高発現ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）プロモーター
作動可能に連結された異種核酸の改善された発現レベルを指令するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターの変異体が同定される。これらは、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、ザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）、および他の関連細菌におけるキメラ遺伝子の発現に有用な高発現プロモーターである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００８年３月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／０３９８７１号明細書（本明細書において参照により援用される）の利益を主張する。
【０００２】
政府の権利についての陳述
本発明は、エネルギー省から授与された契約番号０４−０３−ＣＡ−７０２２４およびＤＥ−ＦＣ３６−０３ＧＯ１３１４６に基づく米国政府の助成により行われた。米国政府は、本発明において所定の権利を有する。さらに、米国政府は、米国エネルギー省と国立再生可能エネルギー研究所（ミッドウエスト研究所の一部局）との間の契約番号ＤＥ−ＡＣ３６−９９ＧＯ１０３３７に基づいて、本発明の権利を有する。
【０００３】
本発明は、微生物学および遺伝子操作の分野に関する。より具体的には、細菌においてキメラ遺伝子の発現を指令するための新規のプロモーターが同定された。
【背景技術】
【０００４】
微生物によるエタノールの産生は、化石燃料の代替的エネルギー源を提供し、従って、現在の重要な研究の分野である。キシロースは、加水分解されたリグノセルロース材料における主要ペントースであり、従って、多量に利用可能な低コストの炭素基質を提供することができるため、エタノール、ならびに他の有用な産物を産生する微生物は、キシロースを炭素源として使用することが可能であることが望ましい。天然ではキシロースを資化しないザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）および他のエタノール産生細菌は、１）キシロースからキシルロースへの変換を触媒するキシロースイソメラーゼ；２）キシルロースをリン酸化して、キシルロース５−リン酸を形成させるキシルロキナーゼ；３）トランスケトラーゼ；および４）トランスアルドラーゼをコードする遺伝子の導入によって、キシロース資化のために遺伝子操作することができる。
【０００５】
キシロース代謝についてＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株（米国特許第５５１４５８３号明細書、米国特許第５７１２１３３号明細書、米国特許第６５６６１０７号明細書、国際公開第９５／２８４７６号パンフレット、Ｆｅｌｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３８：３５４−３６１、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６７：２４０−２４３）、ならびにザイモバクター・パルメ（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ ｐａｌｍａｅ）株（Ｙａｎａｓｅ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｒｏｂｉｏｌ．７３：２５９２−２５９９）を操作することには成功している。しかし、典型的に、操作された株は、キシロース上では、グルコース上ほど良好に増殖せず、そしてエタノールを産生しない。この操作では、キシロース代謝のための異種タンパク質をコードする遺伝子はＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞において活性なプロモーター、典型的に、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターまたはＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）エノラーゼ遺伝子のプロモーターから発現されている。キシロース資化について操作された株は、キシロース培地上での継代培養によって適応され、改善されたキシロース資化を伴う株を生じており、米国特許第７，２２３，５７５号明細書ならびに同一出願人が所有しかつ同時係属中の米国特許出願公開第２００８０２８６８７０号明細書に記載されている。しかし、改善のための遺伝的基礎については決定されていない。
【０００６】
改善されたキシロース資化を有するザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、および他のエタノール産生細菌の遺伝子操作株の必要性が依然として存在する。出願人らは、キシロース資化遺伝子を発現するために使用することができる増加した活性を有する変異プロモーターを発見した。この活性は、これらのプロモーターを含む操作された株に改善されたキシロース資化を付与する。このプロモーターは他の遺伝子の発現に使用してもよい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、遺伝子発現、即ち、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（Ｐｇａｐ）の天然のプロモーターによって指令されるレベルより高いレベルの遺伝子発現を指令するザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、ザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）および関連細菌におけるキメラ遺伝子の発現のための、単離された変異プロモーターに関する。変異プロモーターは、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターの誘導体であり、そして特定の変異の存在により増加した活性を有する。このプロモーターは、コード領域または調節ＲＮＡの発現のための遺伝子操作において使用してもよい。これらのプロモーターによって指令されるキシロースイソメラーゼのコード領域の発現により、キシロース含有培地におけるキシロース資化性ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）の増殖が改善される。
【０００８】
本明細書では、−１９０位、−８９位、または−１９０位および−８９位の両方からなる群から選択される位置においてヌクレオチド置換を有するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターを含む単離された核酸分子であって、前記位置番号は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＣＰ４株およびＺＭ４株におけるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの天然のＡＴＧ翻訳開始コドンに対する番号である、単離された核酸分子について説明する。
【０００９】
また、本明細書では、次のものについても説明する：異種核酸分子に作動可能に連結された上記の単離された核酸分子を含むキメラ遺伝子；上記の核酸分子を含むベクター、ならびに細胞に上記の核酸分子を導入する工程を含む、細菌細胞を遺伝子操作する方法。
【００１０】
本発明の様々な実施形態は、以下の詳細な説明、図面、および本出願の一部をなす添付の配列の説明からさらに詳細に理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】トランスケトラーゼ（Ａ）の酵素アッセイのストラテジーを示す。
【図１Ｂ】トランスアルドラーゼ（Ｂ）の酵素アッセイのストラテジーを示す。
【図１Ｃ】キシロースイソメラーゼ（Ｃ）の酵素アッセイのストラテジーを示す。
【図１Ｄ】キシルロキナーゼ（Ｄ）の酵素アッセイのストラテジーを示す。
【図２】ＰｇａｐｘｙｌＡＢで形質転換したＴ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４Ｃ、およびＴ５Ｃ系統におけるキシロースイソメラーゼ（ＸＩ）およびキシルロキナーゼ（ＸＫ）活性のグラフを示す。
【図３】ＰｇａｐｘｙｌＡＢで形質転換したＴ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４Ｃ、およびＴ５Ｃ系統におけるトランスアルドラーゼ（ＴＡＬ）およびトランスケトラーゼ（ＴＫＴ）活性のグラフを示す。
【図４】選択された適応キシロース資化株コロニーの理論的エタノール収率％およびキシロース資化％のグラフを示す。
【図５】５％グルコースを含むＲＭ（リッチ培地）（ＲＭＧ）において５０代まで増殖する前および後の５％キシロースを含むＲＭ（ＲＭＸ５％）上で７０時間目の適応キシロース資化株の増殖のグラフを示す。
【図６Ａ−Ｂ】（Ａ）ｐＺＢ１８８；（Ｂ）ｐＺＢ１８８／ａａｄＡの略図を示す。
【図６Ｃ】（Ｃ）ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−ＧａｐＸｙｌＡのプラスミド地図の略図を示す。
【図６Ｄ】（Ｄ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセットＰｇａｐＸｙｌＡの略図を示す。
【図７Ａ−Ｂ】（Ａ）ｐＭＯＤTM−２−＜ＭＣＳ＞；（Ｂ）ｐＭＯＤ−リンカーのプラスミド地図を示す。
【図７Ｃ】（Ｃ）ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃのプラスミド地図を示す。
【図８】ｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷのプラスミド地図を示す。
【図９】ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−８０１ＧａｐＸｙｌＡのプラスミド地図を示す。
【図１０Ａ−Ｂ】（Ａ）ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−８０１ＧａｐＸｙｌＡ；（Ｂ）ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−ＧａｐＸｙｌＡのプラスミド地図を示す。
【図１０Ｃ】（Ｃ）ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−８０１ＧａｐＸｙｌＡのプラスミド地図を示す。
【図１１】Ｐｇａｐ−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現プラスミドを所有する３つの株（Ｘ１、Ｘ２およびＸ２）ならびにコントロールプラスミドを保持する３つの株（Ｃ１、Ｃ２およびＣ３）のキシロース含有培地における増殖曲線（ＯＤ６００対時間）のグラフを示す。
【図１２Ａ】（Ａ）線形目盛上にプロットした、スペクチノマイシンを伴わないキシロース含有培地における株ＺＷ６４１、ＺＷ６５８、Ｘ１およびＣ１の増殖曲線（ＯＤ６００対時間）のグラフを示す。
【図１２Ｂ】（Ｂ）対数目盛上にプロットした、スペクチノマイシンを伴わないキシロース含有培地における株ＺＷ６４１、ＺＷ６５８、Ｘ１およびＣ１の増殖曲線（ＯＤ６００対時間）のグラフを示す。
【図１３Ａ】（Ａ）線形目盛上にプロットした、株ＺＷ６５８と比較した、８０１Ｐｇａｐ−ＸｙｌＡが組み込まれた３つの株（＃８−２、＃８−４、＃８−５）および６４１Ｐｇａｐ−ＸｙｌＡが組み込まれた３つの株（＃６−１、＃６−３、＃６−５）の増殖曲線（ＯＤ６００対時間）のグラフを示す。
【図１３Ｂ】（Ｂ）対数目盛上にプロットした、株ＺＷ６５８と比較した、８０１Ｐｇａｐ−ＸｙｌＡが組み込まれた３つの株（＃８−２、＃８−４、＃８−５）および６４１Ｐｇａｐ−ＸｙｌＡが組み込まれた３つの株（＃６−１、＃６−３、＃６−５）の増殖曲線（ＯＤ６００対時間）のグラフを示す。
【図１４】ｐＺＢ１８８ａａｄＡ／Ｇａｐ／ＺｙｍｏＲＰＩ／ＥｃｏｌｉＳＬのプラスミド地図を示す。
【図１５Ａ】（Ａ）ｐＺＢ１８８ａａｄＡ／Ｇａｐ／ＺｙｍｏＲＰＩ／ＥｃｏｌｉＳＬのプラスミド地図を示す。
【図１５Ｂ−Ｃ】図１５−１続き。（Ｂ）ｐＺＢ１８８ａａｄＡ−６４１ＧａｐＲＰＩ；および（Ｃ）ｐＺＢ１８８ａａｄＡ−８０１ＧａｐＲＰＩのプラスミド地図を示す。
【図１６】ＲＰＩを発現する、異なるプロモーターを持つ株由来の全細胞タンパク質の染色されたタンパク質ゲルを示す。
【００１２】
本発明は、以下の詳細な説明、および本出願の一部をなす添付の配列の説明からさらに詳細に理解することができる。
【００１３】
以下の配列は、米国特許法施行規則第１．８２１〜１．８２５条（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則」）に従い、そして世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８年）ならびにＥＰＯおよびＰＣＴの配列表の要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、ならびに実施細則第２０８号および付属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列データに使用した記号および形式は米国特許法施行規則第１．８２２条に記載の規則に従う。
配列番号１は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＣＰ４株由来のＺｍＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号２は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＺＭ４株由来のＺｍＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号３は、ｐＺＢ４由来のＺｍＰｇａｐのヌクレオチド配列であり、これはまた、株ＺＷ６４１および８ＸＬ４のＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンにもある。
配列番号４は、株ＺＷ６５８由来の改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号５は、株８ｂ由来の改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号６は、ＰｇａｐのｐＺＢ４変種において−１９０（ＺＷ６５８）および−８９（８ｂ）変異の両方を伴う改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号７は、ＰｇａｐのＣＰ４変種においてＺＷ６５８由来の−１９０変異を伴う改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号８は、ＰｇａｐのＣＰ４変種において８ｂ由来の−８９変異を伴う改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号９は、ＰｇａｐのＣＰ４変種において−１９０（ＺＷ６５８）および−８９（８ｂ）変異の両方を伴う改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号１０は、ＰｇａｐのＺＭ４変種においてＺＷ６５８由来の−１９０変異を伴う改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号１１は、ＰｇａｐのＺＭ４変種において８ｂ由来の−８９変異を伴う改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号１２は、ＰｇａｐのＺＭ４変種において−１９０（ＺＷ６５８）および−８９（８ｂ）変異の両方を伴う改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号１３および１４は、ｐＺＢ４由来のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（Ｐｇａｐ）を含有するＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号１５および１６は、ｐＺＢ４由来のｔａｌコード領域を含有するＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号１７および１８は、Ｐｇａｐおよびｔａｌフラグメント由来のＰｇａｐｔａｌを含有するＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号１９および２０は、ｐＺＢ１８６由来のｌｏｘＰ：：Ｃｍを含有するＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号２１は、ｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍプラスミドの完全なヌクレオチド配列である。
配列番号２２および２３は、ｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍを収容する形質転換体におけるｔａｌおよびｔｋｔコード領域を含有する３ｋｂのＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号２４は、ｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍプラスミドの完全なヌクレオチド配列である。
配列番号２５および２６は、ｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍを伴うＴ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４ＣおよびＴ５Ｃ組み込み体由来の１．６ｋｂのＰｇａｐｘｙｌＡ ＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号２７および２８は、ＺＷ６４１およびＺＷ６５８由来のＰｇａｐを含有するＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号２９〜３１は、ＺＷ６４１およびＺＷ６５８由来のＰｇａｐを配列決定するためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号３２および３３は、Ｓｐｅｃr−カセットを含有するＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号３４は、キシロースイソメラーゼ発現カセットＰｇａｐＸｙｌＡの完全ヌクレオチド配列である。
配列番号３５および３６は、ｐＭＯＤ２−＜ＭＣＳ＞の異なるマルチクローニング部位を置換するために使用されるオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
配列番号３７および３８は、それぞれ、プラスミドｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−８０１ＧａｐＸｙｌＡおよびｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−６４１ＧａｐＸｙｌＡを得るため、ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃに挿入するための株ＺＷ８０１−４およびＺＷ６４１由来のＰｇａｐｘｙｌＡ領域の増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号３９および４０は、ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−６４１ＧａｐＸｙｌＡ由来のＰｇａｐの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列であり、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＲＰＩオープンリーディングフレームの最初の１５ｂｐを含む。
配列番号４１および４２は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＲＰＩオープンリーディングフレームの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号４３は、プラスミドｐＺＢ１８８ａａｄＡ／Ｇａｐ／ＺｙｍｏＲＰＩ／ＥｃｏｌｉＳＬに存在するＲＰＩ発現カセットの完全ヌクレオチド配列である。
配列番号４４および４５は、８ＸＬ４および８ｂ由来のＰｇａｐを含有するＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号４６は、８ＸＬ４および８ｂ由来のＰｇａｐを配列決定するためのプライマーの完全ヌクレオチド配列である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書では、細菌細胞におけるキメラ遺伝子の発現に使用することができる新規のプロモーターについて説明する。出願人らは、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターの異なる２つの変異のそれぞれはプロモーターによって指令される発現のレベルを個別に増加させることを発見した。１つの変異は−１９０位における変異であり、そして第２の変異は−８９位における変異である。これらの位置は、両方ともＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＣＰ４株およびＺＭ４株におけるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの天然のＡＴＧ翻訳開始コドンに対するものである。これらの変異のいずれか一方または両方を含有するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターは、作動可能に連結された異種のＤＮＡ配列を細菌細胞において発現させるために使用することができる。
【００１５】
明細書および特許請求の範囲の解釈のために、以下の略語および定義が使用される。
【００１６】
本明細書において使用する用語「含む」、「含んでいる」、「含む」、「含んでいる」、「有する」、「有している」、「含有する」もしくは「含有している」またはそれらの他の任意の表現は、非排他的な包含を含むことが意図される。例えば、要素のリストを含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置は、それらの要素のみに限定される必要はなく、明確に列挙されていない他の要素、あるいはそのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置に本来備わっている他の要素を含んでもよい。さらに、異なることを述べている場合を除き、「または」は、包含的論理和を指すものであって、排他的論理和を指すものではない。例えば、条件ＡまたはＢは、次のもののいずれか１つによって満たされる：Ａが真であり（または存在し）かつＢが偽であること（または存在しないこと）、Ａが偽であり（または存在せず）かつＢが真であること（または存在すること）、ならびにＡおよびＢが両方とも真であること（または存在すること）。
【００１７】
また、本発明の要素または成分の前に置かれている不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、要素または成分の事例（即ち、発生）の数に関して非制限的であることが意図される。従って、「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは少なくとも１つを含むものと読み取るべきであり、そして要素または成分の単数形もまた、数が明らかに単数であることを意味しない限り、複数を含む。
【００１８】
「遺伝子」は、コード配列の前（５’非コード配列）および後（３’非コード配列）に調節配列を含み得る特定のタンパク質または機能的ＲＮＡ分子を発現する核酸フラグメントを指す。「生来の遺伝子」または「野生型遺伝子」は、それ自体の調節配列と共に天然に見出されるような遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然には一緒に見出されない調節およびコード配列を含んでなる、生来の遺伝子ではない任意の遺伝子を指す。従って、キメラ遺伝子は、異なる起源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ起源に由来するが、しかし天然に見出されるものとは異なる様式で配列される調節配列およびコード配列を含んでなることができる。「内因性遺伝子」は、生物体のゲノム内の天然の位置にある生来の遺伝子を指す。「外来」遺伝子は、宿主生物体内に通常は見出されない遺伝子を指すが、しかしこれは遺伝子導入により宿主生物体内に導入される。外来遺伝子は、非生来の生物体内に挿入された生来の遺伝子、またはキメラ遺伝子を含んでなることができる。
【００１９】
用語「遺伝子構築物」は、１つ以上の特定のタンパク質または機能的ＲＮＡ分子の発現をコードする核酸フラグメントを指す。遺伝子構築物において、遺伝子は、生来、キメラ、または自然にはない外来性のものであってもよい。典型的に、遺伝子構築物は、「コード配列」を含んでなる。「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。
【００２０】
「プロモーター」または「開始制御領域」は、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列は、プロモーター配列の３’側に局在する。プロモーターは、そのままの形で生来の遺伝子から誘導することができるか、または天然に見出される多様なプロモーターから誘導される多様なエレメントからなるか、またはなお、合成ＤＮＡセグメントを含んでなり得る。当業者であれば、多様なプロモーターは多様な組織もしくは細胞タイプ、または多様な発生段階において、あるいは多様な環境条件に応答して、遺伝子の発現を指令することができることを理解している。ほとんどの時期におけるほとんどの細胞タイプにおいて遺伝子を発現させるプロモーターを、通常、「構成性プロモーター」と呼ぶ。
【００２１】
本明細書において使用する用語「発現」は、遺伝子に由来するコード（ｍＲＮＡ）または機能的ＲＮＡの転写および安定な蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指すことができる。「アンチセンス阻害」は、標的タンパク質の発現を抑制することが可能であるアンチセンスＲＮＡ転写物の産生を指す。「過剰発現」は、通常の産生レベルを超えるトランスジェニック生物体または非形質転換生物体における遺伝子産物の産生を指す。「共抑制」は、同一または実質的に類似する外来または内因性遺伝子の発現を抑制することが可能であるセンスＲＮＡ転写物または断片の産生を指す（米国特許第５，２３１，０２０号明細書）。
【００２２】
本明細書において使用する「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」は、イントロンを含まず、かつ細胞によってタンパク質に翻訳され得るＲＮＡを指す。
【００２３】
本明細書において使用する「形質転換」は、遺伝的に安定に遺伝する核酸フラグメントの宿主生物体への伝達を指す。伝達された核酸は、宿主細胞において維持されるプラスミドの形態であってもよく、またはある伝達された核酸を宿主細胞のゲノムに組込んでもよい。形質転換された核酸フラグメントを含有する宿主生物体を「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換された」生物体と呼ぶ。
【００２４】
本明細書において使用する用語「プラスミド」および「ベクター」は、しばしば細胞の中心的代謝の部分ではない遺伝子を担持する染色体外エレメントを指し、通常は、環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である。そのようなエレメントは、任意の起源に由来する一本鎖または二本鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡの自律的反復配列、ゲノム組込み配列、ファージもしくはヌクレオチド配列で、線状あるいは環状であってもよく、ここで、プロモーターフラグメントおよび適切な３’非翻訳配列を伴う選択された遺伝子産物に対するＤＮＡ配列を細胞に導入することが可能である独特な構築物に、多くのヌクレオチド配列が接続または組換えられている。
【００２５】
用語「作動可能に連結される」は、一方の機能が他方によって影響されるような、単一の核酸フラグメントに対する核酸配列の会合を指す。例えば、プロモーターは、それがコード配列の発現に影響を及ぼすことが可能である場合、コード配列に作動可能に連結される（即ち、コード配列はプロモーターの転写制御下にある）。コード配列は、センスまたはアンチセンス配向で調節配列に作動可能に連結され得る。
【００２６】
用語「選択マーカー」は、同定因子、通常、マーカー遺伝子の効果、即ち、抗生物質に対する耐性に基づいて選択することが可能な抗生物質または化学耐性遺伝子を意味し、ここで、効果は、目的の核酸の遺伝を追跡する、および／または目的の核酸を受け継いでいる細胞もしくは生物体を同定するために使用される。
【００２７】
用語「異種の」は、注目の位置において天然では見出されないことを意味する。例えば、異種遺伝子は、宿主生物体内において天然では見出されないが、遺伝子導入により宿主生物体内に導入される遺伝子を指す。例えば、キメラ遺伝子に存在する異種核酸分子は、天然では相互に関連しないコード領域およびプロモーターセグメントを有する核酸分子のような、キメラ遺伝子の他方のセグメントと関連することが天然では見出されない核酸分子である。
【００２８】
本明細書において、「単離された核酸分子」は、場合により、合成、非天然もしくは改変されたヌクレオチド塩基を含有していてもよい一本鎖または二本鎖であるＲＮＡあるいはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡのポリマーの形態の単離された核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つもしくはそれ以上のセグメントからなり得る。
【００２９】
用語「Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター」および「ＺｍＰｇａｐ」は、天然では、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムにおいてグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼコード領域の上流に存在するヌクレオチド配列を有するプロモーター活性を伴う核酸分子を指す。これらの用語は、ＣＰ４株およびＺＭ４株のようなＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の株のプロモーター（それぞれ、配列番号１および２）、ならびにｐＺＢ４のＺｍＰｇａｐ（配列番号３）のような、実質的に異ならないレベルでの発現を指令する配列および／または長さが異なる変種を指す。
【００３０】
ここで使用した標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野において周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９（以後、「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；ならびにＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８４；ならびにＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅにより出版、１９８７に記載されている。
【００３１】
改善されたグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターの発見
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＺｍＰｇａｐまたはＰｇａｐ）の天然のプロモーターは、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）およびザイモバクター・パルメ（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ ｐａｌｍａｅ）におけるキメラ遺伝子の発現に使用されている。キシロース代謝のための遺伝子を発現させるためにＺｍＰｇａｐを使用した場合、得られるキシロース資化は、典型的には所望されるほど効果的でなかった。さらに、限定的なキシロース資化能力を有する４つのキシロース代謝酵素（キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスケトラーゼ、およびトランスアルドラーゼ）を発現するように操作された組換えＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株が、改善されたキシロース資化のためキシロース培地に対して適応された（同一出願人が所有しかつ同時係属中の米国特許出願公開第２００８０２８６８７０号明細書に記載されている）。
【００３２】
出願人らは、本明細書において実施例３に記載のように、ＺＷ６５８（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７８５８）と呼ばれる改善されたキシロース資化株が、ＺｍＰｇａｐから発現されるオペロン（ＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロン）としてゲノムに組み込まれたキシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼ酵素の発現を増加することを発見した。出願人らは、作動可能に連結されたコード領域の発現の増加を指令するプロモーターを担うＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンのプロモーターに新規の１つのヌクレオチド変化が存在することをさらに発見した。ヌクレオチド変化は、キシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼ活性の増加を有さなかったＺＷ６５８に対する前駆体株におけるＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンのＺｍＰｇａｐの配列と比較して、株ＺＷ６５８におけるＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンのＰｇａｐの配列において新規のものである。それ故、この１つのヌクレオチド変化を有するＰｇａｐは、改善されたプロモーターである。
【００３３】
出願人らは、さらに、４つのキシロース資化酵素をコードする遺伝子で個別に操作し、そして改善されたキシロース資化について個別に適応されたＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株（米国特許第７，２２３，５７５号明細書に記載の株８ｂ）もまた、ＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンとしてゲノムに組み込まれたキシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼ酵素の発現を増加することを発見した。出願人らは、ＺＷ６５８ Ｐｇａｐのヌクレオチド変化とは異なる位置にある８ｂ株におけるＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンのＰｇａｐの新規の１つのヌクレオチド変化が存在することをさらに発見した。ＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンによってコードされるキシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼ酵素の発現の増加に基づいて、ＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンの変異Ｐｇａｐもまた、改善されたプロモーターを提供する。
【００３４】
ＺＷ６５８および８ｂ株ＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンのＰｇａｐにおいて新たに同定されたヌクレオチド変化は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＣＰ４株およびＺＭ４株におけるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの天然のＡＴＧ翻訳開始コドンに対してそれぞれ、−１９０および−８９位に存在する。発見した−１９０位のヌクレオチド変化はＧからＴへの変化であり、そして発見した−８９位のヌクレオチド変化はＣからＴへの変化である。
【００３５】
位置番号は配列の変動によって変化し得るため、塩基の変化の配列構成は重要な因子である。
【００３６】
−１９０位置は、配列構成：
における位置である。
太字および下線を付したＧは、変異によってＴに変化する塩基である。この位置は、ＣＰ４株およびＺＭ４株のＺｍＰｇａｐ配列においては−１９０位であるが、ｐＺＢ４中のプロモーター配列では−２１位のＴが欠失しているため、ｐＺＢ４においては−１８９位である。
【００３７】
−８９位置は、配列構成：
における位置である。
太字および下線を付したＣは、変異によってＴに変化する塩基である。この位置は、ＣＰ４株およびＺＭ４株のＺｍＰｇａｐ配列においては−８９位であるが、ｐＺＢ４中のプロモーター配列では−２１位のＴが欠失しているため、ｐＺＢ４においては−８８位である。本発明のプロモーターは、−１９０位、−８９位、またはこれらの位置の両方においてＺｍＰｇａｐのヌクレオチド変化を有する。好ましくは、変化は、−１９０位におけるＧからＴへの変化であり、そして−８９位におけるＣからＴへの変化である。これらの改変を含む本発明のプロモーターは、改善されたＰｇａｐｓである。
【００３８】
−１９０位および−８９位における他のヌクレオチドへの変化は、ＺｍＰｇａｐの改善された活性を提供し得る。加えて、ＺｍＰｇａｐ内の他の位置におけるヌクレオチド変化も、プロモーターの改善された活性を提供し得る。
【００３９】
ＺｍＰｇａｐの天然に存在する配列は単一の配列ではなく、プロモーターの機能に対して実質的な影響を及ぼさないいくつかの変動を配列内に有していることがある。プロモーターの機能に対して実質的な影響を及ぼさないとは、プロモーター配列が、天然のザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）株に存在するＺｍＰｇａｐによって指令される発現のレベルと実質的に同様の発現レベルを指令することを意味する。配列の変動は、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの天然のＡＴＧ翻訳開始コドンに対する−２９位のＣＰ４株およびＺＭ４株（それぞれ、配列番号１および２）（ここで、ＣＰ４ではＡが存在し、そしてＺＭ４ではＧが存在する）の間の差異のように、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）の異なる単離体または株の間で自然に発生し得る。
【００４０】
天然に存在する配列の変動に加えて、機能に実質的に影響を及ぼさないヌクレオチド変化が、当業者に公知のＰＣＲ、クローニング、形質転換、および株増殖を含む日常的な操作手順の間に発生し得る。例には、−２１位においてＴの欠失を有するｐＺＢ４のＺｍＰｇａｐがある。
