ＧｌｏｂｏＨおよび新規な糖脂質アジュバントを有する関連抗がんワクチン
免疫原性組成物、がんワクチン、およびがんを治療する方法を提供する。（ａ）パラ−ニトロフェニルなどのリンカーによってキャリアタンパク質と共役した、Ｇｌｏｂｏ Ｈまたはその免疫原性フラグメントなどの糖鎖、および（ｂ）α−ガラクトシルセラミド誘導体などの、樹上細胞上のＣＤ１ｄと結合できる糖脂質を含むアジュバント、を含み、前記免疫原性組成物は、ＩｇＭアイソタイプ抗体と比較して、ＩｇＧアイソタイプ抗体を相対的に高いレベルで誘導する免疫応答を誘導する、組成物を提供する。キャリアタンパク質であるジフテリア毒素交差反応物質１９７（ＤＴ−ＣＲＭ１９７）、およびアジュバントであるＣ３４を含む組成物を提供する。本明細書中に開示された免疫原性組成物によって産生された抗体は、さらにＧｌｏｂｏ Ｈ、胚発生段階特異抗原−３（ＳＳＥＡ−３）、および胚発生段階特異抗原−４（ＳＳＥＡ−４）の少なくとも１つを中和する。ＤＴ−ＣＲＭ１９７と共役する、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４を含有する免疫原性組成物を含む、乳癌幹細胞に対する治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願のクロスリファレンス
本出願は、２００８年６月１６日に出願された米国仮特許出願第６１／０６１９６８号に基づく優先権を主張し、「Ｇｌｏｂｏ ＨおよびＳＳＥＡ−３への特異的な免疫応答誘導組成物、およびそのがん治療のおける使用」の名称で２００９年６月１６日に出願された、同時継続の米国特許出願第１２／４８５５４６号の一部継続出願である。本出願の内容は、その全体の内容が参照により引用される。
【０００２】
本発明の技術分野
本発明は、がんワクチン分野に関する。具体的には、本出願は、免疫原性キャリアであるＤＴ−ＣＲＭ１９７と共役する、Ｂ細胞エピトープ、Ｇｌｏｂｏ Ｈ含有ワクチンに基づく糖鎖に関する。より具体的には、本発明は、Ｃ３４のような新規糖脂質アジュバントとともに投与される、抗がんＧｌｏｂｏ Ｈ−ＤＴワクチンを目的とする。
【背景技術】
【０００３】
抗がん治療を設計するため、正常細胞のないがん細胞またはがん幹細胞を標的とする分子を探索することが望まれている。異常グリコシル化は、しばしば腫瘍進行と関係があり、１９６９年にMeezanらによってがんの糖鎖が正常細胞と異なることが示された(Meezan E, et al. (1969) Biochemistry 8:2518-2524.)。異常グリコシル化は、特定構造の欠損または過剰発現、不完全構造の持続、および新規構造の発生を含む。前記構造の違いは、レクチン染色を用いた、正常組織および悪性組織の比較による多くの組織学的証拠によって、その後に支持された(Turner GA (1992) Clin Chim Acta 208:149-171; Gabius HJ (2000) Naturwissenschaften 87:108-121.)。
【０００４】
ごく最近、糖鎖抗原に関連する腫瘍がモノクローナル抗体および質量分析法により同定された（Shriver Z, et al. (2004) Nat Rev Drug Disc 3:863-873; Pacino G, et al. (1991) Br J Cancer 63:390-398.）。このデータにより、糖脂質または糖タンパク質の形成において、がん細胞で発現される抗原と関連する多くのがんが特徴付けられ、がんの特定のタイプと関連付けられている（Bertozzi CR, Dube DH (2005) Nat Rev Drug Discovery 4:477-488.）。悪性細胞における糖鎖表面の役割については比較的にあまり知られていないが、これらの抗原に対する受動的に投与された抗体またはワクチン誘導抗体が予後の改善と関連している。
【０００５】
糖鎖関連腫瘍の報告では、１９８４年に箱守らによって、乳癌ＭＣＦ−７細胞から糖脂質抗原Ｇｌｏｂｏ Ｈ（Fucα1→2Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glc）が初めて単離、同定された（Bremer EG, et al. (1984) J Biol Chem 259:14773-14777.）。抗Ｇｌｏｂｏモノクローナル抗体のさらなる研究により、Ｇｌｏｂｏ Ｈは、前立腺癌、胃癌、膵臓癌、肺癌、卵巣癌および大腸癌を含む他の多くのがんにおいても存在し、並びに容易に免疫系と関与しない正常分泌組織腔表面上にはほとんど発現しないことが示された（Ragupathi G, et al. (1997) Angew Chem Int Ed 36:125-128.）。また、乳癌患者の血清に高レベルの抗Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体が含まれることが証明され（Gilewski T el al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:3270-3275; Huang C-Y, et al. (2006) Proc Natl Acad Sd USA 103:15-20; Wang C-C, et al. (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105(33):11661-11666）、Ｇｌｏｂｏ Ｈ陽性の腫瘍を有する患者は、Ｇｌｏｂｏ Ｈ陰性の腫瘍を有する患者と比較して、生存期間が短いことも示された(Chang, Y-J, et al. (2007) Proc Natl Acad Sci USA 104(25):10299-10304.)。これらの知見は、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、６糖類のエピトープ、魅力的な腫瘍マーカー、および実現可能ながんワクチンの開発のための標的を提供する。
【０００６】
Ｇｌｏｂｏ Ｈはさまざまな上皮がんにおいて過剰に発現するがん抗原である。この抗原は、がん免疫療法の標的として有効でありうることが示唆されている。Ｇｌｏｂｏ Ｈに対する抗体を産生させるためのワクチンが開発されてきたが、Ｇｌｏｂｏ Ｈの抗原性が低いため、これらワクチンの抗がん活性は満足できるものではなかった。高いレベルでＧｌｏｂｏ Ｈを標的とする免疫応答を生じさせることができる新規なワクチンが必要である。
