骨形成促進剤
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、骨形成促進剤に関する。さらに詳細には、本発明はビスホスホン酸またはその塩を有効成分とする骨形成促進剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ビスホスホン酸は、生体内に存在するピロ燐酸の誘導体で、強力な骨吸収抑制作用を有し〔Ｆｌｅｉｓｃｈ Ｈ．， Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ−ｈｉｓｔｏｒｙ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｂａｓｉｓ， Ｂｏｎｅ １９８７， ８（ｓｕｐｐｌ．１）； Ｓ２３−Ｓ２８〕、パジェット（Ｐａｇｅｔ’ｓ）病（Ｋａｎｉｓ ＪＡ． Ｄｒａｇｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｇｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ ｂｏｎｅ，Ｌｏｎｄｏｎ ，Ｍａｒｔｉｎ Ｄｕｎｉｔｚ Ｌｔｄ．，１９９１，１５９，２１６ ）、がんの骨転移や悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症（Ｆｌｅｉｓｃｈ Ｈ．， Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ：ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｕｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｔｕｍｏｕｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｈｙｐｅｒｃａｌｃａｅｍｉｃ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｏｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ，Ｄｒｕｇｓ １９９１，４２，９１９−９４４） および骨粗鬆症（Ｗａｔｔｓ ＮＢ， Ｈａｒｒｉｓ ＳＴ，Ｇｅｎａｎｔ ＨＫ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｍｉｔｔｅｎｔ ｃｙｃｌｉｃａｌ ｅｔｉｄｒｏｎａｔｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９９０，３２３，７３−７９等）における骨溶解の制御または骨量減少の抑制に効果的に使われてきた。
【０００３】
そのようなビスホスホン酸の一つである４−アミノ−１−ヒドロキシブチリデン−１，１−ビスホスホン酸（アレンドロネート）もまた強力な骨吸収抑制剤であることが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（Ｓａｔｏ Ｍ，Ｇｒａｓｓｅｒ Ｗ．，Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ ｏｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｒａｔ ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｓ ａｓ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｂｙ ｒｅｆｌｅｃｔｅｄ ｌｉｇｈｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ． Ｒｅｓ．，１９９０，５，３１−４０）、実験動物（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＤＤ，Ｓｅｅｄｅｒ ＪＧ，Ｑｕａｒｔｕｃｃｉｏ Ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ，ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ，ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｂｏｎｅ ｌｏｓｓ ｉｎ ｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｉｚｅｄ ｂａｂｏｏｎｓ，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１９９２，７，９５１−９６０等）、パジェット病（Ｏ’Ｄｏｈｅｒｔｙ ＤＰ，Ｇｅｒｔｚ ＢＪ，Ｔｉｎｄａｌｅ Ｗ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｆｉｖｅ ｄａｉｌｙ １ｈ ｉｎｆｕｓｉｏｎｓ ｏｆ ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ ｉｎ Ｐａｇｅｔ’ｓ ｄｅｓｅａｓｅ ｏｆ ｂｏｎｅ ，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ． Ｒｅｓ． １９９２，７，８１−８７等、特公平２−１３６４５号公報、特開平４−２１１０１５号公報）、および骨粗鬆症患者（Ｈａｒｒｉｓ ＳＴ，Ｇｅｒｔｚ ＢＪ，Ｇｅｎａｎｔ ＨＫ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｈｏｒｔ ｔｅｒｍ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ ｏｎ ｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｂｏｎｅ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｉｎ ｅａｒｌｙ ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ ｗｏｍｅｎ， Ｊ．Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ．，１９９３，７６，１３９９−１４０６）において確認されている。
【０００４】
ビスホスホン酸は、骨吸収に対して重要な作用を有しているため、これまでその研究の多くはこの骨吸収抑制作用に焦点をあてたものであった（Ｓａｔｏ Ｍ．，Ｇｒａｓｓｅｒ Ｗ．，Ｅｎｄｏ Ｎ．，ｅｔ ａｌ， Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ ａｃｔｉｏｎ： Ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎｒａｔ ｂｏｎｅ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ １９９１， ８８ ：２０９５−２１０５ ）
【０００５】
これに対して、ビスホスホン酸の骨形成に対する直接作用に関する報告として、骨芽細胞において骨形成抑制作用が認められたこと（Ｌｅｍｋｅｓ ＨＨＰＪ，Ｒｅｉｔｓｍａ ＰＨ，Ｆｒｉｊｌｉｎｋ Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｎｅｗ ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ， Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｅｅｎ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｍｉｎｅｒａｌ ｉｎ ｒａｔｓ ａｎｄ ａ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｔｒｉａｌ ｉｎ Ｐａｇｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ．，１９７８，１０３，４５９−４６９）、骨芽細胞においてその機能の上昇作用が認められたこと（Ｆｅｌｉｘ Ｒ，Ｆｌｅｉｓｃｈ Ｈ． Ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｃａｌｖａｒｉａ ｃｅｌｌｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．，１９７９，１８３，７３−８１等）があるが、その骨形成促進作用については何の記載もなされていない。
