関節リウマチの診断のための方法およびキット
本発明は、関節リウマチ（ＲＡ）と臨床的関連を有するタンパク質の同定および使用に関する。とりわけ、本発明は、ＲＡ関連自己抗体と特異的に反応するマーカータンパク質の同定を提供する。また、ＲＡの診断ならびに治療レジメンの選択および／またはモニタリングにおいてこれらのタンパク質を用いるための方法、アレイ、およびキットも提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００８年５月１４日に出願された欧州特許出願ＥＰ０８３０５１６７．２に対する優先権を主張するものである。この欧州特許出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチ（ＲＡ）は、世界人口の約１％が罹患している慢性自己免疫疾患である。これは、軟骨および骨の破壊、関節の変形、ならびに可動性の喪失を最終的にもたらし得る、関節の滑膜表層における炎症および細胞増殖を特徴とする。ＲＡは通常、いくつかの関節において同時に問題を生じさせ、それは対称的であることが多い。初期のＲＡは、手首、手、足首、および足の関節などの小さめの関節に最初に罹患する傾向がある。疾患が進行するにつれて、肩、肘、膝、腰、顎、および首の関節もまた関与してくる可能性がある。関節内または関節周辺の領域のみに罹患する、他の関節の状態とは異なり、ＲＡは、皮膚、血管、心臓、肺、および筋肉を含む体全体にわたる関節外の組織において炎症を生じさせ得る全身性疾患である。
【０００３】
ＲＡは、痛み、変形、生活の質の低下、および障害に関連し、これらは次に、正常かつ生産的な生活を送るための患者の能力に影響する。最近の研究により、この疾患の発病の５年後に、およそ３分の１のＲＡ患者がもはや運動することができず、１０年以内に患者の半分がかなりの機能障害を有することが示されている（Ａ．Ｙｏｕｎｇら、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ、２００７、４６：３５０〜３５７）。結果として、ＲＡは社会に対して多大な経済的負担を強いる。また、かなりのデータが、ＲＡが平均寿命の短縮に関連することを示唆している。
【０００４】
ＲＡは広く研究されてきているが、この疾患の原因および発症機序は依然として完全には理解されていない。ＲＡのリスクを増大させ得る因子には、個体の性別（女性は男性よりも２から３倍この疾患を発症する可能性が高い）、年齢（ＲＡはより一般的には４０歳から６０歳の間に生じるが、子供、十代、および高齢者も罹患し得る）、遺伝的特徴（ＲＡは、遺伝性の組織型主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）抗原であるＨＬＡ−ＤＲ４、より具体的にはＤＲＢ１＊０４０１およびＤＲＢ１＊０４０４に強く関連することが明らかになった）、ならびに喫煙（ＲＡは非喫煙者よりも喫煙者において約４倍多い）が挙げられる。
【０００５】
現在、ＲＡの信頼性のある治療法は存在しない。治療は基本的に、痛みを軽減させ、炎症を低減させ、関節の損傷および骨の破壊を停止または減速させることを目的とするものである。現在の治療アプローチは、状態の初期に疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）を処方することであり、それは、このような薬剤で初期に治療されたＲＡ患者が、機能が良好に保持され、運動障害が少なく、かつ早期に死亡するリスクが小さい、良好な転帰を有するためである。ＲＡの病態生理の理解における最近の進歩により、生物学的応答修飾物質と呼ばれる新たなＤＭＡＲＤが開発されている。生物学的ＤＭＡＲＤは、ＲＡに関連する異常な免疫反応に関与する、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、Ｔ細胞、およびＢ細胞などの、鍵となる特定の細胞または分子の作用を標的化および遮断するように設計されている。従来のＤＭＡＲＤと比較して、生物学的作用物質は、作用の開始がはるかに速く、かつ、関節の損傷の有効な長期の予防を伴う良好な臨床応答をもたらし得る（Ｊ．Ｋ．Ｄ．ｄｅ Ｖｒｉｅｓ−Ｂｏｕｗｓｔｒａら、Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．、２００５、３１：７４５〜７６２）。
【０００６】
回復不能な関節の破壊は、疾患の初期段階での介入により予防することができるため、ＲＡの初期の診断が重要である。しかし、ＲＡの確定診断は困難である可能性がある。ＲＡの診断のために行われ得る免疫学的試験には、特に、リウマチ因子（ＲＦ）、抗核抗体（ＡＮＡ）、および抗環状シトルリン化ペプチド（抗ＣＣＰ）抗体のレベルの測定が含まれる。ＲＦについての血清学的試験は、感度および特異性が中程度であり、他の慢性的炎症および感染性疾患における陽性率が高いことにより、複雑である（Ｔ．Ｄｏｒｎｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ、２００４、１６：２４６〜２５３）。陽性のＡＮＡの結果は、異常に活性のある免疫系を示す。ＲＡ患者の約４０％がＡＮＡについて陽性である。しかし、この疾患の発病の最初の数ヶ月はＡＮＡの試験は陰性であり得、一部の患者においては、それらは疾患が進行しても陰性であり続ける。ＲＡの診断においては、抗ＣＣＰ抗体の試験が特に有用であり、それは、特異性が高く、疾患プロセスの初期において陽性であり、重篤な疾患および回復不能な損傷を有する可能性が高い患者を同定することができる。しかし、抗ＣＣＰ抗体の試験における陰性の結果はＲＡを排除するわけではない。
【０００７】
したがって、ＲＡおよびＲＡ進行の新たな生物学的マーカーが大いに必要である。とりわけ、疾患の初期段階の信頼性のある診断およびモニタリングを可能にし、痛み、関節の破壊、および長期にわたる障害を潜在的に予防するための初期の介入を可能にするバイオマーカーが非常に望ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、関節リウマチ（ＲＡ）の診断のための改良された系および戦略に関する。とりわけ、本発明は、ＲＡ患者における、臨床的に関連する疾患プロセスを反映するタンパク質の同定を提供する。より具体的には、本発明は、患者から得られるインビトロの生物学的試料においてＲＡの指標となる自己抗体の存在を検出するために用いることができるバイオマーカーを提供する。特定の実施形態において、本発明のバイオマーカーは、ＣＣＰ陰性の患者においてＲＡの診断を可能にする利点を有する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
より具体的には、１つの態様において、本発明は、関節リウマチの診断において使用するための、ＢＲＡＦ触媒ドメインまたはその抗体結合断片を含む自己抗原マーカーを提供する。とりわけ、本発明は、対象における関節リウマチのインビトロでの診断方法において用いるための、ＢＲＡＦ触媒ドメインまたはその抗体結合断片を含む自己抗原マーカーを提供する。特定の実施形態において、関節リウマチのインビトロでの診断方法は、対象から得られる生物学的試料を、自己抗原マーカーと、抗原抗体複合体の形成を可能にする時間および条件下で接触させるステップと、形成された任意の抗原抗体複合体を検出するステップとを含み、抗原抗体複合体の存在は、対象における関節リウマチの指標となる。形成された任意の抗原抗体複合体の検出は、任意の適切な方法、例えば免疫アッセイにより行うことができる。
【００１０】
特定の実施形態において、インビトロでの診断方法で試験される対象、例えばヒト患者は、関節リウマチを有することが疑われる。特定の実施形態において、対象はＣＣＰ陰性である。
【００１１】
インビトロでの診断方法において用いられる生物学的試料は、全血、血清、血漿、尿、および滑液からなる群から選択され得る。
【００１２】
特定の実施形態において、ＢＲＡＦ触媒ドメインまたはその抗体結合断片を含む自己抗原マーカーは、固体の担体または支持体上に固定化される。例えば、自己抗原マーカーはアレイ上に固定化される。
【００１３】
特定の実施形態において、自己抗原マーカーに含まれるＢＲＡＦ触媒ドメインは、ヒト由来のものである。例えば、ＢＲＡＦ触媒ドメインは、配列番号２のアミノ酸４１６からアミノ酸７６６にわたるアミノ酸配列を有するか、含むか、またはそれにより構成される。
【００１４】
特定の実施形態において、ＢＲＡＦ触媒ドメインまたはその抗原結合断片を含む自己抗原マーカーは、対象から得られる生物学的試料において抗ＰＡＤ４抗体を検出することをさらに含む、関節リウマチのインビトロでの診断方法において使用される。同一のまたは他の実施形態において、自己抗原マーカーは、対象から得られる生物学的試料においてＣ反応性タンパク質、血清アミロイドＡ、インターロイキン６、Ｓ１００タンパク質、オステオポンチン、リウマチ因子、マトリクスメタロプロテアーゼ１、マトリクスメタロプロテアーゼ３、ヒアルロン酸、ｓＣＤ１４、血管新生マーカー、および骨、軟骨、または滑膜の代謝産物からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーの濃度を測定することをさらに含む、関節リウマチのインビトロでの診断方法において使用される。
【００１５】
関連する態様において、本発明は、関節リウマチの診断において用いるための、アレイの表面に付着した自己抗原マーカーを提供し、自己抗原マーカーは、ＢＲＡＦ触媒ドメインまたはその抗体結合断片を含む。とりわけ、本発明は、対象における関節リウマチのインビトロでの診断方法において用いるための、アレイの表面に付着した自己抗原マーカーを提供し、自己抗原マーカーは、ＢＲＡＦ触媒ドメインまたはその抗体結合断片を含む。
【００１６】
特定の実施形態において、ＢＲＡＦ自己抗原マーカーが付着しているアレイはさらに、その表面に付着した、ＰＡＤ４またはその抗体結合断片を含む自己抗原マーカーを含む。同一のまたは他の実施形態において、ＢＲＡＦ自己抗原マーカーが付着しているアレイはさらに、その表面に付着した、ＲＡ特異的自己抗体、とりわけ抗核抗体および抗ＣＣＰ抗体の存在を検出するための少なくとも１つのさらなるマーカーを含む。
【００１７】
別の態様において、本発明は、関節リウマチのマーカーとしてのＢＲＡＦ触媒ドメインまたはその抗体結合断片を含む自己抗原マーカーの使用を提供する。
【００１８】
さらに別の態様において、本発明は、対象における関節リウマチのインビトロ診断のための方法を提供し、前記方法は、対象から得られる生物学的試料を、ＢＲＡＦ触媒ドメインまたはその抗体結合断片を含む自己抗原マーカーと、抗原抗体複合体の形成を可能にする時間および条件下で接触させるステップと、形成された任意の抗原抗体複合体を検出するステップとを含み、抗原抗体複合体の存在は、対象における関節リウマチの指標となる。
【００１９】
特定の実施形態において、対象、例えばヒト患者は、関節リウマチを有することが疑われる。特定の実施形態において、対象、例えばヒト患者はＣＣＰ陰性である。
【００２０】
対象から得られ、かつ本発明の診断方法における使用に適した生物学的試料は、全血、血清、血漿、尿、および滑液からなる群から選択され得る。
【００２１】
本明細書において提供される診断方法において、自己抗原マーカーと対象から得られる生物学的試料内に存在する自己抗体との間で形成される任意の抗原抗体複合体の検出は、任意の適切な方法によって行うことができる。特定の実施形態において、検出は免疫アッセイによるものである。
【００２２】
特定の実施形態において、ＢＲＡＦ触媒ドメインまたはその抗体結合断片を含む自己抗原マーカーは、固体の担体または支持体上に固定化される。
【００２３】
対象が人間である実施形態において、ＢＲＡＦ触媒ドメインまたはその抗体結合断片は、好ましくはヒト由来のものである。特定の実施形態において、ＢＲＡＦ触媒ドメインは、本明細書において定義される配列番号２のアミノ酸４１６からアミノ酸７６６にわたるアミノ酸配列を有する。
【００２４】
特定の実施形態において、本発明の診断方法はさらに、試験される対象から得られる生物学的試料における抗ＰＡＤ４抗体を検出することを含む。これらまたは他の実施形態において、本方法はさらに、対象から得られる生物学的試料において抗ＣＰＰ抗体を検出することを含む。その代わりに、またはそれに加えて、診断方法はさらに、対象から得られる生物学的試料においてＣ反応性タンパク質、血清アミロイドＡ、インターロイキン６、Ｓ１００タンパク質、オステオポンチン、リウマチ因子、マトリクスメタロプロテアーゼ１、マトリクスメタロプロテアーゼ３、ヒアルロン酸、ｓＣＤ１４、血管新生マーカー、および骨、軟骨、または滑膜の代謝産物からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーの濃度を測定することを含み得る。
【００２５】
さらに別の態様において、本発明は、対象における関節リウマチの診断のためのキットを提供する。より具体的には、キットは、対象から得られる生物学的試料における抗ＢＲＡＦ自己抗体を検出するために提供され、ＢＲＡＦ触媒ドメインまたはその抗体結合断片を含む自己抗原マーカーと、自己抗原マーカーと生物学的試料内に存在する自己抗体との間で形成される抗原抗体複合体を検出するための試薬であって、自己抗体が、対象における関節リウマチの指標となる抗ＢＲＡＦ自己抗体である試薬とを含む。このキットにおいて、自己抗原マーカーは固体の担体もしくは支持体上に固定化され得るか、または、固体の担体もしくは支持体上に自己抗原マーカーを固定化するために用いられる試薬がキット内に含まれ得る。キットはさらに、本明細書において提供される診断方法のいずれかを実施するための指示を含み得る。
【００２６】
特定の実施形態において、キットはさらに、ＰＡＤ４またはその抗体結合断片を含む第２の自己抗原マーカーと、第２の自己抗原マーカーと生物学的試料内に存在する自己抗体との間で形成される抗原抗体複合体を検出するための第２の試薬であって、自己抗体が、対象におけるＲＡの指標となる抗ＰＡＤ４自己抗体である試薬とを含む。
【００２７】
さらに別の態様において、本発明は、対象におけるＲＡの診断のためのアレイを提供する。とりわけ、本発明は、試験される対象から得られる生物学的試料におけるＲＡ特異的自己抗体の存在を検出するためのアレイを提供する。より具体的には、本発明に従ったアレイは、その表面に付着した、ＢＲＡＦ触媒ドメインまたはその抗体結合断片を含む自己抗原マーカーと、場合によっては、ＰＡＤ４またはその抗体結合断片を含む第２の自己抗原マーカーとを含む。特定の実施形態において、本発明のアレイはさらに、その表面に付着した、抗核抗体および抗ＣＣＰ抗体などのＲＡ特異的自己抗体の存在を検出するための少なくとも１つのさらなる自己抗原マーカーを含む。
【００２８】
本発明のこれらおよび他の目的、利点、および特徴が、以下の好ましい実施形態の詳細な説明を読んだ当業者には明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】１９人のＲＡ患者、７人のＡＳ患者、２人のＳＬＥ患者、および４人のＳＳＣ患者、ならびに１０人の健康な対照のそれぞれの血清により認識されるＰｒｏｔｏＡｒｒａｙヒトタンパク質マイクロアレイのタンパク質の数を示すグラフである。
【図１Ｂ】患者および健康な対照のそれぞれの群により認識されるタンパク質マイクロアレイのタンパク質の平均数を示すグラフである。
【図２】ＡＳ患者、ＳＬＥ患者、ＳＳＣ患者、健康な対照、および２個、１個、または０個のＲＡ関連ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子を発現するＲＡ患者により認識されるＰｒｏｔｏＡｒｒａｙヒトタンパク質マイクロアレイのタンパク質の平均数を示すグラフである。
【図３】少なくとも１人のＲＡ患者、少なくとも２人のＲＡ患者、少なくとも３人のＲＡ患者などにより認識されるＰｒｏｔｏＡｒｒａｙヒトタンパク質マイクロアレイのタンパク質の総数を示すグラフである。また、ＡＳ患者の少なくとも２０％、ＳＳＣ患者の少なくとも２０％、および健康な個体の少なくとも２０％によっても認識される、ＲＡ患者により認識されるタンパク質も、このグラフにおいて示される。
【図４】ＲＡ患者の血清により最も頻繁に認識されることが明らかになったタンパク質を列挙する表である。これらのタンパク質を認識したＲＡ患者、ＡＳ患者、ＳＬＥ患者、ＳＳＣ患者、および健康な個体の数がこの表において表される。また、それぞれのタンパク質の対応するヌクレオチド配列のＧｅｎＢａｎｋ登録番号も表される。
【図５Ａ】ＥＬＩＳＡにより決定された、ＰＡＤ４について陽性のＲＡ患者、ＡＳ患者、および健康な個体のパーセンテージを示すグラフである。
【図５Ｂ】ＥＬＩＳＡにより決定された、ＰＡＤ４について陽性の、２個（ＳＥ＋／ＳＥ＋）、１個（ＳＥ＋／ＳＥ−）、または０個（ＳＥ−／ＳＥ−）のＲＡ関連ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子を発現するＲＡ患者のパーセンテージを示すグラフである。
【図６Ａ】ＥＬＩＳＡにより決定された、ＰＩＰ４Ｋ２Ｃについて陽性のＲＡ患者、ＡＳ患者、および健康な個体のパーセンテージを示すグラフである。
【図６Ｂ】ＥＬＩＳＡにより決定された、ＰＩＰ４Ｋ２Ｃについて陽性の、２個（ＳＥ＋／ＳＥ＋）、１個（ＳＥ＋／ＳＥ−）、または０個（ＳＥ−／ＳＥ−）のＲＡ関連ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子を発現するＲＡ患者のパーセンテージを示すグラフである。
【図７Ａ】ウェスタンブロッティングにより決定された、ＢＲＡＦ触媒ドメインについて陽性のＲＡ患者、ＡＳ患者、および健康な個体のパーセンテージを示すグラフである。
【図７Ｂ】ウェスタンブロッティングにより決定された、ＢＲＡＦ触媒ドメインについて陽性の、２個（ＳＥ＋／ＳＥ＋）、１個（ＳＥ＋／ＳＥ−）、または０個（ＳＥ−／ＳＥ−）のＲＡ関連ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子を発現するＲＡ患者のパーセンテージを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
定義
本明細書を通して、以下の段落において定義されるいくつかの用語が用いられる。
【００３１】
本明細書において用いられる場合、「対象」という用語は、ＲＡに罹患し得るが疾患を有していてもよく、または有していなくてもよい、ヒトまたは別の哺乳動物（例えば、霊長類、犬、猫、山羊、馬、豚、マウス、ラット、ウサギなど）を言う。本発明の多くの実施形態において、対象は人間である。このような実施形態において、対象はしばしば「個体」と呼ばれる。「個体」という用語は特定の年齢を指すものではなく、したがって、子供、十代、および成人を包含する。
【００３２】
「ＲＡを有することが疑われる対象」という用語は、ＲＡの指標となる１つもしくは複数の症状（例えば、関節の痛み、こわばり、もしくは腫れ）を示す対象、または（例えば、検診中に）ＲＡについてスクリーニングされる対象を言う。その代わりに、またはそれに加えて、ＲＡを有することが疑われる対象は、１つまたは複数の危険因子（例えば、年齢、性別、家族歴、喫煙など）を有し得る。この用語は、ＲＡについて試験されていない対象および初期診断を受けた対象も包含する。
【００３３】
「生物学的試料」という用語は、本明細書において、その最も広い意味で用いられる。生物学的試料は通常、対象から得られる。試料は、本発明のバイオマーカーと共にアッセイされ得る、任意の生物学的組織または液体のものであり得る。試料は、「臨床試料」、すなわち患者に由来する試料であることが多い。このような試料には、限定はしないが、細胞を含んでいてもよく、または含んでいなくてもよい体液、例えば血液（例えば全血、血清、または血漿）、尿、滑液、唾液、および関節液、骨または軟骨などから得られる組織または細針生検試料、ならびに診断、治療、および／または転帰の履歴が知られている保存された試料が含まれる。生物学的試料にはまた、組織学的な目的で採取された凍結切片などの組織切片が含まれ得る。「生物学的試料」という用語はまた、生物学的試料を処理することにより得られる任意の材料を包含する。得られる材料には、限定はしないが、試料またはその試料から抽出されるタンパク質から単離される細胞（またはその後代）が含まれる。生物学的試料の処理は、ろ過、蒸留、抽出、濃縮、干渉成分の不活性化、試薬の添加などの１つまたは複数を伴い得る。
【００３４】
「正常な」および「健康な」という用語は、本明細書においてほぼ同じ意味で用いられる。それらは、いずれのＲＡ症状も示していない対象、およびＲＡまたは軟骨もしくは骨の傷害と診断されていない対象を言う。好ましくは、正常な対象は、ＲＡに対する投薬治療を受けておらず、いずれの他の疾患とも診断されていない（特に、自己免疫性炎症性疾患）。特定の実施形態において、正常な対象は、試験される生物学的試料を得た対象と比較して同様の性別、年齢、および／または肥満度指数を有する。「正常な」という用語はまた、本明細書において、健康な対象から得られる試料を特定するために用いられる。
【００３５】
本発明の関連において、「対照」という用語は、対象を特徴付けるために用いられる場合、健康な対象またはＲＡ以外の特定の疾患と診断された患者を言う。「対照試料」という用語は、健康な対象またはＲＡ以外の疾患と診断された患者から得られた１つまたは２つ以上の試料を言う。
【００３６】
「自己抗体」という用語は、本明細書において用いられる場合、その技術分野において理解されている意味を有し、かつ、対象の免疫系により産生され、対象自身のタンパク質の１つまたは複数に対する抗体を言う。自己抗体は、身体自体の細胞、組織、および／または器官を攻撃し得、炎症および損傷を生じさせる。
【００３７】
本明細書において用いられる場合、「自己抗原」という用語は、自己免疫反応の場合と同様に対象の身体における自己抗体の産生を刺激する、内因性抗原またはその活性断片を言う。この用語はまた、対象内または対象から得られる生物学的試料内に存在する自己抗体と抗原抗体複合体を形成し得る、任意の物質を包含する。
【００３８】
「抗体結合断片」という用語は、抗原と組み合わせて本明細書において用いられる場合、抗体に結合して抗原抗体複合体を形成するという抗原の能力を保持している、本発明の抗原の断片を言う。とりわけ、本発明の抗原の抗体結合断片は、ＲＡ特異的自己抗体を結合する能力を保持している。抗原の適切な抗体抗原断片は、ＲＡ特異的自己抗体を結合するそれらの能力を確認するための単純な検査によって当業者が同定することができる。
【００３９】
「バイオマーカー」および「マーカー」という用語は、本明細書において、ほぼ同じ意味で用いられる。それらは、生物学的プロセス、生物学的事象、および／または病理学的状態の特徴的な指標となる物質を言う。本明細書において用いられる場合、「自己抗原マーカー」という用語は、本明細書において定義される、自己抗体を伴う生物学的プロセス、生物学的事象、および／または病理学的状態の特徴的な指標となる自己抗原を言う。
【００４０】
本明細書において用いられる場合、「ＲＡの指標となる」という用語は、プロセスまたは事象に適用される場合、プロセスまたは事象が健康な対象および／またはＲＡ以外の疾患に罹患している対象におけるよりもＲＡを有する対象において有意に頻繁に見られるような、ＲＡの診断に役立つプロセスまたは事象を言う。
【００４１】
「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」という用語は、本明細書においてほぼ同じ意味で用いられ、それらの中性（荷電していない）形態の、または塩としての、およびグリコシル化、側鎖の酸化、またはリン酸化により修飾されていないかまたは修飾されている、様々な長さのアミノ酸配列を言う。特定の実施形態において、アミノ酸配列は、完全長の天然タンパク質である。他の実施形態において、アミノ酸配列は、完全長タンパク質の小断片である。さらに他の実施形態において、アミノ酸配列は、グリコシル単位、脂質、またはリン酸塩などの無機イオンなどの、アミノ酸の側鎖に付着したさらなる置換基により、およびスルフヒドリル基の酸化などの鎖の化学的変換に関する修飾により修飾される。したがって、「タンパク質」という用語（またはその同等の用語）は、その特異的特性を有意には変化させない修飾を受ける完全長の天然タンパク質のアミノ酸配列またはその断片を含むことを意図したものである。とりわけ、「タンパク質」という用語は、タンパク質アイソフォーム、すなわち、同一の遺伝子によりコードされるがｐＩもしくはＭＷまたはその両方が異なる変異体を包含する。このようなアイソフォームは、アミノ酸配列が異なり得るか（例えば、選択的スプライシングまたは制限タンパク質分解の結果として）、あるいは、差次的な翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、アシル化、ホスホリル化）から生じ得る。
【００４２】
「タンパク質類似体」という用語は、本明細書において用いられる場合、タンパク質と同様のまたは同一の機能を有するが、そのタンパク質のアミノ酸配列と同様もしくは同一であるアミノ酸配列またはそのタンパク質の構造と同様もしくは同一の構造を含んでいる必要はないポリペプチドを言う。好ましくは、本発明の関連において、タンパク質類似体は、タンパク質のアミノ酸配列に少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一なアミノ酸配列を有する。
【００４３】
「タンパク質断片」という用語は、本明細書において用いられる場合、タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも５個のアミノ酸残基（好ましくは、少なくとも約１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、または２５０個のアミノ酸残基）からなるアミノ酸配列を含むポリペプチドを言う。タンパク質の断片は、タンパク質の機能的活性を有していてもよく、または有していなくてもよい。
【００４４】
「相同」（または「相同性」）という用語は、本明細書において用いられる場合、「同一性」という用語と同義であり、２つのポリペプチド分子の間または２つの核酸分子の間の配列類似性を言う。比較される配列の両方における１つの位置に同一の塩基または同一のアミノ酸残基が存在する場合、それぞれの分子はその位置で相同である。２つの配列の間の相同性のパーセンテージは、２つの配列が共有する、一致するかまたは相同な位置の数を、比較される位置の数で割り、１００をかけたものに対応する。通常、比較は、２つの配列をアラインして最大の相同性を得る場合に行われる。相同なアミノ酸配列は、同一のまたは類似のアミノ酸配列を共有する。類似の残基は、参照配列における対応するアミノ酸残基に対する保存的置換、または前記残基の「許容される点突然変異」である。参照配列における残基の「保存的置換」は、対応する参照残基に物理的または機能的に類似の置換、例えば、類似のサイズ、形状、電荷、共有結合または水素結合を形成する能力を含む化学的特性などを有する置換である。特に好ましい保存的置換は、Ｄａｙｈｏｆｆらによる「認められた点突然変異」について規定された基準を満たす保存的置換である（「Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」、１９７８、Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ、Ｓｕｐｐｌ．３、２２：３５４〜３５２）。
【００４５】
「タンパク質アレイ」および「タンパク質チップ」という用語は、本明細書においてほぼ同じ意味で用いられる。それらは、基質上の個別のスポットに異なるタンパク質が規則的な様式で固定化されている基質表面を言う。タンパク質アレイは、タンパク質／タンパク質相互作用（例えば、抗原／抗体相互作用）を同定するため、酵素の基質を同定するため、または生物学的に活性な小分子の標的を同定するために用いることができる。「マイクロアレイ」という用語は、より具体的には、小型化され、視覚的評価のための顕微鏡的試験が必要となるアレイを言う。
【００４６】
「標識された」、「検出可能な作用物質で標識された」、および「検出可能な部分構造で標識された」という用語は、本明細書においてほぼ同じ意味で用いられる。これらの用語は、実体（例えば抗原）が例えば別の実体（例えば抗体）に結合した後に可視化され得ることを特定するために用いられる。好ましくは、検出可能な作用物質または部分構造はシグナルを生じさせるように選択され、前記シグナルは、測定可能であり、その強度が、結合した実体の量に関連するものである。アレイに基づいた方法において、検出可能な作用物質または部分構造はまた、好ましくは、局所的なシグナルを生じさせ、それによりアレイ上の各スポットからのシグナルの空間分解能を可能にするように選択される。タンパク質およびポリペプチドを標識するための方法は、当技術分野において周知である。標識ポリペプチドは、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、もしくは化学的手段、または任意の他の適切な手段により直接的または間接的に検出可能な、標識の組み込みまたは標識への結合により調製することができる。適切な検出可能な作用物質には、限定はしないが、様々なリガンド、放射性核種、蛍光染料、化学発光作用物質、微小粒子、酵素、比色標識、磁気標識、およびハプテンが含まれる。