【０００７】
幹細胞は、自己複製能並びに異なる細胞および組織へ分化能を有する細胞群として定義される（Reya T et al., (2001) Nature 414:105-111.）。悪性腫瘍および正常細胞の両方で不均一な細胞集団を含むように、がん幹細胞は、不均一な腫瘍成長および腫瘍の維持に重要な役割を果たしている可能性がある。がん幹細胞は、脳腫瘍、乳癌、大腸癌、および前立腺癌などの多様な固形がんから同定されている。乳癌幹細胞（ＢＣＳＣ）は、乳癌のＣＤ２４−ＣＤ４４＋亜集団に存在することが、Al-HajjらによるＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへの異種移植における表現型の多様性を有する腫瘍の産生能に基づき、初めて示された（Al-Hajj M, et al., (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100:3983-3988）。ＣＤ２４−ＣＤ４４＋の表現型で表される乳癌患者のがん細胞の大部分は早期に骨髄中に広まることから（Balic M et al., (2006) Clin Cancer Res 12:5615-5621）、ＢＣＳＣには転移能があることが示唆される。成長能、分化能、転移能、および放射線抵抗性から、ＢＣＳＣは乳癌治療の主要は標的となっている（Tang C. et al., (2007) FASEB J. 21:1-9）。
【０００８】
乳癌において、Ｇｌｏｂｏ Ｈの発現は、腺管癌、小葉癌、および管状腺癌の６０％以上で観測されるが、非上皮性乳癌においては観測されない（Mariani-Constantini R et al., (1984) Am. J. Pathol. 115:47-56）。内腔境界の頂側膜上皮細胞における弱い発現を除き、正常細胞の免疫系に関与しないことが明らかな部位ではＧｌｏｂｏ Ｈは発現しない（Id.; Zhang S. et al., (1997) Int. J. Cancer 73:42-49）。
【０００９】
また、Ｇｌｏｂｏ Ｈは、乳癌幹細胞（ＢＣＳＣ）で発現する。フローサイトメトリーによって、Ｇｌｏｂｏ Ｈは乳癌検体において２５／４１（６１．０％）で発現することが明らかにされた。Ｇｌｏｂｏ Ｈは２５／２５の非ＢＣＳＣおよび８／４０のＢＣＳＣ（２０％）で発現された。Ｇｌｏｂｏ Ｈの６糖類の前駆体である胚発生段階特異抗原−３（ＳＳＥＡ−３）は、腫瘍の３１／４０で発現される。ＳＳＥＡ−３は２９／３１の非ＢＣＳＣおよび２５／４０のＢＣＳＣ（６２．５％）で発現される（Chang W-W. et al., (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105(33):11667-11672.）。
【００１０】
DanishefskyおよびLivingstonは、以前、さまざまながんに対するＧｌｏｂｏ Ｈ−ＫＬＦワクチン（Gilewski T el al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:3270-3275; Ragupathi G, et al. (1997) Angew Chem Int Ed 36:125-128; Kudryashov V, et al. (1998) Glycoconj J. 15:243-249; Slovin SF et al (1997) Proc Natl Acad Sci USA 96:5710-5715）、および７価ワクチン（それぞれＫＬＨと共役するＧＭ２、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、Ｔｎ、ＳＴｎ、ＴＦ、およびＴｎ−ＭＵＣｌを含有する；Sabbatini PJ et al (2007) Clin Cancer Res 13:4170-4177）を報告している。しかしながら、７価ワクチンを接種した患者は、７つの抗原のうち、ＧＭ２抗体およびＬｅｗｉｓ Ｙ抗体を除く５つの抗体が誘導されるのみである。ＧＭ２のように抗原が偏在的に発現されることよりも、Ｇｌｏｂｏ Ｈが正常分泌組織の最小レベルのみを有する腫瘍細胞で特別に発現されることは、ワクチン開発の標的として魅力的なものである。これらの研究において、Ｇｌｏｂｏ Ｈをオゾン分解、次いでＫＬＨキャリアタンパク質を用いた還元的アミノ化反応により、１つのタンパク質から約１５０の糖鎖ユニットが生成される（Ragupathi G, et al. (1997) Angew Chem lnt Ed 36:125-128.）。ＭＭＣＣＨリンカーを用いるさらなる精製により、約７２０：１の共役比で炭化水素が増加した（Wang S-K, et al. (2008). Proc Natl Acad Sci USA105:3690-3695.）。しかしながら、正確に複合糖質を特徴づけることは困難であった。また、免疫学的アジュバントＱＳ−２１と組み合わせた合成ワクチンは、前立腺癌および転移性乳癌患者の両方で主にＩｇＭ抗体を誘導し、ＩｇＧ抗体の量が少なくなった。フェーズ１の臨床試験において、ワクチン接種部位で一過性の局所皮膚反応を有する最小毒性も見られた（Gilewski T el al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:3270-3275; Ragupathi G, et al. (1997) Angew Chem lnt Ed 36:125-128; Slovin SF et al (1997) Proc Natl Acad Sci USA 96:5710-5715.）。いくつかの患者で観測された軽度のインフルエンザ様症状は、おそらくＱＳ−２１の副作用と関連がある。マレイミド修飾キャリアタンパク質ＫＬＨと共役する、前立腺癌および乳癌と関連がある糖鎖抗原――Ｇｌｏｂｏ−Ｈ、ＧＭ２、ＳＴｎ、ＴＦ、およびＴｎ−―含有５価ワクチンは、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ＩｇＭ力価よりも高いＩｇＧ力価を有する抗Ｇｌｏｂｏ−Ｈ血清を産生することが報告されている（Zhu J. et al. (2009) J. Am. Chem. Soc. 131(26):9298-9303）。