【０００６】
一方、Ｔｅｎｅｎｂａｕｍ ＨＣ，Ｔｏｒｏｎｔａｌｉ Ｍ．，Ｓｕｋｈｕ Ｂ．，Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ ａｎｄ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｏｎ ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ，Ｂｏｎｅ，１９９２，１３，２４９−２５５ およびＨａｎｋｅｌ ＬＳ，ＭｃＢｒｉｄｅ ＤＪ，Ｓｈａｐｉｒｏ ＪＲ．，Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ ｅｎｈａｎｃｅ ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｃｈｉｃｋ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｙｓｔｅｍ（ａｂｓｔｒａｃｔ），Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１９９２，７（ｓｕｐｐｌ．１）ｓ７２２ では、いずれもニワトリの骨芽細胞において、ビスホスホン酸の骨形成に対する作用の検討を試みている。
【０００７】
しかしながら、Ｔｅｎｅｎｂａｕｍ らでは、高濃度（３×１０−８Ｍ以上）のパミドロネート、エチドロネートで石灰化の促進作用と抑制作用という相反する結果が得られているにすぎない。また、Ｈａｎｋｅｌらでは、高濃度のエチドロネート等で石灰化促進作用が認められたものの、コラーゲンには変化が認められておらず、これらの結果から、ビスホスホン酸に臨床的に骨形成促進作用が認められるというには、必ずしも十分とはいえない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明の目的は、新規な骨形成促進剤を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ヒト骨芽細胞様細胞を用いて、ビスホスホン酸、特にアレンドロネートについて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ石灰化および骨基質タンパク合成に対する影響を検討し、その結果、到達したものである。
【００１０】
すなわち、本発明は、下記式（Ｉ）
【００１１】
【化２】
〔式中、ＲはＨ２ Ｎ−（ＣＨ２ ）ｎ −（ｎは２〜５の整数を表す）またはＣＨ３ −を表し、Ｒ１ は−ＯＨを表す。〕で示されるビスホスホン酸またはその塩を有効成分とする骨形成促進剤である。
【００１２】
本発明の骨形成促進剤とは、例えば骨芽細胞の石灰化促進作用および／または骨基質産生促進作用に基づくものをいい、前者としては、例えば、類骨層へのカルシウムおよびリンの沈着を促進することにより、後者としては、例えば、骨基質タンパクであるオステオカルシンおよび／またはコラーゲンなどの合成を促進することによる。なかでも、骨芽細胞の石灰化促進作用および骨基質産生促進作用に基づく骨形成促進剤を好ましいものとして挙げることができる。
【００１３】
さらに、例えば１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３ のような骨芽細胞の石灰化を促進する因子（以下、骨形成促進因子と略する）の作用を促進および／またはこれと協調的に作用するという意味で、本発明の骨形成促進剤の骨形成促進が１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３ 依存性のものであるものも本発明の範囲に含まれる。すなわち、本発明の骨形成促進剤として好ましいものとして、この１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３ 依存性と上記骨芽細胞の石灰化促進作用および／または骨基質産生促進作用と組み合わされた作用に基づくものも挙げることができる。
【００１４】
前記式（Ｉ）で示されるビスホスホン酸としては、例えば、６−アミノ−１−ヒドロキシヘキシリデン−１，１−ビスホスホン酸、５−アミノ−１−ヒドロキシペンチリデン−１，１−ビスホスホン酸、４−アミノ−１−ヒドロキシブチリデン−１，１−ビスホスホン酸（アレンドロネート：ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ ）、３−アミノ−１−ヒドロキシプロピリデン−１，１−ビスホスホン酸（パミドロネート：ｐａｍｉｄｒｏｎａｔｅ）、エチドロネート（ｅｔｉｄｒｏｎａｔｅ） が挙げられるが、これらのなかでも、アレンドロネート、パミドロネート、エチドロネートが好ましく、特に、アレンドロネートを好ましいものとして挙げることができる。
【００１５】
本発明のビスホスホン酸の塩としては、薬学的に許容される塩、例えばナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、カルシウム等のアルカリ土類金属塩、塩酸塩等の無機酸塩、クエン酸、アミノ酸塩等の有機酸塩等が挙げられ、なかでも水溶性に優れている点からアレンドロネートのモノナトリウム塩・トリハイドレートを好ましいものとして挙げることができる。
【００１６】
本発明の前記式（Ｉ）で示されるビスホスホン酸はいずれも公知化合物であって、例えば、特公平２−１３６４５号公報、特開昭６１−１０９７９４号公報、特開平３−１０１６８４号公報、特開平５−１３２４９２号公報、特開平４−２１１０１５号公報等に記載された方法によって、アレンドロネートまたはそのモノナトリウム塩・トリハイドレート、カリウム塩、カルシウム塩等の塩を得ることができ、また、例えば西独特許第２１３０７９４号明細書、米国特許第４３２７０３９号明細書等に記載された方法によって、パミドロネートまたはその塩を、米国特許３４６８９３５号、第３４００１４７号、または第３４７５４８６号明細書等に記載された方法によって、エチドロネートまたはその塩を得ることができる。
【００１７】
本発明のビスホスホン酸またはその塩は、経口的、または注射剤等の非経口的投与用の適切な薬理学的単体のいずれかと共に投与することができる。投与量は、被投与者の年令、健康状態、体重、もし行っているとすれば併用療法の種類、治療の頻度および望まれる効果の種類に依存する。
【００１８】
一般に、活性成分化合物の全身的日量は、骨芽細胞レベルにおいて、１０−１３ 〜１０−７Ｍであり、約０．００１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、好ましくは体重ｋｇ当たり、０．０１μｇ〜０．１ｍｇである。通常経口投与の場合、５０ｎｇ／日〜５０ｍｇ／日、非経口投与の場合、０．５ｎｇ／日〜０．５ｍｇ／日である。また、必要に応じて、例えば１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３ 〔１α，２５（ＯＨ）２ Ｄ３ 〕、１α−ヒドロキシビタミンＤ３ 等の活性型ビタミンＤ３ 類、エストロゲン等のホルモン剤と併用することもできる。
【００１９】
本発明の骨形成促進剤は、経口投与の場合、錠剤、カプセル、粉末小包、液体溶液、懸濁液またはエリキシルのような投与形で、非経口的使用の場合、溶液または懸濁液のような処方用無菌液として使用することができる。
【００２０】
かかる場合の賦形剤としては、例えば、糖、例えば、サッカロース、グルコース、ラクトース、スターチ、セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースなど、ゴム類、脂肪酸およびその塩、ポリオール、例えばプロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレングリコールなど、タルク、芳香族エステル、水、生理食塩水、アルコール類、例えばエチルアルコール、脂肪族アルコール、トリグリセリド、脂肪酸エステル等と組み合わせて好適に製剤化される。
【００２１】
本発明の骨形成促進剤は単独で、あるいは本発明の目的に反しない限りにおいて、他の薬物を混合して、あるいは各別に製剤化、投与することができる。そのような他の薬物として、前記した骨形成促進因子、例えば、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３ やビタミンＫ、ＩＬ−４、ＩＧＦ−ＩまたはＴＧＦ−β等のサイトカインを挙げることができ、かかる場合のこれら因子の投与量としては、通常これらの因子を薬物として投与する場合の処方量の範囲を挙げることができる。