【００４７】
「治療」という用語は、（１）疾患もしくは状態の発病を遅らせるかもしくは予防すること、または（２）症状の状態の進行、重篤化、もしくは悪化を減速もしくは停止させること、または（３）症状の状態の改善をもたらすこと、または（４）状態を治癒させることを目的とする方法を特徴付けるために、本明細書において用いられる。治療は、予防的または防止的作用のために、疾患の発病の前に投与され得る。治療はまた、治療作用のために疾患の開始後にも投与され得る。
【００４８】
特定の好ましい実施形態の詳細な説明
上述したように、本発明は、患者から得られる生物学的試料におけるＲＡ特異的自己抗体の存在を検出するために用いることができる自己抗原マーカーを提供するものである。また、ＲＡの診断のためにこれらの自己抗原マーカーを用いるための方法も提供される。
【００４９】
Ｉ− ＲＡの自己抗原マーカー
実施例の節において記載されるように、本出願人らは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されているＰｒｏｔｏＡｒｒａｙヒトタンパク質マイクロアレイを用いてＲＡ患者の血清をスクリーニングすることにより、ＲＡのバイオマーカーを同定した。このマイクロアレイは、プロテアーゼ／ペプチダーゼ、分泌タンパク質、転写因子、細胞死タンパク質、プロテインキナーゼ、核タンパク質、膜タンパク質、および代謝タンパク質を含む、８０００個を超えるヒトタンパク質を含む。より具体的には、本出願人らは、ＲＡ患者、ならびに脊椎関節症（ＡＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、および全身性硬化（ＳＳＣ）に罹患している患者と健康な個体とを含む様々な対照から得られる血清試料をスクリーニングし、試験した様々な群について結合パターンを比較した。本出願人らは、ＲＡ患者の血清により認識されるタンパク質の大部分が対照の血清によっても認識されることを見出した（図３を参照されたい）。
【００５０】
ＲＡ患者の多くにより認識されたタンパク質を、図４に示される表に列挙する。これらのタンパク質には、ＰＡＤ４、ＢＲＡＦ触媒ドメイン、腫瘍抑制副伝達性候補４、プロテインキナーゼＣベータ１、ヌクレオシド二リン酸結合部分Ｘモチーフ２１型、ヌクレオシド二リン酸結合部分Ｘモチーフ２１型、ＥＰＨ受容体Ｂ１、微小管関連ＲＰ ＥＢファミリーのメンバー、ＰＩＰ４Ｋ２Ｃ、プロテインキナーゼＣシータ、Ｖ ＥＲＢ Ｂ２、カルシウムカルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩアルファ、プロテインキナーゼＣアルファ、プロテインキナーゼＣベータ１、およびＤＥＰドメイン６が含まれる。
【００５１】
これらのタンパク質の３つのみが、ＲＡ患者の血清により特異的に認識されることが明らかになり（図４を参照されたい）、それらをＲＡの潜在的な候補バイオマーカーとした。これらのタンパク質は、ＰＡＤ４（ペプチジルアルギニンデイミナーゼ４）、ＰＫＣベータ１（プロテインキナーゼＣベータ１）、およびＰＩＰ４Ｋ２Ｃ（ホスファチルイノシトール４リン酸５キナーゼＩＩ型ガンマ）である。試験したＲＡ患者のうち４７％がＰＡＤ４について陽性であり、３１％がＰＫＣベータ１について陽性であり、２６％がＰＩＰ４Ｋ２Ｃについて陽性であったが、対照群の個体はこれらのタンパク質のそれぞれについて全て陰性であった。これらの３つの候補バイオマーカーに加え、本出願人らは、ＢＲＡＦ触媒ドメイン（ｖ ｒａｆマウス肉腫ウイルス癌遺伝子類似体Ｂ１触媒ドメイン）を選び出したが、それは、このタンパク質が興味深い選択性を示すことが明らかになったためである（図４を参照されたい）。実際、スクリーニング実験において、ＡＳ患者の０％、ＳＬＥ患者の０％、ＳＳＣ患者の０％、および健康な個体の１０％がＢＲＡＦ候補ドメインについて陽性であったのに対し、試験したＲＡ患者の４７％がＢＲＡＦ候補ドメインについて陽性であることが明らかになった。
【００５２】
実施例の節において記載されるように、本出願人らは次に、ウェスタンブロッティングおよび／またはＥＬＩＳＡを用いて、スクリーニング実験において同定されたＲＡの潜在的な候補バイオマーカー（すなわち、ＰＡＤ４、ＰＫＣベータ１、ＰＩＰ４Ｋ２Ｃ、およびＢＲＡＦ触媒ドメイン）の有効性を実証した。このさらなる試験により、４個の候補の２個のみがＲＡの自己抗原マーカーとして有効性を実証された。有効性を実証されたタンパク質は、ＢＲＡＦ触媒ドメインおよびＰＡＤ４である。実際、タンパク質アレイのスクリーニングおよびウェスタンブロッティング分析により、ＡＳ患者の０％、ＳＬＥ患者の０％、ＳＳＣ患者の０％、および健康な個体の４％のみがＢＲＡＦ候補ドメインについて陽性であったのに対し、ＲＡ患者の４７％がＢＲＡＦ候補ドメインについて陽性であることが明らかになった。タンパク質アレイのスクリーニングおよびＥＬＩＳＡ分析により、ＡＳ患者の０％、ＳＳＣ患者の０％、および健康な個体の３％がＰＡＤ４について陽性であったのに対し、ＲＡ患者の３２％がＰＡＤ４について陽性であることが明らかになった。
【００５３】
したがって、特定の実施形態において、本発明は、ＢＲＡＦ触媒ドメインまたはその抗体結合断片もしくは変異体を含む自己抗原マーカーを提供する。他の実施形態において、本発明は、ＰＡＤ４またはその抗体結合断片もしくは変異体を含む自己抗原マーカーを提供する。
【００５４】
ＢＲＡＦ触媒ドメイン
ＢＲＡＦ（Ｂ−ｒａｆとも呼ばれる）は、ＲＡＦタンパク質ファミリーのセリン−スレオニンキナーゼタンパク質である。これは、細胞の成長を調節する保存された経路であるマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達経路に関与する。この経路を介したシグナル伝達は、ヒトの癌のおよそ３０％において上昇している。この経路はまた、関節の炎症および破壊をもたらす炎症性サイトカインの産生に関与することが知られている（Ｃ．Ｍ．ＣｒｅｗｓおよびＲ．Ｌ．Ｅｒｉｋｓｏｎ、Ｃｅｌｌ、１９９３、７４：２１５〜２１７；Ｔ．Ｔｈａｌｈａｍｅｒら、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ、２００８、４７：４０９〜４１４）。
【００５５】
ＲＡＦタンパク質は、Ｎ末端の調節領域およびＣ末端の触媒ドメインを含む。それらは、３つの保存領域、すなわちＣＲ１、ＣＲ２、およびＣＲ３からなる。ＣＲ１は２つのＲａｓ結合ドメイン（Ｒａｆ様Ｒａｓ結合ドメインであるＲＢＤ、およびシステインに富んだドメインであるＣＲＤ）を有し、ＣＲ２はセリン／スレオニンに富んだドメインであり、ＣＲ３は触媒キナーゼドメインである。ヒトにおいて、ＢＲＡＦ遺伝子は、７６６個のアミノ酸残基からなるＢＲＡＦタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＰ＿００４３２４．１）をコードし、その配列は配列番号１において定義される。
【００５６】
【表１】
【００５７】
このタンパク質において、ＲＢＤはアミノ酸１５６から２２７にわたり、プロテインキナーゼＣ保存領域１ドメインはアミノ酸２３５から２８０にわたり、セリン−スレオニンキナーゼ触媒ドメインはアミノ酸４５６から７１２にわたる。
【００５８】
本発明の関連において、「ＢＲＡＦ触媒ドメイン」という用語は、ＢＲＡＦタンパク質のセリン−スレオニンキナーゼ触媒ドメインの配列を含むアミノ酸配列を言う。したがって、例えば、ＢＲＡＦ触媒ドメインのアミノ酸配列は、ＢＲＡＦのセリン−スレオニンキナーゼ触媒ドメインの配列を包含するＢＲＡＦタンパク質のアミノ酸配列であり得る。あるいは、ＢＲＡＦ触媒ドメインのアミノ酸配列は、ＢＲＡＦタンパク質のセリン−スレオニンキナーゼ触媒ドメインの配列であり得る。
【００５９】
本発明の実施において、ＢＲＡＦタンパク質は任意の適切な哺乳動物（例えば、ＢＲＡＦタンパク質の配列が決定されているかまたは予想されているラット、犬、牛、霊長類）由来のものであり得る。しかし、ヒト対象の生物学的試料が試験される実施形態において、ＢＲＡＦタンパク質は好ましくはヒト由来のものである。「ヒト由来のもの」という用語は、タンパク質（またはその領域もしくは断片）を特徴付けるために本明細書において用いられる場合、ヒトタンパク質（すなわち、ヒトの身体において天然に生じる野生型タンパク質）に相同なタンパク質またはポリペプチドを言う。
【００６０】
したがって、ＢＲＡＦタンパク質がヒト由来のものである実施形態において、「ＢＲＡＦ触媒ドメイン」という用語は、配列番号１のアミノ酸４５６からアミノ酸７１２にわたる配列を含むアミノ酸配列を言う。したがって、特定の実施形態において、本発明は、配列番号１のアミノ酸４５６から７１２にわたる配列またはその抗原結合断片を含む自己抗原マーカーを提供する。ＢＲＡＦ触媒ドメインの抗原結合断片は、ＲＡ特異的自己抗体を結合する抗原の能力を保持している、ＢＲＡＦ触媒ドメインの任意の断片である。
【００６１】
本出願人らが用いたＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎヒトタンパク質マイクロアレイにおいて、ＢＲＡＦ触媒ドメインは、配列番号１のアミノ酸４１６から７６６にわたるアミノ酸配列（すなわち、セリン−スレオニンキナーゼ触媒ドメインを包含するＢＲＡＦタンパク質のアミノ酸配列）を含み、この配列は、配列番号２において示されているように、５９９位のバリン残基（Ｖ）がグルタミン酸残基（Ｅ）により置換されている。ヒトの癌においてしばしば見られるＢＲＡＦのＶ５９９Ｅ突然変異は、野生型ＢＲＡＦと比較したキナーゼ活性の上昇に関連することが実証されている（Ｈ．Ｄａｖｉｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、２００２、４１７：９４９〜９５４；Ｍ．Ｈ．Ａｎｄｅｒｓｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、２００４、６４：５４５６〜５４６０）。
【００６２】
【表２】
【００６３】
したがって、特定の実施形態において、本発明は、配列番号２のアミノ酸４１６から７６６にわたる配列またはその抗原結合断片を含む自己抗原マーカーを提供する。
【００６４】
本発明はまた、ＢＲＡＦ触媒ドメインの変異体またはその抗体結合断片を含む自己抗原マーカーを包含する。適切な変異体には置換変異体が含まれ、この置換変異体は、天然の状態で保存的であり、かつ、イソロイシンもしくはバリン残基によるロイシン残基の置換、グルタミン酸残基によるアスパラギン酸残基の置換、またはセリン残基によるスレオニン残基の置換などの、天然に生じるポリペプチドで類似の構造的および／または化学的特性を有する別のアミノ酸による、１つまたは２つ以上のアミノ酸の置換により生じるものである。他の適切な変異体には、１つまたは２つ以上のアミノ酸の挿入または欠失により生じる、挿入変異体または欠失変異体が含まれる。適切な変異体は、天然に生じるポリペプチドの抗原結合活性を保持しているものである。それらは、単純な抗体結合アッセイにより容易に同定され得る。
【００６５】
ＰＡＤ４
ＰＡＤ４（ペプチジルアルギニンデイミナーゼ４）は、アルギニン残基をシトルリンに変換するＣＡ２＋依存性酵素である。ＰＡＤ４遺伝子におけるＲＡ関連の突然変異は様々な個体群において同定されており（Ａ．Ｓｕｚｕｋｉら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、２００３、３４：３９５〜４０２；Ｔ．Ｉｗａｍｏｔｏら、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ、２００６、４５：８０４〜８０７；およびＹ．Ｈ．Ｌｅｅら、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．Ｉｎｔ．、２００７、２７：８２７〜２３３）、また、ＲＡ患者はシトルリン含有タンパク質を認識する自己抗体を産生するため、ＰＡＤ４は、ＲＡ疾患の発病および進行の原因となると広く考えられている。ＰＡＤ４が一部のＲＡ患者において立体構造依存性の自己抗原であることが既に示されている（Ｙ．Ｔａｋｉｚａｗａら、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．、２００５、３：２１２〜２１５）。
【００６６】
ヒトにおいて、ＰＡＤ４タンパク質は、６６３個のアミノ酸残基（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＰ＿０３６５１９．１）を含み、配列番号３において定義される配列を有する。
【００６７】
【表３】
【００６８】
既に上述したように、本発明は、ＢＲＡＦ触媒ドメインまたはその抗体結合断片を含む自己抗原マーカーと組み合わせてＲＡの診断に用いることができる、ＰＡＤ４またはその抗体結合断片を含む自己抗原マーカーを提供する。本発明の関連において、「ＰＡＤ４」という用語は、天然に生じるＰＡＤ４タンパク質に相同なアミノ酸配列を言う。ＰＡＤ４タンパク質は、任意の適切な哺乳動物由来のものであり得る。しかし、ヒト患者から得られる生物学的試料が試験される実施形態において、ＰＡＤ４タンパク質は好ましくはヒト由来のものである。したがって、特定の実施形態において、本発明は、配列番号３により定義されるアミノ酸配列、その抗体結合断片、またはその変異体を含む、自己抗原マーカーを提供する。
【００６９】
自己抗原マーカーの調製
本発明の自己抗原マーカーは、化学的合成および組換え方法を含む任意の適切な方法によって調製することができる。
【００７０】
本発明のバイオマーカーは通常、十分に短いため、標準的な方法を用いる化学的合成が実行可能である。Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９６３、８５：２１４９〜２１５４）により最初に記載された固相ペプチド合成は、既知の配列のペプチドおよび小ペプチド分子を合成するための迅速で容易なアプローチである。このような固相技術の資料は、例えば、「Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｇ．Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ（編）、１９９７、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）において見ることができる。これらの合成手順のほとんどは、成長中のペプチド鎖への、１つまたは複数のアミノ酸残基または適切に保護されたアミノ酸残基の連続的な付加を伴う。例えば、第１のアミノ酸のカルボキシル基は、不安定な結合を介して固相に付着しており、事前に化学的に保護されて自己縮合を避けるようになっているアミノ基を有する第２のアミノ酸と反応する。結合した後、アミノ基は脱保護され、次のアミノ酸とプロセスが反復される。所望のペプチドが組み立てられると、それは固相から切断され、沈殿され、得られた遊離ペプチドは所望により分析および／または精製され得る。例えば「Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（Ｖｏｌ．ＩＩ、第３版、Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈら（編）、１９７６、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１０５〜２３７ページ）に記載されているような溶解方法もまた、本発明のバイオマーカーを合成するために用いることができる。
【００７１】
あるいは、本明細書において提供される自己抗原マーカーは、組換えＤＮＡ法によって産生することができる。これらの方法は通常、所望のタンパク質をコードする遺伝子の単離、適切なベクターへの遺伝子の組み込み、および細胞培養系における大量発現を含む。本発明のポリペプチドの配列をコードするＤＮＡは十分に短いため、当技術分野において知られている方法を用いて容易に合成的に調製される（例えば、Ｍ．Ｐ．Ｅｄｇｅら、Ｎａｔｕｒｅ、１９８１、２９２：７５６〜７６２を参照されたい）。
【００７２】
合成した後、所望のペプチドをコードするＤＮＡは、プラスミド、ファージ、ウイルス粒子、または、ベクターを含む他の核酸分子もしくは媒体を含む核酸分子であり得る、組換え発現ベクター内に挿入され、前記核酸分子は、適切な宿主細胞内に導入されると、目的のコード配列の発現を指示するための必要な遺伝的要素を含むものである。当技術分野において周知の標準的な技術を用いて、発現ベクター内に核酸分子を挿入することができる。挿入により、コード配列が、必要な調節配列に作動可能に連結される。
【００７３】
タンパク質の産生において用いるための宿主細胞は周知であり、容易に入手可能である。宿主細胞の例には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの弱毒株などの細菌細胞、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ株、Ｃａｎｄｉｄａ、または異種タンパク質を発現し得る任意の酵母株などの酵母細胞、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａなどの昆虫細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、サルＣＯＳ細胞、およびマウス３Ｔ３細胞などのヒト以外の哺乳動物組織培養細胞、ならびにＨｅＬａ細胞、ＨＬ−６０細胞、腎２９３細胞、および表皮Ｓ４３１細胞などのヒト組織培養細胞が含まれる。
【００７４】
周知の発現系においてポリペプチドを産生するためのいくつかの発現ベクターが市販されている。例えば、プラスミドｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから入手可能）およびｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡから入手可能）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおける本発明のペプチドの産生に用いることができる。同様に、プラスミドｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、酵母のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株におけるペプチドの産生に用いることができる。バキュロウイルス発現系のための市販されているＭａｃＢａｃＲ（商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から入手可能なＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（商標）トランスフェクションキットを、昆虫細胞における産生に用いることができ、一方、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されているプラスミドｐｃＤＮＡ Ｉ、ｐｃＤＮＡ３、およびｐＲｃ／ＲＳＶを、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞における本発明のペプチドの産生に用いることができる。
【００７５】
他の発現ベクターおよび発現系を、当業者に周知の方法を用いて得るかまたは生成することができる。プロモーターおよびポリアデニル化シグナルなどの必須の制御配列、好ましくはエンハンサーを含有する発現系は、様々な宿主に対して容易に利用可能である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、１９８９、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ、ＮＹ；およびＲ．Ｋａｕｆｍａｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９９０、１８５：５３７〜５６６を参照されたい）。
【００７６】
所望のタンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを用いて、適合性のある宿主細胞を形質転換する。宿主細胞はその後、所望のタンパク質の発現を促進する条件下で培養および維持される。そのようにして産生されたタンパク質は、培地から直接的に、または細胞の溶解により、回収および単離される。次にそれを、核磁気共鳴（ＮＭＲ）およびＸ線結晶構造解析などの様々な方法により特徴付けることができる。
【００７７】
当業者に理解されているように、本発明の自己抗原マーカーは融合タンパク質（すなわち、抗体結合部分、例えばＢＲＡＦ触媒ドメインがポリペプチド体に結合している分子）として産生され得る。このようなポリペプチド体は、得られる融合タンパク質に、多くの有利な特性のいずれかを付与するために選択され得る。例えば、ポリペプチド体は、組換え融合タンパク質の発現を増大させるために選択され得る。その代わりに、またはそれに加えて、ポリペプチド体は、例えばアフィニティー精製におけるリガンドとして作用することにより、融合タンパク質の精製を容易にし得る。タンパク質分解の切断部位を組換えタンパク質に付加し、それにより、精製の後に所望の配列をポリペプチド体から最終的に分離することができる。ポリペプチド体はまた、安定性が目的である場合、融合タンパク質に向上した安定性を付与するために選択され得る。適切なポリペプチド体の例には、例えば、得られた融合タンパク質をニッケルキレートカラム上で容易に精製することを可能にするポリヒスチジンタグが含まれる。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＢ結合タンパク質、またはプロテインＡは、市販されている融合発現ベクターを用いてＢＲＡＦ触媒ドメイン（またはＰＡＤ４）に融合され得る適切なポリペプチド体の他の例である。
【００７８】
あるいは、本発明の自己抗原マーカーは、（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）市販されているＢＲＡＦ触媒ドメイン、またはＰＡＤ４を用いて調製され得る。
【００７９】
特定の実施形態において、本発明の自己抗原マーカーは、固体の担体または支持体（例えば、ビーズまたはアレイ）上に固定化して提供される。固体表面上にポリペプチド分子を固定化するための方法は、当技術分野において知られている。とりわけ、本発明は、ＢＲＡＦ触媒ドメインまたはその抗体結合断片を含む自己抗原マーカーと、ＲＡの少なくとも１つの他のバイオマーカーとを表面に固定化された状態で含む、ＲＡの診断のためのアレイを提供する。特定の実施形態において、ＲＡの少なくとも１つの他のバイオマーカーは、ＰＡＤ４またはその抗体結合断片を含む自己抗原マーカーである。その代わりに、またはそれに加えて、アレイはさらに、対象から得られる生物学的試料における抗核抗体および／または抗ＣＣＰ抗体の存在の検出を可能にするバイオマーカーを表面上に固定化された状態で含み得る。「ＲＡの診断のためのアレイ」および「ＲＡを診断するためのアレイ」という用語は、本明細書においてほぼ同じ意味で用いられる。それらは、より具体的には、生物学的試料におけるＲＡ特異的自己抗体の検出のためのアレイを言う。
【００８０】
ＩＩ− 診断方法
本発明の自己抗原マーカーは、対象から得られる生物学的試料において、ＲＡの指標となる自己抗体の存在を検出するために用いることができる。
【００８１】
したがって、本発明は、対象におけるＲＡを診断するための方法を提供する。このような方法は、対象から得られる生物学的試料を、本発明の自己抗原マーカーと、自己抗原マーカーと生物学的試料内に存在する自己抗体との間での抗原抗体複合体の形成を可能にする時間および条件下で接触させることと、形成された任意の抗原抗体複合体の存在または不存在を検出することとを含み、抗原抗体複合体の存在は、対象におけるＲＡの指標となる。
【００８２】
とりわけ、本発明は、ＢＲＡＦ触媒ドメインまたはその抗体結合断片を含む自己抗原マーカーを用いて生物学的試料における抗ＢＲＡＦ自己抗体の存在を検出することにより対象におけるＲＡを診断するための方法を提供する。このような方法はさらに、ＰＡＤ４またはその抗体結合断片を含む自己抗原マーカーを用いて生物学的試料における抗ＰＡＤ４自己抗体の存在を検出することを含み得る。
【００８３】
生物学的試料
本発明の診断方法は、１つまたは複数の本発明のバイオマーカーをアッセイすることを可能にする、任意のタイプの生物学的試料の研究に適用され得る。適切な生物学的試料の例には、限定はしないが、尿、全血、血清、血漿、唾液、および滑液が含まれる。本発明の実施において用いられる生物学的試料は、対象から回収された新鮮なもしくは凍結された試料、または診断、治療、および／もしくは転帰の履歴が知られている保存された試料であり得る。生物学的試料は、例えば、対象からの血液の採取または細針吸引もしくは針生検の使用による、任意の非侵襲的手段により回収することができる。
【００８４】
好ましい実施形態において、本発明の方法は、試料の処理をすることなく、または限られた処理と共に、生物学的試料自体に対して実施される。
【００８５】
しかし、あるいは、本発明の方法は、生物学的試料から調製されたタンパク質抽出物に対して実施され得る。この場合、タンパク質抽出物は、好ましくは、全タンパク質含有物を含む。タンパク質抽出の方法は、当技術分野において周知である（例えば、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ」、Ｄ．Ｍ．Ｂｏｌｌａｇら、第２版、１９９６、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ；「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｅ．Ｌ．ＨａｒｒｉｓおよびＳ．Ａｎｇａｌ（編）、１９８９；「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｓ．Ｒｏｅ、第２版、２００１、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ」、Ｈ．Ａｈｍｅｄ、２００５、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ：Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬを参照されたい）。様々なキットを、体液および組織からタンパク質を抽出するために用いることができる。このようなキットは、例えばＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から市販されている。その後のプロトコルを非常に詳細に記載しているユーザーガイドが、通常はこれらのキットの全てに含まれる。感度、処理時間、および経費はキットごとに異なり得る。当業者であれば、特定の状況に最も適したキット（１つまたは複数）を容易に選択することができる。
【００８６】
抗原抗体複合体の検出
本発明の診断方法は通常、自己抗原マーカーと生物学的試料内に存在するＲＡ特異的自己抗体との間で形成される複合体の検出を伴う。本発明の実施において、このような抗原抗体複合体の検出は、任意の適切な方法によって行うことができる（例えば、Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＡ．Ｌａｎｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｍａｎｕａｌ」、１９８８、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹを参照されたい）。
【００８７】
