酸化ストレスマーカー及びその測定法
本発明は、ヒドロキシオクタデカジエノイックアシッド（HODE）類及び７−ヒドロキシコレステロール(7-FCOH)類からなる群から選ばれる少なくとも１種からなる哺乳動物の酸化ストレスを評価するためのマーカーに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸化ストレスマーカー及びその定量法並びに酸化ストレスの評価方法に関する。酸化ストレスマーカーの定量は、酸化ストレスに起因する疾患の診断に有用である。
【背景技術】
【０００２】
酸化ストレスは、種々の疾患と関与することが知られており、酸化ストレスマーカーとして、アクロレイン、4-ヒドロキシノネナール、マロンジアルデヒド、クロトンアルデヒド、8-OHｄG（8-ヒドロキシデオキシグアノシン）、メチルグリオキザール、８−アイソ−プロスタグランジンF2α、血漿過酸化脂質(TBARS) 、CoQ10、酸化型α1-antitrypsin、酸化シスチン、尿中Biopyrrinsなどの非常に多くのマーカーが知られている。
これらのマーカーは、活性酸素（スーパーオキシドラジカル、過酸化水素、ヒドロキシラジカルなど）との反応により産生されると考えられるが、酸化ストレスとどの程度関連しているかは不明である。
活性酸素との酸化生成物である酸化ストレスマーカーは、一次酸化生成物としてヒドロペルオキシドなどが挙げられる。しかしながら、ヒドロペルオキシドは測定の途中でも分解或いは更なる反応により他の物質に変化していくため、どの物質を定量すれば酸化ストレスを正確に評価できるのか明らかではない。
【０００３】
リノール酸の過酸化生成物であるＨＯＤＥ（ヒドロキシオクタデカジエノイックアシッド）は、糖尿病、動脈硬化との関連が指摘されている（非特許文献１、２）。
【０００４】
従来、酸化ストレスマーカーの定量は、抗体を用いる方法や、サンプルを抽出等して質量分析やＨＰＬＣ，ＧＣなどの機器分析により定量していたが、活性酸素等との反応により生成する分解物の種類は数多く、酸化ストレスの正確な評価はできなかった。
【非特許文献１】Inoue et al., Biochim. Biophys. Acta 1438, 204-212, 1999
【非特許文献２】Jira et al., Chem. Phys. Lipids 291, 95-100, 1996
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、酸化ストレスに伴う分解物を正確に測定し、酸化ストレスの程度を正しく評価するための方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、以下の発明を提供するものである。
【０００７】
１． ヒドロキシオクタデカジエノイックアシッド（HODE）類及び７−ヒドロキシコレステロール(7-FCOH)類からなる群から選ばれる少なくとも１種からなる哺乳動物の酸化ストレスを評価するためのマーカー。
【０００８】
２． 前記HODE類が、9-HODE, 10-HODE, 12-HODEおよび13-HODEからなる群から選ばれる少なくとも１種である項１に記載のマーカー。
【０００９】
３． 前記HODE類が、9-HODEおよび13-HODEからなる群から選ばれる少なくとも１種である項２に記載のマーカー。
【００１０】
４． 前記HODE類が、9-(E, E)HODEおよび13-(E, E)HODEからなる群から選ばれる(E, E)体と、9-(E, Z)HODEおよび13-(Z, E)HODEからなる群から選ばれる(E, Z)-(Z, E)体との組み合わせであり、(E, E)体と(E, Z)-(Z, E)体と比に基づき酸化ストレスを評価する項１に記載のマーカー。
【００１１】
５． 前記(7-FCOH)類が、７α−ヒドロキシコレステロール(7α-FCOH)および７β−ヒドロキシコレステロール(7β-FCOH)からなる群から選ばれる少なくとも１種である項１に記載のマーカー。
【００１２】
６． 前記(7-FCOH)類が、７β−ヒドロキシコレステロール(7β-FCOH)である項１に記載のマーカー。
【００１３】
７． 酸化ストレスに起因する疾患の診断のためのマーカーである項１に記載のマーカー。
【００１４】
８． 哺乳動物由来のサンプル中のHODE類および７−ＦＣＯＨ類からなる群から選ばれる少なくとも１種を、必要に応じてさらにイソプロスタン類とともに定量することを特徴とする哺乳動物の酸化ストレスの評価方法。
【００１５】
９． 哺乳動物由来のサンプル中のHODE類および７−ＦＣＯＨ類からなる群から選ばれる少なくとも１種を、必要に応じてさらにイソプロスタン類とともに定量することを特徴とする哺乳動物の酸化ストレスに起因する疾患の診断方法。
【００１６】
１０． 哺乳動物由来のサンプルを還元剤で処理後、アルカリ処理してHODE類および７−ＦＣＯＨ類からなる群から選ばれる少なくとも１種を、必要に応じてさらにイソプロスタン類とともに定量することを特徴とする哺乳動物の酸化ストレスマーカーの定量方法。
【００１７】
１１． 還元剤がNaBH4である項６に記載の方法。
【００１８】
１２． アルカリ処理をアルカリ金属水酸化物を用いて行う項１０に記載の方法。
【００１９】
１３． 還元剤とアルカリ処理剤を含むHODE類、7-FCOH類及びイソプロスタン類からなる群から選ばれる少なくとも１種の酸化ストレスマーカーを測定するためのキット。
【００２０】
１４． 還元剤の反応溶剤として、アルコール系溶剤をさらに含む項１３に記載のキット。
【００２１】
１５． アルコール系溶剤が、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノールからなる群から選ばれるいずれかである項１３に記載のキット。
【００２２】
１６． 還元剤がNaBH4である項１３に記載のキット。
【００２３】
１７． アルカリ処理剤がアルカリ金属水酸化物である項１３に記載のキット。
【００２４】
１８． 酸化ストレスに起因する疾患を診断するための項１３に記載のキット。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、酸化ストレスの適切なマーカーを提供することができ、酸化ストレスに関連する疾患、例えば糖尿病、動脈硬化、パーキンソン病、アルツハイマー病などの神経変性疾患、虚血再灌流障害（例えば心筋梗塞、狭心症、脳卒中など）、眼の光刺激による酸化ストレス障害を含む眼科疾患（例えば、白内障、結膜炎など）、呼吸器疾患（特に慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））、肝疾患（慢性肝炎、急性肝炎、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎などのウイルス性肝炎、肝硬変）、歯科疾患（歯周病、歯肉炎）、不妊症（特に酸化ストレスによる精子或いは卵子の機能不全）などの疾患を、本発明のマーカーにより診断し得る。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】マウスでのビタミンＥ投与群と非投与群でのＨＯＤＥとｉｓｏＰｓの血漿及び肝臓での測定値を示す。
【図２】機能性食品を一定期間摂取前後の赤血球中のＨＯＤＥとｉｓｏＰｓの変化を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明の酸化ストレスマーカーは、哺乳動物の酸化ストレスを測定、評価もしくは診断するためのマーカーとして有用である。酸化ストレスは、哺乳動物由来のサンプル中のマーカーを定量することにより測定、評価もしくは診断することができる。
【００２８】
本発明において、サンプルは、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、サル、イヌ、ラット、マウスなどの哺乳動物由来のものであり、好ましくはヒト由来である。
サンプルとしては、血液（血漿、血清、血球（赤血球、白血球）を含む）、尿、脳脊髄液、涙液、精液、唾液、リンパ液、組織の一部（生検等により得られる）などが挙げられ、好ましくは血液（血漿、血清、血球を含む）、尿が例示される。具体的には、以下のような表１に示される酸化ストレスを測定するのに有用である。
【００２９】
【表１】
【００３０】
ＨＯＤＥとしては、水酸基を有するオクタデカジエノイックアシッド（octadecadienoic acid）が挙げられ、該ＨＯＤＥの２つの二重結合は、(E, E)、(E, Z)もしくは(Z, E)のいずれか或いはこれらの混合物であってもよい。HODEとしては、具体的には
9-hydroxyoctadecadienoic acid (9-HODE), 13-hydroxyoctadecadienoic acid (13-HODE), 10-hydroxyoctadecadienoic acid (10-HODE), 12-hydroxyoctadecadienoic acid (12-HODE)が挙げられ、これらは(E, E)体、(E, Z)体、(Z, E)体のいずれであってもよい。マーカーとして好ましいHODEは、以下のものである：
9-(E, E)-HODE, 13-(E, E)-HODE, 9-(E, Z)-HODE, 13-(Z, E)-HODE, 10-(E,Z)-HODEおよび12-(Z, E)-HODE。
