走査型Ｘ線顕微鏡および走査型Ｘ線顕微鏡像の観察方法
【課題】生体物質や有機物質などの極めて脆弱な試料に対してもダメージを与えることなく、その形態や３次元構造を、簡便且つ高分解能に観察し得る手法を提供すること。
【解決手段】
本発明では、例えば直径１ｎｍ程度に収束させた電子線を、観察試料を支持する観察試料支持部材に比較的低加速電圧で入射させて該観察試料支持部材からＸ線を発生させ、電子線入射側とは反対側に配置された検出器によりＸ線を検知する。そして、電子線の入射位置を観察試料支持部材上で走査させてＸ線画像を形成する。上述の手法で検知されるＸ線は、概ね、観察試料支持部材内での入射電子の拡散範囲内の領域から放出されることとなり、当該入射電子の拡散範囲を数ｎｍ程度に制御すれば、得られる走査型Ｘ線顕微鏡像の分解能は、従来の手法の理論的限界とされていた１０ｎｍ以下とすることが可能となる。
【解決手段】
本発明では、例えば直径１ｎｍ程度に収束させた電子線を、観察試料を支持する観察試料支持部材に比較的低加速電圧で入射させて該観察試料支持部材からＸ線を発生させ、電子線入射側とは反対側に配置された検出器によりＸ線を検知する。そして、電子線の入射位置を観察試料支持部材上で走査させてＸ線画像を形成する。上述の手法で検知されるＸ線は、概ね、観察試料支持部材内での入射電子の拡散範囲内の領域から放出されることとなり、当該入射電子の拡散範囲を数ｎｍ程度に制御すれば、得られる走査型Ｘ線顕微鏡像の分解能は、従来の手法の理論的限界とされていた１０ｎｍ以下とすることが可能となる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は走査型Ｘ線顕微鏡および走査型Ｘ線顕微鏡像の観察方法に関する。より詳細には、生体物質や有機物質などの極めて脆弱な試料に対してもダメージを与えることなく、その形態や３次元構造を、簡便且つ高分解能に観察し得る手法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物物質や有機物質等の極めて脆弱な試料の形態観察には、主として、光学顕微鏡や電子顕微鏡が用いられている。光学顕微鏡はプローブとして可視光を用いているため、溶液中の観察試料をそのままの状態で観察可能であるという利点がある。しかし、その分解能は用いられる可視光の波長により決まるため、一般には０．２μｍ程度と低く、ウィルスやタンパク質等の微細な試料の直接観察には適用することができない。
【０００３】
一方、電子顕微鏡の分解能は数Åと極めて高いが、２次電子の発生効率を上げるための染色や、チャージアップを防止するためのコーティングといった処理が必要となる。加えて、一般的な観察条件では、電子線の照射によりウィルスやタンパク質等はダメージを受けて破壊される虞があるため、照射電子線量を低くして観察する必要がある。しかし、低照射電子線量条件下で得られる撮影画像は、ノイズが高くコントラストが低いものとなり易い。このため、かかる電顕画像から正確な試料構造を解析するためには、様々な画像処理技術を駆使しなければならない。
【０００４】
近年、Ｘ線をプローブとして用いるＸ線顕微鏡の開発が進められてきている（例えば、非特許文献１）。これは、波長がＸ線と紫外線の間にある軟Ｘ線は、透過力と物質との相互作用力の双方を併せもつことのほかに、下記のような、生体観察に有利な特質があるためである。
【０００５】
具体的には、２．３〜４．４ｎｍの波長範囲の軟Ｘ線は、生体を構成する物質の吸収係数の差が大きく、水は透過する一方、炭素や窒素に良く吸収されるためにタンパク質などは透過しにくいという特性を有する。このような波長領域は「水の窓」と呼ばれるが、「水の窓」領域のＸ線を用いると、水分を含んだ対象物（生体試料や溶液中の試料）をそのままの状態で観察することが可能となることに加え、波長は可視光よりも短いために、光学顕微鏡以上の高分解能観察が可能である。
【０００６】
Ｘ線顕微鏡は、主として、ゾーンプレート等の集光系を用いてＸ線ビームを細く絞って試料に照射する方法（集光系）と、点光源からのＸ線ビームを試料に照射する方法（点光源系）に分類される。
【０００７】
点光源を用いる方法は、レーザーによりＸ線を発生させる方法と、電子線でＸ線を発生させる方法とに分類され、当該方法のＸ線顕微鏡の分解能は、現状で３０ｎｍ程度とされており、更なる高分解能化のための開発が進められている。
【０００８】
また、集光系のＸ線顕微鏡は、照射透過型のものと走査透過型のものとに分類され（非特許文献２）、集光系Ｘ線顕微鏡の分解能はゾーンプレートの加工精度に依存し、理論的限界は１０〜１５ｎｍ程度と予想されている（非特許文献３）。
【０００９】
このようなＸ線顕微鏡は、試料からの透過情報を得ることができるため、観察試料を様々な角度に傾斜乃至回転させて撮影することにより、３次元構造を再構成することが可能である。
【００１０】
このような利点を有するＸ線顕微鏡であるが、下記のような問題点もある。ゾーンプレート等を用いる集光系のＸ線顕微鏡観察では、Ｘ線の集光効率が２０％程度と低いため、鮮明な像を高分解能で得るためには極めて強いＸ線が必要となる。このため、高分解能観察のためには、放射光施設などの大規模な研究施設が必須となる。また、観察像の分解能は概ねゾーンプレートの集光径程度のものとなるが、一般的に市販されているゾーンプレートの集光径は精々５０ｎｍ程度のものに限られるため、高分解能化が制約されてしまう。さらに、理論的な集光限界も１０〜１５ｎｍ程度と予想されており（非特許文献３）、この程度の分解能ではタンパク質等の試料の微細構造を観察することは困難である。
【００１１】
また、点光源を用いるＸ線顕微鏡の分解能は３０ｎｍ程度であり、これ以上の分解能を達成することは原理的に困難とされている。
【００１２】
さらに、従来のＸ線顕微鏡観察によって試料の３次元構造を得るためには、観察試料を様々な角度から複数回撮影する必要があるため、生体物質や有機物質などの極めて脆弱な試料の３次元構造を得る場合には、Ｘ線によるダメージが深刻なものとなる。
【００１３】
【非特許文献１】真島秀明ほか「細胞をX線顕微鏡で見る」Medical Imaging Technology, Vol. 17, No.3 p.211-216 (1999).
【非特許文献２】Chris Jacobsen "Soft x-ray microscopy" Trend in Cell Biology, Vol. 9, p.44-47 (1999).
【非特許文献３】W. Chao et al., "Soft X-ray microscopy at a spatial resolution better than 15 nm" Nature, Vol. 453, p.1210-1213 (2005).