【００１１】
したがって、Ｇｌｏｂｏ Ｈと反応する抗体、特に高い力価のＩｇＧを増加させる代わりのキャリアおよびアジュバントの同定、並びに副作用が最小限であるワクチンの効果の向上が望まれている。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、ｐ−ニトロフェニルリンカーを通じて、ジフテリア毒素交差反応物質１９７（ＤＴ−ＣＲＭ１９７）（Ｔｈエピトープ）である免疫原性キャリアと化学的に共役した、Ｇｌｏｂｏ Ｈ（Ｂ細胞エピトープ）含有ワクチンに基づく糖鎖に関する。前記合成ワクチンは、糖脂質アジュバントと組み合わせて、ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＭ抗体を誘導し、乳癌モデルにおいて極めて優れた免疫原性を提供し、異種移植研究において腫瘍形成の遅延を示す。Ｇｌｏｂｏ Ｈ−ＤＴおよび糖脂質Ｃ３４によって誘導された抗体の糖鎖アレイ解析によって、前記抗体がＧｌｏｂｏ Ｈだけでなく、ＳＳＥＡ−３（Ｇｂ５）およびＳＳＥＡ−４（シアリルＧｂ５）糖鎖（これらはすべてのがん細胞およびがん幹細胞に対して特異的である）を認識することが示された。
【００１３】
本発明は、（ａ）Ｇｌｏｂｏ Ｈまたはその免疫原性フラグメントから本質的に構成され、リンカーを通じてキャリアタンパク質と共役する糖鎖、および（ｂ）樹状細胞上のＣＤ１ｄ分子と結合できる糖脂質を含むアジュバントを含み、この際、ＩｇＭアイソタイプ抗体と比較して、ＩｇＧアイソタイプ抗体を相対的に高いレベルで誘導する免疫応答を誘導する免疫原性組成物に関する。
【００１４】
いくつかの実施態様において、前記キャリアタンパク質はジフテリア毒素交差反応物質１９７（ＤＴ−ＣＲＭ１９７）である。いくつかの実施態様において、前記リンカーはｐ−ニトロフェニルリンカーである。
【００１５】
いくつかの実施態様において、前記アジュバントはα−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）の合成アナログである。いくつかの実施形態において、前記アジュバントはＣ３４であり、この際、Ｃ３４は下記構造を含む。
【００１６】
【化１】
【００１７】
いくつかの実施態様において、免疫応答は、好ましくはＩｇＧアイソタイプ抗体の産生を目的とする。いくつかの実施態様において、免疫原性組成物は、液性および細胞性免疫応答を誘導できる少なくとも１つのアジュバントを含む。
【００１８】
いくつかの実施態様において、免疫応答によって産生した抗体は、がん細胞またはがん幹細胞で発現する抗原を中和する。いくつかの実施形態において、前記免疫応答によって産生した抗体は、Ｇｂ４抗原、胚発生段階特異抗原−３（ＳＳＥＡ−３）、および胚発生段階特異抗原−４（ＳＳＥＡ−４）の少なくとも１つを中和する。いくつかの実施形態において、Ｇｂ４抗原、胚発生段階特異抗原−３（ＳＳＥＡ−３）、および胚発生段階特異抗原−４（ＳＳＥＡ−４）の少なくとも１つを中和する抗体は、ＩｇＭアイソタイプ抗体と比較して、ＩｇＧアイソタイプ抗体を相対的に高いレベルで含む。
【００１９】
本発明は、被験者の抗がん免疫応答を誘導できる免疫原性組成物を含むがんワクチンに関する。いくつかの実施態様において、前記がんワクチンは、乳癌、肺癌、肝癌、口腔癌、胃癌、大腸癌、上咽頭癌、皮膚癌、腎癌、脳腫瘍、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、および膀胱癌からなる群から選択されるがんの治療に適する。
【００２０】
いくつかの実施態様において、前記がん組織は、細胞表面にＧｌｏｂｏ Ｈ抗原を発現する。いくつかの実施態様において、前記Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗原は、乳房の腫瘍上皮細胞で発現する。
【００２１】
いくつかの実施形態において、前記がんワクチンは、Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗原、Ｇｂ４、胚発生段階特異抗原−３（ＳＳＥＡ−３）、および胚発生段階特異抗原−４（ＳＳＥＡ−４）の少なくとも１つを中和する。いくつかの実施態様において、前記抗原は、乳癌幹細胞で発現する。
【００２２】
本発明は、腫瘍成長の抑制を含み、（ａ）Ｇｌｏｂｏ Ｈまたはその免疫原性フラグメントから本質的に構成され、リンカーを通じてキャリアタンパク質と共役する糖鎖、および樹状細胞上のＣＤ１ｄ分子と結合できる糖脂質を含むアジュバントを含む免疫原性組成物を、必要に応じて被験者に投与すること、並びに（ｂ）ＩｇＭアイソタイプ抗体と比較して、ＩｇＧアイソタイプ抗体を相対的に高い量で誘導する免疫応答を誘導することを含む方法に関する。
【００２３】
前記方法のいくつかの実施形態において、前記リンカーはｐ−ニトロフェノールであり、前記キャリアタンパク質はジフテリア毒素交差反応物質１９７（ＤＴ−ＣＲＭ１９７）であり、および前記アジュバントはα−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）の合成アナログである。一実施形態において、前記アジュバントはＣ３４である。
【００２４】
前記方法のいくつかの実施形態において、前記免疫原性組成物はがんワクチンをさらに含み、さらにこの際、前記がんワクチンの有効量を用いる１またはそれ以上の治療法は、腫瘍成長を抑制する。いくつかの実施形態において、前記がんワクチンの投与によって腫瘍サイズが小さくなる。
【００２５】
前記方法のいくつかの実施形態において、免疫応答反応が、好ましくはＧｌｏｂｏ Ｈ抗原、Ｇｂ４、胚発生段階特異抗原−３（ＳＳＥＡ−３）、および胚発生段階特異抗原−４（ＳＳＥＡ−４）の少なくとも１つを中和するＩｇＧアイソタイプ抗体の産生を目的とする。いくつかの実施態様おいて、Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗原、胚発生段階特異抗原−３（ＳＳＥＡ−３）、および胚発生段階特異抗原−４（ＳＳＥＡ−４）の少なくとも１つが、乳癌幹細胞で発現する。いくつかの実施態様おいて、前記Ｇｌｏｂｏ Ｈは乳房の腫瘍上皮細胞で発現する。
【００２６】
