ＧｌｏｂｏＨおよびその断片に対する抗体のレベルに基づく癌の診断方法
Ｇｂ５ならびにＧｌｏｂｏ Ｈ、Ｂｂ２、Ｂｂ３、および／またはＢｂ４を含むグリカンアレイを用いる癌の診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００８年６月１６日に提出の、米国仮特許出願第６１／０６１，９７４号に対する優先権を主張するものであり、この仮出願は参考で全体を引用する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
６糖のエピトープを含む、Ｇｌｏｂｏ Ｈは、正常な上皮細胞や腺組織に加えて、様々な癌で発現する。Huang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:15-20 (2006), Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 33:11661-11666 (2008)、およびChang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 33:11667-11672 (2008)を参照。乳癌患者の血清が高レベルの抗Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体を含むことが報告された。しかし、これらの抗体単独のレベルは乳癌の信頼性できる目安ではない。
【発明の概要】
【０００３】
発明の要約
本発明は、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、その断片であるＢｂ２、Ｂｂ３、またはＢｂ４に対する抗体のレベルの、Ｇｌｏｂｏ Ｈの他の断片である、Ｇｂ５に対する抗体のレベルに対する割合が、癌をもたないヒトに比べて乳癌患者で有意により高いという予想できない発見に基づくものである。
【０００４】
したがって、本発明は、（ｉ）癌（例えば、乳癌、メラノーマ、神経芽細胞腫、皮膚癌、肝癌、前立腺癌、卵巣癌、結腸癌、胃癌、肺癌、および膵臓癌) を有する疑いのある被検者（例えば、ヒト）から抗体を含むサンプル（例えば、血清サンプル）を用意し、（ｉｉ）前記サンプルをＧｂ５ならびにＧｌｏｂｏ Ｈ、Ｂｂ２、Ｂｂ３、およびＢｂ４の１以上とインキュベートして、これらの分子を前記サンプル中の抗体に結合させ、（ｉｉｉ）Ｇｂ５に結合した抗体の量ならびにＧｌｏｂｏ Ｈに結合した、Ｂｂ２に結合した、Ｂｂ３に結合した、またはＢｂ４に結合した抗体の量の双方を測定し、さらに（ｉｖ）Ｇｂ５に結合した抗体の量に対するＧｌｏｂｏ Ｈに結合した、Ｂｂ２に結合した、Ｂｂ３に結合した、またはＢｂ４に結合した抗体の量の割合に基づいて、前記被検者が癌を有するか否かを決定することを有する、癌の診断方法を特徴とする。割合がより高いと、前記被検者は癌を有していることを示す。Ｇｌｏｂｏ Ｈ、Ｇｂ５、Ｂｂ２、Ｂｂ３、およびＢｂ４は支持デバイスに固定化されて、グリカンアレイを形成してもよい。一例では、前記アレイは、Ｇｂ５ならびにＧｌｏｂｏ Ｈ、Ｂｂ２、Ｂｂ３、およびＢｂ４の一以上を含む。他の例では、前記アレイは、すべてのこれらの分子を含む。
【０００５】
また、癌の診断を目的とするおよび癌の診断に使用される医療デバイスの製造を目的とするＧｂ５ならびにＧｌｏｂｏ Ｈ、Ｂｂ２、Ｂｂ３、およびＢｂ４の１以上の使用もまた、本発明の範囲に含まれる。
【０００６】
本発明の一以上の実施例の詳細は、下記説明で記載される。本発明の他の特徴および利点は、下記図面および様々な実施例の詳細な説明から、また、添付の特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
図面の簡単な説明
図面について、まず説明する。
【図１】図１は、Ｇｌｏｂｏ Ｈ（ＧＨ）における６糖エピトープおよびこのエピトープの断片の構造を示す図である。パネルＡ：６糖エピトープの構造。パネルＢ：６糖エピトープおよびその７個の断片の構造。
【図２】図２は、抗グリカン抗体を検出するための、癌細胞表面を模倣する、グリカンアレイの使用を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
発明の詳細な説明
我々は、抗−Ｇｌｏｂｏ Ｈ／抗−Ｇｂ５、抗−Ｂｂ２／抗−Ｇｂ５、抗−Ｂｂ３／抗−Ｇｂ５、または抗−Ｂｂ４／抗−Ｇｂ５抗体のレベルの割合が、癌を持たない個体に対するより乳癌患者で有意により高いことを発見した。ゆえに、これらの割合のいずれかは、癌の診断において信頼できる目安として機能する。
【０００９】
したがって、癌を有する疑いのある被検者、例えば、遺伝的に癌になりやすい被検者におけるＧｂ５ならびにＧｌｏｂｏ Ｈ、Ｂｂ２、Ｂｂ３、Ｂｂ４の一以上に対する抗体の量を検出し、さらに上記レベルの割合のいずれかに基づいてその被検者が癌を有するか否かを決定することによる癌の診断方法を、本明細書中で説明する。上記抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＤ、またはこれらの混合物でありうる。
【００１０】
