造血幹細胞の培養方法
【課題】生体外で、造血幹細胞の自己複製及び血液細胞への分化を同時に誘導させる。
【解決手段】造血幹細胞又は造血幹細胞を含有する細胞集団と造血支持細胞とを、該造血支持細胞がエポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有する基体に付着した状態で共培養することにより、造血幹細胞の自己複製及び血液細胞への分化を同時に誘導させることを特徴とする、造血幹細胞の培養方法を提供することにより、上記課題を解決する。
【解決手段】造血幹細胞又は造血幹細胞を含有する細胞集団と造血支持細胞とを、該造血支持細胞がエポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有する基体に付着した状態で共培養することにより、造血幹細胞の自己複製及び血液細胞への分化を同時に誘導させることを特徴とする、造血幹細胞の培養方法を提供することにより、上記課題を解決する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、造血幹細胞の培養方法に関する。より詳細には、本発明は、造血幹細胞と特定の培養担体に付着した血液支持細胞とを共培養する、造血幹細胞の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療は、機能不全に陥った組織や器官を正常に機能するものに代替えしたりすることができ、先天的に欠損したか又は疾患や事故によって後天的に失われた組織や器官を再生できる技術として非常に注目を浴びている。
再生医療には、未分化細胞の調達が一番の重要課題ではあるが、細胞を再生医療に用いるためには、生体外で、組織を構成する種々の細胞を個々増殖させ、異種の細胞塊を互いに接着させ、三次元的に生体内と同様の組織を組み上げる技術の確立が必要となる。
【０００３】
しかし、生体内で細胞は三次元的に密接に関わっているにも拘らず、従来の生体外培養法としては、プレートを用いた平面培養法やスピナーを用いた懸濁培養法などが挙げられ、三次元的な細胞の集密培養に関する研究は一部しか行われていない。
また、二種類以上の増殖速度の異なる細胞を従来の方法による同時に培養しても、増殖速度の速い細胞が急速に数を増やし、増殖速度の遅い細胞は淘汰されてしまうため、共培養は困難である。
【０００４】
三次元的な細胞培養法に関して、安田らは、高分子微粒子を細胞の支持担体として用いる付着性細胞の新規三次元培養法を開発している。この培養法では、重合反応性開始剤である２,２'-アゾビス[Ｎ-(２-プロペニル)-２-メチルプロピオンアミド]を用いて懸濁共重合により合成した高分子微粒子に、該微粒子中のアゾ基を開始剤としてエポキシ基及びカルボキシル基を含むグラフト鎖をグラフト重合したものを支持担体として使用して、付着性細胞の固定化と、担体上での細胞増殖が確認されている(例えば、非特許文献１、非特許文献２を参照)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−６１５６９号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】國枝弘史、川又崇弘、安田昌弘、相澤 信、関 実、「高分子担体を用いた付着性細胞の支持培養」化学工学会第72回年会講演要旨I303(2007)
【非特許文献２】國枝弘史、安田昌弘、関 実、相澤 信、「高分子担体を用いた細胞間相互作用の定量的評価」化学工学会第39回秋季大会講演要旨P088(2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記文献に記載の技術は成熟(分化)細胞の単培養に関するものであり、幹細胞のような未分化細胞についての検討はなされていない。
自己再生能(自己複製能)及び多分化能を有する幹細胞(例えば、造血幹細胞)は、培養により自己再生能及び多分化能を消失してしまい、両能力を維持したままで培養することは、通常困難である。
【０００８】
幹細胞を未分化状態で自己再生させる培養技術は知られているが、この技術によれば、幹細胞の成熟細胞への分化に際しては分化誘導培地で培養するなどの分化誘導技術を別途に適用する必要があった(例えば、特許文献１)。
本発明は、造血幹細胞について、自己複製を繰り返しつつ、血液細胞への分化を継続的に維持させることを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意検討の結果、エポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有する基体に固定化した造血支持細胞の存在下で造血幹細胞を培養することによって、造血幹細胞の自己再生能及び分化能が同時に維持されることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、造血幹細胞又は造血幹細胞を含有する細胞集団と造血支持細胞とを、該造血支持細胞がエポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有する基体に付着した状態で共培養することにより、造血幹細胞の自己複製及び血液細胞への分化を同時に誘導させることを特徴とする、造血幹細胞の培養方法を提供する。
【００１１】
本発明はまた、造血幹細胞又は造血幹細胞を含有する細胞集団と造血支持細胞とを、該造血支持細胞がエポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有する基体に付着した状態で共培養することにより、造血幹細胞の自己複製及び血液細胞への分化を同時に誘導させることを特徴とする、造血幹細胞の維持又は増幅方法を提供する。
本発明はまた、造血幹細胞又は造血幹細胞を含有する細胞集団と、エポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有する粒子からなる三次元集積体に付着した造血支持細胞とを含んでなることを特徴とする、三次元共培養物を提供する。
【００１２】
本発明はまた、エポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有する体積平均粒径５０〜２,０００μｍの粒子の三次元集積体と該三次元集積体に付着した造血支持細胞とを含んでなり、該粒子がエポキシ基を０.５×１０-3〜２.０×１０-3ｍｏｌ/ｇ基体の量で有することを特徴とする、造血幹細胞の培養キットを提供する。
本発明はまた、エポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有する体積平均粒径５０〜２,０００μｍの複数の粒子からなり、該粒子がエポキシ基を０.５×１０-3〜２.０×１０-3ｍｏｌ/ｇ基体の量で有する、造血幹細胞と造血支持細胞との共培養用の培養担体を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の培養方法によれば、生体外で、造血幹細胞の自己複製(自己再生)及び血液細胞への分化を誘導することが可能となる。
また、本発明の共培養物によれば、造血幹細胞の維持システム及び/又は血液細胞の提供システムが可能となる。
また、本発明の培養キット及び培養担体によれば、体外での造血幹細胞の維持・分化誘導が容易に可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】造血支持細胞が本発明に係る培養担体の一形態に付着(固定化)することを示す写真である。
【図２】造血支持細胞がグラフト鎖を有さない培養担体へは付着(固定化)しないことを示す写真である。
【図３】グラフト鎖中のエポキシ基量が培養担体への造血支持細胞の付着速度に及ぼす影響を示すグラフである。
【図４】グラフト鎖の数及び密度が培養担体への造血支持細胞の付着に及ぼす影響を示すグラフである。
【図５】グラフト鎖の鎖長が培養担体への造血支持細胞の付着に及ぼす影響を示すグラフである。
【図６】造血支持細胞の付着に対するグラフト鎖の親水性官能基の影響を示すグラフである。
【図７】基体の粒径が培養担体への造血支持細胞の付着に及ぼす影響を示すグラフである。
【図８】造血支持細胞が本発明に係る培養担体の別の形態(基体としてＰＰ板；左)に付着(固定化)するが、未処理ＰＰ板(右)には付着(固定化)しないことを示す写真である。
【図９】造血支持細胞が本発明に係る培養担体の更に別の形態(左)に付着(固定化)するが、グラフト鎖を有さない培養担体(右)には付着(固定化)しないことを示す写真である。
【図１０】本発明に係る培養担体に付着した造血支持細胞(ＭＳ-５)との共培養による造血幹細胞の増殖及び分化並びに造血巣の形成を示す写真である。
【図１１】造血巣(造血幹細胞と本発明に係る培養担体に付着した造血支持細胞との共培養物)から遊離する血球細胞の数を示すグラフである。
【図１２】回収した培養培地中に存在するＣＦＵ-Ｍｉｘ、ＢＦＵ-Ｅ及びＣＦＵ-ＧＭにより形成されたコロニーの比率を示すグラフである。
【図１３】造血巣から遊離された細胞のメイ・グリュンワルド・ギムザ染色写真である。
【図１４】本発明に係る培養担体上で造血支持細胞(ＭＳ-５)と共培養されている造血幹細胞のヘマトキシリン・エオシン染色（Ｈ-Ｅ染色）写真(左)及びアルシアン・ブルー染色写真(右)である。
【図１５】本発明に係る培養担体上で造血支持細胞(ＭＳ-５)と共培養されている造血幹細胞の走査型電子顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
(基体)
本発明において使用し得る基体(固体状支持体)は、その外表面に後述するグラフト鎖を有することができるものであれば、材質について何ら限定されず、無機材料からなるものであっても、有機材料からなるものであってもよい。ここで、「外表面」とは、外部からのアクセス(接近)が容易な外周面をいい、例えば多孔質体における孔のような内部空間を形成している表面を含まない。
【００１６】
無機材料からなる基体としては、例えば、シリカ(代表的にはガラス)、シリコン、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムやヒドロキシアパタイトなどが挙げられる。
有機材料からなる基体としては、例えば、(メタ)アクリル酸系(共)重合体、オレフィン系(共)重合体(例えば、エチレン又はプロピレン(共)重合体)、スチレン(共)重合体、ウレタン(共)重合体のような樹脂からなるものや、乳酸(共)重合体、グリコール酸(共)重合体、εカプロラクトン(共)重合体のような生分解性樹脂からなるものなどが挙げられる。
好ましくは、基体は、(メタ)アクリル酸系(共)重合体、オレフィン系(共)重合体又はスチレン(共)重合体からなる。
【００１７】
共重合体中のコモノマー単位としては、特に制限はないが、例えば、ジビニルベンゼン、トリメリット酸トリアリル、トリ(メタ)アクリル酸ペンタエリスリトール、ジ(メタ)アクリル酸エチレングリコール、２,２'-アゾビス［Ｎ-(２-プロペニル)-２-メチルプロピオンアミド］、２,２'-アゾビス(２-メチルプロピオンアミジン)及び４,４'-アゾビス(４-シアノペンタン酸)、ビニルピロリドンに由来するコモノマー単位が挙げられる。コモノマー単位は１種であってもよいし、２種以上であってもよい。
【００１８】
(メタ)アクリル酸系(共)重合体としては、例えば、ポリ(メタ)アクリル酸、ポリ(メタ)アクリル酸エステル(例えば、(Ｃ1〜Ｃ4)アルキルアルコールや(Ｃ2〜Ｃ4)アルキレンジオールとのエステル)、(メタ)アクリル酸又は(メタ)アクリル酸エステルと他のコモノマーとの共重合体が挙げられる。
【００１９】
より具体的には、ポリ(メタ)アクリル酸メチル、(メタ)アクリル酸メチルと２,２'-アゾビス［Ｎ-(２-プロペニル)-２-メチルプロピオンアミド］との共重合体、(メタ)アクリル酸メチルと２,２'-アゾビス［Ｎ-(２-プロペニル)-２-メチルプロピオンアミド］と他のコモノマー(例えば、ジビニルベンゼン、トリメリット酸トリアリル、トリ(メタ)アクリル酸ペンタエリスリトール、ジ(メタ)アクリル酸エチレングリコール、ビニルピロリドンのうちの１種又は２種以上)の共重合体、ジ(メタ)アクリル酸エチレングリコールと２,２'-アゾビス［Ｎ-(２-プロペニル)-２-メチルプロピオンアミド］との共重合体、ジ(メタ)アクリル酸エチレングリコールと２,２'-アゾビス［Ｎ-(２-プロペニル)-２-メチルプロピオンアミド］と他のコモノマー(例えば、ジビニルベンゼン、トリメリット酸トリアリル、トリ(メタ)アクリル酸ペンタエリスリトール、ビニルピロリドンのうちの１種又は２種以上)との共重合体が挙げられる。
【００２０】
スチレン(共)重合体としては、例えば、ポリスチレン、スチレンと２,２'-アゾビス［Ｎ-(２-プロペニル)-２-メチルプロピオンアミド］との共重合体又はスチレンと２,２'-アゾビス［Ｎ-(２-プロペニル)-２-メチルプロピオンアミド］と他のコモノマー(例えば、ジビニルベンゼン、トリメリット酸トリアリル、トリアクリル酸ペンタエリスリトール、ジメタクリル酸エチレングリコール、ビニルピロリドンのうちの１種又は２種以上)との共重合体が挙げられる。
【００２１】
機械的安定性、タンパク質の非特異的付着及び生体毒性の観点から、メタクリル酸メチルと他のコモノマーとの共重合体、及びメタクリル酸メチルと２,２'-アゾビス［Ｎ-(２-プロペニル)-２-メチルプロピオンアミド］と他のコモノマーとの共重合体からなる基体が好ましい。
【００２２】
基体はまた、その外表面にグラフト鎖を有することができるものであれば、形状についても何ら限定されず、粒子状、繊維状、シート状、メッシュ状など任意の形状をとり得るが、好ましくは粒子状(特に好ましくは、球状又は略球状)である。
粒子状の基体は、好ましくは５０〜２,０００μｍ、より好ましくは１００〜２,０００μｍ、より好ましくは２００〜２,０００μｍ、より好ましくは３００〜２,０００μｍ、より好ましくは５００〜２,０００μｍの体積平均粒径を有する。
【００２３】
基体が粒子状である場合には、複数の基体が三次元集積体を形成していることが好ましい。
基体は多孔質であってもよいが、多孔質でないほうが好ましい。
【００２４】
基体の作製法
重合体からなる基体は、(コ)モノマー(例えば、前述のもの)を公知の方法で重合反応させることにより作製することができる。なかでも、モノマー(必要に応じて、高分子性分散安定剤)を溶媒中に分散させて重合固化させる懸濁重合法は、一段階で基体を作製でき、また後述する重合開始基を容易に導入できる点で、好ましい。
基体を作製するための重合反応に使用する重合開始剤は、任意の公知の重合開始剤(例えば、アゾビスイソブチロニトリル、２,２'-アゾビス(２,４-ジメチルバレロニトリル)、過酸化ベンゾイル)を使用することができる。
【００２５】
後工程で、下記で説明する「表面グラフト重合法」によりグラフト鎖を基体に付与する場合には、表面グラフト重合法で重合開始剤として機能し得る基(重合開始基)を基体に内在させる。
【００２６】
重合開始基を提供し得る化合物としては、例えば、ラジカル発生性アゾ化合物が挙げられる。
ラジカル発生性アゾ化合物を使用する場合、重合反応性であれば、基体を作製するための重合反応において、該化合物をコモノマーの１つとしてそのまま用いることができる。このような重合反応性のラジカル発生性アゾ化合物の具体例には、例えば、２,２'-アゾビス［Ｎ-(２-プロペニル)-２-メチルプロピオンアミド］が挙げられる。
【００２７】
ラジカル発生性アゾ化合物が非重合反応性であれば、他の重合反応性モノマーと予め縮合させて重合反応に用いる。このような非重合反応性のラジカル発生性アゾ化合物の具体例には、例えば、２,２'-アゾビス(２-メチルプロピオンアミジン)、４,４'-アゾビス(４-シアノペンタン酸)が挙げられる。
【００２８】
例えば、２,２'-アゾビス(２-メチルプロピオンアミジン)は、その二塩酸塩を(メタ)アクリル酸クロリドと縮合させ、２,２'-アゾビス(Ｎ-(メタ)アクリロイルアミジノプロパン)とする。４,４'-アゾビス(４-シアノペンタン酸)は、カルボジイミド存在下で(メタ)アクリル酸と縮合させて、(メタ)アクリル酸４,４'-アゾビス(４-シアノペンタノエート)とする。
導入効率の観点から、２,２'-アゾビス［Ｎ-(２-プロペニル)-２-メチルプロピオンアミド］のような重合反応性のラジカル発生性アゾ化合物をそのままモノマーの１つとして用いることが好ましい。
【００２９】
後工程で、下記で説明する「化学結合法」によりグラフト鎖を基体に付与する場合には、コモノマーとして熱開裂性又は光開裂性の反応性官能基を含有するモノマーを使用することが好ましい。熱開裂性又は光開裂性反応性官能基としては、例えば、エポキシ基が挙げられる。
エポキシ基含有モノマーは、エポキシ基を含む重合反応性モノマーであれば限定されないが、例えば、不飽和グリシジルエステル及び不飽和グリシジルエーテルであり得る。
【００３０】
不飽和グリシジルエステルとしては、例えば、置換又は未置換のエチレン系(特にＣ2〜Ｃ4)不飽和炭化水素のグリシジルエステルであり、具体例には、(メタ)アクリル酸グリシジル、イタコン酸のモノ及びジグリシジルエステル、アリルグリシジルエステルが挙げられる。
【００３１】
不飽和グリシジルエーテルとしては、例えば、置換又は未置換のエチレン系(特にＣ2〜Ｃ4)不飽和炭化水素のグリシジルエーテルであり、具体例には、アリルグリシジルエーテル、ビニルグリシジルエーテルが挙げられる。
【００３２】
エポキシ基を有する基体は、例えば、水中に、高分子性分散安定剤、エポキシ基含有モノマー(例えば、メタクリル酸グリシジル)及び任意に他のコモノマーを分散させ、乳化重合、懸濁重合などの公知の方法により重合固化させて作製する。細胞の付着(固定化)に効果的な粒径サイズの粒子が得られる点や他の方法に比べ多量の反応性官能基を基体に導入できる点で、懸濁重合法が好ましい。
【００３３】
