遺伝子発現レベルを指標とした化学物質の生体に対する影響の検出・予測方法
【課題】血液学的手法または病理学的手法による腎臓毒性の検出は指標（マーカー）が限られているため、その評価が困難である。
【解決手段】外部環境の変化による生体内の遺伝子発現変化は鋭敏であるため、生体毒性を判別するための遺伝子セットを同定することは、生体毒性が起こる前におよびそれが病理学的検査により実証される前に生体毒性を迅速かつ正確に検出することが可能である。本発明は、その新たな遺伝子セットを用いた生体毒性の検出・予測方法、そのキット、生体毒性の処置方法及び生体毒性の候補薬剤確認方法を提供する。
【解決手段】外部環境の変化による生体内の遺伝子発現変化は鋭敏であるため、生体毒性を判別するための遺伝子セットを同定することは、生体毒性が起こる前におよびそれが病理学的検査により実証される前に生体毒性を迅速かつ正確に検出することが可能である。本発明は、その新たな遺伝子セットを用いた生体毒性の検出・予測方法、そのキット、生体毒性の処置方法及び生体毒性の候補薬剤確認方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学物質が生体に与える影響、生体毒性の検出、診断、予測および/もしくは処置のための方法、および、生体毒性を検出又は予測するためのキットに関する。特に、本発明は、化学物質が生体に与える影響を指標とした化学物質の毒性の検出・予測方法、腎臓毒性の処置の有効性を確認することを助けるための遺伝子発現解析手段およびその結果の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
我が国では、環境と調和した健全な産業活動及び安心・安全な国民生活の実現を目指した化学物質リスク評価・管理システムの構築へ向け、公的な環境安心イノベーションプログラムが進められている。
【０００３】
人類が生活する環境の中で、膨大な数の化学物質が利用されており、現在でも年々新しい化学物質が開発され続けている。しかしながら、これらの化学物質が環境中に放出されることにより、人体を含む生態系に有害な影響を及ぼすことが問題となっており、特に化学物質による環境汚染による人体への影響は社会問題にまでなっている。したがって、化学物質のリスク（特に人体に与える影響）を評価することは社会的な要請が強い。
【０００４】
これまでの化学物質のリスク評価は、細菌等を用いた単純で簡便な試験、及び、ラット等の実験動物を用いた長期毒性試験によって取得・蓄積されてきた知見を、その基盤としていた。
【０００５】
しかし、これらの従来の毒性学的な手法によって獲得される生物学的情報は知見の種類が限られること、並びに、長期毒性試験では費用と効率等の面で問題があることから、これらの課題を解決できる新規の手法の確立が必要であった。
【０００６】
近年、急速な発展を見せるゲノム学的なアプローチが、薬剤の有効性評価（ファーマコゲノミクス）（非特許文献１、非特許文献２）、食物の生体への影響評価（ニュートリゲノミクス）（非特許文献３）等と同様に、化学物質の生物学的活性（特にその有害性）の評価にも応用され始めてきた（トキシコゲノミクス）（非特許文献４、非特許文献５）。
【０００７】
これらのゲノム学的手法は、全遺伝子を個々のパラメータとして活用できるという、従来の手法では得られない膨大かつ多様な観点による生物学的現象の評価を可能にした。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００４−２３３１０５号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Alison H. Harrill et al., ExpertOpin. Drug Metab. Tosicol. November；４（１１）：１３７９−１３８９（２００８）
【非特許文献２】Elisa Giovannetti et al., Mol. CancerTher. ５（６）：１３８７−１３９４（２００６）
【非特許文献３】Licia Iacoviello et al., Genes Nutr. ３：１９−２４（２００８）
【非特許文献４】Preeti Chavan et al., Evid BasedComplement Alternat Med. Dec；３（４）：４４７−４５７（２００６）
【非特許文献５】渡邉肇 YAKUGAKU ZASSHI：１２７（１２）：１９６７−１９７４（２００７）
【非特許文献６】Paolo Fortina et al., Nature Biotech.２６：２９３−２９４（２００８）
【非特許文献７】Gary K Geiss et al., Nature Biotech. ２６：３１７−３２５（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は化学物質の毒性を簡便かつ確実に検出するための指標の一つを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、既存化学物質毒性データベース（http://dra4.nihs.go.jp/mhlw_data/jsp/SearchPage.jsp）に登録されているうちから腎臓毒性を有することが知られている化学物質を投与したラットの腎臓と正常ラットの腎臓における遺伝子発現を網羅的に比較することにより、両者間で発現レベルに差がある遺伝子を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、（１）化学物質が生体に与える影響を遺伝子発現レベルで検出することにより被検化学物質の毒性を検出する方法であって、（Ａ）前記化学物質の曝露を受けた腎臓組織または腎臓由来の細胞試料に対して、生体応答遺伝子群： (1)ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 1、(2)AHNAK nucleoprotein、(3)alpha 1,3-galactosyltransferase 2、(4)alpha-2-macroglobulin、(5)annexin A2、(6)aquaporin 6, kidney specific、(7)calbindin 1、(8)camello-like 1、(9)cathepsin D、(10)CD24 molecule、(11)Cd44 molecule、(12)claudin 3、(13)collagen triple helix repeat containing 1、(14)cysteine sulfinic acid decarboxylase、(15)deiodinase, iodothyronine, type I、(16)deleted in colorectal carcinoma、(17)deoxyribonuclease I、(18)fibrinogen beta chain、(19)flavin containing monooxygenase 3、(20)glutamate-cysteine ligase, catalytic subunit、(21)glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、(22)glycoprotein (transmembrane) nmb、(23)histamine N-methyltransferase、(24)hypothetical protein LOC56728、(25)kallikrein、(26)kidney androgen regulated protein、(27)lectin, galactoside-binding, soluble, 3、(28)matrix Gla protein、(29)oxidative stress induced growth inhibitor 1、(30)paternally expressed 12、(31)protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 1A、(32)RAS, dexamethasone-induced 1、(regucalcin (senescence marker protein-30)、(33)regucalcin (senescence marker protein-30)、(34)S100 calcium binding protein A10、(35)S100 calcium binding protein A6、(36)secreted phosphoprotein 2、(37)serine (or cysteine) peptidase inhibitor, clade A, member 3K、(38)similar to CPE-receptor、(39)similar to tumor necrosis factor receptor superfamily, mber 12a、(40)solute carrier family 22 (organic cation transporter), member 2、(41)solute carrier family 34 (sodium phosphate), member 2、(42)solute carrier family 4 (anion exchanger), member 1、(43)suppressor of cytokine signaling 3、(44)thymosin, beta 10、(45)tonin、(46)translin、(47)trefoil factor 3, intestinal、(48)ubiquitin D、(49)uromodulinのうちから選択される少なくとも１以上の生体応答遺伝子に対する遺伝子発現レベルを測定する第１の遺伝子発現レベル測定ステップと、
（Ｂ）前記化学物質の曝露を受けていない腎臓組織または腎臓由来の細胞試料に対して、前記第１の遺伝子発現レベル取得ステップにおいて選択された前記生体応答遺伝子のそれぞれに対する遺伝子発現レベルを測定する第２の遺伝子発現レベル測定ステップと、
（Ｃ）前記第１の遺伝子発現データレベル測定ステップ及び前記第２の遺伝子発現データレベル測定ステップにおける前記遺伝子発現レベルを比較するステップと、
を含むことを特徴とする化学物質の毒性の検出方法である。
【００１３】
また、（２）前記（１）に記載の方法であって、前記第１の遺伝子発現レベル取得ステップにおいて、選択される少なくとも１以上の前記生体応答遺伝子は、
（１）ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 1、（２）alpha 1,3-galactosyltransferase 2、（３）alpha-2-macroglobulin、（４）annexin A2、（５）aquaporin 6, kidney specific、（６）calbindin 1、（７）cathepsin D、（８）CD24 molecule、（９）Cd44 molecule、（１０）claudin 3、（１１）cysteine sulfinic acid decarboxylase、（１２）deoxyribonuclease I、（１３）fibrinogen beta chain、（１４）glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、（１５）glycoprotein (transmembrane) nmb、（１６）lectin, galactoside-binding, soluble, 3、（１７）matrix Gla protein、（１８）oxidative stress induced growth inhibitor 1、（１９）RAS, dexamethasone-induced 1、（２０）S100 calcium binding protein A10、（２１）secreted phosphoprotein 2、（２２）similar to CPE-receptor、（２３）similar to tumor necrosis factor receptor superfamily, mber 12a、（２４）solute carrier family 34 (sodium phosphate), member 2、（２５）solute carrier family 4 (anion exchanger), member 1、（２６）suppressor of cytokine signaling 3、（２７）thymosin, beta 10、（２８）translin、のうちの少なくともいずれか１つを含むことが望ましい。
【００１４】
また、（３）前記腎臓組織または前記細胞試料は、マウス、ラット、イヌ、サルまたはヒト由来であることを特徴とする、（１）または（２）のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性の検出方法であってもよい。
【００１５】
また、（４）遺伝子発現レベルの測定は、ＲＴ-ＰＣＲ法、iAFLP（introduced Amplified Fragment Length Polymorphism）法、LAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法、nCounter Analysis system、ハイブリダイゼーション法のうちの１つを用いることを特徴とする（１）または（２）のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性の検出方法であってもよい。
【００１６】
また、（５）前記ハイブリダイゼーション法は、マイクロアレイ法又はブロット法であることを特徴とする（１）または（２）のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性の検出方法であってもよい。
【００１７】
また、（６）前記マイクロアレイ法又はブロット法に用いられるプローブは、ヌクレオチド又はタンパク質であることを特徴とする（５）に記載の化学物質の毒性の検出方法であってもよい。
【００１８】
また、（７）前記ヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチドであることを特徴とする（６）に記載の化学物質の毒性の検出方法であってもよい。
【００１９】
また、（８）前記ヌクレオチドは、標識化ヌクレオチドであることを特徴とする（６）または（７）に記載の化学物質の毒性の検出方法であってもよい。
【００２０】
また、（９）前記遺伝子発現レベルの測定を前記生体応答遺伝子に対応する核酸又は前記生体応答遺伝子によってコードされるタンパク質の存在もしくは量を測定することで決定することを特徴とする（１）または（２）のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性の検出方法であってもよい。
【００２１】
また、（１０）前記遺伝子発現レベルの測定を免疫学的方法によって行うことを特徴とする（１）または（２）のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性の検出方法であっってもよい。
【００２２】
また、（１１）前記免疫学的方法は、前記生体応答遺伝子によってコードされるタンパク質又はその断片に対する特異抗体と標的タンパク質との免疫学的複合体を検出する方法であることを特徴とする（１０）に記載の化学物質の毒性の検出方法であってもよい。
【００２３】
また、（１２）前記特異抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、および抗体フラグメントから選択されることを特徴とする（１１）に記載の化学物質の毒性の検出方法。
【００２４】
また、本発明は（１３）（１）または（２）のうちのいずれか１つに記載の方法に用いられるプローブを含むキットであって、該プローブが、前記生体応答遺伝子に特異的にハイブリダイズする配列を有する分子を含むことを特徴とする化学物質の毒性の検出キットである。
【００２５】
また、（１４）前記プローブは、ヌクレオチド又はタンパク質であることを特徴とする（１３）記載の化学物質の毒性の検出キットであってもよい。
【００２６】
また、（１５）前記ヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチドであることを特徴とする（１４）に記載の化学物質の毒性の検出キットであってもよい。
【００２７】
また、（１６）前記ヌクレオチドは、前記生体応答遺伝子のセンス鎖又はアンチセンス鎖とハイブリダイズし、10〜100 merであることを特徴とする（１４）に記載の化学物質の毒性の検出キットであってもよい。
【００２８】
また、（１７）前記ヌクレオチドは、標識化ヌクレオチドであることを特徴とする（１５）または（１６）に記載の化学物質の毒性の検出キットであってもよい。
【００２９】
また、（１８）前記プローブは、抗体及び/又はアプタマーであるタンパク質であることを特徴とする（１４）に記載の化学物質の毒性の検出・予測キットであってもよい。
【００３０】
また、（１９）前記プローブは、少なくとも1つ以上を固体支持体に固定したＤＮＡマイクロアレイ、ＤＮＡチップ、タンパクチップまたは抗体チップを含むことを特徴とする（１３）ないし（１８）のうちの１つに記載の化学物質の毒性の検出キットであってもよい。
【００３１】
また、（２０）前記固体支持体は、ガラス、シリコン、プラスチック又は生体膜であることを特徴とする（１９）記載の化学物質の毒性の検出キットであってもよい。
【００３２】
また、本発明は（２１）化学物質が生体に与える影響を遺伝子発現レベルで検出することにより被検化学物質の毒性を検出するために用いられる照合データとしての遺伝子発現データベースを作成する方法であって、
（Ａ）2−ブタノンオキシム、ｍ−キシリレンジアミン、3-シアノピリジン、2−（2−アミノエチルアミノ）エタノール、テトラヒドロフルフリルアルコール、メタクリルアミド、スルホラン、2-イソプロポキシエタノール、ヒドラジン一水和物、4-エチルモルホリン、メタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド、塩化ベンジルトリメチルアンモニウム、ｍ-ニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム、1-ナフチルアミン-4-スルホン酸ナトリウム四水和物、3-メトキシ-3-メチル-1-ブタノール、o-ジクロロベンゼン、3,4-キシリジン、N-メチルアニリン、トリレンジイソシアナート、2-（ジブチルアミノ）エタノール、ｐ-クミルフェノール、ｍ-クレゾール、2,3-ジメチルアニリン、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド、フタル酸ジヘプチル、テトラブロモエタン、アジピン酸ジブチル、P-エチルフェノール、ο-t-ブチルフェノールおよびｐ-（1,1,3,3,-テトラメチルブチル）フェノールのそれぞれについて所定量を所定期間生体または腎臓由来の細胞試料に投与（曝露）するステップと、
（Ｂ）前記生体の腎臓組織または前記腎臓由来の前記細胞試料からｍＲＮＡを単離して、生体応答遺伝子群： (1)ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 1、(2)AHNAK nucleoprotein、(3)alpha 1,3-galactosyltransferase 2、(4)alpha-2-macroglobulin、(5)annexin A2、(6)aquaporin 6, kidney specific、(7)calbindin 1、(8)camello-like 1、(9)cathepsin D、(10)CD24 molecule、(11)Cd44 molecule、(12)claudin 3、(13)collagen triple helix repeat containing 1、(14)cysteine sulfinic acid decarboxylase、(15)deiodinase, iodothyronine, type I、(16)deleted in colorectal carcinoma、(17)deoxyribonuclease I、(18)fibrinogen beta chain、(19)flavin containing monooxygenase 3、(20)glutamate-cysteine ligase, catalytic subunit、(21)glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、(22)glycoprotein (transmembrane) nmb、(23)histamine N-methyltransferase、(24)hypothetical protein LOC56728、(25)kallikrein、(26)kidney androgen regulated protein、(27)lectin, galactoside-binding, soluble, 3、(28)matrix Gla protein、(29)oxidative stress induced growth inhibitor 1、(30)paternally expressed 12、(31)protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 1A、(32)RAS, dexamethasone-induced 1、(regucalcin (senescence marker protein-30)、(33)regucalcin (senescence marker protein-30)、(34)S100 calcium binding protein A10、(35)S100 calcium binding protein A6、(36)secreted phosphoprotein 2、(37)serine (or cysteine) peptidase inhibitor, clade A, member 3K、(38)similar to CPE-receptor、(39)similar to tumor necrosis factor receptor superfamily, mber 12a、(40)solute carrier family 22 (organic cation transporter), member 2、(41)solute carrier family 34 (sodium phosphate), member 2、(42)solute carrier family 4 (anion exchanger), member 1、(43)suppressor of cytokine signaling 3、(44)thymosin, beta 10、(45)tonin、(46)translin、(47)trefoil factor 3, intestinal、(48)ubiquitin D、(49)uromodulinのうちから選択される少なくとも１以上の生体応答遺伝子に対する遺伝子発現レベルを測定するステップと、
（Ｃ）（Ｂ）で得られた前記遺伝子発現レベルを対応する前記化学物質、曝露量及び曝露期間とともに遺伝子発現データとしてデータベース化するステップと、
を含むことを特徴とする照合用遺伝子発現データベースの作成方法である。
【００３３】
また、（２２）選択される少なくとも１以上の前記生体応答遺伝子は、
（１）ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 1、（２）alpha 1,3-galactosyltransferase 2、（３）alpha-2-macroglobulin、（４）annexin A2、（５）aquaporin 6, kidney specific、（６）calbindin 1、（７）cathepsin D、（８）CD24 molecule、（９）Cd44 molecule、（１０）claudin 3、（１１）cysteine sulfinic acid decarboxylase、（１２）deoxyribonuclease I、（１３）fibrinogen beta chain、（１４）glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、（１５）glycoprotein (transmembrane) nmb、（１６）lectin, galactoside-binding, soluble, 3、（１７）matrix Gla protein、（１８）oxidative stress induced growth inhibitor 1、（１９）RAS, dexamethasone-induced 1、（２０）S100 calcium binding protein A10、（２１）secreted phosphoprotein 2、（２２）similar to CPE-receptor、（２３）similar to tumor necrosis factor receptor superfamily, mber 12a、（２４）solute carrier family 34 (sodium phosphate), member 2、（２５）solute carrier family 4 (anion exchanger), member 1、（２６）suppressor of cytokine signaling 3、（２７）thymosin, beta 10、（２８）translin、のうちの少なくともいずれか１つを含むことを特徴とする（２１）に記載の照合用遺伝子発現データベースの作成方法が望ましい。
【００３４】
また、（２３）前記腎臓組織または前記細胞試料は、マウス、ラット、イヌ、サルまたはヒト由来であることを特徴とする、（２１）または（２２）に記載の照合用遺伝子発現データベースの作成方法であってもよい。
【００３５】
また、（２４）遺伝子発現レベルの測定は、ＲＴ-ＰＣＲ法、iAFLP（introduced Amplified Fragment Length Polymorphism）法、LAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法、nCounter Analysis system、ハイブリダイゼーション法のうちの１つを用いることを特徴とする（２１）または（２２）に記載の照合用遺伝子発現データベースの作成方法であってもよい。
【００３６】
また、（２５）前記ハイブリダイゼーション法は、マイクロアレイ法又はブロット法であることを特徴とする（２４）に記載の照合用遺伝子発現データベースの作成方法であってもよい。
【００３７】
また、（２６）前記マイクロアレイ法又はブロット法に用いられるプローブは、ヌクレオチド又はタンパク質であることを特徴とする（２５）に記載の照合用遺伝子発現データベースの作成方法であってもよい。
【００３８】
また、（２７）前記ヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチドであることを特徴とする（２６）に記載の照合用遺伝子発現データベースの作成方法であってもよい。
【００３９】
また、（２８）前記ヌクレオチドは、標識化ヌクレオチドであることを特徴とする（２６）または（２７）に記載の照合用遺伝子発現データベースの作成方法であってもよい。
【００４０】
また、（２９）前記遺伝子発現レベルの測定を前記生体応答遺伝子に対応する核酸又は前記生体応答遺伝子によってコードされるタンパク質の存在もしくは量を測定することで決定することを特徴とする（２１）または（２２）のうちのいずれか１つに記載の照合用遺伝子発現データベースの作成方法であってもよい。
【００４１】
また、（３０）前記遺伝子発現レベルの測定を免疫学的方法によって行うことを特徴とする（２１）または（２２）のうちのいずれか１つに記載の照合用遺伝子発現データベースの作成方法であってもよい。
【００４２】
また、（３１）前記免疫学的方法は、前記生体応答遺伝子によってコードされるタンパク質又はその断片に対する特異抗体と標的タンパク質との免疫学的複合体を検出する方法であることを特徴とする（３０）に記載の照合用遺伝子発現データベースの作成方法または化学物質の毒性の検出・予測方法であってもよい。
【００４３】
また、（３２）前記特異抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、および抗体フラグメントから選択されることを特徴とする（３１）に記載の照合用遺伝子発現データベースの作成方法であってもよい。
【００４４】
また、本発明は（３３）（２１）または（２２）のいずれか１つに記載の方法に用いられるプローブを含むキットであって、該プローブが、前記生体応答遺伝子に特異的にハイブリダイズする配列を有する分子を含むことを特徴とする照合用遺伝子発現データベースの作成キットである。
【００４５】
また、（３４）前記プローブは、ヌクレオチド又はタンパク質であることを特徴とする（３３）に記載の照合用遺伝子発現データベースの作成キットであってもよい。
【００４６】
また、（３５）前記ヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチドであることを特徴とする（３４）に記載の照合用遺伝子発現データベースの作成キットであってもよい。
【００４７】
また、（３６）前記ヌクレオチドは、前記生体応答遺伝子のセンス鎖又はアンチセンス鎖とハイブリダイズし、10〜100 merであることを特徴とする（３４）に記載の照合用遺伝子発現データベースの作成キットであってもよい。
【００４８】
また、（３７）前記ヌクレオチドは、標識化ヌクレオチドであることを特徴とする（３５）または（３６）に記載の照合用遺伝子発現データベースの作成キットであってもよい。
【００４９】
また、（３８）前記プローブは、抗体及び/又はアプタマーであるタンパク質であることを特徴とする（３３）に記載の照合用遺伝子発現データベースの作成キットであってもよい。
【００５０】
また、（３９）前記プローブは、少なくとも1つ以上を固体支持体に固定したＤＮＡマイクロアレイ、ＤＮＡチップ、タンパクチップまたは抗体チップを含むことを特徴とする（３３）ないし（３８）のうちの１つに記載の照合用遺伝子発現データベースの作成キットであってもよい。
【００５１】
また、（４０）前記固体支持体は、ガラス、シリコン、プラスチック又は生体膜であることを特徴とする（３９）に記載の照合用遺伝子発現データベースの作成キットであってもよい。
【００５２】
また、本発明は（４１）化学物質が生体に与える影響を遺伝子発現レベルで検出することにより被検化学物質の毒性を検出・予測する方法であって、
（Ａ）2−ブタノンオキシム、ｍ−キシリレンジアミン、3-シアノピリジン、2−（2−アミノエチルアミノ）エタノール、テトラヒドロフルフリルアルコール、メタクリルアミド、スルホラン、2-イソプロポキシエタノール、ヒドラジン一水和物、4-エチルモルホリン、メタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド、塩化ベンジルトリメチルアンモニウム、ｍ-ニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム、1-ナフチルアミン-4-スルホン酸ナトリウム四水和物、3-メトキシ-3-メチル-1-ブタノール、o-ジクロロベンゼン、3,4-キシリジン、N-メチルアニリン、トリレンジイソシアナート、2-（ジブチルアミノ）エタノール、ｐ-クミルフェノール、ｍ-クレゾール、2,3-ジメチルアニリン、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド、フタル酸ジヘプチル、テトラブロモエタン、アジピン酸ジブチル、P-エチルフェノール、ο-t-ブチルフェノールおよびｐ-（1,1,3,3,-テトラメチルブチル）フェノールのそれぞれについて所定量を一定期間生体または腎臓由来の細胞試料に投与（曝露）するステップと、