例えば、抗原抗体複合体の検出は、免疫アッセイを用いて行うことができる。放射免疫アッセイ、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、および免疫蛍光免疫沈降を含む、広範な免疫アッセイ技術が利用可能である。免疫アッセイは当技術分野において周知である。このようなアッセイを実施するための方法、ならびに実用上の用途および手順は、テキストブックに要約されている。このようなテキストブックの例には、Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｉｎ：Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ、Ｒ．Ｈ．Ｂｕｒｄｏｎおよびｖ．Ｐ．Ｈ．Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９９０）、２２１〜２７８ページ、ならびに、免疫学的検出方法を記載している、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｓ．Ｐ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓの様々な巻、とりわけ第７０、７３、７４、８４、９２、および１２１巻が含まれる。免疫アッセイは、競合的または非競合的であってよい。
【００８８】
例えば、サンドイッチアッセイ技術の多くの変形のいずれかを用いて免疫アッセイを行うことができる。簡潔に述べると、本発明に従ったＲＡ特異的自己抗体の検出に適用される典型的なサンドイッチアッセイにおいて、標識されていない自己抗原マーカーは固体基質上に固定化されており、試験される試料を、結合した自己抗原マーカーと、抗原抗体複合体の形成を可能にする時間および条件下で接触させる。インキュベーションの後、検出可能な部分構造で標識された抗体と、試験される種から得られる抗体（例えば、ヒト対象では抗ヒトＩｇＧ）を特異的に認識する抗体とを添加し、任意の抗原結合自己抗体と標識抗体との間の三重複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートする。任意の結合していない材料を洗浄して取り除き、試料内の任意のＲＡ特異的自己抗体の存在を、検出可能な部分構造から直接的にまたは間接的に生じたシグナルの観察によって決定する。このアッセイの変形には、固定化された自己抗原マーカーに生物学的試料および標識抗体の両方が同時に添加されるアッセイが含まれる。
【００８９】
自己抗原マーカーは、固体の担体または支持体の表面に共有結合するかまたは受動的に結合することにより固定化され得る。適切な担体または支持体の材料の例には、限定はしないが、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、デキストラン、セファデックス、セファロース、カルボキシメチルセルロース、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、はんれい岩、フィルターペーパー、マグネタイト、イオン交換樹脂、ガラス、ポリアミンメチルビニルエーテルマレイン酸コポリマー、アミノ酸コポリマー、エチレンマレイン酸コポリマー、ナイロン、シルクなどが含まれる。固体の担体または支持体の表面上への自己抗原マーカーの固定化は、当技術分野において周知の方法を用いる、架橋、共有結合、または物理的吸着を伴い得る。固体の担体または支持体は、ビーズ、粒子、マイクロプレートウェル、アレイ、キュベット、管、膜の形態、または免疫アッセイを行うために適した任意の他の形状であり得る。特定の実施形態において、固体の担体または支持体への自己抗原マーカーの固定化には、当技術分野において周知のウェスタンブロッティング（または免疫ブロット）と呼ばれるプロセスにおける、ゲル電気泳動とその後に行われる膜（典型的には、ニトロセルロースまたはＰＶＤＦ）への転写が含まれる。
【００９０】
第２の抗体（すなわち、上記のサンドイッチアッセイにおいて添加される抗体）は、任意の適切な検出可能な部分構造で標識され得、前記部分構造はすなわち、その化学的性質により、三重複合体の検出、結果的には自己抗原自己抗体複合体の検出を可能にする、分析的に同定可能なシグナルをもたらす、任意の構成要素である。
【００９１】
検出は、定性的または定量的であり得る。抗体などの生物学的分子を標識するための方法は、当技術分野において周知である（例えば、「Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐａｒｔ Ｂ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１９７４、第３４巻、Ｗ．Ｂ．ＪａｋｏｂｙおよびＭ．Ｗｉｌｎｅｃｋ（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；ならびにＭ．ＷｉｌｃｈｅｋおよびＥ．Ａ．Ｂａｙｅｒ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９８８、１７１：１〜３２を参照されたい）。
【００９２】
免疫アッセイにおいて最も一般的に用いられる検出可能な部分構造は、酵素およびフルオロフォアである。酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）の場合、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼなどの酵素が、通常はグルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩により、第２の抗体に結合する。特異的な酵素と共に用いられる基質は通常、対応する酵素の加水分解の際の、検出可能なコロンの変化の発生について選択される。免疫蛍光の場合、第２の抗体は、その結合能を変えることなく、蛍光部分に化学的に結合する。蛍光標識された抗体が抗原抗体複合体に結合し、任意の結合していない材料が除去された後、蛍光部分により生じる蛍光シグナルが検出され、場合により定量される。あるいは、第２の抗体は、放射性同位体、化学発光部分、または生物発光部分で標識され得る。
【００９３】
ＲＡの診断
本発明の方法において、抗原抗体複合体の検出は、試験される生物学的試料におけるＲＡ特異的自己抗体の存在の指標となり、したがって、生物学的試料を得た対象におけるＲＡの指標となる。したがって、本発明の方法は、患者におけるＲＡの診断のために用いることができる。とりわけ、本発明の方法は、ＲＡを有することが疑われる対象を試験するために用いることができる。さらに、ＢＲＡＦ触媒ドメインまたはその抗体結合断片を含む自己抗原マーカーを用いる本発明の方法は、ＣＣＰ陰性の患者におけるＲＡを診断するために用いることができる。実際、本出願人らは、ＢＲＡＦ触媒ドメインについて陽性のＲＡ患者の３３％がＣＣＰ陰性であったことを示している。
【００９４】
当業者には、ＲＡの診断が、本明細書において提供される方法によってもたらされる結果のみに応じて行われ得ることが理解されよう。あるいは、医者は、ＲＡを診断するための既存の方法において用いられる他の臨床的または病理学的パラメーターも考慮し得る。したがって、本発明の方法を用いて得られる結果を、ＲＡの診断のために行われる他の試験、アッセイ、または手順の結果と比較し、かつ／または組み合わせることができる。このような比較および／または組み合わせは、より精密な診断を提供するために役立ち得る。
【００９５】
例えば、本発明のＲＡ診断方法は、ＡＲＡ基準（すなわち、Ｆ．Ｃ．Ａｒｎｅｔｔら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．、１９８８、３１：３１５〜３２４に記載されている、ＲＡの分類のためのＡｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ １９８７改定基準）と組み合わせて用いることができる。ＡＲＡ基準に従うと、患者が、１）少なくとも１時間にわたる朝のこわばり、２）３つ以上の関節領域の関節炎、３）手の関節の関節炎、４）対称性関節炎、５）リウマチ結節、６）血清リウマチ因子（ＲＦ）、および７）Ｘ線画像の変化という７個の基準の少なくとも４個を示す場合、患者はＲＡを有していることになり、基準１〜４は少なくとも６ヶ月にわたり存在していなくてはならない。
【００９６】
その代わりに、またはそれに加えて、本発明のＲＡ診断方法の結果は、他のＲＡバイオマーカーを用いる１つまたは複数のアッセイの結果と組み合わせて用いることができる。したがって、特定の実施形態において、ＲＡの診断は、本発明の方法の結果および異なるＲＡバイオマーカーを用いる１つまたは複数のさらなるアッセイの結果に基づき得る。例えば、ＲＡバイオマーカーのパネルは、例えばチップまたはビーズに基づいたアレイ技術を用いて、個別にまたは同時に試験することができる。
【００９７】
適切なＲＡバイオマーカーの例には、限定はしないが、ＣＣＰ、Ｃ反応性タンパク質、血清アミロイドＡ、インターロイキン６（ＩＬ６）、Ｓ１００タンパク質、オステオポンチン、リウマチ因子、マトリクスメタロプロテアーゼ１（ＭＭＰ−１）、マトリクスメタロプロテアーゼ３（ＭＭＰ−３）、ヒアルロン酸、ｓＣＤ１４、血管新生マーカー（血管内皮成長因子またはＶＥＧＦなど）、および骨、軟骨、または滑膜の代謝産物（ピリジノリンまたはそのグリコシル化形態、デオキシピリジノリン、架橋テロペプチド、コラーゲンネオエピトープ、ＣＳ８４６、軟骨オリゴマー基質タンパク質、軟骨中間層タンパク質、マトリリン、コンドロモジュラチン、オステオカルシンなど）が含まれる。
【００９８】
ＩＩＩ− キット
別の態様において、本発明は、本発明に従った診断方法を実施するために有用な材料を含むキットを提供する。本明細書において提供される診断手順は、診断研究所、実験研究所、または開業医により実施され得る。本発明は、これらの様々な状況において用いることができるキットを提供する。
【００９９】
本発明に従って生物学的試料におけるＲＡ特異的自己抗体を検出するため、および／または対象におけるＲＡを診断するための材料および試薬を、キット内で一緒に組み合わせることができる。本発明のそれぞれのキットは、本発明の少なくとも１つの自己抗原マーカーを、好ましくは生物学的試料における自己抗体の検出に適した量で含む。したがって、特定の実施形態において、本発明のキットは、ＢＲＡＦ触媒ドメインまたはその抗原結合断片を含む自己抗原マーカーを含む。他の実施形態において、本発明のキットは、ＢＲＡＦ触媒ドメインまたはその抗原結合断片を含む第１の自己抗原と、ＰＡＤ４またはその抗原結合断片を含む第２の自己抗原とを含む。自己抗原マーカー（１つまたは複数）は、基質表面（例えば、ビーズ、アレイなど）上に固定化されていてもよく、または固定化していなくてもよい。例えば、本発明のキットは、本明細書において提供される、ＲＡを診断するためのアレイを含み得る。あるいは、基質表面（例えば膜）が、（例えば、ゲル電気泳動および膜への転写を介して）自己抗原マーカーを固定化するために、本発明のキット内に含まれ得る。
【０１００】
さらに、本発明のキットは、通常、キット内に含まれる自己抗原マーカーと生物学的試料内に存在する自己抗体との間で形成される抗原抗体複合体の検出のための少なくとも１つの試薬も含む。このような試薬は、例えば、上記の、試験される種から得られる抗体（例えば、ヒト対象では抗ヒトＩｇＧ）を特異的に認識する標識抗体であり得る。
【０１０１】
手順に応じて、キットはさらに、抽出用の緩衝液および／または試薬、ウェスタンブロッティング用の緩衝液および／または試薬、免疫検出用の緩衝液および／または試薬、標識用の緩衝液および／または試薬、ならびに検出手段の、１つまたは複数を含み得る。手順の様々なステップを行うためのこれらの緩衝液および試薬を用いるためのプロトコルは、キットに含まれ得る。
【０１０２】
本発明のキットに含まれる様々な試薬は、固体（例えば、凍結乾燥されたもの）または液体の形態で供給され得る。本発明のキットは、場合により、それぞれの個別の緩衝液および／または試薬のための様々な容器（例えば、バイアル、アンプル、試験管、フラスコ、またはボトル）を含み得る。それぞれの構成要素は通常、そのそれぞれの容器内に等分されるかまたは濃縮形態で提供されるので適している。開示される方法の特定のステップを実施するために適した他の容器もまた提供され得る。キットの個別の容器は好ましくは、市販のために厳重な管理下で維持される。
【０１０３】
特定の実施形態において、キットは、本発明の方法に従って対象におけるＲＡを診断するためにその構成要素を用いるための指示を含む。本発明の方法に従ってキットを用いるための指示は、対象から得られる生物学的試料を処理するため、および／または試験を行うための指示、または結果を解釈するための指示を含み得る。キットはまた、医薬品または生物学的製剤の製造、使用、または販売を管理する行政機関により規定されている形式の注意事項を含み得る。
【０１０４】
ＩＶ− ＲＡのための新たな治療薬の開発
ＢＲＡＦ触媒ドメインは、ＲＡの治療またはＲＡの進行の予防に潜在的に有用な化合物または物質を同定するための魅力的な標的であり得る。例えば、ＢＲＡＦ触媒ドメインに対する中和活性または阻害活性を有する化合物または物質を同定するためのスクリーニングが開発され得る。
【０１０５】
このようなスクリーニングは、生体液、または細胞などの任意の適切な生物系において実施することができる。通常、スクリーニングは、標準的な組織培養器具において成長することができる細胞を用いて行われる。適切な細胞には、任意の認識されている供給源に由来する、全ての適切な正常細胞および形質転換細胞が含まれる。好ましくは、細胞は哺乳動物（ヒト、または齧歯動物もしくは猿などの動物）由来のものである。より具体的には、細胞はヒト由来のものである。哺乳動物細胞は、任意の器官または組織由来のものであり得（例えば、骨、軟骨、または滑液）、また、ＢＲＡＦを発現する細胞である限りにおいて任意の細胞型のものであり得る。本発明の方法の実施において用いられる細胞は、初代細胞、二次細胞、または不死化細胞（例えば、樹立細胞系）であり得る。それらは、当業者に周知の技術により調製することができる（例えば、細胞は、骨、軟骨、もしくは滑液から単離することができる）か、または免疫学的微生物学的商業リソースから購入することができる（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡから）。その代わりに、またはそれに加えて、細胞は、例えば目的の遺伝子を含むように、遺伝子操作することができる。最初の薬剤スクリーニング（すなわち、スクリーニングの第１回目（１つまたは複数））のために開発されたアッセイが、好ましくは、市販されており通常は比較的成長が容易な樹立細胞系を用いて行われるが、一方、薬剤開発のプロセスにおいてその後に用いられるアッセイが、好ましくは、入手、維持、および／または成長が通常は不死化細胞よりも困難であるがインビボの状況ではより良好な実験モデルとなる初代細胞および二次細胞を用いて行われる。スクリーニング方法は、マルチウェルアッセイプレートの複数のウェルに含まれる細胞を用いて行うことができる。
【０１０６】
当業者には理解されるように、任意の種類の化合物または作用物質をスクリーニングすることができる。候補化合物は合成または天然の化合物であり得、それは単一の分子、または異なる分子の混合物もしくは複合体であり得る。候補化合物は個別にスクリーニングすることができる。あるいは、コレクションまたはライブラリーに含まれる化合物は同時にスクリーニングすることができる。
【０１０７】
細菌、真菌、植物、および動物の抽出物の形態の天然化合物のコレクションは、例えば、Ｐａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ）またはＭｙｃｏＳｅａｒｃｈ（Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）から入手可能である。合成化合物のライブラリーは、例えばＣｏｍｇｅｎｅｘ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）、Ｂｒａｎｄｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ、ＮＨ）、Ｍｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ（Ｎｅｗ Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＣＴ）、およびＡｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）から市販されている。候補化合物のライブラリーもまた、例えばＭｅｒｃｋ、Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｃｏｍｅ、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｅｙｅｒｓ−Ｓｑｕｉｂｂ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ、Ｍｏｎｓａｎｔｏ／Ｓｅａｒｌｅ、およびＰｈａｒｍａｃｉａ ＵｐＪｏｈｎを含む化学系大企業により開発されており、市販されている。さらに、天然物のコレクション、合成により作成されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的、および生化学的手段を介して容易に修飾される。化学的ライブラリーは、従来の自動合成、ＰＣＲ、クローニング、または専売的な合成方法により比較的容易に調製される（例えば、Ｓ．Ｈ．ＤｅＷｉｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９３、９０：６９０９〜６９１３；Ｒ．Ｎ．Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９４、３７：２６７８〜２６８５；Ｃａｒｅｌｌら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．１９９４、３３：２０５９〜２０６０；Ｐ．Ｌ．Ｍｙｅｒｓ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７、８：７０１〜７０７を参照されたい）。
【０１０８】
ＢＲＡＦ触媒ドメインを標的として用いると、ＲＡの治療のための有用な作用物質は、広範なクラスの化学物質のいずれかにおいて見出すことができる。
【０１０９】
抗ＢＲＡＦ触媒ドメイン抗体をＲＡの治療のための治療ツールとして開発することも想定される。抗ＴＮＦアルファ抗体および抗ＣＤ２０抗体が、ＲＡの治療において現在用いられている。抗ＣＤ２０抗体で治療される患者においては高い臨床応答が観察され、これは、Ｂ細胞の枯渇の結果、ひいてはＢ細胞抗体の枯渇の結果生じる。しかし、全てのタイプのＢ細胞抗体の無差別的な枯渇は、免疫系を潜在的に弱め得る。より標的化された作用という利点をもたらす、抗ＢＲＡＦ触媒ドメイン抗体は、抗ＣＤ２０抗体の注射に関する制限および潜在的な問題を解決し得る。
【実施例】
【０１１０】
以下の実施例は、本発明の製造および実施の好ましい様式のいくつかを記載するものである。しかし、実施例は例示的な目的のものに過ぎず、本発明の範囲を制限することを意味するものではないことを理解されたい。さらに、実施例における記載が過去形で表されていない限り、明細書の以降の部分などのテキストは、実験が実際に行われたことまたはデータが実際に得られたことを示唆することを意図したものではない。
【０１１１】
以下に示す結果のほとんどは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる科学論文において、本出願人らにより報告されている（Ｉ．Ａｕｇｅｒら、「Ｎｅｗ Ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎｓ ｉｎ Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ８２６８ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｒｒａｙｓ ｗｉｔｈ ＲＡ Ｐａｔｉｅｎｔ’ｓ Ｓｅｒａ」、Ａｎｎａｌｓ Ｒｈｅｕｍａｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅ、２００９、６８（４）：５９１〜５９４）。
【０１１２】
序論
ＨＬＡ−ＤＲ遺伝子および自己抗体という２つの要素が、ＲＡの発症に重要である。ＲＡは、対立遺伝子多型を示すＨＬＡ−ＤＲ遺伝子の制御下にある。ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子は、ＲＡの発症に対して感受性を有し得るか（例えば、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１、＊０４０４、＊０１０１、＊０１０２、＊１００１）、中立であり得るか（例えば、ＨＬＡ−ＤＲ１５）、または防御的であり得る（例えば、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０７、＊０８、＊０４０２）（Ｐ．Ｋ．Ｇｒｅｇｅｒｓｅｎら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、１９８７、３０：１２０５〜１２１３；Ｄ．Ｒｅｖｉｒｏｎら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、２００１、４４：５３５〜５４０）。ＲＡを発症するリスクは、個体が発現する２つのＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子によって制御されており、ＨＬＡ−ＤＲについて個体を遺伝子型決定することにより評価することができる（Ｗ．Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．、１９９９、４２：７５７〜７６２）。
【０１１３】
本出願人らは、１９９２年から、フランス、マルセイユのＬａ Ｃｏｎｃｅｐｔｉｏｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌのリウマチ病棟における全てのＲＡ患者についてＨＬＡ−ＤＲの遺伝子型決定を行っている。１０００人のＲＡ患者を５００人の対照と比較することにより、本出願人らは、個体群における７２個の最も一般的な遺伝子型のそれぞれについて、ＲＡを発症する相対的なリスクを示す、ＨＬＡ−ＤＲ遺伝子型のリスク表を得ている。ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１とＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０４との間の並はずれた相乗効果、およびＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０７により付与される非常に強力な保護が確認された。これらの実験によりまた、ＤＲ７／ＤＲ９遺伝子型が、感受性のある対立遺伝子を全く含まないにも関わらず、ＲＡを発症する非常に高いリスクを付与することが、意外にも実証された。
【０１１４】
ＲＡは、自己抗体介在性の疾患である。ＲＡにおける最も重要な自己抗体は、フィブリン、フィラグリン、およびビメンチンなどのタンパク質上のシトルリン残基に対するものである。本出願人らは最近、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０４がＲＡ患者の血清における抗シトルリン化フィブリノゲンにも関連することを観察した。実際、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０４を発現するＲＡ患者の８３％が、シトルリン化フィブリノゲンに対する抗体を有することが明らかになった（Ｉ．Ａｕｇｅｒら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、２００５、５２：３４２４〜３４３２）。しかし、カルパスタチンなどの非シトルリン化タンパク質もまた、ＲＡ患者から得られる自己抗体により標的化される。ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子についてホモ接合性のＲＡ患者の血清で滑膜タンパク質をスクリーニングすることによって、本出願人らは、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０４についてホモ接合型のＲＡ患者の血清が、カルパイン（軟骨の破壊に関与するプロテアーゼ）の天然阻害剤であるカルパスタチンとして同定される１００ｋＤの滑膜タンパク質を認識することを観察した。実際、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０４を発現するＲＡ患者の５０％が、滑膜カルパスタチンに対する自己抗体を有する（Ｉ．Ａｕｇｅｒら、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、２００７、６６：１５８８〜１５９３）。本出願人らによって得られたデータは、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０４が、ＲＡにおける多くの自己抗体応答との自らの関連を可能にする固有の機能を有するという考えを支持するものである。
【０１１５】
以下に示す研究において、本出願人らは、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１／０４０４、＊０４０１／０４０１、＊０４０４／０４０４、＊０４０４／０７、＊０４０１／０７、＊０７／０７、＊０９／０７という特定のＨＬＡ−ＤＲ遺伝子型を有するＲＡ患者から得られる血清を使用して、８０００を超えるヒトタンパク質を含むタンパク質アレイをスクリーニングし、それにより特異的な自己抗体のパターンを同定した。
【０１１６】
患者および方法
タンパク質マイクロアレイ分析のためのＲＡ患者の血清
フランス、マルセイユのＬａ Ｃｏｎｃｅｐｔｉｏｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌのリウマチ棟の１９人のＲＡ患者を、この研究のために選択した。全てのＲＡ患者は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ １９８７改定基準（Ｆ．Ｃ．Ａｒｎｅｔｔら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．、１９８８、３１：３１５〜３２４）を満たしていた。ＨＬＡ−ＤＲのオリゴ型決定を、それぞれの患者について行った（Ｏ．Ｏｌｌｅｒｕｐら、Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ、１９９２、３９：２２５〜２３５）。患者のうち３人は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１およびＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０４の両方を発現することが明らかになり、４人の患者はＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１についてホモ接合型であり、３人の患者はＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０４についてホモ接合型であり、２人の患者はＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１およびＨＬＡ−ＤＲ７の両方を発現し、２人の患者はＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０４およびＨＬＡ−ＤＲ７の両方を発現し、１人の患者はＨＬＡ−ＤＲ７およびＨＬＡ−ＤＲ１３を発現し、２人の患者はＨＬＡ−ＤＲ７についてホモ接合型であり、２人の患者は予想外のハイリスクな遺伝子型ＨＬＡ−ＤＲ７／ＤＲ９を発現した。
【０１１７】
タンパク質マイクロアレイ分析のための対照の血清
対象群は、マルセイユのＬａ Ｃｏｎｃｅｐｔｉｏｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌのリウマチ棟の、７人の脊椎関節症（ＡＳ）患者および２人の全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者、ならびに、フランス、パリのＨｏｓｐｉｔａｌ Ｃｏｃｈｉｎ、Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｓａｉｎｔ Ａｎｔｏｉｎｅ、およびＨｏｓｐｉｔａｌ Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、フランス、リールのＨｏｓｐｉｔａｌ Ｃｌａｕｄｅ Ｈｕｒｉｅｚ、およびマルセイユのＨｏｓｐｉｔａｌ Ｌａ Ｃｏｎｃｅｐｔｉｏｎとの協力で作られた全国的なコホートの、４人の全身性硬化（ＳＳＣ）患者からなるものであった。１０人の健康な対照は、自己免疫的な病状を排除するための健康評価の後に、研究所スタッフのボランティアおよびボランティアの骨髄ドナーから採用した。全ての参加者からインフォームドコンセントを得た。
【０１１８】