【００４１】
プロモーターの機能に実質的に影響を及ぼさない、異なる天然の株または操作された株において生じるＺｍＰｇａｐ配列の任意のヌクレオチド変化は、ｐＺＢ４のＺｍＰｇａｐに存在する−２１位後方のＴの欠失（配列番号３）のようなＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターの配列に存在し得る。それ故、プロモーターの機能に影響を及ぼす、即ち、実質的にプロモーターの機能を改善する上記の−１９０位および−８９位における変異は、実質的に同様の活性（天然のレベル）を伴うＺｍＰｇａｐ配列のいずれかにおいて作製してもよく、そして機能に影響を及ぼさない変動と共に同時に発生することができる。
【００４２】
−１９０位および／または−８９位において記載の変異を伴う改善されたＰｇａｐ変異配列の例として、株ＺＷ６５８由来のプロモーター配列（配列番号４）、株８ｂ由来のプロモーター配列（配列番号５）、およびｐＺＢ４由来である同じＺｍＰｇａｐ変異体の二重変異（配列番号６）が挙げられる。改善されたＰｇａｐ配列のさらなる例には、ＣＰ４由来のＺｍＰｇａｐ変種における−１９０位の変異、−８９位の変異、または二重変異（それぞれ、配列番号７、８、および９）ならびにＺＭ４由来のＺｍＰｇａｐ変種における−１９０位の変異、−８９位の変異、または二重変異（それぞれ、配列番号１０、１１、および１２）がある。
【００４３】
加えて、プロモーターの機能に実質的に影響を及ぼさないＺｍＰｇａｐの長さの変動も生じる。本発明は、−１９０位の変異および／または−８９の変異が追加される前の活性に実質的な変化を有さない、様々な長さのＺｍＰｇａｐにＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＣＰ４株およびＺＭ４株におけるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの天然のＡＴＧ翻訳開始コドンに対して、−１９０位および／または−８９位に記載の変異を有する改善されたＰｇａｐを含む。
【００４４】
改善されたＰｇａｐの調製
−１９０位および／または−８９位における記載の変異は、当業者に公知に任意の方法によってＺｍＰｇａｐ核酸分子に導入してもよい。例えば、変異および周囲のＤＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、そしてより大きなプロモーターＤＮＡフラグメントにクローニングして、変異を伴わないセグメントと置換してもよい。変異およびいくつかの隣接するプロモーター配列を含有するプライマーを、合成し、そしてＰＣＲに使用して、プロモーターフラグメントを調製してもよい。全プロモーターＤＮＡフラグメントを、共にライゲートされる複数のオリゴヌクレオチドとして合成してもよい。部位特異的変異誘発を使用して、変異を導入してもよい。加えて、ＺＷ６５８株または８ｂ株由来のＤＮＡをテンプレートして使用して、ＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントとして変異プロモーターを調製してもよい。
【００４５】
キメラ遺伝子およびベクターにおける改善されたＰｇａｐ、細菌細胞への導入
本発明のプロモーターを、細菌細胞中で発現させようとする異種核酸分子（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｎｕｃｌｅｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）に作動可能に連結し、本発明のキメラ核酸分子、またはキメラ遺伝子を形成する。キメラ遺伝子の設計および構築は、当業者に周知である。キメラ遺伝子は、典型的にはプロモーター、発現させようとする異種核酸分子、および３’末端制御領域を含む。末端制御領域は様々な遺伝子に由来してよく、そしてしばしば、標的宿主細胞に生来備わる遺伝子から採取される。作動可能に連結された異種核酸分子は、細菌細胞においてその発現が所望されるいずれの核酸分子であってもよく、例えば、タンパク質またはペプチドのためのコード領域、または機能的ＲＮＡの発現のための核酸を含む。機能的ＲＮＡとして、例えば、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、および干渉ＲＮＡが挙げられる。さらに、本明細書に記載のプロモーター、およびプロモーターから発現される複数のコード領域を含むオペロンを構築してもよい。
【００４６】
本明細書に記載のプロモーターは、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）に属する細菌における発現のためのキメラ遺伝子において使用することができる。キメラ遺伝子は、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）の産物の産生に関与する任意のタンパク質の発現のために使用することができる。例えば、アラニンのようなアミノ酸またはソルビトールもしくはキシリトールの合成に関与する１つもしくはそれ以上の酵素をこれらのプロモーターを有するキメラ遺伝子から発現させることができる。キメラ遺伝子は、キシロースを資化しない天然のザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）もしくはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）株において発現させることができ、またはキシロース資化株において発現させることもできる。また、本明細書に記載のプロモーターは、キシロース代謝または別の代謝経路に関連する酵素の発現に使用することができる。
【００４７】
本明細書に記載のキメラ遺伝子は、さらなる操作のために、典型的にはベクター中に構築されるかまたはベクターにトランスファーされる。ベクターは当該技術分野において周知である。ある種のベクターは広範な宿主細菌において複製することが可能であり、そして接合によってトランスファーすることができる。ｐＲＫ４０４ならびに３つの関連ベクター：ｐＲＫ４３７、ｐＲＫ４４２、およびｐＲＫ４４２（Ｈ）の完全かつ注釈付き配列が利用可能である。これらの誘導体はグラム陰性菌における遺伝子操作のための価値のあるツールであることが証明されている（Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ ５０（１）：７４−７９（２００３））。
【００４８】
他の周知のベクターを様々な標的宿主細胞に使用してもよい。異なる宿主に有用なベクターの例が、同一出願人が所有しかつ同時係属中の米国特許出願公開第２００７００９２９５７Ａ１号明細書、１１〜１３頁（本明細書において参照として援用される）に記載されている。米国特許第５，５１４，５８３号明細書に記載のｐＺＢ１８８のような大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の両方において複製することができるベクターが、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）における発現に特に有用である。ベクターとして、細胞における自律複製のためのプラスミド、および細菌のゲノムに組み込もうとする構築物を担持するプラスミドを挙げることができる。ＤＮＡ組み込みのためのプラスミドとして、トランスポゾン、標的細菌ゲノムに対して相同の核酸配列の領域、または組み込みを支持する他の配列を挙げることができる。さらなるタイプのベクターは、例えば、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）から市販されているシステムを使用して、産生されるトランスポゾンであってもよい。所望される標的宿主および所望される機能のための適切なベクターを選択するための仕方は周知である。
【００４９】
本明細書に記載のプロモーターはまた、発現のために作動可能に連結された核酸分子を有しないベクター中で構築し、内因性コード領域の隣に組み込んで細菌ゲノム中の内因性プロモーターと置き換えるか、または例えばオペロン内のコード領域にプロモーターを付加してもよい。染色体上でのプロモーターの置き換えは、Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ（Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．（２００６）８：７９−９０）、およびＷｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．（Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００７）５３：５６−６２）に記載のような方法を使用して、達成してもよい。
【００５０】
本明細書に記載のプロモーターを含むベクターを、周知の方法、例えば、凍結融解形質転換、カルシウム仲介形質転換、エレクトロポレーション、または接合を使用して、細菌細胞に導入することができる。
【００５１】
改善されたＰｇａｐを使用する異種核酸分子の発現
本明細書に記載の改善されたＰｇａｐを使用して、増加したレベルのキメラ遺伝子発現を得ることができる。改善されたＰｇａｐおよびキシロースイソメラーゼコード領域を含む、ゲノムに組み込まれた構築キメラ遺伝子が実施例８に示されており、これによりキシロース代謝のためのタンパク質をコードする遺伝子を発現するように操作されたＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞のキシロース培地における改善された増殖が可能となった。キシロース上での改善された増殖を実施例３および１０に示した。これはキシロースイソメラーゼ活性およびキシルロキナーゼ活性のより高いレベルの発現に関連している。キシロース上でのより良好な増殖に適応され、そしてキシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼの発現を指令する改善されたＰｇａｐを有するキシロース資化Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の株は、キシロース資化が改善された。キシロースイソメラーゼ活性およびキシルロキナーゼ活性は、キシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼの発現を指令する改善されたＰｇａｐを持たない株より約４〜５倍高かった。
【００５２】
本発明の改善されたＰｇａｐを含有し、安定なプラスミド上に位置するキメラ遺伝子の増加したレベルの発現も本明細書の実施例９に示した。リボース５−リン酸イソメラーゼ（ＲＰＩ）をコードする異種配列に作動可能に連結された改善されたＰｇａｐを有するキメラ遺伝子は、ＺｍＰｇａｐを含有するキメラ遺伝子から産生される量と比較して、より多量のＲＰＩタンパク質を産生した。
【実施例】
【００５３】
本実施例は、本明細書に記載の本発明を例示する。
【００５４】
一般的方法
ここで使用した標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野において周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ，第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８９）（以後、「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；ならびにＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．，ａｎｄ Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）；ならびにＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅにより出版、Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ（１９８７）に記載されている。
【００５５】
略語の意味は次のとおりである：「ｋｂ」はキロベースを意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｎｔ」はヌクレオチドを意味し、「ｈｒ」は時間を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍｌ」はミリリットルを意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｍＭ」はミリモルを意味し、「μＭ」はマイクロモルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモルを意味し、「ｐｍｏｌ」はピコモルを意味し、「Ｃｍ」はクロラムフェニコールを意味し、「Ｃｍr」はクロラムフェニコール耐性を意味し、「Ｃｍs」はクロラムフェニコール感受性を意味し、「Ｓｐr」はスペクチノマイシン耐性を意味し、「Ｓｐs」はスペクチノマイシン感受性を意味し、「ＸＩ」はキシロースイソメラーゼであり、「ＸＫ」はキシルロキナーゼであり、「ＴＡＬ」はトランスアルドラーゼであり、「ＴＫＴ」はトランスケトラーゼであり、「ＥＦＴ」は発酵経過時間を意味し、「ＲＭ」は１０ｇ／Ｌの酵母抽出物＋２ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4を含有するリッチ培地を意味し、「ＭＭ」は１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、５ｇ／Ｌのトリプトン、２．５ｇ／Ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4および０．２ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4を含有する接合培地（ｍａｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）を意味する。
【００５６】
酵素アッセイのためのザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の無細胞抽出物の調製
細胞を、５０ｍｌのＲＭ＋２％グルコース中、３０℃で１晩、１．０〜１．２のＯＤ600まで増殖させた。細胞を４５００ｒｐｍで１０分間、４℃にて遠心分離により回収した。上清を廃棄し、細胞ペレットを２５ｍｌ氷冷音波処理用緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．６、１０ｍＭのＭｇＣｌ2）で洗浄し、続いて、４５００ｒｐｍで１０分間、遠心分離を行った。ペレットを２．０〜２．５ｍｌ音波処理用緩衝液＋１ｍＭジチオスレイトールに再懸濁した。５００μＬアリコートを、１分間、エッペンドルフ遠心管中、４℃で遠心分離した。上清のほとんどを廃棄し、約１０〜２０μＬを残してペレットの乾燥を防止した。細胞を凍結し、アッセイを行うまで約８０℃で貯蔵した。アッセイの前に細胞を融解し、そして５００μＬの音波処理用緩衝液＋１ｍＭジチオスレイトールで再懸濁した。混合物を、Ｂｒａｎｓｏｎ ｓｏｎｉｆｉｅｒ ４５０を使用して、４５秒間、６２％デューティサイクルおよび２の出力制御関数で、２回音波処理し、各音波処理の間に、約３〜５分間、サンプルを冷却した。サンプルを１４，０００ｒｐｍで６０分間、Ｂｅｃｋｍａｎ微量遠心機中、４℃で遠心分離した。上清を新しい試験管に移し、４℃で保持した。タンパク質濃度を決定するためにピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）ＢＣＡアッセイを使用した。
【００５７】
この酵素が他の酵素要素より不安定であるため、通常、最初にトランスケトラーゼ（ＴＫＴ）アッセイを実施した。ＴＫＴアッセイの概念図を図１Ａに示す。
【００５８】
マイクロプレートアッセイでは、２０μＬの無細胞抽出物を次の最終濃度の成分を含んだ反応混合物の各ウェルに３０℃で添加した：０．３７ｍＭのＮＡＤＰ、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ７．５、８．４ｍＭのＭｇＣｌ2、０．１ｍＭのＴＰＰ（（チアミン塩化ピロリン酸）、０．６ｍＭのＥ４Ｐ（エリトロース−４−リン酸）、４ｍＭのＢＨＰ（βヒドロキシピルビン酸）、４Ｕ／ｍｌのＰＧＩ（ホスホグルコースイソメラーゼ）、および４Ｕ／ｍｌのＧ６ＰＤ（グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）。Ａ340を、３〜５分間、プレートリーダー上で読み取った。ＴＫＴ活性を以下のとおりに算出した：
１単位は、３０℃における１μｍｏｌのＤ−フルクトース６−リン酸／分の形成に対応する。
Ｕ（μモル／分）＝勾配（ｄＡ340／分）＊反応物の体積（μＬ）／６２２０／０．５５ｃｍ
（ＮＡＤＰ→ＮＡＤＰＨのモルは１ｃｍキュベットにおける１Ｌあたり１モルあたり６２２０ Ａ340である）
（マイクロプレートにおける１ウェルあたり２００μＬの路長＝０．５５ｃｍ）
比活性（μモル／分−ｍｇ）＝μモル／分／タンパク質濃度（ｍｇ）
【００５９】
トランスアルドラーゼ（ＴＡＬ）アッセイの基礎を図１Ｂに示す。マイクロプレートアッセイでは、２０μＬの無細胞抽出物を次の最終濃度の成分を含んだ反応混合物の各ウェルに３０℃で添加した：０．３８ｍＭのＮＡＤＨ、８７ｍＭトリエタノールアミン、１７ｍＭのＥＤＴＡ、３３ｍＭのＦ６Ｐ（フルクトース−６−リン酸）、１．２ｍＭのＥ４Ｐ（エリトロース−４−リン酸）、２．０Ｕ／ｍｌのＧＤＨ（グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）、および２０Ｕ／ｍｌのＴＰＩ（トリオースリン酸イソメラーゼ）。プレートを５分間、インキュベートし、次いで、Ａ340を３〜５分間、読み取った。ＴＡＬ活性を以下のとおりに算出した：
１単位は、３０℃における１分間あたりの１μｍｏｌのＤ−グリセルアルデヒドの形成に対応する。
Ｕ（μモル／分）＝勾配（ｄＡ340／分）＊反応物の体積（μＬ）／６２２０／０．５５ｃｍ
（ＮＡＤＨ→ＮＡＤのモルは１ｃｍキュベットにおける１Ｌあたり１モルあたり６２２０ Ａ340である）
（マイクロプレートにおける１ウェルあたり２００μＬの路長＝０．５５ｃｍ）
比活性（μモル／分−ｍｇ）＝μモル／分／タンパク
【００６０】
キシロースイソメラーゼ（ＸＩ）アッセイの基礎を図１Ｃに示す。マイクロプレートアッセイでは、２０μＬの無細胞抽出物を、次の最終濃度の成分を含んだ反応混合物の各ウェルに３０℃で添加した：０．２５６ｍＭのＮＡＤＨ、５０ｍＭキシロース、１０ｍＭのＭｇＳＯ4、１０ｍＭトリエタノールアミン、および１Ｕ／ｍｌのＳＤＨ（ソルビトールデヒドロゲナーゼ）。Ａ340を、３〜５分間、プレートリーダー上で読み取った。ＸＩ活性を以下のとおりに算出した：
１単位のＸＩは、３０℃における１分間あたりの１μモルのＤ−キシルロースの形成に対応する。
Ｕ（μモル／分）＝勾配（ｄＡ340／分）＊反応物の体積（μＬ）／６２２０／０．５５ｃｍ
（ＮＡＤＨＰ→ＮＡＤのモルは１ｃｍキュベットにおける１Ｌあたり１モルあたり６２２０ Ａ340である）
（マイクロプレートにおける１ウェルあたり２００μＬの路長＝０．５５ｃｍ）
比活性（μモル／分−ｍｇ）＝μモル／分／タンパク質濃度（ｍｇ）
【００６１】
キシルロキナーゼ（ＸＫ）アッセイの基礎を図１Ｄに示す。
マイクロプレートアッセイでは、２０μＬの無細胞抽出物を次の最終濃度の成分を含んだ反応混合物の各ウェルに３０℃で添加した：０．２ｍＭのＮＡＤＨ、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ７．５、２．０ｍｍのＭｇＣｌ2−６Ｈ2Ｏ、２．０ＭのＡＴＰ、０．２ＭのＰＥＰ（ホスホエノールピルビン酸）、８．５ｍＭのＤ−キシルロース、５Ｕ／ｍｌのＰＫ（ピルビン酸キナーゼ）、および５Ｕ／ｍｌのＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）。Ａ340を、３〜５分間、プレートリーダー上で読み取った。ＸＩ活性を以下のとおりに算出した：
１単位は、３０℃における１分間あたりの１μモルのＤ−キシルロースからＤ−キシルロース−５−リン酸への形成に対応する。
Ｕ（μモル／分）＝勾配（ｄＡ340／分）＊反応物の体積（μＬ）／６２２０／０．５５ｃｍ
（ＮＡＤＨ→ＮＡＤのモルは１ｃｍキュベットにおける１Ｌあたり１モルあたり６２２０ Ａ340である）
（マイクロプレートにおける１ウェルあたり２００μＬの路長＝０．５５ｃｍ）
比活性（μモル／分−ｍｇ）＝μモル／分／タンパク質濃度（ｍｇ）
【００６２】
ＨＰＬＣ方法
分析は、ＬＣ ３ＤのＡｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズＨＰＬＣおよびＡｇｉｌｅｎｔ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアで行った。カラムは、ＢｉｏＲａｄ Ｍｉｃｒｏ−Ｇｕａｒｄ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ Ｃａｔｉｏｎ−Ｈ（１２５−０１２９）を伴うＢｉｏＲａｄ Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈ（ＨＰＬＣ Ｏｒｇａｎｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｃｏｌｕｍｎ １２５−０１４０）であった。操作条件は以下のとおりであった：
【００６３】
【００６４】
実施例１
キシロース発酵性ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）株の構築
同一出願人が所有しかつ同時係属中の米国特許出願公開第２００８０２８６８７０号明細書に記載のように、キシロース発酵性ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）の株を、連続的な転位事象を介して、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼをコードする４つのキシロース資化遺伝子を含有する２つのオペロン、ＰｇａｐｘｙｌＡＢおよびＰｇａｐｔａｌｔｋｔをＺＷ１（ＡＴＣＣ番号３１８２１）のゲノムに組み込むことによって構築し、続いて、キシロースを含有する選択培地に適応した。以前に、米国特許出願公開第２００３０１６２２７１号明細書に記載の８ｂと呼ばれるキシロースを発酵させるザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）株を、相同組換えおよびトランスポゾンアプローチの組み合わせを介して、選択抗生物質マーカーと共に２つのオペロンＰｇａｐｘｙｌＡｘｙｌＢおよびＰｅｎｏｔａｌｔｋｔをザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）５Ｃのゲノムに組み込むことによって構築し、続いて、適応およびＮＴＧ変異誘導を行った。新たな株の調製では、部位特異的相同組換えとは対照的に、転位（ＥｐｉｃｅｎｔｒｅのＥＺ：：Ｔｎインビトロ転位システム）を（このアプローチが利点として組み込み部位の複数の選択肢および比較的高い挿入頻度を付与するので）使用した。組み込みのため、キシロース資化酵素をコードする４つの遺伝子を２つの個別のオペロン：ＰｇａｐｘｙｌＡＢおよびＰｇａｐｔａｌｔｋｔとして配置してクローニングした。２つのＰ１ファージＣｒｅリコンビナーゼ認識配列（ｌｏｘＰ）によってフランキングされる抗生物質耐性マーカー、クロラムフェニコール耐性（Ｃｍr）遺伝子を組み込み体の選択のために各オペロンに付加した。２つのオペロンの組み込みは２段階の連続様式により達成した：Ｐｇａｐｔａｌｔｋｔ、続いて、ＰｇａｐｘｙｌＡＢ。Ｃｍ耐性選択を両方の組み込みにおいて使用した。プラスミド上のＣｒｅリコンビナーゼを発現させ、各組み込み後にプラスミドのキュアリングを行うことによって除去されるからである。このプロセスにより、選択のために同じ抗生物質マーカーを複数回使用することが可能であった。さらに重要なことに、これによりオペロンの組み込みの選択のために導入される抗生物質マーカーの除去が可能であった。このプロセスにより商業的用途のための発酵株に対する抗生物質耐性遺伝子のネガティブな影響が排除された。
【００６５】
転位のためのｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍの構築
米国特許出願公開第２００３０１６２２７１号明細書（その明細書の実施例９）に記載のように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のトランスケトラーゼ（ｔｋｔ）コード領域を含有する２．２ｋｂのＤＮＡフラグメントを、ＢｇｌＩＩ／ＸｂａＩ消化によってｐＵＣｔａｌｔｋｔ（米国特許出願公開第２００３０１６２２７１号明細書）から単離し、そしてＢａｍＨＩ／ＸｂａＩで消化したｐＭＯＤ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）ベクターにクローニングし、ｐＭＯＤｔｋｔを得た。ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）ｇａｐ（Ｐｇａｐ；グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）遺伝子のプロモーター領域を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）トランスアルドラーゼのコード領域（ｔａｌ）に次のとおりに融合することによって、Ｐｇａｐｔａｌと命名されるＰＣＲフラグメントを作製した。配列番号１３および１４のプライマーを使用して、Ｐｇａｐフラグメント（その構築については米国特許第５５１４５８３号明細書（実施例３）に記載されている）をｐＺＢ４から増幅した。ｐＺＢ４は、Ｐｇａｐ−ｘｙｌＡ／ｘｙｌＢオペロンおよびＰｅｎｏ−ｔａｌ／ｔｋｔオペロンを含有する。配列番号１５および１６のプライマーを使用して、ｔａｌコード領域フラグメントを、ｐＺＢ４から増幅した。テンプレートとしてＰｇａｐおよびｔａｌフラグメントを使用し、配列番号１７および１８のプライマーを使用して、Ｐｇａｐｔａｌフラグメントを増幅した。このフラグメントをＸｂａＩで消化し、そしてｔｋｔコード領域の上流のプラスミドｐＭＯＤｔｋｔにクローニングした。Ｃｍｌｏｘ（Ｆ，ｓｆｉ）およびＣｍｌｏｘ（Ｒ，ｓｆｉ）プライマー（配列番号１９および２０）ならびにテンプレートとしてｐＺＢ１８６を使用するＰＣＲによって、ｌｏｘＰ：：Ｃｍフラグメントを作製した。ｐＺＢ１８６は、生来のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）プラスミド、ならびに米国特許第５１４５８３号明細書（実施例３）およびＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６７：２４０−２４３）に記載のｐＡＣＹＣ１８４の組み合わせである。最後に、ｌｏｘＰ：：ＣｍＰＣＲフラグメントを、Ｐｇａｐｔａｌｔｋｔを含有するプラスミドのＳｆｉＩ部位に挿入し、組み込みプラスミドｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍを形成させた。このプラスミドでは、Ｐｇａｐｔａｌｔｋｔ ｌｏｘＰ：：Ｃｍフラグメントを、ｐＭＯＤベクターの２つのモザイク末端（ｍｏｓａｉｃ ｅｎｄ）（トランスポザーゼ結合部位）の間に挿入した。ｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍプラスミドの完全なヌクレオチド配列を、配列番号２１として示す。
【００６６】
ＺＷ１におけるｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍの転位および形質転換
プラスミドｐＭＯＤはｐＵＣに基づくベクターであり、従って、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）における非複製ベクターである。プラスミドｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍを、Ｍｇ2+の存在下、室温で１時間、トランスポザーゼで処置し、そして（２００オーム、２５μＦおよび１６ｋＶ／ｃｍに設定したＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒを使用する）エレクトロポレーションによって、ＺＷ１細胞を形質転換するために使用した。エレクトロポレートした細胞を、５０ｇ／Ｌグルコースおよび１ｍＭのＭｇＳＯ4を補充した１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／Ｌトリプトン、２．５ｇ／Ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．２ｇ／ＬのＫ2ＨＰＯ4）からなる接合培地（ｍａｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）（ＭＭ）中、６時間、３０℃でインキュベートした。形質転換混合物を、５０ｇ／Ｌグルコースおよび１２０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを補充したＭＭ中に１５ｇ／ＬのＢａｃｔｏ寒天を含有する寒天プレート上にプレーティングし、そして３０℃で嫌気的にインキュベートした。約２日間後、形質転換体が目視で認められた。形質転換／転位頻度は、約３×１０1／μｇのＤＮＡであった。
【００６７】
合計で３９個のＣｍr形質転換体コロニーを得た。２１個のコロニーを拾い出し、そしてＰＣＲおよび酵素活性アッセイによってさらに分析した。プライマー配列番号２２および２３を使用するＰＣＲにより、形質転換体におけるｔａｌおよびｔｋｔコード領域を含有する３ｋｂのＤＮＡフラグメントの存在を確認した。２１個の組換え体コロニー由来のプラスミドＤＮＡによる戻し形質転換により、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において戻し形質転換体が作製されなかったことから、ｔａｌおよびｔｋｔは、ＺＷ１のゲノムに組み込まれたことが示唆された。マイクロプレート用に改変したプロトコル（一般的方法）を使用して、これらの組み込み体をトランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼ活性について試験した。ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）ＢＣＡタンパク質アッセイをタンパク質濃度の決定するために使用した。形質転換体を、１２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）を補充した２％（ｗ／ｖ）グルコースを含有するＲＭ培地中、５０ｍｌ円錐遠心管において３０℃で増殖させた。酵素アッセイではコントロール株８ｂおよびＺＷ１も増殖させた（ＺＷ１ではＲＭ＋２％グルコースを使用した）。ＯＤ600が１．０に到達したときに細胞を回収した。細胞を１回洗浄し、そして音波処理用緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６および１０ｍＭのＭｇＣｌ2）に再懸濁した。米国特許出願公開第２００３０１６２２７１号明細書に記載のように、酵素アッセイを行った。単位はμモル／分−ｍｇとして示される。１つを除いて、すべてのサンプルはトランスアルドラーゼ活性およびトランスケトラーゼ活性を有した。
【００６８】
ｔｋｔプローブを使用して、ＰｓｔＩで消化した選択された組み込み体のゲノムＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡに対し、サザンハイブリダイゼーションを実施した。ＺＷ１ ＤＮＡはｔｋｔプローブとはハイブリダイズしなかった。すべての組み込み体ゲノムＤＮＡサンプルにおいて、共通の１．５ｋｂのバンドが認められたが、これは、ｔｋｔ中のＰｓｔＩ部位とｔａｌ中のＰｓｔＩ部位との間において予想されるＤＮＡフラグメントである。第２の認められる高分子量（６ｋｂもしくはそれ以上）のバンドは、独立した系統Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４およびＴ５の間で固有であり、各系統における別個のゲノム組み込み部位を示した。興味深いことに、Ｔ５のプラスミドＤＮＡおよびゲノムＤＮＡの両方ともｔｋｔプローブとハイブリダイズし、ＰｇａｐｔａｌｔｋｔはＴ５において生来のプラスミド上でも組み込まれた可能性があることを示した。Ｃｍrマーカーを除去するためのさらなるＣｒｅ処置のために、これらの４つの株（Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４およびＴ５）を選択した。
【００６９】
ｔａｌｔｋｔ組み込み体からＣｍrマーカーを取り出すためのＣｒｅ処理
染色体からＣｍrマーカーを除去するため、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４およびＴ５をｐＺＢ１８８／Ｓｐｅｃ−Ｃｒｅで形質転換した。このプラスミドは、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現カセットを含有するザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シャトルベクターｐＺＢ１８８［Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６７：２４０−２４３；米国特許第５５１４５８３号明細書］の誘導体である。ｐＺＢ１８８／Ｓｐｅｃ−Ｃｒｅは、それがカナマイシン−耐性遺伝子の代わりにスペクチノマイシン−耐性遺伝子を有することを除いて、実施例１０に記載されているＣｒｅ発現ベクター（ｐＺＢ１８８／Ｋａｎ−Ｃｒｅ）と同一である。２％グルコースおよび２００μｇ／ｍｌスペクチノマイシン）を補充したＭＭ寒天プレート上で、形質転換体を選択した。Ｓｐr耐性コロニーを拾い出して、２％グルコースおよび２００μｇ／ｍｌスペクチノマイシンを補充したＲＭ寒天プレートおよび２％グルコースおよび１２０μｇ／ｍＬのＣｍを補充したＲＭ寒天プレート上に移した。採取したコロニーの１００％がＣｍsであったことから、ＣｒｅによるＣｍrの高い効率の切り出しが示された。ＳｐrＣｍs形質転換体を、ＲＭ＋２％グルコースにおいて、３７℃、２〜５回の連日継代で培養し、ｐＺＢ１８８ａａｄＡＣｒｅＦをキュアリングした。各継代時に、細胞を希釈し、そして拾い出して、２００μｇ／ｍＬのＳｐを伴うまたは伴わない同じ培地のさらなるプレートに移すために、ＲＭ＋２％グルコース寒天プレート上にプレーティングした。ＰＣＲによってＳｐsコロニーを分析して、ｐＺＢ１８８ａａｄＡＣｒｅＦの消失を確認した。組み込み体のプラスミドがキュアリングされた子孫を、Ｔ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４ＣおよびＴ５Ｃと命名した。これらの転位組み込み体が安定であるかどうかを調べるために、これらの４つの株を、ＲＭ＋２％グルコースにおいて増殖させ、次いで、１０ｍｌの同じ培地に移し、そして３７℃で、２回反復測定の試験管において増殖させた。細胞を、１０日間連日、または約１００代まで継代した。１代および１０代継代後、コロニーを希釈し、そしてコロニー単離のためにＲＭＧプレート上にプレーティングした。試験した各株の各継代由来の１２個のコロニーが、５’Ｐｇａｐおよび３’ｔｋｔプライマー（配列番号１３および２３）を使用するコロニーＰＣＲによるＰｇａｐｔａｌｔｋｔの存在についてポジティブであった。トランスアルドラーゼ活性およびトランスケトラーゼ活性もまた、（一般的方法に記載のとおりに）１代および１０代の継代後の単離体について測定した。４つのすべての組み込み体は、非選択的倍地上の１００代目後もＴＡＬ活性およびＴＫＴ活性の両方について同様のレベルを有したことから、これらの組み込み体が遺伝的に安定であることが示唆された。
【００７０】
転位のためのｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍの構築
次の工程は、ＺＷ１：：Ｐｇａｐｔａｌｔｋｔ組み込み体（Ｔ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４ＣおよびＴ５Ｃ）にＰｇａｐｘｙｌＡＢ ｌｏｘＰ：：Ｃｍオペロンをさらに組み込むことであった。プラスミドｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍ（上記）に基づいて、組み込みプラスミドｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍを構築した。ＳａｃＩ／ＳｆｉＩ消化によってＰｇａｐｔａｌｔｋｔＤＮＡフラグメントを取り出した。ＳａｃＩ、ＮｏｔＩ、およびＳｆｉＩ制限部位を含有するアダプターフラグメントを、ライゲーションによって導入した。次いで、ｐＺＢ４（米国特許第５５１４５８３号明細書）から単離したＰｇａｐｘｙｌＡＢのＮｏｔＩフラグメントを、アダプターのＮｏｔＩ部位にクローニングした。キシロースイソメラーゼ（ＸＩ）はｘｙｌＡによってコードされ、そしてキシルロキナーゼ（ＸＫ）はｘｙｌＢによってコードされる。ｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍプラスミドの完全なヌクレオチド配列を、配列番号２４として示す。
【００７１】
Ｔ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４ＣおよびＴ５ＣにおけるｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍの転位および形質転換
ＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍの組み込みと同様のアプローチを使用して、Ｔ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４ＣおよびＴ５Ｃを、トランスポザーゼで処置したｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍ（上記）で形質転換／転位した。Ｃｍ選択後の２回の形質転換／転位実験で、６つの組み込み体（Ｔ３ＣＣｍＸ１、Ｔ３ＣＣｍＸ２、Ｔ３ＣＣｍＸ３、Ｔ４ＣＣｍＸ１、Ｔ５ＣＣｍＸ１、Ｔ５ＣＣｍＸ２）を得た。すべてについて、２つの組のプライマー：配列番号２５、および２６、ならびに配列番号１５および１６を使用するＰＣＲによって、ｘｙｌＡＢの存在か確認されたが、但し、Ｔ２ＣｃｍＸ１およびＴ２ＣｃｍＸ６については、プライマー配列番号２５および２６を使用すると、ＰＣＲフラグメントが検出されなかった。
【００７２】
２つのＰＣＲネガティブ系統を含む組み込み体を、ＸＩ、ＸＫ、ＴＡＬおよびＴＫＴ活性についてアッセイした（一般的方法）。図２および３において示される結果は、６つのｘｙｌＡＢ組み込み体Ｔ３ＣＣｍＸ１、Ｔ３ＣＣｍＸ２、Ｔ３ＣＣｍＸ３、Ｔ４ＣＣｍＸ１、Ｔ５ＣＣｍＸ１、およびＴ５ＣＣｍＸ２はすべて、ＸＩ、ＸＫ、ＴＡＬおよびＴＫＴ活性を有したことを示した。ネガティブな親コントロールと比較して、ＸＩおよびＸＫ活性が新たに獲得された（図２）。ＴＡＬおよびＴＫＴ活性は、親コントロールと同じように維持された。すべての結果は、タンパク質が作製され、そして機能的であることを示した。酵素活性レベルにはばらつきが認められたが、ＴＩおよびＸＫ活性は、同じプラスミドで形質転換／転位されたＺＷ１組み込み体のＴＩおよびＸＫ活性と同様であった。ＸＩ、ＸＫ、ＴＡＬおよびＴＫＴの活性のレベルは、株８ｂより低かった。
【００７３】