懸濁重合法による場合、例えば、反応液総量に対して１質量％〜５質量％のメタクリル酸グリシジル、３質量％〜１０質量％のトリアクリル酸ペンタエリスリトール及び０質量％〜１５質量％のシクロヘキサノールを含む溶液を水に分散させ、３００ｒｐｍで攪拌させながら７０℃にて３時間、次いで８０℃にて２時間反応させ、その液の温度を室温まで降下させ、蒸留水とメタノールで粒子を軽く洗浄することによって、エポキシ基を有する基体が得られる。
【００３４】
(グラフト鎖)
グラフト鎖は、エポキシ基を含む限り特定の形態に限定されない。エポキシ基は、グラフト鎖の主鎖(側鎖の有無は問わず)に存在してもよいし、側鎖に存在していてもよい。
グラフト鎖は、好ましくは、少なくともエポキシ基含有モノマー由来のモノマー単位を含む(共)重合体である。例えば、グラフト鎖は、エポキシ基含有モノマー(任意に、他のコモノマーと)の(共)重合体であり得る。グラフト鎖はまた、エポキシ基含有モノマーを含まない主鎖の重合体に、側鎖としてエポキシ基含有モノマーを重合(又は付加)させたものであり得る。
【００３５】
グラフト鎖は、好ましくは親水性官能基を更に含む。よって、グラフト鎖が(共)重合体である場合には、該(共)重合体は、好ましくは、親水性官能基含有モノマー由来のモノマー単位を含む。
グラフト鎖中のエポキシ基と親水性官能基との割合(エポキシ基：親水性官能基)は、好ましくは１０：１〜１：１０の範囲である。親水性官能基は、例えば、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基及び２-オキソピロリジニルからなる群より選択される。親水性官能基は、グラフト鎖の主鎖に存在してもよいし、側鎖に存在してもよい。
【００３６】
エポキシ基含有モノマーは、エポキシ基を含むモノマーであれば限定されないが、例えば、不飽和グリシジルエステル、不飽和グリシジルエーテル及び脂肪族ポリオールポリグリシジルエーテルであり得る。
不飽和グリシジルエステルとしては、例えば、置換又は未置換のエチレン系(特にＣ2〜Ｃ4)不飽和炭化水素のグリシジルエステルであり、具体例には、(メタ)アクリル酸グリシジル、イタコン酸のモノ及びジグリシジルエステル、アリルグリシジルエステルが挙げられる。
【００３７】
不飽和グリシジルエーテルとしては、例えば、置換又は未置換のエチレン系(特にＣ2〜Ｃ4)不飽和炭化水素のグリシジルエーテルであり、具体例には、アリルグリシジルエーテル、ビニルグリシジルエーテルが挙げられる。
脂肪族ポリオールポリグリシジルエーテルとしては、例えば、置換又は未置換の(Ｃ1〜Ｃ4)アルキレンジオールグリシジルエーテルであり、具体例には１,４-エタンジオールジグリシジルエーテル(エチレングリコールジグリシジルエーテル)、１,３-プロパンジオールジグリシジルエーテル、１,４-ブタンジオールジグリシジルエーテルが挙げられる。
【００３８】
なかでも、(メタ)アクリル酸グリシジル、アリルグリシジルエーテル及び１,４-ブタンジオールジグリシジルエーテルが好ましい。
グラフト鎖中のエポキシ基含有モノマーは、１種であっても、２種以上であってもよい。
【００３９】
ヒドロキシ基含有モノマーとしては、例えば、(メタ)アクリル酸ヒドロキシ(Ｃ1〜Ｃ4)アルキルエステル、ビニルアルコール、(Ｃ2〜Ｃ4)アルキレングリコールであり、具体例には、(メタ)アクリル酸２-ヒドロキシエチル、(メタ)アクリル酸２-ヒドロキシプロピル、(メタ)アクリル酸３-ヒドロキシプロピルが挙げられる。
カルボキシ基含有モノマーとしては、例えば、(メタ)アクリル酸、イタコン酸及びマレイン酸が挙げられる。
【００４０】
アミノ基含有モノマーとしては、例えば、(メタ)アクリルアミド又は(メタ)アクリル酸モノ又はジ(Ｃ1〜Ｃ4)アルキルアミノ(Ｃ1〜Ｃ4)アルキルであり、具体例には、(メタ)アクリル酸２-ジエチルアミノエチル、(メタ)アクリル酸メチルアミノエチル、(メタ)アクリル酸ｔ-ブチルアミノエチル、(メタ)アクリル酸ジメチルアミノエチル、(メタ)アクリル酸ジエチルアミノエチルが挙げられる。
２-オキソピロリジニル基含有モノマーとしては、Ｎ-ビニルピロリドンである。
【００４１】
細胞の付着速度の観点からは、親水性官能基としては、(メタ)アクリル酸及び(メタ)アクリル酸２-ヒドロキシエチルが好ましい。
【００４２】
その他のコモノマーとしては、例えば、(メタ)アクリル酸(Ｃ1〜Ｃ4)アルキルエステル、酢酸ビニル、ビニル(Ｃ1〜Ｃ4)アルキルエーテル、(メタ)アクリル酸アリルなどであり、具体例には、(メタ)アクリル酸メチル、(メタ)アクリル酸エチルが挙げられる。
【００４３】
グラフト鎖は、例えば１０,０００〜１００,０００の分子量を有する。
グラフト鎖は、エポキシ基を、例えば０.３×１０-3〜６.０×１０-3ｍｏｌ/ｇ基体、好ましくは０.５×１０-3〜６.０×１０-3ｍｏｌ/ｇ基体、より好ましくは０.５×１０-3〜２.０×１０-3ｍｏｌ/ｇ基体の量で基体の外表面に付与される。
【００４４】
(基体の外表面へのグラフト鎖の付与方法)
基体へのエポキシ基を有するグラフト鎖の付与方法には、グラフト重合によって基体の外表面上に直接、エポキシ基を有するグラフト鎖を形成する方法(本明細書中、「表面グラフト重合法」と呼ぶ)と、予め作製したグラフト鎖を基体の外表面に化学結合によりグラフトする方法(本明細書中、便宜上、「化学結合法」と呼ぶ)がある。後者の方法には、グラフト鎖がエポキシ基を有して予め作製される方法と、グラフト鎖がエポキシ基自体は有さずエポキシ基含有化合物と反応し得る官能基を有して予め作製され、基体の外表面へのグラフト後に該官能基にエポキシ基含有化合物を反応させる方法がある。
【００４５】
(表面グラフト重合法)
表面グラフト重合法においては、簡潔には、先ず基体の外表面に活性種(ラジカル)を発生させ、次いで該活性種を起点としてエポキシ基含有モノマー(必要に応じて、親水性官能基含有モノマー及び/又はその他のコモノマーと)を重合反応させることによって、基体の外表面にエポキシ基を含むグラフト鎖を形成する。
【００４６】
表面グラフト重合法は、公知の方法で行うことができる。
例えば、活性種(ラジカル)を発生させるためには、基体の外表面に電子線、放射線、プラズマなどを照射することができる。この方法は、材質に関して、無機材料又は有機材料からなる基体のいずれにも適用可能であり、形状に関しても、粒子状、板状又は発泡多孔質状のいずれにも適用可能である。
【００４７】
電子線又は放射線(例えばγ線)は、例えば、不活性ガス(例えば、窒素)雰囲気下で総線量が２０〜３００ｋＧｙになるように２〜５時間にわたって照射し得る。
プラズマは、例えば、酸素又は窒素雰囲気下にて１.２５×１０23〜１.８７×１０24ｅＶ／ｋｇ基体のエネルギーで５〜１５分間にわたって照射し得る。
【００４８】
活性種はまた、基体を、予め、熱開裂性又は光開裂性の重合反応開始剤が内在するように作製しておき(上記「基体の作製」の項を参照)、該開始剤を熱又は光開裂させて生じさせることもできる。
【００４９】
表面グラフト重合は、有機溶剤中にエポキシ基含有モノマー(所望により、親水性官能基及び/又はその他のコモノマー)(いずれも重合禁止剤を除去済みのもの)を希釈したモノマー溶液を、室温又は加熱下に、外表面に活性種を生じさせた基体と接触させることによって行うことができる。
エポキシ基含有モノマー、親水性官能基含有コモノマー及びその他のコモノマーには、グラフト鎖について前述したものを使用できる。親水性官能基含有コモノマー及びその他のコモノマーは、選択したエポキシ基含有モノマーと同様の条件で重合反応し得るものであれば、特に限定されず、所望により適切なものを選択すればよい。
【００５０】
(コ)モノマーを希釈する有機溶媒としては、使用する(コ)モノマーを溶解し得るものであれば特に限定されない。基体が粒子状である場合、該粒子を良好に分散し得るものを適宜選択することが望ましい。(コ)モノマーの溶解性、基体の分散性及び重合反応温度の観点から、トルエン、キシレン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどが好ましい。
【００５１】
具体的には、表面グラフト重合は、例えば、トルエン中にメタクリル酸グリシジル(及びメタクリル酸又はメタクリル酸２-ヒドロキシメチル)を含むモノマー溶液を、予め窒素ガスでバブリングすることにより酸素を追い出した後に、放射線照射などにより表面にラジカルを発生させた基体と６０℃にて８時間反応させて行うことができる。
反応終了後、室温まで放冷し、トルエン、メタノール及び蒸留水で洗浄して、エポキシ基(及び親水性官能基)を含むグラフト鎖を外表面に有する基体が得られる。
【００５２】
表面グラフト重合はまた、例えば熱開裂性開始基を内在させた基体１〜１０質量％、好ましくは２重量％〜４重量％を、１０重量％のメタクリル酸グリシジル(及びメタクリル酸又はメタクリル酸２-ヒドロキシメチル)のモノマーを希釈したトルエンなどの有機溶媒中に添加し、９０℃〜１１０℃にて２〜１２時間、好ましくは４〜８時間反応をさせて行うことができる。反応後、メタノール及び蒸留水で洗浄して、エポキシ基(及び親水性官能基)を含むグラフト鎖を外表面に有する基体が得られる。
【００５３】
(化学反応法)
化学反応法においては、簡潔には、基体に内在する熱開裂性又は光開裂性の反応性官能基(上記「基体の作製」の項を参照)を熱又は光開裂させた後、エポキシ基を含むか又は含まないグラフト鎖を反応させて、基体の外表面にグラフト鎖をグラフトする。エポキシ基を含まないグラフト鎖を用いた場合には、その後グラフト鎖にエポキシ基を付加する。
【００５４】
エポキシ基を含むグラフト鎖を使用する場合、グラフト鎖は、例えば、エポキシ基含有モノマー(必要に応じて、親水性官能基含有モノマー及び/又はその他のモノマーと)を重合反応させて作製する。
エポキシ基含有モノマー、親水性官能基含有コモノマー及びその他のコモノマーには、グラフト鎖に関して前述したものを使用できる。親水性官能基含有コモノマー及びその他のコモノマーは、選択したエポキシ基含有モノマーと同様の条件で重合反応し得るものであれば、特に限定されず、所望により適切なものを選択すればよい。
【００５５】
エポキシ基を含まないグラフト鎖を使用する場合、グラフト鎖は、エポキシ基含有化合物の付加に使用できる基(例えば、エポキシ基含有化合物と所定の条件下で反応性を有する基)を内在するように作製する。
エポキシ基含有化合物の付加に使用できる基は、例えば、カルボキシル基、イソシアナト基、アミノ基、ヒドロキシ基、チオール基である。
【００５６】
アミノ基を内在するグラフト鎖としては、例えば、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリエチレンイミン及びこれらの塩(例えば、酢酸塩)が挙げられる。
ヒドロキシ基を内在するグラフト鎖としては、例えば、ポリビニルアルコール、エチレンビニルアルコールが挙げられる。
チオール基を内在するグラフト鎖としては、例えば、チオール含有ポリビニルアルコールが挙げられる。
【００５７】
一方、エポキシ基含有化合物は、例えば、グラフト鎖について前述した脂肪族ポリオールポリグリシジルエーテル、エピハロヒドリンである。
脂肪族ポリオールポリグリシジルエーテルの好ましい例には、１,４-ブタンジオールジグリシジルエーテルが挙げられる。
エピハロヒドリンには、エピクロロヒドリンが挙げられる。
【００５８】
上記のようなエポキシ基含有化合物は、水若しくは極性溶媒(例えば、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなど)又はこれらの混合溶媒中、例えばアルカリ条件下で、グラフト鎖のアミノ基やヒドロキシ基と反応して容易にグラフト鎖に導入される。
【００５９】
なお、グラフト鎖は、末端又は側鎖に、熱又は光開裂させた反応性官能基と反応し得る基を有する。このような基には、エポキシ基、アミド基、アミノ基、カルボキシ基、イソシアナト基、チオール基が挙げられる。
【００６０】
具体的方法としては、例えば、１,４-ジオキサンと水の等重量混合液中に、反応性官能基としてエポキシ基を内在させた基体１〜５質量％とポリアリルアミン鎖(又はポリアリルアミン塩鎖(例えば酢酸塩))(例えば、分子量１５,０００) ０.１〜０.３質量％とを分散させ、２００ｒｐｍで攪拌しながら２０℃にて２４時間反応させる。基体のエポキシ基にポリアリルアミン鎖が求核的に反応して、基体の外表面にポリアリルアミン鎖がグラフトされる。
【００６１】
次いで、１,４-ジオキサン中に、ポリアリルアミン鎖がグラフトされた基体１〜１０質量％と、１,４-ブタンジオールジグリシジルエーテル ０.２〜１質量％と、水酸化ナトリウム水溶液２質量％とを入れ、２００ｒｐｍで撹拌しながら２０℃にて２４時間、次いで７０℃にて３時間反応させることにより、ポリアリルアミン鎖にアミノ基を介してエポキシ基(を含む基)を付加する。付加後、水及び１,４-ジオキサンで洗浄して、エポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有する基体が得られる。
【００６２】
(造血支持細胞)
エポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有する基体(以下、「本発明に係る培養担体」とも呼び、文脈から明らかな場合には単に「培養担体」とも呼ぶ)に付着させる造血支持細胞は、骨髄、脂肪組織、血管、臍帯のような組織に含まれる細胞のうち付着性を有する細胞(間葉系付着性細胞)及びその株化細胞である。造血支持細胞は、例えば、骨髄ストローマ細胞、骨髄線維芽細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞及びこれらの前駆細胞並びにこれら細胞由来の株化細胞から選択できる。
【００６３】
造血支持細胞は、好ましくは哺乳動物(ヒト、サル、ヒヒ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウサギ、ラット、マウスなど。特に、ヒト)由来の細胞であり得、より好ましくは共培養する造血幹細胞が由来する種と同種の動物由来の細胞であり、より好ましくは共培養する造血幹細胞が由来する個体由来の細胞である。
造血支持細胞は、１種類を単独で用いてもよいし、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
【００６４】
造血支持細胞は、動物(特にヒト)又はその組織から公知の方法によって得ることができる。例えば、骨髄ストローマ細胞は、骨髄穿刺などにより骨髄から採取した細胞群を適切な培養培地中で培養し、非付着性細胞を除去することによって得ることができる。
株化細胞としては、ヒト子宮頸部由来上皮細胞株Ｈｅｌａ、ヒト由来軟骨細胞株Ｃｈ-８、マウス頭蓋骨由来骨芽細胞株ＭＣ ３Ｔ３-Ｅ１、マウス骨髄ストローマ細胞株ＭＳ-５、ＳＴ２、ＨＥＳＳ-５、Ｍ２-１０Ｂ４などが挙げられる。
【００６５】
(培養担体への造血支持細胞の付着)
造血支持細胞を本発明に係る培養担体に付着させる方法は、特に限定されないが、例えば以下の方法により行うことができる。培養担体を含む生理学的溶液と、生理学的溶液中に造血支持細胞を懸濁させた細胞懸濁液とを細胞接着性の低い容器(例えば、疎水性外表面を有する組織培養ディッシュ)に入れて静置する。
生理学的溶液としては、生理食塩水、ハンクス平衡塩溶液、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、下記「造血幹細胞と造血支持細胞との共培養」の項で説明するような液体培養培地などが挙げられる。
【００６６】
付着の際の温度は、細胞に負担のない温度であれば特に限定されないが、例えば４０℃以下であり、好ましくは３４〜３７℃である。造血支持細胞が培養担体に付着して固定化されるに要する時間は、細胞にもよるが概して０.５〜１０時間ほどであり、通常は１〜３時間ほどである。
【００６７】
培養担体への造血支持細胞の付着に際して、細胞濃度は特に限定されない。付着しなかった細胞は、遠心分離又はピペッティングなどにより除去しても差し支えない。造血支持細胞と培養担体との混合割合は、付着(固定)効率の観点から、例えば培養担体０.２〜１０ｇに対して２×１０4〜８×１０6個/ｍｌの細胞懸濁液１０ｍｌ、好ましくは培養担体１〜３ｇに対して５×１０5〜２×１０6個/ｍｌの細胞懸濁液５ｍｌである。
【００６８】
造血幹細胞との共培養の前に、造血支持細胞が付着した培養担体を細胞培養培地に懸濁させて、培養担体上で造血支持細胞を培養してもよい。
培養培地及びその添加剤には、下記「造血幹細胞と造血支持細胞との共培養」の項で説明するような培地と同様な液体培養培地を使用できる。
【００６９】
培養は、上記のような細胞接着性の低い容器中で行う。培養温度は、２０℃〜４０℃、好ましくは２５℃〜４０℃、より好ましくは３０℃〜４０℃、より好ましくは３５℃〜４０℃より好ましくは３５℃〜３８℃である。細胞培養培地のｐＨ値は、一般に７〜９、好ましくは７.５〜８.５である。一般には、培養は、例えば炭酸ガス培養器内で、例えば約３％〜１０％のＣＯ2雰囲気下で行なう。
【００７０】
培養期間は、特に限定されないが、例えば造血細胞が培養担体の略全面を覆うまでであり、例えば１２０時間であり得る。
具体例としては、５％の炭酸ガス雰囲気下で、１０％のウシ胎仔血清を含むＤ-ＭＥＭ中で３７℃にて培養を行う。
【００７１】
(造血幹細胞)
「造血幹細胞」とは、自己再生能及び全ての系統の血液細胞への分化能(全能性)を有する細胞(未分化細胞)をいう。造血幹細胞は、特徴的には、ＣＤ３４陽性の非付着性細胞である。本発明において使用し得る造血幹細胞は、由来する組織について限定されないが、例えば骨髄血、臍帯血又は末梢血に由来し得る。
「造血幹細胞を含有する細胞集団」は、少なくとも造血幹細胞を含む限り、他の細胞を含んでいてもよいが、好ましくは造血幹細胞と造血前駆細胞や(成熟)血液細胞などの非付着性細胞とからなり、より好ましくは造血幹細胞及び造血前駆細胞からなる細胞集団である。
【００７２】