ヒトタンパク質マイクロアレイ
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されている「ＰｒｏｔｏＡｒｒａｙヒトタンパク質マイクロアレイ」を本研究において用いた。このマイクロアレイは８２６８個のヒトタンパク質を含むものである（Ｇ．Ａ．Ｍｉｃｈａｕｄら、「Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ Ｐｒｏｔｏａｒｒａｙ ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｎｏｔｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；Ｍ．Ｅ．Ｈｕｄｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００７、４４：１７４９４〜１７４９９）。
【０１１９】
ＰｒｏｔｏＡｒｒａｙヒトタンパク質マイクロアレイ上のタンパク質の２％がプロテアーゼ／ペプチダーゼであり、２％が分泌タンパク質であり、３％が転写因子であり、３％が細胞死タンパク質であり、５％がプロテインキナーゼであり、１１％が核タンパク質であり、１７％が膜タンパク質であり、そして３１％が代謝タンパク質であった（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより提供されるタンパク質含有量リスト４．０からのデータ）。マイクロアレイ上の全てのタンパク質は（以下に記載される）ＧＳＴ融合タンパク質として発現し、天然の条件下で精製され、ニトロセルロースで被覆したスライドガラス上に２つ組でスポットされた。このヒトタンパク質のコレクションは、ヒトＵｌｔｉｍａｔｅ ＯＲＦクローンコレクションに由来するものである（ｈｔｔｐ：／／ｏｒｆ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍからのデータ）。それぞれのクローンについて、ＧｅｎＢａｎｋで配列の確認を行った。ヒトタンパク質コレクションを作成するために用いられたそれぞれのクローンは、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ベクター内にクローニングされたヒトＯＲＦであった。それぞれの発現クローンを用いて、目的のタンパク質を、バキュロウイルス発現系を用いてＮ末端ＧＳＴ融合タンパク質として発現させた。それぞれの発現したタンパク質の分子量を、ウェスタンブロッティングによって決定した。
【０１２０】
タンパク質アレイ上での血清プロファイリングアッセイ
アレイスライドを１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴでブロックし、次に、（ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水内の）血清試料の存在下で、４℃で１時間にわたりインキュベートした。アレイスライドを次に、希釈した（１：５００）ヒト血清を用いて４℃で１．５時間にわたりプローブした。ＰＢＳＴで洗浄した後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７染料に結合した１μｇ／ｍＬの抗ヒトＩｇＧをスライドに添加した。スライドを次に洗浄し、乾燥させた（Ｐａｒｔｎｅｒｓｈｉｐ、Ｅｖｒｙ、Ｆｒａｎｃｅ）。並行して、別のスライド上で、陰性対照の実験を行った。対照においては、血清の不存在下で緩衝液とインキュベートしたことを除いて、上記と同じ条件下でスライドを処理した。この対照の目的は、データの取得および分析のための基準点を得ることである。
【０１２１】
データの取得／分析
アレイのスライドを、ＧｅｎｅＰｉｘ（登録商標）４０００Ｂ蛍光スキャナを用いてスキャンした。データは、ＧｅｎｅＰｉｘ（登録商標）Ｐｒｏソフトウェアを用いて取得し、ＰｒｏｔｏＡｒｒａｙ（商標）Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ ２．０を用いて処理した。
【０１２２】
データの分析
マイクロアレイのタンパク質の間の自己抗原を同定するために、それぞれのアレイタンパク質について、Ｚスコア、ＣＩ Ｐ値（チェビシェフの不等式の精度値）、およびＣＶを含む、一連の値を計算した。Ｚスコアは、全てのタンパク質特性と比較した、アレイ上のタンパク質スポットから得られるシグナルに基づいて計算した。Ｚスコアは、シグナル使用値から、アレイ上の全てのヒトタンパク質特性から得られるシグナル使用値の平均を引き、全てのヒトタンパク質特性についてのシグナル使用値に対する標準偏差で割ったものである。ＣＩ Ｐ値は、全ての陰性対照のスポットに対する強度を評価し、観察されたシグナルが陰性対照の分布に由来する可能性を計算する。ＣＩ Ｐ値が低いほど、シグナルがランダムな事象によるものではない可能性が高い。ＣＶは、２つ組間の類似性を評価する。タンパク質は、Ｚスコア＞３．０、ＣＩ Ｐ値＜０．０５、かつＣＶ＜０．５である場合、免疫反応性自己抗原として同定された。
【０１２３】
ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット分析のためのＲＡ患者および対照
これらの実験のために、マルセイユのＬａ Ｃｏｎｃｅｐｔｉｏｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌのリウマチ病棟の、ＲＡ患者および脊椎関節症（ＡＳ）患者を選択した。全てのＲＡ患者は、ＲＡについての１９８７年のＡｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ基準を満たしていた。研究所スタッフおよびＭａｒｓｅｉｌｌｅ Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒのスタッフからのボランティアが、正常な対照として参加した。それぞれの患者および正常な対照に対して、ＨＬＡ−ＤＲオリゴ型決定を行った。全ての参加者からインフォームドコンセントを得た。
【０１２４】
ＥＬＩＳＡによる自己抗体の検出
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４で希釈した、０．１μｇ／ｍＬの目的のタンパク質（すなわち、マイクロアレイ実験で同定された候補自己抗原マーカー）で、プレートを一晩被覆した。プレートを、５％ミルクを含むＰＢＳでブロックし、次に、ＰＢＳ内で１：１００に希釈した血清の存在下で３時間にわたりインキュベートした。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した後、ペルオキシダーゼに結合した抗ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、Ｆｒａｎｃｅ）をプレートに添加した。光学密度（ＯＤ）を４０５ｎｍで読み取った。目的のタンパク質を含まないプレートのウェルに添加したそれぞれの血清の光学密度を測定することにより、バックグラウンドのＯＤを得た。測定したＯＤ値がバックグラウンドのＯＤの２倍を超えた場合、血清はタンパク質について陽性であると判断された。
【０１２５】
ウェスタンブロッティングによる自己抗体の検出
タンパク質（すなわち、マイクロアレイ実験において同定された候補自己抗原マーカー）を、１０％ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した。ブロットを患者または対照の血清の存在下でインキュベートし、その後、ペルオキシダーゼに結合した抗ヒトＩｇＧを添加した。検出は化学発光により行った（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍｅｙｌａｎ、Ｆｒａｎｃｅ）。
【０１２６】
結果
ＲＡ患者に関する自己抗体パターン
１９人のＲＡ患者、ならびに２３人の対照（脊椎関節症（ＡＳ）から７人、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）から２人、および全身性硬化（ＳＳＣ）から４人、および健康な個体から１０人）を用いて、８２６８個のヒトタンパク質を含むアレイをプローブした。アレイ上のタンパク質に結合した自己抗体の存在を、蛍光標識した抗ヒトＩｇＧ抗体によって検出した。免疫反応性自己抗原は、Ｚスコア＞３．０、ＣＩ Ｐ値＜０．０５、およびＣＶ＜０．５により規定した。
【０１２７】
図１Ａは、この研究において試験されたそれぞれの患者および対照により認識されるタンパク質の数を表す。図１Ｂおよび以下の表において示されるように、各群の参加者により認識されるタンパク質の数は非常に類似していることが明らかになった。
【０１２８】
各群の患者および健康な対照により認識されるタンパク質の平均数
【０１２９】
【表４】
【０１３０】
１９人のＲＡ患者（１から１９と番号付けされている）のうち、１４人がＣＣＰ陽性であり（患者２〜５、７〜９、１１、１２、１４〜１７、および１９）、５人がＣＣＰ陰性であった（患者１、６、１０、１３、および１８）。ＣＣＰ陽性のＲＡ患者の群により認識されるタンパク質の数は、ＣＣＰ陰性のＲＡ患者の群により認識されるタンパク質の数に匹敵するものであった（以下の表を参照されたい）。
【０１３１】
ＣＣＰ陽性およびＣＣＰ陰性のＲＡ患者により認識されるタンパク質の平均数
【０１３２】
【表５】
【０１３３】
試験したＲＡ患者のうち、１０人がＲＡに１０年未満罹患しており（患者６および８〜１６）、９人がＲＡに１０年を超えて罹患していた（患者１〜５、７、および１７〜１９）。ＲＡ患者により認識されるタンパク質の数は、疾患の期間に依存しないことが明らかになった（以下の表を参照されたい）。
【０１３４】
ＲＡを１０年未満または１０年を超えて有している患者により認識されるタンパク質の平均数
【０１３５】
【表６】
【０１３６】
要約すると、ＲＡ患者により認識されるタンパク質の平均数は、様々な対照により認識されるタンパク質の数とは有意には異ならなかった。疾患の期間およびＣＣＰ反応性もまた、ＲＡ患者により認識されるタンパク質の数に影響しないことが明らかになった。
【０１３７】
ＲＡ患者におけるＨＬＡ−ＤＲ遺伝子型と関連する自己抗体パターン
疾患を発症するリスクの高さまたは低さに関連するＨＬＡ−ＤＲ遺伝子型を有するＲＡ患者の血清を試験して、タンパク質アレイ上でのそれらの反応性パターンを比較した。既に上述したように、２つの感受性対立遺伝子を含むＨＬＡ−ＤＲ遺伝子型は、感受性対立遺伝子を１つだけ含む遺伝子型よりも高いリスクを付与し、感受性対立遺伝子を１つだけ含む遺伝子型はそれ自体、感受性対立遺伝子を含まないＤＲ遺伝子型よりも高いリスクを付与する。ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１およびＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０４の両方を発現する３人の患者、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１についてホモ接合型である４人の患者、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０４についてホモ接合型である３人の患者、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１およびＨＬＡ−ＤＲ７の両方を発現する２人の患者、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０４およびＨＬＡ−ＤＲ７の両方を発現する２人の患者、ＨＬＡ−ＤＲ７およびＨＬＡ−ＤＲ１３を発現する１人の患者、ＨＬＡ−ＤＲ７についてホモ接合型である２人の患者、ならびにＨＬＡ−ＤＲ７／ＤＲ９を発現する２人の患者を試験した。
【０１３８】
図２および以下の表に示されるように、２個、１個、または０個のＲＡ関連ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子を発現するＲＡ患者により認識されるタンパク質の数において、差は見られなかった。
【０１３９】
様々なＨＬＡ−ＤＲ遺伝子型を有するＲＡ患者により認識されるタンパク質の平均数
【０１４０】
【表７】
【０１４１】
ＲＡに関連する特異的抗体の同定
図３は、少なくとも１人のＲＡ患者、少なくとも２人のＲＡ患者、少なくとも３人のＲＡ患者などにより認識される様々なタンパク質の総数を示す。図３ではまた、ＡＳ患者の少なくとも２０％、ＳＳＣ患者の少なくとも２０％、および健康な個体の少なくとも２０％によっても認識される、ＲＡ患者により認識されるタンパク質も示される。この図に表される結果により、ＲＡ患者の血清における自己抗体によって標的化される多くのタンパク質が、ＲＡに特異的ではないが、対照群から得られる自己抗体とも反応性を有することが実証される。
【０１４２】
試験される個体の自己抗体により標的化されるタンパク質のうち、３つのタンパク質のみが、ＲＡ患者の血清により特異的に認識され、対照群の血清によっては認識されないことが明らかになった（図４）。これらのタンパク質は、ＰＡＤ４（ペプチジルアルギニンデイミナーゼ４）、ＰＫＣベータ１（プロテインキナーゼＣベータ１）、およびＰＩＰ４Ｋ２Ｃ（ホスファチジルイノシトール４ホスフェート５キナーゼＩＩ型ガンマ）である。対照の０／２３がＰＡＤ４について陽性であるのに対し、本研究で試験されたＲＡ患者のうち９／１９がＰＡＤ４について陽性であることが明らかになった（ｐ＝０）。同様に、対照の０／２３がＰＣＫベータ１について陽性であるのに対し、ＲＡ患者の６／１９がＰＣＫベータ１について陽性であることが明らかになった（ｐ＝０．０１４）。最後に、対照の０／２３がＰＩＰ４Ｋ２Ｃに対して陽性であるのに対し、ＲＡ患者の５／１９がＰＩＰ４Ｋ２Ｃに対して陽性であることが明らかになった（ｐ＝０．０３２）。
【０１４３】
ＢＲＡＦ触媒ドメイン（ｖ ｒａｆマウス肉腫ウイルス癌遺伝子類似体Ｂ１触媒ドメイン）は、ＲＡについての他の同定された候補マーカーのうち、最も興味深いタンパク質の１つである。実際、疾患対照の０／１３および健康な個体の１／１０のみがＢＲＡＦについて陽性であるのに対し、このアッセイにおいて試験されたＲＡ患者の９／１９がＢＲＡＦについて陽性であることが明らかになった（ｐ＝０．００４、２３人の対照に対し１９の患者）。
【０１４４】
自己抗原の有効性の実証
タンパク質アレイの検出の有効性を確認するため、様々なアッセイを用いて同一のタンパク質を試験した。
【０１４５】
患者および対照における陽性血清の頻度を、精製ＰＡＤ４およびＰＩＰ４Ｋ２Ｃを免疫吸着剤として用いて、ＥＬＩＳＡによって決定した。本出願人らが用いた条件下では、ＥＬＩＳＡアッセイを用いてＰＫＣベータ１およびＢＲＡＦ触媒ドメインについての反応性を検出することは不可能であったため、これらの自己抗原マーカー候補の有効性の実証において、代わりにウェスタンブロッティングアッセイを用いた。
【０１４６】
ＰＡＤ４。ＥＬＩＳＡ実験の結果は、ＡＳ患者の０％および健康な対照の３％がＰＡＤ４について陽性であるのに対し、ＲＡ患者の２９％がＰＡＤ４について陽性であることを示した（図５Ａ）。抗ＰＡＤ４抗体の産生に対するＲＡ関連ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子の影響を評価するために、２個（ＳＥ＋／ＳＥ＋）、１個（ＳＥ＋／ＳＥ−）、または０個（ＳＥ−／ＳＥ−）のＲＡ関連ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子を発現する患者群の間で、ＰＡＤ４について陽性の血清の頻度を比較した。図５Ｂに示すように、ＲＡ関連ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子を発現しない患者（ＳＥ−／ＳＥ−）と少なくとも１つのＲＡ関連ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子を発現する患者（ＳＥ＋／ＳＥ＋およびＳＥ＋／ＳＥ−）との間で、ＰＡＤ４について陽性のＲＡ患者のパーセンテージに有意な差はなかった。
【０１４７】
ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１／ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０４を発現する患者の３６％、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１／ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１を発現する患者の２５％、およびＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０４／ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０４を発現する患者の１７％がＰＡＤ４について陽性であるのに対し、ＳＥ＋／ＳＥ＋患者のうち、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１／ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１を発現する患者の８０％がＰＡＤ４について陽性であることが明らかになった。
【０１４８】
したがって、これらのＥＬＩＳＡ実験により、ＰＡＤ４がＲＡにおける特異的自己抗原であることが確認された。
【０１４９】
ＰＩＰ４Ｋ２Ｃ。ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ＡＳ患者の１８％および健康な対照の１０％がＰＩＰ４Ｋ２Ｃについて陽性であるのに対し、試験したＲＡ患者の１８％がＰＩＰ４Ｋ２Ｃについて陽性であることが明らかになった（図６Ａ）。したがって、これらの結果によっては、ＰＩＰ４Ｋ２ＣはＲＡにおける特異的自己抗原として有効性を実証されなかった。
【０１５０】
ＰＩＰ４Ｋ２Ｃについて陽性の患者のパーセンテージを、２個、１個、または０個のＲＡ関連ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子を発現するＲＡ患者についても計算した。驚くべきことに、１個または０個のＲＡ関連ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子を発現するＲＡ患者よりも高いパーセンテージの、２個のＲＡ関連ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子を発現する患者が、ＰＩＰ４Ｋ２Ｃについて陽性であることが明らかになった。実際、ＳＥ＋／ＳＥ−患者の５％およびＳＥ−／ＳＥ−患者の０％がＰＩＰ４ＰＫ２Ｃについて陽性であるのに対し、ＳＥ＋／ＳＥ＋患者の４０％がＰＩＰ４ＰＫ２Ｃについて陽性であることが明らかになった。
【０１５１】
ＰＫＣベータ１。ウェスタンブロッティングにおいて、６人のＲＡ患者のうち２人のみがＰＫＣベータ１について陽性であることが明らかになった。この研究において用いられる条件下で観察された部分的な反応性に基づいては、ＰＫＣベータ１はＲＡにおける特異的自己抗原として有効性を実証され得ない。
【０１５２】
ＢＲＡＦ触媒ドメイン。ウェスタンブロッティングを用いて、この研究において試験された１９人のＲＡ患者の４７％がＢＲＡＦ触媒ドメインについて陽性であることが明らかになったが、一方、１７人のＡＳ患者および１７人の健康な対照のいずれも反応性を示さなかった（図７Ａ）。これらの結果により、ＢＲＡＦ触媒ドメインはＲＡにおける特異的自己抗原として確認される。
【０１５３】
ＲＡ患者において、ＢＲＡＦ触媒ドメインについての陽性とＨＬＡ−ＤＲ遺伝子型との間では関連は検出されなかった（図７Ｂ）。
【０１５４】
考察
既に上述したように、ＲＡを発症するリスクは、個体により発現される２つのＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子により制御される。ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子は、ＲＡの発症に対して感受性であり得るか、防御的であり得るか、または中立であり得る。さらに、個体により発現される２つのＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子は相互作用する。実際、ＲＡ患者においてほぼ例外なく見られるＨＬＡ−ＤＲＢ１−０４０１／０４０４遺伝子型におけるように、２つの感受性対立遺伝子は協働し得、その結果、ＲＡを発症する非常に高いリスクをもたらす。この相乗効果は依然として説明されておらず、ＲＡの発症機序に対する各対立遺伝子のそれぞれの寄与は理解されていない。過去に、本出願人らは、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１と０４０４との間の並はずれた相乗効果に焦点を当てており、これらの２つの対立遺伝子について固有の特性を記載した。ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１は、構成的な熱ショックタンパク質ｈｓｐ７３との相互作用を介して並はずれて良好な抗原のプロセシングを可能にする、ＱＫＲＡＡモチーフを含む（Ｉ．Ａｕｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９９６、３：３０６〜３１０；Ｉ．Ａｕｇｅｒら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、２００２、４６：９２９〜９３３；Ｓ．Ｒｏｔｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００２、１６９：３０１５〜３０２０）。ＨＬＡ−ＤＲＢ１−０４０４は、並はずれて良好な抗体産生に関連すると考えられる。これは抗シトルリン化フィブリン、抗カルパスタチン、抗ＣＣＰ抗体にも当てはまり、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０４の広いペプチド結合特性にも関連し得る（Ｉ．Ａｕｇｅｒら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、２００５、５２：３４２４〜３４３２；Ｉ．Ａｕｇｅｒら、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、２００７、６６：１５８８〜１５９３；Ｃ．Ｃｈａｒｐｉｎら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．、２００８、２６：６２７〜６３１）。
【０１５５】
特異的なＨＬＡ−ＤＲ遺伝子型が特異的な自己抗体の産生パターンに関連していたかを確認するために、本出願人らは、８０００を超えるヒトタンパク質を含むアレイを用いて、様々なＨＬＡ−ＤＲ遺伝子型を発現するＲＡ患者の血清において自己抗体を分析した。本出願人らは、ＲＡ患者により認識されるタンパク質の大部分が対照の血清においても見られることを観察した。いずれの特異的な抗体パターンも、特定のＨＬＡ−ＤＲ遺伝子型と関連しないことが明らかになった。他方で、この研究により、ＲＡの診断において用いることができるＲＡのタンパク質マーカーが同定された。とりわけ、本出願人らは、ＢＲＡＦ触媒ドメインおよびＰＡＤ４という２つの主要なタンパク質を自己抗原マーカーとして同定し、かつ有効性を実証した。
【０１５６】
他の実施形態
本発明の他の実施形態は、本明細書において開示される発明の明細事項および実施の検討から、当業者に明らかとなろう。明細事項および実施例は例示的なものにすぎないと見なされるべきものであり、本発明の真の範囲は以下の特許請求の範囲により示される。
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００８年５月１４日に出願された欧州特許出願ＥＰ０８３０５１６７．２に対する優先権を主張するものである。この欧州特許出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチ（ＲＡ）は、世界人口の約１％が罹患している慢性自己免疫疾患である。これは、軟骨および骨の破壊、関節の変形、ならびに可動性の喪失を最終的にもたらし得る、関節の滑膜表層における炎症および細胞増殖を特徴とする。ＲＡは通常、いくつかの関節において同時に問題を生じさせ、それは対称的であることが多い。初期のＲＡは、手首、手、足首、および足の関節などの小さめの関節に最初に罹患する傾向がある。疾患が進行するにつれて、肩、肘、膝、腰、顎、および首の関節もまた関与してくる可能性がある。関節内または関節周辺の領域のみに罹患する、他の関節の状態とは異なり、ＲＡは、皮膚、血管、心臓、肺、および筋肉を含む体全体にわたる関節外の組織において炎症を生じさせ得る全身性疾患である。
【０００３】
ＲＡは、痛み、変形、生活の質の低下、および障害に関連し、これらは次に、正常かつ生産的な生活を送るための患者の能力に影響する。最近の研究により、この疾患の発病の５年後に、およそ３分の１のＲＡ患者がもはや運動することができず、１０年以内に患者の半分がかなりの機能障害を有することが示されている（Ａ．Ｙｏｕｎｇら、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ、２００７、４６：３５０〜３５７）。結果として、ＲＡは社会に対して多大な経済的負担を強いる。また、かなりのデータが、ＲＡが平均寿命の短縮に関連することを示唆している。
【０００４】
ＲＡは広く研究されてきているが、この疾患の原因および発症機序は依然として完全には理解されていない。ＲＡのリスクを増大させ得る因子には、個体の性別（女性は男性よりも２から３倍この疾患を発症する可能性が高い）、年齢（ＲＡはより一般的には４０歳から６０歳の間に生じるが、子供、十代、および高齢者も罹患し得る）、遺伝的特徴（ＲＡは、遺伝性の組織型主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）抗原であるＨＬＡ−ＤＲ４、より具体的にはＤＲＢ１＊０４０１およびＤＲＢ１＊０４０４に強く関連することが明らかになった）、ならびに喫煙（ＲＡは非喫煙者よりも喫煙者において約４倍多い）が挙げられる。
【０００５】
現在、ＲＡの信頼性のある治療法は存在しない。治療は基本的に、痛みを軽減させ、炎症を低減させ、関節の損傷および骨の破壊を停止または減速させることを目的とするものである。現在の治療アプローチは、状態の初期に疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）を処方することであり、それは、このような薬剤で初期に治療されたＲＡ患者が、機能が良好に保持され、運動障害が少なく、かつ早期に死亡するリスクが小さい、良好な転帰を有するためである。ＲＡの病態生理の理解における最近の進歩により、生物学的応答修飾物質と呼ばれる新たなＤＭＡＲＤが開発されている。生物学的ＤＭＡＲＤは、ＲＡに関連する異常な免疫反応に関与する、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、Ｔ細胞、およびＢ細胞などの、鍵となる特定の細胞または分子の作用を標的化および遮断するように設計されている。従来のＤＭＡＲＤと比較して、生物学的作用物質は、作用の開始がはるかに速く、かつ、関節の損傷の有効な長期の予防を伴う良好な臨床応答をもたらし得る（Ｊ．Ｋ．Ｄ．ｄｅ Ｖｒｉｅｓ−Ｂｏｕｗｓｔｒａら、Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．、２００５、３１：７４５〜７６２）。
【０００６】
回復不能な関節の破壊は、疾患の初期段階での介入により予防することができるため、ＲＡの初期の診断が重要である。しかし、ＲＡの確定診断は困難である可能性がある。ＲＡの診断のために行われ得る免疫学的試験には、特に、リウマチ因子（ＲＦ）、抗核抗体（ＡＮＡ）、および抗環状シトルリン化ペプチド（抗ＣＣＰ）抗体のレベルの測定が含まれる。ＲＦについての血清学的試験は、感度および特異性が中程度であり、他の慢性的炎症および感染性疾患における陽性率が高いことにより、複雑である（Ｔ．Ｄｏｒｎｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ、２００４、１６：２４６〜２５３）。陽性のＡＮＡの結果は、異常に活性のある免疫系を示す。ＲＡ患者の約４０％がＡＮＡについて陽性である。しかし、この疾患の発病の最初の数ヶ月はＡＮＡの試験は陰性であり得、一部の患者においては、それらは疾患が進行しても陰性であり続ける。ＲＡの診断においては、抗ＣＣＰ抗体の試験が特に有用であり、それは、特異性が高く、疾患プロセスの初期において陽性であり、重篤な疾患および回復不能な損傷を有する可能性が高い患者を同定することができる。しかし、抗ＣＣＰ抗体の試験における陰性の結果はＲＡを排除するわけではない。
