高純度ペンタマイシン
純度９５％を超えるペンタマイシン、ペンタマイシンの特定の多形および溶媒和物、それらの精製法、ならびにペンタマイシンの分解の速度を減少させる方法を記載している。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、高純度ペンタマイシン、ペンタマイシンの特定の多形および溶媒和物、それらの精製法、ならびに純度９５％を超えるペンタマイシンの分解の速度を減少させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ペンタマイシンは、アンホテリシンＢおよびニスタチンＡ１と同様に、抗真菌活性を有するポリエンマクロライド抗生物質のクラスに属する。ペンタマイシンは天然源から入手でき、例えばＳ．ウメザワ（S. Umezawa）およびＹ．タナカ（Y. Tanaka）が「J. Antibiotics, Ser. A, vol. XI, no. 1, pages 26 to 29 (1958)」に記載したアクチノマイセス属のストレプトマイセス・ペンチクス（penticus）の菌糸体、またはグラクソ（Ｇｌａｘｏ）に与えられた英国特許第８８４７１１号に記載されているストレプトマイセス・ロゼオルテウス（roseoluteus）（ＮＲＲＬ２７７６、ＮＣＩＢ８９８４）などの特定のストレプトマイセス菌株から単離されうる。該特許は抗生物質ラゴシンの製造に向けられているが、これは下記のパンデイ（Pandey）らの論文「J. Antibiotics vol. XXXV no. 8, pages 988-996 (1982)」にてフンギクロミンおよびコゴマイシンと同一であると示されている。ラゴシンは、該英国特許の２ページ、右欄、４８〜４９行に、固体および溶液の両方で光に感受性があると述べられている。
【０００３】
ペンタマイシン（＝フンギクロミン）の絶対配置は、分解産物と部分合成のスペクトル比較によって決定された（T. Oishi, Pure & Appl. Chem., vol. 61, no. 3, pp. 427-430 (1989)」）。Ｙ．イガラシ（Y. Igarashi）らが「J. Antibiot. vol. 58, no. 8, pp. 523-525 (2005)」に発表したＸ線分析によると、ペンタマイシンは下記の式を有する。
【化１】
【０００４】
例えば、デイビッド・Ｒ．ウォーゼン（David R. Worthen）らの論文「Drug Development and Industrial Pharmacy、vol. 27(4), 277-286 (2001)」の４７８ページの左欄に述べられているように、「ポリエン抗真菌の製造および精製は、それらの特有の化学的不安定性によって困難なものとなっている。ポリエンは典型的には、加水分解性エステル、アセタール、およびヘミアセタール、ならびに酸化されやすい共役ポリエン系を含む、１個または数個の潜在的に不安定な構造的官能性を有する（１９）。それゆえ、全てのポリエン抗真菌は、ある程度は、大量培養におけるそれらの製造および回収の間に通常直面する条件によって不活性化または明白な分解にさらされる。これらの潜在的に分解性の条件の中で最も注目すべきものは、湿度、温度上昇、空気中の酸素、多価金属、および光照射を含む（１９、２０）」。該論文で述べられている参考文献１９および２０は、（１９）「I. M. Teresin, Polyene Antibiotics-Present and Future; University of Tokyo Press: Tokyo, 1976; 122-123」、および（２０）「K.Thoma and N. Kubler， Photostability of antifungal agents. 2. Photostability of polyene antibiotics. Pharmazie vol. 52, 294-302 (1997)」である。
【０００５】
上記のウォーゼン（Worthen）の論文は、４７８ページの左欄で、「ポリエン精製をさらに複雑にしているのは、ストレプトマイセスからの実質的に全ての粗ポリエン単離物は、数種類の異なった物理化学的に類似しているアイソフォームを含み、その中の１つだけが臨床用途に望ましいであろうという事実である」と続けている。
【０００６】
上記を考慮すると、最初は異なる物質であると考えられていたため、ペンタマイシンは３つの他の名称、すなわちラゴシン、フンギクロミン、およびコゴマイシンをも与えられていたことは驚くべきことではない。Ｒ．Ｃ．パンデイ（R. C. Pandey）らが、「J. Antibiotics vol. XXXV no. 8, pages 988-996 (1982)」のアブストラクトで述べているように、「１つ以上の中心でいくつかの立体化学的相違を有すると以前は記載されていた３つのポリエンマクロライド抗生物質、フンギクロミン、ラゴシン、およびコゴマイシンは、立体化学的側面を含む全ての点で同一であると示されている。それらの性質で以前に観察された相違は、現在は高速液体クロマトグラフィーによって分離可能な不純物の量の相違によるものであるとされている。３つの抗生物質は全て、１つの主成分と数種の微量成分を含む」（強調は筆者による）。パンデイ（Pandey）の該論文の９８８ページの表Ｉに、フンギクロミン、ラゴシン、およびコゴマイシンの融点が文献値として１９０〜２４０℃の範囲であると示されている。
【０００７】
メルクインデックス（１２版）の７２７ページの登録番号４３１２は、フンギクロミンの融点が１５７〜１６２℃（分解）であると記載している。
【０００８】
パンデイ（Pandey）の論文の主題は、該３つのマクロライド抗生物質の物理化学的および生物学的比較であり、純度９５％を超えるペンタマイシンの提供ではない。その９９５ページの「ディスカッション」の初めに述べられているように、ＣＣＤ（向流分配）精製を繰り返した後でさえ、全ての微量成分を除去することは可能ではなかった。そのように精製されたフンギクロミン、ラゴシン、およびコゴマイシンの融点は、９９０ページの表２に、１５７〜１６５℃の範囲であると示されている。該「ディスカッション」の第二段落に、ＨＰＬＣについて、不純物からのフンギクロミン、ラゴシン、およびコゴマイシンの最適な分離は、メタノール−水（６０：４０）を移動相として用いることによって達成されたと記載されている。水に対するメタノールの比率を下げると、ピークは非常に広くなり、保持時間が増加した；該比率の増加は保持時間を減少させ、分離を困難にした。パンデイ（Pandey）の論文の表２の右欄から明らかなように、フンギクロミン、ラゴシン、およびコゴマイシンの保持時間は下記と同一の条件下のＨＰＬＣで６.００分である：９９２ページ、第３および４行、９９０ページ、表２の脚注４、ならびに９８９ページの終わりから３段落目、すなわち、Ｃ１８μＢｏｎｄａｐａｋ逆相カラム（３.９ｍｍ ＩＤ×３０ｃｍ）、ＵＶ（３５７ｎｍ）検出器、メタノール−水（６０：４０）溶媒系、および流速１.５ｍｌ／分を用いる。
【０００９】
本発明の出願人は、第三者が行う試験を注文し、粗ペンタマイシン、すなわち純度約９２％のペンタマイシンをパンデイ（Pandey）の論文に記載されている条件下で精製することを行わせた。ペンタマイシン含有溶出液画分を蒸発させ、以前に用いたのと同一のＨＰＬＣ条件下で再検査した後、純度約９０％のペンタマイシンのみが単離された。単離したペンタマイシンのＨＰＬＣクロマトグラムにより、粗ペンタマイシンには存在していなかった新たな不純物が９.５％存在することが明らかになった。この知見は、パンデイ（Pandey）の論文には、ペンタマイシンがＨＰＬＣ分離後に単離され、または結晶化されたとはどこにも述べられていないという事実を示している。パンデイ（Pandey）の論文に示されている唯一の融点（１５７〜２４０℃の範囲！）は、表１の文献に由来する融点および表２の向流分配に由来する融点である。結論として、パンデイ（Pandey）の論文に開示されているＨＰＬＣ条件は、単離後に純度９５％を超えるペンタマイシンを得るために用いることはできない。
【００１０】
注目すべきは、ペンタマイシンは１２個の不斉中心を含む比較的大きく、かつ、構造的に複雑な分子であり、２１２（＝４０９６）個の立体異性体があることである。さらに、ペンタマイシンは、シス−トランス−異性化を受けうる５個の二重結合を含む。ペンタマイシンの安定性が非常に繊細であることに留意すると、可能な４０９６個の立体異性体の正しいものを全て化学合成するには年月がかかるであろうし、それ自体で発明であろうし、かつ、経済的展望からは、上記のストレプトマイセス菌株による生合成と比較して非常に費用がかかるであろう。
【００１１】
ペンタマイシンの繊細な安定性は、例えばＲ．Ｗ．リッカーズ（R. W. Rickards）らの「J. Antibiotics vol. XXIII, no. 12, pages 603-611」から明らかであり、そこでは抗酸化剤によって阻害されうるラジカル付加工程によるメタノール溶液中のラゴシンの空気中の自動酸化を記載している。リッカーズ(Rickards)らによると、ラゴシンの主要な最初の自動酸化産物は特定のエポキシドであり、一方で、長期の自動酸化は高酸化産物をもたらし、最終的にポリマー性物質をもたらす。上記のウォーゼン（Worthen）の論文の記載に完全に従って、リッカーズ（Rickards）らは６０３ページで、マクロライド抗生物質のポリエンサブグループのメンバーは「総じて不安定であり、酸、アルカリ、熱、空気または光にさらすと分解および生物学的活性の喪失を伴う。特に、主にポリエン発色団と関連する空気および光に対するこの感受性は、臨床用途の前の保存において問題となる」と記載している。
【００１２】
上記の英国特許第８８４７１１号は、８ページ、４１行の実施例１で、「純粋なラゴシン」が得られたと述べている。該実施例１は、ブタノールで発酵ブロスカッティングを抽出すること、抽出液を濃縮すること、水を加えること、ジエチルエーテルで洗浄すること、濾過すること、ソックスレーを用いてメタノールで抽出すること、および濾過することのステップからなる発酵ブロスからのラゴシンの回収を記載し、該英国特許の８ページ、３３および３５行によると、純度「およそ７５％」のラゴシンが得られると記載している。不純物を除去するとされる作業をするために、純度７５％のラゴシンは、８ページの３４〜４２行に記載しているように、ソックスレーを用いてクロロホルムで抽出し、空気乾燥し、エチルエーテルで抽出し、空気乾燥し、メタノールで再抽出する。メタノールを一晩冷却すると、「純粋なラゴシン」とされるものが得られるが、融点は提供されていない。
【００１３】
該英国特許の上記文章を読んだ当業者にとって、上記の手順によって純度７５％のラゴシンが実際にさらに精製されうることは非常に疑わしいものであろう。これは、ジエチルエーテルおよびメタノールでの処理が以前に既になされたが、ラゴシンの純度が７５％以上に増加しなかったからである。それゆえ、該処理の反復によって実質的に純度が増加するのであろうか？さらに、リッカーズ（Rickards）らが記載したように、空気中でラゴシンを乾燥するステップは、酸化をもたらすと予想される（上記を参照のこと）。最後に、本出願の実施例８からも明らかなように、メタノールからの粗ペンタマイシンの結晶化では、（結晶化を３回繰り返した場合でさえ）純度９５％を超えるペンタマイシンを得ることはできない。本発明者が発見したように、これは、特定の不純物がペンタマイシンと共に結晶化し、それゆえ、結晶化によっては除去することができず、本発明に記載したような他の手段によってのみ除去することができるからである。ペンタマイシンは比較的大きな分子であるため、ほんの小さな相違、例えば５つの二重結合のうち１つのエポキシ化だけで不純物はペンタマイシンと区別しうることを留意すべきである。確かに、構造的に互いに非常に近い化合物の分離は非常に多くの問題をもたらす。英国特許第８８４，７１１号の実施例１の手順では「純粋な」ラゴシンを得ることができないことは上記より既に予想できることであるが、本発明の出願人は外部の研究所に、該実施例に記載された精製法をできる限り正確に再現するように依頼した。結果は本出願の実施例１０に記載している。予想されたように、中間体物質について「およそ７５％」の純度がおよそ確認することができた（実測値：６７.３％）一方、さらなる精製ステップでは「純粋な」ペンタマイシンを得られず、純度７０.１％のペンタマイシンのみが得られた。
【００１４】
ペンタマイシンは１９８０年代にスイスで商標名ペンタシン（Ｐｅｎｔａｃｉｎ（登録商標））にて登録された薬物の活性成分であったが、純度および安定性について、登録された製品仕様に適合することが困難であったため（販売された製剤が抗酸化剤を含んでいたにもかかわらず）、市場から撤退した。スイスの登録証の製品仕様によると、ペンタマイシンの純度は９５％であった。しかしながら、今日利用できる現代の分析手段を用いると、過去に登録されたペンタマイシンに存在した多数の不純物は検出されず、それゆえ、過去の実際のペンタマイシンの純度は９５％よりもかなり低かったことが今では分かっている。
【００１５】
ペンタマイシン自体は親油性部分と非常に親水性の部分を有しており、それゆえ、界面活性剤と似たような振る舞いをする。さらに、それは水に比較的不溶性であり、ゲルを形成する傾向にあり、ほとんどろ過することができない。
【００１６】
集中的な取り組みにもかかわらず、本発明者は、長い間、ペンタマイシンの純度を９３％以上に増加させることができなかった。実際、本発明があるまでは、９３％の純度閾値は乗り越えられないように思えた。
【００１７】
本発明者が解決すべき課題は、ペンタマイシンの純度を９３％以上、特に９５％以上に増加させ、ペンタマイシンをスイスの医薬品市場に再導入し得、かつ他の国で薬物として登録することができるのに十分安定な形態にすることであった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
発明の記載
長く、最初は実りのなかった試みの末、今では驚くべきことに、本特許出願の発明者は、どのようにペンタマイシンが９３％を超える、特に９５％を超える純度にて製造され得、かつ、分解に対してうまく安定化されうるのかを発見した。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者は、特定の不純物が同一の結晶格子にてペンタマイシンと共に結晶化するらしく、それゆえ結晶化によるさらなる精製が不可能であることを発見した。実施例８に示すように、粗ペンタマイシンのメタノールからの３回連続した結晶化の後でさえ、得られた生成物は、なおも約１０％の不純物を含む。該不純物は、ペンタマイシンと構造的に非常に似た化合物、例えばペンタマイシンの様々なエポキシド、ヒドロキシ基がオキソ基に交換され、もしくはメトキシ基にメチル化されているペンタマイシン誘導体、二重結合が単結合に還元されているペンタマイシン誘導体、テトラヒドロピラノン環を含むペンタマイシン誘導体、および／または、潜在的に、ペンタマイシンの立体異性体を含み、それゆえ、単純な従来の手段によってそれら全てを除去することはできない。
【００２０】
