク質の測定を行うことについては、前記「Ｉ．試料中のタンパク質の測定方法」に記載した通りである。
【実施例】
【０１７９】
以下、実施例により本発明をより具体的に詳述するが、本発明はこの実施例の記載により限定されるものではない。
【０１８０】
〔実施例１〕（有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体を用いることの効果の確認）
本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定キットにおける、有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体を用いることの効果を確認した。
【０１８１】
１．試薬
（１）試薬Ａ
タンパク質と会合し凝集体を形成する色素としてのエリスロシンＢを４０μＭの濃度で含有し、かつ界面活性物質としてのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を０．０１％（Ｗ／Ｖ）の濃度で含有する水溶液を調製し、試薬Ａとした。
【０１８２】
（２）試薬Ｂ
０．２Ｍクエン酸−水酸化カリウム緩衝液〔ｐＨ２．３（２０℃）〕を調製し、試薬Ｂとした。
【０１８３】
２．多孔性担体
多孔性担体として、下記の多孔性担体をそれぞれ用いた。
（１）有機化合物よりなり孔径が３μｍ未満の多孔性担体（セルロース混合エステル）
有機化合物よりなり孔径が３μｍ未満の多孔性担体である、「商品名：セルロース混合エステルタイプメンブレンフィルター・Ａ０１０Ａ０２５Ａ、商品コード：１００１０００２、孔径：０．１０μｍ、メンブレン：セルロース混合エステル、厚さ：１１０μｍ、アドバンテック東洋社」を、「有機化合物よりなり孔径が３μｍ未満の多孔性担体（セルロース混合エステル）」とした。
【０１８４】
（２）有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体（セルロース混合エステル）
有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体である、「商品名：セルロース混合エステルタイプメンブレンフィルター・Ａ５００Ａ０２５Ａ、商品コード：１０１５０００２、孔径：５．００μｍ、メンブレン：セルロース混合エステル、厚さ：１６０μｍ、アドバンテック東洋社」を、「有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体（セルロース混合エステル）」とした。
【０１８５】
（３）有機化合物よりなり孔径が３μｍ未満の多孔性担体（セルロースアセテート）
有機化合物よりなり孔径が３μｍ未満の多孔性担体である、「商品名：セルロースアセテートタイプメンブレンフィルター・Ｃ０２０Ａ０２５Ａ、商品コード：１１０２０００２、孔径：０．２０μｍ、メンブレン：セルロースアセテート、厚さ：１２５μｍ、アドバンテック東洋社」を、「有機化合物よりなり孔径が３μｍ未満の多孔性担体（セルロースアセテート）」とした。
【０１８６】
（４）有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体（セルロースアセテート）
有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体である、「商品名：セルロースアセテートタイプメンブレンフィルター・Ｃ３００Ａ０２５Ａ、商品コード：１１１３０００２、孔径：３．００μｍ、メンブレン：セルロースアセテート、厚さ：１３５μｍ、アドバンテック東洋社」を、「有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体（セルロースアセテート）」とした。
【０１８７】
３．試料
（１）タンパク質含有試料
タンパク質含有試料として、３０ｍｇ／Ｌ、すなわち３ｍｇ／ｄＬのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む水溶液を調製した。
【０１８８】
（２）タンパク質不含試料
タンパク質を含まない試料、すなわちタンパク質不含試料として、純水を用意した。
【０１８９】
４．測定
（１） 前記１の（１）の試薬Ａの５，０００μＬに、前記１の（２）の試薬Ｂの５００μＬを添加し、混合した。
【０１９０】
（２） 次に、前記（１）の混合液に、前記３の（１）のタンパク質含有試料の１５０μＬを添加し、混合して、接触させた。
【０１９１】
（３） その後、２０秒間室温にて放置した。
【０１９２】
（４） 次に、前記２の（１）の「有機化合物よりなり孔径が３μｍ未満の多孔性担体（セルロース混合エステル）」を、ろ過用の器具にセットし、この多孔性担体の上側の面に、前記（３）の放置後の混合液の全量（５，６５０μＬ）を添加し、通した。
【０１９３】
（５） 前記（４）における混合液の添加後、直ちに前記の多孔性担体の表面の色を目視にて測定した。
【０１９４】
なお、前記の多孔性担体表面の着色が濃いものである場合には試料中にタンパク質が存在すると判定し、前記の多孔性担体表面の着色が無いか又は着色が薄いものである場合には試料中にタンパク質が存在しないと判定した。
【０１９５】
（６） また、試料を前記３の（１）のタンパク質含有試料から（２）のタンパク質不含試料に変える以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、測定を行った。
【０１９６】
（７） 更に、多孔性担体を、前記２の（１）の「有機化合物よりなり孔径が３μｍ未満の多孔性担体（セルロース混合エステル）」から（２）の「有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体（セルロース混合エステル）」に変える以外は、前記（１）〜（６）の通りに操作を行い、測定を行った。
【０１９７】
（８） また、多孔性担体を、前記２の（１）の「有機化合物よりなり孔径が３μｍ未満の多孔性担体（セルロース混合エステル）」から（３）の「有機化合物よりなり孔径が３μｍ未満の多孔性担体（セルロースアセテート）」に変える以外は、前記（１）〜（６）の通りに操作を行い、測定を行った。
【０１９８】
（９） 更に、多孔性担体を、前記２の（１）の「有機化合物よりなり孔径が３μｍ未満の多孔性担体（セルロース混合エステル）」から（４）の「有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体（セルロースアセテート）」に変える以外は、前記（１）〜（６）の通りに操作を行い、測定を行った。
【０１９９】
５．測定結果
（１） 前記の測定の結果を、図１に示した。
この図より、以下のことが分かる。
【０２００】
（２） まず、多孔性担体として、「有機化合物よりなり孔径が３μｍ未満の多孔性担体（セルロース混合エステル）」を用いた場合には、タンパク質（３０ｍｇ／Ｌ、すなわち３ｍｇ／ｄＬのヒト血清アルブミン）を含む試料を測定したときの多孔性担体の表面の着色は濃いものであり、試料中にタンパク質が存在する、と判定することができる。
【０２０１】
しかし、この「有機化合物よりなり孔径が３μｍ未満の多孔性担体（セルロース混合エステル）」を用いた場合、タンパク質を含まない試料（純水）を測定したときの多孔性担体の表面の着色は、これもまた濃いものであり、試料中にタンパク質が存在する、と判定することとなった。
【０２０２】
すなわち、多孔性担体として、「有機化合物よりなり孔径が３μｍ未満の多孔性担体（セルロース混合エステル）」を用いた場合には、試料中にタンパク質が存在しないことを、正しく判定することができないことが分かる。
【０２０３】
よって、多孔性担体として「有機化合物よりなり孔径が３μｍ未満の多孔性担体」を用いる、試料中のタンパク質の測定方法及び測定キットにおいては、試料中のタンパク質を測定することができないことが確かめられた。
【０２０４】
（３） 次に、多孔性担体として、「有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体（セルロース混合エステル）」を用いた場合には、タンパク質（３０ｍｇ／Ｌ、すなわち３ｍｇ／ｄＬのヒト血清アルブミン）を含む試料を測定したときの多孔性担体の表面の着色は濃いものであり、試料中にタンパク質が存在する、と判定することができる。
【０２０５】
また、この「有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体（セルロース混合エステル）」を用いた場合、タンパク質を含まない試料（純水）を測定したときの多孔性担体の表面の着色は薄く、試料中にタンパク質が存在しない、と判定することができる。
【０２０６】
すなわち、多孔性担体として、「有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体（セルロース混合エステル）」を用いた場合には、試料中にタンパク質が存在することと、試料中にタンパク質が存在しないことを、それぞれ正しく判定できていることが分かる。
【０２０７】
よって、有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体を用いる、本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定キットにおいては、試料中のタンパク質を正確に測定できることが確かめられた。
【０２０８】
（４） 次に、多孔性担体として、「有機化合物よりなり孔径が３μｍ未満の多孔性担体（セルロースアセテート）」を用いた場合には、タンパク質（３０ｍｇ／Ｌ、すなわち３ｍｇ／ｄＬのヒト血清アルブミン）を含む試料を測定したときの多孔性担体の表面の着色は濃いものであり、試料中にタンパク質が存在する、と判定することができる。
【０２０９】
しかし、この「有機化合物よりなり孔径が３μｍ未満の多孔性担体（セルロースアセテート）」を用いた場合、タンパク質を含まない試料（純水）を測定したときの多孔性担体の表面の着色は、これもまた濃いものであり、試料中にタンパク質が存在する、と判定することとなった。
【０２１０】
すなわち、多孔性担体として、「有機化合物よりなり孔径が３μｍ未満の多孔性担体（セルロースアセテート）」を用いた場合には、試料中にタンパク質が存在しないことを、正しく判定することができないことが分かる。
【０２１１】
よって、多孔性担体として「有機化合物よりなり孔径が３μｍ未満の多孔性担体」を用いる、試料中のタンパク質の測定方法及び測定キットにおいては、試料中のタンパク質を測定することができないことが、この場合においても確かめられた。
【０２１２】
（５） 次に、多孔性担体として、「有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体（セルロースアセテート）」を用いた場合には、タンパク質（３０ｍｇ／Ｌ、すなわち３ｍｇ／ｄＬのヒト血清アルブミン）を含む試料を測定したときの多孔性担体の表面の着色は濃いものであり、試料中にタンパク質が存在する、と判定することができる。
【０２１３】
また、この「有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体（セルロースアセテート）」を用いた場合、タンパク質を含まない試料（純水）を測定したときの多孔性担体の表面の着色は薄く、試料中にタンパク質が存在しない、と判定することができる。
【０２１４】
すなわち、多孔性担体として、「有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体（セルロースアセテート）」を用いた場合には、試料中にタンパク質が存在することと、試料中にタンパク質が存在しないことを、それぞれ正しく判定できていることが分かる。
【０２１５】
よって、有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体を用いる、本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定キットにおいては、試料中のタンパク質を正確に測定できることが、この場合においても確かめられた。
【０２１６】
以上記載したように、有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体を用いる本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定キットは、試料中のタンパク質を正確に測定することができるのに対して、「有機化合物よりなり孔径が３μｍ未満の多孔性担体」を用いる場合には、試料中のタンパク質を正確に測定することができないことが確認できた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に微量に含まれるタンパク質を、高感度かつ簡便に測定することができる測定方法及び測定キットに関する。
本発明は、分析化学、生命科学及び医療の分野において有用であり、特に臨床検査分野において有用なものである。
【背景技術】
【０００２】
血清又は血漿のタンパク質濃度は、脱水、網内系疾患又は慢性感染症等において高値となる。
また、血漿タンパクの漏出、栄養不良又は肝機能障害等において低値となる。
このように血清又は血漿のタンパク質濃度は、各種疾患又は各種病態に伴って変化するので、その測定は疾患の診断及び治療において重視されている。
【０００３】
また、尿中のタンパク質は、腎疾患、心疾患、血液疾患、黄だん又は高熱等において出現する。
この尿中のタンパク質を測定することも、前記疾患の診断及び治療にとって重要である。
特に、尿中の微量のアルブミンを測定することは、糖尿病性腎症などの早期発見等において、大変重要である。
【０００４】
従来の試料中のタンパク質の測定方法（測定キット）としては、まず、タンパク質と結合するとその色調を変える色素を担体に含浸させた試験片を用いる方法がある。
しかし、この試験片を用いる方法は、測定限界が１０〜２０ｍｇ／ｄＬであり、試料中に微量に含まれるタンパク質を測定することができないものであった。
また、この測定方法（測定キット）は、試料中の他の物質や非結合態色素の影響を受けて、測定誤差が生じる場合もあった。
【０００５】