【０００７】
したがって、ＲＡおよびＲＡ進行の新たな生物学的マーカーが大いに必要である。とりわけ、疾患の初期段階の信頼性のある診断およびモニタリングを可能にし、痛み、関節の破壊、および長期にわたる障害を潜在的に予防するための初期の介入を可能にするバイオマーカーが非常に望ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、関節リウマチ（ＲＡ）の診断のための改良された系および戦略に関する。とりわけ、本発明は、ＲＡ患者における、臨床的に関連する疾患プロセスを反映するタンパク質の同定を提供する。より具体的には、本発明は、患者から得られるインビトロの生物学的試料においてＲＡの指標となる自己抗体の存在を検出するために用いることができるバイオマーカーを提供する。特定の実施形態において、本発明のバイオマーカーは、ＣＣＰ陰性の患者においてＲＡの診断を可能にする利点を有する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
より具体的には、１つの態様において、本発明は、関節リウマチの診断において使用するための、ＢＲＡＦ触媒ドメインまたはその抗体結合断片を含む自己抗原マーカーを提供する。とりわけ、本発明は、対象における関節リウマチのインビトロでの診断方法において用いるための、ＢＲＡＦ触媒ドメインまたはその抗体結合断片を含む自己抗原マーカーを提供する。特定の実施形態において、関節リウマチのインビトロでの診断方法は、対象から得られる生物学的試料を、自己抗原マーカーと、抗原抗体複合体の形成を可能にする時間および条件下で接触させるステップと、形成された任意の抗原抗体複合体を検出するステップとを含み、抗原抗体複合体の存在は、対象における関節リウマチの指標となる。形成された任意の抗原抗体複合体の検出は、任意の適切な方法、例えば免疫アッセイにより行うことができる。
【００１０】
特定の実施形態において、インビトロでの診断方法で試験される対象、例えばヒト患者は、関節リウマチを有することが疑われる。特定の実施形態において、対象はＣＣＰ陰性である。
【００１１】
インビトロでの診断方法において用いられる生物学的試料は、全血、血清、血漿、尿、および滑液からなる群から選択され得る。
【００１２】
特定の実施形態において、ＢＲＡＦ触媒ドメインまたはその抗体結合断片を含む自己抗原マーカーは、固体の担体または支持体上に固定化される。例えば、自己抗原マーカーはアレイ上に固定化される。
【００１３】
特定の実施形態において、自己抗原マーカーに含まれるＢＲＡＦ触媒ドメインは、ヒト由来のものである。例えば、ＢＲＡＦ触媒ドメインは、配列番号２のアミノ酸４１６からアミノ酸７６６にわたるアミノ酸配列を有するか、含むか、またはそれにより構成される。
【００１４】
特定の実施形態において、ＢＲＡＦ触媒ドメインまたはその抗原結合断片を含む自己抗原マーカーは、対象から得られる生物学的試料において抗ＰＡＤ４抗体を検出することをさらに含む、関節リウマチのインビトロでの診断方法において使用される。同一のまたは他の実施形態において、自己抗原マーカーは、対象から得られる生物学的試料においてＣ反応性タンパク質、血清アミロイドＡ、インターロイキン６、Ｓ１００タンパク質、オステオポンチン、リウマチ因子、マトリクスメタロプロテアーゼ１、マトリクスメタロプロテアーゼ３、ヒアルロン酸、ｓＣＤ１４、血管新生マーカー、および骨、軟骨、または滑膜の代謝産物からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーの濃度を測定することをさらに含む、関節リウマチのインビトロでの診断方法において使用される。
【００１５】
関連する態様において、本発明は、関節リウマチの診断において用いるための、アレイの表面に付着した自己抗原マーカーを提供し、自己抗原マーカーは、ＢＲＡＦ触媒ドメインまたはその抗体結合断片を含む。とりわけ、本発明は、対象における関節リウマチのインビトロでの診断方法において用いるための、アレイの表面に付着した自己抗原マーカーを提供し、自己抗原マーカーは、ＢＲＡＦ触媒ドメインまたはその抗体結合断片を含む。
【００１６】
特定の実施形態において、ＢＲＡＦ自己抗原マーカーが付着しているアレイはさらに、その表面に付着した、ＰＡＤ４またはその抗体結合断片を含む自己抗原マーカーを含む。同一のまたは他の実施形態において、ＢＲＡＦ自己抗原マーカーが付着しているアレイはさらに、その表面に付着した、ＲＡ特異的自己抗体、とりわけ抗核抗体および抗ＣＣＰ抗体の存在を検出するための少なくとも１つのさらなるマーカーを含む。
【００１７】
別の態様において、本発明は、関節リウマチのマーカーとしてのＢＲＡＦ触媒ドメインまたはその抗体結合断片を含む自己抗原マーカーの使用を提供する。
【００１８】
さらに別の態様において、本発明は、対象における関節リウマチのインビトロ診断のための方法を提供し、前記方法は、対象から得られる生物学的試料を、ＢＲＡＦ触媒ドメインまたはその抗体結合断片を含む自己抗原マーカーと、抗原抗体複合体の形成を可能にする時間および条件下で接触させるステップと、形成された任意の抗原抗体複合体を検出するステップとを含み、抗原抗体複合体の存在は、対象における関節リウマチの指標となる。
【００１９】
特定の実施形態において、対象、例えばヒト患者は、関節リウマチを有することが疑われる。特定の実施形態において、対象、例えばヒト患者はＣＣＰ陰性である。
【００２０】
対象から得られ、かつ本発明の診断方法における使用に適した生物学的試料は、全血、血清、血漿、尿、および滑液からなる群から選択され得る。
【００２１】
本明細書において提供される診断方法において、自己抗原マーカーと対象から得られる生物学的試料内に存在する自己抗体との間で形成される任意の抗原抗体複合体の検出は、任意の適切な方法によって行うことができる。特定の実施形態において、検出は免疫アッセイによるものである。
【００２２】
特定の実施形態において、ＢＲＡＦ触媒ドメインまたはその抗体結合断片を含む自己抗原マーカーは、固体の担体または支持体上に固定化される。
【００２３】
対象が人間である実施形態において、ＢＲＡＦ触媒ドメインまたはその抗体結合断片は、好ましくはヒト由来のものである。特定の実施形態において、ＢＲＡＦ触媒ドメインは、本明細書において定義される配列番号２のアミノ酸４１６からアミノ酸７６６にわたるアミノ酸配列を有する。
【００２４】
特定の実施形態において、本発明の診断方法はさらに、試験される対象から得られる生物学的試料における抗ＰＡＤ４抗体を検出することを含む。これらまたは他の実施形態において、本方法はさらに、対象から得られる生物学的試料において抗ＣＰＰ抗体を検出することを含む。その代わりに、またはそれに加えて、診断方法はさらに、対象から得られる生物学的試料においてＣ反応性タンパク質、血清アミロイドＡ、インターロイキン６、Ｓ１００タンパク質、オステオポンチン、リウマチ因子、マトリクスメタロプロテアーゼ１、マトリクスメタロプロテアーゼ３、ヒアルロン酸、ｓＣＤ１４、血管新生マーカー、および骨、軟骨、または滑膜の代謝産物からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーの濃度を測定することを含み得る。
【００２５】
さらに別の態様において、本発明は、対象における関節リウマチの診断のためのキットを提供する。より具体的には、キットは、対象から得られる生物学的試料における抗ＢＲＡＦ自己抗体を検出するために提供され、ＢＲＡＦ触媒ドメインまたはその抗体結合断片を含む自己抗原マーカーと、自己抗原マーカーと生物学的試料内に存在する自己抗体との間で形成される抗原抗体複合体を検出するための試薬であって、自己抗体が、対象における関節リウマチの指標となる抗ＢＲＡＦ自己抗体である試薬とを含む。このキットにおいて、自己抗原マーカーは固体の担体もしくは支持体上に固定化され得るか、または、固体の担体もしくは支持体上に自己抗原マーカーを固定化するために用いられる試薬がキット内に含まれ得る。キットはさらに、本明細書において提供される診断方法のいずれかを実施するための指示を含み得る。
【００２６】
特定の実施形態において、キットはさらに、ＰＡＤ４またはその抗体結合断片を含む第２の自己抗原マーカーと、第２の自己抗原マーカーと生物学的試料内に存在する自己抗体との間で形成される抗原抗体複合体を検出するための第２の試薬であって、自己抗体が、対象におけるＲＡの指標となる抗ＰＡＤ４自己抗体である試薬とを含む。
【００２７】
さらに別の態様において、本発明は、対象におけるＲＡの診断のためのアレイを提供する。とりわけ、本発明は、試験される対象から得られる生物学的試料におけるＲＡ特異的自己抗体の存在を検出するためのアレイを提供する。より具体的には、本発明に従ったアレイは、その表面に付着した、ＢＲＡＦ触媒ドメインまたはその抗体結合断片を含む自己抗原マーカーと、場合によっては、ＰＡＤ４またはその抗体結合断片を含む第２の自己抗原マーカーとを含む。特定の実施形態において、本発明のアレイはさらに、その表面に付着した、抗核抗体および抗ＣＣＰ抗体などのＲＡ特異的自己抗体の存在を検出するための少なくとも１つのさらなる自己抗原マーカーを含む。
【００２８】
本発明のこれらおよび他の目的、利点、および特徴が、以下の好ましい実施形態の詳細な説明を読んだ当業者には明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】１９人のＲＡ患者、７人のＡＳ患者、２人のＳＬＥ患者、および４人のＳＳＣ患者、ならびに１０人の健康な対照のそれぞれの血清により認識されるＰｒｏｔｏＡｒｒａｙヒトタンパク質マイクロアレイのタンパク質の数を示すグラフである。
【図１Ｂ】患者および健康な対照のそれぞれの群により認識されるタンパク質マイクロアレイのタンパク質の平均数を示すグラフである。
【図２】ＡＳ患者、ＳＬＥ患者、ＳＳＣ患者、健康な対照、および２個、１個、または０個のＲＡ関連ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子を発現するＲＡ患者により認識されるＰｒｏｔｏＡｒｒａｙヒトタンパク質マイクロアレイのタンパク質の平均数を示すグラフである。
【図３】少なくとも１人のＲＡ患者、少なくとも２人のＲＡ患者、少なくとも３人のＲＡ患者などにより認識されるＰｒｏｔｏＡｒｒａｙヒトタンパク質マイクロアレイのタンパク質の総数を示すグラフである。また、ＡＳ患者の少なくとも２０％、ＳＳＣ患者の少なくとも２０％、および健康な個体の少なくとも２０％によっても認識される、ＲＡ患者により認識されるタンパク質も、このグラフにおいて示される。
【図４】ＲＡ患者の血清により最も頻繁に認識されることが明らかになったタンパク質を列挙する表である。これらのタンパク質を認識したＲＡ患者、ＡＳ患者、ＳＬＥ患者、ＳＳＣ患者、および健康な個体の数がこの表において表される。また、それぞれのタンパク質の対応するヌクレオチド配列のＧｅｎＢａｎｋ登録番号も表される。
【図５Ａ】ＥＬＩＳＡにより決定された、ＰＡＤ４について陽性のＲＡ患者、ＡＳ患者、および健康な個体のパーセンテージを示すグラフである。
【図５Ｂ】ＥＬＩＳＡにより決定された、ＰＡＤ４について陽性の、２個（ＳＥ＋／ＳＥ＋）、１個（ＳＥ＋／ＳＥ−）、または０個（ＳＥ−／ＳＥ−）のＲＡ関連ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子を発現するＲＡ患者のパーセンテージを示すグラフである。
【図６Ａ】ＥＬＩＳＡにより決定された、ＰＩＰ４Ｋ２Ｃについて陽性のＲＡ患者、ＡＳ患者、および健康な個体のパーセンテージを示すグラフである。
【図６Ｂ】ＥＬＩＳＡにより決定された、ＰＩＰ４Ｋ２Ｃについて陽性の、２個（ＳＥ＋／ＳＥ＋）、１個（ＳＥ＋／ＳＥ−）、または０個（ＳＥ−／ＳＥ−）のＲＡ関連ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子を発現するＲＡ患者のパーセンテージを示すグラフである。
【図７Ａ】ウェスタンブロッティングにより決定された、ＢＲＡＦ触媒ドメインについて陽性のＲＡ患者、ＡＳ患者、および健康な個体のパーセンテージを示すグラフである。
【図７Ｂ】ウェスタンブロッティングにより決定された、ＢＲＡＦ触媒ドメインについて陽性の、２個（ＳＥ＋／ＳＥ＋）、１個（ＳＥ＋／ＳＥ−）、または０個（ＳＥ−／ＳＥ−）のＲＡ関連ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子を発現するＲＡ患者のパーセンテージを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
定義
本明細書を通して、以下の段落において定義されるいくつかの用語が用いられる。
【００３１】
本明細書において用いられる場合、「対象」という用語は、ＲＡに罹患し得るが疾患を有していてもよく、または有していなくてもよい、ヒトまたは別の哺乳動物（例えば、霊長類、犬、猫、山羊、馬、豚、マウス、ラット、ウサギなど）を言う。本発明の多くの実施形態において、対象は人間である。このような実施形態において、対象はしばしば「個体」と呼ばれる。「個体」という用語は特定の年齢を指すものではなく、したがって、子供、十代、および成人を包含する。
【００３２】
「ＲＡを有することが疑われる対象」という用語は、ＲＡの指標となる１つもしくは複数の症状（例えば、関節の痛み、こわばり、もしくは腫れ）を示す対象、または（例えば、検診中に）ＲＡについてスクリーニングされる対象を言う。その代わりに、またはそれに加えて、ＲＡを有することが疑われる対象は、１つまたは複数の危険因子（例えば、年齢、性別、家族歴、喫煙など）を有し得る。この用語は、ＲＡについて試験されていない対象および初期診断を受けた対象も包含する。
【００３３】
「生物学的試料」という用語は、本明細書において、その最も広い意味で用いられる。生物学的試料は通常、対象から得られる。試料は、本発明のバイオマーカーと共にアッセイされ得る、任意の生物学的組織または液体のものであり得る。試料は、「臨床試料」、すなわち患者に由来する試料であることが多い。このような試料には、限定はしないが、細胞を含んでいてもよく、または含んでいなくてもよい体液、例えば血液（例えば全血、血清、または血漿）、尿、滑液、唾液、および関節液、骨または軟骨などから得られる組織または細針生検試料、ならびに診断、治療、および／または転帰の履歴が知られている保存された試料が含まれる。生物学的試料にはまた、組織学的な目的で採取された凍結切片などの組織切片が含まれ得る。「生物学的試料」という用語はまた、生物学的試料を処理することにより得られる任意の材料を包含する。得られる材料には、限定はしないが、試料またはその試料から抽出されるタンパク質から単離される細胞（またはその後代）が含まれる。生物学的試料の処理は、ろ過、蒸留、抽出、濃縮、干渉成分の不活性化、試薬の添加などの１つまたは複数を伴い得る。
【００３４】
「正常な」および「健康な」という用語は、本明細書においてほぼ同じ意味で用いられる。それらは、いずれのＲＡ症状も示していない対象、およびＲＡまたは軟骨もしくは骨の傷害と診断されていない対象を言う。好ましくは、正常な対象は、ＲＡに対する投薬治療を受けておらず、いずれの他の疾患とも診断されていない（特に、自己免疫性炎症性疾患）。特定の実施形態において、正常な対象は、試験される生物学的試料を得た対象と比較して同様の性別、年齢、および／または肥満度指数を有する。「正常な」という用語はまた、本明細書において、健康な対象から得られる試料を特定するために用いられる。
【００３５】
本発明の関連において、「対照」という用語は、対象を特徴付けるために用いられる場合、健康な対象またはＲＡ以外の特定の疾患と診断された患者を言う。「対照試料」という用語は、健康な対象またはＲＡ以外の疾患と診断された患者から得られた１つまたは２つ以上の試料を言う。
【００３６】
「自己抗体」という用語は、本明細書において用いられる場合、その技術分野において理解されている意味を有し、かつ、対象の免疫系により産生され、対象自身のタンパク質の１つまたは複数に対する抗体を言う。自己抗体は、身体自体の細胞、組織、および／または器官を攻撃し得、炎症および損傷を生じさせる。
【００３７】
本明細書において用いられる場合、「自己抗原」という用語は、自己免疫反応の場合と同様に対象の身体における自己抗体の産生を刺激する、内因性抗原またはその活性断片を言う。この用語はまた、対象内または対象から得られる生物学的試料内に存在する自己抗体と抗原抗体複合体を形成し得る、任意の物質を包含する。
【００３８】
「抗体結合断片」という用語は、抗原と組み合わせて本明細書において用いられる場合、抗体に結合して抗原抗体複合体を形成するという抗原の能力を保持している、本発明の抗原の断片を言う。とりわけ、本発明の抗原の抗体結合断片は、ＲＡ特異的自己抗体を結合する能力を保持している。抗原の適切な抗体抗原断片は、ＲＡ特異的自己抗体を結合するそれらの能力を確認するための単純な検査によって当業者が同定することができる。
【００３９】
「バイオマーカー」および「マーカー」という用語は、本明細書において、ほぼ同じ意味で用いられる。それらは、生物学的プロセス、生物学的事象、および／または病理学的状態の特徴的な指標となる物質を言う。本明細書において用いられる場合、「自己抗原マーカー」という用語は、本明細書において定義される、自己抗体を伴う生物学的プロセス、生物学的事象、および／または病理学的状態の特徴的な指標となる自己抗原を言う。
【００４０】
本明細書において用いられる場合、「ＲＡの指標となる」という用語は、プロセスまたは事象に適用される場合、プロセスまたは事象が健康な対象および／またはＲＡ以外の疾患に罹患している対象におけるよりもＲＡを有する対象において有意に頻繁に見られるような、ＲＡの診断に役立つプロセスまたは事象を言う。
【００４１】
「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」という用語は、本明細書においてほぼ同じ意味で用いられ、それらの中性（荷電していない）形態の、または塩としての、およびグリコシル化、側鎖の酸化、またはリン酸化により修飾されていないかまたは修飾されている、様々な長さのアミノ酸配列を言う。特定の実施形態において、アミノ酸配列は、完全長の天然タンパク質である。他の実施形態において、アミノ酸配列は、完全長タンパク質の小断片である。さらに他の実施形態において、アミノ酸配列は、グリコシル単位、脂質、またはリン酸塩などの無機イオンなどの、アミノ酸の側鎖に付着したさらなる置換基により、およびスルフヒドリル基の酸化などの鎖の化学的変換に関する修飾により修飾される。したがって、「タンパク質」という用語（またはその同等の用語）は、その特異的特性を有意には変化させない修飾を受ける完全長の天然タンパク質のアミノ酸配列またはその断片を含むことを意図したものである。とりわけ、「タンパク質」という用語は、タンパク質アイソフォーム、すなわち、同一の遺伝子によりコードされるがｐＩもしくはＭＷまたはその両方が異なる変異体を包含する。このようなアイソフォームは、アミノ酸配列が異なり得るか（例えば、選択的スプライシングまたは制限タンパク質分解の結果として）、あるいは、差次的な翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、アシル化、ホスホリル化）から生じ得る。
【００４２】
「タンパク質類似体」という用語は、本明細書において用いられる場合、タンパク質と同様のまたは同一の機能を有するが、そのタンパク質のアミノ酸配列と同様もしくは同一であるアミノ酸配列またはそのタンパク質の構造と同様もしくは同一の構造を含んでいる必要はないポリペプチドを言う。好ましくは、本発明の関連において、タンパク質類似体は、タンパク質のアミノ酸配列に少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一なアミノ酸配列を有する。
【００４３】
「タンパク質断片」という用語は、本明細書において用いられる場合、タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも５個のアミノ酸残基（好ましくは、少なくとも約１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、または２５０個のアミノ酸残基）からなるアミノ酸配列を含むポリペプチドを言う。タンパク質の断片は、タンパク質の機能的活性を有していてもよく、または有していなくてもよい。
【００４４】
「相同」（または「相同性」）という用語は、本明細書において用いられる場合、「同一性」という用語と同義であり、２つのポリペプチド分子の間または２つの核酸分子の間の配列類似性を言う。比較される配列の両方における１つの位置に同一の塩基または同一のアミノ酸残基が存在する場合、それぞれの分子はその位置で相同である。２つの配列の間の相同性のパーセンテージは、２つの配列が共有する、一致するかまたは相同な位置の数を、比較される位置の数で割り、１００をかけたものに対応する。通常、比較は、２つの配列をアラインして最大の相同性を得る場合に行われる。相同なアミノ酸配列は、同一のまたは類似のアミノ酸配列を共有する。類似の残基は、参照配列における対応するアミノ酸残基に対する保存的置換、または前記残基の「許容される点突然変異」である。参照配列における残基の「保存的置換」は、対応する参照残基に物理的または機能的に類似の置換、例えば、類似のサイズ、形状、電荷、共有結合または水素結合を形成する能力を含む化学的特性などを有する置換である。特に好ましい保存的置換は、Ｄａｙｈｏｆｆらによる「認められた点突然変異」について規定された基準を満たす保存的置換である（「Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」、１９７８、Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ、Ｓｕｐｐｌ．３、２２：３５４〜３５２）。
【００４５】
「タンパク質アレイ」および「タンパク質チップ」という用語は、本明細書においてほぼ同じ意味で用いられる。それらは、基質上の個別のスポットに異なるタンパク質が規則的な様式で固定化されている基質表面を言う。タンパク質アレイは、タンパク質／タンパク質相互作用（例えば、抗原／抗体相互作用）を同定するため、酵素の基質を同定するため、または生物学的に活性な小分子の標的を同定するために用いることができる。「マイクロアレイ」という用語は、より具体的には、小型化され、視覚的評価のための顕微鏡的試験が必要となるアレイを言う。
【００４６】
「標識された」、「検出可能な作用物質で標識された」、および「検出可能な部分構造で標識された」という用語は、本明細書においてほぼ同じ意味で用いられる。これらの用語は、実体（例えば抗原）が例えば別の実体（例えば抗体）に結合した後に可視化され得ることを特定するために用いられる。好ましくは、検出可能な作用物質または部分構造はシグナルを生じさせるように選択され、前記シグナルは、測定可能であり、その強度が、結合した実体の量に関連するものである。アレイに基づいた方法において、検出可能な作用物質または部分構造はまた、好ましくは、局所的なシグナルを生じさせ、それによりアレイ上の各スポットからのシグナルの空間分解能を可能にするように選択される。タンパク質およびポリペプチドを標識するための方法は、当技術分野において周知である。標識ポリペプチドは、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、もしくは化学的手段、または任意の他の適切な手段により直接的または間接的に検出可能な、標識の組み込みまたは標識への結合により調製することができる。適切な検出可能な作用物質には、限定はしないが、様々なリガンド、放射性核種、蛍光染料、化学発光作用物質、微小粒子、酵素、比色標識、磁気標識、およびハプテンが含まれる。
【００４７】
「治療」という用語は、（１）疾患もしくは状態の発病を遅らせるかもしくは予防すること、または（２）症状の状態の進行、重篤化、もしくは悪化を減速もしくは停止させること、または（３）症状の状態の改善をもたらすこと、または（４）状態を治癒させることを目的とする方法を特徴付けるために、本明細書において用いられる。治療は、予防的または防止的作用のために、疾患の発病の前に投与され得る。治療はまた、治療作用のために疾患の開始後にも投与され得る。
【００４８】
特定の好ましい実施形態の詳細な説明
上述したように、本発明は、患者から得られる生物学的試料におけるＲＡ特異的自己抗体の存在を検出するために用いることができる自己抗原マーカーを提供するものである。また、ＲＡの診断のためにこれらの自己抗原マーカーを用いるための方法も提供される。
【００４９】
Ｉ− ＲＡの自己抗原マーカー
実施例の節において記載されるように、本出願人らは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されているＰｒｏｔｏＡｒｒａｙヒトタンパク質マイクロアレイを用いてＲＡ患者の血清をスクリーニングすることにより、ＲＡのバイオマーカーを同定した。このマイクロアレイは、プロテアーゼ／ペプチダーゼ、分泌タンパク質、転写因子、細胞死タンパク質、プロテインキナーゼ、核タンパク質、膜タンパク質、および代謝タンパク質を含む、８０００個を超えるヒトタンパク質を含む。より具体的には、本出願人らは、ＲＡ患者、ならびに脊椎関節症（ＡＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、および全身性硬化（ＳＳＣ）に罹患している患者と健康な個体とを含む様々な対照から得られる血清試料をスクリーニングし、試験した様々な群について結合パターンを比較した。本出願人らは、ＲＡ患者の血清により認識されるタンパク質の大部分が対照の血清によっても認識されることを見出した（図３を参照されたい）。
【００５０】
ＲＡ患者の多くにより認識されたタンパク質を、図４に示される表に列挙する。これらのタンパク質には、ＰＡＤ４、ＢＲＡＦ触媒ドメイン、腫瘍抑制副伝達性候補４、プロテインキナーゼＣベータ１、ヌクレオシド二リン酸結合部分Ｘモチーフ２１型、ヌクレオシド二リン酸結合部分Ｘモチーフ２１型、ＥＰＨ受容体Ｂ１、微小管関連ＲＰ ＥＢファミリーのメンバー、ＰＩＰ４Ｋ２Ｃ、プロテインキナーゼＣシータ、Ｖ ＥＲＢ Ｂ２、カルシウムカルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩアルファ、プロテインキナーゼＣアルファ、プロテインキナーゼＣベータ１、およびＤＥＰドメイン６が含まれる。
【００５１】
これらのタンパク質の３つのみが、ＲＡ患者の血清により特異的に認識されることが明らかになり（図４を参照されたい）、それらをＲＡの潜在的な候補バイオマーカーとした。これらのタンパク質は、ＰＡＤ４（ペプチジルアルギニンデイミナーゼ４）、ＰＫＣベータ１（プロテインキナーゼＣベータ１）、およびＰＩＰ４Ｋ２Ｃ（ホスファチルイノシトール４リン酸５キナーゼＩＩ型ガンマ）である。試験したＲＡ患者のうち４７％がＰＡＤ４について陽性であり、３１％がＰＫＣベータ１について陽性であり、２６％がＰＩＰ４Ｋ２Ｃについて陽性であったが、対照群の個体はこれらのタンパク質のそれぞれについて全て陰性であった。これらの３つの候補バイオマーカーに加え、本出願人らは、ＢＲＡＦ触媒ドメイン（ｖ ｒａｆマウス肉腫ウイルス癌遺伝子類似体Ｂ１触媒ドメイン）を選び出したが、それは、このタンパク質が興味深い選択性を示すことが明らかになったためである（図４を参照されたい）。実際、スクリーニング実験において、ＡＳ患者の０％、ＳＬＥ患者の０％、ＳＳＣ患者の０％、および健康な個体の１０％がＢＲＡＦ候補ドメインについて陽性であったのに対し、試験したＲＡ患者の４７％がＢＲＡＦ候補ドメインについて陽性であることが明らかになった。
【００５２】
実施例の節において記載されるように、本出願人らは次に、ウェスタンブロッティングおよび／またはＥＬＩＳＡを用いて、スクリーニング実験において同定されたＲＡの潜在的な候補バイオマーカー（すなわち、ＰＡＤ４、ＰＫＣベータ１、ＰＩＰ４Ｋ２Ｃ、およびＢＲＡＦ触媒ドメイン）の有効性を実証した。このさらなる試験により、４個の候補の２個のみがＲＡの自己抗原マーカーとして有効性を実証された。有効性を実証されたタンパク質は、ＢＲＡＦ触媒ドメインおよびＰＡＤ４である。実際、タンパク質アレイのスクリーニングおよびウェスタンブロッティング分析により、ＡＳ患者の０％、ＳＬＥ患者の０％、ＳＳＣ患者の０％、および健康な個体の４％のみがＢＲＡＦ候補ドメインについて陽性であったのに対し、ＲＡ患者の４７％がＢＲＡＦ候補ドメインについて陽性であることが明らかになった。タンパク質アレイのスクリーニングおよびＥＬＩＳＡ分析により、ＡＳ患者の０％、ＳＳＣ患者の０％、および健康な個体の３％がＰＡＤ４について陽性であったのに対し、ＲＡ患者の３２％がＰＡＤ４について陽性であることが明らかになった。
