遺伝子の検出方法
【目的】 極めて簡便で迅速な遺伝子の検出方法を提供する。
【構成】 蛍光色素で標識されたプライマを用いて、検出対象となる遺伝子をポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）により増幅させる。増幅された遺伝子が有する該蛍光色素の蛍光偏光解消度を時間分解的に測定する。
【効果】 蛍光色素で標識されたプライマーを用いて、検出対象となる遺伝子を鋳型としてＰＣＲにより増幅させることによって、蛍光色素で標識されたプライマーを含む遺伝子が増幅、生成される。また、増幅遺伝子の塩基配列上の該蛍光色素の蛍光を励起させ、該蛍光の偏光解消度を時間分解的に測定することによって、該増幅遺伝子の分子回転運動による蛍光異方性の消失を捉えることができる。したがって、ＰＣＲにより増幅された増幅遺伝子の鋳型である検出対象遺伝子を極めて簡便に、かつ短時間で検出することができる。
【構成】 蛍光色素で標識されたプライマを用いて、検出対象となる遺伝子をポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）により増幅させる。増幅された遺伝子が有する該蛍光色素の蛍光偏光解消度を時間分解的に測定する。
【効果】 蛍光色素で標識されたプライマーを用いて、検出対象となる遺伝子を鋳型としてＰＣＲにより増幅させることによって、蛍光色素で標識されたプライマーを含む遺伝子が増幅、生成される。また、増幅遺伝子の塩基配列上の該蛍光色素の蛍光を励起させ、該蛍光の偏光解消度を時間分解的に測定することによって、該増幅遺伝子の分子回転運動による蛍光異方性の消失を捉えることができる。したがって、ＰＣＲにより増幅された増幅遺伝子の鋳型である検出対象遺伝子を極めて簡便に、かつ短時間で検出することができる。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、微量の遺伝子の検出方法に関するものであり、その主たる利用分野としては、医学、法医学、獣医学などの分野における遺伝子検査、および生化学、生物学、薬理学、農学、さらには考古学の分野における遺伝子測定が挙げられる。
【０００２】
【従来の技術】ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（以下「ＰＣＲ」という。）は、微量の遺伝子を指数関数的に増幅させる反応であり、近年、遺伝子の検出やクローニングに多用されている。特に、数分子から数千分子の極微量遺伝子の検出は、本法をもって初めて可能になったと言える。
【０００３】検出対象となる遺伝子（以下「検出対象遺伝子」ともいう。）を鋳型としてＰＣＲにより増幅された遺伝子（以下「増幅遺伝子」という。）の測定について、多数の方法が開発されているが、その中でも頻繁に用いられる方法としては、■ドットブロット法、■ゲル電気泳動法、および■サザンブロット法が挙げられる（例えば、斉藤監訳、ＰＣＲ実験マニュアル、ＨＢＪ出版局、１９９１年発行を参照）。以下、上記■〜■の各法について説明する。
【０００４】■ドットブロット法においては、まずＰＣＲ反応終了後に、反応溶液中の増幅遺伝子を二本鎖から一本鎖に変性させる。その後、反応溶液の一部を多孔性のドットブロット膜に滴下し、増幅遺伝子を該膜上に付着させ、次いで増幅遺伝子に特異的にハイブリダイズする標識プローブの溶液と該膜とを反応させる。ドットブロット膜上に付着した増幅遺伝子と標識プローブとをハイブリダイズさせた後、該膜をよく洗浄してハイブリダイズしていない未反応の標識プローブを除去し、残存する標識プローブの量を測定する。標識としては、放射性同位元素または適当な酵素が用いられ、前者についてはオートラジオグラフィで、後者については発色法、蛍光法または化学発光法で測定される。
【０００５】■電気泳動法においては、ＰＣＲ反応溶液の一部が、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動に供され、分子サイズに応じた分離を行った後、分離されたバンドを例えばエチジウムブロマイドのような蛍光色素で染色し、バンド強度を肉眼またはデンシトメータで測定する。
【０００６】■サザンブロット法においては、■と同様の電気泳動による分離を行った後、ゲルをＮａＯＨで変性させる。その後、ゲル上の遺伝子を多孔性の膜にトランスファさせ、該膜と標識プローブとを■のドットブロット法の場合と同じように反応させ、洗浄した後、残存する標識プローブの量を定量する。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】以上のように、ＰＣＲ反応溶液中の増幅遺伝子の検出に関する従来の方法は、いずれも繁雑である。特に、感度および特異性に優れたサザンブロット法においては、電気泳動、膜への転写、プローブとのハイブリダイゼーション、標識の測定などと多くの工程、時間および繁雑な操作を要する。したがって、本発明の目的は、従来の方法に比べて、簡便で迅速な遺伝子の検出方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明の遺伝子の検出方法は、蛍光色素で標識されたプライマーを用いて、検出対象遺伝子をＰＣＲにより増幅させた後に、増幅遺伝子が有する該蛍光色素の蛍光偏光解消度を時間分解的に測定することを特徴とする。
【０００９】本発明方法においては、まず（１）検出対象となる遺伝子（ＰＣＲにより増幅される鋳型となる遺伝子）に対して相補性を有するプライマーを作成し、該プライマーを蛍光色素で標識して、蛍光標識プライマーを準備することが必要である。次に、（２）該プライマーを用いて、検出対象となる遺伝子を鋳型とするＰＣＲを実施し、（３）ＰＣＲ終了後に、増幅遺伝子について該蛍光色素の蛍光偏光解消度を時間分解的に測定する。以下これらの各工程について詳しく説明する。