また、タンパク質中の４個のペプチド結合がアルカリ溶液中で２価の銅イオンとキレート結合して紫色に発色する反応を利用するＢｉｕｒｅｔ法（ビュレット法）は、測定限界は１０ｍｇ／ｄＬであるが、測定の操作は煩雑であり、測定に時間が掛かるものであった。
【０００６】
そして、２価の銅イオンとフェノール試薬を用いるＬｏｗｒｙ法（ローリー法）は、測定限界が２．５ｍｇ／ｄＬと感度は高いが、やはり測定の操作は煩雑であり、測定に時間を要するものであった。
【０００７】
また、ピロガロールレッド・モリブデン錯体が酸性条件下でタンパク質と結合することにより青紫色に変色する反応を利用するピロガロールレッド・モリブデン錯体発色法は、測定限界が２ｍｇ／ｄＬと感度は高いが、やはり測定の操作は煩雑なものであり測定に時間が掛かるものであった。
【０００８】
また、木下らは、試料中のタンパク質をメンブランフィルタ上に濃縮し、その後フィルタをフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で蛍光染色し、洗浄後にスポットの蛍光強度を測定する方法を報告している。
しかしながら、この方法においては、タンパク質とＦＩＴＣとの反応に３０分も要し、また妨害物質を除去するために染色後には洗浄を必要とするという煩雑なものであった（非特許文献１参照。）。
【０００９】
そして、藤田らは、タンパク質と色素−金属錯体との沈殿会合体をフィルタで物理的に補集した後、水酸化ナトリウム水溶液で再溶解し、この溶液の吸光度を測定する方法を報告している。
しかしながら、この方法においては、沈殿物の目詰まりのため定量性が決して良好とは言えず、またフィルタ上の着色を観察するものではなく、再溶解液を測定するものであるため、簡易迅速な分析に適さないものであった（非特許文献２参照。）。
【００１０】
なお、尿中の微量アルブミンを測定する方法（測定試薬）として、免疫比濁法又はラテックス比濁法を測定原理とするものがある。
この方法は高感度であるが、その測定に高価な分析装置を必要とするものであり、かつ測定試薬のコストも高いものであった。
【００１１】
また、最近、タンパク質と結合するとその色調を変える色素を担体に含浸させた試験片において、測定限界が２〜３ｍｇ／ｄＬのものが出てきたが、試験片は試料を希釈することなく、直接試料を試験片に接触させ測定を行うものであるので、試料中に含まれる種々の干渉物質の影響を受け易く、特に試料が尿である場合には尿に含まれる緩衝能を有する物質によりｐＨが変動し、このｐＨの変動により色素の色調の変化が影響を受け、試料中のタンパク質の測定に誤差が生じてしまうことがあった。
【００１２】
上述した従来のタンパク質の測定方法及び測定キットは、測定限界が高くすなわち測定の感度が低いものであったり、測定の操作が煩雑であったり、測定に時間を要したり、測定に高価な分析装置を必要とするものであったり、測定試薬のコストが高いものであったり、又は試料中の干渉物質による測定結果への影響を受け易いものであった。
【００１３】
なお、本発明者らは、先に、ａ）タンパク質を含有する可能性がある試料と、タンパク質とイオン会合体を形成する色素を混合し、前記イオン会合体を沈殿させずにイオン会合体溶液を形成させる工程；ｂ）前記イオン会合体溶液を疎水性フィルタに通すことにより、前記イオン会合体溶液中に溶解した前記会合体を前記フィルタに吸着させる工程；及び、ｃ）前記フィルタ上の前記会合体を定性・定量的に分析する工程を順次行う、試料中のタンパク質の分析方法及び分析キットを開発した（特許文献１参照。）。
【００１４】
また、本発明者らは、先に、試料、タンパク質と会合体を形成する色素、及び界面活性物質を接触させる工程；前記接触後その一定量を多孔性膜上に添加する工程；並びに前記多孔性膜上の着色域を測定する工程を含む、試料中のタンパク質の測定方法及び測定キットを開発した（特許文献２参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特開平１１−３０４８０３号公報
【特許文献２】特開２００５−５５４１７号公報
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】「分析化学」、第２３巻、第１５４３頁〜第１５４４頁、１９７４年
【非特許文献２】「分析化学」、第４４巻、第７３３頁〜第７３８頁、１９９５年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の課題は、測定に当たり高価な装置、器具又は測定試薬を必要とせず、測定の操作が簡便であり、測定に要する時間が極めて短く、試料中の干渉物質による測定結果への影響を受けにくいものであり、かつ試料中に微量に含まれるタンパク質をも測定することができる高感度な試料中のタンパク質の測定方法及び測定キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、本出願人が独立行政法人科学技術振興機構から開発委託を受けたことに基づき、種々検討を行ない、本発明を完成させた。
本発明は、以下の発明を包含するものである。
（１） １）試料、及びタンパク質と会合し凝集体を形成する色素を、接触させ、これにより、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる凝集体形成工程；
２）当該凝集体の形成後、当該凝集体を含む溶液の一定量を有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体に通す通流工程；及び
３）当該多孔性担体表面の色を測定する色測定工程、を含む試料中のタンパク質の測定方法。
（２） 凝集体形成工程において、界面活性物質を共存させる、前記（１）記載の試料中のタンパク質の測定方法。
（３） タンパク質と会合し凝集体を形成する色素を含有する試薬、及び有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体を含む、試料中のタンパク質の測定キット。
（４） 界面活性物質を更に含む、前記（３）記載の試料中のタンパク質の測定キット。
（５） 前記（１）記載の測定方法に使用されるものである、前記（３）記載の試料中のタンパク質の測定キット。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定キットは、測定に当たり高価な装置、器具又は測定試薬を必要とせず、測定の操作が簡便であり、測定に要する時間が極めて短く、かつ試料中に微量に含まれるタンパク質をも測定することができる高感度な試料中のタンパク質の測定方法及び測定キットである。
【００２０】
また、本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定キットは、試料と、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素を接触させるものであり、これにより試料は希釈され、すなわち試料中の干渉物質も希釈され、当該干渉物質の濃度は低いものとなるので、本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定キットは、試料中の干渉物質による測定結果への影響を受けにくいものである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】試料中のタンパク質の測定方法及び測定キットにおける、有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体を用いることの効果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
Ｉ．試料中のタンパク質の測定方法
１．試料
本発明における試料としては、タンパク質を含む可能性がある試料であれば特に限定されない。
【００２３】
この試料としては、例えば、ヒト若しくは動物に由来する試料、植物に由来する試料、微生物に由来する試料、食物、飲料、飲料水、薬剤、試薬、又は環境試料等を挙げることができる。
【００２４】
ヒト若しくは動物に由来する試料は、特に限定されず、例えば、ヒト或いは動物の、血液、血清、血漿、尿、精液、髄液、唾液、汗、涙、腹水、若しくは羊水などの体液；大便などの排泄物；脳、心臓、腎臓、若しくは肝臓などの臓器；毛髪、皮膚、爪、筋肉、若しくは神経などの組織；又は細胞等を挙げることができる。
【００２５】
食物は、特に限定されず、例えば、食肉、野菜、穀物、果物、卵、水産物、又は加工食品等を挙げることができる。
【００２６】
飲料は、特に限定されず、例えば、ジュース、牛乳、茶、コーヒー、又は酒類等を挙げることができる。
【００２７】
薬剤は、特に限定されず、例えば、輸液、注射液、散剤、又は錠剤等を挙げることができる。
【００２８】
なお、本発明において測定に用いる試料は、液体である必要があるので、もし試料が液体でない場合には、抽出処理又は可溶化処理等の前処理を既知の方法に従って行い、液体試料とすればよい。
また、試料は、必要に応じて、希釈又は濃縮処理等を行ってもよい。
【００２９】
２．タンパク質と会合し凝集体を形成する色素
本発明における、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素は、静電気的引力又は疎水相互作用等によってタンパク質と会合することが可能であり、かつ、この色素と会合したタンパク質同士が凝集体を形成することが可能なものである。
このような色素であれば、特に限定されずに用いることができる。
【００３０】
このタンパク質と会合し凝集体を形成する色素としては、例えば、エリスロシンＢ、エオシンＢ、エオシンＹ、フロキシンＢ、若しくはローズベンガルなどのキサンテン系色素；クマシブリリアントブルー（ＣＢＢ）、ブロモクロロフェノールブルー、テトラブロモフェノールブルー、ブロモフェノールブルー、若しくはブロモクレゾールパープルなどのトリフェニルメタン系色素；又はバッファローブラック、アシドオレンジ１２、メチルオレンジ、オレンジＧ、若しくはアゾスルファチアゾールなどのアゾ色素等を挙げることができる。
【００３１】
このタンパク質と会合し凝集体を形成する色素としては、疎水性が高いものが好ましい。
【００３２】
また、このタンパク質と会合し凝集体を形成する色素としては、その酸解離定数（ｐＫａ）の値が測定を行おうとするタンパク質の等電点（ｐＩ）の値よりも低いものが好ましい。
【００３３】
このように、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値が、測定を行おうとするタンパク質の等電点の値よりも低い場合、前記の凝集体形成工程において当該凝集体を形成させる際のｐＨを、測定しようとするタンパク質の等電点未満のｐＨとしたときは、測定しようとするタンパク質の電荷がプラス側となり、また前記色素のマイナス電荷を保つことができ、これにより試料に含まれるタンパク質と前記色素とが会合し易くなり、これによりこのタンパク質測定の感度を高めることができるので、好ましい。
【００３４】
このタンパク質と会合し凝集体を形成する色素としては、キサンテン系色素であることが好ましく、エリスロシンＢ、エオシンＢ、エオシンＹ、フロキシンＢ若しくはローズベンガルであることがより好ましく、エリスロシンＢであることが特に好ましい。
【００３５】
このタンパク質と会合し凝集体を形成する色素は、このタンパク質と会合し凝集体を形成する色素を含有する試薬として、より好ましくは、このタンパク質と会合し凝集体を形成する色素を含有する溶液の試薬として、試料と混合し、接触させることが好ましい。
【００３６】
なお、このタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の濃度は、低すぎると測定の感度が得られず試料中のタンパク質を測定することができないので、通常、試料中のタンパク質と接触させるときの濃度で、１μＭ以上であることが好ましく、１０μＭ以上であることがより好ましく、２０μＭ以上であることが特に好ましい。
【００３７】
また、このタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の濃度は、高すぎると試料中にタンパク質が存在しなくとも当該多孔性担体の表面に発色が生じてしまい、試料中にタンパク質が存在するときとの判別が難しくなるので、通常、試料中のタンパク質と接触させるときの濃度で、５００μＭ以下であることが好ましく、１００μＭ以下であることがより好ましく、５０μＭ以下であることが特に好ましい。
【００３８】
３．有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体
本発明における有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体は、有機化合物よりなり、多数の微細な孔を有し、かつその孔径が３μｍ以上の担体であって、この担体に溶液を添加したときにその溶液を通すことができるものであれば、特に制限なく用いることができる。
【００３９】
この有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体であるが、有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体であれば、特に制限なく用いることができる。
この有機化合物としては、特に限定はないが、例えば、セルロースアセテート、セルロース混合エステル、セルロース混合エステル−混合エステル、セルロース繊維、再生セルロース、親水性強化セルロース、ニトロセルロース、強化セルロース、ポリプロピレン、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、ポリフッ化ビニリデン、親水性ポリフッ化ビニリデン、親水性ポリテトラフルオロエチレン、ポリカーボネート、ナイロン、ポリアミド、ポリエステル、ポリエステル−ポリエチレンテレフタレート、又はセルロースアセテートコートポリエステル不織布等を挙げることができる。
【００４０】
前記の多孔性担体の孔径（又は粒子保持能、若しくは保留粒子径等）は、３μｍ以上である必要がある。
有機化合物よりなり孔径が３μｍ未満の多孔性担体を用いて測定を行う場合、タンパク質を含まない試料を測定したときの当該多孔性担体の表面の着色は濃いものとなり、「試料中にタンパク質が存在する」と誤って判定されることになる。