【００５３】
したがって、特定の実施形態において、本発明は、ＢＲＡＦ触媒ドメインまたはその抗体結合断片もしくは変異体を含む自己抗原マーカーを提供する。他の実施形態において、本発明は、ＰＡＤ４またはその抗体結合断片もしくは変異体を含む自己抗原マーカーを提供する。
【００５４】
ＢＲＡＦ触媒ドメイン
ＢＲＡＦ（Ｂ−ｒａｆとも呼ばれる）は、ＲＡＦタンパク質ファミリーのセリン−スレオニンキナーゼタンパク質である。これは、細胞の成長を調節する保存された経路であるマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達経路に関与する。この経路を介したシグナル伝達は、ヒトの癌のおよそ３０％において上昇している。この経路はまた、関節の炎症および破壊をもたらす炎症性サイトカインの産生に関与することが知られている（Ｃ．Ｍ．ＣｒｅｗｓおよびＲ．Ｌ．Ｅｒｉｋｓｏｎ、Ｃｅｌｌ、１９９３、７４：２１５〜２１７；Ｔ．Ｔｈａｌｈａｍｅｒら、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ、２００８、４７：４０９〜４１４）。
【００５５】
ＲＡＦタンパク質は、Ｎ末端の調節領域およびＣ末端の触媒ドメインを含む。それらは、３つの保存領域、すなわちＣＲ１、ＣＲ２、およびＣＲ３からなる。ＣＲ１は２つのＲａｓ結合ドメイン（Ｒａｆ様Ｒａｓ結合ドメインであるＲＢＤ、およびシステインに富んだドメインであるＣＲＤ）を有し、ＣＲ２はセリン／スレオニンに富んだドメインであり、ＣＲ３は触媒キナーゼドメインである。ヒトにおいて、ＢＲＡＦ遺伝子は、７６６個のアミノ酸残基からなるＢＲＡＦタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＰ＿００４３２４．１）をコードし、その配列は配列番号１において定義される。
【００５６】
【表１】
【００５７】
このタンパク質において、ＲＢＤはアミノ酸１５６から２２７にわたり、プロテインキナーゼＣ保存領域１ドメインはアミノ酸２３５から２８０にわたり、セリン−スレオニンキナーゼ触媒ドメインはアミノ酸４５６から７１２にわたる。
【００５８】
本発明の関連において、「ＢＲＡＦ触媒ドメイン」という用語は、ＢＲＡＦタンパク質のセリン−スレオニンキナーゼ触媒ドメインの配列を含むアミノ酸配列を言う。したがって、例えば、ＢＲＡＦ触媒ドメインのアミノ酸配列は、ＢＲＡＦのセリン−スレオニンキナーゼ触媒ドメインの配列を包含するＢＲＡＦタンパク質のアミノ酸配列であり得る。あるいは、ＢＲＡＦ触媒ドメインのアミノ酸配列は、ＢＲＡＦタンパク質のセリン−スレオニンキナーゼ触媒ドメインの配列であり得る。
【００５９】
本発明の実施において、ＢＲＡＦタンパク質は任意の適切な哺乳動物（例えば、ＢＲＡＦタンパク質の配列が決定されているかまたは予想されているラット、犬、牛、霊長類）由来のものであり得る。しかし、ヒト対象の生物学的試料が試験される実施形態において、ＢＲＡＦタンパク質は好ましくはヒト由来のものである。「ヒト由来のもの」という用語は、タンパク質（またはその領域もしくは断片）を特徴付けるために本明細書において用いられる場合、ヒトタンパク質（すなわち、ヒトの身体において天然に生じる野生型タンパク質）に相同なタンパク質またはポリペプチドを言う。
【００６０】
したがって、ＢＲＡＦタンパク質がヒト由来のものである実施形態において、「ＢＲＡＦ触媒ドメイン」という用語は、配列番号１のアミノ酸４５６からアミノ酸７１２にわたる配列を含むアミノ酸配列を言う。したがって、特定の実施形態において、本発明は、配列番号１のアミノ酸４５６から７１２にわたる配列またはその抗原結合断片を含む自己抗原マーカーを提供する。ＢＲＡＦ触媒ドメインの抗原結合断片は、ＲＡ特異的自己抗体を結合する抗原の能力を保持している、ＢＲＡＦ触媒ドメインの任意の断片である。
【００６１】
本出願人らが用いたＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎヒトタンパク質マイクロアレイにおいて、ＢＲＡＦ触媒ドメインは、配列番号１のアミノ酸４１６から７６６にわたるアミノ酸配列（すなわち、セリン−スレオニンキナーゼ触媒ドメインを包含するＢＲＡＦタンパク質のアミノ酸配列）を含み、この配列は、配列番号２において示されているように、５９９位のバリン残基（Ｖ）がグルタミン酸残基（Ｅ）により置換されている。ヒトの癌においてしばしば見られるＢＲＡＦのＶ５９９Ｅ突然変異は、野生型ＢＲＡＦと比較したキナーゼ活性の上昇に関連することが実証されている（Ｈ．Ｄａｖｉｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、２００２、４１７：９４９〜９５４；Ｍ．Ｈ．Ａｎｄｅｒｓｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、２００４、６４：５４５６〜５４６０）。
【００６２】
【表２】
【００６３】
したがって、特定の実施形態において、本発明は、配列番号２のアミノ酸４１６から７６６にわたる配列またはその抗原結合断片を含む自己抗原マーカーを提供する。
【００６４】
本発明はまた、ＢＲＡＦ触媒ドメインの変異体またはその抗体結合断片を含む自己抗原マーカーを包含する。適切な変異体には置換変異体が含まれ、この置換変異体は、天然の状態で保存的であり、かつ、イソロイシンもしくはバリン残基によるロイシン残基の置換、グルタミン酸残基によるアスパラギン酸残基の置換、またはセリン残基によるスレオニン残基の置換などの、天然に生じるポリペプチドで類似の構造的および／または化学的特性を有する別のアミノ酸による、１つまたは２つ以上のアミノ酸の置換により生じるものである。他の適切な変異体には、１つまたは２つ以上のアミノ酸の挿入または欠失により生じる、挿入変異体または欠失変異体が含まれる。適切な変異体は、天然に生じるポリペプチドの抗原結合活性を保持しているものである。それらは、単純な抗体結合アッセイにより容易に同定され得る。
【００６５】
ＰＡＤ４
ＰＡＤ４（ペプチジルアルギニンデイミナーゼ４）は、アルギニン残基をシトルリンに変換するＣＡ２＋依存性酵素である。ＰＡＤ４遺伝子におけるＲＡ関連の突然変異は様々な個体群において同定されており（Ａ．Ｓｕｚｕｋｉら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、２００３、３４：３９５〜４０２；Ｔ．Ｉｗａｍｏｔｏら、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ、２００６、４５：８０４〜８０７；およびＹ．Ｈ．Ｌｅｅら、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．Ｉｎｔ．、２００７、２７：８２７〜２３３）、また、ＲＡ患者はシトルリン含有タンパク質を認識する自己抗体を産生するため、ＰＡＤ４は、ＲＡ疾患の発病および進行の原因となると広く考えられている。ＰＡＤ４が一部のＲＡ患者において立体構造依存性の自己抗原であることが既に示されている（Ｙ．Ｔａｋｉｚａｗａら、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．、２００５、３：２１２〜２１５）。
【００６６】
ヒトにおいて、ＰＡＤ４タンパク質は、６６３個のアミノ酸残基（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＰ＿０３６５１９．１）を含み、配列番号３において定義される配列を有する。
【００６７】
【表３】
【００６８】
既に上述したように、本発明は、ＢＲＡＦ触媒ドメインまたはその抗体結合断片を含む自己抗原マーカーと組み合わせてＲＡの診断に用いることができる、ＰＡＤ４またはその抗体結合断片を含む自己抗原マーカーを提供する。本発明の関連において、「ＰＡＤ４」という用語は、天然に生じるＰＡＤ４タンパク質に相同なアミノ酸配列を言う。ＰＡＤ４タンパク質は、任意の適切な哺乳動物由来のものであり得る。しかし、ヒト患者から得られる生物学的試料が試験される実施形態において、ＰＡＤ４タンパク質は好ましくはヒト由来のものである。したがって、特定の実施形態において、本発明は、配列番号３により定義されるアミノ酸配列、その抗体結合断片、またはその変異体を含む、自己抗原マーカーを提供する。
【００６９】
自己抗原マーカーの調製
本発明の自己抗原マーカーは、化学的合成および組換え方法を含む任意の適切な方法によって調製することができる。
【００７０】
本発明のバイオマーカーは通常、十分に短いため、標準的な方法を用いる化学的合成が実行可能である。Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９６３、８５：２１４９〜２１５４）により最初に記載された固相ペプチド合成は、既知の配列のペプチドおよび小ペプチド分子を合成するための迅速で容易なアプローチである。このような固相技術の資料は、例えば、「Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｇ．Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ（編）、１９９７、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）において見ることができる。これらの合成手順のほとんどは、成長中のペプチド鎖への、１つまたは複数のアミノ酸残基または適切に保護されたアミノ酸残基の連続的な付加を伴う。例えば、第１のアミノ酸のカルボキシル基は、不安定な結合を介して固相に付着しており、事前に化学的に保護されて自己縮合を避けるようになっているアミノ基を有する第２のアミノ酸と反応する。結合した後、アミノ基は脱保護され、次のアミノ酸とプロセスが反復される。所望のペプチドが組み立てられると、それは固相から切断され、沈殿され、得られた遊離ペプチドは所望により分析および／または精製され得る。例えば「Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（Ｖｏｌ．ＩＩ、第３版、Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈら（編）、１９７６、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１０５〜２３７ページ）に記載されているような溶解方法もまた、本発明のバイオマーカーを合成するために用いることができる。
【００７１】
あるいは、本明細書において提供される自己抗原マーカーは、組換えＤＮＡ法によって産生することができる。これらの方法は通常、所望のタンパク質をコードする遺伝子の単離、適切なベクターへの遺伝子の組み込み、および細胞培養系における大量発現を含む。本発明のポリペプチドの配列をコードするＤＮＡは十分に短いため、当技術分野において知られている方法を用いて容易に合成的に調製される（例えば、Ｍ．Ｐ．Ｅｄｇｅら、Ｎａｔｕｒｅ、１９８１、２９２：７５６〜７６２を参照されたい）。
【００７２】
合成した後、所望のペプチドをコードするＤＮＡは、プラスミド、ファージ、ウイルス粒子、または、ベクターを含む他の核酸分子もしくは媒体を含む核酸分子であり得る、組換え発現ベクター内に挿入され、前記核酸分子は、適切な宿主細胞内に導入されると、目的のコード配列の発現を指示するための必要な遺伝的要素を含むものである。当技術分野において周知の標準的な技術を用いて、発現ベクター内に核酸分子を挿入することができる。挿入により、コード配列が、必要な調節配列に作動可能に連結される。
【００７３】
タンパク質の産生において用いるための宿主細胞は周知であり、容易に入手可能である。宿主細胞の例には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの弱毒株などの細菌細胞、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ株、Ｃａｎｄｉｄａ、または異種タンパク質を発現し得る任意の酵母株などの酵母細胞、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａなどの昆虫細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、サルＣＯＳ細胞、およびマウス３Ｔ３細胞などのヒト以外の哺乳動物組織培養細胞、ならびにＨｅＬａ細胞、ＨＬ−６０細胞、腎２９３細胞、および表皮Ｓ４３１細胞などのヒト組織培養細胞が含まれる。
【００７４】
周知の発現系においてポリペプチドを産生するためのいくつかの発現ベクターが市販されている。例えば、プラスミドｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから入手可能）およびｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡから入手可能）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおける本発明のペプチドの産生に用いることができる。同様に、プラスミドｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、酵母のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株におけるペプチドの産生に用いることができる。バキュロウイルス発現系のための市販されているＭａｃＢａｃＲ（商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から入手可能なＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（商標）トランスフェクションキットを、昆虫細胞における産生に用いることができ、一方、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されているプラスミドｐｃＤＮＡ Ｉ、ｐｃＤＮＡ３、およびｐＲｃ／ＲＳＶを、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞における本発明のペプチドの産生に用いることができる。
【００７５】
他の発現ベクターおよび発現系を、当業者に周知の方法を用いて得るかまたは生成することができる。プロモーターおよびポリアデニル化シグナルなどの必須の制御配列、好ましくはエンハンサーを含有する発現系は、様々な宿主に対して容易に利用可能である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、１９８９、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ、ＮＹ；およびＲ．Ｋａｕｆｍａｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９９０、１８５：５３７〜５６６を参照されたい）。
【００７６】
所望のタンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを用いて、適合性のある宿主細胞を形質転換する。宿主細胞はその後、所望のタンパク質の発現を促進する条件下で培養および維持される。そのようにして産生されたタンパク質は、培地から直接的に、または細胞の溶解により、回収および単離される。次にそれを、核磁気共鳴（ＮＭＲ）およびＸ線結晶構造解析などの様々な方法により特徴付けることができる。
【００７７】
当業者に理解されているように、本発明の自己抗原マーカーは融合タンパク質（すなわち、抗体結合部分、例えばＢＲＡＦ触媒ドメインがポリペプチド体に結合している分子）として産生され得る。このようなポリペプチド体は、得られる融合タンパク質に、多くの有利な特性のいずれかを付与するために選択され得る。例えば、ポリペプチド体は、組換え融合タンパク質の発現を増大させるために選択され得る。その代わりに、またはそれに加えて、ポリペプチド体は、例えばアフィニティー精製におけるリガンドとして作用することにより、融合タンパク質の精製を容易にし得る。タンパク質分解の切断部位を組換えタンパク質に付加し、それにより、精製の後に所望の配列をポリペプチド体から最終的に分離することができる。ポリペプチド体はまた、安定性が目的である場合、融合タンパク質に向上した安定性を付与するために選択され得る。適切なポリペプチド体の例には、例えば、得られた融合タンパク質をニッケルキレートカラム上で容易に精製することを可能にするポリヒスチジンタグが含まれる。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＢ結合タンパク質、またはプロテインＡは、市販されている融合発現ベクターを用いてＢＲＡＦ触媒ドメイン（またはＰＡＤ４）に融合され得る適切なポリペプチド体の他の例である。
【００７８】
あるいは、本発明の自己抗原マーカーは、（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）市販されているＢＲＡＦ触媒ドメイン、またはＰＡＤ４を用いて調製され得る。
【００７９】
特定の実施形態において、本発明の自己抗原マーカーは、固体の担体または支持体（例えば、ビーズまたはアレイ）上に固定化して提供される。固体表面上にポリペプチド分子を固定化するための方法は、当技術分野において知られている。とりわけ、本発明は、ＢＲＡＦ触媒ドメインまたはその抗体結合断片を含む自己抗原マーカーと、ＲＡの少なくとも１つの他のバイオマーカーとを表面に固定化された状態で含む、ＲＡの診断のためのアレイを提供する。特定の実施形態において、ＲＡの少なくとも１つの他のバイオマーカーは、ＰＡＤ４またはその抗体結合断片を含む自己抗原マーカーである。その代わりに、またはそれに加えて、アレイはさらに、対象から得られる生物学的試料における抗核抗体および／または抗ＣＣＰ抗体の存在の検出を可能にするバイオマーカーを表面上に固定化された状態で含み得る。「ＲＡの診断のためのアレイ」および「ＲＡを診断するためのアレイ」という用語は、本明細書においてほぼ同じ意味で用いられる。それらは、より具体的には、生物学的試料におけるＲＡ特異的自己抗体の検出のためのアレイを言う。
【００８０】
ＩＩ− 診断方法
本発明の自己抗原マーカーは、対象から得られる生物学的試料において、ＲＡの指標となる自己抗体の存在を検出するために用いることができる。
【００８１】
したがって、本発明は、対象におけるＲＡを診断するための方法を提供する。このような方法は、対象から得られる生物学的試料を、本発明の自己抗原マーカーと、自己抗原マーカーと生物学的試料内に存在する自己抗体との間での抗原抗体複合体の形成を可能にする時間および条件下で接触させることと、形成された任意の抗原抗体複合体の存在または不存在を検出することとを含み、抗原抗体複合体の存在は、対象におけるＲＡの指標となる。
【００８２】
とりわけ、本発明は、ＢＲＡＦ触媒ドメインまたはその抗体結合断片を含む自己抗原マーカーを用いて生物学的試料における抗ＢＲＡＦ自己抗体の存在を検出することにより対象におけるＲＡを診断するための方法を提供する。このような方法はさらに、ＰＡＤ４またはその抗体結合断片を含む自己抗原マーカーを用いて生物学的試料における抗ＰＡＤ４自己抗体の存在を検出することを含み得る。
【００８３】
生物学的試料
本発明の診断方法は、１つまたは複数の本発明のバイオマーカーをアッセイすることを可能にする、任意のタイプの生物学的試料の研究に適用され得る。適切な生物学的試料の例には、限定はしないが、尿、全血、血清、血漿、唾液、および滑液が含まれる。本発明の実施において用いられる生物学的試料は、対象から回収された新鮮なもしくは凍結された試料、または診断、治療、および／もしくは転帰の履歴が知られている保存された試料であり得る。生物学的試料は、例えば、対象からの血液の採取または細針吸引もしくは針生検の使用による、任意の非侵襲的手段により回収することができる。
【００８４】
好ましい実施形態において、本発明の方法は、試料の処理をすることなく、または限られた処理と共に、生物学的試料自体に対して実施される。
【００８５】
しかし、あるいは、本発明の方法は、生物学的試料から調製されたタンパク質抽出物に対して実施され得る。この場合、タンパク質抽出物は、好ましくは、全タンパク質含有物を含む。タンパク質抽出の方法は、当技術分野において周知である（例えば、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ」、Ｄ．Ｍ．Ｂｏｌｌａｇら、第２版、１９９６、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ；「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｅ．Ｌ．ＨａｒｒｉｓおよびＳ．Ａｎｇａｌ（編）、１９８９；「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｓ．Ｒｏｅ、第２版、２００１、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ」、Ｈ．Ａｈｍｅｄ、２００５、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ：Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬを参照されたい）。様々なキットを、体液および組織からタンパク質を抽出するために用いることができる。このようなキットは、例えばＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から市販されている。その後のプロトコルを非常に詳細に記載しているユーザーガイドが、通常はこれらのキットの全てに含まれる。感度、処理時間、および経費はキットごとに異なり得る。当業者であれば、特定の状況に最も適したキット（１つまたは複数）を容易に選択することができる。
【００８６】
抗原抗体複合体の検出
本発明の診断方法は通常、自己抗原マーカーと生物学的試料内に存在するＲＡ特異的自己抗体との間で形成される複合体の検出を伴う。本発明の実施において、このような抗原抗体複合体の検出は、任意の適切な方法によって行うことができる（例えば、Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＡ．Ｌａｎｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｍａｎｕａｌ」、１９８８、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹを参照されたい）。
【００８７】
例えば、抗原抗体複合体の検出は、免疫アッセイを用いて行うことができる。放射免疫アッセイ、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、および免疫蛍光免疫沈降を含む、広範な免疫アッセイ技術が利用可能である。免疫アッセイは当技術分野において周知である。このようなアッセイを実施するための方法、ならびに実用上の用途および手順は、テキストブックに要約されている。このようなテキストブックの例には、Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｉｎ：Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ、Ｒ．Ｈ．Ｂｕｒｄｏｎおよびｖ．Ｐ．Ｈ．Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９９０）、２２１〜２７８ページ、ならびに、免疫学的検出方法を記載している、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｓ．Ｐ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓの様々な巻、とりわけ第７０、７３、７４、８４、９２、および１２１巻が含まれる。免疫アッセイは、競合的または非競合的であってよい。
【００８８】
例えば、サンドイッチアッセイ技術の多くの変形のいずれかを用いて免疫アッセイを行うことができる。簡潔に述べると、本発明に従ったＲＡ特異的自己抗体の検出に適用される典型的なサンドイッチアッセイにおいて、標識されていない自己抗原マーカーは固体基質上に固定化されており、試験される試料を、結合した自己抗原マーカーと、抗原抗体複合体の形成を可能にする時間および条件下で接触させる。インキュベーションの後、検出可能な部分構造で標識された抗体と、試験される種から得られる抗体（例えば、ヒト対象では抗ヒトＩｇＧ）を特異的に認識する抗体とを添加し、任意の抗原結合自己抗体と標識抗体との間の三重複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートする。任意の結合していない材料を洗浄して取り除き、試料内の任意のＲＡ特異的自己抗体の存在を、検出可能な部分構造から直接的にまたは間接的に生じたシグナルの観察によって決定する。このアッセイの変形には、固定化された自己抗原マーカーに生物学的試料および標識抗体の両方が同時に添加されるアッセイが含まれる。
【００８９】
自己抗原マーカーは、固体の担体または支持体の表面に共有結合するかまたは受動的に結合することにより固定化され得る。適切な担体または支持体の材料の例には、限定はしないが、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、デキストラン、セファデックス、セファロース、カルボキシメチルセルロース、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、はんれい岩、フィルターペーパー、マグネタイト、イオン交換樹脂、ガラス、ポリアミンメチルビニルエーテルマレイン酸コポリマー、アミノ酸コポリマー、エチレンマレイン酸コポリマー、ナイロン、シルクなどが含まれる。固体の担体または支持体の表面上への自己抗原マーカーの固定化は、当技術分野において周知の方法を用いる、架橋、共有結合、または物理的吸着を伴い得る。固体の担体または支持体は、ビーズ、粒子、マイクロプレートウェル、アレイ、キュベット、管、膜の形態、または免疫アッセイを行うために適した任意の他の形状であり得る。特定の実施形態において、固体の担体または支持体への自己抗原マーカーの固定化には、当技術分野において周知のウェスタンブロッティング（または免疫ブロット）と呼ばれるプロセスにおける、ゲル電気泳動とその後に行われる膜（典型的には、ニトロセルロースまたはＰＶＤＦ）への転写が含まれる。
【００９０】
第２の抗体（すなわち、上記のサンドイッチアッセイにおいて添加される抗体）は、任意の適切な検出可能な部分構造で標識され得、前記部分構造はすなわち、その化学的性質により、三重複合体の検出、結果的には自己抗原自己抗体複合体の検出を可能にする、分析的に同定可能なシグナルをもたらす、任意の構成要素である。
【００９１】
検出は、定性的または定量的であり得る。抗体などの生物学的分子を標識するための方法は、当技術分野において周知である（例えば、「Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐａｒｔ Ｂ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１９７４、第３４巻、Ｗ．Ｂ．ＪａｋｏｂｙおよびＭ．Ｗｉｌｎｅｃｋ（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；ならびにＭ．ＷｉｌｃｈｅｋおよびＥ．Ａ．Ｂａｙｅｒ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９８８、１７１：１〜３２を参照されたい）。
【００９２】
免疫アッセイにおいて最も一般的に用いられる検出可能な部分構造は、酵素およびフルオロフォアである。酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）の場合、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼなどの酵素が、通常はグルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩により、第２の抗体に結合する。特異的な酵素と共に用いられる基質は通常、対応する酵素の加水分解の際の、検出可能なコロンの変化の発生について選択される。免疫蛍光の場合、第２の抗体は、その結合能を変えることなく、蛍光部分に化学的に結合する。蛍光標識された抗体が抗原抗体複合体に結合し、任意の結合していない材料が除去された後、蛍光部分により生じる蛍光シグナルが検出され、場合により定量される。あるいは、第２の抗体は、放射性同位体、化学発光部分、または生物発光部分で標識され得る。