ｘｙｌＡＢオペロンの組み込みを、サザンハイブリダイゼーションによって確認した。６系統のゲノムＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡの両方を、ＳｐｈＩで消化し、そしてジゴキシゲニン標識ｘｙｌＢプローブにハイブリダイズさせた。ｘｙｌＢにおけるＳｐｈＩ部位およびｐＭＯＤベクター上の隣接するクローニング部位におけるもう１つのＳｐｈＩ部位から作製される約３ｋｂの共通のバンドは、すべてのゲノムＤＮＡサンプルに存在し、さらに、ゲノムＤＮＡサンプル中に、より高い分子量のハイブリダイズバンドが認められたことから、染色体にＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンのための４つの組み込みの部位が存在することが示された。Ｔ３ＣＣｍＸ１およびＴ３ＣＣｍＸ２は、同じ組み込み部位を有するようであり、Ｔ３ＣＣｍＸ３およびＴ４ＣＣｍＸ１は、同じ組み込み部位を有し得、そしてＴ５ＣＣｍＸ１およびＴ５ＣＣｍＸ２はそれぞれ、個別の組み込み部位を有した。ＰｓｔＩによる同じＤＮＡの消化、それに続く、ｔｋｔプローブとのサザンハイブリダイゼーションにより、各組み込み体は、そのそれぞれの親株と同じハイブリダイゼーションパターンを有したことが実証された。
【００７４】
キシロース培地におけるＺＷ１：：Ｐｇａｐｔａｌｔｋｔ ＰｇａｐｘｙｌＡＢ Ｃｍ組み込み体の適応
キシロース資化のための４つのすべての酵素活性が存在しているにもかかわらず、先の観察（米国特許出願公開第２００３０１６２２７１号明細書）では、組み込み体は、キシロース上で直ぐには増殖しないことが示された。キシロース上での増殖は、（試験管中またはプレート上のいずれかにおける）キシロース培地上での長期のインキュベーション、適応と呼ばれるプロセス後、生じ得る。
【００７５】
株は、以下のとおりに適応させた。ＺＷ１：：ＰｇａｐｔａｌｔｋｔＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍ組み込み体株を、ＲＭＸ（１０ｇ／ｌ酵母抽出物、２ｇ／ｌのＫＨ2ＰＯ4、２０ｇ／ｌまたは２％（ｗ／ｖ）キシロースを含有する）を含有する試験管、ならびにＭＭＧＸまたはＭＭＸプレート（１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／Ｌのトリプトン、２．５ｇ／Ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．２ｇ／ＬのＫ2ＨＰＯ4、１ｍＭのＭｇＳＯ4、１．５％（ｗ／ｖ）寒天、０．０２５％（ｗ／ｖ）グルコースおよび４％（ｗ／ｖ）キシロースもしくは４％（ｗ／ｖ）キシロースのみ）上に播種した。低レベルのグルコースを使用して、初期の増殖を支持し、適応中の変異の可能性を増加させた。培養およびプレートの両方におけるキシロースに対する適応について少なくとも５つ試みたうちの１つが、成功であった。３０℃での１０日間の嫌気的インキュベーションの後、１７および１９個のコロニーが、それぞれＴ３ＣＣｍＸ１およびＴ３ＣＣｍＸ２細胞をプレーティングしたＭＭＧＸ上で認められた。コロニーは小さく、そしてプレート上では健常でないように見えた（透明であった）。１２個のコロニー（Ｔ３ＣＣｍＸ１プレーティング由来の４個：Ｔ３ＣＣｍＸ１１、Ｔ３ＣＣｍＸ１２、Ｔ３ＣＣｍＸ１３およびＴ３ＣＣｍＸ１１０；Ｔ３ＣＣｍＸ２プレーティング由来の８個：Ｔ３ＣＣｍＸ２４、Ｔ３ＣＣｍＸ２５、Ｔ３ＣＣｍＸ２６、Ｔ３ＣＣｍＸ２７、Ｔ３ＣＣｍＸ２８、Ｔ３ＣＣｍＸ２９、Ｔ３ＣＣｍＸ２１１およびＴ３ＣＣｍＸ２１２）をＲＭＧＣｍ１２０に播種し、そしてさらなる適応のために３ｍｌのＲＭＸに移して、キシロース上でより迅速に増殖することが可能な系統を得た。
【００７６】
３ｍｌのＲＭＸを含有する試験管における組み込み体の適応は、３０℃で行った。ＯＤ600を、スペクトロニック（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）６０１分光光度計で絶えずモニターした。増殖が対数期の中間部に到達したら、培養をＲＭＸの新鮮な管に移した。このプロセスを、７継代、連続した。増殖速度および最終ＯＤ（非線形的な読み取り）が、継代の間に改善された。
【００７７】
６回目の継代において、培養物をＲＭＸプレート上から画線して、単一のコロニーを単離した。３つの組込み体：Ｔ３ＣＣｍＸ１３、Ｔ３ＣＣｍＸ２６およびＴ３ＣＣｍＸ２７が、ＲＭＸ画線プレート上で他より迅速に増殖したが、これらを、以下の表および考察でＸ１３、Ｘ２６およびＸ２７と称する。最良のキシロース資化増殖体をスクリーニングするために、ＴＸ１３、Ｘ２６およびＸ２７に対するそれぞれ４個の大きな（Ｌ１−４）および４個の小さな（Ｓ１−４）コロニーを選択し、そして増殖、糖資化、およびエタノール産生をモニターし得るように、ＲＭＸ試験管中で増殖させた。コロニーを、１晩、３０℃で増殖させ、続いて、２回反復測定の試験管中３ｍｌのＲＭＸにＯＤ600＝０．０５を播種した。Ｘ２７は、ＲＭＧにおいて、他の培養物より遅く増殖し、そして６．５時間後に再度、播種した。６９時間（Ｘ２７では６２．５時間）後、サンプルを、ＨＰＬＣ分析（一般的方法）のために採取した。図４は、６９時間目（すべてのＸ２７培養物については６２．５時間）での培養の平均エタノール収率（理論的収率の％）およびキシロース資化（％）を示す図表である。大きなコロニーと小さなコロニーとの間で、有意差は認められなかった。Ｘ２７の性能は、キシロース上のＸ２６と比較して、より良好であったが、それは、グルコース上では、より遅い増殖を示した。従って、最上位の性能を示すもの、Ｘ１３（Ｘ１３Ｌ３）およびＸ２６（Ｘ２６Ｌ１）の大きなコロニーを、ｐＨ制御された発酵におけるさらなる評価のために選択した。発酵を、ＲＭＧ（６％グルコース）、ＲＭＸ（６％キシロース）およびＲＭＧＸ（８％：４％；グルコース：キシロース）中、３７℃で、株Ｘ１３Ｌ３およびＸ２６Ｌ１、ならびにコントロール株８ｂについて行った。ＲＭＧ（６％）およびＲＭＧＸ（８％：４％）において増殖したＸ１３Ｌ３およびＸ２６Ｌ１によるグルコースの発酵は、かなり迅速に進行した。ＲＭＧＸ（８％：４％）におけるキシロースの発酵は、Ｘ１３Ｌ３およびＸ２６Ｌ１では両方とも、株８ｂと比較して緩徐であった。さらに、ＲＭＸ（６％）上、３７℃での増殖は、Ｘ１３Ｌ３およびＸ２６Ｌ１の両方とも、長い停滞の後に生じた。いくらかの単離体、Ｘ１３ｂ、Ｘ１３ｃおよびＸ１３ＦＬを、ＲＭＸ（６％）発酵から回収した。これらの単離体を、本来の株Ｘ１３ａ（Ｘ１３Ｌ３の単離体）およびＸ２６と共に、本実施例において先に記載のようにＣｒｅ処置に供して、ＺＷ１：：ＰｇａｐｔａｌｔｋｔＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍ株からＣｍrマーカーを取り出した。得られたＣｒｅ処置されたＣｍrを含まない組込み体を：Ｘ１３ａＣ、Ｘ１３ｂＣ、Ｘ１３ｃＣ、Ｘ１３ＦＬＣおよびＸ２６Ｃと命名した。
【００７８】
実施例２
株ＺＷ６５８の適応および選択
先に記載のように、ＲＭＸ上、３０℃での初期のＺＷ１：：ＰｇａｐｔａｌｔｋｔＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍ株の適応により、これらの条件における株の増殖が顕著に改善された。しかし、適応された株は、ＲＭＸ（６％）における３７℃での増殖および発酵の間、長い停滞を蒙る。より高い糖濃度および温度を含む好適なプロセス条件でのキシロース発酵のために組込み体をさらに改善するために、進化または適応プロセスを、ＲＭＸ（５％）中３７℃で継続させた。連続継代を行い、そして最も良好な資化増殖体を選択した。このプロセスで使用した組込み体は、Ｘ１３ａＣ、Ｘ１３ｂＣ、Ｘ１３ｃＣ、Ｘ２６ＣおよびＸ１３ＦＬＣを含んだ。これらの５つの株を、ＲＭＸ中３０℃で６継代増殖させた後、さらに５〜１６代の継代のために、３７℃でＲＭＸ（５％）に移した。すべての継代中および後、培養物をＲＭＸプレート上に画線し、そして３７℃でインキュベートして、単一のコロニーを単離した。大きなコロニーについてさらに、ＲＭＸプレート上での画線および３７℃でのインキュベートを３〜４回行い、コロニーを精製した。最終的な大きなコロニーを、ＲＭＸ（５％）における３７℃での増殖試験のために選択した。
【００７９】
ＲＭＸ（５％）培地における３７℃での適応由来の株の評価
連続継代による適応後に単離した１８個のコロニーを、はじめに、ＲＭＸ（５％）試験管中、３７℃で試験した。１２の株を、第２の試験管評価のために選択した。比較のために、株８ｂをすべての評価に含めた。１８個のコロニーを、ＲＭＧにおいて３７℃で１晩増殖させ、遠心分離し、そして細胞を第１の評価のために試験管中４ｍｌのＲＭＸ（５％）に３７℃で静置状態で播種した。増殖（ＯＤ600、非線形的）およびエンドポイントのＨＰＬＣ結果（低い残留キシロースおよび高エタノール）に基づいて、１２の株を第２の評価のために選択した。
【００８０】
第２の評価の目的の１つは、キシロース上での改善された増殖の安定性および株のキシロース資化能を試験することであった。１２のすべての株を安定性研究に供して、適応された株を非選択培地に暴露して３７℃で５０代連続的に継代培養させた後にそれらが安定であるかどうかを調べた。ＲＭＧ（５％）継代培養の前および後の培養物をＲＭＸ（５％）試験管に播種し、そして評価のために３７℃で増殖させた。非線形的ＯＤを、Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ ６０１分光光度計において、試験管の直接読み取りによってモニターした。ＲＭＧにおける５０代の増殖の前および後のＲＭＸ（５％）における増殖の７０時間目のＯＤを、図５にプロットした。結果は、ほとんどの株がＲＭＧ、３７℃において５０代後も安定であったことを示した。（定常期における）エンドポイントの上清もまた、キシロースおよびエタノール濃度についてＨＰＬＣによって分析した。これらの培養物において低い残留キシロースおよび高いエタノール濃度が認められたことから、株が増殖し、そしてキシロースを良好に発酵したという事実が支持された。
【００８１】
上記の試験管評価（低い残留キシロース、高いエタノール濃度およびより高いＯＤ）ならびに高度の糖類における、および酢酸塩の存在下でのより良好な増殖体を選択するための高濃度のグルコースおよび／またはキシロース（２０％まで）、およびグルコースおよびキシロースと酢酸塩との混合物による以後のマイクロタイタープレート増殖スクリーニングの結果に基づいて、全体的に最も良好な性能を示した、例えば株番号２６を、ＺＷ６５８と称した。
【００８２】
実施例３
ペントースリン酸経路酵素活性のアッセイ
組み込まれた遺伝子によってコードされる４つのキシロース資化酵素（実施例１に記載）の活性を、（実施例１の）高度の糖および３７℃における適応について選択された株のうち３つについて、一般的方法に記載のとおりに測定し、そして（実施例２の）さらに適応された株ＺＷ６５８における同じ酵素の活性と比較した。結果を、μモルの産物／ｍｇタンパク質／分で表し、表１に示す。
【００８３】
表１．異なるキシロース資化適応Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株における酵素活性
【００８４】
ｘｙｌＡＢオペロンの両方のメンバーについての活性レベルは、部分的に適応された前駆体株におけるレベルと比較して、さらに適応された株ＺＷ６５８において約４〜８倍増化した。ｔａｌ／ｔｋｔオペロンからの酵素の発現レベルは、ＺＷ６５８と部分的に適応された前駆体株との間で、ほとんどまたは全く変化が認められなかった。
【００８５】
実施例４
部分的に適応された株およびＺＷ６５８におけるＸＹＬＡＢオペロンのプロモーター領域の配列比較
ｘｙｌＡＢを駆動するＧＡＰプロモーター（Ｐｇａｐ）の制御下での両方の遺伝子の産物の酵素活性レベルの明確な変化がＺＷ６５８をもたらす適応の結果として認められたため、部分的に適応された株（実施例１；その後株番号ＺＷ６４１が与えられた）およびＺＷ６５８由来のそのオペロンのプロモーター領域をＰＣＲによって増幅し、そして配列決定した。ＰＣＲフラグメントを、ｒｅｃＧコード領域由来の順方向ＰＣＲプライマー（ＰＣ１１；配列番号２７）（ここにＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンを組み込んだ）およびｘｙｌＡコード領域由来の逆方向プライマー（ＰＣ１２；配列番号２８）を使用して、調製した。得られた９６１ｂｐのＰＣＲ産物を、プライマーＬＭ１２１、ＬＭ１２２、およびＬＭ１２３（配列番号２９、３０、および３１）を使用して配列決定した。ＺＷ６４１由来のプロモーター配列を配列番号３に示し、そしてＺＷ６５８由来のプロモーター配列を配列番号４に示す。これらのプロモーター配列は、両方とも、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株ＣＰ４におけるＰｇａｐの公開された配列（配列番号１）とは１箇所の位置において異なることを見出した：ＧＡＰコード領域のＡＴＧ開始コドンから数えて上流の５’末端の方向へ−２１位の次の（Ｔの）１塩基欠失である。この配列の変化は両方の株に存在するため、それは、ＺＷ６４１のＰｇａｐとＺＷ６５８のＰｇａｐとの間の発現の差異に寄与しない。この共通の変化に加えて、ＺＷ６４１およびＺＷ６５８のＰｇａｐ配列の間に１塩基対の差異も認められた。ＺＷ６４１株由来の配列におけるＸｙｌＡのコード領域開始ＡＴＧに対する−１８９位のＧが、ＺＷ６５８由来の配列ではＴに置き換えられた。２つの配列の間ではそれ以外の違いは認められず、そしてＧＡＰプロモーター領域におけるこの１つの塩基変化による発現レベルの違いが、そのプロモーターの制御下の遺伝子によってコードされる両方のタンパク質に見出された酵素活性の増加を担うようであった。
【００８６】
実施例５
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ６４１においてＸＹＬＡ／Ｂオペロンを駆動する同じＰＧＡＰを有するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のためのキシロースイソメラーゼ発現ベクターの構築
出発物質として大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）／Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）シャトルベクター（ｐＺＢ１８８）を使用して、以下に記載のように、スペクチノマイシンに対する耐性およびＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼの発現を付与するプラスミド構築物（ｐＺＢ１８８／ａａｄａ−ＧａｐＸｙｌＡ；ここで、Ｇａｐはプロモーターを表す）を作製した（図６Ａ）。ｐＺＢ１８８の構築に関与する工程については、米国特許第５，５１４，５８３号明細書に開示されている。簡単に説明すると、この７００８ｂｐのプラスミドは、２つの異なる複製開始点を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）に対して１つずつ有するため、それぞれの細菌種において複製することが可能である。ｐＺＢ１８８はまた、テトラサイクリン（すなわちＴＣr−カセット）に対する耐性を付与するＤＮＡフラグメントも含む。ｐＺＢ１８８／ａａｄａ−ＧａｐＸｙｌＡの構築における第１の工程は、ｐＺＢ１８８からＴｃr−カセットを取り出し、そしてそれを、スペクチノマイシンに対する耐性を付与するＤＮＡフラグメント（即ち、Ｓｐｅｃr−カセット）で置き換えることであった。以下に詳細に説明するように、ｐＺＢ１８８からＴｃr−カセットを切り出すために、プラスミドをＣｌａＩおよびＢｓｓＨＩＩで切断し、そして得られた大きなベクターフラグメントを、アガロースゲル電気泳動によって精製した。テンプレートしてプラスミドｐＨＰ１５５７８（Ｃａｈｏｏｎ ｅｔ ａｌ，（２００３）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１：１０８２−１０８７）ならびにプライマー１（配列番号３２）および２（配列番号３３）を使用して、ＰＣＲによってＳｐｅｃr−カセットを作製した。プラスミドｐＨＰ１５５７８は、Ｓｐｅｃr−カセットおよびそのプロモーターの完全なヌクレオチド配列を含有し、３’（９）−Ｏ−ヌクレオチジルトランスフェラーゼをコードするトランスポゾンＴｎ７ ａａｄＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０３０４３）の公開された配列に基づく。
プライマー１（配列番号３２）
ＣＴＡＣＴＣＡＴＴＴａｔｃｇａｔＧＧＡＧＣＡＣＡＧＧＡＴＧＡＣＧＣＣＴ
プライマー２（配列番号３３）
ＣＡＴＣＴＴＡＣＴａｃｇｃｇｔＴＧＧＣＡＧＧＴＣＡＧＣＡＡＧＴＧＣＣ
【００８７】
プライマー１（順方向プライマー）の下線を付した塩基は、Ｓｐｅｃr−カセットのプロモーターの直ぐ上流（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０３０４３のｎｔ４〜２２に）にハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＣｌａＩ部位に対応する。プライマー２（逆方向プライマー）の下線を付した塩基は、Ｓｐｅｃr−カセットの終止コドンから約１３０塩基下流（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０３０４３のｎｔ１００２〜１０２０）にハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＡｆｌＩＩＩ部位に対応する。１０４８ｂｐのＰＣＲ作製したＳｐｅｃr−カセットをＣｌａＩおよびＡｆｌＩＩＩで二重消化し、そして得られたＤＮＡフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８１０４）を使用し、および販売者の推奨するプロトコルに従って、精製した。次の工程では、（ｄａｍメチル化に対して感受性である）ＣｌａＩでの切断のための非メチル化プラスミドＤＮＡを得るための大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＣ１１０（ｄｃｍ-、ｄａｍ-）から単離されたプラスミドｐＺＢ１８８を、ＣｌａＩおよびＢｓｓＨＩＩで二重消化して、Ｔｃr−カセットを取り出し、そして得られた大きなベクターフラグメントを、アガロースゲル電気泳動によって精製した。次いで、このＤＮＡフラグメントおよびクリーンアップされたＰＣＲ産物を共にライゲートし、そしてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（カタログ番号２００２３９）から得られた化学的にコンピテントな細胞を使用して、形質転換反応混合物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１１０に導入した。ＢｓｓＨＩＩおよびＡｆｌＩＩＩは適合性の「粘着末端」を作製するが、両方の部位が共にライゲートされる場合、それらが破壊されることにさらに留意すること。形質転換体を、スペクチノマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上でプレーティングし、そして３７℃で増殖させた。正確なサイズ挿入部を伴うプラスミドを含有するスペクチノマイシン耐性形質転換体を、ＮｏｔＩによる制限消化分析によって同定し、そしてさらなる操作のために選択したプラスミドを以下でｐＺＢ１８８／ａａｄＡと称する。この構築物の環状図を図６Ｂに示す。
【００８８】
次の工程では、ｐＺＢ１８８／ａａｄＡをＮｃｏＩおよびＡｃｌＩの両方の酵素で切断し、そしてアガロースゲル電気泳動によって大きなベクターフラグメントを精製した後、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセットを、ｐＺＢ１８８／ａａｄＡのＮｃｏＩおよびＡｃｌＩ部位の間に挿入した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセットとしての役割を果たす約２ＫｂｐのＤＮＡフラグメントを、プラスミドｐＺＢ４の構築物をＮｃｏＩおよびＣｌａＩで切断し、そしてアガロースゲル電気泳動によって関連ＤＮＡフラグメントを精製することによって、プラスミドｐＺＢ４から単離した。プラスミドｐＺＢ４については、米国特許第５５１４５８３号明細書に詳述されており、そして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセットＰｇａｐＸｙｌＡ（配列番号３４）の略図を、図６Ｄの枠内の概念図に示す。
【００８９】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセットを含有するフラグメントは、それぞれ、その５’末端においてＮｃｏＩ部位および３’末端においてＣｌａＩ部位を有する。米国特許第５５１４５８３号明細書においてより詳細に記載されているように、このフラグメントは、キシロースイソメラーゼをコードする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｘｙｌＡオープンリーディングフレーム（ｎｔ６２０〜１９４２）の完全なオープンリーディングフレームに正確に融合される強力な構成性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）プロモーター（ｎｔ３１６〜６１９）を含有する。それはまた、キシロースイソメラーゼ終止コドンの直後に続く小さなステムループ領域（ｎｔ１９６５〜１９９９）を含有する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセットを、標準的な連結反応で、ｐＺＢ１８８／ａａｄＡのＮｃｏＩおよびＡｃｌＩ部位の間に挿入した。ＣｌａＩおよびＡｃｌＩは適合性の「粘着末端」を作製するが、両方の部位が共に連結される場合、それらが破壊されることにさらに留意すること。次いで、ライゲーション反応混合物を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＣ１１０（ｄｃｍ-、ｄａｍ-）にエレクトロポレートして、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のその後の形質転換のための非メチル化プラスミドＤＮＡを入手し、そして形質転換された細胞を、１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含有するＬＢ培地上でプレーティングした；増殖は３７℃であった。正確なサイズの挿入物を伴うプラスミドを有するスペクチノマイシン耐性形質転換体を、ＮｏｔＩ、ＮｃｏＩおよびＡｃｌＩによる制限消化分析によって同定した。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ６４１株において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼのさらなる操作および過剰発現のために選択したプラスミドを、以下で、「ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−６４１ＧａｐＸｙｌＡ」と称する；このプラスミド構築物の環状図を図６Ｃに示す。
【００９０】
たとえ、配列番号３４のヌクレオチド配列が同じ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセット（ＰｇａｐＸｙｌＡ）に対応するとしても、配列番号３４のヌクレオチド配列は、同一出願人が所有しかつ同時係属中の米国特許出願公開第２００８０２８６８７０号明細書および米国特許出願公開第２００８０１８７９７３号明細書における配列番号３４に記載のヌクレオチド配列と同一ではないに留意することが重要である。本研究における配列番号３４において開示されたＤＮＡ配列は、米国特許出願公開第２００８０２８６８７０号明細書および米国特許出願公開第２００８０１８７９７３号明細書における配列番号３４のｎｔ５９９に対応するＰｇａｐにおいて１ｂｐの欠失を有する。先の特許出願において報告されたヌクレオチド配列は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株ＣＰ４のＰｇａｐの公開されたＤＮＡ配列（Ｃｏｎｗａｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９（１２）：５６５３−５６６２（１９８７））に基づいていたが、当時、プロモーターは、再配列決定されなかった。しかし、最近、本発明者らは、ｐＺＢ４におけるＰｇａｐもまた、同じヌクレオチドを欠き、そして３つのすべての特許出願に使用された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセット（ＰｇａｐＸｙｌＡ）が、上記のこのプラスミドから駆動されたことを発見した。
【００９１】
実施例６
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ６５８およびＺＷ８０１−４においてＸＹＬＡ／Ｂオペロンを駆動する同じＰＧＡＰを有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現ベクターの作製
プラスミドｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−８０１ＧａｐＸｙｌＡは、ｐＺＢ１８８−ａａｄＡ−６４１ＧａｐＸｙｌＡ（図６Ｃ）と同一であるが、ＺＷ６５８において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸｙｌＡ／Ｂオペロンの発現を駆動するＰｇａｐの−１８９位に存在するＧ→Ｔ変異に対応するＰｇａｐにおける１つのｂｐ置換を有する。同じ点変異が、以下に記載のようにＺＷ６５８から連続的に誘導された株ＺＷ８００およびＺＷ８０１−４にも存在する。ＺＷ８００およびＺＷ８０１−４の構築および特徴付けについては、同一出願人が所有しかつ同時係属中の米国特許出願公開第２００８０２８６８７０号明細書に詳述されている。ＺＷ８００は、この活性を不活化するグルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ（ＧＦＯＲ）酵素をコードする配列へのスペクチノマイシン耐性カセットの二重交差挿入を有するＺＷ６５８の誘導体である。ＺＷ８０１−４は、部位特異的組換えによってスペクチノマイシン耐性カセットが欠失され、タンパク質を未成熟にトランケートするインフレームの終止コドンが後に残ったＺＷ８００の誘導体である。これらの操作のいずれも、ＺＷ６５８においてＸｙｌＡ／Ｂオペロンを駆動する変異Ｐｇａｐプロモーターのヌクレオチド配列を変異しなかった。それ故、「８０１ＧＡＰプロモーター」とは、次の株：ＺＷ６５８、ＺＷ８００、およびＺＷ８０１−４に存在するプロモーター配列を指す。
【００９２】
ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−８０１ＧａｐＸｙｌＡを作製するために使用した工程およびプラスミド中間体を、プラスミドｐＭＯＤ−リンカーを出発点として時系列で説明する。
【００９３】
ｐＭＯＤ−リンカーの構築
プラスミドｐＭＯＤ−リンカーの前駆体は、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）から市販されているｐＭＯＤTM−２＜ＭＣＳ＞Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ（カタログ番号ＭＯＤ０６０２）であった。図７Ａに示すように、ｐＭＯＤTM−２＜ＭＣＳ＞は、アンピシリン耐性遺伝子（ａｍｐＲ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製開始点（ｏｒｉ）、およびＴｎ５トランスポザーゼが相互作用する２つのモザイク末端（ＭＥ）の間に位置するマルチクローニング部位を有する。ｐＭＯＤ−リンカーの構築における第１の工程は、ｐＭＯＤ２−＜ＭＣＳ＞における本来のマルチクローニング部位を取り出すことであったが、これは、それを、ＡｓｉＳｉ、ＦｓｅＩおよびＳｂｆＩに独特の制限部位を有する新たなマルチクローニング部位で置き換えることであった。これは、プラスミドをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、そしてアガロースゲル電気泳動により大きな（約２．５Ｋｂｐの）ベクターフラグメントを精製することによって行った。次いで、新たなマルチクローニング部位を、両方ともそれらの５’末端でリン酸化された２つの合成オリゴヌクレオチド、リンカーＢ（配列番号３５）およびリンカーＴ（配列番号３６）を共にアニーリングすることによって、作製した。
【００９４】
これらのオリゴヌクレオチドは、相互に相補的であり、そして共にアニーリングする場合、両末端に一本鎖オーバーハング（小文字）を有する二本鎖のリンカーを形成し、このリンカーは、ＤＮＡフラグメントが、上記の大きなｐＭＯＤTM−２＜ＭＣＳ＞ベクターフラグメントのＥｃｏＲＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間でライゲートすることを可能にする。上記のように、この合成リンカーもまた、以後のクローニング工程に使用することができる３つの独特な制限部位（ＡｓｉＳｉ、ＦｓｅＩおよびＳｂｆＩ）を含有する。ＳｂｆＩ部位には細線で下線を付し、ＦｓｅＩ部位には太線で下線を付し、そしてＡｓｉＳＩ部位には２本の細線で下線を付す。リンカーＢおよびリンカーＴを共にアニーリングし、そして標準的なライゲーション反応において、得られたＤＮＡフラグメントを、ｐＭＯＤTM−２＜ＭＣＳ＞のＥｃｏＲＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入した。連結反応混合物を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂを形質転換して、そして形質転換された細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地上でプレーティングした。次いで、プラスミドＤＮＡを、新たなマルチクローニング部位を含有する代表的なアンピシリン耐性コロニーから単離した。得られたプラスミド構築物（以下、「ｐＭＯＤ−リンカー」と称する）の環状図を図７Ｂに示す。
【００９５】
ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃの構築
スペクチノマイシンに対する耐性（Ｓｐｅｃr）を付与し、そして両方の末端において野生型ｌｏｘＰ部位を有するＤＮＡフラグメントを、上記のｐＭＯＤ−リンカー構築物のＡｓｉＳＩ部位とＦｓｅＩ部位との間に挿入した。ｌｏｘＰフランキングＳｐｅｃrカセットの供給源は、米国特許出願第１１／８６２５６６号明細書に詳述されているプラスミドｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷ（図８）であった。第１の工程では、ＭＯＤ−リンカープラスミドＤＮＡを、ＦｓｅＩおよびＡｓｉＳＩで連続的に消化し、そしてＺｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（カタログ番号ＤＯ４００３）から購入したＤＮＡ Ｃｌｅａｎ＆ＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒＴＭ−５スピンカラムキットを使用して、大きなベクターフラグメントを精製した。次に、プラスミドｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷもまた、同じ２つの酵素で二重消化し、そしてｌｏｘＰフランキングＳｐｅｃrカセットを含有する小さな（約１．１Ｋｂｐの）ＤＮＡフラグメントを、アガロースゲル電気泳動によって精製した。次いで、２つのＤＮＡフラグメントを共に連結し、そしてエレクトロポレーションを使用して、形質転換反応混合物を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂに導入した。形質転換体を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびスペクチノマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上に置き、そして増殖は３７℃であった。次いで、プラスミドＤＮＡを、正確なサイズのＤＮＡフラグメントを含有するアンピシリン耐性コロニーのうちの１つから単離し、そしてこれを以後の操作に使用した。構築物（以下、「ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ」と称する）の環状図を図７Ｃに示す。
【００９６】
ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−８０１ＧａｐＸｙｌＡおよびｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−６４１ＧａｐＸｙｌＡの構築
Ｐｇａｐ全体、ＸｙｌＡコード領域、ならびにＸｙｌＡおよびＸｙｌＢオープンリーディングフレームの間に存在するステムループ領域を含有するＤＮＡフラグメントを、プライマー３および４（それぞれ、配列番号３７および３８）ならびに再懸濁した細胞をテンプレートとして使用して、ＺＷ８０１−４からＰＣＲ増幅した。既に記載のように、ＤＮＡ配列解析により、ＺＷ８０１−４は、組み込まれた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸｙｌＡ／Ｂオペロンの発現を駆動するＰｇａｐプロモーターにおいて−１８９位でＺＷ６５８と同じＧ→Ｔ点変異を有し、そして両方の株のＰｇａｐが同一であることが示された。
プライマー３（配列番号３７）
ＴＣＡＣＴＣＡＴｇｇｃｃｇｇｃｃＧＴＴＣＧＡＴＣＡＡＣＡＡＣＣＣＧＡＡＴＣＣ
プライマー４（配列番号３８）
ＣＴＡＣＴＣＡＴｃｃｔｇｃａｇｇＣＣＧＡＴＡＴＡＣＴＴＡＴＣＧＡＴＣＧＴＴＣＣ
【００９７】
プライマー３（順方向プライマー）の下線を付した塩基は、Ｐｇａｐの最初の２２塩基（および配列番号３４のｎｔ３１６〜３３７）にハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＦｓｅＩ部位に対応する。プライマー４（逆方向プライマー）の下線を付した塩基は、ＸｙｌＡ終止コドンの後方に存在するステムループ領域の直ぐ下流（および配列番号３４の最後の１２ｎｔ）にハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＳｂｆＩ部位に対応する。
【００９８】
ＰＣＲ産物を、ＦｓｅＩおよびＳｂｆＩで二重消化し、そしてＺｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（カタログ番号ＤＯ４００３）から購入したＤＮＡ Ｃｌｅａｎ＆ＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒＴＭ−５スピンカラムキットを使用して、精製した。次に、プラスミドｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃを同じ２つの酵素で切断し、そして得られた大きなベクターフラグメントを、同じ手順を使用して精製した。次いで、２つのＤＮＡフラグメントを共に連結し、そしてエレクトロポレーションを使用して、形質転換反応混合物を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂに導入した。細胞を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびスペクチノマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上にプレーティングし、そして増殖は３７℃であった。正確なサイズの挿入物のプラスミドを含有する形質転換体を、テンプレートとしてプライマー３および４ならびに再懸濁したコロニーを使用するＰＣＲ（「コロニーＰＣＲ」）によって同定した。さらなる操作のために選択したプラスミドを、以下で、ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−８０１ＧａｐＸｙｌＡと称し、そしてこの構築物の環状図を図９に示す。
【００９９】
Ｐｇａｐ−ＸｙｌＡ遺伝子ＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅に使用したテンプレートがＺＷ６４１の細胞懸濁液であったことを除いて、上記の同じ工程を使用して、以下、「ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−６４１ＧａｐＸｙｌＡ」と称するもう１つのプラスミドを作製した。ＺＷ６５８（およびＺＷ８０１−４）とＺＷ６４１とを区別するＰｇａｐにおけるＧ→Ｔ置換を除いて、ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−６４１ＧａｐＸｙｌＡおよびｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−８０１ＧａｐＸｙｌＡは同一である。
【０１００】
ｐＺＢ１８８−ａａｄＡ−８０１ＧａｐＸｙｌＡの構築
実施例６の最初の段落に記載のように、ｐＺＢ１８８−ａａｄＡ−８０１ＧａｐＸｙｌＡは、ｐＺＢ１８８−ａａｄＡ−６４１ＧａｐＸｙｌＡに同一なＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現ベクターであるが、それは、ＺＷ６５８（およびＺＷ８０１−４）において組み込まれたＰｇａｐ−ＸｙｌＡ／Ｂオペロンの発現を駆動するＰｇａｐにおける同じＧ→Ｔ置換を有する。このプラスミドを構築するため、ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−８０１ＧａｐＸｙｌＡ（図１０Ａ）をＭｌｕＩおよびＳａｌＩで二重消化し、そしてより小さなＤＮＡフラグメント（約１１００ｂｐ）を、アガロースゲル電気泳動およびＺｙｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（カタログ番号Ｄ４００１、Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、精製した。このフラグメントは、ＰｇａｐのＧ→Ｔ置換およびＸｙｌＡ ＯＲＦの一部を含有するが、後者の構築物を同じ２つの酵素で切断し、そして大きなベクターフラグメントをアガロースゲル電気泳動によって精製した後、ｐＺＢ１８８−ａａｄＡ−６４１ＧａｐＸｙｌＡ（図１０Ｂ）において対応するフラグメントを置き換えるために使用した。次いで、２つのフラグメントを共にライゲートし、そしてエレクトロポレーションを使用して、ライゲーション反応混合物を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂに導入した。形質転換体を、スペクチノマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上でプレーティングし、そして増殖は３７℃であった。プラスミドＤＮＡをスペクチノマイシン耐性コロニーから単離し、そしてＰｇａｐプロモーターＧ→Ｔ置換の存在を、ＤＮＡ配列解析によって確認した。以後の操作に使用したプラスミド（「ｐＺＢ１８８−ａａｄＡ−８０１ＧａｐＸｙｌＡ」）を図１０Ｃに示す。
【０１０１】
実施例７
ＺＷ６４１における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼの過剰発現
