酸素運搬成分を使用して血流力学的安定性を増強する方法
【課題】酸素運搬成分を使用して血流力学的安定性を増強する方法を提供すること。
【解決手段】本発明は、外科手術を受ける正常血液量の被験体の血流力学的安定性を増強するための処置における、組成物の使用に関する。１つの実施形態において、本発明は、外科手術を受ける正常血液量の被験体の血流力学的安定性を増強するための方法であって、ａ）上記外科手術に伴って、全血より高い酸素親和性を有するヘモグロビンベースの酸素キャリア（ＨＢＯＣ）を含む組成物を上記被験体に投与する工程；およびｂ）上記患者の血流力学的安定性をモニタリングする工程を包含する方法に関する。このような投与は、外科手術の前、外科手術の間、または外科手術の後に生じても、それらの任意の組み合わせで生じてもよい。
【解決手段】本発明は、外科手術を受ける正常血液量の被験体の血流力学的安定性を増強するための処置における、組成物の使用に関する。１つの実施形態において、本発明は、外科手術を受ける正常血液量の被験体の血流力学的安定性を増強するための方法であって、ａ）上記外科手術に伴って、全血より高い酸素親和性を有するヘモグロビンベースの酸素キャリア（ＨＢＯＣ）を含む組成物を上記被験体に投与する工程；およびｂ）上記患者の血流力学的安定性をモニタリングする工程を包含する方法に関する。このような投与は、外科手術の前、外科手術の間、または外科手術の後に生じても、それらの任意の組み合わせで生じてもよい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、ヘモグロビンベースの酸素キャリアを含有する組成物を投与することによって、外科手術を受ける個体の血流力学的安定性を増強するための方法に関する。１つの実施形態において、本発明は、外科手術の間の血流力学的安定性に関連した合併症を回避するための予防措置として酸素の解放を増強するための、減少した協同性および高い酸素親和性を有するポリアルキレンオキシド改変されたヘモグロビンの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
血液は、組織に栄養分を送達し、組織からの廃棄物を除去するための手段である。血液は、赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）（ＲＢＣまたは赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ））、白血球（ＷＢＣ）、および血小板が懸濁している血漿からなる。赤血球は、血液中で細胞の約９９％を構成し、それらの主な機能は、酸素を組織に輸送し、組織からの二酸化炭素を除去することである。
【０００３】
左心室は、動脈および循環系のより小さい動脈を通して血液をポンピングする。次いで、血液は、毛細管に入り、ここで、酸素の送達、栄養分の交換および細胞の廃棄物の抽出の大半が起きる（例えば、非特許文献１を参照のこと）。その後、血液は、右心房に血液を戻すのに、細静脈および静脈を通って移動する。心臓に戻る血液は、心臓からポンピングされる血液と比較して、酸素量が乏しいが、安静状態である場合、戻ってくる血液はなお、本来の酸素含量の約７５％を含んでいる。
【０００４】
ＲＢＣの可逆性酸素付加機能（すなわち、酸素の送達）は、タンパク質ヘモグロビンによって行われる。哺乳動物において、ヘモグロビンは、約６４，０００ダルトンの分子量（ＭＷ）を有し、約６％のヘムと９４％グロビンとから構成される。そのネイティブの形態において、ヘモグロビンは、２対のサブユニット（すなわち、四量体）を含み、各々が、ヘム基およびグロビンポリペプチド鎖を含む。水溶液中で、ヘモグロビンは、四量体形態（ＭＷ ６４，０００ダルトン）と二量体形態（ＭＷ ３２，０００ダルトン）との間で平衡状態で存在しており；ＲＢＣを除いて、その二量体は、腎臓によって早期（約２〜４時間の血漿半減期）に排出される。ヘモグロビンとともに、ＲＢＣは、支質（ＲＢＣ膜）を含み、この支質は、タンパク質、コレステロール、およびリン脂質を含む。
【０００５】
病院および他の設備における血液製剤の需要に起因して、代用血液の開発における広範な研究が指向されている。「代用血液」は、酸素を組織に運搬および供給し得る血液製剤である。ヘモグロビンベースの酸素キャリア（ＨＢＯＣ）は、ヘモグロビンを含む代用血液である。ＨＢＯＣは、多数の用途を有する。これらの用途としては、外科手順の間およびその後の急性出血により損失される血液の交換、ならびに外傷性損傷後の蘇生手順のための用途が挙げられる。本質的には、ＨＢＯＣは、これらの目的または保存血液を容易に患者に投与する任意の目的のために使用され得る（例えば、Ｂｏｎｓｏｎらに対する特許文献１およびＭｏｒｒｉｓに対する特許文献２を参照のこと）。
【０００６】
ＨＢＯＣの開発は、現在のヒトの血液供給が限られることを踏まえると、特に重要である。この理由のために、ヒトの血液は、通常、医学的に必要である状況においてのみ使用される。これは、通常、ヒトの血液が予防的使用（例えば、「血液ドーピング（ｂｌｏｏｄ ｄｏｐｉｎｇ）」（すなわち、血液の酸素運搬能力を増大させることによって血液の性能を増強する目的のために全血を投与すること）に適切でないことを意味する。したがって、予防的適応のための全血およびＨＢＯＣの使用は両方とも、広く普及しておらず、そしてほとんどの場合、若干問題のある実施と見なされる。
【０００７】
外科手術前の患者に対するＨＢＯＣの投与は、必要な場合、その手順の後期か、または外科手術後に患者に戻され得る患者からの自家血液の取り出し（すなわち、希釈式自己血輸血または「ＡＮＨ」）との組み合わせにおいて提案されてきた。例えば、特許文献３を参照のこと。このような患者は、本明細書中において、外科手術時に「正常血液量」であると見なされない。しかし、この手順は、外科的手順の不利な初頭効果を回避（例えば、血流力学的安定性）する予防措置に対する必要性を扱わず、外科手術に関連した失血の副次的効果を扱うのみである。
【０００８】
全身麻酔を必要とする外科手術の間に血流力学的安定性を増強することは、２つの基本的な理由から重要である。第１に、失血または他の因子によって引き起こされる血流力学的不安定性は、組織の損傷、および死亡さえもたらし得る。例えば、出血性低血圧およびアナフィラキシーショックは、組織の酸素化の減少をもたらす著しい失血から生じる状態である。このような医学的状態を有する患者に関して、患者の血圧を安定化させること、および患者の循環系によって身体組織に提供される酸素の量を増加させることは、患者の生存のために望ましく、そして多くの場合、患者の生存のために重要である。
第２に、そして最も重要なことには、軽微かつ一時的でさえ、血流力学的不安定性は、手術後の患者の回復に影響し得る。この不安定性は、身体全体の任意の場所で起こり得、そして、しばしば、血圧の低下として通常は記録される「低血圧事象」として発現される。このような事象は、全身麻酔の間（血液の損失がない場合でさえ）の局在化した血流力学特性の変動の結果として起こり得る。これらの事象は、外科手術後の回復に悪影響を及ぼす認知の障害および他の合併症を引き起こし得る。例えば、侵襲的な外科的手順（例えば、人工股関節置換術）を受ける高齢患者は、外科手術の間に患者の血流力学的安定性を増強する任意の予防的処置によって利益を受ける。さらに、このような患者は、多くの場合、ＡＮＨに適した候補者ではなく、そしてそれらの患者血流力学的安定性を増強することは、ドナー血液を使用する輸血に対する必要性を減少させると予想される。
血漿増量剤の使用および血流力学的安定性を維持するための容量負荷（ｖｏｌｕｍｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）が、広く普及している。しかし、これらの非酸素運搬溶液は、付随するＡＮＨを伴わない場合でさえ、血液の酸素能力を希釈するだけであり、そしていくつかの場合において、実際に血流力学的不安定性を引き起こし得る。血漿増量剤および容量負荷に加えて、晶質溶液が、血流力学的安定性の維持における使用について提案されている。しかし、これらの溶液の投与は、過剰な水分貯留および浮腫を生じ得、これらもまた、血流力学特性の変動を引き起こし得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第４，００１，４０１号明細書
【特許文献２】米国特許第４，０６１，７３６号明細書
【特許文献３】国際公開第９８／３７９０９号パンフレット
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ａ．Ｃ．Ｇｕｙｔｏｎ、「Ｈｕｍａｎ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ Ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ」、第３版、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．、１９８２年、ｐ．２２８−２２９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、血液の固有の酸素運搬能力を消失しない一過性の低血圧事象を生じ得る、血流力学的安定性を増強する方法に対する必要性が、存在する。この目的に従って、本発明は、ヘモグロビンベースの酸素キャリア（例えば、特別に処方されるポリアルキレンオキシド改変されたヘモグロビン）を含有する組成物を投与することによって血流力学的安定性を増強する方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
本発明は、外科手術を受ける正常血液量の被験体の血流力学的安定性を増強するための処置における、組成物の使用に関する。１つの実施形態において、本発明は、外科手術を受ける正常血液量の被験体の血流力学的安定性を増強するための方法であって、ａ）上記外科手術に伴って、全血より高い酸素親和性を有するヘモグロビンベースの酸素キャリア（ＨＢＯＣ）を含む組成物を上記被験体に投与する工程；およびｂ）上記患者の血流力学的安定性をモニタリングする工程を包含する方法に関する。このような投与は、外科手術の前、外科手術の間、または外科手術の後に生じても、それらの任意の組み合わせで生じてもよい。さらに、上記血流力学的安定性は、外科手術の前、外科手術の間、または外科手術の後に測定されても、それらの任意の組み合わせで測定されてもよい。さらに、上記患者の血流力学的安定性のモニタリングは、多くの形態（例えば、患者の血圧のモニタリング）をとり得る。１つの実施形態において、血流力学的安定性は、９０ｍｍＨｇを上回って維持する収縮期血圧によって特徴付けられる。
【００１３】
本発明のＨＢＯＣは、多くの形態（例えば、ポリアルキレンオキシド改変された、天然または合成の供給源（組換えの供給源が挙げられる）から得られ得るヘモグロビン）をとり得る。さらに、ヘモグロビンの供給源は、ヒト、または他のヒトではない動物由来であり得る。
【００１４】
本発明の別の実施形態において、上記ＨＢＯＣは、全血の酸素親和性の２倍より大きい酸素親和性を有し、上記ＨＢＯＣとしては、４〜１５の間のＰ５０を有するＨＢＯＣが挙げられ得る。
【００１５】
別の局面において、本発明は、外科手術を受ける正常血液量の被験体の血流力学的安定性を増強するための医薬の製造におけるヘモグロビンベースの酸素キャリア（ＨＢＯＣ）の使用を包含し、上記ＨＢＯＣは、全血より大きい酸素親和性を有する。このような使用は、外科手術に関連した血流力学的不安定性を回避するための予防措置としての酸素の解放（ｏｘｙｇｅｎ ｏｆｆｌｏａｄｉｎｇ）の増強をさらに含み得る。上記ＨＢＯＣの特徴および上記医薬の投与は、例えば、上に記載される通りである。
【００１６】
本発明の他の局面は、本明細書全体を通じて記載される。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
外科手術を受ける正常血液量の被験体の血流力学的安定性を増強するための方法であって、以下：
ａ）該外科手術に伴って、全血より高い酸素親和性を有するヘモグロビンベースの酸素キャリア（ＨＢＯＣ）を含む組成物を該被験体に投与する工程；および
ｂ）該患者の血流力学的安定性をモニタリングする工程
を包含する、方法。
（項目２）
前記組成物は、外科手術の前に投与される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記組成物は、外科手術の間に投与される、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記組成物は、外科手術の後に投与される、項目１に記載の方法。
（項目５）
工程ｂ）は、外科手術の前に実施される、項目１に記載の方法。
（項目６）
工程ｂ）は、外科手術の間に実施される、項目１に記載の方法。
（項目７）
工程ｂ）は、外科手術の後に実施される、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記ＨＢＯＣは、ポリアルキレンオキシド改変された天然のヘモグロビンをさらに含有する、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記ＨＢＯＣは、ポリアルキレンオキシド改変された合成のヘモグロビンをさらに含有する、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記ＨＢＯＣは、組換えヘモグロビンをさらに含有する、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記ＨＢＯＣは、ヒトヘモグロビンをさらに含有する、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記ＨＢＯＣは、ヒトではない動物から得たヒトヘモグロビンをさらに含有する、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記ＨＢＯＣは、全血の酸素親和性の２倍より大きい酸素親和性を有する、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記ＨＢＯＣは、４と１５との間のＰ５０を有する、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記ＨＢＯＣは、マレイミジル活性型ポリエチレングリコールの共有結合によって改変されたヘモグロビンをさらに含有する、項目１に記載の方法。
（項目１６）
工程ｂ）は、前記被験体の血圧をモニタリングする工程を包含する、項目１に記載の方法。
（項目１７）
血流力学的な安定化は、９０ｍｍＨｇを上回る収縮期血圧を維持する前記被験体によって特徴付けられる、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
外科手術を受ける正常血液量の被験体の血流力学的安定性を増強するための医薬の製造におけるヘモグロビンベースの酸素キャリア（ＨＢＯＣ）の使用であって、該ＨＢＯＣは、全血より大きい酸素親和性を有する、使用。
（項目１９）
外科手術に関連した血流力学的不安定性を回避するための予防措置としての酸素の解放の増強をさらに含む、項目１８に記載の使用。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂおよび支質非含有ヘモグロビン（ＳＦＨ）のＦＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図２】図２は、ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂ、ＳＦＨおよび全血についての酸素平衡曲線を示す。
【図３】図３は、種々の試験溶液の投与後における、ラットの生存率を示す。
【図４】図４は、ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂまたは乳酸リンゲル液を受容する患者の尿量を示す。
【図５】図５は、麻酔前にＭａｌＰＥＧ−Ｈｂを受容する患者のバイタルサインを示す。
【図６】図６は、ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂまたはプラセボを受容し、外科手術の間に低血圧事象を示す患者の％を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ヘモグロビンベースの酸素キャリアを含有する組成物を投与することによって、外科手術を受ける個体の血流力学的安定性を増強するための方法に関する。１つの実施形態において、本発明は、外科手術の間の血流力学的安定性に関連した合併症を回避するための予防措置として酸素の解放を増強するための、減少した協同性および高い酸素親和性を有するポリアルキレンオキシド改変されたヘモグロビンの使用に関する。
後述の開示に記載される本発明の理解を深めるために、多くの用語が下記で定義されている。
【００１９】
（定義）
用語「ヘモグロビン」は、一般的に、酸素を運ぶ赤血球内に含まれるタンパク質をいう。各ヘモグロビン分子は、４つのサブユニットを有し（２つのα鎖および２つのβ鎖）、四量体構造で配列している。各サブユニットはまた、１つのヘム基を含み、ヘム基は、酸素と結合するイオン含有中心である。このように、各ヘモグロビン分子は、４つの酸素分子と結合し得る。
【００２０】
用語「改変ヘモグロビン」は、化学反応（例えば、分子内架橋および分子間架橋、遺伝子操作、重合、および／または他の化学基（例えば、ポリアルキレンオキシド、例えばポリエチレングリコール、または他の付加物（例えば、タンパク質、ペプチド、炭水化物、合成ポリマーなど）との結合によって変化したヘモグロビンを含むが、それらに制限されない。つまり、ヘモグロビンは、その構造または機能的特徴のいずれかが、そのネイティブな状態から変化され得る場合、「改変される」。本明細書中で使用される場合、用語「ヘモグロビン」それ自体は、ネイティブなヘモグロビン、未改変ヘモグロビン、および改変ヘモグロビンのいずれもいう。
【００２１】
用語「表面改変ヘモグロビン」は、化学基（例えば、デキストラン、またはポリアルキレンオキシド）が結合した（最も一般的には、共有結合）、上述のヘモグロビンをいうために使用され得る。用語「表面改変酸化型ヘモグロビン」は、それが表面改変される場合、「Ｒ」状態であるヘモグロビンをいう。
【００２２】
用語「支質非含有ヘモグロビン」は、全ての赤血球のメンバーが除去されたヘモグロビンをいう。
【００２３】
用語「メトヘモグロビン」は、第二鉄状態で鉄を含む酸化型ヘモグロビンをいい、酸素キャリアとして機能できない。
【００２４】
用語「ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂ」は、マレイミジル活性型ＰＥＧが結合体化されたヘモグロビンをいう。さらに、このようなＭａｌＰＥＧは、次の式によって説明され得る：
Ｈｂ−（Ｓ−Ｙ−Ｒ−ＣＨ２−ＣＨ２−［Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２］ｎ−Ｏ−ＣＨ３）ｍ 式Ｉ
ここで、Ｈｂは、四量体のヘモグロビンであり、Ｓは、表面チオール基であり、Ｙは、ＨｂとＭａｌ−ＰＥＧとの間のスクシンイミド共有結合であり、Ｒは、非存在であるか、アルキル、アミド、カルバミン酸塩またはフェニル基（生材料の供給源および化学合成の方法に依存して）であり、［Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２］ｎは、ＰＥＧポリマーの骨格を形成するオキシエチレン単位であり、ここで、ｎは、ポリマーの長さ（例えば、分子量＝５０００）を定義し、そしてＯ−ＣＨ３は、末端メトキシ基である。
【００２５】
用語「血漿増量剤（ｅｘｐａｎｄｅｒ）」は、血漿容量を増加させるために被験体に与えられ得る任意の溶液をいう。
【００２６】
用語「酸素運搬能力」または単に用語「酸素能力」は、酸素を運搬するための代用血液の能力をいうが、それが酸素を送達する効率と必ずしも相関しない。ヘモグロビン含有代用血液の酸素運搬能力は、一般的に、ヘモグロビ濃度から算出される。なぜなら、１グラムのヘモグロビンが１．３４ｍｌの酸素と結合することが知られているからである。このように、ヘモグロビン濃度（ｇ／ｄｌ）に１．３４を掛けると、酸素能力（ｍｌ／ｄｌ）が算出される。ヘモグロビン濃度は、任意の公知の方法（例えば、β−ヘモグロビンフォトメーター（ＨｅｍｏＣｕｅ，Ｉｎｃ．，Ａｎｇｅｌｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ））によって測定され得る。同様に、酸素能力は、例えば、燃料電池装置（例えば、Ｌｅｘ−Ｏ２−Ｃｏｎ；Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて、ヘモグロビンまたは血液のサンプルから放出される酸素の量によって測定される得る。
【００２７】
用語「酸素親和性」は、酸素キャリア（例えば、ヘモグロビン）が分子酸素と結合するアビディティーをいう。この特徴は、酸素分圧（Ｘ軸）と、ヘモグロビン分子の酸素飽和の程度（Ｙ軸）に関連する酸素平衡曲線によって定義される。この曲線の位置は、酸素キャリアが、酸素で半分飽和され、そして酸素親和性に逆相関するＰ５０値、酸素分圧によって示される。ここでＰ５０が低ければ、酸素親和性は高くなる。全血（および全血の組成物（例えば、赤血球およびヘモグロビン））、および任意の酸素キャリアの酸素親和性は、当業者の公知の種々の方法によって測定され得る（例えば、Ｗｉｎｓｌｏｗら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２（７）：２３１−３７（１９７７）を参照のこと）。酸素親和性はまた、市販のＨＥＭＯＸＴＭ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＴＣＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎｅｗ Ｈｏｐｅ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）を用いて決定され得る（例えば、ＶａｎｄｅｇｒｉｆｆおよびＳｈｒａｇｅｒ「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ｅｖｅｒｓｅら、編）２３２：４６０（１９９４）を参照のこと）。
【００２８】
用語「酸素運搬成分」は、体内の循環系に酸素を運搬することができ、そして組織に、その酸素の少なくとも一部分を送達することができる物質を広くいう。好ましい実施形態において、酸素運搬成分は、ネイティブなヘモグロビンまたは改変ヘモグロビンであり、「ヘモグロビンベースの酸素キャリア」または「ＨＢＯＣ」として本明細書中でもいわれている。