【００１０】まず、蛍光標識プライマーの作成について述べる。プライマーは、検出対象遺伝子の各一本鎖のＤＮＡにそれぞれ特異的にハイブリダイズして、ＰＣＲの開始点（ＰＣＲによる増幅反応後の二本鎖の増幅遺伝子の両末端）となる二種類の遺伝子断片であるので、以下の条件を満足するものでなければならない。
【００１１】検出対象遺伝子の塩基配列の中から該遺伝子のみに特異的な塩基配列を検索し、その中から一組（二種類）のプライマーを選択する。但し、プライマー同士の相補鎖生成を避けるために、二種類のプライマーの３’側が相補性を有しないこと、プライマー内にパリンドロームを形成しないことなどに注意して、プライマーの配列を選択することが必要である。プライマーの長さは、特に限定されないが、通常は１０塩基〜４０塩基、好ましくは１５塩基〜３０塩基である。
【００１２】検出対象遺伝子の塩基配列のうち二種類のプライマーに挟まれる塩基配列の領域が、ＰＣＲにより増幅される領域（以下「ＰＣＲ増幅領域」という。）となる。このＰＣＲ増幅領域の鎖長は、特に限定されないが、通常は５０塩基〜５０００塩基、好ましくは１００塩基〜２０００塩基となるように二種類のプライマーを選択することが望ましい。なお、通常は、検出対象遺伝子の一部の領域がＰＣＲ増幅領域となるが、特に検出対象遺伝子が短鎖である場合には、その全領域がＰＣＲ増幅領域となることもあり得る。
【００１３】このように設計、作成されたプライマーに蛍光色素を結合させる方法としては、プライマーの５’末端にアミノ基などの官能基をまず導入し、該官能基と結合できるように修飾された蛍光色素を反応させる方法が、一般的に用いられる（上記“ＰＣＲ実験マニュアル”８９頁参照）。これとは別に、プライマーをＤＮＡ合成装置で合成する際に、蛍光色素で標識されたヌクレオチド三リン酸を取り込ませる方法もある。前者の方法では、蛍光色素が５’末端のみに導入されるのに対して、後者の方法では、プライマーの鎖の中にいくつかの蛍光色素が導入される。なお、２種類のプライマーのうち少なくとも一方のプライマーに蛍光色素を結合させればよい。
【００１４】蛍光色素としては、フルオレシン、ローダミンなどが例示され、例えばフルオレシン・イソチオシアネートは、チオクルドミド結合を介してプライマーに結合する。
【００１５】次に、蛍光標識プライマーを用いたＰＣＲ法について説明する。まず、検出対象遺伝子を９２℃〜９６℃で１０秒〜３分間加熱して熱変性させ、一本鎖のＤＮＡとする。その後、蛍光標識プライマーを一本鎖のＤＮＡにアニーリングする。アニーリングは、５５℃〜７２℃で１０秒〜３分間加熱して行われる。さらに、塩基の存在下で、上記のポリメラーゼを用いて、７０℃〜７３℃で３０秒〜３分間加熱して、プライマーの伸長反応を行う。
【００１６】伸長反応に用いられるポリメラーゼとしては、特に限定されるものではないが、通常はTaq ＤＮＡポリメラーゼが用いられる。また、ポリメラーゼの基質となる塩基は、デオキシヌクレオチド5'−トリフォスフェート[dNTP]、すなわち、アデニン、グアニン、シトシンおよびチミンである。
【００１７】以上の工程を経ることによって、検出対象遺伝子の一部または全領域（ＰＣＲ増幅領域）の遺伝子の複製が行われ、さらに上記の熱変性、アニーリングおよびプライマーの伸長反応を順次複数回行うことによって、ＰＣＲ増幅領域の遺伝子の増幅が行われる。ＰＣＲのサイクル数は、通常は１０回〜５０回、好ましくは２０回〜３５回である。
【００１８】標準的なＰＣＲ仕込み液の組成は以下の通りである。
所定量の検出対象遺伝子０．５ｍＭ〜５００ｍＭのＫＣｌ１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３）
０．２５ｍＭ〜１５ｍＭのＭｇＣｌ2０．１重量％ゼラチン２０μＭ〜２００μＭの各ｄＮＴＰ０．０１μＭ〜１μＭの蛍光標識プライマー１ｕｎｉｔ〜３ｕｎｉｔのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
【００１９】ＰＣＲが終了した後の反応溶液は、そのまま、あるいは必要ならばエタノール沈殿によってＤＮＡ分画のみを分離した後、適当な溶媒に再溶解して、時間分解的な蛍光偏光解消度の測定に供される。また、適当なカラムによって未反応の蛍光標識プライマーを分離除去し、増幅遺伝子のみを該測定に供することも可能である。多くの場合、ＰＣＲ反応溶液をそのまま該測定に供することが可能である。
【００２０】次に、蛍光偏光解消度を時間分解的に測定する方法について説明する。図１は、時間分解蛍光偏光解消度測定装置の基本構成の一例を示す図である。モード同期アルゴンイオンレーザ１によって駆動されたＣＷ色素レーザ２とキャビティーダンパ３とから、ピコ秒単位でパルスを発振できる波長可変な色素レーザ共振器が構成される。該共振器のパルス幅は、通常、５ピコ秒〜２０ピコ秒であり、パルスの繰り返し周期は、通常、８２ＭＨｚ〜０．８ＭＨｚである。
【００２１】該共振器から発せられたレーザ光の一部が、ビームスプリッタ４によって分岐されて、ＰＩＮホトダイオード５に入射する。入射したレーザ光は、ＰＩＮホトダイオード５によって光電変換され、入射光と同期したトリガ信号として、時間遅延ケーブルユニット６を経由して、シンクロスキャンストリークカメラ１６に送信される。時間遅延ケーブルユニット６は、該トリガ信号と後述の蛍光信号との時間関係の調節に用いられる。