表１における酵素活性測定値は、ＺＷ６４１からＺＷ６５８へのトランジション中にキシロースイソメラーゼ活性およびキシルロキナーゼ活性が劇的に増加することを示す。キシロースイソメラーゼが、ＺＷ６４１におけるキシロース上での増殖の律速酵素であるという仮説を試験するため、マルチコピープラスミド、ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−６４１ＧａｐＸｙｌＡ（図６Ｃ）を使用して、酵素をこの株において過剰発現させた。この実験のコントロールは、Ｐｇａｐ−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセットを欠くマルチコピープラスミドｐＺＢ１８８／ａａｄＡで形質転換されたＺＷ６４１であった（図６Ｂ）。これらの両方のプラスミドの構築については、実施例５に記載されており、そして形質転換プロトコルは、本質的に、同一出願人が所有しかつ同時係属中の米国特許出願公開第２００８０１８７９７３号明細書の実施例５に記載のとおりであった。簡単に説明すると、エレクトロポレーションを使用して、非メチル化プラスミドＤＮＡ（ｄｃｍ-およびｄａｍ-株である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＣ１１０から単離された）をＺＷ６４１に導入し、そして形質転換細胞を、２００μｇ／ｍｌスペクチノマイシンを含有するＬＢ培地上にプレーティングした。嫌気条件下３０℃で４８時間の培養期間後、各プラスミドについて、３つの初代形質転換体を無作為に選択し、そしてこれらを、さらなる特徴付けのために同じ増殖培地を含有する寒天プレート上にパッチした（移した）。
【０１０２】
図１１は、６４１Ｐｇａｐ−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現プラスミドを所有する３つの株（Ｘ１、Ｘ２およびＸ２）ならびにコントロールプラスミドを所有する３つの株（Ｃ１、Ｃ２およびＣ３）のキシロース含有培地における増殖曲線（ＯＤ600対時間）を示す。この実験は、振盪フラスコ（１５０ｒｐｍで１５ｍｌ試験管中５ｍｌの培養液）中３０℃で実施し、そして増殖培地は、スペクチノマイシン（２００μｇ／ｍｌ）をも含有するｍＲＭ３−Ｘ１０（１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ4および１００ｇ／Ｌキシロース）であった。培養液は、上記の段落において記載のパッチしたプレート由来の１植菌耳の細胞から開始し、そしてそれぞれの場合の初期ＯＤ600は約０．１３であった。ＺＷ６４１と同様に、コントロールプラスミドを伴う３つの株は、キシロース上ではほとんど増殖しなかった。全く対照的に、ＺＷ６４１を、６４１Ｐｇａｐ−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現プラスミド、ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−６４１ＧａｐＸｙｌＡで形質転換した場合、キシロース上での増殖の速度および程度（最終ＯＤ600値）の両方とも、劇的に改善された。このプラスミドを有する３つのすべての株は、図１１に示す実験において同じ挙動を示したため、Ｘ１株およびＣ１株のみをさらなる特徴付けに供した。
【０１０３】
図１２は、スペクチノマイシンを伴わない同じキシロース含有増殖培地におけるＺＷ６４１、ＺＷ６５８、Ｘ１およびＣ１の並列比較を示す。この実験の条件は、上記の条件と同一であったが、２０ｍｌ培養液を、５０ｍｌ試験管中で増殖させ、そして初期ＯＤ600は約１／４であった（０．０３５）。図１２Ａに示す増殖曲線を線形目盛（ＯＤ600対時間）でプロットする一方、図１２Ｂは、指数増殖速度を比較するために、対数目盛（ｌｏｇＯＤ600対時間）に対してプロットした同じ実験データを示す。この実験から、Ｘ１の指数増殖速度は、キシロース適応株ＺＷ６５８とほとんど同じ速さであること、およびこの株は、コントロールプラスミドを伴っても伴わなくても親株ＺＷ６４１よりかなり良好にキシロース上で増殖することが明らかである。それ故、（マルチコピープラスミド由来の６４１Ｐｇａｐプロモーターによって駆動される）ＺＷ６４１におけるキシロースイソメラーゼの高発現は、キシロース上での増殖に対して、キシロースイソメラーゼ活性の増加がＺＷ６５８に対して及ぼす効果（表１に示す）に類似の効果を及ぼす。Ｘ１の最終的なバイオマス収量は、ＺＷ６５８によって得られる収量の約１／２であるが、このデータから、ＺＷ６４１におけるキシロース上での増殖の律速酵素はキシロースイソメラーゼであることが明らかである。図１１および１２に示される実験から、次の他の２つの興味深い可能性がさらに示唆される：（１）ＺＷ６４１からＺＷ６５８へのトランジション中に生じるキシロースイソメラーゼ活性の大きな増加（表Ｉ）が、「キシロース適応」プロセス中に生じたキシロース上でのより良好な増殖の主な原因であったこと；および（２）キシロースイソメラーゼ活性の増加は、ＺＷ６５８に存在する染色体上に組み込まれたＰｇａｐ−ＸｙｌＡ／Ｂオペロンの発現を駆動するＰｇａｐプロモーターにおけるＧ→Ｔ置換から生じ得たこと。
【０１０４】
実施例８
ＺＷ６４１における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼのトランスポゾン仲介組み込み
ＺＷ６４１および２つのプラスミド構築物（ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−８０１ＧａｐＸｙｌＡおよびｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−６４１ＧａｐＸｙｌＡ）を使用して、ＺＷ６５８において組み込まれたＸｙｌＡ／Ｂオペロンの発現を駆動するＧ→Ｔ置換を伴うＰｇａｐプロモーター（以後、「８０１ＧＡＰプロモーター」と称する）が、ＺＷ６４１における対応するプロモーター（以後、「６４１ＧＡＰプロモーター」と称する）より強力であるという仮説を試験した。ＺＷ６４１は、キシロース上ではほとんど増殖することができず、そしてこの株においてキシロースイソメラーゼが過剰発現すると、キシロース上での増殖がより速くなる（実施例７、図１１および１２）ため、ＺＷ６４１をこれらの実験に選択した。基本理念は、（６４１ＧＡＰプロモーターまたは８０１ＧＡＰプロモーターによって駆動される）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ遺伝子の追加のコピーをＺＷ６４１の染色体へ導入すること、およびどちらの構築物がキシロース上で最も速く増殖するかを調べることであった。Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅのトランスポソーム技術を使用して、２つのキメラ遺伝子の染色体組み込みを達成した。
【０１０５】
既に示したように、ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−６４１ＧａｐＸｙｌＡおよびｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−８０１ＧａｐＸｙｌＡは、後者の構築物のＰｇａｐプロモーターにＧ→Ｔ点変異が存在することを除いて、同一のプラスミドである。両方の場合においてＤＮＡへの無作為な挿入に使用された転移因子は、２つの１９ｂｐのモザイク末端（ＭＥ）およびそれらの間に挟まれる全ＤＮＡフラグメントからなる。図９に示すように、トランスポゾンと称されるこのエレメントは、スペクチノマイシン耐性カセット（Ｓｐｅｃr）および下流のＰｇａｐ−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセットを含有する。トランスポソームを形成するために使用したプロトコルは、本質的に、ＥＺ：：ＴＮTMｐＭＯＤTM−２＜ＭＣＳ＞Ｔｒａｎｓｐｏｓｎ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ（カタログ番号ＭＯＤ０６０２）についてのＥｐｉｃｅｎｔｒｅの取扱説明書に記載のプロトコルと同じであった。８μＬ反応物は、Ｍｇ++イオンを含まない１．５μＬの５’−リン酸化、平滑末端化されたトランスポゾンＤＮＡ（約２５０ｎｇ／μＬ）、４μＬのＥｐｉｃｅｎｔｒｅのＥＺ：：ＴＮトランスポザーゼおよび２．５μＬの８０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含有した。コントロールトランスポソーム反応混合物も同一であったが、但し、トランスポザーゼの代わりに４μＬの滅菌水を使用した。反応物を室温で３０分間、インキュベートし、次いで、緩徐な異性化工程に必要な２〜７日間のインキュベーション期間、４℃に移した（これにより、活性なトランスポソームが形成する；この手順を使用すれば、トランスポソームは、−２０℃で少なくとも３箇月間、安定である）。
【０１０６】
本質的に、米国特許第５，５１４，５８３号明細書に記載のプロトコルと同じ形質転換プロトコルを使用して、トランスポソームをＺＷ６４１にエレクトロポレートした。簡単に説明すると、４０μＬの形質転換反応物は、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール中約１０10個の細胞／ｍｌ、１μＬのＥｐｉｃｅｎｔｒｅのＴｙｐｅＯｎｅTMＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎインヒビター（カタログ番号ＴＹＯ２６１Ｈ）および１μＬのコントロールまたはトランスポソーム反応混合物を含有した。エレクトロポレーターの設定は、１．６ｋｖ／ｃｍ、２００Ω、および２５μＦ、およびキュベットのギャップ幅は０．１ｃｍであった。エレクトロポレーション後、形質転換物を１．０ｍｌのＭＭＧ培地（５０ｇ／Ｌグルコース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／Ｌのトリプトン、２．５ｇ／Ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．２ｇ／ＬのＫ2ＨＰＯ4、および１ｍＭのＭｇＳ０4）で希釈し、そして細胞を約３時間、３０℃で回復させた。次いで、細胞を、室温で、滅菌１．５ｍｌ微量遠心管中、遠心分離（１３，０００×ｇ、５分間）によって回収し、そして上清を注意深く取り除いた。細胞ペレットを、２００μＬの液体ＭＭＧ培地に再懸濁し、そして１００μＬアリコートの各細胞懸濁液を、１．５％寒天および２００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含有するＭＭＧ培地上でプレーティングした。３０℃、嫌気条件下での７２時間のインキュベーション期間後、３個のコロニーがコントロールプレート上で認められ、１３個のコロニーが６４１ＧａｐＸｙｌＡトランスポソームプレート上で認められ、そして１８個のコロニーが８０１ＧａｐＸｙｌＡトランスポソームプレート上で認められた。さらなる特徴付けのために、両方のトランスポソームプレート由来の６個のコロニーを無作為に選択し、そしてこれらを、ＭＭＸ培地および２００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含有する寒天プレート上にパッチした；増殖条件は上記のとおりであった。ＭＭＸ培地は、ＭＭＧ培地と同じであるが、但し、グルコースの代わりに５０ｇ／Ｌのキシロースを含有した。新鮮なＭＭＸ＋スペクチノマイシンプレート上での２回の増殖後、キシロース上で最も増殖した６つの株（各トランスポソームについて３つ）を、下記の実験に使用した。
【０１０７】
図１３Ａは、６４１Ｇａｐ−ＸｙｌＡトランスポソーム（＃６−１、＃６−３および＃６−５）によって得られた３つのＺＷ６４１株ならびにキシロース含有培地において８０１ＧａｐＸｙｌＡトランスポソーム（＃８−２、＃８−４および＃８−５）を受容した３つの株の線形増殖曲線を示す。同じデータを、図１３Ｂにおいて対数目盛でプロットする。この実験は、振盪フラスコ（１５０ｒｐｍで１５ｍｌ試験管中７ｍｌ培養液）中３０℃で実施し、そしてｍＲＭ３−Ｘ１０（１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ4および１００ｇ／Ｌキシロース）が増殖培地であった。培養は、上記のパッチしたプレート由来の１植菌耳の細胞から開始し、そして初期ＯＤは、極めて類似していた（約０．０２〜０．０３）。この実験のコントロールは、染色体に組み込まれた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸｙｌＡ／Ｂオペロンを駆動するＰｇａｐにおけるＧ→Ｔ置換を有するキシロース適応株ＺＷ６５８であった。
【０１０８】
親株（ＺＷ６４１）と同様に、６４１ＧａｐＸｙｌＡ発現カセットの染色体外に組み込まれた追加のコピーを有する３つの株では、キシロース含有培地における増殖が極めて不良であったが、特に、株＃６−５の増殖速度およびバイオマス収量（ＯＤ600）の両方においていくつかの若干の改善が認められたようであった（図１２Ａと図１３Ａとを比較すること）。対照的に、８０１ＧａｐＸｙｌＡトランスポゾンによって得られた３つのすべての株は、キシロース上で親株よりかなり良好に増殖した（図１３Ａおよび１３Ｂ）。事実、形質転換体のうちの２つ（＃８−４および＃８−５）は、この糖上において、６４１ＧａｐＸｙｌＡ発現カセットを含有するマルチコピープラスミドｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−ＧａｐＸｙｌＡを所有するＺＷ６５８およびＺＷ６４１形質転換体とほぼ同様に良好に増殖した（図１２と図１３とを比較すること）。転移は無作為な事象であり、そして６つのすべての株は、染色体の異なる場所に挿入された６４１ＧａｐＸｙｌＡまたは８０１ＧａｐＸｙｌＡ発現カセットを有するため、同じトランスポソームを使用してこの実験において観察された外来遺伝子発現の差異は、位置効果による可能性がある。例えば、位置効果は、＃６−１および＃６−３より良好な＃６−５の増殖、ならびに＃８−４および＃８−５より不良な＃８−２の増殖を説明し得る。それでも、分析した集団のサイズが小さいにもかかわらず、図１３に示す結果は、ＺＷ６５８およびＺＷ８０１−４において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸｙｌＡ／Ｂオペロンを駆動するＰｇａｐプロモーターに存在するＧ→Ｔ変異が、親株ＺＷ６４１と比較して、これらの株で観察されるより高いキシロースイソメラーゼ活性およびキシロース上でのより良好な増殖を担うという見解を強力に支持する。
【０１０９】
実施例９
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）におけるリボース５−リン酸イソメラーゼの６４１ＧＡＰプロモーターより高い発現レベルを指令する８０１ＧＡＰプロモーター
８０１ＧＡＰプロモーターが、実際に、６４１ＧＡＰプロモーターより強力である場合、発現に対するその刺激効果は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ遺伝子に限定されるべきではなく、そしてこのプロモーターを伴う他のタンパク質の発現もまた増強されることが予想される。この重要な問題に取り組むために、リボース５−リン酸イソメラーゼ（ＲＰＩ）をコードするＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）遺伝子を、両方のプロモーターに融合し、そしてキメラ遺伝子を、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）において複製するマルチコピープラスミドに挿入した。得られたＰｇａｐ−ＲＰＩ発現プラスミド（ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−６４１ＧａｐＲＰＩおよびｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−８０１ＧａｐＲＰＩ）をＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）に導入し、そしてＲＰＩ発現レベルを、下記のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０１１０】
ｐＺＢ１８８ａａｄＡ／Ｇａｐ／Ｚｙｍｏ ＲＰＩ／ＥｃｏｌｉＳＬの構築
プラスミドｐＺＢ１８８ａａｄＡ／Ｇａｐ／Ｚｙｍｏ ＲＰＩ／ＥｃｏｌｉＳＬは、本発明において使用した２つのＰｇａｐ−ＲＰＩ発現プラスミドの構築において重要な中間体であった。図１４に示すように、このプラスミドは、独特なＮｃｏＩ部位とＸｈｏＩ部位との間に局在するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）リボース５−リン酸イソメラーゼ（ＲＰＩ）遺伝子の発現カセットを含有する。下記のオーバーラップＰＣＲ技術を使用して、全長６４１ＧＡＰプロモーター配列（配列番号３４のｎｔ３１６〜６１９）およびＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＲＰＩ遺伝子の全オープンリーディングフレームを含有するキメラ遺伝子であるＲＰＩ発現カセットを作製した。ＲＰＩ ＯＲＦは、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ００８６９２）のｎｔ１２２４７３０〜１２２５２０３に対応し、そしてＲＰＩの開始コドンは、６４１ＧＡＰプロモーターの３’−末端に直接融合される。
【０１１１】
６４１ＧａｐプロモーターのテンプレートはｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−６４１ＧａｐＸｙｌＡであり、そしてＰＣＲ反応においてプライマー５および６（それぞれ、配列番号３９および４０）を使用して、このプラスミドから３２０ｂｐのＤＮＡフラグメントを増幅した。得られたＰＣＲ産物は、６４１ＧＡＰプロモーター、およびその３’−末端に付着し、ＧＴＧ開始コドンから開始するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＲＰＩ ＯＲＦの最初の１５ｂｐを含有する。このフラグメントはまた、クローニング目的のためにプライマー５の５’−末端に付加されたその５’−末端（小文字）において独特なＮｃｏＩ部位を有する。
プライマー５（配列番号３９）
ＣＡＴＧｃｃａｔｇｇＧＡＧＣＴＣＧＴＴＣＧＡＴＣＡＡＣＡＡＣＣＣＧＡＡＴＣＣＴＡ
プライマー６（配列番号４０）
ＣＡＣＡＧＣＡＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＴＴＡＴＴＣＴＣＣＴＡＡＣＴＴＡＴＴＡＡＧＴＡＧＣ
【０１１２】
個別のＰＣＲ反応において、プライマー７および８（それぞれ、配列番号４１および４２）を使用して、生来のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＲＰＩ遺伝子の全ＯＲＦを含有する４７３ｂｐフラグメントを作製した。増幅に使用したテンプレートは、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株ＺＷ８０１−４から単離されたゲノムＤＮＡであった。プライマー７の５’−末端は、３２０ｂｐの６４１ＧＡＰプロモーターフラグメントの３’−末端にハイブリダイズすることができるオーバーラップ配列の１５ｂｐを有すること、およびＸｈｏＩ部位（小文字）は、クローニング目的のためにプライマー８の５’−末端に付加されたことに留意すること。
プライマー７（配列番号４１）
ＧＴＴＡＧＧＡＧＡＡＴＡＡＡＣＧＴＧＡＣＣＴＣＴＧＣＴＧＴＧＣＣＡＴＣＡＡＡ
プライマー８（配列番号４２）
ＣＣＧｃｔｃｇａｇＣＴＡＧＡＴＡＴＴＧＡＡＣＴＧＡＧＧＡＴＴＣＧＡＡＡ
【０１１３】
次いで、プライマー５および８（それぞれ、配列番号３９および４２）を使用して、上記の２つのフラグメントをオーバーラップＰＣＲ反応に供し、そしてこの操作により、ＲＰＩ発現カセットが作製された。後者は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＲＰＩ ＯＲＦの開始コドンに直接融合された６４１ＧＡＰプロモーターを含有する７７８ｂｐフラグメントである。次いで、ＰＣＲ産物をＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで切断し、そして得られたフラグメントを、究極的にｐＺＢ１８８／ａａｄａ−６４１ＧａｐＸｙｌＡ（図６Ｃ）から誘導されたプラスミドのＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ部位に挿入して、最終産物ｐＺＢ１８８ａａｄＡ／Ｇａｐ／Ｚｙｍｏ ＲＰＩ／ＥｃｏｌｉＳＬ（図１４）を得た。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＲＰＩ発現ベクターであるこのプラスミドもまた、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸｙｌＡ／Ｂオペロンの遺伝子間領域に存在するステムループ領域を含有すること、およびこの安定化エレメントは、ＲＰＩ終止コドンの直ぐ下流のＸｈｏＩ部位とＮｏｔＩ部位との間に局在することに留意することが重要である。プラスミドｐＺＢ１８８ａａｄＡ／Ｇａｐ／Ｚｙｍｏ ＲＰＩ／ＥｃｏｌｉＳＬ（ＸｙｌＡステムループ構造を含む）に存在するＲＰＩ発現カセットのヌクレオチド配列は、配列番号４３に開示されている。示されているヌクレオチド配列は、ＮｃｏＩ部位とＮｏｔＩ部位との間に局在するＤＮＡフラグメントに対応し、そして両方の制限部位を含む。
【０１１４】
ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−６４１ＧａｐＲＰＩおよびｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−８０１ＧａｐＲＰＩの構築
ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−６４１ＧａｐＲＰＩおよびｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−８０１ＧａｐＲＰＩは、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＰｇａｐ−ＲＰＩ発現プラスミドであり、それらは、後者の構築物が、８０１ＧＡＰプロモーターと６４１ＧＡＰプロモーターとを区別するＧ→Ｔ置換を有することを除いて同一である。ｐＺＢ１８８ａａｄＡ／Ｇａｐ／Ｚｙｍｏ ＲＰＩ／ＥｃｏｌｉＳＬ由来の１２４０ｂｐのＤＮＡフラグメントを使用して、ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−６４１ＧａｐＸｙｌＡ（図６Ｃ）をｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−６４１ＧａｐＲＰＩ（図１５Ｂ）に、そしてｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−８０１ＧａｐＸｙｌＡ（図１０Ｃ）をｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−８０１ＧａｐＲＰＩ（図１５Ｃ）に変換した。ＤＮＡのこの部分は、ｐＺＢ１８８ａａｄＡ／Ｇａｐ／Ｚｙｍｏ ＲＰＩ／ＥｃｏｌｉＳＬをＡｓｉＳＩおよびＮｈｅＩで切断し、そしてアガロースゲル電気泳動によって、より小さなフラグメントを精製することによって、作製した。図１５Ａに示すように、ｐＺＢ１８８ａａｄＡ／Ｇａｐ／Ｚｙｍｏ ＲＰＩ／ＥｃｏｌｉＳＬは、独特なＡｓｉＳＩおよびＮｈｅＩ制限部位を有し、そして同じ部位が、ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−６４１ＧａｐＸｙｌＡおよびｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−８０１ＧａｐＸｙｌＡにも存在する。ＡｓｉＳＩは、８０１ＧＡＰプロモーターと６４１ＧＡＰプロモーターとを区別するＧ→Ｔ置換より下流のＰｇａｐにおいて、３つのすべてのこれらのプラスミドを切断すること、およびＮｈｅＩは、ＸｙｌＡまたはＲＰＩ終止コドンより約７００ｂｐ下流のプラスミド骨格を切断することに留意すること。従って、ｐＺＢ１８８ａａｄＡ／Ｇａｐ／Ｚｙｍｏ ＲＰＩ／ＥｃｏｌｉＳＬから得られた１２４０ｂｐのＤＮＡフラグメントは、６４１Ｇａｐプロモーターおよび８０１Ｇａｐプロモーターが共有するＤＮＡの小さなストレッチ、全ＲＰＩオープンリーディングフレームおよび安定化ＸｙｌＡステムループ領域を含有する。
【０１１５】
次の工程では、ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−６４１ＧａｐＲＰＩおよびｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−８０１ＧａｐＲＰＩの構築において、これらのプラスミドの両方をＡｓｉＳＩおよびＮｈｅＩで切断し、そして大きい方のベクターフラグメントを精製した後、上記の１２４０ｂｐのＤＮＡフラグメントを、個別の２つのライゲーション反応において、ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−６４１ＧａｐＸｙｌＡおよびｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−８０１ＧａｐＸｙｌＡのＡｓｉＳＩ部位とＮｈｅＩ部位との間に挿入した。エレクトロポレーションを使用して、両方のライゲーション反応混合物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂに導入し、そして形質転換体を、スペクチノマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上でプレーティングした；増殖は３７℃であった。最後に、ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−６４１ＧａｐＲＰＩ（図１５Ｂ）およびｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−８０１ＧａｐＲＰＩ（図１５Ｃ）プラスミドＤＮＡを、正確な構築物（ＤＮＡ配列解析によって確認される）を含有するコロニーから単離し、次いで、両方のプラスミドを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＣＳ１１０（ｄａｍ−、ｄｃｍ−）に導入して、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の形質転換のための非メチル化プラスミドＤＮＡを作製した。
【０１１６】
６４１ＧＡＰプロモーターおよび８０１ＧＡＰプロモーターを伴うＲＰＩの発現
エレクトロポレーションおよび非メチル化プラスミドＤＮＡを使用して、上記の２つのＰｇａｐ−ＲＰＩ発現ベクター（ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−６４１ＧａｐＲＰＩおよびｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−８０１ＧａｐＲＰＩ）を、野生型Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株ＺＷ１に導入した。形質転換細胞を、ＭＭＧ培地（５０ｇ／Ｌグルコース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／Ｌのトリプトン、２．５ｇ／Ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．２ｇ／ＬのＫ2ＨＰＯ4、および１ｍＭのＭｇＳＯ4）ならびに２００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含有する１．５％寒天プレート上、３０℃で嫌気的に増殖させた。６４１ＧＡＰ−ＲＰＩプラスミド（６４１ｇａｐＲｐｉ＃１および６４１ｇａｐＲｐｉ＃２）を含有する無作為に選択された２つのコロニー、ならびに８０１ＧＡＰ−ＲＰＩプラスミド（８０１ｇａｐＲｐｉ＃１および８０１ｇａｐＲｐｉ＃２）を所有する２つのコロニーを、同じ増殖培地を含有する１．５％寒天プレート上にパッチし、そしてプレートを、嫌気条件下で約２４時間、３０℃でインキュベートした。このプレートを使用して、ＲＰＩ発現実験のための種培養を開始した。
【０１１７】
種培養を１植菌耳の細胞から開始し、そして５ｍｌのＭＭＧ培地およびスペクチノマイシン（２００μｇ／ｍｌ）を含有する１５ｍｌキャップ付き試験管中３０℃（１５０ｒｐｍ）で増殖させた。この実験のコントロール（親株、ＺＷ１）を、同じ条件下で増殖させたが、但し、増殖培地はスペクチノマイシンを含まなかった。種培養を、飽和状態に到達させ、次いで、上記の同じ増殖培地および条件を使用して、５０ｍｌキャップ付き試験管中２０ｍｌ培養を開始するために使用した。初期ＯＤ600値は、すべての場合において約０．１２であった。指数期（ＯＤ600約１．１）中の培養物のアリコート（５００μＬ）を遠心分離（１５，０００×ｇ、１０分間）によって回収し、そして細胞ペレットを、２５０μＬの１Ｘ ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中に再懸濁した。電気泳動のためのすべての試薬は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得た。１ミリリットルの１Ｘ ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液は、２５０μＬのＮｕＰＡＧＥTMＬＤＳ ４Ｘ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（カタログ番号Ｎ０００７）、１００μＬのＮｕＰＡＧＥTMＳａｍｐｌｅ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ａｇｅｎｔ（カタログ番号ＮＰ０００４）および６５０μＬ蒸留水を含有する。サンプルを、１０分間、８０℃で加熱し、そして粒状破砕物を、遠心分離（１５，０００×ｇ、１０分間）によって取り出した。次いで、販売者が推奨するように、還元されたサンプルのＮｕＰＡＧＥTM１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（カタログ番号ＮＰ０３４１）およびＮｕＰＡＧＥTMＭＥＳ ＳＤＳ Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（カタログ番号ＮＰ０００２）プロトコルを使用して、澄明化したサンプルのアリコート（２０μＬ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ゲルを、室温、定電圧（１８０Ｖ）で約１時間、稼動させ、そして、製造者が推奨するように、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎ（カタログ番号ＬＣ６０６０）で染色した。
【０１１８】
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＲＰＩタンパク質の分子量は、オープンリーディングフレームのＤＮＡ配列に基づいて１６９２７．３７Ｄａである。図１６に示すように、親株、ＺＷ１では、いくらかの薄く染色されたタンパク質のバンドが、この領域（即ち、１７ｋＤａと１９ｋＤａとの分子量標準物質の間）までポリアクリルアミドゲルを泳動した（レーン２および７）。ゲルの目視検査により、６４１ＧＡＰ−ＲＰＩ発現プラスミドをＺＷ１に導入した場合（レーン３および５）、染色されたバンド（矢印で示す）の１つの強度が少なくとも２倍増加したことが示され、これがＲＰＩタンパク質であることが示された。さらに加えて、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＲＰＩのバンドの強度は、８０１ＧＡＰ−ＲＰＩ発現プラスミドを所有する２つの株（レーン４および６）では、かなり劇的に増加したことが、図１２においてかなり明白である。これらの結果は、８０１ＧＡＰプロモーターが６４８ＧＡＰプロモーターより強力なプロモーターであること、および後者は、極めて高いレベルで外来遺伝子を発現させるための有用なツールであることの説得力のある証拠を提供する。
【０１１９】
実施例１０
キシロース資化Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の独立して適応させた株の導入遺伝子ＧＡＰプロモーター領域の酵素活性および配列比較
また、ＺＷ６５８に類似の遺伝子導入および株適応の経過を使用して、株８ｂ（実施例１および米国特許出願公開第２００３０１６２２７１号明細書）を得たため、ペントースリン酸経路の導入遺伝子活性およびＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンの配列を、この独立した株の産生について部分的およびより完全に適応された株で比較した。部分的適応株８ＸＬ４および最終適応株８ｂにおけるＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンの産物の酵素活性を、一般的方法に記載の技術を使用して測定し、そしてμモルの産物／ｍｇタンパク質／分で表した結果を表２に示す。
【０１２０】
表２．異なるキシロース資化適応Ｚ．モビリス（Z.mobilis）株における酵素活性
【０１２１】
ＺＷ６５８より以前の株が、キシロース上での増殖の増強を可能にする変異をとらえた場合に生じる適応の場合と同様に、株８ｂでは、ｘｙｌＡＢオペロンでの両方の遺伝子の産物の活性が、その先祖株８ＸＬ４より増加した。さらに述べると、測定した酵素活性の増加は、それほど適応されていない株より約５倍増加した。
【０１２２】
８ｂおよび８ＸＬ４株においてｘｙｌＡＢオペロンの発現を指令するＰｇａｐを、配列決定した。ＰＣＲフラグメントを、プロモーターの５’末端由来の順方向ＰＣＲプライマー（ＧＡＰ−Ｆ８；配列番号４４）およびｘｙｌＡコード領域由来の逆方向プライマー（ＸｙｌＡＢ８５１Ｒ；配列番号５）を使用して、調製した。得られたＰＣＲ産物を、プライマーＧＡＰ−Ｆ８、ＸｙｌＡＢ４４９Ｒ、およびＸｙｌＡＢ８５１Ｒ（配列番号４４、４６、および４５）を使用して配列決定した。ＺＷ８ＸＬ４由来のプロモーター配列を配列番号３に示し、そして８ｂ由来のプロモーター配列を配列番号５に示す。ＺＷ６４１およびＺＷ６５８におけるｘｙｌＡＢオペロンのＰｇａｐにおける場合と同様に、これらのプロモーター配列もまた、両方とも、株ＣＰ４のＰｇａｐの公開された配列との間で１つの差異を有した。これらの共通の変化に加えて、ＺＷ６４１およびＺＷ６５８のＰｇａｐ配列の間にも１つの塩基対の違いが認められた。８ＸＬ４と８ｂとの比較では、開始ＡＴＧに対して−１８９位でのＧからＴへの変化が認められなかった一方、開始ＡＴＧに対して−８９位において、ＣからＴへの変化が生じた。
【０１２３】
株ＺＷ６５８のＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンのプロモーター配列の場合と同様に、新規の配列の制御下でのコード領域からのタンパク質の産生が、部分的に適応された株由来の同じプロモーターの配列よりも多く産生されることを可能にする新規の配列への適応中に、株８ｂのＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンのプロモーター配列が変化した。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００８年３月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／０３９８７１号明細書（本明細書において参照により援用される）の利益を主張する。
【０００２】
政府の権利についての陳述
本発明は、エネルギー省から授与された契約番号０４−０３−ＣＡ−７０２２４およびＤＥ−ＦＣ３６−０３ＧＯ１３１４６に基づく米国政府の助成により行われた。米国政府は、本発明において所定の権利を有する。さらに、米国政府は、米国エネルギー省と国立再生可能エネルギー研究所（ミッドウエスト研究所の一部局）との間の契約番号ＤＥ−ＡＣ３６−９９ＧＯ１０３３７に基づいて、本発明の権利を有する。
【０００３】
本発明は、微生物学および遺伝子操作の分野に関する。より具体的には、細菌においてキメラ遺伝子の発現を指令するための新規のプロモーターが同定された。
【背景技術】
【０００４】
微生物によるエタノールの産生は、化石燃料の代替的エネルギー源を提供し、従って、現在の重要な研究の分野である。キシロースは、加水分解されたリグノセルロース材料における主要ペントースであり、従って、多量に利用可能な低コストの炭素基質を提供することができるため、エタノール、ならびに他の有用な産物を産生する微生物は、キシロースを炭素源として使用することが可能であることが望ましい。天然ではキシロースを資化しないザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）および他のエタノール産生細菌は、１）キシロースからキシルロースへの変換を触媒するキシロースイソメラーゼ；２）キシルロースをリン酸化して、キシルロース５−リン酸を形成させるキシルロキナーゼ；３）トランスケトラーゼ；および４）トランスアルドラーゼをコードする遺伝子の導入によって、キシロース資化のために遺伝子操作することができる。
【０００５】
キシロース代謝についてＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株（米国特許第５５１４５８３号明細書、米国特許第５７１２１３３号明細書、米国特許第６５６６１０７号明細書、国際公開第９５／２８４７６号パンフレット、Ｆｅｌｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３８：３５４−３６１、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６７：２４０−２４３）、ならびにザイモバクター・パルメ（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ ｐａｌｍａｅ）株（Ｙａｎａｓｅ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｒｏｂｉｏｌ．７３：２５９２−２５９９）を操作することには成功している。しかし、典型的に、操作された株は、キシロース上では、グルコース上ほど良好に増殖せず、そしてエタノールを産生しない。この操作では、キシロース代謝のための異種タンパク質をコードする遺伝子はＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞において活性なプロモーター、典型的に、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターまたはＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）エノラーゼ遺伝子のプロモーターから発現されている。キシロース資化について操作された株は、キシロース培地上での継代培養によって適応され、改善されたキシロース資化を伴う株を生じており、米国特許第７，２２３，５７５号明細書ならびに同一出願人が所有しかつ同時係属中の米国特許出願公開第２００８０２８６８７０号明細書に記載されている。しかし、改善のための遺伝的基礎については決定されていない。
【０００６】