【００２９】
用語「血流力学的パラメータ」は、血液の圧力、流れ、および容積の状態を示す測定値を広くいい、血圧、心拍出量、右心房圧、左室拡張終期圧のような直接的な測定値、ならびに頻拍、虚血、徐脈、伝導の問題、体液平衡、体重、ＩＣＵ時間および腎機能の間接的な測定値が挙げられる。
【００３０】
用語「晶質」は、塩、糖、および緩衝液のような低分子（通常、１０Å未満）をいう。膠質と異なり、晶質は、いかなる腫脹活性成分も含まず、そしてその循環空間と間隙性空間との間で非常に素早く平衡化する。
【００３１】
用語「膠質」は、「晶質」とは対照的に、それらの大きさおよび電荷に依存して生物学的膜を越えて平衡化する高分子（通常は、１０Åより大きい）をいい、アルブミンおよびゼラチンのようなタンパク質、ならびにペンタスターチおよびヘタスターチのようなスターチが挙げられる。
【００３２】
用語「膠質浸透圧」は、膠質により付与され、膜を越えての体液平衡を平衡化する圧力をいう。
【００３３】
用語「自動酸化に対して安定」は、低い自動酸化率を維持するＨＢＯＣの能力をいう。ＨＢＯＣは、メトヘモグロビン／総ヘモグロビン比が、２４℃で１０時間後に２％を超えて増加しない場合、２４℃で安定であるとみなされる。例えば、自動酸化率が０．２ｈｒ−１である場合、そして、最初のメトヘモグロビンの割合が５％である場合、ＨＢＯＣは、この割合が７％を超えて増加しなかった場合に、室温で１０時間安定であるとみなされる。
【００３４】
用語「メトヘモグロビン／総ヘモグロビン比」は、酸化型ヘモグロビン対総ヘモグロビンの比をいう。
【００３５】
用語「混合物」は、個々の特性を失う反応を生じることなく、２つ以上の物質が一緒に入り混ざったものをいう。用語「溶液」は、液体混合物をいう。用語「水溶液」は、いくらかの水を含有し、水と共に１つ以上の他の液体物質も含有し、多成分溶液を形成し得る溶液をいう。用語「約」は、実際の値が一定の範囲内にあることをいう（例えば、示される値の１０％以内）。
【００３６】
用語「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」は、一般化学式Ｈ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ（ここで、ｎは、４以上である）の液体または固体ポリマー、およびその改変体（例えば、活性型、置換型、および/または非置換型のＰＥＧ）をいう。
【００３７】
用語「灌流」とは、動脈および毛細管を通した組織および器官への流体の流れをいう。
【００３８】
用語「血流力学的安定性」とは、循環の機構において安定に機能すること（すなわち、任意の血流力学的パラメータの所与の時間にわたる安定性）をいう。
【００３９】
用語「低血圧事象」は、限局性または全身性の低血圧（すなわち、血圧の低下）によって特徴付けられるか、またはそれに起因し、低血圧事象は、さらに、９０ｍｍＨｇ未満の収縮期血圧またはベースライン値の７５％を下回る血圧の減少として定量的に定義される。
【００４０】
本明細書中で使用される他の用語の意味は、当業者により容易に理解されるはずである。
【００４１】
（酸素送達および消費の性質）
本発明の組成物および方法の首尾良い使用は、酸素送達および消費の基礎的な機構の理解を必要としないが、これらの推定機構のいくつかに関する基本的な知見は、以下の議論を理解することを補助し得る。一般的に、毛細管は、組織への酸素の主要な運搬体であると推定されてきた。しかし、休止している組織に関して、現在の発見は、細動脈の酸素放出と毛細管の酸素放出との間にほぼ均等分配（ｅｑｕｉｐａｒｔｉｔｉｏｎ）が存在することを示す。すなわち、動脈系におけるヘモグロビンは、細動脈網におけるその酸素含有量の約１／３および毛細管における１／３を送達し、残りは静脈系を通じて微小循環を出ると考えられる。
【００４２】
動脈自体は、酸素利用部位である。例えば、動脈壁は、血管抵抗に対する収縮を通して血流を調節するのにエネルギーを必要とする。従って、動脈壁は通常、血液からの酸素の拡散のための重要な部位である。しかし、現在の酸素送達組成物（例えば、ＨＢＯＣ）は、動脈系においてそれらの酸素含有量の多くを放出しすぎ得、それによって、毛細管灌流における自己調節性の還元を誘導する。従って、代用血液の酸素送達の効率は、実際は、高すぎる酸素親和性または低すぎる酸素親和性を有することによって妨げられ得る。
【００４３】
血管壁による酸素消費の速度（すなわち、機械的作業に必要とされる酸素および生化学的合成に必要とされる酸素の組み合わせ）は、血管壁での勾配を測定することによって決定され得る。例えば、Ｗｉｎｓｌｏｗら、「Ａｄｖａｎｃｅ ｉｎ Ｂｌｏｏｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ」（１９９７）、Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ編、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、１６７〜１８８頁を参照のこと。現在の技術は、種々の血管における正確な酸素の部分圧の測定を可能にする。測定された勾配は、測定領域中の組織による酸素利用の率に直接的に比例する。このような測定は、血管壁が、基底線酸素利用を有し、これは炎症および絞窄における増加と共に増加し、そして弛緩により減少することを示す。
【００４４】
血管壁の勾配は、組織の酸化に反比例する。血管収縮は、酸素勾配（組織代謝）を増加させるが、血管拡張は、その勾配を低下させる。より高い勾配は、より多くの酸素が血管壁によって使用される一方で、より少ない酸素が組織に利用可能であるという事実を示す。同じ現象が微小循環を通じて全体にわたって存在すると考えられる。
【００４５】
（血管収縮と酸素親和性との間の関係）
高い酸素親和性を有するＨＢＯＣを開発するための原理は、一部、赤血球注入の代替として無細胞ヘモグロビンを用いた過去の研究に基づく。これらの溶液の生理学的効果のいくつかは、理解が不完全なままである。これらのうち、おそらく最大の論議は、動物および人間において高血圧として現れ得る血管収縮を引き起こす傾向である（Ａｍｂｅｒｓｏｎ，Ｗ．，「Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ−ｓａｌｉｎｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ」，Ｓｉｃｅｎｃｅ １０６：１１７−１１７（１９４７））（Ｋｅｉｐｅｒｔ，Ｐ．，Ａ．Ｇｏｎｚａｌｅｓ，Ｃ．Ｇｏｍｅｚ，Ｖ．Ｍａｃｄｏｎａｌｄ，Ｊ．Ｈｅｓｓ，およびＲ．Ｗｉｎｓｌｏｗ，「Ａｃｕｔｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｓｙｓｍｅｔｉｃ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ａｎｄ ｕｒｉｎｅ ｏｕｔｐｕｔ ｏｆ ｃｏｎｓｃｉｏｕｓ ｒａｔｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ｗｉｔｈ ｄｉａｓｐｉｒｉｎ−ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ」，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ３３：７０１−７０８（１９９３））。α鎖間でビス−ジブロモサリチル−フマレートを用いて架橋されたヒトヘモグロビン（ααＨｂ）は、モデル代用赤血球として米軍により開発されたが、肺および全身血管抵抗の重篤な増加が実証された後、米軍によって中止された（Ｈｅｓｓ，Ｊ．，Ｖ．Ｍａｃｄｏｎａｌｄ，Ａ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｖ．Ｃｏｐｐｅｓ，およびＣ．Ｇｏｍｅｚ，「Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ａｎｄ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｈｙｐｅｒｔｅｎｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ」，Ｂｌｏｏｄ ７８：３５６Ａ（１９９１））。この製品の市販版もまた、第ＩＩＩ相臨床試験が実現しなかった後に中止された（Ｗｉｎｓｌｏｗ，Ｒ．Ｍ．「αα−Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ：Ｗａｓ ｆａｉｌｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｂｙ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｅｓｔｉｎｇ？」，Ｖｏｘ ｓａｎｇ ７９：１−２０（２０００））。
【００４６】
無細胞ヘモグロビンにより生じる血管収縮についての最も一般的に前進した説明は、それが、内皮由来弛緩因子、一酸化窒素（ＮＯ）に容易に結合することである。実際、最高負荷ラット実験においてより低い高血圧性であるようである、ＮＯに対して減少した親和性を有する組み換えヘモグロビンが生成された（Ｄｏｈｅｒｔｙ，Ｄ．Ｈ．，Ｍ．Ｐ．Ｄｏｙｌｅ，Ｓ．Ｒ．Ｃｕｒｒｙ，Ｒ．Ｊ．Ｖａｌｉ，Ｔ．Ｊ．Ｆａｔｔｏｒ，Ｊ．Ｓ．Ｏｌｓｏｎ，およびＤ．Ｄ．Ｌｅｍｏｎ，「Ｒａｔｅ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ
ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｔｈｅ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ」，Ｎａｔｕｒｅ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：６７２−６７６（１９９８））（Ｌｅｍｏｎ，Ｄ．Ｄ．，Ｄ．Ｈ．Ｄｏｈｅｒｔｙ，Ｓ．Ｒ．Ｃｕｒｒｙ，Ａ．Ｊ．Ｍａｔｈｅｗｓ，Ｍ．Ｐ．Ｄｏｙｌｅ，Ｔ．Ｊ．Ｆａｔｔｏｒ，およびＪ．Ｓ．Ｏｌｓｏｎ，「Ｃｏｎｔｒｏｌ
ｏｆ ｔｈｅ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ−ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ
ｏｆ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ」，Ａｒｔ Ｃｅｌｌｓ，Ｂｌｏｏｄ Ｓｕｂｓ．，ａｎｄ Ｉｍｍｏｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈ ２４：３７８（１９９６））。
【００４７】
しかし、ＮＯ結合はヘモグロビンの血管作用性についての唯一の説明ではないかもしれないことを研究が示唆している。特定の大きなヘモグロビン分子（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で改変されたヘモグロビン分子）は、それらのＮＯ結合率が重篤な高血圧性のααＨｂと同一であるにもかかわらず、高血圧効果を実質的に有さないことが見出された（Ｒｏｈｌｆｓ，Ｒ．Ｊ．，Ｅ．Ｂｒｕｎｅｒ，Ａ．Ｃｈｉｕ，Ａ．Ｇｏｎｚａｌｅｓ，Ｍ．Ｌ．Ｇｏｎｚａｌｅｓ，Ｄ．Ｍａｇｄｅ，Ｍ．Ｄ．Ｍａｇｄｅ，Ｋ．Ｄ．Ｖａｎｄｅｇｒｉｆｆ，およびＲ．Ｍ．Ｗｉｎｓｌｏｗ，「Ａｒｔｅｒｉａｌ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ」，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７３：１２１２８−１２１３４（１９９８））。さらに、ＰＥＧ−ヘモグロビンが出血前の交換輸血として与えられた場合、出血の影響を防ぐのに並外れて効果的であることが見出された（Ｗｉｎｓｌｏｗ，Ｒ．Ｍ．，Ａ．Ｇｏｎｚａｌｅｓ，Ｍ．Ｇｏｎｚａｌｅｓ，Ｍ．Ｍａｇｄｅ，Ｍ．ＭｃＣａｒｔｈｙ，Ｒ．Ｊ．Ｒｏｈｌｆｓ，およびＫ．Ｄ．Ｖａｎｄｅｇｒｉｆｆ，「Ｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｒｅｄ ｃｅｌｌ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ」，Ｊ Ａｐｐｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ８５：９９３−１００３（１９９８））。
【００４８】
この保護効果は、高血圧の欠如と相関し、このことは、血管収縮が多くの今日までに研究されたヘモグロビンベースの産物の効能を消失させることを伴うことを示唆している。これらの観察に基づいて、ＮＯ結合の効果の代替として、またはおそらくそれに加えて、血管収縮を説明する仮説が展開された。任意の特定の学説に拘束されることを望まないが、ヘモグロビンの血管作用効果の実質的な要素は、無細胞空間におけるヘモグロビンの拡散に対する弛緩応答であると考えられる。この仮説は、インビトロ毛細管系において試験され、そして低下した拡散係数を有するＰＥＧ−ヘモグロビンが、ネイティブの赤血球と非常に類似した様式でＯ２を運搬したことが実証された（ＭｃＣａｒｔｈｙ，Ｍ．Ｒ．，Ｋ．Ｄ．Ｖａｎｄｅｇｒｉｆｆ，およびＲ．Ｍ．Ｗｉｎｓｌｏｗ，「Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｉｎ ｏｘｙｇｅｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｂｙ ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ：Ｉｍｐｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ−ｂａｓｅｄ ｏｘｙｇｅｎ ｃａｒｒｉｅｒｓ」，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ９２：１０３−１１７（２００１））。酸素親和性は、血漿空間におけるヘモグロビンによるその促進された拡散において役割を果たすと予想される。なぜならば、ヘモグロビンから血管壁への飽和状態の変化は、ヘモグロビン自体の拡散勾配の決定因子であるからである。
【００４９】
無細胞ヘモグロビンの酸素親和性は、血管緊張（ｖａｓｃｕｌａｒ ｔｏｎｅ）の調節においてさらなる役割を果たし得る。なぜなら、Ｏ２の細動脈中の血管壁に対する遊離は、血管収縮を誘発するからである（Ｌｉｎｄｂｏｍ，Ｌ．，Ｒ．ＴｕｍａおよびＫ．Ａｒｆｏｒｓ，「Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｏｘｙｇｅｎ ｏｎ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｄｅｎｓｉｔｙ ａｎｄ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｒｅｄ ｃｅｌｌ ｖｅｌｏｃｉｔｙ ｉｎ ｒａｂｂｉｔ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ」、Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ Ｒｅｓ １９：１９７−２０８（１９８０））。ハムスター皮下脂肪において、このような血管中のＰＯ２は、２０〜４０トルの範囲にあり、ここで、正常な赤血球酸素平衡曲線は、最も急勾配である（Ｉｎｔａｇｌｉｅｔｔａ，Ｍ．，Ｐ．ＪｏｈｎｓｏｎおよびＲ．Ｗｉｎｓｌｏｗ，「Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｏｘｙｇｅｎ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ」、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ ３２：６３２−６４３（１９９６））。従って、理論的観点から、細動脈調節性血管におけるＯ２の遊離を防止するために、無細胞ヘモグロビンのＰ５０が、赤血球のＰ５０より低い（すなわち、より高いＯ２親和性）ことが重要であり得る。
【００５０】
（酸素の解放）
酸素親和性に加えて、酸素結合特性それ自体（すなわち、協同性およびアロステリック効果）は、ＨＢＯＣの酸素の解放の性能において重要な役割を果たし得る。ヘモグロビンに結合するポリアルキレンは、グロビン構造の一般的な「締め付け（ｔｉｇｈｔｅｎｉｎｇ）」を生じることが、観察されている。これは、ヘモグロビンを取り囲む親水性のシェル（ｓｈｅｌｌ）を有する浸透圧効果に起因し、そしてポリアルキレンオキシドを結合するために使用される連結基の性質および位置に依存し得る。最も一般的な通念は、ＨＢＯＣの設計がネイティブなヘモグロビンの特徴を模倣するはずであるということである。しかし、ヘモグロビンの四次コンフォメーションの摂動が、特に、酸素の解放の状況において利点を有し得ることが、予期せず見出された。
【００５１】
タンパク質の特徴が、そのアロステリック部位においてエフェクター分子（すなわち、リガンド）に結合する結果として変化する場合、そのタンパク質は、「アロステリック」であると見なされる。ヘモグロビンの場合において、上記リガンドは、酸素である。ヘモグロビン四量体の各サブユニットは、１つの酸素分子に結合し得る。各サブユニットはまた、２つのコンフォメーションの緊張（Ｔ）または弛緩（Ｒ）の２つのうちの１つで存在する。Ｒ状態において、上記サブユニットは、Ｔ状態より容易に酸素を結合し得る。
【００５２】
ヘモグロビンは、酸素を結合する個々のサブユニットの間で、協調した効果または協同性を示す。１つのサブユニットに対する酸素の結合は、残りの活性部位が増強した酸素親和性を示すようにする、酸素が結合したサブユニットにおけるコンフォメーションの変化を誘導する。したがって、ヘモグロビン分子に結合するそれぞれの逐次的な酸素分子は、ヘモグロビン分子が、４個の結合した酸素分子を伴うＲ状態または「リガンドと結合した（ｌｉｇａｎｄｅｄ）」状態を達成するまで、その前の酸素分子より容易に結合する。
【００５３】
逆に、ネイティブなヘモグロビンは、酸素を放出するその効率に関して、協調した効果を示す。第１の分子は、より堅く結合され、そしてより多くのエネルギーを得て、「解放され（ｏｆｆｌｏａｄｅｄ）」、次いで次の分子が、解放されるなどである。したがって、ネイティブなヘモグロビンの協同性を模倣する代用血液の設計についての従来技術は、一旦結合した酸素を放出するその能力に対して不利に影響し得る。
【００５４】
本発明は、ネイティブなヘモグロビンより小さい（ネイティブなヘモグロビンより大きくない）協同性を有するがＨＢＯＣが、酸素の解放に関連する用途において、予想外に、より有用であるという知見に関する。したがって、血流力学的安定性の増強において使用するための組成物は、一旦上記組成物がその標的位置に到達した場合に、その酸素を容易に放出できなければならないが、血管収縮効果を回避するために、大きすぎる酸素放出能力を含むべきではない。要約すると、外科的手順に関連した予防的処置のための、血流力学的安定性を必然的に増強する理想的な組成物は、ネイティブなヘモグロビンより小さい協同性を有するが、全血と比較した場合にずっと高い酸素親和性（例えば、半分未満のＰ５０）を有する組成物中に処方される改変ヘモグロビンを含む。
【００５５】
（酸素運搬成分）
好ましい実施形態において、酸素キャリア（すなわち、酸素運搬成分）は、ヘモグロビンベースの酸素キャリア（すなわち、ＨＢＯＣ）である。ヘモグロビンは、ネイティブ（未改変）であり；続いて、化学反応（例えば、分子内架橋または分子間架橋、重合、または化学官能基（例えば、ポリアルキレンオキシド、または他の付加物）の付加）によって改変され得るか；またはヘモグロビンは、組換え操作され得る。ヒトα−グロビン遺伝子およびβ−グロビン遺伝子は、クローン化され、配列決定されている。Ｌｉｅｂｈａｂｅｒら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．７７：７０５４−７０５８（１９８０）；Ｍａｒｏｔｔａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３５３：５０４０−５０５３（１９７７）（β−グロビンｃＤＮＡ）。さらに、多くの組換え産生され改変されたヘモグロビンは、ここで、部位特異的変異誘発を使用して生成されたが、これらの「変異型」ヘモグロビン変種は、高い酸素親和性を有するとして報告された。例えば、Ｎａｇａｉら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，８２：７２５２−７２５５（１９８５）を参照のこと。
【００５６】
本発明の実施において使用されるＨＢＯＣは、通常の全血（必然的にヒトでない可能性がある被験体と同じ動物供給源由来）より高い酸素親和性を有し、この酸素親和性は、全血のＰ５０より低いＰ５０として表される。全血は、一般的に、２８トルに近いＰ５０を有すると見なされる。１つの実施形態において、本発明のＨＢＯＣは、全血のＰ５０の半分未満のＰ５０を有し、このことは、「高酸素親和性」であると見なされる。このような高酸素親和性のＨＢＯＣは、４〜１５（例えば、１０、７など）のＰ５０を有し得る。
【００５７】
本発明は、ヘモグロビンの供給源によって限定されない。例えば、ヘモグロビンは、動物およびヒトに由来し得る。特定の適用に対する好ましいヘモグロビンの供給源は、ヒト、ウシおよびブタ、ならびに哺乳動物ではない供給源（例えば、環形動物、爬虫類など）である。さらに、ヘモグロビンは、他の方法（化学合成および組換え技術を含む）によって産生され得る。ヘモグロビンは、遊離形態で血液製剤組成物に添加され得るか、または、小胞（例えば、合成粒子、マイクロバルーンまたはリポソーム）中にカプセル化され得る。本発明の好ましい酸素運搬成分は、支質非含有であり、そして内毒素非含有であるべきである。酸素運搬成分の代表的な例は、以下の多くの発行された米国特許に開示され、これらとしては、Ｈｓｉａに対する米国特許第４，８５７，６３６号；Ｗａｌｄｅｒに対する同第４，６００，５３１号；Ｍｏｒｒｉｓらに対する同第４，０６１，７３６号；Ｍａｚｕｒに対する同第３，９２５，３４４号；Ｔｙｅに対する同第４，５２９，７１９号；Ｓｃａｎｎｏｎに対する同第４，４７３，４９６号；Ｂｏｃｃｉらに対する同第４，５８４，１３０号；Ｋｌｕｇｅｒらに対する同第５，２５０，６６５号；Ｈｏｆｆｍａｎらに対する同第５，０２８，５８８号；ならびにＳｅｈｇａｌらに対する同第４，８２６，８１１号および同第５，１９４，５９０号が挙げられる。