【非特許文献４】T.Ogura "A high contrast method of unstained biological samples under a thin carbon film by scanning electron microscopy" Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol.377, p79-84 (2008).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明はこのような問題に鑑みてなされたもので、その目的とするところは、生体物質や有機物質などの極めて脆弱な試料に対してもダメージを与えることなく、その形態や３次元構造を、簡便且つ高分解能に観察し得る手法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上述の課題を解決するために、本発明の走査型Ｘ線顕微鏡は、観察試料支持部材を保持する試料ホルダと、前記観察試料支持部材に電子線を収束させて入射する電子銃と、該電子線の走査機構部と、前記電子線入射に伴い前記観察試料支持部材から発生するＸ線を検知するＸ線検出器と、該Ｘ線の検出信号に基づいてＸ線画像を形成する信号処理部と、を備えている。
【００１６】
本発明の走査型Ｘ線顕微鏡は、前記Ｘ線検出器を複数備え、該複数のＸ線検出器は、前記観察試料支持部材に支持される観察試料を異なる方向から望む位置に配置されている態様とすることができる。
【００１７】
また、本発明の走査型Ｘ線顕微鏡は、前記信号処理部は、前記複数のＸ線検出器からのＸ線検出信号に基づいて、３次元のＸ線画像を形成する画像処理手段を備えている態様とすることもできる。
【００１８】
さらに、本発明の走査型Ｘ線顕微鏡は、前記電子線入射に伴い観察試料から発生する２次電子を検知する電子線検出器を備え、前記信号処理部により、該２次電子線の検出信号に基づく２次電子線画像を形成する態様とすることもできる。
【００１９】
なお、必要に応じ、前記試料ホルダの走査機構部をさらに備える構成としてもよい。
【００２０】
本発明に係る走査型Ｘ線顕微鏡像の観察方法では、観察試料支持部材の裏面側に観察試料を支持し、前記観察試料支持部材の表面側から収束させた電子線を走査させて入射して該観察試料支持部材からＸ線を発生させ、前記観察試料支持部材の裏面側に配置された検出器により前記Ｘ線を検知してＸ線画像を形成する。
【００２１】
本発明に係る走査型Ｘ線顕微鏡像の観察方法の別の態様では、前記観察試料支持部材に対向させて第２の観察試料支持部材を設け、該２つの観察試料支持部材の間に溶液と一緒に観察試料を挟み込んで支持する。
【００２２】
これらの観察方法は、前記検出器を、前記観察試料支持部材に支持された観察試料を異なる方向から望む位置に複数配置し、該複数の検出器からの検知信号を処理して３次元のＸ線画像を形成する態様とすることもできる。
【００２３】
好ましくは、前記観察試料支持部材には、カーボン膜や窒化シリコン膜を用いる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明では、例えば直径１ｎｍ程度に収束させた電子線を、観察試料を支持する観察試料支持部材に比較的低加速電圧で入射させて該観察試料支持部材からＸ線を発生させ、電子線入射側とは反対側に配置された検出器によりＸ線を検知する。そして、電子線の入射位置を観察試料支持部材上で走査させてＸ線画像を形成する。上述の手法で検知されるＸ線は、概ね、観察試料支持部材内での入射電子の拡散範囲内の領域から放出されることとなり、当該入射電子の拡散範囲を数ｎｍ程度に制御すれば、得られる走査型Ｘ線顕微鏡像の分解能は、従来の手法の理論的限界とされていた１０ｎｍ以下とすることが可能となる。
【００２５】
このような走査型Ｘ線顕微鏡は、通常の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）内にＸ線検出器を新たに設けることにより実現可能であるから、放射光施設などの大規模な研究施設を必要としない。
【００２６】
また、入射電子の拡散範囲からは様々な方向にＸ線が放射されるため、Ｘ線検出器を複数個、様々な位置や角度で設置することで、その角度に依存した傾斜画像を得ることが可能となる。このため、１回の走査で多数の傾斜画像が得られ、これらの傾斜画像に基づいて３次元のＸ線画像を得ることが可能であることに加え、観察試料へのダメージが顕著に軽減される。
【００２７】
さらに、観察試料を支持する部材としてカーボン膜や窒化シリコン膜を用いると、電子線入射により炭素や窒素の特性Ｘ線が放出されることとなるが、当該特性Ｘ線の波長はいわゆる「水の窓」内にあり、水分を含んだ対象物（生体試料や溶液中の試料）をそのままの状態で観察することも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明に係る走査型Ｘ線顕微鏡の構成例を説明するためのブロック図である。
【図２】Ｘ線フォトダイオードにより検知されたＸ線の検出信号の様子を概念的に説明するための図である。
【図３】Ｘ線検出器であるＸ線フォトダイオードを複数備えた走査型Ｘ線顕微鏡の構成例を説明するための図である。
【図４】試料支持膜上での電子線の走査距離（Ｘ）と、異なる角度で配置されたＸ線フォトダイオードにおけるそれぞれの「走査距離」（Ｘ’、Ｘ”）の違いを示した図である。
【図５】図３に示した構成例の走査型Ｘ線顕微鏡に設けられている３つのＸ線フォトダイオードで検知された信号に基づいてそれぞれの角度補正後の画像データを求め、これらの画像データに基づいて対象試料の３次元構造を求めるプロセスを概念的に説明するための図である。
【図６】試料支持膜に対向させてもう一つの試料支持部材を設け、これら２つの試料支持部材の間に溶液と一緒に試料を挟み込んで支持した様子を示す図である。
【図７】実施例１を説明するためのＩＳＥＣ画像（図７Ａ）およびＸ線画像（図７Ｂ）である。
【図８】実施例２を説明するためのＩＳＥＣ画像（図８Ａ）およびＸ線画像（図８Ｂ）である。
【図９】実施例３を説明するためのＸ線画像であり、Ｘ線フォトダイオードの配置位置は、それぞれ、図９Ａはθ＝３０°、図９Ｂはθ＝９０°である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下に、図面を参照して、本発明のＸ線顕微鏡およびその観察方法について説明する。
【００３０】
図１は、本発明に係る走査型Ｘ線顕微鏡の構成例を説明するためのブロック図で、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）内にＸ線検出器を設けた構成例を図示している。したがって、この走査型Ｘ線顕微鏡は、ＳＥＭ機能も併せもつことが可能である。
【００３１】
図１に示した構成例の走査型Ｘ線顕微鏡は、観察試料支持部材である試料支持膜（１１）を保持する試料ホルダ（１２）と、試料支持膜（１１）に電子線を収束させて入射する電子銃（１３）と、電子銃（１３）から出射する電子線を走査させる信号（走査信号）を生成する回路部（１４）と、当該回路部（１４）からの走査信号に基づいて電子線を走査させるための偏向コイル（１５）と、入射電子線によって試料支持膜（１１）内で発生するＸ線を検知するＸ線フォトダイオード（１６）と、Ｘ線フォトダイオード（１６）の検出信号を増幅する増幅器（１７）と、該Ｘ線の検出信号に基づいてＸ線画像を形成するＸ線画像処理ＰＣ（１８）を備えている。