改善されたキシロース資化を有するザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、および他のエタノール産生細菌の遺伝子操作株の必要性が依然として存在する。出願人らは、キシロース資化遺伝子を発現するために使用することができる増加した活性を有する変異プロモーターを発見した。この活性は、これらのプロモーターを含む操作された株に改善されたキシロース資化を付与する。このプロモーターは他の遺伝子の発現に使用してもよい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、遺伝子発現、即ち、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（Ｐｇａｐ）の天然のプロモーターによって指令されるレベルより高いレベルの遺伝子発現を指令するザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、ザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）および関連細菌におけるキメラ遺伝子の発現のための、単離された変異プロモーターに関する。変異プロモーターは、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターの誘導体であり、そして特定の変異の存在により増加した活性を有する。このプロモーターは、コード領域または調節ＲＮＡの発現のための遺伝子操作において使用してもよい。これらのプロモーターによって指令されるキシロースイソメラーゼのコード領域の発現により、キシロース含有培地におけるキシロース資化性ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）の増殖が改善される。
【０００８】
本明細書では、−１９０位、−８９位、または−１９０位および−８９位の両方からなる群から選択される位置においてヌクレオチド置換を有するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターを含む単離された核酸分子であって、前記位置番号は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＣＰ４株およびＺＭ４株におけるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの天然のＡＴＧ翻訳開始コドンに対する番号である、単離された核酸分子について説明する。
【０００９】
また、本明細書では、次のものについても説明する：異種核酸分子に作動可能に連結された上記の単離された核酸分子を含むキメラ遺伝子；上記の核酸分子を含むベクター、ならびに細胞に上記の核酸分子を導入する工程を含む、細菌細胞を遺伝子操作する方法。
【００１０】
本発明の様々な実施形態は、以下の詳細な説明、図面、および本出願の一部をなす添付の配列の説明からさらに詳細に理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】トランスケトラーゼ（Ａ）の酵素アッセイのストラテジーを示す。
【図１Ｂ】トランスアルドラーゼ（Ｂ）の酵素アッセイのストラテジーを示す。
【図１Ｃ】キシロースイソメラーゼ（Ｃ）の酵素アッセイのストラテジーを示す。
【図１Ｄ】キシルロキナーゼ（Ｄ）の酵素アッセイのストラテジーを示す。
【図２】ＰｇａｐｘｙｌＡＢで形質転換したＴ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４Ｃ、およびＴ５Ｃ系統におけるキシロースイソメラーゼ（ＸＩ）およびキシルロキナーゼ（ＸＫ）活性のグラフを示す。
【図３】ＰｇａｐｘｙｌＡＢで形質転換したＴ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４Ｃ、およびＴ５Ｃ系統におけるトランスアルドラーゼ（ＴＡＬ）およびトランスケトラーゼ（ＴＫＴ）活性のグラフを示す。
【図４】選択された適応キシロース資化株コロニーの理論的エタノール収率％およびキシロース資化％のグラフを示す。
【図５】５％グルコースを含むＲＭ（リッチ培地）（ＲＭＧ）において５０代まで増殖する前および後の５％キシロースを含むＲＭ（ＲＭＸ５％）上で７０時間目の適応キシロース資化株の増殖のグラフを示す。
【図６Ａ−Ｂ】（Ａ）ｐＺＢ１８８；（Ｂ）ｐＺＢ１８８／ａａｄＡの略図を示す。
【図６Ｃ】（Ｃ）ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−ＧａｐＸｙｌＡのプラスミド地図の略図を示す。
【図６Ｄ】（Ｄ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセットＰｇａｐＸｙｌＡの略図を示す。
【図７Ａ−Ｂ】（Ａ）ｐＭＯＤTM−２−＜ＭＣＳ＞；（Ｂ）ｐＭＯＤ−リンカーのプラスミド地図を示す。
【図７Ｃ】（Ｃ）ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃのプラスミド地図を示す。
【図８】ｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷのプラスミド地図を示す。
【図９】ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−８０１ＧａｐＸｙｌＡのプラスミド地図を示す。
【図１０Ａ−Ｂ】（Ａ）ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−８０１ＧａｐＸｙｌＡ；（Ｂ）ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−ＧａｐＸｙｌＡのプラスミド地図を示す。
【図１０Ｃ】（Ｃ）ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−８０１ＧａｐＸｙｌＡのプラスミド地図を示す。
【図１１】Ｐｇａｐ−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現プラスミドを所有する３つの株（Ｘ１、Ｘ２およびＸ２）ならびにコントロールプラスミドを保持する３つの株（Ｃ１、Ｃ２およびＣ３）のキシロース含有培地における増殖曲線（ＯＤ６００対時間）のグラフを示す。
【図１２Ａ】（Ａ）線形目盛上にプロットした、スペクチノマイシンを伴わないキシロース含有培地における株ＺＷ６４１、ＺＷ６５８、Ｘ１およびＣ１の増殖曲線（ＯＤ６００対時間）のグラフを示す。
【図１２Ｂ】（Ｂ）対数目盛上にプロットした、スペクチノマイシンを伴わないキシロース含有培地における株ＺＷ６４１、ＺＷ６５８、Ｘ１およびＣ１の増殖曲線（ＯＤ６００対時間）のグラフを示す。
【図１３Ａ】（Ａ）線形目盛上にプロットした、株ＺＷ６５８と比較した、８０１Ｐｇａｐ−ＸｙｌＡが組み込まれた３つの株（＃８−２、＃８−４、＃８−５）および６４１Ｐｇａｐ−ＸｙｌＡが組み込まれた３つの株（＃６−１、＃６−３、＃６−５）の増殖曲線（ＯＤ６００対時間）のグラフを示す。
【図１３Ｂ】（Ｂ）対数目盛上にプロットした、株ＺＷ６５８と比較した、８０１Ｐｇａｐ−ＸｙｌＡが組み込まれた３つの株（＃８−２、＃８−４、＃８−５）および６４１Ｐｇａｐ−ＸｙｌＡが組み込まれた３つの株（＃６−１、＃６−３、＃６−５）の増殖曲線（ＯＤ６００対時間）のグラフを示す。
【図１４】ｐＺＢ１８８ａａｄＡ／Ｇａｐ／ＺｙｍｏＲＰＩ／ＥｃｏｌｉＳＬのプラスミド地図を示す。
【図１５Ａ】（Ａ）ｐＺＢ１８８ａａｄＡ／Ｇａｐ／ＺｙｍｏＲＰＩ／ＥｃｏｌｉＳＬのプラスミド地図を示す。
【図１５Ｂ−Ｃ】図１５−１続き。（Ｂ）ｐＺＢ１８８ａａｄＡ−６４１ＧａｐＲＰＩ；および（Ｃ）ｐＺＢ１８８ａａｄＡ−８０１ＧａｐＲＰＩのプラスミド地図を示す。
【図１６】ＲＰＩを発現する、異なるプロモーターを持つ株由来の全細胞タンパク質の染色されたタンパク質ゲルを示す。
【００１２】
本発明は、以下の詳細な説明、および本出願の一部をなす添付の配列の説明からさらに詳細に理解することができる。
【００１３】
以下の配列は、米国特許法施行規則第１．８２１〜１．８２５条（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則」）に従い、そして世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８年）ならびにＥＰＯおよびＰＣＴの配列表の要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、ならびに実施細則第２０８号および付属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列データに使用した記号および形式は米国特許法施行規則第１．８２２条に記載の規則に従う。
配列番号１は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＣＰ４株由来のＺｍＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号２は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＺＭ４株由来のＺｍＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号３は、ｐＺＢ４由来のＺｍＰｇａｐのヌクレオチド配列であり、これはまた、株ＺＷ６４１および８ＸＬ４のＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンにもある。
配列番号４は、株ＺＷ６５８由来の改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号５は、株８ｂ由来の改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号６は、ＰｇａｐのｐＺＢ４変種において−１９０（ＺＷ６５８）および−８９（８ｂ）変異の両方を伴う改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号７は、ＰｇａｐのＣＰ４変種においてＺＷ６５８由来の−１９０変異を伴う改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号８は、ＰｇａｐのＣＰ４変種において８ｂ由来の−８９変異を伴う改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号９は、ＰｇａｐのＣＰ４変種において−１９０（ＺＷ６５８）および−８９（８ｂ）変異の両方を伴う改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号１０は、ＰｇａｐのＺＭ４変種においてＺＷ６５８由来の−１９０変異を伴う改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号１１は、ＰｇａｐのＺＭ４変種において８ｂ由来の−８９変異を伴う改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号１２は、ＰｇａｐのＺＭ４変種において−１９０（ＺＷ６５８）および−８９（８ｂ）変異の両方を伴う改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号１３および１４は、ｐＺＢ４由来のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（Ｐｇａｐ）を含有するＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号１５および１６は、ｐＺＢ４由来のｔａｌコード領域を含有するＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号１７および１８は、Ｐｇａｐおよびｔａｌフラグメント由来のＰｇａｐｔａｌを含有するＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号１９および２０は、ｐＺＢ１８６由来のｌｏｘＰ：：Ｃｍを含有するＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号２１は、ｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍプラスミドの完全なヌクレオチド配列である。
配列番号２２および２３は、ｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍを収容する形質転換体におけるｔａｌおよびｔｋｔコード領域を含有する３ｋｂのＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号２４は、ｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍプラスミドの完全なヌクレオチド配列である。
配列番号２５および２６は、ｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍを伴うＴ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４ＣおよびＴ５Ｃ組み込み体由来の１．６ｋｂのＰｇａｐｘｙｌＡ ＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号２７および２８は、ＺＷ６４１およびＺＷ６５８由来のＰｇａｐを含有するＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号２９〜３１は、ＺＷ６４１およびＺＷ６５８由来のＰｇａｐを配列決定するためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号３２および３３は、Ｓｐｅｃr−カセットを含有するＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号３４は、キシロースイソメラーゼ発現カセットＰｇａｐＸｙｌＡの完全ヌクレオチド配列である。
配列番号３５および３６は、ｐＭＯＤ２−＜ＭＣＳ＞の異なるマルチクローニング部位を置換するために使用されるオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
配列番号３７および３８は、それぞれ、プラスミドｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−８０１ＧａｐＸｙｌＡおよびｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−６４１ＧａｐＸｙｌＡを得るため、ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃに挿入するための株ＺＷ８０１−４およびＺＷ６４１由来のＰｇａｐｘｙｌＡ領域の増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号３９および４０は、ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−６４１ＧａｐＸｙｌＡ由来のＰｇａｐの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列であり、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＲＰＩオープンリーディングフレームの最初の１５ｂｐを含む。
配列番号４１および４２は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＲＰＩオープンリーディングフレームの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号４３は、プラスミドｐＺＢ１８８ａａｄＡ／Ｇａｐ／ＺｙｍｏＲＰＩ／ＥｃｏｌｉＳＬに存在するＲＰＩ発現カセットの完全ヌクレオチド配列である。
配列番号４４および４５は、８ＸＬ４および８ｂ由来のＰｇａｐを含有するＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号４６は、８ＸＬ４および８ｂ由来のＰｇａｐを配列決定するためのプライマーの完全ヌクレオチド配列である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書では、細菌細胞におけるキメラ遺伝子の発現に使用することができる新規のプロモーターについて説明する。出願人らは、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターの異なる２つの変異のそれぞれはプロモーターによって指令される発現のレベルを個別に増加させることを発見した。１つの変異は−１９０位における変異であり、そして第２の変異は−８９位における変異である。これらの位置は、両方ともＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＣＰ４株およびＺＭ４株におけるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの天然のＡＴＧ翻訳開始コドンに対するものである。これらの変異のいずれか一方または両方を含有するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターは、作動可能に連結された異種のＤＮＡ配列を細菌細胞において発現させるために使用することができる。
【００１５】
明細書および特許請求の範囲の解釈のために、以下の略語および定義が使用される。
【００１６】
本明細書において使用する用語「含む」、「含んでいる」、「含む」、「含んでいる」、「有する」、「有している」、「含有する」もしくは「含有している」またはそれらの他の任意の表現は、非排他的な包含を含むことが意図される。例えば、要素のリストを含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置は、それらの要素のみに限定される必要はなく、明確に列挙されていない他の要素、あるいはそのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置に本来備わっている他の要素を含んでもよい。さらに、異なることを述べている場合を除き、「または」は、包含的論理和を指すものであって、排他的論理和を指すものではない。例えば、条件ＡまたはＢは、次のもののいずれか１つによって満たされる：Ａが真であり（または存在し）かつＢが偽であること（または存在しないこと）、Ａが偽であり（または存在せず）かつＢが真であること（または存在すること）、ならびにＡおよびＢが両方とも真であること（または存在すること）。
【００１７】
また、本発明の要素または成分の前に置かれている不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、要素または成分の事例（即ち、発生）の数に関して非制限的であることが意図される。従って、「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは少なくとも１つを含むものと読み取るべきであり、そして要素または成分の単数形もまた、数が明らかに単数であることを意味しない限り、複数を含む。
【００１８】
「遺伝子」は、コード配列の前（５’非コード配列）および後（３’非コード配列）に調節配列を含み得る特定のタンパク質または機能的ＲＮＡ分子を発現する核酸フラグメントを指す。「生来の遺伝子」または「野生型遺伝子」は、それ自体の調節配列と共に天然に見出されるような遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然には一緒に見出されない調節およびコード配列を含んでなる、生来の遺伝子ではない任意の遺伝子を指す。従って、キメラ遺伝子は、異なる起源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ起源に由来するが、しかし天然に見出されるものとは異なる様式で配列される調節配列およびコード配列を含んでなることができる。「内因性遺伝子」は、生物体のゲノム内の天然の位置にある生来の遺伝子を指す。「外来」遺伝子は、宿主生物体内に通常は見出されない遺伝子を指すが、しかしこれは遺伝子導入により宿主生物体内に導入される。外来遺伝子は、非生来の生物体内に挿入された生来の遺伝子、またはキメラ遺伝子を含んでなることができる。
【００１９】
用語「遺伝子構築物」は、１つ以上の特定のタンパク質または機能的ＲＮＡ分子の発現をコードする核酸フラグメントを指す。遺伝子構築物において、遺伝子は、生来、キメラ、または自然にはない外来性のものであってもよい。典型的に、遺伝子構築物は、「コード配列」を含んでなる。「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。
【００２０】
「プロモーター」または「開始制御領域」は、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列は、プロモーター配列の３’側に局在する。プロモーターは、そのままの形で生来の遺伝子から誘導することができるか、または天然に見出される多様なプロモーターから誘導される多様なエレメントからなるか、またはなお、合成ＤＮＡセグメントを含んでなり得る。当業者であれば、多様なプロモーターは多様な組織もしくは細胞タイプ、または多様な発生段階において、あるいは多様な環境条件に応答して、遺伝子の発現を指令することができることを理解している。ほとんどの時期におけるほとんどの細胞タイプにおいて遺伝子を発現させるプロモーターを、通常、「構成性プロモーター」と呼ぶ。
【００２１】
本明細書において使用する用語「発現」は、遺伝子に由来するコード（ｍＲＮＡ）または機能的ＲＮＡの転写および安定な蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指すことができる。「アンチセンス阻害」は、標的タンパク質の発現を抑制することが可能であるアンチセンスＲＮＡ転写物の産生を指す。「過剰発現」は、通常の産生レベルを超えるトランスジェニック生物体または非形質転換生物体における遺伝子産物の産生を指す。「共抑制」は、同一または実質的に類似する外来または内因性遺伝子の発現を抑制することが可能であるセンスＲＮＡ転写物または断片の産生を指す（米国特許第５，２３１，０２０号明細書）。
【００２２】
本明細書において使用する「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」は、イントロンを含まず、かつ細胞によってタンパク質に翻訳され得るＲＮＡを指す。
【００２３】
本明細書において使用する「形質転換」は、遺伝的に安定に遺伝する核酸フラグメントの宿主生物体への伝達を指す。伝達された核酸は、宿主細胞において維持されるプラスミドの形態であってもよく、またはある伝達された核酸を宿主細胞のゲノムに組込んでもよい。形質転換された核酸フラグメントを含有する宿主生物体を「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換された」生物体と呼ぶ。
【００２４】
本明細書において使用する用語「プラスミド」および「ベクター」は、しばしば細胞の中心的代謝の部分ではない遺伝子を担持する染色体外エレメントを指し、通常は、環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である。そのようなエレメントは、任意の起源に由来する一本鎖または二本鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡの自律的反復配列、ゲノム組込み配列、ファージもしくはヌクレオチド配列で、線状あるいは環状であってもよく、ここで、プロモーターフラグメントおよび適切な３’非翻訳配列を伴う選択された遺伝子産物に対するＤＮＡ配列を細胞に導入することが可能である独特な構築物に、多くのヌクレオチド配列が接続または組換えられている。
【００２５】
用語「作動可能に連結される」は、一方の機能が他方によって影響されるような、単一の核酸フラグメントに対する核酸配列の会合を指す。例えば、プロモーターは、それがコード配列の発現に影響を及ぼすことが可能である場合、コード配列に作動可能に連結される（即ち、コード配列はプロモーターの転写制御下にある）。コード配列は、センスまたはアンチセンス配向で調節配列に作動可能に連結され得る。
【００２６】
用語「選択マーカー」は、同定因子、通常、マーカー遺伝子の効果、即ち、抗生物質に対する耐性に基づいて選択することが可能な抗生物質または化学耐性遺伝子を意味し、ここで、効果は、目的の核酸の遺伝を追跡する、および／または目的の核酸を受け継いでいる細胞もしくは生物体を同定するために使用される。
【００２７】
用語「異種の」は、注目の位置において天然では見出されないことを意味する。例えば、異種遺伝子は、宿主生物体内において天然では見出されないが、遺伝子導入により宿主生物体内に導入される遺伝子を指す。例えば、キメラ遺伝子に存在する異種核酸分子は、天然では相互に関連しないコード領域およびプロモーターセグメントを有する核酸分子のような、キメラ遺伝子の他方のセグメントと関連することが天然では見出されない核酸分子である。
【００２８】
本明細書において、「単離された核酸分子」は、場合により、合成、非天然もしくは改変されたヌクレオチド塩基を含有していてもよい一本鎖または二本鎖であるＲＮＡあるいはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡのポリマーの形態の単離された核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つもしくはそれ以上のセグメントからなり得る。
【００２９】
用語「Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター」および「ＺｍＰｇａｐ」は、天然では、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムにおいてグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼコード領域の上流に存在するヌクレオチド配列を有するプロモーター活性を伴う核酸分子を指す。これらの用語は、ＣＰ４株およびＺＭ４株のようなＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の株のプロモーター（それぞれ、配列番号１および２）、ならびにｐＺＢ４のＺｍＰｇａｐ（配列番号３）のような、実質的に異ならないレベルでの発現を指令する配列および／または長さが異なる変種を指す。
【００３０】
ここで使用した標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野において周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９（以後、「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；ならびにＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８４；ならびにＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅにより出版、１９８７に記載されている。
【００３１】
改善されたグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターの発見
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＺｍＰｇａｐまたはＰｇａｐ）の天然のプロモーターは、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）およびザイモバクター・パルメ（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ ｐａｌｍａｅ）におけるキメラ遺伝子の発現に使用されている。キシロース代謝のための遺伝子を発現させるためにＺｍＰｇａｐを使用した場合、得られるキシロース資化は、典型的には所望されるほど効果的でなかった。さらに、限定的なキシロース資化能力を有する４つのキシロース代謝酵素（キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスケトラーゼ、およびトランスアルドラーゼ）を発現するように操作された組換えＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株が、改善されたキシロース資化のためキシロース培地に対して適応された（同一出願人が所有しかつ同時係属中の米国特許出願公開第２００８０２８６８７０号明細書に記載されている）。
【００３２】
出願人らは、本明細書において実施例３に記載のように、ＺＷ６５８（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７８５８）と呼ばれる改善されたキシロース資化株が、ＺｍＰｇａｐから発現されるオペロン（ＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロン）としてゲノムに組み込まれたキシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼ酵素の発現を増加することを発見した。出願人らは、作動可能に連結されたコード領域の発現の増加を指令するプロモーターを担うＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンのプロモーターに新規の１つのヌクレオチド変化が存在することをさらに発見した。ヌクレオチド変化は、キシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼ活性の増加を有さなかったＺＷ６５８に対する前駆体株におけるＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンのＺｍＰｇａｐの配列と比較して、株ＺＷ６５８におけるＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンのＰｇａｐの配列において新規のものである。それ故、この１つのヌクレオチド変化を有するＰｇａｐは、改善されたプロモーターである。
【００３３】
出願人らは、さらに、４つのキシロース資化酵素をコードする遺伝子で個別に操作し、そして改善されたキシロース資化について個別に適応されたＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株（米国特許第７，２２３，５７５号明細書に記載の株８ｂ）もまた、ＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンとしてゲノムに組み込まれたキシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼ酵素の発現を増加することを発見した。出願人らは、ＺＷ６５８ Ｐｇａｐのヌクレオチド変化とは異なる位置にある８ｂ株におけるＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンのＰｇａｐの新規の１つのヌクレオチド変化が存在することをさらに発見した。ＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンによってコードされるキシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼ酵素の発現の増加に基づいて、ＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンの変異Ｐｇａｐもまた、改善されたプロモーターを提供する。
【００３４】
ＺＷ６５８および８ｂ株ＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンのＰｇａｐにおいて新たに同定されたヌクレオチド変化は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＣＰ４株およびＺＭ４株におけるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの天然のＡＴＧ翻訳開始コドンに対してそれぞれ、−１９０および−８９位に存在する。発見した−１９０位のヌクレオチド変化はＧからＴへの変化であり、そして発見した−８９位のヌクレオチド変化はＣからＴへの変化である。
【００３５】
位置番号は配列の変動によって変化し得るため、塩基の変化の配列構成は重要な因子である。
【００３６】
−１９０位置は、配列構成：
における位置である。
太字および下線を付したＧは、変異によってＴに変化する塩基である。この位置は、ＣＰ４株およびＺＭ４株のＺｍＰｇａｐ配列においては−１９０位であるが、ｐＺＢ４中のプロモーター配列では−２１位のＴが欠失しているため、ｐＺＢ４においては−１８９位である。
【００３７】
−８９位置は、配列構成：
における位置である。
太字および下線を付したＣは、変異によってＴに変化する塩基である。この位置は、ＣＰ４株およびＺＭ４株のＺｍＰｇａｐ配列においては−８９位であるが、ｐＺＢ４中のプロモーター配列では−２１位のＴが欠失しているため、ｐＺＢ４においては−８８位である。本発明のプロモーターは、−１９０位、−８９位、またはこれらの位置の両方においてＺｍＰｇａｐのヌクレオチド変化を有する。好ましくは、変化は、−１９０位におけるＧからＴへの変化であり、そして−８９位におけるＣからＴへの変化である。これらの改変を含む本発明のプロモーターは、改善されたＰｇａｐｓである。
【００３８】
−１９０位および−８９位における他のヌクレオチドへの変化は、ＺｍＰｇａｐの改善された活性を提供し得る。加えて、ＺｍＰｇａｐ内の他の位置におけるヌクレオチド変化も、プロモーターの改善された活性を提供し得る。
【００３９】
ＺｍＰｇａｐの天然に存在する配列は単一の配列ではなく、プロモーターの機能に対して実質的な影響を及ぼさないいくつかの変動を配列内に有していることがある。プロモーターの機能に対して実質的な影響を及ぼさないとは、プロモーター配列が、天然のザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）株に存在するＺｍＰｇａｐによって指令される発現のレベルと実質的に同様の発現レベルを指令することを意味する。配列の変動は、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの天然のＡＴＧ翻訳開始コドンに対する−２９位のＣＰ４株およびＺＭ４株（それぞれ、配列番号１および２）（ここで、ＣＰ４ではＡが存在し、そしてＺＭ４ではＧが存在する）の間の差異のように、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）の異なる単離体または株の間で自然に発生し得る。
【００４０】
天然に存在する配列の変動に加えて、機能に実質的に影響を及ぼさないヌクレオチド変化が、当業者に公知のＰＣＲ、クローニング、形質転換、および株増殖を含む日常的な操作手順の間に発生し得る。例には、−２１位においてＴの欠失を有するｐＺＢ４のＺｍＰｇａｐがある。
【００４１】
プロモーターの機能に実質的に影響を及ぼさない、異なる天然の株または操作された株において生じるＺｍＰｇａｐ配列の任意のヌクレオチド変化は、ｐＺＢ４のＺｍＰｇａｐに存在する−２１位後方のＴの欠失（配列番号３）のようなＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターの配列に存在し得る。それ故、プロモーターの機能に影響を及ぼす、即ち、実質的にプロモーターの機能を改善する上記の−１９０位および−８９位における変異は、実質的に同様の活性（天然のレベル）を伴うＺｍＰｇａｐ配列のいずれかにおいて作製してもよく、そして機能に影響を及ぼさない変動と共に同時に発生することができる。
【００４２】
−１９０位および／または−８９位において記載の変異を伴う改善されたＰｇａｐ変異配列の例として、株ＺＷ６５８由来のプロモーター配列（配列番号４）、株８ｂ由来のプロモーター配列（配列番号５）、およびｐＺＢ４由来である同じＺｍＰｇａｐ変異体の二重変異（配列番号６）が挙げられる。改善されたＰｇａｐ配列のさらなる例には、ＣＰ４由来のＺｍＰｇａｐ変種における−１９０位の変異、−８９位の変異、または二重変異（それぞれ、配列番号７、８、および９）ならびにＺＭ４由来のＺｍＰｇａｐ変種における−１９０位の変異、−８９位の変異、または二重変異（それぞれ、配列番号１０、１１、および１２）がある。
【００４３】
加えて、プロモーターの機能に実質的に影響を及ぼさないＺｍＰｇａｐの長さの変動も生じる。本発明は、−１９０位の変異および／または−８９の変異が追加される前の活性に実質的な変化を有さない、様々な長さのＺｍＰｇａｐにＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＣＰ４株およびＺＭ４株におけるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの天然のＡＴＧ翻訳開始コドンに対して、−１９０位および／または−８９位に記載の変異を有する改善されたＰｇａｐを含む。
【００４４】
改善されたＰｇａｐの調製
−１９０位および／または−８９位における記載の変異は、当業者に公知に任意の方法によってＺｍＰｇａｐ核酸分子に導入してもよい。例えば、変異および周囲のＤＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、そしてより大きなプロモーターＤＮＡフラグメントにクローニングして、変異を伴わないセグメントと置換してもよい。変異およびいくつかの隣接するプロモーター配列を含有するプライマーを、合成し、そしてＰＣＲに使用して、プロモーターフラグメントを調製してもよい。全プロモーターＤＮＡフラグメントを、共にライゲートされる複数のオリゴヌクレオチドとして合成してもよい。部位特異的変異誘発を使用して、変異を導入してもよい。加えて、ＺＷ６５８株または８ｂ株由来のＤＮＡをテンプレートして使用して、ＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントとして変異プロモーターを調製してもよい。
【００４５】
キメラ遺伝子およびベクターにおける改善されたＰｇａｐ、細菌細胞への導入
本発明のプロモーターを、細菌細胞中で発現させようとする異種核酸分子（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｎｕｃｌｅｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）に作動可能に連結し、本発明のキメラ核酸分子、またはキメラ遺伝子を形成する。キメラ遺伝子の設計および構築は、当業者に周知である。キメラ遺伝子は、典型的にはプロモーター、発現させようとする異種核酸分子、および３’末端制御領域を含む。末端制御領域は様々な遺伝子に由来してよく、そしてしばしば、標的宿主細胞に生来備わる遺伝子から採取される。作動可能に連結された異種核酸分子は、細菌細胞においてその発現が所望されるいずれの核酸分子であってもよく、例えば、タンパク質またはペプチドのためのコード領域、または機能的ＲＮＡの発現のための核酸を含む。機能的ＲＮＡとして、例えば、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、および干渉ＲＮＡが挙げられる。さらに、本明細書に記載のプロモーター、およびプロモーターから発現される複数のコード領域を含むオペロンを構築してもよい。
【００４６】
本明細書に記載のプロモーターは、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）に属する細菌における発現のためのキメラ遺伝子において使用することができる。キメラ遺伝子は、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）の産物の産生に関与する任意のタンパク質の発現のために使用することができる。例えば、アラニンのようなアミノ酸またはソルビトールもしくはキシリトールの合成に関与する１つもしくはそれ以上の酵素をこれらのプロモーターを有するキメラ遺伝子から発現させることができる。キメラ遺伝子は、キシロースを資化しない天然のザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）もしくはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）株において発現させることができ、またはキシロース資化株において発現させることもできる。また、本明細書に記載のプロモーターは、キシロース代謝または別の代謝経路に関連する酵素の発現に使用することができる。