（Ｂ）前記生体由来の腎臓組織または前記腎臓由来の前記細胞試料からｍＲＮＡを単離して、生体応答遺伝子群： (1)ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 1、(2)AHNAK nucleoprotein、(3)alpha 1,3-galactosyltransferase 2、(4)alpha-2-macroglobulin、(5)annexin A2、(6)aquaporin 6, kidney specific、(7)calbindin 1、(8)camello-like 1、(9)cathepsin D、(10)CD24 molecule、(11)Cd44 molecule、(12)claudin 3、(13)collagen triple helix repeat containing 1、(14)cysteine sulfinic acid decarboxylase、(15)deiodinase, iodothyronine, type I、(16)deleted in colorectal carcinoma、(17)deoxyribonuclease I、(18)fibrinogen beta chain、(19)flavin containing monooxygenase 3、(20)glutamate-cysteine ligase, catalytic subunit、(21)glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、(22)glycoprotein (transmembrane) nmb、(23)histamine N-methyltransferase、(24)hypothetical protein LOC56728、(25)kallikrein、(26)kidney androgen regulated protein、(27)lectin, galactoside-binding, soluble, 3、(28)matrix Gla protein、(29)oxidative stress induced growth inhibitor 1、(30)paternally expressed 12、(31)protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 1A、(32)RAS, dexamethasone-induced 1、(regucalcin (senescence marker protein-30)、(33)regucalcin (senescence marker protein-30)、(34)S100 calcium binding protein A10、(35)S100 calcium binding protein A6、(36)secreted phosphoprotein 2、(37)serine (or cysteine) peptidase inhibitor, clade A, member 3K、(38)similar to CPE-receptor、(39)similar to tumor necrosis factor receptor superfamily, mber 12a、(40)solute carrier family 22 (organic cation transporter), member 2、(41)solute carrier family 34 (sodium phosphate), member 2、(42)solute carrier family 4 (anion exchanger), member 1、(43)suppressor of cytokine signaling 3、(44)thymosin, beta 10、(45)tonin、(46)translin、(47)trefoil factor 3, intestinal、(48)ubiquitin D、(49)uromodulinのうちから少なくとも1以上の生体応答遺伝子に対する遺伝子発現レベルを測定するステップと、
（Ｃ）（Ｂ）で得られた前記遺伝子発現レベルを対応する前記化学物質、曝露量、曝露期間とともに遺伝子発現データとして収集するステップと、
（Ｄ）被検化学物質を適当な濃度で一定期間生体または腎臓由来の細胞試料に曝露させるステップと、
（Ｅ）前記生体由来の前記腎臓組織または前記腎臓由来の細胞試料からｍＲＮＡを単離して、生体応答遺伝子群： (1)ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 1、(2)AHNAK nucleoprotein、(3)alpha 1,3-galactosyltransferase 2、(4)alpha-2-macroglobulin、(5)annexin A2、(6)aquaporin 6, kidney specific、(7)calbindin 1、(8)camello-like 1、(9)cathepsin D、(10)CD24 molecule、(11)Cd44 molecule、(12)claudin 3、(13)collagen triple helix repeat containing 1、(14)cysteine sulfinic acid decarboxylase、(15)deiodinase, iodothyronine, type I、(16)deleted in colorectal carcinoma、(17)deoxyribonuclease I、(18)fibrinogen beta chain、(19)flavin containing monooxygenase 3、(20)glutamate-cysteine ligase, catalytic subunit、(21)glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、(22)glycoprotein (transmembrane) nmb、(23)histamine N-methyltransferase、(24)hypothetical protein LOC56728、(25)kallikrein、(26)kidney androgen regulated protein、(27)lectin, galactoside-binding, soluble, 3、(28)matrix Gla protein、(29)oxidative stress induced growth inhibitor 1、(30)paternally expressed 12、(31)protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 1A、(32)RAS, dexamethasone-induced 1、(regucalcin (senescence marker protein-30)、(33)regucalcin (senescence marker protein-30)、(34)S100 calcium binding protein A10、(35)S100 calcium binding protein A6、(36)secreted phosphoprotein 2、(37)serine (or cysteine) peptidase inhibitor, clade A, member 3K、(38)similar to CPE-receptor、(39)similar to tumor necrosis factor receptor superfamily, mber 12a、(40)solute carrier family 22 (organic cation transporter), member 2、(41)solute carrier family 34 (sodium phosphate), member 2、(42)solute carrier family 4 (anion exchanger), member 1、(43)suppressor of cytokine signaling 3、(44)thymosin, beta 10、(45)tonin、(46)translin、(47)trefoil factor 3, intestinal、(48)ubiquitin D、(49)uromodulinのうちから選択される少なくとも１以上の生体応答遺伝子に対する遺伝子発現レベルを測定するステップと、
（Ｆ）（Ｅ）で得られた前記遺伝子発現レベルを前記被検化学物質、曝露量及び曝露期間とともに遺伝子発現データとして収集するステップと、
（Ｇ）（Ｆ）で収集された遺伝子発現データを（Ｃ）で収集された照合用の対応する遺伝子発現データと比較するステップと、
を含むことを特徴とする化学物質の毒性検出・予測方法である。
【００５３】
また、（４２）（４１）に記載の（Ｂ）および（Ｅ）において選択される少なくとも１以上の前記生体応答遺伝子は、
（１）ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 1、（２）alpha 1,3-galactosyltransferase 2、（３）alpha-2-macroglobulin、（４）annexin A2、（５）aquaporin 6, kidney specific、（６）calbindin 1、（７）cathepsin D、（８）CD24 molecule、（９）Cd44 molecule、（１０）claudin 3、（１１）cysteine sulfinic acid decarboxylase、（１２）deoxyribonuclease I、（１３）fibrinogen beta chain、（１４）glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、（１５）glycoprotein (transmembrane) nmb、（１６）lectin, galactoside-binding, soluble, 3、（１７）matrix Gla protein、（１８）oxidative stress induced growth inhibitor 1、（１９）RAS, dexamethasone-induced 1、（２０）S100 calcium binding protein A10、（２１）secreted phosphoprotein 2、（２２）similar to CPE-receptor、（２３）similar to tumor necrosis factor receptor superfamily, mber 12a、（２４）solute carrier family 34 (sodium phosphate), member 2、（２５）solute carrier family 4 (anion exchanger), member 1、（２６）suppressor of cytokine signaling 3、（２７）thymosin, beta 10、（２８）translin、のうちの少なくともいずれか１つを含むことを特徴とする、（４１）に記載の化学物質の毒性検出・予測方法であってもよい。
【００５４】
また、（４３）前記腎臓組織または前記細胞試料は、マウス、ラット、イヌ、サルまたはヒト由来であることを特徴とする、（４１）または（４２）のうちの１つに記載の化学物質の毒性の検出・予測方法であってもよい。
【００５５】
また、（４４）遺伝子発現レベルの測定は、ＲＴ-ＰＣＲ法、iAFLP（introduced
Amplified Fragment Length Polymorphism）法、LAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法、nCounter
Analysis system、ハイブリダイゼーション法のうちの１つを用いることを特徴とする（４１）または（４２）のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性の検出・予測方法であってもよい。
【００５６】
また、（４５）前記ハイブリダイゼーション法は、マイクロアレイ法又はブロット法であることを特徴とする（４４）に記載の化学物質の毒性の検出・予測方法であってもよい。
【００５７】
また、（４６）前記マイクロアレイ法又はブロット法に用いられるプローブは、ヌクレオチド又はタンパク質であることを特徴とする（４５）に記載の化学物質の毒性の検出・予測方法であってもよい。
【００５８】
また、（４７）前記ヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチドであることを特徴とする（４６）に記載の化学物質の毒性の検出・予測方法であってもよい。
【００５９】
また、（４８）前記ヌクレオチドは、標識化ヌクレオチドであることを特徴とする（４５）または（４７）に記載の化学物質の毒性の検出・予測方法であってもよい。
【００６０】
また、（４９）前記遺伝子発現レベルの測定を前記生体応答遺伝子に対応する核酸又は前記生体応答遺伝子によってコードされるタンパク質の存在もしくは量を測定することで決定することを特徴とする（４１）または（４２）のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性の検出・予測方法であってもよい。
【００６１】
また、（５０）前記遺伝子発現レベルの測定を免疫学的方法によって行うことを特徴とする（４１）または（４２）のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性の検出・予測方法であってもよい。
【００６２】
また、（５１）前記免疫学的方法は、前記生体応答遺伝子によってコードされるタンパク質又はその断片に対する特異抗体と標的タンパク質との免疫学的複合体を検出する方法であることを特徴とする（５０）に記載の化学物質の毒性の検出・予測方法であってもよい。
【００６３】
また、（５２）前記特異抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、および抗体フラグメントから選択されることを特徴とする（５１）に記載の化学物質の毒性の検出・予測方法であってもよい。
【００６４】
また、本発明は（５３）（４１）または（４２）のうちのいずれか１つに記載の方法に用いられるプローブを含むキットであって、該プローブが、前記生体応答遺伝子に特異的にハイブリダイズする配列を有する分子を含むことを特徴とする化学物質の毒性の検出・予測キットである。
【００６５】
また、（５４）前記プローブは、ヌクレオチド又はタンパク質であることを特徴とする（５３）記載の化学物質の毒性の検出・予測キットであってもよい。
【００６６】
また、（５５）前記ヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチドであることを特徴とする（５４）に記載の化学物質の毒性の検出・予測キットであってもよい。
【００６７】
また、（５６）前記ヌクレオチドは、前記生体応答遺伝子のセンス鎖又はアンチセンス鎖とハイブリダイズし、10〜100 merであることを特徴とする（５４）に記載の化学物質の毒性の検出・予測キットであってもよい。
【００６８】
また、（５７）前記ヌクレオチドは、標識化ヌクレオチドであることを特徴とする（５５）または（５６）に記載の化学物質の毒性の検出・予測キットであってもよい。
【００６９】
また、（５８）前記プローブは、抗体及び/又はアプタマーであるタンパク質であることを特徴とする（５４）に記載の化学物質の毒性の検出・予測キットであってもよい。
【００７０】
また、（５９）前記プローブは、少なくとも1つ以上を固体支持体に固定したＤＮＡマイクロアレイ、ＤＮＡチップ、タンパクチップまたは抗体チップを含むことを特徴とする（５３）ないし（５８）のうちの１つに記載の化学物質の毒性の検出・予測キットであってもよい。
【００７１】
また、（６０）前記固体支持体は、ガラス、シリコン、プラスチック又は生体膜であることを特徴とする（５９）に記載の化学物質の毒性の検出・予測キットであってもよい。
【発明の効果】
【００７２】
本発明によれば、化学物質を生体に投与した後の臓器における遺伝子発現様式を比較することにより、化学物質が生体に対して毒性を有するか否かを簡便に判定あるいは予測できる。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】クラスタ分析を表す。デンドログラムの下のカラムに記載されているtmp-1、tmp-2、tmp-3はｐ-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェノールを28日間反復投与したラットの腎臓サンプルを表す。また、対照-１、対照-２、対照-３はそれぞれオリブ油を28日間反復投与したラットの腎臓サンプルを表す。なお、記号の後の数字は個体番号を表している。さらに、図中右側のカラムは遺伝子数を表示している。また、図中左側のバーはlog2比値を表している。
【図２】CRE（血中クレアチニン）の値をグラフ化したものを表す。デンドログラムの下のカラムに記載されている対照-１、対照-２、対照-３はそれぞれオリブ油を28日間反復投与したラットの腎臓サンプルを表す。また、tmp-1、tmp-2、tmp-3はそれぞれ化学物質ｐ-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェノールを28日間反復投与したラットの腎臓サンプルを表す。なお、記号の後の数字は個体番号を表している。
【図３】CRE（血中クレアチニン）の値をグラフ化したものを表す。デンドログラムの下のカラムに記載されている対照A-１、対照A-２、対照A-３、対照B-１、対照B-２、対照B-３、はそれぞれオリブ油を28日間反復投与したラットの腎臓サンプルを表している。また、tmp-1、tmp-2、tmp-3はそれぞれ化学物質ｐ-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェノールを28日間反復投与したラットの腎臓サンプルを表す。さらに、pcp-1、pcp-2、pcp-3はそれぞれ化学物質ｐ-クミルフェノールを28日間反復投与したラットの腎臓サンプルを表す。なお、記号の後の数字は個体番号を表している。
【図４】クラスタ分析を表す。デンドログラムの下のカラムに記載されているtmp-1、tmp-2、tmp-3はｐ-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェノールを28日間反復投与したラットの腎臓サンプルを表し、pcp-1、pcp-2、pcp-3はそれぞれ化学物質ｐ-クミルフェノールを28日間反復投与したラットの腎臓サンプルを表す。なお、記号の後の数字は個体番号を表している。また、対照はオリブ油を28日間反復投与したラットの腎臓サンプルを表し、contは対照以外の正常ラットの腎臓サンプルを表す。さらに、図中右側のカラムは遺伝子数を表示している。また、図中左側のバーはlog2比値を表している。
【図５】クラスタ分析を表す。デンドログラムの下のカラムに記載されているtmp-1、tmp-2、tmp-3はｐ-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェノールを28日間反復投与したラットの腎臓サンプルを表す。また、対照-１、対照-２、対照-３はそれぞれオリブ油を28日間反復投与したラットの腎臓サンプルを表す。なお、記号の後の数字は個体番号を表している。さらに、図中右側のカラムは遺伝子数を表示している。また、図中左側のバーはlog2比値を表している。
【図６】４９個の生体応答遺伝子の遺伝子発現データセットによるクラスタ分析を表す。デンドログラムの下のカラムはそれぞれラットに投与した化学物質の区別を表しており、図中左上には各カラムに対する化学物質の対応一覧を記している。mcaはメタクリルアミドを、sufはスルホランを、2ipは2-イソプロポキシエタノールを、hmhはヒドラジン一水和物を、4emは4-エチルモルホリンを、mtaはメタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリドを、bacは塩化ベンジルトリメチルアンモニウムを、mnsはｍ-ニトロベンゼンスルホン酸ナトリウムを、natは1-ナフチルアミン-4-スルホン酸ナトリウム四水和物を、mmbは3-メトキシ-3-メチル-1-ブタノールを、dcbはo-ジクロロベンゼンを、34xは3,4-キシリジンを、nmaはN-メチルアニリンを、tdnはトリレンジイソシアナートを、2deは2-（ジブチルアミノ）エタノールを、pcpはｐ-クミルフェノールを、mcsはｍ-クレゾールを、23dは2,3-ジメチルアニリンを、dhcはN,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミドを、dhpはフタル酸ジヘプチルを、tbeはテトラブロモエタンを、dbaはアジピン酸ジブチルを、pepはP-エチルフェノールを、tbpはο-t-ブチルフェノールを、tmpはｐ-（1,1,3,3,-テトラメチルブチル）フェノールを表している。さらに、図中右側のカラムは遺伝子数を表示している。また、図中左側のバーはlog2比値を表している。
【図７】２８個の生体応答遺伝子の遺伝子発現データセットによるクラスタ分析を表す。デンドログラムの下のカラムはそれぞれラットに投与した化学物質の区別を表しており、図中左上には各カラムに対する化学物質の対応一覧を記している。mcaはメタクリルアミドを、sufはスルホランを、2ipは2-イソプロポキシエタノールを、hmhはヒドラジン一水和物を、4emは4-エチルモルホリンを、mtaはメタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリドを、bacは塩化ベンジルトリメチルアンモニウムを、mnsはｍ-ニトロベンゼンスルホン酸ナトリウムを、natは1-ナフチルアミン-4-スルホン酸ナトリウム四水和物を、mmbは3-メトキシ-3-メチル-1-ブタノールを、dcbはo-ジクロロベンゼンを、34xは3,4-キシリジンを、nmaはN-メチルアニリンを、tdnはトリレンジイソシアナートを、2deは2-（ジブチルアミノ）エタノールを、pcpはｐ-クミルフェノールを、mcsはｍ-クレゾールを、23dは2,3-ジメチルアニリンを、dhcはN,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミドを、dhpはフタル酸ジヘプチルを、tbeはテトラブロモエタンを、dbaはアジピン酸ジブチルを、pepはP-エチルフェノールを、tbpはο-t-ブチルフェノールを、tmpはｐ-（1,1,3,3,-テトラメチルブチル）フェノールを表している。さらに、図中右側のカラムは遺伝子数を表示している。また、図中左側のバーはlog2比値を表している。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
他に特に規定されない限り、本明細書中に使用される用語は、本発明が属する分野における通常の知識を有する者（当業者）によって、一般的に理解されるものと同一の意味を有する。
【００７５】
当業者は、本明細書中に記載されるものと同等または類似の多くの方法および物質を認識する。ただし、本発明は本明細書に記載される方法および物質に限定されない。
【００７６】
「遺伝子発現レベルを測定する」とは、該遺伝子の発現レベルを検出又は定量する限り特に制限されず、例えば、該遺伝子のｍＲＮＡやｃＤＮＡを検出又は定量してもよい。さらには、該遺伝子がコードするタンパク質を検出又は定量してもよい。これらの検出又は定量には、該遺伝子又はその遺伝子産物であるペプチド若しくはタンパク質に特異的に結合する分子を用いることが望ましい。遺伝子又はその遺伝子産物であるペプチド若しくはタンパク質に特異的に結合する分子とは、特に制限されないが、該遺伝子に特異的に結合するヌクレオチド、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド若しくはタンパク質に特異的に結合する抗体等を例示することができる。また、該遺伝子の発現レベルの検出又は定量には、該遺伝子のｍＲＮＡもしくはタンパク質の断片またはホモログを用いてもよい。
【００７７】
「ＤＮＡマイクロアレイ」とは、オリゴヌクレオチドや一本鎖または二本鎖のＤＮＡをガラス基板上などに高密度に配置したものをいい、「ＤＮＡマイクロアレイ法」とは、そのＤＮＡマイクロアレイ上で蛍光標識したＲＮＡ分子などとハイブリッド形成を行わせて定性的定量的にＤＮＡと結合した核酸の種類や量を測定する手法をいう。
【００７８】
「オリゴヌクレオチド」とは、ヌクレオチドが数個重合した分子の総称のことをいう。
【００７９】
本明細書中、ｍＲＮＡの「ホモログ」とは、該ｍＲＮＡに実質的に類似したヌクレオチドに関連する。「実質的に類似した」とは、当業者によって十分理解され、具体的にはそれぞれの配列類似性が少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％を有することを意味する。
【００８０】
また、本明細書中、タンパク質の「ホモログ」とは、該ｍＲＮＡに実質的に類似したペプチドに関連する。「実質的に類似した」とは、当業者によって十分理解され、具体的にはそれぞれの配列類似性が少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％を有することを意味する。
【００８１】
「候補化合物」とは、その毒性について試験される任意の化合物を指す。
【００８２】
「化合物に曝露された臓器組織または細胞試料」とは、組織もしくは細胞試料、または試料が由来した動物が、化合物により処理されたことを意味する。
【００８３】
「腎臓毒性」とは、多くの疾病もしくは障害のプロセスにより誘発され得るところの急性もしくは慢性の腎臓の不全もしくは機能障害を意味する。
【００８４】
「毒性作用」とは、化合物の存在に起因する、生体、臓器系、各臓器、組織、細胞、または細胞内単位に対する有害作用を指す。毒性作用は、生理的もしくは物理的な症状、または細胞もしくは臓器の壊死のような撹乱であり得る。
【００８５】
「試料」には、好ましくは腎臓の生検材料、並びに、例えば血液、血漿、血清、リンパ液、腹水、尿、便のような任意の体液が含まれるものとする。なお、これに限られるものではない。
【００８６】
本明細書で使用される際には、「個体」とは、ヒトの個体、動物又は個体の集団もしくはプールを意味するものとする。
【００８７】
「候補薬剤」には、タンパク質もしくはそのフラグメント、抗体、小分子の阻害剤もしくはアゴニスト、核酸分子、たとえば、アンチセンスヌクレオチド、リボザイム、二重鎖ＲＮＡ、有機および無機化合物等のような天然のまたは合成の分子を含む。
【００８８】
遺伝子の発現レベルを検出又は定量する具体的な方法としては、該遺伝子に特異的に結合するプローブ用の標識化ヌクレオチド、標識化ｃＤＮＡまたは標識化ＲＮＡを用いたノーザンブロット法、ドットブロット法、iAFLP法、LAMP法、nCounter Analysis systemまたはＰＣＲ法を用いることができる。ＰＣＲ法として、ＲＴ-ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、コンペティティブＰＣＲ法を挙げることができる。
【００８９】
さらに、遺伝子の発現レベルを検出又は定量する具体的な方法としては、ＤＮＡマイクロアレイ、ＤＮＡチップ、または抗体アレイ等が挙げられる。ＤＮＡマイクロアレイ又はＤＮＡチップには該遺伝子のヌクレオチド又はｃＤＮＡが少なくとも１つ以上固定化されているものを用いる。
【００９０】
なお、ヌクレオチド又はｃＤＮＡは、該遺伝子の一部に相当する部分でもよい。
【００９１】
上記プローブの標識化に用いられる標識試薬は、例えば放射性同位元素である［125I］、［131I］、［３H］、［１４C］、［３２P］、［３５S］、酵素であるβーガラクトシダーゼ、βーグルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、また、蛍光物質であるシアニン蛍光色素蛍光色素（例えば、Cy２、Cy３、Cy５、Cy5.5、Cy７、Cyanine３、Cyanine５など）を用いることができる。
【００９２】
また、上記リアルタイムＰＣＲ法としては、例えば、組織内又は細胞内の全ＲＮＡやｍＲＮＡから逆転写酵素により合成したｃＤＮＡを鋳型にして、ＰＣＲの増幅産物をリアルタイムでモニタリングする方法が挙げられる。リアルタイムＰＣＲ用モニタリング試薬としては、例えばSYBR GreenＩやTaqManプローブ等が用いられる。
【００９３】
通常、ＤＮＡマイクロアレイやＤＮＡチップは、プローブが支持体の上に固定されているアレイ又はチップであり、ＤＮＡマイクロアレイ又はＤＮＡチップの支持体としては、ハイブリダイゼーションに使用可能なものであればよく、例えばガラス、シリコン、プラスチックなどの基板や、ニトロセルロース膜、ナイロン膜等を用いることができる。
【００９４】
なお、ＤＮＡマイクロアレイとは、生体応答遺伝子セットに含まれる遺伝子全長、またはその部分配列と相補的なｃＤＮＡ断片若しくはオリゴＤＮＡを固定支持体に１つ以上固定したものをいう。ここでいう相補的なオリゴＤＮＡは一般的には２５〜１００塩基の長さのものが用いられるが、必ずしもこれに限定されない。
【００９５】
ＤＮＡマイクロアレイやＤＮＡチップの使用方法については特に制限されない。例えば、生体試料からｍＲＮＡを精製し、該ｍＲＮＡを鋳型とした逆転写反応を行う際に、適切な標識を付したプライマーや標識ヌクレオチドを使用することにより、標識されたｃＤＮＡを得ることができる。この標識化ｃＤＮＡとＤＮＡマイクロアレイやＤＮＡチップ表面上に固定された本発明におけるプローブとの間でハイブリダイゼーションを行わせ、被検試料とのハイブリダイゼーション及び対照試料とのハイブリダイゼーションのそれぞれの結果を比較し、該遺伝子の有無を検出したり、発現レベルを測定することにより、臓器毒性の検出または予測を行うことができる。
【００９６】
上記標識化ｃＤＮＡの作製に用いられる標識物質としては、放射性同位元素、蛍光物質等を用いることができる。例えば、蛍光物質としては、Cy２、Cy３、Cy５、Cy5.5、Cy７、Cyanine３、Cyanaine５、FITC（イソチオシアン酸フルオレセイン）、テキサスレッド、ローダミン等が挙げられる。
【００９７】
遺伝子に対応するポリペプチド又はタンパク質は上記生体応答遺伝子の発現産物であり、該ポリペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列の配列情報は、NCBIの遺伝子データベースにおいて、それぞれのアクセッションナンバーによりアプローチすることもできる。
【００９８】
上記ポリペプチド又はタンパク質を検出又は定量する方法としては、所定のポリペプチド又はタンパク質を検出又は定量する方法であれば特に制限されない。例えば、該ポリペプチド又はタンパク質に特異的に結合する抗体やアプタマー等を用いることができ、抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、２つのエピトープを同時に認識することができる二機能性抗体等を例示できる。これらの抗体は、慣用のプロトコルを用いて該ポリペプチド又はタンパク質又はそれらの断片を抗原として用いて作製することができる。また、アプタマーとは、タンパク質、アミノ酸等の分子に特異的に結合する核酸分子である。
【００９９】
上記ポリペプチド又はタンパク質に特異的に結合する抗体を用いて、被検試料中に存在する該ポリペプチド又はタンパク質を検出又は定量する場合、免疫沈降法、電気化学発光法、RIA（Radioimmunoassay）法、ELISA（Enzyme-liked immunosorbent assay）法、蛍光抗体法等の公知の免疫学的方法を用いることができる。
【０１００】
上記判定の基準としては、被検試料中に存在する該遺伝子の発現レベル（又は該遺伝子に対応するポリペプチド若しくはタンパク質の発現レベル）が正常対照試料中に存在する、該遺伝子の発現レベル（又は該遺伝子に対応するポリペプチド若しくはタンパク質の発現レベル）よりも高いまたは低いことを用いる。例えば、1群3検体以上の試料の発現レベルを測定した結果について、ｔ検定を行った場合に、P＜0.05、より好ましくはP＜0.01、さらに好ましくはP＜0.001、さらにより好ましくはP＜0.0001である場合が挙げられる。
【０１０１】
検定方法はｔ検定に限定されるものではなく、マン・ホイットニ検定やウィルコクサン符号付順位検定でもよい。また検定に限定されるものではなく、例えば各群の発現レベルの平均値の差を用いてもよい。
【０１０２】
基準値は、被検試料における発現レベルを測定する度に毎回測定する必要はなく、例えば、様々な種の生体試料における正常対照試料中に存在する遺伝子の発現レベルをあらかじめ測定しておき、その測定値を用いて比較することができる。
【０１０３】
遺伝子発現レベルの変化には特定の化合物と生体組織との直接の反応のみならず、臓器に障害が生じた結果としての二次的反応も含まれる。
【０１０４】
生体応答遺伝子セットに含まれる遺伝子は、ヒト、ラット、マウス、またはサルのような任意の哺乳動物において、マーカーとして用いられ得る。好ましくは、生体応答遺伝子セットに含まれる遺伝子は、ラットまたはマウスにおいてマーカーとして用いられる。
【０１０５】
動物の種類は特に限定されるものではなく、例えば、ラットの場合にはSD、Wistarラットなどでもよく、雄でも雌でも構わない。
【０１０６】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【０１０７】
本発明の毒性作用を検出または予測するための方法に用いられる生体応答遺伝子セットは、ｐ-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェノール（和光純薬株式会社製）を雄のSDラット（６週齢）に28日間反復投与（300 mg/kg）することにより腎臓で発現レベルが著しく変化した遺伝子群である。
【０１０８】
本発明で用いられる生体応答遺伝子セットは以下の方法により得られる。なお、ここで、「発現レベル」とは絶対量である必要はなく相対量でよい。
【０１０９】
[遺伝子発現データベース]
本発明の遺伝子発現データベースを作成するには、
（１）種々の化学物質について、ラットなどが死亡しない適当な投与量を決定し、
（２）適当な濃度の化学物質を一定期間、ラットなどに繰り返し曝露し、
（３）曝露した生体から各臓器を摘出し、
（４）摘出した臓器からｍＲＮＡを単離し、
（５）ＤＮＡマイクロアレイ法などにより特定遺伝子の発現レベルを測定し、
（６）得られた遺伝子発現レベルを化学物質、その濃度、曝露時間とともに遺伝子発現データベースとしてまとめる。
という工程によりなされる。
【０１１０】
[動物試験]