【００３２】
生体の観察対象である試料（１０）は、薄いカーボン膜や窒化シリコン膜の試料支持膜（１１）の下面（裏面）に付着させることで支持されている。なお、試料支持膜（１１）を保持する試料ホルダ（１２）は、走査機構部（不図示）により、ＸＹ平面内での移動が可能である。
【００３３】
試料支持膜（１１）の上面（表面）からは、低加速電圧の電子線が照射され、入射電子は試料支持膜（１１）の内部で拡散しながら広がり、試料支持膜（１１）の下面付近に到達する。このときの電子線の加速電圧は、試料支持膜（１１）に入射した電子が該試料支持膜（１１）をほとんど透過せず、且つ、試料支持膜（１１）の下面に到達する程度の低加速電圧に調整されている。
【００３４】
このような加速電圧とした場合には、試料支持膜（１１）の下面からは、試料支持膜（１１）内で発生したＸ線及び低エネルギの２次電子のみが放出され、入射電子線（１次電子）の試料支持膜（１１）外への放出はほとんどなくなる。このため、試料支持膜（１１）の下面に付着している試料（１０）に対して１次電子がダメージを与えることを回避することができる。
【００３５】
試料支持膜（１１）の下面から放出されたＸ線及び２次電子は、試料（１０）が付着している部位では少なくともその一部が吸収される一方、その他の部位ではそのまま透過することとなる。
【００３６】
図２は、Ｘ線フォトダイオード（１６）により検知されたＸ線の検出信号の様子を概念的に説明するための図である。試料支持膜（１１）の下方に配置されているＸ線フォトダイオード（１６）は透過してきたＸ線を検知し、増幅器（１７）で増幅されたＸ線の検知信号は、走査回路部（１４）から走査信号を受信するデータレコーダ（１９）に送られて記録され、この検知信号（および走査信号）に基づいてＸ線画像処理ＰＣ（１８）によりＸ線画像が形成される。
【００３７】
上述したとおり、電子銃（１３）から出射する電子線は、偏向コイル（１５）により試料支持膜（１１）上の所望の範囲を走査可能であるから、Ｘ線フォトダイオード（１６）で検知されるＸ線の強度は、試料（１０）の付着領域では相対的に弱く、その他の領域では相対的に強くなり、Ｘ線画像処理ＰＣ（１８）により形成されるＸ線画像には、試料（１０）の形状や構造等の情報を含む「コントラスト」が生じることとなる。
【００３８】
図１に示した構成例では、試料支持膜（１１）の下横方向に、２次電子を集電させるための金属製メッシュ（２０）を設け、これにプラスの電圧（＋Ｖ）を加えている。これは、試料支持膜（１１）下面から放出される２次電子がＸ線フォトダイオード（１６）によって検知されてノイズとなることがないように横方向に集電するため、及び、２次電子検出器（２１）への集電を容易にするためのものである。
【００３９】
２次電子検出器（２１）により検知された信号は信号処理部でもあるコントロールＰＣ（２２）に送られ、この信号に基づいて、間接２次電子コントラスト（ＩＳＥＣ）画像（２次電子線画像）を形成することができる。なお、間接２次電子コントラスト（ＩＳＥＣ）画像は、生物試料を非染色のまま観察することが可能である（非特許文献４）。
【００４０】
なお、上記構成例では、Ｘ線検出器としてＸ線フォトダイオードを例示したが、Ｘ線に対する感度を有する他の検出器も使用可能である。
【００４１】
本発明に係る走査型Ｘ線顕微鏡では、Ｘ線は極めて微小な領域から発生（放射）し、しかも、当該Ｘ線放射領域は観察対象である試料の極近傍にあるため、当該Ｘ線放射領域は理想的な点光源と捉えることができる。その結果、電子線の走査により、高分解能のＸ線画像が得られる。
【００４２】
また、本発明で用いる試料支持膜は、５〜４０ｎｍ厚のカーボン薄膜や２０〜５０ｎｍ厚の窒化シリコン膜が理想的である。例えば、厚み４０ｎｍのカーボン膜に、加速電圧１．０〜１．５ｋｅＶ程度の電子線を入射すると、炭素の特性Ｘ線が効率的に放射される。しかし、試料支持膜はこれらの素材のものに限定されるわけではない。例えば、膜厚が５〜５０ｎｍ程度で、「水の窓」の特性Ｘ線を放射可能な素材であれば、生物試料の走査Ｘ線画像を得ることができる。
【００４３】
図１に示した構成例では、Ｘ線検出器は１つだけ設けられているが、Ｘ線検出器を複数備えることとし、これら複数のＸ線検出器を、試料支持膜に支持された観察試料を異なる方向から望む位置に配置するようにしてもよい。
【００４４】
図３は、Ｘ線検出器であるＸ線フォトダイオードを複数備えた走査型Ｘ線顕微鏡の構成例を説明するための図で、Ｘ線フォトダイオード（ＸＰＤ）を３つ設けた（１６ａ〜ｃ）ことに対応して、増幅器（ＡＭＰ）も３つ設けられ（１６ａ〜ｃ）、これら増幅器（１６ａ〜ｃ）からの検知信号をＡ／Ｄ変換器（２３）およびデータレコーダ（１９）を介して、Ｘ線画像処理ＰＣ（１８：ここでは３次元画像処理用ＰＣ）に送る構成となっている。これ以外の基本的構成は、図１に示したものと同じである。
【００４５】
試料支持膜（１１）内からのＸ線は様々な方向に放出されるが、Ｘ線検出器を複数設け、これらを試料支持膜（１１）に支持された観察試料（１０）を異なる方向から望む位置に配置することとすれば、試料を望む角度に依存した複数のＸ線画像（傾斜画像）を得ることができる。つまり、１回の電子線走査で検出器数と同数の傾斜画像が得られることとなり、これらの傾斜画像から、観察対象である試料の３次元構造を求めることが可能となり、しかも、試料に対するダメージは極めて軽微なものとなる。
【００４６】
なお、図３では、Ｘ線検出器数が３の例を示したが、当然のことながら、例えば数十個あるいはそれ以上のＸ線検出器を配置するようにして多数の傾斜画像を取得し、高精度の３次元構造を求めるようにすることも可能である。
【００４７】
図４は、試料支持膜（１１）上での電子線の走査距離（Ｘ）と、異なる角度で配置されたＸ線フォトダイオード（１６ａ、１６ｂ）におけるそれぞれの「走査距離」（Ｘ’、Ｘ”）の違いを示した図である。
【００４８】
また、図５は、図３に示した構成例の走査型Ｘ線顕微鏡に設けられている３つのＸ線フォトダイオード（１６ａ〜ｃ）で検知された信号に基づいてそれぞれの角度補正後の画像データを求め、これらの画像データに基づいて対象試料の３次元構造を求めるプロセスを概念的に説明するための図である。
【００４９】
試料支持膜（１１）上で電子線を距離Ｘだけ走査した場合、試料支持膜（１１）直下のＸ線フォトダイオード（１６ｂ）では、実際の走査距離Ｘと同じＸ’だけ、Ｘ線の放射位置が変わる。すなわち、Ｘ’をＸ線フォトダイオード（１６ｂ）側から見た「走査距離」とすると、Ｘ’＝Ｘとなる。
【００５０】
一方、試料支持膜（１１）面を角度θで斜めから望むＸ線フォトダイオード（１６ａ）では、Ｘ線の放射位置の変化はＸ”＝Ｘ・ｓｉｎθとなり、Ｘに比べてsinθだけ短くなる。
【００５１】
Ｘ線フォトダイオード（１６ａ）で検知されたＸ線検出信号を基に画像を形成する際、電子線の走査信号に何ら処理を施さずに画像形成してしまうと、Ｘ”がＸに比べてsinθだけ短いにも関わらず、距離Ｘとして傾斜画像が形成されてしまい、その傾斜画像は、１／sinθだけ「引伸ばし」された画像となってしまう。このため、３次元画像処理用ＰＣ（１８）は、Ｘ線フォトダイオード（１６ａ）が試料支持膜（１１）面を望む角度θに応じた補正を行なった上で本来の傾斜画像を形成する。