「造血前駆細胞」とは、１つ又は限定された複数(２〜３)の系統の血液細胞への分化能を有する(単能性又は寡能性(非全能性))細胞をいい、赤血球系へ方向付けられた赤芽球バースト形成細胞(ＢＦＣ-Ｅ又はＢＦＵ-Ｅ)及び赤芽球コロニー形成細胞(ＣＦＣ-Ｅ又はＣＦＵ-Ｅ)、白血球系へ方向付けられた顆粒球マクロファージコロニー形成細胞(ＣＦＣ-ＧＭ又はＣＦＵ-ＧＭ)、好酸球コロニー形成細胞(ＣＦＣ-Ｅ0又はＣＦＵ-Ｅ0)及び好塩基球コロニー形成細胞(ＣＦＣ-Ｂａｓｏ又はＣＦＵ-Ｂａｓｏ)、血小板系へ方向付けられた巨核球コロニー形成細胞(ＣＦＣ-Ｍｅｇ又はＣＦＵ-Ｍｅｇ)、限定された複数系統の血液細胞に分化し得る混合コロニー形成細胞(ＣＦＣ-Ｍｉｘ又はＣＦＵ-Ｍｉｘ)などが含まれる。
【００７３】
造血幹細胞を含有する細胞集団は、例えば、造血幹細胞を含有することが知られている組織(例えば、骨髄血、臍帯血又は末梢血)からＣＤ３４陽性細胞集団として単離し得る。ＣＤ３４陽性細胞集団は、公知の方法、例えば抗ＣＤ３４抗体を用いるアフィニティーカラムによる精製、フローサイトメーター(例えば、ＦＡＣＳ)による分取や磁気(例えば磁性ビーズ)を利用する分離などによって容易に得ることができる。
【００７４】
造血幹細胞又は造血幹細胞を含有する細胞集団は、由来する動物について限定されないが、好ましくは哺乳動物(ヒト、ネコ、イヌなど。特に、ヒト)由来の細胞又は細胞集団であり、より好ましくは共培養する造血支持細胞が由来する種と同種の動物由来の細胞又は細胞集団であり、より好ましくは共培養する造血支持細胞が由来する個体由来の細胞又は細胞集団である。
【００７５】
(造血幹細胞と造血支持細胞との共培養)
培養培地には、任意の液体培養培地、好ましくは哺乳動物細胞用培地を使用できる。細胞培養培地としては、例えば、イーグル培地のような最小必須培地(ＭＥＭ)、ダルベッコ改変イーグル培地(Ｄ-ＭＥＭ）、α-ＭＥＭ、ハムＦ-１２及びＦ-１０培地、Ｄ-ＭＥＭ/Ｆ-１２培地、ウィリアムＥ培地、ＲＰＭＩ培地(例えばＲＰＭＩ-１６４０)、ＭＣＤＢ培地、１９９培地、１９９/Ｆ-１２培地、フィッシャー培地、イスコフ改変ダルベッコ培地(Ｉ-ＭＤＭ)、マッコイ５Ａ及び７Ａ培地、Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ培地(メチルセルロース培地)が挙げられる。
【００７６】
これらの培地は必要に応じて適切に改変してもよい。例えば、ビタミン(例えば、アスコルビン酸、トコフェロール)、アミノ酸(例えば、グルタミン、アルギニン)、血清、抗生物質又は抗真菌剤(例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシン、ゲンタマイシン)、種々の成長因子/増殖因子(例えば、インスリン)、グルコース、トランスフェリン、セレン酸(例えば亜セレン酸ナトリウム)などの添加剤を培地に添加することができる。
生物由来の添加剤(例えば、血清)は、造血幹細胞及び/又は造血支持細胞と同種又は同一個体に由来する血清であることが好ましいが、他の種の動物由来(例えば、ウシ胎仔血清、ウシ血清、ウマ血清)であってもよい。
【００７７】
共培養は、付着性/非付着性を問わず、任意の培養容器(例えば、ディッシュ、ウェル、シャーレ、ボトル、フラスコなど)中で行う。
培養担体が粒子である場合、該粒子は培養容器中で三次元集積体を形成していることが好ましい。ここで、「三次元集積体」とは、形状を問わず、複数の粒子が三次元的に集積して構成される構造体をいう。
【００７８】
培養温度は、２０℃〜４０℃、好ましくは２５℃〜４０℃、より好ましくは３０℃〜４０℃、より好ましくは３５℃〜４０℃、より好ましくは３５℃〜３８℃である。細胞培養培地のｐＨ値は、一般に７〜９、好ましくは７.５〜８.５である。一般には、培養は、例えば炭酸ガス培養器内で、例えば約３％〜１０％のＣＯ2雰囲気下で行なう。
【００７９】
共培養の期間は、特に限定されないが、例えば１週間以上、２週間以上、３週間以上、４週間以上、５週間以上、６週間以上、７週間以上、８週間以上であり、具体的には、例えば、１週間〜１２週間、１週間〜１０週間、１週間〜８週間、１週間〜７週間、１週間〜６週間、１週間〜５週間、１週間〜４週間、１週間〜３週間、１週間〜２週間、２週間〜１２週間、２週間〜１０週間、２週間〜８週間、２週間〜７週間、２週間〜６週間、２週間〜５週間、２週間〜４週間、２週間〜３週間、３週間〜１２週間、３週間〜１０週間、３週間〜８週間、３週間〜７週間、３週間〜６週間、３週間〜５週間、３週間〜４週間、４週間〜１２週間、４週間〜１０週間、４週間〜８週間、４週間〜７週間、４週間〜６週間、４週間〜５週間であり得る。培養期間中、培養培地は、定期的に(例えば、１週間ごとに)交換することが好ましい。
【００８０】
共培養開始時の造血幹細胞と造血支持細胞の割合は、特に限定されないが、例えば１０：１〜１：１０であり、好ましくは２：１〜１：１０であり、より好ましくは２：１〜１：２である。
【００８１】
(造血幹細胞、造血前駆細胞、血液細胞の回収)
共培養物から、公知の方法を用いて、造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞を回収することができる。回収法には、密度勾配遠心法(例えば、フィコール法)、血液凝集法、パンニング法、(例えば、アフィニティーカラムやＦＡＣＳのようなセルソーティングにおいて)適切な表面マーカー(例えば、ＣＤ３４、ｌｉｎ)又はその組合せについてポジティブ及び/又はネガティブ選択を行う方法などが挙げられる。
【実施例】
【００８２】
以下に、実施例等を用いて本発明を具体的に説明するが、下記の実施例等は本発明のより詳細な理解に資するために提供されるのであって、本発明の範囲を限定することを意図して提供されるものではない。
【００８３】
１．培養担体の製造
培養担体の製造には、１０００ｍｌ容のガラス製セパラブルフラスコに三口セパラブルフラスコカバーを取り付けたものを反応容器として使用した。反応液の撹拌は、テフロン（登録商標）製攪拌翼が先端に取り付けられた攪拌棒を攪拌モーター(スリーワンモーター、新東科学製)により回転させて行った。反応容器は、温度コントローラー(ＮＴＴ-１０００、東京理化)により温度制御された恒温水槽内に設置した。反応の間のモノマーや溶媒の蒸発を防ぐために、長さ３０ｃｍのジムロート式又はアリン式冷却管をフラスコに取り付け、１６℃の冷却水を流した。
【００８４】
１.１．培養担体１〜１５の製造
(基体の製造)
反応液が入っていない上記三口フラスコを恒温水槽に設置し、予め攪拌翼を３００ｒｐｍで回転させた。
反応容器に、メタクリル酸メチル(ＭＭＡ；和光純薬工業)を３８ｇ、トリアクリル酸ペンタエリスリトール(ＰＥＴＡ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、米国)を３８ｇ、２,２'-アゾビス［Ｎ-(２-プロペニル)-２-メチルプロピオンアミド］(ＡＰＭＰＡ；和光純薬工業)を０.７５〜１１.４ｇ(下記表１を参照)、アゾビスイソブチロニトリル(ＡＩＢＮ；和光純薬工業)を２ｇ、ポリビニルピロリドン(ＰＶＰ；Ｋ-９０、ナカライテスク)を５.６４ｇ、蒸留水を５９０ｇ入れ、７０℃にて２時間、次いで８０℃にて２時間反応させた。反応液が室温になるまで放置して、アゾ基を含む粒子状の基体(樹脂粒子)を７０ｇ得た。
【００８５】
(表面グラフト重合)
反応液が入っていない上記三口フラスコを恒温水槽に設置し、予め攪拌翼を１５０ｒｐｍで回転させた。
反応容器に、樹脂粒子を１０ｇ、メタクリル酸グリシジル(ＧＭＡ；和光純薬工業)を０〜２５ｇ(表１を参照)、コモノマーを０〜２５ｇ(表１を参照)、トルエン(ナカライテスク)を２５０ｇ入れ、１００℃にて８時間反応させた。ただし、培養担体１１及び１２の製造時には、反応時間をそれぞれ４時間及び２時間とした。
【００８６】
コモノマーとして、培養担体１〜１２を製造する際にはメタクリル酸２-ヒドロキシエチル(ＨＭＡ)を用い、培養担体１３〜１５を製造する際にはメタクリル酸(ＭＡ)を用いた。
反応終了後、反応液が室温になるまで放置した後、メタノールと蒸留水及び生理食塩水にて洗浄して、グラフト鎖を外表面に有する樹脂粒子(培養担体１〜１５)を２０〜１００ｇを得た(表１)。
【００８７】
なお、得られた培養担体１は、グラフト鎖にエポキシ基を含むが親水性官能基は含まない。
また、得られた培養担体２〜６、８〜１２は、グラフト鎖にエポキシ基及びヒドロキシ基を含む。
また、培養担体１３〜１５は、グラフト鎖にエポキシ基及びカルボキシル基を含む。
また、得られた培養担体７は、グラフト鎖にエポキシ基を含まない。
【００８８】
更に、培養担体９、１０、１４、１５については、樹脂粒子中に含まれるアゾ基の量が異なるため、外表面に有するグラフト鎖の本数が他の培養担体とは異なる。
また、培養担体１１及び１２については、表面グラフト重合の反応時間が短いため、グラフト鎖の鎖長が他の培養担体と比べて短い。
【００８９】
１.２．培養担体１６の製造
上記１０００ｍｌ容三口フラスコに、ＧＭＡを３８ｇ、ＰＥＴＡを３８ｇ、ＡＩＢＮを２ｇ、ＰＶＰを５.６４ｇ、水を５９０ｇ入れ、３００ｒｐｍで攪拌させながら７０℃にて３時間、次いで８０℃にて２時間反応させた。反応液を室温まで降温させ、蒸留水とメタノールで軽く洗浄して、エポキシ基を有する基体(樹脂粒子)を得た。
この樹脂粒子をこのまま(グラフト鎖を付与せずに)培養担体１６とした。
【００９０】
１.３．培養担体１７の製造
窒素雰囲気下で、ポリスチレン製ディシュに入れたポリプロピレン(ＰＰ)板(１ｃｍ×５ｃｍ)にガンマ線を１５０ｋＧｙ(２５ｋＧｙ/ｈ×６ｈｒ)照射してＰＰ外表面にラジカルを発生させた。次に、上記三口フラスコに、ＰＰ板(０.４ｇ)、ＧＭＡを２０ｇ、ＭＡを５ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム(和光純薬工業)を８ｇ、蒸留水を４００ｇ入れ、窒素ガスを用いてバブリングしながら６０℃にて８時間反応させた。反応後、反応液が室温になるまで放置した後、メタノールと蒸留水及び生理食塩水にて洗浄して、エポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有するＰＰ板(培養担体１７)を得た。
【００９１】
１.４．培養担体１８及び１９の製造
(基体の製造)
上記１０００ｍｌ容三口フラスコに、ＧＭＡを２０ｇ、ＰＥＴＡを５０ｇ、ＰＶＰを５ｇ、水を５００ｇ入れ、３００ｒｐｍで攪拌させながら７０℃にて３時間、次いで８０℃にて２時間反応させた。反応液を室温にまで降温させ、蒸留水とメタノールで軽く洗浄して、エポキシ基が内在する基体(樹脂粒子)を得た。
なお、得られた樹脂粒子をこのままで培養担体１８とした。
【００９２】
次いで、１５ｇの上記樹脂粒子及び１ｇのポリアリルアミン(ＰＡＡ)酢酸塩(分子量１５,０００)を、１,４-ジオキサンと水の等重量混合液に分散させ、２００ｒｐｍで攪拌させながら２０℃にて２４時間反応させた。蒸留水と１,４-ジオキサンで軽く洗浄して、ＰＡＡがグラフトされた樹脂粒子を得た。
【００９３】
ＰＡＡがグラフトされた樹脂粒子を６ｇ、１,４-ブタンジオールジグリシジルエーテルを０.８４ｇ、０.５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を２ｇ、１００ｇの１,４-ジオキサン中に入れ、２００ｒｐｍで撹拌しながら２０℃にて２４時間、次いで７０℃にて３時間反応させた。粒子を水及び１,４-ジオキサンで洗浄することにより、エポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有する樹脂粒子(培養担体１９)を得た。
【００９４】
製造した培養担体を表１にまとめる。
【表１】
【００９５】
培養担体１〜７は、密度が約１.１９×１０3ｋｇ・ｍ-3で、粒径分布があり、おおよそ２００〜４００μｍの粒径を有していた。また、粒径及びその分布はレーザー回折散乱法にて測定した。
測定データを表２に示す。
【表２】
【００９６】
また、培養担体１〜７について、グラフト鎖中のエポキシ基量を塩酸ジオキサン法により定量した。
簡潔には、共栓付き１００ｍｌ容三角フラスコに、乾燥重量で０.４ｍｇの培養担体と２５ｍｌの塩酸-ジオキサン溶液(濃塩酸１.６ｍｌに対して１,４-ジオキサン１００ｍｌ)を入れ、恒温振盪水槽を用いて振幅２ｃｍ、１２５回/分の速さで振盪させながら、６０℃にて１時間反応させた。反応後、反応液を室温まで降温させ、２５ｍｌ中性エタノール溶液(エタノール１００ｍｌ中クレゾールレッド指示薬１ｍｌ)を加えた。０.０５Ｎメタノール性水酸化ナトリウム溶液により残存する塩酸の定量を行った。ブランク実験を行い、補正した塩酸消費量から培養担体のグラフト鎖中のエポキシ基量を算出した。
【００９７】
結果を表３に示す。
【表３】
表より、表面グラフト重合時のモノマー組成に応じて培養担体のグラフト鎖中のエポキシ基量が変化していることが解る。
【００９８】
２．培養担体への造血支持細胞の付着に対するエポキシ基を含むグラフト鎖の効果(１)
２.１．
培養担体３［ｐ(ＭＭＡ-ＡＰ３)-ｇ-ｐ(ＨＭＡ/ＧＭＡ)３］２.０ｇを含む生理食塩水５ｍｌと、生理食塩水中に造血支持細胞としてヒト上皮細胞由来細胞株(Ｈｅｌａ細胞)、マウス骨髄由来線維芽細胞株(ＭＳ-５細胞)、マウス頭蓋骨由来骨芽細胞株(ＭＣ ３Ｔ３-Ｅ１細胞)又はヒト由来軟骨細胞(Ｃｈ-８細胞)２.０×１０4個を懸濁させた細胞懸濁液を組織培養ディッシュに入れて３７℃にて１２０時間静置して、培養担体３に各造血支持細胞を付着させた。
【００９９】
次いで、各造血支持細胞が付着した培養担体を、１０％のウシ胎仔血清を含むＤ-ＭＥＭ中、５％の炭酸ガス雰囲気下で３７℃にて培養した。
５日間の培養後の培養担体と造血支持細胞の様子を図１に示す。
図より、培養担体３(本発明に係る培養担体)には、用いた何れの造血支持細胞も良好に付着(固定化)し、担体間隙に細胞からなるバイオフィルムが形成されることが明らかとなった。細胞数が添加量から増加しており、本発明に係る培養担体上で造血支持細胞が増殖すると理解できた。
【０１００】
Ｃｈ-８細胞(軟骨細胞)については、培養１４日目のサンプルを採取し、ヘマトキシリン-エオシン(Ｈ-Ｅ)染色を行った。担体間の空隙にエオシン染色された細胞質とヘマトキシリン染色された核が均等に分布していることから、粒子間隙にバイオフィルムが形成されていることが明らかとなった。このことから、軟骨細胞が培養担体上に三次元的に付着し、増殖していると理解された。
【０１０１】
２.２．
培養担体１６［ｐ(ＰＥＴＡ-ＧＭＡ１)］を含む生理食塩水２.０ｇを含む生理食塩水５ｍｌと、生理食塩水中にＭＳ-５細胞を懸濁させた細胞懸濁液組織培養ディッシュに入れて３７℃にて１２０時間静置して、培養担体１６に造血支持細胞を付着させた。
次いで、造血支持細胞が付着した培養担体を、１０％のウシ胎仔血清を含むＤ-ＭＥＭ中、５％の炭酸ガス雰囲気下で３７℃にて培養した。
【０１０２】
５日間の培養後の培養担体とＭＳ-５細胞の様子を図２に示す。
図より、樹脂粒子自体にエポキシ基を含むがエポキシ基を含むグラフト鎖を有さない培養担体１６には、ＭＳ-５細胞の付着(固定化)・増殖が全く見られなかった。
【０１０３】
２.３．
細胞を含む培地懸濁液と培養担体とを接触後、その時間を０分としてからの培地中の細胞数をビルゲルチュルク式血球計算盤により測定することにより、培養担体１〜７［ｐ(ＭＭＡ-ＡＰ３)-ｇ-ｐ(ＨＭＡ/ＧＭＡ)１〜７］へのＭＳ-５細胞の付着(固定化)速度を測定した。
結果を図３に示す。
【０１０４】
図より、培養担体１〜４には細胞が速やかに付着することから、培養担体に導入したグラフト鎖に含まれるエポキシ基及びヒドロキシ基が細胞の付着に有効であるのではないかと考えられるが、グラフト鎖にヒドロキシ基を含みエポキシ基を含まない培養担体７へは細胞付着が全く確認できなかった一方で、グラフト鎖にエポキシ基を含みヒドロキシ基を含まない培養担体１へは細胞付着が確認できたことから、グラフト鎖に存在するエポキシ基が造血支持細胞の付着に有効であるとことが理解できる。
【０１０５】
ただし、培養担体５及び６についての結果より、グラフト鎖がエポキシ基を含んでいても０.５×１０-3ｍｏｌ/ｇ-基体以上でないと、測定時間内(９０分以内)に細胞が付着しないことも明らかとなった。
また、培養担体１〜４についての結果より、グラフト鎖がエポキシ基に加えてヒドロキシ基を含むことにより、造血支持細胞の付着性(付着速度)が更に向上することも理解できる。
【０１０６】
３．造血支持細胞の付着に対するグラフト鎖の数及び密度の影響
培養担体８〜１０［ｐ(ＭＭＡ-ＡＰ１〜３)-ｇ-ｐ(ＨＭＡ/ＧＭＡ)３］に存在するグラフト鎖の本数は、ＡＰＭＰＡの添加量と開始剤効率からそれぞれ２.１４×１０18、４.０３×１０18、８.０７×１０18本/ｇ-基体であると推定された。
また、グラフト鎖中のエポキシ基量を塩酸ジオキサン法により定量したところ、それぞれ０.３４３、０.５２４及び１.６３×１０-3ｍｏｌ/ｇ-基体となった。
【０１０７】
これら培養担体へのＭＳ-５細胞の付着速度を上記と同様にして測定した。結果を図４に示す。
図より、グラフト鎖の本数よりもむしろ絶対的なエポキシ基量が細胞の付着に影響を及ぼしていることが解る。
【０１０８】
４．造血支持細胞の付着に対するグラフト鎖の鎖長の影響
培養担体３と培養担体１１及び１２［ｐ(ＭＭＡ-ＡＰ３)-ｇ-ｐ(ＨＭＡ/ＧＭＡ)３/４及びｐ(ＭＭＡ-ＡＰ３)-ｇ-ｐ(ＨＭＡ/ＧＭＡ)３/２］のエポキシ基量を塩酸ジオキサン法により定量することによって、グラフト鎖の平均重合度はそれぞれ４１１、２０２、１００となった。
これら培養担体へのＭＳ-５細胞の付着速度を上記と同様にして測定した。結果を図５に示す。
【０１０９】
図より、培養担体３への付着速度が最も速く、培養担体１２には細胞付着は測定時間内に観察できなかった。培養担体３への付着速度は、培養担体１１への付着速度より速い。これらの結果は、グラフト鎖が長いと細胞が付着可能な部位が多くなることを反映していると考えられる。
【０１１０】
５．造血支持細胞の付着に対するグラフト鎖の親水性官能基の影響