すなわち、多孔性担体として、有機化合物よりなり孔径が３μｍ未満の多孔性担体を用いた場合には、試料中にタンパク質が存在しないことを、正しく判定することができない。
よって、有機化合物よりなる多孔性担体を用いて試料中のタンパク質の測定を行う場合、その孔径は３μｍ以上である必要がある。
【００４１】
なお、特に挙げるならば、前記の孔径は５μｍ以上のものが好ましく、８μｍ以上のものがより好ましく、１０μｍ以上のものが特に好ましい。
また、これも特に挙げるならば、孔径が２０μｍ以下のものが好ましい。
【００４２】
なお、本発明における有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体は、孔径が３μｍ以上のろ紙若しくは有機化合物よりなるフィルタ等よりなるものであっても良く、そしてこれらのろ紙若しくはフィルタ等が複数組み合わされたものであっても良く、又はこれらのろ紙若しくはフィルタ等がろ過（フィルタ）用の器具にセットされたものであっても良く、あるいはこれらのろ紙若しくはフィルタ等がハウジングに収められたものであっても良く、更には、これらのろ紙若しくはフィルタ等が有機化合物若しくは他の材質よりなるプレフィルタ等と組み合わされたものであってもよい。
【００４３】
この有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体の内、孔径が３μｍ以上のろ紙若しくは有機化合物よりなるフィルタ等よりなるものとしては、例えば、ワットマンジャパン社の製品としては、「商品名：トラックエッチ・サイクロポアメンブレン、カタログ番号：７０６１−１３１３、孔径：５．０μｍ、メンブレン：ポリエステル」、「商品名：トラックエッチ・サイクロポアメンブレン、カタログ番号：７０６２−４７１２、孔径：３．０μｍ、メンブレン：ポリカーボネート」、「商品名：トラックエッチ・サイクロポアメンブレン、カタログ番号：７０６２−２５１３、孔径：５．０μｍ、メンブレン：ポリカーボネート、厚さ：１５μｍ」、「商品名：トラックエッチ・サイクロポアメンブレン、カタログ番号：７０６０−２５１４、孔径：８．０μｍ、メンブレン：ポリカーボネート、厚さ：１２μｍ」、「商品名：トラックエッチ・サイクロポアメンブレン、カタログ番号：７０６０−２５１５、孔径：１０．０μｍ、メンブレン：ポリカーボネート」、「商品名：トラックエッチ・サイクロポアメンブレン、カタログ番号：７０６０−２５１６、孔径：１２．０μｍ、メンブレン：ポリカーボネート、厚さ：８μｍ」、「商品名：トラックエッチ・ニュークリポアメンブレン、カタログ番号：１１０６１２、孔径：３．０μｍ、メンブレン：ポリカーボネート」、「商品名：トラックエッチ・ニュークリポアメンブレン、カタログ番号：１１０６１３、孔径：５．０μｍ、メンブレン：ポリカーボネート」、「商品名：トラックエッチ・ニュークリポアメンブレン、カタログ番号：１１０６１４、孔径：８．０μｍ、メンブレン：ポリカーボネート」、「商品名：トラックエッチ・ニュークリポアメンブレン、カタログ番号：１１０６１５、孔径：１０．０μｍ、メンブレン：ポリカーボネート」、「商品名：トラックエッチ・ニュークリポアメンブレン、カタログ番号：１１０６１６、孔径：１２．０μｍ、メンブレン：ポリカーボネート」、「商品名：トラックエッチ・ニュークリポアメンブレン、カタログ番号：１５０４４６、孔径：８．０μｍ、メンブレン：ポリカーボネート・ＰＶＰフリー」、「商品名：ニトロセルロースメンブレンＷＣＮ、カタログ番号：７１９３−００２、孔径：３．０μｍ、メンブレン：ニトロセルロース、厚さ：１２５μｍ」、「商品名：ニトロセルロースメンブレンＷＣＮ、カタログ番号：７１９５−００２、孔径：５．０μｍ、メンブレン：ニトロセルロース、厚さ：１２５μｍ」、「商品名：ニトロセルロースメンブレンＡＥ９８、カタログ番号：１０４００２０６、孔径：５．０μｍ、メンブレン：ニトロセルロース、厚さ：１２５μｍ」、「商品名：ニトロセルロースメンブレンＡＥ９９、カタログ番号：１０４００１０６、孔径：８．０μｍ、メンブレン：ニトロセルロース、厚さ：１２５μｍ」、「商品名：ニトロセルロースメンブレンＡＥ１００、カタログ番号：１０４０００１２、孔径：１２．０μｍ、メンブレン：ニトロセルロース、厚さ：１２５μｍ」、又は「商品名：セルロース混合エステルメンブレンＭＥ２９、カタログ番号：１０４００７７２、孔径：３．０μｍ、メンブレン：セルロース混合エステル、厚さ：１５０μｍ」等を挙げることができる。また、アドバンテック東洋社の製品としては、「商品名：ポリカーボネートタイプメンブレンフィルター・Ｋ８００Ａ０１３Ａ、商品コード：１６１８０００１、孔径：８．００μｍ、メンブレン：ポリカーボネート、厚さ：７μｍ」、「商品名：セルロース混合エステルタイプメンブレンフィルター・Ａ５００Ａ０２５Ａ、商品コード：１０１５０００２、孔径：５．００μｍ、メンブレン：セルロース混合エステル、厚さ：１６０μｍ」、「商品名：セルロース混合エステルタイプメンブレンフィルター・Ａ３００Ａ０２５Ａ、商品コード：１０１３０００２、孔径：３．００μｍ、メンブレン：セルロース混合エステル、厚さ：１５５μｍ」、又は「商品名：セルロースアセテートタイプメンブレンフィルター・Ｃ３００Ａ０２５Ａ、商品コード：１１１３０００２、孔径：３．００μｍ、メンブレン：セルロースアセテート、厚さ：１３５μｍ」等を挙げることができる。
【００４４】
また、有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体の内、孔径が３μｍ以上のろ紙若しくは有機化合物よりなるフィルタ等がハウジングに収められたものとしては、例えば、ワットマンジャパン社の「商品名：ＧＤ／Ｘ シリンジフィルタ、カタログ番号：６８７０−２５５０、孔径：５．０μｍ、メンブレン：ナイロン」、「商品名：プラディスクＦＰ３０ ＣＮ−Ｓ、滅菌済み個包装、カタログ番号：１０４６２０００、孔径：５．０μｍ、メンブレン：ニトロセルロース」、「商品名：プラディスクＦＰ３０ ＣＮ、非滅菌、カタログ番号：１０４６２５２０、孔径：５．０μｍ、メンブレン：ニトロセルロース」、又は「商品名：ポリディスクＨＤ、カタログ番号：６７２８−５０５０、孔径：５．０μｍ、メンブレン：ポリプロピレン」等を挙げることができる。
【００４５】
４．界面活性物質
本発明においては、前記の凝集体形成工程において、界面活性物質を共存させることが、前記の色測定工程においてタンパク質を含有する試料における多孔性担体表面の色の発色度（濃さ）が高くなって高感度に測定が行えるようになり、かつタンパク質を含有しない試料の測定（陰性対照；又は試薬ブランク）において前記の多孔性担体表面の色の発色が無いか又はごく薄い発色にとどまり、前記の色の測定におけるタンパク質を含有する試料とタンパク質を含有しない試料との判別が容易になるという効果を生じるので、界面活性物質を共存させることが好ましい。
【００４６】
この界面活性物質としては、界面活性物質であれば、特に限定されずに用いることができる。
この界面活性物質は、天然の界面活性物質であってもよく、合成等により製造された界面活性物質であってもよい。
【００４７】
この界面活性物質としては、例えば、界面活性剤、多糖類若しくはその誘導体、又はその他の界面活性物質等を挙げることができる。
【００４８】
界面活性剤としては、例えば、非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、及び陽イオン性界面活性剤等を挙げることができる。
【００４９】
なお、この界面活性剤をより具体的に例示すると、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンフィトステロール、フィトスタノール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油若しくはポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性界面活性剤；酢酸ベタインなどの両性界面活性剤；ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩などの陰イオン性界面活性剤；アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩若しくは塩化ベンザルコニウムなどの陽イオン性界面活性剤等を挙げることができる。
【００５０】
前記の非イオン性界面活性剤の具体例として、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−４０５、又はＴｗｅｅｎ２０等を挙げることができる。
【００５１】
多糖類としては、単糖が数個以上脱水縮合して生じた糖質を挙げることができ、例えば、シクロデキストリン（ＣＤ）、デキストラン、又はヘパリン等を挙げることができる。
【００５２】
多糖類の誘導体としては、前記多糖類の水素若しくは水酸基などの官能基が、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシブチル基、グルコシル基、マルトシル基、ジエチルアミノエチル基、メチル基若しくはエチリデン基などの脂肪族炭化水素基、シクロプロピル基などの脂環式炭化水素基、フェニル基、ベンジル基若しくはベンジリデン基などの芳香族炭化水素基、メトキシ基若しくはフェノキシ基などのエーテル基、アセトキシ基若しくはベンゾイロキシ基などのエステル基、アセチル基、プロピオニル基若しくはベンゾイル基などのアシル基、スルフヒドリル基、スルホ基、スルホニル基、カルボキシル基、アミノ基、イミノ基、ニトリル基、カルボニル基、オキソ基、水酸基、又はニトロ基等で置換されたもの等を挙げることができる。
更に、多糖類の誘導体としては、前記多糖類又は前記置換体の架橋物等を挙げることができる。
【００５３】
シクロデキストリンとしては、α−シクロデキストリン（α−ＣＤ）、β−シクロデキストリン（β−ＣＤ）、γ−シクロデキストリン（γ−ＣＤ）等を挙げることができる。
また、シクロデキストリン誘導体としては、例えば、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン又はγ−シクロデキストリン等の水酸基が、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシブチル基、グルコシル基、マルトシル基、ベンジル基、若しくはスルホニル基などで置換されたもの、又はこれらのシクロデキストリン若しくはその誘導体の架橋物等を挙げることができる。
【００５４】
シクロデキストリンとしては、β−シクロデキストリン又はγ−シクロデキストリンが好ましく、シクロデキストリン誘導体としては、β−シクロデキストリン若しくはγ−シクロデキストリンの水酸基などが置換されたもの、又はβ−シクロデキストリン若しくはγ−シクロデキストリンの架橋物が好ましい。
【００５５】
デキストランサルフェイト若しくはその誘導体は、分子量が１，０００〜５，０００，０００の範囲のものが好ましく、分子量が５，０００〜１，０００，０００の範囲のものが特に好ましい。
【００５６】
その他の界面活性物質としては、例えば、ポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコールなどのポリアルキレングリコール等を挙げることができる。
このポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコール等のポリアルキレングリコールとしては、例えば、分子量２００〜４，０００，０００のものを用いることができる。分子量１，０００〜４００，０００のものがより好ましく、分子量２，０００〜４０，０００のものが特に好ましい。
【００５７】
界面活性物質としては、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−４０５若しくはＴｗｅｅｎ２０等の非イオン性界面活性剤、又はポリエチレングリコール若しくはポリプロピレングリコールなどのポリアルキレングリコール等が好ましく、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００がより好ましい。
【００５８】
なお、この界面活性物質の濃度は、低すぎるとその共存の効果が得られないので、通常は、前記凝集体形成工程において共存させるときの濃度で、０．０００１％（Ｗ／Ｖ）以上であることが好ましく、０．００１％（Ｗ／Ｖ）以上であることがより好ましく、０．００５％（Ｗ／Ｖ）以上であることが特に好ましい。
【００５９】
また、この界面活性物質の濃度は、高すぎるとそれを含む溶液の粘性が上昇する可能性があり、そうなると前記通流工程における有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体への添加等の量に誤差が生じることにもなるので、通常は、前記凝集体形成工程において共存させるときの濃度で、５％（Ｗ／Ｖ）以下であることが好ましく、１％（Ｗ／Ｖ）以下であることがより好ましく、０．１％（Ｗ／Ｖ）以下であることが特に好ましい。
【００６０】
前記の凝集体形成工程において、界面活性物質は、複数種類のものを組み合わせて共存させても良い。
【００６１】
５．ｐＨ
本発明では、前記の凝集体形成工程において、試料に含まれていたタンパク質と、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる際のｐＨは、測定しようとするタンパク質の等電点（ｐＩ）の値未満のｐＨであることが好ましい。
このように、測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨとした場合には、
測定しようとするタンパク質の電荷がプラス側となり、前記の色素と会合し易くなり、これによりこのタンパク質測定の感度を高めることができるので、好ましい。
【００６２】
なお、このタンパク質の等電点の値の例を示すと、ヒトのアルブミンはｐＨ４．８、α１−グロブリンはｐＨ２．０、γ１−グロブリンはｐＨ５．８、γ２−グロブリンはｐＨ７．４、ハプトグロブリンはｐＨ４．１、卵白アルブミンはｐＨ４．６等を挙げることができる。
よって、例えば、ヒトのアルブミンを測定しようとする場合は、前記の凝集体形成工程におけるｐＨをｐＨ４．８未満とすることが好ましい。