【００５８】
前述のヘモグロビンの供給源に加えて、ウマヘモグロビンが、本発明の組成物中の酸素運搬成分として特定の利点を有することが最近見出された。１つの利点は、ウマヘモグロビンが精製され得る市販量のウマ血液が、容易に入手可能であるということである。別の予想外の利点は、ウマヘモグロビンが、本発明の代用血液において、その有用性を増強し得る化学的特性を示すことである。
【００５９】
以前の報告は、ウマヘモグロビンが、ヒトヘモグロビンより早くメトヘモグロビンに自動酸化することを示し、このことは、ウマヘモグロビンが、代用血液成分としてより所望されないものにする。例えば、Ｊ．Ｇ．ＭｃＬｅａｎおよびＩ．Ｍ．Ｌｅｗｉｓ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｖｅｔ．Ｓｃｉ．，１９：２５９−２６２（１９７５）を参照のこと。自動酸化を最小にするために、ＭｃＬｅａｎおよびＬｅｗｉｓは、赤血球溶解の後、還元剤（グルタチオン）を使用した。しかし、本発明の組成物を調製するために使用されるヘモグロビンは、ヘモグロビンの供給源がヒトであるかウマであるかに関わらず、赤血球溶解後の自動酸化を防止するために還元剤の使用を必要としない。
【００６０】
より最近、ウマヘモグロビンが、ヒトヘモグロビンと異なる酸素親和性を有することが報告された。例えば、Ｍ．Ｍｅｌｌｅｇｒｉｎｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６８：３３１３−３３２０（２００１）を参照のこと。このような差異は、ヒトヘモグロビンを模倣する代用血液を調製するためのウマヘモグロビンの選択を思いとどまらせる。しかし、本発明の組成物に組込む場合、ヒトヘモグロビン含有結合体とウマヘモグロビン含有結合体との間の酸素親和性に有意な差異は、観察されない（１０％未満）。従って、これらの表面上所望されない特性に反して、本発明の組成物において、ウマヘモグロビンは、ヒトヘモグロビンより優れない場合、等価である。
【００６１】
本発明における使用のために、ＨＢＯＣは、全血より優れた酸素親和性を有し、同じ条件下で測定された場合、好ましくは全血の２倍であり、あるいは、支質非含有ヘモグロビン（ＳＦＨ）より酸素親和性が大きい。ほとんどの場合において、これは、代用血液中でのＨＢＯＣが、１０未満のＰ５０を有し、より好ましくは７未満のＰ５０を有することを意味する。遊離状態において、ＳＦＨは、約１５トルのＰ５０を有し、その一方で、全血に対するＰ５０は、約２８トルである。酸素親和性を増大し、それによってＰ５０を低下することは、酸素の組織への送達を増大し得ることが以前に示唆されたが、ＳＦＨのＰ５０より小さなＰ５０が、許容されないことを意味した。Ｗｉｎｓｌｏｗら、「Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｌｏｏｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ」（１９９７），Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ編、Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，第１６７頁および米国特許第６，０５４，４２７号を参照のこと。この示唆は、代用血液としての使用のための改変ヘモグロビンが、より小さな酸素親和性を有するべきであり、全血のＰ５０に近いＰ５０を有するべきであるという広くもたれている確信と矛盾する。従って、多くの研究者は、リン酸ピリドキシルを使用して、ＳＦＨのＰ５０を、１０から約２０〜２２へと上げる。なぜなら、ピリドキシル化ヘモグロビンは、ＳＦＨと比べた場合、より容易に酸素を遊離するからである。
【００６２】
高い酸素親和性を有するＨＢＯＣ（すなわち、ＳＦＨより小さなＰ５０を有するＨＢＯＣ）を製造するために多くの異なる科学的アプローチが存在する。例えば、研究は、酸素親和性において役割を果たすアミノ酸残基（例えば、Ｂ−９３システイン）を同定し、それによって、部位特異的変異誘発が、ここで、酸素親和性を所望のレベルに操作するために容易に実施され得る。例えば、米国特許第５，６６１，１２４号を参照のこと。他の多くのアプローチは、米国特許第６，０５４，４２７号に議論される。
【００６３】
（ヘモグロビン関連毒性）
ヘモグロビンは、第１鉄形態（Ｆｅ２＋）から第２鉄形態（Ｆｅ３＋）（すなわち、メトヘモグロビン形態）に可逆的に変化する場合、自動酸化を示すことが公知である。これが生じる場合、分子酸素は、スーパーオキシドアニオン（Ｏ２−）の形態において、オキシヘモグロビンから解離する。これはまた、ヘム−グロビン複合体の不安定化を生じ、結果としてグロビン鎖の変性を生じる。酸素ラジカル形成およびタンパク質変性の両方は、ＨＢＯＣのインビボ毒性において役割を果たすと考えられる（Ｖａｎｄｅｇｒｉｆｆ，Ｋ．Ｄ．，Ｂｌｏｏｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｅｆｆｉｃａｃｙ，第１０５頁−第１３０頁，Ｗｉｎｓｌｏｗら編、Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ（１９９５））。
【００６４】
ほとんどのＨＢＯＳに関して、酸素親和性とヘモグロビン酸化との間に負の相関が存在し、すなわち、酸素親和性がより高いと、自動酸化の速度がより遅い。しかし、異なるヘモグロビン改変の、酸素親和性および自動酸化速度に対する効果は、いつも予測可能であるわけではない。さらに、酸素親和性と自動酸化速度との間の最適のバランスは、よく理解されてはいない。
【００６５】
１つの実施形態において、本発明の組成物は、室温において自動酸化の非常に低い速度を示すポリアルキレンオキシド−Ｈｂ結合体（例えば、ポリエチレングリコール−Ｈｂ結合体）を含む。酸化の速度として測定される場合、この値は、可能な限り低く（すなわち、１時間当たり全ヘモグロビンの０．２％）、より好ましくは、室温で少なくとも３時間の間、より好ましくは少なくとも１０時間の間、１時間当たり全ヘモグロビンの０．１％である。従って、本発明の例示的なＨＢＯＳは、投与および／または室温での保存の間安定である。
【００６６】
（酸素運搬成分の改変）
例示的な実施形態において、上記酸素運搬成分は、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）改変されたヘモグロビンである。適切なＰＡＯとしては、とりわけ、ポリアルキレンオキシド（例えば、ポリエチレンオキシド（（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ）、ポリプロピレンオキシド（（ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２Ｏ）ｎ）またはポリエチレン／ポリプロピレンオキシドコポリマー（（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−（ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２Ｏ）ｎ））が挙げられる。本発明の実施に適切な他の直鎖合成ポリマー、分枝鎖合成ポリマーおよび必要に応じて置換された合成ポリマーは、医学分野において周知である。
【００６７】
最も一般的には、ヘモグロビンに結合される化学的官能基は、その薬学的受容性および市販入手性に起因して、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧは、一般化学式Ｈ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨのポリマーであり、ここで、ｎは、一般に、４以上である。ＰＥＧ処方物は、通常、これらの平均分子量に対応する数を後に付ける。例えば、ＰＥＧ−２００は、２００の平均分子量を有し、そして１９０〜２１０の分子量範囲を有し得る。ＰＥＧは、多くの異なる形態で市販されており、多くの場合、前もって活性化されており、タンパク質に容易に結合体化される。
【００６８】
本発明の例示的な実施形態の重要な局面は、ヘモグロビンが、酸化された状態、すなわち「Ｒ」状態である場合に、表面改変が起こることである。これは、ヘモグロビンを結合体化の前に大気と平衡化させる（あるいは、活性酸化が実施され得る）ことによって容易に達成される。酸化されたヘモグロビンへの結合体化を実施することによって、得られたヘモグロビンの酸素親和性は、増大される。このような工程は、一般的に、禁忌としてみなされる。なぜなら、多くの研究者は、結合体化前の脱酸化が、酸素親和性を低下することを記載するからである。例えば、米国特許第５，２３４，９０３号を参照のこと。
【００６９】
多くの局面において、表面改変されたヘモグロビンの性能は、ヘモグロビンと改変因子（例えば、ＰＥＧ）との間の結合に非依存性であるが、リンカーの型（例えば、より剛性の、不飽和脂肪族または芳香族のＣ１〜Ｃ６リンカー置換基）は、まさに記載される剛性のリンカーと比較して付着のより変形可能な様式のような異なる連結を有する置換基と比較される場合に、結合体の製造および／または特徴を変化し得ると考えられる。
【００７０】
ヘモグロビン分子に付加されるＰＥＧの数は、そのＰＥＧのサイズに依存して変動し得る。しかし、得られる改変ヘモグロビンの分子サイズは、所望の半減期を達成するために、腎臓によって排除されることを回避するために十分な大きさであるべきである。Ｂｌｕｍｅｎｓｔｅｉｎらは、このサイズは、８４，０００ダルトンより大きい分子量に達すると決定した（Ｂｌｕｍｅｎｓｔｅｉｎら、「Ｂｌｏｏｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍａ Ｅｘｐａｎｄｅｒｓ」、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ編、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０５−２１２頁（１９７８））。この文献において、この著者は、ヘモグロビンを、種々の分子量のデキストランに結合体化させた。この著者らは、ヘモグロビン（６４，０００ダルトンの分子量を有する）およびデキストラン（２０，０００ダルトンの分子量を有する）の結合体化が、「循環からゆっくりと除去され、そしてごくわずかにしか腎臓を通らない」ことを報告したが、８４，０００ダルトンより分子量を大きくすることは、クリアランス曲線を変化させなかった。従って、Ｂｌｕｍｅｎｓｔｅｉｎらによって決定されるように、ＨＢＯＣが、少なくとも８４，０００ダルトンの分子量を有することが好ましい。
【００７１】
本発明の１つの実施形態において、ＨＢＯＣは、「ＭａｌＰＥＧ」であり、これは、マレイミジル活性型ＰＥＧが結合体化したヘモグロビンを表す。このようなＭａｌＰＥＧは、以下の式によってさらに表され得る：
Ｈｂ−（Ｓ−Ｙ−Ｒ−ＣＨ２−ＣＨ２−［Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２］ｎ−Ｏ−ＣＨ３）ｍ 式Ｉ
ここで、Ｈｂは、四量体のヘモグロビンを表し、Ｓは、表面チオール基であり、Ｙは、ＨｂとＭａｌ−ＰＥＧとの間のスクシンイミド共有結合であり、Ｒは、非存在であるか、アルキル、アミド、カルバメートまたはフェニル基（原材料の供給源および化学合成の方法に依存する）であり、［Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２］ｎは、ＰＥＧポリマーの骨格を形成するオキシエチレン単位であり、ここで、ｎは、このポリマーの長さを規定し（例えば、ＭＷ＝５０００）、そしてＯ−ＣＨ３は、末端メトキシ基である。
（処方物）
本発明のＨＢＯＣは、上記ＨＢＯＣおよび他の任意の賦形剤を、適切な水溶液または「希釈剤」（すなわち、静脈内注射について薬学的に受容可能なもの）と混合することによって処方される。この希釈剤中の酸素キャリアの濃度は、適用に従って変動し得、そして特に、予測される投与後の希釈に基づくが、好ましい実施形態において、増強した酸素送達および治療効果を提供する、本発明の組成物の他の特徴に起因して、通常、６ｇ／ｄｌより高い濃度は必要ではなく、そして０．１〜４ｇ／ｄｌの間であり得る。
【００７２】
適切な希釈剤としてはまた、とりわけ、タンパク質、糖タンパク質、多糖類、および他の膠質が挙げられ得る。これらの実施形態は、いずれの特定の希釈剤にも限定されることは、意図されない。従って、希釈剤は、アルブミンの水性無細胞溶液、他の膠質、または他の非酸素保有成分を包含することが意図される。いくつかの実施形態において、上記水溶液は、少なくとも２．５ｃＰの粘度を有し得る。他の実施形態において、この水溶液の粘度は、２．５ｃＰと４ｃＰとの間である。
【００７３】
本明細書中に記載される組成物の投与は、外科手術の１日前、外科手術の間、または外科手術の１日後程度の長さを含む「外科手術に伴う」任意の時間に生じ得る。
【００７４】
（臨床適用）
本発明は、ヘモグロビンネイティブなより小さい協同性を示し得、全血より低いＰ５０を有する組成物中に処方されるＨＢＯＣ（例えば、ＰＡＯ改変されたヘモグロビン結合体）に関する。いくつかの実施形態において、そのＰ５０は、全血のＰ５０の半分未満である。このような組成物は、外科手術を受ける正常血液量の患者において血流力学的安定性を増強するのに有用である。それらは、血漿増量剤、容量向上剤（ｖｏｌｕｍｅ ｅｎｈａｎｃｅｒ）などの分野において周知である同じパラメータを使用して投与され得る。血流力学的安定性は、外科手術の前、外科手術の間、または外科手術の後にモニタリングされても、それらの任意の組み合わせでモニタリングされてもよい。したがって、血流力学的安定性の増強は、必然的に、外科的手順それ自体の際の被験体の血流力学特性の測定に限定されず、そして投与後の任意の時間に観察され得る。
【００７５】
本発明の方法の実施から最も利益を受け得る患者集団は、「外科手術を受ける正常血液量の患者」である。したがって、１つの実施形態において、本発明の方法は、希釈式自己血輸血（ＡＮＨ）処置の間に血液の抽出を受けなかった患者に対する上記組成物の投与に関する。これは、外科的手順に伴って、これらの組成物を受容する個体が、外科手術の間、またはその後に輸血を必要とする可能性が低いという知見に基づく。したがって、本発明の方法は、１つの局面において、ＡＮＨの代替的方法である。
【００７６】
別の局面において、本発明の方法はまた、外科手術の間に血圧を上昇させるための血管収縮薬のより少ない投与を必要とする外科手術を受ける正常血液量の患者の、間接的な利益をもたらす。なぜなら、その患者の血圧は、外科手術に伴うＨＢＯＣの予防的投与に起因して、外科手術の間に効率的に安定化されるからである。
【実施例】
【００７７】
以下の３つの実施例の類似するバージョンは、開示された米国特許出願第２００３／０１６２６９３号（２００３年８月２８日公開）である。これらの実施例の全てに関して、ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂは、モデルＨＢＯＣとして使用される。他のＨＢＯＣの生成および利用性は、科学文献において周知であるが、ヒト被験体において臨床試験を行なうための能力は、なおも慎重に調節され、そしてＨＢＯＣの複数の形態を使用して行なうことは不可能である。従って、本明細書中の教示に基づいて、本発明の範囲が、ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂの使用に限定されず、そして同様の特徴（例えば、ネイティブなヘモグロビンより高い酸素親和性、そして特に、ＰＡＯ改変されたヘモグロビン）を有するＨＢＯＣがまた、使用に適していることは、当業者に十分に理解されるはずである。
（実施例１）
（支質非含有ヘモグロビンの産生）
（工程１：期限切れの赤血球の調達）
期限切れのパック詰めの赤血球を、市販の供給源（例えば、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｂｌｏｏｄ ＢａｎｋまたはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ）から調達する。好ましくは、期限切れの材料は、回収時から４５日以下で受け取られる。パック詰めのＲＢＣ（ｐＲＢＣ）をさらなる処理まで（１〜７日間）４±２℃で保管する。全てのユニットを、ウイルス感染についてスクリーニングし、使用の前に核酸試験に供する。
【００７８】
（工程２：期限切れの血液のプール）
パック詰めの赤血球をクリーン施設の滅菌容器にプールする。パック詰めの赤血球の体積を記載し、そして市販の同時酸素濃度計または他の当業者に認識される方法を使用してヘモグロビン濃度を測定する。
【００７９】
（工程３：白血球枯渇（ｌｅｕｋｏｄｅｐｌｅｔｉｏｎ））
白血球枯渇（すなわち、白血球の除去）を、膜ろ過を用いて実施する。このプロセスの効率をモニタリングするために、開始および最終の白血球数を数える。
【００８０】
（工程４：細胞分離および細胞洗浄）
赤血球を、６倍容量の０．９％塩化ナトリウムで洗浄する。このプロセスは４±２℃で実施する。細胞洗浄物を、アルブミンについての分光光度的分析によって、血漿成分の除去を検証するために分析する。
【００８１】
（工程５：赤血球溶解および細胞細片の除去）
洗浄した赤血球を、６倍容量の水を用いて攪拌しながら少なくとも４時間または一晩、４±２℃で溶解する。溶解物を、冷却した状態で処理してヘモグロビンを精製する。これは、溶解物を０．１６μｍ膜に通す処理によって達成する。精製したヘモグロビンは、加熱滅菌容器（ｓｔｅｒｉｌｅ ｄｅｐｙｒｏｇｅｎｅｔａｅｄ ｖｅｓｓｅｌ）に回収する。この処理における全工程を４±２℃で実施する。
【００８２】
（工程６：ウイルスの除去）
ウイルス除去を、４±２℃にて、限外濾過によって実施する。
【００８３】
（工程７：濃縮および溶媒交換）
溶解物および限外濾過から精製したヘモグロビンを、１０ｌＤ膜を用いて、乳酸リンゲル液（ＲＬ）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中に交換する。次いで、このヘモグロビンを、同じ膜を用いて１．１〜１．５ｍＭ（四量体）の最終濃度まで濃縮する。１０〜１２容量のＲＬまたはＰＢＳを、溶媒交換に使用する。この処理を４±２℃で実施する。ＲＬ中で調製した溶液のｐＨを、７．０〜７．６に調整する。
【００８４】
（工程８：滅菌濾過）
ＰＢＳまたは乳酸リンゲル液（ＲＬ）中のヘモグロビンを、０．４５または０．２μｍの使い捨てフィルタカプセルに通して滅菌濾過し、化学改変反応を実施するまで４±２℃で保管する。
【００８５】
ヘモグロビンを精製する他の方法は、当該分野で周知である。さらに、細胞溶解後の自動酸化を防ぐための還元剤（例えば、グルタチオンまたは別のチオール含有還元剤）の使用は、通常不必要である。
【００８６】
（実施例２）
（支質非含有ヘモグロビンの改変）
（工程１：チオール化）
チオール化を、ヘモグロビンについて１０倍モル濃度の過剰なイミノチオラン（ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ）を使用して、４±２℃にて４時間、連続攪拌しながら実施する。
【００８７】
反応条件：
・ＲＬ（ｐＨ７．０〜７．５）またはＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、１ｍＭヘモグロビン（四量体）
・ＲＬ（ｐＨ７．０〜７．５）またはＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、１０ｍＭイミノチオラン
１：１０ ＳＦＨ：イミノチオランの比率および反応時間を、ＰＥＧ化チオール基の数を最大にし、かつ異成分の生産を最小にするように最適化した。
【００８８】
（工程２：チオール化したヘモグロビンのＰＥＧ化）
チオール化したヘモグロビンを、開始の四量体ヘモグロビン濃度に基づいて２０倍モル濃度の過剰なＭａｌ−ＰＥＧ（アルキルリンカーまたはフェニルリンカーを有する）を用いて、ＰＥＧ化する。ヘモグロビンを、まず、ヘモグロビンを酸化するための雰囲気で平衡化させる。この反応物を、連続攪拌しながら４±２℃で２時間置く。
【００８９】
反応条件：
・ＲＬまたはＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、１ｍＭチオール化ヘモグロビン
・ＲＬまたはＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、２０ｍＭ Ｍａｌ−ＰＥＧ。
【００９０】
（工程３：未反応の試薬の除去）
ＰＥＧ化−Ｈｂを、７０ｋＤ膜を通して処理し、過剰な未反応の試薬またはヘモグロビンを除去する。２０−容量の濾過を、未反応の試薬の除去を確実にするために実施し、サイズ排除クロマトグラフィーによってモニタリング（５４０ｎｍおよび２８０ｎｍ）する。このタンパク質濃度を、４ｇ／ｄｌに希釈する。ｐＨは、１Ｎ ＮａＯＨを用いて７．３〜０．３に調整する。
【００９１】
（工程４：滅菌濾過）
最終ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂ生成物を、０．２μｍ無菌ディスポーザブルカプセルを用いて無菌濾過し、４±２℃で加熱滅菌容器（ｓｔｅｒｉｌｅ ｄｅｐｙｒｏｇｅｎａｔｅｄ ｖｅｓｓｅｌ）に回収した。
【００９２】
（工程５：ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂの形成）
ＰＥＧ化したＨｂを４ｇ／ｄｌ ＲＩに希釈し、ｐＨを７．４±０．２に調整した。
【００９３】
（工程６：無菌充填）
最終代用血液組成物を無菌濾過（０．２μｍ）し、無菌ガラスバイアルに重量で分取し、層流フード内で捲縮シールを備える無菌ゴム栓で封じ、そして、使用まで−８０℃で保存した。
【００９４】
（実施例３）
（ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂの生理化学分析）
（生理化学分析の方法論）
ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂ代用血液の同質性および分子サイズは、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）により特徴付けられる。分析用ＬＣを使用して、ＰＥＧ化ヘモグロビンの同質性および未反応のＭａｌ−ＰＥＧの除去程度を評価する。５４０ｎｍでの吸光度を使用して、ヘモグロビンを評価し、ピーク位置により未反応のヘモグロビンからＰＥＧ化ヘモグロビンを分離する。２８０ｎｍでの吸光度を使用して、遊離Ｍａｌ−ＰＥＧからＰＥＧ化ヘモグロビンを分離する。この遊離Ｍａｌ−ＰＥＧは、ＭａｌＰＥＧの環状構造に起因して紫外（ＵＶ）スペクトルで吸収する。