Ｇｌｏｂｏ Ｈは、図１、パネルＡに示される６糖エピトープ、および場合によっては、非糖部分を含むグリカンである。その断片（例えば、Ｇｂ５、Ｂｂ２、Ｂｂ３、及びＢｂ４）は、６糖エピトープの断片および該当する場合には、非糖部分を含むグリカンである。６糖エピトープの７種の断片を図１、パネルＢに示す。これらのオリゴ糖は通常の方法によって調製できる。例えば、Huang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:15-20 (2006)を参照。好ましくは、これらを、アルキルアミン、例えば、（ＣＨ２）５ＮＨ２、またはアルキルアジド、例えば、（ＣＨ２）５Ｎ３と結合し、これを、ガラス、プラスチック、ナイロン、金属、またはシリコン等の、様々な材料から作製される支持デバイス（例えば、ポリマー基材）に共有結合してもよい。Ｇｌｏｂｏ Ｈ、Ｇｂ５、Ｂｂ２、Ｂｂ３、およびＢｂ４を、グリカンアレイを形成するために、支持デバイス上に所定のアドレスでスポットしてもよい。Ｇｌｏｂｏ Ｈ、Ｇｂ５、Ｂｂ２、Ｂｂ３、およびＢｂ４（図２参照）に含まれるオリゴ糖エピトープを発現する癌細胞の表面を模倣する、このアレイは、このオリゴ糖エピトープに結合する抗体の量を検出するのに使用できる。
【００１１】
本発明の方法を実施するために、本明細書に記載されるグリカンアレイを、癌を有する疑いのある被検者からの抗体含有サンプルとともにインキュベートする。サンプルの例としては、以下に制限されないが、血清、唾液およびリンパ節液などが挙げられる。このアレイを洗浄して、非結合抗体を除去した後、所望の抗体に特異的の結合する標識された二次抗体とともにインキュベートするが、この際、当該二次抗体は、ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭでありうる。このグリカンアレイを再度洗浄し、非結合二次抗体分子を除去すると、結合した二次抗体分子から放出されるシグナルの強度がターゲット抗体のレベルに相当する。抗−Ｇｌｏｂｏ Ｈ／抗−Ｇｂ５、抗−Ｂｂ２／抗−Ｇｂ５、抗−Ｂｂ３／抗−Ｇｂ５、または抗−Ｂｂ４／抗−Ｇｂ５のより高い割合が被検者で検出された場合には、その被検者は、癌を有するまたは癌を発症する危険性があると、診断される。
【実施例】
【００１２】
さらに詳述されなくとも、当業者は、上記説明に基づいて、本発明を十分利用できると考えられる。したがって、下記特定の実施形態は、単に詳細に説明するためのものであり、いずれの残りの開示を制限するものではないと、解されるべきである。本明細書中に挙げられたすべての公報は、参考で引用される。
【００１３】
実施例１：グリカンアレイへの抗体Ｖｋ９、Ｍｂｒ１、およびＡ４８８の結合
図１に示されるオリゴ糖Ｇｌｏｂｏ Ｈ、Ｇｂ５、Ｇｂ４、Ｇｂ３、Ｇｂ２、Ｂｂ４、Ｂｂ３、Ｂｂ２を、Hung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103-15-20 (2006)に記載されるワン−ポットプログラマブルプロトコル(one-pot programmable protocol)に従って調製した。これらのオリゴ糖を、Hung et al. and Blixt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:17033-17038 (2004)に記載される標準的なマイクロアレイロボット印刷技術(microarray robotic printing technology)によって、Nexterion H slide (SCHOTT North America)から購入した、ＮＨＳ−被覆スライドガラス上に共有結合させた。より詳しくは、各オリゴ糖のストック溶液（８０μＭ）のアリコートを、各オリゴ糖について２列で、１６−列フォーマット(16-row format)でスライドガラス上に置いた。
【００１４】
下記３種の抗体を本研究で使用した：
・Ｍｂｒ１、マウスＩｇＭ 抗−Ｇｌｏｂｏ Ｈモノクローナル抗体、
・Ｖｋ９、マウスＩｇＧ 抗−Ｇｌｏｂｏ Ｈモノクローナル抗体、および
・Ａ４８８、抗−マウス／ヒトＧｂ５モノクローナル抗体。
【００１５】
各抗体を、１時間、振盪しながら、加湿チャンバーで０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳバッファー（ｐＨ ７．４）中で上記スライドガラス（ここに、オリゴ糖が結合している）と共にインキュベートした。次に、このスライドガラスを、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳバッファー（ｐＨ ７．４）で３回、ＰＢＳバッファー（ｐＨ ７．４）で３回、および水で３回、順次洗浄した。次に、このスライドガラスを、１時間、振盪しながら、同じチャンバーでＣｙ３−結合ヤギ抗−マウスＩｇＭ（ＭＢｒ１について）またはＩｇＧ（ＶＫ−９およびＡ４８８について）抗体と共にインキュベートした。このスライドガラスを再度、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳバッファー（ｐＨ ７．４）で３回、ＰＢＳバッファー（ｐＨ ７．４）で３回、およびＨ２Ｏで３回、洗浄し、乾燥した。最後に、このスライドガラスを、マイクロアレイ蛍光チップリーダー(microarray fluorescence chip reader)（ＡｒｒａｙＷｏｒｘ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｒｅａｄｅｒ）を用いて、５９５ｎｍ（Ｃｙ３−結合二次抗体について）および４８８ｎｍ（Ａ４８８抗−ＳＳＥＡ−３抗原抗体について）でスキャンした。