培養担体３及び培養担体１３［ｐ(ＭＭＡ-ＡＰ３)-ｇ-ｐ(ＭＡ/ＧＭＡ)３］のエポキシ基量を塩酸ジオキサン法により定量したところ１.０３及び２.０４×１０-3ｍｏｌ/ｇとなった。
培養担体３と培養担体１３へのＭＳ-５細胞の付着速度を上記と同様にして測定した。結果を図６に示す。
【０１１１】
図より、培養担体３への付着速度と培養担体１３への付着速度は大きく変化しなかった。これらの結果は、グラフト鎖中の親水性官能基が細胞の付着速度に大きく影響しないと考えられる。
【０１１２】
６．造血支持細胞の付着に対する粒径の影響
培養担体３を篩にかけ、粒径に従って、５−５８μｍ画分、５８−１０８μｍ画分、１０８−１９０μｍ画分、２１０−４２０μｍ画分、及び５９０−８４０μｍ画分に分けた。
次に、各画分についてＭＳ-５細胞の付着速度を上記と同様にして測定した。結果を図７に示す。
【０１１３】
図より、粒径５〜５８μｍの画分では測定時間内に細胞付着は始まらず、粒径５８〜１０８μｍの画分及び粒径１０８〜１９０μｍの画分の細胞付着速度は、篩い分けをしていない培養担体３に比べて遅かった。しかしながら、粒径５９０〜８４０μｍの画分の細胞付着速度は、培養担体３に比べて速くなった。
【０１１４】
粒径が細胞の付着に影響する要因として、粒子が持つ曲率が考えられる。細胞は担体外表面に沿って付着するため、曲率が大きくなると(すなわち粒径が小さくなると)、平面の培養担体に付着する場合と比べて、細胞が担体に付着するのに時間がかかり、ある曲率以上の粒子には細胞は付着できないのではないかと推測される。
また、粒子は球形であり、比重も１.１９×１０3ｋｇ・ｍ-3と培地の密度と大きく変わらず、僅かな衝撃でも培地中で移動してしまう。そのため、粒子の移動が細胞に応力を与え、細胞にストレスがかかると推測される。
以上の結果から考えて、粒子径は細胞の付着に影響を与えることが推定される。
【０１１５】
７．培養担体に付着した細胞の増殖に対するグラフト鎖の密度の影響
表４に示す培養担体にＭＳ-５を付着(固定化)させ、１０％のウシ胎仔血清を含むＤ-ＭＥＭ中、５％の炭酸ガス雰囲気下で３７℃にて培養した。５日間の培養後、培養担体の単位表面積当たりに付着(固定化)している細胞数を培養担体から剥離した細胞をビルゲルチュルク式血球計算盤を用いて計数した。結果を表４に示す。
【表４】
【０１１６】
表より、グラフト鎖の密度が低い(すなわちエポキシ基の導入量が少ない)と付着(固定化)速度が遅くなり、培養担体上での細胞増殖が制限されることが解る。
培養担体上での細胞の増殖に限って言えば、担体の粒径が大きな影響を及ぼしていることが解る。
【０１１７】
８．グラフト鎖に含まれるヒドロキシ基のカルボキシル基での置換の影響
培養担体１３〜１５［ｐ(ＭＭＡ-ＡＰ３〜５)-ｇ-ｐ(ＭＡ/ＧＭＡ)３］へのＭＳ-５細胞の付着速度を上記と同様にして測定した。また、これら培養担体について、グラフト鎖中のエポキシ基量を塩酸ジオキサン法により定量した。結果を表５に示す。
【表５】
【０１１８】
表より、コモノマーをＨＭＡに代えてＭＡを用いることにより、グラフト鎖に含まれるヒドロキシ基をカルボキシル基に置換しても、造血支持細胞の付着に関して略同等の効果が得られることが明らかとなった。
また、ＡＰＭＰＡをＨＭＡの場合よりも多く用いてアゾ基を含む樹脂粒子を作製すると、ＨＭＡの場合よりも多くのエポキシ基を含むグラフト鎖を作製することができたものの、培養５日目の細胞数はほとんど変わらなかった。
【０１１９】
９．培養担体への造血支持細胞の付着に対するエポキシ基を含むグラフト鎖の効果(２)
培養担体１７［ＰＰ-ｇ-ｐ(ＭＡ/ＧＭＡ)］又は未処理ＰＰ板と、生理食塩水中にＨｅｌａ細胞を懸濁させた細胞懸濁液(１〜１０×１０4個)を疎水性外表面を有する組織培養ディッシュに入れて３７℃にて１２０時間静置して、培養担体又は未処理ＰＰ板に造血支持細胞を付着させた。
次いで、造血支持細胞が付着した培養担体又は未処理ＰＰ板を、１０％のウシ胎仔血清を含むＤ-ＭＥＭ中、５％の炭酸ガス雰囲気下で３７℃にて培養した。
【０１２０】
３日間の培養後の培養担体とＨｅｌａ細胞の様子を図８に示す。
図より、未処理ＰＰ板では、Ｈｅｌａ細胞が付着(固定化)して伸長している様子は見えないのに対して、培養担体１７(本発明に係る培養担体)にはＨｅｌａ細胞が付着(固定化)し伸長していることが明らかとなった。
【０１２１】
１０．培養担体への造血支持細胞の付着に対するエポキシ基を含むグラフト鎖の効果(３)
培養担体１８［ｐ(ＰＥＴＡ-ＧＭＡ０)］又は培養担体１９［ｐ(ＰＥＴＡ-ＧＭＡ０)-ｇ-ｐ(ＰＡＡ-ｅｐｏｘｙ)］０.２４ｇを含む生理食塩水５ｍｌと、生理食塩水中にＭＳ-５細胞を懸濁させた細胞懸濁液（１〜１０×１０4個）を疎水性外表面を有する組織培養ディッシュに入れて３７℃にて１２０時間静置して、上記両培養担体に造血支持細胞を付着させた。
次いで、造血支持細胞が付着した両培養担体を、１０％のウシ胎仔血清を含むＤ-ＭＥＭ中、５％の炭酸ガス雰囲気下で３７℃にて培養した。
【０１２２】
５日間の培養後の培養担体とＭＳ-５細胞の様子を図９に示す。
図より、培養担体１８には、ＭＳ-５細胞の付着(固定化)・増殖が全く見られないのに対して、本発明に係る培養担体１０にはそれを取り囲むようにＭＳ-５細胞が付着(固定化)・増殖し、培養担体間隙にもバイオフィルムが形成されていることが解る。
【０１２３】
１１．培養担体に付着させた造血支持細胞と造血幹細胞との共培養(実施例)
培養担体３［ｐ(ＭＭＡ-ＡＰ３)-ｇ-ｐ(ＨＭＡ/ＧＭＡ)３］及び培養担体１９［ｐ(ＰＥＴＡ-ＧＭＡ０)-ｇ-ｐ(ＰＡＡ-ｅｐｏｘｙ)］にＭＳ-５細胞を付着(固定化)させた。
先ず、５０ｍｌ容のポリプロピレンチューブ内で、５００ｍｇの培養担体３又は１９を５ｍｌのＤ-ＭＥＭ中に懸濁させた。
【０１２４】
１００ｍｍの組織培養用ディッシュにおいて付着培養したＭＳ-５細胞を、トリプシン-ＥＤＴＡ(０.５ｗｔ％トリプシン、５.３ｍＭ ＥＤＴＡ・４Ｎａ)(×１０)(インビトロジェン、米国)を用いてディッシュから剥離させ、生理食塩水で洗浄後、Ｄ-ＭＥＭ中に細胞数５×１０5個/ｍｌの濃度になるように懸濁させた。
この細胞懸濁液５ｍｌを、予め培養担体を懸濁しておいた５０ｍｌ容のポリプロピレンチューブに添加した。そのまま、３７℃にて２４時間放置した後、培養担体と細胞の混合懸濁液を６０ｍｍの組織培養用ディシュに移して、更に培養を５日間続けた。
【０１２５】
抗ＣＤ３４抗体が結合したフェライト粒子からなるイムノビーズ(ＤＹＮＡＬ ＣＤ３４ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、ＤＹＮＡＬ ＢＩＯＴＥＣＨ、ノルウェー)を用いて、ヒト正常人由来の臍帯血を処理し、ＣＤ３４陽性の造血幹細胞を得た。採取後、１０％ウシ胎仔血清を含むＤ-ＭＥＭ中で細胞数５×１０3個/ｍｌの細胞懸濁液４ｍｌを、培養担体に付着したＭＳ-５細胞を含む上記ディシュに添加した。７日ごとに培地交換を繰り返しながら、ＣＯ2インキュベータ内で３７℃にて、造血幹細胞を培養担体に付着したＭＳ-５細胞との三次元共培養に付した。
【０１２６】
培地を交換する際に、細胞の生死をトリパンブルー溶液により確認し、遊離した細胞は、血球計算板を用いて細胞濃度を調べるとともに、サイトスピン標本を作製し、メイ・グリュンワルド・ギムザ染色後に光学顕微鏡で観察し、血球の種類を同定した。
【０１２７】
(ＣＦＵ-Ｍｉｘ、ＢＦＵ-Ｅ、ＣＦＵ-ＧＭの同定方法)
培地交換時に培養用ディッシュより回収した細胞は、造血幹細胞コロニーアッセイ用メディウム(ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ Ｈ４０３４、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、カナダ)と共に３０ｍｍ培養用ディッシュに播き、３７℃インキュベーター内で１４日間培養後、形成されたコロニーを倒立顕微鏡下に観察して、未熟造血細胞としてＣＦＵ-Ｍｉｘ、ＢＦＵ-Ｅ、ＣＦＵ-ＧＭの同定を行った。
【０１２８】
(共培養コロニーから遊離する血球)
造血幹細胞は、培養開始後数日で培養担体に付着したＭＳ-５細胞層に潜り込むようにしながら増殖及び分化し、造血巣を形成した(図１０左)。Ｈ-Ｅ染色より、培養担体の周りに付着・増殖した約１０〜２０μｍの比較的大きなＭＳ-５細胞に、５〜１０μｍの小さな血球細胞が潜り込むようにしながら増殖及び分化している様子が解る(図１０右)。
【０１２９】
次に、培地交換の際に造血巣から遊離してくる血球の数を経時的に調べた。結果を図１１に示す。図中、「Ｇ-０２ｂｅａｄｓ」は培養担体３を示し、「Ｍ-０２ｂｅａｄｓ」は培養担体１９を示す(図１２、１３及び１５中も同様)。
図より、造血幹細胞を単独又は培養担体のみとの共存下で培養した場合(図中、「ＣＤ３４ ａｌｏｎｅ」及び「Ｍ-０２ｂｅａｄｓ＋ＣＤ３４」)、４〜６週間で造血巣から遊離してくる血球が観察されなくなった。これは、造血幹細胞が成熟血球に分化してしまい、全て死滅してしまった結果と考えられた。
【０１３０】
また、造血幹細胞を組織培養ディッシュに直接付着させたＭＳ−５細胞との共存下で培養した場合、成熟血球の産生は約８週間で見られなくなった。これは、やはり造血幹細胞が成熟血球まで分化してしまい、８週後までには全て死滅してしまった結果と考えられた。
【０１３１】
一方、本発明に係る培養担体に付着させたＭＳ-５細胞との共存下で造血幹細胞を培養した場合(図中、「Ｍ-０２ｂｅａｄｓ＋ＭＳ-５＋ＣＤ３４」及び「Ｇ-０２ｂｅａｄｓ＋ＭＳ-５＋ＣＤ３４」)、成熟血球の産生は、８週間以上維持されることが明らかになった。成熟血球の産生は、８週間の培養時点でさえ当初の７〜８割のレベルに維持された。播種した造血幹細胞が成熟血球に分化するだけでは、絶対的な細胞数の物質収支を説明できない。すなわち、造血幹細胞は、本発明に係る培養担体に付着させたＭＳ-５細胞との共培養物中で、成熟血球の産生と併せて自己再生(自己増殖)を繰り返しているものと考えられる。
【０１３２】
本発明に係る培養担体(培養担体３に付着させたＭＳ-５細胞との共存下で造血幹細胞を培養した場合(図中、「Ｇ-０２ｂｅａｄｓ＋ＭＳ-５＋ＣＤ３４」)、培地交換時に回収された細胞中に存在する造血前駆細胞ＣＦＵ-Ｍｉｘ、ＢＦＵ-Ｅ及びＣＦＵ-ＧＭコロニーの形成細胞数の変動を図１２に示す。本発明に係る培養担体に付着させたＭＳ-５細胞と共培養することにより、造血前駆細胞が長期間(１２週間以上)維持されていることが確認できる。
【０１３３】
(培養液中の細胞染色)
次に、培地交換時に、培養液中に造血巣から遊離して回収された細胞をメイ・グリュンワルド・ギムザ染色し、その形態を観察した。染色写真を図１３に示す。
図より、造血幹細胞が単独で培養された場合(図中、「ＣＤ３４ ａｌｏｎｅ」)、４週目に残存する細胞のほとんどが分化したマクロファージであったのに対し、造血幹細胞が本発明に係る培養担体に付着した骨髄ストローマ細胞と三次元共培養される場合(図中、「Ｍ-０２ｂｅａｄｓ」及び「Ｇ-０２ｂｅａｄｓ」)には、７週目でも培養物中に未分化細胞から分化細胞(成熟血液細胞)まで観察できた。すなわち、造血幹細胞の自己再生(自己増殖)及び血液細胞への分化が、骨髄と同様に、体外で人工的に再現された。
【０１３４】
(細胞染色)
培養中のＭＳ-５細胞及び造血幹細胞の発育の様子を示す。
図１４に、培養担体に付着し、増殖して三次元的に発育しているＭＳ-５細胞のＨ-Ｅ染色写真、アルシアン・ブルー染色写真を示す。ＭＳ-５細胞は、培養担体間にネット状構造物を形成しながら発育している。
図１５に、走査型電子顕微鏡による観察写真を示す。培養担体に付着して三次元的構造を形成しながら発育するＭＳ-５細胞と、隙間に潜り込むようにしながら増殖している造血細胞が観察できる。
【０１３５】
上記の具体的な培養担体の製造例及び実施例は、本発明の理解を容易にするために例示として記載されたものであって、本発明は本明細書又は添付図面に記載された具体的な構成のみに限定されるものではない。本明細書に記載した具体的構成、手段、方法及び装置は、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、当該分野において公知の他の多くのものと置換可能である。
【産業上の利用可能性】
【０１３６】
本発明に係る培養担体に付着(固定化)した造血支持細胞と造血幹細胞との三次元的な共培養系は、骨髄移植に有用な造血幹細胞の増殖・分化のシステムや成分輸血等に有用な血球提供システム等を提供することができ、再生医療や創薬などの産業上の幅広い分野への利用が可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、造血幹細胞の培養方法に関する。より詳細には、本発明は、造血幹細胞と特定の培養担体に付着した血液支持細胞とを共培養する、造血幹細胞の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療は、機能不全に陥った組織や器官を正常に機能するものに代替えしたりすることができ、先天的に欠損したか又は疾患や事故によって後天的に失われた組織や器官を再生できる技術として非常に注目を浴びている。
再生医療には、未分化細胞の調達が一番の重要課題ではあるが、細胞を再生医療に用いるためには、生体外で、組織を構成する種々の細胞を個々増殖させ、異種の細胞塊を互いに接着させ、三次元的に生体内と同様の組織を組み上げる技術の確立が必要となる。
【０００３】
しかし、生体内で細胞は三次元的に密接に関わっているにも拘らず、従来の生体外培養法としては、プレートを用いた平面培養法やスピナーを用いた懸濁培養法などが挙げられ、三次元的な細胞の集密培養に関する研究は一部しか行われていない。
また、二種類以上の増殖速度の異なる細胞を従来の方法による同時に培養しても、増殖速度の速い細胞が急速に数を増やし、増殖速度の遅い細胞は淘汰されてしまうため、共培養は困難である。
【０００４】
三次元的な細胞培養法に関して、安田らは、高分子微粒子を細胞の支持担体として用いる付着性細胞の新規三次元培養法を開発している。この培養法では、重合反応性開始剤である２,２'-アゾビス[Ｎ-(２-プロペニル)-２-メチルプロピオンアミド]を用いて懸濁共重合により合成した高分子微粒子に、該微粒子中のアゾ基を開始剤としてエポキシ基及びカルボキシル基を含むグラフト鎖をグラフト重合したものを支持担体として使用して、付着性細胞の固定化と、担体上での細胞増殖が確認されている(例えば、非特許文献１、非特許文献２を参照)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−６１５６９号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】國枝弘史、川又崇弘、安田昌弘、相澤 信、関 実、「高分子担体を用いた付着性細胞の支持培養」化学工学会第72回年会講演要旨I303(2007)
【非特許文献２】國枝弘史、安田昌弘、関 実、相澤 信、「高分子担体を用いた細胞間相互作用の定量的評価」化学工学会第39回秋季大会講演要旨P088(2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記文献に記載の技術は成熟(分化)細胞の単培養に関するものであり、幹細胞のような未分化細胞についての検討はなされていない。
自己再生能(自己複製能)及び多分化能を有する幹細胞(例えば、造血幹細胞)は、培養により自己再生能及び多分化能を消失してしまい、両能力を維持したままで培養することは、通常困難である。
【０００８】
幹細胞を未分化状態で自己再生させる培養技術は知られているが、この技術によれば、幹細胞の成熟細胞への分化に際しては分化誘導培地で培養するなどの分化誘導技術を別途に適用する必要があった(例えば、特許文献１)。
本発明は、造血幹細胞について、自己複製を繰り返しつつ、血液細胞への分化を継続的に維持させることを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意検討の結果、エポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有する基体に固定化した造血支持細胞の存在下で造血幹細胞を培養することによって、造血幹細胞の自己再生能及び分化能が同時に維持されることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、造血幹細胞又は造血幹細胞を含有する細胞集団と造血支持細胞とを、該造血支持細胞がエポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有する基体に付着した状態で共培養することにより、造血幹細胞の自己複製及び血液細胞への分化を同時に誘導させることを特徴とする、造血幹細胞の培養方法を提供する。
【００１１】
本発明はまた、造血幹細胞又は造血幹細胞を含有する細胞集団と造血支持細胞とを、該造血支持細胞がエポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有する基体に付着した状態で共培養することにより、造血幹細胞の自己複製及び血液細胞への分化を同時に誘導させることを特徴とする、造血幹細胞の維持又は増幅方法を提供する。
本発明はまた、造血幹細胞又は造血幹細胞を含有する細胞集団と、エポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有する粒子からなる三次元集積体に付着した造血支持細胞とを含んでなることを特徴とする、三次元共培養物を提供する。
【００１２】
本発明はまた、エポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有する体積平均粒径５０〜２,０００μｍの粒子の三次元集積体と該三次元集積体に付着した造血支持細胞とを含んでなり、該粒子がエポキシ基を０.５×１０-3〜２.０×１０-3ｍｏｌ/ｇ基体の量で有することを特徴とする、造血幹細胞の培養キットを提供する。