【００５２】
なお、図４に示した例では、Ｘ線フォトダイオード（１６ｂ）を試料支持膜（１１）面の直下（θ＝９０°）に配置しているが、θ≠９０°の場合には上述と同様の補正が必要であることは云うまでもない。
【００５３】
本発明の走査型Ｘ線顕微鏡像の観察を行なう際には、溶液中の試料からの画像を得ることも可能である。
【００５４】
図６は、上述した試料支持膜（１１）に対向させてもう一つの試料支持部材（１１’）を設け、これら２つの試料支持部材の間に溶液と一緒に試料（１０）を挟み込んで支持した様子を示す図である。
【００５５】
試料（１０）は水溶液中にあり、２枚の部材（１１、１１’）に挟み込まれて支持されている。この状態の２枚の部材はサンプルホルダ（２４）内に大気圧下で収納され、Ｏ−リング（２５）によってＳＥＭ装置内の真空と分離されている。従って、サンプルホルダ（２４）を真空中に設置しても、水溶液の蒸発を防ぐことができる。
【００５６】
このような試料の支持を行なう際に用いる部材としては、窒化シリコンが好ましい。これは、窒化シリコンの膜は比較的機械的強度（耐圧性）が高いため、図６に図示したような、ＳＥＭ装置内の真空と分離した状態でのＸ線画像の撮影が容易なためである（非特許文献１参照）。
【実施例１】
【００５７】
図７Ａおよび図７Ｂは、それぞれ、４０ｎｍ厚のカーボン支持膜の下面に観察対象であるバクテリアを付着させ、非染色のまま、上述の本発明の走査型Ｘ線顕微鏡で撮影したＩＳＥＣ画像およびＸ線画像である。
【００５８】
これらの画像の撮影は、電子線の加速電圧を１．０ｋｅＶとし、２次電子集電メッシュの電圧を＋２００Ｖとした。また、Ｘ線フォトダイオードは、試料支持膜の下面から３ｃｍの真下に設置した。なお、ここで示した画像は、ＩＳＥＣ画像及びＸ線画像ともに、信号が弱い部分で白く強い部分で黒くなるようにコントラストを付けている。
【００５９】
図７ＡのＩＳＥＣ画像では、細胞体や太い鞭毛は確認できるが、細い鞭毛は鮮明に確認することができない。一方、図７ＢのＸ線画像では、細い鞭毛まで鮮明に確認することができる。これは、カーボン膜への電子線照射により、約２８０ｅＶのエネルギの特性Ｘ線が放出され、カーボンが当該波長領域のＸ線に対する高い吸収性を示すことによる。生物試料には炭素元素が多量に含まれているため、コントラストの高いＸ線画像を構成することができる。
【実施例２】
【００６０】
図８Ａおよび図８Ｂは、それぞれ、３０ｎｍ厚の窒化シリコン支持膜の下面に観察対象であるバクテリアを付着させ、非染色のまま、上述の本発明の走査型Ｘ線顕微鏡で撮影したＩＳＥＣ画像およびＸ線画像である。なお、このときの電子線の加速電圧は１．５ｋｅＶとし、その他の条件は実施例１と同様とした。
【００６１】
図８ＡのＩＳＥＣ画像よりも、図８ＢのＸ線画像の方が、高いコントラストとなっている。しかし、実施例１のカーボン支持膜の場合と比較すると、コントラストは低下している。窒化シリコン膜の特性Ｘ線は約４００ｅＶ付近にあり、この波長領域のＸ線は炭素よりも窒素に吸収され易いが、生物試料の含有元素としては、炭素よりも窒素の方が含有量は少ないため、コントラストが低下したものと予想される。
【実施例３】
【００６２】
図９Ａおよび図９Ｂは、４０ｎｍ厚のカーボン支持膜の下面に観察対象であるバクテリアを付着させ、非染色のまま、上述の本発明の走査型Ｘ線顕微鏡で撮影したＸ線画像である。
【００６３】
図９Ａはカーボン支持膜面を下側斜めから望む方向（θ＝３０°）に配置したＸ線フォトダイオードからの検出信号に基づくＸ線画像（角度補正後）であり、Ｘ線フォトダイオードは、カーボン支持膜の下面から３ｃｍの距離で、さらに１．５ｃｍ光軸から下側にずらした位置に配置した。
【００６４】
図９Ｂはカーボン支持膜直下（θ＝９０°）に配置したＸ線フォトダイオードからの検出信号に基づくＸ線画像である。
【００６５】
これらのＸ線画像から、Ｘ線検出器を配置する位置により、見え方が変化することが確認できる。
【００６６】
以上説明したように、本発明によれば、簡便に高分解能のＸ線画像を得ることができる。なお、上記実施例に示した画像は何れも、熱電子型の電子銃を用いて得られたものであるが、より点光源に近い電子銃である電界放射型のものを用いることとすれば、１０ｎｍ以下の分解能を容易に達成可能である。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
以上説明したように、本発明は、生体物質や有機物質などの極めて脆弱な試料に対してもダメージを与えることなく、その形態や３次元構造を、簡便且つ高分解能に観察し得る手法を提供する。
【符号の説明】
【００６８】
１０ 観察対象試料
１１ 試料支持膜
１２ 試料ホルダ
１３ 電子銃
１４ 走査信号を生成する回路部
１５ 偏向コイル
１６ Ｘ線フォトダイオード
１７ 増幅器
１８ Ｘ線画像処理ＰＣ
１９ データレコーダ
２０ 金属製メッシュ
２１ ２次電子検出器
２２ コントロールＰＣ
２３ Ａ／Ｄ変換器
２４ サンプルホルダ
２５ Ｏ−リング
【技術分野】
【０００１】
本発明は走査型Ｘ線顕微鏡および走査型Ｘ線顕微鏡像の観察方法に関する。より詳細には、生体物質や有機物質などの極めて脆弱な試料に対してもダメージを与えることなく、その形態や３次元構造を、簡便且つ高分解能に観察し得る手法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物物質や有機物質等の極めて脆弱な試料の形態観察には、主として、光学顕微鏡や電子顕微鏡が用いられている。光学顕微鏡はプローブとして可視光を用いているため、溶液中の観察試料をそのままの状態で観察可能であるという利点がある。しかし、その分解能は用いられる可視光の波長により決まるため、一般には０．２μｍ程度と低く、ウィルスやタンパク質等の微細な試料の直接観察には適用することができない。
【０００３】
一方、電子顕微鏡の分解能は数Åと極めて高いが、２次電子の発生効率を上げるための染色や、チャージアップを防止するためのコーティングといった処理が必要となる。加えて、一般的な観察条件では、電子線の照射によりウィルスやタンパク質等はダメージを受けて破壊される虞があるため、照射電子線量を低くして観察する必要がある。しかし、低照射電子線量条件下で得られる撮影画像は、ノイズが高くコントラストが低いものとなり易い。このため、かかる電顕画像から正確な試料構造を解析するためには、様々な画像処理技術を駆使しなければならない。
【０００４】
近年、Ｘ線をプローブとして用いるＸ線顕微鏡の開発が進められてきている（例えば、非特許文献１）。これは、波長がＸ線と紫外線の間にある軟Ｘ線は、透過力と物質との相互作用力の双方を併せもつことのほかに、下記のような、生体観察に有利な特質があるためである。
【０００５】