現在では、ペンタマイシンは、好ましくはメタノールまたはエタノールなどのアルコール性溶媒中で、モルホリン（１：１のモル比）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ；１：１のモル比）、Ｎ−エチルピロリドン（ＮＥＰ）、またはテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）などの小さな極性のヘテロ環と特定の溶媒和物を形成し、それら溶媒和物の一部、例えばＮＭＰおよび特にモルホリンとの溶媒和物は有用な性質を有し、すなわち、それらは驚くべきことに、現在の経験に従うと、メチル第３級ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）またはトルエンなどの非極性の溶媒中ではなくメタノールまたはエタノール中で製造すると、閾値９３％以上にペンタマイシンを精製することに用いることができることが分かってきた。溶媒和物と共結晶の間の相違は、単に上記の小さな極性のヘテロ環が室温で液体であるか固体であるかに帰するだけであるため、本文章の文脈において、用語「溶媒和物」は、共結晶も含むと理解されるべきである。
【００２１】
それゆえ、本発明は、化学純度９３％を超える、好ましくは９５％を超える、より好ましくは９６％を超える、および最も好ましくは９７重量％を超えるペンタマイシンの精製法、ならびにペンタマイシンの特定の溶媒和物および多形、ならびにペンタマイシンを精製および／または安定化するためのそれらの使用に関する。
【００２２】
本発明者は、ペンタマイシンを、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、およびＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）に溶解した多数の結晶化実験を実施した。そのようにして得られた溶液に、結晶化が起こるまで抗溶媒を加えたが、ここで抗溶媒はペンタマイシンの溶解度が非常に低い溶媒、例えばメタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、酢酸エチル、またはアセトニトリルなどの溶媒を意味する。高容量の抗溶媒、例えばメタノールに溶解したペンタマイシンの結晶化も検査した。
【００２３】
該結晶化実験の過程の中で、ペンタマイシンがモルホリンおよびＮ−メチルピロリドンと溶媒和物を形成するが、ＤＭＳＯとは溶媒和物を形成せず、かつ、該溶媒和物は驚くべきことに、該溶媒和物の再結晶化の反復によって、ペンタマイシンと共結晶化する不純物を減少させるために用いられうることを発見した。
【００２４】
ペンタマイシンと共結晶化する不純物を除去する１つの方法は、ペンタマイシンとモルホリンの溶媒和物を連続的に製造および結晶化することであり、最初に針状の形態（図１参照）に結晶化し、次いで針状の多形性モルホリン溶媒和物をフレーク状の形態（図２参照）に結晶化するモルホリン溶媒和物に変換し、次いでモルホリンを除去することである。フレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物と比較すると、針状の溶媒和物はあまり精製に適切ではない。これまでに得られた（限定的ではあるが）実験的経験によると、それは再結晶化によって十分に閾値９３％を上回るように精製することはできない。それゆえ、針状の溶媒和物はできる限り早く、例えばフレーク状の溶媒和物の種結晶を加えることによってフレーク状の溶媒和物に変換される。針状およびフレーク状のモルホリン溶媒和物の連続的な製造は、１つのポット内にて行われうる。モルホリン溶媒和物の製造は、好ましくは窒素などの保護ガス下で、光から保護し、かつ、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、または好ましくはブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、すなわち２，６−ジ第３級ブチル−４−メチルフェノールなどの抗酸化剤の存在下で行われる。結晶化は好ましくは、適切な極性溶媒、例えば適切なアルコール、例えば適切なアルカノール、例えばエタノール、または最も好ましくはメタノール中で行われる。より長鎖のアルコールおよび非極性の溶媒、例えばトルエン、ＭＴＢＥなどでは、ほとんど精製効果が達成されなかった。モルホリン中ではペンタマイシンの溶解度が高過ぎるため、モルホリンも単一の溶媒としては有効ではない。フレーク状のモルホリン溶媒和物の形成による精製は、所望の純度が得られるまで必要に応じて何度でも繰り返される。
【００２５】
溶媒系の中でペンタマイシンに対するモルホリンの量を増加させると、針状多形のフレーク状多形への変換を促進する。上記のように、該変換はフレーク状多形の種結晶を加えることによっても促進することができる。
【００２６】
本発明は、粗ペンタマイシン、適切なアルコール、特に低級アルカノール、例えばエタノールまたは好ましくはメタノール、モルホリン、およびＢＨＴなどの適切な抗酸化剤の混合物を、好ましくは温度約５〜５０℃で、好ましくは室温で、有利には窒素などの保護ガス下、フレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物が結晶化するまで攪拌し、例えば濾過によってそれを単離し、メタノールなどの低級アルカノールで洗浄し、必要であれば、得られたフレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物を粗ペンタマイシンの代わりに用いて上記手順を１回以上繰り返すことによって、得られたフレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物をさらに精製することによって、フレーク状のモルホリン溶媒和物（ペンタマイシンとモルホリンの１：１のモル比）を形成することによる、粗ペンタマイシンを精製する方法に関する。
【００２７】
本発明は、粗ペンタマイシン、適切なアルコール、特に低級アルカノール、例えばエタノールまたは好ましくはメタノール、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、およびＢＨＴなどの適切な抗酸化剤の混合物を、好ましくは温度約５〜５０℃で、好ましくは室温で、有利には窒素などの保護ガス下、ＮＭＰ溶媒和物が結晶化するまで攪拌し、例えば濾過によってそれを単離し、メタノールなどの低級アルカノールで洗浄し、必要であれば、上記手順を繰り返すことによって得られたＮＭＰ溶媒和物をさらに精製することによって、ＮＭＰ溶媒和物を形成することによる、粗ペンタマイシンを精製する方法にも関する。
【００２８】
ＮＭＰ溶媒和物を用いる上記方法によって、ペンタマイシンと共結晶化する２つの不純物のうち１つ、すなわち相対保持時間（ｒｒｔ）１.５４（本明細書で記載するＨＰＬＣ系にて）の不純物（ｉｍｐ）が除去されうる一方で、ｒｒｔ０.８３の別の不純物は３.３％のレベルしか減少させることができない。
【００２９】
モルホリンおよびＮＭＰは、溶媒和物を数時間、メタノールまたは好ましくはエタノール中、例えば温度０℃〜＋５０℃で、好ましくは室温で攪拌し、得られた結晶を濾過し、それらをメタノールまたは好ましくはエタノールで洗浄し、必要であれば、得られた生成物に含まれるモルホリンまたはＮＭＰが０.１％未満になるまで該精製法を繰り返すことによって、それぞれのペンタマイシン溶媒和物から除去される。
【００３０】
残存するモルホリンまたはＮＭＰは、ＤＭＳＯ／エタノールまたはＤＭＳＯ／メタノールからの結晶化によって除去することができ、それによってペンタマイシンの多形Ａが得られる。
【００３１】
ペンタマイシンは、非晶質形態（図８および図９参照）ならびに多形Ａ以外の他のいくつかの多形体（以下多形Ｂ〜Ｅと称する）にて存在することが分かった。他の多形と比較すると、多形Ａは粉末回折Ｘ線にて下記の２θ角（±約０.２°）：２.２８、７.３８および２０.１６の線によって区別され、多形Ｂは９.５４、２１.２８および２２.３２に線を生じ、多形Ｃは７.０４に特性線を有し、多形Ｄは２.５８に特性線を有し、多形Ｅは３.３２にあまり強くない特性線を有し、粗ペンタマイシン（図１１および図１２参照）は８.８４および１３.１４に特性線を示す。多形Ａについての上記の２θ角（±約０.２°）：２.２８、７.３８および２０.１６を実施例７の対応する値、すなわち２.２２、７.２９および２０.１７と比較すると、小さな相違が認められる。これは、それぞれの数値が異なる測定に由来するという事実によるものである。しかしながら、該相違は、±０.２°の２θ角について十分に国際的に許容される実験誤差の範囲内である。
【００３２】
多形Ａは、例えば酢酸エチルを加えた後にペンタマイシンのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液から結晶化する。
【００３３】
非晶質ペンタマイシンは、例えばアセトニトリルを加えた後にペンタマイシンのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液から得られる。
【００３４】
多形Ｂは、メタノール／クロロホルムから結晶化する。
【００３５】
多形Ｃ（図１０参照）は、ペンタマイシンのジメチルホルムアミド溶液に６０℃でメタノールを加え、メタノールを加え、０℃まで冷却することによって得られる。
【００３６】
多形Ｅは、ジメチルスルホキシド／アセトニトリルから結晶化する。
【００３７】
多形Ａは、熱力学的に最も安定な多形であるようである。その示差走査熱量測定（ＤＳＣ）図（図７に示している）は、１つの単一シグナルを示す。それとは対照的に、他の結晶性多形のＤＳＣ図は、２つ以上のシグナルを示し（例えば図１０の多形ＣのＤＳＣ参照）、それゆえ、徐々に温度を増加させると他の多形体に転移することを示している。純粋な多形Ａの最も驚くべきかつ全く予測できない性質は、空気にさらしたときのその安定性であり（実施例９参照）、これはこれまでに知られている純粋なペンタマイシンの全ての形態と全く対照的である。
【００３８】
本発明のペンタマイシンの高純度形態、特に化学純度９５％を超えるペンタマイシンの多形Ａは、例えば、カンジダ、特にカンジダ・アルビカンス、および膣トリコモナスに起因する膣および粘膜感染を治療するための膣坐剤などの局所使用のための医薬製剤の形態にて、好ましくは哺乳類を含む温血動物、特にヒトを治療する方法に用いることができる。
【００３９】
局所使用のための該医薬製剤、例えば膣坐剤は、例えば適切な医薬賦形剤と共に濃度０.１〜５重量％のペンタマイシンを含み、投与単位、すなわち坐剤あたり３ｍｇ〜１５０ｍｇのペンタマイシンを含む。膣坐剤は、例えば体重約６０ｋｇのヒト女性に、１日１〜２回提供される。
【００４０】
要約すると、本発明は、化学純度９５％を超える、好ましくは化学純度９７％を超えるペンタマイシン、特に多形Ａの形態にある、とりわけ化学純度９５％を超える、好ましくは９７％を超える多形Ａの形態にあるペンタマイシンであって、相対強度が単なる目安として提供されるＸ線粉末回折スペクトルにおいて、下記の最も強い線の２θ値±約０.２°によって特徴付けられるペンタマイシンに関する：
【表１】
。
【００４１】
本発明はさらに、溶媒和物の形態にあるペンタマイシン、特にペンタマイシンの精製に適切な溶媒和物の形態にあるペンタマイシン、例えばヘテロ環化合物、好ましくは、例えばＮ−メチル−ピロリドンまたは好ましくはモルホリンなどの低分子量ヘテロ環化合物との溶媒和物の形態にあるペンタマイシンであり、針状のモルホリン溶媒和物、または好ましくはフレーク状のモルホリン溶媒和物などの形態にあるペンタマイシンであって、特に化学純度９５％を超える、９６％を超える、または好ましくは９７％を超える溶媒和物、特に相対強度が単なる目安として提供される粉末Ｘ線回折スペクトルにおいて、下記の最も強い線の２θ値±約０.２°を有するフレーク状のモルホリン溶媒和物に関する：
【表２】
。
【００４２】
本発明はさらに、ペンタマイシンの化学的精製のための上記のペンタマイシン溶媒和物の使用に関する。
【００４３】
本発明はさらに、化学純度９３％以下のペンタマイシンを適切な溶媒和物、特に上記の溶媒和物の１つに変換し、該溶媒和物を結晶化によって精製し、例えばＣ１−５−アルカノール中の長時間の攪拌によってペンタマイシンを溶媒和物から遊離させることによるペンタマイシンの精製法であって、該精製法が、必要であれば、好ましくは２，６−ジ第３級ブチル−４−メチルフェノールなどの適切な抗酸化剤の存在下で行われる、ペンタマイシンの精製法に関する。
【００４４】
本発明はさらに、ペンタマイシンをその多形Ａの形態に変換することによって、化学純度９５％を超えるペンタマイシンの分解の速度を有意に減少させる方法に関し、特に多形Ａへの変換が、酢酸エチルを加えた後、純度９５％を超えるペンタマイシンのジメチルスルホキシド溶液から結晶化することによって達成される方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、針状のペンタマイシン−モルホリン（１：１）溶媒和物の写真を示す。
【図２】図２は、フレーク状のペンタマイシン−モルホリン（１：１）溶媒和物の写真を示す。
【図３】図３は、針状のペンタマイシン−モルホリン（１：１）溶媒和物の粉末回折図を示す。
【図４】図４は、フレーク状のペンタマイシン−モルホリン（１：１）溶媒和物の粉末Ｘ線回折スペクトルを示す。
【図５】図５は、ペンタマイシンの多形Ａの粉末Ｘ線回折図を示す。
【図６】図６は、ペンタマイシンの多形Ａの写真を示す。
【図７】図７は、ペンタマイシンの多形Ａの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）図を示す。
【図８】図８は、非晶質ペンタマイシンのＤＳＣを示す。
【図９】図９は、非晶質ペンタマイシンの粉末Ｘ線回折図を示す。
【図１０】図１０は、ペンタマイシンの多形ＣのＤＳＣ（上）およびＸ線（下）を示す。
【図１１】図１１は、粗ペンタマイシンの粉末Ｘ線回折図（上）およびＤＳＣを示す。
【図１２】図１２は、粗ペンタマイシンの高圧液体クロマトグラム（ＨＰＬＣ）を示す。
【図１３】図１３は、「J. Antibiotics, ser. A, vol. XI, no.1, Jan. 1958, pp. 26-29」に記載されているメタノールからの３回の結晶化後に記録されたペンタマイシンのＤＳＣ（上）および粉末Ｘ線回折図（下）を示す。
【図１４】図１４は、「J. Antibiotics, ser. A, vol. XI, no.1, Jan. 1958, pp. 26-29」に記載されているメタノールからの３回の結晶化後に記録されたペンタマイシンのＨＰＬＣを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
実験の詳細な記載
粉末Ｘ線スペクトルは、Ｒｉｇａｋｕ Ｍｉｎｉｆｌｅｘ回折計に記録する（ＣｕＫα照射、記録範囲２〜４０°［２θ］、ステップ幅０.０２°［２θ］、記録間隔０.００８３°［２θ］、プローブ容器：シリコン）。記録した２θ角の実験誤差は約±０.２°である。相対強度の実験誤差は大きい。それゆえ、相対強度は単なる目安であると理解されるべきである。
【００４７】