本発明はまた、エポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有する体積平均粒径５０〜２,０００μｍの複数の粒子からなり、該粒子がエポキシ基を０.５×１０-3〜２.０×１０-3ｍｏｌ/ｇ基体の量で有する、造血幹細胞と造血支持細胞との共培養用の培養担体を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の培養方法によれば、生体外で、造血幹細胞の自己複製(自己再生)及び血液細胞への分化を誘導することが可能となる。
また、本発明の共培養物によれば、造血幹細胞の維持システム及び/又は血液細胞の提供システムが可能となる。
また、本発明の培養キット及び培養担体によれば、体外での造血幹細胞の維持・分化誘導が容易に可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】造血支持細胞が本発明に係る培養担体の一形態に付着(固定化)することを示す写真である。
【図２】造血支持細胞がグラフト鎖を有さない培養担体へは付着(固定化)しないことを示す写真である。
【図３】グラフト鎖中のエポキシ基量が培養担体への造血支持細胞の付着速度に及ぼす影響を示すグラフである。
【図４】グラフト鎖の数及び密度が培養担体への造血支持細胞の付着に及ぼす影響を示すグラフである。
【図５】グラフト鎖の鎖長が培養担体への造血支持細胞の付着に及ぼす影響を示すグラフである。
【図６】造血支持細胞の付着に対するグラフト鎖の親水性官能基の影響を示すグラフである。
【図７】基体の粒径が培養担体への造血支持細胞の付着に及ぼす影響を示すグラフである。
【図８】造血支持細胞が本発明に係る培養担体の別の形態(基体としてＰＰ板；左)に付着(固定化)するが、未処理ＰＰ板(右)には付着(固定化)しないことを示す写真である。
【図９】造血支持細胞が本発明に係る培養担体の更に別の形態(左)に付着(固定化)するが、グラフト鎖を有さない培養担体(右)には付着(固定化)しないことを示す写真である。
【図１０】本発明に係る培養担体に付着した造血支持細胞(ＭＳ-５)との共培養による造血幹細胞の増殖及び分化並びに造血巣の形成を示す写真である。
【図１１】造血巣(造血幹細胞と本発明に係る培養担体に付着した造血支持細胞との共培養物)から遊離する血球細胞の数を示すグラフである。
【図１２】回収した培養培地中に存在するＣＦＵ-Ｍｉｘ、ＢＦＵ-Ｅ及びＣＦＵ-ＧＭにより形成されたコロニーの比率を示すグラフである。
【図１３】造血巣から遊離された細胞のメイ・グリュンワルド・ギムザ染色写真である。
【図１４】本発明に係る培養担体上で造血支持細胞(ＭＳ-５)と共培養されている造血幹細胞のヘマトキシリン・エオシン染色（Ｈ-Ｅ染色）写真(左)及びアルシアン・ブルー染色写真(右)である。
【図１５】本発明に係る培養担体上で造血支持細胞(ＭＳ-５)と共培養されている造血幹細胞の走査型電子顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
(基体)
本発明において使用し得る基体(固体状支持体)は、その外表面に後述するグラフト鎖を有することができるものであれば、材質について何ら限定されず、無機材料からなるものであっても、有機材料からなるものであってもよい。ここで、「外表面」とは、外部からのアクセス(接近)が容易な外周面をいい、例えば多孔質体における孔のような内部空間を形成している表面を含まない。
【００１６】
無機材料からなる基体としては、例えば、シリカ(代表的にはガラス)、シリコン、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムやヒドロキシアパタイトなどが挙げられる。
有機材料からなる基体としては、例えば、(メタ)アクリル酸系(共)重合体、オレフィン系(共)重合体(例えば、エチレン又はプロピレン(共)重合体)、スチレン(共)重合体、ウレタン(共)重合体のような樹脂からなるものや、乳酸(共)重合体、グリコール酸(共)重合体、εカプロラクトン(共)重合体のような生分解性樹脂からなるものなどが挙げられる。
好ましくは、基体は、(メタ)アクリル酸系(共)重合体、オレフィン系(共)重合体又はスチレン(共)重合体からなる。
【００１７】
共重合体中のコモノマー単位としては、特に制限はないが、例えば、ジビニルベンゼン、トリメリット酸トリアリル、トリ(メタ)アクリル酸ペンタエリスリトール、ジ(メタ)アクリル酸エチレングリコール、２,２'-アゾビス［Ｎ-(２-プロペニル)-２-メチルプロピオンアミド］、２,２'-アゾビス(２-メチルプロピオンアミジン)及び４,４'-アゾビス(４-シアノペンタン酸)、ビニルピロリドンに由来するコモノマー単位が挙げられる。コモノマー単位は１種であってもよいし、２種以上であってもよい。
【００１８】
(メタ)アクリル酸系(共)重合体としては、例えば、ポリ(メタ)アクリル酸、ポリ(メタ)アクリル酸エステル(例えば、(Ｃ1〜Ｃ4)アルキルアルコールや(Ｃ2〜Ｃ4)アルキレンジオールとのエステル)、(メタ)アクリル酸又は(メタ)アクリル酸エステルと他のコモノマーとの共重合体が挙げられる。
【００１９】
より具体的には、ポリ(メタ)アクリル酸メチル、(メタ)アクリル酸メチルと２,２'-アゾビス［Ｎ-(２-プロペニル)-２-メチルプロピオンアミド］との共重合体、(メタ)アクリル酸メチルと２,２'-アゾビス［Ｎ-(２-プロペニル)-２-メチルプロピオンアミド］と他のコモノマー(例えば、ジビニルベンゼン、トリメリット酸トリアリル、トリ(メタ)アクリル酸ペンタエリスリトール、ジ(メタ)アクリル酸エチレングリコール、ビニルピロリドンのうちの１種又は２種以上)の共重合体、ジ(メタ)アクリル酸エチレングリコールと２,２'-アゾビス［Ｎ-(２-プロペニル)-２-メチルプロピオンアミド］との共重合体、ジ(メタ)アクリル酸エチレングリコールと２,２'-アゾビス［Ｎ-(２-プロペニル)-２-メチルプロピオンアミド］と他のコモノマー(例えば、ジビニルベンゼン、トリメリット酸トリアリル、トリ(メタ)アクリル酸ペンタエリスリトール、ビニルピロリドンのうちの１種又は２種以上)との共重合体が挙げられる。
【００２０】
スチレン(共)重合体としては、例えば、ポリスチレン、スチレンと２,２'-アゾビス［Ｎ-(２-プロペニル)-２-メチルプロピオンアミド］との共重合体又はスチレンと２,２'-アゾビス［Ｎ-(２-プロペニル)-２-メチルプロピオンアミド］と他のコモノマー(例えば、ジビニルベンゼン、トリメリット酸トリアリル、トリアクリル酸ペンタエリスリトール、ジメタクリル酸エチレングリコール、ビニルピロリドンのうちの１種又は２種以上)との共重合体が挙げられる。
【００２１】
機械的安定性、タンパク質の非特異的付着及び生体毒性の観点から、メタクリル酸メチルと他のコモノマーとの共重合体、及びメタクリル酸メチルと２,２'-アゾビス［Ｎ-(２-プロペニル)-２-メチルプロピオンアミド］と他のコモノマーとの共重合体からなる基体が好ましい。
【００２２】
基体はまた、その外表面にグラフト鎖を有することができるものであれば、形状についても何ら限定されず、粒子状、繊維状、シート状、メッシュ状など任意の形状をとり得るが、好ましくは粒子状(特に好ましくは、球状又は略球状)である。
粒子状の基体は、好ましくは５０〜２,０００μｍ、より好ましくは１００〜２,０００μｍ、より好ましくは２００〜２,０００μｍ、より好ましくは３００〜２,０００μｍ、より好ましくは５００〜２,０００μｍの体積平均粒径を有する。
【００２３】
基体が粒子状である場合には、複数の基体が三次元集積体を形成していることが好ましい。
基体は多孔質であってもよいが、多孔質でないほうが好ましい。
【００２４】
基体の作製法
重合体からなる基体は、(コ)モノマー(例えば、前述のもの)を公知の方法で重合反応させることにより作製することができる。なかでも、モノマー(必要に応じて、高分子性分散安定剤)を溶媒中に分散させて重合固化させる懸濁重合法は、一段階で基体を作製でき、また後述する重合開始基を容易に導入できる点で、好ましい。
基体を作製するための重合反応に使用する重合開始剤は、任意の公知の重合開始剤(例えば、アゾビスイソブチロニトリル、２,２'-アゾビス(２,４-ジメチルバレロニトリル)、過酸化ベンゾイル)を使用することができる。
【００２５】
後工程で、下記で説明する「表面グラフト重合法」によりグラフト鎖を基体に付与する場合には、表面グラフト重合法で重合開始剤として機能し得る基(重合開始基)を基体に内在させる。
【００２６】
重合開始基を提供し得る化合物としては、例えば、ラジカル発生性アゾ化合物が挙げられる。
ラジカル発生性アゾ化合物を使用する場合、重合反応性であれば、基体を作製するための重合反応において、該化合物をコモノマーの１つとしてそのまま用いることができる。このような重合反応性のラジカル発生性アゾ化合物の具体例には、例えば、２,２'-アゾビス［Ｎ-(２-プロペニル)-２-メチルプロピオンアミド］が挙げられる。
【００２７】
ラジカル発生性アゾ化合物が非重合反応性であれば、他の重合反応性モノマーと予め縮合させて重合反応に用いる。このような非重合反応性のラジカル発生性アゾ化合物の具体例には、例えば、２,２'-アゾビス(２-メチルプロピオンアミジン)、４,４'-アゾビス(４-シアノペンタン酸)が挙げられる。
【００２８】
例えば、２,２'-アゾビス(２-メチルプロピオンアミジン)は、その二塩酸塩を(メタ)アクリル酸クロリドと縮合させ、２,２'-アゾビス(Ｎ-(メタ)アクリロイルアミジノプロパン)とする。４,４'-アゾビス(４-シアノペンタン酸)は、カルボジイミド存在下で(メタ)アクリル酸と縮合させて、(メタ)アクリル酸４,４'-アゾビス(４-シアノペンタノエート)とする。
導入効率の観点から、２,２'-アゾビス［Ｎ-(２-プロペニル)-２-メチルプロピオンアミド］のような重合反応性のラジカル発生性アゾ化合物をそのままモノマーの１つとして用いることが好ましい。
【００２９】
後工程で、下記で説明する「化学結合法」によりグラフト鎖を基体に付与する場合には、コモノマーとして熱開裂性又は光開裂性の反応性官能基を含有するモノマーを使用することが好ましい。熱開裂性又は光開裂性反応性官能基としては、例えば、エポキシ基が挙げられる。
エポキシ基含有モノマーは、エポキシ基を含む重合反応性モノマーであれば限定されないが、例えば、不飽和グリシジルエステル及び不飽和グリシジルエーテルであり得る。
【００３０】
不飽和グリシジルエステルとしては、例えば、置換又は未置換のエチレン系(特にＣ2〜Ｃ4)不飽和炭化水素のグリシジルエステルであり、具体例には、(メタ)アクリル酸グリシジル、イタコン酸のモノ及びジグリシジルエステル、アリルグリシジルエステルが挙げられる。
【００３１】
不飽和グリシジルエーテルとしては、例えば、置換又は未置換のエチレン系(特にＣ2〜Ｃ4)不飽和炭化水素のグリシジルエーテルであり、具体例には、アリルグリシジルエーテル、ビニルグリシジルエーテルが挙げられる。
【００３２】
エポキシ基を有する基体は、例えば、水中に、高分子性分散安定剤、エポキシ基含有モノマー(例えば、メタクリル酸グリシジル)及び任意に他のコモノマーを分散させ、乳化重合、懸濁重合などの公知の方法により重合固化させて作製する。細胞の付着(固定化)に効果的な粒径サイズの粒子が得られる点や他の方法に比べ多量の反応性官能基を基体に導入できる点で、懸濁重合法が好ましい。
【００３３】
懸濁重合法による場合、例えば、反応液総量に対して１質量％〜５質量％のメタクリル酸グリシジル、３質量％〜１０質量％のトリアクリル酸ペンタエリスリトール及び０質量％〜１５質量％のシクロヘキサノールを含む溶液を水に分散させ、３００ｒｐｍで攪拌させながら７０℃にて３時間、次いで８０℃にて２時間反応させ、その液の温度を室温まで降下させ、蒸留水とメタノールで粒子を軽く洗浄することによって、エポキシ基を有する基体が得られる。
【００３４】
(グラフト鎖)
グラフト鎖は、エポキシ基を含む限り特定の形態に限定されない。エポキシ基は、グラフト鎖の主鎖(側鎖の有無は問わず)に存在してもよいし、側鎖に存在していてもよい。
グラフト鎖は、好ましくは、少なくともエポキシ基含有モノマー由来のモノマー単位を含む(共)重合体である。例えば、グラフト鎖は、エポキシ基含有モノマー(任意に、他のコモノマーと)の(共)重合体であり得る。グラフト鎖はまた、エポキシ基含有モノマーを含まない主鎖の重合体に、側鎖としてエポキシ基含有モノマーを重合(又は付加)させたものであり得る。
【００３５】
グラフト鎖は、好ましくは親水性官能基を更に含む。よって、グラフト鎖が(共)重合体である場合には、該(共)重合体は、好ましくは、親水性官能基含有モノマー由来のモノマー単位を含む。
グラフト鎖中のエポキシ基と親水性官能基との割合(エポキシ基：親水性官能基)は、好ましくは１０：１〜１：１０の範囲である。親水性官能基は、例えば、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基及び２-オキソピロリジニルからなる群より選択される。親水性官能基は、グラフト鎖の主鎖に存在してもよいし、側鎖に存在してもよい。
【００３６】
エポキシ基含有モノマーは、エポキシ基を含むモノマーであれば限定されないが、例えば、不飽和グリシジルエステル、不飽和グリシジルエーテル及び脂肪族ポリオールポリグリシジルエーテルであり得る。
不飽和グリシジルエステルとしては、例えば、置換又は未置換のエチレン系(特にＣ2〜Ｃ4)不飽和炭化水素のグリシジルエステルであり、具体例には、(メタ)アクリル酸グリシジル、イタコン酸のモノ及びジグリシジルエステル、アリルグリシジルエステルが挙げられる。
【００３７】
不飽和グリシジルエーテルとしては、例えば、置換又は未置換のエチレン系(特にＣ2〜Ｃ4)不飽和炭化水素のグリシジルエーテルであり、具体例には、アリルグリシジルエーテル、ビニルグリシジルエーテルが挙げられる。
脂肪族ポリオールポリグリシジルエーテルとしては、例えば、置換又は未置換の(Ｃ1〜Ｃ4)アルキレンジオールグリシジルエーテルであり、具体例には１,４-エタンジオールジグリシジルエーテル(エチレングリコールジグリシジルエーテル)、１,３-プロパンジオールジグリシジルエーテル、１,４-ブタンジオールジグリシジルエーテルが挙げられる。
【００３８】
なかでも、(メタ)アクリル酸グリシジル、アリルグリシジルエーテル及び１,４-ブタンジオールジグリシジルエーテルが好ましい。
グラフト鎖中のエポキシ基含有モノマーは、１種であっても、２種以上であってもよい。
【００３９】
ヒドロキシ基含有モノマーとしては、例えば、(メタ)アクリル酸ヒドロキシ(Ｃ1〜Ｃ4)アルキルエステル、ビニルアルコール、(Ｃ2〜Ｃ4)アルキレングリコールであり、具体例には、(メタ)アクリル酸２-ヒドロキシエチル、(メタ)アクリル酸２-ヒドロキシプロピル、(メタ)アクリル酸３-ヒドロキシプロピルが挙げられる。
カルボキシ基含有モノマーとしては、例えば、(メタ)アクリル酸、イタコン酸及びマレイン酸が挙げられる。
【００４０】
アミノ基含有モノマーとしては、例えば、(メタ)アクリルアミド又は(メタ)アクリル酸モノ又はジ(Ｃ1〜Ｃ4)アルキルアミノ(Ｃ1〜Ｃ4)アルキルであり、具体例には、(メタ)アクリル酸２-ジエチルアミノエチル、(メタ)アクリル酸メチルアミノエチル、(メタ)アクリル酸ｔ-ブチルアミノエチル、(メタ)アクリル酸ジメチルアミノエチル、(メタ)アクリル酸ジエチルアミノエチルが挙げられる。
２-オキソピロリジニル基含有モノマーとしては、Ｎ-ビニルピロリドンである。
【００４１】
細胞の付着速度の観点からは、親水性官能基としては、(メタ)アクリル酸及び(メタ)アクリル酸２-ヒドロキシエチルが好ましい。
【００４２】
その他のコモノマーとしては、例えば、(メタ)アクリル酸(Ｃ1〜Ｃ4)アルキルエステル、酢酸ビニル、ビニル(Ｃ1〜Ｃ4)アルキルエーテル、(メタ)アクリル酸アリルなどであり、具体例には、(メタ)アクリル酸メチル、(メタ)アクリル酸エチルが挙げられる。
【００４３】
グラフト鎖は、例えば１０,０００〜１００,０００の分子量を有する。
グラフト鎖は、エポキシ基を、例えば０.３×１０-3〜６.０×１０-3ｍｏｌ/ｇ基体、好ましくは０.５×１０-3〜６.０×１０-3ｍｏｌ/ｇ基体、より好ましくは０.５×１０-3〜２.０×１０-3ｍｏｌ/ｇ基体の量で基体の外表面に付与される。
【００４４】
(基体の外表面へのグラフト鎖の付与方法)
基体へのエポキシ基を有するグラフト鎖の付与方法には、グラフト重合によって基体の外表面上に直接、エポキシ基を有するグラフト鎖を形成する方法(本明細書中、「表面グラフト重合法」と呼ぶ)と、予め作製したグラフト鎖を基体の外表面に化学結合によりグラフトする方法(本明細書中、便宜上、「化学結合法」と呼ぶ)がある。後者の方法には、グラフト鎖がエポキシ基を有して予め作製される方法と、グラフト鎖がエポキシ基自体は有さずエポキシ基含有化合物と反応し得る官能基を有して予め作製され、基体の外表面へのグラフト後に該官能基にエポキシ基含有化合物を反応させる方法がある。
【００４５】
(表面グラフト重合法)
表面グラフト重合法においては、簡潔には、先ず基体の外表面に活性種(ラジカル)を発生させ、次いで該活性種を起点としてエポキシ基含有モノマー(必要に応じて、親水性官能基含有モノマー及び/又はその他のコモノマーと)を重合反応させることによって、基体の外表面にエポキシ基を含むグラフト鎖を形成する。
【００４６】
表面グラフト重合法は、公知の方法で行うことができる。
例えば、活性種(ラジカル)を発生させるためには、基体の外表面に電子線、放射線、プラズマなどを照射することができる。この方法は、材質に関して、無機材料又は有機材料からなる基体のいずれにも適用可能であり、形状に関しても、粒子状、板状又は発泡多孔質状のいずれにも適用可能である。
【００４７】
電子線又は放射線(例えばγ線)は、例えば、不活性ガス(例えば、窒素)雰囲気下で総線量が２０〜３００ｋＧｙになるように２〜５時間にわたって照射し得る。
プラズマは、例えば、酸素又は窒素雰囲気下にて１.２５×１０23〜１.８７×１０24ｅＶ／ｋｇ基体のエネルギーで５〜１５分間にわたって照射し得る。