【００２２】一方、該共振器から発せられたレーザ光のうちビームスプリッタ４を透過したレーザ光は、ＮＤ（neutral density ）フィルタ７によって適当な強度に減衰された後、パビネソレイユ補償板８によって偏光化され、集光レンズ９によって、ＰＣＲ反応溶液が充填された試料室１０に入射する。入射したレーザ光は、蛍光標識プライマーを含む増幅遺伝子の蛍光を励起させる励起光として作用する。
【００２３】試料室１０から出射した蛍光は、蛍光集光レンズ１１によって集められて平行ビームとなる。平行化された蛍光ビームは、偏光子１２を透過することによって、蛍光ビームの偏光方向が励起光の偏光方向と平行な場合と垂直な場合の二通りに分光可能となる。
【００２４】偏光子１２を透過したビームは、蛍光フォーカス用レンズ１３によって、入射口側に偏光解消板１４が設けられた分光器１５の入射スリットに集光される。分光器１５によって分光された蛍光は、分光器１５の出射口を経てシンクロスキャンストリークカメラ１６の入射スリットに結像される。なお、偏光解消板１４は、分光器１５中の回析格子やカメラ１６の光電変換面が有する望ましくない偏光特性をキャンセルする。
【００２５】カメラ１６によって光電変換された蛍光信号は、時間遅延ケーブルユニット６によって時間分解される。すなわち、ユニット６からのトリガー信号が、カメラ１６をストリーク掃引させることによって、レーザ光発振（励起光照射）後、予め定められた時間経過毎に分解された蛍光信号が、それぞれ選択される。励起光照射後の分解時間幅としては、後述の蛍光偏光解消度が１となる時間よりも短ければ特に限定されないが、通常は、０．１ナノ秒〜１０００ナノ秒、好ましくは１ナノ秒〜１００ナノ秒である。
【００２６】時間分解された蛍光信号は、二次元画像（時間−波長）としてＳＩＴ（Silicon Intensified Target) カメラ１７により撮像された後、デジタル信号としてデータプロセッサ１８中のメモリやフロッピーディスク駆動装置１９中のフロッピーディスクの記憶領域に蓄えられる。このデータは、データ処理を行うためのコンピュータ２０によって演算解析され、その演算結果は、図示しないディスプレイ、プリンタなどの出力装置に出力される。
【００２７】蛍光偏光解消度測定装置によって求められる偏光解消度は、１−ｒ（ｔ）と定義される。ｒ（ｔ）は、励起光照射後の経過時間に依存する蛍光異方性を示し、次式で表される。
ｒ（ｔ）＝｛ＩW （ｔ）−ＩVH（ｔ）｝／｛ＩW （ｔ）＋２ＩVH（ｔ）｝
但し、ＩW （ｔ）は蛍光強度のうち励起偏光と同じ方向の偏光の強度を、ＩVH（ｔ）は励起偏光と垂直方向の偏光の強度を、ｔは励起光照射後の経過時間をそれぞれ示す。
【００２８】検出対象遺伝子は、蛍光標識されたプライマーに比して長鎖であるので、ＰＣＲにより増幅され、蛍光標識プライマーを含む増幅遺伝子も、該プライマーに比して長鎖となる。長鎖の遺伝子分子が１回転するのに要する時間は、アニーリングしていない未反応の短鎖プライマーのそれよりも長いので、励起光照射後、蛍光異方性が消失するまでの時間は、該未反応プライマーよりも該増幅遺伝子の方が長く残存する。すなわち、ＰＣＲ反応溶液中に検出対象遺伝子が存在する場合、偏光解消度が１となるまでの励起光照射後の経過時間は、検出対象遺伝子が存在しない場合の経過時間よりも長くなる。したがって、予めブランク試験を行って、偏光解消度が１となるまでの励起光照射後の経過時間を求め、ブランク試験の結果と比較することによって、ＰＣＲ反応溶液中に検出対象遺伝子が存在するか否かを判定することができる。
【００２９】
【作用】本発明の遺伝子の検出方法によれば、蛍光色素で標識されたプライマーを用いて、検出対象となる遺伝子をＰＣＲにより増幅させることによって、蛍光色素で標識されたプライマーを含む遺伝子が増幅、生成される。また、増幅遺伝子の塩基配列上の該蛍光色素の蛍光を励起させ、該蛍光の偏光解消度を時間分解的に測定することによって、該増幅遺伝子の分子回転運動による蛍光異方性の消失を捉えることが可能となり、該増幅遺伝子の有無を判定できる。したがって、ＰＣＲにより増幅された増幅遺伝子の鋳型である検出対象遺伝子を極めて簡便に、かつ短時間で検出することができる。
【００３０】
【実施例】以下、本発明を詳細に説明するため実施例を挙げるが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【００３１】実施例１プライマーの合成成人Ｔ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−Ｉ）のプロウイルス遺伝子の検出について説明する。ＨＴＬＶ−Ｉプロウイルスは９０３２塩基よりなる遺伝子である。ここでは、該プロウイルス遺伝子の塩基配列のうちｅｎｖ領域からｐＸ領域にわたる１６２塩基対を増幅するよう一組のプライマー、Ａ（ＴＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＣＡＡＣＴＴＣＣＴ）およびＢ（ＧＡＡＣＧＣＧＡＧＴＧＣＣＧＣＧＡＧＧ）を選択した。プライマーＢについては、Applied Biosystems社の自動ＤＮＡ合成装置３８０Ｂ型を用いて合成し、エタノール沈殿の後、ＨＰＬＣで精製して得た。
【００３２】一方、プライマーＡについては、その合成および５’末端へのアミノリンク（アミノ基導入試薬、Applied Biosystems社製）の結合を上記の自動ＤＮＡ合成装置によって行った後、エタノール沈殿した。このプライマーＡに、０．５ＭのＮａＨＣＯ3 ／Ｎａ2 ＣＯ3 緩衝液（ｐＨ９．０）中にて、Ｎ−ヒドロキシサクシミド化ＲＯＸ蛍光色素（以下「ＲＯＸ−ＮＨＳ」と略称する。Applied Biosystems社製）を反応させ、エタノール沈殿の後、ＨＰＬＣによって精製した。このようにして、５’末端にＲＯＸ色素を有するプライマー（Ａ−ＲＯＸ）を得た。