【００４７】
本明細書に記載のキメラ遺伝子は、さらなる操作のために、典型的にはベクター中に構築されるかまたはベクターにトランスファーされる。ベクターは当該技術分野において周知である。ある種のベクターは広範な宿主細菌において複製することが可能であり、そして接合によってトランスファーすることができる。ｐＲＫ４０４ならびに３つの関連ベクター：ｐＲＫ４３７、ｐＲＫ４４２、およびｐＲＫ４４２（Ｈ）の完全かつ注釈付き配列が利用可能である。これらの誘導体はグラム陰性菌における遺伝子操作のための価値のあるツールであることが証明されている（Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ ５０（１）：７４−７９（２００３））。
【００４８】
他の周知のベクターを様々な標的宿主細胞に使用してもよい。異なる宿主に有用なベクターの例が、同一出願人が所有しかつ同時係属中の米国特許出願公開第２００７００９２９５７Ａ１号明細書、１１〜１３頁（本明細書において参照として援用される）に記載されている。米国特許第５，５１４，５８３号明細書に記載のｐＺＢ１８８のような大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の両方において複製することができるベクターが、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）における発現に特に有用である。ベクターとして、細胞における自律複製のためのプラスミド、および細菌のゲノムに組み込もうとする構築物を担持するプラスミドを挙げることができる。ＤＮＡ組み込みのためのプラスミドとして、トランスポゾン、標的細菌ゲノムに対して相同の核酸配列の領域、または組み込みを支持する他の配列を挙げることができる。さらなるタイプのベクターは、例えば、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）から市販されているシステムを使用して、産生されるトランスポゾンであってもよい。所望される標的宿主および所望される機能のための適切なベクターを選択するための仕方は周知である。
【００４９】
本明細書に記載のプロモーターはまた、発現のために作動可能に連結された核酸分子を有しないベクター中で構築し、内因性コード領域の隣に組み込んで細菌ゲノム中の内因性プロモーターと置き換えるか、または例えばオペロン内のコード領域にプロモーターを付加してもよい。染色体上でのプロモーターの置き換えは、Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ（Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．（２００６）８：７９−９０）、およびＷｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．（Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００７）５３：５６−６２）に記載のような方法を使用して、達成してもよい。
【００５０】
本明細書に記載のプロモーターを含むベクターを、周知の方法、例えば、凍結融解形質転換、カルシウム仲介形質転換、エレクトロポレーション、または接合を使用して、細菌細胞に導入することができる。
【００５１】
改善されたＰｇａｐを使用する異種核酸分子の発現
本明細書に記載の改善されたＰｇａｐを使用して、増加したレベルのキメラ遺伝子発現を得ることができる。改善されたＰｇａｐおよびキシロースイソメラーゼコード領域を含む、ゲノムに組み込まれた構築キメラ遺伝子が実施例８に示されており、これによりキシロース代謝のためのタンパク質をコードする遺伝子を発現するように操作されたＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞のキシロース培地における改善された増殖が可能となった。キシロース上での改善された増殖を実施例３および１０に示した。これはキシロースイソメラーゼ活性およびキシルロキナーゼ活性のより高いレベルの発現に関連している。キシロース上でのより良好な増殖に適応され、そしてキシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼの発現を指令する改善されたＰｇａｐを有するキシロース資化Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の株は、キシロース資化が改善された。キシロースイソメラーゼ活性およびキシルロキナーゼ活性は、キシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼの発現を指令する改善されたＰｇａｐを持たない株より約４〜５倍高かった。
【００５２】
本発明の改善されたＰｇａｐを含有し、安定なプラスミド上に位置するキメラ遺伝子の増加したレベルの発現も本明細書の実施例９に示した。リボース５−リン酸イソメラーゼ（ＲＰＩ）をコードする異種配列に作動可能に連結された改善されたＰｇａｐを有するキメラ遺伝子は、ＺｍＰｇａｐを含有するキメラ遺伝子から産生される量と比較して、より多量のＲＰＩタンパク質を産生した。
【実施例】
【００５３】
本実施例は、本明細書に記載の本発明を例示する。
【００５４】
一般的方法
ここで使用した標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野において周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ，第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８９）（以後、「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；ならびにＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．，ａｎｄ Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）；ならびにＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅにより出版、Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ（１９８７）に記載されている。
【００５５】
略語の意味は次のとおりである：「ｋｂ」はキロベースを意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｎｔ」はヌクレオチドを意味し、「ｈｒ」は時間を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍｌ」はミリリットルを意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｍＭ」はミリモルを意味し、「μＭ」はマイクロモルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモルを意味し、「ｐｍｏｌ」はピコモルを意味し、「Ｃｍ」はクロラムフェニコールを意味し、「Ｃｍr」はクロラムフェニコール耐性を意味し、「Ｃｍs」はクロラムフェニコール感受性を意味し、「Ｓｐr」はスペクチノマイシン耐性を意味し、「Ｓｐs」はスペクチノマイシン感受性を意味し、「ＸＩ」はキシロースイソメラーゼであり、「ＸＫ」はキシルロキナーゼであり、「ＴＡＬ」はトランスアルドラーゼであり、「ＴＫＴ」はトランスケトラーゼであり、「ＥＦＴ」は発酵経過時間を意味し、「ＲＭ」は１０ｇ／Ｌの酵母抽出物＋２ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4を含有するリッチ培地を意味し、「ＭＭ」は１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、５ｇ／Ｌのトリプトン、２．５ｇ／Ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4および０．２ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4を含有する接合培地（ｍａｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）を意味する。
【００５６】
酵素アッセイのためのザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の無細胞抽出物の調製
細胞を、５０ｍｌのＲＭ＋２％グルコース中、３０℃で１晩、１．０〜１．２のＯＤ600まで増殖させた。細胞を４５００ｒｐｍで１０分間、４℃にて遠心分離により回収した。上清を廃棄し、細胞ペレットを２５ｍｌ氷冷音波処理用緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．６、１０ｍＭのＭｇＣｌ2）で洗浄し、続いて、４５００ｒｐｍで１０分間、遠心分離を行った。ペレットを２．０〜２．５ｍｌ音波処理用緩衝液＋１ｍＭジチオスレイトールに再懸濁した。５００μＬアリコートを、１分間、エッペンドルフ遠心管中、４℃で遠心分離した。上清のほとんどを廃棄し、約１０〜２０μＬを残してペレットの乾燥を防止した。細胞を凍結し、アッセイを行うまで約８０℃で貯蔵した。アッセイの前に細胞を融解し、そして５００μＬの音波処理用緩衝液＋１ｍＭジチオスレイトールで再懸濁した。混合物を、Ｂｒａｎｓｏｎ ｓｏｎｉｆｉｅｒ ４５０を使用して、４５秒間、６２％デューティサイクルおよび２の出力制御関数で、２回音波処理し、各音波処理の間に、約３〜５分間、サンプルを冷却した。サンプルを１４，０００ｒｐｍで６０分間、Ｂｅｃｋｍａｎ微量遠心機中、４℃で遠心分離した。上清を新しい試験管に移し、４℃で保持した。タンパク質濃度を決定するためにピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）ＢＣＡアッセイを使用した。
【００５７】
この酵素が他の酵素要素より不安定であるため、通常、最初にトランスケトラーゼ（ＴＫＴ）アッセイを実施した。ＴＫＴアッセイの概念図を図１Ａに示す。
【００５８】
マイクロプレートアッセイでは、２０μＬの無細胞抽出物を次の最終濃度の成分を含んだ反応混合物の各ウェルに３０℃で添加した：０．３７ｍＭのＮＡＤＰ、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ７．５、８．４ｍＭのＭｇＣｌ2、０．１ｍＭのＴＰＰ（（チアミン塩化ピロリン酸）、０．６ｍＭのＥ４Ｐ（エリトロース−４−リン酸）、４ｍＭのＢＨＰ（βヒドロキシピルビン酸）、４Ｕ／ｍｌのＰＧＩ（ホスホグルコースイソメラーゼ）、および４Ｕ／ｍｌのＧ６ＰＤ（グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）。Ａ340を、３〜５分間、プレートリーダー上で読み取った。ＴＫＴ活性を以下のとおりに算出した：
１単位は、３０℃における１μｍｏｌのＤ−フルクトース６−リン酸／分の形成に対応する。
Ｕ（μモル／分）＝勾配（ｄＡ340／分）＊反応物の体積（μＬ）／６２２０／０．５５ｃｍ
（ＮＡＤＰ→ＮＡＤＰＨのモルは１ｃｍキュベットにおける１Ｌあたり１モルあたり６２２０ Ａ340である）
（マイクロプレートにおける１ウェルあたり２００μＬの路長＝０．５５ｃｍ）
比活性（μモル／分−ｍｇ）＝μモル／分／タンパク質濃度（ｍｇ）
【００５９】
トランスアルドラーゼ（ＴＡＬ）アッセイの基礎を図１Ｂに示す。マイクロプレートアッセイでは、２０μＬの無細胞抽出物を次の最終濃度の成分を含んだ反応混合物の各ウェルに３０℃で添加した：０．３８ｍＭのＮＡＤＨ、８７ｍＭトリエタノールアミン、１７ｍＭのＥＤＴＡ、３３ｍＭのＦ６Ｐ（フルクトース−６−リン酸）、１．２ｍＭのＥ４Ｐ（エリトロース−４−リン酸）、２．０Ｕ／ｍｌのＧＤＨ（グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）、および２０Ｕ／ｍｌのＴＰＩ（トリオースリン酸イソメラーゼ）。プレートを５分間、インキュベートし、次いで、Ａ340を３〜５分間、読み取った。ＴＡＬ活性を以下のとおりに算出した：
１単位は、３０℃における１分間あたりの１μｍｏｌのＤ−グリセルアルデヒドの形成に対応する。
Ｕ（μモル／分）＝勾配（ｄＡ340／分）＊反応物の体積（μＬ）／６２２０／０．５５ｃｍ
（ＮＡＤＨ→ＮＡＤのモルは１ｃｍキュベットにおける１Ｌあたり１モルあたり６２２０ Ａ340である）
（マイクロプレートにおける１ウェルあたり２００μＬの路長＝０．５５ｃｍ）
比活性（μモル／分−ｍｇ）＝μモル／分／タンパク
【００６０】
キシロースイソメラーゼ（ＸＩ）アッセイの基礎を図１Ｃに示す。マイクロプレートアッセイでは、２０μＬの無細胞抽出物を、次の最終濃度の成分を含んだ反応混合物の各ウェルに３０℃で添加した：０．２５６ｍＭのＮＡＤＨ、５０ｍＭキシロース、１０ｍＭのＭｇＳＯ4、１０ｍＭトリエタノールアミン、および１Ｕ／ｍｌのＳＤＨ（ソルビトールデヒドロゲナーゼ）。Ａ340を、３〜５分間、プレートリーダー上で読み取った。ＸＩ活性を以下のとおりに算出した：
１単位のＸＩは、３０℃における１分間あたりの１μモルのＤ−キシルロースの形成に対応する。
Ｕ（μモル／分）＝勾配（ｄＡ340／分）＊反応物の体積（μＬ）／６２２０／０．５５ｃｍ
（ＮＡＤＨＰ→ＮＡＤのモルは１ｃｍキュベットにおける１Ｌあたり１モルあたり６２２０ Ａ340である）
（マイクロプレートにおける１ウェルあたり２００μＬの路長＝０．５５ｃｍ）
比活性（μモル／分−ｍｇ）＝μモル／分／タンパク質濃度（ｍｇ）
【００６１】
キシルロキナーゼ（ＸＫ）アッセイの基礎を図１Ｄに示す。
マイクロプレートアッセイでは、２０μＬの無細胞抽出物を次の最終濃度の成分を含んだ反応混合物の各ウェルに３０℃で添加した：０．２ｍＭのＮＡＤＨ、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ７．５、２．０ｍｍのＭｇＣｌ2−６Ｈ2Ｏ、２．０ＭのＡＴＰ、０．２ＭのＰＥＰ（ホスホエノールピルビン酸）、８．５ｍＭのＤ−キシルロース、５Ｕ／ｍｌのＰＫ（ピルビン酸キナーゼ）、および５Ｕ／ｍｌのＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）。Ａ340を、３〜５分間、プレートリーダー上で読み取った。ＸＩ活性を以下のとおりに算出した：
１単位は、３０℃における１分間あたりの１μモルのＤ−キシルロースからＤ−キシルロース−５−リン酸への形成に対応する。
Ｕ（μモル／分）＝勾配（ｄＡ340／分）＊反応物の体積（μＬ）／６２２０／０．５５ｃｍ
（ＮＡＤＨ→ＮＡＤのモルは１ｃｍキュベットにおける１Ｌあたり１モルあたり６２２０ Ａ340である）
（マイクロプレートにおける１ウェルあたり２００μＬの路長＝０．５５ｃｍ）
比活性（μモル／分−ｍｇ）＝μモル／分／タンパク質濃度（ｍｇ）
【００６２】
ＨＰＬＣ方法
分析は、ＬＣ ３ＤのＡｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズＨＰＬＣおよびＡｇｉｌｅｎｔ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアで行った。カラムは、ＢｉｏＲａｄ Ｍｉｃｒｏ−Ｇｕａｒｄ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ Ｃａｔｉｏｎ−Ｈ（１２５−０１２９）を伴うＢｉｏＲａｄ Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈ（ＨＰＬＣ Ｏｒｇａｎｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｃｏｌｕｍｎ １２５−０１４０）であった。操作条件は以下のとおりであった：
【００６３】
【００６４】
実施例１
キシロース発酵性ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）株の構築
同一出願人が所有しかつ同時係属中の米国特許出願公開第２００８０２８６８７０号明細書に記載のように、キシロース発酵性ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）の株を、連続的な転位事象を介して、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼをコードする４つのキシロース資化遺伝子を含有する２つのオペロン、ＰｇａｐｘｙｌＡＢおよびＰｇａｐｔａｌｔｋｔをＺＷ１（ＡＴＣＣ番号３１８２１）のゲノムに組み込むことによって構築し、続いて、キシロースを含有する選択培地に適応した。以前に、米国特許出願公開第２００３０１６２２７１号明細書に記載の８ｂと呼ばれるキシロースを発酵させるザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）株を、相同組換えおよびトランスポゾンアプローチの組み合わせを介して、選択抗生物質マーカーと共に２つのオペロンＰｇａｐｘｙｌＡｘｙｌＢおよびＰｅｎｏｔａｌｔｋｔをザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）５Ｃのゲノムに組み込むことによって構築し、続いて、適応およびＮＴＧ変異誘導を行った。新たな株の調製では、部位特異的相同組換えとは対照的に、転位（ＥｐｉｃｅｎｔｒｅのＥＺ：：Ｔｎインビトロ転位システム）を（このアプローチが利点として組み込み部位の複数の選択肢および比較的高い挿入頻度を付与するので）使用した。組み込みのため、キシロース資化酵素をコードする４つの遺伝子を２つの個別のオペロン：ＰｇａｐｘｙｌＡＢおよびＰｇａｐｔａｌｔｋｔとして配置してクローニングした。２つのＰ１ファージＣｒｅリコンビナーゼ認識配列（ｌｏｘＰ）によってフランキングされる抗生物質耐性マーカー、クロラムフェニコール耐性（Ｃｍr）遺伝子を組み込み体の選択のために各オペロンに付加した。２つのオペロンの組み込みは２段階の連続様式により達成した：Ｐｇａｐｔａｌｔｋｔ、続いて、ＰｇａｐｘｙｌＡＢ。Ｃｍ耐性選択を両方の組み込みにおいて使用した。プラスミド上のＣｒｅリコンビナーゼを発現させ、各組み込み後にプラスミドのキュアリングを行うことによって除去されるからである。このプロセスにより、選択のために同じ抗生物質マーカーを複数回使用することが可能であった。さらに重要なことに、これによりオペロンの組み込みの選択のために導入される抗生物質マーカーの除去が可能であった。このプロセスにより商業的用途のための発酵株に対する抗生物質耐性遺伝子のネガティブな影響が排除された。
【００６５】
転位のためのｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍの構築
米国特許出願公開第２００３０１６２２７１号明細書（その明細書の実施例９）に記載のように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のトランスケトラーゼ（ｔｋｔ）コード領域を含有する２．２ｋｂのＤＮＡフラグメントを、ＢｇｌＩＩ／ＸｂａＩ消化によってｐＵＣｔａｌｔｋｔ（米国特許出願公開第２００３０１６２２７１号明細書）から単離し、そしてＢａｍＨＩ／ＸｂａＩで消化したｐＭＯＤ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）ベクターにクローニングし、ｐＭＯＤｔｋｔを得た。ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）ｇａｐ（Ｐｇａｐ；グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）遺伝子のプロモーター領域を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）トランスアルドラーゼのコード領域（ｔａｌ）に次のとおりに融合することによって、Ｐｇａｐｔａｌと命名されるＰＣＲフラグメントを作製した。配列番号１３および１４のプライマーを使用して、Ｐｇａｐフラグメント（その構築については米国特許第５５１４５８３号明細書（実施例３）に記載されている）をｐＺＢ４から増幅した。ｐＺＢ４は、Ｐｇａｐ−ｘｙｌＡ／ｘｙｌＢオペロンおよびＰｅｎｏ−ｔａｌ／ｔｋｔオペロンを含有する。配列番号１５および１６のプライマーを使用して、ｔａｌコード領域フラグメントを、ｐＺＢ４から増幅した。テンプレートとしてＰｇａｐおよびｔａｌフラグメントを使用し、配列番号１７および１８のプライマーを使用して、Ｐｇａｐｔａｌフラグメントを増幅した。このフラグメントをＸｂａＩで消化し、そしてｔｋｔコード領域の上流のプラスミドｐＭＯＤｔｋｔにクローニングした。Ｃｍｌｏｘ（Ｆ，ｓｆｉ）およびＣｍｌｏｘ（Ｒ，ｓｆｉ）プライマー（配列番号１９および２０）ならびにテンプレートとしてｐＺＢ１８６を使用するＰＣＲによって、ｌｏｘＰ：：Ｃｍフラグメントを作製した。ｐＺＢ１８６は、生来のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）プラスミド、ならびに米国特許第５１４５８３号明細書（実施例３）およびＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６７：２４０−２４３）に記載のｐＡＣＹＣ１８４の組み合わせである。最後に、ｌｏｘＰ：：ＣｍＰＣＲフラグメントを、Ｐｇａｐｔａｌｔｋｔを含有するプラスミドのＳｆｉＩ部位に挿入し、組み込みプラスミドｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍを形成させた。このプラスミドでは、Ｐｇａｐｔａｌｔｋｔ ｌｏｘＰ：：Ｃｍフラグメントを、ｐＭＯＤベクターの２つのモザイク末端（ｍｏｓａｉｃ ｅｎｄ）（トランスポザーゼ結合部位）の間に挿入した。ｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍプラスミドの完全なヌクレオチド配列を、配列番号２１として示す。
【００６６】
ＺＷ１におけるｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍの転位および形質転換
プラスミドｐＭＯＤはｐＵＣに基づくベクターであり、従って、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）における非複製ベクターである。プラスミドｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍを、Ｍｇ2+の存在下、室温で１時間、トランスポザーゼで処置し、そして（２００オーム、２５μＦおよび１６ｋＶ／ｃｍに設定したＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒを使用する）エレクトロポレーションによって、ＺＷ１細胞を形質転換するために使用した。エレクトロポレートした細胞を、５０ｇ／Ｌグルコースおよび１ｍＭのＭｇＳＯ4を補充した１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／Ｌトリプトン、２．５ｇ／Ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．２ｇ／ＬのＫ2ＨＰＯ4）からなる接合培地（ｍａｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）（ＭＭ）中、６時間、３０℃でインキュベートした。形質転換混合物を、５０ｇ／Ｌグルコースおよび１２０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを補充したＭＭ中に１５ｇ／ＬのＢａｃｔｏ寒天を含有する寒天プレート上にプレーティングし、そして３０℃で嫌気的にインキュベートした。約２日間後、形質転換体が目視で認められた。形質転換／転位頻度は、約３×１０1／μｇのＤＮＡであった。
【００６７】
合計で３９個のＣｍr形質転換体コロニーを得た。２１個のコロニーを拾い出し、そしてＰＣＲおよび酵素活性アッセイによってさらに分析した。プライマー配列番号２２および２３を使用するＰＣＲにより、形質転換体におけるｔａｌおよびｔｋｔコード領域を含有する３ｋｂのＤＮＡフラグメントの存在を確認した。２１個の組換え体コロニー由来のプラスミドＤＮＡによる戻し形質転換により、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において戻し形質転換体が作製されなかったことから、ｔａｌおよびｔｋｔは、ＺＷ１のゲノムに組み込まれたことが示唆された。マイクロプレート用に改変したプロトコル（一般的方法）を使用して、これらの組み込み体をトランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼ活性について試験した。ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）ＢＣＡタンパク質アッセイをタンパク質濃度の決定するために使用した。形質転換体を、１２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）を補充した２％（ｗ／ｖ）グルコースを含有するＲＭ培地中、５０ｍｌ円錐遠心管において３０℃で増殖させた。酵素アッセイではコントロール株８ｂおよびＺＷ１も増殖させた（ＺＷ１ではＲＭ＋２％グルコースを使用した）。ＯＤ600が１．０に到達したときに細胞を回収した。細胞を１回洗浄し、そして音波処理用緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６および１０ｍＭのＭｇＣｌ2）に再懸濁した。米国特許出願公開第２００３０１６２２７１号明細書に記載のように、酵素アッセイを行った。単位はμモル／分−ｍｇとして示される。１つを除いて、すべてのサンプルはトランスアルドラーゼ活性およびトランスケトラーゼ活性を有した。
【００６８】
ｔｋｔプローブを使用して、ＰｓｔＩで消化した選択された組み込み体のゲノムＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡに対し、サザンハイブリダイゼーションを実施した。ＺＷ１ ＤＮＡはｔｋｔプローブとはハイブリダイズしなかった。すべての組み込み体ゲノムＤＮＡサンプルにおいて、共通の１．５ｋｂのバンドが認められたが、これは、ｔｋｔ中のＰｓｔＩ部位とｔａｌ中のＰｓｔＩ部位との間において予想されるＤＮＡフラグメントである。第２の認められる高分子量（６ｋｂもしくはそれ以上）のバンドは、独立した系統Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４およびＴ５の間で固有であり、各系統における別個のゲノム組み込み部位を示した。興味深いことに、Ｔ５のプラスミドＤＮＡおよびゲノムＤＮＡの両方ともｔｋｔプローブとハイブリダイズし、ＰｇａｐｔａｌｔｋｔはＴ５において生来のプラスミド上でも組み込まれた可能性があることを示した。Ｃｍrマーカーを除去するためのさらなるＣｒｅ処置のために、これらの４つの株（Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４およびＴ５）を選択した。
【００６９】
ｔａｌｔｋｔ組み込み体からＣｍrマーカーを取り出すためのＣｒｅ処理
染色体からＣｍrマーカーを除去するため、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４およびＴ５をｐＺＢ１８８／Ｓｐｅｃ−Ｃｒｅで形質転換した。このプラスミドは、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現カセットを含有するザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シャトルベクターｐＺＢ１８８［Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６７：２４０−２４３；米国特許第５５１４５８３号明細書］の誘導体である。ｐＺＢ１８８／Ｓｐｅｃ−Ｃｒｅは、それがカナマイシン−耐性遺伝子の代わりにスペクチノマイシン−耐性遺伝子を有することを除いて、実施例１０に記載されているＣｒｅ発現ベクター（ｐＺＢ１８８／Ｋａｎ−Ｃｒｅ）と同一である。２％グルコースおよび２００μｇ／ｍｌスペクチノマイシン）を補充したＭＭ寒天プレート上で、形質転換体を選択した。Ｓｐr耐性コロニーを拾い出して、２％グルコースおよび２００μｇ／ｍｌスペクチノマイシンを補充したＲＭ寒天プレートおよび２％グルコースおよび１２０μｇ／ｍＬのＣｍを補充したＲＭ寒天プレート上に移した。採取したコロニーの１００％がＣｍsであったことから、ＣｒｅによるＣｍrの高い効率の切り出しが示された。ＳｐrＣｍs形質転換体を、ＲＭ＋２％グルコースにおいて、３７℃、２〜５回の連日継代で培養し、ｐＺＢ１８８ａａｄＡＣｒｅＦをキュアリングした。各継代時に、細胞を希釈し、そして拾い出して、２００μｇ／ｍＬのＳｐを伴うまたは伴わない同じ培地のさらなるプレートに移すために、ＲＭ＋２％グルコース寒天プレート上にプレーティングした。ＰＣＲによってＳｐsコロニーを分析して、ｐＺＢ１８８ａａｄＡＣｒｅＦの消失を確認した。組み込み体のプラスミドがキュアリングされた子孫を、Ｔ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４ＣおよびＴ５Ｃと命名した。これらの転位組み込み体が安定であるかどうかを調べるために、これらの４つの株を、ＲＭ＋２％グルコースにおいて増殖させ、次いで、１０ｍｌの同じ培地に移し、そして３７℃で、２回反復測定の試験管において増殖させた。細胞を、１０日間連日、または約１００代まで継代した。１代および１０代継代後、コロニーを希釈し、そしてコロニー単離のためにＲＭＧプレート上にプレーティングした。試験した各株の各継代由来の１２個のコロニーが、５’Ｐｇａｐおよび３’ｔｋｔプライマー（配列番号１３および２３）を使用するコロニーＰＣＲによるＰｇａｐｔａｌｔｋｔの存在についてポジティブであった。トランスアルドラーゼ活性およびトランスケトラーゼ活性もまた、（一般的方法に記載のとおりに）１代および１０代の継代後の単離体について測定した。４つのすべての組み込み体は、非選択的倍地上の１００代目後もＴＡＬ活性およびＴＫＴ活性の両方について同様のレベルを有したことから、これらの組み込み体が遺伝的に安定であることが示唆された。
【００７０】
転位のためのｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍの構築
次の工程は、ＺＷ１：：Ｐｇａｐｔａｌｔｋｔ組み込み体（Ｔ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４ＣおよびＴ５Ｃ）にＰｇａｐｘｙｌＡＢ ｌｏｘＰ：：Ｃｍオペロンをさらに組み込むことであった。プラスミドｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍ（上記）に基づいて、組み込みプラスミドｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍを構築した。ＳａｃＩ／ＳｆｉＩ消化によってＰｇａｐｔａｌｔｋｔＤＮＡフラグメントを取り出した。ＳａｃＩ、ＮｏｔＩ、およびＳｆｉＩ制限部位を含有するアダプターフラグメントを、ライゲーションによって導入した。次いで、ｐＺＢ４（米国特許第５５１４５８３号明細書）から単離したＰｇａｐｘｙｌＡＢのＮｏｔＩフラグメントを、アダプターのＮｏｔＩ部位にクローニングした。キシロースイソメラーゼ（ＸＩ）はｘｙｌＡによってコードされ、そしてキシルロキナーゼ（ＸＫ）はｘｙｌＢによってコードされる。ｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍプラスミドの完全なヌクレオチド配列を、配列番号２４として示す。
【００７１】
Ｔ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４ＣおよびＴ５ＣにおけるｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍの転位および形質転換
ＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍの組み込みと同様のアプローチを使用して、Ｔ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４ＣおよびＴ５Ｃを、トランスポザーゼで処置したｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍ（上記）で形質転換／転位した。Ｃｍ選択後の２回の形質転換／転位実験で、６つの組み込み体（Ｔ３ＣＣｍＸ１、Ｔ３ＣＣｍＸ２、Ｔ３ＣＣｍＸ３、Ｔ４ＣＣｍＸ１、Ｔ５ＣＣｍＸ１、Ｔ５ＣＣｍＸ２）を得た。すべてについて、２つの組のプライマー：配列番号２５、および２６、ならびに配列番号１５および１６を使用するＰＣＲによって、ｘｙｌＡＢの存在か確認されたが、但し、Ｔ２ＣｃｍＸ１およびＴ２ＣｃｍＸ６については、プライマー配列番号２５および２６を使用すると、ＰＣＲフラグメントが検出されなかった。
【００７２】
２つのＰＣＲネガティブ系統を含む組み込み体を、ＸＩ、ＸＫ、ＴＡＬおよびＴＫＴ活性についてアッセイした（一般的方法）。図２および３において示される結果は、６つのｘｙｌＡＢ組み込み体Ｔ３ＣＣｍＸ１、Ｔ３ＣＣｍＸ２、Ｔ３ＣＣｍＸ３、Ｔ４ＣＣｍＸ１、Ｔ５ＣＣｍＸ１、およびＴ５ＣＣｍＸ２はすべて、ＸＩ、ＸＫ、ＴＡＬおよびＴＫＴ活性を有したことを示した。ネガティブな親コントロールと比較して、ＸＩおよびＸＫ活性が新たに獲得された（図２）。ＴＡＬおよびＴＫＴ活性は、親コントロールと同じように維持された。すべての結果は、タンパク質が作製され、そして機能的であることを示した。酵素活性レベルにはばらつきが認められたが、ＴＩおよびＸＫ活性は、同じプラスミドで形質転換／転位されたＺＷ１組み込み体のＴＩおよびＸＫ活性と同様であった。ＸＩ、ＸＫ、ＴＡＬおよびＴＫＴの活性のレベルは、株８ｂより低かった。
【００７３】
ｘｙｌＡＢオペロンの組み込みを、サザンハイブリダイゼーションによって確認した。６系統のゲノムＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡの両方を、ＳｐｈＩで消化し、そしてジゴキシゲニン標識ｘｙｌＢプローブにハイブリダイズさせた。ｘｙｌＢにおけるＳｐｈＩ部位およびｐＭＯＤベクター上の隣接するクローニング部位におけるもう１つのＳｐｈＩ部位から作製される約３ｋｂの共通のバンドは、すべてのゲノムＤＮＡサンプルに存在し、さらに、ゲノムＤＮＡサンプル中に、より高い分子量のハイブリダイズバンドが認められたことから、染色体にＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンのための４つの組み込みの部位が存在することが示された。Ｔ３ＣＣｍＸ１およびＴ３ＣＣｍＸ２は、同じ組み込み部位を有するようであり、Ｔ３ＣＣｍＸ３およびＴ４ＣＣｍＸ１は、同じ組み込み部位を有し得、そしてＴ５ＣＣｍＸ１およびＴ５ＣＣｍＸ２はそれぞれ、個別の組み込み部位を有した。ＰｓｔＩによる同じＤＮＡの消化、それに続く、ｔｋｔプローブとのサザンハイブリダイゼーションにより、各組み込み体は、そのそれぞれの親株と同じハイブリダイゼーションパターンを有したことが実証された。
【００７４】
キシロース培地におけるＺＷ１：：Ｐｇａｐｔａｌｔｋｔ ＰｇａｐｘｙｌＡＢ Ｃｍ組み込み体の適応
キシロース資化のための４つのすべての酵素活性が存在しているにもかかわらず、先の観察（米国特許出願公開第２００３０１６２２７１号明細書）では、組み込み体は、キシロース上で直ぐには増殖しないことが示された。キシロース上での増殖は、（試験管中またはプレート上のいずれかにおける）キシロース培地上での長期のインキュベーション、適応と呼ばれるプロセス後、生じ得る。
【００７５】
株は、以下のとおりに適応させた。ＺＷ１：：ＰｇａｐｔａｌｔｋｔＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍ組み込み体株を、ＲＭＸ（１０ｇ／ｌ酵母抽出物、２ｇ／ｌのＫＨ2ＰＯ4、２０ｇ／ｌまたは２％（ｗ／ｖ）キシロースを含有する）を含有する試験管、ならびにＭＭＧＸまたはＭＭＸプレート（１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／Ｌのトリプトン、２．５ｇ／Ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．２ｇ／ＬのＫ2ＨＰＯ4、１ｍＭのＭｇＳＯ4、１．５％（ｗ／ｖ）寒天、０．０２５％（ｗ／ｖ）グルコースおよび４％（ｗ／ｖ）キシロースもしくは４％（ｗ／ｖ）キシロースのみ）上に播種した。低レベルのグルコースを使用して、初期の増殖を支持し、適応中の変異の可能性を増加させた。培養およびプレートの両方におけるキシロースに対する適応について少なくとも５つ試みたうちの１つが、成功であった。３０℃での１０日間の嫌気的インキュベーションの後、１７および１９個のコロニーが、それぞれＴ３ＣＣｍＸ１およびＴ３ＣＣｍＸ２細胞をプレーティングしたＭＭＧＸ上で認められた。コロニーは小さく、そしてプレート上では健常でないように見えた（透明であった）。１２個のコロニー（Ｔ３ＣＣｍＸ１プレーティング由来の４個：Ｔ３ＣＣｍＸ１１、Ｔ３ＣＣｍＸ１２、Ｔ３ＣＣｍＸ１３およびＴ３ＣＣｍＸ１１０；Ｔ３ＣＣｍＸ２プレーティング由来の８個：Ｔ３ＣＣｍＸ２４、Ｔ３ＣＣｍＸ２５、Ｔ３ＣＣｍＸ２６、Ｔ３ＣＣｍＸ２７、Ｔ３ＣＣｍＸ２８、Ｔ３ＣＣｍＸ２９、Ｔ３ＣＣｍＸ２１１およびＴ３ＣＣｍＸ２１２）をＲＭＧＣｍ１２０に播種し、そしてさらなる適応のために３ｍｌのＲＭＸに移して、キシロース上でより迅速に増殖することが可能な系統を得た。
【００７６】
３ｍｌのＲＭＸを含有する試験管における組み込み体の適応は、３０℃で行った。ＯＤ600を、スペクトロニック（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）６０１分光光度計で絶えずモニターした。増殖が対数期の中間部に到達したら、培養をＲＭＸの新鮮な管に移した。このプロセスを、７継代、連続した。増殖速度および最終ＯＤ（非線形的な読み取り）が、継代の間に改善された。
【００７７】
６回目の継代において、培養物をＲＭＸプレート上から画線して、単一のコロニーを単離した。３つの組込み体：Ｔ３ＣＣｍＸ１３、Ｔ３ＣＣｍＸ２６およびＴ３ＣＣｍＸ２７が、ＲＭＸ画線プレート上で他より迅速に増殖したが、これらを、以下の表および考察でＸ１３、Ｘ２６およびＸ２７と称する。最良のキシロース資化増殖体をスクリーニングするために、ＴＸ１３、Ｘ２６およびＸ２７に対するそれぞれ４個の大きな（Ｌ１−４）および４個の小さな（Ｓ１−４）コロニーを選択し、そして増殖、糖資化、およびエタノール産生をモニターし得るように、ＲＭＸ試験管中で増殖させた。コロニーを、１晩、３０℃で増殖させ、続いて、２回反復測定の試験管中３ｍｌのＲＭＸにＯＤ600＝０．０５を播種した。Ｘ２７は、ＲＭＧにおいて、他の培養物より遅く増殖し、そして６．５時間後に再度、播種した。６９時間（Ｘ２７では６２．５時間）後、サンプルを、ＨＰＬＣ分析（一般的方法）のために採取した。図４は、６９時間目（すべてのＸ２７培養物については６２．５時間）での培養の平均エタノール収率（理論的収率の％）およびキシロース資化（％）を示す図表である。大きなコロニーと小さなコロニーとの間で、有意差は認められなかった。Ｘ２７の性能は、キシロース上のＸ２６と比較して、より良好であったが、それは、グルコース上では、より遅い増殖を示した。従って、最上位の性能を示すもの、Ｘ１３（Ｘ１３Ｌ３）およびＸ２６（Ｘ２６Ｌ１）の大きなコロニーを、ｐＨ制御された発酵におけるさらなる評価のために選択した。発酵を、ＲＭＧ（６％グルコース）、ＲＭＸ（６％キシロース）およびＲＭＧＸ（８％：４％；グルコース：キシロース）中、３７℃で、株Ｘ１３Ｌ３およびＸ２６Ｌ１、ならびにコントロール株８ｂについて行った。ＲＭＧ（６％）およびＲＭＧＸ（８％：４％）において増殖したＸ１３Ｌ３およびＸ２６Ｌ１によるグルコースの発酵は、かなり迅速に進行した。ＲＭＧＸ（８％：４％）におけるキシロースの発酵は、Ｘ１３Ｌ３およびＸ２６Ｌ１では両方とも、株８ｂと比較して緩徐であった。さらに、ＲＭＸ（６％）上、３７℃での増殖は、Ｘ１３Ｌ３およびＸ２６Ｌ１の両方とも、長い停滞の後に生じた。いくらかの単離体、Ｘ１３ｂ、Ｘ１３ｃおよびＸ１３ＦＬを、ＲＭＸ（６％）発酵から回収した。これらの単離体を、本来の株Ｘ１３ａ（Ｘ１３Ｌ３の単離体）およびＸ２６と共に、本実施例において先に記載のようにＣｒｅ処置に供して、ＺＷ１：：ＰｇａｐｔａｌｔｋｔＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍ株からＣｍrマーカーを取り出した。得られたＣｒｅ処置されたＣｍrを含まない組込み体を：Ｘ１３ａＣ、Ｘ１３ｂＣ、Ｘ１３ｃＣ、Ｘ１３ＦＬＣおよびＸ２６Ｃと命名した。