【００４８】
活性種はまた、基体を、予め、熱開裂性又は光開裂性の重合反応開始剤が内在するように作製しておき(上記「基体の作製」の項を参照)、該開始剤を熱又は光開裂させて生じさせることもできる。
【００４９】
表面グラフト重合は、有機溶剤中にエポキシ基含有モノマー(所望により、親水性官能基及び/又はその他のコモノマー)(いずれも重合禁止剤を除去済みのもの)を希釈したモノマー溶液を、室温又は加熱下に、外表面に活性種を生じさせた基体と接触させることによって行うことができる。
エポキシ基含有モノマー、親水性官能基含有コモノマー及びその他のコモノマーには、グラフト鎖について前述したものを使用できる。親水性官能基含有コモノマー及びその他のコモノマーは、選択したエポキシ基含有モノマーと同様の条件で重合反応し得るものであれば、特に限定されず、所望により適切なものを選択すればよい。
【００５０】
(コ)モノマーを希釈する有機溶媒としては、使用する(コ)モノマーを溶解し得るものであれば特に限定されない。基体が粒子状である場合、該粒子を良好に分散し得るものを適宜選択することが望ましい。(コ)モノマーの溶解性、基体の分散性及び重合反応温度の観点から、トルエン、キシレン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどが好ましい。
【００５１】
具体的には、表面グラフト重合は、例えば、トルエン中にメタクリル酸グリシジル(及びメタクリル酸又はメタクリル酸２-ヒドロキシメチル)を含むモノマー溶液を、予め窒素ガスでバブリングすることにより酸素を追い出した後に、放射線照射などにより表面にラジカルを発生させた基体と６０℃にて８時間反応させて行うことができる。
反応終了後、室温まで放冷し、トルエン、メタノール及び蒸留水で洗浄して、エポキシ基(及び親水性官能基)を含むグラフト鎖を外表面に有する基体が得られる。
【００５２】
表面グラフト重合はまた、例えば熱開裂性開始基を内在させた基体１〜１０質量％、好ましくは２重量％〜４重量％を、１０重量％のメタクリル酸グリシジル(及びメタクリル酸又はメタクリル酸２-ヒドロキシメチル)のモノマーを希釈したトルエンなどの有機溶媒中に添加し、９０℃〜１１０℃にて２〜１２時間、好ましくは４〜８時間反応をさせて行うことができる。反応後、メタノール及び蒸留水で洗浄して、エポキシ基(及び親水性官能基)を含むグラフト鎖を外表面に有する基体が得られる。
【００５３】
(化学反応法)
化学反応法においては、簡潔には、基体に内在する熱開裂性又は光開裂性の反応性官能基(上記「基体の作製」の項を参照)を熱又は光開裂させた後、エポキシ基を含むか又は含まないグラフト鎖を反応させて、基体の外表面にグラフト鎖をグラフトする。エポキシ基を含まないグラフト鎖を用いた場合には、その後グラフト鎖にエポキシ基を付加する。
【００５４】
エポキシ基を含むグラフト鎖を使用する場合、グラフト鎖は、例えば、エポキシ基含有モノマー(必要に応じて、親水性官能基含有モノマー及び/又はその他のモノマーと)を重合反応させて作製する。
エポキシ基含有モノマー、親水性官能基含有コモノマー及びその他のコモノマーには、グラフト鎖に関して前述したものを使用できる。親水性官能基含有コモノマー及びその他のコモノマーは、選択したエポキシ基含有モノマーと同様の条件で重合反応し得るものであれば、特に限定されず、所望により適切なものを選択すればよい。
【００５５】
エポキシ基を含まないグラフト鎖を使用する場合、グラフト鎖は、エポキシ基含有化合物の付加に使用できる基(例えば、エポキシ基含有化合物と所定の条件下で反応性を有する基)を内在するように作製する。
エポキシ基含有化合物の付加に使用できる基は、例えば、カルボキシル基、イソシアナト基、アミノ基、ヒドロキシ基、チオール基である。
【００５６】
アミノ基を内在するグラフト鎖としては、例えば、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリエチレンイミン及びこれらの塩(例えば、酢酸塩)が挙げられる。
ヒドロキシ基を内在するグラフト鎖としては、例えば、ポリビニルアルコール、エチレンビニルアルコールが挙げられる。
チオール基を内在するグラフト鎖としては、例えば、チオール含有ポリビニルアルコールが挙げられる。
【００５７】
一方、エポキシ基含有化合物は、例えば、グラフト鎖について前述した脂肪族ポリオールポリグリシジルエーテル、エピハロヒドリンである。
脂肪族ポリオールポリグリシジルエーテルの好ましい例には、１,４-ブタンジオールジグリシジルエーテルが挙げられる。
エピハロヒドリンには、エピクロロヒドリンが挙げられる。
【００５８】
上記のようなエポキシ基含有化合物は、水若しくは極性溶媒(例えば、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなど)又はこれらの混合溶媒中、例えばアルカリ条件下で、グラフト鎖のアミノ基やヒドロキシ基と反応して容易にグラフト鎖に導入される。
【００５９】
なお、グラフト鎖は、末端又は側鎖に、熱又は光開裂させた反応性官能基と反応し得る基を有する。このような基には、エポキシ基、アミド基、アミノ基、カルボキシ基、イソシアナト基、チオール基が挙げられる。
【００６０】
具体的方法としては、例えば、１,４-ジオキサンと水の等重量混合液中に、反応性官能基としてエポキシ基を内在させた基体１〜５質量％とポリアリルアミン鎖(又はポリアリルアミン塩鎖(例えば酢酸塩))(例えば、分子量１５,０００) ０.１〜０.３質量％とを分散させ、２００ｒｐｍで攪拌しながら２０℃にて２４時間反応させる。基体のエポキシ基にポリアリルアミン鎖が求核的に反応して、基体の外表面にポリアリルアミン鎖がグラフトされる。
【００６１】
次いで、１,４-ジオキサン中に、ポリアリルアミン鎖がグラフトされた基体１〜１０質量％と、１,４-ブタンジオールジグリシジルエーテル ０.２〜１質量％と、水酸化ナトリウム水溶液２質量％とを入れ、２００ｒｐｍで撹拌しながら２０℃にて２４時間、次いで７０℃にて３時間反応させることにより、ポリアリルアミン鎖にアミノ基を介してエポキシ基(を含む基)を付加する。付加後、水及び１,４-ジオキサンで洗浄して、エポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有する基体が得られる。
【００６２】
(造血支持細胞)
エポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有する基体(以下、「本発明に係る培養担体」とも呼び、文脈から明らかな場合には単に「培養担体」とも呼ぶ)に付着させる造血支持細胞は、骨髄、脂肪組織、血管、臍帯のような組織に含まれる細胞のうち付着性を有する細胞(間葉系付着性細胞)及びその株化細胞である。造血支持細胞は、例えば、骨髄ストローマ細胞、骨髄線維芽細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞及びこれらの前駆細胞並びにこれら細胞由来の株化細胞から選択できる。
【００６３】
造血支持細胞は、好ましくは哺乳動物(ヒト、サル、ヒヒ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウサギ、ラット、マウスなど。特に、ヒト)由来の細胞であり得、より好ましくは共培養する造血幹細胞が由来する種と同種の動物由来の細胞であり、より好ましくは共培養する造血幹細胞が由来する個体由来の細胞である。
造血支持細胞は、１種類を単独で用いてもよいし、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
【００６４】
造血支持細胞は、動物(特にヒト)又はその組織から公知の方法によって得ることができる。例えば、骨髄ストローマ細胞は、骨髄穿刺などにより骨髄から採取した細胞群を適切な培養培地中で培養し、非付着性細胞を除去することによって得ることができる。
株化細胞としては、ヒト子宮頸部由来上皮細胞株Ｈｅｌａ、ヒト由来軟骨細胞株Ｃｈ-８、マウス頭蓋骨由来骨芽細胞株ＭＣ ３Ｔ３-Ｅ１、マウス骨髄ストローマ細胞株ＭＳ-５、ＳＴ２、ＨＥＳＳ-５、Ｍ２-１０Ｂ４などが挙げられる。
【００６５】
(培養担体への造血支持細胞の付着)
造血支持細胞を本発明に係る培養担体に付着させる方法は、特に限定されないが、例えば以下の方法により行うことができる。培養担体を含む生理学的溶液と、生理学的溶液中に造血支持細胞を懸濁させた細胞懸濁液とを細胞接着性の低い容器(例えば、疎水性外表面を有する組織培養ディッシュ)に入れて静置する。
生理学的溶液としては、生理食塩水、ハンクス平衡塩溶液、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、下記「造血幹細胞と造血支持細胞との共培養」の項で説明するような液体培養培地などが挙げられる。
【００６６】
付着の際の温度は、細胞に負担のない温度であれば特に限定されないが、例えば４０℃以下であり、好ましくは３４〜３７℃である。造血支持細胞が培養担体に付着して固定化されるに要する時間は、細胞にもよるが概して０.５〜１０時間ほどであり、通常は１〜３時間ほどである。
【００６７】
培養担体への造血支持細胞の付着に際して、細胞濃度は特に限定されない。付着しなかった細胞は、遠心分離又はピペッティングなどにより除去しても差し支えない。造血支持細胞と培養担体との混合割合は、付着(固定)効率の観点から、例えば培養担体０.２〜１０ｇに対して２×１０4〜８×１０6個/ｍｌの細胞懸濁液１０ｍｌ、好ましくは培養担体１〜３ｇに対して５×１０5〜２×１０6個/ｍｌの細胞懸濁液５ｍｌである。
【００６８】
造血幹細胞との共培養の前に、造血支持細胞が付着した培養担体を細胞培養培地に懸濁させて、培養担体上で造血支持細胞を培養してもよい。
培養培地及びその添加剤には、下記「造血幹細胞と造血支持細胞との共培養」の項で説明するような培地と同様な液体培養培地を使用できる。
【００６９】
培養は、上記のような細胞接着性の低い容器中で行う。培養温度は、２０℃〜４０℃、好ましくは２５℃〜４０℃、より好ましくは３０℃〜４０℃、より好ましくは３５℃〜４０℃より好ましくは３５℃〜３８℃である。細胞培養培地のｐＨ値は、一般に７〜９、好ましくは７.５〜８.５である。一般には、培養は、例えば炭酸ガス培養器内で、例えば約３％〜１０％のＣＯ2雰囲気下で行なう。
【００７０】
培養期間は、特に限定されないが、例えば造血細胞が培養担体の略全面を覆うまでであり、例えば１２０時間であり得る。
具体例としては、５％の炭酸ガス雰囲気下で、１０％のウシ胎仔血清を含むＤ-ＭＥＭ中で３７℃にて培養を行う。
【００７１】
(造血幹細胞)
「造血幹細胞」とは、自己再生能及び全ての系統の血液細胞への分化能(全能性)を有する細胞(未分化細胞)をいう。造血幹細胞は、特徴的には、ＣＤ３４陽性の非付着性細胞である。本発明において使用し得る造血幹細胞は、由来する組織について限定されないが、例えば骨髄血、臍帯血又は末梢血に由来し得る。
「造血幹細胞を含有する細胞集団」は、少なくとも造血幹細胞を含む限り、他の細胞を含んでいてもよいが、好ましくは造血幹細胞と造血前駆細胞や(成熟)血液細胞などの非付着性細胞とからなり、より好ましくは造血幹細胞及び造血前駆細胞からなる細胞集団である。
【００７２】
「造血前駆細胞」とは、１つ又は限定された複数(２〜３)の系統の血液細胞への分化能を有する(単能性又は寡能性(非全能性))細胞をいい、赤血球系へ方向付けられた赤芽球バースト形成細胞(ＢＦＣ-Ｅ又はＢＦＵ-Ｅ)及び赤芽球コロニー形成細胞(ＣＦＣ-Ｅ又はＣＦＵ-Ｅ)、白血球系へ方向付けられた顆粒球マクロファージコロニー形成細胞(ＣＦＣ-ＧＭ又はＣＦＵ-ＧＭ)、好酸球コロニー形成細胞(ＣＦＣ-Ｅ0又はＣＦＵ-Ｅ0)及び好塩基球コロニー形成細胞(ＣＦＣ-Ｂａｓｏ又はＣＦＵ-Ｂａｓｏ)、血小板系へ方向付けられた巨核球コロニー形成細胞(ＣＦＣ-Ｍｅｇ又はＣＦＵ-Ｍｅｇ)、限定された複数系統の血液細胞に分化し得る混合コロニー形成細胞(ＣＦＣ-Ｍｉｘ又はＣＦＵ-Ｍｉｘ)などが含まれる。
【００７３】
造血幹細胞を含有する細胞集団は、例えば、造血幹細胞を含有することが知られている組織(例えば、骨髄血、臍帯血又は末梢血)からＣＤ３４陽性細胞集団として単離し得る。ＣＤ３４陽性細胞集団は、公知の方法、例えば抗ＣＤ３４抗体を用いるアフィニティーカラムによる精製、フローサイトメーター(例えば、ＦＡＣＳ)による分取や磁気(例えば磁性ビーズ)を利用する分離などによって容易に得ることができる。
【００７４】
造血幹細胞又は造血幹細胞を含有する細胞集団は、由来する動物について限定されないが、好ましくは哺乳動物(ヒト、ネコ、イヌなど。特に、ヒト)由来の細胞又は細胞集団であり、より好ましくは共培養する造血支持細胞が由来する種と同種の動物由来の細胞又は細胞集団であり、より好ましくは共培養する造血支持細胞が由来する個体由来の細胞又は細胞集団である。
【００７５】
(造血幹細胞と造血支持細胞との共培養)
培養培地には、任意の液体培養培地、好ましくは哺乳動物細胞用培地を使用できる。細胞培養培地としては、例えば、イーグル培地のような最小必須培地(ＭＥＭ)、ダルベッコ改変イーグル培地(Ｄ-ＭＥＭ）、α-ＭＥＭ、ハムＦ-１２及びＦ-１０培地、Ｄ-ＭＥＭ/Ｆ-１２培地、ウィリアムＥ培地、ＲＰＭＩ培地(例えばＲＰＭＩ-１６４０)、ＭＣＤＢ培地、１９９培地、１９９/Ｆ-１２培地、フィッシャー培地、イスコフ改変ダルベッコ培地(Ｉ-ＭＤＭ)、マッコイ５Ａ及び７Ａ培地、Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ培地(メチルセルロース培地)が挙げられる。
【００７６】
これらの培地は必要に応じて適切に改変してもよい。例えば、ビタミン(例えば、アスコルビン酸、トコフェロール)、アミノ酸(例えば、グルタミン、アルギニン)、血清、抗生物質又は抗真菌剤(例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシン、ゲンタマイシン)、種々の成長因子/増殖因子(例えば、インスリン)、グルコース、トランスフェリン、セレン酸(例えば亜セレン酸ナトリウム)などの添加剤を培地に添加することができる。
生物由来の添加剤(例えば、血清)は、造血幹細胞及び/又は造血支持細胞と同種又は同一個体に由来する血清であることが好ましいが、他の種の動物由来(例えば、ウシ胎仔血清、ウシ血清、ウマ血清)であってもよい。
【００７７】
共培養は、付着性/非付着性を問わず、任意の培養容器(例えば、ディッシュ、ウェル、シャーレ、ボトル、フラスコなど)中で行う。
培養担体が粒子である場合、該粒子は培養容器中で三次元集積体を形成していることが好ましい。ここで、「三次元集積体」とは、形状を問わず、複数の粒子が三次元的に集積して構成される構造体をいう。
【００７８】
培養温度は、２０℃〜４０℃、好ましくは２５℃〜４０℃、より好ましくは３０℃〜４０℃、より好ましくは３５℃〜４０℃、より好ましくは３５℃〜３８℃である。細胞培養培地のｐＨ値は、一般に７〜９、好ましくは７.５〜８.５である。一般には、培養は、例えば炭酸ガス培養器内で、例えば約３％〜１０％のＣＯ2雰囲気下で行なう。
【００７９】
共培養の期間は、特に限定されないが、例えば１週間以上、２週間以上、３週間以上、４週間以上、５週間以上、６週間以上、７週間以上、８週間以上であり、具体的には、例えば、１週間〜１２週間、１週間〜１０週間、１週間〜８週間、１週間〜７週間、１週間〜６週間、１週間〜５週間、１週間〜４週間、１週間〜３週間、１週間〜２週間、２週間〜１２週間、２週間〜１０週間、２週間〜８週間、２週間〜７週間、２週間〜６週間、２週間〜５週間、２週間〜４週間、２週間〜３週間、３週間〜１２週間、３週間〜１０週間、３週間〜８週間、３週間〜７週間、３週間〜６週間、３週間〜５週間、３週間〜４週間、４週間〜１２週間、４週間〜１０週間、４週間〜８週間、４週間〜７週間、４週間〜６週間、４週間〜５週間であり得る。培養期間中、培養培地は、定期的に(例えば、１週間ごとに)交換することが好ましい。
【００８０】
共培養開始時の造血幹細胞と造血支持細胞の割合は、特に限定されないが、例えば１０：１〜１：１０であり、好ましくは２：１〜１：１０であり、より好ましくは２：１〜１：２である。
【００８１】
(造血幹細胞、造血前駆細胞、血液細胞の回収)
共培養物から、公知の方法を用いて、造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞を回収することができる。回収法には、密度勾配遠心法(例えば、フィコール法)、血液凝集法、パンニング法、(例えば、アフィニティーカラムやＦＡＣＳのようなセルソーティングにおいて)適切な表面マーカー(例えば、ＣＤ３４、ｌｉｎ)又はその組合せについてポジティブ及び/又はネガティブ選択を行う方法などが挙げられる。
【実施例】
【００８２】
以下に、実施例等を用いて本発明を具体的に説明するが、下記の実施例等は本発明のより詳細な理解に資するために提供されるのであって、本発明の範囲を限定することを意図して提供されるものではない。
【００８３】
１．培養担体の製造
培養担体の製造には、１０００ｍｌ容のガラス製セパラブルフラスコに三口セパラブルフラスコカバーを取り付けたものを反応容器として使用した。反応液の撹拌は、テフロン（登録商標）製攪拌翼が先端に取り付けられた攪拌棒を攪拌モーター(スリーワンモーター、新東科学製)により回転させて行った。反応容器は、温度コントローラー(ＮＴＴ-１０００、東京理化)により温度制御された恒温水槽内に設置した。反応の間のモノマーや溶媒の蒸発を防ぐために、長さ３０ｃｍのジムロート式又はアリン式冷却管をフラスコに取り付け、１６℃の冷却水を流した。
【００８４】
１.１．培養担体１〜１５の製造
(基体の製造)
反応液が入っていない上記三口フラスコを恒温水槽に設置し、予め攪拌翼を３００ｒｐｍで回転させた。