【００３３】ＭＴ−１細胞からのゲノム遺伝子の抽出ＨＴＬＶ−Ｉ感染株化細胞であるＭＴ−１からＨＴＬＶ−Ｉプロウイルス遺伝子を含むゲノム遺伝子を以下のように抽出した。７×１０6 個のＭＴ−１細胞を含む１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌと１ｍＭのＥＤＴＡとを含む緩衝液（ｐＨ８．０）０．１ｍｌに、蛋白分解用緩衝液（１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２５ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム、０．１ｍｇ／ｍｌプロテナーゼＫ、ｐＨ８．０）１ｍｌを添加し、７０℃で１５分間インキュベートした。
【００３４】その後、ドデシル硫酸ナトリウムを含まない上記蛋白分解用緩衝液１ｍｌを添加し、３７℃で１６時間さらに反応を行った。反応後の溶液からＤＮＡ以外をまずフェノール、ついでフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールの混液、さらにクロロホルム／イソアミルアルコールの混液で十分に抽出し、水層を別チューブに移した後、７．５Ｍの酢酸アンモニウム１／２容と１００％エタノール２容とを添加し、遠心分離によってゲノム遺伝子を得た。７０％エタノールで洗浄した後、ペレットを乾燥し、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌと１ｍＭのＥＤＴＡとを含む緩衝液（ｐＨ８．０）０．１ｍｌに再溶解した。２６０ｎｍの吸収から計算したＤＮＡの濃度は、１．３ｍｇ／ｍｌであった。
【００３５】ＰＣＲＰＣＲは、５ピコモルの蛍光標識プライマー（Ａ−ＲＯＸ）、１００ピコモルの未標識プライマー（Ｂ）、２．５ｕｎｉｔのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を用い、１０ｎｇのＭＴ−１ゲノム遺伝子を鋳型として、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2 、２５ｍＭのＫＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ、および５０μＭのｄＮＴＰを含む反応液（ｐＨ８．３）１００μｌ中で行われた。反応条件は、変性が９４℃で１分間、アニーリングが５５℃で２分間、伸長が７２℃で１分間であり、これを３５サイクル行った。一方、ブランク試験として、鋳型となるＭＴ−１ゲノム遺伝子を含まない溶液を用い、その他の反応条件は上記と全く同一でＰＣＲを行った。
【００３６】時間分解蛍光偏光解消度の測定ＲＯＸ−ＮＨＳは、５７９ｎｍに吸収ピーク（分子吸光係数は約９５，０００ｃｍ-1・Ｍ-1）を、６０２ｎｍに蛍光ピークを有する。蛍光偏光解消度の測定を行う前に、上記の二つのＰＣＲ反応液についてＲＯＸ色素の蛍光寿命を測定した。すなわち５７０ｎｍ、１０ピコ秒の励起光パルスを照射した後の６０２ｎｍの蛍光の減衰を測定した。その結果、いずれの試料も単一指数関数的減衰を示し、その寿命（励起光照射直後の強度の１／ｅとなるまでの経過時間）は、ブランク試験液が４．６ナノ秒、ＭＴ−１ゲノム遺伝子を含む増幅液が５．２ナノ秒であった。すなわち未反応のプライマー上のＲＯＸ色素と、増幅遺伝子上のＲＯＸ色素とは、ほぼ同一の蛍光寿命を有することが確認された。
【００３７】次に、蛍光偏光解消度の測定を行った。蛍光偏光解消度測定装置として図１に示される装置を用い、励起光パルス幅約１０ピコ秒、繰り返し周期４ＭＨｚ、励起光平均出力１００ｍＷで２０秒間行った。
【００３８】偏光解消度は、上述の通り、１−ｒ（ｔ）と定義されるが、ここでは蛍光異方性を用いて説明する。表１に、ブランク試験液およびＭＴ−１ゲノム遺伝子を含む増幅液のｒ（ｔ）の測定結果を示した。表１から明らかなように、ブランク試験液では、７．７ナノ秒の時点で蛍光異方性が消失しているのに対して、ＭＴ−１ゲノム遺伝子を含む増幅反応液においては、１１．５ナノ秒の時点でも約０．１１の蛍光異方性が残存している。
【００３９】
【表１】
【００４０】表１の結果から、本実施例においては、時間分解的に、すなわち励起光照射後、約１０ナノ秒の分解時間毎に、または約１０ナノ秒を２以上の自然数で除した分解時間毎に蛍光異方性を測定することによって、増幅遺伝子の有無を極めて簡易に、かつ短時間で判定できることが判る。なお、本実施例で用いたＭＴ−１細胞のゲノム遺伝子１０ｎｇは、約５００個のＭＴ−１細胞に相当する。
【００４１】比較例１次に、実施例１と同じ試料を用いて、定常光による蛍光偏光解消度を測定した。測定装置としては、日立製作所製の蛍光分光光度計６５０−６０型を使用し、偏光特性Ｐ＝（ＩW −ＩVH）／（ＩW ＋ＩVH）を測定した。ここでＩW は励起光の偏光面を測定蛍光偏光面と平行にしたときの蛍光強度であり、ＩVHは同じく垂直にしたときの蛍光強度である。励起光波長、蛍光測定波長、ＨＴＬＶ−Ｉプロウイルス遺伝子を含む増幅反応液の調製、ブランク試験液の調製などの条件は、実施例１とまったく同一である。但し、Ｐの値は試料の濃度によって若干変化するので、いずれの試料もＩW の値が０．２付近となる濃度で測定を行った。
【００４２】その結果、ブランク試験液およびＨＴＬＶ−Ｉプロウイルス遺伝子を含む増幅反応液についてのＰ値として、それぞれ０．２３５±０．０２３および０．２５４±０．０３３という値が得られ、両者に有意差は認められなかった。