下記の実施例は本発明を説明する。略語「ｒｒｔ」は「相対保持時間」、すなわちＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）内の不純物の正味の保持時間と、ペンタマイシンの正味の保持時間の間の比を意味する。実施例にて用いられている用語「ｉｍｐ ｒｒｔ」は、ペンタマイシンに対する不純物の保持時間を意味し、すなわちペンタマイシンのｒｒｔは１.００である。１.００以下の相対保持時間は不純物がペンタマイシンよりも早く溶出されることを意味し、１.００より大きい相対保持時間は不純物がペンタマイシンよりも後に溶出されることを意味する。例えば、「ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：８.０％」は、相対保持時間０.８３で８％量の不純物があることを意味する。ＨＰＬＣの慣例により、検出された化合物のパーセンテージはそれぞれのシグナルの面積を反映する面積パーセントとして表され、すなわち上記の例では、８.０％は面積パーセントである。
【００４８】
本明細書で記載しているＨＰＬＣクロマトグラフィーは、Ａｇｉｌｅｎｔ（登録商標）１１００システムまたはこれに相当するものを用いて行っている。移動相は溶液ＡおよびＢを含み、溶液Ａは水−アセトニトリル−トリフルオロ酢酸の６５０：３５０：０.０１（ｖ：ｖ：ｖ）比の溶液であり、溶液Ｂはアセトニトリル−２−プロパノール−トリフルオロ酢酸の７５０：２５０：０.０１（ｖ：ｖ：ｖ）比の溶液である。
【００４９】
分析するサンプルはアセトニトリル−水−テトラヒドロフランの１：１：２（ｖ：ｖ：ｖ）比の溶液に溶解し、そこへアセトニトリル−水−テトラヒドロフランの１：１：２（ｖ：ｖ：ｖ）比の溶液に溶解した０.１％（ｗ：ｖ）のＢＨＴを加え、終濃度０.６ｍｇ／ｍｌで検査する。
【００５０】
ＨＰＬＣは、Ｗａｔｅｒｓ Ａｔｌａｎｔｉｓ（登録商標）ｄＣ１８ＲＰ２５０ｘ４.６ｍｍ、５μｍカラムで行う。Ａｔｌａｎｔｉｓ ｄＣ１８カラムは、シリカベースのラインの二機能的に結合した逆相Ｃ１８カラムである。下記のパラメーターを用いている：
グラジエント：
【表３】
流速：１.０ｍｌ／分
温度：４０℃
検出：３２０ｎｍ
注入量：５μｌ。
【実施例】
【００５１】
実施例１：針状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物
メタノール（１.７５ｇ）およびモルホリン（０.７５ｇ）の混合物に、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ；２，６−ジ第３級ブチル−４−メチルフェノール）（４ｍｇ）および粗ペンタマイシン（５００ｍｇ；化学純度：８０.６％）；ペンタマイシン含有量：８０％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：８.０％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：７.０％）を加える。粗ペンタマイシンのＨＰＬＣクロマトグラムは、不純物に起因する２つの主要なピークを示す。第１のピークは相対保持時間（ｒｒｔ）０.８３を有する。このピークは、同一の保持時間を有する（少なくとも）２つの異なる不純物からなる。これら２つの不純物の全量は、合わせて８％である。第２の主要な不純物はｒｒｔ１.５４を有し、出発物質中のこの不純物の量は７％である。
【００５２】
該混合物を室温で３日間攪拌する。結晶を濾過し、メタノール（１ｍｌで２回）で洗浄し、減圧下で乾燥し、針状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物（３６２ｍｇ；化学純度：８６.２％；ペンタマイシン含有量：７５％；モルホリン含有量：１０％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：５.３％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：６.５％）を得る。
【００５３】
上記から明らかなように、針状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物中では、ｒｒｔ０.８３およびｒｒｔ１.５４での両不純物の量は、出発物質として用いた粗ペンタマイシンと比較して減少している。
【００５４】
実施例２：フレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物（１：１のモル比）
メタノール（１.５ｇ）およびモルホリン（１ｇ）の混合物に、ＢＨＴ（４ｍｇ）および粗ペンタマイシン（５００ｍｇ；化学純度：８０.６％；ペンタマイシン含有量：８０％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：８.０％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：７.０％）を加える。該混合物を室温で３日間攪拌する。結晶を濾過し、メタノール（１ｍｌで２回）で洗浄し、減圧下で乾燥し、ペンタマイシンとモルホリンを１：１のモル比にて含むフレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物（３２７ｍｇ；化学純度：９０.９％；ペンタマイシン含有量：８２％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：４.３％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：３.０％）を得る。
【００５５】
注意：攪拌３０分後は、主として針状多形が顕微鏡下で観察される。３日間攪拌後、結晶形は「フレーク」状に変化する。
【００５６】
上記から明らかなように、フレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物中のｒｒｔ０.８３およびｒｒｔ１.５４での両不純物の量は、出発物質として用いた粗ペンタマイシンおよび実施例１に記載した針状多形の両方と比較してさらに減少している。
【００５７】
ペンタマイシン−モルホリン溶媒和物（１：１のモル比）の針状多形の粉末Ｘ線回折スペクトルは、図３に示している。
【００５８】
実施例３：種結晶を用いたフレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物の製造
メタノール（１１.５２ｇ）およびモルホリン（７.６８ｇ）の混合物に、ＢＨＴ（１０ｍｇ）および粗ペンタマイシン（４.０ｇ；化学純度：８０.６％；ペンタマイシン含有量：８０％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：８.０％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：７.０％）を加える。該混合物にフレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物の種結晶（１２ｍｇ；フレーク状多形）を播種し、室温で１０時間攪拌する。次いで、さらなる分量の粗ペンタマイシン（２.４ｇ）を加え、該混合物を一晩攪拌する。結晶を濾過し、メタノール（３ｍｌで３回）で洗浄し、減圧下で乾燥し、ペンタマイシン（５.４６g；化学純度：８９，２％；ペンタマイシン含有量：８２％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：４.９％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：４.０％；含有量補正収率：７８％；理論収率：８７％）を得る。
【００５９】
実施例４：フレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物の精製
メタノール（２０.６ｇ）およびモルホリン（１３.７ｇ）の混合物に、ＢＨＴ（４ｍｇ）およびフレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物（４.７５ｇ；化学純度：８９.２％；ペンタマイシン含有量：８１％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：４.９％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：４.０％）を加える。該混合物を室温で１６時間攪拌する。結晶を濾過し、メタノール（２ｍｌで２回）で洗浄し、減圧下で乾燥し、精製されたフレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物（３.４５ｇ）を得る。この物質の一部（３.３９ｇ）を、メタノール（１０.８ｇ）、モルホリン（７.２ｇ）およびＢＨＴ（４ｍｇ）の混合物に加える。該混合物を室温で１６時間攪拌する。結晶を濾過し、メタノール（１ｍｌで２回）で洗浄し、減圧下で乾燥し、さらに精製されたフレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物（２.２７ｇ；化学純度：９３.７％；ペンタマイシン含有量：８３％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：３.２％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：２.０％）を得る。
【００６０】
実施例５：フレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物の連続的な再結晶化
メタノール（１.５ｇ）およびモルホリン（１.０ｇ）の混合物に、ＢＨＴ（５ｍｇ）およびフレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物（３８５ｍｇ；化学純度：８７.７％；ペンタマイシン含有量：８０％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：５.４％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：４.７％）を加える。該混合物を室温で１８時間攪拌する。結晶を濾過し、メタノール（０.５ｍｌで３回）で洗浄し、減圧下で乾燥し、フレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物（２３０ｍｇ；化学純度：９４.５％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：３.０％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：１.５％）を得る。
【００６１】
メタノール（０.８４ｇ）およびモルホリン（０.５６ｇ）の混合物に、ＢＨＴ（３ｍｇ）およびフレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物（２２０ｍｇ；化学純度：９４.５％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：３.０％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：１.５％）を加える。該混合物を室温で１８時間攪拌する。結晶を濾過し、メタノール（０.５ｍｌで３回）で洗浄し、減圧下で乾燥し、フレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物（１４４ｍｇ；化学純度：９６.２％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：２.３％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：０.８２％）を得る。
【００６２】
メタノール（０.６ｇ）およびモルホリン（０.４ｇ）の混合物に、ＢＨＴ（２ｍｇ）およびフレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物（２４４ｍｇ；化学純度：９６％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：２.３％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：１.０％）を加える。該混合物を室温で１８時間攪拌する。結晶を濾過し、メタノール（０.５ｍｌで３回）で洗浄し、減圧下で乾燥し、フレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物ペンタマイシン（１６２ｍｇ；化学純度：９６.６％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：１.９％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：０.７％）を得る。
【００６３】
メタノール（０.４２ｇ）およびモルホリン（０.２８ｇ）の混合物に、ＢＨＴ（２ｍｇ）およびフレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物（１４０ｍｇ；化学純度：９６.６％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：１.９％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：０.７％）を加える。該混合物を室温で１８時間攪拌する。結晶を濾過し、メタノール（０.５ｍｌで３回）で洗浄し、減圧下で乾燥し、フレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物（８９ｍｇ；化学純度：９７.３％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：１.６％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：０.５％）を得る。
【００６４】
得られたペンタマイシン−モルホリン溶媒和物（１：１のモル比）のフレーク状多形の粉末Ｘ線回折スペクトルは、図４に示している。最も強い線の２θ角［度］±約０.１°、および相対強度［％］は下記の通りである：
【表４】
。
【００６５】
上記から明らかなように、ｒｒｔ０.８３およびｒｒｔ１.５４での両不純物の量は、出発物質として用いた粗ペンタマイシン、実施例１に記載した針状多形、および実施例２に記載したフレーク状の粗ペンタマイシン−モルホリン溶媒和物と比較して、精製されたフレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物中においてさらに減少している。
【００６６】
実施例６：ペンタマイシン−Ｎ−メチルピロリドン溶媒和物（１：１のモル比）
ステップ６.１〜６.８は、上記の溶媒和物の製造および反復結晶化によるその精製を示す。そこから明らかなように、ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４は効率的に除去されるが、もう一方の主要なｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３は３.３％のレベルしか減少しない。