国立医薬品食品衛生研究所の既存化学物質毒性データベース（http://dra4.nihs.go.jp/mhlw_data/jsp/SearchPage.jsp）に登録されている３０種類の化学物質腎臓毒性が報告されている化学物質2−ブタノンオキシム（和光純薬株式会社）（100mg/kg）、ｍ−キシリレンジアミン（東京化成工業株式会社）（400mg/kg）、3-シアノピリジン（和光純薬株式会社）（180mg/kg）、2−（2−アミノエチルアミノ）エタノール（和光純薬株式会社）（1000mg/kg）、テトラヒドロフルフリルアルコール（和光純薬株式会社）（600mg/kg）、メタクリルアミド（和光純薬株式会社）（150mg/kg）、スルホラン（和光純薬株式会社）（700mg/kg）、2-イソプロポキシエタノール（和光純薬株式会社）（500mg/kg）、ヒドラジン一水和物（和光純薬株式会社）（30mg/kg）、4-エチルモルホリン（和光純薬株式会社）（500mg/kg）、メタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド（和光純薬株式会社）（1000mg/kg）、塩化ベンジルトリメチルアンモニウム（和光純薬株式会社）（120mg/kg）、ｍ-ニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム（和光純薬株式会社）（1000mg/kg）、1-ナフチルアミン-4-スルホン酸ナトリウム四水和物（和光純薬株式会社）（1000mg/kg）、3-メトキシ-3-メチル-1-ブタノール（和光純薬株式会社）（1000mg/kg）、o-ジクロロベンゼン（和光純薬株式会社）（500mg/kg）、3,4-キシリジン（和光純薬株式会社）（250mg/kg）、N-メチルアニリン（和光純薬株式会社）（125mg/kg）、トリレンジイソシアナート（和光純薬株式会社）（300mg/kg）、2-（ジブチルアミノ）エタノール（和光純薬株式会社）（250mg/kg）、ｐ-クミルフェノール（和光純薬株式会社）（700mg/kg）、ｍ-クレゾール（和光純薬株式会社）（1000mg/kg）、2,3-ジメチルアニリン（東京化成工業株式会社）（200mg/kg）、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（和光純薬株式会社）（300mg/kg）、フタル酸ジヘプチル（和光純薬株式会社）（1000mg/kg）、テトラブロモエタン（和光純薬株式会社）（200mg/kg）、アジピン酸ジブチル（和光純薬株式会社）（1000mg/kg）、p-エチルフェノール（和光純薬株式会社）（1000mg/kg）、ο-t-ブチルフェノール（和光純薬株式会社）（500mg/kg）およびｐ-（1,1,3,3,-テトラメチルブチル）フェノール（和光純薬株式会社）（300mg/kg）を28日間反復してSDラット（７週齢、雄）に経口投与した。正常対照群として、オリブ油（小堺製薬株式会社製）または注射用水（日本薬局方 注射用水、大塚蒸留水）を28日間反復してSDラット（６週齢、雄）に経口投与した。28日間の反復投与後、ラットから腎臓を採取し、速やかに液体窒素で凍結させた。凍結させた腎臓組織はISOGEN（ニッポンジーン社製）を用いて粉砕した。なお、動物試験は28日間に制限されることはなく、例えば数日間でもよい。
【０１１１】
[全ＲＮＡの抽出]
腎臓組織からの全ＲＮＡの抽出はISOGEN試薬（ニッポンジーン社製）を用いて推奨のプロトコルに従って行った。
【０１１２】
[核酸検体の調製]
検体用ｍＲＮＡの調製は、腎臓組織からISOGEN試薬（ニッポンジーン社製）を用いて抽出した全ＲＮＡから、Poly（A）Pureキット（Ambion社製）を用い、各社推奨のプロトコルに従って行った。
【０１１３】
[マイクロアレイの作製]
マイクロアレイ用合成ＤＮＡを用いてマイクロアレイを作製した。マイクロアレイの作製方法・条件に限定はないが、例えば（Schena,M.et.al.,Science,270,467-470.(1995)）に記載の作製方法を用いることができる。
【０１１４】
ラット遺伝子断片ライブラリー（マイクロダイアグノスティック社製）を超微量分注装置（マイクロダイアグノスティク社製）によりスライドガラス（松波硝子工業社製、HAコートスライドガラス）にプリントしてマイクロアレイを作製した。該マイクロアレイを気相恒温器内にて80℃で1時間静置し、さらにUVクロスリンカー（Hoefer社製、UVC500）を用いて120mJの紫外線を照射した。
【０１１５】
[マイクロアレイの後処理]
マイクロアレイの後処理については、公開特許公報（特開2004-233105）記載の方法により行った。
【０１１６】
[標識ｃＤＮＡの合成]
該ｍＲＮＡ 1.5μgを核酸標識・ハイブリダイゼーション試薬（マイクロダイアグノスティック社製）、逆転写酵素SuperScriptII（インビトロジェン社製）、Cyanine5-deoxyuridinetriphosphate(Cyanine5-dUTP)（Perkin Elmer社製）を用い、標識ｃＤＮＡを作製した。一方、対照としてラット共通レファレンス（マイクロダイアグノスティック社製）を使用した。共通レファレンスに対しては核酸標識・ハイブリダイゼーション試薬（マイクロダイアグノスティック社製）、逆転写酵素SuperScriptII（インビトロジェン社製）、Cyanine3-deoxyuridinetriphosphate(Cyanine3-dUTP)（Perkin Elmer社製）を用い、標識ｃＤＮＡを作製した。作製方法は、各社推奨のプロトコルに従った。
【０１１７】
[標識プローブの作製]
これらの標識ｃＤＮＡ、すなわち、Cyanine5-dUTPで標識した検体およびCyanine3-dUTPで標識した対照レファレンスを同一試験管内で混合した後、MicropureEZ（ミリポア社製）およびMicroconYM30（ミリポア社製）により精製した。最終的には核酸標識・ハイブリダイゼーション試薬に付属のハイブリダイゼーションバッファーおよび純水を用いて15μlに調製した。
【０１１８】
[ハイブリダイゼーション]
該溶液を99℃で5分間加熱して熱変性させた後に、ＤＮＡマイクロアレイ上に滴下し、ハイブリダイゼーションカセット（マイクロダイアグノスティック社製）に格納した。該ハイブリダイゼーションカセットを気相恒温器（三洋電機バイオメディカ社製）に入れ、42℃で約20時間、静置した状態で保温した。この操作によって、サンプル中に含まれる標識ｃＤＮＡがＤＮＡマイクロアレイ上の相補的なオリゴＤＮＡと特異的に結合する。
【０１１９】
[洗浄]
ハイブリダイゼーションカセットからスライドガラスを取り出し、核酸標識・ハイブリダイゼーション試薬（マイクロダイアグノスティック社製）付属のハイブリダイゼーション洗浄溶液を用い、同社推奨のプロトコルに従ってスライドガラスを洗浄した。
【０１２０】
[蛍光強度の検出および数値化]
各遺伝子の発現レベルはＤＮＡマイクロアレイ上に固定されたオリゴＤＮＡと結合した標識ｃＤＮＡの蛍光強度を測定することにより見積もることができる。洗浄したスライドガラスをスキャナGenePix4000B（Axon Instrument社製）を用いて蛍光を測定し、スキャナに付属の解析ソフトウエアGenePixPro（Axon Instrument社製）を用いて光学的に評価し、蛍光強度を数値化した。すなわち、ＤＮＡマイクロアレイ上に固定されたオリゴＤＮＡのスポットの蛍光強度をそれぞれ別々に測定し、スポット以外の場所の蛍光強度からバックグラウンドを算出してノイズとしてそれぞれのスポットの蛍光強度から差し引く。そして、サンプルにおける蛍光強度/共通レファレンスの蛍光強度を算出するという解析を行う。すなわち、各サンプルの遺伝子発現レベルはすべて共通レファレンスに対する相対比として検出されるため、単純に複数サンプルを横並び比較できる状態となっている。このようにして取得された数値を集積してデータベース化する。表１から５がデータ例である。
【０１２１】
【表１】
【０１２２】
【表２】
【０１２３】
【表３】
【０１２４】
【表４】
【０１２５】
【表５】
【０１２６】
[血液サンプル処理]
採血は、投与最終日翌日に実施する剖検と同時に行った。ラットは採血前日の午後5時から除餌し、水のみを給与した。エーテル麻酔下でラットを開腹し、腹部大静脈より血液を採取した。採取した血液は、ガラス製試験管に入れ、室温で10分間静置し、さらに氷中で15分静置した後、遠心分離を行い、上清を採って、これを血液生化学検査用血清とした。なお、血液生化学検査は財団法人畜産生物科学安全研究所にて行った。
【０１２７】
[生体応答遺伝子群の抽出]
腎臓毒性を判別するための有用な遺伝子を選択するために以下の計算を行った。最初に対照群のラットの腎臓における遺伝子発現データの平均値を算出した。次に化学物質ｐ-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェノールを投与したラットの腎臓における遺伝子発現レベルと前記対照群の平均値との比を算出した。さらに、前記化学物質を投与したラットのうち少なくとも2個体以上で前記対照群の平均値との比が2.83倍以上または0.35倍以下の遺伝子を抽出した。さらに、対照群の標準偏差が0.5未満の遺伝子を選択した（４９遺伝子）。
【０１２８】
[クラスタ分析]
ＤＮＡマイクロアレイで取得した遺伝子発現データの分析手法として、例えばクラスタ分析が挙げられる。クラスタ分析とは、遺伝子発現変化パターンの類似した遺伝子同士をグルーピングする統計的手法である。データ間の類似度（例えばユークリッド距離など）を定義し、その類似度を用いることにより遺伝子発現パターンの類似した、すなわち、遺伝子発現に対して類似した影響を持つ化学物質どうしがグループ化される。
【０１２９】
上記同定された遺伝子について階層的クラスタ分析を行った。階層的クラスタ分析は解析用ソフトウェア「Expression View Pro」（マイクロダイアグノスティック社製）を用いて行った。また、階層的クラスタ分析は「cluster」や「treeview」などのソフトウェアを用いても行うことができる。その結果、化学物質ｐ-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェノールを投与したラットのうち2個体（個体識別番号：tmp-1およびtmp-3）と対照群とが大きく2群に分類され、さらに、残りの1個体（個体識別番号：tmp-2）がその中間に位置した（図１）。中間に位置した個体（個体識別番号：tmp-2）は、血液生化学検査の結果、他の2個体（個体識別番号：tmp-1およびtmp-3）よりもクレアチニン（CRE）の異常値の程度が低く（図２）、該クラスタ分析の結果は上記クレアチニンの異常値と相関していた。なお、血液生化学検査におけるクレアチニン（CRE）の値は、腎臓に障害が起こると異常値を示すマーカーであることが知られている。
【実施例２】
【０１３０】
[ｐ-クミルフェノールの腎臓毒性]
ｐ-クミルフェノールは、国立医薬品食品衛生研究所の既存化学物質毒性データベースにおいて腎臓毒性が報告されている化学物質である。本発明における生体応答遺伝子セットで上記化学物質による腎臓毒性を検出できるかを検証した。
【０１３１】
[ｐ-クミルフェノール投与試験]
実施例１の場合と同様の方法により、ｐ-クミルフェノール（和光純薬株式会社製）（500mg/kg）を28日間反復してSDラット（６週齢、雄）に経口投与した。正常対照群として、化学物質ｐ-クミルフェノールを溶解したオリブ油（小堺製薬株式会社製）を28日間反復してSDラット（６週齢、雄）に経口投与した。さらに、上記と同様の方法によりラットから腎臓を採取し、血液生化学検査および遺伝子発現プロファイルを取得した。
【０１３２】
[血液生化学検査]
クレアチニン（CRE）の値が対照群と比較して上記化学物質投与群が有意に高かった（P＜0.004）（図３）。
【０１３３】
[クラスタ分析]
上記同定された遺伝子セットのデータを用いて、同様にクラスタ分析を行った。その結果、ｐ-クミルフェノールを投与したラットはすべて上記ｐ-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェノールを投与したラットのうちの1個体（個体識別番号：tmp-2）と同じクラスタを形成した。一方、化学物質を投与していないラット（Cont）は6個体とも対照群と同じクラスタを形成した（図４）。
【実施例３】
【０１３４】
[生体応答遺伝子セットの絞り込み]
上記生体応答遺伝子セットから、個体識別番号tmp-2と対照群とのlog2比の差の絶対値が0.75以上の遺伝子を抽出した（２８遺伝子）。
【０１３５】
[クラスタ分析]
上記同定された生体応答遺伝子セットのデータを用いて、同様にクラスタ分析を行った。その結果、ｐ-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェノール投与群と対照群が2群に分類された（図５）。
【０１３６】
[ｐ-クミルフェノールの毒性評価]
上記同定された生体応答遺伝子セットのデータを用いて、同様にクラスタ分析を行った。その結果、ｐ-クミルフェノールを投与したラットはすべて上記ｐ-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェノールを投与したラットのうちの1個体（個体識別番号：tmp-2）と同じクラスタを形成した。一方、化学物質を投与していないラット（Cont）は6個体とも対照群と同じクラスタを形成した（図５）。
【実施例４】
【０１３７】
2−ブタノンオキシム、ｍ−キシリレンジアミン、3-シアノピリジン、2−（2−アミノエチルアミノ）エタノール、テトラヒドロフルフリルアルコール、メタクリルアミド、スルホラン、2-イソプロポキシエタノール、ヒドラジン一水和物、4-エチルモルホリン、メタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド、塩化ベンジルトリメチルアンモニウム、ｍ-ニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム、1-ナフチルアミン-4-スルホン酸ナトリウム四水和物、3-メトキシ-3-メチル-1-ブタノール、o-ジクロロベンゼン、3,4-キシリジン、N-メチルアニリン、トリレンジイソシアナート、2-（ジブチルアミノ）エタノール、ｐ-クミルフェノール、ｍ-クレゾール、2,3-ジメチルアニリン、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド、フタル酸ジヘプチル、テトラブロモエタン、アジピン酸ジブチル、P-エチルフェノール、ο-t-ブチルフェノールおよびｐ-（1,1,3,3,-テトラメチルブチル）フェノールをそれぞれ適当な濃度で28日間反復してラットに曝露させたのち、腎臓組織からｍＲＮＡを単離し、遺伝子発現プロファイルを取得した。それらの遺伝子発現プロファイルから生体応答遺伝子群：(1)ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 1、(2)AHNAK nucleoprotein、(3)alpha 1,3-galactosyltransferase 2、(4)alpha-2-macroglobulin、(5)annexin A2、(6)aquaporin 6, kidney specific、(7)calbindin 1、(8)camello-like 1、(9)cathepsin D、(10)CD24 molecule、(11)Cd44 molecule、(12)claudin 3、(13)collagen triple helix repeat containing 1、(14)cysteine sulfinic acid decarboxylase、(15)deiodinase, iodothyronine, type I、(16)deleted in colorectal carcinoma、(17)deoxyribonuclease I、(18)fibrinogen beta chain、(19)flavin containing monooxygenase 3、(20)glutamate-cysteine ligase, catalytic subunit、(21)glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、(22)glycoprotein (transmembrane) nmb、(23)histamine N-methyltransferase、(24)hypothetical protein LOC56728、(25)kallikrein、(26)kidney androgen regulated protein、(27)lectin, galactoside-binding, soluble, 3、(28)matrix Gla protein、(29)oxidative stress induced growth inhibitor 1、(30)paternally expressed 12、(31)protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 1A、(32)RAS, dexamethasone-induced 1、(regucalcin (senescence marker protein-30)、(33)regucalcin (senescence marker protein-30)、(34)S100 calcium binding protein A10、(35)S100 calcium binding protein A6、(36)secreted phosphoprotein 2、(37)serine (or cysteine) peptidase inhibitor, clade A, member 3K、(38)similar to CPE-receptor、(39)similar to tumor necrosis factor receptor superfamily, mber 12a、(40)solute carrier family 22 (organic cation transporter), member 2、(41)solute carrier family 34 (sodium phosphate), member 2、(42)solute carrier family 4 (anion exchanger), member 1、(43)suppressor of cytokine signaling 3、(44)thymosin, beta 10、(45)tonin、(46)translin、(47)trefoil factor 3, intestinal、(48)ubiquitin D、(49)uromodulinの遺伝子発現データを抽出して遺伝子発現データセットとした。
【０１３８】
これらの遺伝子発現データをもとにしてクラスタ分析を行ったところ、ｐ-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェノールを投与したラットのうち２個体が一つのクラスタを形成し、ｐ-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェノールの１個体とｐ-クミルフェノールを投与したラットの３個体すべてが一つのクラスタを形成した（図７）。また、その他の化学物質は対照群と同じクラスタの中で混在していた（図７）。
【０１３９】
なお、ｐ-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェノールおよびｐ-クミルフェノールはラットに２８日間反復投与することにより腎臓に毒性を有することが知られている（http://dra4.nihs.go.jp/mhlw_data/jsp/SearchPage.jsp）。
【０１４０】
これらのことは、被検化学物質について同様の動物実験を行い、この生体応答遺伝子セットについての遺伝子発現レベルを測定した後、前記遺伝子発現データセットを用いて比較することにより、被検化学物質について、少なくともｐ-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェノールおよびｐ-クミルフェノールに類似した毒性の有無を判定できることを意味する。
【０１４１】
なお、表１から５は、ＤＮＡマイクロアレイ法により取得した遺伝子発現データセットの例を示す。左端の列は生体応答遺伝子の遺伝子名であり、その次の列にはGenBank IDを記載してある。また一番上の行には、化学物質の略号を記しており、mcaはメタクリルアミドを、sufはスルホランを、2ipは2-イソプロポキシエタノールを、hmhはヒドラジン一水和物を、4emは4-エチルモルホリンを、mtaはメタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリドを、bacは塩化ベンジルトリメチルアンモニウムを、mnsはｍ-ニトロベンゼンスルホン酸ナトリウムを、natは1-ナフチルアミン-4-スルホン酸ナトリウム四水和物を、mmbは3-メトキシ-3-メチル-1-ブタノールを、dcbはo-ジクロロベンゼンを、34xは3,4-キシリジンを、nmaはN-メチルアニリンを、tdnはトリレンジイソシアナートを、2deは2-（ジブチルアミノ）エタノールを、pcpはｐ-クミルフェノールを、mcsはｍ-クレゾールを、23dは2,3-ジメチルアニリンを、dhcはN,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミドを、dhpはフタル酸ジヘプチルを、tbeはテトラブロモエタンを、dbaはアジピン酸ジブチルを、pepはP-エチルフェノールを、tbpはο-t-ブチルフェノールを、tmpはｐ-（1,1,3,3,-テトラメチルブチル）フェノールである。数値は、それぞれの化学物質を28日間ラットに反復して投与した後の腎臓の遺伝子発現レベルを対照群の平均値の相対比に換算した値である。
【実施例５】
【０１４２】
2−ブタノンオキシム、ｍ−キシリレンジアミン、3-シアノピリジン、2−（2−アミノエチルアミノ）エタノール、テトラヒドロフルフリルアルコール、メタクリルアミド、スルホラン、2-イソプロポキシエタノール、ヒドラジン一水和物、4-エチルモルホリン、メタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド、塩化ベンジルトリメチルアンモニウム、ｍ-ニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム、1-ナフチルアミン-4-スルホン酸ナトリウム四水和物、3-メトキシ-3-メチル-1-ブタノール、o-ジクロロベンゼン、3,4-キシリジン、N-メチルアニリン、トリレンジイソシアナート、2-（ジブチルアミノ）エタノール、ｐ-クミルフェノール、ｍ-クレゾール、2,3-ジメチルアニリン、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド、フタル酸ジヘプチル、テトラブロモエタン、アジピン酸ジブチル、P-エチルフェノール、ο-t-ブチルフェノールおよびｐ-（1,1,3,3,-テトラメチルブチル）フェノールをそれぞれ適当な濃度で28日間反復してラットに曝露させたのち、腎臓組織からｍＲＮＡを単離し、遺伝子発現プロファイルを取得した。それらの遺伝子発現プロファイルから生体応答遺伝子群：（１）ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 1、（２）alpha 1,3-galactosyltransferase 2、（３）alpha-2-macroglobulin、（４）annexin A2、（５）aquaporin 6, kidney specific、（６）calbindin 1、（７）cathepsin D、（８）CD24 molecule、（９）Cd44 molecule、（１０）claudin 3、（１１）cysteine sulfinic acid decarboxylase、（１２）deoxyribonuclease I、（１３）fibrinogen beta chain、（１４）glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、（１５）glycoprotein (transmembrane) nmb、（１６）lectin, galactoside-binding, soluble, 3、（１７）matrix Gla protein、（１８）oxidative stress induced growth inhibitor 1、（１９）RAS, dexamethasone-induced 1、（２０）S100 calcium binding protein A10、（２１）secreted phosphoprotein 2、（２２）similar to CPE-receptor、（２３）similar to tumor necrosis factor receptor superfamily, mber 12a、（２４）solute carrier family 34 (sodium phosphate), member 2、（２５）solute carrier family 4 (anion exchanger), member 1、（２６）suppressor of cytokine signaling 3、（２７）thymosin, beta 10、（２８）translin、の遺伝子発現データを抽出して遺伝子発現データセットとした。
【０１４３】
これらの遺伝子発現データをもとにしてクラスタ分析を行ったところ、ｐ-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェノールを投与したラットのうち２個体が一つのクラスタを形成し、ｐ-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェノールの１個体とｐ-クミルフェノールを投与したラットの３個体すべてが一つのクラスタを形成した（図７）。また、その他の化学物質は対照群と同じクラスタの中で混在していた（図７）。
【０１４４】
なお、ｐ-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェノールおよびｐ-クミルフェノールはラットに２８日間反復投与することにより腎臓に毒性を有することが知られている（http://dra4.nihs.go.jp/mhlw_data/jsp/SearchPage.jsp）。
【０１４５】
これらのことは、被検化学物質について同様の動物実験を行い、この生体応答遺伝子セットについての遺伝子発現レベルを測定した後、この遺伝子発現データセットを用いて比較することにより、被検化学物質について、少なくともｐ-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェノールおよびｐ-クミルフェノールに類似した毒性の有無を判定できることを意味する。
【産業上の利用可能性】
【０１４６】
本発明の腎臓毒性判定遺伝子セットは、腎障害、すなわち、腎臓疾患、損傷または毒性のモニタリング、それらの診断および/またはそれらに対する種々の措置もしくは薬剤の有効性を判定することを助けることができる可能性がある。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学物質が生体に与える影響、生体毒性の検出、診断、予測および/もしくは処置のための方法、および、生体毒性を検出又は予測するためのキットに関する。特に、本発明は、化学物質が生体に与える影響を指標とした化学物質の毒性の検出・予測方法、腎臓毒性の処置の有効性を確認することを助けるための遺伝子発現解析手段およびその結果の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
我が国では、環境と調和した健全な産業活動及び安心・安全な国民生活の実現を目指した化学物質リスク評価・管理システムの構築へ向け、公的な環境安心イノベーションプログラムが進められている。
【０００３】
人類が生活する環境の中で、膨大な数の化学物質が利用されており、現在でも年々新しい化学物質が開発され続けている。しかしながら、これらの化学物質が環境中に放出されることにより、人体を含む生態系に有害な影響を及ぼすことが問題となっており、特に化学物質による環境汚染による人体への影響は社会問題にまでなっている。したがって、化学物質のリスク（特に人体に与える影響）を評価することは社会的な要請が強い。
【０００４】
これまでの化学物質のリスク評価は、細菌等を用いた単純で簡便な試験、及び、ラット等の実験動物を用いた長期毒性試験によって取得・蓄積されてきた知見を、その基盤としていた。
【０００５】
しかし、これらの従来の毒性学的な手法によって獲得される生物学的情報は知見の種類が限られること、並びに、長期毒性試験では費用と効率等の面で問題があることから、これらの課題を解決できる新規の手法の確立が必要であった。
【０００６】
近年、急速な発展を見せるゲノム学的なアプローチが、薬剤の有効性評価（ファーマコゲノミクス）（非特許文献１、非特許文献２）、食物の生体への影響評価（ニュートリゲノミクス）（非特許文献３）等と同様に、化学物質の生物学的活性（特にその有害性）の評価にも応用され始めてきた（トキシコゲノミクス）（非特許文献４、非特許文献５）。
【０００７】
これらのゲノム学的手法は、全遺伝子を個々のパラメータとして活用できるという、従来の手法では得られない膨大かつ多様な観点による生物学的現象の評価を可能にした。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００４−２３３１０５号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Alison H. Harrill et al., ExpertOpin. Drug Metab. Tosicol. November；４（１１）：１３７９−１３８９（２００８）
【非特許文献２】Elisa Giovannetti et al., Mol. CancerTher. ５（６）：１３８７−１３９４（２００６）
【非特許文献３】Licia Iacoviello et al., Genes Nutr. ３：１９−２４（２００８）
【非特許文献４】Preeti Chavan et al., Evid BasedComplement Alternat Med. Dec；３（４）：４４７−４５７（２００６）
【非特許文献５】渡邉肇 YAKUGAKU ZASSHI：１２７（１２）：１９６７−１９７４（２００７）
【非特許文献６】Paolo Fortina et al., Nature Biotech.２６：２９３−２９４（２００８）
【非特許文献７】Gary K Geiss et al., Nature Biotech. ２６：３１７−３２５（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は化学物質の毒性を簡便かつ確実に検出するための指標の一つを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、既存化学物質毒性データベース（http://dra4.nihs.go.jp/mhlw_data/jsp/SearchPage.jsp）に登録されているうちから腎臓毒性を有することが知られている化学物質を投与したラットの腎臓と正常ラットの腎臓における遺伝子発現を網羅的に比較することにより、両者間で発現レベルに差がある遺伝子を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、（１）化学物質が生体に与える影響を遺伝子発現レベルで検出することにより被検化学物質の毒性を検出する方法であって、（Ａ）前記化学物質の曝露を受けた腎臓組織または腎臓由来の細胞試料に対して、生体応答遺伝子群： (1)ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 1、(2)AHNAK nucleoprotein、(3)alpha 1,3-galactosyltransferase 2、(4)alpha-2-macroglobulin、(5)annexin A2、(6)aquaporin 6, kidney specific、(7)calbindin 1、(8)camello-like 1、(9)cathepsin D、(10)CD24 molecule、(11)Cd44 molecule、(12)claudin 3、(13)collagen triple helix repeat containing 1、(14)cysteine sulfinic acid decarboxylase、(15)deiodinase, iodothyronine, type I、(16)deleted in colorectal carcinoma、(17)deoxyribonuclease I、(18)fibrinogen beta chain、(19)flavin containing monooxygenase 3、(20)glutamate-cysteine ligase, catalytic subunit、(21)glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、(22)glycoprotein (transmembrane) nmb、(23)histamine N-methyltransferase、(24)hypothetical protein LOC56728、(25)kallikrein、(26)kidney androgen regulated protein、(27)lectin, galactoside-binding, soluble, 3、(28)matrix Gla protein、(29)oxidative stress induced growth inhibitor 1、(30)paternally expressed 12、(31)protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 1A、(32)RAS, dexamethasone-induced 1、(regucalcin (senescence marker protein-30)、(33)regucalcin (senescence marker protein-30)、(34)S100 calcium binding protein A10、(35)S100 calcium binding protein A6、(36)secreted phosphoprotein 2、(37)serine (or cysteine) peptidase inhibitor, clade A, member 3K、(38)similar to CPE-receptor、(39)similar to tumor necrosis factor receptor superfamily, mber 12a、(40)solute carrier family 22 (organic cation transporter), member 2、(41)solute carrier family 34 (sodium phosphate), member 2、(42)solute carrier family 4 (anion exchanger), member 1、(43)suppressor of cytokine signaling 3、(44)thymosin, beta 10、(45)tonin、(46)translin、(47)trefoil factor 3, intestinal、(48)ubiquitin D、(49)uromodulinのうちから選択される少なくとも１以上の生体応答遺伝子に対する遺伝子発現レベルを測定する第１の遺伝子発現レベル測定ステップと、