【００９５】
高速走査ダイオードアレイ分光光度計（Ｍｉｌｔｏｎ Ｒｏｙ ２０００またはＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ Ｍｏｄｅｌ ８４５３）を使用して、ヘモグロビン濃度およびメトヘモグロビンの割合の分析（多成分性分析による）のために、ソレー帯および可視領域の可視スペクトルを回収する（Ｖａｎｄｅｇｒｉｆｆ，Ｋ．Ｄ．，およびＲ．Ｅ．，Ｓｈｒａｇｅｒ。Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｘｙｇｅｎ ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ
ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｂｙ ｒａｐｉｄ−ｓｃａｎｎｉｎｇ
ｓｐｃｅｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｓｉｎｇｕｌａｒ ｖａｌｕｅ ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２３２：４６０−４８５（１９９４））。
【００９６】
同時酸素濃度計を使用して、ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂ濃度およびメトヘモグロビンの割合を決定する。レオメーターを使用して粘度を決定する。膠質浸透圧計を使用して膠質浸透圧を決定する。酸素結合パラメータを酸素平衡曲線から決定する。
【００９７】
代用血液組成物のための好ましい規格を以下の表１に示す：
【００９８】
【表１】
（ＭａｌＰＥＧ−ＨｂにおけるＰＥＧ化部位の数）
表面改変について、式Ｉの数「ｍ」は、ヘモグロビン表面に結合するＰＥＧポリマーの数を規定するパラメータである。
Ｈｂ−（Ｓ−Ｙ−Ｒ−ＣＨ２−ＣＨ２−［Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２］ｎ−Ｏ−ＣＨ３）ｍ 式Ｉ
この数を決定するために、ジチオピリジン比色定量アッセイ（Ａｍｐｕｌｓｋｉ，Ｒ．，Ｖ．ＡｙｅｒｓおよびＳ．Ｍｏｒｅｌｌ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ
ｒｅａｃｔｉｖｅ ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ ｈｅｍｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ４，４’−ｄｉｐｙｒｉｄｉｎｅｓｄｉｓｕｌｄｅ．Ｂｉｏｃｈｅｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １６３−１６９，１９６９）を使用して、チオール化の前後、次いで、Ｈｂの再度のＰＥＧ化の後に、Ｈｂ四量体の表面の利用可能なチオール基の数を測定する。ヒトヘモグロビンは、２つの内因性の反応性チオール基をβ９３Ｃｙｓ残基に含み、この反応性チオール基は、ジチオピリジン反応によって確認される。１：１０ ＳＦＨ：イミンチオラン（ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ）の比でのＳＦＨのチオール化の後、ジチオピリジン反応による反応性チオール基の数は２チオールから６チオールに増加する。ＰＥＧ化反応の後、反応性チオール基の数は、１．３に減少する。このことは、ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂに４〜５のＰＥＧ化部位が存在することを示す。
【００９９】
（ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂ対ＳＦＨのサイズ排除クロマトグラフィー分析）
最終ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂ生成物の分析のためにＦＰＬＣを実施する。未改変のＳＦＨと比較したＭａｌＰＥＧ−Ｈｂについての代表的なクロマトグラムを図１に示す。ＳＦＨに対する保持時間は約５７分である。ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂに対する保持時間は約４４分である。
【０１００】
（ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂの物理的性質および化学的性質）
血液および未改変のヒトヘモグロビン（ＳＦＨ）と比較したＭａｌＰＥＧ−Ｈｂの物理的性質を以下の表２に示す。
【０１０１】
【表２】
１全血について１５ｇ／ｄｌおよびヘモグロビン溶液について約４ｇ／ｄｌで決定した。２ＣＯＰ測定およびＦＰＬＣにより決定した。
【０１０２】
（酸素親和性）
ヘモグロビン−酸素平衡結合曲線を、酵素的酸素消費の間に測定した（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５６：１０７−１１６，１９９８）。ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂは、高い酸素親和性（Ｐ５０＝５ｍｍＨｇ）および低い協同性（ｎ５０＝１．０〜１．４）を示す。図２は、支質非含有ヘモグロビン（ＳＦＨ）溶液とＭａｌＰＥＧ−Ｈｂ溶液を比較する代表的な曲線を示す。
【０１０３】
（粘度）
ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂのこの溶液特性は、ポリエチレングリコール鎖と溶媒の水分子との間の強い相互作用に起因する。このことは、以下の２つの理由から代用血液のための重要な特性であると考えられる：１）より高い粘度が溶媒を介して拡散するＰＥＧ−Ｈｂ分子とガス状のリガンド分子の両方の拡散定数を減少させ、そして２）より高い粘度が内皮壁に向って流れる溶液のずり応力を増加させ、血管狭窄に対抗するために血管拡張因子の放出を誘発する。表２に示すように、ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂ溶液の粘度は２．５ｃＰｓである。
【０１０４】
（膠質浸透圧（ＣＯＰ））
未改変の分子内架橋ヘモグロビンおよび分子間架橋ヘモグロビンまたはＰＥＧ−表面−結合体化ヘモグロビンを含有するヘモグロビン溶液のＣＯＰを測定して、その高分子溶液特性を決定した（Ｖａｎｄｅｇｒｉｆｆ，Ｋ．Ｄ．，Ｒ．Ｊ．ＲｏｈｌｆｓおよびＲ．Ｍ．Ｗｉｓｌｏｗ．Ｃｏｌｌｏｉｄ ｏｓｍｏｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ−ｂａｓｅｄ ｏｘｙｇｅｎ ｃａｒｒｉｅｒｓ．Ｗｉｎｓｌｏｗ，Ｒ．Ｍ．，Ｋ．Ｄ．ＶａｎｄｅｇｒｉｆｆおよびＭ．Ｉｎｔａｇｌｉａ編、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｌｏｏｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ｂｏｓｔｏｎ，Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ，２０７−２３２頁（１９９７））。四量体ヘモグロビンは、理想溶液に近い挙動を示すが、ＰＥＧと結合体化されたヘモグロビンは、有意により高い膠質浸透活性を有し、非理想的な溶液を示す（Ｖａｎｄｅｇｒｉｆｆ，Ｋ．Ｄ．，Ｍ．Ｍｃａｒｔｈｙ，Ｒ．Ｊ．ＲｏｈｌｓおよびＲ．Ｍ．Ｗｉｎｓｌｏｗ．Ｃｏｌｌｏｉｄ ｏｓｍｏｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｓ：ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ ｖｅｒｓｕｓ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｓｕｒｆａｃｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．６９：２３−３０（１９９７））。表２に示すように、ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂ溶液のＣＯＰは５０である。
【０１０５】
（安定性）
ＰＥＧ−ヘモグロビンを含むヘモグロビン溶液の安定性を、自動酸化の速度を試験することによって決定した。室温において、ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂの自動酸化は、１０時間で、約５％ＭｅｔＨｂから５．５％ＭｅｔＨｂに増加した。従って、ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂの自動酸化速度は、０．０５％／時間であった。
【０１０６】
（実施例４：ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂの安定性）
この研究の目的は、例示的な貯蔵条件および取扱い条件のシミュレーションの間のＭａｌＰＥＧ−Ｈｂの安定性を決定することであった。取り扱いの三段階の間の安定性を評価した。段階Ｉは、製造施設での凍結保存から臨床現場に輸送される間の温度条件への移動を示した（凍結貯蔵研究）。段階ＩＩは、＋４℃で２４時間にわたるそのＭａｌＰＥＧ−Ｈｂの融解およびその後の４℃で５日間にわたる貯蔵を示した（冷蔵研究）。段階ＩＩＩは、＋４℃まで２４時間でのそのＭａｌＰＥＧ−Ｈｂの融解およびその後の患者に投与する前に数日間室温でのＭａｌＰＥＧ−Ｈｂの貯蔵を示した（室温研究）。
【０１０７】
（実験方法）
安定性を、そのＭａｌＰＥＧ−Ｈｂ試験材料の酸化の速度によって規定した。同時酸素濃度計（ＩＬ Ｃｏ−Ｏｘｉｍｅｔｒｙ ６８２、ＧＭＩ，Ｉｎｃ、Ｒａｍｓｅｙ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）を使用して、サンプル中のメトヘモグロビンの割合を測定した。プロトコルに従って、各時点で、二連で測定を行った。
【０１０８】
温度計または温度チャートレコーダーによって、温度をモニタリングした。凍結貯蔵研究は、−２１．０±３．０℃の温度範囲で行った。冷蔵研究を、＋４．０±０．２℃の温度範囲で行った。室温研究を、＋２１．０±１．０℃の温度範囲で行った。
【０１０９】
温度、総ヘモグロビン、および％メトヘモグロビンを、示された時点の各々で記録した。凍結研究および冷蔵研究において、測定を時間０（完全に解凍）、１時間後、および次いで、５日間にわたり２４時間ごとで行った。室温研究において、時間０（完全に解凍）およびその後１０時間にわたり１時間ごとに測定を行った。
【０１１０】
（結果）
ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂは、−２０℃での６日間の貯蔵の間に％メトヘモグロビンにおいて変化を示さなかった。同様に、ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂは、＋４℃での５日間の貯蔵の間に、％メトヘモグロビンにおいて変化を示さなかった。
【０１１１】
（実施例５）
（血流力学的安定性を促すＭａＩ−ＰＥＧの使用）
ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂを、上に記載されるように調製した。１０００ｍＬ乳酸リンゲル液の総容量に平衡化した、ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂの０ｍＬ（乳酸リンゲル液単独）、２００ｍＬ（「Ａ」）、４００ｍＬ（「Ｂ」）または６００ｍＬ（「Ｃ」）の投薬量を、脊髄麻酔誘導の前に、選択性の整形外科手術を受ける患者に投与した。この結果を、図４に示す。
【０１１２】
図５は、６００ｍＬ ＭａＩＰＥＧ Ｈｂを受容した患者のバイタルサインを示す。示されるように、血圧の上昇は、ベースラインの測定値と比較して観察されなかった。対照的に、検出可能であるが、わずかな血圧の増大が、２００ｍＬ ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂまたは４００ｍＬ ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂを受容した患者において観察された。
【０１１３】
低血圧事象をまた、患者においてモニタリングした。その結果を、表３において以下に示す：
【０１１４】
【表３】
示されるように、ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂを受容した患者は、プラセボを受容した患者より少ない低血圧事象を示した。
【０１１５】
（実施例６）
（外科手術の間に血流力学的安定性を増強するためのＭａｌＰＥＧ−Ｈｂの使用の拡大した臨床研究）
ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂは、先に、健康なボランティアにおける第１相試験において試験されており、有意な有害事象を生じず、そしてまた、支質非含有Ｈｂと比較して減少した血管作用活性を示す非臨床研究と一致した。特に、心血管の疾患を有する高齢患者において低血圧事象として測定される血流力学的不安定性（例えば、心血管事象）は、外科手術を受けるこのような患者に対して問題である。多数の文献は、このような低血圧が、有意な手術後の罹患率を生じ得る、脳、心臓および腎臓における虚血をもたらすという仮説を支持する。これらの有害事象の効果からこのような外科手術患者を保護するためのＨｂベースの酸素キャリア（ＨＢＯＣ）の開発が、この実験の焦点である。
【０１１６】
ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂ（２５０ｍＬまたは５００ｍＬ）群、および酢酸リンゲル液単独を受容するコントロール群の無作為化二重盲検研究を、６つの異なる病院にてそれぞれ３０人の患者の群で実施した。同意患者は、一次的な侵襲的な外科手術（主に、人工股関節置換術）を受けた。投薬は、脊髄麻酔の誘導前に生じた。安全評価は、バイタルサインおよびＨｏｌｔｅｒモニタリング（注入から２４時間まで）、ならびに臨床化学、凝固、血液学、および体液平衡を含む。９０ｍｍＨｇ未満またはベースライン値の７５％未満の収縮期血圧として定量的に定義される低血圧の出現は、効力の一次的なエンドポイントであった。効力の別の基準は、下でより完全に記載される通り、血圧および体液平衡を安定化するための薬理学的介入についての必要性であった。
【０１１７】
（研究集団）
この実験において研究した患者の大部分は、変形性関節症を有する患者における選択性の一次的な人工股関節置換術である外科的手順を受けていた。しかし、多くの急性骨折をまた、研究し、そして少数の二次的な置換を研究した。算入および除外の判定基準を、表４に示す。
【０１１８】
【表４】
（無作為化および盲検（ｂｌｉｎｄｉｎｇ））
番号付けした各患者に割り当てられた処置は、コンピューターで作成し、連続して番号付けした無作為化コードの一覧表に従って決定した。処置群を、以下のように指定した：Ａ、２５０ｍＬのＭａｌＰＥＧ−Ｈｂ；Ｂ、５００ｍＬのＭａｌＰＥＧ−Ｈｂ；（ＡおよびＢは、「試験群」を表す）およびＣ、酢酸リンゲル液（「プラセボ群」を表す）（各群に対して全投与容量を用い、この投与用量は投与の前に同じ総投与容量に調整された）。ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂが、赤色であり、そしてプラセボが、透明である場合、試みはまた、患者および「事情を知らない（ｂｌｉｎｄｅｄ）」職員に、注入される溶液が分からないように行なった（すなわち、この研究を、伝統的な「二重盲検された」様式で行なった）。
【０１１９】
（材料）
ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂを、本質的に、いくつかの少数のバリエーションを伴って、実施例１〜実施例３において上に記載したように調製した。投与の約２４時間前、ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂのボトルを、冷凍庫（−２０℃）から取り出し、そして徐々に解凍するために、室温においた。酢酸リンゲル液を、商業的供給源（Ｆｒｅｓｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）から入手した。
【０１２０】
（投与）
ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂまたはプラセボのいずれかを、確立した静脈ラインを通して、較正した容量測定注入ポンプによって投与した。１０００ｍＬの総容量のＭａｌＰＥＧ−Ｈｂおよび／または酢酸リンゲル液を、注入の終了後３０分以内に行なわれる麻酔が誘導される前に、盲検の目的のために注入した。
【０１２１】
試験組成物溶液またはプラセボ溶液の注入は、患者の通常の看護に影響しなかった。試験溶液またはプラセボ溶液のいずれかを受容する患者はまた、その患者の健康のために必要であると判断される任意のさらなる処置を受容した。全ての医学的手順および処置を、その診療所の標準的な看護に従って行なった。研究開始において進行中であった全ての継続的な薬剤の投与、およびこの研究の間に与えられる併用する薬剤を、記録し、そして結果の解釈において考慮した。
【０１２２】
（薬物動態の測定および可変性）
ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂの脈管内における存続および脈管内の産物の安定性を、注入前、注入の終了時、注入の６時間後、注入後１日目、２日目および３日目ならびに７〜１０日目の、血漿ヘモグロビンレベルおよび血漿メトヘモグロビンレベルから決定した。これらの研究の結果は、異常なものではなく、そして本明細書中で報告しない。
【０１２３】
（サンプルの回収および分析）
血液サンプルを、サンプル採取の間の溶血を最小限にする慣用的な方法を使用して、引き抜き、そして血漿からの血液サンプルの分離を保証するように処理した。ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂを含む血液サンプルの血漿部分が、赤色であった場合、サンプルの処理のために、「事情を知っている（ｕｎｂｌｅｎｄｅｄ）」技術者によって行なわれることが、必要であった。サンプルの分析を、「暗号が破られる（ｃｏｄｅ ｂｒｅａｋｉｎｇ）」前に行なった。従って、その分析を行なう研究室を、適切に分からないようにした。
【０１２４】
（効力の測定値および可変性）
血流力学的安定性を増強するための例示的なＨＢＯＣとしてのＭａｌＰＥＧ−Ｈｂの有効性を、以下のエンドポイントを使用して研究した：
（Ａ．低血圧のエピソード）
ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂ／プラセボの注入後における低血圧のエピソードの数を、収縮期血圧（ＳＢＰ）＜９０ｍｍＨｇまたは注入前と比較して、ＳＢＰにおける＞２５％の降下として定義した。その定義を満たすＳＢＰのそれぞれの登録を、１つの低血圧のエピソードとして計測した。
【０１２５】
（Ｂ．総水分摂取量および総水分排出量（体液平衡））
測定を、外科手術の当日（注入の開始〜注入開始の２４時間後）ならびに手術後１日目、２日目および３日目に行なった。摂取量は、以下を含む：注入した流体（ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂ／プラセボ、膠質および晶質）、輸血および流体の経口摂取量。排出量は、以下を含む：尿、および外科手術の間の推定された失血。
【０１２６】
静脈内の流体の型および量を、記録した（データ示さず）。晶質注入物および膠質注入物の総量は、３つの群の間で、入院期間全体について統計学的に異ならなかった。しかし、差が、術中の期間において生じた。群Ａは、群Ｂ（１２９９±１８３ｍＬ）および群Ｃ（１２８１±１４４ｍＬ）と比較して、有意に少ない晶質（９１３±１０６ｍＬ）を受容した（Ｐ＜０．０５）。さらに、ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂを投与された膠質の量に含めた場合、群Ｂは、群Ａ（８５０±６６ｍＬ）または群Ｃ（６６６±６９ｍＬ）と比較して、有意に多い合計の晶質（１３８９±１６９ｍＬ）を受容した。両方の差（Ｂ対ＣおよびＡ対Ｂ）は、統計学的に有意であった（Ｐ＜０．０５）。残りの研究については、晶質、膠質または合計の静脈内の流体投与に有意な差は、存在しなかった。
【０１２７】
（Ｃ．心臓の障害）
血流力学的不安定性の測定としての心臓の障害の数および型（頻拍、虚血、徐脈および伝導の問題）は、事情を知らない心臓病専門医によって評価された。心臓のリズムの障害を、継続的なＨｏｌｔｅｒモニタリングおよびＥＣＧを使用して記録した。
【０１２８】
（Ｄ．薬理学的介入）
心臓血管を支援するための薬理学的介入（例えば、血圧の薬物、利尿剤）の数および用量をまた、麻酔の誘導から注入の開始後１２時間まで記録した。
【０１２９】
（Ｅ．輸血）
外科手術の間（麻酔の誘導から外科手術の終了およびその後）に投与された輸血（パックされた赤血球の体積）をまた、記録した。
【０１３０】
（Ｆ．酸素利用）
手術後に追加した酸素投与の持続期間を、外科手術の当日およびその後数日間記録した。
【０１３１】
（結果）
有害事象として発現される低血圧性の不安定性（例えば、低血圧のエピソード、および昇圧剤の投与に対する必要性）を、下の表５に示す。低血圧事象の％について得られた結果をまた、図６に示す。
【０１３２】
【表５】
上記の実施例は、組成物の好ましい実施形態の作製および使用の方法の完全な開示および記載を当業者に与えるために提供されるのであって、本発明者らが、彼らが発明として考えるものの範囲を限定することを意図するのではない。当業者に明らかな、本発明を実施するための上記の態様の改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。本明細書中で引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、各々のこのような刊行物、特許または特許出願が具体的にかつ個々に本明細書中に参考として援用されることが示されるかのように、本明細書中に参考として援用される。