【００６７】
ステップ６.１：ペンタマイシン−ＮＭＰ溶媒和物の製造
メタノール（６５ｇ）およびＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ；６５ｇ）の混合物に、ＢＨＴ（１００ｍｇ）および粗ペンタマイシン（２０ｇ；化学純度：８０.６％；ペンタマイシン含有量：８０％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：８.０％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：７.０％）を加える。該混合物を室温で５時間攪拌した。結晶を濾過し、メタノール（１０ｍｌで２回）で洗浄し、減圧下で乾燥し、ペンタマイシン−ＮＭＰ溶媒和物（１７.３ｇ；化学純度：８６.９％；ペンタマイシン含有量：７１％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：５.８％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：５.０％）を得る。
【００６８】
ステップ６.２：ペンタマイシン−ＮＭＰ溶媒和物の第１回目の再結晶化
メタノール（５０ｇ）およびＮＭＰ（５０ｇ）の混合物に、ＢＨＴ（１００ｍｇ）およびステップ６.１から得られたペンタマイシン−ＮＭＰ溶媒和物（１７.３ｇ；化学純度：８６.９％；ペンタマイシン含有量：７１％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：５.８％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：５.０％）を加える。該混合物を室温で１８時間攪拌する。結晶を濾過し、メタノール（１０ｍｌで２回）で洗浄し、減圧下で乾燥し、ペンタマイシン−ＮＭＰ溶媒和物（９.７ｇ；化学純度：９１.５％；ペンタマイシン含有量：８１％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：４.３％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：２.９％）を得る。
【００６９】
ステップ６.３：ペンタマイシン−ＮＭＰ溶媒和物の第２回目の再結晶化
メタノール（３０ｇ）およびＮＭＰ（３０ｇ）の混合物に、ＢＨＴ（１００ｍｇ）およびステップ６.２から得られたペンタマイシン−ＮＭＰ溶媒和物（９.６５ｇ）を加える。該混合物を室温で５時間攪拌する。結晶を濾過し、メタノール（１０ｍｌで２回）で洗浄し、減圧下で乾燥し、ペンタマイシン−ＮＭＰ溶媒和物（７.５ｇ；化学純度：９３.５％；ペンタマイシン含有量：８３％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：３.８％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：１.９％）を得る。
【００７０】
ステップ６.４：ペンタマイシン−ＮＭＰ溶媒和物の第３回目の再結晶化
メタノール（２２ｇ）およびＮＭＰ（２２ｇ）の混合物に、ＢＨＴ（１００ｍｇ）およびステップ６.３から得られたペンタマイシン−ＮＭＰ溶媒和物（７.４５ｇ）を加える。該混合物を室温で１８時間攪拌する。結晶を濾過し、メタノール（１０ｍｌで２回）で洗浄し、減圧下で乾燥し、ペンタマイシン−ＮＭＰ溶媒和物（４.０ｇ；化学純度：９４.９％；ペンタマイシン含有量：８７％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：３.５％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：１.２％）を得る。
【００７１】
ステップ６.５：ペンタマイシン−ＮＭＰ溶媒和物の第４回目の再結晶化
メタノール（１２ｇ）およびＮＭＰ（１２ｇ）の混合物に、ＢＨＴ（５０ｍｇ）およびステップ６.４から得られたペンタマイシン−ＮＭＰ溶媒和物（３.６ｇ）を加える。該混合物を室温で３日間攪拌する。結晶を濾過し、メタノール（５ｍｌで２回）で洗浄し、減圧下で乾燥し、ペンタマイシン−ＮＭＰ溶媒和物（２.７８ｇ；化学純度：９５.８％；ペンタマイシン含有量：８６％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：３.３％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：０.５％）を得る。
【００７２】
ステップ６.６：ペンタマイシン−ＮＭＰ溶媒和物の第５回目の再結晶化
メタノール（８ｇ）およびＮＭＰ（８ｇ）の混合物に、ＢＨＴ（５０ｍｇ）およびステップ６.５から得られたペンタマイシン−ＮＭＰ溶媒和物（２.５ｇ）を加える。該混合物を室温で４時間攪拌する。結晶を濾過し、メタノール（４ｍｌで２回）で洗浄し、減圧下で乾燥し、ペンタマイシン−ＮＭＰ溶媒和物（３.１ｇ；化学純度：９５.８％；ペンタマイシン含有量：７１％（残留溶媒のため）；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：３.３％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：０.４％）を得る。
【００７３】
ステップ６.７：ペンタマイシン−ＮＭＰ溶媒和物の第６回目の再結晶化
メタノール（６ｇ）およびＮＭＰ（６ｇ）の混合物に、ＢＨＴ（５０ｍｇ）およびステップ６.６から得られたペンタマイシン−ＮＭＰ溶媒和物（２.３ｇ）を加える。該混合物を室温で１８時間攪拌する。結晶を濾過し、メタノール（３ｍｌで２回）で洗浄し、減圧下で乾燥し、ペンタマイシン−ＮＭＰ溶媒和物（１.６ｇ；化学純度：９６.０％；ペンタマイシン含有量：８８％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：３.３％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：０.３％）を得る。
【００７４】
ステップ６.５〜６.７から明らかなように、相対保持時間０.８３で存在する不純物の量は３.３％のままであり、さらに減少させることはできなかった。
【００７５】
実施例７：ペンタマイシン−モルホリン溶媒和物からのペンタマイシンの多形Ａの製造
フレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物（１.５ｇ；モルホリンの含有量：８％；化学純度：９７.２％）に、エタノール（１３ｇ）およびＢＨＴ（５ｍｇ）を加え、該混合物を室温で２時間攪拌する。結晶を濾過し、エタノール（２ｍｌで３回）で洗浄する。結晶に再びエタノール（１３ｇ）およびＢＨＴ（５ｍｇ）を加え、該混合物を室温で２時間攪拌する。結晶を濾過し、エタノール（２ｍｌで３回）で洗浄し、減圧下で乾燥し、ペンタマイシン（１.１ｇ；モルホリンの含有量：＜０.１％；化学純度：９７.３％）を得る。
【００７６】
得られた生成物を８０℃で窒素下、ＤＭＳＯに溶解し、メタノールまたはエタノールをゆっくりと加えることによって結晶化し、０℃まで冷却し、得られた結晶を濾過し、それをメタノールまたはエタノールで洗浄すると、ペンタマイシンの多形Ａが得られる。結晶の写真は図６に示している。
【００７７】
ペンタマイシンの多形ＡのＤＳＣは、図７に示している（開始温度２５３.７；ピーク温度２５４.４℃）。
ペンタマイシンの多形Ａの粉末Ｘ線回折スペクトルは、図５に示している。
最も強い線の２θ角［度］±約０.２°、および相対強度［％］は、下記の通りである：
【表５】
。
【００７８】
実施例８：粗ペンタマイシンのメタノールからの反復結晶化
それぞれ図１１および図１２に示しているＸ線、ＤＳＣ、およびＨＰＬＣを示す粗ペンタマイシンを、「J. Antibiotics, ser. A, vol. XI, no.1, Jan. 1958, pp. 26-29」に記載しているようにメタノールから３回結晶化する。
【００７９】
１０ｇの粗ペンタマイシンを、６００ｍｌの沸騰メタノール中で約１５分間攪拌する。熱メタノール溶液を濾過し、濾液を再び加熱し、沈殿が生じるまでメタノールの容量を減少させる。室温まで冷却し、３０分間保存した後、固体物質を濾過によって単離し、３０ｍｌの冷（４℃）メタノールで洗浄する。４０℃の水浴温度で１６ｍｂａｒに達した後、濾過ケーキを真空蒸発によって３０分間乾燥する。回収率は調査していない。
【００８０】
第１回目のメタノール結晶化から得られた３分の２の部分（Two of three parts）を４００ｍｌの沸騰メタノールに再溶解する。透明な溶液を攪拌しながらさらに加熱し、メタノールの容量を１５０ｍｌまで減少させる。室温まで冷却し、３０分間保存した後、固体物質を濾過によって単離し、３０ｍｌの冷メタノール（４℃）で洗浄する。４０℃の水浴温度で１６ｍｂａｒに達した後、濾過ケーキを真空蒸発によって３０分間乾燥する。回収率は調査していない。
【００８１】
第２回目のメタノール結晶化から得られた３分の２の部分（Two of three parts）を３００ｍｌの沸騰メタノールに再溶解する。透明な溶液をさらに加熱し、メタノールの容量をおよそ７５ｍｌまで減少させる。室温まで冷却し、３０分間保存した後、固体物質を濾過によって単離し、３０ｍｌの冷メタノール（４℃）で洗浄する。４０℃の水浴温度で１６ｍｂａｒに達した後、濾過ケーキを真空蒸発によって３０分間乾燥する。回収率は調査していない。
【００８２】
図１４に示しているＨＰＬＣクロマトグラムから明らかなように、得られた生成物は化学純度が約９０％にすぎないペンタマイシンである。図１４（３回結晶化後のＨＰＬＣ）を図１２（結晶化前のＨＰＬＣ）と比較すると、一部の微量な不純物が除去されているが、２つの主要な不純物がなおも存在していることが分かる。得られた生成物の粉末Ｘ線回折スペクトルおよびＤＳＣ（ピーク温度２４３.５５℃）は、図１３に示している。ＤＳＣのピーク温度２４３.５５℃は、「J. Antibiotics, ser. A, vol. XI, no.1, Jan. 1958, pp. 26-29」に報告されている融点（分解）２３６〜２３７℃に匹敵し、本発明のペンタマイシンの多形Ａについて図７に示しているピーク温度２５４.４２℃よりも明らかに低い。
【００８３】
実施例９：ペンタマイシンの多形Ａの安定性
空気および熱にさらした場合の純度９５％を超える多形Ａの安定性を、非晶質ペンタマイシン（純度９５％を超えるペンタマイシンを含む）の安定性と以下で比較する：
【００８４】
非晶質ペンタマイシンは、アセトニトリルを加えることによって、純度９５％を超えるペンタマイシンのジメチルスルホキシド溶液から沈殿を得、次いで濾過し、沈殿を乾燥することによって製造する。
【００８５】
純度９５％を超えるペンタマイシンの多形Ａは、酢酸エチルを加えることによって、純度９５％を超えるペンタマイシンのジメチルスルホキシド溶液から結晶を得、次いで濾過し、沈殿を乾燥することによって製造する。
【００８６】
上記のようにして得られた非晶質ペンタマイシンのサンプルと、上記のようにして得られた多形Ａのサンプルを、開放容器中、約６日間６０℃でインキュベートし、さらに２週間４０℃でインキュベートする。分解の過程をＨＰＬＣによってモニターし、１００％に設定したゼロ時間（ｔ０）での初期状態と比較した純度の減少を測定する。インキュベーション後、非晶質ペンタマイシンの分解量は１１％である一方、多形Ａの分解量はわずか１％である。
【００８７】
実施例１０：英国特許第８８４，７１１号の実施例１の再現
英国特許第８８４，７１１号の８ページの実施例１に記載されている工程と類似の工程により、３.５ｋｇの発酵ブロスカッティングを１６リットルのブタノールで抽出し、抽出液を５５℃で６００ｍｌまで減圧濃縮し、次いで、６００ｍｌの蒸留水を加える。ペースト状になるまで濃縮した後、１リットルのジエチルエーテルで洗浄し、濾過する。得られた４０ｇの固体を、ソックスレーにて６時間、メタノールでさらに抽出処理し、４℃で結晶化し、濾過する。ＨＰＬＣによると、得られた結晶は純度６７.３％のペンタマイシンを含んでいる。これは、該英国特許の８ページ、３３行および３５行に報告されている純度およそ７５％に匹敵する。１.９ｇの結晶をソックスレーにて１００ｍｌのクロロホルムで２時間洗浄し、次いで、ソックスレーにて２時間、ジエチルエーテルで抽出する。得られた固体をソックスレーにてメタノールで４時間再抽出する。４℃で４０時間冷却し、真空下で乾燥することによって得られた結晶は、ＨＰＬＣによると純度７０.１％のペンタマイシンを含む。これは、「純粋」とされるラゴシン（ペンタマイシン）が得られるという英国特許第８８４，７１１号の８ページ、４１行に匹敵するものである。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、高純度ペンタマイシン、ペンタマイシンの特定の多形および溶媒和物、それらの精製法、ならびに純度９５％を超えるペンタマイシンの分解の速度を減少させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ペンタマイシンは、アンホテリシンＢおよびニスタチンＡ１と同様に、抗真菌活性を有するポリエンマクロライド抗生物質のクラスに属する。ペンタマイシンは天然源から入手でき、例えばＳ．ウメザワ（S. Umezawa）およびＹ．タナカ（Y. Tanaka）が「J. Antibiotics, Ser. A, vol. XI, no. 1, pages 26 to 29 (1958)」に記載したアクチノマイセス属のストレプトマイセス・ペンチクス（penticus）の菌糸体、またはグラクソ（Ｇｌａｘｏ）に与えられた英国特許第８８４７１１号に記載されているストレプトマイセス・ロゼオルテウス（roseoluteus）（ＮＲＲＬ２７７６、ＮＣＩＢ８９８４）などの特定のストレプトマイセス菌株から単離されうる。該特許は抗生物質ラゴシンの製造に向けられているが、これは下記のパンデイ（Pandey）らの論文「J. Antibiotics vol. XXXV no. 8, pages 988-996 (1982)」にてフンギクロミンおよびコゴマイシンと同一であると示されている。ラゴシンは、該英国特許の２ページ、右欄、４８〜４９行に、固体および溶液の両方で光に感受性があると述べられている。
【０００３】
ペンタマイシン（＝フンギクロミン）の絶対配置は、分解産物と部分合成のスペクトル比較によって決定された（T. Oishi, Pure & Appl. Chem., vol. 61, no. 3, pp. 427-430 (1989)」）。Ｙ．イガラシ（Y. Igarashi）らが「J. Antibiot. vol. 58, no. 8, pp. 523-525 (2005)」に発表したＸ線分析によると、ペンタマイシンは下記の式を有する。
【化１】
【０００４】