【００６３】
また、本発明では、前記の凝集体形成工程において、試料に含まれていたタンパク質と、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる際のｐＨは、このタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近にあることが好ましい。
これは、より好ましくは前記の凝集体形成工程においてタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値の±２の範囲内のｐＨとすることであり、特に好ましくはタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値の±１．５の範囲内のｐＨとすることであり、更に好ましくはこのタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値の±１の範囲内のｐＨとすることである。
【００６４】
このように、前記の凝集体形成工程において、ｐＨを前記のようにタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近にすることにより、前記色素のマイナス電荷を保つことができ、これにより試料に含まれるタンパク質と会合し易くなり、これによりこのタンパク質測定の感度を高めることができるので、好ましい。
【００６５】
なお、このタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の例を示すと、エリスロシンＢはｐＫａ３．２、エオシンＢはｐＫａ２．２、エオシンＹはｐＫａ２．８、及びローズベンガルはｐＫａ３．５１等である。
【００６６】
よって、例えば、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素としてエリスロシンＢを用いる場合には、前記の凝集体形成工程におけるｐＨを、エリスロシンＢの酸解離定数（ｐＫａ）３．２の付近のｐＨとすることが好ましく、ｐＨ１．２〜ｐＨ５．２の範囲内のｐＨとすることがより好ましく、ｐＨ１．７〜ｐＨ４．７の範囲内のｐＨとすることが特に好ましく、ｐＨ２．２〜ｐＨ４．２の範囲内のｐＨとすることが更に好ましい。
【００６７】
また、例えば、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素としてエオシンＢを用いる場合には、前記の凝集体形成工程におけるｐＨを、エオシンＢの酸解離定数（ｐＫａ）２．２の付近のｐＨとすることが好ましく、ｐＨ１．２〜ｐＨ４．２の範囲内のｐＨとすることがより好ましく、ｐＨ１．４〜ｐＨ３．７の範囲内のｐＨとすることが特に好ましく、ｐＨ１．７〜ｐＨ３．２の範囲内のｐＨとすることが更に好ましい。
【００６８】
そして、例えば、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素としてエオシンＹを用いる場合には、前記の凝集体形成工程におけるｐＨを、エオシンＹの酸解離定数（ｐＫａ）２．８の付近のｐＨとすることが好ましく、ｐＨ１．２〜ｐＨ４．８の範囲内のｐＨとすることがより好ましく、ｐＨ１．５〜ｐＨ４．３の範囲内のｐＨとすることが特に好ましく、ｐＨ１．８〜ｐＨ３．８の範囲内のｐＨとすることが更に好ましい。
【００６９】
そして、例えば、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素としてローズベンガルを用いる場合には、前記の凝集体形成工程におけるｐＨを、ローズベンガルの酸解離定数（ｐＫａ）３．５１の付近のｐＨとすることが好ましく、ｐＨ１．５〜ｐＨ５．５の範囲内のｐＨとすることがより好ましく、ｐＨ２．０〜ｐＨ５．０の範囲内のｐＨとすることが特に好ましく、ｐＨ２．５〜ｐＨ４．５の範囲内のｐＨとすることが更に好ましい。
【００７０】
以上のことより、前記の凝集体形成工程においては、ｐＨを、測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨとし、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨとすることが特に好ましい。
【００７１】
例えば、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素としてエリスロシンＢを用い、試料中のヒトのアルブミンを測定しようとする場合は、前記の凝集体形成工程において、ヒトのアルブミンの等電点であるｐＨ４．８未満のｐＨであって、かつエリスロシンＢの酸解離定数（ｐＫａ）３．２の付近のｐＨとすることが好ましく、ｐＨ１．２以上かつｐＨ４．８未満の範囲内のｐＨとすることがより好ましく、ｐＨ１．７〜ｐＨ４．５の範囲内のｐＨとすることが特に好ましく、ｐＨ２．２〜ｐＨ４．２の範囲内のｐＨとすることが更に好ましい。
【００７２】
また、例えば、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素としてエオシンＢを用い、試料中のヒトのアルブミンを測定しようとする場合は、前記の凝集体形成工程において、ヒトのアルブミンの等電点であるｐＨ４．８未満のｐＨであって、かつエオシンＢの酸解離定数（ｐＫａ）２．２の付近のｐＨとすることが好ましく、ｐＨ１．２〜ｐＨ４．２の範囲内のｐＨとすることがより好ましく、ｐＨ１．４〜ｐＨ３．７の範囲内のｐＨとすることが特に好ましく、ｐＨ１．７〜ｐＨ３．２の範囲内のｐＨとすることが更に好ましい。
【００７３】
そして、例えば、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素としてエオシンＹを用い、試料中のヒトのアルブミンを測定しようとする場合は、前記の凝集体形成工程において、ヒトのアルブミンの等電点であるｐＨ４．８未満のｐＨであって、かつエオシンＹの酸解離定数（ｐＫａ）２．８の付近のｐＨとすることが好ましく、ｐＨ１．２以上かつｐＨ４．８未満の範囲内のｐＨとすることがより好ましく、ｐＨ１．５〜ｐＨ４．３の範囲内のｐＨとすることが特に好ましく、ｐＨ１．８〜ｐＨ３．８の範囲内のｐＨとすることが更に好ましい。
【００７４】
そして、例えば、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素としてローズベンガルを用い、試料中のヒトのアルブミンを測定しようとする場合は、前記の凝集体形成工程において、ヒトのアルブミンの等電点であるｐＨ４．８未満のｐＨであって、かつローズベンガルの酸解離定数（ｐＫａ）３．５１の付近のｐＨとすることが好ましく、ｐＨ１．５以上かつｐＨ４．８未満の範囲内のｐＨとすることがより好ましく、ｐＨ２．０〜ｐＨ４．６５の範囲内のｐＨとすることが特に好ましく、ｐＨ２．５〜ｐＨ４．５の範囲内のｐＨとすることが更に好ましい。
【００７５】
なお、前記の凝集体形成工程においては、そのｐＨが低すぎると、例えばｐＨ１未満であると、タンパク質が変性や不溶化されるので好ましくない。
【００７６】
そして、前記の凝集体形成工程において、試料に含まれていたタンパク質と、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる際のｐＨを前記の通りのｐＨとするには、このｐＨとなるような緩衝剤（これらのｐＨ域に緩衝能がある緩衝剤）を用いることが好ましい。
この緩衝剤としては、既知の緩衝剤を用いることができる。
【００７７】
例えば、緩衝剤として、グリシン（ｐＫａ１：２．３５）、リン酸（ｐＫａ１：２．１５）、フタル酸（ｐＫａ１：２．９５、ｐＫａ２：５．４１）、クエン酸（ｐＫａ１：３．１３、ｐＫａ２：４．７６）、バルビツール酸（ｐＫａ１：４．０４）、コハク酸（ｐＫａ１：４．２１、ｐＫａ２：５．６４）、酢酸（ｐＫａ２：４．７６）、及び種々のグッド緩衝剤等を挙げることができる。
【００７８】
６．測定操作
本発明における試料中のタンパク質の測定方法の測定操作について、以下説明を行う。
（１）凝集体形成工程
試料、及びタンパク質と会合し凝集体を形成する色素を、接触させ、これにより、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる凝集体形成工程であるが、前記の試料と、前記のタンパク質と会合し凝集体を形成する色素を、接触させることができれば、どのような方法でもよい。
この接触により、試料中に含まれるタンパク質と、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素とを、会合させ、これら会合した「タンパク質−タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」の凝集体が形成される。
このときの濃度については、前記の通りである。
【００７９】
なお、前記の通り、この凝集体形成工程においては、界面活性物質を共存させることが好ましい。
【００８０】
この凝集体形成工程において、前記の凝集体を形成させるために、試料、及びタンパク質と会合し凝集体を形成する色素を接触させる時間であるが、これは特には限定はなく、適宜設定すれば良い。
【００８１】
なお、通常は、この凝集体形成工程において、試料と、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素とを接触させて、直ちに、次の通流工程を実施することができるが、この試料と、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素を接触させる時間としては、２秒間以上接触させることが好ましく、５秒間以上であることがより好ましく、１０秒間以上であることが特に好ましく、２０秒間以上であることが更に好ましい。
【００８２】
なお、この凝集体形成工程において、前記の凝集体を形成させるために、試料、及びタンパク質と会合し凝集体を形成する色素を接触させる際の温度であるが、特に限定はない。
但し、温度が高すぎるとタンパク質が変性する可能性があるので、６０℃以下が好ましく、５０℃以下がより好ましく、４０℃以下が特に好ましく、３０℃以下が更に好ましい。
【００８３】
また、この凝集体形成工程において、試料、及びタンパク質と会合し凝集体を形成する色素を接触させる際の温度が低すぎると、タンパク質が変性したり、タンパク質と当該色素との会合及び凝集体形成の反応に時間が掛かる可能性があるので、５℃以上が好ましく、１０℃以上がより好ましく、１５℃以上が特に好ましく、２０℃以上が更に好ましい。
【００８４】
なお、試料、及びタンパク質と会合し凝集体を形成する色素を、接触させ、これにより、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる凝集体形成工程は１段階で行ってもよいが、２段階以上の複数段階で行ってもよい。
【００８５】
この凝集体形成工程を１段階で行う場合、例えば、次の態様により実施することができる。
【００８６】
（ａ） 「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」を含有する試薬と、試料とを混合し、接触させ、これにより、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる。
【００８７】
（ｂ） 「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」を含有し、そのｐＨが「測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨ」である試薬と、試料とを混合し、接触させ、これにより、測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨにおいて、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる。
【００８８】
（ｃ） 「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」及び「界面活性物質」を含有する試薬と、試料とを混合し、接触させ、これにより、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる。又は、
【００８９】
（ｄ） 「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」及び「界面活性物質」を含有し、そのｐＨが「測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨ」である試薬と、試料とを混合し、接触させ、これにより、測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨにおいて、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる。
【００９０】
また、この凝集体形成工程を２段階以上の複数段階で行う場合、例えば、次の態様により実施することができる。
【００９１】
（Ａ） 第１段階： 「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」を含有する試薬と、試料とを混合し、接触させる。
第２段階： 第１段階の混合液に、「緩衝剤」を含有する試薬〔そのｐＨが測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨであるもの〕を混合し、この混合液のｐＨを「測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨ」とし、このｐＨにおいて、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる。
【００９２】
（Ｂ） 第１段階： 「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」及び「界面活性物質」を含有する試薬と、試料とを混合し、接触させる。