【００４３】このように定常光蛍光偏光解消度の測定では、増幅されたＨＴＬＶ−Ｉプロウイルス遺伝子の分子回転運動による蛍光異方性の消失を捉えることができず、偏光特性が平均化されて測定されるので、該プロウイルス遺伝子とブランク試験液中の未反応プライマーとを区別することは困難である。
【００４４】
【発明の効果】以上のように、本発明の遺伝子の検出方法によれば、極めて容易に、かつ短時間で遺伝子を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ピコ秒時間分解蛍光偏光解消度測定システムの基本構成を例示する。
【符号の説明】
１：モード同期アルゴンイオンレーザ
２：ＣＷ色素レーザ
３：キャビティーダンパ
４：ビームスプリッタ
５：ＰＩＮホトダイオード
６：時間遅延ケーブルユニット
７：ＮＤフィルタ
８：パビネソレイユ補償板
９：集光レンズ
１０：試料室
１１：蛍光集光レンズ
１２：偏光子
１３：蛍光フォーカス用レンズ
１４：偏光解消板
１５：分光器
１６：シンクロスキャンストリークカメラ
１７：ＳＩＴカメラ
１８：データプロセッサ
１９：フロッピーディスク駆動装置
２０：コンピュータ
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、微量の遺伝子の検出方法に関するものであり、その主たる利用分野としては、医学、法医学、獣医学などの分野における遺伝子検査、および生化学、生物学、薬理学、農学、さらには考古学の分野における遺伝子測定が挙げられる。
【０００２】
【従来の技術】ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（以下「ＰＣＲ」という。）は、微量の遺伝子を指数関数的に増幅させる反応であり、近年、遺伝子の検出やクローニングに多用されている。特に、数分子から数千分子の極微量遺伝子の検出は、本法をもって初めて可能になったと言える。
【０００３】検出対象となる遺伝子（以下「検出対象遺伝子」ともいう。）を鋳型としてＰＣＲにより増幅された遺伝子（以下「増幅遺伝子」という。）の測定について、多数の方法が開発されているが、その中でも頻繁に用いられる方法としては、
【０００４】
【０００５】
【０００６】
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】以上のように、ＰＣＲ反応溶液中の増幅遺伝子の検出に関する従来の方法は、いずれも繁雑である。特に、感度および特異性に優れたサザンブロット法においては、電気泳動、膜への転写、プローブとのハイブリダイゼーション、標識の測定などと多くの工程、時間および繁雑な操作を要する。したがって、本発明の目的は、従来の方法に比べて、簡便で迅速な遺伝子の検出方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明の遺伝子の検出方法は、蛍光色素で標識されたプライマーを用いて、検出対象遺伝子をＰＣＲにより増幅させた後に、増幅遺伝子が有する該蛍光色素の蛍光偏光解消度を時間分解的に測定することを特徴とする。
【０００９】本発明方法においては、まず（１）検出対象となる遺伝子（ＰＣＲにより増幅される鋳型となる遺伝子）に対して相補性を有するプライマーを作成し、該プライマーを蛍光色素で標識して、蛍光標識プライマーを準備することが必要である。次に、（２）該プライマーを用いて、検出対象となる遺伝子を鋳型とするＰＣＲを実施し、（３）ＰＣＲ終了後に、増幅遺伝子について該蛍光色素の蛍光偏光解消度を時間分解的に測定する。以下これらの各工程について詳しく説明する。
【００１０】まず、蛍光標識プライマーの作成について述べる。プライマーは、検出対象遺伝子の各一本鎖のＤＮＡにそれぞれ特異的にハイブリダイズして、ＰＣＲの開始点（ＰＣＲによる増幅反応後の二本鎖の増幅遺伝子の両末端）となる二種類の遺伝子断片であるので、以下の条件を満足するものでなければならない。
【００１１】検出対象遺伝子の塩基配列の中から該遺伝子のみに特異的な塩基配列を検索し、その中から一組（二種類）のプライマーを選択する。但し、プライマー同士の相補鎖生成を避けるために、二種類のプライマーの３’側が相補性を有しないこと、プライマー内にパリンドロームを形成しないことなどに注意して、プライマーの配列を選択することが必要である。プライマーの長さは、特に限定されないが、通常は１０塩基〜４０塩基、好ましくは１５塩基〜３０塩基である。
【００１２】検出対象遺伝子の塩基配列のうち二種類のプライマーに挟まれる塩基配列の領域が、ＰＣＲにより増幅される領域（以下「ＰＣＲ増幅領域」という。）となる。このＰＣＲ増幅領域の鎖長は、特に限定されないが、通常は５０塩基〜５０００塩基、好ましくは１００塩基〜２０００塩基となるように二種類のプライマーを選択することが望ましい。なお、通常は、検出対象遺伝子の一部の領域がＰＣＲ増幅領域となるが、特に検出対象遺伝子が短鎖である場合には、その全領域がＰＣＲ増幅領域となることもあり得る。
【００１３】このように設計、作成されたプライマーに蛍光色素を結合させる方法としては、プライマーの５’末端にアミノ基などの官能基をまず導入し、該官能基と結合できるように修飾された蛍光色素を反応させる方法が、一般的に用いられる（上記“ＰＣＲ実験マニュアル”８９頁参照）。これとは別に、プライマーをＤＮＡ合成装置で合成する際に、蛍光色素で標識されたヌクレオチド三リン酸を取り込ませる方法もある。前者の方法では、蛍光色素が５’末端のみに導入されるのに対して、後者の方法では、プライマーの鎖の中にいくつかの蛍光色素が導入される。なお、２種類のプライマーのうち少なくとも一方のプライマーに蛍光色素を結合させればよい。