（Ｂ）前記化学物質の曝露を受けていない腎臓組織または腎臓由来の細胞試料に対して、前記第１の遺伝子発現レベル取得ステップにおいて選択された前記生体応答遺伝子のそれぞれに対する遺伝子発現レベルを測定する第２の遺伝子発現レベル測定ステップと、
（Ｃ）前記第１の遺伝子発現データレベル測定ステップ及び前記第２の遺伝子発現データレベル測定ステップにおける前記遺伝子発現レベルを比較するステップと、
を含むことを特徴とする化学物質の毒性の検出方法である。
【００１３】
また、（２）前記（１）に記載の方法であって、前記第１の遺伝子発現レベル取得ステップにおいて、選択される少なくとも１以上の前記生体応答遺伝子は、
（１）ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 1、（２）alpha 1,3-galactosyltransferase 2、（３）alpha-2-macroglobulin、（４）annexin A2、（５）aquaporin 6, kidney specific、（６）calbindin 1、（７）cathepsin D、（８）CD24 molecule、（９）Cd44 molecule、（１０）claudin 3、（１１）cysteine sulfinic acid decarboxylase、（１２）deoxyribonuclease I、（１３）fibrinogen beta chain、（１４）glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、（１５）glycoprotein (transmembrane) nmb、（１６）lectin, galactoside-binding, soluble, 3、（１７）matrix Gla protein、（１８）oxidative stress induced growth inhibitor 1、（１９）RAS, dexamethasone-induced 1、（２０）S100 calcium binding protein A10、（２１）secreted phosphoprotein 2、（２２）similar to CPE-receptor、（２３）similar to tumor necrosis factor receptor superfamily, mber 12a、（２４）solute carrier family 34 (sodium phosphate), member 2、（２５）solute carrier family 4 (anion exchanger), member 1、（２６）suppressor of cytokine signaling 3、（２７）thymosin, beta 10、（２８）translin、のうちの少なくともいずれか１つを含むことが望ましい。
【００１４】
また、（３）前記腎臓組織または前記細胞試料は、マウス、ラット、イヌ、サルまたはヒト由来であることを特徴とする、（１）または（２）のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性の検出方法であってもよい。
【００１５】
また、（４）遺伝子発現レベルの測定は、ＲＴ-ＰＣＲ法、iAFLP（introduced Amplified Fragment Length Polymorphism）法、LAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法、nCounter Analysis system、ハイブリダイゼーション法のうちの１つを用いることを特徴とする（１）または（２）のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性の検出方法であってもよい。
【００１６】
また、（５）前記ハイブリダイゼーション法は、マイクロアレイ法又はブロット法であることを特徴とする（１）または（２）のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性の検出方法であってもよい。
【００１７】
また、（６）前記マイクロアレイ法又はブロット法に用いられるプローブは、ヌクレオチド又はタンパク質であることを特徴とする（５）に記載の化学物質の毒性の検出方法であってもよい。
【００１８】
また、（７）前記ヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチドであることを特徴とする（６）に記載の化学物質の毒性の検出方法であってもよい。
【００１９】
また、（８）前記ヌクレオチドは、標識化ヌクレオチドであることを特徴とする（６）または（７）に記載の化学物質の毒性の検出方法であってもよい。
【００２０】
また、（９）前記遺伝子発現レベルの測定を前記生体応答遺伝子に対応する核酸又は前記生体応答遺伝子によってコードされるタンパク質の存在もしくは量を測定することで決定することを特徴とする（１）または（２）のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性の検出方法であってもよい。
【００２１】
また、（１０）前記遺伝子発現レベルの測定を免疫学的方法によって行うことを特徴とする（１）または（２）のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性の検出方法であっってもよい。
【００２２】
また、（１１）前記免疫学的方法は、前記生体応答遺伝子によってコードされるタンパク質又はその断片に対する特異抗体と標的タンパク質との免疫学的複合体を検出する方法であることを特徴とする（１０）に記載の化学物質の毒性の検出方法であってもよい。
【００２３】
また、（１２）前記特異抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、および抗体フラグメントから選択されることを特徴とする（１１）に記載の化学物質の毒性の検出方法。
【００２４】
また、本発明は（１３）（１）または（２）のうちのいずれか１つに記載の方法に用いられるプローブを含むキットであって、該プローブが、前記生体応答遺伝子に特異的にハイブリダイズする配列を有する分子を含むことを特徴とする化学物質の毒性の検出キットである。
【００２５】
また、（１４）前記プローブは、ヌクレオチド又はタンパク質であることを特徴とする（１３）記載の化学物質の毒性の検出キットであってもよい。
【００２６】
また、（１５）前記ヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチドであることを特徴とする（１４）に記載の化学物質の毒性の検出キットであってもよい。
【００２７】
また、（１６）前記ヌクレオチドは、前記生体応答遺伝子のセンス鎖又はアンチセンス鎖とハイブリダイズし、10〜100 merであることを特徴とする（１４）に記載の化学物質の毒性の検出キットであってもよい。
【００２８】
また、（１７）前記ヌクレオチドは、標識化ヌクレオチドであることを特徴とする（１５）または（１６）に記載の化学物質の毒性の検出キットであってもよい。
【００２９】
また、（１８）前記プローブは、抗体及び/又はアプタマーであるタンパク質であることを特徴とする（１４）に記載の化学物質の毒性の検出・予測キットであってもよい。
【００３０】
また、（１９）前記プローブは、少なくとも1つ以上を固体支持体に固定したＤＮＡマイクロアレイ、ＤＮＡチップ、タンパクチップまたは抗体チップを含むことを特徴とする（１３）ないし（１８）のうちの１つに記載の化学物質の毒性の検出キットであってもよい。
【００３１】
また、（２０）前記固体支持体は、ガラス、シリコン、プラスチック又は生体膜であることを特徴とする（１９）記載の化学物質の毒性の検出キットであってもよい。
【００３２】
また、本発明は（２１）化学物質が生体に与える影響を遺伝子発現レベルで検出することにより被検化学物質の毒性を検出するために用いられる照合データとしての遺伝子発現データベースを作成する方法であって、
（Ａ）2−ブタノンオキシム、ｍ−キシリレンジアミン、3-シアノピリジン、2−（2−アミノエチルアミノ）エタノール、テトラヒドロフルフリルアルコール、メタクリルアミド、スルホラン、2-イソプロポキシエタノール、ヒドラジン一水和物、4-エチルモルホリン、メタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド、塩化ベンジルトリメチルアンモニウム、ｍ-ニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム、1-ナフチルアミン-4-スルホン酸ナトリウム四水和物、3-メトキシ-3-メチル-1-ブタノール、o-ジクロロベンゼン、3,4-キシリジン、N-メチルアニリン、トリレンジイソシアナート、2-（ジブチルアミノ）エタノール、ｐ-クミルフェノール、ｍ-クレゾール、2,3-ジメチルアニリン、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド、フタル酸ジヘプチル、テトラブロモエタン、アジピン酸ジブチル、P-エチルフェノール、ο-t-ブチルフェノールおよびｐ-（1,1,3,3,-テトラメチルブチル）フェノールのそれぞれについて所定量を所定期間生体または腎臓由来の細胞試料に投与（曝露）するステップと、
（Ｂ）前記生体の腎臓組織または前記腎臓由来の前記細胞試料からｍＲＮＡを単離して、生体応答遺伝子群： (1)ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 1、(2)AHNAK nucleoprotein、(3)alpha 1,3-galactosyltransferase 2、(4)alpha-2-macroglobulin、(5)annexin A2、(6)aquaporin 6, kidney specific、(7)calbindin 1、(8)camello-like 1、(9)cathepsin D、(10)CD24 molecule、(11)Cd44 molecule、(12)claudin 3、(13)collagen triple helix repeat containing 1、(14)cysteine sulfinic acid decarboxylase、(15)deiodinase, iodothyronine, type I、(16)deleted in colorectal carcinoma、(17)deoxyribonuclease I、(18)fibrinogen beta chain、(19)flavin containing monooxygenase 3、(20)glutamate-cysteine ligase, catalytic subunit、(21)glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、(22)glycoprotein (transmembrane) nmb、(23)histamine N-methyltransferase、(24)hypothetical protein LOC56728、(25)kallikrein、(26)kidney androgen regulated protein、(27)lectin, galactoside-binding, soluble, 3、(28)matrix Gla protein、(29)oxidative stress induced growth inhibitor 1、(30)paternally expressed 12、(31)protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 1A、(32)RAS, dexamethasone-induced 1、(regucalcin (senescence marker protein-30)、(33)regucalcin (senescence marker protein-30)、(34)S100 calcium binding protein A10、(35)S100 calcium binding protein A6、(36)secreted phosphoprotein 2、(37)serine (or cysteine) peptidase inhibitor, clade A, member 3K、(38)similar to CPE-receptor、(39)similar to tumor necrosis factor receptor superfamily, mber 12a、(40)solute carrier family 22 (organic cation transporter), member 2、(41)solute carrier family 34 (sodium phosphate), member 2、(42)solute carrier family 4 (anion exchanger), member 1、(43)suppressor of cytokine signaling 3、(44)thymosin, beta 10、(45)tonin、(46)translin、(47)trefoil factor 3, intestinal、(48)ubiquitin D、(49)uromodulinのうちから選択される少なくとも１以上の生体応答遺伝子に対する遺伝子発現レベルを測定するステップと、
（Ｃ）（Ｂ）で得られた前記遺伝子発現レベルを対応する前記化学物質、曝露量及び曝露期間とともに遺伝子発現データとしてデータベース化するステップと、
を含むことを特徴とする照合用遺伝子発現データベースの作成方法である。
【００３３】
また、（２２）選択される少なくとも１以上の前記生体応答遺伝子は、
（１）ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 1、（２）alpha 1,3-galactosyltransferase 2、（３）alpha-2-macroglobulin、（４）annexin A2、（５）aquaporin 6, kidney specific、（６）calbindin 1、（７）cathepsin D、（８）CD24 molecule、（９）Cd44 molecule、（１０）claudin 3、（１１）cysteine sulfinic acid decarboxylase、（１２）deoxyribonuclease I、（１３）fibrinogen beta chain、（１４）glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、（１５）glycoprotein (transmembrane) nmb、（１６）lectin, galactoside-binding, soluble, 3、（１７）matrix Gla protein、（１８）oxidative stress induced growth inhibitor 1、（１９）RAS, dexamethasone-induced 1、（２０）S100 calcium binding protein A10、（２１）secreted phosphoprotein 2、（２２）similar to CPE-receptor、（２３）similar to tumor necrosis factor receptor superfamily, mber 12a、（２４）solute carrier family 34 (sodium phosphate), member 2、（２５）solute carrier family 4 (anion exchanger), member 1、（２６）suppressor of cytokine signaling 3、（２７）thymosin, beta 10、（２８）translin、のうちの少なくともいずれか１つを含むことを特徴とする（２１）に記載の照合用遺伝子発現データベースの作成方法が望ましい。
【００３４】
また、（２３）前記腎臓組織または前記細胞試料は、マウス、ラット、イヌ、サルまたはヒト由来であることを特徴とする、（２１）または（２２）に記載の照合用遺伝子発現データベースの作成方法であってもよい。
【００３５】
また、（２４）遺伝子発現レベルの測定は、ＲＴ-ＰＣＲ法、iAFLP（introduced Amplified Fragment Length Polymorphism）法、LAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法、nCounter Analysis system、ハイブリダイゼーション法のうちの１つを用いることを特徴とする（２１）または（２２）に記載の照合用遺伝子発現データベースの作成方法であってもよい。
【００３６】
また、（２５）前記ハイブリダイゼーション法は、マイクロアレイ法又はブロット法であることを特徴とする（２４）に記載の照合用遺伝子発現データベースの作成方法であってもよい。
【００３７】
また、（２６）前記マイクロアレイ法又はブロット法に用いられるプローブは、ヌクレオチド又はタンパク質であることを特徴とする（２５）に記載の照合用遺伝子発現データベースの作成方法であってもよい。
【００３８】
また、（２７）前記ヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチドであることを特徴とする（２６）に記載の照合用遺伝子発現データベースの作成方法であってもよい。
【００３９】
また、（２８）前記ヌクレオチドは、標識化ヌクレオチドであることを特徴とする（２６）または（２７）に記載の照合用遺伝子発現データベースの作成方法であってもよい。
【００４０】
また、（２９）前記遺伝子発現レベルの測定を前記生体応答遺伝子に対応する核酸又は前記生体応答遺伝子によってコードされるタンパク質の存在もしくは量を測定することで決定することを特徴とする（２１）または（２２）のうちのいずれか１つに記載の照合用遺伝子発現データベースの作成方法であってもよい。
【００４１】
また、（３０）前記遺伝子発現レベルの測定を免疫学的方法によって行うことを特徴とする（２１）または（２２）のうちのいずれか１つに記載の照合用遺伝子発現データベースの作成方法であってもよい。
【００４２】
また、（３１）前記免疫学的方法は、前記生体応答遺伝子によってコードされるタンパク質又はその断片に対する特異抗体と標的タンパク質との免疫学的複合体を検出する方法であることを特徴とする（３０）に記載の照合用遺伝子発現データベースの作成方法または化学物質の毒性の検出・予測方法であってもよい。
【００４３】
また、（３２）前記特異抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、および抗体フラグメントから選択されることを特徴とする（３１）に記載の照合用遺伝子発現データベースの作成方法であってもよい。
【００４４】
また、本発明は（３３）（２１）または（２２）のいずれか１つに記載の方法に用いられるプローブを含むキットであって、該プローブが、前記生体応答遺伝子に特異的にハイブリダイズする配列を有する分子を含むことを特徴とする照合用遺伝子発現データベースの作成キットである。
【００４５】
また、（３４）前記プローブは、ヌクレオチド又はタンパク質であることを特徴とする（３３）に記載の照合用遺伝子発現データベースの作成キットであってもよい。
【００４６】
また、（３５）前記ヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチドであることを特徴とする（３４）に記載の照合用遺伝子発現データベースの作成キットであってもよい。
【００４７】
また、（３６）前記ヌクレオチドは、前記生体応答遺伝子のセンス鎖又はアンチセンス鎖とハイブリダイズし、10〜100 merであることを特徴とする（３４）に記載の照合用遺伝子発現データベースの作成キットであってもよい。
【００４８】
また、（３７）前記ヌクレオチドは、標識化ヌクレオチドであることを特徴とする（３５）または（３６）に記載の照合用遺伝子発現データベースの作成キットであってもよい。
【００４９】
また、（３８）前記プローブは、抗体及び/又はアプタマーであるタンパク質であることを特徴とする（３３）に記載の照合用遺伝子発現データベースの作成キットであってもよい。
【００５０】
また、（３９）前記プローブは、少なくとも1つ以上を固体支持体に固定したＤＮＡマイクロアレイ、ＤＮＡチップ、タンパクチップまたは抗体チップを含むことを特徴とする（３３）ないし（３８）のうちの１つに記載の照合用遺伝子発現データベースの作成キットであってもよい。
【００５１】
また、（４０）前記固体支持体は、ガラス、シリコン、プラスチック又は生体膜であることを特徴とする（３９）に記載の照合用遺伝子発現データベースの作成キットであってもよい。
【００５２】
また、本発明は（４１）化学物質が生体に与える影響を遺伝子発現レベルで検出することにより被検化学物質の毒性を検出・予測する方法であって、
（Ａ）2−ブタノンオキシム、ｍ−キシリレンジアミン、3-シアノピリジン、2−（2−アミノエチルアミノ）エタノール、テトラヒドロフルフリルアルコール、メタクリルアミド、スルホラン、2-イソプロポキシエタノール、ヒドラジン一水和物、4-エチルモルホリン、メタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド、塩化ベンジルトリメチルアンモニウム、ｍ-ニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム、1-ナフチルアミン-4-スルホン酸ナトリウム四水和物、3-メトキシ-3-メチル-1-ブタノール、o-ジクロロベンゼン、3,4-キシリジン、N-メチルアニリン、トリレンジイソシアナート、2-（ジブチルアミノ）エタノール、ｐ-クミルフェノール、ｍ-クレゾール、2,3-ジメチルアニリン、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド、フタル酸ジヘプチル、テトラブロモエタン、アジピン酸ジブチル、P-エチルフェノール、ο-t-ブチルフェノールおよびｐ-（1,1,3,3,-テトラメチルブチル）フェノールのそれぞれについて所定量を一定期間生体または腎臓由来の細胞試料に投与（曝露）するステップと、
（Ｂ）前記生体由来の腎臓組織または前記腎臓由来の前記細胞試料からｍＲＮＡを単離して、生体応答遺伝子群： (1)ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 1、(2)AHNAK nucleoprotein、(3)alpha 1,3-galactosyltransferase 2、(4)alpha-2-macroglobulin、(5)annexin A2、(6)aquaporin 6, kidney specific、(7)calbindin 1、(8)camello-like 1、(9)cathepsin D、(10)CD24 molecule、(11)Cd44 molecule、(12)claudin 3、(13)collagen triple helix repeat containing 1、(14)cysteine sulfinic acid decarboxylase、(15)deiodinase, iodothyronine, type I、(16)deleted in colorectal carcinoma、(17)deoxyribonuclease I、(18)fibrinogen beta chain、(19)flavin containing monooxygenase 3、(20)glutamate-cysteine ligase, catalytic subunit、(21)glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、(22)glycoprotein (transmembrane) nmb、(23)histamine N-methyltransferase、(24)hypothetical protein LOC56728、(25)kallikrein、(26)kidney androgen regulated protein、(27)lectin, galactoside-binding, soluble, 3、(28)matrix Gla protein、(29)oxidative stress induced growth inhibitor 1、(30)paternally expressed 12、(31)protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 1A、(32)RAS, dexamethasone-induced 1、(regucalcin (senescence marker protein-30)、(33)regucalcin (senescence marker protein-30)、(34)S100 calcium binding protein A10、(35)S100 calcium binding protein A6、(36)secreted phosphoprotein 2、(37)serine (or cysteine) peptidase inhibitor, clade A, member 3K、(38)similar to CPE-receptor、(39)similar to tumor necrosis factor receptor superfamily, mber 12a、(40)solute carrier family 22 (organic cation transporter), member 2、(41)solute carrier family 34 (sodium phosphate), member 2、(42)solute carrier family 4 (anion exchanger), member 1、(43)suppressor of cytokine signaling 3、(44)thymosin, beta 10、(45)tonin、(46)translin、(47)trefoil factor 3, intestinal、(48)ubiquitin D、(49)uromodulinのうちから少なくとも1以上の生体応答遺伝子に対する遺伝子発現レベルを測定するステップと、
（Ｃ）（Ｂ）で得られた前記遺伝子発現レベルを対応する前記化学物質、曝露量、曝露期間とともに遺伝子発現データとして収集するステップと、
（Ｄ）被検化学物質を適当な濃度で一定期間生体または腎臓由来の細胞試料に曝露させるステップと、
（Ｅ）前記生体由来の前記腎臓組織または前記腎臓由来の細胞試料からｍＲＮＡを単離して、生体応答遺伝子群： (1)ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 1、(2)AHNAK nucleoprotein、(3)alpha 1,3-galactosyltransferase 2、(4)alpha-2-macroglobulin、(5)annexin A2、(6)aquaporin 6, kidney specific、(7)calbindin 1、(8)camello-like 1、(9)cathepsin D、(10)CD24 molecule、(11)Cd44 molecule、(12)claudin 3、(13)collagen triple helix repeat containing 1、(14)cysteine sulfinic acid decarboxylase、(15)deiodinase, iodothyronine, type I、(16)deleted in colorectal carcinoma、(17)deoxyribonuclease I、(18)fibrinogen beta chain、(19)flavin containing monooxygenase 3、(20)glutamate-cysteine ligase, catalytic subunit、(21)glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、(22)glycoprotein (transmembrane) nmb、(23)histamine N-methyltransferase、(24)hypothetical protein LOC56728、(25)kallikrein、(26)kidney androgen regulated protein、(27)lectin, galactoside-binding, soluble, 3、(28)matrix Gla protein、(29)oxidative stress induced growth inhibitor 1、(30)paternally expressed 12、(31)protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 1A、(32)RAS, dexamethasone-induced 1、(regucalcin (senescence marker protein-30)、(33)regucalcin (senescence marker protein-30)、(34)S100 calcium binding protein A10、(35)S100 calcium binding protein A6、(36)secreted phosphoprotein 2、(37)serine (or cysteine) peptidase inhibitor, clade A, member 3K、(38)similar to CPE-receptor、(39)similar to tumor necrosis factor receptor superfamily, mber 12a、(40)solute carrier family 22 (organic cation transporter), member 2、(41)solute carrier family 34 (sodium phosphate), member 2、(42)solute carrier family 4 (anion exchanger), member 1、(43)suppressor of cytokine signaling 3、(44)thymosin, beta 10、(45)tonin、(46)translin、(47)trefoil factor 3, intestinal、(48)ubiquitin D、(49)uromodulinのうちから選択される少なくとも１以上の生体応答遺伝子に対する遺伝子発現レベルを測定するステップと、
（Ｆ）（Ｅ）で得られた前記遺伝子発現レベルを前記被検化学物質、曝露量及び曝露期間とともに遺伝子発現データとして収集するステップと、
（Ｇ）（Ｆ）で収集された遺伝子発現データを（Ｃ）で収集された照合用の対応する遺伝子発現データと比較するステップと、
を含むことを特徴とする化学物質の毒性検出・予測方法である。
【００５３】
また、（４２）（４１）に記載の（Ｂ）および（Ｅ）において選択される少なくとも１以上の前記生体応答遺伝子は、
（１）ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 1、（２）alpha 1,3-galactosyltransferase 2、（３）alpha-2-macroglobulin、（４）annexin A2、（５）aquaporin 6, kidney specific、（６）calbindin 1、（７）cathepsin D、（８）CD24 molecule、（９）Cd44 molecule、（１０）claudin 3、（１１）cysteine sulfinic acid decarboxylase、（１２）deoxyribonuclease I、（１３）fibrinogen beta chain、（１４）glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、（１５）glycoprotein (transmembrane) nmb、（１６）lectin, galactoside-binding, soluble, 3、（１７）matrix Gla protein、（１８）oxidative stress induced growth inhibitor 1、（１９）RAS, dexamethasone-induced 1、（２０）S100 calcium binding protein A10、（２１）secreted phosphoprotein 2、（２２）similar to CPE-receptor、（２３）similar to tumor necrosis factor receptor superfamily, mber 12a、（２４）solute carrier family 34 (sodium phosphate), member 2、（２５）solute carrier family 4 (anion exchanger), member 1、（２６）suppressor of cytokine signaling 3、（２７）thymosin, beta 10、（２８）translin、のうちの少なくともいずれか１つを含むことを特徴とする、（４１）に記載の化学物質の毒性検出・予測方法であってもよい。