具体的には、２．３〜４．４ｎｍの波長範囲の軟Ｘ線は、生体を構成する物質の吸収係数の差が大きく、水は透過する一方、炭素や窒素に良く吸収されるためにタンパク質などは透過しにくいという特性を有する。このような波長領域は「水の窓」と呼ばれるが、「水の窓」領域のＸ線を用いると、水分を含んだ対象物（生体試料や溶液中の試料）をそのままの状態で観察することが可能となることに加え、波長は可視光よりも短いために、光学顕微鏡以上の高分解能観察が可能である。
【０００６】
Ｘ線顕微鏡は、主として、ゾーンプレート等の集光系を用いてＸ線ビームを細く絞って試料に照射する方法（集光系）と、点光源からのＸ線ビームを試料に照射する方法（点光源系）に分類される。
【０００７】
点光源を用いる方法は、レーザーによりＸ線を発生させる方法と、電子線でＸ線を発生させる方法とに分類され、当該方法のＸ線顕微鏡の分解能は、現状で３０ｎｍ程度とされており、更なる高分解能化のための開発が進められている。
【０００８】
また、集光系のＸ線顕微鏡は、照射透過型のものと走査透過型のものとに分類され（非特許文献２）、集光系Ｘ線顕微鏡の分解能はゾーンプレートの加工精度に依存し、理論的限界は１０〜１５ｎｍ程度と予想されている（非特許文献３）。
【０００９】
このようなＸ線顕微鏡は、試料からの透過情報を得ることができるため、観察試料を様々な角度に傾斜乃至回転させて撮影することにより、３次元構造を再構成することが可能である。
【００１０】
このような利点を有するＸ線顕微鏡であるが、下記のような問題点もある。ゾーンプレート等を用いる集光系のＸ線顕微鏡観察では、Ｘ線の集光効率が２０％程度と低いため、鮮明な像を高分解能で得るためには極めて強いＸ線が必要となる。このため、高分解能観察のためには、放射光施設などの大規模な研究施設が必須となる。また、観察像の分解能は概ねゾーンプレートの集光径程度のものとなるが、一般的に市販されているゾーンプレートの集光径は精々５０ｎｍ程度のものに限られるため、高分解能化が制約されてしまう。さらに、理論的な集光限界も１０〜１５ｎｍ程度と予想されており（非特許文献３）、この程度の分解能ではタンパク質等の試料の微細構造を観察することは困難である。
【００１１】
また、点光源を用いるＸ線顕微鏡の分解能は３０ｎｍ程度であり、これ以上の分解能を達成することは原理的に困難とされている。
【００１２】
さらに、従来のＸ線顕微鏡観察によって試料の３次元構造を得るためには、観察試料を様々な角度から複数回撮影する必要があるため、生体物質や有機物質などの極めて脆弱な試料の３次元構造を得る場合には、Ｘ線によるダメージが深刻なものとなる。
【００１３】
【非特許文献１】真島秀明ほか「細胞をX線顕微鏡で見る」Medical Imaging Technology, Vol. 17, No.3 p.211-216 (1999).
【非特許文献２】Chris Jacobsen "Soft x-ray microscopy" Trend in Cell Biology, Vol. 9, p.44-47 (1999).
【非特許文献３】W. Chao et al., "Soft X-ray microscopy at a spatial resolution better than 15 nm" Nature, Vol. 453, p.1210-1213 (2005).
【非特許文献４】T.Ogura "A high contrast method of unstained biological samples under a thin carbon film by scanning electron microscopy" Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol.377, p79-84 (2008).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明はこのような問題に鑑みてなされたもので、その目的とするところは、生体物質や有機物質などの極めて脆弱な試料に対してもダメージを与えることなく、その形態や３次元構造を、簡便且つ高分解能に観察し得る手法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上述の課題を解決するために、本発明の走査型Ｘ線顕微鏡は、観察試料支持部材を保持する試料ホルダと、前記観察試料支持部材に電子線を収束させて入射する電子銃と、該電子線の走査機構部と、前記電子線入射に伴い前記観察試料支持部材から発生するＸ線を検知するＸ線検出器と、該Ｘ線の検出信号に基づいてＸ線画像を形成する信号処理部と、を備えている。
【００１６】
本発明の走査型Ｘ線顕微鏡は、前記Ｘ線検出器を複数備え、該複数のＸ線検出器は、前記観察試料支持部材に支持される観察試料を異なる方向から望む位置に配置されている態様とすることができる。
【００１７】
また、本発明の走査型Ｘ線顕微鏡は、前記信号処理部は、前記複数のＸ線検出器からのＸ線検出信号に基づいて、３次元のＸ線画像を形成する画像処理手段を備えている態様とすることもできる。
【００１８】
さらに、本発明の走査型Ｘ線顕微鏡は、前記電子線入射に伴い観察試料から発生する２次電子を検知する電子線検出器を備え、前記信号処理部により、該２次電子線の検出信号に基づく２次電子線画像を形成する態様とすることもできる。
【００１９】
なお、必要に応じ、前記試料ホルダの走査機構部をさらに備える構成としてもよい。
【００２０】
本発明に係る走査型Ｘ線顕微鏡像の観察方法では、観察試料支持部材の裏面側に観察試料を支持し、前記観察試料支持部材の表面側から収束させた電子線を走査させて入射して該観察試料支持部材からＸ線を発生させ、前記観察試料支持部材の裏面側に配置された検出器により前記Ｘ線を検知してＸ線画像を形成する。
【００２１】
本発明に係る走査型Ｘ線顕微鏡像の観察方法の別の態様では、前記観察試料支持部材に対向させて第２の観察試料支持部材を設け、該２つの観察試料支持部材の間に溶液と一緒に観察試料を挟み込んで支持する。
【００２２】
これらの観察方法は、前記検出器を、前記観察試料支持部材に支持された観察試料を異なる方向から望む位置に複数配置し、該複数の検出器からの検知信号を処理して３次元のＸ線画像を形成する態様とすることもできる。
【００２３】
好ましくは、前記観察試料支持部材には、カーボン膜や窒化シリコン膜を用いる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明では、例えば直径１ｎｍ程度に収束させた電子線を、観察試料を支持する観察試料支持部材に比較的低加速電圧で入射させて該観察試料支持部材からＸ線を発生させ、電子線入射側とは反対側に配置された検出器によりＸ線を検知する。そして、電子線の入射位置を観察試料支持部材上で走査させてＸ線画像を形成する。上述の手法で検知されるＸ線は、概ね、観察試料支持部材内での入射電子の拡散範囲内の領域から放出されることとなり、当該入射電子の拡散範囲を数ｎｍ程度に制御すれば、得られる走査型Ｘ線顕微鏡像の分解能は、従来の手法の理論的限界とされていた１０ｎｍ以下とすることが可能となる。
【００２５】
このような走査型Ｘ線顕微鏡は、通常の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）内にＸ線検出器を新たに設けることにより実現可能であるから、放射光施設などの大規模な研究施設を必要としない。
【００２６】