本発明は、（ａ）Ｇｌｏｂｏ Ｈまたはその免疫原性フラグメントから本質的に構成され、リンカーを通じてキャリアタンパク質と共役する糖鎖、および樹状細胞上のＣＤ１ｄ分子と結合できる糖脂質を含むアジュバントを含み、この際、前記免疫原性組成物がＩｇＭアイソタイプ抗体と比較して、ＩｇＧアイソタイプ抗体を相対的に高いレベルで誘導する免疫応答を誘導する免疫原性組成物、並びに（ｂ）薬学的に許容される賦形剤を含むがんワクチンに関する。
【００２７】
いくつかの実施態様において、前記がんワクチンは、前記免疫原性組成物の前記リンカーがｐ−ニトロフェノールであり、前記キャリアタンパク質がジフテリア毒素交差反応物質１９７（ＤＴ−ＣＲＭ１９７）であり、および前記アジュバントがα−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）の合成アナログであることを含む。一実施形態において、前記アジュバントはＣ３４である。
【００２８】
いくつかの実施態様において、前記がんワクチンはがんの治療に用いられ、この際、前記がんワクチンの有効量を用いる１またはそれ以上の治療法は、腫瘍成長を抑制する。いくつかの実施形態において、前記がんワクチンの投与によって腫瘍サイズが小さくなる。いくつかの実施態様において、前記がんは、乳癌、肺癌、肝癌、口腔癌、胃癌、大腸癌、上咽頭癌、皮膚癌、腎癌、脳腫瘍、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、および膀胱癌からなる群から選択される。
【００２９】
本発明は、（ａ）Ｇｌｏｂｏ Ｈ関連糖鎖またはその免疫原性フラグメントから本質的に構成され、リンカーを通じてキャリアタンパク質と共役する糖鎖、および（ｂ）樹状細胞上のＣＤ１ｄ分子と結合できる糖脂質を含むアジュバントを含み、この際、前記Ｇｌｏｂｏ Ｈ関連糖鎖が、ＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４からなる群から選択され、ＩｇＭアイソタイプ抗体と比較して、ＩｇＧアイソタイプ抗体を相対的に高いレベルで誘導する免疫応答を誘導する免疫原性組成物に関する。前記キャリアタンパク質はジフテリア毒素交差反応物質１９７（ＤＴ−ＣＲＭ１９７）であり、前記アジュバントはα−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）の合成アナログであり、および前記リンカーはｐ−ニトロフェニルリンカーである。一実施形態において、前記アジュバントはＣ３４である。
【００３０】
本発明は、ｐ−ニトロフェニルリンカーを通じてジフテリア毒素交差反応物質１９７（ＤＴ−ＣＲＭ１９７）キャリアタンパク質と結合するＧｌｏｂｏ Ｈ、および樹状細胞上のＣＤ１ｄ分子と結合できる糖脂質を含むアジュバントを含む、乳癌幹細胞に対する治療剤に関する。前記治療剤のいくつかの実施形態において、前記アジュバントはＣ３４である。
【００３１】
本発明は、ｐ−ニトロフェニルリンカーを通じてジフテリア毒素交差反応物質１９７（ＤＴ−ＣＲＭ１９７）キャリアタンパク質と共役するＳＳＥＡ−３、および樹状細胞上のＣＤ１ｄ分子と結合できる糖脂質Ｃ３４を含むアジュバントを含む、乳癌幹細胞に対する治療剤に関する。
【００３２】
本発明は、ｐ−ニトロフェニルリンカーを通じてジフテリア毒素交差反応物質１９７（ＤＴ−ＣＲＭ１９７）キャリアタンパク質と共役するＳＳＥＡ−４を含む、乳癌幹細胞に対する治療剤に関する。いくつかの実施形態において、前記治療剤は、樹状細胞上のＣＤ１ｄ分子と結合できる糖脂質Ｃ３４を含むアジュバントをさらに含む。
【００３３】
被験者への本発明に係る治療剤の投与は、乳癌幹細胞（ＢＣＳＣ）で発現する抗原を認識する抗体の産生を誘導し、この際、前記抗原は、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４からなる群から選択される。本発明は、本発明に係る治療剤を投与することを含む、乳癌の治療方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、発明の開示のいくつかの実施態様をさらに説明するためのものであり、１またはそれ以上の図面は、本明細書中の特定の実施形態の発明の詳細な説明と組み合わせて参照されることにより、本発明がより理解されうる。特許または出願は、少なくとも１つのカラーの図面を含む。カラーの図面を有する本特許権または特許出願公報のコピーは、請求により有料で庁から提供されうる。
【図１】図１は、Ｇｌｏｂｏ Ｈおよび切断型誘導体の構造を示す。
【図２】図２Ａ〜２Ｃは、それぞれモノクローナル抗体ＶＫ９およびＭｂｒｌ（Ｇｌｏｂｏ Ｈとの特異的結合）、並びに抗ＳＳＥＡ−３の特異的結合を示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｂは、Ｇｌｏｂｏ Ｈ複合体およびα−ＧａｌＣｅｒを接種したマウスの血清学的応答を示す。３匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの群は、１μｇの合成複合糖質を２μｇの複合糖質とともに用いて／用いないで皮下投与で接種させた。マウス血清は、ＩｇＭ（図３Ａ）およびＩｇＧ（図３Ｂ）抗体分析用にそれぞれ１：６０および１：２４０でそれぞれ希釈した。Ｃｙ３−抗マウスＩｇＧまたはＩｇＭ二次抗体を、ＰＭＴ５００で５３２ｎｍにおける蛍光検出に用いた。前記データは、３匹のマウス±ＳＥＭの平均蛍光強度で示す。
【図４】図４は、α−ＧＡｌＣｅｒおよびアナログを示す。
【図５】図５は、共役Ｇｌｏｂｏ Ｈおよびα―ＧａｌＣｅｒ誘導体をワクチン接種されたマウスのＩｇＭレベルを示す。図に示されるように、マウス血清は第２および第３ワクチン接種後に収集および分析した。Ｃｙ３第２抗−マウスＩｇＭは、ＰＭＴ４００、５３２ｎｍの条件で検出した。その結果を、３匹のマウス±ＳＥＭの平均蛍光強度で示す。
【図６】図６は、ワクチン接種後のマウスポリクローナル抗体（抗Ｇｌｏｂｏ Ｈ、抗Ｇｂ５、抗ＳＳＥＡ−４、および抗Ｇｂ４）の反応特異性を示す。マウス血清は、２μｇのアジュバントとともに用いて／用いないで、１．６μｇのＧＨ−ＤＴの第３のワクチン接種２週間後に得た（メス、Ｂａｌｂ／ｃ、筋肉注射）。前記ＩｇＧ力価は、糖鎖マイクロアレイで分析し、ＰＭＴ４００で、１０００（バッククラウンドの１０倍）以上のＭＦＩの最大希釈収率で定義した。各スポットは、マウスごとの力価を示す。