【００５４】
また、（４３）前記腎臓組織または前記細胞試料は、マウス、ラット、イヌ、サルまたはヒト由来であることを特徴とする、（４１）または（４２）のうちの１つに記載の化学物質の毒性の検出・予測方法であってもよい。
【００５５】
また、（４４）遺伝子発現レベルの測定は、ＲＴ-ＰＣＲ法、iAFLP（introduced
Amplified Fragment Length Polymorphism）法、LAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法、nCounter
Analysis system、ハイブリダイゼーション法のうちの１つを用いることを特徴とする（４１）または（４２）のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性の検出・予測方法であってもよい。
【００５６】
また、（４５）前記ハイブリダイゼーション法は、マイクロアレイ法又はブロット法であることを特徴とする（４４）に記載の化学物質の毒性の検出・予測方法であってもよい。
【００５７】
また、（４６）前記マイクロアレイ法又はブロット法に用いられるプローブは、ヌクレオチド又はタンパク質であることを特徴とする（４５）に記載の化学物質の毒性の検出・予測方法であってもよい。
【００５８】
また、（４７）前記ヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチドであることを特徴とする（４６）に記載の化学物質の毒性の検出・予測方法であってもよい。
【００５９】
また、（４８）前記ヌクレオチドは、標識化ヌクレオチドであることを特徴とする（４５）または（４７）に記載の化学物質の毒性の検出・予測方法であってもよい。
【００６０】
また、（４９）前記遺伝子発現レベルの測定を前記生体応答遺伝子に対応する核酸又は前記生体応答遺伝子によってコードされるタンパク質の存在もしくは量を測定することで決定することを特徴とする（４１）または（４２）のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性の検出・予測方法であってもよい。
【００６１】
また、（５０）前記遺伝子発現レベルの測定を免疫学的方法によって行うことを特徴とする（４１）または（４２）のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性の検出・予測方法であってもよい。
【００６２】
また、（５１）前記免疫学的方法は、前記生体応答遺伝子によってコードされるタンパク質又はその断片に対する特異抗体と標的タンパク質との免疫学的複合体を検出する方法であることを特徴とする（５０）に記載の化学物質の毒性の検出・予測方法であってもよい。
【００６３】
また、（５２）前記特異抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、および抗体フラグメントから選択されることを特徴とする（５１）に記載の化学物質の毒性の検出・予測方法であってもよい。
【００６４】
また、本発明は（５３）（４１）または（４２）のうちのいずれか１つに記載の方法に用いられるプローブを含むキットであって、該プローブが、前記生体応答遺伝子に特異的にハイブリダイズする配列を有する分子を含むことを特徴とする化学物質の毒性の検出・予測キットである。
【００６５】
また、（５４）前記プローブは、ヌクレオチド又はタンパク質であることを特徴とする（５３）記載の化学物質の毒性の検出・予測キットであってもよい。
【００６６】
また、（５５）前記ヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチドであることを特徴とする（５４）に記載の化学物質の毒性の検出・予測キットであってもよい。
【００６７】
また、（５６）前記ヌクレオチドは、前記生体応答遺伝子のセンス鎖又はアンチセンス鎖とハイブリダイズし、10〜100 merであることを特徴とする（５４）に記載の化学物質の毒性の検出・予測キットであってもよい。
【００６８】
また、（５７）前記ヌクレオチドは、標識化ヌクレオチドであることを特徴とする（５５）または（５６）に記載の化学物質の毒性の検出・予測キットであってもよい。
【００６９】
また、（５８）前記プローブは、抗体及び/又はアプタマーであるタンパク質であることを特徴とする（５４）に記載の化学物質の毒性の検出・予測キットであってもよい。
【００７０】
また、（５９）前記プローブは、少なくとも1つ以上を固体支持体に固定したＤＮＡマイクロアレイ、ＤＮＡチップ、タンパクチップまたは抗体チップを含むことを特徴とする（５３）ないし（５８）のうちの１つに記載の化学物質の毒性の検出・予測キットであってもよい。
【００７１】
また、（６０）前記固体支持体は、ガラス、シリコン、プラスチック又は生体膜であることを特徴とする（５９）に記載の化学物質の毒性の検出・予測キットであってもよい。
【発明の効果】
【００７２】
本発明によれば、化学物質を生体に投与した後の臓器における遺伝子発現様式を比較することにより、化学物質が生体に対して毒性を有するか否かを簡便に判定あるいは予測できる。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】クラスタ分析を表す。デンドログラムの下のカラムに記載されているtmp-1、tmp-2、tmp-3はｐ-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェノールを28日間反復投与したラットの腎臓サンプルを表す。また、対照-１、対照-２、対照-３はそれぞれオリブ油を28日間反復投与したラットの腎臓サンプルを表す。なお、記号の後の数字は個体番号を表している。さらに、図中右側のカラムは遺伝子数を表示している。また、図中左側のバーはlog2比値を表している。
【図２】CRE（血中クレアチニン）の値をグラフ化したものを表す。デンドログラムの下のカラムに記載されている対照-１、対照-２、対照-３はそれぞれオリブ油を28日間反復投与したラットの腎臓サンプルを表す。また、tmp-1、tmp-2、tmp-3はそれぞれ化学物質ｐ-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェノールを28日間反復投与したラットの腎臓サンプルを表す。なお、記号の後の数字は個体番号を表している。
【図３】CRE（血中クレアチニン）の値をグラフ化したものを表す。デンドログラムの下のカラムに記載されている対照A-１、対照A-２、対照A-３、対照B-１、対照B-２、対照B-３、はそれぞれオリブ油を28日間反復投与したラットの腎臓サンプルを表している。また、tmp-1、tmp-2、tmp-3はそれぞれ化学物質ｐ-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェノールを28日間反復投与したラットの腎臓サンプルを表す。さらに、pcp-1、pcp-2、pcp-3はそれぞれ化学物質ｐ-クミルフェノールを28日間反復投与したラットの腎臓サンプルを表す。なお、記号の後の数字は個体番号を表している。
【図４】クラスタ分析を表す。デンドログラムの下のカラムに記載されているtmp-1、tmp-2、tmp-3はｐ-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェノールを28日間反復投与したラットの腎臓サンプルを表し、pcp-1、pcp-2、pcp-3はそれぞれ化学物質ｐ-クミルフェノールを28日間反復投与したラットの腎臓サンプルを表す。なお、記号の後の数字は個体番号を表している。また、対照はオリブ油を28日間反復投与したラットの腎臓サンプルを表し、contは対照以外の正常ラットの腎臓サンプルを表す。さらに、図中右側のカラムは遺伝子数を表示している。また、図中左側のバーはlog2比値を表している。
【図５】クラスタ分析を表す。デンドログラムの下のカラムに記載されているtmp-1、tmp-2、tmp-3はｐ-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェノールを28日間反復投与したラットの腎臓サンプルを表す。また、対照-１、対照-２、対照-３はそれぞれオリブ油を28日間反復投与したラットの腎臓サンプルを表す。なお、記号の後の数字は個体番号を表している。さらに、図中右側のカラムは遺伝子数を表示している。また、図中左側のバーはlog2比値を表している。
【図６】４９個の生体応答遺伝子の遺伝子発現データセットによるクラスタ分析を表す。デンドログラムの下のカラムはそれぞれラットに投与した化学物質の区別を表しており、図中左上には各カラムに対する化学物質の対応一覧を記している。mcaはメタクリルアミドを、sufはスルホランを、2ipは2-イソプロポキシエタノールを、hmhはヒドラジン一水和物を、4emは4-エチルモルホリンを、mtaはメタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリドを、bacは塩化ベンジルトリメチルアンモニウムを、mnsはｍ-ニトロベンゼンスルホン酸ナトリウムを、natは1-ナフチルアミン-4-スルホン酸ナトリウム四水和物を、mmbは3-メトキシ-3-メチル-1-ブタノールを、dcbはo-ジクロロベンゼンを、34xは3,4-キシリジンを、nmaはN-メチルアニリンを、tdnはトリレンジイソシアナートを、2deは2-（ジブチルアミノ）エタノールを、pcpはｐ-クミルフェノールを、mcsはｍ-クレゾールを、23dは2,3-ジメチルアニリンを、dhcはN,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミドを、dhpはフタル酸ジヘプチルを、tbeはテトラブロモエタンを、dbaはアジピン酸ジブチルを、pepはP-エチルフェノールを、tbpはο-t-ブチルフェノールを、tmpはｐ-（1,1,3,3,-テトラメチルブチル）フェノールを表している。さらに、図中右側のカラムは遺伝子数を表示している。また、図中左側のバーはlog2比値を表している。
【図７】２８個の生体応答遺伝子の遺伝子発現データセットによるクラスタ分析を表す。デンドログラムの下のカラムはそれぞれラットに投与した化学物質の区別を表しており、図中左上には各カラムに対する化学物質の対応一覧を記している。mcaはメタクリルアミドを、sufはスルホランを、2ipは2-イソプロポキシエタノールを、hmhはヒドラジン一水和物を、4emは4-エチルモルホリンを、mtaはメタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリドを、bacは塩化ベンジルトリメチルアンモニウムを、mnsはｍ-ニトロベンゼンスルホン酸ナトリウムを、natは1-ナフチルアミン-4-スルホン酸ナトリウム四水和物を、mmbは3-メトキシ-3-メチル-1-ブタノールを、dcbはo-ジクロロベンゼンを、34xは3,4-キシリジンを、nmaはN-メチルアニリンを、tdnはトリレンジイソシアナートを、2deは2-（ジブチルアミノ）エタノールを、pcpはｐ-クミルフェノールを、mcsはｍ-クレゾールを、23dは2,3-ジメチルアニリンを、dhcはN,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミドを、dhpはフタル酸ジヘプチルを、tbeはテトラブロモエタンを、dbaはアジピン酸ジブチルを、pepはP-エチルフェノールを、tbpはο-t-ブチルフェノールを、tmpはｐ-（1,1,3,3,-テトラメチルブチル）フェノールを表している。さらに、図中右側のカラムは遺伝子数を表示している。また、図中左側のバーはlog2比値を表している。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
他に特に規定されない限り、本明細書中に使用される用語は、本発明が属する分野における通常の知識を有する者（当業者）によって、一般的に理解されるものと同一の意味を有する。
【００７５】
当業者は、本明細書中に記載されるものと同等または類似の多くの方法および物質を認識する。ただし、本発明は本明細書に記載される方法および物質に限定されない。
【００７６】
「遺伝子発現レベルを測定する」とは、該遺伝子の発現レベルを検出又は定量する限り特に制限されず、例えば、該遺伝子のｍＲＮＡやｃＤＮＡを検出又は定量してもよい。さらには、該遺伝子がコードするタンパク質を検出又は定量してもよい。これらの検出又は定量には、該遺伝子又はその遺伝子産物であるペプチド若しくはタンパク質に特異的に結合する分子を用いることが望ましい。遺伝子又はその遺伝子産物であるペプチド若しくはタンパク質に特異的に結合する分子とは、特に制限されないが、該遺伝子に特異的に結合するヌクレオチド、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド若しくはタンパク質に特異的に結合する抗体等を例示することができる。また、該遺伝子の発現レベルの検出又は定量には、該遺伝子のｍＲＮＡもしくはタンパク質の断片またはホモログを用いてもよい。
【００７７】
「ＤＮＡマイクロアレイ」とは、オリゴヌクレオチドや一本鎖または二本鎖のＤＮＡをガラス基板上などに高密度に配置したものをいい、「ＤＮＡマイクロアレイ法」とは、そのＤＮＡマイクロアレイ上で蛍光標識したＲＮＡ分子などとハイブリッド形成を行わせて定性的定量的にＤＮＡと結合した核酸の種類や量を測定する手法をいう。
【００７８】
「オリゴヌクレオチド」とは、ヌクレオチドが数個重合した分子の総称のことをいう。
【００７９】
本明細書中、ｍＲＮＡの「ホモログ」とは、該ｍＲＮＡに実質的に類似したヌクレオチドに関連する。「実質的に類似した」とは、当業者によって十分理解され、具体的にはそれぞれの配列類似性が少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％を有することを意味する。
【００８０】
また、本明細書中、タンパク質の「ホモログ」とは、該ｍＲＮＡに実質的に類似したペプチドに関連する。「実質的に類似した」とは、当業者によって十分理解され、具体的にはそれぞれの配列類似性が少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％を有することを意味する。
【００８１】
「候補化合物」とは、その毒性について試験される任意の化合物を指す。
【００８２】
「化合物に曝露された臓器組織または細胞試料」とは、組織もしくは細胞試料、または試料が由来した動物が、化合物により処理されたことを意味する。
【００８３】
「腎臓毒性」とは、多くの疾病もしくは障害のプロセスにより誘発され得るところの急性もしくは慢性の腎臓の不全もしくは機能障害を意味する。
【００８４】
「毒性作用」とは、化合物の存在に起因する、生体、臓器系、各臓器、組織、細胞、または細胞内単位に対する有害作用を指す。毒性作用は、生理的もしくは物理的な症状、または細胞もしくは臓器の壊死のような撹乱であり得る。
【００８５】
「試料」には、好ましくは腎臓の生検材料、並びに、例えば血液、血漿、血清、リンパ液、腹水、尿、便のような任意の体液が含まれるものとする。なお、これに限られるものではない。
【００８６】
本明細書で使用される際には、「個体」とは、ヒトの個体、動物又は個体の集団もしくはプールを意味するものとする。
【００８７】
「候補薬剤」には、タンパク質もしくはそのフラグメント、抗体、小分子の阻害剤もしくはアゴニスト、核酸分子、たとえば、アンチセンスヌクレオチド、リボザイム、二重鎖ＲＮＡ、有機および無機化合物等のような天然のまたは合成の分子を含む。
【００８８】
遺伝子の発現レベルを検出又は定量する具体的な方法としては、該遺伝子に特異的に結合するプローブ用の標識化ヌクレオチド、標識化ｃＤＮＡまたは標識化ＲＮＡを用いたノーザンブロット法、ドットブロット法、iAFLP法、LAMP法、nCounter Analysis systemまたはＰＣＲ法を用いることができる。ＰＣＲ法として、ＲＴ-ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、コンペティティブＰＣＲ法を挙げることができる。
【００８９】
さらに、遺伝子の発現レベルを検出又は定量する具体的な方法としては、ＤＮＡマイクロアレイ、ＤＮＡチップ、または抗体アレイ等が挙げられる。ＤＮＡマイクロアレイ又はＤＮＡチップには該遺伝子のヌクレオチド又はｃＤＮＡが少なくとも１つ以上固定化されているものを用いる。
【００９０】
なお、ヌクレオチド又はｃＤＮＡは、該遺伝子の一部に相当する部分でもよい。
【００９１】
上記プローブの標識化に用いられる標識試薬は、例えば放射性同位元素である［125I］、［131I］、［３H］、［１４C］、［３２P］、［３５S］、酵素であるβーガラクトシダーゼ、βーグルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、また、蛍光物質であるシアニン蛍光色素蛍光色素（例えば、Cy２、Cy３、Cy５、Cy5.5、Cy７、Cyanine３、Cyanine５など）を用いることができる。
【００９２】
また、上記リアルタイムＰＣＲ法としては、例えば、組織内又は細胞内の全ＲＮＡやｍＲＮＡから逆転写酵素により合成したｃＤＮＡを鋳型にして、ＰＣＲの増幅産物をリアルタイムでモニタリングする方法が挙げられる。リアルタイムＰＣＲ用モニタリング試薬としては、例えばSYBR GreenＩやTaqManプローブ等が用いられる。
【００９３】
通常、ＤＮＡマイクロアレイやＤＮＡチップは、プローブが支持体の上に固定されているアレイ又はチップであり、ＤＮＡマイクロアレイ又はＤＮＡチップの支持体としては、ハイブリダイゼーションに使用可能なものであればよく、例えばガラス、シリコン、プラスチックなどの基板や、ニトロセルロース膜、ナイロン膜等を用いることができる。
【００９４】
なお、ＤＮＡマイクロアレイとは、生体応答遺伝子セットに含まれる遺伝子全長、またはその部分配列と相補的なｃＤＮＡ断片若しくはオリゴＤＮＡを固定支持体に１つ以上固定したものをいう。ここでいう相補的なオリゴＤＮＡは一般的には２５〜１００塩基の長さのものが用いられるが、必ずしもこれに限定されない。
【００９５】
ＤＮＡマイクロアレイやＤＮＡチップの使用方法については特に制限されない。例えば、生体試料からｍＲＮＡを精製し、該ｍＲＮＡを鋳型とした逆転写反応を行う際に、適切な標識を付したプライマーや標識ヌクレオチドを使用することにより、標識されたｃＤＮＡを得ることができる。この標識化ｃＤＮＡとＤＮＡマイクロアレイやＤＮＡチップ表面上に固定された本発明におけるプローブとの間でハイブリダイゼーションを行わせ、被検試料とのハイブリダイゼーション及び対照試料とのハイブリダイゼーションのそれぞれの結果を比較し、該遺伝子の有無を検出したり、発現レベルを測定することにより、臓器毒性の検出または予測を行うことができる。
【００９６】
上記標識化ｃＤＮＡの作製に用いられる標識物質としては、放射性同位元素、蛍光物質等を用いることができる。例えば、蛍光物質としては、Cy２、Cy３、Cy５、Cy5.5、Cy７、Cyanine３、Cyanaine５、FITC（イソチオシアン酸フルオレセイン）、テキサスレッド、ローダミン等が挙げられる。
【００９７】
遺伝子に対応するポリペプチド又はタンパク質は上記生体応答遺伝子の発現産物であり、該ポリペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列の配列情報は、NCBIの遺伝子データベースにおいて、それぞれのアクセッションナンバーによりアプローチすることもできる。
【００９８】
上記ポリペプチド又はタンパク質を検出又は定量する方法としては、所定のポリペプチド又はタンパク質を検出又は定量する方法であれば特に制限されない。例えば、該ポリペプチド又はタンパク質に特異的に結合する抗体やアプタマー等を用いることができ、抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、２つのエピトープを同時に認識することができる二機能性抗体等を例示できる。これらの抗体は、慣用のプロトコルを用いて該ポリペプチド又はタンパク質又はそれらの断片を抗原として用いて作製することができる。また、アプタマーとは、タンパク質、アミノ酸等の分子に特異的に結合する核酸分子である。
【００９９】
上記ポリペプチド又はタンパク質に特異的に結合する抗体を用いて、被検試料中に存在する該ポリペプチド又はタンパク質を検出又は定量する場合、免疫沈降法、電気化学発光法、RIA（Radioimmunoassay）法、ELISA（Enzyme-liked immunosorbent assay）法、蛍光抗体法等の公知の免疫学的方法を用いることができる。
【０１００】
上記判定の基準としては、被検試料中に存在する該遺伝子の発現レベル（又は該遺伝子に対応するポリペプチド若しくはタンパク質の発現レベル）が正常対照試料中に存在する、該遺伝子の発現レベル（又は該遺伝子に対応するポリペプチド若しくはタンパク質の発現レベル）よりも高いまたは低いことを用いる。例えば、1群3検体以上の試料の発現レベルを測定した結果について、ｔ検定を行った場合に、P＜0.05、より好ましくはP＜0.01、さらに好ましくはP＜0.001、さらにより好ましくはP＜0.0001である場合が挙げられる。
【０１０１】
検定方法はｔ検定に限定されるものではなく、マン・ホイットニ検定やウィルコクサン符号付順位検定でもよい。また検定に限定されるものではなく、例えば各群の発現レベルの平均値の差を用いてもよい。
【０１０２】
基準値は、被検試料における発現レベルを測定する度に毎回測定する必要はなく、例えば、様々な種の生体試料における正常対照試料中に存在する遺伝子の発現レベルをあらかじめ測定しておき、その測定値を用いて比較することができる。
【０１０３】
遺伝子発現レベルの変化には特定の化合物と生体組織との直接の反応のみならず、臓器に障害が生じた結果としての二次的反応も含まれる。
【０１０４】
生体応答遺伝子セットに含まれる遺伝子は、ヒト、ラット、マウス、またはサルのような任意の哺乳動物において、マーカーとして用いられ得る。好ましくは、生体応答遺伝子セットに含まれる遺伝子は、ラットまたはマウスにおいてマーカーとして用いられる。
【０１０５】
動物の種類は特に限定されるものではなく、例えば、ラットの場合にはSD、Wistarラットなどでもよく、雄でも雌でも構わない。
【０１０６】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【０１０７】
本発明の毒性作用を検出または予測するための方法に用いられる生体応答遺伝子セットは、ｐ-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェノール（和光純薬株式会社製）を雄のSDラット（６週齢）に28日間反復投与（300 mg/kg）することにより腎臓で発現レベルが著しく変化した遺伝子群である。
【０１０８】
本発明で用いられる生体応答遺伝子セットは以下の方法により得られる。なお、ここで、「発現レベル」とは絶対量である必要はなく相対量でよい。
【０１０９】
[遺伝子発現データベース]
本発明の遺伝子発現データベースを作成するには、
（１）種々の化学物質について、ラットなどが死亡しない適当な投与量を決定し、
（２）適当な濃度の化学物質を一定期間、ラットなどに繰り返し曝露し、
（３）曝露した生体から各臓器を摘出し、
（４）摘出した臓器からｍＲＮＡを単離し、
（５）ＤＮＡマイクロアレイ法などにより特定遺伝子の発現レベルを測定し、
（６）得られた遺伝子発現レベルを化学物質、その濃度、曝露時間とともに遺伝子発現データベースとしてまとめる。
という工程によりなされる。
【０１１０】
[動物試験]
国立医薬品食品衛生研究所の既存化学物質毒性データベース（http://dra4.nihs.go.jp/mhlw_data/jsp/SearchPage.jsp）に登録されている３０種類の化学物質腎臓毒性が報告されている化学物質2−ブタノンオキシム（和光純薬株式会社）（100mg/kg）、ｍ−キシリレンジアミン（東京化成工業株式会社）（400mg/kg）、3-シアノピリジン（和光純薬株式会社）（180mg/kg）、2−（2−アミノエチルアミノ）エタノール（和光純薬株式会社）（1000mg/kg）、テトラヒドロフルフリルアルコール（和光純薬株式会社）（600mg/kg）、メタクリルアミド（和光純薬株式会社）（150mg/kg）、スルホラン（和光純薬株式会社）（700mg/kg）、2-イソプロポキシエタノール（和光純薬株式会社）（500mg/kg）、ヒドラジン一水和物（和光純薬株式会社）（30mg/kg）、4-エチルモルホリン（和光純薬株式会社）（500mg/kg）、メタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド（和光純薬株式会社）（1000mg/kg）、塩化ベンジルトリメチルアンモニウム（和光純薬株式会社）（120mg/kg）、ｍ-ニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム（和光純薬株式会社）（1000mg/kg）、1-ナフチルアミン-4-スルホン酸ナトリウム四水和物（和光純薬株式会社）（1000mg/kg）、3-メトキシ-3-メチル-1-ブタノール（和光純薬株式会社）（1000mg/kg）、o-ジクロロベンゼン（和光純薬株式会社）（500mg/kg）、3,4-キシリジン（和光純薬株式会社）（250mg/kg）、N-メチルアニリン（和光純薬株式会社）（125mg/kg）、トリレンジイソシアナート（和光純薬株式会社）（300mg/kg）、2-（ジブチルアミノ）エタノール（和光純薬株式会社）（250mg/kg）、ｐ-クミルフェノール（和光純薬株式会社）（700mg/kg）、ｍ-クレゾール（和光純薬株式会社）（1000mg/kg）、2,3-ジメチルアニリン（東京化成工業株式会社）（200mg/kg）、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（和光純薬株式会社）（300mg/kg）、フタル酸ジヘプチル（和光純薬株式会社）（1000mg/kg）、テトラブロモエタン（和光純薬株式会社）（200mg/kg）、アジピン酸ジブチル（和光純薬株式会社）（1000mg/kg）、p-エチルフェノール（和光純薬株式会社）（1000mg/kg）、ο-t-ブチルフェノール（和光純薬株式会社）（500mg/kg）およびｐ-（1,1,3,3,-テトラメチルブチル）フェノール（和光純薬株式会社）（300mg/kg）を28日間反復してSDラット（７週齢、雄）に経口投与した。正常対照群として、オリブ油（小堺製薬株式会社製）または注射用水（日本薬局方 注射用水、大塚蒸留水）を28日間反復してSDラット（６週齢、雄）に経口投与した。28日間の反復投与後、ラットから腎臓を採取し、速やかに液体窒素で凍結させた。凍結させた腎臓組織はISOGEN（ニッポンジーン社製）を用いて粉砕した。なお、動物試験は28日間に制限されることはなく、例えば数日間でもよい。
【０１１１】
[全ＲＮＡの抽出]
腎臓組織からの全ＲＮＡの抽出はISOGEN試薬（ニッポンジーン社製）を用いて推奨のプロトコルに従って行った。
【０１１２】
[核酸検体の調製]
検体用ｍＲＮＡの調製は、腎臓組織からISOGEN試薬（ニッポンジーン社製）を用いて抽出した全ＲＮＡから、Poly（A）Pureキット（Ambion社製）を用い、各社推奨のプロトコルに従って行った。
【０１１３】
[マイクロアレイの作製]
マイクロアレイ用合成ＤＮＡを用いてマイクロアレイを作製した。マイクロアレイの作製方法・条件に限定はないが、例えば（Schena,M.et.al.,Science,270,467-470.(1995)）に記載の作製方法を用いることができる。
【０１１４】
ラット遺伝子断片ライブラリー（マイクロダイアグノスティック社製）を超微量分注装置（マイクロダイアグノスティク社製）によりスライドガラス（松波硝子工業社製、HAコートスライドガラス）にプリントしてマイクロアレイを作製した。該マイクロアレイを気相恒温器内にて80℃で1時間静置し、さらにUVクロスリンカー（Hoefer社製、UVC500）を用いて120mJの紫外線を照射した。
【０１１５】
[マイクロアレイの後処理]
マイクロアレイの後処理については、公開特許公報（特開2004-233105）記載の方法により行った。
【０１１６】
[標識ｃＤＮＡの合成]
該ｍＲＮＡ 1.5μgを核酸標識・ハイブリダイゼーション試薬（マイクロダイアグノスティック社製）、逆転写酵素SuperScriptII（インビトロジェン社製）、Cyanine5-deoxyuridinetriphosphate(Cyanine5-dUTP)（Perkin Elmer社製）を用い、標識ｃＤＮＡを作製した。一方、対照としてラット共通レファレンス（マイクロダイアグノスティック社製）を使用した。共通レファレンスに対しては核酸標識・ハイブリダイゼーション試薬（マイクロダイアグノスティック社製）、逆転写酵素SuperScriptII（インビトロジェン社製）、Cyanine3-deoxyuridinetriphosphate(Cyanine3-dUTP)（Perkin Elmer社製）を用い、標識ｃＤＮＡを作製した。作製方法は、各社推奨のプロトコルに従った。
【０１１７】
[標識プローブの作製]
これらの標識ｃＤＮＡ、すなわち、Cyanine5-dUTPで標識した検体およびCyanine3-dUTPで標識した対照レファレンスを同一試験管内で混合した後、MicropureEZ（ミリポア社製）およびMicroconYM30（ミリポア社製）により精製した。最終的には核酸標識・ハイブリダイゼーション試薬に付属のハイブリダイゼーションバッファーおよび純水を用いて15μlに調製した。
【０１１８】
[ハイブリダイゼーション]
該溶液を99℃で5分間加熱して熱変性させた後に、ＤＮＡマイクロアレイ上に滴下し、ハイブリダイゼーションカセット（マイクロダイアグノスティック社製）に格納した。該ハイブリダイゼーションカセットを気相恒温器（三洋電機バイオメディカ社製）に入れ、42℃で約20時間、静置した状態で保温した。この操作によって、サンプル中に含まれる標識ｃＤＮＡがＤＮＡマイクロアレイ上の相補的なオリゴＤＮＡと特異的に結合する。
【０１１９】
[洗浄]
ハイブリダイゼーションカセットからスライドガラスを取り出し、核酸標識・ハイブリダイゼーション試薬（マイクロダイアグノスティック社製）付属のハイブリダイゼーション洗浄溶液を用い、同社推奨のプロトコルに従ってスライドガラスを洗浄した。
【０１２０】
[蛍光強度の検出および数値化]
各遺伝子の発現レベルはＤＮＡマイクロアレイ上に固定されたオリゴＤＮＡと結合した標識ｃＤＮＡの蛍光強度を測定することにより見積もることができる。洗浄したスライドガラスをスキャナGenePix4000B（Axon Instrument社製）を用いて蛍光を測定し、スキャナに付属の解析ソフトウエアGenePixPro（Axon Instrument社製）を用いて光学的に評価し、蛍光強度を数値化した。すなわち、ＤＮＡマイクロアレイ上に固定されたオリゴＤＮＡのスポットの蛍光強度をそれぞれ別々に測定し、スポット以外の場所の蛍光強度からバックグラウンドを算出してノイズとしてそれぞれのスポットの蛍光強度から差し引く。そして、サンプルにおける蛍光強度/共通レファレンスの蛍光強度を算出するという解析を行う。すなわち、各サンプルの遺伝子発現レベルはすべて共通レファレンスに対する相対比として検出されるため、単純に複数サンプルを横並び比較できる状態となっている。このようにして取得された数値を集積してデータベース化する。表１から５がデータ例である。
【０１２１】
【表１】
【０１２２】
【表２】
【０１２３】
【表３】
【０１２４】
【表４】
【０１２５】
【表５】
【０１２６】
[血液サンプル処理]
採血は、投与最終日翌日に実施する剖検と同時に行った。ラットは採血前日の午後5時から除餌し、水のみを給与した。エーテル麻酔下でラットを開腹し、腹部大静脈より血液を採取した。採取した血液は、ガラス製試験管に入れ、室温で10分間静置し、さらに氷中で15分静置した後、遠心分離を行い、上清を採って、これを血液生化学検査用血清とした。なお、血液生化学検査は財団法人畜産生物科学安全研究所にて行った。
【０１２７】
[生体応答遺伝子群の抽出]
腎臓毒性を判別するための有用な遺伝子を選択するために以下の計算を行った。最初に対照群のラットの腎臓における遺伝子発現データの平均値を算出した。次に化学物質ｐ-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェノールを投与したラットの腎臓における遺伝子発現レベルと前記対照群の平均値との比を算出した。さらに、前記化学物質を投与したラットのうち少なくとも2個体以上で前記対照群の平均値との比が2.83倍以上または0.35倍以下の遺伝子を抽出した。さらに、対照群の標準偏差が0.5未満の遺伝子を選択した（４９遺伝子）。
【０１２８】