また、入射電子の拡散範囲からは様々な方向にＸ線が放射されるため、Ｘ線検出器を複数個、様々な位置や角度で設置することで、その角度に依存した傾斜画像を得ることが可能となる。このため、１回の走査で多数の傾斜画像が得られ、これらの傾斜画像に基づいて３次元のＸ線画像を得ることが可能であることに加え、観察試料へのダメージが顕著に軽減される。
【００２７】
さらに、観察試料を支持する部材としてカーボン膜や窒化シリコン膜を用いると、電子線入射により炭素や窒素の特性Ｘ線が放出されることとなるが、当該特性Ｘ線の波長はいわゆる「水の窓」内にあり、水分を含んだ対象物（生体試料や溶液中の試料）をそのままの状態で観察することも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明に係る走査型Ｘ線顕微鏡の構成例を説明するためのブロック図である。
【図２】Ｘ線フォトダイオードにより検知されたＸ線の検出信号の様子を概念的に説明するための図である。
【図３】Ｘ線検出器であるＸ線フォトダイオードを複数備えた走査型Ｘ線顕微鏡の構成例を説明するための図である。
【図４】試料支持膜上での電子線の走査距離（Ｘ）と、異なる角度で配置されたＸ線フォトダイオードにおけるそれぞれの「走査距離」（Ｘ’、Ｘ”）の違いを示した図である。
【図５】図３に示した構成例の走査型Ｘ線顕微鏡に設けられている３つのＸ線フォトダイオードで検知された信号に基づいてそれぞれの角度補正後の画像データを求め、これらの画像データに基づいて対象試料の３次元構造を求めるプロセスを概念的に説明するための図である。
【図６】試料支持膜に対向させてもう一つの試料支持部材を設け、これら２つの試料支持部材の間に溶液と一緒に試料を挟み込んで支持した様子を示す図である。
【図７】実施例１を説明するためのＩＳＥＣ画像（図７Ａ）およびＸ線画像（図７Ｂ）である。
【図８】実施例２を説明するためのＩＳＥＣ画像（図８Ａ）およびＸ線画像（図８Ｂ）である。
【図９】実施例３を説明するためのＸ線画像であり、Ｘ線フォトダイオードの配置位置は、それぞれ、図９Ａはθ＝３０°、図９Ｂはθ＝９０°である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下に、図面を参照して、本発明のＸ線顕微鏡およびその観察方法について説明する。
【００３０】
図１は、本発明に係る走査型Ｘ線顕微鏡の構成例を説明するためのブロック図で、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）内にＸ線検出器を設けた構成例を図示している。したがって、この走査型Ｘ線顕微鏡は、ＳＥＭ機能も併せもつことが可能である。
【００３１】
図１に示した構成例の走査型Ｘ線顕微鏡は、観察試料支持部材である試料支持膜（１１）を保持する試料ホルダ（１２）と、試料支持膜（１１）に電子線を収束させて入射する電子銃（１３）と、電子銃（１３）から出射する電子線を走査させる信号（走査信号）を生成する回路部（１４）と、当該回路部（１４）からの走査信号に基づいて電子線を走査させるための偏向コイル（１５）と、入射電子線によって試料支持膜（１１）内で発生するＸ線を検知するＸ線フォトダイオード（１６）と、Ｘ線フォトダイオード（１６）の検出信号を増幅する増幅器（１７）と、該Ｘ線の検出信号に基づいてＸ線画像を形成するＸ線画像処理ＰＣ（１８）を備えている。
【００３２】
生体の観察対象である試料（１０）は、薄いカーボン膜や窒化シリコン膜の試料支持膜（１１）の下面（裏面）に付着させることで支持されている。なお、試料支持膜（１１）を保持する試料ホルダ（１２）は、走査機構部（不図示）により、ＸＹ平面内での移動が可能である。
【００３３】
試料支持膜（１１）の上面（表面）からは、低加速電圧の電子線が照射され、入射電子は試料支持膜（１１）の内部で拡散しながら広がり、試料支持膜（１１）の下面付近に到達する。このときの電子線の加速電圧は、試料支持膜（１１）に入射した電子が該試料支持膜（１１）をほとんど透過せず、且つ、試料支持膜（１１）の下面に到達する程度の低加速電圧に調整されている。
【００３４】
このような加速電圧とした場合には、試料支持膜（１１）の下面からは、試料支持膜（１１）内で発生したＸ線及び低エネルギの２次電子のみが放出され、入射電子線（１次電子）の試料支持膜（１１）外への放出はほとんどなくなる。このため、試料支持膜（１１）の下面に付着している試料（１０）に対して１次電子がダメージを与えることを回避することができる。
【００３５】
試料支持膜（１１）の下面から放出されたＸ線及び２次電子は、試料（１０）が付着している部位では少なくともその一部が吸収される一方、その他の部位ではそのまま透過することとなる。
【００３６】
図２は、Ｘ線フォトダイオード（１６）により検知されたＸ線の検出信号の様子を概念的に説明するための図である。試料支持膜（１１）の下方に配置されているＸ線フォトダイオード（１６）は透過してきたＸ線を検知し、増幅器（１７）で増幅されたＸ線の検知信号は、走査回路部（１４）から走査信号を受信するデータレコーダ（１９）に送られて記録され、この検知信号（および走査信号）に基づいてＸ線画像処理ＰＣ（１８）によりＸ線画像が形成される。
【００３７】
上述したとおり、電子銃（１３）から出射する電子線は、偏向コイル（１５）により試料支持膜（１１）上の所望の範囲を走査可能であるから、Ｘ線フォトダイオード（１６）で検知されるＸ線の強度は、試料（１０）の付着領域では相対的に弱く、その他の領域では相対的に強くなり、Ｘ線画像処理ＰＣ（１８）により形成されるＸ線画像には、試料（１０）の形状や構造等の情報を含む「コントラスト」が生じることとなる。
【００３８】
図１に示した構成例では、試料支持膜（１１）の下横方向に、２次電子を集電させるための金属製メッシュ（２０）を設け、これにプラスの電圧（＋Ｖ）を加えている。これは、試料支持膜（１１）下面から放出される２次電子がＸ線フォトダイオード（１６）によって検知されてノイズとなることがないように横方向に集電するため、及び、２次電子検出器（２１）への集電を容易にするためのものである。
【００３９】
２次電子検出器（２１）により検知された信号は信号処理部でもあるコントロールＰＣ（２２）に送られ、この信号に基づいて、間接２次電子コントラスト（ＩＳＥＣ）画像（２次電子線画像）を形成することができる。なお、間接２次電子コントラスト（ＩＳＥＣ）画像は、生物試料を非染色のまま観察することが可能である（非特許文献４）。
【００４０】
なお、上記構成例では、Ｘ線検出器としてＸ線フォトダイオードを例示したが、Ｘ線に対する感度を有する他の検出器も使用可能である。
【００４１】
本発明に係る走査型Ｘ線顕微鏡では、Ｘ線は極めて微小な領域から発生（放射）し、しかも、当該Ｘ線放射領域は観察対象である試料の極近傍にあるため、当該Ｘ線放射領域は理想的な点光源と捉えることができる。その結果、電子線の走査により、高分解能のＸ線画像が得られる。
【００４２】
また、本発明で用いる試料支持膜は、５〜４０ｎｍ厚のカーボン薄膜や２０〜５０ｎｍ厚の窒化シリコン膜が理想的である。例えば、厚み４０ｎｍのカーボン膜に、加速電圧１．０〜１．５ｋｅＶ程度の電子線を入射すると、炭素の特性Ｘ線が効率的に放射される。しかし、試料支持膜はこれらの素材のものに限定されるわけではない。例えば、膜厚が５〜５０ｎｍ程度で、「水の窓」の特性Ｘ線を放射可能な素材であれば、生物試料の走査Ｘ線画像を得ることができる。