【図７】図７は、異なるアジュバントを用いた場合のＩｇＧ抗体対ＩｇＭ抗体の抗体力価を示す。
【図８】図８は、ＧＨ−ＫＬＨワクチンのアジュバント活性評価を示す。メスＢａｌｂ／ｃマウスに筋肉注射で１．６μｇのＧＨ−ＫＬＨおよび２μｇのアジュバントをワクチン接種し、ワクチン接種後、２週間ごとに採血した。前記血清を希釈し、マイクロアレイ分析した。
【図９】図９は、免疫付与後の抗体アイソタイプ特性を示す。マウスを上述のようにワクチン接種した。血清（１：６０で希釈）は、マイクロアレイ抗体サブクラス分析した（５３２ｎｍ、ＰＭＴ３００）。前記データは、３匹のマウス±ＳＥＭの平均蛍光強度で示す。
【図１０】図１０は、糖脂質アジュバントと異なる種類のＳＳＥＡ−３−ＤＴまたはＳＳＥＡ−４−ＤＴによって生じるＩｇＭ抗体対ＩｇＧ抗体の抗体力価を示す。
【図１１】図１１は、細胞表面の２４の糖鎖構造を示す。
【図１２Ａ】図１２Ａは、異なるワクチンで誘導されるＩｇＧの交差反応性実験を示す。図１２Ａ：Ｇｌｏｂｏ Ｈ−ＤＴおよびＣ１アジュバントによって誘導された抗Ｇｌｏｂｏ Ｈ ＩｇＧ。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、異なるワクチンで誘導されるＩｇＧの交差反応性実験を示す。図１２Ｂ：Ｇｂ５−ＤＴおよびＣ１アジュバントによって誘導された抗Ｇｂ５ ＩｇＧ。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、異なるワクチンで誘導されるＩｇＧの交差反応性実験を示す。図１２Ｃ：ＳＳＥＡ−４−ＤＴおよびＣ１アジュバントによって誘導された抗ＳＳＥＡ−４ ＩｇＧ。
【図１３】図１３は、マウス異種移植モデルを示す。２×１０５の４Ｔ１マウス転移性乳癌細胞を無菌ＰＢＳおよび調製し、ワクチン接種を受けたＢａｌｂ／ｃマウスに皮下投与した。マウスの腫瘍サイズはノギスで測定し、（長さ×高さ×幅）／２（ｍｍ３）で定義した。
【図１４】図１４は、Ｇｌｏｂｏ Ｈハーフエステルおよび複合糖質の合成スキームを示す。
【図１５】図１５は、原発性乳癌幹細胞におけるＳＳＥＡ−４発現のフローサイトメトリー分析を示す。ＢＣＳＣおよび非ＢＣＳＣ表面のＳＳＥＡ−４の発現は、４色の免疫蛍光染色、続くフローサイトメトリー分析によって評価した。左のパネルに示されるように、ＢＣＳＣは、ＣＤ４５−／ＣＤ２４−／ＣＤ４４＋細胞として定義し、非ＢＣＳＣは、その他のＣＤ４５−細胞集団として定義した。ＢＣＳＣおよび非ＢＣＳＣの目的の抗原の発現は、それぞれ中央および右のパネルに示されている。点線はアイソタイプの対照群を示し、数値は陽性細胞の割合を示す。
【図１６】図１６は、正常組織におけるＳＳＥＡ−４の発現の制限を示す。正常組織配列の免疫組織化学的染色により、乳房、小腸、および直腸のＳＳＥＡ−４の発現が分析された。ＳＳＥＡ−４のポジティブ染色では、頂側膜上皮細胞に制限される。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明は、ＤＴ−ＣＲＭ１９７が数十年間ジフテリアに対するワクチンとしてヒトに広く用いられてきただけでなく、高い免疫原性を有するため、Ｇｌｏｂｏ ＨおよびＳＳＥＡ−４のキャリアタンパク質に有用であるという驚くべき知見に関するものである。最も重要なことは、さまざまな複合糖質ワクチンが、ＦＤＡに承認されていることである。ジフテリア毒素交差反応物質１９７（ＤＴ−ＣＲＭ１９７）は、ＤＴの非毒性突然変異体であり、前記ＤＴは、正常分子の免疫原性と、ヘパリン結合性上皮成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）との結合能を共有する。ＤＴに対する特異的な細胞膜受容体は、しばしばがんで過剰発現する（Buzzi S. et al., Cancer Immunology, Immunotherapy (2004), 53(11):1041-1048）。
【００３６】
アジュバントとしてＣ３４を用いると、ＧＨ−ＤＴおよびＳＳＥＡ−４−ＤＴの両方が腫瘍抗原に対するＩｇＧ抗体をＩｇＭ抗体よりも多く誘導する免疫応答を最も効果的に示す。Ｃ３４と組み合わせたＧＨ−ＤＴは、Ｇｌｏｂｏ Ｈだけでなく、ＳＳＥＡ−３（Ｇｂ５）およびＳＳＥＡ−４をも中和する抗体を誘導し、この際、前記Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４は、乳癌細胞およびがん幹細胞に特異的である。
【００３７】
さらに、糖鎖マイクロアレイの開示は、抗体特異性試験について強力な基礎となり、ワクチン試験のための患者の同定および免疫付与後の免疫応答のモニタリングに有用である。
【００３８】
下記発明の詳細な説明において、実施されうる特定の実施形態を説明する方法として示される一部を形成する図面とともに説明する。これらの実施形態は、当業者が本発明を実施できるように詳細に記載され、その他の実施形態も実施可能であることが理解され、並びに本発明の技術的思想を逸脱することなく、その構造的、論理的、および電気的変更がされうる。したがって、下記実施形態の説明は、狭義に限定されるものではなく、本発明の技術的範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義される。
【００３９】
別途定義がない限り、すべての技術的および化学的用語は、本発明が属する分野における当業者に共通に理解されるものとして、同様の意味を有するものが使用されている。本明細書中に記載されたものと同等または等価の方法および物質は本発明の実施または試験に用いられうるが、好ましい方法および方法および物質が説明される。本明細書中で具体的に言及したすべての刊行物および特許文献は、本発明と関連して用いられうる刊行物に記載された、化学物質、細胞株、ベクター、動物、装置、統計的分析、および手法を含むすべての目的において参照により組み込まれる。本明細書中で引用したすべての刊行物は、当該技術分野における技能レベルの指標としてみなされる。本明細書の記載事項はいずれも、本発明が先発明についての開示に先行するものではないとの自認として解釈されるべきではない。
【００４０】