【００２２】
かくして本発明の骨形成促進剤が得られるが、本発明の骨形成促進剤は、前記のように石灰化促進作用、骨基質産生促進作用を有するので、例えば骨軟化症、骨形成不全症、骨粗鬆症、二次性副甲状腺機能亢進に基づく骨異栄養症、腎性骨異栄養症、歯周病の予防、治療および骨折の治療促進、歯科矯正に有用である。
【００２３】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
【００２４】
なお、用いた骨芽細胞様細胞、測定法などは次のとおりである。
（１）細胞培養
ヒト骨膜由来骨芽細胞様細胞として、１０歳男児の大腿骨由来の細胞（東京都老人総合研究所、腰原康子博士より）を用いた。すなわち、α−グリセロ燐酸−２Ｎａ（α−ＧＰ）〔東京化成工業（株）製〕および１α，２５（ＯＨ）２ Ｄ３ との培養により、高いアルカリフォスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ：ＡＬＰ）活性を示し、オステオカルシン（ＢＧＰ）産生および石灰化がおこるものである。
【００２５】
細胞の調製、培養法については、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８７，１４５，６５１−６５７ ，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．，１９８９，２５，３７−４３ ，Ｃｏｎｎｅｃｔ． Ｔｉｓｓ． ，１９９３，２４．２１７−２３１ （いずれも、Ｋｏｓｈｉｈａｒａ Ｙ，ｅｔ ａｌ．， の著） に従って行った。具体的には、細胞集団倍化数（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｌｅｖｅｌ，ＰＤＬ）１９（以下、１９ＰＤＬ）の細胞を６または１２−ｗｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ） を用いて１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（アービンサイエンテイフィック製）を含む Ｅａｇｌｅ’ｓ α−ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ （α−ＭＥＭ）（ライフテクノロジーズ社製）中で培養（３７℃、５％ＣＯ２ ／９５％ａｉｒ ）した。コンフルエント到達（２０ＰＤＬ）２〜３日後、２ｍＭのα−ＧＰ存在下に１α，２５（ＯＨ）２ Ｄ３ を添加または非添加でさらに所定期間培養した。１α，２５（ＯＨ）２ Ｄ３ はエタノール溶液として−２０℃で保存し、エタノールの最終濃度が０．１％（ｖ／ｖ）となるように培養系に添加した。ビスホスホン酸はそれぞれｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ （ＰＢＳ）溶液として４℃で保存し、ＰＢＳの最終濃度が０．１％（ｖ／ｖ）となるように培養系に添加した。培養液は週３回交換した。
【００２６】
（２）ＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）
ヒト骨芽細胞様細胞よりｔｏｔａｌ ＲＮＡをＡＧＰＣ法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８７，１６２，１５６−１５９）により調製した。ｔｏｔａｌ ＲＮＡ１μｇから、ｃＤＮＡを合成した（３７℃、６０分）。Ｐｒｏ α１（Ｉ）ｃｏｌｌａｇｅｎ遺伝子およびＢＧＰ遺伝子に対する特異的プライマーとして、それぞれＨＣＯＬＡ−１Ａ（５’−ＣＣＡ ＣＣＧ ＡＣＣ ＡＡＧ ＡＡＡ ＣＣＡ−３’） およびＨＣＯＬＡ−１Ｂ（５’−ＧＣＴ ＣＡＣ ＣＡＧ ＧＡＣ ＧＡＣ ＣＡＧ−３’） とＨＢＧＰ−１Ａ（５’−ＣＣＴ ＣＡＣ ＡＣＴ ＣＣＴＣＧＣ ＣＣＴ ＡＴＴ−３’）およびＨＢＧＰ−１Ｂ（５’−ＡＴＡ ＧＧＣ ＣＴＣ ＣＴＧ ＡＡＡ ＧＣＣ ＧＡＴ−３’）を用いて、ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ ｏｖｅｎ （ＭｉｎｉＣｙｃｌｅｒ ＰＴＣ−１５０；ＭＪリサーチ製） 中でＰＣＲ増幅を行った。最初に２分間の変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ） を行った後、９４℃、１分間の変性、５５℃（ＢＧＰ）または６０℃〔ｐｒｏ α１（Ｉ）ｃｏｌｌａｇｅｎ〕、２分間のａｎｎｅａｌｉｎｇ 、７２℃、３分間のｅｘｔｅｎｓｉｏｎ を３０サイクル行った。アガロースゲル上で電気泳動後、ＰＣＲ産物をｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅで染色して写真に撮影した（Ｐｏｌａｒｏｉｄ ＡＣＭＥＬ Ｍ−０８５ Ａｕｔｏ）。
【００２７】
（３）カルシウム（Ｃａ） 、リン（Ｐｉ）、ＡＬＰ活性、ＢＧＰ、ｃｏｌｌａｇｅｎ、ＤＮＡの定量
ＡＬＰ活性はＭａｉｏ ａｎｄ ｄｅ Ｃａｒｌｉ（Ｎａｔｕｒｅ １９６２， １９６， ６００−６０１）の方法により、ｐ−ニトロフェニルフォスフェート〔シグマ化学（株）製〕を基質として測定した。すなわち、培養終了後に細胞を生理食塩液で３回洗い、１０ｍＭｐ−ニトロフェニルフォスフェート−１ｍＭＭｇＣｌ２ −０．１Ｍカーボネートバッファー（ｐＨ１０．０）を加えて１５〜２０分間反応させた。反応液を移し、４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００２８】
ＡＬＰ活性測定反応後の細胞を再度生理食塩液で洗った後、５％過塩素酸（ＰＣＡ）を加えてＣａおよびＰｉを抽出（氷水中で１５分間）する操作を２回繰り返して行った。ＣａおよびＰｉの含量はそれぞれｏ−ｃｒｅｓｏｌｐｈｔｈａｌｅｉｎ ｃｏｍｐｅｘｏｎｅ（ＯＣＰＣ）法（Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９６７， １８， ５２１−５３１） およびＣｈｅｎらの方法（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．， １９５６，２８，１７５６−１７５８）で定量した。
【００２９】
ＢＣＰは細胞を２０％ギ酸中で超音波破砕して抽出し、凍結乾燥したのち測定まで−８０℃に保存した。測定は、Ｇｌａ−Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ 測定キット〔宝酒造（株）製〕を用いた酵素免疫測定法によった。
【００３０】
細胞層のｃｏｌｌａｇｅｎ量は６Ｎ塩酸で加水分解（オートクレーブ中、１３０℃、３０分間）したのち、Ｋｉｖｉｒｉｋｋｏ らの方法（Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９６７，１９，２４９−２５５） に従ってハイドロキシプロリンを測定して定量した。
【００３１】
ＤＮＡ含量は、ＰＣＡ抽出したのち、Ｂｕｒｔｏｎ法（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．，１９５６，６２，３１５−３２３）により測定した。
【００３２】
（実施例１）ビスホスホン酸のヒト骨芽細胞様細胞の石灰化に及ぼす影響
コンフルエントに到達した２０ＰＤＬのヒト骨芽細胞様細胞に、図１に示した濃度（１０−１２ Ｍ〜１０−５Ｍ）のアレンドロネートまたはエチドロネートを添加し、１α，２５（ＯＨ）２ Ｄ３ （１００ｎｇ／ｍｌ）および２ｍＭα−ＧＰ存在下に７日間培養した。
【００３３】
対照例としては、１α，２５（ＯＨ）２ Ｄ３ 単独のものを用い、前記カルシウム定量法に従って７日間培養後のヒト骨芽細胞様細胞層のＣａ含量を定量した。結果を図１に示した。図１において、各カラムは平均値±標準誤差（例数３）を示す。対照との統計学的有意差は、＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１である。
【００３４】
図１から、アレンドロネートが１０−１２ 〜１０−７Ｍの濃度では、１００ｎｇ／ｍｌの１α，２５（ＯＨ）２ Ｄ３ 存在下で７日間培養したヒト骨芽細胞様細胞のＣａ沈着（石灰化）を促進し、１０−６Ｍ以上の濃度ではこれを逆に抑制することが判る。石灰化促進作用は、１０−９Ｍ付近で最大となったが、１α，２５（ＯＨ）２ Ｄ３ の非存在下ではこのような促進効果は認められなかった（データ示さず）。
【００３５】