【００７８】
実施例２
株ＺＷ６５８の適応および選択
先に記載のように、ＲＭＸ上、３０℃での初期のＺＷ１：：ＰｇａｐｔａｌｔｋｔＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍ株の適応により、これらの条件における株の増殖が顕著に改善された。しかし、適応された株は、ＲＭＸ（６％）における３７℃での増殖および発酵の間、長い停滞を蒙る。より高い糖濃度および温度を含む好適なプロセス条件でのキシロース発酵のために組込み体をさらに改善するために、進化または適応プロセスを、ＲＭＸ（５％）中３７℃で継続させた。連続継代を行い、そして最も良好な資化増殖体を選択した。このプロセスで使用した組込み体は、Ｘ１３ａＣ、Ｘ１３ｂＣ、Ｘ１３ｃＣ、Ｘ２６ＣおよびＸ１３ＦＬＣを含んだ。これらの５つの株を、ＲＭＸ中３０℃で６継代増殖させた後、さらに５〜１６代の継代のために、３７℃でＲＭＸ（５％）に移した。すべての継代中および後、培養物をＲＭＸプレート上に画線し、そして３７℃でインキュベートして、単一のコロニーを単離した。大きなコロニーについてさらに、ＲＭＸプレート上での画線および３７℃でのインキュベートを３〜４回行い、コロニーを精製した。最終的な大きなコロニーを、ＲＭＸ（５％）における３７℃での増殖試験のために選択した。
【００７９】
ＲＭＸ（５％）培地における３７℃での適応由来の株の評価
連続継代による適応後に単離した１８個のコロニーを、はじめに、ＲＭＸ（５％）試験管中、３７℃で試験した。１２の株を、第２の試験管評価のために選択した。比較のために、株８ｂをすべての評価に含めた。１８個のコロニーを、ＲＭＧにおいて３７℃で１晩増殖させ、遠心分離し、そして細胞を第１の評価のために試験管中４ｍｌのＲＭＸ（５％）に３７℃で静置状態で播種した。増殖（ＯＤ600、非線形的）およびエンドポイントのＨＰＬＣ結果（低い残留キシロースおよび高エタノール）に基づいて、１２の株を第２の評価のために選択した。
【００８０】
第２の評価の目的の１つは、キシロース上での改善された増殖の安定性および株のキシロース資化能を試験することであった。１２のすべての株を安定性研究に供して、適応された株を非選択培地に暴露して３７℃で５０代連続的に継代培養させた後にそれらが安定であるかどうかを調べた。ＲＭＧ（５％）継代培養の前および後の培養物をＲＭＸ（５％）試験管に播種し、そして評価のために３７℃で増殖させた。非線形的ＯＤを、Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ ６０１分光光度計において、試験管の直接読み取りによってモニターした。ＲＭＧにおける５０代の増殖の前および後のＲＭＸ（５％）における増殖の７０時間目のＯＤを、図５にプロットした。結果は、ほとんどの株がＲＭＧ、３７℃において５０代後も安定であったことを示した。（定常期における）エンドポイントの上清もまた、キシロースおよびエタノール濃度についてＨＰＬＣによって分析した。これらの培養物において低い残留キシロースおよび高いエタノール濃度が認められたことから、株が増殖し、そしてキシロースを良好に発酵したという事実が支持された。
【００８１】
上記の試験管評価（低い残留キシロース、高いエタノール濃度およびより高いＯＤ）ならびに高度の糖類における、および酢酸塩の存在下でのより良好な増殖体を選択するための高濃度のグルコースおよび／またはキシロース（２０％まで）、およびグルコースおよびキシロースと酢酸塩との混合物による以後のマイクロタイタープレート増殖スクリーニングの結果に基づいて、全体的に最も良好な性能を示した、例えば株番号２６を、ＺＷ６５８と称した。
【００８２】
実施例３
ペントースリン酸経路酵素活性のアッセイ
組み込まれた遺伝子によってコードされる４つのキシロース資化酵素（実施例１に記載）の活性を、（実施例１の）高度の糖および３７℃における適応について選択された株のうち３つについて、一般的方法に記載のとおりに測定し、そして（実施例２の）さらに適応された株ＺＷ６５８における同じ酵素の活性と比較した。結果を、μモルの産物／ｍｇタンパク質／分で表し、表１に示す。
【００８３】
表１．異なるキシロース資化適応Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株における酵素活性
【００８４】
ｘｙｌＡＢオペロンの両方のメンバーについての活性レベルは、部分的に適応された前駆体株におけるレベルと比較して、さらに適応された株ＺＷ６５８において約４〜８倍増化した。ｔａｌ／ｔｋｔオペロンからの酵素の発現レベルは、ＺＷ６５８と部分的に適応された前駆体株との間で、ほとんどまたは全く変化が認められなかった。
【００８５】
実施例４
部分的に適応された株およびＺＷ６５８におけるＸＹＬＡＢオペロンのプロモーター領域の配列比較
ｘｙｌＡＢを駆動するＧＡＰプロモーター（Ｐｇａｐ）の制御下での両方の遺伝子の産物の酵素活性レベルの明確な変化がＺＷ６５８をもたらす適応の結果として認められたため、部分的に適応された株（実施例１；その後株番号ＺＷ６４１が与えられた）およびＺＷ６５８由来のそのオペロンのプロモーター領域をＰＣＲによって増幅し、そして配列決定した。ＰＣＲフラグメントを、ｒｅｃＧコード領域由来の順方向ＰＣＲプライマー（ＰＣ１１；配列番号２７）（ここにＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンを組み込んだ）およびｘｙｌＡコード領域由来の逆方向プライマー（ＰＣ１２；配列番号２８）を使用して、調製した。得られた９６１ｂｐのＰＣＲ産物を、プライマーＬＭ１２１、ＬＭ１２２、およびＬＭ１２３（配列番号２９、３０、および３１）を使用して配列決定した。ＺＷ６４１由来のプロモーター配列を配列番号３に示し、そしてＺＷ６５８由来のプロモーター配列を配列番号４に示す。これらのプロモーター配列は、両方とも、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株ＣＰ４におけるＰｇａｐの公開された配列（配列番号１）とは１箇所の位置において異なることを見出した：ＧＡＰコード領域のＡＴＧ開始コドンから数えて上流の５’末端の方向へ−２１位の次の（Ｔの）１塩基欠失である。この配列の変化は両方の株に存在するため、それは、ＺＷ６４１のＰｇａｐとＺＷ６５８のＰｇａｐとの間の発現の差異に寄与しない。この共通の変化に加えて、ＺＷ６４１およびＺＷ６５８のＰｇａｐ配列の間に１塩基対の差異も認められた。ＺＷ６４１株由来の配列におけるＸｙｌＡのコード領域開始ＡＴＧに対する−１８９位のＧが、ＺＷ６５８由来の配列ではＴに置き換えられた。２つの配列の間ではそれ以外の違いは認められず、そしてＧＡＰプロモーター領域におけるこの１つの塩基変化による発現レベルの違いが、そのプロモーターの制御下の遺伝子によってコードされる両方のタンパク質に見出された酵素活性の増加を担うようであった。
【００８６】
実施例５
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ６４１においてＸＹＬＡ／Ｂオペロンを駆動する同じＰＧＡＰを有するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のためのキシロースイソメラーゼ発現ベクターの構築
出発物質として大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）／Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）シャトルベクター（ｐＺＢ１８８）を使用して、以下に記載のように、スペクチノマイシンに対する耐性およびＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼの発現を付与するプラスミド構築物（ｐＺＢ１８８／ａａｄａ−ＧａｐＸｙｌＡ；ここで、Ｇａｐはプロモーターを表す）を作製した（図６Ａ）。ｐＺＢ１８８の構築に関与する工程については、米国特許第５，５１４，５８３号明細書に開示されている。簡単に説明すると、この７００８ｂｐのプラスミドは、２つの異なる複製開始点を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）に対して１つずつ有するため、それぞれの細菌種において複製することが可能である。ｐＺＢ１８８はまた、テトラサイクリン（すなわちＴＣr−カセット）に対する耐性を付与するＤＮＡフラグメントも含む。ｐＺＢ１８８／ａａｄａ−ＧａｐＸｙｌＡの構築における第１の工程は、ｐＺＢ１８８からＴｃr−カセットを取り出し、そしてそれを、スペクチノマイシンに対する耐性を付与するＤＮＡフラグメント（即ち、Ｓｐｅｃr−カセット）で置き換えることであった。以下に詳細に説明するように、ｐＺＢ１８８からＴｃr−カセットを切り出すために、プラスミドをＣｌａＩおよびＢｓｓＨＩＩで切断し、そして得られた大きなベクターフラグメントを、アガロースゲル電気泳動によって精製した。テンプレートしてプラスミドｐＨＰ１５５７８（Ｃａｈｏｏｎ ｅｔ ａｌ，（２００３）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１：１０８２−１０８７）ならびにプライマー１（配列番号３２）および２（配列番号３３）を使用して、ＰＣＲによってＳｐｅｃr−カセットを作製した。プラスミドｐＨＰ１５５７８は、Ｓｐｅｃr−カセットおよびそのプロモーターの完全なヌクレオチド配列を含有し、３’（９）−Ｏ−ヌクレオチジルトランスフェラーゼをコードするトランスポゾンＴｎ７ ａａｄＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０３０４３）の公開された配列に基づく。
プライマー１（配列番号３２）
ＣＴＡＣＴＣＡＴＴＴａｔｃｇａｔＧＧＡＧＣＡＣＡＧＧＡＴＧＡＣＧＣＣＴ
プライマー２（配列番号３３）
ＣＡＴＣＴＴＡＣＴａｃｇｃｇｔＴＧＧＣＡＧＧＴＣＡＧＣＡＡＧＴＧＣＣ
【００８７】
プライマー１（順方向プライマー）の下線を付した塩基は、Ｓｐｅｃr−カセットのプロモーターの直ぐ上流（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０３０４３のｎｔ４〜２２に）にハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＣｌａＩ部位に対応する。プライマー２（逆方向プライマー）の下線を付した塩基は、Ｓｐｅｃr−カセットの終止コドンから約１３０塩基下流（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０３０４３のｎｔ１００２〜１０２０）にハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＡｆｌＩＩＩ部位に対応する。１０４８ｂｐのＰＣＲ作製したＳｐｅｃr−カセットをＣｌａＩおよびＡｆｌＩＩＩで二重消化し、そして得られたＤＮＡフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８１０４）を使用し、および販売者の推奨するプロトコルに従って、精製した。次の工程では、（ｄａｍメチル化に対して感受性である）ＣｌａＩでの切断のための非メチル化プラスミドＤＮＡを得るための大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＣ１１０（ｄｃｍ-、ｄａｍ-）から単離されたプラスミドｐＺＢ１８８を、ＣｌａＩおよびＢｓｓＨＩＩで二重消化して、Ｔｃr−カセットを取り出し、そして得られた大きなベクターフラグメントを、アガロースゲル電気泳動によって精製した。次いで、このＤＮＡフラグメントおよびクリーンアップされたＰＣＲ産物を共にライゲートし、そしてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（カタログ番号２００２３９）から得られた化学的にコンピテントな細胞を使用して、形質転換反応混合物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１１０に導入した。ＢｓｓＨＩＩおよびＡｆｌＩＩＩは適合性の「粘着末端」を作製するが、両方の部位が共にライゲートされる場合、それらが破壊されることにさらに留意すること。形質転換体を、スペクチノマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上でプレーティングし、そして３７℃で増殖させた。正確なサイズ挿入部を伴うプラスミドを含有するスペクチノマイシン耐性形質転換体を、ＮｏｔＩによる制限消化分析によって同定し、そしてさらなる操作のために選択したプラスミドを以下でｐＺＢ１８８／ａａｄＡと称する。この構築物の環状図を図６Ｂに示す。
【００８８】
次の工程では、ｐＺＢ１８８／ａａｄＡをＮｃｏＩおよびＡｃｌＩの両方の酵素で切断し、そしてアガロースゲル電気泳動によって大きなベクターフラグメントを精製した後、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセットを、ｐＺＢ１８８／ａａｄＡのＮｃｏＩおよびＡｃｌＩ部位の間に挿入した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセットとしての役割を果たす約２ＫｂｐのＤＮＡフラグメントを、プラスミドｐＺＢ４の構築物をＮｃｏＩおよびＣｌａＩで切断し、そしてアガロースゲル電気泳動によって関連ＤＮＡフラグメントを精製することによって、プラスミドｐＺＢ４から単離した。プラスミドｐＺＢ４については、米国特許第５５１４５８３号明細書に詳述されており、そして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセットＰｇａｐＸｙｌＡ（配列番号３４）の略図を、図６Ｄの枠内の概念図に示す。
【００８９】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセットを含有するフラグメントは、それぞれ、その５’末端においてＮｃｏＩ部位および３’末端においてＣｌａＩ部位を有する。米国特許第５５１４５８３号明細書においてより詳細に記載されているように、このフラグメントは、キシロースイソメラーゼをコードする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｘｙｌＡオープンリーディングフレーム（ｎｔ６２０〜１９４２）の完全なオープンリーディングフレームに正確に融合される強力な構成性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）プロモーター（ｎｔ３１６〜６１９）を含有する。それはまた、キシロースイソメラーゼ終止コドンの直後に続く小さなステムループ領域（ｎｔ１９６５〜１９９９）を含有する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセットを、標準的な連結反応で、ｐＺＢ１８８／ａａｄＡのＮｃｏＩおよびＡｃｌＩ部位の間に挿入した。ＣｌａＩおよびＡｃｌＩは適合性の「粘着末端」を作製するが、両方の部位が共に連結される場合、それらが破壊されることにさらに留意すること。次いで、ライゲーション反応混合物を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＣ１１０（ｄｃｍ-、ｄａｍ-）にエレクトロポレートして、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のその後の形質転換のための非メチル化プラスミドＤＮＡを入手し、そして形質転換された細胞を、１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含有するＬＢ培地上でプレーティングした；増殖は３７℃であった。正確なサイズの挿入物を伴うプラスミドを有するスペクチノマイシン耐性形質転換体を、ＮｏｔＩ、ＮｃｏＩおよびＡｃｌＩによる制限消化分析によって同定した。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ６４１株において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼのさらなる操作および過剰発現のために選択したプラスミドを、以下で、「ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−６４１ＧａｐＸｙｌＡ」と称する；このプラスミド構築物の環状図を図６Ｃに示す。
【００９０】
たとえ、配列番号３４のヌクレオチド配列が同じ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセット（ＰｇａｐＸｙｌＡ）に対応するとしても、配列番号３４のヌクレオチド配列は、同一出願人が所有しかつ同時係属中の米国特許出願公開第２００８０２８６８７０号明細書および米国特許出願公開第２００８０１８７９７３号明細書における配列番号３４に記載のヌクレオチド配列と同一ではないに留意することが重要である。本研究における配列番号３４において開示されたＤＮＡ配列は、米国特許出願公開第２００８０２８６８７０号明細書および米国特許出願公開第２００８０１８７９７３号明細書における配列番号３４のｎｔ５９９に対応するＰｇａｐにおいて１ｂｐの欠失を有する。先の特許出願において報告されたヌクレオチド配列は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株ＣＰ４のＰｇａｐの公開されたＤＮＡ配列（Ｃｏｎｗａｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９（１２）：５６５３−５６６２（１９８７））に基づいていたが、当時、プロモーターは、再配列決定されなかった。しかし、最近、本発明者らは、ｐＺＢ４におけるＰｇａｐもまた、同じヌクレオチドを欠き、そして３つのすべての特許出願に使用された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセット（ＰｇａｐＸｙｌＡ）が、上記のこのプラスミドから駆動されたことを発見した。
【００９１】
実施例６
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ６５８およびＺＷ８０１−４においてＸＹＬＡ／Ｂオペロンを駆動する同じＰＧＡＰを有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現ベクターの作製
プラスミドｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−８０１ＧａｐＸｙｌＡは、ｐＺＢ１８８−ａａｄＡ−６４１ＧａｐＸｙｌＡ（図６Ｃ）と同一であるが、ＺＷ６５８において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸｙｌＡ／Ｂオペロンの発現を駆動するＰｇａｐの−１８９位に存在するＧ→Ｔ変異に対応するＰｇａｐにおける１つのｂｐ置換を有する。同じ点変異が、以下に記載のようにＺＷ６５８から連続的に誘導された株ＺＷ８００およびＺＷ８０１−４にも存在する。ＺＷ８００およびＺＷ８０１−４の構築および特徴付けについては、同一出願人が所有しかつ同時係属中の米国特許出願公開第２００８０２８６８７０号明細書に詳述されている。ＺＷ８００は、この活性を不活化するグルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ（ＧＦＯＲ）酵素をコードする配列へのスペクチノマイシン耐性カセットの二重交差挿入を有するＺＷ６５８の誘導体である。ＺＷ８０１−４は、部位特異的組換えによってスペクチノマイシン耐性カセットが欠失され、タンパク質を未成熟にトランケートするインフレームの終止コドンが後に残ったＺＷ８００の誘導体である。これらの操作のいずれも、ＺＷ６５８においてＸｙｌＡ／Ｂオペロンを駆動する変異Ｐｇａｐプロモーターのヌクレオチド配列を変異しなかった。それ故、「８０１ＧＡＰプロモーター」とは、次の株：ＺＷ６５８、ＺＷ８００、およびＺＷ８０１−４に存在するプロモーター配列を指す。
【００９２】
ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−８０１ＧａｐＸｙｌＡを作製するために使用した工程およびプラスミド中間体を、プラスミドｐＭＯＤ−リンカーを出発点として時系列で説明する。
【００９３】
ｐＭＯＤ−リンカーの構築
プラスミドｐＭＯＤ−リンカーの前駆体は、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）から市販されているｐＭＯＤTM−２＜ＭＣＳ＞Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ（カタログ番号ＭＯＤ０６０２）であった。図７Ａに示すように、ｐＭＯＤTM−２＜ＭＣＳ＞は、アンピシリン耐性遺伝子（ａｍｐＲ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製開始点（ｏｒｉ）、およびＴｎ５トランスポザーゼが相互作用する２つのモザイク末端（ＭＥ）の間に位置するマルチクローニング部位を有する。ｐＭＯＤ−リンカーの構築における第１の工程は、ｐＭＯＤ２−＜ＭＣＳ＞における本来のマルチクローニング部位を取り出すことであったが、これは、それを、ＡｓｉＳｉ、ＦｓｅＩおよびＳｂｆＩに独特の制限部位を有する新たなマルチクローニング部位で置き換えることであった。これは、プラスミドをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、そしてアガロースゲル電気泳動により大きな（約２．５Ｋｂｐの）ベクターフラグメントを精製することによって行った。次いで、新たなマルチクローニング部位を、両方ともそれらの５’末端でリン酸化された２つの合成オリゴヌクレオチド、リンカーＢ（配列番号３５）およびリンカーＴ（配列番号３６）を共にアニーリングすることによって、作製した。
【００９４】
これらのオリゴヌクレオチドは、相互に相補的であり、そして共にアニーリングする場合、両末端に一本鎖オーバーハング（小文字）を有する二本鎖のリンカーを形成し、このリンカーは、ＤＮＡフラグメントが、上記の大きなｐＭＯＤTM−２＜ＭＣＳ＞ベクターフラグメントのＥｃｏＲＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間でライゲートすることを可能にする。上記のように、この合成リンカーもまた、以後のクローニング工程に使用することができる３つの独特な制限部位（ＡｓｉＳｉ、ＦｓｅＩおよびＳｂｆＩ）を含有する。ＳｂｆＩ部位には細線で下線を付し、ＦｓｅＩ部位には太線で下線を付し、そしてＡｓｉＳＩ部位には２本の細線で下線を付す。リンカーＢおよびリンカーＴを共にアニーリングし、そして標準的なライゲーション反応において、得られたＤＮＡフラグメントを、ｐＭＯＤTM−２＜ＭＣＳ＞のＥｃｏＲＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入した。連結反応混合物を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂを形質転換して、そして形質転換された細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地上でプレーティングした。次いで、プラスミドＤＮＡを、新たなマルチクローニング部位を含有する代表的なアンピシリン耐性コロニーから単離した。得られたプラスミド構築物（以下、「ｐＭＯＤ−リンカー」と称する）の環状図を図７Ｂに示す。
【００９５】
ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃの構築
スペクチノマイシンに対する耐性（Ｓｐｅｃr）を付与し、そして両方の末端において野生型ｌｏｘＰ部位を有するＤＮＡフラグメントを、上記のｐＭＯＤ−リンカー構築物のＡｓｉＳＩ部位とＦｓｅＩ部位との間に挿入した。ｌｏｘＰフランキングＳｐｅｃrカセットの供給源は、米国特許出願第１１／８６２５６６号明細書に詳述されているプラスミドｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷ（図８）であった。第１の工程では、ＭＯＤ−リンカープラスミドＤＮＡを、ＦｓｅＩおよびＡｓｉＳＩで連続的に消化し、そしてＺｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（カタログ番号ＤＯ４００３）から購入したＤＮＡ Ｃｌｅａｎ＆ＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒＴＭ−５スピンカラムキットを使用して、大きなベクターフラグメントを精製した。次に、プラスミドｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷもまた、同じ２つの酵素で二重消化し、そしてｌｏｘＰフランキングＳｐｅｃrカセットを含有する小さな（約１．１Ｋｂｐの）ＤＮＡフラグメントを、アガロースゲル電気泳動によって精製した。次いで、２つのＤＮＡフラグメントを共に連結し、そしてエレクトロポレーションを使用して、形質転換反応混合物を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂに導入した。形質転換体を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびスペクチノマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上に置き、そして増殖は３７℃であった。次いで、プラスミドＤＮＡを、正確なサイズのＤＮＡフラグメントを含有するアンピシリン耐性コロニーのうちの１つから単離し、そしてこれを以後の操作に使用した。構築物（以下、「ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ」と称する）の環状図を図７Ｃに示す。
【００９６】
ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−８０１ＧａｐＸｙｌＡおよびｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−６４１ＧａｐＸｙｌＡの構築
Ｐｇａｐ全体、ＸｙｌＡコード領域、ならびにＸｙｌＡおよびＸｙｌＢオープンリーディングフレームの間に存在するステムループ領域を含有するＤＮＡフラグメントを、プライマー３および４（それぞれ、配列番号３７および３８）ならびに再懸濁した細胞をテンプレートとして使用して、ＺＷ８０１−４からＰＣＲ増幅した。既に記載のように、ＤＮＡ配列解析により、ＺＷ８０１−４は、組み込まれた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸｙｌＡ／Ｂオペロンの発現を駆動するＰｇａｐプロモーターにおいて−１８９位でＺＷ６５８と同じＧ→Ｔ点変異を有し、そして両方の株のＰｇａｐが同一であることが示された。
プライマー３（配列番号３７）
ＴＣＡＣＴＣＡＴｇｇｃｃｇｇｃｃＧＴＴＣＧＡＴＣＡＡＣＡＡＣＣＣＧＡＡＴＣＣ
プライマー４（配列番号３８）
ＣＴＡＣＴＣＡＴｃｃｔｇｃａｇｇＣＣＧＡＴＡＴＡＣＴＴＡＴＣＧＡＴＣＧＴＴＣＣ
【００９７】
プライマー３（順方向プライマー）の下線を付した塩基は、Ｐｇａｐの最初の２２塩基（および配列番号３４のｎｔ３１６〜３３７）にハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＦｓｅＩ部位に対応する。プライマー４（逆方向プライマー）の下線を付した塩基は、ＸｙｌＡ終止コドンの後方に存在するステムループ領域の直ぐ下流（および配列番号３４の最後の１２ｎｔ）にハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＳｂｆＩ部位に対応する。
【００９８】
ＰＣＲ産物を、ＦｓｅＩおよびＳｂｆＩで二重消化し、そしてＺｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（カタログ番号ＤＯ４００３）から購入したＤＮＡ Ｃｌｅａｎ＆ＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒＴＭ−５スピンカラムキットを使用して、精製した。次に、プラスミドｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃを同じ２つの酵素で切断し、そして得られた大きなベクターフラグメントを、同じ手順を使用して精製した。次いで、２つのＤＮＡフラグメントを共に連結し、そしてエレクトロポレーションを使用して、形質転換反応混合物を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂに導入した。細胞を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびスペクチノマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上にプレーティングし、そして増殖は３７℃であった。正確なサイズの挿入物のプラスミドを含有する形質転換体を、テンプレートとしてプライマー３および４ならびに再懸濁したコロニーを使用するＰＣＲ（「コロニーＰＣＲ」）によって同定した。さらなる操作のために選択したプラスミドを、以下で、ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−８０１ＧａｐＸｙｌＡと称し、そしてこの構築物の環状図を図９に示す。
【００９９】
Ｐｇａｐ−ＸｙｌＡ遺伝子ＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅に使用したテンプレートがＺＷ６４１の細胞懸濁液であったことを除いて、上記の同じ工程を使用して、以下、「ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−６４１ＧａｐＸｙｌＡ」と称するもう１つのプラスミドを作製した。ＺＷ６５８（およびＺＷ８０１−４）とＺＷ６４１とを区別するＰｇａｐにおけるＧ→Ｔ置換を除いて、ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−６４１ＧａｐＸｙｌＡおよびｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−８０１ＧａｐＸｙｌＡは同一である。
【０１００】
ｐＺＢ１８８−ａａｄＡ−８０１ＧａｐＸｙｌＡの構築
実施例６の最初の段落に記載のように、ｐＺＢ１８８−ａａｄＡ−８０１ＧａｐＸｙｌＡは、ｐＺＢ１８８−ａａｄＡ−６４１ＧａｐＸｙｌＡに同一なＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現ベクターであるが、それは、ＺＷ６５８（およびＺＷ８０１−４）において組み込まれたＰｇａｐ−ＸｙｌＡ／Ｂオペロンの発現を駆動するＰｇａｐにおける同じＧ→Ｔ置換を有する。このプラスミドを構築するため、ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−８０１ＧａｐＸｙｌＡ（図１０Ａ）をＭｌｕＩおよびＳａｌＩで二重消化し、そしてより小さなＤＮＡフラグメント（約１１００ｂｐ）を、アガロースゲル電気泳動およびＺｙｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（カタログ番号Ｄ４００１、Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、精製した。このフラグメントは、ＰｇａｐのＧ→Ｔ置換およびＸｙｌＡ ＯＲＦの一部を含有するが、後者の構築物を同じ２つの酵素で切断し、そして大きなベクターフラグメントをアガロースゲル電気泳動によって精製した後、ｐＺＢ１８８−ａａｄＡ−６４１ＧａｐＸｙｌＡ（図１０Ｂ）において対応するフラグメントを置き換えるために使用した。次いで、２つのフラグメントを共にライゲートし、そしてエレクトロポレーションを使用して、ライゲーション反応混合物を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂに導入した。形質転換体を、スペクチノマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上でプレーティングし、そして増殖は３７℃であった。プラスミドＤＮＡをスペクチノマイシン耐性コロニーから単離し、そしてＰｇａｐプロモーターＧ→Ｔ置換の存在を、ＤＮＡ配列解析によって確認した。以後の操作に使用したプラスミド（「ｐＺＢ１８８−ａａｄＡ−８０１ＧａｐＸｙｌＡ」）を図１０Ｃに示す。
【０１０１】
実施例７
ＺＷ６４１における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼの過剰発現
表１における酵素活性測定値は、ＺＷ６４１からＺＷ６５８へのトランジション中にキシロースイソメラーゼ活性およびキシルロキナーゼ活性が劇的に増加することを示す。キシロースイソメラーゼが、ＺＷ６４１におけるキシロース上での増殖の律速酵素であるという仮説を試験するため、マルチコピープラスミド、ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−６４１ＧａｐＸｙｌＡ（図６Ｃ）を使用して、酵素をこの株において過剰発現させた。この実験のコントロールは、Ｐｇａｐ−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセットを欠くマルチコピープラスミドｐＺＢ１８８／ａａｄＡで形質転換されたＺＷ６４１であった（図６Ｂ）。これらの両方のプラスミドの構築については、実施例５に記載されており、そして形質転換プロトコルは、本質的に、同一出願人が所有しかつ同時係属中の米国特許出願公開第２００８０１８７９７３号明細書の実施例５に記載のとおりであった。簡単に説明すると、エレクトロポレーションを使用して、非メチル化プラスミドＤＮＡ（ｄｃｍ-およびｄａｍ-株である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＣ１１０から単離された）をＺＷ６４１に導入し、そして形質転換細胞を、２００μｇ／ｍｌスペクチノマイシンを含有するＬＢ培地上にプレーティングした。嫌気条件下３０℃で４８時間の培養期間後、各プラスミドについて、３つの初代形質転換体を無作為に選択し、そしてこれらを、さらなる特徴付けのために同じ増殖培地を含有する寒天プレート上にパッチした（移した）。
【０１０２】
図１１は、６４１Ｐｇａｐ−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現プラスミドを所有する３つの株（Ｘ１、Ｘ２およびＸ２）ならびにコントロールプラスミドを所有する３つの株（Ｃ１、Ｃ２およびＣ３）のキシロース含有培地における増殖曲線（ＯＤ600対時間）を示す。この実験は、振盪フラスコ（１５０ｒｐｍで１５ｍｌ試験管中５ｍｌの培養液）中３０℃で実施し、そして増殖培地は、スペクチノマイシン（２００μｇ／ｍｌ）をも含有するｍＲＭ３−Ｘ１０（１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ4および１００ｇ／Ｌキシロース）であった。培養液は、上記の段落において記載のパッチしたプレート由来の１植菌耳の細胞から開始し、そしてそれぞれの場合の初期ＯＤ600は約０．１３であった。ＺＷ６４１と同様に、コントロールプラスミドを伴う３つの株は、キシロース上ではほとんど増殖しなかった。全く対照的に、ＺＷ６４１を、６４１Ｐｇａｐ−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現プラスミド、ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−６４１ＧａｐＸｙｌＡで形質転換した場合、キシロース上での増殖の速度および程度（最終ＯＤ600値）の両方とも、劇的に改善された。このプラスミドを有する３つのすべての株は、図１１に示す実験において同じ挙動を示したため、Ｘ１株およびＣ１株のみをさらなる特徴付けに供した。
【０１０３】
図１２は、スペクチノマイシンを伴わない同じキシロース含有増殖培地におけるＺＷ６４１、ＺＷ６５８、Ｘ１およびＣ１の並列比較を示す。この実験の条件は、上記の条件と同一であったが、２０ｍｌ培養液を、５０ｍｌ試験管中で増殖させ、そして初期ＯＤ600は約１／４であった（０．０３５）。図１２Ａに示す増殖曲線を線形目盛（ＯＤ600対時間）でプロットする一方、図１２Ｂは、指数増殖速度を比較するために、対数目盛（ｌｏｇＯＤ600対時間）に対してプロットした同じ実験データを示す。この実験から、Ｘ１の指数増殖速度は、キシロース適応株ＺＷ６５８とほとんど同じ速さであること、およびこの株は、コントロールプラスミドを伴っても伴わなくても親株ＺＷ６４１よりかなり良好にキシロース上で増殖することが明らかである。それ故、（マルチコピープラスミド由来の６４１Ｐｇａｐプロモーターによって駆動される）ＺＷ６４１におけるキシロースイソメラーゼの高発現は、キシロース上での増殖に対して、キシロースイソメラーゼ活性の増加がＺＷ６５８に対して及ぼす効果（表１に示す）に類似の効果を及ぼす。Ｘ１の最終的なバイオマス収量は、ＺＷ６５８によって得られる収量の約１／２であるが、このデータから、ＺＷ６４１におけるキシロース上での増殖の律速酵素はキシロースイソメラーゼであることが明らかである。図１１および１２に示される実験から、次の他の２つの興味深い可能性がさらに示唆される：（１）ＺＷ６４１からＺＷ６５８へのトランジション中に生じるキシロースイソメラーゼ活性の大きな増加（表Ｉ）が、「キシロース適応」プロセス中に生じたキシロース上でのより良好な増殖の主な原因であったこと；および（２）キシロースイソメラーゼ活性の増加は、ＺＷ６５８に存在する染色体上に組み込まれたＰｇａｐ−ＸｙｌＡ／Ｂオペロンの発現を駆動するＰｇａｐプロモーターにおけるＧ→Ｔ置換から生じ得たこと。
【０１０４】
実施例８
ＺＷ６４１における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼのトランスポゾン仲介組み込み