【００３１】
本発明において、HODE類及び7-FCOH類から選ばれる少なくとも１種のマーカーのみを用いて酸化ストレスを測定もしくは評価、或いは酸化ストレスに基づく疾患の診断をしてもよいが、HODE類及び7-FCOH類から選ばれる少なくとも１種のマーカーと組み合わせて公知のマーカーである8-iso-PGF2αを使用し、これらのマーカーの測定結果を組み合わせて、酸化ストレスを測定もしくは評価、或いは酸化ストレスに基づく疾患を診断することもできる。
【００３２】
また、７−ヒドロキシコレステロール（7-FCOH）類としては、７α−ヒドロキシコレステロール（７α−ＦＣＯＨ）、７β−ヒドロキシコレステロール（７β−ＦＣＯＨ）が挙げられる。好ましい7-FCOH類は、7β-FCOHである。
【００３３】
さらにイソプロスタン類としては、３個の水酸基、２個の二重結合、COOH基、シクロペンタン環を分子内に有し、アラキドン酸から誘導されるプロスタグランジンであり、８−アイソ−プロスタグランジンF2α(8-iso-PGF2α)、iPF2α-VI、iPF2α-V、iPF2α-IVなどが挙げられる。
【００３４】
本発明の１つの実施形態において使用され得る好ましいマーカーの構造式を以下に示す。
【００３５】
【化１】
【００３６】
酸化ストレスマーカーであるHODE類、7-FCOH類、イソプロスタン類（特に８−アイソ−プロスタグランジンF2α）などは、例えば以下のようにして定量することができる。
【００３７】
サンプルは、まず還元剤で処理されて、ヒドロペルオキシド、ペルオキシド等の活性酸素との反応生成物をその還元体に導き、それ以上の分解を抑制するのが好ましい。例えば、HODE（ヒドロキシオクタデカジエノイック酸）の原料であるリノール酸などは、活性酸素と反応して下式のようにヒドロペルオキシドになる。
【００３８】
これを還元体に導くと、9-HODEまたは13-HODEなどに変換される。なお、HODEは、哺乳動物生体内の活性酸素と反応し、さらに還元されて9-HODE、13-HODEなどに導かれるが、一重項酸素と反応すると10-HODEまたは12-HODEに変換され得る。従って、皮膚や眼、鼻、耳、口腔内などの光（太陽光、蛍光灯、紫外線など）と接触し得る粘膜、或いはX線やγ線などを受けた場合には、10-HODE、12-HODEについても測定する価値がある。
【００３９】
生体サンプルを還元して過酸化物を安定なＨＯＤＥ類、7-FCOH類、イソプロスタン類に導くための還元剤としては、ヒドロペルオキシドを還元できるが、炭素−炭素二重結合、カルボキシル（ＣＯＯＨ）基、エステル基などは還元しない還元剤が使用され、例えば水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）、ソディウムシアノボロヒドリド（NaCNBH3）などが挙げられる。
【００４０】
還元反応は、還元剤を１当量から過剰量用い、メタノール、エタノールなどのアルコール又は含水アルコール中で、０℃〜５０℃程度の温度下に１分から５時間程度反応させることにより有利に進行する。
【００４１】
リノール酸（２つの二重結合がZ, Z(シス型)）が酸化されると、ZEないしEZ、或いはEEに異性化する。このときの(Z, E)体と(E, Z)体の合計量と、(E, E)体の比（R）は
R＝｛(Z, E)体と(E, Z)体の合計量｝／(E, E)体の量
により計算でき、これを酸化ストレスの状態が低い健常者と比較することで、酸化ストレスの状態を推定することができる。
【００４２】
例えば、健常者の上記比（R）に対し、５％以上、あるいは１０％以上、さらに１５％以上、特に２０％以上、より特別には３０％以上低下している場合には、酸化ストレスを受けていると判断され、低下率が大きいほど酸化ストレスは強いと判断される。
【００４３】
7-FCOH類、イソプロスタン類についてもHODE類と同様にヒドロペルオキシド（OOH）或いはペルオキシド（OO）を経由しているので、還元処理により、さらなる分解が抑制されて、酸化ストレスをより正確に測定することができるようになる。
【００４４】
HODE類、7-FCOH類は、血液、尿、唾液、脳脊髄液、リンパ液、精液などの体液中でより多く発現されるので、これらに関する酸化ストレスを測定、評価ないし酸化ストレスに起因する疾患を診断するのに有用である。
【００４５】
また、8-iso-PGF2αなどのイソプロスタン類は、組織サンプル中でより強く発現される可能性があり、特定の組織、器官、臓器などにおける酸化ストレスを測定、評価ないし酸化ストレスに起因する疾患を診断するのに有用である。
【００４６】
従って、これら２種類のマーカーを組み合わせることで、酸化ストレスをより精密に測定、評価ないし酸化ストレスに起因する疾患を診断し得る。
【００４７】
上記の還元処理により生成する9-HODE、10-HODE、12-HODE、13-HODE、7α-FCOH、7β-FCOH、8-iso-PGF2αなどのHODE類、7-FCOH類、イソプロスタン類(isoPs)は比較的安定な化合物であり、それ以上の分解は抑制される。
【００４８】
上記のように還元処理により得られる、9-HODE、10-HODE、12-HODE、13-HODE、7α-FCOH、7β-FCOH、8-iso-PGF2αなどのHODE類、7-FCOH類、イソプロスタン類(isoPs)はフリー形態とエステル形態の両方で存在している。これらは安定な化合物であり、それ以上の分解は抑制される。
【００４９】
上記で得られた還元体は、HODE類の脂肪酸型のものも存在するが、多くはホスファチジルコリンなどのリン脂質、コレステロールエステル、トリグリセライド、ジグリセライドなどのグリセリンエステルとして存在する。従って、このエステルを加水分解して高級脂肪酸に導くために、アルカリ処理剤、好ましくは水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウムなどのアルカリ金属水酸化物と反応させてHODEを脂肪酸に導く。
【００５０】
アルカリ処理により３位の水酸基がエステル化されていた７−ヒドロキシコレステロールエステルが対応する７−ヒドロキシコレステロールに変換される。
【００５１】
同様に８−アイソ−プロスタグランジンF2α等のイソプロスタン類のエステルもアルカリ処理により加水分解される。
【００５２】
アルカリ加水分解は塩基の存在下に、室温から溶媒の沸騰する程度の温度下に１０分間から２４時間程度行うことにより有利に進行する。塩基としては、溶液をアルカリ性にしてエステルを加水分解できるものであれば特に限定されないが、例えばアルカリ金属水酸化物（NaOH, KOH, LiOHなど）、アルカリ土類金属水酸化物（Ca(OH)2, Mg(OH)2, Ba(OH)2）など）、アルカリ金属炭酸水素塩（NaHCO3, KHCO3, LiHCO3）, アルカリ金属炭酸塩（Na2CO3, K2CO3, Li2CO3）,などが挙げられる。好ましいアルカリはNaOH, KOH, LiOHなどのアルカリ金属水酸化物である。
【００５３】
加水分解は、水中で行ってもよく、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、エタノール、メタノール、イソプロパノール、ブタノール、アセトン、ＤＭＦ，ＤＭＳＯ，Ｎ−メチルピロリドン、などの溶媒を水と混合して行うこともできる。
【００５４】
このような加水分解によって、遊離形態と共にエステル形態の酸化物（HODE類、7-FCOH類、イソプロスタン類）を測定することができ、酸化ストレスを精密に測定ないし評価することができる。
【００５５】
「酸化ストレス」とは、過酸化水素、スーパーオキサイド、ヒドロキシラジカル、一重項酸素などの生体内で発生し得る活性酸素によるストレスを意味し、本発明ではリノール酸、コレステロール、アラキドン酸が活性酸素により酸化されて発生したＨＯＤＥ類、7-FCOH類、イソプロスタン類）を測定することにより、酸化ストレスの程度を評価することができる。
【００５６】
酸化ストレスは、血液サンプル中の血清または血漿などを測定することもできるが、例えば赤血球ないし白血球と血漿ないし血清の測定値を総合的に評価して、酸化ストレスをより精密に評価することもできる。また、唾液、涙液、精液などの局所サンプルと血液などの全身性サンプルの測定値を組み合わせることもできる。唾液、涙液、精液などの局所サンプルのマーカーを測定することにより、例えば、眼、口腔内、精子などに対する酸化ストレスの程度を調べることができ、眼科疾患（白内障、緑内障、ドライアイ、結膜炎、角膜炎など）、歯科疾患（歯周病、歯肉炎、歯槽膿漏など）、不妊症（特に精子に起因する不妊症）の診断に利用し得る。
【００５７】
酸化ストレスに起因する疾患としては、糖尿病、動脈硬化、パーキンソン病、アルツハイマー病などの神経変性疾患、虚血再灌流障害（例えば心筋梗塞、狭心症、脳卒中など）、眼の光刺激による酸化ストレス障害を含む眼科疾患（例えば、白内障、結膜炎など）、呼吸器疾患（特に慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））、肝疾患（慢性肝炎、急性肝炎、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎などのウイルス性肝炎、肝硬変）、歯科疾患（歯周病、歯肉炎）、不妊症（特に酸化ストレスによる精子或いは卵子の機能不全）などの疾患を例示でき、これらの疾患は本発明のマーカーにより診断し得る。