【００４３】
図１に示した構成例では、Ｘ線検出器は１つだけ設けられているが、Ｘ線検出器を複数備えることとし、これら複数のＸ線検出器を、試料支持膜に支持された観察試料を異なる方向から望む位置に配置するようにしてもよい。
【００４４】
図３は、Ｘ線検出器であるＸ線フォトダイオードを複数備えた走査型Ｘ線顕微鏡の構成例を説明するための図で、Ｘ線フォトダイオード（ＸＰＤ）を３つ設けた（１６ａ〜ｃ）ことに対応して、増幅器（ＡＭＰ）も３つ設けられ（１６ａ〜ｃ）、これら増幅器（１６ａ〜ｃ）からの検知信号をＡ／Ｄ変換器（２３）およびデータレコーダ（１９）を介して、Ｘ線画像処理ＰＣ（１８：ここでは３次元画像処理用ＰＣ）に送る構成となっている。これ以外の基本的構成は、図１に示したものと同じである。
【００４５】
試料支持膜（１１）内からのＸ線は様々な方向に放出されるが、Ｘ線検出器を複数設け、これらを試料支持膜（１１）に支持された観察試料（１０）を異なる方向から望む位置に配置することとすれば、試料を望む角度に依存した複数のＸ線画像（傾斜画像）を得ることができる。つまり、１回の電子線走査で検出器数と同数の傾斜画像が得られることとなり、これらの傾斜画像から、観察対象である試料の３次元構造を求めることが可能となり、しかも、試料に対するダメージは極めて軽微なものとなる。
【００４６】
なお、図３では、Ｘ線検出器数が３の例を示したが、当然のことながら、例えば数十個あるいはそれ以上のＸ線検出器を配置するようにして多数の傾斜画像を取得し、高精度の３次元構造を求めるようにすることも可能である。
【００４７】
図４は、試料支持膜（１１）上での電子線の走査距離（Ｘ）と、異なる角度で配置されたＸ線フォトダイオード（１６ａ、１６ｂ）におけるそれぞれの「走査距離」（Ｘ’、Ｘ”）の違いを示した図である。
【００４８】
また、図５は、図３に示した構成例の走査型Ｘ線顕微鏡に設けられている３つのＸ線フォトダイオード（１６ａ〜ｃ）で検知された信号に基づいてそれぞれの角度補正後の画像データを求め、これらの画像データに基づいて対象試料の３次元構造を求めるプロセスを概念的に説明するための図である。
【００４９】
試料支持膜（１１）上で電子線を距離Ｘだけ走査した場合、試料支持膜（１１）直下のＸ線フォトダイオード（１６ｂ）では、実際の走査距離Ｘと同じＸ’だけ、Ｘ線の放射位置が変わる。すなわち、Ｘ’をＸ線フォトダイオード（１６ｂ）側から見た「走査距離」とすると、Ｘ’＝Ｘとなる。
【００５０】
一方、試料支持膜（１１）面を角度θで斜めから望むＸ線フォトダイオード（１６ａ）では、Ｘ線の放射位置の変化はＸ”＝Ｘ・ｓｉｎθとなり、Ｘに比べてsinθだけ短くなる。
【００５１】
Ｘ線フォトダイオード（１６ａ）で検知されたＸ線検出信号を基に画像を形成する際、電子線の走査信号に何ら処理を施さずに画像形成してしまうと、Ｘ”がＸに比べてsinθだけ短いにも関わらず、距離Ｘとして傾斜画像が形成されてしまい、その傾斜画像は、１／sinθだけ「引伸ばし」された画像となってしまう。このため、３次元画像処理用ＰＣ（１８）は、Ｘ線フォトダイオード（１６ａ）が試料支持膜（１１）面を望む角度θに応じた補正を行なった上で本来の傾斜画像を形成する。
【００５２】
なお、図４に示した例では、Ｘ線フォトダイオード（１６ｂ）を試料支持膜（１１）面の直下（θ＝９０°）に配置しているが、θ≠９０°の場合には上述と同様の補正が必要であることは云うまでもない。
【００５３】
本発明の走査型Ｘ線顕微鏡像の観察を行なう際には、溶液中の試料からの画像を得ることも可能である。
【００５４】
図６は、上述した試料支持膜（１１）に対向させてもう一つの試料支持部材（１１’）を設け、これら２つの試料支持部材の間に溶液と一緒に試料（１０）を挟み込んで支持した様子を示す図である。
【００５５】
試料（１０）は水溶液中にあり、２枚の部材（１１、１１’）に挟み込まれて支持されている。この状態の２枚の部材はサンプルホルダ（２４）内に大気圧下で収納され、Ｏ−リング（２５）によってＳＥＭ装置内の真空と分離されている。従って、サンプルホルダ（２４）を真空中に設置しても、水溶液の蒸発を防ぐことができる。
【００５６】
このような試料の支持を行なう際に用いる部材としては、窒化シリコンが好ましい。これは、窒化シリコンの膜は比較的機械的強度（耐圧性）が高いため、図６に図示したような、ＳＥＭ装置内の真空と分離した状態でのＸ線画像の撮影が容易なためである（非特許文献１参照）。
【実施例１】
【００５７】
図７Ａおよび図７Ｂは、それぞれ、４０ｎｍ厚のカーボン支持膜の下面に観察対象であるバクテリアを付着させ、非染色のまま、上述の本発明の走査型Ｘ線顕微鏡で撮影したＩＳＥＣ画像およびＸ線画像である。
【００５８】
これらの画像の撮影は、電子線の加速電圧を１．０ｋｅＶとし、２次電子集電メッシュの電圧を＋２００Ｖとした。また、Ｘ線フォトダイオードは、試料支持膜の下面から３ｃｍの真下に設置した。なお、ここで示した画像は、ＩＳＥＣ画像及びＸ線画像ともに、信号が弱い部分で白く強い部分で黒くなるようにコントラストを付けている。
【００５９】
図７ＡのＩＳＥＣ画像では、細胞体や太い鞭毛は確認できるが、細い鞭毛は鮮明に確認することができない。一方、図７ＢのＸ線画像では、細い鞭毛まで鮮明に確認することができる。これは、カーボン膜への電子線照射により、約２８０ｅＶのエネルギの特性Ｘ線が放出され、カーボンが当該波長領域のＸ線に対する高い吸収性を示すことによる。生物試料には炭素元素が多量に含まれているため、コントラストの高いＸ線画像を構成することができる。
【実施例２】
【００６０】
図８Ａおよび図８Ｂは、それぞれ、３０ｎｍ厚の窒化シリコン支持膜の下面に観察対象であるバクテリアを付着させ、非染色のまま、上述の本発明の走査型Ｘ線顕微鏡で撮影したＩＳＥＣ画像およびＸ線画像である。なお、このときの電子線の加速電圧は１．５ｋｅＶとし、その他の条件は実施例１と同様とした。
【００６１】
図８ＡのＩＳＥＣ画像よりも、図８ＢのＸ線画像の方が、高いコントラストとなっている。しかし、実施例１のカーボン支持膜の場合と比較すると、コントラストは低下している。窒化シリコン膜の特性Ｘ線は約４００ｅＶ付近にあり、この波長領域のＸ線は炭素よりも窒素に吸収され易いが、生物試料の含有元素としては、炭素よりも窒素の方が含有量は少ないため、コントラストが低下したものと予想される。
【実施例３】
【００６２】
図９Ａおよび図９Ｂは、４０ｎｍ厚のカーボン支持膜の下面に観察対象であるバクテリアを付着させ、非染色のまま、上述の本発明の走査型Ｘ線顕微鏡で撮影したＸ線画像である。
【００６３】
図９Ａはカーボン支持膜面を下側斜めから望む方向（θ＝３０°）に配置したＸ線フォトダイオードからの検出信号に基づくＸ線画像（角度補正後）であり、Ｘ線フォトダイオードは、カーボン支持膜の下面から３ｃｍの距離で、さらに１．５ｃｍ光軸から下側にずらした位置に配置した。
【００６４】
図９Ｂはカーボン支持膜直下（θ＝９０°）に配置したＸ線フォトダイオードからの検出信号に基づくＸ線画像である。
【００６５】
これらのＸ線画像から、Ｘ線検出器を配置する位置により、見え方が変化することが確認できる。