例えば、デイビッド・Ｒ．ウォーゼン（David R. Worthen）らの論文「Drug Development and Industrial Pharmacy、vol. 27(4), 277-286 (2001)」の４７８ページの左欄に述べられているように、「ポリエン抗真菌の製造および精製は、それらの特有の化学的不安定性によって困難なものとなっている。ポリエンは典型的には、加水分解性エステル、アセタール、およびヘミアセタール、ならびに酸化されやすい共役ポリエン系を含む、１個または数個の潜在的に不安定な構造的官能性を有する（１９）。それゆえ、全てのポリエン抗真菌は、ある程度は、大量培養におけるそれらの製造および回収の間に通常直面する条件によって不活性化または明白な分解にさらされる。これらの潜在的に分解性の条件の中で最も注目すべきものは、湿度、温度上昇、空気中の酸素、多価金属、および光照射を含む（１９、２０）」。該論文で述べられている参考文献１９および２０は、（１９）「I. M. Teresin, Polyene Antibiotics-Present and Future; University of Tokyo Press: Tokyo, 1976; 122-123」、および（２０）「K.Thoma and N. Kubler， Photostability of antifungal agents. 2. Photostability of polyene antibiotics. Pharmazie vol. 52, 294-302 (1997)」である。
【０００５】
上記のウォーゼン（Worthen）の論文は、４７８ページの左欄で、「ポリエン精製をさらに複雑にしているのは、ストレプトマイセスからの実質的に全ての粗ポリエン単離物は、数種類の異なった物理化学的に類似しているアイソフォームを含み、その中の１つだけが臨床用途に望ましいであろうという事実である」と続けている。
【０００６】
上記を考慮すると、最初は異なる物質であると考えられていたため、ペンタマイシンは３つの他の名称、すなわちラゴシン、フンギクロミン、およびコゴマイシンをも与えられていたことは驚くべきことではない。Ｒ．Ｃ．パンデイ（R. C. Pandey）らが、「J. Antibiotics vol. XXXV no. 8, pages 988-996 (1982)」のアブストラクトで述べているように、「１つ以上の中心でいくつかの立体化学的相違を有すると以前は記載されていた３つのポリエンマクロライド抗生物質、フンギクロミン、ラゴシン、およびコゴマイシンは、立体化学的側面を含む全ての点で同一であると示されている。それらの性質で以前に観察された相違は、現在は高速液体クロマトグラフィーによって分離可能な不純物の量の相違によるものであるとされている。３つの抗生物質は全て、１つの主成分と数種の微量成分を含む」（強調は筆者による）。パンデイ（Pandey）の該論文の９８８ページの表Ｉに、フンギクロミン、ラゴシン、およびコゴマイシンの融点が文献値として１９０〜２４０℃の範囲であると示されている。
【０００７】
メルクインデックス（１２版）の７２７ページの登録番号４３１２は、フンギクロミンの融点が１５７〜１６２℃（分解）であると記載している。
【０００８】
パンデイ（Pandey）の論文の主題は、該３つのマクロライド抗生物質の物理化学的および生物学的比較であり、純度９５％を超えるペンタマイシンの提供ではない。その９９５ページの「ディスカッション」の初めに述べられているように、ＣＣＤ（向流分配）精製を繰り返した後でさえ、全ての微量成分を除去することは可能ではなかった。そのように精製されたフンギクロミン、ラゴシン、およびコゴマイシンの融点は、９９０ページの表２に、１５７〜１６５℃の範囲であると示されている。該「ディスカッション」の第二段落に、ＨＰＬＣについて、不純物からのフンギクロミン、ラゴシン、およびコゴマイシンの最適な分離は、メタノール−水（６０：４０）を移動相として用いることによって達成されたと記載されている。水に対するメタノールの比率を下げると、ピークは非常に広くなり、保持時間が増加した；該比率の増加は保持時間を減少させ、分離を困難にした。パンデイ（Pandey）の論文の表２の右欄から明らかなように、フンギクロミン、ラゴシン、およびコゴマイシンの保持時間は下記と同一の条件下のＨＰＬＣで６.００分である：９９２ページ、第３および４行、９９０ページ、表２の脚注４、ならびに９８９ページの終わりから３段落目、すなわち、Ｃ１８μＢｏｎｄａｐａｋ逆相カラム（３.９ｍｍ ＩＤ×３０ｃｍ）、ＵＶ（３５７ｎｍ）検出器、メタノール−水（６０：４０）溶媒系、および流速１.５ｍｌ／分を用いる。
【０００９】
本発明の出願人は、第三者が行う試験を注文し、粗ペンタマイシン、すなわち純度約９２％のペンタマイシンをパンデイ（Pandey）の論文に記載されている条件下で精製することを行わせた。ペンタマイシン含有溶出液画分を蒸発させ、以前に用いたのと同一のＨＰＬＣ条件下で再検査した後、純度約９０％のペンタマイシンのみが単離された。単離したペンタマイシンのＨＰＬＣクロマトグラムにより、粗ペンタマイシンには存在していなかった新たな不純物が９.５％存在することが明らかになった。この知見は、パンデイ（Pandey）の論文には、ペンタマイシンがＨＰＬＣ分離後に単離され、または結晶化されたとはどこにも述べられていないという事実を示している。パンデイ（Pandey）の論文に示されている唯一の融点（１５７〜２４０℃の範囲！）は、表１の文献に由来する融点および表２の向流分配に由来する融点である。結論として、パンデイ（Pandey）の論文に開示されているＨＰＬＣ条件は、単離後に純度９５％を超えるペンタマイシンを得るために用いることはできない。
【００１０】
注目すべきは、ペンタマイシンは１２個の不斉中心を含む比較的大きく、かつ、構造的に複雑な分子であり、２１２（＝４０９６）個の立体異性体があることである。さらに、ペンタマイシンは、シス−トランス−異性化を受けうる５個の二重結合を含む。ペンタマイシンの安定性が非常に繊細であることに留意すると、可能な４０９６個の立体異性体の正しいものを全て化学合成するには年月がかかるであろうし、それ自体で発明であろうし、かつ、経済的展望からは、上記のストレプトマイセス菌株による生合成と比較して非常に費用がかかるであろう。
【００１１】
ペンタマイシンの繊細な安定性は、例えばＲ．Ｗ．リッカーズ（R. W. Rickards）らの「J. Antibiotics vol. XXIII, no. 12, pages 603-611」から明らかであり、そこでは抗酸化剤によって阻害されうるラジカル付加工程によるメタノール溶液中のラゴシンの空気中の自動酸化を記載している。リッカーズ(Rickards)らによると、ラゴシンの主要な最初の自動酸化産物は特定のエポキシドであり、一方で、長期の自動酸化は高酸化産物をもたらし、最終的にポリマー性物質をもたらす。上記のウォーゼン（Worthen）の論文の記載に完全に従って、リッカーズ（Rickards）らは６０３ページで、マクロライド抗生物質のポリエンサブグループのメンバーは「総じて不安定であり、酸、アルカリ、熱、空気または光にさらすと分解および生物学的活性の喪失を伴う。特に、主にポリエン発色団と関連する空気および光に対するこの感受性は、臨床用途の前の保存において問題となる」と記載している。
【００１２】
上記の英国特許第８８４７１１号は、８ページ、４１行の実施例１で、「純粋なラゴシン」が得られたと述べている。該実施例１は、ブタノールで発酵ブロスカッティングを抽出すること、抽出液を濃縮すること、水を加えること、ジエチルエーテルで洗浄すること、濾過すること、ソックスレーを用いてメタノールで抽出すること、および濾過することのステップからなる発酵ブロスからのラゴシンの回収を記載し、該英国特許の８ページ、３３および３５行によると、純度「およそ７５％」のラゴシンが得られると記載している。不純物を除去するとされる作業をするために、純度７５％のラゴシンは、８ページの３４〜４２行に記載しているように、ソックスレーを用いてクロロホルムで抽出し、空気乾燥し、エチルエーテルで抽出し、空気乾燥し、メタノールで再抽出する。メタノールを一晩冷却すると、「純粋なラゴシン」とされるものが得られるが、融点は提供されていない。
【００１３】
該英国特許の上記文章を読んだ当業者にとって、上記の手順によって純度７５％のラゴシンが実際にさらに精製されうることは非常に疑わしいものであろう。これは、ジエチルエーテルおよびメタノールでの処理が以前に既になされたが、ラゴシンの純度が７５％以上に増加しなかったからである。それゆえ、該処理の反復によって実質的に純度が増加するのであろうか？さらに、リッカーズ（Rickards）らが記載したように、空気中でラゴシンを乾燥するステップは、酸化をもたらすと予想される（上記を参照のこと）。最後に、本出願の実施例８からも明らかなように、メタノールからの粗ペンタマイシンの結晶化では、（結晶化を３回繰り返した場合でさえ）純度９５％を超えるペンタマイシンを得ることはできない。本発明者が発見したように、これは、特定の不純物がペンタマイシンと共に結晶化し、それゆえ、結晶化によっては除去することができず、本発明に記載したような他の手段によってのみ除去することができるからである。ペンタマイシンは比較的大きな分子であるため、ほんの小さな相違、例えば５つの二重結合のうち１つのエポキシ化だけで不純物はペンタマイシンと区別しうることを留意すべきである。確かに、構造的に互いに非常に近い化合物の分離は非常に多くの問題をもたらす。英国特許第８８４，７１１号の実施例１の手順では「純粋な」ラゴシンを得ることができないことは上記より既に予想できることであるが、本発明の出願人は外部の研究所に、該実施例に記載された精製法をできる限り正確に再現するように依頼した。結果は本出願の実施例１０に記載している。予想されたように、中間体物質について「およそ７５％」の純度がおよそ確認することができた（実測値：６７.３％）一方、さらなる精製ステップでは「純粋な」ペンタマイシンを得られず、純度７０.１％のペンタマイシンのみが得られた。
【００１４】
ペンタマイシンは１９８０年代にスイスで商標名ペンタシン（Ｐｅｎｔａｃｉｎ（登録商標））にて登録された薬物の活性成分であったが、純度および安定性について、登録された製品仕様に適合することが困難であったため（販売された製剤が抗酸化剤を含んでいたにもかかわらず）、市場から撤退した。スイスの登録証の製品仕様によると、ペンタマイシンの純度は９５％であった。しかしながら、今日利用できる現代の分析手段を用いると、過去に登録されたペンタマイシンに存在した多数の不純物は検出されず、それゆえ、過去の実際のペンタマイシンの純度は９５％よりもかなり低かったことが今では分かっている。
【００１５】
ペンタマイシン自体は親油性部分と非常に親水性の部分を有しており、それゆえ、界面活性剤と似たような振る舞いをする。さらに、それは水に比較的不溶性であり、ゲルを形成する傾向にあり、ほとんどろ過することができない。
【００１６】
集中的な取り組みにもかかわらず、本発明者は、長い間、ペンタマイシンの純度を９３％以上に増加させることができなかった。実際、本発明があるまでは、９３％の純度閾値は乗り越えられないように思えた。
【００１７】
本発明者が解決すべき課題は、ペンタマイシンの純度を９３％以上、特に９５％以上に増加させ、ペンタマイシンをスイスの医薬品市場に再導入し得、かつ他の国で薬物として登録することができるのに十分安定な形態にすることであった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
発明の記載
長く、最初は実りのなかった試みの末、今では驚くべきことに、本特許出願の発明者は、どのようにペンタマイシンが９３％を超える、特に９５％を超える純度にて製造され得、かつ、分解に対してうまく安定化されうるのかを発見した。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者は、特定の不純物が同一の結晶格子にてペンタマイシンと共に結晶化するらしく、それゆえ結晶化によるさらなる精製が不可能であることを発見した。実施例８に示すように、粗ペンタマイシンのメタノールからの３回連続した結晶化の後でさえ、得られた生成物は、なおも約１０％の不純物を含む。該不純物は、ペンタマイシンと構造的に非常に似た化合物、例えばペンタマイシンの様々なエポキシド、ヒドロキシ基がオキソ基に交換され、もしくはメトキシ基にメチル化されているペンタマイシン誘導体、二重結合が単結合に還元されているペンタマイシン誘導体、テトラヒドロピラノン環を含むペンタマイシン誘導体、および／または、潜在的に、ペンタマイシンの立体異性体を含み、それゆえ、単純な従来の手段によってそれら全てを除去することはできない。
【００２０】
現在では、ペンタマイシンは、好ましくはメタノールまたはエタノールなどのアルコール性溶媒中で、モルホリン（１：１のモル比）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ；１：１のモル比）、Ｎ−エチルピロリドン（ＮＥＰ）、またはテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）などの小さな極性のヘテロ環と特定の溶媒和物を形成し、それら溶媒和物の一部、例えばＮＭＰおよび特にモルホリンとの溶媒和物は有用な性質を有し、すなわち、それらは驚くべきことに、現在の経験に従うと、メチル第３級ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）またはトルエンなどの非極性の溶媒中ではなくメタノールまたはエタノール中で製造すると、閾値９３％以上にペンタマイシンを精製することに用いることができることが分かってきた。溶媒和物と共結晶の間の相違は、単に上記の小さな極性のヘテロ環が室温で液体であるか固体であるかに帰するだけであるため、本文章の文脈において、用語「溶媒和物」は、共結晶も含むと理解されるべきである。
【００２１】
それゆえ、本発明は、化学純度９３％を超える、好ましくは９５％を超える、より好ましくは９６％を超える、および最も好ましくは９７重量％を超えるペンタマイシンの精製法、ならびにペンタマイシンの特定の溶媒和物および多形、ならびにペンタマイシンを精製および／または安定化するためのそれらの使用に関する。
【００２２】
本発明者は、ペンタマイシンを、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、およびＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）に溶解した多数の結晶化実験を実施した。そのようにして得られた溶液に、結晶化が起こるまで抗溶媒を加えたが、ここで抗溶媒はペンタマイシンの溶解度が非常に低い溶媒、例えばメタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、酢酸エチル、またはアセトニトリルなどの溶媒を意味する。高容量の抗溶媒、例えばメタノールに溶解したペンタマイシンの結晶化も検査した。
【００２３】
該結晶化実験の過程の中で、ペンタマイシンがモルホリンおよびＮ−メチルピロリドンと溶媒和物を形成するが、ＤＭＳＯとは溶媒和物を形成せず、かつ、該溶媒和物は驚くべきことに、該溶媒和物の再結晶化の反復によって、ペンタマイシンと共結晶化する不純物を減少させるために用いられうることを発見した。