ＨＯＤＥが生体内で生成するメカニズムを以下に示す。
【００５８】
【化２】
【００５９】
（式中Ｒ１，Ｒ２は、一方が(ＣＨ２)４ＣＨ３を示し、他方が(ＣＨ２)７ＣＯＯＨを示す。ｈｐｏはヒドロペルオキシドを示す。）
酸化ストレスマーカーが７−ヒドロキシコレステロールである場合、還元剤処理によりコレステロールおよびコレステロールエステルの過酸化物ないしカルボニル化合物は、下式のように７α−ヒドロキシコレステロール又は７β−ヒドロキシコレステロールに導かれる。
7-FCOH類の生成メカニズム
【００６０】
【化３】
【００６１】
なお、アラキドン酸から８−アイソ−プロスタグランジンF2α（8-iso-PGF２α）などのイソプロスタン類に至るまでの反応中間体の一部は、上記還元処理により8-iso-PGF２αに導かれるが、その量はわずかである。以下に、アラキドン酸からイソプロスタン類が生成する推定機構を示す。
【００６２】
【化４】
【００６３】
アルカリ処理後のサンプルは、HPLC等の通常の分離手段により分離し、GC/MSのような通常の分析手段を用いて、HODE類、７−ヒドロキシコレステロール類、８−アイソ−プロスタグランジンF2αなどイソプロスタン類の酸化ストレスマーカーを定量し、酸化ストレスの程度を評価することができる。
【００６４】
以下の実施例に示されるように、HODE類、７−ヒドロキシコレステロール類、８−アイソ−プロスタグランジンF2αなどの酸化ストレスマーカーは、ＡＩＰＨなどのラジカル発生剤の投与によりその量が大幅に増大することが確認されており、さらに、抗酸化作用を有するビタミンＥや、食品中に含まれる天然抗酸化物質（例えばアントシアニン、ポリフェノール、カテキン、コエンザイムＱ１０など）の投与によりこのようなストレスマーカーの測定値は低下する。
【００６５】
従って、本発明のマーカーは、哺乳動物（特にヒト）における酸化ストレスを評価し、酸化ストレスに起因する疾患の診断、将来これらの疾患に罹患する可能性、疾患の将来の経過（予後）の予測などに有用である。
【００６６】
酸化ストレスマーカーとして、ＨＯＤＥと７−ヒドロキシコレステロールは同様な方向に変動するが、８−アイソ−プロスタグランジンF2αはこれらとは変動の仕方が異なっており、ＨＯＤＥと７−ヒドロキシコレステロールがより重要な酸化ストレスの指標であり、これらを組み合わせることにより、より正確な酸化ストレスの評価を行うことができると期待される。
【００６７】
本発明は、さらに、HODE類、７−ヒドロキシコレステロール類及びイソプロスタン類からなる酸化ストレスマーカーを測定するためのキットに関する。
【００６８】
該キットは、哺乳動物（特に好ましくはヒト）由来のサンプルを還元し、ヒドロペルオキシド等の過酸化物をアルコールに導くための還元剤、および、エステル型のヒドロペルオキシドを遊離のカルボン酸に鹸化するためのアルカリ処理剤を含む。
【００６９】
キットに含まれる還元剤は、サンプルの過酸化物を還元するための過剰量含まれるのが好ましく、例えば１サンプルあたり０．１〜１００mg程度（或いは3マイクロモル〜3ミリモル）使用される。好ましい還元剤は、NaBH4である。
【００７０】
また、アルカリ処理剤はエステルを加水分解できる量であれば特に限定されないが、例えば１〜１０００mg程度（或いは0.2〜20ミリモル）使用される。
【００７１】
本発明のキットは、さらに還元剤をサンプルに加えた還元反応に使用される溶剤を含むことができる。好ましい溶剤としては、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノールなどのアルコール系溶剤が例示される。
【実施例】
【００７２】
以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明する。
実施例１
8週齢Wistar系雄性ラット4匹へ2,2’-アゾビス[2-（2-イミダゾリン-2-イル）プロパン]ジヒドロクロライド（AIPH）を含有する生理食塩水を腹腔内へAIPHとして60 ｍｇ／ｋｇ-体重となるように注入した。1.5時間後採血し、即座に遠心機にて血漿を採取した（3500ｒｐｍ×10分）。血漿2ｍｌを正確に測りとり、内部標準物質として8-アイソ-プロスタグランジンF2a-ｄ4を50ｎｇ添加した。メタノールを1ｍｌ添加した後、窒素気流下でソディウムボロハイドライドを0.01ｇ添加し1分間激しく攪拌した後、4分間室温下で放置した。続いて窒素下で1ｍｏｌ／ｌに調整した水酸化カリウムのメタノール溶液を1ｍｌ添加し密栓した後、40℃で30分間攪拌した。続いて4℃にて3000Ｇで10分間遠心し、上澄み液を採取した後塩酸水溶液によってｐＨを3に調整した。さらに4℃にて3000Ｇで10分間遠心し、上澄み液をメタノールおよびｐＨ3の水（各2ｍｌ）によって前調整したＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃ18（Ｗａｔｅｒｓ社製、体積1ｍｌ）へ充填し、各々10ｍｌのｐＨ3水およびアセトニトリル／水（１５／８５、体積）混合液によって洗浄した。続いて4ｍｌのヘキサン／酢酸エチル／イソプロピルアルコール（３０／６５／５、体積）混合液で目的成分を溶出した。溶出した液を5ｍｌのヘキサンによって前調整したＳｅｐ−Ｐａｋ ＮＨ２（Ｗａｔｅｒｓ社製、体積1ｍｌ）へ充填し、各々5ｍｌのヘキサン／酢酸エチル（３／７、体積）およびアセトニトリルによって洗浄した。続いて5ｍｌの酢酸エチル／メタノール／酢酸（１０／８５／５、体積）混合液で目的成分を溶出した。溶出した液を窒素気流下で溶媒留去を行った。蒸発乾固した成分にＮ、Ｏ-ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（和光純薬社製）を30μｌ加え、60℃にて1時間反応した。得られたＴＭＳ化サンプルの3μｌをマス検出装置（アジェレント社製5973）を備えたガスクロマトグラフィー（アジェレント社製6890Ｎ）によって分析し、血漿中の濃度として、トータルヒドロキシオクタデカジエノイック酸が78、209、88、226ｎＭ、8-アイソ-プロスタグランジンF2aが55、36、27、40ｎＭ存在していることがわかった。一方、AIPHを投与していないラットの血漿を測定したところ、トータルヒドロキシオクタデカジエノイック酸が23ｎM、8-アイソ-プロスタグランジンF2aが17ｎMであることがわかり、これらの化合物がラジカルによる酸化傷害マーカーとして有用であることがわかった。
実施例２
8週齢Wistar系雄性ラット3匹へ2,2’-アゾビス[2-（2-イミダゾリン-2-イル）プロパン]ジヒドロクロライド（AIPH）を含有する水を飲料水として1ヶ月間与え続けた。このとき、AIPHの濃度は50 mmol/lとした。一ヵ月後採血し、即座に遠心機にて血漿を採取した（3500ｒｐｍ×10分）。血漿0.2 ｍｌを正確に測りとり、クロロホルム／メタノール（２／１、体積比）を0.4 ｍｌさらに酢酸エチルを0.1 ml添加し、1分間激しく攪拌した。4℃にて3000Ｇで10分間遠心し、下層であるクロロホルムおよび酢酸エチル層から0.3 ml採取し、窒素気流下で溶媒留去を行った。メタノール0.3 mlを添加した後、窒素気流下でソディウムボロハイドライドを0.01ｇ添加し1分間激しく攪拌した後、4分間室温下で放置した。続いて窒素下で1ｍｏｌ／ｌに調整した水酸化カリウムのメタノール溶液を2ｍｌおよびジエチルエーテルを2ｍｌ添加し密栓した後、40℃で30分間攪拌した。20体積％酢酸水溶液2ｍｌを添加して、加水分解反応を停止した後、ヘキサン3ｍｌを添加した。1分間激しく攪拌した後、4℃にて3000Ｇで10分間遠心し、上層であるヘキサンおよびジエチルエーテル層から3.0 ml採取し、窒素気流下で溶媒留去を行った。蒸発乾固した成分にＮ、Ｏ-ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（和光純薬社製）を30μｌ加え、60℃にて1時間反応した。得られたＴＭＳ化サンプルの3μｌをマス検出装置（アジェレント社製5973）を備えたガスクロマトグラフィー（アジェレント社製6890Ｎ）によって分析し、トータル7-ヒドロキシコレステロール（M/Z=456でのイオン強度）のコレステロール（M/Z=458でのイオン強度）に対する相対イオン強度比を求めたところ、3匹それぞれの値は1.18、3.23、2.29（×10-3）となった。一方、AIPHの含有しない水を与えたラット6匹についても同様の実験を行い、相対イオン強度比を求めたところ、0.572、0.623、0.689、0.387、0.901、0.81（×10-3）となって、トータル7-ヒドロキシコレステロールの測定がラジカルによる酸化傷害マーカーとして有用であることがわかった。
実施例３