【００１６】
３種の抗体はすべて、上記グリカンアレイに結合した。ＶＫ９は、Ｇｌｏｂｏ ＨおよびＢｂ４に特異的に結合した；Ｍｂｒ１は、Ｇｌｏｂｏ ＨおよびＢＢ４に特異的に結合し、より低い親和性であったがＢｂ３にも結合した；およびＡ４８８は、Ｇｂ５に特異的に結合した。これらの結果から、このグリカンアレイは、Ｇｌｏｂｏ Ｈおよび／またはその断片に結合する抗体を捕捉することができることが示される。
【００１７】
実施例２：乳癌患者におけるＧｌｏｂｏ Ｈおよびその断片に対する抗体を検出することを目的とするグリカンアレイの使用
乳癌患者および健常個体からの血漿サンプルを、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／３％ ＢＳＡ／ＰＢＳバッファー（ｐＨ ７．４）で１：２０に希釈し、１時間、振盪しながら、加湿チャンバーで上記実施例１に記載されたグリカンアレイと共にインキュベートした。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳバッファー（ｐＨ ７．４）、ＰＢＳバッファー（ｐＨ ７．４）、および水で、それぞれ、３回ずつ洗浄した後、スライドガラスを、１時間、振盪しながら、加湿チャンバーでＣｙ３−結合ヤギ抗−ヒトＩｇＭまたはＩｇＧ抗体と共にインキュベートした。次に、このスライドガラスを、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳバッファー（ｐＨ ７．４）で３回、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で３回、およびＨ２Ｏで３回洗浄した。乾燥した後、スライドガラスを、マイクロアレイ蛍光チップリーダー(microarray fluorescence chip reader)（ＡｒｒａｙＷｏｒｘ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｒｅａｄｅｒ）を用いて、５９５ｎｍ（Ｃｙ３−結合二次抗体について）でスキャンした。
【００１８】
下記表１および表２に示されるように、Ｇｌｏｂｏ Ｈ−結合ＩｇＧ／Ｇｂ５−結合ＩｇＧ（ＧＨ／Ｇｂ５ ＩｇＧ）およびＧｌｏｂｏ Ｈ−結合ＩｇＭ／Ｇｂ５−結合ＩｇＭ（ＧＨ／Ｇｂ５ ＩｇＭ）のレベルの比は、健常個体の血漿サンプルに比して、乳癌患者の血漿サンプルで非常に高かった。また、これらの２つの表に示されるように、癌患者のＢｂ２／Ｇｂ５ ＩｇＧ、Ｂｂ４／Ｇｂ５ ＩｇＭ、Ｂｂ３／Ｇｂ５ ＩｇＭ、およびＢｂ２／Ｇｂ５ ＩｇＭの割合は、健常個体のものに比べて有意により高かった。これらのデータから、上記列挙された割合は癌を診断するのに信頼できるマーカーであることが示される。
【００１９】
【表１】
【００２０】
【表２】
【００２１】
実施例３：Ｇｌｏｂｏ Ｈによって誘導される免疫応答を検出することを目的とするグリカンアレイの使用
ワクチン
マウス（６週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウス、BioLASCO, Taiwan）に、Ｇｌｏｂｏ Ｈ−ＫＬＨワクチン(Optimer Pharmaceuticals, Inc., San Diego, Ca.)を、３週間、週１回、皮下に免疫処置した。コントロールマウスには、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を注射した。血清サンプルを、最後に免疫処置してから１０日目に処置マウスから集めた。これらのサンプルを、３０、１２０、２４０、４８０、９６０、及び１９２０倍に順次希釈し、抗−Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体の力価を、上記実施例１に記載されたグリカンアレイスライド（１スポット当たり、３．５×１０−１４モルのオリゴ糖）を用いてまたは公知のＥＬＩＳＡ（１ウェル当たり、１．２８×１０−１０モルのＧｌｏｂｏ Ｈを被覆）によって、希釈した血清サンプルで試験した。
【００２２】
このＧｌｏｂｏ Ｈ−ＫＬＨワクチンは、免疫処理されたマウスで抗−Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体の分泌を誘導した。下記表３参照。また、上記したグリカンアレイアッセイは公知のＥＬＩＳＡに比べて非常に感受性がより高いことも分かった。
【００２３】
【表３】
【００２４】
他の実施形態
本明細書中に開示されるすべての特徴は、いずれの組み合わせで組み合わされてもよい。本明細書中に開示される各特徴は、同じ、等価のまたは同様の目的を果たす別の特徴で置換されてもよい。ゆえに、特記されない限り、開示される各特徴は、包括的な一連の等価のまたは同様の特徴の一例にすぎない。
【００２５】
上記説明から、当業者は、本発明の必須の特性を容易に確認でき、本発明の概念および範囲を逸脱しない限り、本発明の様々な変更および修飾を行って様々な用法および症状に適応できる。ゆえに、他の実施形態もまた本願特許請求の範囲に含まれる。
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００８年６月１６日に提出の、米国仮特許出願第６１／０６１，９７４号に対する優先権を主張するものであり、この仮出願は参考で全体を引用する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