【００２４】
ペンタマイシンと共結晶化する不純物を除去する１つの方法は、ペンタマイシンとモルホリンの溶媒和物を連続的に製造および結晶化することであり、最初に針状の形態（図１参照）に結晶化し、次いで針状の多形性モルホリン溶媒和物をフレーク状の形態（図２参照）に結晶化するモルホリン溶媒和物に変換し、次いでモルホリンを除去することである。フレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物と比較すると、針状の溶媒和物はあまり精製に適切ではない。これまでに得られた（限定的ではあるが）実験的経験によると、それは再結晶化によって十分に閾値９３％を上回るように精製することはできない。それゆえ、針状の溶媒和物はできる限り早く、例えばフレーク状の溶媒和物の種結晶を加えることによってフレーク状の溶媒和物に変換される。針状およびフレーク状のモルホリン溶媒和物の連続的な製造は、１つのポット内にて行われうる。モルホリン溶媒和物の製造は、好ましくは窒素などの保護ガス下で、光から保護し、かつ、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、または好ましくはブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、すなわち２，６−ジ第３級ブチル−４−メチルフェノールなどの抗酸化剤の存在下で行われる。結晶化は好ましくは、適切な極性溶媒、例えば適切なアルコール、例えば適切なアルカノール、例えばエタノール、または最も好ましくはメタノール中で行われる。より長鎖のアルコールおよび非極性の溶媒、例えばトルエン、ＭＴＢＥなどでは、ほとんど精製効果が達成されなかった。モルホリン中ではペンタマイシンの溶解度が高過ぎるため、モルホリンも単一の溶媒としては有効ではない。フレーク状のモルホリン溶媒和物の形成による精製は、所望の純度が得られるまで必要に応じて何度でも繰り返される。
【００２５】
溶媒系の中でペンタマイシンに対するモルホリンの量を増加させると、針状多形のフレーク状多形への変換を促進する。上記のように、該変換はフレーク状多形の種結晶を加えることによっても促進することができる。
【００２６】
本発明は、粗ペンタマイシン、適切なアルコール、特に低級アルカノール、例えばエタノールまたは好ましくはメタノール、モルホリン、およびＢＨＴなどの適切な抗酸化剤の混合物を、好ましくは温度約５〜５０℃で、好ましくは室温で、有利には窒素などの保護ガス下、フレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物が結晶化するまで攪拌し、例えば濾過によってそれを単離し、メタノールなどの低級アルカノールで洗浄し、必要であれば、得られたフレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物を粗ペンタマイシンの代わりに用いて上記手順を１回以上繰り返すことによって、得られたフレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物をさらに精製することによって、フレーク状のモルホリン溶媒和物（ペンタマイシンとモルホリンの１：１のモル比）を形成することによる、粗ペンタマイシンを精製する方法に関する。
【００２７】
本発明は、粗ペンタマイシン、適切なアルコール、特に低級アルカノール、例えばエタノールまたは好ましくはメタノール、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、およびＢＨＴなどの適切な抗酸化剤の混合物を、好ましくは温度約５〜５０℃で、好ましくは室温で、有利には窒素などの保護ガス下、ＮＭＰ溶媒和物が結晶化するまで攪拌し、例えば濾過によってそれを単離し、メタノールなどの低級アルカノールで洗浄し、必要であれば、上記手順を繰り返すことによって得られたＮＭＰ溶媒和物をさらに精製することによって、ＮＭＰ溶媒和物を形成することによる、粗ペンタマイシンを精製する方法にも関する。
【００２８】
ＮＭＰ溶媒和物を用いる上記方法によって、ペンタマイシンと共結晶化する２つの不純物のうち１つ、すなわち相対保持時間（ｒｒｔ）１.５４（本明細書で記載するＨＰＬＣ系にて）の不純物（ｉｍｐ）が除去されうる一方で、ｒｒｔ０.８３の別の不純物は３.３％のレベルしか減少させることができない。
【００２９】
モルホリンおよびＮＭＰは、溶媒和物を数時間、メタノールまたは好ましくはエタノール中、例えば温度０℃〜＋５０℃で、好ましくは室温で攪拌し、得られた結晶を濾過し、それらをメタノールまたは好ましくはエタノールで洗浄し、必要であれば、得られた生成物に含まれるモルホリンまたはＮＭＰが０.１％未満になるまで該精製法を繰り返すことによって、それぞれのペンタマイシン溶媒和物から除去される。
【００３０】
残存するモルホリンまたはＮＭＰは、ＤＭＳＯ／エタノールまたはＤＭＳＯ／メタノールからの結晶化によって除去することができ、それによってペンタマイシンの多形Ａが得られる。
【００３１】
ペンタマイシンは、非晶質形態（図８および図９参照）ならびに多形Ａ以外の他のいくつかの多形体（以下多形Ｂ〜Ｅと称する）にて存在することが分かった。他の多形と比較すると、多形Ａは粉末回折Ｘ線にて下記の２θ角（±約０.２°）：２.２８、７.３８および２０.１６の線によって区別され、多形Ｂは９.５４、２１.２８および２２.３２に線を生じ、多形Ｃは７.０４に特性線を有し、多形Ｄは２.５８に特性線を有し、多形Ｅは３.３２にあまり強くない特性線を有し、粗ペンタマイシン（図１１および図１２参照）は８.８４および１３.１４に特性線を示す。多形Ａについての上記の２θ角（±約０.２°）：２.２８、７.３８および２０.１６を実施例７の対応する値、すなわち２.２２、７.２９および２０.１７と比較すると、小さな相違が認められる。これは、それぞれの数値が異なる測定に由来するという事実によるものである。しかしながら、該相違は、±０.２°の２θ角について十分に国際的に許容される実験誤差の範囲内である。
【００３２】
多形Ａは、例えば酢酸エチルを加えた後にペンタマイシンのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液から結晶化する。
【００３３】
非晶質ペンタマイシンは、例えばアセトニトリルを加えた後にペンタマイシンのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液から得られる。
【００３４】
多形Ｂは、メタノール／クロロホルムから結晶化する。
【００３５】
多形Ｃ（図１０参照）は、ペンタマイシンのジメチルホルムアミド溶液に６０℃でメタノールを加え、メタノールを加え、０℃まで冷却することによって得られる。
【００３６】
多形Ｅは、ジメチルスルホキシド／アセトニトリルから結晶化する。
【００３７】
多形Ａは、熱力学的に最も安定な多形であるようである。その示差走査熱量測定（ＤＳＣ）図（図７に示している）は、１つの単一シグナルを示す。それとは対照的に、他の結晶性多形のＤＳＣ図は、２つ以上のシグナルを示し（例えば図１０の多形ＣのＤＳＣ参照）、それゆえ、徐々に温度を増加させると他の多形体に転移することを示している。純粋な多形Ａの最も驚くべきかつ全く予測できない性質は、空気にさらしたときのその安定性であり（実施例９参照）、これはこれまでに知られている純粋なペンタマイシンの全ての形態と全く対照的である。
【００３８】
本発明のペンタマイシンの高純度形態、特に化学純度９５％を超えるペンタマイシンの多形Ａは、例えば、カンジダ、特にカンジダ・アルビカンス、および膣トリコモナスに起因する膣および粘膜感染を治療するための膣坐剤などの局所使用のための医薬製剤の形態にて、好ましくは哺乳類を含む温血動物、特にヒトを治療する方法に用いることができる。
【００３９】
局所使用のための該医薬製剤、例えば膣坐剤は、例えば適切な医薬賦形剤と共に濃度０.１〜５重量％のペンタマイシンを含み、投与単位、すなわち坐剤あたり３ｍｇ〜１５０ｍｇのペンタマイシンを含む。膣坐剤は、例えば体重約６０ｋｇのヒト女性に、１日１〜２回提供される。
【００４０】
要約すると、本発明は、化学純度９５％を超える、好ましくは化学純度９７％を超えるペンタマイシン、特に多形Ａの形態にある、とりわけ化学純度９５％を超える、好ましくは９７％を超える多形Ａの形態にあるペンタマイシンであって、相対強度が単なる目安として提供されるＸ線粉末回折スペクトルにおいて、下記の最も強い線の２θ値±約０.２°によって特徴付けられるペンタマイシンに関する：
【表１】
。
【００４１】
本発明はさらに、溶媒和物の形態にあるペンタマイシン、特にペンタマイシンの精製に適切な溶媒和物の形態にあるペンタマイシン、例えばヘテロ環化合物、好ましくは、例えばＮ−メチル−ピロリドンまたは好ましくはモルホリンなどの低分子量ヘテロ環化合物との溶媒和物の形態にあるペンタマイシンであり、針状のモルホリン溶媒和物、または好ましくはフレーク状のモルホリン溶媒和物などの形態にあるペンタマイシンであって、特に化学純度９５％を超える、９６％を超える、または好ましくは９７％を超える溶媒和物、特に相対強度が単なる目安として提供される粉末Ｘ線回折スペクトルにおいて、下記の最も強い線の２θ値±約０.２°を有するフレーク状のモルホリン溶媒和物に関する：
【表２】
。
【００４２】
本発明はさらに、ペンタマイシンの化学的精製のための上記のペンタマイシン溶媒和物の使用に関する。
【００４３】
本発明はさらに、化学純度９３％以下のペンタマイシンを適切な溶媒和物、特に上記の溶媒和物の１つに変換し、該溶媒和物を結晶化によって精製し、例えばＣ１−５−アルカノール中の長時間の攪拌によってペンタマイシンを溶媒和物から遊離させることによるペンタマイシンの精製法であって、該精製法が、必要であれば、好ましくは２，６−ジ第３級ブチル−４−メチルフェノールなどの適切な抗酸化剤の存在下で行われる、ペンタマイシンの精製法に関する。
【００４４】
本発明はさらに、ペンタマイシンをその多形Ａの形態に変換することによって、化学純度９５％を超えるペンタマイシンの分解の速度を有意に減少させる方法に関し、特に多形Ａへの変換が、酢酸エチルを加えた後、純度９５％を超えるペンタマイシンのジメチルスルホキシド溶液から結晶化することによって達成される方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、針状のペンタマイシン−モルホリン（１：１）溶媒和物の写真を示す。
【図２】図２は、フレーク状のペンタマイシン−モルホリン（１：１）溶媒和物の写真を示す。
【図３】図３は、針状のペンタマイシン−モルホリン（１：１）溶媒和物の粉末回折図を示す。
【図４】図４は、フレーク状のペンタマイシン−モルホリン（１：１）溶媒和物の粉末Ｘ線回折スペクトルを示す。
【図５】図５は、ペンタマイシンの多形Ａの粉末Ｘ線回折図を示す。
【図６】図６は、ペンタマイシンの多形Ａの写真を示す。
【図７】図７は、ペンタマイシンの多形Ａの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）図を示す。
【図８】図８は、非晶質ペンタマイシンのＤＳＣを示す。
【図９】図９は、非晶質ペンタマイシンの粉末Ｘ線回折図を示す。
【図１０】図１０は、ペンタマイシンの多形ＣのＤＳＣ（上）およびＸ線（下）を示す。
【図１１】図１１は、粗ペンタマイシンの粉末Ｘ線回折図（上）およびＤＳＣを示す。
【図１２】図１２は、粗ペンタマイシンの高圧液体クロマトグラム（ＨＰＬＣ）を示す。
【図１３】図１３は、「J. Antibiotics, ser. A, vol. XI, no.1, Jan. 1958, pp. 26-29」に記載されているメタノールからの３回の結晶化後に記録されたペンタマイシンのＤＳＣ（上）および粉末Ｘ線回折図（下）を示す。
【図１４】図１４は、「J. Antibiotics, ser. A, vol. XI, no.1, Jan. 1958, pp. 26-29」に記載されているメタノールからの３回の結晶化後に記録されたペンタマイシンのＨＰＬＣを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
実験の詳細な記載
粉末Ｘ線スペクトルは、Ｒｉｇａｋｕ Ｍｉｎｉｆｌｅｘ回折計に記録する（ＣｕＫα照射、記録範囲２〜４０°［２θ］、ステップ幅０.０２°［２θ］、記録間隔０.００８３°［２θ］、プローブ容器：シリコン）。記録した２θ角の実験誤差は約±０.２°である。相対強度の実験誤差は大きい。それゆえ、相対強度は単なる目安であると理解されるべきである。
【００４７】
下記の実施例は本発明を説明する。略語「ｒｒｔ」は「相対保持時間」、すなわちＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）内の不純物の正味の保持時間と、ペンタマイシンの正味の保持時間の間の比を意味する。実施例にて用いられている用語「ｉｍｐ ｒｒｔ」は、ペンタマイシンに対する不純物の保持時間を意味し、すなわちペンタマイシンのｒｒｔは１.００である。１.００以下の相対保持時間は不純物がペンタマイシンよりも早く溶出されることを意味し、１.００より大きい相対保持時間は不純物がペンタマイシンよりも後に溶出されることを意味する。例えば、「ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：８.０％」は、相対保持時間０.８３で８％量の不純物があることを意味する。ＨＰＬＣの慣例により、検出された化合物のパーセンテージはそれぞれのシグナルの面積を反映する面積パーセントとして表され、すなわち上記の例では、８.０％は面積パーセントである。
【００４８】
本明細書で記載しているＨＰＬＣクロマトグラフィーは、Ａｇｉｌｅｎｔ（登録商標）１１００システムまたはこれに相当するものを用いて行っている。移動相は溶液ＡおよびＢを含み、溶液Ａは水−アセトニトリル−トリフルオロ酢酸の６５０：３５０：０.０１（ｖ：ｖ：ｖ）比の溶液であり、溶液Ｂはアセトニトリル−２−プロパノール−トリフルオロ酢酸の７５０：２５０：０.０１（ｖ：ｖ：ｖ）比の溶液である。
【００４９】
分析するサンプルはアセトニトリル−水−テトラヒドロフランの１：１：２（ｖ：ｖ：ｖ）比の溶液に溶解し、そこへアセトニトリル−水−テトラヒドロフランの１：１：２（ｖ：ｖ：ｖ）比の溶液に溶解した０.１％（ｗ：ｖ）のＢＨＴを加え、終濃度０.６ｍｇ／ｍｌで検査する。
【００５０】
ＨＰＬＣは、Ｗａｔｅｒｓ Ａｔｌａｎｔｉｓ（登録商標）ｄＣ１８ＲＰ２５０ｘ４.６ｍｍ、５μｍカラムで行う。Ａｔｌａｎｔｉｓ ｄＣ１８カラムは、シリカベースのラインの二機能的に結合した逆相Ｃ１８カラムである。下記のパラメーターを用いている：
グラジエント：
【表３】
流速：１.０ｍｌ／分
温度：４０℃
検出：３２０ｎｍ
注入量：５μｌ。
【実施例】
【００５１】
実施例１：針状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物