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、ヘモグロビンベースの酸素キャリアを含有する組成物を投与することによって、外科手術を受ける個体の血流力学的安定性を増強するための方法に関する。１つの実施形態において、本発明は、外科手術の間の血流力学的安定性に関連した合併症を回避するための予防措置として酸素の解放を増強するための、減少した協同性および高い酸素親和性を有するポリアルキレンオキシド改変されたヘモグロビンの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
血液は、組織に栄養分を送達し、組織からの廃棄物を除去するための手段である。血液は、赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）（ＲＢＣまたは赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ））、白血球（ＷＢＣ）、および血小板が懸濁している血漿からなる。赤血球は、血液中で細胞の約９９％を構成し、それらの主な機能は、酸素を組織に輸送し、組織からの二酸化炭素を除去することである。
【０００３】
左心室は、動脈および循環系のより小さい動脈を通して血液をポンピングする。次いで、血液は、毛細管に入り、ここで、酸素の送達、栄養分の交換および細胞の廃棄物の抽出の大半が起きる（例えば、非特許文献１を参照のこと）。その後、血液は、右心房に血液を戻すのに、細静脈および静脈を通って移動する。心臓に戻る血液は、心臓からポンピングされる血液と比較して、酸素量が乏しいが、安静状態である場合、戻ってくる血液はなお、本来の酸素含量の約７５％を含んでいる。
【０００４】
ＲＢＣの可逆性酸素付加機能（すなわち、酸素の送達）は、タンパク質ヘモグロビンによって行われる。哺乳動物において、ヘモグロビンは、約６４，０００ダルトンの分子量（ＭＷ）を有し、約６％のヘムと９４％グロビンとから構成される。そのネイティブの形態において、ヘモグロビンは、２対のサブユニット（すなわち、四量体）を含み、各々が、ヘム基およびグロビンポリペプチド鎖を含む。水溶液中で、ヘモグロビンは、四量体形態（ＭＷ ６４，０００ダルトン）と二量体形態（ＭＷ ３２，０００ダルトン）との間で平衡状態で存在しており；ＲＢＣを除いて、その二量体は、腎臓によって早期（約２〜４時間の血漿半減期）に排出される。ヘモグロビンとともに、ＲＢＣは、支質（ＲＢＣ膜）を含み、この支質は、タンパク質、コレステロール、およびリン脂質を含む。
【０００５】
病院および他の設備における血液製剤の需要に起因して、代用血液の開発における広範な研究が指向されている。「代用血液」は、酸素を組織に運搬および供給し得る血液製剤である。ヘモグロビンベースの酸素キャリア（ＨＢＯＣ）は、ヘモグロビンを含む代用血液である。ＨＢＯＣは、多数の用途を有する。これらの用途としては、外科手順の間およびその後の急性出血により損失される血液の交換、ならびに外傷性損傷後の蘇生手順のための用途が挙げられる。本質的には、ＨＢＯＣは、これらの目的または保存血液を容易に患者に投与する任意の目的のために使用され得る（例えば、Ｂｏｎｓｏｎらに対する特許文献１およびＭｏｒｒｉｓに対する特許文献２を参照のこと）。
【０００６】
ＨＢＯＣの開発は、現在のヒトの血液供給が限られることを踏まえると、特に重要である。この理由のために、ヒトの血液は、通常、医学的に必要である状況においてのみ使用される。これは、通常、ヒトの血液が予防的使用（例えば、「血液ドーピング（ｂｌｏｏｄ ｄｏｐｉｎｇ）」（すなわち、血液の酸素運搬能力を増大させることによって血液の性能を増強する目的のために全血を投与すること）に適切でないことを意味する。したがって、予防的適応のための全血およびＨＢＯＣの使用は両方とも、広く普及しておらず、そしてほとんどの場合、若干問題のある実施と見なされる。
【０００７】
外科手術前の患者に対するＨＢＯＣの投与は、必要な場合、その手順の後期か、または外科手術後に患者に戻され得る患者からの自家血液の取り出し（すなわち、希釈式自己血輸血または「ＡＮＨ」）との組み合わせにおいて提案されてきた。例えば、特許文献３を参照のこと。このような患者は、本明細書中において、外科手術時に「正常血液量」であると見なされない。しかし、この手順は、外科的手順の不利な初頭効果を回避（例えば、血流力学的安定性）する予防措置に対する必要性を扱わず、外科手術に関連した失血の副次的効果を扱うのみである。
【０００８】
全身麻酔を必要とする外科手術の間に血流力学的安定性を増強することは、２つの基本的な理由から重要である。第１に、失血または他の因子によって引き起こされる血流力学的不安定性は、組織の損傷、および死亡さえもたらし得る。例えば、出血性低血圧およびアナフィラキシーショックは、組織の酸素化の減少をもたらす著しい失血から生じる状態である。このような医学的状態を有する患者に関して、患者の血圧を安定化させること、および患者の循環系によって身体組織に提供される酸素の量を増加させることは、患者の生存のために望ましく、そして多くの場合、患者の生存のために重要である。
第２に、そして最も重要なことには、軽微かつ一時的でさえ、血流力学的不安定性は、手術後の患者の回復に影響し得る。この不安定性は、身体全体の任意の場所で起こり得、そして、しばしば、血圧の低下として通常は記録される「低血圧事象」として発現される。このような事象は、全身麻酔の間（血液の損失がない場合でさえ）の局在化した血流力学特性の変動の結果として起こり得る。これらの事象は、外科手術後の回復に悪影響を及ぼす認知の障害および他の合併症を引き起こし得る。例えば、侵襲的な外科的手順（例えば、人工股関節置換術）を受ける高齢患者は、外科手術の間に患者の血流力学的安定性を増強する任意の予防的処置によって利益を受ける。さらに、このような患者は、多くの場合、ＡＮＨに適した候補者ではなく、そしてそれらの患者血流力学的安定性を増強することは、ドナー血液を使用する輸血に対する必要性を減少させると予想される。
血漿増量剤の使用および血流力学的安定性を維持するための容量負荷（ｖｏｌｕｍｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）が、広く普及している。しかし、これらの非酸素運搬溶液は、付随するＡＮＨを伴わない場合でさえ、血液の酸素能力を希釈するだけであり、そしていくつかの場合において、実際に血流力学的不安定性を引き起こし得る。血漿増量剤および容量負荷に加えて、晶質溶液が、血流力学的安定性の維持における使用について提案されている。しかし、これらの溶液の投与は、過剰な水分貯留および浮腫を生じ得、これらもまた、血流力学特性の変動を引き起こし得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第４，００１，４０１号明細書
【特許文献２】米国特許第４，０６１，７３６号明細書
【特許文献３】国際公開第９８／３７９０９号パンフレット
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ａ．Ｃ．Ｇｕｙｔｏｎ、「Ｈｕｍａｎ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ Ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ」、第３版、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．、１９８２年、ｐ．２２８−２２９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、血液の固有の酸素運搬能力を消失しない一過性の低血圧事象を生じ得る、血流力学的安定性を増強する方法に対する必要性が、存在する。この目的に従って、本発明は、ヘモグロビンベースの酸素キャリア（例えば、特別に処方されるポリアルキレンオキシド改変されたヘモグロビン）を含有する組成物を投与することによって血流力学的安定性を増強する方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
本発明は、外科手術を受ける正常血液量の被験体の血流力学的安定性を増強するための処置における、組成物の使用に関する。１つの実施形態において、本発明は、外科手術を受ける正常血液量の被験体の血流力学的安定性を増強するための方法であって、ａ）上記外科手術に伴って、全血より高い酸素親和性を有するヘモグロビンベースの酸素キャリア（ＨＢＯＣ）を含む組成物を上記被験体に投与する工程；およびｂ）上記患者の血流力学的安定性をモニタリングする工程を包含する方法に関する。このような投与は、外科手術の前、外科手術の間、または外科手術の後に生じても、それらの任意の組み合わせで生じてもよい。さらに、上記血流力学的安定性は、外科手術の前、外科手術の間、または外科手術の後に測定されても、それらの任意の組み合わせで測定されてもよい。さらに、上記患者の血流力学的安定性のモニタリングは、多くの形態（例えば、患者の血圧のモニタリング）をとり得る。１つの実施形態において、血流力学的安定性は、９０ｍｍＨｇを上回って維持する収縮期血圧によって特徴付けられる。
【００１３】
本発明のＨＢＯＣは、多くの形態（例えば、ポリアルキレンオキシド改変された、天然または合成の供給源（組換えの供給源が挙げられる）から得られ得るヘモグロビン）をとり得る。さらに、ヘモグロビンの供給源は、ヒト、または他のヒトではない動物由来であり得る。
【００１４】
本発明の別の実施形態において、上記ＨＢＯＣは、全血の酸素親和性の２倍より大きい酸素親和性を有し、上記ＨＢＯＣとしては、４〜１５の間のＰ５０を有するＨＢＯＣが挙げられ得る。
【００１５】
別の局面において、本発明は、外科手術を受ける正常血液量の被験体の血流力学的安定性を増強するための医薬の製造におけるヘモグロビンベースの酸素キャリア（ＨＢＯＣ）の使用を包含し、上記ＨＢＯＣは、全血より大きい酸素親和性を有する。このような使用は、外科手術に関連した血流力学的不安定性を回避するための予防措置としての酸素の解放（ｏｘｙｇｅｎ ｏｆｆｌｏａｄｉｎｇ）の増強をさらに含み得る。上記ＨＢＯＣの特徴および上記医薬の投与は、例えば、上に記載される通りである。
【００１６】
本発明の他の局面は、本明細書全体を通じて記載される。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
外科手術を受ける正常血液量の被験体の血流力学的安定性を増強するための方法であって、以下：
ａ）該外科手術に伴って、全血より高い酸素親和性を有するヘモグロビンベースの酸素キャリア（ＨＢＯＣ）を含む組成物を該被験体に投与する工程；および
ｂ）該患者の血流力学的安定性をモニタリングする工程
を包含する、方法。
（項目２）
前記組成物は、外科手術の前に投与される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記組成物は、外科手術の間に投与される、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記組成物は、外科手術の後に投与される、項目１に記載の方法。
（項目５）
工程ｂ）は、外科手術の前に実施される、項目１に記載の方法。
（項目６）
工程ｂ）は、外科手術の間に実施される、項目１に記載の方法。
（項目７）
工程ｂ）は、外科手術の後に実施される、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記ＨＢＯＣは、ポリアルキレンオキシド改変された天然のヘモグロビンをさらに含有する、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記ＨＢＯＣは、ポリアルキレンオキシド改変された合成のヘモグロビンをさらに含有する、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記ＨＢＯＣは、組換えヘモグロビンをさらに含有する、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記ＨＢＯＣは、ヒトヘモグロビンをさらに含有する、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記ＨＢＯＣは、ヒトではない動物から得たヒトヘモグロビンをさらに含有する、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記ＨＢＯＣは、全血の酸素親和性の２倍より大きい酸素親和性を有する、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記ＨＢＯＣは、４と１５との間のＰ５０を有する、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記ＨＢＯＣは、マレイミジル活性型ポリエチレングリコールの共有結合によって改変されたヘモグロビンをさらに含有する、項目１に記載の方法。
（項目１６）
工程ｂ）は、前記被験体の血圧をモニタリングする工程を包含する、項目１に記載の方法。
（項目１７）
血流力学的な安定化は、９０ｍｍＨｇを上回る収縮期血圧を維持する前記被験体によって特徴付けられる、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
外科手術を受ける正常血液量の被験体の血流力学的安定性を増強するための医薬の製造におけるヘモグロビンベースの酸素キャリア（ＨＢＯＣ）の使用であって、該ＨＢＯＣは、全血より大きい酸素親和性を有する、使用。
（項目１９）
外科手術に関連した血流力学的不安定性を回避するための予防措置としての酸素の解放の増強をさらに含む、項目１８に記載の使用。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂおよび支質非含有ヘモグロビン（ＳＦＨ）のＦＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図２】図２は、ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂ、ＳＦＨおよび全血についての酸素平衡曲線を示す。
【図３】図３は、種々の試験溶液の投与後における、ラットの生存率を示す。
【図４】図４は、ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂまたは乳酸リンゲル液を受容する患者の尿量を示す。
【図５】図５は、麻酔前にＭａｌＰＥＧ−Ｈｂを受容する患者のバイタルサインを示す。
【図６】図６は、ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂまたはプラセボを受容し、外科手術の間に低血圧事象を示す患者の％を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ヘモグロビンベースの酸素キャリアを含有する組成物を投与することによって、外科手術を受ける個体の血流力学的安定性を増強するための方法に関する。１つの実施形態において、本発明は、外科手術の間の血流力学的安定性に関連した合併症を回避するための予防措置として酸素の解放を増強するための、減少した協同性および高い酸素親和性を有するポリアルキレンオキシド改変されたヘモグロビンの使用に関する。
後述の開示に記載される本発明の理解を深めるために、多くの用語が下記で定義されている。
【００１９】
（定義）
用語「ヘモグロビン」は、一般的に、酸素を運ぶ赤血球内に含まれるタンパク質をいう。各ヘモグロビン分子は、４つのサブユニットを有し（２つのα鎖および２つのβ鎖）、四量体構造で配列している。各サブユニットはまた、１つのヘム基を含み、ヘム基は、酸素と結合するイオン含有中心である。このように、各ヘモグロビン分子は、４つの酸素分子と結合し得る。
【００２０】
用語「改変ヘモグロビン」は、化学反応（例えば、分子内架橋および分子間架橋、遺伝子操作、重合、および／または他の化学基（例えば、ポリアルキレンオキシド、例えばポリエチレングリコール、または他の付加物（例えば、タンパク質、ペプチド、炭水化物、合成ポリマーなど）との結合によって変化したヘモグロビンを含むが、それらに制限されない。つまり、ヘモグロビンは、その構造または機能的特徴のいずれかが、そのネイティブな状態から変化され得る場合、「改変される」。本明細書中で使用される場合、用語「ヘモグロビン」それ自体は、ネイティブなヘモグロビン、未改変ヘモグロビン、および改変ヘモグロビンのいずれもいう。
【００２１】
用語「表面改変ヘモグロビン」は、化学基（例えば、デキストラン、またはポリアルキレンオキシド）が結合した（最も一般的には、共有結合）、上述のヘモグロビンをいうために使用され得る。用語「表面改変酸化型ヘモグロビン」は、それが表面改変される場合、「Ｒ」状態であるヘモグロビンをいう。
【００２２】
用語「支質非含有ヘモグロビン」は、全ての赤血球のメンバーが除去されたヘモグロビンをいう。
【００２３】
用語「メトヘモグロビン」は、第二鉄状態で鉄を含む酸化型ヘモグロビンをいい、酸素キャリアとして機能できない。
【００２４】
用語「ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂ」は、マレイミジル活性型ＰＥＧが結合体化されたヘモグロビンをいう。さらに、このようなＭａｌＰＥＧは、次の式によって説明され得る：
Ｈｂ−（Ｓ−Ｙ−Ｒ−ＣＨ２−ＣＨ２−［Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２］ｎ−Ｏ−ＣＨ３）ｍ 式Ｉ
ここで、Ｈｂは、四量体のヘモグロビンであり、Ｓは、表面チオール基であり、Ｙは、ＨｂとＭａｌ−ＰＥＧとの間のスクシンイミド共有結合であり、Ｒは、非存在であるか、アルキル、アミド、カルバミン酸塩またはフェニル基（生材料の供給源および化学合成の方法に依存して）であり、［Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２］ｎは、ＰＥＧポリマーの骨格を形成するオキシエチレン単位であり、ここで、ｎは、ポリマーの長さ（例えば、分子量＝５０００）を定義し、そしてＯ−ＣＨ３は、末端メトキシ基である。
【００２５】
用語「血漿増量剤（ｅｘｐａｎｄｅｒ）」は、血漿容量を増加させるために被験体に与えられ得る任意の溶液をいう。
【００２６】
用語「酸素運搬能力」または単に用語「酸素能力」は、酸素を運搬するための代用血液の能力をいうが、それが酸素を送達する効率と必ずしも相関しない。ヘモグロビン含有代用血液の酸素運搬能力は、一般的に、ヘモグロビ濃度から算出される。なぜなら、１グラムのヘモグロビンが１．３４ｍｌの酸素と結合することが知られているからである。このように、ヘモグロビン濃度（ｇ／ｄｌ）に１．３４を掛けると、酸素能力（ｍｌ／ｄｌ）が算出される。ヘモグロビン濃度は、任意の公知の方法（例えば、β−ヘモグロビンフォトメーター（ＨｅｍｏＣｕｅ，Ｉｎｃ．，Ａｎｇｅｌｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ））によって測定され得る。同様に、酸素能力は、例えば、燃料電池装置（例えば、Ｌｅｘ−Ｏ２−Ｃｏｎ；Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて、ヘモグロビンまたは血液のサンプルから放出される酸素の量によって測定される得る。
【００２７】
用語「酸素親和性」は、酸素キャリア（例えば、ヘモグロビン）が分子酸素と結合するアビディティーをいう。この特徴は、酸素分圧（Ｘ軸）と、ヘモグロビン分子の酸素飽和の程度（Ｙ軸）に関連する酸素平衡曲線によって定義される。この曲線の位置は、酸素キャリアが、酸素で半分飽和され、そして酸素親和性に逆相関するＰ５０値、酸素分圧によって示される。ここでＰ５０が低ければ、酸素親和性は高くなる。全血（および全血の組成物（例えば、赤血球およびヘモグロビン））、および任意の酸素キャリアの酸素親和性は、当業者の公知の種々の方法によって測定され得る（例えば、Ｗｉｎｓｌｏｗら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２（７）：２３１−３７（１９７７）を参照のこと）。酸素親和性はまた、市販のＨＥＭＯＸＴＭ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＴＣＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎｅｗ Ｈｏｐｅ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）を用いて決定され得る（例えば、ＶａｎｄｅｇｒｉｆｆおよびＳｈｒａｇｅｒ「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ｅｖｅｒｓｅら、編）２３２：４６０（１９９４）を参照のこと）。
【００２８】
用語「酸素運搬成分」は、体内の循環系に酸素を運搬することができ、そして組織に、その酸素の少なくとも一部分を送達することができる物質を広くいう。好ましい実施形態において、酸素運搬成分は、ネイティブなヘモグロビンまたは改変ヘモグロビンであり、「ヘモグロビンベースの酸素キャリア」または「ＨＢＯＣ」として本明細書中でもいわれている。
【００２９】
用語「血流力学的パラメータ」は、血液の圧力、流れ、および容積の状態を示す測定値を広くいい、血圧、心拍出量、右心房圧、左室拡張終期圧のような直接的な測定値、ならびに頻拍、虚血、徐脈、伝導の問題、体液平衡、体重、ＩＣＵ時間および腎機能の間接的な測定値が挙げられる。
【００３０】
用語「晶質」は、塩、糖、および緩衝液のような低分子（通常、１０Å未満）をいう。膠質と異なり、晶質は、いかなる腫脹活性成分も含まず、そしてその循環空間と間隙性空間との間で非常に素早く平衡化する。
【００３１】
用語「膠質」は、「晶質」とは対照的に、それらの大きさおよび電荷に依存して生物学的膜を越えて平衡化する高分子（通常は、１０Åより大きい）をいい、アルブミンおよびゼラチンのようなタンパク質、ならびにペンタスターチおよびヘタスターチのようなスターチが挙げられる。
【００３２】
用語「膠質浸透圧」は、膠質により付与され、膜を越えての体液平衡を平衡化する圧力をいう。
【００３３】
用語「自動酸化に対して安定」は、低い自動酸化率を維持するＨＢＯＣの能力をいう。ＨＢＯＣは、メトヘモグロビン／総ヘモグロビン比が、２４℃で１０時間後に２％を超えて増加しない場合、２４℃で安定であるとみなされる。例えば、自動酸化率が０．２ｈｒ−１である場合、そして、最初のメトヘモグロビンの割合が５％である場合、ＨＢＯＣは、この割合が７％を超えて増加しなかった場合に、室温で１０時間安定であるとみなされる。