第２段階： 第１段階の混合液に、「緩衝剤」を含有する試薬〔そのｐＨが測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨであるもの〕を混合し、この混合液のｐＨを「測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨ」とし、このｐＨにおいて、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる。
【００９３】
（Ｃ） 第１段階： 「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」を含有する試薬と、試料とを混合し、接触させる。
第２段階： 第１段階の混合液に、「界面活性物質」及び「緩衝剤」を含有する試薬〔そのｐＨが測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨであるもの〕を混合し、この混合液のｐＨを「測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨ」とし、このｐＨにおいて、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる。
【００９４】
（Ｄ） 第１段階： 「緩衝剤」を含有する試薬〔そのｐＨが測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨであるもの〕と、試料とを混合する。
第２段階： 第１段階の混合液に、「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」を含有する試薬を混合し、この混合液において、「測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨ」で、試料及び「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」を接触させ、これにより、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる。
【００９５】
（Ｅ） 第１段階： 「緩衝剤」及び「界面活性物質」を含有する試薬〔そのｐＨが測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨであるもの〕と、試料とを混合する。
第２段階： 第１段階の混合液に、「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」を含有する試薬を混合し、この混合液において、「測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨ」で、試料及び「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」を接触させ、これにより、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる。
【００９６】
（Ｆ） 第１段階： 「緩衝剤」を含有する試薬〔そのｐＨが測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨであるもの〕と、試料とを混合する。
第２段階： 第１段階の混合液に、「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」及び「界面活性物質」を含有する試薬を混合し、この混合液において、「測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨ」で、試料及び「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」を接触させ、これにより、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる。
【００９７】
（Ｇ） 第１段階： 「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」を含有する試薬と、試料とを混合し、接触させる。
第２段階： 第１段階の混合液に、「界面活性物質」を含有する試薬を混合する。
第３段階： 第２段階の混合液に、「緩衝剤」を含有する試薬〔そのｐＨが測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨであるもの〕を混合し、この混合液のｐＨを「測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨ」とし、このｐＨにおいて、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる。
【００９８】
（Ｈ） 第１段階： 「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」を含有する試薬と、試料とを混合し、接触させる。
第２段階： 第１段階の混合液に、「緩衝剤」を含有する試薬〔そのｐＨが測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨであるもの〕を混合する。
第３段階： 第２段階の混合液に、「界面活性物質」を含有する試薬を混合し、この混合液において、「測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨ」で、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる。
【００９９】
（Ｉ） 第１段階： 「界面活性物質」を含有する試薬と、試料とを混合する。
第２段階： 第１段階の混合液に、「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」を含有する試薬を混合し、接触させる。
第３段階： 第２段階の混合液に、「緩衝剤」を含有する試薬〔そのｐＨが測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨであるもの〕を混合し、この混合液のｐＨを「測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨ」とし、このｐＨにおいて、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる。
【０１００】
（Ｊ） 第１段階： 「界面活性物質」を含有する試薬と、試料とを混合する。
第２段階： 第１段階の混合液に、「緩衝剤」を含有する試薬〔そのｐＨが測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨであるもの〕を混合する。
第３段階： 第２段階の混合液に、「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」を含有する試薬を混合し、接触させ、この混合液において、「測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨ」で、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる。
【０１０１】
（Ｋ） 第１段階： 「緩衝剤」を含有する試薬〔そのｐＨが測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨであるもの〕と、試料とを混合する。
第２段階： 第１段階の混合液に、「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」を含有する試薬を混合し、接触させる。
第３段階： 第２段階の混合液に、「界面活性物質」を含有する試薬を混合し、この混合液において、「測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨ」で、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる。
【０１０２】
（Ｌ） 第１段階： 「緩衝剤」を含有する試薬〔そのｐＨが測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨであるもの〕と、試料とを混合する。
第２段階： 第１段階の混合液に、「界面活性物質」を含有する試薬を混合する。
第３段階： 第２段階の混合液に、「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」を含有する試薬を混合し、接触させ、この混合液において、「測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨ」で、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる。
【０１０３】
（Ｍ） 第１段階： 「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」を含有する試薬と、「界面活性物質」を含有する試薬とを混合する。
第２段階： 第１段階の混合液に、試料を混合し、接触させる。
第３段階： 第２段階の混合液に、「緩衝剤」を含有する試薬〔そのｐＨが測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨであるもの〕を混合し、この混合液のｐＨを「測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨ」とし、このｐＨにおいて、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる。
【０１０４】
（Ｎ） 第１段階： 「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」を含有する試薬と、「緩衝剤」を含有する試薬〔そのｐＨが測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨであるもの〕を混合する。
第２段階： 第１段階の混合液に、試料を混合し、接触させる。
第３段階： 第２段階の混合液に、「界面活性物質」を含有する試薬を混合し、この混合液において、「測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨ」で、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる。
【０１０５】
（Ｏ） 第１段階： 「界面活性物質」を含有する試薬と、「緩衝剤」を含有する試薬〔そのｐＨが測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨであるもの〕を混合する。
第２段階： 第１段階の混合液に、試料を混合する。
第３段階： 第２段階の混合液に、「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」を含有する試薬を混合し、接触させ、この混合液において、「測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨ」で、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる。
【０１０６】
（Ｐ） 第１段階： 「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」を含有する試薬と、「界面活性物質」を含有する試薬とを混合する。
第２段階： 第１段階の混合液に、「緩衝剤」を含有する試薬〔そのｐＨが測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨであるもの〕を混合する。
第３段階： 第２段階の混合液に、試料を混合し、接触させ、この混合液において、「測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨ」で、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる。
【０１０７】
（Ｑ） 第１段階： 「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」を含有する試薬と、「緩衝剤」を含有する試薬〔そのｐＨが測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨであるもの〕を混合する。
第２段階： 第１段階の混合液に、「界面活性物質」を含有する試薬を混合する。
第３段階： 第２段階の混合液に、試料を混合し、接触させ、この混合液において、「測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨ」で、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる。
【０１０８】
（Ｒ） 第１段階： 「界面活性物質」を含有する試薬と、「緩衝剤」を含有する試薬〔そのｐＨが測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨであるもの〕を混合する。
第２段階： 第１段階の混合液に、「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」を含有する試薬を混合する。
第３段階： 第２段階の混合液に、試料を混合し、接触させ、この混合液において、「測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨ」で、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる。
【０１０９】
なお、前記の凝集体形成工程を２段階以上の複数段階で行う場合、最後の段階で、混合液のｐＨを「測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであって、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨ」とすることが好ましい。
【０１１０】
（２）通流工程
前記の凝集体形成工程における当該凝集体の形成後、当該凝集体を含む溶液の一定量を有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体に通す通流工程であるが、当該凝集体を含む溶液の一定量を、前記の有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体に通すことができれば、特に限定はなく、どのような方法でもよい。