エチドロネートも同様に、低濃度（１０−１０ 〜１０−８Ｍ）ではヒト骨芽細胞様細胞の石灰化を促進し、１０−６Ｍ以上ではこれを抑制した。石灰化促進作用におけるエチドロネートの最小有効濃度はアレンドロネートのそれに比べて少なくとも１００倍高かったが、高濃度側における石灰化抑制作用の発現濃度は両ビスホスホン酸でほとんど差がなかった。なお、データには示さないが、アレンドロネートおよびエチドロネートによるＰｉ含量の変化も石灰化促進作用と同様であった。
【００３６】
（実施例２）アレンドロネートのヒト骨芽細胞様細胞の石灰化に及ぼす影響
コンフルエントに到達した２０ＰＤＬのヒト骨芽細胞様細胞に、図２に示した濃度（１０−１４ Ｍ〜１０−９Ｍ）のアレンドロネートを添加し、１α，２５（ＯＨ）２ Ｄ３ （１００ｎｇ／ｍｌ）および２ｍＭα−ＧＰ存在下に１４日間培養した。対照例としては１α，２５（ＯＨ）２ Ｄ３ 単独のものを用い、実施例１と同様にして１４日間培養後のヒト骨芽細胞様細胞層のＣａ含量を定量し、結果を図２に示す。図２において、各カラムは平均値±標準誤差（例数６）を示す。対照との統計学的有意差は、＊：Ｐ＜０．０５、＊＊＊：Ｐ＜０．００１である。
【００３７】
図２から、１α，２５（ＯＨ）２ Ｄ３ （１００ｎｇ／ｍｌ）を加えて細胞を１４日間培養する条件下では、アレンドロネートによる石灰化促進作用は１０−１４ Ｍではほとんど認められないが、１０−１３ Ｍから明らかに発現することが判る。
【００３８】
（実施例３）アレンドロネートのヒト骨芽細胞様細胞のＢＧＰ産生およびｃｏｌｌａｇｅｎ産生に及ぼす影響
コンフルエントに到達した２０ＰＤＬのヒト骨芽細胞様細胞に、アレンドロネートを添加し、２ｍＭα−ＧＰ存在、かつ１α，２５（ＯＨ）２ Ｄ３ （１０ｎｇ／ｍｌ）存在または非存在下に１０日間培養した。対照例としてはアレンドロネート非添加のものを用い、前記の方法に従って細胞層のＢＧＰおよびｃｏｌｌａｇｅｎ量を定量し、結果を図３および図４に示す。図３および４において、各カラムは平均値±標準誤差（例数４）を示す。対照との統計学的有意差は、＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１である。アレンドロネートは、石灰化促進作用における最小有効濃度（１０−１３ Ｍ）および最大効果発現濃度以下の濃度（１０−１１ Ｍ）を用いた。
【００３９】
図３から、アレンドロネートが１α，２５（ＯＨ）２ Ｄ３ 存在下で顕著にＢＧＰ産生を促進することが判る。また、図４から、アレンドロネートがｃｏｌｌａｇｅｎ産生を１α，２５（ＯＨ）２ Ｄ３ 存在下で有意に促進することが判る。
【００４０】
（実施例４）アレンドロネートのヒト骨芽細胞様細胞のＢＧＰおよびｐｒｏ α１（Ｉ）ｃｏｌｌａｇｅｎの遺伝子発現に及ぼす影響
コンフルエントに到達した２０ＰＤＬのヒト骨芽細胞様細胞に、実施例３で用いたのと同じ濃度のアレンドロネートを添加し、２ｍＭα−ＧＰおよび１α，２５（ＯＨ）２ Ｄ３ （１０ｎｇ／ｍｌ）存在下に３、７または１４日間培養した。対照例としては１α，２５（ＯＨ）２ Ｄ３ 単独のものを用い、前記方法に従って細胞のｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、ＢＧＰおよびｐｒｏ α１（Ｉ）ｃｏｌｌａｇｅｎの遺伝子発現を検討した。結果を図５（ａ）（ＢＧＰ遺伝子発現）および（ｂ）〔ｐｒｏ α１（Ｉ）ｃｏｌｌａｇｅｎ遺伝子発現）に示す。
【００４１】
図５（ａ）からは、いずれの時点においてもアレンドロネートが１α，２５（ＯＨ）２ Ｄ３ によって強力に誘導されたＢＧＰ遺伝子発現をさらに促進するとは確認できなかったが、１α，２５（ＯＨ）２ Ｄ３ 単独で既に強力にＢＧＰ遺伝子の発現が誘導されていることから、この測定系では、アレンドロネートによるそれ以上の発現を十分に検出できなかったものと考えられる。一方、図５（ｂ）からは、アレンドロネートが１α，２５（ＯＨ）２ Ｄ３ によって誘導されたｐｒｏ α１（Ｉ）ｃｏｌｌａｇｅｎの遺伝子発現をすべての時点で濃度依存的にさらに促進することが判る。
【００４２】
以上のとおり、これまでビスホスホン酸の作用としてよく知られている骨吸収抑制作用の発現濃度よりもさらに低濃度で、また、アレンドロネートおよびエチドロネートは、１α，２５（ＯＨ）２ Ｄ３ 存在下でヒト骨芽細胞様細胞の石灰化を促進した。アレンドロネートによる石灰化促進に骨基質タンパクであるＢＧＰおよびｃｏｌｌａｇｅｎの産生とｐｒｏ α１（Ｉ）ｃｏｌｌａｇｅｎのｍＲＮＡ発現の促進を伴っていたことから、ビスホスホン酸の物理化学的性質によるものではないと考えられた。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１におけるビスホスホン酸のヒト骨芽細胞様細胞の石灰化に及ぼす影響を示すグラフである。
【図２】実施例２におけるアレンドロネートのヒト骨芽細胞様細胞の石灰化促進作用を示すグラフである。
【図３】実施例３におけるアレンドロネートのヒト骨芽細胞様細胞のＢＧＰ産生に及ぼす影響を示すグラフである。
【図４】実施例３におけるアレンドロネートのヒト骨芽細胞様細胞のｃｏｌｌａｇｅｎ産生に及ぼす影響を示すグラフである。
【図５】実施例４におけるアレンドロネートのＢＧＰ（ａ）およびｐｒｏ α１（Ｉ）ｃｏｌｌａｇｅｎ（ｂ） 遺伝子発現に及ぼす影響を示す、電気泳動後の染色写真のバンドの位置を示す図である。
各レーンは以下のとおり：（０）ＢＲＬ１００塩基対ラダー、（１）、（２）、（３）無処置−３、７、１４日、（４）、（５）、（６）１α，２５（ＯＨ）２ Ｄ３ 単独−３、７、１４日、（７）、（８）、（９）１α，２５（ＯＨ）２ Ｄ３ 加アレンドロネート１０−１３ Ｍ−３、７、１４日、（１０）、（１１）、（１２）１α，２５（ＯＨ）２ Ｄ３ 加アレンドロネート１０−１１ Ｍ−３、７、１４日
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、骨形成促進剤に関する。さらに詳細には、本発明はビスホスホン酸またはその塩を有効成分とする骨形成促進剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ビスホスホン酸は、生体内に存在するピロ燐酸の誘導体で、強力な骨吸収抑制作用を有し〔Ｆｌｅｉｓｃｈ Ｈ．， Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ−ｈｉｓｔｏｒｙ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｂａｓｉｓ， Ｂｏｎｅ １９８７， ８（ｓｕｐｐｌ．１）； Ｓ２３−Ｓ２８〕、パジェット（Ｐａｇｅｔ’ｓ）病（Ｋａｎｉｓ ＪＡ． Ｄｒａｇｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｇｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ ｂｏｎｅ，Ｌｏｎｄｏｎ ，Ｍａｒｔｉｎ Ｄｕｎｉｔｚ Ｌｔｄ．，１９９１，１５９，２１６ ）、がんの骨転移や悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症（Ｆｌｅｉｓｃｈ Ｈ．， Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ：ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｕｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｔｕｍｏｕｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｈｙｐｅｒｃａｌｃａｅｍｉｃ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｏｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ，Ｄｒｕｇｓ １９９１，４２，９１９−９４４） および骨粗鬆症（Ｗａｔｔｓ ＮＢ， Ｈａｒｒｉｓ ＳＴ，Ｇｅｎａｎｔ ＨＫ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｍｉｔｔｅｎｔ ｃｙｃｌｉｃａｌ ｅｔｉｄｒｏｎａｔｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９９０，３２３，７３−７９等）における骨溶解の制御または骨量減少の抑制に効果的に使われてきた。
【０００３】