反応容器に、メタクリル酸メチル(ＭＭＡ；和光純薬工業)を３８ｇ、トリアクリル酸ペンタエリスリトール(ＰＥＴＡ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、米国)を３８ｇ、２,２'-アゾビス［Ｎ-(２-プロペニル)-２-メチルプロピオンアミド］(ＡＰＭＰＡ；和光純薬工業)を０.７５〜１１.４ｇ(下記表１を参照)、アゾビスイソブチロニトリル(ＡＩＢＮ；和光純薬工業)を２ｇ、ポリビニルピロリドン(ＰＶＰ；Ｋ-９０、ナカライテスク)を５.６４ｇ、蒸留水を５９０ｇ入れ、７０℃にて２時間、次いで８０℃にて２時間反応させた。反応液が室温になるまで放置して、アゾ基を含む粒子状の基体(樹脂粒子)を７０ｇ得た。
【００８５】
(表面グラフト重合)
反応液が入っていない上記三口フラスコを恒温水槽に設置し、予め攪拌翼を１５０ｒｐｍで回転させた。
反応容器に、樹脂粒子を１０ｇ、メタクリル酸グリシジル(ＧＭＡ；和光純薬工業)を０〜２５ｇ(表１を参照)、コモノマーを０〜２５ｇ(表１を参照)、トルエン(ナカライテスク)を２５０ｇ入れ、１００℃にて８時間反応させた。ただし、培養担体１１及び１２の製造時には、反応時間をそれぞれ４時間及び２時間とした。
【００８６】
コモノマーとして、培養担体１〜１２を製造する際にはメタクリル酸２-ヒドロキシエチル(ＨＭＡ)を用い、培養担体１３〜１５を製造する際にはメタクリル酸(ＭＡ)を用いた。
反応終了後、反応液が室温になるまで放置した後、メタノールと蒸留水及び生理食塩水にて洗浄して、グラフト鎖を外表面に有する樹脂粒子(培養担体１〜１５)を２０〜１００ｇを得た(表１)。
【００８７】
なお、得られた培養担体１は、グラフト鎖にエポキシ基を含むが親水性官能基は含まない。
また、得られた培養担体２〜６、８〜１２は、グラフト鎖にエポキシ基及びヒドロキシ基を含む。
また、培養担体１３〜１５は、グラフト鎖にエポキシ基及びカルボキシル基を含む。
また、得られた培養担体７は、グラフト鎖にエポキシ基を含まない。
【００８８】
更に、培養担体９、１０、１４、１５については、樹脂粒子中に含まれるアゾ基の量が異なるため、外表面に有するグラフト鎖の本数が他の培養担体とは異なる。
また、培養担体１１及び１２については、表面グラフト重合の反応時間が短いため、グラフト鎖の鎖長が他の培養担体と比べて短い。
【００８９】
１.２．培養担体１６の製造
上記１０００ｍｌ容三口フラスコに、ＧＭＡを３８ｇ、ＰＥＴＡを３８ｇ、ＡＩＢＮを２ｇ、ＰＶＰを５.６４ｇ、水を５９０ｇ入れ、３００ｒｐｍで攪拌させながら７０℃にて３時間、次いで８０℃にて２時間反応させた。反応液を室温まで降温させ、蒸留水とメタノールで軽く洗浄して、エポキシ基を有する基体(樹脂粒子)を得た。
この樹脂粒子をこのまま(グラフト鎖を付与せずに)培養担体１６とした。
【００９０】
１.３．培養担体１７の製造
窒素雰囲気下で、ポリスチレン製ディシュに入れたポリプロピレン(ＰＰ)板(１ｃｍ×５ｃｍ)にガンマ線を１５０ｋＧｙ(２５ｋＧｙ/ｈ×６ｈｒ)照射してＰＰ外表面にラジカルを発生させた。次に、上記三口フラスコに、ＰＰ板(０.４ｇ)、ＧＭＡを２０ｇ、ＭＡを５ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム(和光純薬工業)を８ｇ、蒸留水を４００ｇ入れ、窒素ガスを用いてバブリングしながら６０℃にて８時間反応させた。反応後、反応液が室温になるまで放置した後、メタノールと蒸留水及び生理食塩水にて洗浄して、エポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有するＰＰ板(培養担体１７)を得た。
【００９１】
１.４．培養担体１８及び１９の製造
(基体の製造)
上記１０００ｍｌ容三口フラスコに、ＧＭＡを２０ｇ、ＰＥＴＡを５０ｇ、ＰＶＰを５ｇ、水を５００ｇ入れ、３００ｒｐｍで攪拌させながら７０℃にて３時間、次いで８０℃にて２時間反応させた。反応液を室温にまで降温させ、蒸留水とメタノールで軽く洗浄して、エポキシ基が内在する基体(樹脂粒子)を得た。
なお、得られた樹脂粒子をこのままで培養担体１８とした。
【００９２】
次いで、１５ｇの上記樹脂粒子及び１ｇのポリアリルアミン(ＰＡＡ)酢酸塩(分子量１５,０００)を、１,４-ジオキサンと水の等重量混合液に分散させ、２００ｒｐｍで攪拌させながら２０℃にて２４時間反応させた。蒸留水と１,４-ジオキサンで軽く洗浄して、ＰＡＡがグラフトされた樹脂粒子を得た。
【００９３】
ＰＡＡがグラフトされた樹脂粒子を６ｇ、１,４-ブタンジオールジグリシジルエーテルを０.８４ｇ、０.５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を２ｇ、１００ｇの１,４-ジオキサン中に入れ、２００ｒｐｍで撹拌しながら２０℃にて２４時間、次いで７０℃にて３時間反応させた。粒子を水及び１,４-ジオキサンで洗浄することにより、エポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有する樹脂粒子(培養担体１９)を得た。
【００９４】
製造した培養担体を表１にまとめる。
【表１】
【００９５】
培養担体１〜７は、密度が約１.１９×１０3ｋｇ・ｍ-3で、粒径分布があり、おおよそ２００〜４００μｍの粒径を有していた。また、粒径及びその分布はレーザー回折散乱法にて測定した。
測定データを表２に示す。
【表２】
【００９６】
また、培養担体１〜７について、グラフト鎖中のエポキシ基量を塩酸ジオキサン法により定量した。
簡潔には、共栓付き１００ｍｌ容三角フラスコに、乾燥重量で０.４ｍｇの培養担体と２５ｍｌの塩酸-ジオキサン溶液(濃塩酸１.６ｍｌに対して１,４-ジオキサン１００ｍｌ)を入れ、恒温振盪水槽を用いて振幅２ｃｍ、１２５回/分の速さで振盪させながら、６０℃にて１時間反応させた。反応後、反応液を室温まで降温させ、２５ｍｌ中性エタノール溶液(エタノール１００ｍｌ中クレゾールレッド指示薬１ｍｌ)を加えた。０.０５Ｎメタノール性水酸化ナトリウム溶液により残存する塩酸の定量を行った。ブランク実験を行い、補正した塩酸消費量から培養担体のグラフト鎖中のエポキシ基量を算出した。
【００９７】
結果を表３に示す。
【表３】
表より、表面グラフト重合時のモノマー組成に応じて培養担体のグラフト鎖中のエポキシ基量が変化していることが解る。
【００９８】
２．培養担体への造血支持細胞の付着に対するエポキシ基を含むグラフト鎖の効果(１)
２.１．
培養担体３［ｐ(ＭＭＡ-ＡＰ３)-ｇ-ｐ(ＨＭＡ/ＧＭＡ)３］２.０ｇを含む生理食塩水５ｍｌと、生理食塩水中に造血支持細胞としてヒト上皮細胞由来細胞株(Ｈｅｌａ細胞)、マウス骨髄由来線維芽細胞株(ＭＳ-５細胞)、マウス頭蓋骨由来骨芽細胞株(ＭＣ ３Ｔ３-Ｅ１細胞)又はヒト由来軟骨細胞(Ｃｈ-８細胞)２.０×１０4個を懸濁させた細胞懸濁液を組織培養ディッシュに入れて３７℃にて１２０時間静置して、培養担体３に各造血支持細胞を付着させた。
【００９９】
次いで、各造血支持細胞が付着した培養担体を、１０％のウシ胎仔血清を含むＤ-ＭＥＭ中、５％の炭酸ガス雰囲気下で３７℃にて培養した。
５日間の培養後の培養担体と造血支持細胞の様子を図１に示す。
図より、培養担体３(本発明に係る培養担体)には、用いた何れの造血支持細胞も良好に付着(固定化)し、担体間隙に細胞からなるバイオフィルムが形成されることが明らかとなった。細胞数が添加量から増加しており、本発明に係る培養担体上で造血支持細胞が増殖すると理解できた。
【０１００】
Ｃｈ-８細胞(軟骨細胞)については、培養１４日目のサンプルを採取し、ヘマトキシリン-エオシン(Ｈ-Ｅ)染色を行った。担体間の空隙にエオシン染色された細胞質とヘマトキシリン染色された核が均等に分布していることから、粒子間隙にバイオフィルムが形成されていることが明らかとなった。このことから、軟骨細胞が培養担体上に三次元的に付着し、増殖していると理解された。
【０１０１】
２.２．
培養担体１６［ｐ(ＰＥＴＡ-ＧＭＡ１)］を含む生理食塩水２.０ｇを含む生理食塩水５ｍｌと、生理食塩水中にＭＳ-５細胞を懸濁させた細胞懸濁液組織培養ディッシュに入れて３７℃にて１２０時間静置して、培養担体１６に造血支持細胞を付着させた。
次いで、造血支持細胞が付着した培養担体を、１０％のウシ胎仔血清を含むＤ-ＭＥＭ中、５％の炭酸ガス雰囲気下で３７℃にて培養した。
【０１０２】
５日間の培養後の培養担体とＭＳ-５細胞の様子を図２に示す。
図より、樹脂粒子自体にエポキシ基を含むがエポキシ基を含むグラフト鎖を有さない培養担体１６には、ＭＳ-５細胞の付着(固定化)・増殖が全く見られなかった。
【０１０３】
２.３．
細胞を含む培地懸濁液と培養担体とを接触後、その時間を０分としてからの培地中の細胞数をビルゲルチュルク式血球計算盤により測定することにより、培養担体１〜７［ｐ(ＭＭＡ-ＡＰ３)-ｇ-ｐ(ＨＭＡ/ＧＭＡ)１〜７］へのＭＳ-５細胞の付着(固定化)速度を測定した。
結果を図３に示す。
【０１０４】
図より、培養担体１〜４には細胞が速やかに付着することから、培養担体に導入したグラフト鎖に含まれるエポキシ基及びヒドロキシ基が細胞の付着に有効であるのではないかと考えられるが、グラフト鎖にヒドロキシ基を含みエポキシ基を含まない培養担体７へは細胞付着が全く確認できなかった一方で、グラフト鎖にエポキシ基を含みヒドロキシ基を含まない培養担体１へは細胞付着が確認できたことから、グラフト鎖に存在するエポキシ基が造血支持細胞の付着に有効であるとことが理解できる。
【０１０５】
ただし、培養担体５及び６についての結果より、グラフト鎖がエポキシ基を含んでいても０.５×１０-3ｍｏｌ/ｇ-基体以上でないと、測定時間内(９０分以内)に細胞が付着しないことも明らかとなった。
また、培養担体１〜４についての結果より、グラフト鎖がエポキシ基に加えてヒドロキシ基を含むことにより、造血支持細胞の付着性(付着速度)が更に向上することも理解できる。
【０１０６】
３．造血支持細胞の付着に対するグラフト鎖の数及び密度の影響
培養担体８〜１０［ｐ(ＭＭＡ-ＡＰ１〜３)-ｇ-ｐ(ＨＭＡ/ＧＭＡ)３］に存在するグラフト鎖の本数は、ＡＰＭＰＡの添加量と開始剤効率からそれぞれ２.１４×１０18、４.０３×１０18、８.０７×１０18本/ｇ-基体であると推定された。
また、グラフト鎖中のエポキシ基量を塩酸ジオキサン法により定量したところ、それぞれ０.３４３、０.５２４及び１.６３×１０-3ｍｏｌ/ｇ-基体となった。
【０１０７】
これら培養担体へのＭＳ-５細胞の付着速度を上記と同様にして測定した。結果を図４に示す。
図より、グラフト鎖の本数よりもむしろ絶対的なエポキシ基量が細胞の付着に影響を及ぼしていることが解る。
【０１０８】
４．造血支持細胞の付着に対するグラフト鎖の鎖長の影響
培養担体３と培養担体１１及び１２［ｐ(ＭＭＡ-ＡＰ３)-ｇ-ｐ(ＨＭＡ/ＧＭＡ)３/４及びｐ(ＭＭＡ-ＡＰ３)-ｇ-ｐ(ＨＭＡ/ＧＭＡ)３/２］のエポキシ基量を塩酸ジオキサン法により定量することによって、グラフト鎖の平均重合度はそれぞれ４１１、２０２、１００となった。
これら培養担体へのＭＳ-５細胞の付着速度を上記と同様にして測定した。結果を図５に示す。
【０１０９】
図より、培養担体３への付着速度が最も速く、培養担体１２には細胞付着は測定時間内に観察できなかった。培養担体３への付着速度は、培養担体１１への付着速度より速い。これらの結果は、グラフト鎖が長いと細胞が付着可能な部位が多くなることを反映していると考えられる。
【０１１０】
５．造血支持細胞の付着に対するグラフト鎖の親水性官能基の影響
培養担体３及び培養担体１３［ｐ(ＭＭＡ-ＡＰ３)-ｇ-ｐ(ＭＡ/ＧＭＡ)３］のエポキシ基量を塩酸ジオキサン法により定量したところ１.０３及び２.０４×１０-3ｍｏｌ/ｇとなった。
培養担体３と培養担体１３へのＭＳ-５細胞の付着速度を上記と同様にして測定した。結果を図６に示す。
【０１１１】
図より、培養担体３への付着速度と培養担体１３への付着速度は大きく変化しなかった。これらの結果は、グラフト鎖中の親水性官能基が細胞の付着速度に大きく影響しないと考えられる。
【０１１２】
６．造血支持細胞の付着に対する粒径の影響
培養担体３を篩にかけ、粒径に従って、５−５８μｍ画分、５８−１０８μｍ画分、１０８−１９０μｍ画分、２１０−４２０μｍ画分、及び５９０−８４０μｍ画分に分けた。
次に、各画分についてＭＳ-５細胞の付着速度を上記と同様にして測定した。結果を図７に示す。
【０１１３】
図より、粒径５〜５８μｍの画分では測定時間内に細胞付着は始まらず、粒径５８〜１０８μｍの画分及び粒径１０８〜１９０μｍの画分の細胞付着速度は、篩い分けをしていない培養担体３に比べて遅かった。しかしながら、粒径５９０〜８４０μｍの画分の細胞付着速度は、培養担体３に比べて速くなった。
【０１１４】
粒径が細胞の付着に影響する要因として、粒子が持つ曲率が考えられる。細胞は担体外表面に沿って付着するため、曲率が大きくなると(すなわち粒径が小さくなると)、平面の培養担体に付着する場合と比べて、細胞が担体に付着するのに時間がかかり、ある曲率以上の粒子には細胞は付着できないのではないかと推測される。
また、粒子は球形であり、比重も１.１９×１０3ｋｇ・ｍ-3と培地の密度と大きく変わらず、僅かな衝撃でも培地中で移動してしまう。そのため、粒子の移動が細胞に応力を与え、細胞にストレスがかかると推測される。
以上の結果から考えて、粒子径は細胞の付着に影響を与えることが推定される。
【０１１５】
７．培養担体に付着した細胞の増殖に対するグラフト鎖の密度の影響
表４に示す培養担体にＭＳ-５を付着(固定化)させ、１０％のウシ胎仔血清を含むＤ-ＭＥＭ中、５％の炭酸ガス雰囲気下で３７℃にて培養した。５日間の培養後、培養担体の単位表面積当たりに付着(固定化)している細胞数を培養担体から剥離した細胞をビルゲルチュルク式血球計算盤を用いて計数した。結果を表４に示す。
【表４】
【０１１６】
表より、グラフト鎖の密度が低い(すなわちエポキシ基の導入量が少ない)と付着(固定化)速度が遅くなり、培養担体上での細胞増殖が制限されることが解る。
培養担体上での細胞の増殖に限って言えば、担体の粒径が大きな影響を及ぼしていることが解る。
【０１１７】
８．グラフト鎖に含まれるヒドロキシ基のカルボキシル基での置換の影響
培養担体１３〜１５［ｐ(ＭＭＡ-ＡＰ３〜５)-ｇ-ｐ(ＭＡ/ＧＭＡ)３］へのＭＳ-５細胞の付着速度を上記と同様にして測定した。また、これら培養担体について、グラフト鎖中のエポキシ基量を塩酸ジオキサン法により定量した。結果を表５に示す。
【表５】
【０１１８】
表より、コモノマーをＨＭＡに代えてＭＡを用いることにより、グラフト鎖に含まれるヒドロキシ基をカルボキシル基に置換しても、造血支持細胞の付着に関して略同等の効果が得られることが明らかとなった。
また、ＡＰＭＰＡをＨＭＡの場合よりも多く用いてアゾ基を含む樹脂粒子を作製すると、ＨＭＡの場合よりも多くのエポキシ基を含むグラフト鎖を作製することができたものの、培養５日目の細胞数はほとんど変わらなかった。
【０１１９】
９．培養担体への造血支持細胞の付着に対するエポキシ基を含むグラフト鎖の効果(２)
培養担体１７［ＰＰ-ｇ-ｐ(ＭＡ/ＧＭＡ)］又は未処理ＰＰ板と、生理食塩水中にＨｅｌａ細胞を懸濁させた細胞懸濁液(１〜１０×１０4個)を疎水性外表面を有する組織培養ディッシュに入れて３７℃にて１２０時間静置して、培養担体又は未処理ＰＰ板に造血支持細胞を付着させた。
次いで、造血支持細胞が付着した培養担体又は未処理ＰＰ板を、１０％のウシ胎仔血清を含むＤ-ＭＥＭ中、５％の炭酸ガス雰囲気下で３７℃にて培養した。
【０１２０】
３日間の培養後の培養担体とＨｅｌａ細胞の様子を図８に示す。
図より、未処理ＰＰ板では、Ｈｅｌａ細胞が付着(固定化)して伸長している様子は見えないのに対して、培養担体１７(本発明に係る培養担体)にはＨｅｌａ細胞が付着(固定化)し伸長していることが明らかとなった。
【０１２１】
１０．培養担体への造血支持細胞の付着に対するエポキシ基を含むグラフト鎖の効果(３)
培養担体１８［ｐ(ＰＥＴＡ-ＧＭＡ０)］又は培養担体１９［ｐ(ＰＥＴＡ-ＧＭＡ０)-ｇ-ｐ(ＰＡＡ-ｅｐｏｘｙ)］０.２４ｇを含む生理食塩水５ｍｌと、生理食塩水中にＭＳ-５細胞を懸濁させた細胞懸濁液（１〜１０×１０4個）を疎水性外表面を有する組織培養ディッシュに入れて３７℃にて１２０時間静置して、上記両培養担体に造血支持細胞を付着させた。
次いで、造血支持細胞が付着した両培養担体を、１０％のウシ胎仔血清を含むＤ-ＭＥＭ中、５％の炭酸ガス雰囲気下で３７℃にて培養した。
【０１２２】
５日間の培養後の培養担体とＭＳ-５細胞の様子を図９に示す。
図より、培養担体１８には、ＭＳ-５細胞の付着(固定化)・増殖が全く見られないのに対して、本発明に係る培養担体１０にはそれを取り囲むようにＭＳ-５細胞が付着(固定化)・増殖し、培養担体間隙にもバイオフィルムが形成されていることが解る。
【０１２３】
１１．培養担体に付着させた造血支持細胞と造血幹細胞との共培養(実施例)
培養担体３［ｐ(ＭＭＡ-ＡＰ３)-ｇ-ｐ(ＨＭＡ/ＧＭＡ)３］及び培養担体１９［ｐ(ＰＥＴＡ-ＧＭＡ０)-ｇ-ｐ(ＰＡＡ-ｅｐｏｘｙ)］にＭＳ-５細胞を付着(固定化)させた。
先ず、５０ｍｌ容のポリプロピレンチューブ内で、５００ｍｇの培養担体３又は１９を５ｍｌのＤ-ＭＥＭ中に懸濁させた。
【０１２４】
１００ｍｍの組織培養用ディッシュにおいて付着培養したＭＳ-５細胞を、トリプシン-ＥＤＴＡ(０.５ｗｔ％トリプシン、５.３ｍＭ ＥＤＴＡ・４Ｎａ)(×１０)(インビトロジェン、米国)を用いてディッシュから剥離させ、生理食塩水で洗浄後、Ｄ-ＭＥＭ中に細胞数５×１０5個/ｍｌの濃度になるように懸濁させた。
この細胞懸濁液５ｍｌを、予め培養担体を懸濁しておいた５０ｍｌ容のポリプロピレンチューブに添加した。そのまま、３７℃にて２４時間放置した後、培養担体と細胞の混合懸濁液を６０ｍｍの組織培養用ディシュに移して、更に培養を５日間続けた。
【０１２５】