この当該凝集体を含む溶液を通すことにより、当該凝集体が有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体に捕捉される。
【０１１１】
なお、前記の当該凝集体を含む溶液の一定量を有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体に通すとき、当該一定量がごく微量の場合は、この有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体の内部に保持されるが、この保持の最大量を超えた場合は、この有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体の内部を通り、添加した側の反対側より流れ出る。
【０１１２】
ところで、前記の有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体に通す前記の当該凝集体を含む溶液の一定量であるが、この添加量は、量が多い程、前記の有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体に捕捉される前記の当該凝集体の量が多くなり、その結果、より低い濃度のタンパク質までも測定できるようになり、測定が高感度となるので好ましい。
【０１１３】
前記の一定量は、通常は、０．１ｍＬ以上であることが好ましく、０．５ｍＬ以上であることがより好ましく、２ｍＬ以上であることが特に好ましく、５ｍＬ以上であることが更に好ましい。
【０１１４】
なお、前記の一定量の上限は特にはないが、強いて言えば、用いる有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体に捕捉される物質の捕捉最大量（上限）に達するまでの量である。
【０１１５】
この通流工程において、当該凝集体を含む溶液の一定量を有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体に通すことであるが、これには特に限定はない。
【０１１６】
例えば、当該凝集体を含む溶液を有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体に添加等して、圧力又は吸引力を加えずに重力により当該凝集体を含む溶液をこの多孔性担体に通してもよい。
【０１１７】
また、当該凝集体を含む溶液を有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体に添加、注入又は吸い込む等し、加圧したり、又は吸引して、当該凝集体を含む溶液をこの多孔性担体に通してもよい。
【０１１８】
あるいは、有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体がシリンジに接続できるハウジングに収められたシリンジフィルタである場合（例えば、ワットマンジャパン社の「ＧＤ／Ｘ シリンジフィルタ」等の場合）、当該凝集体を含む溶液をシリンジの中に入れ、このシリンジと前記シリンジフィルタとを接続し、このシリンジのピストン部分を押すことにより、当該凝集体を含む溶液が押し出されて、このシリンジフィルタの有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体に当該凝集体を含む溶液を通すことができる。
【０１１９】
また、有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体がシリンジに接続できるハウジングに収められたシリンジフィルタである場合（例えば、ワットマンジャパン社の「ＧＤ／Ｘ シリンジフィルタ」等の場合）、シリンジと前記シリンジフィルタとを接続し、前記シリンジフィルタのこのシリンジを接続した側とは反対側のもう一方の口部を、当該凝集体を含む溶液に接触させ、そして、このシリンジのピストン部分を引くことにより、当該凝集体を含む溶液をこのシリンジ内に吸引し、これによりこのシリンジフィルタの有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体に当該凝集体を含む溶液を通すことができる。
【０１２０】
（３）色測定工程
前記の通流工程において当該凝集体を含む溶液の一定量を通した有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体の表面の色、すなわち当該多孔性担体の表面の色をこの色測定工程において測定することは、当該多孔性担体表面の色を測定することができれば、特に限定はなく、どのような方法でもよい。
【０１２１】
この当該多孔性担体表面の色の測定であるが、前記の通流工程において当該凝集体を含む溶液の一定量を通した有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体の表面に生じる色は、試料中にタンパク質が存在しない場合には、着色が無いか、又は着色が薄いものである。
【０１２２】
これに対して、試料中にタンパク質が存在する場合には、有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体の表面の着色が濃いものとなるので、この当該多孔性担体表面の色を測定することにより、試料中にタンパク質が存在するか否かを判別することができる。
すなわち、この色測定工程において、当該多孔性担体表面の色を測定し、着色が無いか、又は着色が薄いものである場合は、試料中にタンパク質が存在しない又は一定濃度（カットオフ値）未満であると判定する。（すなわち、「陰性」と判定する。）
また、当該多孔性担体表面の色を測定し、着色が濃いものである場合は、試料中にタンパク質が存在する又は一定濃度（カットオフ値）以上であると判定する。（すなわち、「陽性」と判定する。）
【０１２３】
そして、前記の当該多孔性担体表面の色の測定であるが、これは目視により行ってもよく、又は、デンシトメーター、スポットメーター、若しくはＣＣＤ装置等の装置を用いて測定を行ってもよい。
【０１２４】
また、タンパク質を含まない試料（陰性対照試料又は試薬ブランク試料）及び／又はタンパク質を含む試料（陽性対照試料）を測定して得られた前記の当該多孔性担体表面の色の濃さと、試料を測定して得られた前記の当該多孔性担体表面の色の濃さとを比較して、試料中のタンパク質の存在の判定を行ってもよい。
【０１２５】
なお、試料中に含まれていたタンパク質の濃度を定量測定する場合は、タンパク質を含まない試料（陰性対照試料又は試薬ブランク試料）及び／又はタンパク質濃度が既知の試料（標準試料）の一濃度又は複数濃度のものを測定して得られた前記の当該多孔性担体表面の色の濃さと、タンパク質濃度が未知の試料を測定して得られた前記の当該多孔性担体表面の色の濃さとを比較（又は比例計算等して算出）すること等により定量値を求めることができる。
【０１２６】
前記の通流工程において当該凝集体を含む溶液の一定量を有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体に通した後、この色測定工程において当該多孔性担体表面の色を測定するまでの時間は、用いる有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体の種類、面積及び厚さ、当該凝集体を含む溶液の当該一定量の量若しくは粘度、又は加圧若しくは吸引の有無等の条件により異なるので一概に言うことは出来ない。
【０１２７】
しかしながら、通常は、前記の当該凝集体を含む溶液の一定量を有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体に通して、時間を置かず直ちに当該多孔性担体表面の色を測定することができる。
【０１２８】
なお、この当該多孔性担体表面の着色は安定ではあるが、当該凝集体を含む溶液の一定量を有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体に通した後６時間以内に当該多孔性担体表面の色を測定することが好ましい。
【０１２９】
ＩＩ．試料中のタンパク質の測定キット
本発明の試料中のタンパク質の測定キットは、少なくとも、「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素を含有する試薬」、及び「有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体」を含むものである。
【０１３０】
１．試薬
本発明の試料中のタンパク質の測定キットは、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素を含有する試薬を含む。
【０１３１】
（１）タンパク質と会合し凝集体を形成する色素
本発明の試料中のタンパク質の測定キットにおける、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素を含有する試薬において、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素は、前記「Ｉ．試料中のタンパク質の測定方法」の「２．タンパク質と会合し凝集体を形成する色素」等において詳述した通りである。
【０１３２】
このタンパク質と会合し凝集体を形成する色素を前記試薬に含有させる濃度は、低すぎると測定の感度が得られず試料中のタンパク質を測定することができないので、通常、試料中のタンパク質と接触させるときの濃度が１μＭ以上となるように前記試薬に含有させることが好ましく、試料中のタンパク質と接触させるときの濃度が１０μＭ以上となるように前記試薬に含有させることがより好ましく、試料中のタンパク質と接触させるときの濃度が２０μＭ以上となるように前記試薬に含有させることが特に好ましい。
【０１３３】
また、このタンパク質と会合し凝集体を形成する色素を前記試薬に含有させる濃度は、高すぎると試料中にタンパク質が存在しなくとも前記の当該多孔性担体の表面に発色が生じてしまい、試料中にタンパク質が存在するときとの判別が難しくなるので、通常、試料中のタンパク質と接触させるときの濃度が５００μＭ以下となるように前記試薬に含有させることが好ましく、試料中のタンパク質と接触させるときの濃度が１００μＭ以下となるように前記試薬に含有させることがより好ましく、試料中のタンパク質と接触させるときの濃度が５０μＭ以下となるように前記試薬に含有させることが特に好ましい。
【０１３４】
（２）界面活性物質
本発明の試料中のタンパク質の測定キットに含まれる、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素を含有する試薬又は他の試薬に、界面活性物質を含有させてもよい。
タンパク質と会合し凝集体を形成する色素を含有する試薬又は他の試薬に、界面活性物質を含有させることにより、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素を含有する試薬（及び当該他の試薬）と試料との混合液を有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体に通した後のこの多孔性担体表面の色の発色度（濃さ）が、タンパク質を含む試料においては、この発色度（濃さ）が高くなって高感度に測定が行えるようになり、かつタンパク質を含有しない試料の測定（陰性対照；又は試薬ブランク）において前記の多孔性担体表面の色の発色が無いか又はごく薄い発色にとどまり、前記の色の測定におけるタンパク質を含有する試料とタンパク質を含有しない試料との判別が容易になるという効果を生じるので、本発明の試料中のタンパク質の測定キットに含まれる「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素を含有する試薬」又は「その他の試薬」に、界面活性物質を含有させることが好ましい。
なお、この界面活性物質については、前記「Ｉ．試料中のタンパク質の測定方法」の「４．界面活性物質」等において詳述した通りである。
【０１３５】
この界面活性物質の濃度は低すぎると、これを含有させることの効果が得られないので、通常は、界面活性物質、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素、及び試料中のタンパク質を接触させる時の濃度が０．０００１％（Ｗ／Ｖ）以上となるように前記試薬に含有させることが好ましく、当該接触時の濃度が０．００１％（Ｗ／Ｖ）以上となるように前記試薬に含有させることがより好ましく、当該接触時の濃度が０．００５％（Ｗ／Ｖ）以上となるように前記試薬に含有させることが特に好ましい。
【０１３６】
また、この界面活性物質の濃度は、高すぎるとそれを含む溶液の粘性が上昇する可能性があり、そうなると有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体への、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素を含有する試薬等と試料との混合液の添加等の量に誤差が生じることにもなるので、通常は、界面活性物質、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素、及び試料中のタンパク質を接触させる時の濃度が５％（Ｗ／Ｖ）以下となるように界面活性物質を前記試薬に含有させることが好ましく、当該接触時の濃度が１％（Ｗ／Ｖ）以下となるように前記試薬に含有させることがより好ましく、当該接触時の濃度が０．１％（Ｗ／Ｖ）以下となるように前記試薬に含有させることが特に好ましい。
【０１３７】
（３）ｐＨ
本発明では、試料に含まれていたタンパク質と、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる際のｐＨは、測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨであることが好ましい。
このように、測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨとした場合には、