そのようなビスホスホン酸の一つである４−アミノ−１−ヒドロキシブチリデン−１，１−ビスホスホン酸（アレンドロネート）もまた強力な骨吸収抑制剤であることが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（Ｓａｔｏ Ｍ，Ｇｒａｓｓｅｒ Ｗ．，Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ ｏｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｒａｔ ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｓ ａｓ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｂｙ ｒｅｆｌｅｃｔｅｄ ｌｉｇｈｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ． Ｒｅｓ．，１９９０，５，３１−４０）、実験動物（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＤＤ，Ｓｅｅｄｅｒ ＪＧ，Ｑｕａｒｔｕｃｃｉｏ Ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ，ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ，ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｂｏｎｅ ｌｏｓｓ ｉｎ ｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｉｚｅｄ ｂａｂｏｏｎｓ，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１９９２，７，９５１−９６０等）、パジェット病（Ｏ’Ｄｏｈｅｒｔｙ ＤＰ，Ｇｅｒｔｚ ＢＪ，Ｔｉｎｄａｌｅ Ｗ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｆｉｖｅ ｄａｉｌｙ １ｈ ｉｎｆｕｓｉｏｎｓ ｏｆ ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ ｉｎ Ｐａｇｅｔ’ｓ ｄｅｓｅａｓｅ ｏｆ ｂｏｎｅ ，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ． Ｒｅｓ． １９９２，７，８１−８７等、特公平２−１３６４５号公報、特開平４−２１１０１５号公報）、および骨粗鬆症患者（Ｈａｒｒｉｓ ＳＴ，Ｇｅｒｔｚ ＢＪ，Ｇｅｎａｎｔ ＨＫ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｈｏｒｔ ｔｅｒｍ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ ｏｎ ｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｂｏｎｅ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｉｎ ｅａｒｌｙ ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ ｗｏｍｅｎ， Ｊ．Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ．，１９９３，７６，１３９９−１４０６）において確認されている。
【０００４】
ビスホスホン酸は、骨吸収に対して重要な作用を有しているため、これまでその研究の多くはこの骨吸収抑制作用に焦点をあてたものであった（Ｓａｔｏ Ｍ．，Ｇｒａｓｓｅｒ Ｗ．，Ｅｎｄｏ Ｎ．，ｅｔ ａｌ， Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ ａｃｔｉｏｎ： Ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎｒａｔ ｂｏｎｅ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ １９９１， ８８ ：２０９５−２１０５ ）
【０００５】
これに対して、ビスホスホン酸の骨形成に対する直接作用に関する報告として、骨芽細胞において骨形成抑制作用が認められたこと（Ｌｅｍｋｅｓ ＨＨＰＪ，Ｒｅｉｔｓｍａ ＰＨ，Ｆｒｉｊｌｉｎｋ Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｎｅｗ ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ， Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｅｅｎ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｍｉｎｅｒａｌ ｉｎ ｒａｔｓ ａｎｄ ａ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｔｒｉａｌ ｉｎ Ｐａｇｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ．，１９７８，１０３，４５９−４６９）、骨芽細胞においてその機能の上昇作用が認められたこと（Ｆｅｌｉｘ Ｒ，Ｆｌｅｉｓｃｈ Ｈ． Ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｃａｌｖａｒｉａ ｃｅｌｌｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．，１９７９，１８３，７３−８１等）があるが、その骨形成促進作用については何の記載もなされていない。
【０００６】
一方、Ｔｅｎｅｎｂａｕｍ ＨＣ，Ｔｏｒｏｎｔａｌｉ Ｍ．，Ｓｕｋｈｕ Ｂ．，Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ ａｎｄ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｏｎ ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ，Ｂｏｎｅ，１９９２，１３，２４９−２５５ およびＨａｎｋｅｌ ＬＳ，ＭｃＢｒｉｄｅ ＤＪ，Ｓｈａｐｉｒｏ ＪＲ．，Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ ｅｎｈａｎｃｅ ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｃｈｉｃｋ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｙｓｔｅｍ（ａｂｓｔｒａｃｔ），Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１９９２，７（ｓｕｐｐｌ．１）ｓ７２２ では、いずれもニワトリの骨芽細胞において、ビスホスホン酸の骨形成に対する作用の検討を試みている。
【０００７】
しかしながら、Ｔｅｎｅｎｂａｕｍ らでは、高濃度（３×１０−８Ｍ以上）のパミドロネート、エチドロネートで石灰化の促進作用と抑制作用という相反する結果が得られているにすぎない。また、Ｈａｎｋｅｌらでは、高濃度のエチドロネート等で石灰化促進作用が認められたものの、コラーゲンには変化が認められておらず、これらの結果から、ビスホスホン酸に臨床的に骨形成促進作用が認められるというには、必ずしも十分とはいえない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明の目的は、新規な骨形成促進剤を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ヒト骨芽細胞様細胞を用いて、ビスホスホン酸、特にアレンドロネートについて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ石灰化および骨基質タンパク合成に対する影響を検討し、その結果、到達したものである。
【００１０】
すなわち、本発明は、下記式（Ｉ）
【００１１】
【化２】
〔式中、ＲはＨ２ Ｎ−（ＣＨ２ ）ｎ −（ｎは２〜５の整数を表す）またはＣＨ３ −を表し、Ｒ１ は−ＯＨを表す。〕で示されるビスホスホン酸またはその塩を有効成分とする骨形成促進剤である。
【００１２】