8週齢Wistar系雄性マウス4匹へ、0.002%ビタミンＥを含む或いは含まない食餌（船橋農場から得た）を与えて飼育した。３．５ヶ月後に28週齢となったマウスの肝臓摘出と血液の採取を行い、以下の条件に従い、肝臓及び血漿中のＨＯＤＥとｉｓｏＰｓを定量した。結果を図１に示す。血液は実施例1と同様に血漿300μｌを用いて分析を行った。肝臓については以下のとおりである。肝臓1重量部に対して生理食塩水3重量部を添加し、ホモジナイザーによって均一化処理を行った。得られたホモジナイズ溶液300μｌに対して、1700μｌの生理食塩水、内部標準物質として8−iso−プロスタグランジンF2a-ｄ4およびＨＯＤＥ-ｄ4をそれぞれ100ｎｇ添加した。メタノールを1ｍｌ添加した後、窒素気流下でソディウムボロハイドライドを0.01ｇ添加し1分間激しく攪拌した後、4分間室温下で放置した。続いて窒素下で1ｍｏｌ／ｌに調整した水酸化カリウムのメタノール溶液を1ｍｌ添加し密栓した後、40℃で30分間攪拌した。続いて4℃にて3000Ｇで10分間遠心し、上澄み液を採取した後塩酸水溶液によってｐＨを3に調整した。さらに4℃にて3000Ｇで10分間遠心し、上澄み液をメタノールおよびｐＨ3の水（各2ｍｌ）によって前調整したＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃ18（Ｗａｔｅｒｓ社製、体積1ｍｌ）へ充填し、各々10ｍｌのｐＨ3水およびアセトニトリル／水（１５／８５、体積）混合液によって洗浄した。続いて4ｍｌのヘキサン／酢酸エチル／イソプロピルアルコール（３０／６５／５、体積）混合液で目的成分を溶出した。溶出した液を5ｍｌのヘキサンによって前調整したＳｅｐ−Ｐａｋ ＮＨ２（Ｗａｔｅｒｓ社製、体積1ｍｌ）へ充填し、各々5ｍｌのヘキサン／酢酸エチル（３／７、体積）およびアセトニトリルによって洗浄した。続いて5ｍｌの酢酸エチル／メタノール／酢酸（１０／８５／５、体積）混合液で目的成分を溶出した。溶出した液を窒素気流下で溶媒留去を行った。蒸発乾固した成分にＮ、Ｏ-ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（和光純薬社製）を30μｌ加え、60℃にて1時間反応した。得られたＴＭＳ化サンプルの3μｌをマス検出装置（アジェレント社製5973）を備えたガスクロマトグラフィー（アジェレント社製6890Ｎ）によって分析した。
【００７３】
実施例４
健常人4名にantioxidant biofactor(AOB；エイオーエイジャパン株式会社製、発酵性穀物、柑橘類、お茶などの混合物を低温焙煎して得られる化合物)３g／１袋を４袋／１日服用し、２週間後に採血して、赤血球中のＨＯＤＥとｉｓｏＰｓを測定した。結果を図２に示す。血球と血漿を実施例1と同様に分離し、血球は4倍体積量の生理食塩水によって2回洗浄を行い、血漿を洗い流した。その溶液のヘマトクリット値を測定した後、血球1ｍｌを正確に測りとり、メタノール4ｍｌを添加して激しく2分間撹拌し、完全に溶血させた。遠心分離（15000rpm10分間）によって蛋白とメタノール溶液を分離し、メタノール溶液2mlを正確に測り取り、内部標準物質として8-アイソ-プロスタグランジンF2a-ｄ4およびHＯＤＥ-ｄ4をそれぞれ100ｎｇ添加した。窒素気流下でソディウムボロハイドライドを0.01ｇ添加し1分間激しく攪拌した後、4分間室温下で放置した。続いて窒素下で1ｍｏｌ／ｌに調整した水酸化カリウムのメタノール溶液を1ｍｌ添加し密栓した後、40℃で30分間攪拌した。続いて4℃にて3000Ｇで10分間遠心し、上澄み液を採取した後塩酸水溶液によってｐＨを3に調整した。さらに4℃にて3000Ｇで10分間遠心し、上澄み液をメタノールおよびｐＨ3の水（各2ｍｌ）によって前調整したＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃ18（Ｗａｔｅｒｓ社製、体積1ｍｌ）へ充填し、各々10ｍｌのｐＨ3水およびアセトニトリル／水（１５／８５、体積）混合液によって洗浄した。続いて4ｍｌのヘキサン／酢酸エチル／イソプロピルアルコール（３０／６５／５、体積）混合液で目的成分を溶出した。溶出した液を5ｍｌのヘキサンによって前調整したＳｅｐ−Ｐａｋ ＮＨ２（Ｗａｔｅｒｓ社製、体積1ｍｌ）へ充填し、各々5ｍｌのヘキサン／酢酸エチル（３／７、体積）およびアセトニトリルによって洗浄した。続いて5ｍｌの酢酸エチル／メタノール／酢酸（１０／８５／５、体積）混合液で目的成分を溶出した。溶出した液を窒素気流下で溶媒留去を行った。蒸発乾固した成分にＮ、Ｏ-ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（和光純薬社製）を30μｌ加え、60℃にて1時間反応した。得られたＴＭＳ化サンプルの3μｌをマス検出装置（アジェレント社製5973）を備えたガスクロマトグラフィー（アジェレント社製6890Ｎ）によって分析した。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明のマーカーは、哺乳動物（特にヒト）における酸化ストレスを評価し、酸化ストレスに起因する疾患の診断、将来これらの疾患に罹患する可能性、疾患の将来の経過（予後）の予測などに有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸化ストレスマーカー及びその定量法並びに酸化ストレスの評価方法に関する。酸化ストレスマーカーの定量は、酸化ストレスに起因する疾患の診断に有用である。
【背景技術】
【０００２】
酸化ストレスは、種々の疾患と関与することが知られており、酸化ストレスマーカーとして、アクロレイン、4-ヒドロキシノネナール、マロンジアルデヒド、クロトンアルデヒド、8-OHｄG（8-ヒドロキシデオキシグアノシン）、メチルグリオキザール、８−アイソ−プロスタグランジンF2α、血漿過酸化脂質(TBARS) 、CoQ10、酸化型α1-antitrypsin、酸化シスチン、尿中Biopyrrinsなどの非常に多くのマーカーが知られている。
これらのマーカーは、活性酸素（スーパーオキシドラジカル、過酸化水素、ヒドロキシラジカルなど）との反応により産生されると考えられるが、酸化ストレスとどの程度関連しているかは不明である。
活性酸素との酸化生成物である酸化ストレスマーカーは、一次酸化生成物としてヒドロペルオキシドなどが挙げられる。しかしながら、ヒドロペルオキシドは測定の途中でも分解或いは更なる反応により他の物質に変化していくため、どの物質を定量すれば酸化ストレスを正確に評価できるのか明らかではない。
【０００３】
リノール酸の過酸化生成物であるＨＯＤＥ（ヒドロキシオクタデカジエノイックアシッド）は、糖尿病、動脈硬化との関連が指摘されている（非特許文献１、２）。
【０００４】
従来、酸化ストレスマーカーの定量は、抗体を用いる方法や、サンプルを抽出等して質量分析やＨＰＬＣ，ＧＣなどの機器分析により定量していたが、活性酸素等との反応により生成する分解物の種類は数多く、酸化ストレスの正確な評価はできなかった。
【非特許文献１】Inoue et al., Biochim. Biophys. Acta 1438, 204-212, 1999
【非特許文献２】Jira et al., Chem. Phys. Lipids 291, 95-100, 1996
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、酸化ストレスに伴う分解物を正確に測定し、酸化ストレスの程度を正しく評価するための方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、以下の発明を提供するものである。
【０００７】
１． ヒドロキシオクタデカジエノイックアシッド（HODE）類及び７−ヒドロキシコレステロール(7-FCOH)類からなる群から選ばれる少なくとも１種からなる哺乳動物の酸化ストレスを評価するためのマーカー。
【０００８】
２． 前記HODE類が、9-HODE, 10-HODE, 12-HODEおよび13-HODEからなる群から選ばれる少なくとも１種である項１に記載のマーカー。
【０００９】
３． 前記HODE類が、9-HODEおよび13-HODEからなる群から選ばれる少なくとも１種である項２に記載のマーカー。
【００１０】
４． 前記HODE類が、9-(E, E)HODEおよび13-(E, E)HODEからなる群から選ばれる(E, E)体と、9-(E, Z)HODEおよび13-(Z, E)HODEからなる群から選ばれる(E, Z)-(Z, E)体との組み合わせであり、(E, E)体と(E, Z)-(Z, E)体と比に基づき酸化ストレスを評価する項１に記載のマーカー。
【００１１】
５． 前記(7-FCOH)類が、７α−ヒドロキシコレステロール(7α-FCOH)および７β−ヒドロキシコレステロール(7β-FCOH)からなる群から選ばれる少なくとも１種である項１に記載のマーカー。
【００１２】
６． 前記(7-FCOH)類が、７β−ヒドロキシコレステロール(7β-FCOH)である項１に記載のマーカー。
【００１３】
７． 酸化ストレスに起因する疾患の診断のためのマーカーである項１に記載のマーカー。
【００１４】
８． 哺乳動物由来のサンプル中のHODE類および７−ＦＣＯＨ類からなる群から選ばれる少なくとも１種を、必要に応じてさらにイソプロスタン類とともに定量することを特徴とする哺乳動物の酸化ストレスの評価方法。
【００１５】