６糖のエピトープを含む、Ｇｌｏｂｏ Ｈは、正常な上皮細胞や腺組織に加えて、様々な癌で発現する。Huang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:15-20 (2006), Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 33:11661-11666 (2008)、およびChang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 33:11667-11672 (2008)を参照。乳癌患者の血清が高レベルの抗Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体を含むことが報告された。しかし、これらの抗体単独のレベルは乳癌の信頼性できる目安ではない。
【発明の概要】
【０００３】
発明の要約
本発明は、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、その断片であるＢｂ２、Ｂｂ３、またはＢｂ４に対する抗体のレベルの、Ｇｌｏｂｏ Ｈの他の断片である、Ｇｂ５に対する抗体のレベルに対する割合が、癌をもたないヒトに比べて乳癌患者で有意により高いという予想できない発見に基づくものである。
【０００４】
したがって、本発明は、（ｉ）癌（例えば、乳癌、メラノーマ、神経芽細胞腫、皮膚癌、肝癌、前立腺癌、卵巣癌、結腸癌、胃癌、肺癌、および膵臓癌) を有する疑いのある被検者（例えば、ヒト）から抗体を含むサンプル（例えば、血清サンプル）を用意し、（ｉｉ）前記サンプルをＧｂ５ならびにＧｌｏｂｏ Ｈ、Ｂｂ２、Ｂｂ３、およびＢｂ４の１以上とインキュベートして、これらの分子を前記サンプル中の抗体に結合させ、（ｉｉｉ）Ｇｂ５に結合した抗体の量ならびにＧｌｏｂｏ Ｈに結合した、Ｂｂ２に結合した、Ｂｂ３に結合した、またはＢｂ４に結合した抗体の量の双方を測定し、さらに（ｉｖ）Ｇｂ５に結合した抗体の量に対するＧｌｏｂｏ Ｈに結合した、Ｂｂ２に結合した、Ｂｂ３に結合した、またはＢｂ４に結合した抗体の量の割合に基づいて、前記被検者が癌を有するか否かを決定することを有する、癌の診断方法を特徴とする。割合がより高いと、前記被検者は癌を有していることを示す。Ｇｌｏｂｏ Ｈ、Ｇｂ５、Ｂｂ２、Ｂｂ３、およびＢｂ４は支持デバイスに固定化されて、グリカンアレイを形成してもよい。一例では、前記アレイは、Ｇｂ５ならびにＧｌｏｂｏ Ｈ、Ｂｂ２、Ｂｂ３、およびＢｂ４の一以上を含む。他の例では、前記アレイは、すべてのこれらの分子を含む。
【０００５】
また、癌の診断を目的とするおよび癌の診断に使用される医療デバイスの製造を目的とするＧｂ５ならびにＧｌｏｂｏ Ｈ、Ｂｂ２、Ｂｂ３、およびＢｂ４の１以上の使用もまた、本発明の範囲に含まれる。
【０００６】
本発明の一以上の実施例の詳細は、下記説明で記載される。本発明の他の特徴および利点は、下記図面および様々な実施例の詳細な説明から、また、添付の特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
図面の簡単な説明
図面について、まず説明する。
【図１】図１は、Ｇｌｏｂｏ Ｈ（ＧＨ）における６糖エピトープおよびこのエピトープの断片の構造を示す図である。パネルＡ：６糖エピトープの構造。パネルＢ：６糖エピトープおよびその７個の断片の構造。
【図２】図２は、抗グリカン抗体を検出するための、癌細胞表面を模倣する、グリカンアレイの使用を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
発明の詳細な説明
我々は、抗−Ｇｌｏｂｏ Ｈ／抗−Ｇｂ５、抗−Ｂｂ２／抗−Ｇｂ５、抗−Ｂｂ３／抗−Ｇｂ５、または抗−Ｂｂ４／抗−Ｇｂ５抗体のレベルの割合が、癌を持たない個体に対するより乳癌患者で有意により高いことを発見した。ゆえに、これらの割合のいずれかは、癌の診断において信頼できる目安として機能する。
【０００９】
したがって、癌を有する疑いのある被検者、例えば、遺伝的に癌になりやすい被検者におけるＧｂ５ならびにＧｌｏｂｏ Ｈ、Ｂｂ２、Ｂｂ３、Ｂｂ４の一以上に対する抗体の量を検出し、さらに上記レベルの割合のいずれかに基づいてその被検者が癌を有するか否かを決定することによる癌の診断方法を、本明細書中で説明する。上記抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＤ、またはこれらの混合物でありうる。
【００１０】
Ｇｌｏｂｏ Ｈは、図１、パネルＡに示される６糖エピトープ、および場合によっては、非糖部分を含むグリカンである。その断片（例えば、Ｇｂ５、Ｂｂ２、Ｂｂ３、及びＢｂ４）は、６糖エピトープの断片および該当する場合には、非糖部分を含むグリカンである。６糖エピトープの７種の断片を図１、パネルＢに示す。これらのオリゴ糖は通常の方法によって調製できる。例えば、Huang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:15-20 (2006)を参照。好ましくは、これらを、アルキルアミン、例えば、（ＣＨ２）５ＮＨ２、またはアルキルアジド、例えば、（ＣＨ２）５Ｎ３と結合し、これを、ガラス、プラスチック、ナイロン、金属、またはシリコン等の、様々な材料から作製される支持デバイス（例えば、ポリマー基材）に共有結合してもよい。Ｇｌｏｂｏ Ｈ、Ｇｂ５、Ｂｂ２、Ｂｂ３、およびＢｂ４を、グリカンアレイを形成するために、支持デバイス上に所定のアドレスでスポットしてもよい。Ｇｌｏｂｏ Ｈ、Ｇｂ５、Ｂｂ２、Ｂｂ３、およびＢｂ４（図２参照）に含まれるオリゴ糖エピトープを発現する癌細胞の表面を模倣する、このアレイは、このオリゴ糖エピトープに結合する抗体の量を検出するのに使用できる。