【００９３】
ＲＡの診断
本発明の方法において、抗原抗体複合体の検出は、試験される生物学的試料におけるＲＡ特異的自己抗体の存在の指標となり、したがって、生物学的試料を得た対象におけるＲＡの指標となる。したがって、本発明の方法は、患者におけるＲＡの診断のために用いることができる。とりわけ、本発明の方法は、ＲＡを有することが疑われる対象を試験するために用いることができる。さらに、ＢＲＡＦ触媒ドメインまたはその抗体結合断片を含む自己抗原マーカーを用いる本発明の方法は、ＣＣＰ陰性の患者におけるＲＡを診断するために用いることができる。実際、本出願人らは、ＢＲＡＦ触媒ドメインについて陽性のＲＡ患者の３３％がＣＣＰ陰性であったことを示している。
【００９４】
当業者には、ＲＡの診断が、本明細書において提供される方法によってもたらされる結果のみに応じて行われ得ることが理解されよう。あるいは、医者は、ＲＡを診断するための既存の方法において用いられる他の臨床的または病理学的パラメーターも考慮し得る。したがって、本発明の方法を用いて得られる結果を、ＲＡの診断のために行われる他の試験、アッセイ、または手順の結果と比較し、かつ／または組み合わせることができる。このような比較および／または組み合わせは、より精密な診断を提供するために役立ち得る。
【００９５】
例えば、本発明のＲＡ診断方法は、ＡＲＡ基準（すなわち、Ｆ．Ｃ．Ａｒｎｅｔｔら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．、１９８８、３１：３１５〜３２４に記載されている、ＲＡの分類のためのＡｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ １９８７改定基準）と組み合わせて用いることができる。ＡＲＡ基準に従うと、患者が、１）少なくとも１時間にわたる朝のこわばり、２）３つ以上の関節領域の関節炎、３）手の関節の関節炎、４）対称性関節炎、５）リウマチ結節、６）血清リウマチ因子（ＲＦ）、および７）Ｘ線画像の変化という７個の基準の少なくとも４個を示す場合、患者はＲＡを有していることになり、基準１〜４は少なくとも６ヶ月にわたり存在していなくてはならない。
【００９６】
その代わりに、またはそれに加えて、本発明のＲＡ診断方法の結果は、他のＲＡバイオマーカーを用いる１つまたは複数のアッセイの結果と組み合わせて用いることができる。したがって、特定の実施形態において、ＲＡの診断は、本発明の方法の結果および異なるＲＡバイオマーカーを用いる１つまたは複数のさらなるアッセイの結果に基づき得る。例えば、ＲＡバイオマーカーのパネルは、例えばチップまたはビーズに基づいたアレイ技術を用いて、個別にまたは同時に試験することができる。
【００９７】
適切なＲＡバイオマーカーの例には、限定はしないが、ＣＣＰ、Ｃ反応性タンパク質、血清アミロイドＡ、インターロイキン６（ＩＬ６）、Ｓ１００タンパク質、オステオポンチン、リウマチ因子、マトリクスメタロプロテアーゼ１（ＭＭＰ−１）、マトリクスメタロプロテアーゼ３（ＭＭＰ−３）、ヒアルロン酸、ｓＣＤ１４、血管新生マーカー（血管内皮成長因子またはＶＥＧＦなど）、および骨、軟骨、または滑膜の代謝産物（ピリジノリンまたはそのグリコシル化形態、デオキシピリジノリン、架橋テロペプチド、コラーゲンネオエピトープ、ＣＳ８４６、軟骨オリゴマー基質タンパク質、軟骨中間層タンパク質、マトリリン、コンドロモジュラチン、オステオカルシンなど）が含まれる。
【００９８】
ＩＩＩ− キット
別の態様において、本発明は、本発明に従った診断方法を実施するために有用な材料を含むキットを提供する。本明細書において提供される診断手順は、診断研究所、実験研究所、または開業医により実施され得る。本発明は、これらの様々な状況において用いることができるキットを提供する。
【００９９】
本発明に従って生物学的試料におけるＲＡ特異的自己抗体を検出するため、および／または対象におけるＲＡを診断するための材料および試薬を、キット内で一緒に組み合わせることができる。本発明のそれぞれのキットは、本発明の少なくとも１つの自己抗原マーカーを、好ましくは生物学的試料における自己抗体の検出に適した量で含む。したがって、特定の実施形態において、本発明のキットは、ＢＲＡＦ触媒ドメインまたはその抗原結合断片を含む自己抗原マーカーを含む。他の実施形態において、本発明のキットは、ＢＲＡＦ触媒ドメインまたはその抗原結合断片を含む第１の自己抗原と、ＰＡＤ４またはその抗原結合断片を含む第２の自己抗原とを含む。自己抗原マーカー（１つまたは複数）は、基質表面（例えば、ビーズ、アレイなど）上に固定化されていてもよく、または固定化していなくてもよい。例えば、本発明のキットは、本明細書において提供される、ＲＡを診断するためのアレイを含み得る。あるいは、基質表面（例えば膜）が、（例えば、ゲル電気泳動および膜への転写を介して）自己抗原マーカーを固定化するために、本発明のキット内に含まれ得る。
【０１００】
さらに、本発明のキットは、通常、キット内に含まれる自己抗原マーカーと生物学的試料内に存在する自己抗体との間で形成される抗原抗体複合体の検出のための少なくとも１つの試薬も含む。このような試薬は、例えば、上記の、試験される種から得られる抗体（例えば、ヒト対象では抗ヒトＩｇＧ）を特異的に認識する標識抗体であり得る。
【０１０１】
手順に応じて、キットはさらに、抽出用の緩衝液および／または試薬、ウェスタンブロッティング用の緩衝液および／または試薬、免疫検出用の緩衝液および／または試薬、標識用の緩衝液および／または試薬、ならびに検出手段の、１つまたは複数を含み得る。手順の様々なステップを行うためのこれらの緩衝液および試薬を用いるためのプロトコルは、キットに含まれ得る。
【０１０２】
本発明のキットに含まれる様々な試薬は、固体（例えば、凍結乾燥されたもの）または液体の形態で供給され得る。本発明のキットは、場合により、それぞれの個別の緩衝液および／または試薬のための様々な容器（例えば、バイアル、アンプル、試験管、フラスコ、またはボトル）を含み得る。それぞれの構成要素は通常、そのそれぞれの容器内に等分されるかまたは濃縮形態で提供されるので適している。開示される方法の特定のステップを実施するために適した他の容器もまた提供され得る。キットの個別の容器は好ましくは、市販のために厳重な管理下で維持される。
【０１０３】
特定の実施形態において、キットは、本発明の方法に従って対象におけるＲＡを診断するためにその構成要素を用いるための指示を含む。本発明の方法に従ってキットを用いるための指示は、対象から得られる生物学的試料を処理するため、および／または試験を行うための指示、または結果を解釈するための指示を含み得る。キットはまた、医薬品または生物学的製剤の製造、使用、または販売を管理する行政機関により規定されている形式の注意事項を含み得る。
【０１０４】
ＩＶ− ＲＡのための新たな治療薬の開発
ＢＲＡＦ触媒ドメインは、ＲＡの治療またはＲＡの進行の予防に潜在的に有用な化合物または物質を同定するための魅力的な標的であり得る。例えば、ＢＲＡＦ触媒ドメインに対する中和活性または阻害活性を有する化合物または物質を同定するためのスクリーニングが開発され得る。
【０１０５】
このようなスクリーニングは、生体液、または細胞などの任意の適切な生物系において実施することができる。通常、スクリーニングは、標準的な組織培養器具において成長することができる細胞を用いて行われる。適切な細胞には、任意の認識されている供給源に由来する、全ての適切な正常細胞および形質転換細胞が含まれる。好ましくは、細胞は哺乳動物（ヒト、または齧歯動物もしくは猿などの動物）由来のものである。より具体的には、細胞はヒト由来のものである。哺乳動物細胞は、任意の器官または組織由来のものであり得（例えば、骨、軟骨、または滑液）、また、ＢＲＡＦを発現する細胞である限りにおいて任意の細胞型のものであり得る。本発明の方法の実施において用いられる細胞は、初代細胞、二次細胞、または不死化細胞（例えば、樹立細胞系）であり得る。それらは、当業者に周知の技術により調製することができる（例えば、細胞は、骨、軟骨、もしくは滑液から単離することができる）か、または免疫学的微生物学的商業リソースから購入することができる（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡから）。その代わりに、またはそれに加えて、細胞は、例えば目的の遺伝子を含むように、遺伝子操作することができる。最初の薬剤スクリーニング（すなわち、スクリーニングの第１回目（１つまたは複数））のために開発されたアッセイが、好ましくは、市販されており通常は比較的成長が容易な樹立細胞系を用いて行われるが、一方、薬剤開発のプロセスにおいてその後に用いられるアッセイが、好ましくは、入手、維持、および／または成長が通常は不死化細胞よりも困難であるがインビボの状況ではより良好な実験モデルとなる初代細胞および二次細胞を用いて行われる。スクリーニング方法は、マルチウェルアッセイプレートの複数のウェルに含まれる細胞を用いて行うことができる。
【０１０６】
当業者には理解されるように、任意の種類の化合物または作用物質をスクリーニングすることができる。候補化合物は合成または天然の化合物であり得、それは単一の分子、または異なる分子の混合物もしくは複合体であり得る。候補化合物は個別にスクリーニングすることができる。あるいは、コレクションまたはライブラリーに含まれる化合物は同時にスクリーニングすることができる。
【０１０７】
細菌、真菌、植物、および動物の抽出物の形態の天然化合物のコレクションは、例えば、Ｐａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ）またはＭｙｃｏＳｅａｒｃｈ（Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）から入手可能である。合成化合物のライブラリーは、例えばＣｏｍｇｅｎｅｘ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）、Ｂｒａｎｄｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ、ＮＨ）、Ｍｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ（Ｎｅｗ Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＣＴ）、およびＡｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）から市販されている。候補化合物のライブラリーもまた、例えばＭｅｒｃｋ、Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｃｏｍｅ、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｅｙｅｒｓ−Ｓｑｕｉｂｂ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ、Ｍｏｎｓａｎｔｏ／Ｓｅａｒｌｅ、およびＰｈａｒｍａｃｉａ ＵｐＪｏｈｎを含む化学系大企業により開発されており、市販されている。さらに、天然物のコレクション、合成により作成されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的、および生化学的手段を介して容易に修飾される。化学的ライブラリーは、従来の自動合成、ＰＣＲ、クローニング、または専売的な合成方法により比較的容易に調製される（例えば、Ｓ．Ｈ．ＤｅＷｉｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９３、９０：６９０９〜６９１３；Ｒ．Ｎ．Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９４、３７：２６７８〜２６８５；Ｃａｒｅｌｌら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．１９９４、３３：２０５９〜２０６０；Ｐ．Ｌ．Ｍｙｅｒｓ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７、８：７０１〜７０７を参照されたい）。
【０１０８】
ＢＲＡＦ触媒ドメインを標的として用いると、ＲＡの治療のための有用な作用物質は、広範なクラスの化学物質のいずれかにおいて見出すことができる。
【０１０９】
抗ＢＲＡＦ触媒ドメイン抗体をＲＡの治療のための治療ツールとして開発することも想定される。抗ＴＮＦアルファ抗体および抗ＣＤ２０抗体が、ＲＡの治療において現在用いられている。抗ＣＤ２０抗体で治療される患者においては高い臨床応答が観察され、これは、Ｂ細胞の枯渇の結果、ひいてはＢ細胞抗体の枯渇の結果生じる。しかし、全てのタイプのＢ細胞抗体の無差別的な枯渇は、免疫系を潜在的に弱め得る。より標的化された作用という利点をもたらす、抗ＢＲＡＦ触媒ドメイン抗体は、抗ＣＤ２０抗体の注射に関する制限および潜在的な問題を解決し得る。
【実施例】
【０１１０】
以下の実施例は、本発明の製造および実施の好ましい様式のいくつかを記載するものである。しかし、実施例は例示的な目的のものに過ぎず、本発明の範囲を制限することを意味するものではないことを理解されたい。さらに、実施例における記載が過去形で表されていない限り、明細書の以降の部分などのテキストは、実験が実際に行われたことまたはデータが実際に得られたことを示唆することを意図したものではない。
【０１１１】
以下に示す結果のほとんどは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる科学論文において、本出願人らにより報告されている（Ｉ．Ａｕｇｅｒら、「Ｎｅｗ Ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎｓ ｉｎ Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ８２６８ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｒｒａｙｓ ｗｉｔｈ ＲＡ Ｐａｔｉｅｎｔ’ｓ Ｓｅｒａ」、Ａｎｎａｌｓ Ｒｈｅｕｍａｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅ、２００９、６８（４）：５９１〜５９４）。
【０１１２】
序論
ＨＬＡ−ＤＲ遺伝子および自己抗体という２つの要素が、ＲＡの発症に重要である。ＲＡは、対立遺伝子多型を示すＨＬＡ−ＤＲ遺伝子の制御下にある。ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子は、ＲＡの発症に対して感受性を有し得るか（例えば、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１、＊０４０４、＊０１０１、＊０１０２、＊１００１）、中立であり得るか（例えば、ＨＬＡ−ＤＲ１５）、または防御的であり得る（例えば、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０７、＊０８、＊０４０２）（Ｐ．Ｋ．Ｇｒｅｇｅｒｓｅｎら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、１９８７、３０：１２０５〜１２１３；Ｄ．Ｒｅｖｉｒｏｎら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、２００１、４４：５３５〜５４０）。ＲＡを発症するリスクは、個体が発現する２つのＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子によって制御されており、ＨＬＡ−ＤＲについて個体を遺伝子型決定することにより評価することができる（Ｗ．Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．、１９９９、４２：７５７〜７６２）。
【０１１３】
本出願人らは、１９９２年から、フランス、マルセイユのＬａ Ｃｏｎｃｅｐｔｉｏｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌのリウマチ病棟における全てのＲＡ患者についてＨＬＡ−ＤＲの遺伝子型決定を行っている。１０００人のＲＡ患者を５００人の対照と比較することにより、本出願人らは、個体群における７２個の最も一般的な遺伝子型のそれぞれについて、ＲＡを発症する相対的なリスクを示す、ＨＬＡ−ＤＲ遺伝子型のリスク表を得ている。ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１とＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０４との間の並はずれた相乗効果、およびＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０７により付与される非常に強力な保護が確認された。これらの実験によりまた、ＤＲ７／ＤＲ９遺伝子型が、感受性のある対立遺伝子を全く含まないにも関わらず、ＲＡを発症する非常に高いリスクを付与することが、意外にも実証された。
【０１１４】
ＲＡは、自己抗体介在性の疾患である。ＲＡにおける最も重要な自己抗体は、フィブリン、フィラグリン、およびビメンチンなどのタンパク質上のシトルリン残基に対するものである。本出願人らは最近、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０４がＲＡ患者の血清における抗シトルリン化フィブリノゲンにも関連することを観察した。実際、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０４を発現するＲＡ患者の８３％が、シトルリン化フィブリノゲンに対する抗体を有することが明らかになった（Ｉ．Ａｕｇｅｒら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、２００５、５２：３４２４〜３４３２）。しかし、カルパスタチンなどの非シトルリン化タンパク質もまた、ＲＡ患者から得られる自己抗体により標的化される。ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子についてホモ接合性のＲＡ患者の血清で滑膜タンパク質をスクリーニングすることによって、本出願人らは、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０４についてホモ接合型のＲＡ患者の血清が、カルパイン（軟骨の破壊に関与するプロテアーゼ）の天然阻害剤であるカルパスタチンとして同定される１００ｋＤの滑膜タンパク質を認識することを観察した。実際、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０４を発現するＲＡ患者の５０％が、滑膜カルパスタチンに対する自己抗体を有する（Ｉ．Ａｕｇｅｒら、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、２００７、６６：１５８８〜１５９３）。本出願人らによって得られたデータは、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０４が、ＲＡにおける多くの自己抗体応答との自らの関連を可能にする固有の機能を有するという考えを支持するものである。
【０１１５】
以下に示す研究において、本出願人らは、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１／０４０４、＊０４０１／０４０１、＊０４０４／０４０４、＊０４０４／０７、＊０４０１／０７、＊０７／０７、＊０９／０７という特定のＨＬＡ−ＤＲ遺伝子型を有するＲＡ患者から得られる血清を使用して、８０００を超えるヒトタンパク質を含むタンパク質アレイをスクリーニングし、それにより特異的な自己抗体のパターンを同定した。
【０１１６】
患者および方法
タンパク質マイクロアレイ分析のためのＲＡ患者の血清
フランス、マルセイユのＬａ Ｃｏｎｃｅｐｔｉｏｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌのリウマチ棟の１９人のＲＡ患者を、この研究のために選択した。全てのＲＡ患者は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ １９８７改定基準（Ｆ．Ｃ．Ａｒｎｅｔｔら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．、１９８８、３１：３１５〜３２４）を満たしていた。ＨＬＡ−ＤＲのオリゴ型決定を、それぞれの患者について行った（Ｏ．Ｏｌｌｅｒｕｐら、Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ、１９９２、３９：２２５〜２３５）。患者のうち３人は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１およびＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０４の両方を発現することが明らかになり、４人の患者はＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１についてホモ接合型であり、３人の患者はＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０４についてホモ接合型であり、２人の患者はＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１およびＨＬＡ−ＤＲ７の両方を発現し、２人の患者はＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０４およびＨＬＡ−ＤＲ７の両方を発現し、１人の患者はＨＬＡ−ＤＲ７およびＨＬＡ−ＤＲ１３を発現し、２人の患者はＨＬＡ−ＤＲ７についてホモ接合型であり、２人の患者は予想外のハイリスクな遺伝子型ＨＬＡ−ＤＲ７／ＤＲ９を発現した。
【０１１７】
タンパク質マイクロアレイ分析のための対照の血清
対象群は、マルセイユのＬａ Ｃｏｎｃｅｐｔｉｏｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌのリウマチ棟の、７人の脊椎関節症（ＡＳ）患者および２人の全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者、ならびに、フランス、パリのＨｏｓｐｉｔａｌ Ｃｏｃｈｉｎ、Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｓａｉｎｔ Ａｎｔｏｉｎｅ、およびＨｏｓｐｉｔａｌ Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、フランス、リールのＨｏｓｐｉｔａｌ Ｃｌａｕｄｅ Ｈｕｒｉｅｚ、およびマルセイユのＨｏｓｐｉｔａｌ Ｌａ Ｃｏｎｃｅｐｔｉｏｎとの協力で作られた全国的なコホートの、４人の全身性硬化（ＳＳＣ）患者からなるものであった。１０人の健康な対照は、自己免疫的な病状を排除するための健康評価の後に、研究所スタッフのボランティアおよびボランティアの骨髄ドナーから採用した。全ての参加者からインフォームドコンセントを得た。
【０１１８】
ヒトタンパク質マイクロアレイ
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されている「ＰｒｏｔｏＡｒｒａｙヒトタンパク質マイクロアレイ」を本研究において用いた。このマイクロアレイは８２６８個のヒトタンパク質を含むものである（Ｇ．Ａ．Ｍｉｃｈａｕｄら、「Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ Ｐｒｏｔｏａｒｒａｙ ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｎｏｔｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；Ｍ．Ｅ．Ｈｕｄｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００７、４４：１７４９４〜１７４９９）。
【０１１９】
ＰｒｏｔｏＡｒｒａｙヒトタンパク質マイクロアレイ上のタンパク質の２％がプロテアーゼ／ペプチダーゼであり、２％が分泌タンパク質であり、３％が転写因子であり、３％が細胞死タンパク質であり、５％がプロテインキナーゼであり、１１％が核タンパク質であり、１７％が膜タンパク質であり、そして３１％が代謝タンパク質であった（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより提供されるタンパク質含有量リスト４．０からのデータ）。マイクロアレイ上の全てのタンパク質は（以下に記載される）ＧＳＴ融合タンパク質として発現し、天然の条件下で精製され、ニトロセルロースで被覆したスライドガラス上に２つ組でスポットされた。このヒトタンパク質のコレクションは、ヒトＵｌｔｉｍａｔｅ ＯＲＦクローンコレクションに由来するものである（ｈｔｔｐ：／／ｏｒｆ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍからのデータ）。それぞれのクローンについて、ＧｅｎＢａｎｋで配列の確認を行った。ヒトタンパク質コレクションを作成するために用いられたそれぞれのクローンは、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ベクター内にクローニングされたヒトＯＲＦであった。それぞれの発現クローンを用いて、目的のタンパク質を、バキュロウイルス発現系を用いてＮ末端ＧＳＴ融合タンパク質として発現させた。それぞれの発現したタンパク質の分子量を、ウェスタンブロッティングによって決定した。
【０１２０】
タンパク質アレイ上での血清プロファイリングアッセイ
アレイスライドを１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴでブロックし、次に、（ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水内の）血清試料の存在下で、４℃で１時間にわたりインキュベートした。アレイスライドを次に、希釈した（１：５００）ヒト血清を用いて４℃で１．５時間にわたりプローブした。ＰＢＳＴで洗浄した後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７染料に結合した１μｇ／ｍＬの抗ヒトＩｇＧをスライドに添加した。スライドを次に洗浄し、乾燥させた（Ｐａｒｔｎｅｒｓｈｉｐ、Ｅｖｒｙ、Ｆｒａｎｃｅ）。並行して、別のスライド上で、陰性対照の実験を行った。対照においては、血清の不存在下で緩衝液とインキュベートしたことを除いて、上記と同じ条件下でスライドを処理した。この対照の目的は、データの取得および分析のための基準点を得ることである。
【０１２１】
データの取得／分析
アレイのスライドを、ＧｅｎｅＰｉｘ（登録商標）４０００Ｂ蛍光スキャナを用いてスキャンした。データは、ＧｅｎｅＰｉｘ（登録商標）Ｐｒｏソフトウェアを用いて取得し、ＰｒｏｔｏＡｒｒａｙ（商標）Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ ２．０を用いて処理した。
【０１２２】
データの分析
マイクロアレイのタンパク質の間の自己抗原を同定するために、それぞれのアレイタンパク質について、Ｚスコア、ＣＩ Ｐ値（チェビシェフの不等式の精度値）、およびＣＶを含む、一連の値を計算した。Ｚスコアは、全てのタンパク質特性と比較した、アレイ上のタンパク質スポットから得られるシグナルに基づいて計算した。Ｚスコアは、シグナル使用値から、アレイ上の全てのヒトタンパク質特性から得られるシグナル使用値の平均を引き、全てのヒトタンパク質特性についてのシグナル使用値に対する標準偏差で割ったものである。ＣＩ Ｐ値は、全ての陰性対照のスポットに対する強度を評価し、観察されたシグナルが陰性対照の分布に由来する可能性を計算する。ＣＩ Ｐ値が低いほど、シグナルがランダムな事象によるものではない可能性が高い。ＣＶは、２つ組間の類似性を評価する。タンパク質は、Ｚスコア＞３．０、ＣＩ Ｐ値＜０．０５、かつＣＶ＜０．５である場合、免疫反応性自己抗原として同定された。
【０１２３】
ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット分析のためのＲＡ患者および対照