本発明の骨形成促進剤とは、例えば骨芽細胞の石灰化促進作用および／または骨基質産生促進作用に基づくものをいい、前者としては、例えば、類骨層へのカルシウムおよびリンの沈着を促進することにより、後者としては、例えば、骨基質タンパクであるオステオカルシンおよび／またはコラーゲンなどの合成を促進することによる。なかでも、骨芽細胞の石灰化促進作用および骨基質産生促進作用に基づく骨形成促進剤を好ましいものとして挙げることができる。
【００１３】
さらに、例えば１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３ のような骨芽細胞の石灰化を促進する因子（以下、骨形成促進因子と略する）の作用を促進および／またはこれと協調的に作用するという意味で、本発明の骨形成促進剤の骨形成促進が１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３ 依存性のものであるものも本発明の範囲に含まれる。すなわち、本発明の骨形成促進剤として好ましいものとして、この１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３ 依存性と上記骨芽細胞の石灰化促進作用および／または骨基質産生促進作用と組み合わされた作用に基づくものも挙げることができる。
【００１４】
前記式（Ｉ）で示されるビスホスホン酸としては、例えば、６−アミノ−１−ヒドロキシヘキシリデン−１，１−ビスホスホン酸、５−アミノ−１−ヒドロキシペンチリデン−１，１−ビスホスホン酸、４−アミノ−１−ヒドロキシブチリデン−１，１−ビスホスホン酸（アレンドロネート：ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ ）、３−アミノ−１−ヒドロキシプロピリデン−１，１−ビスホスホン酸（パミドロネート：ｐａｍｉｄｒｏｎａｔｅ）、エチドロネート（ｅｔｉｄｒｏｎａｔｅ） が挙げられるが、これらのなかでも、アレンドロネート、パミドロネート、エチドロネートが好ましく、特に、アレンドロネートを好ましいものとして挙げることができる。
【００１５】
本発明のビスホスホン酸の塩としては、薬学的に許容される塩、例えばナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、カルシウム等のアルカリ土類金属塩、塩酸塩等の無機酸塩、クエン酸、アミノ酸塩等の有機酸塩等が挙げられ、なかでも水溶性に優れている点からアレンドロネートのモノナトリウム塩・トリハイドレートを好ましいものとして挙げることができる。
【００１６】
本発明の前記式（Ｉ）で示されるビスホスホン酸はいずれも公知化合物であって、例えば、特公平２−１３６４５号公報、特開昭６１−１０９７９４号公報、特開平３−１０１６８４号公報、特開平５−１３２４９２号公報、特開平４−２１１０１５号公報等に記載された方法によって、アレンドロネートまたはそのモノナトリウム塩・トリハイドレート、カリウム塩、カルシウム塩等の塩を得ることができ、また、例えば西独特許第２１３０７９４号明細書、米国特許第４３２７０３９号明細書等に記載された方法によって、パミドロネートまたはその塩を、米国特許３４６８９３５号、第３４００１４７号、または第３４７５４８６号明細書等に記載された方法によって、エチドロネートまたはその塩を得ることができる。
【００１７】
本発明のビスホスホン酸またはその塩は、経口的、または注射剤等の非経口的投与用の適切な薬理学的単体のいずれかと共に投与することができる。投与量は、被投与者の年令、健康状態、体重、もし行っているとすれば併用療法の種類、治療の頻度および望まれる効果の種類に依存する。
【００１８】
一般に、活性成分化合物の全身的日量は、骨芽細胞レベルにおいて、１０−１３ 〜１０−７Ｍであり、約０．００１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、好ましくは体重ｋｇ当たり、０．０１μｇ〜０．１ｍｇである。通常経口投与の場合、５０ｎｇ／日〜５０ｍｇ／日、非経口投与の場合、０．５ｎｇ／日〜０．５ｍｇ／日である。また、必要に応じて、例えば１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３ 〔１α，２５（ＯＨ）２ Ｄ３ 〕、１α−ヒドロキシビタミンＤ３ 等の活性型ビタミンＤ３ 類、エストロゲン等のホルモン剤と併用することもできる。
【００１９】
本発明の骨形成促進剤は、経口投与の場合、錠剤、カプセル、粉末小包、液体溶液、懸濁液またはエリキシルのような投与形で、非経口的使用の場合、溶液または懸濁液のような処方用無菌液として使用することができる。
【００２０】
かかる場合の賦形剤としては、例えば、糖、例えば、サッカロース、グルコース、ラクトース、スターチ、セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースなど、ゴム類、脂肪酸およびその塩、ポリオール、例えばプロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレングリコールなど、タルク、芳香族エステル、水、生理食塩水、アルコール類、例えばエチルアルコール、脂肪族アルコール、トリグリセリド、脂肪酸エステル等と組み合わせて好適に製剤化される。
【００２１】
本発明の骨形成促進剤は単独で、あるいは本発明の目的に反しない限りにおいて、他の薬物を混合して、あるいは各別に製剤化、投与することができる。そのような他の薬物として、前記した骨形成促進因子、例えば、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３ やビタミンＫ、ＩＬ−４、ＩＧＦ−ＩまたはＴＧＦ−β等のサイトカインを挙げることができ、かかる場合のこれら因子の投与量としては、通常これらの因子を薬物として投与する場合の処方量の範囲を挙げることができる。
【００２２】
かくして本発明の骨形成促進剤が得られるが、本発明の骨形成促進剤は、前記のように石灰化促進作用、骨基質産生促進作用を有するので、例えば骨軟化症、骨形成不全症、骨粗鬆症、二次性副甲状腺機能亢進に基づく骨異栄養症、腎性骨異栄養症、歯周病の予防、治療および骨折の治療促進、歯科矯正に有用である。
【００２３】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
【００２４】
なお、用いた骨芽細胞様細胞、測定法などは次のとおりである。
（１）細胞培養
ヒト骨膜由来骨芽細胞様細胞として、１０歳男児の大腿骨由来の細胞（東京都老人総合研究所、腰原康子博士より）を用いた。すなわち、α−グリセロ燐酸−２Ｎａ（α−ＧＰ）〔東京化成工業（株）製〕および１α，２５（ＯＨ）２ Ｄ３ との培養により、高いアルカリフォスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ：ＡＬＰ）活性を示し、オステオカルシン（ＢＧＰ）産生および石灰化がおこるものである。
【００２５】
細胞の調製、培養法については、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８７，１４５，６５１−６５７ ，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．，１９８９，２５，３７−４３ ，Ｃｏｎｎｅｃｔ． Ｔｉｓｓ． ，１９９３，２４．２１７−２３１ （いずれも、Ｋｏｓｈｉｈａｒａ Ｙ，ｅｔ ａｌ．， の著） に従って行った。具体的には、細胞集団倍化数（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｌｅｖｅｌ，ＰＤＬ）１９（以下、１９ＰＤＬ）の細胞を６または１２−ｗｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ） を用いて１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（アービンサイエンテイフィック製）を含む Ｅａｇｌｅ’ｓ α−ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ （α−ＭＥＭ）（ライフテクノロジーズ社製）中で培養（３７℃、５％ＣＯ２ ／９５％ａｉｒ ）した。コンフルエント到達（２０ＰＤＬ）２〜３日後、２ｍＭのα−ＧＰ存在下に１α，２５（ＯＨ）２ Ｄ３ を添加または非添加でさらに所定期間培養した。１α，２５（ＯＨ）２ Ｄ３ はエタノール溶液として−２０℃で保存し、エタノールの最終濃度が０．１％（ｖ／ｖ）となるように培養系に添加した。ビスホスホン酸はそれぞれｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ （ＰＢＳ）溶液として４℃で保存し、ＰＢＳの最終濃度が０．１％（ｖ／ｖ）となるように培養系に添加した。培養液は週３回交換した。