【００１１】
本発明の方法を実施するために、本明細書に記載されるグリカンアレイを、癌を有する疑いのある被検者からの抗体含有サンプルとともにインキュベートする。サンプルの例としては、以下に制限されないが、血清、唾液およびリンパ節液などが挙げられる。このアレイを洗浄して、非結合抗体を除去した後、所望の抗体に特異的の結合する標識された二次抗体とともにインキュベートするが、この際、当該二次抗体は、ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭでありうる。このグリカンアレイを再度洗浄し、非結合二次抗体分子を除去すると、結合した二次抗体分子から放出されるシグナルの強度がターゲット抗体のレベルに相当する。抗−Ｇｌｏｂｏ Ｈ／抗−Ｇｂ５、抗−Ｂｂ２／抗−Ｇｂ５、抗−Ｂｂ３／抗−Ｇｂ５、または抗−Ｂｂ４／抗−Ｇｂ５のより高い割合が被検者で検出された場合には、その被検者は、癌を有するまたは癌を発症する危険性があると、診断される。
【実施例】
【００１２】
さらに詳述されなくとも、当業者は、上記説明に基づいて、本発明を十分利用できると考えられる。したがって、下記特定の実施形態は、単に詳細に説明するためのものであり、いずれの残りの開示を制限するものではないと、解されるべきである。本明細書中に挙げられたすべての公報は、参考で引用される。
【００１３】
実施例１：グリカンアレイへの抗体Ｖｋ９、Ｍｂｒ１、およびＡ４８８の結合
図１に示されるオリゴ糖Ｇｌｏｂｏ Ｈ、Ｇｂ５、Ｇｂ４、Ｇｂ３、Ｇｂ２、Ｂｂ４、Ｂｂ３、Ｂｂ２を、Hung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103-15-20 (2006)に記載されるワン−ポットプログラマブルプロトコル(one-pot programmable protocol)に従って調製した。これらのオリゴ糖を、Hung et al. and Blixt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:17033-17038 (2004)に記載される標準的なマイクロアレイロボット印刷技術(microarray robotic printing technology)によって、Nexterion H slide (SCHOTT North America)から購入した、ＮＨＳ−被覆スライドガラス上に共有結合させた。より詳しくは、各オリゴ糖のストック溶液（８０μＭ）のアリコートを、各オリゴ糖について２列で、１６−列フォーマット(16-row format)でスライドガラス上に置いた。
【００１４】
下記３種の抗体を本研究で使用した：
・Ｍｂｒ１、マウスＩｇＭ 抗−Ｇｌｏｂｏ Ｈモノクローナル抗体、
・Ｖｋ９、マウスＩｇＧ 抗−Ｇｌｏｂｏ Ｈモノクローナル抗体、および
・Ａ４８８、抗−マウス／ヒトＧｂ５モノクローナル抗体。
【００１５】
各抗体を、１時間、振盪しながら、加湿チャンバーで０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳバッファー（ｐＨ ７．４）中で上記スライドガラス（ここに、オリゴ糖が結合している）と共にインキュベートした。次に、このスライドガラスを、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳバッファー（ｐＨ ７．４）で３回、ＰＢＳバッファー（ｐＨ ７．４）で３回、および水で３回、順次洗浄した。次に、このスライドガラスを、１時間、振盪しながら、同じチャンバーでＣｙ３−結合ヤギ抗−マウスＩｇＭ（ＭＢｒ１について）またはＩｇＧ（ＶＫ−９およびＡ４８８について）抗体と共にインキュベートした。このスライドガラスを再度、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳバッファー（ｐＨ ７．４）で３回、ＰＢＳバッファー（ｐＨ ７．４）で３回、およびＨ２Ｏで３回、洗浄し、乾燥した。最後に、このスライドガラスを、マイクロアレイ蛍光チップリーダー(microarray fluorescence chip reader)（ＡｒｒａｙＷｏｒｘ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｒｅａｄｅｒ）を用いて、５９５ｎｍ（Ｃｙ３−結合二次抗体について）および４８８ｎｍ（Ａ４８８抗−ＳＳＥＡ−３抗原抗体について）でスキャンした。
【００１６】
３種の抗体はすべて、上記グリカンアレイに結合した。ＶＫ９は、Ｇｌｏｂｏ ＨおよびＢｂ４に特異的に結合した；Ｍｂｒ１は、Ｇｌｏｂｏ ＨおよびＢＢ４に特異的に結合し、より低い親和性であったがＢｂ３にも結合した；およびＡ４８８は、Ｇｂ５に特異的に結合した。これらの結果から、このグリカンアレイは、Ｇｌｏｂｏ Ｈおよび／またはその断片に結合する抗体を捕捉することができることが示される。