９． 哺乳動物由来のサンプル中のHODE類および７−ＦＣＯＨ類からなる群から選ばれる少なくとも１種を、必要に応じてさらにイソプロスタン類とともに定量することを特徴とする哺乳動物の酸化ストレスに起因する疾患の診断方法。
【００１６】
１０． 哺乳動物由来のサンプルを還元剤で処理後、アルカリ処理してHODE類および７−ＦＣＯＨ類からなる群から選ばれる少なくとも１種を、必要に応じてさらにイソプロスタン類とともに定量することを特徴とする哺乳動物の酸化ストレスマーカーの定量方法。
【００１７】
１１． 還元剤がNaBH4である項６に記載の方法。
【００１８】
１２． アルカリ処理をアルカリ金属水酸化物を用いて行う項１０に記載の方法。
【００１９】
１３． 還元剤とアルカリ処理剤を含むHODE類、7-FCOH類及びイソプロスタン類からなる群から選ばれる少なくとも１種の酸化ストレスマーカーを測定するためのキット。
【００２０】
１４． 還元剤の反応溶剤として、アルコール系溶剤をさらに含む項１３に記載のキット。
【００２１】
１５． アルコール系溶剤が、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノールからなる群から選ばれるいずれかである項１３に記載のキット。
【００２２】
１６． 還元剤がNaBH4である項１３に記載のキット。
【００２３】
１７． アルカリ処理剤がアルカリ金属水酸化物である項１３に記載のキット。
【００２４】
１８． 酸化ストレスに起因する疾患を診断するための項１３に記載のキット。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、酸化ストレスの適切なマーカーを提供することができ、酸化ストレスに関連する疾患、例えば糖尿病、動脈硬化、パーキンソン病、アルツハイマー病などの神経変性疾患、虚血再灌流障害（例えば心筋梗塞、狭心症、脳卒中など）、眼の光刺激による酸化ストレス障害を含む眼科疾患（例えば、白内障、結膜炎など）、呼吸器疾患（特に慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））、肝疾患（慢性肝炎、急性肝炎、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎などのウイルス性肝炎、肝硬変）、歯科疾患（歯周病、歯肉炎）、不妊症（特に酸化ストレスによる精子或いは卵子の機能不全）などの疾患を、本発明のマーカーにより診断し得る。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】マウスでのビタミンＥ投与群と非投与群でのＨＯＤＥとｉｓｏＰｓの血漿及び肝臓での測定値を示す。
【図２】機能性食品を一定期間摂取前後の赤血球中のＨＯＤＥとｉｓｏＰｓの変化を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明の酸化ストレスマーカーは、哺乳動物の酸化ストレスを測定、評価もしくは診断するためのマーカーとして有用である。酸化ストレスは、哺乳動物由来のサンプル中のマーカーを定量することにより測定、評価もしくは診断することができる。
【００２８】
本発明において、サンプルは、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、サル、イヌ、ラット、マウスなどの哺乳動物由来のものであり、好ましくはヒト由来である。
サンプルとしては、血液（血漿、血清、血球（赤血球、白血球）を含む）、尿、脳脊髄液、涙液、精液、唾液、リンパ液、組織の一部（生検等により得られる）などが挙げられ、好ましくは血液（血漿、血清、血球を含む）、尿が例示される。具体的には、以下のような表１に示される酸化ストレスを測定するのに有用である。
【００２９】
【表１】
【００３０】
ＨＯＤＥとしては、水酸基を有するオクタデカジエノイックアシッド（octadecadienoic acid）が挙げられ、該ＨＯＤＥの２つの二重結合は、(E, E)、(E, Z)もしくは(Z, E)のいずれか或いはこれらの混合物であってもよい。HODEとしては、具体的には
9-hydroxyoctadecadienoic acid (9-HODE), 13-hydroxyoctadecadienoic acid (13-HODE), 10-hydroxyoctadecadienoic acid (10-HODE), 12-hydroxyoctadecadienoic acid (12-HODE)が挙げられ、これらは(E, E)体、(E, Z)体、(Z, E)体のいずれであってもよい。マーカーとして好ましいHODEは、以下のものである：
9-(E, E)-HODE, 13-(E, E)-HODE, 9-(E, Z)-HODE, 13-(Z, E)-HODE, 10-(E,Z)-HODEおよび12-(Z, E)-HODE。
【００３１】
本発明において、HODE類及び7-FCOH類から選ばれる少なくとも１種のマーカーのみを用いて酸化ストレスを測定もしくは評価、或いは酸化ストレスに基づく疾患の診断をしてもよいが、HODE類及び7-FCOH類から選ばれる少なくとも１種のマーカーと組み合わせて公知のマーカーである8-iso-PGF2αを使用し、これらのマーカーの測定結果を組み合わせて、酸化ストレスを測定もしくは評価、或いは酸化ストレスに基づく疾患を診断することもできる。
【００３２】
また、７−ヒドロキシコレステロール（7-FCOH）類としては、７α−ヒドロキシコレステロール（７α−ＦＣＯＨ）、７β−ヒドロキシコレステロール（７β−ＦＣＯＨ）が挙げられる。好ましい7-FCOH類は、7β-FCOHである。
【００３３】
さらにイソプロスタン類としては、３個の水酸基、２個の二重結合、COOH基、シクロペンタン環を分子内に有し、アラキドン酸から誘導されるプロスタグランジンであり、８−アイソ−プロスタグランジンF2α(8-iso-PGF2α)、iPF2α-VI、iPF2α-V、iPF2α-IVなどが挙げられる。
【００３４】
本発明の１つの実施形態において使用され得る好ましいマーカーの構造式を以下に示す。
【００３５】
【化１】
【００３６】
酸化ストレスマーカーであるHODE類、7-FCOH類、イソプロスタン類（特に８−アイソ−プロスタグランジンF2α）などは、例えば以下のようにして定量することができる。
【００３７】
サンプルは、まず還元剤で処理されて、ヒドロペルオキシド、ペルオキシド等の活性酸素との反応生成物をその還元体に導き、それ以上の分解を抑制するのが好ましい。例えば、HODE（ヒドロキシオクタデカジエノイック酸）の原料であるリノール酸などは、活性酸素と反応して下式のようにヒドロペルオキシドになる。
【００３８】
これを還元体に導くと、9-HODEまたは13-HODEなどに変換される。なお、HODEは、哺乳動物生体内の活性酸素と反応し、さらに還元されて9-HODE、13-HODEなどに導かれるが、一重項酸素と反応すると10-HODEまたは12-HODEに変換され得る。従って、皮膚や眼、鼻、耳、口腔内などの光（太陽光、蛍光灯、紫外線など）と接触し得る粘膜、或いはX線やγ線などを受けた場合には、10-HODE、12-HODEについても測定する価値がある。
【００３９】
生体サンプルを還元して過酸化物を安定なＨＯＤＥ類、7-FCOH類、イソプロスタン類に導くための還元剤としては、ヒドロペルオキシドを還元できるが、炭素−炭素二重結合、カルボキシル（ＣＯＯＨ）基、エステル基などは還元しない還元剤が使用され、例えば水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）、ソディウムシアノボロヒドリド（NaCNBH3）などが挙げられる。
【００４０】
還元反応は、還元剤を１当量から過剰量用い、メタノール、エタノールなどのアルコール又は含水アルコール中で、０℃〜５０℃程度の温度下に１分から５時間程度反応させることにより有利に進行する。
【００４１】
リノール酸（２つの二重結合がZ, Z(シス型)）が酸化されると、ZEないしEZ、或いはEEに異性化する。このときの(Z, E)体と(E, Z)体の合計量と、(E, E)体の比（R）は
R＝｛(Z, E)体と(E, Z)体の合計量｝／(E, E)体の量
により計算でき、これを酸化ストレスの状態が低い健常者と比較することで、酸化ストレスの状態を推定することができる。
【００４２】
例えば、健常者の上記比（R）に対し、５％以上、あるいは１０％以上、さらに１５％以上、特に２０％以上、より特別には３０％以上低下している場合には、酸化ストレスを受けていると判断され、低下率が大きいほど酸化ストレスは強いと判断される。
【００４３】
7-FCOH類、イソプロスタン類についてもHODE類と同様にヒドロペルオキシド（OOH）或いはペルオキシド（OO）を経由しているので、還元処理により、さらなる分解が抑制されて、酸化ストレスをより正確に測定することができるようになる。
【００４４】
HODE類、7-FCOH類は、血液、尿、唾液、脳脊髄液、リンパ液、精液などの体液中でより多く発現されるので、これらに関する酸化ストレスを測定、評価ないし酸化ストレスに起因する疾患を診断するのに有用である。
【００４５】
また、8-iso-PGF2αなどのイソプロスタン類は、組織サンプル中でより強く発現される可能性があり、特定の組織、器官、臓器などにおける酸化ストレスを測定、評価ないし酸化ストレスに起因する疾患を診断するのに有用である。