【００３４】
用語「メトヘモグロビン／総ヘモグロビン比」は、酸化型ヘモグロビン対総ヘモグロビンの比をいう。
【００３５】
用語「混合物」は、個々の特性を失う反応を生じることなく、２つ以上の物質が一緒に入り混ざったものをいう。用語「溶液」は、液体混合物をいう。用語「水溶液」は、いくらかの水を含有し、水と共に１つ以上の他の液体物質も含有し、多成分溶液を形成し得る溶液をいう。用語「約」は、実際の値が一定の範囲内にあることをいう（例えば、示される値の１０％以内）。
【００３６】
用語「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」は、一般化学式Ｈ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ（ここで、ｎは、４以上である）の液体または固体ポリマー、およびその改変体（例えば、活性型、置換型、および/または非置換型のＰＥＧ）をいう。
【００３７】
用語「灌流」とは、動脈および毛細管を通した組織および器官への流体の流れをいう。
【００３８】
用語「血流力学的安定性」とは、循環の機構において安定に機能すること（すなわち、任意の血流力学的パラメータの所与の時間にわたる安定性）をいう。
【００３９】
用語「低血圧事象」は、限局性または全身性の低血圧（すなわち、血圧の低下）によって特徴付けられるか、またはそれに起因し、低血圧事象は、さらに、９０ｍｍＨｇ未満の収縮期血圧またはベースライン値の７５％を下回る血圧の減少として定量的に定義される。
【００４０】
本明細書中で使用される他の用語の意味は、当業者により容易に理解されるはずである。
【００４１】
（酸素送達および消費の性質）
本発明の組成物および方法の首尾良い使用は、酸素送達および消費の基礎的な機構の理解を必要としないが、これらの推定機構のいくつかに関する基本的な知見は、以下の議論を理解することを補助し得る。一般的に、毛細管は、組織への酸素の主要な運搬体であると推定されてきた。しかし、休止している組織に関して、現在の発見は、細動脈の酸素放出と毛細管の酸素放出との間にほぼ均等分配（ｅｑｕｉｐａｒｔｉｔｉｏｎ）が存在することを示す。すなわち、動脈系におけるヘモグロビンは、細動脈網におけるその酸素含有量の約１／３および毛細管における１／３を送達し、残りは静脈系を通じて微小循環を出ると考えられる。
【００４２】
動脈自体は、酸素利用部位である。例えば、動脈壁は、血管抵抗に対する収縮を通して血流を調節するのにエネルギーを必要とする。従って、動脈壁は通常、血液からの酸素の拡散のための重要な部位である。しかし、現在の酸素送達組成物（例えば、ＨＢＯＣ）は、動脈系においてそれらの酸素含有量の多くを放出しすぎ得、それによって、毛細管灌流における自己調節性の還元を誘導する。従って、代用血液の酸素送達の効率は、実際は、高すぎる酸素親和性または低すぎる酸素親和性を有することによって妨げられ得る。
【００４３】
血管壁による酸素消費の速度（すなわち、機械的作業に必要とされる酸素および生化学的合成に必要とされる酸素の組み合わせ）は、血管壁での勾配を測定することによって決定され得る。例えば、Ｗｉｎｓｌｏｗら、「Ａｄｖａｎｃｅ ｉｎ Ｂｌｏｏｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ」（１９９７）、Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ編、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、１６７〜１８８頁を参照のこと。現在の技術は、種々の血管における正確な酸素の部分圧の測定を可能にする。測定された勾配は、測定領域中の組織による酸素利用の率に直接的に比例する。このような測定は、血管壁が、基底線酸素利用を有し、これは炎症および絞窄における増加と共に増加し、そして弛緩により減少することを示す。
【００４４】
血管壁の勾配は、組織の酸化に反比例する。血管収縮は、酸素勾配（組織代謝）を増加させるが、血管拡張は、その勾配を低下させる。より高い勾配は、より多くの酸素が血管壁によって使用される一方で、より少ない酸素が組織に利用可能であるという事実を示す。同じ現象が微小循環を通じて全体にわたって存在すると考えられる。
【００４５】
（血管収縮と酸素親和性との間の関係）
高い酸素親和性を有するＨＢＯＣを開発するための原理は、一部、赤血球注入の代替として無細胞ヘモグロビンを用いた過去の研究に基づく。これらの溶液の生理学的効果のいくつかは、理解が不完全なままである。これらのうち、おそらく最大の論議は、動物および人間において高血圧として現れ得る血管収縮を引き起こす傾向である（Ａｍｂｅｒｓｏｎ，Ｗ．，「Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ−ｓａｌｉｎｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ」，Ｓｉｃｅｎｃｅ １０６：１１７−１１７（１９４７））（Ｋｅｉｐｅｒｔ，Ｐ．，Ａ．Ｇｏｎｚａｌｅｓ，Ｃ．Ｇｏｍｅｚ，Ｖ．Ｍａｃｄｏｎａｌｄ，Ｊ．Ｈｅｓｓ，およびＲ．Ｗｉｎｓｌｏｗ，「Ａｃｕｔｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｓｙｓｍｅｔｉｃ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ａｎｄ ｕｒｉｎｅ ｏｕｔｐｕｔ ｏｆ ｃｏｎｓｃｉｏｕｓ ｒａｔｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ｗｉｔｈ ｄｉａｓｐｉｒｉｎ−ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ」，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ３３：７０１−７０８（１９９３））。α鎖間でビス−ジブロモサリチル−フマレートを用いて架橋されたヒトヘモグロビン（ααＨｂ）は、モデル代用赤血球として米軍により開発されたが、肺および全身血管抵抗の重篤な増加が実証された後、米軍によって中止された（Ｈｅｓｓ，Ｊ．，Ｖ．Ｍａｃｄｏｎａｌｄ，Ａ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｖ．Ｃｏｐｐｅｓ，およびＣ．Ｇｏｍｅｚ，「Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ａｎｄ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｈｙｐｅｒｔｅｎｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ」，Ｂｌｏｏｄ ７８：３５６Ａ（１９９１））。この製品の市販版もまた、第ＩＩＩ相臨床試験が実現しなかった後に中止された（Ｗｉｎｓｌｏｗ，Ｒ．Ｍ．「αα−Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ：Ｗａｓ ｆａｉｌｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｂｙ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｅｓｔｉｎｇ？」，Ｖｏｘ ｓａｎｇ ７９：１−２０（２０００））。
【００４６】
無細胞ヘモグロビンにより生じる血管収縮についての最も一般的に前進した説明は、それが、内皮由来弛緩因子、一酸化窒素（ＮＯ）に容易に結合することである。実際、最高負荷ラット実験においてより低い高血圧性であるようである、ＮＯに対して減少した親和性を有する組み換えヘモグロビンが生成された（Ｄｏｈｅｒｔｙ，Ｄ．Ｈ．，Ｍ．Ｐ．Ｄｏｙｌｅ，Ｓ．Ｒ．Ｃｕｒｒｙ，Ｒ．Ｊ．Ｖａｌｉ，Ｔ．Ｊ．Ｆａｔｔｏｒ，Ｊ．Ｓ．Ｏｌｓｏｎ，およびＤ．Ｄ．Ｌｅｍｏｎ，「Ｒａｔｅ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ
ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｔｈｅ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ」，Ｎａｔｕｒｅ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：６７２−６７６（１９９８））（Ｌｅｍｏｎ，Ｄ．Ｄ．，Ｄ．Ｈ．Ｄｏｈｅｒｔｙ，Ｓ．Ｒ．Ｃｕｒｒｙ，Ａ．Ｊ．Ｍａｔｈｅｗｓ，Ｍ．Ｐ．Ｄｏｙｌｅ，Ｔ．Ｊ．Ｆａｔｔｏｒ，およびＪ．Ｓ．Ｏｌｓｏｎ，「Ｃｏｎｔｒｏｌ
ｏｆ ｔｈｅ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ−ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ
ｏｆ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ」，Ａｒｔ Ｃｅｌｌｓ，Ｂｌｏｏｄ Ｓｕｂｓ．，ａｎｄ Ｉｍｍｏｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈ ２４：３７８（１９９６））。
【００４７】
しかし、ＮＯ結合はヘモグロビンの血管作用性についての唯一の説明ではないかもしれないことを研究が示唆している。特定の大きなヘモグロビン分子（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で改変されたヘモグロビン分子）は、それらのＮＯ結合率が重篤な高血圧性のααＨｂと同一であるにもかかわらず、高血圧効果を実質的に有さないことが見出された（Ｒｏｈｌｆｓ，Ｒ．Ｊ．，Ｅ．Ｂｒｕｎｅｒ，Ａ．Ｃｈｉｕ，Ａ．Ｇｏｎｚａｌｅｓ，Ｍ．Ｌ．Ｇｏｎｚａｌｅｓ，Ｄ．Ｍａｇｄｅ，Ｍ．Ｄ．Ｍａｇｄｅ，Ｋ．Ｄ．Ｖａｎｄｅｇｒｉｆｆ，およびＲ．Ｍ．Ｗｉｎｓｌｏｗ，「Ａｒｔｅｒｉａｌ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ」，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７３：１２１２８−１２１３４（１９９８））。さらに、ＰＥＧ−ヘモグロビンが出血前の交換輸血として与えられた場合、出血の影響を防ぐのに並外れて効果的であることが見出された（Ｗｉｎｓｌｏｗ，Ｒ．Ｍ．，Ａ．Ｇｏｎｚａｌｅｓ，Ｍ．Ｇｏｎｚａｌｅｓ，Ｍ．Ｍａｇｄｅ，Ｍ．ＭｃＣａｒｔｈｙ，Ｒ．Ｊ．Ｒｏｈｌｆｓ，およびＫ．Ｄ．Ｖａｎｄｅｇｒｉｆｆ，「Ｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｒｅｄ ｃｅｌｌ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ」，Ｊ Ａｐｐｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ８５：９９３−１００３（１９９８））。
【００４８】
この保護効果は、高血圧の欠如と相関し、このことは、血管収縮が多くの今日までに研究されたヘモグロビンベースの産物の効能を消失させることを伴うことを示唆している。これらの観察に基づいて、ＮＯ結合の効果の代替として、またはおそらくそれに加えて、血管収縮を説明する仮説が展開された。任意の特定の学説に拘束されることを望まないが、ヘモグロビンの血管作用効果の実質的な要素は、無細胞空間におけるヘモグロビンの拡散に対する弛緩応答であると考えられる。この仮説は、インビトロ毛細管系において試験され、そして低下した拡散係数を有するＰＥＧ−ヘモグロビンが、ネイティブの赤血球と非常に類似した様式でＯ２を運搬したことが実証された（ＭｃＣａｒｔｈｙ，Ｍ．Ｒ．，Ｋ．Ｄ．Ｖａｎｄｅｇｒｉｆｆ，およびＲ．Ｍ．Ｗｉｎｓｌｏｗ，「Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｉｎ ｏｘｙｇｅｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｂｙ ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ：Ｉｍｐｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ−ｂａｓｅｄ ｏｘｙｇｅｎ ｃａｒｒｉｅｒｓ」，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ９２：１０３−１１７（２００１））。酸素親和性は、血漿空間におけるヘモグロビンによるその促進された拡散において役割を果たすと予想される。なぜならば、ヘモグロビンから血管壁への飽和状態の変化は、ヘモグロビン自体の拡散勾配の決定因子であるからである。
【００４９】
無細胞ヘモグロビンの酸素親和性は、血管緊張（ｖａｓｃｕｌａｒ ｔｏｎｅ）の調節においてさらなる役割を果たし得る。なぜなら、Ｏ２の細動脈中の血管壁に対する遊離は、血管収縮を誘発するからである（Ｌｉｎｄｂｏｍ，Ｌ．，Ｒ．ＴｕｍａおよびＫ．Ａｒｆｏｒｓ，「Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｏｘｙｇｅｎ ｏｎ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｄｅｎｓｉｔｙ ａｎｄ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｒｅｄ ｃｅｌｌ ｖｅｌｏｃｉｔｙ ｉｎ ｒａｂｂｉｔ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ」、Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ Ｒｅｓ １９：１９７−２０８（１９８０））。ハムスター皮下脂肪において、このような血管中のＰＯ２は、２０〜４０トルの範囲にあり、ここで、正常な赤血球酸素平衡曲線は、最も急勾配である（Ｉｎｔａｇｌｉｅｔｔａ，Ｍ．，Ｐ．ＪｏｈｎｓｏｎおよびＲ．Ｗｉｎｓｌｏｗ，「Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｏｘｙｇｅｎ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ」、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ ３２：６３２−６４３（１９９６））。従って、理論的観点から、細動脈調節性血管におけるＯ２の遊離を防止するために、無細胞ヘモグロビンのＰ５０が、赤血球のＰ５０より低い（すなわち、より高いＯ２親和性）ことが重要であり得る。
【００５０】
（酸素の解放）
酸素親和性に加えて、酸素結合特性それ自体（すなわち、協同性およびアロステリック効果）は、ＨＢＯＣの酸素の解放の性能において重要な役割を果たし得る。ヘモグロビンに結合するポリアルキレンは、グロビン構造の一般的な「締め付け（ｔｉｇｈｔｅｎｉｎｇ）」を生じることが、観察されている。これは、ヘモグロビンを取り囲む親水性のシェル（ｓｈｅｌｌ）を有する浸透圧効果に起因し、そしてポリアルキレンオキシドを結合するために使用される連結基の性質および位置に依存し得る。最も一般的な通念は、ＨＢＯＣの設計がネイティブなヘモグロビンの特徴を模倣するはずであるということである。しかし、ヘモグロビンの四次コンフォメーションの摂動が、特に、酸素の解放の状況において利点を有し得ることが、予期せず見出された。
【００５１】
タンパク質の特徴が、そのアロステリック部位においてエフェクター分子（すなわち、リガンド）に結合する結果として変化する場合、そのタンパク質は、「アロステリック」であると見なされる。ヘモグロビンの場合において、上記リガンドは、酸素である。ヘモグロビン四量体の各サブユニットは、１つの酸素分子に結合し得る。各サブユニットはまた、２つのコンフォメーションの緊張（Ｔ）または弛緩（Ｒ）の２つのうちの１つで存在する。Ｒ状態において、上記サブユニットは、Ｔ状態より容易に酸素を結合し得る。
【００５２】
ヘモグロビンは、酸素を結合する個々のサブユニットの間で、協調した効果または協同性を示す。１つのサブユニットに対する酸素の結合は、残りの活性部位が増強した酸素親和性を示すようにする、酸素が結合したサブユニットにおけるコンフォメーションの変化を誘導する。したがって、ヘモグロビン分子に結合するそれぞれの逐次的な酸素分子は、ヘモグロビン分子が、４個の結合した酸素分子を伴うＲ状態または「リガンドと結合した（ｌｉｇａｎｄｅｄ）」状態を達成するまで、その前の酸素分子より容易に結合する。
【００５３】
逆に、ネイティブなヘモグロビンは、酸素を放出するその効率に関して、協調した効果を示す。第１の分子は、より堅く結合され、そしてより多くのエネルギーを得て、「解放され（ｏｆｆｌｏａｄｅｄ）」、次いで次の分子が、解放されるなどである。したがって、ネイティブなヘモグロビンの協同性を模倣する代用血液の設計についての従来技術は、一旦結合した酸素を放出するその能力に対して不利に影響し得る。
【００５４】
本発明は、ネイティブなヘモグロビンより小さい（ネイティブなヘモグロビンより大きくない）協同性を有するがＨＢＯＣが、酸素の解放に関連する用途において、予想外に、より有用であるという知見に関する。したがって、血流力学的安定性の増強において使用するための組成物は、一旦上記組成物がその標的位置に到達した場合に、その酸素を容易に放出できなければならないが、血管収縮効果を回避するために、大きすぎる酸素放出能力を含むべきではない。要約すると、外科的手順に関連した予防的処置のための、血流力学的安定性を必然的に増強する理想的な組成物は、ネイティブなヘモグロビンより小さい協同性を有するが、全血と比較した場合にずっと高い酸素親和性（例えば、半分未満のＰ５０）を有する組成物中に処方される改変ヘモグロビンを含む。
【００５５】
（酸素運搬成分）
好ましい実施形態において、酸素キャリア（すなわち、酸素運搬成分）は、ヘモグロビンベースの酸素キャリア（すなわち、ＨＢＯＣ）である。ヘモグロビンは、ネイティブ（未改変）であり；続いて、化学反応（例えば、分子内架橋または分子間架橋、重合、または化学官能基（例えば、ポリアルキレンオキシド、または他の付加物）の付加）によって改変され得るか；またはヘモグロビンは、組換え操作され得る。ヒトα−グロビン遺伝子およびβ−グロビン遺伝子は、クローン化され、配列決定されている。Ｌｉｅｂｈａｂｅｒら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．７７：７０５４−７０５８（１９８０）；Ｍａｒｏｔｔａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３５３：５０４０−５０５３（１９７７）（β−グロビンｃＤＮＡ）。さらに、多くの組換え産生され改変されたヘモグロビンは、ここで、部位特異的変異誘発を使用して生成されたが、これらの「変異型」ヘモグロビン変種は、高い酸素親和性を有するとして報告された。例えば、Ｎａｇａｉら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，８２：７２５２−７２５５（１９８５）を参照のこと。
【００５６】
本発明の実施において使用されるＨＢＯＣは、通常の全血（必然的にヒトでない可能性がある被験体と同じ動物供給源由来）より高い酸素親和性を有し、この酸素親和性は、全血のＰ５０より低いＰ５０として表される。全血は、一般的に、２８トルに近いＰ５０を有すると見なされる。１つの実施形態において、本発明のＨＢＯＣは、全血のＰ５０の半分未満のＰ５０を有し、このことは、「高酸素親和性」であると見なされる。このような高酸素親和性のＨＢＯＣは、４〜１５（例えば、１０、７など）のＰ５０を有し得る。
【００５７】
本発明は、ヘモグロビンの供給源によって限定されない。例えば、ヘモグロビンは、動物およびヒトに由来し得る。特定の適用に対する好ましいヘモグロビンの供給源は、ヒト、ウシおよびブタ、ならびに哺乳動物ではない供給源（例えば、環形動物、爬虫類など）である。さらに、ヘモグロビンは、他の方法（化学合成および組換え技術を含む）によって産生され得る。ヘモグロビンは、遊離形態で血液製剤組成物に添加され得るか、または、小胞（例えば、合成粒子、マイクロバルーンまたはリポソーム）中にカプセル化され得る。本発明の好ましい酸素運搬成分は、支質非含有であり、そして内毒素非含有であるべきである。酸素運搬成分の代表的な例は、以下の多くの発行された米国特許に開示され、これらとしては、Ｈｓｉａに対する米国特許第４，８５７，６３６号；Ｗａｌｄｅｒに対する同第４，６００，５３１号；Ｍｏｒｒｉｓらに対する同第４，０６１，７３６号；Ｍａｚｕｒに対する同第３，９２５，３４４号；Ｔｙｅに対する同第４，５２９，７１９号；Ｓｃａｎｎｏｎに対する同第４，４７３，４９６号；Ｂｏｃｃｉらに対する同第４，５８４，１３０号；Ｋｌｕｇｅｒらに対する同第５，２５０，６６５号；Ｈｏｆｆｍａｎらに対する同第５，０２８，５８８号；ならびにＳｅｈｇａｌらに対する同第４，８２６，８１１号および同第５，１９４，５９０号が挙げられる。
【００５８】
前述のヘモグロビンの供給源に加えて、ウマヘモグロビンが、本発明の組成物中の酸素運搬成分として特定の利点を有することが最近見出された。１つの利点は、ウマヘモグロビンが精製され得る市販量のウマ血液が、容易に入手可能であるということである。別の予想外の利点は、ウマヘモグロビンが、本発明の代用血液において、その有用性を増強し得る化学的特性を示すことである。
【００５９】
以前の報告は、ウマヘモグロビンが、ヒトヘモグロビンより早くメトヘモグロビンに自動酸化することを示し、このことは、ウマヘモグロビンが、代用血液成分としてより所望されないものにする。例えば、Ｊ．Ｇ．ＭｃＬｅａｎおよびＩ．Ｍ．Ｌｅｗｉｓ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｖｅｔ．Ｓｃｉ．，１９：２５９−２６２（１９７５）を参照のこと。自動酸化を最小にするために、ＭｃＬｅａｎおよびＬｅｗｉｓは、赤血球溶解の後、還元剤（グルタチオン）を使用した。しかし、本発明の組成物を調製するために使用されるヘモグロビンは、ヘモグロビンの供給源がヒトであるかウマであるかに関わらず、赤血球溶解後の自動酸化を防止するために還元剤の使用を必要としない。
【００６０】