【００６６】
以上説明したように、本発明によれば、簡便に高分解能のＸ線画像を得ることができる。なお、上記実施例に示した画像は何れも、熱電子型の電子銃を用いて得られたものであるが、より点光源に近い電子銃である電界放射型のものを用いることとすれば、１０ｎｍ以下の分解能を容易に達成可能である。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
以上説明したように、本発明は、生体物質や有機物質などの極めて脆弱な試料に対してもダメージを与えることなく、その形態や３次元構造を、簡便且つ高分解能に観察し得る手法を提供する。
【符号の説明】
【００６８】
１０ 観察対象試料
１１ 試料支持膜
１２ 試料ホルダ
１３ 電子銃
１４ 走査信号を生成する回路部
１５ 偏向コイル
１６ Ｘ線フォトダイオード
１７ 増幅器
１８ Ｘ線画像処理ＰＣ
１９ データレコーダ
２０ 金属製メッシュ
２１ ２次電子検出器
２２ コントロールＰＣ
２３ Ａ／Ｄ変換器
２４ サンプルホルダ
２５ Ｏ−リング
【特許請求の範囲】
【請求項１】
観察試料支持部材を保持する試料ホルダと、前記観察試料支持部材に電子線を収束させて入射する電子銃と、該電子線の走査機構部と、前記電子線入射に伴い前記観察試料支持部材から発生するＸ線を検知するＸ線検出器と、該Ｘ線の検出信号に基づいてＸ線画像を形成する信号処理部と、を備えている走査型Ｘ線顕微鏡。
【請求項２】
前記Ｘ線検出器を複数備え、該複数のＸ線検出器は、前記観察試料支持部材に支持される観察試料を異なる方向から望む位置に配置されている請求項１に記載の走査型Ｘ線顕微鏡。
【請求項３】
前記信号処理部は、前記複数のＸ線検出器からのＸ線検出信号に基づいて、３次元のＸ線画像を形成する画像処理手段を備えている請求項２に記載の走査型Ｘ線顕微鏡。
【請求項４】
前記電子線入射に伴い観察試料から発生する２次電子を検知する電子線検出器を備え、前記信号処理部により、該２次電子線の検出信号に基づく２次電子線画像を形成する請求項１乃至３の何れか１項に記載の走査型Ｘ線顕微鏡。
【請求項５】
前記試料ホルダの走査機構部をさらに備えている請求項１乃至４の何れか１項に記載の走査型Ｘ線顕微鏡。
【請求項６】
観察試料支持部材の裏面側に観察試料を支持し、前記観察試料支持部材の表面側から収束させた電子線を走査させて入射して該観察試料支持部材からＸ線を発生させ、前記観察試料支持部材の裏面側に配置された検出器により前記Ｘ線を検知してＸ線画像を形成する、走査型Ｘ線顕微鏡像の観察方法。
【請求項７】
前記検出器を、前記観察試料支持部材に支持された観察試料を異なる方向から望む位置に複数配置し、該複数の検出器からの検知信号を処理して３次元のＸ線画像を形成する、請求項６に記載の走査型Ｘ線顕微鏡像の観察方法。
【請求項８】
前記観察試料支持部材としてカーボン膜または窒化シリコン膜を用いる、請求項６又は７に記載の走査型Ｘ線顕微鏡像の観察方法。
【請求項９】
前記観察試料支持部材に対向させて第２の観察試料支持部材を設け、該２つの観察試料支持部材の間に溶液と一緒に観察試料を挟み込んで支持する、請求項６乃至８の何れか１項に記載の走査型Ｘ線顕微鏡像の観察方法。
【請求項１０】
前記第２の観察試料支持部材として窒化シリコン膜を用いる、請求項９に記載の走査型Ｘ線顕微鏡像の観察方法。
【請求項１】
観察試料支持部材を保持する試料ホルダと、前記観察試料支持部材に電子線を収束させて入射する電子銃と、該電子線の走査機構部と、前記電子線入射に伴い前記観察試料支持部材から発生するＸ線を検知するＸ線検出器と、該Ｘ線の検出信号に基づいてＸ線画像を形成する信号処理部と、を備えている走査型Ｘ線顕微鏡。
【請求項２】
前記Ｘ線検出器を複数備え、該複数のＸ線検出器は、前記観察試料支持部材に支持される観察試料を異なる方向から望む位置に配置されている請求項１に記載の走査型Ｘ線顕微鏡。
【請求項３】
前記信号処理部は、前記複数のＸ線検出器からのＸ線検出信号に基づいて、３次元のＸ線画像を形成する画像処理手段を備えている請求項２に記載の走査型Ｘ線顕微鏡。
【請求項４】
前記電子線入射に伴い観察試料から発生する２次電子を検知する電子線検出器を備え、前記信号処理部により、該２次電子線の検出信号に基づく２次電子線画像を形成する請求項１乃至３の何れか１項に記載の走査型Ｘ線顕微鏡。
【請求項５】
前記試料ホルダの走査機構部をさらに備えている請求項１乃至４の何れか１項に記載の走査型Ｘ線顕微鏡。
【請求項６】
観察試料支持部材の裏面側に観察試料を支持し、前記観察試料支持部材の表面側から収束させた電子線を走査させて入射して該観察試料支持部材からＸ線を発生させ、前記観察試料支持部材の裏面側に配置された検出器により前記Ｘ線を検知してＸ線画像を形成する、走査型Ｘ線顕微鏡像の観察方法。
【請求項７】
前記検出器を、前記観察試料支持部材に支持された観察試料を異なる方向から望む位置に複数配置し、該複数の検出器からの検知信号を処理して３次元のＸ線画像を形成する、請求項６に記載の走査型Ｘ線顕微鏡像の観察方法。
【請求項８】
前記観察試料支持部材としてカーボン膜または窒化シリコン膜を用いる、請求項６又は７に記載の走査型Ｘ線顕微鏡像の観察方法。
【請求項９】
前記観察試料支持部材に対向させて第２の観察試料支持部材を設け、該２つの観察試料支持部材の間に溶液と一緒に観察試料を挟み込んで支持する、請求項６乃至８の何れか１項に記載の走査型Ｘ線顕微鏡像の観察方法。
【請求項１０】
前記第２の観察試料支持部材として窒化シリコン膜を用いる、請求項９に記載の走査型Ｘ線顕微鏡像の観察方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１０−１７５３８９（Ｐ２０１０−１７５３８９Ａ）
【公開日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１８２９０（Ｐ２００９−１８２９０）
【出願日】平成２１年１月２９日（２００９．１．２９）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２０年度、独立行政法人科学技術振興機構委託研究「蛋白質電顕画像を用いた自動ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ擬似結晶構造解析法の開発」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【公開日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月２９日（２００９．１．２９）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２０年度、独立行政法人科学技術振興機構委託研究「蛋白質電顕画像を用いた自動ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ擬似結晶構造解析法の開発」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
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