【００１４】蛍光色素としては、フルオレシン、ローダミンなどが例示され、例えばフルオレシン・イソチオシアネートは、チオクルドミド結合を介してプライマーに結合する。
【００１５】次に、蛍光標識プライマーを用いたＰＣＲ法について説明する。まず、検出対象遺伝子を９２℃〜９６℃で１０秒〜３分間加熱して熱変性させ、一本鎖のＤＮＡとする。その後、蛍光標識プライマーを一本鎖のＤＮＡにアニーリングする。アニーリングは、５５℃〜７２℃で１０秒〜３分間加熱して行われる。さらに、塩基の存在下で、上記のポリメラーゼを用いて、７０℃〜７３℃で３０秒〜３分間加熱して、プライマーの伸長反応を行う。
【００１６】伸長反応に用いられるポリメラーゼとしては、特に限定されるものではないが、通常はTaq ＤＮＡポリメラーゼが用いられる。また、ポリメラーゼの基質となる塩基は、デオキシヌクレオチド5'−トリフォスフェート[dNTP]、すなわち、アデニン、グアニン、シトシンおよびチミンである。
【００１７】以上の工程を経ることによって、検出対象遺伝子の一部または全領域（ＰＣＲ増幅領域）の遺伝子の複製が行われ、さらに上記の熱変性、アニーリングおよびプライマーの伸長反応を順次複数回行うことによって、ＰＣＲ増幅領域の遺伝子の増幅が行われる。ＰＣＲのサイクル数は、通常は１０回〜５０回、好ましくは２０回〜３５回である。
【００１８】標準的なＰＣＲ仕込み液の組成は以下の通りである。
所定量の検出対象遺伝子０．５ｍＭ〜５００ｍＭのＫＣｌ１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３）
０．２５ｍＭ〜１５ｍＭのＭｇＣｌ2０．１重量％ゼラチン２０μＭ〜２００μＭの各ｄＮＴＰ０．０１μＭ〜１μＭの蛍光標識プライマー１ｕｎｉｔ〜３ｕｎｉｔのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
【００１９】ＰＣＲが終了した後の反応溶液は、そのまま、あるいは必要ならばエタノール沈殿によってＤＮＡ分画のみを分離した後、適当な溶媒に再溶解して、時間分解的な蛍光偏光解消度の測定に供される。また、適当なカラムによって未反応の蛍光標識プライマーを分離除去し、増幅遺伝子のみを該測定に供することも可能である。多くの場合、ＰＣＲ反応溶液をそのまま該測定に供することが可能である。
【００２０】次に、蛍光偏光解消度を時間分解的に測定する方法について説明する。図１は、時間分解蛍光偏光解消度測定装置の基本構成の一例を示す図である。モード同期アルゴンイオンレーザ１によって駆動されたＣＷ色素レーザ２とキャビティーダンパ３とから、ピコ秒単位でパルスを発振できる波長可変な色素レーザ共振器が構成される。該共振器のパルス幅は、通常、５ピコ秒〜２０ピコ秒であり、パルスの繰り返し周期は、通常、８２ＭＨｚ〜０．８ＭＨｚである。
【００２１】該共振器から発せられたレーザ光の一部が、ビームスプリッタ４によって分岐されて、ＰＩＮホトダイオード５に入射する。入射したレーザ光は、ＰＩＮホトダイオード５によって光電変換され、入射光と同期したトリガ信号として、時間遅延ケーブルユニット６を経由して、シンクロスキャンストリークカメラ１６に送信される。時間遅延ケーブルユニット６は、該トリガ信号と後述の蛍光信号との時間関係の調節に用いられる。
【００２２】一方、該共振器から発せられたレーザ光のうちビームスプリッタ４を透過したレーザ光は、ＮＤ（neutral density ）フィルタ７によって適当な強度に減衰された後、パビネソレイユ補償板８によって偏光化され、集光レンズ９によって、ＰＣＲ反応溶液が充填された試料室１０に入射する。入射したレーザ光は、蛍光標識プライマーを含む増幅遺伝子の蛍光を励起させる励起光として作用する。
【００２３】試料室１０から出射した蛍光は、蛍光集光レンズ１１によって集められて平行ビームとなる。平行化された蛍光ビームは、偏光子１２を透過することによって、蛍光ビームの偏光方向が励起光の偏光方向と平行な場合と垂直な場合の二通りに分光可能となる。
【００２４】偏光子１２を透過したビームは、蛍光フォーカス用レンズ１３によって、入射口側に偏光解消板１４が設けられた分光器１５の入射スリットに集光される。分光器１５によって分光された蛍光は、分光器１５の出射口を経てシンクロスキャンストリークカメラ１６の入射スリットに結像される。なお、偏光解消板１４は、分光器１５中の回析格子やカメラ１６の光電変換面が有する望ましくない偏光特性をキャンセルする。
【００２５】カメラ１６によって光電変換された蛍光信号は、時間遅延ケーブルユニット６によって時間分解される。すなわち、ユニット６からのトリガー信号が、カメラ１６をストリーク掃引させることによって、レーザ光発振（励起光照射）後、予め定められた時間経過毎に分解された蛍光信号が、それぞれ選択される。励起光照射後の分解時間幅としては、後述の蛍光偏光解消度が１となる時間よりも短ければ特に限定されないが、通常は、０．１ナノ秒〜１０００ナノ秒、好ましくは１ナノ秒〜１００ナノ秒である。
【００２６】時間分解された蛍光信号は、二次元画像（時間−波長）としてＳＩＴ（Silicon Intensified Target) カメラ１７により撮像された後、デジタル信号としてデータプロセッサ１８中のメモリやフロッピーディスク駆動装置１９中のフロッピーディスクの記憶領域に蓄えられる。このデータは、データ処理を行うためのコンピュータ２０によって演算解析され、その演算結果は、図示しないディスプレイ、プリンタなどの出力装置に出力される。
【００２７】蛍光偏光解消度測定装置によって求められる偏光解消度は、１−ｒ（ｔ）と定義される。ｒ（ｔ）は、励起光照射後の経過時間に依存する蛍光異方性を示し、次式で表される。