メタノール（１.７５ｇ）およびモルホリン（０.７５ｇ）の混合物に、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ；２，６−ジ第３級ブチル−４−メチルフェノール）（４ｍｇ）および粗ペンタマイシン（５００ｍｇ；化学純度：８０.６％）；ペンタマイシン含有量：８０％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：８.０％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：７.０％）を加える。粗ペンタマイシンのＨＰＬＣクロマトグラムは、不純物に起因する２つの主要なピークを示す。第１のピークは相対保持時間（ｒｒｔ）０.８３を有する。このピークは、同一の保持時間を有する（少なくとも）２つの異なる不純物からなる。これら２つの不純物の全量は、合わせて８％である。第２の主要な不純物はｒｒｔ１.５４を有し、出発物質中のこの不純物の量は７％である。
【００５２】
該混合物を室温で３日間攪拌する。結晶を濾過し、メタノール（１ｍｌで２回）で洗浄し、減圧下で乾燥し、針状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物（３６２ｍｇ；化学純度：８６.２％；ペンタマイシン含有量：７５％；モルホリン含有量：１０％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：５.３％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：６.５％）を得る。
【００５３】
上記から明らかなように、針状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物中では、ｒｒｔ０.８３およびｒｒｔ１.５４での両不純物の量は、出発物質として用いた粗ペンタマイシンと比較して減少している。
【００５４】
実施例２：フレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物（１：１のモル比）
メタノール（１.５ｇ）およびモルホリン（１ｇ）の混合物に、ＢＨＴ（４ｍｇ）および粗ペンタマイシン（５００ｍｇ；化学純度：８０.６％；ペンタマイシン含有量：８０％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：８.０％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：７.０％）を加える。該混合物を室温で３日間攪拌する。結晶を濾過し、メタノール（１ｍｌで２回）で洗浄し、減圧下で乾燥し、ペンタマイシンとモルホリンを１：１のモル比にて含むフレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物（３２７ｍｇ；化学純度：９０.９％；ペンタマイシン含有量：８２％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：４.３％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：３.０％）を得る。
【００５５】
注意：攪拌３０分後は、主として針状多形が顕微鏡下で観察される。３日間攪拌後、結晶形は「フレーク」状に変化する。
【００５６】
上記から明らかなように、フレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物中のｒｒｔ０.８３およびｒｒｔ１.５４での両不純物の量は、出発物質として用いた粗ペンタマイシンおよび実施例１に記載した針状多形の両方と比較してさらに減少している。
【００５７】
ペンタマイシン−モルホリン溶媒和物（１：１のモル比）の針状多形の粉末Ｘ線回折スペクトルは、図３に示している。
【００５８】
実施例３：種結晶を用いたフレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物の製造
メタノール（１１.５２ｇ）およびモルホリン（７.６８ｇ）の混合物に、ＢＨＴ（１０ｍｇ）および粗ペンタマイシン（４.０ｇ；化学純度：８０.６％；ペンタマイシン含有量：８０％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：８.０％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：７.０％）を加える。該混合物にフレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物の種結晶（１２ｍｇ；フレーク状多形）を播種し、室温で１０時間攪拌する。次いで、さらなる分量の粗ペンタマイシン（２.４ｇ）を加え、該混合物を一晩攪拌する。結晶を濾過し、メタノール（３ｍｌで３回）で洗浄し、減圧下で乾燥し、ペンタマイシン（５.４６g；化学純度：８９，２％；ペンタマイシン含有量：８２％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：４.９％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：４.０％；含有量補正収率：７８％；理論収率：８７％）を得る。
【００５９】
実施例４：フレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物の精製
メタノール（２０.６ｇ）およびモルホリン（１３.７ｇ）の混合物に、ＢＨＴ（４ｍｇ）およびフレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物（４.７５ｇ；化学純度：８９.２％；ペンタマイシン含有量：８１％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：４.９％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：４.０％）を加える。該混合物を室温で１６時間攪拌する。結晶を濾過し、メタノール（２ｍｌで２回）で洗浄し、減圧下で乾燥し、精製されたフレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物（３.４５ｇ）を得る。この物質の一部（３.３９ｇ）を、メタノール（１０.８ｇ）、モルホリン（７.２ｇ）およびＢＨＴ（４ｍｇ）の混合物に加える。該混合物を室温で１６時間攪拌する。結晶を濾過し、メタノール（１ｍｌで２回）で洗浄し、減圧下で乾燥し、さらに精製されたフレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物（２.２７ｇ；化学純度：９３.７％；ペンタマイシン含有量：８３％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：３.２％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：２.０％）を得る。
【００６０】
実施例５：フレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物の連続的な再結晶化
メタノール（１.５ｇ）およびモルホリン（１.０ｇ）の混合物に、ＢＨＴ（５ｍｇ）およびフレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物（３８５ｍｇ；化学純度：８７.７％；ペンタマイシン含有量：８０％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：５.４％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：４.７％）を加える。該混合物を室温で１８時間攪拌する。結晶を濾過し、メタノール（０.５ｍｌで３回）で洗浄し、減圧下で乾燥し、フレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物（２３０ｍｇ；化学純度：９４.５％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：３.０％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：１.５％）を得る。
【００６１】
メタノール（０.８４ｇ）およびモルホリン（０.５６ｇ）の混合物に、ＢＨＴ（３ｍｇ）およびフレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物（２２０ｍｇ；化学純度：９４.５％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：３.０％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：１.５％）を加える。該混合物を室温で１８時間攪拌する。結晶を濾過し、メタノール（０.５ｍｌで３回）で洗浄し、減圧下で乾燥し、フレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物（１４４ｍｇ；化学純度：９６.２％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：２.３％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：０.８２％）を得る。
【００６２】
メタノール（０.６ｇ）およびモルホリン（０.４ｇ）の混合物に、ＢＨＴ（２ｍｇ）およびフレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物（２４４ｍｇ；化学純度：９６％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：２.３％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：１.０％）を加える。該混合物を室温で１８時間攪拌する。結晶を濾過し、メタノール（０.５ｍｌで３回）で洗浄し、減圧下で乾燥し、フレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物ペンタマイシン（１６２ｍｇ；化学純度：９６.６％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：１.９％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：０.７％）を得る。
【００６３】
メタノール（０.４２ｇ）およびモルホリン（０.２８ｇ）の混合物に、ＢＨＴ（２ｍｇ）およびフレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物（１４０ｍｇ；化学純度：９６.６％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：１.９％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：０.７％）を加える。該混合物を室温で１８時間攪拌する。結晶を濾過し、メタノール（０.５ｍｌで３回）で洗浄し、減圧下で乾燥し、フレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物（８９ｍｇ；化学純度：９７.３％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：１.６％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：０.５％）を得る。
【００６４】
得られたペンタマイシン−モルホリン溶媒和物（１：１のモル比）のフレーク状多形の粉末Ｘ線回折スペクトルは、図４に示している。最も強い線の２θ角［度］±約０.１°、および相対強度［％］は下記の通りである：
【表４】
。
【００６５】
上記から明らかなように、ｒｒｔ０.８３およびｒｒｔ１.５４での両不純物の量は、出発物質として用いた粗ペンタマイシン、実施例１に記載した針状多形、および実施例２に記載したフレーク状の粗ペンタマイシン−モルホリン溶媒和物と比較して、精製されたフレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物中においてさらに減少している。
【００６６】
実施例６：ペンタマイシン−Ｎ−メチルピロリドン溶媒和物（１：１のモル比）
ステップ６.１〜６.８は、上記の溶媒和物の製造および反復結晶化によるその精製を示す。そこから明らかなように、ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４は効率的に除去されるが、もう一方の主要なｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３は３.３％のレベルしか減少しない。
【００６７】
ステップ６.１：ペンタマイシン−ＮＭＰ溶媒和物の製造
メタノール（６５ｇ）およびＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ；６５ｇ）の混合物に、ＢＨＴ（１００ｍｇ）および粗ペンタマイシン（２０ｇ；化学純度：８０.６％；ペンタマイシン含有量：８０％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：８.０％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：７.０％）を加える。該混合物を室温で５時間攪拌した。結晶を濾過し、メタノール（１０ｍｌで２回）で洗浄し、減圧下で乾燥し、ペンタマイシン−ＮＭＰ溶媒和物（１７.３ｇ；化学純度：８６.９％；ペンタマイシン含有量：７１％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：５.８％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：５.０％）を得る。
【００６８】
ステップ６.２：ペンタマイシン−ＮＭＰ溶媒和物の第１回目の再結晶化
メタノール（５０ｇ）およびＮＭＰ（５０ｇ）の混合物に、ＢＨＴ（１００ｍｇ）およびステップ６.１から得られたペンタマイシン−ＮＭＰ溶媒和物（１７.３ｇ；化学純度：８６.９％；ペンタマイシン含有量：７１％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：５.８％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：５.０％）を加える。該混合物を室温で１８時間攪拌する。結晶を濾過し、メタノール（１０ｍｌで２回）で洗浄し、減圧下で乾燥し、ペンタマイシン−ＮＭＰ溶媒和物（９.７ｇ；化学純度：９１.５％；ペンタマイシン含有量：８１％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：４.３％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：２.９％）を得る。
【００６９】
ステップ６.３：ペンタマイシン−ＮＭＰ溶媒和物の第２回目の再結晶化