測定しようとするタンパク質の電荷がプラス側となり、前記の色素と会合し易くなり、これによりこのタンパク質測定の感度を高めることができるので、好ましい。
【０１３８】
よって、試料に含まれていたタンパク質と、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる際のｐＨが、測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨとなるように、本発明の試料中のタンパク質の測定キットに含まれる試薬のｐＨを設定することが好ましい。
【０１３９】
また、本発明では、試料に含まれていたタンパク質と、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる際のｐＨは、このタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近にあることが好ましい。
これは、より好ましくは前記の凝集体形成時において、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値の±２の範囲内のｐＨとすることであり、特に好ましくはタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値の±１．５の範囲内のｐＨとすることであり、更に好ましくはこのタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値の±１の範囲内のｐＨとすることである。
【０１４０】
このように、前記の凝集体形成時において、ｐＨを前記のようにタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近にすることにより、前記色素のマイナス電荷を保つことができ、これにより試料に含まれるタンパク質と会合し易くなり、これによりこのタンパク質測定の感度を高めることができるので、好ましい。
【０１４１】
よって、前記の凝集体形成時において、ｐＨを前記のようにタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近となるように、本発明の試料中のタンパク質の測定キットに含まれる試薬のｐＨを設定することが好ましい。
【０１４２】
以上のことより、前記の凝集体形成時においては、ｐＨを、測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨとし、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨとすることが特に好ましい。
【０１４３】
よって、前記の凝集体形成時において、ｐＨを、測定しようとするタンパク質の等電点の値未満のｐＨとし、かつタンパク質と会合し凝集体を形成する色素の酸解離定数（ｐＫａ）の値のｐＨ付近のｐＨとなるように、本発明の試料中のタンパク質の測定キットに含まれる試薬のｐＨを設定することが特に好ましい。
【０１４４】
なお、前記の凝集体形成時においては、そのｐＨが低すぎると、例えばｐＨ１未満であると、タンパク質が変性や不溶化されるので好ましくない。
【０１４５】
よって、前記の凝集体形成時において、ｐＨを、低くなりすぎないように、例えばｐＨ１未満とならないように、本発明の試料中のタンパク質の測定キットに含まれる試薬のｐＨを設定することが好ましい。
【０１４６】
なお、前記の凝集体形成時において、試料に含まれていたタンパク質と、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる際のｐＨを前記の通りのｐＨとするには、このｐＨとなるような緩衝剤（これらのｐＨ域に緩衝能がある緩衝剤）を用いることが好ましい。
【０１４７】
この緩衝剤としては、既知の緩衝剤を用いることができる。
例えば、緩衝剤として、グリシン（ｐＫａ１：２．３５）、リン酸（ｐＫａ１：２．１５）、フタル酸（ｐＫａ１：２．９５、ｐＫａ２：５．４１）、クエン酸（ｐＫａ１：３．１３、ｐＫａ２：４．７６）、バルビツール酸（ｐＫａ１：４．０４）、コハク酸（ｐＫａ１：４．２１、ｐＫａ２：５．６４）、酢酸（ｐＫａ２：４．７６）、及び種々のグッド緩衝剤等を挙げることができる。
【０１４８】
よって、前記の凝集体形成時において、ｐＨを前記の通りとするため、当該ｐＨとなるような緩衝剤（これらのｐＨ域に緩衝能がある緩衝剤）を、本発明の試料中のタンパク質の測定キットに含まれる試薬に含有させることが好ましい。
【０１４９】
なお、このｐＨの他の事項については、前記「Ｉ．試料中のタンパク質の測定方法」の「５．ｐＨ」等において詳述した通りである。
【０１５０】
（４）試薬の構成
本発明の試料中のタンパク質の測定キットは、一つの試薬を含むものであってもよいし、又は二つ以上の複数の試薬を含むものであってもよい。
一つの試薬のみを含むものである場合、当該試薬は、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素を含有する試薬である。
また、二つ以上の複数の試薬を含むものである場合、当該複数の試薬は、その一つ又は二つ以上の試薬がタンパク質と会合し凝集体を形成する色素を含有するものである。
【０１５１】
更に、本発明の試料中のタンパク質の測定キットは、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素以外の成分を含有する試薬を含むものであってもよい。
本発明の試料中のタンパク質の測定キットは、例えば、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素を含有する試薬、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素及び界面活性物質を含有する試薬、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素及び緩衝剤を含有する試薬、タンパク質と会合し凝集体を形成する色素、界面活性物質及び緩衝剤を含有する試薬、界面活性物質を含有する試薬、緩衝剤を含有する試薬、界面活性物質及び緩衝剤を含有する試薬、又は試料希釈液よりなる試薬等を含むものであってもよい。
なお、本発明の試料中のタンパク質の測定キットに含まれる試薬の態様は、前記「Ｉ．試料中のタンパク質の測定方法」の「６．測定操作」の「（１）凝集体形成工程」等に記載した通りのもの等である。
【０１５２】
（５）その他の試薬成分
本発明における、本発明の試料中のタンパク質の測定キットに含まれる試薬には、必要に応じて、例えば、塩；アジ化ナトリウム、抗生物質若しくは合成抗菌剤などの防腐剤；糖類などの安定化剤；反応活性化剤；試料中に含まれる測定妨害物質の消去若しくは影響抑制に関わる物質；又は他の試薬成分等を適宜含有させることができる。
【０１５３】
なお、前記の塩としては、例えば、陽イオン及び陰イオンよりなる化合物等を挙げることができる。
【０１５４】
この陽イオンとしては、正の電荷を有するイオンであれば、特に限定されず用いることができる。
この陽イオンとしては、１価の陽イオンであってもよく、又は２価以上の多価の陽イオンであってもよい。
そして、この陽イオンとしては、例えば、金属イオン、アンモニウムイオン、又はその他の陽イオン等を挙げることができる。
【０１５５】
この金属イオンとしては、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、遷移金属イオン、又はその他の金属イオン等を挙げることができる。
【０１５６】
アルカリ金属イオンとしては、例えば、リチウムイオン、ナトリウムイオン、又はカリウムイオン等を挙げることができる。
【０１５７】
アルカリ土類金属イオンとしては、例えば、ベリリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、又はバリウムイオン等を挙げることができる。
【０１５８】
遷移金属イオンとしては、例えば、マンガンイオン、鉄イオン、コバルトイオン、ニッケルイオン、又は銅イオン等を挙げることができる。
【０１５９】
その他の金属イオンとしては、例えば、亜鉛イオン、又はアルミニウムイオン等を挙げることができる。
【０１６０】
アンモニウムイオンとしては、例えば、一級のアンモニウムイオン、二級のアンモニウムイオン、三級のアンモニウムイオン、又は四級のアンモニウムイオン等を挙げることができる。
【０１６１】
その他の陽イオンとしては、例えば、炭素原子、ケイ素原子、ホウ素原子、窒素原子（アンモニウムイオン以外の場合において）、リン原子、若しくは硫黄原子などが正の電荷を帯びている原子、又は原子団等を挙げることができる。
【０１６２】
この具体的な例としては、炭素原子が正の電荷を帯びているコリンイオン等を挙げることができる。
【０１６３】
なお、この陽イオンとしては、１価の陽イオンが好ましい。
【０１６４】
そして、この１価の陽イオンとしては、アルカリ金属イオンが好ましい。特に、ナトリウムイオンが好ましい。
【０１６５】
なお、この陽イオンとしては、１種類のものだけを用いてもよいし、又は複数種類のものを同時に用いてもよい。
【０１６６】
また、陰イオンとしては、負の電荷を有するイオンであれば、特に限定されず用いることができる。
【０１６７】
この陰イオンとしては、１価の陰イオンであってもよく、又は２価以上の多価の陰イオンであってもよい。
【０１６８】
そして、この陰イオンとしては、例えば、ハロゲンイオン、有機化合物よりなる酸基、又はその他の無機化合物よりなる酸基等を挙げることができる。
【０１６９】
ハロゲンイオンとしては、例えば、フッ素イオン、塩素イオン、臭素イオン、又はヨウ素イオン等を挙げることができる。
【０１７０】
有機化合物よりなる酸基としては、例えば、酢酸イオン、クエン酸イオン、グルコン酸イオン、又はシュウ酸イオン等を挙げることができる。
【０１７１】
その他の無機化合物よりなる酸基としては、例えば、硫酸イオン、亜硫酸イオン、二亜硫酸イオン、亜二チオン酸イオン、チオ亜硫酸イオン、硝酸イオン、亜硝酸イオン、次亜硝酸イオン、ペルオキソ亜硝酸イオン、リン酸イオン、亜リン酸イオン、二亜リン酸イオン、次亜リン酸イオン、二リン酸イオン、ホウ酸イオン、炭酸イオン、シアン酸イオン、イソシアン酸イオン、又はケイ酸イオン等を挙げることができる。
【０１７２】
なお、この陰イオンとしては、１価の陰イオンが好ましい。
【０１７３】
そして、この１価の陰イオンとしては、ハロゲンイオンが好ましい。特に、塩素イオンが好ましい。
【０１７４】
また、この陰イオンとしては、１種類のものだけを用いてもよいし、又は複数種類のものを同時に用いてもよい。
【０１７５】
２．多孔性担体
本発明の試料中のタンパク質の測定キットにおける「有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体」は、有機化合物よりなり、多数の微細な孔を有し、かつその孔径が３μｍ以上の担体であって、この担体に溶液を添加したときにその溶液を通すことができるものであれば、特に制限なく用いることができる。
なお、この「有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体」については、前記「Ｉ．試料中のタンパク質の測定方法」の「３．有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体」等において詳述した通りである。
【０１７６】
３．他の物
本発明の試料中のタンパク質の測定キットには、必要に応じて、「タンパク質と会合し凝集体を形成する色素を含有する試薬」、及び「有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体」以外の物を含めることができる。
【０１７７】
この物としては、例えば、「陰性対照試料（試薬ブランク試料）」、「陽性対照試料」、「標準物質（標準試料）」、「測定結果（当該多孔性担体表面の色）の対照表」等を挙げることができる。
【０１７８】
４．試料中のタンパク質の測定
本発明の試料中のタンパク質の測定キットは、前記の本発明の「試料中のタンパク質の測定方法」に適したものである。
本発明の試料中のタンパク質の測定キットを用いて、本発明の「試料中のタンパク質の測定方法」に従い、試料中のタンパク質の測定を行うことについては、前記「Ｉ．試料中のタンパク質の測定方法」に記載した通りである。
【実施例】
【０１７９】
以下、実施例により本発明をより具体的に詳述するが、本発明はこの実施例の記載により限定されるものではない。
【０１８０】
〔実施例１〕（有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体を用いることの効果の確認）
本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定キットにおける、有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体を用いることの効果を確認した。
【０１８１】
１．試薬
（１）試薬Ａ
タンパク質と会合し凝集体を形成する色素としてのエリスロシンＢを４０μＭの濃度で含有し、かつ界面活性物質としてのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を０．０１％（Ｗ／Ｖ）の濃度で含有する水溶液を調製し、試薬Ａとした。
【０１８２】
（２）試薬Ｂ
０．２Ｍクエン酸−水酸化カリウム緩衝液〔ｐＨ２．３（２０℃）〕を調製し、試薬Ｂとした。
【０１８３】
２．多孔性担体
多孔性担体として、下記の多孔性担体をそれぞれ用いた。
（１）有機化合物よりなり孔径が３μｍ未満の多孔性担体（セルロース混合エステル）
有機化合物よりなり孔径が３μｍ未満の多孔性担体である、「商品名：セルロース混合エステルタイプメンブレンフィルター・Ａ０１０Ａ０２５Ａ、商品コード：１００１０００２、孔径：０．１０μｍ、メンブレン：セルロース混合エステル、厚さ：１１０μｍ、アドバンテック東洋社」を、「有機化合物よりなり孔径が３μｍ未満の多孔性担体（セルロース混合エステル）」とした。
【０１８４】
（２）有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体（セルロース混合エステル）