[クラスタ分析]
ＤＮＡマイクロアレイで取得した遺伝子発現データの分析手法として、例えばクラスタ分析が挙げられる。クラスタ分析とは、遺伝子発現変化パターンの類似した遺伝子同士をグルーピングする統計的手法である。データ間の類似度（例えばユークリッド距離など）を定義し、その類似度を用いることにより遺伝子発現パターンの類似した、すなわち、遺伝子発現に対して類似した影響を持つ化学物質どうしがグループ化される。
【０１２９】
上記同定された遺伝子について階層的クラスタ分析を行った。階層的クラスタ分析は解析用ソフトウェア「Expression View Pro」（マイクロダイアグノスティック社製）を用いて行った。また、階層的クラスタ分析は「cluster」や「treeview」などのソフトウェアを用いても行うことができる。その結果、化学物質ｐ-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェノールを投与したラットのうち2個体（個体識別番号：tmp-1およびtmp-3）と対照群とが大きく2群に分類され、さらに、残りの1個体（個体識別番号：tmp-2）がその中間に位置した（図１）。中間に位置した個体（個体識別番号：tmp-2）は、血液生化学検査の結果、他の2個体（個体識別番号：tmp-1およびtmp-3）よりもクレアチニン（CRE）の異常値の程度が低く（図２）、該クラスタ分析の結果は上記クレアチニンの異常値と相関していた。なお、血液生化学検査におけるクレアチニン（CRE）の値は、腎臓に障害が起こると異常値を示すマーカーであることが知られている。
【実施例２】
【０１３０】
[ｐ-クミルフェノールの腎臓毒性]
ｐ-クミルフェノールは、国立医薬品食品衛生研究所の既存化学物質毒性データベースにおいて腎臓毒性が報告されている化学物質である。本発明における生体応答遺伝子セットで上記化学物質による腎臓毒性を検出できるかを検証した。
【０１３１】
[ｐ-クミルフェノール投与試験]
実施例１の場合と同様の方法により、ｐ-クミルフェノール（和光純薬株式会社製）（500mg/kg）を28日間反復してSDラット（６週齢、雄）に経口投与した。正常対照群として、化学物質ｐ-クミルフェノールを溶解したオリブ油（小堺製薬株式会社製）を28日間反復してSDラット（６週齢、雄）に経口投与した。さらに、上記と同様の方法によりラットから腎臓を採取し、血液生化学検査および遺伝子発現プロファイルを取得した。
【０１３２】
[血液生化学検査]
クレアチニン（CRE）の値が対照群と比較して上記化学物質投与群が有意に高かった（P＜0.004）（図３）。
【０１３３】
[クラスタ分析]
上記同定された遺伝子セットのデータを用いて、同様にクラスタ分析を行った。その結果、ｐ-クミルフェノールを投与したラットはすべて上記ｐ-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェノールを投与したラットのうちの1個体（個体識別番号：tmp-2）と同じクラスタを形成した。一方、化学物質を投与していないラット（Cont）は6個体とも対照群と同じクラスタを形成した（図４）。
【実施例３】
【０１３４】
[生体応答遺伝子セットの絞り込み]
上記生体応答遺伝子セットから、個体識別番号tmp-2と対照群とのlog2比の差の絶対値が0.75以上の遺伝子を抽出した（２８遺伝子）。
【０１３５】
[クラスタ分析]
上記同定された生体応答遺伝子セットのデータを用いて、同様にクラスタ分析を行った。その結果、ｐ-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェノール投与群と対照群が2群に分類された（図５）。
【０１３６】
[ｐ-クミルフェノールの毒性評価]
上記同定された生体応答遺伝子セットのデータを用いて、同様にクラスタ分析を行った。その結果、ｐ-クミルフェノールを投与したラットはすべて上記ｐ-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェノールを投与したラットのうちの1個体（個体識別番号：tmp-2）と同じクラスタを形成した。一方、化学物質を投与していないラット（Cont）は6個体とも対照群と同じクラスタを形成した（図５）。
【実施例４】
【０１３７】
2−ブタノンオキシム、ｍ−キシリレンジアミン、3-シアノピリジン、2−（2−アミノエチルアミノ）エタノール、テトラヒドロフルフリルアルコール、メタクリルアミド、スルホラン、2-イソプロポキシエタノール、ヒドラジン一水和物、4-エチルモルホリン、メタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド、塩化ベンジルトリメチルアンモニウム、ｍ-ニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム、1-ナフチルアミン-4-スルホン酸ナトリウム四水和物、3-メトキシ-3-メチル-1-ブタノール、o-ジクロロベンゼン、3,4-キシリジン、N-メチルアニリン、トリレンジイソシアナート、2-（ジブチルアミノ）エタノール、ｐ-クミルフェノール、ｍ-クレゾール、2,3-ジメチルアニリン、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド、フタル酸ジヘプチル、テトラブロモエタン、アジピン酸ジブチル、P-エチルフェノール、ο-t-ブチルフェノールおよびｐ-（1,1,3,3,-テトラメチルブチル）フェノールをそれぞれ適当な濃度で28日間反復してラットに曝露させたのち、腎臓組織からｍＲＮＡを単離し、遺伝子発現プロファイルを取得した。それらの遺伝子発現プロファイルから生体応答遺伝子群：(1)ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 1、(2)AHNAK nucleoprotein、(3)alpha 1,3-galactosyltransferase 2、(4)alpha-2-macroglobulin、(5)annexin A2、(6)aquaporin 6, kidney specific、(7)calbindin 1、(8)camello-like 1、(9)cathepsin D、(10)CD24 molecule、(11)Cd44 molecule、(12)claudin 3、(13)collagen triple helix repeat containing 1、(14)cysteine sulfinic acid decarboxylase、(15)deiodinase, iodothyronine, type I、(16)deleted in colorectal carcinoma、(17)deoxyribonuclease I、(18)fibrinogen beta chain、(19)flavin containing monooxygenase 3、(20)glutamate-cysteine ligase, catalytic subunit、(21)glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、(22)glycoprotein (transmembrane) nmb、(23)histamine N-methyltransferase、(24)hypothetical protein LOC56728、(25)kallikrein、(26)kidney androgen regulated protein、(27)lectin, galactoside-binding, soluble, 3、(28)matrix Gla protein、(29)oxidative stress induced growth inhibitor 1、(30)paternally expressed 12、(31)protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 1A、(32)RAS, dexamethasone-induced 1、(regucalcin (senescence marker protein-30)、(33)regucalcin (senescence marker protein-30)、(34)S100 calcium binding protein A10、(35)S100 calcium binding protein A6、(36)secreted phosphoprotein 2、(37)serine (or cysteine) peptidase inhibitor, clade A, member 3K、(38)similar to CPE-receptor、(39)similar to tumor necrosis factor receptor superfamily, mber 12a、(40)solute carrier family 22 (organic cation transporter), member 2、(41)solute carrier family 34 (sodium phosphate), member 2、(42)solute carrier family 4 (anion exchanger), member 1、(43)suppressor of cytokine signaling 3、(44)thymosin, beta 10、(45)tonin、(46)translin、(47)trefoil factor 3, intestinal、(48)ubiquitin D、(49)uromodulinの遺伝子発現データを抽出して遺伝子発現データセットとした。
【０１３８】
これらの遺伝子発現データをもとにしてクラスタ分析を行ったところ、ｐ-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェノールを投与したラットのうち２個体が一つのクラスタを形成し、ｐ-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェノールの１個体とｐ-クミルフェノールを投与したラットの３個体すべてが一つのクラスタを形成した（図７）。また、その他の化学物質は対照群と同じクラスタの中で混在していた（図７）。
【０１３９】
なお、ｐ-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェノールおよびｐ-クミルフェノールはラットに２８日間反復投与することにより腎臓に毒性を有することが知られている（http://dra4.nihs.go.jp/mhlw_data/jsp/SearchPage.jsp）。
【０１４０】
これらのことは、被検化学物質について同様の動物実験を行い、この生体応答遺伝子セットについての遺伝子発現レベルを測定した後、前記遺伝子発現データセットを用いて比較することにより、被検化学物質について、少なくともｐ-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェノールおよびｐ-クミルフェノールに類似した毒性の有無を判定できることを意味する。
【０１４１】
なお、表１から５は、ＤＮＡマイクロアレイ法により取得した遺伝子発現データセットの例を示す。左端の列は生体応答遺伝子の遺伝子名であり、その次の列にはGenBank IDを記載してある。また一番上の行には、化学物質の略号を記しており、mcaはメタクリルアミドを、sufはスルホランを、2ipは2-イソプロポキシエタノールを、hmhはヒドラジン一水和物を、4emは4-エチルモルホリンを、mtaはメタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリドを、bacは塩化ベンジルトリメチルアンモニウムを、mnsはｍ-ニトロベンゼンスルホン酸ナトリウムを、natは1-ナフチルアミン-4-スルホン酸ナトリウム四水和物を、mmbは3-メトキシ-3-メチル-1-ブタノールを、dcbはo-ジクロロベンゼンを、34xは3,4-キシリジンを、nmaはN-メチルアニリンを、tdnはトリレンジイソシアナートを、2deは2-（ジブチルアミノ）エタノールを、pcpはｐ-クミルフェノールを、mcsはｍ-クレゾールを、23dは2,3-ジメチルアニリンを、dhcはN,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミドを、dhpはフタル酸ジヘプチルを、tbeはテトラブロモエタンを、dbaはアジピン酸ジブチルを、pepはP-エチルフェノールを、tbpはο-t-ブチルフェノールを、tmpはｐ-（1,1,3,3,-テトラメチルブチル）フェノールである。数値は、それぞれの化学物質を28日間ラットに反復して投与した後の腎臓の遺伝子発現レベルを対照群の平均値の相対比に換算した値である。
【実施例５】
【０１４２】
2−ブタノンオキシム、ｍ−キシリレンジアミン、3-シアノピリジン、2−（2−アミノエチルアミノ）エタノール、テトラヒドロフルフリルアルコール、メタクリルアミド、スルホラン、2-イソプロポキシエタノール、ヒドラジン一水和物、4-エチルモルホリン、メタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド、塩化ベンジルトリメチルアンモニウム、ｍ-ニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム、1-ナフチルアミン-4-スルホン酸ナトリウム四水和物、3-メトキシ-3-メチル-1-ブタノール、o-ジクロロベンゼン、3,4-キシリジン、N-メチルアニリン、トリレンジイソシアナート、2-（ジブチルアミノ）エタノール、ｐ-クミルフェノール、ｍ-クレゾール、2,3-ジメチルアニリン、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド、フタル酸ジヘプチル、テトラブロモエタン、アジピン酸ジブチル、P-エチルフェノール、ο-t-ブチルフェノールおよびｐ-（1,1,3,3,-テトラメチルブチル）フェノールをそれぞれ適当な濃度で28日間反復してラットに曝露させたのち、腎臓組織からｍＲＮＡを単離し、遺伝子発現プロファイルを取得した。それらの遺伝子発現プロファイルから生体応答遺伝子群：（１）ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 1、（２）alpha 1,3-galactosyltransferase 2、（３）alpha-2-macroglobulin、（４）annexin A2、（５）aquaporin 6, kidney specific、（６）calbindin 1、（７）cathepsin D、（８）CD24 molecule、（９）Cd44 molecule、（１０）claudin 3、（１１）cysteine sulfinic acid decarboxylase、（１２）deoxyribonuclease I、（１３）fibrinogen beta chain、（１４）glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、（１５）glycoprotein (transmembrane) nmb、（１６）lectin, galactoside-binding, soluble, 3、（１７）matrix Gla protein、（１８）oxidative stress induced growth inhibitor 1、（１９）RAS, dexamethasone-induced 1、（２０）S100 calcium binding protein A10、（２１）secreted phosphoprotein 2、（２２）similar to CPE-receptor、（２３）similar to tumor necrosis factor receptor superfamily, mber 12a、（２４）solute carrier family 34 (sodium phosphate), member 2、（２５）solute carrier family 4 (anion exchanger), member 1、（２６）suppressor of cytokine signaling 3、（２７）thymosin, beta 10、（２８）translin、の遺伝子発現データを抽出して遺伝子発現データセットとした。
【０１４３】
これらの遺伝子発現データをもとにしてクラスタ分析を行ったところ、ｐ-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェノールを投与したラットのうち２個体が一つのクラスタを形成し、ｐ-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェノールの１個体とｐ-クミルフェノールを投与したラットの３個体すべてが一つのクラスタを形成した（図７）。また、その他の化学物質は対照群と同じクラスタの中で混在していた（図７）。
【０１４４】
なお、ｐ-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェノールおよびｐ-クミルフェノールはラットに２８日間反復投与することにより腎臓に毒性を有することが知られている（http://dra4.nihs.go.jp/mhlw_data/jsp/SearchPage.jsp）。
【０１４５】
これらのことは、被検化学物質について同様の動物実験を行い、この生体応答遺伝子セットについての遺伝子発現レベルを測定した後、この遺伝子発現データセットを用いて比較することにより、被検化学物質について、少なくともｐ-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェノールおよびｐ-クミルフェノールに類似した毒性の有無を判定できることを意味する。
【産業上の利用可能性】
【０１４６】
本発明の腎臓毒性判定遺伝子セットは、腎障害、すなわち、腎臓疾患、損傷または毒性のモニタリング、それらの診断および/またはそれらに対する種々の措置もしくは薬剤の有効性を判定することを助けることができる可能性がある。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学物質が生体に与える影響を遺伝子発現レベルで検出することにより被検化学物質の毒性を検出する方法であって、（Ａ）前記化学物質の曝露を受けた腎臓組織または腎臓由来の細胞試料に対して、生体応答遺伝子群：(1)ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 1、(2)AHNAK nucleoprotein、(3)alpha 1,3-galactosyltransferase 2、(4)alpha-2-macroglobulin、(5)annexin A2、(6)aquaporin 6, kidney specific、(7)calbindin 1、(8)camello-like 1、(9)cathepsin D、(10)CD24 molecule、(11)Cd44 molecule、(12)claudin 3、(13)collagen triple helix repeat containing 1、(14)cysteine sulfinic acid decarboxylase、(15)deiodinase, iodothyronine, type I、(16)deleted in colorectal carcinoma、(17)deoxyribonuclease I、(18)fibrinogen beta chain、(19)flavin containing monooxygenase 3、(20)glutamate-cysteine ligase, catalytic subunit、(21)glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、(22)glycoprotein (transmembrane) nmb、(23)histamine N-methyltransferase、(24)hypothetical protein LOC56728、(25)kallikrein、(26)kidney androgen regulated protein、(27)lectin, galactoside-binding, soluble, 3、(28)matrix Gla protein、(29)oxidative stress induced growth inhibitor 1、(30)paternally expressed 12、(31)protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 1A、(32)RAS, dexamethasone-induced 1、(regucalcin (senescence marker protein-30)、(33)regucalcin (senescence marker protein-30)、(34)S100 calcium binding protein A10、(35)S100 calcium binding protein A6、(36)secreted phosphoprotein 2、(37)serine (or cysteine) peptidase inhibitor, clade A, member 3K、(38)similar to CPE-receptor、(39)similar to tumor necrosis factor receptor superfamily, mber 12a、(40)solute carrier family 22 (organic cation transporter), member 2、(41)solute carrier family 34 (sodium phosphate), member 2、(42)solute carrier family 4 (anion exchanger), member 1、(43)suppressor of cytokine signaling 3、(44)thymosin, beta 10、(45)tonin、(46)translin、(47)trefoil factor 3, intestinal、(48)ubiquitin D、(49)uromodulinのうちから選択される少なくとも１以上の生体応答遺伝子に対する遺伝子発現レベルを測定する第１の遺伝子発現レベル測定ステップと、
（Ｂ）前記化学物質の曝露を受けていない腎臓組織または腎臓由来の細胞試料に対して、前記第１の遺伝子発現レベル取得ステップにおいて選択された前記生体応答遺伝子のそれぞれに対する遺伝子発現レベルを測定する第２の遺伝子発現レベル測定ステップと、
（Ｃ）前記第１の遺伝子発現データレベル測定ステップ及び前記第２の遺伝子発現データレベル測定ステップにおける前記遺伝子発現レベルを比較するステップと、
を含むことを特徴とする化学物質の毒性の検出方法。
【請求項２】
前記第１の遺伝子発現レベル取得ステップにおいて、選択される少なくとも１以上の前記生体応答遺伝子は、
（１）ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 1、（２）alpha 1,3-galactosyltransferase 2、（３）alpha-2-macroglobulin、（４）annexin A2、（５）aquaporin 6, kidney specific、（６）calbindin 1、（７）cathepsin D、（８）CD24 molecule、（９）Cd44 molecule、（１０）claudin 3、（１１）cysteine sulfinic acid decarboxylase、（１２）deoxyribonuclease I、（１３）fibrinogen beta chain、（１４）glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、（１５）glycoprotein (transmembrane) nmb、（１６）lectin, galactoside-binding, soluble, 3、（１７）matrix Gla protein、（１８）oxidative stress induced growth inhibitor 1、（１９）RAS, dexamethasone-induced 1、（２０）S100 calcium binding protein A10、（２１）secreted phosphoprotein 2、（２２）similar to CPE-receptor、（２３）similar to tumor necrosis factor receptor superfamily, mber 12a、（２４）solute carrier family 34 (sodium phosphate), member 2、（２５）solute carrier family 4 (anion exchanger), member 1、（２６）suppressor of cytokine signaling 3、（２７）thymosin, beta 10、（２８）translin、のうちの少なくともいずれか１つを含むことを特徴とする、請求項１記載の化学物質の毒性の検出方法。
【請求項３】
前記腎臓組織または前記細胞試料は、マウス、ラット、イヌ、サルまたはヒト由来であることを特徴とする、請求項１または請求項２のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性の検出方法。
【請求項４】
遺伝子発現レベルの測定は、ＲＴ-ＰＣＲ法、iAFLP（introduced Amplified Fragment Length Polymorphism）法、LAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法、nCounter Analysis system、ハイブリダイゼーション法のうちの１つを用いることを特徴とする請求項１または請求項２のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性の検出方法。
【請求項５】
前記ハイブリダイゼーション法は、マイクロアレイ法又はブロット法であることを特徴とする請求項１または請求項２のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性の検出方法。
【請求項６】
前記マイクロアレイ法又はブロット法に用いられるプローブは、ヌクレオチド又はタンパク質であることを特徴とする請求項５記載の化学物質の毒性の検出方法。
【請求項７】
前記ヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項６記載の化学物質の毒性の検出方法。
【請求項８】
前記ヌクレオチドは、標識化ヌクレオチドであることを特徴とする請求項６または請求項７記載の化学物質の毒性の検出方法。
【請求項９】
前記遺伝子発現レベルの測定を前記生体応答遺伝子に対応する核酸又は前記生体応答遺伝子によってコードされるタンパク質の存在もしくは量を測定することで決定することを特徴とする請求項１または請求項２のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性の検出方法。
【請求項１０】
前記遺伝子発現レベルの測定を免疫学的方法によって行うことを特徴とする請求項１または請求項２のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性の検出方法。
【請求項１１】
前記免疫学的方法は、前記生体応答遺伝子によってコードされるタンパク質又はその断片に対する特異抗体と標的タンパク質との免疫学的複合体を検出する方法であることを特徴とする請求項１０記載の化学物質の毒性の検出方法。
【請求項１２】
前記特異抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、および抗体フラグメントから選択されることを特徴とする請求項１１記載の化学物質の毒性の検出方法。
【請求項１３】
請求項１または請求項２のうちのいずれか１つに記載の方法に用いられるプローブを含むキットであって、該プローブが、前記生体応答遺伝子に特異的にハイブリダイズする配列を有する分子を含むことを特徴とする化学物質の毒性の検出キット。
【請求項１４】
前記プローブは、ヌクレオチド又はタンパク質であることを特徴とする請求項１３記載の化学物質の毒性の検出キット。
【請求項１５】
前記ヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１４記載の化学物質の毒性の検出キット。
【請求項１６】
前記ヌクレオチドは、前記生体応答遺伝子のセンス鎖又はアンチセンス鎖とハイブリダイズし、10〜100 merであることを特徴とする請求項１４記載の化学物質の毒性の検出キット。
【請求項１７】
前記ヌクレオチドは、標識化ヌクレオチドであることを特徴とする請求項１５または請求項１６記載の化学物質の毒性の検出キット。
【請求項１８】
前記プローブは、抗体及び/又はアプタマーであるタンパク質であることを特徴とする請求項１４記載の化学物質の毒性の検出・予測キット。
【請求項１９】
前記プローブは、少なくとも1つ以上を固体支持体に固定したＤＮＡマイクロアレイ、ＤＮＡチップ、タンパクチップまたは抗体チップを含むことを特徴とする請求項１３ないし請求項１８のうちの１つに記載の化学物質の毒性の検出キット。
【請求項２０】
前記固体支持体は、ガラス、シリコン、プラスチック又は生体膜であることを特徴とする請求項１９記載の化学物質の毒性の検出キット。
【請求項２１】
化学物質が生体に与える影響を遺伝子発現レベルで検出することにより被検化学物質の毒性を検出するために用いられる照合データとしての遺伝子発現データベースを作成する方法であって、
（Ａ）2−ブタノンオキシム、ｍ−キシリレンジアミン、3-シアノピリジン、2−（2−アミノエチルアミノ）エタノール、テトラヒドロフルフリルアルコール、メタクリルアミド、スルホラン、2-イソプロポキシエタノール、ヒドラジン一水和物、4-エチルモルホリン、メタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド、塩化ベンジルトリメチルアンモニウム、ｍ-ニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム、1-ナフチルアミン-4-スルホン酸ナトリウム四水和物、3-メトキシ-3-メチル-1-ブタノール、o-ジクロロベンゼン、3,4-キシリジン、N-メチルアニリン、トリレンジイソシアナート、2-（ジブチルアミノ）エタノール、ｐ-クミルフェノール、ｍ-クレゾール、2,3-ジメチルアニリン、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド、フタル酸ジヘプチル、テトラブロモエタン、アジピン酸ジブチル、P-エチルフェノール、ο-t-ブチルフェノールおよびｐ-（1,1,3,3,-テトラメチルブチル）フェノールのそれぞれについて所定量を所定期間生体または腎臓由来の細胞試料に投与（曝露）するステップと、
（Ｂ）前記生体の腎臓組織または前記腎臓由来の前記細胞試料からｍＲＮＡを単離して、生体応答遺伝子群： (1)ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 1、(2)AHNAK nucleoprotein、(3)alpha 1,3-galactosyltransferase 2、(4)alpha-2-macroglobulin、(5)annexin A2、(6)aquaporin 6, kidney specific、(7)calbindin 1、(8)camello-like 1、(9)cathepsin D、(10)CD24 molecule、(11)Cd44 molecule、(12)claudin 3、(13)collagen triple helix repeat containing 1、(14)cysteine sulfinic acid decarboxylase、(15)deiodinase, iodothyronine, type I、(16)deleted in colorectal carcinoma、(17)deoxyribonuclease I、(18)fibrinogen beta chain、(19)flavin containing monooxygenase 3、(20)glutamate-cysteine ligase, catalytic subunit、(21)glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、(22)glycoprotein (transmembrane) nmb、(23)histamine N-methyltransferase、(24)hypothetical protein LOC56728、(25)kallikrein、(26)kidney androgen regulated protein、(27)lectin, galactoside-binding, soluble, 3、(28)matrix Gla protein、(29)oxidative stress induced growth inhibitor 1、(30)paternally expressed 12、(31)protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 1A、(32)RAS, dexamethasone-induced 1、(regucalcin (senescence marker protein-30)、(33)regucalcin (senescence marker protein-30)、(34)S100 calcium binding protein A10、(35)S100 calcium binding protein A6、(36)secreted phosphoprotein 2、(37)serine (or cysteine) peptidase inhibitor, clade A, member 3K、(38)similar to CPE-receptor、(39)similar to tumor necrosis factor receptor superfamily, mber 12a、(40)solute carrier family 22 (organic cation transporter), member 2、(41)solute carrier family 34 (sodium phosphate), member 2、(42)solute carrier family 4 (anion exchanger), member 1、(43)suppressor of cytokine signaling 3、(44)thymosin, beta 10、(45)tonin、(46)translin、(47)trefoil factor 3, intestinal、(48)ubiquitin D、(49)uromodulinのうちから選択される少なくとも１以上の生体応答遺伝子に対する遺伝子発現レベルを測定するステップと、