本発明に係る物質および方法を記載する前に、本発明は、記載される特定の方法、プロトコル、物質、および試薬に限定されず、多様なものでありうることが理解される。また、本明細書中で用いられる専門用語は、特定の実施形態を示すことのみを目的としているだけであり、本発明の技術的範囲を制限するものではない（添付の特許請求の範囲によってのみ制限される）ことが理解される。
【００４１】
定義
本明細書および添付の特許請求の範囲に用いられる、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、別に明確な記載が本文中にない限り、複数の引用を含むものであることに留意しなければならない。同様に、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１またはそれ以上」、および「少なくとも１つ」は、本明細書中で交互に用いられうる。また、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」、および「ｈａｖｉｎｇ」も交互に用いられうることに留意する。
【００４２】
本発明の実施は、別に規定がない限り、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学における当該技術分野の技術の範囲内の従来技術が利用されうる。当該技術は、文献において十分に説明される。例えば、Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, VoIs. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Antibodies: A Laboratory Manual, by Harlow and Lane s (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988); およびHandbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986)を参照。
【００４３】
本明細書中で用いられる用語「脂質」は、細胞シグナル経路に関与する任意の脂溶性（lipophilic）分子を意味する。
【００４４】
本明細書中で用いられる用語「糖脂質」は、細胞認識の標識としての機能を有する、脂質が結合した糖を意味する。
【００４５】
本明細書中で用いられる用語「アルファ−ガラクトシルセラミド」および「α−ＧａｌＣｅｒ」は、ナチュラルキラーＴ細胞を刺激してヘルパーＴ（ＴＨ）１およびＴＨ２サイトカインをともに産生する糖脂質を意味する。本明細書中で用いられる前記糖脂質誘導体Ｃ３４は、下記の構造を有する。
【００４６】
【化２】
【００４７】
本発明に係る前記α−ＧａｌＣｅｒアナログは、細胞起源のα−ＧａｌＣｅｒアナログ（グループＩ：Ｃ２、Ｃ３、およびＣ１４）、スルホン化により修飾されたα−ＧａｌＣｅｒアナログ（グループＩＩ：Ｃ４、Ｃ５、およびＣ９）、フェニルアルキル鎖のα−ＧａｌＣｅｒアナログ（グループＩＩＩ：Ｃ６−Ｃ８、Ｃ１０−Ｃ１１、Ｃ１５−Ｃ１６、Ｃ１８−Ｃ３４、Ｃ８−５、およびＣ８−６）、およびα−ＧａｌＣｅｒアナログが切断されたフィトスフィンゴシンを含む。Ｃ３４および他のアルファ−ガラクトシルセラミドアナログの構造、並びにそのアジュバントとしての用途は、その詳細が２００８年４月１４日に出願された、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６０２７５に開示されている。
【００４８】
Ｃ３４を含む合成α−ＧａｌＣｅｒアナログは、ＣＤ１ｄ分子と複合体を形成できる。合成α−ＧａｌＣｅｒアナログは、ＮＫＴのＴ細胞受容体に認識されうる。合成α−ＧａｌＣｅｒアナログは、ＴＨ１型応答、ＴＨ２型応答、もしくはＴＨ１型応答、およびＴＨ２型応答を起こしうる。前記α−ＧａｌＣｅｒアナログは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＮＫＴを活性化させうる。前記α−ＧａｌＣｅｒアナログは、ｉｎ ｖｉｖｏでＮＫＴを活性化させうる。
【００４９】
本明細書中で用いられる用語「糖鎖（glycan）」は、多糖またはオリゴ糖を意味する。本明細書中で用いられる糖鎖はまた、糖タンパク質、糖脂質、糖ペプチド、糖プロテオーム、ペプチドグリカン、リポ多糖、またはプロテオグリカンなどの複合糖質の糖質部分を意味する。糖鎖は、通常、単糖間における単一のＯ−グリコシド結合からなる。例えば、セルロースは、β―１，４結合したＤ−グルコースから構成される糖鎖（より具体的には、グルカン）であり、キチンは、β―１，４結合したＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンから構成される糖鎖である。糖鎖は、単糖残基のホモまたはヘテロ重合体であり、直鎖または分岐鎖でありうる。糖鎖は、糖タンバク質およびプロテオグリカンなどのタンパク質に結合して存在しうる。前記糖鎖は、一般的に、細胞の外面上に見られる。Ｏ−およびＮ−結合糖鎖は、真核生物において非常によく見られ、原核生物においても少数であるが見られうる。Ｎ−結合糖鎖は、シークオン配列におけるアスパラギンのＲ基の窒素（Ｎ）に結合して存在する。前記シークオンは、Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ配列であり、この際、Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸である。
【００５０】
本明細書中で用いられる用語「糖タンパク質」は、糖鎖を共有結合で修飾させたタンパク質を意味する。前記糖タンパク質には、下記４つのタイプがある：（１）Ｎ−結合糖タンパク質、（２）Ｏ−結合糖タンパク質（ムチン）、（３）グルコサミノグリカン（ＧＡＧ、プロテオグリカンとも呼ばれる）、（４）ＧＰＩアンカー。大抵の糖タンパク質は、構造的な微小不均一性（同一のグリコシル化部位に複数の異なる糖鎖構造が結合する）、および構造的な巨大不均一性（複数の部位および複数の糖鎖タイプの結合）を有する。
【００５１】
本明細書中で用いられる用語「抗原」は、免疫応答を起こすことができる任意の基質と定義される。
【００５２】
本明細書中で用いられる用語「免疫原」は、抗原またはＤＮＡワクチンのような抗原の産生を誘導できる基質を意味する。
【００５３】
本明細書中で用いられる用語「免疫原性」は、免疫応答を刺激する免疫原、抗原、またはワクチンの活性を意味する。