有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体である、「商品名：セルロース混合エステルタイプメンブレンフィルター・Ａ５００Ａ０２５Ａ、商品コード：１０１５０００２、孔径：５．００μｍ、メンブレン：セルロース混合エステル、厚さ：１６０μｍ、アドバンテック東洋社」を、「有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体（セルロース混合エステル）」とした。
【０１８５】
（３）有機化合物よりなり孔径が３μｍ未満の多孔性担体（セルロースアセテート）
有機化合物よりなり孔径が３μｍ未満の多孔性担体である、「商品名：セルロースアセテートタイプメンブレンフィルター・Ｃ０２０Ａ０２５Ａ、商品コード：１１０２０００２、孔径：０．２０μｍ、メンブレン：セルロースアセテート、厚さ：１２５μｍ、アドバンテック東洋社」を、「有機化合物よりなり孔径が３μｍ未満の多孔性担体（セルロースアセテート）」とした。
【０１８６】
（４）有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体（セルロースアセテート）
有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体である、「商品名：セルロースアセテートタイプメンブレンフィルター・Ｃ３００Ａ０２５Ａ、商品コード：１１１３０００２、孔径：３．００μｍ、メンブレン：セルロースアセテート、厚さ：１３５μｍ、アドバンテック東洋社」を、「有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体（セルロースアセテート）」とした。
【０１８７】
３．試料
（１）タンパク質含有試料
タンパク質含有試料として、３０ｍｇ／Ｌ、すなわち３ｍｇ／ｄＬのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む水溶液を調製した。
【０１８８】
（２）タンパク質不含試料
タンパク質を含まない試料、すなわちタンパク質不含試料として、純水を用意した。
【０１８９】
４．測定
（１） 前記１の（１）の試薬Ａの５，０００μＬに、前記１の（２）の試薬Ｂの５００μＬを添加し、混合した。
【０１９０】
（２） 次に、前記（１）の混合液に、前記３の（１）のタンパク質含有試料の１５０μＬを添加し、混合して、接触させた。
【０１９１】
（３） その後、２０秒間室温にて放置した。
【０１９２】
（４） 次に、前記２の（１）の「有機化合物よりなり孔径が３μｍ未満の多孔性担体（セルロース混合エステル）」を、ろ過用の器具にセットし、この多孔性担体の上側の面に、前記（３）の放置後の混合液の全量（５，６５０μＬ）を添加し、通した。
【０１９３】
（５） 前記（４）における混合液の添加後、直ちに前記の多孔性担体の表面の色を目視にて測定した。
【０１９４】
なお、前記の多孔性担体表面の着色が濃いものである場合には試料中にタンパク質が存在すると判定し、前記の多孔性担体表面の着色が無いか又は着色が薄いものである場合には試料中にタンパク質が存在しないと判定した。
【０１９５】
（６） また、試料を前記３の（１）のタンパク質含有試料から（２）のタンパク質不含試料に変える以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、測定を行った。
【０１９６】
（７） 更に、多孔性担体を、前記２の（１）の「有機化合物よりなり孔径が３μｍ未満の多孔性担体（セルロース混合エステル）」から（２）の「有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体（セルロース混合エステル）」に変える以外は、前記（１）〜（６）の通りに操作を行い、測定を行った。
【０１９７】
（８） また、多孔性担体を、前記２の（１）の「有機化合物よりなり孔径が３μｍ未満の多孔性担体（セルロース混合エステル）」から（３）の「有機化合物よりなり孔径が３μｍ未満の多孔性担体（セルロースアセテート）」に変える以外は、前記（１）〜（６）の通りに操作を行い、測定を行った。
【０１９８】
（９） 更に、多孔性担体を、前記２の（１）の「有機化合物よりなり孔径が３μｍ未満の多孔性担体（セルロース混合エステル）」から（４）の「有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体（セルロースアセテート）」に変える以外は、前記（１）〜（６）の通りに操作を行い、測定を行った。
【０１９９】
５．測定結果
（１） 前記の測定の結果を、図１に示した。
この図より、以下のことが分かる。
【０２００】
（２） まず、多孔性担体として、「有機化合物よりなり孔径が３μｍ未満の多孔性担体（セルロース混合エステル）」を用いた場合には、タンパク質（３０ｍｇ／Ｌ、すなわち３ｍｇ／ｄＬのヒト血清アルブミン）を含む試料を測定したときの多孔性担体の表面の着色は濃いものであり、試料中にタンパク質が存在する、と判定することができる。
【０２０１】
しかし、この「有機化合物よりなり孔径が３μｍ未満の多孔性担体（セルロース混合エステル）」を用いた場合、タンパク質を含まない試料（純水）を測定したときの多孔性担体の表面の着色は、これもまた濃いものであり、試料中にタンパク質が存在する、と判定することとなった。
【０２０２】
すなわち、多孔性担体として、「有機化合物よりなり孔径が３μｍ未満の多孔性担体（セルロース混合エステル）」を用いた場合には、試料中にタンパク質が存在しないことを、正しく判定することができないことが分かる。
【０２０３】
よって、多孔性担体として「有機化合物よりなり孔径が３μｍ未満の多孔性担体」を用いる、試料中のタンパク質の測定方法及び測定キットにおいては、試料中のタンパク質を測定することができないことが確かめられた。
【０２０４】
（３） 次に、多孔性担体として、「有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体（セルロース混合エステル）」を用いた場合には、タンパク質（３０ｍｇ／Ｌ、すなわち３ｍｇ／ｄＬのヒト血清アルブミン）を含む試料を測定したときの多孔性担体の表面の着色は濃いものであり、試料中にタンパク質が存在する、と判定することができる。
【０２０５】
また、この「有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体（セルロース混合エステル）」を用いた場合、タンパク質を含まない試料（純水）を測定したときの多孔性担体の表面の着色は薄く、試料中にタンパク質が存在しない、と判定することができる。
【０２０６】
すなわち、多孔性担体として、「有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体（セルロース混合エステル）」を用いた場合には、試料中にタンパク質が存在することと、試料中にタンパク質が存在しないことを、それぞれ正しく判定できていることが分かる。
【０２０７】
よって、有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体を用いる、本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定キットにおいては、試料中のタンパク質を正確に測定できることが確かめられた。
【０２０８】
（４） 次に、多孔性担体として、「有機化合物よりなり孔径が３μｍ未満の多孔性担体（セルロースアセテート）」を用いた場合には、タンパク質（３０ｍｇ／Ｌ、すなわち３ｍｇ／ｄＬのヒト血清アルブミン）を含む試料を測定したときの多孔性担体の表面の着色は濃いものであり、試料中にタンパク質が存在する、と判定することができる。
【０２０９】
しかし、この「有機化合物よりなり孔径が３μｍ未満の多孔性担体（セルロースアセテート）」を用いた場合、タンパク質を含まない試料（純水）を測定したときの多孔性担体の表面の着色は、これもまた濃いものであり、試料中にタンパク質が存在する、と判定することとなった。
【０２１０】
すなわち、多孔性担体として、「有機化合物よりなり孔径が３μｍ未満の多孔性担体（セルロースアセテート）」を用いた場合には、試料中にタンパク質が存在しないことを、正しく判定することができないことが分かる。
【０２１１】
よって、多孔性担体として「有機化合物よりなり孔径が３μｍ未満の多孔性担体」を用いる、試料中のタンパク質の測定方法及び測定キットにおいては、試料中のタンパク質を測定することができないことが、この場合においても確かめられた。
【０２１２】
（５） 次に、多孔性担体として、「有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体（セルロースアセテート）」を用いた場合には、タンパク質（３０ｍｇ／Ｌ、すなわち３ｍｇ／ｄＬのヒト血清アルブミン）を含む試料を測定したときの多孔性担体の表面の着色は濃いものであり、試料中にタンパク質が存在する、と判定することができる。
【０２１３】
また、この「有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体（セルロースアセテート）」を用いた場合、タンパク質を含まない試料（純水）を測定したときの多孔性担体の表面の着色は薄く、試料中にタンパク質が存在しない、と判定することができる。
【０２１４】
すなわち、多孔性担体として、「有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体（セルロースアセテート）」を用いた場合には、試料中にタンパク質が存在することと、試料中にタンパク質が存在しないことを、それぞれ正しく判定できていることが分かる。
【０２１５】
よって、有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体を用いる、本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定キットにおいては、試料中のタンパク質を正確に測定できることが、この場合においても確かめられた。
【０２１６】
以上記載したように、有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体を用いる本発明の試料中のタンパク質の測定方法及び測定キットは、試料中のタンパク質を正確に測定することができるのに対して、「有機化合物よりなり孔径が３μｍ未満の多孔性担体」を用いる場合には、試料中のタンパク質を正確に測定することができないことが確認できた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）試料、及びタンパク質と会合し凝集体を形成する色素を、接触させ、これにより、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる凝集体形成工程；
２）当該凝集体の形成後、当該凝集体を含む溶液の一定量を有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体に通す通流工程；及び
３）当該多孔性担体表面の色を測定する色測定工程、を含む試料中のタンパク質の測定方法。
【請求項２】
凝集体形成工程において、界面活性物質を共存させる、請求項１記載の試料中のタンパク質の測定方法。
【請求項３】
タンパク質と会合し凝集体を形成する色素を含有する試薬、及び有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体を含む、試料中のタンパク質の測定キット。
【請求項４】
界面活性物質を更に含む、請求項３記載の試料中のタンパク質の測定キット。
【請求項５】
請求項１記載の測定方法に使用されるものである、請求項３記載の試料中のタンパク質の測定キット。
【請求項１】
１）試料、及びタンパク質と会合し凝集体を形成する色素を、接触させ、これにより、試料に含まれていたタンパク質と当該色素とを会合させ、これらの凝集体を形成させる凝集体形成工程；
２）当該凝集体の形成後、当該凝集体を含む溶液の一定量を有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体に通す通流工程；及び
３）当該多孔性担体表面の色を測定する色測定工程、を含む試料中のタンパク質の測定方法。
【請求項２】
凝集体形成工程において、界面活性物質を共存させる、請求項１記載の試料中のタンパク質の測定方法。
【請求項３】
タンパク質と会合し凝集体を形成する色素を含有する試薬、及び有機化合物よりなり孔径が３μｍ以上の多孔性担体を含む、試料中のタンパク質の測定キット。
【請求項４】
界面活性物質を更に含む、請求項３記載の試料中のタンパク質の測定キット。
【請求項５】
請求項１記載の測定方法に使用されるものである、請求項３記載の試料中のタンパク質の測定キット。
【図１】
【公開番号】特開２０１０−２４３３１６（Ｐ２０１０−２４３３１６Ａ）
【公開日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−９１８３３（Ｐ２００９−９１８３３）
【出願日】平成２１年４月６日（２００９．４．６）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１８年度 独立行政法人科学技術振興機構 独創シーズ展開事業委託開発「尿中微量蛋白質検出キット」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００１３１４７４）株式会社シノテスト (28)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月６日（２００９．４．６）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１８年度 独立行政法人科学技術振興機構 独創シーズ展開事業委託開発「尿中微量蛋白質検出キット」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００１３１４７４）株式会社シノテスト (28)
【Ｆターム（参考）】
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