【００１７】
実施例２：乳癌患者におけるＧｌｏｂｏ Ｈおよびその断片に対する抗体を検出することを目的とするグリカンアレイの使用
乳癌患者および健常個体からの血漿サンプルを、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／３％ ＢＳＡ／ＰＢＳバッファー（ｐＨ ７．４）で１：２０に希釈し、１時間、振盪しながら、加湿チャンバーで上記実施例１に記載されたグリカンアレイと共にインキュベートした。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳバッファー（ｐＨ ７．４）、ＰＢＳバッファー（ｐＨ ７．４）、および水で、それぞれ、３回ずつ洗浄した後、スライドガラスを、１時間、振盪しながら、加湿チャンバーでＣｙ３−結合ヤギ抗−ヒトＩｇＭまたはＩｇＧ抗体と共にインキュベートした。次に、このスライドガラスを、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳバッファー（ｐＨ ７．４）で３回、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で３回、およびＨ２Ｏで３回洗浄した。乾燥した後、スライドガラスを、マイクロアレイ蛍光チップリーダー(microarray fluorescence chip reader)（ＡｒｒａｙＷｏｒｘ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｒｅａｄｅｒ）を用いて、５９５ｎｍ（Ｃｙ３−結合二次抗体について）でスキャンした。
【００１８】
下記表１および表２に示されるように、Ｇｌｏｂｏ Ｈ−結合ＩｇＧ／Ｇｂ５−結合ＩｇＧ（ＧＨ／Ｇｂ５ ＩｇＧ）およびＧｌｏｂｏ Ｈ−結合ＩｇＭ／Ｇｂ５−結合ＩｇＭ（ＧＨ／Ｇｂ５ ＩｇＭ）のレベルの比は、健常個体の血漿サンプルに比して、乳癌患者の血漿サンプルで非常に高かった。また、これらの２つの表に示されるように、癌患者のＢｂ２／Ｇｂ５ ＩｇＧ、Ｂｂ４／Ｇｂ５ ＩｇＭ、Ｂｂ３／Ｇｂ５ ＩｇＭ、およびＢｂ２／Ｇｂ５ ＩｇＭの割合は、健常個体のものに比べて有意により高かった。これらのデータから、上記列挙された割合は癌を診断するのに信頼できるマーカーであることが示される。
【００１９】
【表１】
【００２０】
【表２】
【００２１】
実施例３：Ｇｌｏｂｏ Ｈによって誘導される免疫応答を検出することを目的とするグリカンアレイの使用
ワクチン
マウス（６週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウス、BioLASCO, Taiwan）に、Ｇｌｏｂｏ Ｈ−ＫＬＨワクチン(Optimer Pharmaceuticals, Inc., San Diego, Ca.)を、３週間、週１回、皮下に免疫処置した。コントロールマウスには、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を注射した。血清サンプルを、最後に免疫処置してから１０日目に処置マウスから集めた。これらのサンプルを、３０、１２０、２４０、４８０、９６０、及び１９２０倍に順次希釈し、抗−Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体の力価を、上記実施例１に記載されたグリカンアレイスライド（１スポット当たり、３．５×１０−１４モルのオリゴ糖）を用いてまたは公知のＥＬＩＳＡ（１ウェル当たり、１．２８×１０−１０モルのＧｌｏｂｏ Ｈを被覆）によって、希釈した血清サンプルで試験した。
【００２２】
このＧｌｏｂｏ Ｈ−ＫＬＨワクチンは、免疫処理されたマウスで抗−Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体の分泌を誘導した。下記表３参照。また、上記したグリカンアレイアッセイは公知のＥＬＩＳＡに比べて非常に感受性がより高いことも分かった。
【００２３】
【表３】
【００２４】
他の実施形態
本明細書中に開示されるすべての特徴は、いずれの組み合わせで組み合わされてもよい。本明細書中に開示される各特徴は、同じ、等価のまたは同様の目的を果たす別の特徴で置換されてもよい。ゆえに、特記されない限り、開示される各特徴は、包括的な一連の等価のまたは同様の特徴の一例にすぎない。
【００２５】
上記説明から、当業者は、本発明の必須の特性を容易に確認でき、本発明の概念および範囲を逸脱しない限り、本発明の様々な変更および修飾を行って様々な用法および症状に適応できる。ゆえに、他の実施形態もまた本願特許請求の範囲に含まれる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を有する疑いのある被検者からの抗体を含むサンプルを用意し、
前記サンプルをＧｂ５ならびにＧｌｏｂｏ Ｈ、Ｂｂ２、Ｂｂ３、およびＢｂ４の１以上とインキュベートして、前記サンプル中の抗体をＧｂ５ならびにＧｌｏｂｏ Ｈ、Ｂｂ２、Ｂｂ３、およびＢｂ４の１以上に結合させ、
Ｇｂ５に結合した抗体の量ならびにＧｌｏｂｏ Ｈに結合した、Ｂｂ２に結合した、Ｂｂ３に結合した、またはＢｂ４に結合した抗体の量の双方を測定し、さらに
すべての結合した抗体の量に基づいて、前記被検者が癌を有しているか否かを決定する