（Ｃ）（Ｂ）で得られた前記遺伝子発現レベルを対応する前記化学物質、曝露量及び曝露期間とともに遺伝子発現データとしてデータベース化するステップと、
を含むことを特徴とする照合用遺伝子発現データベースの作成方法。
【請求項２２】
選択される少なくとも１以上の前記生体応答遺伝子は、
（１）ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 1、（２）alpha 1,3-galactosyltransferase 2、（３）alpha-2-macroglobulin、（４）annexin A2、（５）aquaporin 6, kidney specific、（６）calbindin 1、（７）cathepsin D、（８）CD24 molecule、（９）Cd44 molecule、（１０）claudin 3、（１１）cysteine sulfinic acid decarboxylase、（１２）deoxyribonuclease I、（１３）fibrinogen beta chain、（１４）glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、（１５）glycoprotein (transmembrane) nmb、（１６）lectin, galactoside-binding, soluble, 3、（１７）matrix Gla protein、（１８）oxidative stress induced growth inhibitor 1、（１９）RAS, dexamethasone-induced 1、（２０）S100 calcium binding protein A10、（２１）secreted phosphoprotein 2、（２２）similar to CPE-receptor、（２３）similar to tumor necrosis factor receptor superfamily, mber 12a、（２４）solute carrier family 34 (sodium phosphate), member 2、（２５）solute carrier family 4 (anion exchanger), member 1、（２６）suppressor of cytokine signaling 3、（２７）thymosin, beta 10、（２８）translin、のうちの少なくともいずれか１つを含むことを特徴とする請求項２１記載の照合用遺伝子発現データベースの作成方法。
【請求項２３】
前記腎臓組織または前記細胞試料は、マウス、ラット、イヌ、サルまたはヒト由来であることを特徴とする、請求項２１または請求項２２記載の照合用遺伝子発現データベースの作成方法。
【請求項２４】
遺伝子発現レベルの測定は、ＲＴ-ＰＣＲ法、iAFLP（introduced Amplified Fragment Length Polymorphism）法、LAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法、nCounter Analysis system、ハイブリダイゼーション法のうちの１つを用いることを特徴とする請求項２１または請求項２２記載の照合用遺伝子発現データベースの作成方法。
【請求項２５】
前記ハイブリダイゼーション法は、マイクロアレイ法又はブロット法であることを特徴とする請求項２４記載の照合用遺伝子発現データベースの作成方法。
【請求項２６】
前記マイクロアレイ法又はブロット法に用いられるプローブは、ヌクレオチド又はタンパク質であることを特徴とする請求項２５記載の照合用遺伝子発現データベースの作成方法。
【請求項２７】
前記ヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項２６記載の照合用遺伝子発現データベースの作成方法。
【請求項２８】
前記ヌクレオチドは、標識化ヌクレオチドであることを特徴とする請求項２６または請求項２６記載の照合用遺伝子発現データベースの作成方法。
【請求項２９】
前記遺伝子発現レベルの測定を前記生体応答遺伝子に対応する核酸又は前記生体応答遺伝子によってコードされるタンパク質の存在もしくは量を測定することで決定することを特徴とする請求項２１または請求項２２のうちのいずれか１つに記載の照合用遺伝子発現データベースの作成方法。
【請求項３０】
前記遺伝子発現レベルの測定を免疫学的方法によって行うことを特徴とする請求項２１または請求項２２のうちのいずれか１つに記載の照合用遺伝子発現データベースの作成方法。
【請求項３１】
前記免疫学的方法は、前記生体応答遺伝子によってコードされるタンパク質又はその断片に対する特異抗体と標的タンパク質との免疫学的複合体を検出する方法であることを特徴とする請求項３０記載の照合用遺伝子発現データベースの作成方法または化学物質の毒性の検出・予測方法。
【請求項３２】
前記特異抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、および抗体フラグメントから選択されることを特徴とする請求項３１記載の照合用遺伝子発現データベースの作成方法。
【請求項３３】
請求項２１または請求項２２のうちのいずれか１つに記載の方法に用いられるプローブを含むキットであって、該プローブが、前記生体応答遺伝子に特異的にハイブリダイズする配列を有する分子を含むことを特徴とする照合用遺伝子発現データベースの作成キット。
【請求項３４】
前記プローブは、ヌクレオチド又はタンパク質であることを特徴とする請求項３３記載の照合用遺伝子発現データベースの作成キット。
【請求項３５】
前記ヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項３４記載の照合用遺伝子発現データベースの作成キット。
【請求項３６】
前記ヌクレオチドは、前記生体応答遺伝子のセンス鎖又はアンチセンス鎖とハイブリダイズし、10〜100 merであることを特徴とする請求項３４記載の照合用遺伝子発現データベースの作成キット。
【請求項３７】
前記ヌクレオチドは、標識化ヌクレオチドであることを特徴とする請求項３５または請求項３６記載の照合用遺伝子発現データベースの作成キット。
【請求項３８】
前記プローブは、抗体及び/又はアプタマーであるタンパク質であることを特徴とする請求項３３記載の照合用遺伝子発現データベースの作成キット。
【請求項３９】
前記プローブは、少なくとも1つ以上を固体支持体に固定したＤＮＡマイクロアレイ、ＤＮＡチップ、タンパクチップまたは抗体チップを含むことを特徴とする請求項３３ないし請求項３８のうちの１つに記載の照合用遺伝子発現データベースの作成キット。
【請求項４０】
前記固体支持体は、ガラス、シリコン、プラスチック又は生体膜であることを特徴とする請求項３９記載の照合用遺伝子発現データベースの作成キット。
【請求項４１】
化学物質が生体に与える影響を遺伝子発現レベルで検出することにより被検化学物質の毒性を検出・予測する方法であって、
（Ａ）2−ブタノンオキシム、ｍ−キシリレンジアミン、3-シアノピリジン、2−（2−アミノエチルアミノ）エタノール、テトラヒドロフルフリルアルコール、メタクリルアミド、スルホラン、2-イソプロポキシエタノール、ヒドラジン一水和物、4-エチルモルホリン、メタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド、塩化ベンジルトリメチルアンモニウム、ｍ-ニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム、1-ナフチルアミン-4-スルホン酸ナトリウム四水和物、3-メトキシ-3-メチル-1-ブタノール、o-ジクロロベンゼン、3,4-キシリジン、N-メチルアニリン、トリレンジイソシアナート、2-（ジブチルアミノ）エタノール、ｐ-クミルフェノール、ｍ-クレゾール、2,3-ジメチルアニリン、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド、フタル酸ジヘプチル、テトラブロモエタン、アジピン酸ジブチル、P-エチルフェノール、ο-t-ブチルフェノールおよびｐ-（1,1,3,3,-テトラメチルブチル）フェノールのそれぞれについて所定量を一定期間生体または腎臓由来の細胞試料に投与（曝露）するステップと、
（Ｂ）前記生体由来の腎臓組織または前記腎臓由来の前記細胞試料からｍＲＮＡを単離して、生体応答遺伝子群： (1)ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 1、(2)AHNAK nucleoprotein、(3)alpha 1,3-galactosyltransferase 2、(4)alpha-2-macroglobulin、(5)annexin A2、(6)aquaporin 6, kidney specific、(7)calbindin 1、(8)camello-like 1、(9)cathepsin D、(10)CD24 molecule、(11)Cd44 molecule、(12)claudin 3、(13)collagen triple helix repeat containing 1、(14)cysteine sulfinic acid decarboxylase、(15)deiodinase, iodothyronine, type I、(16)deleted in colorectal carcinoma、(17)deoxyribonuclease I、(18)fibrinogen beta chain、(19)flavin containing monooxygenase 3、(20)glutamate-cysteine ligase, catalytic subunit、(21)glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、(22)glycoprotein (transmembrane) nmb、(23)histamine N-methyltransferase、(24)hypothetical protein LOC56728、(25)kallikrein、(26)kidney androgen regulated protein、(27)lectin, galactoside-binding, soluble, 3、(28)matrix Gla protein、(29)oxidative stress induced growth inhibitor 1、(30)paternally expressed 12、(31)protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 1A、(32)RAS, dexamethasone-induced 1、(regucalcin (senescence marker protein-30)、(33)regucalcin (senescence marker protein-30)、(34)S100 calcium binding protein A10、(35)S100 calcium binding protein A6、(36)secreted phosphoprotein 2、(37)serine (or cysteine) peptidase inhibitor, clade A, member 3K、(38)similar to CPE-receptor、(39)similar to tumor necrosis factor receptor superfamily, mber 12a、(40)solute carrier family 22 (organic cation transporter), member 2、(41)solute carrier family 34 (sodium phosphate), member 2、(42)solute carrier family 4 (anion exchanger), member 1、(43)suppressor of cytokine signaling 3、(44)thymosin, beta 10、(45)tonin、(46)translin、(47)trefoil factor 3, intestinal、(48)ubiquitin D、(49)uromodulinのうちから少なくとも1以上の生体応答遺伝子に対する遺伝子発現レベルを測定するステップと、
（Ｃ）（Ｂ）で得られた前記遺伝子発現レベルを対応する前記化学物質、曝露量、曝露期間とともに遺伝子発現データとして収集するステップと、
（Ｄ）被検化学物質を適当な濃度で一定期間生体または腎臓由来の細胞試料に曝露させるステップと、
（Ｅ）前記生体由来の前記腎臓組織または前記腎臓由来の細胞試料からｍＲＮＡを単離して、生体応答遺伝子群： (1)ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 1、(2)AHNAK nucleoprotein、(3)alpha 1,3-galactosyltransferase 2、(4)alpha-2-macroglobulin、(5)annexin A2、(6)aquaporin 6, kidney specific、(7)calbindin 1、(8)camello-like 1、(9)cathepsin D、(10)CD24 molecule、(11)Cd44 molecule、(12)claudin 3、(13)collagen triple helix repeat containing 1、(14)cysteine sulfinic acid decarboxylase、(15)deiodinase, iodothyronine, type I、(16)deleted in colorectal carcinoma、(17)deoxyribonuclease I、(18)fibrinogen beta chain、(19)flavin containing monooxygenase 3、(20)glutamate-cysteine ligase, catalytic subunit、(21)glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、(22)glycoprotein (transmembrane) nmb、(23)histamine N-methyltransferase、(24)hypothetical protein LOC56728、(25)kallikrein、(26)kidney androgen regulated protein、(27)lectin, galactoside-binding, soluble, 3、(28)matrix Gla protein、(29)oxidative stress induced growth inhibitor 1、(30)paternally expressed 12、(31)protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 1A、(32)RAS, dexamethasone-induced 1、(regucalcin (senescence marker protein-30)、(33)regucalcin (senescence marker protein-30)、(34)S100 calcium binding protein A10、(35)S100 calcium binding protein A6、(36)secreted phosphoprotein 2、(37)serine (or cysteine) peptidase inhibitor, clade A, member 3K、(38)similar to CPE-receptor、(39)similar to tumor necrosis factor receptor superfamily, mber 12a、(40)solute carrier family 22 (organic cation transporter), member 2、(41)solute carrier family 34 (sodium phosphate), member 2、(42)solute carrier family 4 (anion exchanger), member 1、(43)suppressor of cytokine signaling 3、(44)thymosin, beta 10、(45)tonin、(46)translin、(47)trefoil factor 3, intestinal、(48)ubiquitin D、(49)uromodulinのうちから選択される少なくとも１以上の生体応答遺伝子に対する遺伝子発現レベルを測定するステップと、
（Ｆ）（Ｅ）で得られた前記遺伝子発現レベルを前記被検化学物質、曝露量及び曝露期間とともに遺伝子発現データとして収集するステップと、
（Ｇ）（Ｆ）で収集された遺伝子発現データを（Ｃ）で収集された照合用の対応する遺伝子発現データと比較するステップと、
を含むことを特徴とする化学物質の毒性検出・予測方法。
【請求項４２】
請求項４１記載の（Ｂ）および（Ｅ）において選択される少なくとも１以上の前記生体応答遺伝子は、
（１）ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 1、（２）alpha 1,3-galactosyltransferase 2、（３）alpha-2-macroglobulin、（４）annexin A2、（５）aquaporin 6, kidney specific、（６）calbindin 1、（７）cathepsin D、（８）CD24 molecule、（９）Cd44 molecule、（１０）claudin 3、（１１）cysteine sulfinic acid decarboxylase、（１２）deoxyribonuclease I、（１３）fibrinogen beta chain、（１４）glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、（１５）glycoprotein (transmembrane) nmb、（１６）lectin, galactoside-binding, soluble, 3、（１７）matrix Gla protein、（１８）oxidative stress induced growth inhibitor 1、（１９）RAS, dexamethasone-induced 1、（２０）S100 calcium binding protein A10、（２１）secreted phosphoprotein 2、（２２）similar to CPE-receptor、（２３）similar to tumor necrosis factor receptor superfamily, mber 12a、（２４）solute carrier family 34 (sodium phosphate), member 2、（２５）solute carrier family 4 (anion exchanger), member 1、（２６）suppressor of cytokine signaling 3、（２７）thymosin, beta 10、（２８）translin、のうちの少なくともいずれか１つを含むことを特徴とする、請求項４１記載の化学物質の毒性検出・予測方法。
【請求項４３】
前記腎臓組織または前記細胞試料は、マウス、ラット、イヌ、サルまたはヒト由来であることを特徴とする、請求項４１または請求項４２のうちの１つに記載の化学物質の毒性の検出・予測方法。
【請求項４４】
遺伝子発現レベルの測定は、ＲＴ-ＰＣＲ法、iAFLP（introduced Amplified Fragment Length Polymorphism）法、LAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法、nCounter Analysis system、ハイブリダイゼーション法のうちの１つを用いることを特徴とする請求項４１または請求項４２のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性の検出・予測方法。
【請求項４５】
前記ハイブリダイゼーション法は、マイクロアレイ法又はブロット法であることを特徴とする請求項４４記載の化学物質の毒性の検出・予測方法。
【請求項４６】
前記マイクロアレイ法又はブロット法に用いられるプローブは、ヌクレオチド又はタンパク質であることを特徴とする請求項４５記載の化学物質の毒性の検出・予測方法。
【請求項４７】
前記ヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項４６記載の化学物質の毒性の検出・予測方法。
【請求項４８】
前記ヌクレオチドは、標識化ヌクレオチドであることを特徴とする請求項４６または請求項４７記載の化学物質の毒性の検出・予測方法。
【請求項４９】
前記遺伝子発現レベルの測定を前記生体応答遺伝子に対応する核酸又は前記生体応答遺伝子によってコードされるタンパク質の存在もしくは量を測定することで決定することを特徴とする請求項４１または請求項４２のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性の検出・予測方法。
【請求項５０】
前記遺伝子発現レベルの測定を免疫学的方法によって行うことを特徴とする請求項４１または請求項４２のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性の検出・予測方法。
【請求項５１】
前記免疫学的方法は、前記生体応答遺伝子によってコードされるタンパク質又はその断片に対する特異抗体と標的タンパク質との免疫学的複合体を検出する方法であることを特徴とする請求項５０記載の化学物質の毒性の検出・予測方法。
【請求項５２】
前記特異抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、および抗体フラグメントから選択されることを特徴とする請求項５１記載の化学物質の毒性の検出・予測方法。
【請求項５３】
請求項４１または請求項４２のうちのいずれか１つに記載の方法に用いられるプローブを含むキットであって、該プローブが、前記生体応答遺伝子に特異的にハイブリダイズする配列を有する分子を含むことを特徴とする化学物質の毒性の検出・予測キット。
【請求項５４】
前記プローブは、ヌクレオチド又はタンパク質であることを特徴とする請求項５３記載の化学物質の毒性の検出・予測キット。
【請求項５５】
前記ヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項５４記載の化学物質の毒性の検出・予測キット。
【請求項５６】
前記ヌクレオチドは、前記生体応答遺伝子のセンス鎖又はアンチセンス鎖とハイブリダイズし、10〜100 merであることを特徴とする請求項５４記載の化学物質の毒性の検出・予測キット。
【請求項５７】
前記ヌクレオチドは、標識化ヌクレオチドであることを特徴とする請求項５４または請求項５６記載の化学物質の毒性の検出・予測キット。
【請求項５８】
前記プローブは、抗体及び/又はアプタマーであるタンパク質であることを特徴とする請求項５４記載の化学物質の毒性の検出・予測キット。
【請求項５９】
前記プローブは、少なくとも1つ以上を固体支持体に固定したＤＮＡマイクロアレイ、ＤＮＡチップ、タンパクチップまたは抗体チップを含むことを特徴とする請求項５２ないし請求項５８のうちの１つに記載の化学物質の毒性の検出・予測キット。
【請求項６０】
前記固体支持体は、ガラス、シリコン、プラスチック又は生体膜であることを特徴とする請求項５９記載の化学物質の毒性の検出・予測キット。
【請求項１】
化学物質が生体に与える影響を遺伝子発現レベルで検出することにより被検化学物質の毒性を検出する方法であって、（Ａ）前記化学物質の曝露を受けた腎臓組織または腎臓由来の細胞試料に対して、生体応答遺伝子群：(1)ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 1、(2)AHNAK nucleoprotein、(3)alpha 1,3-galactosyltransferase 2、(4)alpha-2-macroglobulin、(5)annexin A2、(6)aquaporin 6, kidney specific、(7)calbindin 1、(8)camello-like 1、(9)cathepsin D、(10)CD24 molecule、(11)Cd44 molecule、(12)claudin 3、(13)collagen triple helix repeat containing 1、(14)cysteine sulfinic acid decarboxylase、(15)deiodinase, iodothyronine, type I、(16)deleted in colorectal carcinoma、(17)deoxyribonuclease I、(18)fibrinogen beta chain、(19)flavin containing monooxygenase 3、(20)glutamate-cysteine ligase, catalytic subunit、(21)glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、(22)glycoprotein (transmembrane) nmb、(23)histamine N-methyltransferase、(24)hypothetical protein LOC56728、(25)kallikrein、(26)kidney androgen regulated protein、(27)lectin, galactoside-binding, soluble, 3、(28)matrix Gla protein、(29)oxidative stress induced growth inhibitor 1、(30)paternally expressed 12、(31)protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 1A、(32)RAS, dexamethasone-induced 1、(regucalcin (senescence marker protein-30)、(33)regucalcin (senescence marker protein-30)、(34)S100 calcium binding protein A10、(35)S100 calcium binding protein A6、(36)secreted phosphoprotein 2、(37)serine (or cysteine) peptidase inhibitor, clade A, member 3K、(38)similar to CPE-receptor、(39)similar to tumor necrosis factor receptor superfamily, mber 12a、(40)solute carrier family 22 (organic cation transporter), member 2、(41)solute carrier family 34 (sodium phosphate), member 2、(42)solute carrier family 4 (anion exchanger), member 1、(43)suppressor of cytokine signaling 3、(44)thymosin, beta 10、(45)tonin、(46)translin、(47)trefoil factor 3, intestinal、(48)ubiquitin D、(49)uromodulinのうちから選択される少なくとも１以上の生体応答遺伝子に対する遺伝子発現レベルを測定する第１の遺伝子発現レベル測定ステップと、
（Ｂ）前記化学物質の曝露を受けていない腎臓組織または腎臓由来の細胞試料に対して、前記第１の遺伝子発現レベル取得ステップにおいて選択された前記生体応答遺伝子のそれぞれに対する遺伝子発現レベルを測定する第２の遺伝子発現レベル測定ステップと、
（Ｃ）前記第１の遺伝子発現データレベル測定ステップ及び前記第２の遺伝子発現データレベル測定ステップにおける前記遺伝子発現レベルを比較するステップと、
を含むことを特徴とする化学物質の毒性の検出方法。
【請求項２】
前記第１の遺伝子発現レベル取得ステップにおいて、選択される少なくとも１以上の前記生体応答遺伝子は、
（１）ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 1、（２）alpha 1,3-galactosyltransferase 2、（３）alpha-2-macroglobulin、（４）annexin A2、（５）aquaporin 6, kidney specific、（６）calbindin 1、（７）cathepsin D、（８）CD24 molecule、（９）Cd44 molecule、（１０）claudin 3、（１１）cysteine sulfinic acid decarboxylase、（１２）deoxyribonuclease I、（１３）fibrinogen beta chain、（１４）glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、（１５）glycoprotein (transmembrane) nmb、（１６）lectin, galactoside-binding, soluble, 3、（１７）matrix Gla protein、（１８）oxidative stress induced growth inhibitor 1、（１９）RAS, dexamethasone-induced 1、（２０）S100 calcium binding protein A10、（２１）secreted phosphoprotein 2、（２２）similar to CPE-receptor、（２３）similar to tumor necrosis factor receptor superfamily, mber 12a、（２４）solute carrier family 34 (sodium phosphate), member 2、（２５）solute carrier family 4 (anion exchanger), member 1、（２６）suppressor of cytokine signaling 3、（２７）thymosin, beta 10、（２８）translin、のうちの少なくともいずれか１つを含むことを特徴とする、請求項１記載の化学物質の毒性の検出方法。
【請求項３】
前記腎臓組織または前記細胞試料は、マウス、ラット、イヌ、サルまたはヒト由来であることを特徴とする、請求項１または請求項２のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性の検出方法。
【請求項４】
遺伝子発現レベルの測定は、ＲＴ-ＰＣＲ法、iAFLP（introduced Amplified Fragment Length Polymorphism）法、LAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法、nCounter Analysis system、ハイブリダイゼーション法のうちの１つを用いることを特徴とする請求項１または請求項２のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性の検出方法。
【請求項５】
前記ハイブリダイゼーション法は、マイクロアレイ法又はブロット法であることを特徴とする請求項１または請求項２のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性の検出方法。
【請求項６】
前記マイクロアレイ法又はブロット法に用いられるプローブは、ヌクレオチド又はタンパク質であることを特徴とする請求項５記載の化学物質の毒性の検出方法。
【請求項７】
前記ヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項６記載の化学物質の毒性の検出方法。
【請求項８】