【００２６】
（２）ＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）
ヒト骨芽細胞様細胞よりｔｏｔａｌ ＲＮＡをＡＧＰＣ法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８７，１６２，１５６−１５９）により調製した。ｔｏｔａｌ ＲＮＡ１μｇから、ｃＤＮＡを合成した（３７℃、６０分）。Ｐｒｏ α１（Ｉ）ｃｏｌｌａｇｅｎ遺伝子およびＢＧＰ遺伝子に対する特異的プライマーとして、それぞれＨＣＯＬＡ−１Ａ（５’−ＣＣＡ ＣＣＧ ＡＣＣ ＡＡＧ ＡＡＡ ＣＣＡ−３’） およびＨＣＯＬＡ−１Ｂ（５’−ＧＣＴ ＣＡＣ ＣＡＧ ＧＡＣ ＧＡＣ ＣＡＧ−３’） とＨＢＧＰ−１Ａ（５’−ＣＣＴ ＣＡＣ ＡＣＴ ＣＣＴＣＧＣ ＣＣＴ ＡＴＴ−３’）およびＨＢＧＰ−１Ｂ（５’−ＡＴＡ ＧＧＣ ＣＴＣ ＣＴＧ ＡＡＡ ＧＣＣ ＧＡＴ−３’）を用いて、ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ ｏｖｅｎ （ＭｉｎｉＣｙｃｌｅｒ ＰＴＣ−１５０；ＭＪリサーチ製） 中でＰＣＲ増幅を行った。最初に２分間の変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ） を行った後、９４℃、１分間の変性、５５℃（ＢＧＰ）または６０℃〔ｐｒｏ α１（Ｉ）ｃｏｌｌａｇｅｎ〕、２分間のａｎｎｅａｌｉｎｇ 、７２℃、３分間のｅｘｔｅｎｓｉｏｎ を３０サイクル行った。アガロースゲル上で電気泳動後、ＰＣＲ産物をｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅで染色して写真に撮影した（Ｐｏｌａｒｏｉｄ ＡＣＭＥＬ Ｍ−０８５ Ａｕｔｏ）。
【００２７】
（３）カルシウム（Ｃａ） 、リン（Ｐｉ）、ＡＬＰ活性、ＢＧＰ、ｃｏｌｌａｇｅｎ、ＤＮＡの定量
ＡＬＰ活性はＭａｉｏ ａｎｄ ｄｅ Ｃａｒｌｉ（Ｎａｔｕｒｅ １９６２， １９６， ６００−６０１）の方法により、ｐ−ニトロフェニルフォスフェート〔シグマ化学（株）製〕を基質として測定した。すなわち、培養終了後に細胞を生理食塩液で３回洗い、１０ｍＭｐ−ニトロフェニルフォスフェート−１ｍＭＭｇＣｌ２ −０．１Ｍカーボネートバッファー（ｐＨ１０．０）を加えて１５〜２０分間反応させた。反応液を移し、４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００２８】
ＡＬＰ活性測定反応後の細胞を再度生理食塩液で洗った後、５％過塩素酸（ＰＣＡ）を加えてＣａおよびＰｉを抽出（氷水中で１５分間）する操作を２回繰り返して行った。ＣａおよびＰｉの含量はそれぞれｏ−ｃｒｅｓｏｌｐｈｔｈａｌｅｉｎ ｃｏｍｐｅｘｏｎｅ（ＯＣＰＣ）法（Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９６７， １８， ５２１−５３１） およびＣｈｅｎらの方法（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．， １９５６，２８，１７５６−１７５８）で定量した。
【００２９】
ＢＣＰは細胞を２０％ギ酸中で超音波破砕して抽出し、凍結乾燥したのち測定まで−８０℃に保存した。測定は、Ｇｌａ−Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ 測定キット〔宝酒造（株）製〕を用いた酵素免疫測定法によった。
【００３０】
細胞層のｃｏｌｌａｇｅｎ量は６Ｎ塩酸で加水分解（オートクレーブ中、１３０℃、３０分間）したのち、Ｋｉｖｉｒｉｋｋｏ らの方法（Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９６７，１９，２４９−２５５） に従ってハイドロキシプロリンを測定して定量した。
【００３１】
ＤＮＡ含量は、ＰＣＡ抽出したのち、Ｂｕｒｔｏｎ法（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．，１９５６，６２，３１５−３２３）により測定した。
【００３２】
（実施例１）ビスホスホン酸のヒト骨芽細胞様細胞の石灰化に及ぼす影響
コンフルエントに到達した２０ＰＤＬのヒト骨芽細胞様細胞に、図１に示した濃度（１０−１２ Ｍ〜１０−５Ｍ）のアレンドロネートまたはエチドロネートを添加し、１α，２５（ＯＨ）２ Ｄ３ （１００ｎｇ／ｍｌ）および２ｍＭα−ＧＰ存在下に７日間培養した。
【００３３】
対照例としては、１α，２５（ＯＨ）２ Ｄ３ 単独のものを用い、前記カルシウム定量法に従って７日間培養後のヒト骨芽細胞様細胞層のＣａ含量を定量した。結果を図１に示した。図１において、各カラムは平均値±標準誤差（例数３）を示す。対照との統計学的有意差は、＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１である。
【００３４】
図１から、アレンドロネートが１０−１２ 〜１０−７Ｍの濃度では、１００ｎｇ／ｍｌの１α，２５（ＯＨ）２ Ｄ３ 存在下で７日間培養したヒト骨芽細胞様細胞のＣａ沈着（石灰化）を促進し、１０−６Ｍ以上の濃度ではこれを逆に抑制することが判る。石灰化促進作用は、１０−９Ｍ付近で最大となったが、１α，２５（ＯＨ）２ Ｄ３ の非存在下ではこのような促進効果は認められなかった（データ示さず）。
【００３５】
エチドロネートも同様に、低濃度（１０−１０ 〜１０−８Ｍ）ではヒト骨芽細胞様細胞の石灰化を促進し、１０−６Ｍ以上ではこれを抑制した。石灰化促進作用におけるエチドロネートの最小有効濃度はアレンドロネートのそれに比べて少なくとも１００倍高かったが、高濃度側における石灰化抑制作用の発現濃度は両ビスホスホン酸でほとんど差がなかった。なお、データには示さないが、アレンドロネートおよびエチドロネートによるＰｉ含量の変化も石灰化促進作用と同様であった。
【００３６】
（実施例２）アレンドロネートのヒト骨芽細胞様細胞の石灰化に及ぼす影響
コンフルエントに到達した２０ＰＤＬのヒト骨芽細胞様細胞に、図２に示した濃度（１０−１４ Ｍ〜１０−９Ｍ）のアレンドロネートを添加し、１α，２５（ＯＨ）２ Ｄ３ （１００ｎｇ／ｍｌ）および２ｍＭα−ＧＰ存在下に１４日間培養した。対照例としては１α，２５（ＯＨ）２ Ｄ３ 単独のものを用い、実施例１と同様にして１４日間培養後のヒト骨芽細胞様細胞層のＣａ含量を定量し、結果を図２に示す。図２において、各カラムは平均値±標準誤差（例数６）を示す。対照との統計学的有意差は、＊：Ｐ＜０．０５、＊＊＊：Ｐ＜０．００１である。
【００３７】
図２から、１α，２５（ＯＨ）２ Ｄ３ （１００ｎｇ／ｍｌ）を加えて細胞を１４日間培養する条件下では、アレンドロネートによる石灰化促進作用は１０−１４ Ｍではほとんど認められないが、１０−１３ Ｍから明らかに発現することが判る。
【００３８】
（実施例３）アレンドロネートのヒト骨芽細胞様細胞のＢＧＰ産生およびｃｏｌｌａｇｅｎ産生に及ぼす影響
コンフルエントに到達した２０ＰＤＬのヒト骨芽細胞様細胞に、アレンドロネートを添加し、２ｍＭα−ＧＰ存在、かつ１α，２５（ＯＨ）２ Ｄ３ （１０ｎｇ／ｍｌ）存在または非存在下に１０日間培養した。対照例としてはアレンドロネート非添加のものを用い、前記の方法に従って細胞層のＢＧＰおよびｃｏｌｌａｇｅｎ量を定量し、結果を図３および図４に示す。図３および４において、各カラムは平均値±標準誤差（例数４）を示す。対照との統計学的有意差は、＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１である。アレンドロネートは、石灰化促進作用における最小有効濃度（１０−１３ Ｍ）および最大効果発現濃度以下の濃度（１０−１１ Ｍ）を用いた。
【００３９】
図３から、アレンドロネートが１α，２５（ＯＨ）２ Ｄ３ 存在下で顕著にＢＧＰ産生を促進することが判る。また、図４から、アレンドロネートがｃｏｌｌａｇｅｎ産生を１α，２５（ＯＨ）２ Ｄ３ 存在下で有意に促進することが判る。
【００４０】
（実施例４）アレンドロネートのヒト骨芽細胞様細胞のＢＧＰおよびｐｒｏ α１（Ｉ）ｃｏｌｌａｇｅｎの遺伝子発現に及ぼす影響