ことを有し、
癌を有していない被検者に比して、Ｇｂ５に結合した抗体の量に対するＧｌｏｂｏ Ｈに結合した、Ｂｂ２に結合した、Ｂｂ３に結合した、またはＢｂ４に結合した抗体の量の割合がより高いと、前記被検者は癌を有していることを示す、癌の診断方法。
【請求項２】
前記インキュベートする段階は、前記サンプルをＧｂ５およびＧｌｏｂｏ Ｈと混合することによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記インキュベートする段階は、前記サンプルをＧｂ５およびＢｂ３と混合することによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記インキュベートする段階は、前記サンプルをＧｂ５およびＢｂ２と混合することによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記インキュベートする段階は、前記サンプルをＧｂ５、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、Ｂｂ２、Ｂｂ３、およびＢｂ４と混合することによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルが血清サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
Ｇｂ５ならびにＧｌｏｂｏ Ｈ、Ｂｂ２、Ｂｂ３、およびＢｂ４の１以上は、支持デバイスに固定化される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記癌は、乳癌、メラノーマ、神経芽細胞腫、皮膚癌、肝癌、前立腺癌、卵巣癌、結腸癌、胃癌、および膵臓癌からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記癌は乳癌である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｇｂ５ならびにＧｌｏｂｏ Ｈ、Ｂｂ２、Ｂｂ３、およびＢｂ４の１以上は、支持デバイスに固定化される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記インキュベートする段階は、前記サンプルをＧｂ５およびＧｌｏｂｏ Ｈと混合することによって行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｇｂ５およびＧｌｏｂｏ Ｈは、支持デバイスに固定化される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記インキュベートする段階は、前記サンプルをＧｂ５およびＢｂ２と混合することによって行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｇｂ５およびＢｂ２は、支持デバイスに固定化される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記インキュベートする段階は、前記サンプルをＧｂ５およびＢｂ３と混合することによって行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｇｂ５およびＢｂ３は、支持デバイスに固定化される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記インキュベートする段階は、前記サンプルをＧｂ５、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、Ｂｂ２、Ｂｂ３、およびＢｂ４と混合することによって行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｇｂ５、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、Ｂｂ２、Ｂｂ３、およびＢｂ４は、支持デバイスに固定化される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記サンプルが血清サンプルである、請求項９に記載の方法。
【請求項１】
癌を有する疑いのある被検者からの抗体を含むサンプルを用意し、
前記サンプルをＧｂ５ならびにＧｌｏｂｏ Ｈ、Ｂｂ２、Ｂｂ３、およびＢｂ４の１以上とインキュベートして、前記サンプル中の抗体をＧｂ５ならびにＧｌｏｂｏ Ｈ、Ｂｂ２、Ｂｂ３、およびＢｂ４の１以上に結合させ、
Ｇｂ５に結合した抗体の量ならびにＧｌｏｂｏ Ｈに結合した、Ｂｂ２に結合した、Ｂｂ３に結合した、またはＢｂ４に結合した抗体の量の双方を測定し、さらに
すべての結合した抗体の量に基づいて、前記被検者が癌を有しているか否かを決定する
ことを有し、
癌を有していない被検者に比して、Ｇｂ５に結合した抗体の量に対するＧｌｏｂｏ Ｈに結合した、Ｂｂ２に結合した、Ｂｂ３に結合した、またはＢｂ４に結合した抗体の量の割合がより高いと、前記被検者は癌を有していることを示す、癌の診断方法。
【請求項２】