抗ＣＤ３４抗体が結合したフェライト粒子からなるイムノビーズ(ＤＹＮＡＬ ＣＤ３４ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、ＤＹＮＡＬ ＢＩＯＴＥＣＨ、ノルウェー)を用いて、ヒト正常人由来の臍帯血を処理し、ＣＤ３４陽性の造血幹細胞を得た。採取後、１０％ウシ胎仔血清を含むＤ-ＭＥＭ中で細胞数５×１０3個/ｍｌの細胞懸濁液４ｍｌを、培養担体に付着したＭＳ-５細胞を含む上記ディシュに添加した。７日ごとに培地交換を繰り返しながら、ＣＯ2インキュベータ内で３７℃にて、造血幹細胞を培養担体に付着したＭＳ-５細胞との三次元共培養に付した。
【０１２６】
培地を交換する際に、細胞の生死をトリパンブルー溶液により確認し、遊離した細胞は、血球計算板を用いて細胞濃度を調べるとともに、サイトスピン標本を作製し、メイ・グリュンワルド・ギムザ染色後に光学顕微鏡で観察し、血球の種類を同定した。
【０１２７】
(ＣＦＵ-Ｍｉｘ、ＢＦＵ-Ｅ、ＣＦＵ-ＧＭの同定方法)
培地交換時に培養用ディッシュより回収した細胞は、造血幹細胞コロニーアッセイ用メディウム(ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ Ｈ４０３４、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、カナダ)と共に３０ｍｍ培養用ディッシュに播き、３７℃インキュベーター内で１４日間培養後、形成されたコロニーを倒立顕微鏡下に観察して、未熟造血細胞としてＣＦＵ-Ｍｉｘ、ＢＦＵ-Ｅ、ＣＦＵ-ＧＭの同定を行った。
【０１２８】
(共培養コロニーから遊離する血球)
造血幹細胞は、培養開始後数日で培養担体に付着したＭＳ-５細胞層に潜り込むようにしながら増殖及び分化し、造血巣を形成した(図１０左)。Ｈ-Ｅ染色より、培養担体の周りに付着・増殖した約１０〜２０μｍの比較的大きなＭＳ-５細胞に、５〜１０μｍの小さな血球細胞が潜り込むようにしながら増殖及び分化している様子が解る(図１０右)。
【０１２９】
次に、培地交換の際に造血巣から遊離してくる血球の数を経時的に調べた。結果を図１１に示す。図中、「Ｇ-０２ｂｅａｄｓ」は培養担体３を示し、「Ｍ-０２ｂｅａｄｓ」は培養担体１９を示す(図１２、１３及び１５中も同様)。
図より、造血幹細胞を単独又は培養担体のみとの共存下で培養した場合(図中、「ＣＤ３４ ａｌｏｎｅ」及び「Ｍ-０２ｂｅａｄｓ＋ＣＤ３４」)、４〜６週間で造血巣から遊離してくる血球が観察されなくなった。これは、造血幹細胞が成熟血球に分化してしまい、全て死滅してしまった結果と考えられた。
【０１３０】
また、造血幹細胞を組織培養ディッシュに直接付着させたＭＳ−５細胞との共存下で培養した場合、成熟血球の産生は約８週間で見られなくなった。これは、やはり造血幹細胞が成熟血球まで分化してしまい、８週後までには全て死滅してしまった結果と考えられた。
【０１３１】
一方、本発明に係る培養担体に付着させたＭＳ-５細胞との共存下で造血幹細胞を培養した場合(図中、「Ｍ-０２ｂｅａｄｓ＋ＭＳ-５＋ＣＤ３４」及び「Ｇ-０２ｂｅａｄｓ＋ＭＳ-５＋ＣＤ３４」)、成熟血球の産生は、８週間以上維持されることが明らかになった。成熟血球の産生は、８週間の培養時点でさえ当初の７〜８割のレベルに維持された。播種した造血幹細胞が成熟血球に分化するだけでは、絶対的な細胞数の物質収支を説明できない。すなわち、造血幹細胞は、本発明に係る培養担体に付着させたＭＳ-５細胞との共培養物中で、成熟血球の産生と併せて自己再生(自己増殖)を繰り返しているものと考えられる。
【０１３２】
本発明に係る培養担体(培養担体３に付着させたＭＳ-５細胞との共存下で造血幹細胞を培養した場合(図中、「Ｇ-０２ｂｅａｄｓ＋ＭＳ-５＋ＣＤ３４」)、培地交換時に回収された細胞中に存在する造血前駆細胞ＣＦＵ-Ｍｉｘ、ＢＦＵ-Ｅ及びＣＦＵ-ＧＭコロニーの形成細胞数の変動を図１２に示す。本発明に係る培養担体に付着させたＭＳ-５細胞と共培養することにより、造血前駆細胞が長期間(１２週間以上)維持されていることが確認できる。
【０１３３】
(培養液中の細胞染色)
次に、培地交換時に、培養液中に造血巣から遊離して回収された細胞をメイ・グリュンワルド・ギムザ染色し、その形態を観察した。染色写真を図１３に示す。
図より、造血幹細胞が単独で培養された場合(図中、「ＣＤ３４ ａｌｏｎｅ」)、４週目に残存する細胞のほとんどが分化したマクロファージであったのに対し、造血幹細胞が本発明に係る培養担体に付着した骨髄ストローマ細胞と三次元共培養される場合(図中、「Ｍ-０２ｂｅａｄｓ」及び「Ｇ-０２ｂｅａｄｓ」)には、７週目でも培養物中に未分化細胞から分化細胞(成熟血液細胞)まで観察できた。すなわち、造血幹細胞の自己再生(自己増殖)及び血液細胞への分化が、骨髄と同様に、体外で人工的に再現された。
【０１３４】
(細胞染色)
培養中のＭＳ-５細胞及び造血幹細胞の発育の様子を示す。
図１４に、培養担体に付着し、増殖して三次元的に発育しているＭＳ-５細胞のＨ-Ｅ染色写真、アルシアン・ブルー染色写真を示す。ＭＳ-５細胞は、培養担体間にネット状構造物を形成しながら発育している。
図１５に、走査型電子顕微鏡による観察写真を示す。培養担体に付着して三次元的構造を形成しながら発育するＭＳ-５細胞と、隙間に潜り込むようにしながら増殖している造血細胞が観察できる。
【０１３５】
上記の具体的な培養担体の製造例及び実施例は、本発明の理解を容易にするために例示として記載されたものであって、本発明は本明細書又は添付図面に記載された具体的な構成のみに限定されるものではない。本明細書に記載した具体的構成、手段、方法及び装置は、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、当該分野において公知の他の多くのものと置換可能である。
【産業上の利用可能性】
【０１３６】
本発明に係る培養担体に付着(固定化)した造血支持細胞と造血幹細胞との三次元的な共培養系は、骨髄移植に有用な造血幹細胞の増殖・分化のシステムや成分輸血等に有用な血球提供システム等を提供することができ、再生医療や創薬などの産業上の幅広い分野への利用が可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
造血幹細胞又は造血幹細胞を含有する細胞集団と造血支持細胞とを、該造血支持細胞がエポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有する基体に付着した状態で共培養することにより、造血幹細胞の自己複製及び血液細胞への分化を同時に誘導させることを特徴とする、造血幹細胞の培養方法。
【請求項２】
前記基体が粒子状である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記粒子が５０〜２,０００μｍの体積平均粒径を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記粒子が三次元集積体を形成している、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記基体がエポキシ基を０.５×１０-3〜２.０×１０-3ｍｏｌ/ｇ基体の量で有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記グラフト鎖が親水性官能基を更に含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記グラフト鎖が、エポキシ基及び親水性官能基を１０：１〜１：１０の割合で含む請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記グラフト鎖が１０,０００〜１００,０００の分子量を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記グラフト鎖が(メタ)アクリル酸グリシジル、アリルグリシジルエーテル又は１,４-ブタンジオールジグリシジルエーテルをエポキシ基含有モノマー単位として有する(共)重合体である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記基体が(メタ)アクリル酸系(共)重合体、オレフィン系(共)重合体又はスチレン(共)重合体からなる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記共培養の前に、前記基体上で前記造血支持細胞を培養する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
造血幹細胞又は造血幹細胞を含有する細胞集団が骨髄血、臍帯血又は末梢血に由来する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記造血支持細胞が骨髄ストローマ細胞、骨髄線維芽細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞若しくはこれらの前駆細胞又はこれら細胞由来の株化細胞である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞を回収することを更に含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
血液細胞を回収することを更に含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
造血幹細胞又は造血幹細胞を含有する細胞集団と造血支持細胞とを、該造血支持細胞がエポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有する基体に付着した状態で共培養することにより、造血幹細胞の自己複製および血液細胞への分化を同時に誘導させることを特徴とする、造血幹細胞の維持又は増幅方法。
【請求項１７】
造血幹細胞又は造血幹細胞を含有する細胞集団と、エポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有する粒子からなる三次元集積体に付着した造血支持細胞とを含んでなることを特徴とする、三次元共培養物。
【請求項１８】
エポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有する体積平均粒径５０〜２,０００μｍの粒子の三次元集積体と該三次元集積体に付着した造血支持細胞とを含んでなり、該粒子がエポキシ基を０.５×１０-3〜２.０×１０-3ｍｏｌ/ｇ基体の量で有することを特徴とする、造血幹細胞の培養キット。
【請求項１９】
エポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有する体積平均粒径５０〜２,０００μｍの複数の粒子からなり、該粒子がエポキシ基を０.５×１０-3〜２.０×１０-3ｍｏｌ/ｇ基体の量で有する、造血幹細胞と造血支持細胞との共培養用の培養担体。
【請求項１】
造血幹細胞又は造血幹細胞を含有する細胞集団と造血支持細胞とを、該造血支持細胞がエポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有する基体に付着した状態で共培養することにより、造血幹細胞の自己複製及び血液細胞への分化を同時に誘導させることを特徴とする、造血幹細胞の培養方法。
【請求項２】
前記基体が粒子状である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記粒子が５０〜２,０００μｍの体積平均粒径を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記粒子が三次元集積体を形成している、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記基体がエポキシ基を０.５×１０-3〜２.０×１０-3ｍｏｌ/ｇ基体の量で有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記グラフト鎖が親水性官能基を更に含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記グラフト鎖が、エポキシ基及び親水性官能基を１０：１〜１：１０の割合で含む請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記グラフト鎖が１０,０００〜１００,０００の分子量を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記グラフト鎖が(メタ)アクリル酸グリシジル、アリルグリシジルエーテル又は１,４-ブタンジオールジグリシジルエーテルをエポキシ基含有モノマー単位として有する(共)重合体である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記基体が(メタ)アクリル酸系(共)重合体、オレフィン系(共)重合体又はスチレン(共)重合体からなる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記共培養の前に、前記基体上で前記造血支持細胞を培養する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
造血幹細胞又は造血幹細胞を含有する細胞集団が骨髄血、臍帯血又は末梢血に由来する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記造血支持細胞が骨髄ストローマ細胞、骨髄線維芽細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞若しくはこれらの前駆細胞又はこれら細胞由来の株化細胞である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
造血幹細胞及び/又は造血前駆細胞を回収することを更に含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
血液細胞を回収することを更に含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
造血幹細胞又は造血幹細胞を含有する細胞集団と造血支持細胞とを、該造血支持細胞がエポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有する基体に付着した状態で共培養することにより、造血幹細胞の自己複製および血液細胞への分化を同時に誘導させることを特徴とする、造血幹細胞の維持又は増幅方法。
【請求項１７】
造血幹細胞又は造血幹細胞を含有する細胞集団と、エポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有する粒子からなる三次元集積体に付着した造血支持細胞とを含んでなることを特徴とする、三次元共培養物。
【請求項１８】
エポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有する体積平均粒径５０〜２,０００μｍの粒子の三次元集積体と該三次元集積体に付着した造血支持細胞とを含んでなり、該粒子がエポキシ基を０.５×１０-3〜２.０×１０-3ｍｏｌ/ｇ基体の量で有することを特徴とする、造血幹細胞の培養キット。
【請求項１９】
エポキシ基を含むグラフト鎖を外表面に有する体積平均粒径５０〜２,０００μｍの複数の粒子からなり、該粒子がエポキシ基を０.５×１０-3〜２.０×１０-3ｍｏｌ/ｇ基体の量で有する、造血幹細胞と造血支持細胞との共培養用の培養担体。
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図１１】
【図１２】
【図１】
【図２】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図１１】
【図１２】
【図１】
【図２】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２０１０−２２０５８１（Ｐ２０１０−２２０５８１Ａ）
【公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−７４１３３（Ｐ２００９−７４１３３）
【出願日】平成２１年３月２５日（２００９．３．２５）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年９月３０日 社団法人 日本血液学会 東京事務局「臨床血液」編集部発行の「臨床血液 Ｖｏｌ．４９ Ｎｏ．９ ２００８ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ」、 平成２０年１０月１０日 社団法人 日本血液学会主催の「第７０回日本血液学会総会」、 平成２０年１０月１７日 化学工学会関西支部発行の「化学工学会 姫路大会講演要旨集」および 平成２０年１１月１８日 化学工学会関西支部主催の「化学工学会姫路大会」において発表
【出願人】（５０５１２７７２１）公立大学法人大阪府立大学 (688)
【出願人】（８９９００００５７）学校法人日本大学 (650)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月２５日（２００９．３．２５）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年９月３０日 社団法人 日本血液学会 東京事務局「臨床血液」編集部発行の「臨床血液 Ｖｏｌ．４９ Ｎｏ．９ ２００８ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ」、 平成２０年１０月１０日 社団法人 日本血液学会主催の「第７０回日本血液学会総会」、 平成２０年１０月１７日 化学工学会関西支部発行の「化学工学会 姫路大会講演要旨集」および 平成２０年１１月１８日 化学工学会関西支部主催の「化学工学会姫路大会」において発表
【出願人】（５０５１２７７２１）公立大学法人大阪府立大学 (688)
【出願人】（８９９００００５７）学校法人日本大学 (650)
【Ｆターム（参考）】
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