これらの実験のために、マルセイユのＬａ Ｃｏｎｃｅｐｔｉｏｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌのリウマチ病棟の、ＲＡ患者および脊椎関節症（ＡＳ）患者を選択した。全てのＲＡ患者は、ＲＡについての１９８７年のＡｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ基準を満たしていた。研究所スタッフおよびＭａｒｓｅｉｌｌｅ Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒのスタッフからのボランティアが、正常な対照として参加した。それぞれの患者および正常な対照に対して、ＨＬＡ−ＤＲオリゴ型決定を行った。全ての参加者からインフォームドコンセントを得た。
【０１２４】
ＥＬＩＳＡによる自己抗体の検出
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４で希釈した、０．１μｇ／ｍＬの目的のタンパク質（すなわち、マイクロアレイ実験で同定された候補自己抗原マーカー）で、プレートを一晩被覆した。プレートを、５％ミルクを含むＰＢＳでブロックし、次に、ＰＢＳ内で１：１００に希釈した血清の存在下で３時間にわたりインキュベートした。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した後、ペルオキシダーゼに結合した抗ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、Ｆｒａｎｃｅ）をプレートに添加した。光学密度（ＯＤ）を４０５ｎｍで読み取った。目的のタンパク質を含まないプレートのウェルに添加したそれぞれの血清の光学密度を測定することにより、バックグラウンドのＯＤを得た。測定したＯＤ値がバックグラウンドのＯＤの２倍を超えた場合、血清はタンパク質について陽性であると判断された。
【０１２５】
ウェスタンブロッティングによる自己抗体の検出
タンパク質（すなわち、マイクロアレイ実験において同定された候補自己抗原マーカー）を、１０％ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した。ブロットを患者または対照の血清の存在下でインキュベートし、その後、ペルオキシダーゼに結合した抗ヒトＩｇＧを添加した。検出は化学発光により行った（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍｅｙｌａｎ、Ｆｒａｎｃｅ）。
【０１２６】
結果
ＲＡ患者に関する自己抗体パターン
１９人のＲＡ患者、ならびに２３人の対照（脊椎関節症（ＡＳ）から７人、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）から２人、および全身性硬化（ＳＳＣ）から４人、および健康な個体から１０人）を用いて、８２６８個のヒトタンパク質を含むアレイをプローブした。アレイ上のタンパク質に結合した自己抗体の存在を、蛍光標識した抗ヒトＩｇＧ抗体によって検出した。免疫反応性自己抗原は、Ｚスコア＞３．０、ＣＩ Ｐ値＜０．０５、およびＣＶ＜０．５により規定した。
【０１２７】
図１Ａは、この研究において試験されたそれぞれの患者および対照により認識されるタンパク質の数を表す。図１Ｂおよび以下の表において示されるように、各群の参加者により認識されるタンパク質の数は非常に類似していることが明らかになった。
【０１２８】
各群の患者および健康な対照により認識されるタンパク質の平均数
【０１２９】
【表４】
【０１３０】
１９人のＲＡ患者（１から１９と番号付けされている）のうち、１４人がＣＣＰ陽性であり（患者２〜５、７〜９、１１、１２、１４〜１７、および１９）、５人がＣＣＰ陰性であった（患者１、６、１０、１３、および１８）。ＣＣＰ陽性のＲＡ患者の群により認識されるタンパク質の数は、ＣＣＰ陰性のＲＡ患者の群により認識されるタンパク質の数に匹敵するものであった（以下の表を参照されたい）。
【０１３１】
ＣＣＰ陽性およびＣＣＰ陰性のＲＡ患者により認識されるタンパク質の平均数
【０１３２】
【表５】
【０１３３】
試験したＲＡ患者のうち、１０人がＲＡに１０年未満罹患しており（患者６および８〜１６）、９人がＲＡに１０年を超えて罹患していた（患者１〜５、７、および１７〜１９）。ＲＡ患者により認識されるタンパク質の数は、疾患の期間に依存しないことが明らかになった（以下の表を参照されたい）。
【０１３４】
ＲＡを１０年未満または１０年を超えて有している患者により認識されるタンパク質の平均数
【０１３５】
【表６】
【０１３６】
要約すると、ＲＡ患者により認識されるタンパク質の平均数は、様々な対照により認識されるタンパク質の数とは有意には異ならなかった。疾患の期間およびＣＣＰ反応性もまた、ＲＡ患者により認識されるタンパク質の数に影響しないことが明らかになった。
【０１３７】
ＲＡ患者におけるＨＬＡ−ＤＲ遺伝子型と関連する自己抗体パターン
疾患を発症するリスクの高さまたは低さに関連するＨＬＡ−ＤＲ遺伝子型を有するＲＡ患者の血清を試験して、タンパク質アレイ上でのそれらの反応性パターンを比較した。既に上述したように、２つの感受性対立遺伝子を含むＨＬＡ−ＤＲ遺伝子型は、感受性対立遺伝子を１つだけ含む遺伝子型よりも高いリスクを付与し、感受性対立遺伝子を１つだけ含む遺伝子型はそれ自体、感受性対立遺伝子を含まないＤＲ遺伝子型よりも高いリスクを付与する。ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１およびＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０４の両方を発現する３人の患者、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１についてホモ接合型である４人の患者、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０４についてホモ接合型である３人の患者、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１およびＨＬＡ−ＤＲ７の両方を発現する２人の患者、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０４およびＨＬＡ−ＤＲ７の両方を発現する２人の患者、ＨＬＡ−ＤＲ７およびＨＬＡ−ＤＲ１３を発現する１人の患者、ＨＬＡ−ＤＲ７についてホモ接合型である２人の患者、ならびにＨＬＡ−ＤＲ７／ＤＲ９を発現する２人の患者を試験した。
【０１３８】
図２および以下の表に示されるように、２個、１個、または０個のＲＡ関連ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子を発現するＲＡ患者により認識されるタンパク質の数において、差は見られなかった。
【０１３９】
様々なＨＬＡ−ＤＲ遺伝子型を有するＲＡ患者により認識されるタンパク質の平均数
【０１４０】
【表７】
【０１４１】
ＲＡに関連する特異的抗体の同定
図３は、少なくとも１人のＲＡ患者、少なくとも２人のＲＡ患者、少なくとも３人のＲＡ患者などにより認識される様々なタンパク質の総数を示す。図３ではまた、ＡＳ患者の少なくとも２０％、ＳＳＣ患者の少なくとも２０％、および健康な個体の少なくとも２０％によっても認識される、ＲＡ患者により認識されるタンパク質も示される。この図に表される結果により、ＲＡ患者の血清における自己抗体によって標的化される多くのタンパク質が、ＲＡに特異的ではないが、対照群から得られる自己抗体とも反応性を有することが実証される。
【０１４２】
試験される個体の自己抗体により標的化されるタンパク質のうち、３つのタンパク質のみが、ＲＡ患者の血清により特異的に認識され、対照群の血清によっては認識されないことが明らかになった（図４）。これらのタンパク質は、ＰＡＤ４（ペプチジルアルギニンデイミナーゼ４）、ＰＫＣベータ１（プロテインキナーゼＣベータ１）、およびＰＩＰ４Ｋ２Ｃ（ホスファチジルイノシトール４ホスフェート５キナーゼＩＩ型ガンマ）である。対照の０／２３がＰＡＤ４について陽性であるのに対し、本研究で試験されたＲＡ患者のうち９／１９がＰＡＤ４について陽性であることが明らかになった（ｐ＝０）。同様に、対照の０／２３がＰＣＫベータ１について陽性であるのに対し、ＲＡ患者の６／１９がＰＣＫベータ１について陽性であることが明らかになった（ｐ＝０．０１４）。最後に、対照の０／２３がＰＩＰ４Ｋ２Ｃに対して陽性であるのに対し、ＲＡ患者の５／１９がＰＩＰ４Ｋ２Ｃに対して陽性であることが明らかになった（ｐ＝０．０３２）。
【０１４３】
ＢＲＡＦ触媒ドメイン（ｖ ｒａｆマウス肉腫ウイルス癌遺伝子類似体Ｂ１触媒ドメイン）は、ＲＡについての他の同定された候補マーカーのうち、最も興味深いタンパク質の１つである。実際、疾患対照の０／１３および健康な個体の１／１０のみがＢＲＡＦについて陽性であるのに対し、このアッセイにおいて試験されたＲＡ患者の９／１９がＢＲＡＦについて陽性であることが明らかになった（ｐ＝０．００４、２３人の対照に対し１９の患者）。
【０１４４】
自己抗原の有効性の実証
タンパク質アレイの検出の有効性を確認するため、様々なアッセイを用いて同一のタンパク質を試験した。
【０１４５】
患者および対照における陽性血清の頻度を、精製ＰＡＤ４およびＰＩＰ４Ｋ２Ｃを免疫吸着剤として用いて、ＥＬＩＳＡによって決定した。本出願人らが用いた条件下では、ＥＬＩＳＡアッセイを用いてＰＫＣベータ１およびＢＲＡＦ触媒ドメインについての反応性を検出することは不可能であったため、これらの自己抗原マーカー候補の有効性の実証において、代わりにウェスタンブロッティングアッセイを用いた。
【０１４６】
ＰＡＤ４。ＥＬＩＳＡ実験の結果は、ＡＳ患者の０％および健康な対照の３％がＰＡＤ４について陽性であるのに対し、ＲＡ患者の２９％がＰＡＤ４について陽性であることを示した（図５Ａ）。抗ＰＡＤ４抗体の産生に対するＲＡ関連ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子の影響を評価するために、２個（ＳＥ＋／ＳＥ＋）、１個（ＳＥ＋／ＳＥ−）、または０個（ＳＥ−／ＳＥ−）のＲＡ関連ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子を発現する患者群の間で、ＰＡＤ４について陽性の血清の頻度を比較した。図５Ｂに示すように、ＲＡ関連ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子を発現しない患者（ＳＥ−／ＳＥ−）と少なくとも１つのＲＡ関連ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子を発現する患者（ＳＥ＋／ＳＥ＋およびＳＥ＋／ＳＥ−）との間で、ＰＡＤ４について陽性のＲＡ患者のパーセンテージに有意な差はなかった。
【０１４７】
ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１／ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０４を発現する患者の３６％、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１／ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１を発現する患者の２５％、およびＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０４／ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０４を発現する患者の１７％がＰＡＤ４について陽性であるのに対し、ＳＥ＋／ＳＥ＋患者のうち、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１／ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１を発現する患者の８０％がＰＡＤ４について陽性であることが明らかになった。
【０１４８】
したがって、これらのＥＬＩＳＡ実験により、ＰＡＤ４がＲＡにおける特異的自己抗原であることが確認された。
【０１４９】
ＰＩＰ４Ｋ２Ｃ。ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ＡＳ患者の１８％および健康な対照の１０％がＰＩＰ４Ｋ２Ｃについて陽性であるのに対し、試験したＲＡ患者の１８％がＰＩＰ４Ｋ２Ｃについて陽性であることが明らかになった（図６Ａ）。したがって、これらの結果によっては、ＰＩＰ４Ｋ２ＣはＲＡにおける特異的自己抗原として有効性を実証されなかった。
【０１５０】
ＰＩＰ４Ｋ２Ｃについて陽性の患者のパーセンテージを、２個、１個、または０個のＲＡ関連ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子を発現するＲＡ患者についても計算した。驚くべきことに、１個または０個のＲＡ関連ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子を発現するＲＡ患者よりも高いパーセンテージの、２個のＲＡ関連ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子を発現する患者が、ＰＩＰ４Ｋ２Ｃについて陽性であることが明らかになった。実際、ＳＥ＋／ＳＥ−患者の５％およびＳＥ−／ＳＥ−患者の０％がＰＩＰ４ＰＫ２Ｃについて陽性であるのに対し、ＳＥ＋／ＳＥ＋患者の４０％がＰＩＰ４ＰＫ２Ｃについて陽性であることが明らかになった。
【０１５１】
ＰＫＣベータ１。ウェスタンブロッティングにおいて、６人のＲＡ患者のうち２人のみがＰＫＣベータ１について陽性であることが明らかになった。この研究において用いられる条件下で観察された部分的な反応性に基づいては、ＰＫＣベータ１はＲＡにおける特異的自己抗原として有効性を実証され得ない。
【０１５２】
ＢＲＡＦ触媒ドメイン。ウェスタンブロッティングを用いて、この研究において試験された１９人のＲＡ患者の４７％がＢＲＡＦ触媒ドメインについて陽性であることが明らかになったが、一方、１７人のＡＳ患者および１７人の健康な対照のいずれも反応性を示さなかった（図７Ａ）。これらの結果により、ＢＲＡＦ触媒ドメインはＲＡにおける特異的自己抗原として確認される。
【０１５３】
ＲＡ患者において、ＢＲＡＦ触媒ドメインについての陽性とＨＬＡ−ＤＲ遺伝子型との間では関連は検出されなかった（図７Ｂ）。
【０１５４】
考察
既に上述したように、ＲＡを発症するリスクは、個体により発現される２つのＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子により制御される。ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子は、ＲＡの発症に対して感受性であり得るか、防御的であり得るか、または中立であり得る。さらに、個体により発現される２つのＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子は相互作用する。実際、ＲＡ患者においてほぼ例外なく見られるＨＬＡ−ＤＲＢ１−０４０１／０４０４遺伝子型におけるように、２つの感受性対立遺伝子は協働し得、その結果、ＲＡを発症する非常に高いリスクをもたらす。この相乗効果は依然として説明されておらず、ＲＡの発症機序に対する各対立遺伝子のそれぞれの寄与は理解されていない。過去に、本出願人らは、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１と０４０４との間の並はずれた相乗効果に焦点を当てており、これらの２つの対立遺伝子について固有の特性を記載した。ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１は、構成的な熱ショックタンパク質ｈｓｐ７３との相互作用を介して並はずれて良好な抗原のプロセシングを可能にする、ＱＫＲＡＡモチーフを含む（Ｉ．Ａｕｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９９６、３：３０６〜３１０；Ｉ．Ａｕｇｅｒら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、２００２、４６：９２９〜９３３；Ｓ．Ｒｏｔｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００２、１６９：３０１５〜３０２０）。ＨＬＡ−ＤＲＢ１−０４０４は、並はずれて良好な抗体産生に関連すると考えられる。これは抗シトルリン化フィブリン、抗カルパスタチン、抗ＣＣＰ抗体にも当てはまり、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０４の広いペプチド結合特性にも関連し得る（Ｉ．Ａｕｇｅｒら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、２００５、５２：３４２４〜３４３２；Ｉ．Ａｕｇｅｒら、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、２００７、６６：１５８８〜１５９３；Ｃ．Ｃｈａｒｐｉｎら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．、２００８、２６：６２７〜６３１）。
【０１５５】
特異的なＨＬＡ−ＤＲ遺伝子型が特異的な自己抗体の産生パターンに関連していたかを確認するために、本出願人らは、８０００を超えるヒトタンパク質を含むアレイを用いて、様々なＨＬＡ−ＤＲ遺伝子型を発現するＲＡ患者の血清において自己抗体を分析した。本出願人らは、ＲＡ患者により認識されるタンパク質の大部分が対照の血清においても見られることを観察した。いずれの特異的な抗体パターンも、特定のＨＬＡ−ＤＲ遺伝子型と関連しないことが明らかになった。他方で、この研究により、ＲＡの診断において用いることができるＲＡのタンパク質マーカーが同定された。とりわけ、本出願人らは、ＢＲＡＦ触媒ドメインおよびＰＡＤ４という２つの主要なタンパク質を自己抗原マーカーとして同定し、かつ有効性を実証した。
【０１５６】
他の実施形態
本発明の他の実施形態は、本明細書において開示される発明の明細事項および実施の検討から、当業者に明らかとなろう。明細事項および実施例は例示的なものにすぎないと見なされるべきものであり、本発明の真の範囲は以下の特許請求の範囲により示される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における関節リウマチのインビトロ診断のための方法であって、
ＢＲＡＦ触媒ドメインまたはその抗体結合断片を含む自己抗原マーカーを提供するステップと、
対象から得られる生物学的試料を、自己抗原マーカーと、抗原抗体複合体の形成を可能にする時間および条件下で接触させるステップと、
形成された任意の抗原抗体複合体の存在または不存在を検出するステップと
を含み、前記抗原抗体複合体の存在が対象における関節リウマチの指標となる方法。
【請求項２】
対象がＣＣＰ陰性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生物学的試料が、全血、血清、血漿、尿、および滑液からなる群から選択される、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
自己抗原マーカーが固体の担体または支持体上に固定化される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
抗原抗体複合体の存在または不存在の検出が免疫アッセイによるものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＢＲＡＦ触媒ドメインがヒト由来のものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＢＲＡＦ触媒ドメインが、配列番号２のアミノ酸４１６からアミノ酸７６６にわたるアミノ酸配列を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記対象から得られる生物学的試料における抗ＰＡＤ４抗体を検出するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記対象から得られる生物学的試料においてＣ反応性タンパク質、血清アミロイドＡ、インターロイキン６、Ｓ１００タンパク質、オステオポンチン、リウマチ因子、マトリクスメタロプロテアーゼ１、マトリクスメタロプロテアーゼ３、ヒアルロン酸、ｓＣＤ１４、血管新生マーカー、および骨、軟骨、または滑膜の代謝産物からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーの濃度を測定することをさらに含む、請求項１または請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
対象から得られる生物学的試料における抗ＢＲＡＦ自己抗体を検出するためのキットであって、
ＢＲＡＦ触媒ドメインまたはその抗体結合断片を含む自己抗原マーカーと、
自己抗原マーカーと生物学的試料内に存在する自己抗体との間で形成される抗原抗体複合体を検出するための試薬であって、前記自己抗体が、関節リウマチの指標となる抗ＢＲＡＦ自己抗体である試薬と
を含むキット。
【請求項１１】
自己抗原マーカーが固体の担体または支持体上に固定化される、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法を実施するための指示をさらに含む、請求項１０または請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
ＰＡＤ４またはその抗体結合断片を含む第２の自己抗原マーカーと、
第２の自己抗原マーカーと生物学的試料内に存在する自己抗体との間で形成される抗原抗体複合体を検出するための第２の試薬であって、前記自己抗体が、関節リウマチの指標となる抗ＰＡＤ４自己抗体である試薬と
をさらに含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１４】
対象における関節リウマチを診断するためのアレイであって、その表面に付着した、
ＢＲＡＦ触媒ドメインまたはその抗体結合断片を含む自己抗原マーカーと、場合によっては
ＰＡＤ４またはその抗体結合断片を含む第２の自己抗原マーカーと
を含むアレイ。
【請求項１５】
その表面に付着した、生物学的試料におけるＲＡ特異的自己抗体、とりわけ抗核抗体および抗ＣＣＰ抗体の存在を検出するための少なくとも１つのさらなる自己抗原マーカーをさらに含む、請求項１４に記載のアレイ。
【請求項１６】
関節リウマチのマーカーとしての、ＢＲＡＦ触媒ドメインまたはその抗体結合断片を含む自己抗原マーカーの使用。
【請求項１】
対象における関節リウマチのインビトロ診断のための方法であって、
ＢＲＡＦ触媒ドメインまたはその抗体結合断片を含む自己抗原マーカーを提供するステップと、
対象から得られる生物学的試料を、自己抗原マーカーと、抗原抗体複合体の形成を可能にする時間および条件下で接触させるステップと、
形成された任意の抗原抗体複合体の存在または不存在を検出するステップと
を含み、前記抗原抗体複合体の存在が対象における関節リウマチの指標となる方法。
【請求項２】
対象がＣＣＰ陰性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生物学的試料が、全血、血清、血漿、尿、および滑液からなる群から選択される、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
自己抗原マーカーが固体の担体または支持体上に固定化される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
抗原抗体複合体の存在または不存在の検出が免疫アッセイによるものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＢＲＡＦ触媒ドメインがヒト由来のものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＢＲＡＦ触媒ドメインが、配列番号２のアミノ酸４１６からアミノ酸７６６にわたるアミノ酸配列を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記対象から得られる生物学的試料における抗ＰＡＤ４抗体を検出するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記対象から得られる生物学的試料においてＣ反応性タンパク質、血清アミロイドＡ、インターロイキン６、Ｓ１００タンパク質、オステオポンチン、リウマチ因子、マトリクスメタロプロテアーゼ１、マトリクスメタロプロテアーゼ３、ヒアルロン酸、ｓＣＤ１４、血管新生マーカー、および骨、軟骨、または滑膜の代謝産物からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーの濃度を測定することをさらに含む、請求項１または請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
対象から得られる生物学的試料における抗ＢＲＡＦ自己抗体を検出するためのキットであって、
ＢＲＡＦ触媒ドメインまたはその抗体結合断片を含む自己抗原マーカーと、
自己抗原マーカーと生物学的試料内に存在する自己抗体との間で形成される抗原抗体複合体を検出するための試薬であって、前記自己抗体が、関節リウマチの指標となる抗ＢＲＡＦ自己抗体である試薬と
を含むキット。
【請求項１１】
自己抗原マーカーが固体の担体または支持体上に固定化される、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法を実施するための指示をさらに含む、請求項１０または請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
ＰＡＤ４またはその抗体結合断片を含む第２の自己抗原マーカーと、
第２の自己抗原マーカーと生物学的試料内に存在する自己抗体との間で形成される抗原抗体複合体を検出するための第２の試薬であって、前記自己抗体が、関節リウマチの指標となる抗ＰＡＤ４自己抗体である試薬と
をさらに含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１４】
対象における関節リウマチを診断するためのアレイであって、その表面に付着した、
ＢＲＡＦ触媒ドメインまたはその抗体結合断片を含む自己抗原マーカーと、場合によっては
ＰＡＤ４またはその抗体結合断片を含む第２の自己抗原マーカーと
を含むアレイ。
【請求項１５】
その表面に付着した、生物学的試料におけるＲＡ特異的自己抗体、とりわけ抗核抗体および抗ＣＣＰ抗体の存在を検出するための少なくとも１つのさらなる自己抗原マーカーをさらに含む、請求項１４に記載のアレイ。
【請求項１６】
関節リウマチのマーカーとしての、ＢＲＡＦ触媒ドメインまたはその抗体結合断片を含む自己抗原マーカーの使用。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【公表番号】特表２０１１−５２１２１６（Ｐ２０１１−５２１２１６Ａ）
【公表日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０８９００（Ｐ２０１１−５０８９００）
【出願日】平成２１年５月１２日（２００９．５．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５５７３１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１３８４０８
【国際公開日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【出願人】（５９９１７６５０６）アンセルム（アンスチチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル） (23)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月１２日（２００９．５．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５５７３１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１３８４０８
【国際公開日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【出願人】（５９９１７６５０６）アンセルム（アンスチチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル） (23)
【Ｆターム（参考）】
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