前記ヌクレオチドは、標識化ヌクレオチドであることを特徴とする請求項６または請求項７記載の化学物質の毒性の検出方法。
【請求項９】
前記遺伝子発現レベルの測定を前記生体応答遺伝子に対応する核酸又は前記生体応答遺伝子によってコードされるタンパク質の存在もしくは量を測定することで決定することを特徴とする請求項１または請求項２のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性の検出方法。
【請求項１０】
前記遺伝子発現レベルの測定を免疫学的方法によって行うことを特徴とする請求項１または請求項２のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性の検出方法。
【請求項１１】
前記免疫学的方法は、前記生体応答遺伝子によってコードされるタンパク質又はその断片に対する特異抗体と標的タンパク質との免疫学的複合体を検出する方法であることを特徴とする請求項１０記載の化学物質の毒性の検出方法。
【請求項１２】
前記特異抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、および抗体フラグメントから選択されることを特徴とする請求項１１記載の化学物質の毒性の検出方法。
【請求項１３】
請求項１または請求項２のうちのいずれか１つに記載の方法に用いられるプローブを含むキットであって、該プローブが、前記生体応答遺伝子に特異的にハイブリダイズする配列を有する分子を含むことを特徴とする化学物質の毒性の検出キット。
【請求項１４】
前記プローブは、ヌクレオチド又はタンパク質であることを特徴とする請求項１３記載の化学物質の毒性の検出キット。
【請求項１５】
前記ヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１４記載の化学物質の毒性の検出キット。
【請求項１６】
前記ヌクレオチドは、前記生体応答遺伝子のセンス鎖又はアンチセンス鎖とハイブリダイズし、10〜100 merであることを特徴とする請求項１４記載の化学物質の毒性の検出キット。
【請求項１７】
前記ヌクレオチドは、標識化ヌクレオチドであることを特徴とする請求項１５または請求項１６記載の化学物質の毒性の検出キット。
【請求項１８】
前記プローブは、抗体及び/又はアプタマーであるタンパク質であることを特徴とする請求項１４記載の化学物質の毒性の検出・予測キット。
【請求項１９】
前記プローブは、少なくとも1つ以上を固体支持体に固定したＤＮＡマイクロアレイ、ＤＮＡチップ、タンパクチップまたは抗体チップを含むことを特徴とする請求項１３ないし請求項１８のうちの１つに記載の化学物質の毒性の検出キット。
【請求項２０】
前記固体支持体は、ガラス、シリコン、プラスチック又は生体膜であることを特徴とする請求項１９記載の化学物質の毒性の検出キット。
【請求項２１】
化学物質が生体に与える影響を遺伝子発現レベルで検出することにより被検化学物質の毒性を検出するために用いられる照合データとしての遺伝子発現データベースを作成する方法であって、
（Ａ）2−ブタノンオキシム、ｍ−キシリレンジアミン、3-シアノピリジン、2−（2−アミノエチルアミノ）エタノール、テトラヒドロフルフリルアルコール、メタクリルアミド、スルホラン、2-イソプロポキシエタノール、ヒドラジン一水和物、4-エチルモルホリン、メタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド、塩化ベンジルトリメチルアンモニウム、ｍ-ニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム、1-ナフチルアミン-4-スルホン酸ナトリウム四水和物、3-メトキシ-3-メチル-1-ブタノール、o-ジクロロベンゼン、3,4-キシリジン、N-メチルアニリン、トリレンジイソシアナート、2-（ジブチルアミノ）エタノール、ｐ-クミルフェノール、ｍ-クレゾール、2,3-ジメチルアニリン、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド、フタル酸ジヘプチル、テトラブロモエタン、アジピン酸ジブチル、P-エチルフェノール、ο-t-ブチルフェノールおよびｐ-（1,1,3,3,-テトラメチルブチル）フェノールのそれぞれについて所定量を所定期間生体または腎臓由来の細胞試料に投与（曝露）するステップと、
（Ｂ）前記生体の腎臓組織または前記腎臓由来の前記細胞試料からｍＲＮＡを単離して、生体応答遺伝子群： (1)ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 1、(2)AHNAK nucleoprotein、(3)alpha 1,3-galactosyltransferase 2、(4)alpha-2-macroglobulin、(5)annexin A2、(6)aquaporin 6, kidney specific、(7)calbindin 1、(8)camello-like 1、(9)cathepsin D、(10)CD24 molecule、(11)Cd44 molecule、(12)claudin 3、(13)collagen triple helix repeat containing 1、(14)cysteine sulfinic acid decarboxylase、(15)deiodinase, iodothyronine, type I、(16)deleted in colorectal carcinoma、(17)deoxyribonuclease I、(18)fibrinogen beta chain、(19)flavin containing monooxygenase 3、(20)glutamate-cysteine ligase, catalytic subunit、(21)glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、(22)glycoprotein (transmembrane) nmb、(23)histamine N-methyltransferase、(24)hypothetical protein LOC56728、(25)kallikrein、(26)kidney androgen regulated protein、(27)lectin, galactoside-binding, soluble, 3、(28)matrix Gla protein、(29)oxidative stress induced growth inhibitor 1、(30)paternally expressed 12、(31)protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 1A、(32)RAS, dexamethasone-induced 1、(regucalcin (senescence marker protein-30)、(33)regucalcin (senescence marker protein-30)、(34)S100 calcium binding protein A10、(35)S100 calcium binding protein A6、(36)secreted phosphoprotein 2、(37)serine (or cysteine) peptidase inhibitor, clade A, member 3K、(38)similar to CPE-receptor、(39)similar to tumor necrosis factor receptor superfamily, mber 12a、(40)solute carrier family 22 (organic cation transporter), member 2、(41)solute carrier family 34 (sodium phosphate), member 2、(42)solute carrier family 4 (anion exchanger), member 1、(43)suppressor of cytokine signaling 3、(44)thymosin, beta 10、(45)tonin、(46)translin、(47)trefoil factor 3, intestinal、(48)ubiquitin D、(49)uromodulinのうちから選択される少なくとも１以上の生体応答遺伝子に対する遺伝子発現レベルを測定するステップと、
（Ｃ）（Ｂ）で得られた前記遺伝子発現レベルを対応する前記化学物質、曝露量及び曝露期間とともに遺伝子発現データとしてデータベース化するステップと、
を含むことを特徴とする照合用遺伝子発現データベースの作成方法。
【請求項２２】
選択される少なくとも１以上の前記生体応答遺伝子は、
（１）ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 1、（２）alpha 1,3-galactosyltransferase 2、（３）alpha-2-macroglobulin、（４）annexin A2、（５）aquaporin 6, kidney specific、（６）calbindin 1、（７）cathepsin D、（８）CD24 molecule、（９）Cd44 molecule、（１０）claudin 3、（１１）cysteine sulfinic acid decarboxylase、（１２）deoxyribonuclease I、（１３）fibrinogen beta chain、（１４）glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、（１５）glycoprotein (transmembrane) nmb、（１６）lectin, galactoside-binding, soluble, 3、（１７）matrix Gla protein、（１８）oxidative stress induced growth inhibitor 1、（１９）RAS, dexamethasone-induced 1、（２０）S100 calcium binding protein A10、（２１）secreted phosphoprotein 2、（２２）similar to CPE-receptor、（２３）similar to tumor necrosis factor receptor superfamily, mber 12a、（２４）solute carrier family 34 (sodium phosphate), member 2、（２５）solute carrier family 4 (anion exchanger), member 1、（２６）suppressor of cytokine signaling 3、（２７）thymosin, beta 10、（２８）translin、のうちの少なくともいずれか１つを含むことを特徴とする請求項２１記載の照合用遺伝子発現データベースの作成方法。
【請求項２３】
前記腎臓組織または前記細胞試料は、マウス、ラット、イヌ、サルまたはヒト由来であることを特徴とする、請求項２１または請求項２２記載の照合用遺伝子発現データベースの作成方法。
【請求項２４】
遺伝子発現レベルの測定は、ＲＴ-ＰＣＲ法、iAFLP（introduced Amplified Fragment Length Polymorphism）法、LAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法、nCounter Analysis system、ハイブリダイゼーション法のうちの１つを用いることを特徴とする請求項２１または請求項２２記載の照合用遺伝子発現データベースの作成方法。
【請求項２５】
前記ハイブリダイゼーション法は、マイクロアレイ法又はブロット法であることを特徴とする請求項２４記載の照合用遺伝子発現データベースの作成方法。
【請求項２６】
前記マイクロアレイ法又はブロット法に用いられるプローブは、ヌクレオチド又はタンパク質であることを特徴とする請求項２５記載の照合用遺伝子発現データベースの作成方法。
【請求項２７】
前記ヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項２６記載の照合用遺伝子発現データベースの作成方法。
【請求項２８】
前記ヌクレオチドは、標識化ヌクレオチドであることを特徴とする請求項２６または請求項２６記載の照合用遺伝子発現データベースの作成方法。
【請求項２９】
前記遺伝子発現レベルの測定を前記生体応答遺伝子に対応する核酸又は前記生体応答遺伝子によってコードされるタンパク質の存在もしくは量を測定することで決定することを特徴とする請求項２１または請求項２２のうちのいずれか１つに記載の照合用遺伝子発現データベースの作成方法。
【請求項３０】
前記遺伝子発現レベルの測定を免疫学的方法によって行うことを特徴とする請求項２１または請求項２２のうちのいずれか１つに記載の照合用遺伝子発現データベースの作成方法。
【請求項３１】
前記免疫学的方法は、前記生体応答遺伝子によってコードされるタンパク質又はその断片に対する特異抗体と標的タンパク質との免疫学的複合体を検出する方法であることを特徴とする請求項３０記載の照合用遺伝子発現データベースの作成方法または化学物質の毒性の検出・予測方法。
【請求項３２】
前記特異抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、および抗体フラグメントから選択されることを特徴とする請求項３１記載の照合用遺伝子発現データベースの作成方法。
【請求項３３】
請求項２１または請求項２２のうちのいずれか１つに記載の方法に用いられるプローブを含むキットであって、該プローブが、前記生体応答遺伝子に特異的にハイブリダイズする配列を有する分子を含むことを特徴とする照合用遺伝子発現データベースの作成キット。
【請求項３４】
前記プローブは、ヌクレオチド又はタンパク質であることを特徴とする請求項３３記載の照合用遺伝子発現データベースの作成キット。
【請求項３５】
前記ヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項３４記載の照合用遺伝子発現データベースの作成キット。
【請求項３６】
前記ヌクレオチドは、前記生体応答遺伝子のセンス鎖又はアンチセンス鎖とハイブリダイズし、10〜100 merであることを特徴とする請求項３４記載の照合用遺伝子発現データベースの作成キット。
【請求項３７】
前記ヌクレオチドは、標識化ヌクレオチドであることを特徴とする請求項３５または請求項３６記載の照合用遺伝子発現データベースの作成キット。
【請求項３８】
前記プローブは、抗体及び/又はアプタマーであるタンパク質であることを特徴とする請求項３３記載の照合用遺伝子発現データベースの作成キット。
【請求項３９】
前記プローブは、少なくとも1つ以上を固体支持体に固定したＤＮＡマイクロアレイ、ＤＮＡチップ、タンパクチップまたは抗体チップを含むことを特徴とする請求項３３ないし請求項３８のうちの１つに記載の照合用遺伝子発現データベースの作成キット。
【請求項４０】
前記固体支持体は、ガラス、シリコン、プラスチック又は生体膜であることを特徴とする請求項３９記載の照合用遺伝子発現データベースの作成キット。
【請求項４１】
化学物質が生体に与える影響を遺伝子発現レベルで検出することにより被検化学物質の毒性を検出・予測する方法であって、
（Ａ）2−ブタノンオキシム、ｍ−キシリレンジアミン、3-シアノピリジン、2−（2−アミノエチルアミノ）エタノール、テトラヒドロフルフリルアルコール、メタクリルアミド、スルホラン、2-イソプロポキシエタノール、ヒドラジン一水和物、4-エチルモルホリン、メタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド、塩化ベンジルトリメチルアンモニウム、ｍ-ニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム、1-ナフチルアミン-4-スルホン酸ナトリウム四水和物、3-メトキシ-3-メチル-1-ブタノール、o-ジクロロベンゼン、3,4-キシリジン、N-メチルアニリン、トリレンジイソシアナート、2-（ジブチルアミノ）エタノール、ｐ-クミルフェノール、ｍ-クレゾール、2,3-ジメチルアニリン、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド、フタル酸ジヘプチル、テトラブロモエタン、アジピン酸ジブチル、P-エチルフェノール、ο-t-ブチルフェノールおよびｐ-（1,1,3,3,-テトラメチルブチル）フェノールのそれぞれについて所定量を一定期間生体または腎臓由来の細胞試料に投与（曝露）するステップと、
（Ｂ）前記生体由来の腎臓組織または前記腎臓由来の前記細胞試料からｍＲＮＡを単離して、生体応答遺伝子群： (1)ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 1、(2)AHNAK nucleoprotein、(3)alpha 1,3-galactosyltransferase 2、(4)alpha-2-macroglobulin、(5)annexin A2、(6)aquaporin 6, kidney specific、(7)calbindin 1、(8)camello-like 1、(9)cathepsin D、(10)CD24 molecule、(11)Cd44 molecule、(12)claudin 3、(13)collagen triple helix repeat containing 1、(14)cysteine sulfinic acid decarboxylase、(15)deiodinase, iodothyronine, type I、(16)deleted in colorectal carcinoma、(17)deoxyribonuclease I、(18)fibrinogen beta chain、(19)flavin containing monooxygenase 3、(20)glutamate-cysteine ligase, catalytic subunit、(21)glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、(22)glycoprotein (transmembrane) nmb、(23)histamine N-methyltransferase、(24)hypothetical protein LOC56728、(25)kallikrein、(26)kidney androgen regulated protein、(27)lectin, galactoside-binding, soluble, 3、(28)matrix Gla protein、(29)oxidative stress induced growth inhibitor 1、(30)paternally expressed 12、(31)protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 1A、(32)RAS, dexamethasone-induced 1、(regucalcin (senescence marker protein-30)、(33)regucalcin (senescence marker protein-30)、(34)S100 calcium binding protein A10、(35)S100 calcium binding protein A6、(36)secreted phosphoprotein 2、(37)serine (or cysteine) peptidase inhibitor, clade A, member 3K、(38)similar to CPE-receptor、(39)similar to tumor necrosis factor receptor superfamily, mber 12a、(40)solute carrier family 22 (organic cation transporter), member 2、(41)solute carrier family 34 (sodium phosphate), member 2、(42)solute carrier family 4 (anion exchanger), member 1、(43)suppressor of cytokine signaling 3、(44)thymosin, beta 10、(45)tonin、(46)translin、(47)trefoil factor 3, intestinal、(48)ubiquitin D、(49)uromodulinのうちから少なくとも1以上の生体応答遺伝子に対する遺伝子発現レベルを測定するステップと、
（Ｃ）（Ｂ）で得られた前記遺伝子発現レベルを対応する前記化学物質、曝露量、曝露期間とともに遺伝子発現データとして収集するステップと、
（Ｄ）被検化学物質を適当な濃度で一定期間生体または腎臓由来の細胞試料に曝露させるステップと、
（Ｅ）前記生体由来の前記腎臓組織または前記腎臓由来の細胞試料からｍＲＮＡを単離して、生体応答遺伝子群： (1)ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 1、(2)AHNAK nucleoprotein、(3)alpha 1,3-galactosyltransferase 2、(4)alpha-2-macroglobulin、(5)annexin A2、(6)aquaporin 6, kidney specific、(7)calbindin 1、(8)camello-like 1、(9)cathepsin D、(10)CD24 molecule、(11)Cd44 molecule、(12)claudin 3、(13)collagen triple helix repeat containing 1、(14)cysteine sulfinic acid decarboxylase、(15)deiodinase, iodothyronine, type I、(16)deleted in colorectal carcinoma、(17)deoxyribonuclease I、(18)fibrinogen beta chain、(19)flavin containing monooxygenase 3、(20)glutamate-cysteine ligase, catalytic subunit、(21)glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、(22)glycoprotein (transmembrane) nmb、(23)histamine N-methyltransferase、(24)hypothetical protein LOC56728、(25)kallikrein、(26)kidney androgen regulated protein、(27)lectin, galactoside-binding, soluble, 3、(28)matrix Gla protein、(29)oxidative stress induced growth inhibitor 1、(30)paternally expressed 12、(31)protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 1A、(32)RAS, dexamethasone-induced 1、(regucalcin (senescence marker protein-30)、(33)regucalcin (senescence marker protein-30)、(34)S100 calcium binding protein A10、(35)S100 calcium binding protein A6、(36)secreted phosphoprotein 2、(37)serine (or cysteine) peptidase inhibitor, clade A, member 3K、(38)similar to CPE-receptor、(39)similar to tumor necrosis factor receptor superfamily, mber 12a、(40)solute carrier family 22 (organic cation transporter), member 2、(41)solute carrier family 34 (sodium phosphate), member 2、(42)solute carrier family 4 (anion exchanger), member 1、(43)suppressor of cytokine signaling 3、(44)thymosin, beta 10、(45)tonin、(46)translin、(47)trefoil factor 3, intestinal、(48)ubiquitin D、(49)uromodulinのうちから選択される少なくとも１以上の生体応答遺伝子に対する遺伝子発現レベルを測定するステップと、
（Ｆ）（Ｅ）で得られた前記遺伝子発現レベルを前記被検化学物質、曝露量及び曝露期間とともに遺伝子発現データとして収集するステップと、
（Ｇ）（Ｆ）で収集された遺伝子発現データを（Ｃ）で収集された照合用の対応する遺伝子発現データと比較するステップと、
を含むことを特徴とする化学物質の毒性検出・予測方法。
【請求項４２】
請求項４１記載の（Ｂ）および（Ｅ）において選択される少なくとも１以上の前記生体応答遺伝子は、
（１）ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 1、（２）alpha 1,3-galactosyltransferase 2、（３）alpha-2-macroglobulin、（４）annexin A2、（５）aquaporin 6, kidney specific、（６）calbindin 1、（７）cathepsin D、（８）CD24 molecule、（９）Cd44 molecule、（１０）claudin 3、（１１）cysteine sulfinic acid decarboxylase、（１２）deoxyribonuclease I、（１３）fibrinogen beta chain、（１４）glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、（１５）glycoprotein (transmembrane) nmb、（１６）lectin, galactoside-binding, soluble, 3、（１７）matrix Gla protein、（１８）oxidative stress induced growth inhibitor 1、（１９）RAS, dexamethasone-induced 1、（２０）S100 calcium binding protein A10、（２１）secreted phosphoprotein 2、（２２）similar to CPE-receptor、（２３）similar to tumor necrosis factor receptor superfamily, mber 12a、（２４）solute carrier family 34 (sodium phosphate), member 2、（２５）solute carrier family 4 (anion exchanger), member 1、（２６）suppressor of cytokine signaling 3、（２７）thymosin, beta 10、（２８）translin、のうちの少なくともいずれか１つを含むことを特徴とする、請求項４１記載の化学物質の毒性検出・予測方法。
【請求項４３】
前記腎臓組織または前記細胞試料は、マウス、ラット、イヌ、サルまたはヒト由来であることを特徴とする、請求項４１または請求項４２のうちの１つに記載の化学物質の毒性の検出・予測方法。
【請求項４４】
遺伝子発現レベルの測定は、ＲＴ-ＰＣＲ法、iAFLP（introduced Amplified Fragment Length Polymorphism）法、LAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法、nCounter Analysis system、ハイブリダイゼーション法のうちの１つを用いることを特徴とする請求項４１または請求項４２のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性の検出・予測方法。
【請求項４５】
前記ハイブリダイゼーション法は、マイクロアレイ法又はブロット法であることを特徴とする請求項４４記載の化学物質の毒性の検出・予測方法。
【請求項４６】
前記マイクロアレイ法又はブロット法に用いられるプローブは、ヌクレオチド又はタンパク質であることを特徴とする請求項４５記載の化学物質の毒性の検出・予測方法。
【請求項４７】
前記ヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項４６記載の化学物質の毒性の検出・予測方法。
【請求項４８】
前記ヌクレオチドは、標識化ヌクレオチドであることを特徴とする請求項４６または請求項４７記載の化学物質の毒性の検出・予測方法。
【請求項４９】
前記遺伝子発現レベルの測定を前記生体応答遺伝子に対応する核酸又は前記生体応答遺伝子によってコードされるタンパク質の存在もしくは量を測定することで決定することを特徴とする請求項４１または請求項４２のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性の検出・予測方法。
【請求項５０】
前記遺伝子発現レベルの測定を免疫学的方法によって行うことを特徴とする請求項４１または請求項４２のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性の検出・予測方法。
【請求項５１】
前記免疫学的方法は、前記生体応答遺伝子によってコードされるタンパク質又はその断片に対する特異抗体と標的タンパク質との免疫学的複合体を検出する方法であることを特徴とする請求項５０記載の化学物質の毒性の検出・予測方法。
【請求項５２】
前記特異抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、および抗体フラグメントから選択されることを特徴とする請求項５１記載の化学物質の毒性の検出・予測方法。
【請求項５３】
請求項４１または請求項４２のうちのいずれか１つに記載の方法に用いられるプローブを含むキットであって、該プローブが、前記生体応答遺伝子に特異的にハイブリダイズする配列を有する分子を含むことを特徴とする化学物質の毒性の検出・予測キット。
【請求項５４】
前記プローブは、ヌクレオチド又はタンパク質であることを特徴とする請求項５３記載の化学物質の毒性の検出・予測キット。
【請求項５５】
前記ヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項５４記載の化学物質の毒性の検出・予測キット。
【請求項５６】
前記ヌクレオチドは、前記生体応答遺伝子のセンス鎖又はアンチセンス鎖とハイブリダイズし、10〜100 merであることを特徴とする請求項５４記載の化学物質の毒性の検出・予測キット。
【請求項５７】
前記ヌクレオチドは、標識化ヌクレオチドであることを特徴とする請求項５４または請求項５６記載の化学物質の毒性の検出・予測キット。
【請求項５８】
前記プローブは、抗体及び/又はアプタマーであるタンパク質であることを特徴とする請求項５４記載の化学物質の毒性の検出・予測キット。
【請求項５９】
前記プローブは、少なくとも1つ以上を固体支持体に固定したＤＮＡマイクロアレイ、ＤＮＡチップ、タンパクチップまたは抗体チップを含むことを特徴とする請求項５２ないし請求項５８のうちの１つに記載の化学物質の毒性の検出・予測キット。
【請求項６０】
前記固体支持体は、ガラス、シリコン、プラスチック又は生体膜であることを特徴とする請求項５９記載の化学物質の毒性の検出・予測キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１１−１３７６５９（Ｐ２０１１−１３７６５９Ａ）
【公開日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２９６２３２（Ｐ２００９−２９６２３２）
【出願日】平成２１年１２月２５日（２００９．１２．２５）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２１年度独立行政法人新エネルギー・産業技術開発機構「高機能簡易型有害性評価手法の開発／２８日間反復投与試験結果と相関する遺伝子発現データセットの開発」にかかる業務委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０９０８８６５３）株式会社メディクローム (19)
【公開日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月２５日（２００９．１２．２５）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２１年度独立行政法人新エネルギー・産業技術開発機構「高機能簡易型有害性評価手法の開発／２８日間反復投与試験結果と相関する遺伝子発現データセットの開発」にかかる業務委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０９０８８６５３）株式会社メディクローム (19)
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