メタノール（３０ｇ）およびＮＭＰ（３０ｇ）の混合物に、ＢＨＴ（１００ｍｇ）およびステップ６.２から得られたペンタマイシン−ＮＭＰ溶媒和物（９.６５ｇ）を加える。該混合物を室温で５時間攪拌する。結晶を濾過し、メタノール（１０ｍｌで２回）で洗浄し、減圧下で乾燥し、ペンタマイシン−ＮＭＰ溶媒和物（７.５ｇ；化学純度：９３.５％；ペンタマイシン含有量：８３％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：３.８％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：１.９％）を得る。
【００７０】
ステップ６.４：ペンタマイシン−ＮＭＰ溶媒和物の第３回目の再結晶化
メタノール（２２ｇ）およびＮＭＰ（２２ｇ）の混合物に、ＢＨＴ（１００ｍｇ）およびステップ６.３から得られたペンタマイシン−ＮＭＰ溶媒和物（７.４５ｇ）を加える。該混合物を室温で１８時間攪拌する。結晶を濾過し、メタノール（１０ｍｌで２回）で洗浄し、減圧下で乾燥し、ペンタマイシン−ＮＭＰ溶媒和物（４.０ｇ；化学純度：９４.９％；ペンタマイシン含有量：８７％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：３.５％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：１.２％）を得る。
【００７１】
ステップ６.５：ペンタマイシン−ＮＭＰ溶媒和物の第４回目の再結晶化
メタノール（１２ｇ）およびＮＭＰ（１２ｇ）の混合物に、ＢＨＴ（５０ｍｇ）およびステップ６.４から得られたペンタマイシン−ＮＭＰ溶媒和物（３.６ｇ）を加える。該混合物を室温で３日間攪拌する。結晶を濾過し、メタノール（５ｍｌで２回）で洗浄し、減圧下で乾燥し、ペンタマイシン−ＮＭＰ溶媒和物（２.７８ｇ；化学純度：９５.８％；ペンタマイシン含有量：８６％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：３.３％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：０.５％）を得る。
【００７２】
ステップ６.６：ペンタマイシン−ＮＭＰ溶媒和物の第５回目の再結晶化
メタノール（８ｇ）およびＮＭＰ（８ｇ）の混合物に、ＢＨＴ（５０ｍｇ）およびステップ６.５から得られたペンタマイシン−ＮＭＰ溶媒和物（２.５ｇ）を加える。該混合物を室温で４時間攪拌する。結晶を濾過し、メタノール（４ｍｌで２回）で洗浄し、減圧下で乾燥し、ペンタマイシン−ＮＭＰ溶媒和物（３.１ｇ；化学純度：９５.８％；ペンタマイシン含有量：７１％（残留溶媒のため）；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：３.３％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：０.４％）を得る。
【００７３】
ステップ６.７：ペンタマイシン−ＮＭＰ溶媒和物の第６回目の再結晶化
メタノール（６ｇ）およびＮＭＰ（６ｇ）の混合物に、ＢＨＴ（５０ｍｇ）およびステップ６.６から得られたペンタマイシン−ＮＭＰ溶媒和物（２.３ｇ）を加える。該混合物を室温で１８時間攪拌する。結晶を濾過し、メタノール（３ｍｌで２回）で洗浄し、減圧下で乾燥し、ペンタマイシン−ＮＭＰ溶媒和物（１.６ｇ；化学純度：９６.０％；ペンタマイシン含有量：８８％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝０.８３：３.３％；ｉｍｐ ｒｒｔ＝１.５４：０.３％）を得る。
【００７４】
ステップ６.５〜６.７から明らかなように、相対保持時間０.８３で存在する不純物の量は３.３％のままであり、さらに減少させることはできなかった。
【００７５】
実施例７：ペンタマイシン−モルホリン溶媒和物からのペンタマイシンの多形Ａの製造
フレーク状のペンタマイシン−モルホリン溶媒和物（１.５ｇ；モルホリンの含有量：８％；化学純度：９７.２％）に、エタノール（１３ｇ）およびＢＨＴ（５ｍｇ）を加え、該混合物を室温で２時間攪拌する。結晶を濾過し、エタノール（２ｍｌで３回）で洗浄する。結晶に再びエタノール（１３ｇ）およびＢＨＴ（５ｍｇ）を加え、該混合物を室温で２時間攪拌する。結晶を濾過し、エタノール（２ｍｌで３回）で洗浄し、減圧下で乾燥し、ペンタマイシン（１.１ｇ；モルホリンの含有量：＜０.１％；化学純度：９７.３％）を得る。
【００７６】
得られた生成物を８０℃で窒素下、ＤＭＳＯに溶解し、メタノールまたはエタノールをゆっくりと加えることによって結晶化し、０℃まで冷却し、得られた結晶を濾過し、それをメタノールまたはエタノールで洗浄すると、ペンタマイシンの多形Ａが得られる。結晶の写真は図６に示している。
【００７７】
ペンタマイシンの多形ＡのＤＳＣは、図７に示している（開始温度２５３.７；ピーク温度２５４.４℃）。
ペンタマイシンの多形Ａの粉末Ｘ線回折スペクトルは、図５に示している。
最も強い線の２θ角［度］±約０.２°、および相対強度［％］は、下記の通りである：
【表５】
。
【００７８】
実施例８：粗ペンタマイシンのメタノールからの反復結晶化
それぞれ図１１および図１２に示しているＸ線、ＤＳＣ、およびＨＰＬＣを示す粗ペンタマイシンを、「J. Antibiotics, ser. A, vol. XI, no.1, Jan. 1958, pp. 26-29」に記載しているようにメタノールから３回結晶化する。
【００７９】
１０ｇの粗ペンタマイシンを、６００ｍｌの沸騰メタノール中で約１５分間攪拌する。熱メタノール溶液を濾過し、濾液を再び加熱し、沈殿が生じるまでメタノールの容量を減少させる。室温まで冷却し、３０分間保存した後、固体物質を濾過によって単離し、３０ｍｌの冷（４℃）メタノールで洗浄する。４０℃の水浴温度で１６ｍｂａｒに達した後、濾過ケーキを真空蒸発によって３０分間乾燥する。回収率は調査していない。
【００８０】
第１回目のメタノール結晶化から得られた３分の２の部分（Two of three parts）を４００ｍｌの沸騰メタノールに再溶解する。透明な溶液を攪拌しながらさらに加熱し、メタノールの容量を１５０ｍｌまで減少させる。室温まで冷却し、３０分間保存した後、固体物質を濾過によって単離し、３０ｍｌの冷メタノール（４℃）で洗浄する。４０℃の水浴温度で１６ｍｂａｒに達した後、濾過ケーキを真空蒸発によって３０分間乾燥する。回収率は調査していない。
【００８１】
第２回目のメタノール結晶化から得られた３分の２の部分（Two of three parts）を３００ｍｌの沸騰メタノールに再溶解する。透明な溶液をさらに加熱し、メタノールの容量をおよそ７５ｍｌまで減少させる。室温まで冷却し、３０分間保存した後、固体物質を濾過によって単離し、３０ｍｌの冷メタノール（４℃）で洗浄する。４０℃の水浴温度で１６ｍｂａｒに達した後、濾過ケーキを真空蒸発によって３０分間乾燥する。回収率は調査していない。
【００８２】
図１４に示しているＨＰＬＣクロマトグラムから明らかなように、得られた生成物は化学純度が約９０％にすぎないペンタマイシンである。図１４（３回結晶化後のＨＰＬＣ）を図１２（結晶化前のＨＰＬＣ）と比較すると、一部の微量な不純物が除去されているが、２つの主要な不純物がなおも存在していることが分かる。得られた生成物の粉末Ｘ線回折スペクトルおよびＤＳＣ（ピーク温度２４３.５５℃）は、図１３に示している。ＤＳＣのピーク温度２４３.５５℃は、「J. Antibiotics, ser. A, vol. XI, no.1, Jan. 1958, pp. 26-29」に報告されている融点（分解）２３６〜２３７℃に匹敵し、本発明のペンタマイシンの多形Ａについて図７に示しているピーク温度２５４.４２℃よりも明らかに低い。
【００８３】
実施例９：ペンタマイシンの多形Ａの安定性
空気および熱にさらした場合の純度９５％を超える多形Ａの安定性を、非晶質ペンタマイシン（純度９５％を超えるペンタマイシンを含む）の安定性と以下で比較する：
【００８４】
非晶質ペンタマイシンは、アセトニトリルを加えることによって、純度９５％を超えるペンタマイシンのジメチルスルホキシド溶液から沈殿を得、次いで濾過し、沈殿を乾燥することによって製造する。
【００８５】
純度９５％を超えるペンタマイシンの多形Ａは、酢酸エチルを加えることによって、純度９５％を超えるペンタマイシンのジメチルスルホキシド溶液から結晶を得、次いで濾過し、沈殿を乾燥することによって製造する。
【００８６】
上記のようにして得られた非晶質ペンタマイシンのサンプルと、上記のようにして得られた多形Ａのサンプルを、開放容器中、約６日間６０℃でインキュベートし、さらに２週間４０℃でインキュベートする。分解の過程をＨＰＬＣによってモニターし、１００％に設定したゼロ時間（ｔ０）での初期状態と比較した純度の減少を測定する。インキュベーション後、非晶質ペンタマイシンの分解量は１１％である一方、多形Ａの分解量はわずか１％である。
【００８７】
実施例１０：英国特許第８８４，７１１号の実施例１の再現
英国特許第８８４，７１１号の８ページの実施例１に記載されている工程と類似の工程により、３.５ｋｇの発酵ブロスカッティングを１６リットルのブタノールで抽出し、抽出液を５５℃で６００ｍｌまで減圧濃縮し、次いで、６００ｍｌの蒸留水を加える。ペースト状になるまで濃縮した後、１リットルのジエチルエーテルで洗浄し、濾過する。得られた４０ｇの固体を、ソックスレーにて６時間、メタノールでさらに抽出処理し、４℃で結晶化し、濾過する。ＨＰＬＣによると、得られた結晶は純度６７.３％のペンタマイシンを含んでいる。これは、該英国特許の８ページ、３３行および３５行に報告されている純度およそ７５％に匹敵する。１.９ｇの結晶をソックスレーにて１００ｍｌのクロロホルムで２時間洗浄し、次いで、ソックスレーにて２時間、ジエチルエーテルで抽出する。得られた固体をソックスレーにてメタノールで４時間再抽出する。４℃で４０時間冷却し、真空下で乾燥することによって得られた結晶は、ＨＰＬＣによると純度７０.１％のペンタマイシンを含む。これは、「純粋」とされるラゴシン（ペンタマイシン）が得られるという英国特許第８８４，７１１号の８ページ、４１行に匹敵するものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学純度９５％を超えるペンタマイシン。
【請求項２】
相対強度が単なる目安として提供されるＸ線粉末回折スペクトルにおいて、下記の最も強い線の２θ値±約０.２°によって特徴付けられる化学純度９５％を超える多形Ａの形態にある、請求項１記載のペンタマイシン
【表１】
。
【請求項３】
ヘテロ環化合物との溶媒和物の形態にあるペンタマイシン。
【請求項４】
モルホリン溶媒和物の形態にある、請求項３記載のペンタマイシン。
【請求項５】
ペンタマイシンの化学的精製のための、ヘテロ環化合物とのペンタマイシン溶媒和物の使用。
【請求項６】
化学純度９３％以下のペンタマイシンをヘテロ環化合物との適切な溶媒和物に変換し、結晶化によって該溶媒和物を精製し、該溶媒和物からペンタマイシンを遊離させることによる、ペンタマイシンの精製法。
【請求項７】
該溶媒和物がモルホリン溶媒和物である、請求項６記載の精製法。
【請求項８】
ペンタマイシンがＣ１−５−アルカノール中での長時間の攪拌によって該溶媒和物から遊離する、請求項６または７記載の精製法。
【請求項９】
適切な抗酸化剤の存在下で行われる、請求項６〜８のいずれか１項に記載の精製法。
【請求項１０】
純度９５％を超えるペンタマイシンの分解の速度を多形Ａに変換することによって有意に減少させる方法。
【請求項１１】
多形Ａへの変換が、酢酸エチルを加えた後、純度９５％を超えるペンタマイシンのジメチルスルホキシド溶液から結晶化することによって達成される、請求項１０記載の方法。
【請求項１】
化学純度９５％を超えるペンタマイシン。
【請求項２】
相対強度が単なる目安として提供されるＸ線粉末回折スペクトルにおいて、下記の最も強い線の２θ値±約０.２°によって特徴付けられる化学純度９５％を超える多形Ａの形態にある、請求項１記載のペンタマイシン
【表１】
。
【請求項３】
ヘテロ環化合物との溶媒和物の形態にあるペンタマイシン。
【請求項４】
モルホリン溶媒和物の形態にある、請求項３記載のペンタマイシン。
【請求項５】
ペンタマイシンの化学的精製のための、ヘテロ環化合物とのペンタマイシン溶媒和物の使用。
【請求項６】
化学純度９３％以下のペンタマイシンをヘテロ環化合物との適切な溶媒和物に変換し、結晶化によって該溶媒和物を精製し、該溶媒和物からペンタマイシンを遊離させることによる、ペンタマイシンの精製法。
【請求項７】
該溶媒和物がモルホリン溶媒和物である、請求項６記載の精製法。
【請求項８】
ペンタマイシンがＣ１−５−アルカノール中での長時間の攪拌によって該溶媒和物から遊離する、請求項６または７記載の精製法。
【請求項９】
適切な抗酸化剤の存在下で行われる、請求項６〜８のいずれか１項に記載の精製法。
【請求項１０】
純度９５％を超えるペンタマイシンの分解の速度を多形Ａに変換することによって有意に減少させる方法。
【請求項１１】
多形Ａへの変換が、酢酸エチルを加えた後、純度９５％を超えるペンタマイシンのジメチルスルホキシド溶液から結晶化することによって達成される、請求項１０記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２０１１−５１６４３４（Ｐ２０１１−５１６４３４Ａ）
【公表日】平成２３年５月２６日（２０１１．５．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０２２５６（Ｐ２０１１−５０２２５６）
【出願日】平成２１年３月２０日（２００９．３．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／００２０５４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１２１４９５
【国際公開日】平成２１年１０月８日（２００９．１０．８）
【出願人】（５１０２６２４５９）ルマヴィータ・アクチェンゲゼルシャフト (1)
【氏名又は名称原語表記】Ｌｕｍａｖｉｔａ ＡＧ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年５月２６日（２０１１．５．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月２０日（２００９．３．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／００２０５４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１２１４９５
【国際公開日】平成２１年１０月８日（２００９．１０．８）
【出願人】（５１０２６２４５９）ルマヴィータ・アクチェンゲゼルシャフト (1)
【氏名又は名称原語表記】Ｌｕｍａｖｉｔａ ＡＧ
【Ｆターム（参考）】
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