【００５４】
本明細書中で用いられる用語「免疫療法」は、予防目的／治療目的を達成するための、免疫応答を調節する概念に基づく多くの治療戦略を意味する。
【００５５】
本明細書中で用いられる用語「ＣＤ１ｄ」は、さまざまなヒト抗原提示細胞の表面に発現するタンパク質のＣＤ１（分化１群）ファミリーのメンバーを意味する。ＣＤ１ｄは脂質抗原活性ナチュラルキラーＴ細胞に提示される。ＣＤ１ｄは、糖脂質抗原結合中に深抗原結合溝を有する。樹状細胞上に発現するＣＤ１ｄ分子は、Ｃ３４等のα−ＧａｌＣｅｒアナログを含む糖脂質に結合して存在している。
【００５６】
本明細書中で用いられる用語「適応免疫系」は、高度に専門化された、全身性の細胞および病原性の抗原を除去する経路を意味する。前記適応免疫系の細胞は、白血球の一種であり、リンパ球と呼ばれている。Ｂ細胞およびＴ細胞は、リンパ球の主要な一例である。
【００５７】
本明細書中で用いられる用語「Ｔ細胞」および「Ｔｓ」は、細胞性免疫に主要な役割を果たす、リンパ球として知られている白血球群を意味する。Ｔ細胞は、細胞表面の存在するＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）と呼ばれる特有の受容体の存在によって、Ｂ細胞およびＮＫｓ等の他のリンパ球型と識別されうる。いくつかのＴ細胞のサブセットの相違は、それぞれ異なる機能を示す。ヘルパーＴ細胞（ＴＨ）は、適応免疫系の「仲介役」である。１度活性化されると、急速に分裂し、免疫応答を調節する、または「助ける」、サイトカインと呼ばれる低分子量タンパク質を分泌する。サイトカインのシグナルを受け取ることによって、これらの細胞は、異なるサイトカインを分泌するＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ１７、または他のサブセットの１つに分化する。
【００５８】
本明細書中で用いられる用語「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）は、細胞表面で主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）と複合体を形成する外部抗原を示す細胞を意味する。Ｔ細胞は、ＴＣＲによりこの複合体を認識しうる。ＡＰＣは、専門的または非専門的の２つのカテゴリーに分類される。樹状細胞（ＤＣ）は、専門的なカテゴリーに該当され、ＣＤ１と関連してＴ細胞に抗原提示能がある。典型的な実施において、本開示の方法を用いたＤＣは、ある実施におけるリンパ、または別の実施における骨髄性骨髄前駆細胞から分化した、いくつかのＤＣサブセットでありうる。
【００５９】
本明細書中で用いられる用語「未感作細胞」は、未分化の免疫細胞、例えば、未だ特異的病原体を認識するように分化されていないＣＤ４Ｔ細胞を意味する。
【００６０】
本明細書中で用いられる用語「ナチュラルキラー細胞」は、ウイルスまたは細胞内病原体に対する自然宿主の防御に寄与するインターフェロンで活性化された、リンパ系細胞のクラスを意味する。
【００６１】
本明細書中で用いられる用語「ナチュラルキラーＴ細胞」は、通常のＴｓおよびＮＫｓをともに有する性質／受容体を持つ、Ｔ細胞のサブセットを意味する。これらの細胞の多くは、非多形性ＣＤ１ｄ分子、自己および外部脂質と結合する抗原提示細胞、並びに糖脂質を認識する。ＮＫｓのＴＣＲは、ＣＤ１ｄ分子によって提示された糖脂質抗原（シャペロン）を認識できる。ＮＫＴｓの主要な応答は、刺激後の急速なＩＬ−４、ＩＦＮ−γ、およびＩＬ−１０を含むサイトカインの分泌、並びにそれによって影響が及ぼされる多様な免疫応答および発病過程である。ＮＫＴｓは、均一集団または不均一集団でありうる。一つの典型的な実施において、前記集団は、ヒトおよびマウス骨髄、並びにヒト肝Ｔ細胞集団、例えば、さまざまなＴＣＲｓで発現し、多量のＩＬ−４およびＩＮＦ−γを生産しうる、ＣＤ１ｄ反応性非インバリアントＴ細胞を含む、「非インバリアントＮＫＴｓ」でありうる。ＣＤ１ｄ依存性ＮＫＴｓの最も知られたサブセットは、インバリエントＴＣＲ−アルファ（ＴＣＲ−α）鎖を発現する。これらは、Ｉ型またはインバリエントＮＫＴｓ（ｉＮＫＴｓ）と呼ばれる。これらの細胞は、ヒト（Ｖα２１ｉＮＫＴｓ）およびマウス（Ｖα１４ＮｉＫＴｓ）間で維持され、多くの免疫学的過程に関連がある。
【００６２】
本明細書中で用いられる用語「サイトカイン」は、前駆細胞が異なる特異的な細胞タイプとなることによって変化する、遺伝子発現に通常関与する免疫細胞の分化過程の影響によって、免疫応答の強度および持続を調節する、任意の多数の小さい分泌タンパク質を意味する。サイトカインは、推定される機能、分泌細胞、または作用標的に基づき、リンホカイン、インターロイキン、およびケモカインとさまざまな命名がなされている。例えば、いくつかの共通するインターロイキンは、限定されないが、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２、ＩＮＦ−γ、ＴＮＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−２１、およびＴＧＦ−βを含む。
【００６３】
本明細書中で用いられる用語「ケモカイン」は、リンパ球の可動および活性化の手段を与える感染部位から放出される、任意のさまざまな小さい遊走性のサイトカインを意味する。ケモカインは、白血球を感染部位に引き付ける。ケモカインは、ケモカインを４つのグループに分類できる保存システイン残基を有する。前記グループとその代表的なケモカインは、Ｃ−Ｃケモカイン（ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ１α、およびＭＩＰ−１β）、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン（ＩＬ−８）、Ｃケモカイン（リンホタクチン）、並びにＣＸＸＸＣケモカイン（フラクタルカイン）である。
【００６４】
本明細書中で用いられる用語「ＴＨ２型応答」は、サイトカイン、インターフェロン、ケモカインの特定のタイプが産生される等のサイトカイン発現のパターンを意味する。典型的なＴＨ２サイトカインは、限定されないが、ＩＬ−４．ＩＬ−５、ＩＬ−６、およびＩＬ−１０を含む。
【００６５】