前記インキュベートする段階は、前記サンプルをＧｂ５およびＧｌｏｂｏ Ｈと混合することによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記インキュベートする段階は、前記サンプルをＧｂ５およびＢｂ３と混合することによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記インキュベートする段階は、前記サンプルをＧｂ５およびＢｂ２と混合することによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記インキュベートする段階は、前記サンプルをＧｂ５、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、Ｂｂ２、Ｂｂ３、およびＢｂ４と混合することによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルが血清サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
Ｇｂ５ならびにＧｌｏｂｏ Ｈ、Ｂｂ２、Ｂｂ３、およびＢｂ４の１以上は、支持デバイスに固定化される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記癌は、乳癌、メラノーマ、神経芽細胞腫、皮膚癌、肝癌、前立腺癌、卵巣癌、結腸癌、胃癌、および膵臓癌からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記癌は乳癌である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｇｂ５ならびにＧｌｏｂｏ Ｈ、Ｂｂ２、Ｂｂ３、およびＢｂ４の１以上は、支持デバイスに固定化される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記インキュベートする段階は、前記サンプルをＧｂ５およびＧｌｏｂｏ Ｈと混合することによって行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｇｂ５およびＧｌｏｂｏ Ｈは、支持デバイスに固定化される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記インキュベートする段階は、前記サンプルをＧｂ５およびＢｂ２と混合することによって行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｇｂ５およびＢｂ２は、支持デバイスに固定化される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記インキュベートする段階は、前記サンプルをＧｂ５およびＢｂ３と混合することによって行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｇｂ５およびＢｂ３は、支持デバイスに固定化される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記インキュベートする段階は、前記サンプルをＧｂ５、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、Ｂｂ２、Ｂｂ３、およびＢｂ４と混合することによって行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｇｂ５、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、Ｂｂ２、Ｂｂ３、およびＢｂ４は、支持デバイスに固定化される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記サンプルが血清サンプルである、請求項９に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２０１１−５２４５３７（Ｐ２０１１−５２４５３７Ａ）
【公表日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１４７５７（Ｐ２０１１−５１４７５７）
【出願日】平成２１年６月１６日（２００９．６．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４７５３２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／００８７３６
【国際公開日】平成２２年１月２１日（２０１０．１．２１）
【出願人】（５９６１１８４９３）アカデミア シニカ (33)
【氏名又は名称原語表記】ＡＣＡＤＥＭＩＡ ＳＩＮＩＣＡ
【住所又は居所原語表記】１２８ Ｓｅｃ ２，Ａｃａｄｅｍｉａ Ｒｏａｄ，Ｎａｎｋａｎｇ，Ｔａｉｐｅｉ １１５２９ ＴＷ
【公表日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月１６日（２００９．６．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４７５３２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／００８７３６
【国際公開日】平成２２年１月２１日（２０１０．１．２１）
【出願人】（５９６１１８４９３）アカデミア シニカ (33)
【氏名又は名称原語表記】ＡＣＡＤＥＭＩＡ ＳＩＮＩＣＡ
【住所又は居所原語表記】１２８ Ｓｅｃ ２，Ａｃａｄｅｍｉａ Ｒｏａｄ，Ｎａｎｋａｎｇ，Ｔａｉｐｅｉ １１５２９ ＴＷ
[ Back to top ]