ｒ（ｔ）＝｛ＩW （ｔ）−ＩVH（ｔ）｝／｛ＩW （ｔ）＋２ＩVH（ｔ）｝
但し、ＩW （ｔ）は蛍光強度のうち励起偏光と同じ方向の偏光の強度を、ＩVH（ｔ）は励起偏光と垂直方向の偏光の強度を、ｔは励起光照射後の経過時間をそれぞれ示す。
【００２８】検出対象遺伝子は、蛍光標識されたプライマーに比して長鎖であるので、ＰＣＲにより増幅され、蛍光標識プライマーを含む増幅遺伝子も、該プライマーに比して長鎖となる。長鎖の遺伝子分子が１回転するのに要する時間は、アニーリングしていない未反応の短鎖プライマーのそれよりも長いので、励起光照射後、蛍光異方性が消失するまでの時間は、該未反応プライマーよりも該増幅遺伝子の方が長く残存する。すなわち、ＰＣＲ反応溶液中に検出対象遺伝子が存在する場合、偏光解消度が１となるまでの励起光照射後の経過時間は、検出対象遺伝子が存在しない場合の経過時間よりも長くなる。したがって、予めブランク試験を行って、偏光解消度が１となるまでの励起光照射後の経過時間を求め、ブランク試験の結果と比較することによって、ＰＣＲ反応溶液中に検出対象遺伝子が存在するか否かを判定することができる。
【００２９】
【作用】本発明の遺伝子の検出方法によれば、蛍光色素で標識されたプライマーを用いて、検出対象となる遺伝子をＰＣＲにより増幅させることによって、蛍光色素で標識されたプライマーを含む遺伝子が増幅、生成される。また、増幅遺伝子の塩基配列上の該蛍光色素の蛍光を励起させ、該蛍光の偏光解消度を時間分解的に測定することによって、該増幅遺伝子の分子回転運動による蛍光異方性の消失を捉えることが可能となり、該増幅遺伝子の有無を判定できる。したがって、ＰＣＲにより増幅された増幅遺伝子の鋳型である検出対象遺伝子を極めて簡便に、かつ短時間で検出することができる。
【００３０】
【実施例】以下、本発明を詳細に説明するため実施例を挙げるが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【００３１】実施例１プライマーの合成成人Ｔ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−Ｉ）のプロウイルス遺伝子の検出について説明する。ＨＴＬＶ−Ｉプロウイルスは９０３２塩基よりなる遺伝子である。ここでは、該プロウイルス遺伝子の塩基配列のうちｅｎｖ領域からｐＸ領域にわたる１６２塩基対を増幅するよう一組のプライマー、Ａ（ＴＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＣＡＡＣＴＴＣＣＴ）およびＢ（ＧＡＡＣＧＣＧＡＧＴＧＣＣＧＣＧＡＧＧ）を選択した。プライマーＢについては、Applied Biosystems社の自動ＤＮＡ合成装置３８０Ｂ型を用いて合成し、エタノール沈殿の後、ＨＰＬＣで精製して得た。
【００３２】一方、プライマーＡについては、その合成および５’末端へのアミノリンク（アミノ基導入試薬、Applied Biosystems社製）の結合を上記の自動ＤＮＡ合成装置によって行った後、エタノール沈殿した。このプライマーＡに、０．５ＭのＮａＨＣＯ3 ／Ｎａ2 ＣＯ3 緩衝液（ｐＨ９．０）中にて、Ｎ−ヒドロキシサクシミド化ＲＯＸ蛍光色素（以下「ＲＯＸ−ＮＨＳ」と略称する。Applied Biosystems社製）を反応させ、エタノール沈殿の後、ＨＰＬＣによって精製した。このようにして、５’末端にＲＯＸ色素を有するプライマー（Ａ−ＲＯＸ）を得た。
【００３３】ＭＴ−１細胞からのゲノム遺伝子の抽出ＨＴＬＶ−Ｉ感染株化細胞であるＭＴ−１からＨＴＬＶ−Ｉプロウイルス遺伝子を含むゲノム遺伝子を以下のように抽出した。７×１０6 個のＭＴ−１細胞を含む１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌと１ｍＭのＥＤＴＡとを含む緩衝液（ｐＨ８．０）０．１ｍｌに、蛋白分解用緩衝液（１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２５ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム、０．１ｍｇ／ｍｌプロテナーゼＫ、ｐＨ８．０）１ｍｌを添加し、７０℃で１５分間インキュベートした。
【００３４】その後、ドデシル硫酸ナトリウムを含まない上記蛋白分解用緩衝液１ｍｌを添加し、３７℃で１６時間さらに反応を行った。反応後の溶液からＤＮＡ以外をまずフェノール、ついでフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールの混液、さらにクロロホルム／イソアミルアルコールの混液で十分に抽出し、水層を別チューブに移した後、７．５Ｍの酢酸アンモニウム１／２容と１００％エタノール２容とを添加し、遠心分離によってゲノム遺伝子を得た。７０％エタノールで洗浄した後、ペレットを乾燥し、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌと１ｍＭのＥＤＴＡとを含む緩衝液（ｐＨ８．０）０．１ｍｌに再溶解した。２６０ｎｍの吸収から計算したＤＮＡの濃度は、１．３ｍｇ／ｍｌであった。
【００３５】ＰＣＲＰＣＲは、５ピコモルの蛍光標識プライマー（Ａ−ＲＯＸ）、１００ピコモルの未標識プライマー（Ｂ）、２．５ｕｎｉｔのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を用い、１０ｎｇのＭＴ−１ゲノム遺伝子を鋳型として、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2 、２５ｍＭのＫＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ、および５０μＭのｄＮＴＰを含む反応液（ｐＨ８．３）１００μｌ中で行われた。反応条件は、変性が９４℃で１分間、アニーリングが５５℃で２分間、伸長が７２℃で１分間であり、これを３５サイクル行った。一方、ブランク試験として、鋳型となるＭＴ−１ゲノム遺伝子を含まない溶液を用い、その他の反応条件は上記と全く同一でＰＣＲを行った。