より最近、ウマヘモグロビンが、ヒトヘモグロビンと異なる酸素親和性を有することが報告された。例えば、Ｍ．Ｍｅｌｌｅｇｒｉｎｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６８：３３１３−３３２０（２００１）を参照のこと。このような差異は、ヒトヘモグロビンを模倣する代用血液を調製するためのウマヘモグロビンの選択を思いとどまらせる。しかし、本発明の組成物に組込む場合、ヒトヘモグロビン含有結合体とウマヘモグロビン含有結合体との間の酸素親和性に有意な差異は、観察されない（１０％未満）。従って、これらの表面上所望されない特性に反して、本発明の組成物において、ウマヘモグロビンは、ヒトヘモグロビンより優れない場合、等価である。
【００６１】
本発明における使用のために、ＨＢＯＣは、全血より優れた酸素親和性を有し、同じ条件下で測定された場合、好ましくは全血の２倍であり、あるいは、支質非含有ヘモグロビン（ＳＦＨ）より酸素親和性が大きい。ほとんどの場合において、これは、代用血液中でのＨＢＯＣが、１０未満のＰ５０を有し、より好ましくは７未満のＰ５０を有することを意味する。遊離状態において、ＳＦＨは、約１５トルのＰ５０を有し、その一方で、全血に対するＰ５０は、約２８トルである。酸素親和性を増大し、それによってＰ５０を低下することは、酸素の組織への送達を増大し得ることが以前に示唆されたが、ＳＦＨのＰ５０より小さなＰ５０が、許容されないことを意味した。Ｗｉｎｓｌｏｗら、「Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｌｏｏｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ」（１９９７），Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ編、Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，第１６７頁および米国特許第６，０５４，４２７号を参照のこと。この示唆は、代用血液としての使用のための改変ヘモグロビンが、より小さな酸素親和性を有するべきであり、全血のＰ５０に近いＰ５０を有するべきであるという広くもたれている確信と矛盾する。従って、多くの研究者は、リン酸ピリドキシルを使用して、ＳＦＨのＰ５０を、１０から約２０〜２２へと上げる。なぜなら、ピリドキシル化ヘモグロビンは、ＳＦＨと比べた場合、より容易に酸素を遊離するからである。
【００６２】
高い酸素親和性を有するＨＢＯＣ（すなわち、ＳＦＨより小さなＰ５０を有するＨＢＯＣ）を製造するために多くの異なる科学的アプローチが存在する。例えば、研究は、酸素親和性において役割を果たすアミノ酸残基（例えば、Ｂ−９３システイン）を同定し、それによって、部位特異的変異誘発が、ここで、酸素親和性を所望のレベルに操作するために容易に実施され得る。例えば、米国特許第５，６６１，１２４号を参照のこと。他の多くのアプローチは、米国特許第６，０５４，４２７号に議論される。
【００６３】
（ヘモグロビン関連毒性）
ヘモグロビンは、第１鉄形態（Ｆｅ２＋）から第２鉄形態（Ｆｅ３＋）（すなわち、メトヘモグロビン形態）に可逆的に変化する場合、自動酸化を示すことが公知である。これが生じる場合、分子酸素は、スーパーオキシドアニオン（Ｏ２−）の形態において、オキシヘモグロビンから解離する。これはまた、ヘム−グロビン複合体の不安定化を生じ、結果としてグロビン鎖の変性を生じる。酸素ラジカル形成およびタンパク質変性の両方は、ＨＢＯＣのインビボ毒性において役割を果たすと考えられる（Ｖａｎｄｅｇｒｉｆｆ，Ｋ．Ｄ．，Ｂｌｏｏｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｅｆｆｉｃａｃｙ，第１０５頁−第１３０頁，Ｗｉｎｓｌｏｗら編、Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ（１９９５））。
【００６４】
ほとんどのＨＢＯＳに関して、酸素親和性とヘモグロビン酸化との間に負の相関が存在し、すなわち、酸素親和性がより高いと、自動酸化の速度がより遅い。しかし、異なるヘモグロビン改変の、酸素親和性および自動酸化速度に対する効果は、いつも予測可能であるわけではない。さらに、酸素親和性と自動酸化速度との間の最適のバランスは、よく理解されてはいない。
【００６５】
１つの実施形態において、本発明の組成物は、室温において自動酸化の非常に低い速度を示すポリアルキレンオキシド−Ｈｂ結合体（例えば、ポリエチレングリコール−Ｈｂ結合体）を含む。酸化の速度として測定される場合、この値は、可能な限り低く（すなわち、１時間当たり全ヘモグロビンの０．２％）、より好ましくは、室温で少なくとも３時間の間、より好ましくは少なくとも１０時間の間、１時間当たり全ヘモグロビンの０．１％である。従って、本発明の例示的なＨＢＯＳは、投与および／または室温での保存の間安定である。
【００６６】
（酸素運搬成分の改変）
例示的な実施形態において、上記酸素運搬成分は、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）改変されたヘモグロビンである。適切なＰＡＯとしては、とりわけ、ポリアルキレンオキシド（例えば、ポリエチレンオキシド（（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ）、ポリプロピレンオキシド（（ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２Ｏ）ｎ）またはポリエチレン／ポリプロピレンオキシドコポリマー（（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−（ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２Ｏ）ｎ））が挙げられる。本発明の実施に適切な他の直鎖合成ポリマー、分枝鎖合成ポリマーおよび必要に応じて置換された合成ポリマーは、医学分野において周知である。
【００６７】
最も一般的には、ヘモグロビンに結合される化学的官能基は、その薬学的受容性および市販入手性に起因して、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧは、一般化学式Ｈ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨのポリマーであり、ここで、ｎは、一般に、４以上である。ＰＥＧ処方物は、通常、これらの平均分子量に対応する数を後に付ける。例えば、ＰＥＧ−２００は、２００の平均分子量を有し、そして１９０〜２１０の分子量範囲を有し得る。ＰＥＧは、多くの異なる形態で市販されており、多くの場合、前もって活性化されており、タンパク質に容易に結合体化される。
【００６８】
本発明の例示的な実施形態の重要な局面は、ヘモグロビンが、酸化された状態、すなわち「Ｒ」状態である場合に、表面改変が起こることである。これは、ヘモグロビンを結合体化の前に大気と平衡化させる（あるいは、活性酸化が実施され得る）ことによって容易に達成される。酸化されたヘモグロビンへの結合体化を実施することによって、得られたヘモグロビンの酸素親和性は、増大される。このような工程は、一般的に、禁忌としてみなされる。なぜなら、多くの研究者は、結合体化前の脱酸化が、酸素親和性を低下することを記載するからである。例えば、米国特許第５，２３４，９０３号を参照のこと。
【００６９】
多くの局面において、表面改変されたヘモグロビンの性能は、ヘモグロビンと改変因子（例えば、ＰＥＧ）との間の結合に非依存性であるが、リンカーの型（例えば、より剛性の、不飽和脂肪族または芳香族のＣ１〜Ｃ６リンカー置換基）は、まさに記載される剛性のリンカーと比較して付着のより変形可能な様式のような異なる連結を有する置換基と比較される場合に、結合体の製造および／または特徴を変化し得ると考えられる。
【００７０】
ヘモグロビン分子に付加されるＰＥＧの数は、そのＰＥＧのサイズに依存して変動し得る。しかし、得られる改変ヘモグロビンの分子サイズは、所望の半減期を達成するために、腎臓によって排除されることを回避するために十分な大きさであるべきである。Ｂｌｕｍｅｎｓｔｅｉｎらは、このサイズは、８４，０００ダルトンより大きい分子量に達すると決定した（Ｂｌｕｍｅｎｓｔｅｉｎら、「Ｂｌｏｏｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍａ Ｅｘｐａｎｄｅｒｓ」、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ編、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０５−２１２頁（１９７８））。この文献において、この著者は、ヘモグロビンを、種々の分子量のデキストランに結合体化させた。この著者らは、ヘモグロビン（６４，０００ダルトンの分子量を有する）およびデキストラン（２０，０００ダルトンの分子量を有する）の結合体化が、「循環からゆっくりと除去され、そしてごくわずかにしか腎臓を通らない」ことを報告したが、８４，０００ダルトンより分子量を大きくすることは、クリアランス曲線を変化させなかった。従って、Ｂｌｕｍｅｎｓｔｅｉｎらによって決定されるように、ＨＢＯＣが、少なくとも８４，０００ダルトンの分子量を有することが好ましい。
【００７１】
本発明の１つの実施形態において、ＨＢＯＣは、「ＭａｌＰＥＧ」であり、これは、マレイミジル活性型ＰＥＧが結合体化したヘモグロビンを表す。このようなＭａｌＰＥＧは、以下の式によってさらに表され得る：
Ｈｂ−（Ｓ−Ｙ−Ｒ−ＣＨ２−ＣＨ２−［Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２］ｎ−Ｏ−ＣＨ３）ｍ 式Ｉ
ここで、Ｈｂは、四量体のヘモグロビンを表し、Ｓは、表面チオール基であり、Ｙは、ＨｂとＭａｌ−ＰＥＧとの間のスクシンイミド共有結合であり、Ｒは、非存在であるか、アルキル、アミド、カルバメートまたはフェニル基（原材料の供給源および化学合成の方法に依存する）であり、［Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２］ｎは、ＰＥＧポリマーの骨格を形成するオキシエチレン単位であり、ここで、ｎは、このポリマーの長さを規定し（例えば、ＭＷ＝５０００）、そしてＯ−ＣＨ３は、末端メトキシ基である。
（処方物）
本発明のＨＢＯＣは、上記ＨＢＯＣおよび他の任意の賦形剤を、適切な水溶液または「希釈剤」（すなわち、静脈内注射について薬学的に受容可能なもの）と混合することによって処方される。この希釈剤中の酸素キャリアの濃度は、適用に従って変動し得、そして特に、予測される投与後の希釈に基づくが、好ましい実施形態において、増強した酸素送達および治療効果を提供する、本発明の組成物の他の特徴に起因して、通常、６ｇ／ｄｌより高い濃度は必要ではなく、そして０．１〜４ｇ／ｄｌの間であり得る。
【００７２】
適切な希釈剤としてはまた、とりわけ、タンパク質、糖タンパク質、多糖類、および他の膠質が挙げられ得る。これらの実施形態は、いずれの特定の希釈剤にも限定されることは、意図されない。従って、希釈剤は、アルブミンの水性無細胞溶液、他の膠質、または他の非酸素保有成分を包含することが意図される。いくつかの実施形態において、上記水溶液は、少なくとも２．５ｃＰの粘度を有し得る。他の実施形態において、この水溶液の粘度は、２．５ｃＰと４ｃＰとの間である。
【００７３】
本明細書中に記載される組成物の投与は、外科手術の１日前、外科手術の間、または外科手術の１日後程度の長さを含む「外科手術に伴う」任意の時間に生じ得る。
【００７４】
（臨床適用）
本発明は、ヘモグロビンネイティブなより小さい協同性を示し得、全血より低いＰ５０を有する組成物中に処方されるＨＢＯＣ（例えば、ＰＡＯ改変されたヘモグロビン結合体）に関する。いくつかの実施形態において、そのＰ５０は、全血のＰ５０の半分未満である。このような組成物は、外科手術を受ける正常血液量の患者において血流力学的安定性を増強するのに有用である。それらは、血漿増量剤、容量向上剤（ｖｏｌｕｍｅ ｅｎｈａｎｃｅｒ）などの分野において周知である同じパラメータを使用して投与され得る。血流力学的安定性は、外科手術の前、外科手術の間、または外科手術の後にモニタリングされても、それらの任意の組み合わせでモニタリングされてもよい。したがって、血流力学的安定性の増強は、必然的に、外科的手順それ自体の際の被験体の血流力学特性の測定に限定されず、そして投与後の任意の時間に観察され得る。
【００７５】
本発明の方法の実施から最も利益を受け得る患者集団は、「外科手術を受ける正常血液量の患者」である。したがって、１つの実施形態において、本発明の方法は、希釈式自己血輸血（ＡＮＨ）処置の間に血液の抽出を受けなかった患者に対する上記組成物の投与に関する。これは、外科的手順に伴って、これらの組成物を受容する個体が、外科手術の間、またはその後に輸血を必要とする可能性が低いという知見に基づく。したがって、本発明の方法は、１つの局面において、ＡＮＨの代替的方法である。
【００７６】
別の局面において、本発明の方法はまた、外科手術の間に血圧を上昇させるための血管収縮薬のより少ない投与を必要とする外科手術を受ける正常血液量の患者の、間接的な利益をもたらす。なぜなら、その患者の血圧は、外科手術に伴うＨＢＯＣの予防的投与に起因して、外科手術の間に効率的に安定化されるからである。
【実施例】
【００７７】
以下の３つの実施例の類似するバージョンは、開示された米国特許出願第２００３／０１６２６９３号（２００３年８月２８日公開）である。これらの実施例の全てに関して、ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂは、モデルＨＢＯＣとして使用される。他のＨＢＯＣの生成および利用性は、科学文献において周知であるが、ヒト被験体において臨床試験を行なうための能力は、なおも慎重に調節され、そしてＨＢＯＣの複数の形態を使用して行なうことは不可能である。従って、本明細書中の教示に基づいて、本発明の範囲が、ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂの使用に限定されず、そして同様の特徴（例えば、ネイティブなヘモグロビンより高い酸素親和性、そして特に、ＰＡＯ改変されたヘモグロビン）を有するＨＢＯＣがまた、使用に適していることは、当業者に十分に理解されるはずである。
（実施例１）
（支質非含有ヘモグロビンの産生）
（工程１：期限切れの赤血球の調達）
期限切れのパック詰めの赤血球を、市販の供給源（例えば、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｂｌｏｏｄ ＢａｎｋまたはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ）から調達する。好ましくは、期限切れの材料は、回収時から４５日以下で受け取られる。パック詰めのＲＢＣ（ｐＲＢＣ）をさらなる処理まで（１〜７日間）４±２℃で保管する。全てのユニットを、ウイルス感染についてスクリーニングし、使用の前に核酸試験に供する。
【００７８】
（工程２：期限切れの血液のプール）
パック詰めの赤血球をクリーン施設の滅菌容器にプールする。パック詰めの赤血球の体積を記載し、そして市販の同時酸素濃度計または他の当業者に認識される方法を使用してヘモグロビン濃度を測定する。
【００７９】
（工程３：白血球枯渇（ｌｅｕｋｏｄｅｐｌｅｔｉｏｎ））
白血球枯渇（すなわち、白血球の除去）を、膜ろ過を用いて実施する。このプロセスの効率をモニタリングするために、開始および最終の白血球数を数える。
【００８０】
（工程４：細胞分離および細胞洗浄）
赤血球を、６倍容量の０．９％塩化ナトリウムで洗浄する。このプロセスは４±２℃で実施する。細胞洗浄物を、アルブミンについての分光光度的分析によって、血漿成分の除去を検証するために分析する。
【００８１】
（工程５：赤血球溶解および細胞細片の除去）
洗浄した赤血球を、６倍容量の水を用いて攪拌しながら少なくとも４時間または一晩、４±２℃で溶解する。溶解物を、冷却した状態で処理してヘモグロビンを精製する。これは、溶解物を０．１６μｍ膜に通す処理によって達成する。精製したヘモグロビンは、加熱滅菌容器（ｓｔｅｒｉｌｅ ｄｅｐｙｒｏｇｅｎｅｔａｅｄ ｖｅｓｓｅｌ）に回収する。この処理における全工程を４±２℃で実施する。
【００８２】
（工程６：ウイルスの除去）
ウイルス除去を、４±２℃にて、限外濾過によって実施する。
【００８３】
（工程７：濃縮および溶媒交換）
溶解物および限外濾過から精製したヘモグロビンを、１０ｌＤ膜を用いて、乳酸リンゲル液（ＲＬ）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中に交換する。次いで、このヘモグロビンを、同じ膜を用いて１．１〜１．５ｍＭ（四量体）の最終濃度まで濃縮する。１０〜１２容量のＲＬまたはＰＢＳを、溶媒交換に使用する。この処理を４±２℃で実施する。ＲＬ中で調製した溶液のｐＨを、７．０〜７．６に調整する。
【００８４】
（工程８：滅菌濾過）
ＰＢＳまたは乳酸リンゲル液（ＲＬ）中のヘモグロビンを、０．４５または０．２μｍの使い捨てフィルタカプセルに通して滅菌濾過し、化学改変反応を実施するまで４±２℃で保管する。
【００８５】
ヘモグロビンを精製する他の方法は、当該分野で周知である。さらに、細胞溶解後の自動酸化を防ぐための還元剤（例えば、グルタチオンまたは別のチオール含有還元剤）の使用は、通常不必要である。
【００８６】
（実施例２）
（支質非含有ヘモグロビンの改変）
（工程１：チオール化）
チオール化を、ヘモグロビンについて１０倍モル濃度の過剰なイミノチオラン（ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ）を使用して、４±２℃にて４時間、連続攪拌しながら実施する。
【００８７】
反応条件：
・ＲＬ（ｐＨ７．０〜７．５）またはＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、１ｍＭヘモグロビン（四量体）
・ＲＬ（ｐＨ７．０〜７．５）またはＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、１０ｍＭイミノチオラン
１：１０ ＳＦＨ：イミノチオランの比率および反応時間を、ＰＥＧ化チオール基の数を最大にし、かつ異成分の生産を最小にするように最適化した。
【００８８】
（工程２：チオール化したヘモグロビンのＰＥＧ化）
チオール化したヘモグロビンを、開始の四量体ヘモグロビン濃度に基づいて２０倍モル濃度の過剰なＭａｌ−ＰＥＧ（アルキルリンカーまたはフェニルリンカーを有する）を用いて、ＰＥＧ化する。ヘモグロビンを、まず、ヘモグロビンを酸化するための雰囲気で平衡化させる。この反応物を、連続攪拌しながら４±２℃で２時間置く。
【００８９】
反応条件：
・ＲＬまたはＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、１ｍＭチオール化ヘモグロビン
・ＲＬまたはＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、２０ｍＭ Ｍａｌ−ＰＥＧ。
【００９０】
（工程３：未反応の試薬の除去）
ＰＥＧ化−Ｈｂを、７０ｋＤ膜を通して処理し、過剰な未反応の試薬またはヘモグロビンを除去する。２０−容量の濾過を、未反応の試薬の除去を確実にするために実施し、サイズ排除クロマトグラフィーによってモニタリング（５４０ｎｍおよび２８０ｎｍ）する。このタンパク質濃度を、４ｇ／ｄｌに希釈する。ｐＨは、１Ｎ ＮａＯＨを用いて７．３〜０．３に調整する。
【００９１】
（工程４：滅菌濾過）
最終ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂ生成物を、０．２μｍ無菌ディスポーザブルカプセルを用いて無菌濾過し、４±２℃で加熱滅菌容器（ｓｔｅｒｉｌｅ ｄｅｐｙｒｏｇｅｎａｔｅｄ ｖｅｓｓｅｌ）に回収した。
【００９２】
（工程５：ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂの形成）
ＰＥＧ化したＨｂを４ｇ／ｄｌ ＲＩに希釈し、ｐＨを７．４±０．２に調整した。
【００９３】
（工程６：無菌充填）
最終代用血液組成物を無菌濾過（０．２μｍ）し、無菌ガラスバイアルに重量で分取し、層流フード内で捲縮シールを備える無菌ゴム栓で封じ、そして、使用まで−８０℃で保存した。
【００９４】
（実施例３）
（ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂの生理化学分析）
（生理化学分析の方法論）
ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂ代用血液の同質性および分子サイズは、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）により特徴付けられる。分析用ＬＣを使用して、ＰＥＧ化ヘモグロビンの同質性および未反応のＭａｌ−ＰＥＧの除去程度を評価する。５４０ｎｍでの吸光度を使用して、ヘモグロビンを評価し、ピーク位置により未反応のヘモグロビンからＰＥＧ化ヘモグロビンを分離する。２８０ｎｍでの吸光度を使用して、遊離Ｍａｌ−ＰＥＧからＰＥＧ化ヘモグロビンを分離する。この遊離Ｍａｌ−ＰＥＧは、ＭａｌＰＥＧの環状構造に起因して紫外（ＵＶ）スペクトルで吸収する。
【００９５】
高速走査ダイオードアレイ分光光度計（Ｍｉｌｔｏｎ Ｒｏｙ ２０００またはＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ Ｍｏｄｅｌ ８４５３）を使用して、ヘモグロビン濃度およびメトヘモグロビンの割合の分析（多成分性分析による）のために、ソレー帯および可視領域の可視スペクトルを回収する（Ｖａｎｄｅｇｒｉｆｆ，Ｋ．Ｄ．，およびＲ．Ｅ．，Ｓｈｒａｇｅｒ。Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｘｙｇｅｎ ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ
ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｂｙ ｒａｐｉｄ−ｓｃａｎｎｉｎｇ
ｓｐｃｅｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｓｉｎｇｕｌａｒ ｖａｌｕｅ ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２３２：４６０−４８５（１９９４））。