【００４６】
従って、これら２種類のマーカーを組み合わせることで、酸化ストレスをより精密に測定、評価ないし酸化ストレスに起因する疾患を診断し得る。
【００４７】
上記の還元処理により生成する9-HODE、10-HODE、12-HODE、13-HODE、7α-FCOH、7β-FCOH、8-iso-PGF2αなどのHODE類、7-FCOH類、イソプロスタン類(isoPs)は比較的安定な化合物であり、それ以上の分解は抑制される。
【００４８】
上記のように還元処理により得られる、9-HODE、10-HODE、12-HODE、13-HODE、7α-FCOH、7β-FCOH、8-iso-PGF2αなどのHODE類、7-FCOH類、イソプロスタン類(isoPs)はフリー形態とエステル形態の両方で存在している。これらは安定な化合物であり、それ以上の分解は抑制される。
【００４９】
上記で得られた還元体は、HODE類の脂肪酸型のものも存在するが、多くはホスファチジルコリンなどのリン脂質、コレステロールエステル、トリグリセライド、ジグリセライドなどのグリセリンエステルとして存在する。従って、このエステルを加水分解して高級脂肪酸に導くために、アルカリ処理剤、好ましくは水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウムなどのアルカリ金属水酸化物と反応させてHODEを脂肪酸に導く。
【００５０】
アルカリ処理により３位の水酸基がエステル化されていた７−ヒドロキシコレステロールエステルが対応する７−ヒドロキシコレステロールに変換される。
【００５１】
同様に８−アイソ−プロスタグランジンF2α等のイソプロスタン類のエステルもアルカリ処理により加水分解される。
【００５２】
アルカリ加水分解は塩基の存在下に、室温から溶媒の沸騰する程度の温度下に１０分間から２４時間程度行うことにより有利に進行する。塩基としては、溶液をアルカリ性にしてエステルを加水分解できるものであれば特に限定されないが、例えばアルカリ金属水酸化物（NaOH, KOH, LiOHなど）、アルカリ土類金属水酸化物（Ca(OH)2, Mg(OH)2, Ba(OH)2）など）、アルカリ金属炭酸水素塩（NaHCO3, KHCO3, LiHCO3）, アルカリ金属炭酸塩（Na2CO3, K2CO3, Li2CO3）,などが挙げられる。好ましいアルカリはNaOH, KOH, LiOHなどのアルカリ金属水酸化物である。
【００５３】
加水分解は、水中で行ってもよく、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、エタノール、メタノール、イソプロパノール、ブタノール、アセトン、ＤＭＦ，ＤＭＳＯ，Ｎ−メチルピロリドン、などの溶媒を水と混合して行うこともできる。
【００５４】
このような加水分解によって、遊離形態と共にエステル形態の酸化物（HODE類、7-FCOH類、イソプロスタン類）を測定することができ、酸化ストレスを精密に測定ないし評価することができる。
【００５５】
「酸化ストレス」とは、過酸化水素、スーパーオキサイド、ヒドロキシラジカル、一重項酸素などの生体内で発生し得る活性酸素によるストレスを意味し、本発明ではリノール酸、コレステロール、アラキドン酸が活性酸素により酸化されて発生したＨＯＤＥ類、7-FCOH類、イソプロスタン類）を測定することにより、酸化ストレスの程度を評価することができる。
【００５６】
酸化ストレスは、血液サンプル中の血清または血漿などを測定することもできるが、例えば赤血球ないし白血球と血漿ないし血清の測定値を総合的に評価して、酸化ストレスをより精密に評価することもできる。また、唾液、涙液、精液などの局所サンプルと血液などの全身性サンプルの測定値を組み合わせることもできる。唾液、涙液、精液などの局所サンプルのマーカーを測定することにより、例えば、眼、口腔内、精子などに対する酸化ストレスの程度を調べることができ、眼科疾患（白内障、緑内障、ドライアイ、結膜炎、角膜炎など）、歯科疾患（歯周病、歯肉炎、歯槽膿漏など）、不妊症（特に精子に起因する不妊症）の診断に利用し得る。
【００５７】
酸化ストレスに起因する疾患としては、糖尿病、動脈硬化、パーキンソン病、アルツハイマー病などの神経変性疾患、虚血再灌流障害（例えば心筋梗塞、狭心症、脳卒中など）、眼の光刺激による酸化ストレス障害を含む眼科疾患（例えば、白内障、結膜炎など）、呼吸器疾患（特に慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））、肝疾患（慢性肝炎、急性肝炎、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎などのウイルス性肝炎、肝硬変）、歯科疾患（歯周病、歯肉炎）、不妊症（特に酸化ストレスによる精子或いは卵子の機能不全）などの疾患を例示でき、これらの疾患は本発明のマーカーにより診断し得る。
ＨＯＤＥが生体内で生成するメカニズムを以下に示す。
【００５８】
【化２】
【００５９】
（式中Ｒ１，Ｒ２は、一方が(ＣＨ２)４ＣＨ３を示し、他方が(ＣＨ２)７ＣＯＯＨを示す。ｈｐｏはヒドロペルオキシドを示す。）
酸化ストレスマーカーが７−ヒドロキシコレステロールである場合、還元剤処理によりコレステロールおよびコレステロールエステルの過酸化物ないしカルボニル化合物は、下式のように７α−ヒドロキシコレステロール又は７β−ヒドロキシコレステロールに導かれる。
7-FCOH類の生成メカニズム
【００６０】
【化３】
【００６１】
なお、アラキドン酸から８−アイソ−プロスタグランジンF2α（8-iso-PGF２α）などのイソプロスタン類に至るまでの反応中間体の一部は、上記還元処理により8-iso-PGF２αに導かれるが、その量はわずかである。以下に、アラキドン酸からイソプロスタン類が生成する推定機構を示す。
【００６２】
【化４】
【００６３】
アルカリ処理後のサンプルは、HPLC等の通常の分離手段により分離し、GC/MSのような通常の分析手段を用いて、HODE類、７−ヒドロキシコレステロール類、８−アイソ−プロスタグランジンF2αなどイソプロスタン類の酸化ストレスマーカーを定量し、酸化ストレスの程度を評価することができる。
【００６４】
以下の実施例に示されるように、HODE類、７−ヒドロキシコレステロール類、８−アイソ−プロスタグランジンF2αなどの酸化ストレスマーカーは、ＡＩＰＨなどのラジカル発生剤の投与によりその量が大幅に増大することが確認されており、さらに、抗酸化作用を有するビタミンＥや、食品中に含まれる天然抗酸化物質（例えばアントシアニン、ポリフェノール、カテキン、コエンザイムＱ１０など）の投与によりこのようなストレスマーカーの測定値は低下する。
【００６５】
従って、本発明のマーカーは、哺乳動物（特にヒト）における酸化ストレスを評価し、酸化ストレスに起因する疾患の診断、将来これらの疾患に罹患する可能性、疾患の将来の経過（予後）の予測などに有用である。
【００６６】
酸化ストレスマーカーとして、ＨＯＤＥと７−ヒドロキシコレステロールは同様な方向に変動するが、８−アイソ−プロスタグランジンF2αはこれらとは変動の仕方が異なっており、ＨＯＤＥと７−ヒドロキシコレステロールがより重要な酸化ストレスの指標であり、これらを組み合わせることにより、より正確な酸化ストレスの評価を行うことができると期待される。
【００６７】
本発明は、さらに、HODE類、７−ヒドロキシコレステロール類及びイソプロスタン類からなる酸化ストレスマーカーを測定するためのキットに関する。
【００６８】
該キットは、哺乳動物（特に好ましくはヒト）由来のサンプルを還元し、ヒドロペルオキシド等の過酸化物をアルコールに導くための還元剤、および、エステル型のヒドロペルオキシドを遊離のカルボン酸に鹸化するためのアルカリ処理剤を含む。
【００６９】
キットに含まれる還元剤は、サンプルの過酸化物を還元するための過剰量含まれるのが好ましく、例えば１サンプルあたり０．１〜１００mg程度（或いは3マイクロモル〜3ミリモル）使用される。好ましい還元剤は、NaBH4である。
【００７０】
また、アルカリ処理剤はエステルを加水分解できる量であれば特に限定されないが、例えば１〜１０００mg程度（或いは0.2〜20ミリモル）使用される。
【００７１】
本発明のキットは、さらに還元剤をサンプルに加えた還元反応に使用される溶剤を含むことができる。好ましい溶剤としては、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノールなどのアルコール系溶剤が例示される。
【実施例】
【００７２】
以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明する。
実施例１