コンフルエントに到達した２０ＰＤＬのヒト骨芽細胞様細胞に、実施例３で用いたのと同じ濃度のアレンドロネートを添加し、２ｍＭα−ＧＰおよび１α，２５（ＯＨ）２ Ｄ３ （１０ｎｇ／ｍｌ）存在下に３、７または１４日間培養した。対照例としては１α，２５（ＯＨ）２ Ｄ３ 単独のものを用い、前記方法に従って細胞のｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、ＢＧＰおよびｐｒｏ α１（Ｉ）ｃｏｌｌａｇｅｎの遺伝子発現を検討した。結果を図５（ａ）（ＢＧＰ遺伝子発現）および（ｂ）〔ｐｒｏ α１（Ｉ）ｃｏｌｌａｇｅｎ遺伝子発現）に示す。
【００４１】
図５（ａ）からは、いずれの時点においてもアレンドロネートが１α，２５（ＯＨ）２ Ｄ３ によって強力に誘導されたＢＧＰ遺伝子発現をさらに促進するとは確認できなかったが、１α，２５（ＯＨ）２ Ｄ３ 単独で既に強力にＢＧＰ遺伝子の発現が誘導されていることから、この測定系では、アレンドロネートによるそれ以上の発現を十分に検出できなかったものと考えられる。一方、図５（ｂ）からは、アレンドロネートが１α，２５（ＯＨ）２ Ｄ３ によって誘導されたｐｒｏ α１（Ｉ）ｃｏｌｌａｇｅｎの遺伝子発現をすべての時点で濃度依存的にさらに促進することが判る。
【００４２】
以上のとおり、これまでビスホスホン酸の作用としてよく知られている骨吸収抑制作用の発現濃度よりもさらに低濃度で、また、アレンドロネートおよびエチドロネートは、１α，２５（ＯＨ）２ Ｄ３ 存在下でヒト骨芽細胞様細胞の石灰化を促進した。アレンドロネートによる石灰化促進に骨基質タンパクであるＢＧＰおよびｃｏｌｌａｇｅｎの産生とｐｒｏ α１（Ｉ）ｃｏｌｌａｇｅｎのｍＲＮＡ発現の促進を伴っていたことから、ビスホスホン酸の物理化学的性質によるものではないと考えられた。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１におけるビスホスホン酸のヒト骨芽細胞様細胞の石灰化に及ぼす影響を示すグラフである。
【図２】実施例２におけるアレンドロネートのヒト骨芽細胞様細胞の石灰化促進作用を示すグラフである。
【図３】実施例３におけるアレンドロネートのヒト骨芽細胞様細胞のＢＧＰ産生に及ぼす影響を示すグラフである。
【図４】実施例３におけるアレンドロネートのヒト骨芽細胞様細胞のｃｏｌｌａｇｅｎ産生に及ぼす影響を示すグラフである。
【図５】実施例４におけるアレンドロネートのＢＧＰ（ａ）およびｐｒｏ α１（Ｉ）ｃｏｌｌａｇｅｎ（ｂ） 遺伝子発現に及ぼす影響を示す、電気泳動後の染色写真のバンドの位置を示す図である。
各レーンは以下のとおり：（０）ＢＲＬ１００塩基対ラダー、（１）、（２）、（３）無処置−３、７、１４日、（４）、（５）、（６）１α，２５（ＯＨ）２ Ｄ３ 単独−３、７、１４日、（７）、（８）、（９）１α，２５（ＯＨ）２ Ｄ３ 加アレンドロネート１０−１３ Ｍ−３、７、１４日、（１０）、（１１）、（１２）１α，２５（ＯＨ）２ Ｄ３ 加アレンドロネート１０−１１ Ｍ−３、７、１４日
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）
【化１】
〔式中、ＲはＨ2 Ｎ−（ＣＨ2 ）n −（ｎは２〜５の整数を表す）またはＣＨ3−を表し、Ｒ1は−ＯＨを表す。〕で示されるビスホスホン酸またはその塩を有効成分とする骨軟化症治療剤。
【請求項２】
下記式（Ｉ）
【化２】
〔式中、ＲはＨ2 Ｎ−（ＣＨ2 ）n −（ｎは２〜５の整数を表す）またはＣＨ3−を表し、Ｒ1は−ＯＨを表す。〕で示されるビスホスホン酸またはその塩を有効成分とする腎性骨異栄養症治療剤。
【請求項３】
下記式（Ｉ）
【化３】
〔式中、ＲはＨ2 Ｎ−（ＣＨ2 ）n −（ｎは２〜５の整数を表す）またはＣＨ3−を表し、Ｒ1は−ＯＨを表す。〕で示されるビスホスホン酸またはその塩を有効成分とする骨形成不全症治療剤。
【請求項４】
ＲがＨ2 Ｎ−（ＣＨ2 ）3 −、またはＣＨ3 −である請求項１記載の骨軟化症治療剤。
【請求項５】
ＲがＨ2 Ｎ−（ＣＨ2 ）3 −、またはＣＨ3 −である請求項２記載の腎性骨異栄養症治療剤。
【請求項６】
ＲがＨ2 Ｎ−（ＣＨ2 ）3 −、またはＣＨ3 −である請求項３記載の骨形成不全症治療剤。
【請求項７】
ビスホスホン酸またはその塩が、４−アミノ−１−ヒドロキシブチリデン−１，１−ビスホスホン酸モノＮａ塩・トリハイドレートである請求項１記載の骨軟化症治療剤。
【請求項８】
ビスホスホン酸またはその塩が、４−アミノ−１−ヒドロキシブチリデン−１，１−ビスホスホン酸モノＮａ塩・トリハイドレートである請求項２記載の腎性骨異栄養症治療剤。
【請求項９】
ビスホスホン酸またはその塩が、４−アミノ−１−ヒドロキシブチリデン−１，１−ビスホスホン酸モノＮａ塩・トリハイドレートである請求項３記載の骨形成不全症治療剤。
【請求項１】
下記式（Ｉ）
【化１】
〔式中、ＲはＨ2 Ｎ−（ＣＨ2 ）n −（ｎは２〜５の整数を表す）またはＣＨ3−を表し、Ｒ1は−ＯＨを表す。〕で示されるビスホスホン酸またはその塩を有効成分とする骨軟化症治療剤。
【請求項２】
下記式（Ｉ）
【化２】
〔式中、ＲはＨ2 Ｎ−（ＣＨ2 ）n −（ｎは２〜５の整数を表す）またはＣＨ3−を表し、Ｒ1は−ＯＨを表す。〕で示されるビスホスホン酸またはその塩を有効成分とする腎性骨異栄養症治療剤。
【請求項３】
下記式（Ｉ）
【化３】
〔式中、ＲはＨ2 Ｎ−（ＣＨ2 ）n −（ｎは２〜５の整数を表す）またはＣＨ3−を表し、Ｒ1は−ＯＨを表す。〕で示されるビスホスホン酸またはその塩を有効成分とする骨形成不全症治療剤。
【請求項４】
ＲがＨ2 Ｎ−（ＣＨ2 ）3 −、またはＣＨ3 −である請求項１記載の骨軟化症治療剤。
【請求項５】
ＲがＨ2 Ｎ−（ＣＨ2 ）3 −、またはＣＨ3 −である請求項２記載の腎性骨異栄養症治療剤。
【請求項６】
ＲがＨ2 Ｎ−（ＣＨ2 ）3 −、またはＣＨ3 −である請求項３記載の骨形成不全症治療剤。
【請求項７】
ビスホスホン酸またはその塩が、４−アミノ−１−ヒドロキシブチリデン−１，１−ビスホスホン酸モノＮａ塩・トリハイドレートである請求項１記載の骨軟化症治療剤。
【請求項８】
ビスホスホン酸またはその塩が、４−アミノ−１−ヒドロキシブチリデン−１，１−ビスホスホン酸モノＮａ塩・トリハイドレートである請求項２記載の腎性骨異栄養症治療剤。
【請求項９】
ビスホスホン酸またはその塩が、４−アミノ−１−ヒドロキシブチリデン−１，１−ビスホスホン酸モノＮａ塩・トリハイドレートである請求項３記載の骨形成不全症治療剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【特許番号】特許第３５６６９８４号（Ｐ３５６６９８４）
【登録日】平成１６年６月１８日（２００４．６．１８）
【発行日】平成１６年９月１５日（２００４．９．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願平６−１２１２５８
【出願日】平成６年６月２日（１９９４．６．２）
【公開番号】特開平７−３３０６１３
【公開日】平成７年１２月１９日（１９９５．１２．１９）
【審査請求日】平成１２年５月３０日（２０００．５．３０）
【出願人】（０００００３００１）帝人株式会社 (1,209)
【参考文献】
【文献】特開平０７−０４８２６１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開平０４−２１１０１５（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第９４／００５２９７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第９５／０２９６７９（ＷＯ，Ａ１）
【登録日】平成１６年６月１８日（２００４．６．１８）
【発行日】平成１６年９月１５日（２００４．９．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成６年６月２日（１９９４．６．２）
【公開番号】特開平７−３３０６１３
【公開日】平成７年１２月１９日（１９９５．１２．１９）
【審査請求日】平成１２年５月３０日（２０００．５．３０）
【出願人】（０００００３００１）帝人株式会社 (1,209)
【参考文献】
【文献】特開平０７−０４８２６１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開平０４−２１１０１５（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第９４／００５２９７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第９５／０２９６７９（ＷＯ，Ａ１）
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