ＺＷ６４１および２つのプラスミド構築物（ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−８０１ＧａｐＸｙｌＡおよびｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−６４１ＧａｐＸｙｌＡ）を使用して、ＺＷ６５８において組み込まれたＸｙｌＡ／Ｂオペロンの発現を駆動するＧ→Ｔ置換を伴うＰｇａｐプロモーター（以後、「８０１ＧＡＰプロモーター」と称する）が、ＺＷ６４１における対応するプロモーター（以後、「６４１ＧＡＰプロモーター」と称する）より強力であるという仮説を試験した。ＺＷ６４１は、キシロース上ではほとんど増殖することができず、そしてこの株においてキシロースイソメラーゼが過剰発現すると、キシロース上での増殖がより速くなる（実施例７、図１１および１２）ため、ＺＷ６４１をこれらの実験に選択した。基本理念は、（６４１ＧＡＰプロモーターまたは８０１ＧＡＰプロモーターによって駆動される）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ遺伝子の追加のコピーをＺＷ６４１の染色体へ導入すること、およびどちらの構築物がキシロース上で最も速く増殖するかを調べることであった。Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅのトランスポソーム技術を使用して、２つのキメラ遺伝子の染色体組み込みを達成した。
【０１０５】
既に示したように、ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−６４１ＧａｐＸｙｌＡおよびｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−８０１ＧａｐＸｙｌＡは、後者の構築物のＰｇａｐプロモーターにＧ→Ｔ点変異が存在することを除いて、同一のプラスミドである。両方の場合においてＤＮＡへの無作為な挿入に使用された転移因子は、２つの１９ｂｐのモザイク末端（ＭＥ）およびそれらの間に挟まれる全ＤＮＡフラグメントからなる。図９に示すように、トランスポゾンと称されるこのエレメントは、スペクチノマイシン耐性カセット（Ｓｐｅｃr）および下流のＰｇａｐ−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセットを含有する。トランスポソームを形成するために使用したプロトコルは、本質的に、ＥＺ：：ＴＮTMｐＭＯＤTM−２＜ＭＣＳ＞Ｔｒａｎｓｐｏｓｎ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ（カタログ番号ＭＯＤ０６０２）についてのＥｐｉｃｅｎｔｒｅの取扱説明書に記載のプロトコルと同じであった。８μＬ反応物は、Ｍｇ++イオンを含まない１．５μＬの５’−リン酸化、平滑末端化されたトランスポゾンＤＮＡ（約２５０ｎｇ／μＬ）、４μＬのＥｐｉｃｅｎｔｒｅのＥＺ：：ＴＮトランスポザーゼおよび２．５μＬの８０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含有した。コントロールトランスポソーム反応混合物も同一であったが、但し、トランスポザーゼの代わりに４μＬの滅菌水を使用した。反応物を室温で３０分間、インキュベートし、次いで、緩徐な異性化工程に必要な２〜７日間のインキュベーション期間、４℃に移した（これにより、活性なトランスポソームが形成する；この手順を使用すれば、トランスポソームは、−２０℃で少なくとも３箇月間、安定である）。
【０１０６】
本質的に、米国特許第５，５１４，５８３号明細書に記載のプロトコルと同じ形質転換プロトコルを使用して、トランスポソームをＺＷ６４１にエレクトロポレートした。簡単に説明すると、４０μＬの形質転換反応物は、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール中約１０10個の細胞／ｍｌ、１μＬのＥｐｉｃｅｎｔｒｅのＴｙｐｅＯｎｅTMＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎインヒビター（カタログ番号ＴＹＯ２６１Ｈ）および１μＬのコントロールまたはトランスポソーム反応混合物を含有した。エレクトロポレーターの設定は、１．６ｋｖ／ｃｍ、２００Ω、および２５μＦ、およびキュベットのギャップ幅は０．１ｃｍであった。エレクトロポレーション後、形質転換物を１．０ｍｌのＭＭＧ培地（５０ｇ／Ｌグルコース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／Ｌのトリプトン、２．５ｇ／Ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．２ｇ／ＬのＫ2ＨＰＯ4、および１ｍＭのＭｇＳ０4）で希釈し、そして細胞を約３時間、３０℃で回復させた。次いで、細胞を、室温で、滅菌１．５ｍｌ微量遠心管中、遠心分離（１３，０００×ｇ、５分間）によって回収し、そして上清を注意深く取り除いた。細胞ペレットを、２００μＬの液体ＭＭＧ培地に再懸濁し、そして１００μＬアリコートの各細胞懸濁液を、１．５％寒天および２００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含有するＭＭＧ培地上でプレーティングした。３０℃、嫌気条件下での７２時間のインキュベーション期間後、３個のコロニーがコントロールプレート上で認められ、１３個のコロニーが６４１ＧａｐＸｙｌＡトランスポソームプレート上で認められ、そして１８個のコロニーが８０１ＧａｐＸｙｌＡトランスポソームプレート上で認められた。さらなる特徴付けのために、両方のトランスポソームプレート由来の６個のコロニーを無作為に選択し、そしてこれらを、ＭＭＸ培地および２００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含有する寒天プレート上にパッチした；増殖条件は上記のとおりであった。ＭＭＸ培地は、ＭＭＧ培地と同じであるが、但し、グルコースの代わりに５０ｇ／Ｌのキシロースを含有した。新鮮なＭＭＸ＋スペクチノマイシンプレート上での２回の増殖後、キシロース上で最も増殖した６つの株（各トランスポソームについて３つ）を、下記の実験に使用した。
【０１０７】
図１３Ａは、６４１Ｇａｐ−ＸｙｌＡトランスポソーム（＃６−１、＃６−３および＃６−５）によって得られた３つのＺＷ６４１株ならびにキシロース含有培地において８０１ＧａｐＸｙｌＡトランスポソーム（＃８−２、＃８−４および＃８−５）を受容した３つの株の線形増殖曲線を示す。同じデータを、図１３Ｂにおいて対数目盛でプロットする。この実験は、振盪フラスコ（１５０ｒｐｍで１５ｍｌ試験管中７ｍｌ培養液）中３０℃で実施し、そしてｍＲＭ３−Ｘ１０（１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ4および１００ｇ／Ｌキシロース）が増殖培地であった。培養は、上記のパッチしたプレート由来の１植菌耳の細胞から開始し、そして初期ＯＤは、極めて類似していた（約０．０２〜０．０３）。この実験のコントロールは、染色体に組み込まれた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸｙｌＡ／Ｂオペロンを駆動するＰｇａｐにおけるＧ→Ｔ置換を有するキシロース適応株ＺＷ６５８であった。
【０１０８】
親株（ＺＷ６４１）と同様に、６４１ＧａｐＸｙｌＡ発現カセットの染色体外に組み込まれた追加のコピーを有する３つの株では、キシロース含有培地における増殖が極めて不良であったが、特に、株＃６−５の増殖速度およびバイオマス収量（ＯＤ600）の両方においていくつかの若干の改善が認められたようであった（図１２Ａと図１３Ａとを比較すること）。対照的に、８０１ＧａｐＸｙｌＡトランスポゾンによって得られた３つのすべての株は、キシロース上で親株よりかなり良好に増殖した（図１３Ａおよび１３Ｂ）。事実、形質転換体のうちの２つ（＃８−４および＃８−５）は、この糖上において、６４１ＧａｐＸｙｌＡ発現カセットを含有するマルチコピープラスミドｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−ＧａｐＸｙｌＡを所有するＺＷ６５８およびＺＷ６４１形質転換体とほぼ同様に良好に増殖した（図１２と図１３とを比較すること）。転移は無作為な事象であり、そして６つのすべての株は、染色体の異なる場所に挿入された６４１ＧａｐＸｙｌＡまたは８０１ＧａｐＸｙｌＡ発現カセットを有するため、同じトランスポソームを使用してこの実験において観察された外来遺伝子発現の差異は、位置効果による可能性がある。例えば、位置効果は、＃６−１および＃６−３より良好な＃６−５の増殖、ならびに＃８−４および＃８−５より不良な＃８−２の増殖を説明し得る。それでも、分析した集団のサイズが小さいにもかかわらず、図１３に示す結果は、ＺＷ６５８およびＺＷ８０１−４において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸｙｌＡ／Ｂオペロンを駆動するＰｇａｐプロモーターに存在するＧ→Ｔ変異が、親株ＺＷ６４１と比較して、これらの株で観察されるより高いキシロースイソメラーゼ活性およびキシロース上でのより良好な増殖を担うという見解を強力に支持する。
【０１０９】
実施例９
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）におけるリボース５−リン酸イソメラーゼの６４１ＧＡＰプロモーターより高い発現レベルを指令する８０１ＧＡＰプロモーター
８０１ＧＡＰプロモーターが、実際に、６４１ＧＡＰプロモーターより強力である場合、発現に対するその刺激効果は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ遺伝子に限定されるべきではなく、そしてこのプロモーターを伴う他のタンパク質の発現もまた増強されることが予想される。この重要な問題に取り組むために、リボース５−リン酸イソメラーゼ（ＲＰＩ）をコードするＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）遺伝子を、両方のプロモーターに融合し、そしてキメラ遺伝子を、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）において複製するマルチコピープラスミドに挿入した。得られたＰｇａｐ−ＲＰＩ発現プラスミド（ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−６４１ＧａｐＲＰＩおよびｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−８０１ＧａｐＲＰＩ）をＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）に導入し、そしてＲＰＩ発現レベルを、下記のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０１１０】
ｐＺＢ１８８ａａｄＡ／Ｇａｐ／Ｚｙｍｏ ＲＰＩ／ＥｃｏｌｉＳＬの構築
プラスミドｐＺＢ１８８ａａｄＡ／Ｇａｐ／Ｚｙｍｏ ＲＰＩ／ＥｃｏｌｉＳＬは、本発明において使用した２つのＰｇａｐ−ＲＰＩ発現プラスミドの構築において重要な中間体であった。図１４に示すように、このプラスミドは、独特なＮｃｏＩ部位とＸｈｏＩ部位との間に局在するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）リボース５−リン酸イソメラーゼ（ＲＰＩ）遺伝子の発現カセットを含有する。下記のオーバーラップＰＣＲ技術を使用して、全長６４１ＧＡＰプロモーター配列（配列番号３４のｎｔ３１６〜６１９）およびＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＲＰＩ遺伝子の全オープンリーディングフレームを含有するキメラ遺伝子であるＲＰＩ発現カセットを作製した。ＲＰＩ ＯＲＦは、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ００８６９２）のｎｔ１２２４７３０〜１２２５２０３に対応し、そしてＲＰＩの開始コドンは、６４１ＧＡＰプロモーターの３’−末端に直接融合される。
【０１１１】
６４１ＧａｐプロモーターのテンプレートはｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−６４１ＧａｐＸｙｌＡであり、そしてＰＣＲ反応においてプライマー５および６（それぞれ、配列番号３９および４０）を使用して、このプラスミドから３２０ｂｐのＤＮＡフラグメントを増幅した。得られたＰＣＲ産物は、６４１ＧＡＰプロモーター、およびその３’−末端に付着し、ＧＴＧ開始コドンから開始するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＲＰＩ ＯＲＦの最初の１５ｂｐを含有する。このフラグメントはまた、クローニング目的のためにプライマー５の５’−末端に付加されたその５’−末端（小文字）において独特なＮｃｏＩ部位を有する。
プライマー５（配列番号３９）
ＣＡＴＧｃｃａｔｇｇＧＡＧＣＴＣＧＴＴＣＧＡＴＣＡＡＣＡＡＣＣＣＧＡＡＴＣＣＴＡ
プライマー６（配列番号４０）
ＣＡＣＡＧＣＡＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＴＴＡＴＴＣＴＣＣＴＡＡＣＴＴＡＴＴＡＡＧＴＡＧＣ
【０１１２】
個別のＰＣＲ反応において、プライマー７および８（それぞれ、配列番号４１および４２）を使用して、生来のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＲＰＩ遺伝子の全ＯＲＦを含有する４７３ｂｐフラグメントを作製した。増幅に使用したテンプレートは、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株ＺＷ８０１−４から単離されたゲノムＤＮＡであった。プライマー７の５’−末端は、３２０ｂｐの６４１ＧＡＰプロモーターフラグメントの３’−末端にハイブリダイズすることができるオーバーラップ配列の１５ｂｐを有すること、およびＸｈｏＩ部位（小文字）は、クローニング目的のためにプライマー８の５’−末端に付加されたことに留意すること。
プライマー７（配列番号４１）
ＧＴＴＡＧＧＡＧＡＡＴＡＡＡＣＧＴＧＡＣＣＴＣＴＧＣＴＧＴＧＣＣＡＴＣＡＡＡ
プライマー８（配列番号４２）
ＣＣＧｃｔｃｇａｇＣＴＡＧＡＴＡＴＴＧＡＡＣＴＧＡＧＧＡＴＴＣＧＡＡＡ
【０１１３】
次いで、プライマー５および８（それぞれ、配列番号３９および４２）を使用して、上記の２つのフラグメントをオーバーラップＰＣＲ反応に供し、そしてこの操作により、ＲＰＩ発現カセットが作製された。後者は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＲＰＩ ＯＲＦの開始コドンに直接融合された６４１ＧＡＰプロモーターを含有する７７８ｂｐフラグメントである。次いで、ＰＣＲ産物をＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで切断し、そして得られたフラグメントを、究極的にｐＺＢ１８８／ａａｄａ−６４１ＧａｐＸｙｌＡ（図６Ｃ）から誘導されたプラスミドのＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ部位に挿入して、最終産物ｐＺＢ１８８ａａｄＡ／Ｇａｐ／Ｚｙｍｏ ＲＰＩ／ＥｃｏｌｉＳＬ（図１４）を得た。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＲＰＩ発現ベクターであるこのプラスミドもまた、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸｙｌＡ／Ｂオペロンの遺伝子間領域に存在するステムループ領域を含有すること、およびこの安定化エレメントは、ＲＰＩ終止コドンの直ぐ下流のＸｈｏＩ部位とＮｏｔＩ部位との間に局在することに留意することが重要である。プラスミドｐＺＢ１８８ａａｄＡ／Ｇａｐ／Ｚｙｍｏ ＲＰＩ／ＥｃｏｌｉＳＬ（ＸｙｌＡステムループ構造を含む）に存在するＲＰＩ発現カセットのヌクレオチド配列は、配列番号４３に開示されている。示されているヌクレオチド配列は、ＮｃｏＩ部位とＮｏｔＩ部位との間に局在するＤＮＡフラグメントに対応し、そして両方の制限部位を含む。
【０１１４】
ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−６４１ＧａｐＲＰＩおよびｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−８０１ＧａｐＲＰＩの構築
ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−６４１ＧａｐＲＰＩおよびｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−８０１ＧａｐＲＰＩは、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＰｇａｐ−ＲＰＩ発現プラスミドであり、それらは、後者の構築物が、８０１ＧＡＰプロモーターと６４１ＧＡＰプロモーターとを区別するＧ→Ｔ置換を有することを除いて同一である。ｐＺＢ１８８ａａｄＡ／Ｇａｐ／Ｚｙｍｏ ＲＰＩ／ＥｃｏｌｉＳＬ由来の１２４０ｂｐのＤＮＡフラグメントを使用して、ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−６４１ＧａｐＸｙｌＡ（図６Ｃ）をｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−６４１ＧａｐＲＰＩ（図１５Ｂ）に、そしてｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−８０１ＧａｐＸｙｌＡ（図１０Ｃ）をｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−８０１ＧａｐＲＰＩ（図１５Ｃ）に変換した。ＤＮＡのこの部分は、ｐＺＢ１８８ａａｄＡ／Ｇａｐ／Ｚｙｍｏ ＲＰＩ／ＥｃｏｌｉＳＬをＡｓｉＳＩおよびＮｈｅＩで切断し、そしてアガロースゲル電気泳動によって、より小さなフラグメントを精製することによって、作製した。図１５Ａに示すように、ｐＺＢ１８８ａａｄＡ／Ｇａｐ／Ｚｙｍｏ ＲＰＩ／ＥｃｏｌｉＳＬは、独特なＡｓｉＳＩおよびＮｈｅＩ制限部位を有し、そして同じ部位が、ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−６４１ＧａｐＸｙｌＡおよびｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−８０１ＧａｐＸｙｌＡにも存在する。ＡｓｉＳＩは、８０１ＧＡＰプロモーターと６４１ＧＡＰプロモーターとを区別するＧ→Ｔ置換より下流のＰｇａｐにおいて、３つのすべてのこれらのプラスミドを切断すること、およびＮｈｅＩは、ＸｙｌＡまたはＲＰＩ終止コドンより約７００ｂｐ下流のプラスミド骨格を切断することに留意すること。従って、ｐＺＢ１８８ａａｄＡ／Ｇａｐ／Ｚｙｍｏ ＲＰＩ／ＥｃｏｌｉＳＬから得られた１２４０ｂｐのＤＮＡフラグメントは、６４１Ｇａｐプロモーターおよび８０１Ｇａｐプロモーターが共有するＤＮＡの小さなストレッチ、全ＲＰＩオープンリーディングフレームおよび安定化ＸｙｌＡステムループ領域を含有する。
【０１１５】
次の工程では、ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−６４１ＧａｐＲＰＩおよびｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−８０１ＧａｐＲＰＩの構築において、これらのプラスミドの両方をＡｓｉＳＩおよびＮｈｅＩで切断し、そして大きい方のベクターフラグメントを精製した後、上記の１２４０ｂｐのＤＮＡフラグメントを、個別の２つのライゲーション反応において、ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−６４１ＧａｐＸｙｌＡおよびｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−８０１ＧａｐＸｙｌＡのＡｓｉＳＩ部位とＮｈｅＩ部位との間に挿入した。エレクトロポレーションを使用して、両方のライゲーション反応混合物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂに導入し、そして形質転換体を、スペクチノマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上でプレーティングした；増殖は３７℃であった。最後に、ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−６４１ＧａｐＲＰＩ（図１５Ｂ）およびｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−８０１ＧａｐＲＰＩ（図１５Ｃ）プラスミドＤＮＡを、正確な構築物（ＤＮＡ配列解析によって確認される）を含有するコロニーから単離し、次いで、両方のプラスミドを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＣＳ１１０（ｄａｍ−、ｄｃｍ−）に導入して、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の形質転換のための非メチル化プラスミドＤＮＡを作製した。
【０１１６】
６４１ＧＡＰプロモーターおよび８０１ＧＡＰプロモーターを伴うＲＰＩの発現
エレクトロポレーションおよび非メチル化プラスミドＤＮＡを使用して、上記の２つのＰｇａｐ−ＲＰＩ発現ベクター（ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−６４１ＧａｐＲＰＩおよびｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−８０１ＧａｐＲＰＩ）を、野生型Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株ＺＷ１に導入した。形質転換細胞を、ＭＭＧ培地（５０ｇ／Ｌグルコース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／Ｌのトリプトン、２．５ｇ／Ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．２ｇ／ＬのＫ2ＨＰＯ4、および１ｍＭのＭｇＳＯ4）ならびに２００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含有する１．５％寒天プレート上、３０℃で嫌気的に増殖させた。６４１ＧＡＰ−ＲＰＩプラスミド（６４１ｇａｐＲｐｉ＃１および６４１ｇａｐＲｐｉ＃２）を含有する無作為に選択された２つのコロニー、ならびに８０１ＧＡＰ−ＲＰＩプラスミド（８０１ｇａｐＲｐｉ＃１および８０１ｇａｐＲｐｉ＃２）を所有する２つのコロニーを、同じ増殖培地を含有する１．５％寒天プレート上にパッチし、そしてプレートを、嫌気条件下で約２４時間、３０℃でインキュベートした。このプレートを使用して、ＲＰＩ発現実験のための種培養を開始した。
【０１１７】
種培養を１植菌耳の細胞から開始し、そして５ｍｌのＭＭＧ培地およびスペクチノマイシン（２００μｇ／ｍｌ）を含有する１５ｍｌキャップ付き試験管中３０℃（１５０ｒｐｍ）で増殖させた。この実験のコントロール（親株、ＺＷ１）を、同じ条件下で増殖させたが、但し、増殖培地はスペクチノマイシンを含まなかった。種培養を、飽和状態に到達させ、次いで、上記の同じ増殖培地および条件を使用して、５０ｍｌキャップ付き試験管中２０ｍｌ培養を開始するために使用した。初期ＯＤ600値は、すべての場合において約０．１２であった。指数期（ＯＤ600約１．１）中の培養物のアリコート（５００μＬ）を遠心分離（１５，０００×ｇ、１０分間）によって回収し、そして細胞ペレットを、２５０μＬの１Ｘ ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中に再懸濁した。電気泳動のためのすべての試薬は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得た。１ミリリットルの１Ｘ ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液は、２５０μＬのＮｕＰＡＧＥTMＬＤＳ ４Ｘ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（カタログ番号Ｎ０００７）、１００μＬのＮｕＰＡＧＥTMＳａｍｐｌｅ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ａｇｅｎｔ（カタログ番号ＮＰ０００４）および６５０μＬ蒸留水を含有する。サンプルを、１０分間、８０℃で加熱し、そして粒状破砕物を、遠心分離（１５，０００×ｇ、１０分間）によって取り出した。次いで、販売者が推奨するように、還元されたサンプルのＮｕＰＡＧＥTM１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（カタログ番号ＮＰ０３４１）およびＮｕＰＡＧＥTMＭＥＳ ＳＤＳ Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（カタログ番号ＮＰ０００２）プロトコルを使用して、澄明化したサンプルのアリコート（２０μＬ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ゲルを、室温、定電圧（１８０Ｖ）で約１時間、稼動させ、そして、製造者が推奨するように、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎ（カタログ番号ＬＣ６０６０）で染色した。
【０１１８】
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＲＰＩタンパク質の分子量は、オープンリーディングフレームのＤＮＡ配列に基づいて１６９２７．３７Ｄａである。図１６に示すように、親株、ＺＷ１では、いくらかの薄く染色されたタンパク質のバンドが、この領域（即ち、１７ｋＤａと１９ｋＤａとの分子量標準物質の間）までポリアクリルアミドゲルを泳動した（レーン２および７）。ゲルの目視検査により、６４１ＧＡＰ−ＲＰＩ発現プラスミドをＺＷ１に導入した場合（レーン３および５）、染色されたバンド（矢印で示す）の１つの強度が少なくとも２倍増加したことが示され、これがＲＰＩタンパク質であることが示された。さらに加えて、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＲＰＩのバンドの強度は、８０１ＧＡＰ−ＲＰＩ発現プラスミドを所有する２つの株（レーン４および６）では、かなり劇的に増加したことが、図１２においてかなり明白である。これらの結果は、８０１ＧＡＰプロモーターが６４８ＧＡＰプロモーターより強力なプロモーターであること、および後者は、極めて高いレベルで外来遺伝子を発現させるための有用なツールであることの説得力のある証拠を提供する。
【０１１９】
実施例１０
キシロース資化Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の独立して適応させた株の導入遺伝子ＧＡＰプロモーター領域の酵素活性および配列比較
また、ＺＷ６５８に類似の遺伝子導入および株適応の経過を使用して、株８ｂ（実施例１および米国特許出願公開第２００３０１６２２７１号明細書）を得たため、ペントースリン酸経路の導入遺伝子活性およびＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンの配列を、この独立した株の産生について部分的およびより完全に適応された株で比較した。部分的適応株８ＸＬ４および最終適応株８ｂにおけるＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンの産物の酵素活性を、一般的方法に記載の技術を使用して測定し、そしてμモルの産物／ｍｇタンパク質／分で表した結果を表２に示す。
【０１２０】
表２．異なるキシロース資化適応Ｚ．モビリス（Z.mobilis）株における酵素活性
【０１２１】
ＺＷ６５８より以前の株が、キシロース上での増殖の増強を可能にする変異をとらえた場合に生じる適応の場合と同様に、株８ｂでは、ｘｙｌＡＢオペロンでの両方の遺伝子の産物の活性が、その先祖株８ＸＬ４より増加した。さらに述べると、測定した酵素活性の増加は、それほど適応されていない株より約５倍増加した。
【０１２２】
８ｂおよび８ＸＬ４株においてｘｙｌＡＢオペロンの発現を指令するＰｇａｐを、配列決定した。ＰＣＲフラグメントを、プロモーターの５’末端由来の順方向ＰＣＲプライマー（ＧＡＰ−Ｆ８；配列番号４４）およびｘｙｌＡコード領域由来の逆方向プライマー（ＸｙｌＡＢ８５１Ｒ；配列番号５）を使用して、調製した。得られたＰＣＲ産物を、プライマーＧＡＰ−Ｆ８、ＸｙｌＡＢ４４９Ｒ、およびＸｙｌＡＢ８５１Ｒ（配列番号４４、４６、および４５）を使用して配列決定した。ＺＷ８ＸＬ４由来のプロモーター配列を配列番号３に示し、そして８ｂ由来のプロモーター配列を配列番号５に示す。ＺＷ６４１およびＺＷ６５８におけるｘｙｌＡＢオペロンのＰｇａｐにおける場合と同様に、これらのプロモーター配列もまた、両方とも、株ＣＰ４のＰｇａｐの公開された配列との間で１つの差異を有した。これらの共通の変化に加えて、ＺＷ６４１およびＺＷ６５８のＰｇａｐ配列の間にも１つの塩基対の違いが認められた。８ＸＬ４と８ｂとの比較では、開始ＡＴＧに対して−１８９位でのＧからＴへの変化が認められなかった一方、開始ＡＴＧに対して−８９位において、ＣからＴへの変化が生じた。
【０１２３】
株ＺＷ６５８のＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンのプロモーター配列の場合と同様に、新規の配列の制御下でのコード領域からのタンパク質の産生が、部分的に適応された株由来の同じプロモーターの配列よりも多く産生されることを可能にする新規の配列への適応中に、株８ｂのＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンのプロモーター配列が変化した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
−１９０位、−８９位、または−１９０位および−８９位の両方からなる群から選択される位置において塩基置換を有するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターを含む単離された核酸分子であって、前記位置番号は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＣＰ４およびＺＭ４株におけるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの天然のＡＴＧ翻訳開始コドンに対する番号である、前記核酸分子。
【請求項２】
塩基置換が、
ａ）−１９０位におけるＧからＴへの置き換え；および
ｂ）−８９位におけるＣからＴへの置き換え
である、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２からなる群から選択される配列を含む、請求項２に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
異種核酸分子に作動可能に連結された請求項１に記載の単離された核酸分子を含む、キメラ遺伝子。
【請求項５】
異種核酸分子がタンパク質またはペプチドをコードする、請求項３に記載のキメラ遺伝子。
【請求項６】
異種核酸分子が、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、および干渉ＲＮＡからなる群から選択される調節ＲＮＡ分子をコードする、請求項３に記載のキメラ遺伝子。
【請求項７】
請求項１に記載の単離された核酸分子を含むベクター。
【請求項８】
請求項２に記載の単離された核酸分子を含むベクター。
【請求項９】
請求項３に記載の単離された核酸分子を含むベクター。
【請求項１０】
請求項１に記載の単離された核酸分子を細胞に導入する工程を含む、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞およびザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）細胞からなる群から選択される細菌細胞を形質転換する方法。
【請求項１１】
請求項２に記載の単離された核酸分子を細胞に導入する工程を含む、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞およびザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）細胞からなる群から選択される細菌細胞を形質転換する方法。
【請求項１２】
請求項３に記載の単離された核酸分子を細胞に導入する工程を含む、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞およびザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）細胞からなる群から選択される細菌細胞を形質転換する方法。
【請求項１３】
導入する工程が、請求項１に記載の単離された核酸分子を細胞のゲノムに組み込むか、または細胞内の安定に複製するプラスミド上で維持する工程を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１】
−１９０位、−８９位、または−１９０位および−８９位の両方からなる群から選択される位置において塩基置換を有するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターを含む単離された核酸分子であって、前記位置番号は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＣＰ４およびＺＭ４株におけるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの天然のＡＴＧ翻訳開始コドンに対する番号である、前記核酸分子。
【請求項２】
塩基置換が、
ａ）−１９０位におけるＧからＴへの置き換え；および
ｂ）−８９位におけるＣからＴへの置き換え
である、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２からなる群から選択される配列を含む、請求項２に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
異種核酸分子に作動可能に連結された請求項１に記載の単離された核酸分子を含む、キメラ遺伝子。
【請求項５】
異種核酸分子がタンパク質またはペプチドをコードする、請求項３に記載のキメラ遺伝子。
【請求項６】
異種核酸分子が、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、および干渉ＲＮＡからなる群から選択される調節ＲＮＡ分子をコードする、請求項３に記載のキメラ遺伝子。
【請求項７】
請求項１に記載の単離された核酸分子を含むベクター。
【請求項８】
請求項２に記載の単離された核酸分子を含むベクター。
【請求項９】
請求項３に記載の単離された核酸分子を含むベクター。
【請求項１０】
請求項１に記載の単離された核酸分子を細胞に導入する工程を含む、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞およびザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）細胞からなる群から選択される細菌細胞を形質転換する方法。
【請求項１１】
請求項２に記載の単離された核酸分子を細胞に導入する工程を含む、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞およびザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）細胞からなる群から選択される細菌細胞を形質転換する方法。
【請求項１２】
請求項３に記載の単離された核酸分子を細胞に導入する工程を含む、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞およびザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）細胞からなる群から選択される細菌細胞を形質転換する方法。
【請求項１３】
導入する工程が、請求項１に記載の単離された核酸分子を細胞のゲノムに組み込むか、または細胞内の安定に複製するプラスミド上で維持する工程を含む、請求項１０に記載の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ−Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７Ａ−Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ−Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１４】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ−Ｃ】
【図１６】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ−Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７Ａ−Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ−Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１４】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ−Ｃ】
【図１６】
【公表番号】特表２０１１−５１５１０６（Ｐ２０１１−５１５１０６Ａ）
【公表日】平成２３年５月１９日（２０１１．５．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０１９９５（Ｐ２０１１−５０１９９５）
【出願日】平成２１年３月２５日（２００９．３．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３８１５８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１２０７３０
【国際公開日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【出願人】（３９００２３６７４）イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー (2,692)
【氏名又は名称原語表記】Ｅ．Ｉ．ＤＵ ＰＯＮＴ ＤＥ ＮＥＭＯＵＲＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ
【出願人】（５１０１１９６８１）アライアンス フォア サステイナブル エナジー エルエルシー (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年５月１９日（２０１１．５．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月２５日（２００９．３．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３８１５８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１２０７３０
【国際公開日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【出願人】（３９００２３６７４）イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー (2,692)
【氏名又は名称原語表記】Ｅ．Ｉ．ＤＵ ＰＯＮＴ ＤＥ ＮＥＭＯＵＲＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ
【出願人】（５１０１１９６８１）アライアンス フォア サステイナブル エナジー エルエルシー (5)
【Ｆターム（参考）】
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