【００９６】
同時酸素濃度計を使用して、ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂ濃度およびメトヘモグロビンの割合を決定する。レオメーターを使用して粘度を決定する。膠質浸透圧計を使用して膠質浸透圧を決定する。酸素結合パラメータを酸素平衡曲線から決定する。
【００９７】
代用血液組成物のための好ましい規格を以下の表１に示す：
【００９８】
【表１】
（ＭａｌＰＥＧ−ＨｂにおけるＰＥＧ化部位の数）
表面改変について、式Ｉの数「ｍ」は、ヘモグロビン表面に結合するＰＥＧポリマーの数を規定するパラメータである。
Ｈｂ−（Ｓ−Ｙ−Ｒ−ＣＨ２−ＣＨ２−［Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２］ｎ−Ｏ−ＣＨ３）ｍ 式Ｉ
この数を決定するために、ジチオピリジン比色定量アッセイ（Ａｍｐｕｌｓｋｉ，Ｒ．，Ｖ．ＡｙｅｒｓおよびＳ．Ｍｏｒｅｌｌ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ
ｒｅａｃｔｉｖｅ ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ ｈｅｍｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ４，４’−ｄｉｐｙｒｉｄｉｎｅｓｄｉｓｕｌｄｅ．Ｂｉｏｃｈｅｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １６３−１６９，１９６９）を使用して、チオール化の前後、次いで、Ｈｂの再度のＰＥＧ化の後に、Ｈｂ四量体の表面の利用可能なチオール基の数を測定する。ヒトヘモグロビンは、２つの内因性の反応性チオール基をβ９３Ｃｙｓ残基に含み、この反応性チオール基は、ジチオピリジン反応によって確認される。１：１０ ＳＦＨ：イミンチオラン（ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ）の比でのＳＦＨのチオール化の後、ジチオピリジン反応による反応性チオール基の数は２チオールから６チオールに増加する。ＰＥＧ化反応の後、反応性チオール基の数は、１．３に減少する。このことは、ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂに４〜５のＰＥＧ化部位が存在することを示す。
【００９９】
（ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂ対ＳＦＨのサイズ排除クロマトグラフィー分析）
最終ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂ生成物の分析のためにＦＰＬＣを実施する。未改変のＳＦＨと比較したＭａｌＰＥＧ−Ｈｂについての代表的なクロマトグラムを図１に示す。ＳＦＨに対する保持時間は約５７分である。ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂに対する保持時間は約４４分である。
【０１００】
（ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂの物理的性質および化学的性質）
血液および未改変のヒトヘモグロビン（ＳＦＨ）と比較したＭａｌＰＥＧ−Ｈｂの物理的性質を以下の表２に示す。
【０１０１】
【表２】
１全血について１５ｇ／ｄｌおよびヘモグロビン溶液について約４ｇ／ｄｌで決定した。２ＣＯＰ測定およびＦＰＬＣにより決定した。
【０１０２】
（酸素親和性）
ヘモグロビン−酸素平衡結合曲線を、酵素的酸素消費の間に測定した（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５６：１０７−１１６，１９９８）。ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂは、高い酸素親和性（Ｐ５０＝５ｍｍＨｇ）および低い協同性（ｎ５０＝１．０〜１．４）を示す。図２は、支質非含有ヘモグロビン（ＳＦＨ）溶液とＭａｌＰＥＧ−Ｈｂ溶液を比較する代表的な曲線を示す。
【０１０３】
（粘度）
ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂのこの溶液特性は、ポリエチレングリコール鎖と溶媒の水分子との間の強い相互作用に起因する。このことは、以下の２つの理由から代用血液のための重要な特性であると考えられる：１）より高い粘度が溶媒を介して拡散するＰＥＧ−Ｈｂ分子とガス状のリガンド分子の両方の拡散定数を減少させ、そして２）より高い粘度が内皮壁に向って流れる溶液のずり応力を増加させ、血管狭窄に対抗するために血管拡張因子の放出を誘発する。表２に示すように、ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂ溶液の粘度は２．５ｃＰｓである。
【０１０４】
（膠質浸透圧（ＣＯＰ））
未改変の分子内架橋ヘモグロビンおよび分子間架橋ヘモグロビンまたはＰＥＧ−表面−結合体化ヘモグロビンを含有するヘモグロビン溶液のＣＯＰを測定して、その高分子溶液特性を決定した（Ｖａｎｄｅｇｒｉｆｆ，Ｋ．Ｄ．，Ｒ．Ｊ．ＲｏｈｌｆｓおよびＲ．Ｍ．Ｗｉｓｌｏｗ．Ｃｏｌｌｏｉｄ ｏｓｍｏｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ−ｂａｓｅｄ ｏｘｙｇｅｎ ｃａｒｒｉｅｒｓ．Ｗｉｎｓｌｏｗ，Ｒ．Ｍ．，Ｋ．Ｄ．ＶａｎｄｅｇｒｉｆｆおよびＭ．Ｉｎｔａｇｌｉａ編、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｌｏｏｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ｂｏｓｔｏｎ，Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ，２０７−２３２頁（１９９７））。四量体ヘモグロビンは、理想溶液に近い挙動を示すが、ＰＥＧと結合体化されたヘモグロビンは、有意により高い膠質浸透活性を有し、非理想的な溶液を示す（Ｖａｎｄｅｇｒｉｆｆ，Ｋ．Ｄ．，Ｍ．Ｍｃａｒｔｈｙ，Ｒ．Ｊ．ＲｏｈｌｓおよびＲ．Ｍ．Ｗｉｎｓｌｏｗ．Ｃｏｌｌｏｉｄ ｏｓｍｏｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｓ：ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ ｖｅｒｓｕｓ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｓｕｒｆａｃｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．６９：２３−３０（１９９７））。表２に示すように、ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂ溶液のＣＯＰは５０である。
【０１０５】
（安定性）
ＰＥＧ−ヘモグロビンを含むヘモグロビン溶液の安定性を、自動酸化の速度を試験することによって決定した。室温において、ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂの自動酸化は、１０時間で、約５％ＭｅｔＨｂから５．５％ＭｅｔＨｂに増加した。従って、ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂの自動酸化速度は、０．０５％／時間であった。
【０１０６】
（実施例４：ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂの安定性）
この研究の目的は、例示的な貯蔵条件および取扱い条件のシミュレーションの間のＭａｌＰＥＧ−Ｈｂの安定性を決定することであった。取り扱いの三段階の間の安定性を評価した。段階Ｉは、製造施設での凍結保存から臨床現場に輸送される間の温度条件への移動を示した（凍結貯蔵研究）。段階ＩＩは、＋４℃で２４時間にわたるそのＭａｌＰＥＧ−Ｈｂの融解およびその後の４℃で５日間にわたる貯蔵を示した（冷蔵研究）。段階ＩＩＩは、＋４℃まで２４時間でのそのＭａｌＰＥＧ−Ｈｂの融解およびその後の患者に投与する前に数日間室温でのＭａｌＰＥＧ−Ｈｂの貯蔵を示した（室温研究）。
【０１０７】
（実験方法）
安定性を、そのＭａｌＰＥＧ−Ｈｂ試験材料の酸化の速度によって規定した。同時酸素濃度計（ＩＬ Ｃｏ−Ｏｘｉｍｅｔｒｙ ６８２、ＧＭＩ，Ｉｎｃ、Ｒａｍｓｅｙ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）を使用して、サンプル中のメトヘモグロビンの割合を測定した。プロトコルに従って、各時点で、二連で測定を行った。
【０１０８】
温度計または温度チャートレコーダーによって、温度をモニタリングした。凍結貯蔵研究は、−２１．０±３．０℃の温度範囲で行った。冷蔵研究を、＋４．０±０．２℃の温度範囲で行った。室温研究を、＋２１．０±１．０℃の温度範囲で行った。
【０１０９】
温度、総ヘモグロビン、および％メトヘモグロビンを、示された時点の各々で記録した。凍結研究および冷蔵研究において、測定を時間０（完全に解凍）、１時間後、および次いで、５日間にわたり２４時間ごとで行った。室温研究において、時間０（完全に解凍）およびその後１０時間にわたり１時間ごとに測定を行った。
【０１１０】
（結果）
ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂは、−２０℃での６日間の貯蔵の間に％メトヘモグロビンにおいて変化を示さなかった。同様に、ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂは、＋４℃での５日間の貯蔵の間に、％メトヘモグロビンにおいて変化を示さなかった。
【０１１１】
（実施例５）
（血流力学的安定性を促すＭａＩ−ＰＥＧの使用）
ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂを、上に記載されるように調製した。１０００ｍＬ乳酸リンゲル液の総容量に平衡化した、ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂの０ｍＬ（乳酸リンゲル液単独）、２００ｍＬ（「Ａ」）、４００ｍＬ（「Ｂ」）または６００ｍＬ（「Ｃ」）の投薬量を、脊髄麻酔誘導の前に、選択性の整形外科手術を受ける患者に投与した。この結果を、図４に示す。
【０１１２】
図５は、６００ｍＬ ＭａＩＰＥＧ Ｈｂを受容した患者のバイタルサインを示す。示されるように、血圧の上昇は、ベースラインの測定値と比較して観察されなかった。対照的に、検出可能であるが、わずかな血圧の増大が、２００ｍＬ ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂまたは４００ｍＬ ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂを受容した患者において観察された。
【０１１３】
低血圧事象をまた、患者においてモニタリングした。その結果を、表３において以下に示す：
【０１１４】
【表３】
示されるように、ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂを受容した患者は、プラセボを受容した患者より少ない低血圧事象を示した。
【０１１５】
（実施例６）
（外科手術の間に血流力学的安定性を増強するためのＭａｌＰＥＧ−Ｈｂの使用の拡大した臨床研究）
ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂは、先に、健康なボランティアにおける第１相試験において試験されており、有意な有害事象を生じず、そしてまた、支質非含有Ｈｂと比較して減少した血管作用活性を示す非臨床研究と一致した。特に、心血管の疾患を有する高齢患者において低血圧事象として測定される血流力学的不安定性（例えば、心血管事象）は、外科手術を受けるこのような患者に対して問題である。多数の文献は、このような低血圧が、有意な手術後の罹患率を生じ得る、脳、心臓および腎臓における虚血をもたらすという仮説を支持する。これらの有害事象の効果からこのような外科手術患者を保護するためのＨｂベースの酸素キャリア（ＨＢＯＣ）の開発が、この実験の焦点である。
【０１１６】
ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂ（２５０ｍＬまたは５００ｍＬ）群、および酢酸リンゲル液単独を受容するコントロール群の無作為化二重盲検研究を、６つの異なる病院にてそれぞれ３０人の患者の群で実施した。同意患者は、一次的な侵襲的な外科手術（主に、人工股関節置換術）を受けた。投薬は、脊髄麻酔の誘導前に生じた。安全評価は、バイタルサインおよびＨｏｌｔｅｒモニタリング（注入から２４時間まで）、ならびに臨床化学、凝固、血液学、および体液平衡を含む。９０ｍｍＨｇ未満またはベースライン値の７５％未満の収縮期血圧として定量的に定義される低血圧の出現は、効力の一次的なエンドポイントであった。効力の別の基準は、下でより完全に記載される通り、血圧および体液平衡を安定化するための薬理学的介入についての必要性であった。
【０１１７】
（研究集団）
この実験において研究した患者の大部分は、変形性関節症を有する患者における選択性の一次的な人工股関節置換術である外科的手順を受けていた。しかし、多くの急性骨折をまた、研究し、そして少数の二次的な置換を研究した。算入および除外の判定基準を、表４に示す。
【０１１８】
【表４】
（無作為化および盲検（ｂｌｉｎｄｉｎｇ））
番号付けした各患者に割り当てられた処置は、コンピューターで作成し、連続して番号付けした無作為化コードの一覧表に従って決定した。処置群を、以下のように指定した：Ａ、２５０ｍＬのＭａｌＰＥＧ−Ｈｂ；Ｂ、５００ｍＬのＭａｌＰＥＧ−Ｈｂ；（ＡおよびＢは、「試験群」を表す）およびＣ、酢酸リンゲル液（「プラセボ群」を表す）（各群に対して全投与容量を用い、この投与用量は投与の前に同じ総投与容量に調整された）。ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂが、赤色であり、そしてプラセボが、透明である場合、試みはまた、患者および「事情を知らない（ｂｌｉｎｄｅｄ）」職員に、注入される溶液が分からないように行なった（すなわち、この研究を、伝統的な「二重盲検された」様式で行なった）。
【０１１９】
（材料）
ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂを、本質的に、いくつかの少数のバリエーションを伴って、実施例１〜実施例３において上に記載したように調製した。投与の約２４時間前、ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂのボトルを、冷凍庫（−２０℃）から取り出し、そして徐々に解凍するために、室温においた。酢酸リンゲル液を、商業的供給源（Ｆｒｅｓｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）から入手した。
【０１２０】
（投与）
ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂまたはプラセボのいずれかを、確立した静脈ラインを通して、較正した容量測定注入ポンプによって投与した。１０００ｍＬの総容量のＭａｌＰＥＧ−Ｈｂおよび／または酢酸リンゲル液を、注入の終了後３０分以内に行なわれる麻酔が誘導される前に、盲検の目的のために注入した。
【０１２１】
試験組成物溶液またはプラセボ溶液の注入は、患者の通常の看護に影響しなかった。試験溶液またはプラセボ溶液のいずれかを受容する患者はまた、その患者の健康のために必要であると判断される任意のさらなる処置を受容した。全ての医学的手順および処置を、その診療所の標準的な看護に従って行なった。研究開始において進行中であった全ての継続的な薬剤の投与、およびこの研究の間に与えられる併用する薬剤を、記録し、そして結果の解釈において考慮した。
【０１２２】
（薬物動態の測定および可変性）
ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂの脈管内における存続および脈管内の産物の安定性を、注入前、注入の終了時、注入の６時間後、注入後１日目、２日目および３日目ならびに７〜１０日目の、血漿ヘモグロビンレベルおよび血漿メトヘモグロビンレベルから決定した。これらの研究の結果は、異常なものではなく、そして本明細書中で報告しない。
【０１２３】
（サンプルの回収および分析）
血液サンプルを、サンプル採取の間の溶血を最小限にする慣用的な方法を使用して、引き抜き、そして血漿からの血液サンプルの分離を保証するように処理した。ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂを含む血液サンプルの血漿部分が、赤色であった場合、サンプルの処理のために、「事情を知っている（ｕｎｂｌｅｎｄｅｄ）」技術者によって行なわれることが、必要であった。サンプルの分析を、「暗号が破られる（ｃｏｄｅ ｂｒｅａｋｉｎｇ）」前に行なった。従って、その分析を行なう研究室を、適切に分からないようにした。
【０１２４】
（効力の測定値および可変性）
血流力学的安定性を増強するための例示的なＨＢＯＣとしてのＭａｌＰＥＧ−Ｈｂの有効性を、以下のエンドポイントを使用して研究した：
（Ａ．低血圧のエピソード）
ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂ／プラセボの注入後における低血圧のエピソードの数を、収縮期血圧（ＳＢＰ）＜９０ｍｍＨｇまたは注入前と比較して、ＳＢＰにおける＞２５％の降下として定義した。その定義を満たすＳＢＰのそれぞれの登録を、１つの低血圧のエピソードとして計測した。
【０１２５】
（Ｂ．総水分摂取量および総水分排出量（体液平衡））
測定を、外科手術の当日（注入の開始〜注入開始の２４時間後）ならびに手術後１日目、２日目および３日目に行なった。摂取量は、以下を含む：注入した流体（ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂ／プラセボ、膠質および晶質）、輸血および流体の経口摂取量。排出量は、以下を含む：尿、および外科手術の間の推定された失血。
【０１２６】
静脈内の流体の型および量を、記録した（データ示さず）。晶質注入物および膠質注入物の総量は、３つの群の間で、入院期間全体について統計学的に異ならなかった。しかし、差が、術中の期間において生じた。群Ａは、群Ｂ（１２９９±１８３ｍＬ）および群Ｃ（１２８１±１４４ｍＬ）と比較して、有意に少ない晶質（９１３±１０６ｍＬ）を受容した（Ｐ＜０．０５）。さらに、ＭａｌＰＥＧ−Ｈｂを投与された膠質の量に含めた場合、群Ｂは、群Ａ（８５０±６６ｍＬ）または群Ｃ（６６６±６９ｍＬ）と比較して、有意に多い合計の晶質（１３８９±１６９ｍＬ）を受容した。両方の差（Ｂ対ＣおよびＡ対Ｂ）は、統計学的に有意であった（Ｐ＜０．０５）。残りの研究については、晶質、膠質または合計の静脈内の流体投与に有意な差は、存在しなかった。
【０１２７】
（Ｃ．心臓の障害）
血流力学的不安定性の測定としての心臓の障害の数および型（頻拍、虚血、徐脈および伝導の問題）は、事情を知らない心臓病専門医によって評価された。心臓のリズムの障害を、継続的なＨｏｌｔｅｒモニタリングおよびＥＣＧを使用して記録した。
【０１２８】
（Ｄ．薬理学的介入）
心臓血管を支援するための薬理学的介入（例えば、血圧の薬物、利尿剤）の数および用量をまた、麻酔の誘導から注入の開始後１２時間まで記録した。
【０１２９】
（Ｅ．輸血）
外科手術の間（麻酔の誘導から外科手術の終了およびその後）に投与された輸血（パックされた赤血球の体積）をまた、記録した。
【０１３０】
（Ｆ．酸素利用）
手術後に追加した酸素投与の持続期間を、外科手術の当日およびその後数日間記録した。
【０１３１】
（結果）
有害事象として発現される低血圧性の不安定性（例えば、低血圧のエピソード、および昇圧剤の投与に対する必要性）を、下の表５に示す。低血圧事象の％について得られた結果をまた、図６に示す。
【０１３２】
【表５】
上記の実施例は、組成物の好ましい実施形態の作製および使用の方法の完全な開示および記載を当業者に与えるために提供されるのであって、本発明者らが、彼らが発明として考えるものの範囲を限定することを意図するのではない。当業者に明らかな、本発明を実施するための上記の態様の改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。本明細書中で引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、各々のこのような刊行物、特許または特許出願が具体的にかつ個々に本明細書中に参考として援用されることが示されるかのように、本明細書中に参考として援用される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１２−２０７０４８（Ｐ２０１２−２０７０４８Ａ）
【公開日】平成２４年１０月２５日（２０１２．１０．２５）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−１６８５６７（Ｐ２０１２−１６８５６７）
【出願日】平成２４年７月３０日（２０１２．７．３０）
【分割の表示】特願２００７−５３０３８３（Ｐ２００７−５３０３８３）の分割
【原出願日】平成１７年８月３０日（２００５．８．３０）
【出願人】（５０４２６７１１６）サンガート， インコーポレイテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１０月２５日（２０１２．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１６８５６７（Ｐ２０１２−１６８５６７）
【出願日】平成２４年７月３０日（２０１２．７．３０）
【分割の表示】特願２００７−５３０３８３（Ｐ２００７−５３０３８３）の分割
【原出願日】平成１７年８月３０日（２００５．８．３０）
【出願人】（５０４２６７１１６）サンガート， インコーポレイテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
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