【００３６】時間分解蛍光偏光解消度の測定ＲＯＸ−ＮＨＳは、５７９ｎｍに吸収ピーク（分子吸光係数は約９５，０００ｃｍ-1・Ｍ-1）を、６０２ｎｍに蛍光ピークを有する。蛍光偏光解消度の測定を行う前に、上記の二つのＰＣＲ反応液についてＲＯＸ色素の蛍光寿命を測定した。すなわち５７０ｎｍ、１０ピコ秒の励起光パルスを照射した後の６０２ｎｍの蛍光の減衰を測定した。その結果、いずれの試料も単一指数関数的減衰を示し、その寿命（励起光照射直後の強度の１／ｅとなるまでの経過時間）は、ブランク試験液が４．６ナノ秒、ＭＴ−１ゲノム遺伝子を含む増幅液が５．２ナノ秒であった。すなわち未反応のプライマー上のＲＯＸ色素と、増幅遺伝子上のＲＯＸ色素とは、ほぼ同一の蛍光寿命を有することが確認された。
【００３７】次に、蛍光偏光解消度の測定を行った。蛍光偏光解消度測定装置として図１に示される装置を用い、励起光パルス幅約１０ピコ秒、繰り返し周期４ＭＨｚ、励起光平均出力１００ｍＷで２０秒間行った。
【００３８】偏光解消度は、上述の通り、１−ｒ（ｔ）と定義されるが、ここでは蛍光異方性を用いて説明する。表１に、ブランク試験液およびＭＴ−１ゲノム遺伝子を含む増幅液のｒ（ｔ）の測定結果を示した。表１から明らかなように、ブランク試験液では、７．７ナノ秒の時点で蛍光異方性が消失しているのに対して、ＭＴ−１ゲノム遺伝子を含む増幅反応液においては、１１．５ナノ秒の時点でも約０．１１の蛍光異方性が残存している。
【００３９】
【表１】
【００４０】表１の結果から、本実施例においては、時間分解的に、すなわち励起光照射後、約１０ナノ秒の分解時間毎に、または約１０ナノ秒を２以上の自然数で除した分解時間毎に蛍光異方性を測定することによって、増幅遺伝子の有無を極めて簡易に、かつ短時間で判定できることが判る。なお、本実施例で用いたＭＴ−１細胞のゲノム遺伝子１０ｎｇは、約５００個のＭＴ−１細胞に相当する。
【００４１】比較例１次に、実施例１と同じ試料を用いて、定常光による蛍光偏光解消度を測定した。測定装置としては、日立製作所製の蛍光分光光度計６５０−６０型を使用し、偏光特性Ｐ＝（ＩW −ＩVH）／（ＩW ＋ＩVH）を測定した。ここでＩW は励起光の偏光面を測定蛍光偏光面と平行にしたときの蛍光強度であり、ＩVHは同じく垂直にしたときの蛍光強度である。励起光波長、蛍光測定波長、ＨＴＬＶ−Ｉプロウイルス遺伝子を含む増幅反応液の調製、ブランク試験液の調製などの条件は、実施例１とまったく同一である。但し、Ｐの値は試料の濃度によって若干変化するので、いずれの試料もＩW の値が０．２付近となる濃度で測定を行った。
【００４２】その結果、ブランク試験液およびＨＴＬＶ−Ｉプロウイルス遺伝子を含む増幅反応液についてのＰ値として、それぞれ０．２３５±０．０２３および０．２５４±０．０３３という値が得られ、両者に有意差は認められなかった。
【００４３】このように定常光蛍光偏光解消度の測定では、増幅されたＨＴＬＶ−Ｉプロウイルス遺伝子の分子回転運動による蛍光異方性の消失を捉えることができず、偏光特性が平均化されて測定されるので、該プロウイルス遺伝子とブランク試験液中の未反応プライマーとを区別することは困難である。
【００４４】
【発明の効果】以上のように、本発明の遺伝子の検出方法によれば、極めて容易に、かつ短時間で遺伝子を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ピコ秒時間分解蛍光偏光解消度測定システムの基本構成を例示する。
【符号の説明】
１：モード同期アルゴンイオンレーザ
２：ＣＷ色素レーザ
３：キャビティーダンパ
４：ビームスプリッタ
５：ＰＩＮホトダイオード
６：時間遅延ケーブルユニット
７：ＮＤフィルタ
８：パビネソレイユ補償板
９：集光レンズ
１０：試料室
１１：蛍光集光レンズ
１２：偏光子
１３：蛍光フォーカス用レンズ
１４：偏光解消板
１５：分光器
１６：シンクロスキャンストリークカメラ
１７：ＳＩＴカメラ
１８：データプロセッサ
１９：フロッピーディスク駆動装置
２０：コンピュータ
【特許請求の範囲】
【請求項１】 蛍光色素で標識されたプライマーを用いて、検出対象となる遺伝子をポリメラーゼ・チェイン・リアクションにより増幅させた後に、増幅された遺伝子が有する該蛍光色素の蛍光偏光解消度を時間分解的に測定することを特徴とする遺伝子の検出方法。
【請求項１】 蛍光色素で標識されたプライマーを用いて、検出対象となる遺伝子をポリメラーゼ・チェイン・リアクションにより増幅させた後に、増幅された遺伝子が有する該蛍光色素の蛍光偏光解消度を時間分解的に測定することを特徴とする遺伝子の検出方法。
【図１】
【公開番号】特開平７−１７７８９９
【公開日】平成７年（１９９５）７月１８日
【国際特許分類】
【出願番号】特願平５−３２７５２８
【出願日】平成５年（１９９３）１２月２４日
【出願人】（５９２０２６３３６）株式会社バイオセンサー研究所 (1)
【公開日】平成７年（１９９５）７月１８日
【国際特許分類】
【出願日】平成５年（１９９３）１２月２４日
【出願人】（５９２０２６３３６）株式会社バイオセンサー研究所 (1)
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