8週齢Wistar系雄性ラット4匹へ2,2’-アゾビス[2-（2-イミダゾリン-2-イル）プロパン]ジヒドロクロライド（AIPH）を含有する生理食塩水を腹腔内へAIPHとして60 ｍｇ／ｋｇ-体重となるように注入した。1.5時間後採血し、即座に遠心機にて血漿を採取した（3500ｒｐｍ×10分）。血漿2ｍｌを正確に測りとり、内部標準物質として8-アイソ-プロスタグランジンF2a-ｄ4を50ｎｇ添加した。メタノールを1ｍｌ添加した後、窒素気流下でソディウムボロハイドライドを0.01ｇ添加し1分間激しく攪拌した後、4分間室温下で放置した。続いて窒素下で1ｍｏｌ／ｌに調整した水酸化カリウムのメタノール溶液を1ｍｌ添加し密栓した後、40℃で30分間攪拌した。続いて4℃にて3000Ｇで10分間遠心し、上澄み液を採取した後塩酸水溶液によってｐＨを3に調整した。さらに4℃にて3000Ｇで10分間遠心し、上澄み液をメタノールおよびｐＨ3の水（各2ｍｌ）によって前調整したＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃ18（Ｗａｔｅｒｓ社製、体積1ｍｌ）へ充填し、各々10ｍｌのｐＨ3水およびアセトニトリル／水（１５／８５、体積）混合液によって洗浄した。続いて4ｍｌのヘキサン／酢酸エチル／イソプロピルアルコール（３０／６５／５、体積）混合液で目的成分を溶出した。溶出した液を5ｍｌのヘキサンによって前調整したＳｅｐ−Ｐａｋ ＮＨ２（Ｗａｔｅｒｓ社製、体積1ｍｌ）へ充填し、各々5ｍｌのヘキサン／酢酸エチル（３／７、体積）およびアセトニトリルによって洗浄した。続いて5ｍｌの酢酸エチル／メタノール／酢酸（１０／８５／５、体積）混合液で目的成分を溶出した。溶出した液を窒素気流下で溶媒留去を行った。蒸発乾固した成分にＮ、Ｏ-ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（和光純薬社製）を30μｌ加え、60℃にて1時間反応した。得られたＴＭＳ化サンプルの3μｌをマス検出装置（アジェレント社製5973）を備えたガスクロマトグラフィー（アジェレント社製6890Ｎ）によって分析し、血漿中の濃度として、トータルヒドロキシオクタデカジエノイック酸が78、209、88、226ｎＭ、8-アイソ-プロスタグランジンF2aが55、36、27、40ｎＭ存在していることがわかった。一方、AIPHを投与していないラットの血漿を測定したところ、トータルヒドロキシオクタデカジエノイック酸が23ｎM、8-アイソ-プロスタグランジンF2aが17ｎMであることがわかり、これらの化合物がラジカルによる酸化傷害マーカーとして有用であることがわかった。
実施例２
8週齢Wistar系雄性ラット3匹へ2,2’-アゾビス[2-（2-イミダゾリン-2-イル）プロパン]ジヒドロクロライド（AIPH）を含有する水を飲料水として1ヶ月間与え続けた。このとき、AIPHの濃度は50 mmol/lとした。一ヵ月後採血し、即座に遠心機にて血漿を採取した（3500ｒｐｍ×10分）。血漿0.2 ｍｌを正確に測りとり、クロロホルム／メタノール（２／１、体積比）を0.4 ｍｌさらに酢酸エチルを0.1 ml添加し、1分間激しく攪拌した。4℃にて3000Ｇで10分間遠心し、下層であるクロロホルムおよび酢酸エチル層から0.3 ml採取し、窒素気流下で溶媒留去を行った。メタノール0.3 mlを添加した後、窒素気流下でソディウムボロハイドライドを0.01ｇ添加し1分間激しく攪拌した後、4分間室温下で放置した。続いて窒素下で1ｍｏｌ／ｌに調整した水酸化カリウムのメタノール溶液を2ｍｌおよびジエチルエーテルを2ｍｌ添加し密栓した後、40℃で30分間攪拌した。20体積％酢酸水溶液2ｍｌを添加して、加水分解反応を停止した後、ヘキサン3ｍｌを添加した。1分間激しく攪拌した後、4℃にて3000Ｇで10分間遠心し、上層であるヘキサンおよびジエチルエーテル層から3.0 ml採取し、窒素気流下で溶媒留去を行った。蒸発乾固した成分にＮ、Ｏ-ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（和光純薬社製）を30μｌ加え、60℃にて1時間反応した。得られたＴＭＳ化サンプルの3μｌをマス検出装置（アジェレント社製5973）を備えたガスクロマトグラフィー（アジェレント社製6890Ｎ）によって分析し、トータル7-ヒドロキシコレステロール（M/Z=456でのイオン強度）のコレステロール（M/Z=458でのイオン強度）に対する相対イオン強度比を求めたところ、3匹それぞれの値は1.18、3.23、2.29（×10-3）となった。一方、AIPHの含有しない水を与えたラット6匹についても同様の実験を行い、相対イオン強度比を求めたところ、0.572、0.623、0.689、0.387、0.901、0.81（×10-3）となって、トータル7-ヒドロキシコレステロールの測定がラジカルによる酸化傷害マーカーとして有用であることがわかった。
実施例３
8週齢Wistar系雄性マウス4匹へ、0.002%ビタミンＥを含む或いは含まない食餌（船橋農場から得た）を与えて飼育した。３．５ヶ月後に28週齢となったマウスの肝臓摘出と血液の採取を行い、以下の条件に従い、肝臓及び血漿中のＨＯＤＥとｉｓｏＰｓを定量した。結果を図１に示す。血液は実施例1と同様に血漿300μｌを用いて分析を行った。肝臓については以下のとおりである。肝臓1重量部に対して生理食塩水3重量部を添加し、ホモジナイザーによって均一化処理を行った。得られたホモジナイズ溶液300μｌに対して、1700μｌの生理食塩水、内部標準物質として8−iso−プロスタグランジンF2a-ｄ4およびＨＯＤＥ-ｄ4をそれぞれ100ｎｇ添加した。メタノールを1ｍｌ添加した後、窒素気流下でソディウムボロハイドライドを0.01ｇ添加し1分間激しく攪拌した後、4分間室温下で放置した。続いて窒素下で1ｍｏｌ／ｌに調整した水酸化カリウムのメタノール溶液を1ｍｌ添加し密栓した後、40℃で30分間攪拌した。続いて4℃にて3000Ｇで10分間遠心し、上澄み液を採取した後塩酸水溶液によってｐＨを3に調整した。さらに4℃にて3000Ｇで10分間遠心し、上澄み液をメタノールおよびｐＨ3の水（各2ｍｌ）によって前調整したＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃ18（Ｗａｔｅｒｓ社製、体積1ｍｌ）へ充填し、各々10ｍｌのｐＨ3水およびアセトニトリル／水（１５／８５、体積）混合液によって洗浄した。続いて4ｍｌのヘキサン／酢酸エチル／イソプロピルアルコール（３０／６５／５、体積）混合液で目的成分を溶出した。溶出した液を5ｍｌのヘキサンによって前調整したＳｅｐ−Ｐａｋ ＮＨ２（Ｗａｔｅｒｓ社製、体積1ｍｌ）へ充填し、各々5ｍｌのヘキサン／酢酸エチル（３／７、体積）およびアセトニトリルによって洗浄した。続いて5ｍｌの酢酸エチル／メタノール／酢酸（１０／８５／５、体積）混合液で目的成分を溶出した。溶出した液を窒素気流下で溶媒留去を行った。蒸発乾固した成分にＮ、Ｏ-ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（和光純薬社製）を30μｌ加え、60℃にて1時間反応した。得られたＴＭＳ化サンプルの3μｌをマス検出装置（アジェレント社製5973）を備えたガスクロマトグラフィー（アジェレント社製6890Ｎ）によって分析した。
【００７３】
実施例４
健常人4名にantioxidant biofactor(AOB；エイオーエイジャパン株式会社製、発酵性穀物、柑橘類、お茶などの混合物を低温焙煎して得られる化合物)３g／１袋を４袋／１日服用し、２週間後に採血して、赤血球中のＨＯＤＥとｉｓｏＰｓを測定した。結果を図２に示す。血球と血漿を実施例1と同様に分離し、血球は4倍体積量の生理食塩水によって2回洗浄を行い、血漿を洗い流した。その溶液のヘマトクリット値を測定した後、血球1ｍｌを正確に測りとり、メタノール4ｍｌを添加して激しく2分間撹拌し、完全に溶血させた。遠心分離（15000rpm10分間）によって蛋白とメタノール溶液を分離し、メタノール溶液2mlを正確に測り取り、内部標準物質として8-アイソ-プロスタグランジンF2a-ｄ4およびHＯＤＥ-ｄ4をそれぞれ100ｎｇ添加した。窒素気流下でソディウムボロハイドライドを0.01ｇ添加し1分間激しく攪拌した後、4分間室温下で放置した。続いて窒素下で1ｍｏｌ／ｌに調整した水酸化カリウムのメタノール溶液を1ｍｌ添加し密栓した後、40℃で30分間攪拌した。続いて4℃にて3000Ｇで10分間遠心し、上澄み液を採取した後塩酸水溶液によってｐＨを3に調整した。さらに4℃にて3000Ｇで10分間遠心し、上澄み液をメタノールおよびｐＨ3の水（各2ｍｌ）によって前調整したＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃ18（Ｗａｔｅｒｓ社製、体積1ｍｌ）へ充填し、各々10ｍｌのｐＨ3水およびアセトニトリル／水（１５／８５、体積）混合液によって洗浄した。続いて4ｍｌのヘキサン／酢酸エチル／イソプロピルアルコール（３０／６５／５、体積）混合液で目的成分を溶出した。溶出した液を5ｍｌのヘキサンによって前調整したＳｅｐ−Ｐａｋ ＮＨ２（Ｗａｔｅｒｓ社製、体積1ｍｌ）へ充填し、各々5ｍｌのヘキサン／酢酸エチル（３／７、体積）およびアセトニトリルによって洗浄した。続いて5ｍｌの酢酸エチル／メタノール／酢酸（１０／８５／５、体積）混合液で目的成分を溶出した。溶出した液を窒素気流下で溶媒留去を行った。蒸発乾固した成分にＮ、Ｏ-ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（和光純薬社製）を30μｌ加え、60℃にて1時間反応した。得られたＴＭＳ化サンプルの3μｌをマス検出装置（アジェレント社製5973）を備えたガスクロマトグラフィー（アジェレント社製6890Ｎ）によって分析した。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明のマーカーは、哺乳動物（特にヒト）における酸化ストレスを評価し、酸化ストレスに起因する疾患の診断、将来これらの疾患に罹患する可能性、疾患の将来の経過（予後）の予測などに有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒドロキシオクタデカジエノイックアシッド（HODE）類及び７−ヒドロキシコレステロール(7-FCOH)類からなる群から選ばれる少なくとも１種からなる哺乳動物の酸化ストレスを評価するためのマーカー。
【請求項２】
前記HODE類が、9-HODE, 10-HODE, 12-HODEおよび13-HODEからなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載のマーカー。
【請求項３】
前記HODE類が、9-HODEおよび13-HODEからなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項２に記載のマーカー。
【請求項４】
前記HODE類が、9-(E, E)HODEおよび13-(E, E)HODEからなる群から選ばれる(E, E)体と、9-(E, Z)HODEおよび13-(Z, E)HODEからなる群から選ばれる(E, Z)-(Z, E)体との組み合わせであり、(E, E)体と(E, Z)-(Z, E)体と比に基づき酸化ストレスを評価する請求項１に記載のマーカー。
【請求項５】
前記(7-FCOH)類が、７α−ヒドロキシコレステロール(7α-FCOH)および７β−ヒドロキシコレステロール(7β-FCOH)からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載のマーカー。
【請求項６】
前記(7-FCOH)類が、７β−ヒドロキシコレステロール(7β-FCOH)である請求項１に記載のマーカー。
【請求項７】
酸化ストレスに起因する疾患の診断のためのマーカーである請求項１に記載のマーカー。
【請求項８】
哺乳動物由来のサンプル中のHODE類および７−ＦＣＯＨ類からなる群から選ばれる少なくとも１種を、必要に応じてさらにイソプロスタン類とともに定量することを特徴とする哺乳動物の酸化ストレスの評価方法。
【請求項９】
哺乳動物由来のサンプル中のHODE類および７−ＦＣＯＨ類からなる群から選ばれる少なくとも１種を、必要に応じてさらにイソプロスタン類とともに定量することを特徴とする哺乳動物の酸化ストレスに起因する疾患の診断方法。
【請求項１０】
哺乳動物由来のサンプルを還元剤で処理後、アルカリ処理してHODE類および７−ＦＣＯＨ類からなる群から選ばれる少なくとも１種を、必要に応じてさらにイソプロスタン類とともに定量することを特徴とする哺乳動物の酸化ストレスマーカーの定量方法。
【請求項１１】
還元剤がNaBH4である請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
アルカリ処理をアルカリ金属水酸化物を用いて行う請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
還元剤とアルカリ処理剤を含むHODE類、７−ＦＣＯＨ類及びイソプロスタン類からなる群から選ばれる少なくとも１種の酸化ストレスマーカーを測定するためのキット。
【請求項１４】
還元剤の反応溶剤として、アルコール系溶剤をさらに含む請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
アルコール系溶剤が、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノールからなる群から選ばれるいずれかである請求項１３に記載のキット。
【請求項１６】
還元剤がNaBH4である請求項１３に記載のキット。
【請求項１７】
アルカリ処理剤がアルカリ金属水酸化物である請求項１３に記載のキット。
【請求項１８】
酸化ストレスに起因する疾患を診断するための請求項１３に記載のキット。
【請求項１】
ヒドロキシオクタデカジエノイックアシッド（HODE）類及び７−ヒドロキシコレステロール(7-FCOH)類からなる群から選ばれる少なくとも１種からなる哺乳動物の酸化ストレスを評価するためのマーカー。
【請求項２】
前記HODE類が、9-HODE, 10-HODE, 12-HODEおよび13-HODEからなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載のマーカー。
【請求項３】
前記HODE類が、9-HODEおよび13-HODEからなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項２に記載のマーカー。
【請求項４】
前記HODE類が、9-(E, E)HODEおよび13-(E, E)HODEからなる群から選ばれる(E, E)体と、9-(E, Z)HODEおよび13-(Z, E)HODEからなる群から選ばれる(E, Z)-(Z, E)体との組み合わせであり、(E, E)体と(E, Z)-(Z, E)体と比に基づき酸化ストレスを評価する請求項１に記載のマーカー。
【請求項５】
前記(7-FCOH)類が、７α−ヒドロキシコレステロール(7α-FCOH)および７β−ヒドロキシコレステロール(7β-FCOH)からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載のマーカー。
【請求項６】
前記(7-FCOH)類が、７β−ヒドロキシコレステロール(7β-FCOH)である請求項１に記載のマーカー。
【請求項７】
酸化ストレスに起因する疾患の診断のためのマーカーである請求項１に記載のマーカー。
【請求項８】
哺乳動物由来のサンプル中のHODE類および７−ＦＣＯＨ類からなる群から選ばれる少なくとも１種を、必要に応じてさらにイソプロスタン類とともに定量することを特徴とする哺乳動物の酸化ストレスの評価方法。
【請求項９】
哺乳動物由来のサンプル中のHODE類および７−ＦＣＯＨ類からなる群から選ばれる少なくとも１種を、必要に応じてさらにイソプロスタン類とともに定量することを特徴とする哺乳動物の酸化ストレスに起因する疾患の診断方法。
【請求項１０】
哺乳動物由来のサンプルを還元剤で処理後、アルカリ処理してHODE類および７−ＦＣＯＨ類からなる群から選ばれる少なくとも１種を、必要に応じてさらにイソプロスタン類とともに定量することを特徴とする哺乳動物の酸化ストレスマーカーの定量方法。
【請求項１１】
還元剤がNaBH4である請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
アルカリ処理をアルカリ金属水酸化物を用いて行う請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
還元剤とアルカリ処理剤を含むHODE類、７−ＦＣＯＨ類及びイソプロスタン類からなる群から選ばれる少なくとも１種の酸化ストレスマーカーを測定するためのキット。
【請求項１４】
還元剤の反応溶剤として、アルコール系溶剤をさらに含む請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
アルコール系溶剤が、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノールからなる群から選ばれるいずれかである請求項１３に記載のキット。
【請求項１６】
還元剤がNaBH4である請求項１３に記載のキット。
【請求項１７】
アルカリ処理剤がアルカリ金属水酸化物である請求項１３に記載のキット。
【請求項１８】
酸化ストレスに起因する疾患を診断するための請求項１３に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図２】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５９５６６
【国際公開日】平成１７年６月３０日（２００５．６．３０）
【発行日】平成１９年７月１２日（２００７．７．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１６３１２（Ｐ２００５−５１６３１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１８６４５
【国際出願日】平成１６年１２月１４日（２００４．１２．１４）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年６月３０日（２００５．６．３０）
【発行日】平成１９年７月１２日（２００７．７．１２）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１８６４５
【国際出願日】平成１６年１２月１４日（２００４．１２．１４）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
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