本明細書中で用いられる用語「ＴＨ１型応答」は、サイトカイン、インターフェロン、ケモカインの特定のタイプが産生される等のサイトカイン発現のパターンを意味する。典型的なＴＨ１サイトカインは、限定されないが、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＧＭＣＳＦ、およびＴＮＦ−βを含む。
【００６６】
本明細書中で用いられる用語「ＴＨ１バイアス」は、免疫原性応答を意味し、この際、ＴＨ１サイトカインおよび／またはケモカインの産生は、ＴＨ２サイトカインおよび／またはケモカインの産生よりも大きく増加する。
【００６７】
本明細書中で用いられる用語「エピトープ」は、抗体またはＴ細胞レセプターの抗原結合部位と接触する抗原分子の一部として定義される。
【００６８】
本明細書中で用いられる用語「ワクチン」は、全病原微生物（死滅または弱毒化）またはタンパク質、ペプチド、または多糖などの微生物の成分からなる抗原、すなわち、微生物が引き起こす疾病に対する免疫を付与する抗原を含む製剤を意味する。ワクチン製剤は天然または組換えＤＮＡ技術によって合成もしくは誘導させたものでありうる。
【００６９】
本明細書中で用いられる用語「免疫学的アジュバント」は、免疫原とともに用いられる、免疫原に対する免疫応答を増強または改善する物質を意味する。本開示に係るα―ＧａｌＣｅｒアナログは、より強力にワクチンに応答するように、ワクチンを投与した患者の免疫系を刺激することによって、ワクチンの効果を改善または増強するための、免疫学的アジュバントとして用いられる。一つの典型的な実施において、Ｃ３４アナログはアジュバントとして用いられる。
【００７０】
本明細書中で用いられる用語「ミョウバンアジュバント」は、免疫アジュバント活性を有するアルミニウム塩を意味する。この物質は、溶液中においてタンパク質抗原を吸収および沈殿させ、当該沈殿物は、接種部位において形成された貯蔵ワクチンから抗原の持続的な放出を促進することによって、ワクチンの免疫原性を向上する。
【００７１】
本明細書中で用いられる用語「抗がん免疫治療活性剤」は、腫瘍を阻害、減少および／または除去する、本開示に係るワクチンによって発生した抗体を意味する。
【００７２】
本明細書中で用いられる用語「抗原特異的」は、特定抗原の供給、または抗原フラグメントの供給、その結果生じる特異的細胞増殖のような細胞集団の性質を意味する。
【００７３】
本明細書中で用いられる用語「フローサイトメトリー」または「ＦＡＣＳ」は、流体の流れの中の懸濁化した粒子または細胞の物理的または化学的性質を、光学的または電子的検出装置を通して分析する技術を意味する。
【００７４】
後述するペプチド中のアミノ酸残基は、以下のように省略する：フェニルアラニンはＰｈｅまたはＦ；ロイシンはＬｅｕまたはＬ；イソロイシンはＩｌｅまたはＩ；メチオニンはＭｅｔまたはＭ；バリンはＶａｌまたはＶ；セリンはＳｅｒまたはＳ；プロリンはＰｒｏまたはＰ；トレオニンはＴｈｒまたはＴ；アラニンはＡｌａまたはＡ；チロシンはＴｙｒまたはＹ；ヒスチジンはＨｉｓまたはＨ；グルタミンはＧｌｎまたはＱ；アスパラギンはＡｓｎまたはＮ；リジンはＬｙｓまたはＫ；アスパラギン酸はＡｓｐまたはＤ；グルタミン酸はＧｌｕまたはＥ；システインはＣｙｓまたはＣ；トリプトファンはＴｒｐまたはＷ；アルギニンはＡｒｇまたはＲ；およびグリシンはＧｌｙまたはＧである。アミノ酸のさらなる記述に対しては、Proteins: Structure and Molecular Properties by Creighton, T. E., W. H. Freeman & Co., New York1983を参照。
【００７５】
本明細書中に開示される組成物は、本開示に接した当業者によって特定可能な追加の活性化剤、キャリア、ビヒクル、賦形剤、または助剤とともに含む、医薬組成物または栄養補助組成物を含みうる。
【００７６】
前記医薬組成物または栄養補助組成物は好ましくは、少なくとも１つの薬学的に許容されるキャリアを含む。このような医薬組成物において、本明細書中に開示された組成物は、「活性化合物」を形成し、「活性剤」として参照される。本明細書中で用いられる用語「薬学的に許容されるキャリア」は、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などの、投与薬剤と相溶性が高いものを含む。補足的な活性化合物も組成物中に組み込まれうる。医薬組成物は、目的とする投与経路に適するように製剤化される。投与経路の例として、例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与などの非経口投与、経口投与（例えば、吸入投与）、経皮投与（局所投与）、経粘膜投与、および直腸投与を含む。非経口投与、皮内投与、または皮下投与に適用するために用いられる溶液または懸濁液は、以下の成分を含みうる：注射用蒸留水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒などの無菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤；エチレンジアミンテトラ酢酸等のキレート剤；酢酸、クエン酸、またはリン酸等の緩衝剤；および塩化ナトリウムまたはＤグルコース等の等張化剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムの等の酸または塩基を用いて調製されうる。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチックで製造されたアンプル、使い捨てシリンジ、または多用量バイアルに封入されうる。
【００７７】
本明細書中で用いられる被験者は、ヒトおよびヒト以外の霊長類（例えば、ゴリラ、マカク、マーモセット）、家畜動物（例えば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、およびブタ）、ペット（例えば、犬、猫）、実験室試験の動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター）、捕獲野生動物（例えば、キツネ、シカ）、並びに本開示に係る抗原から恩恵を受けうる他の任意の動物を意味する。本開示の抗原から恩恵を受けうる動物のタイプには制限はない。ヒトであるかヒト以外の生物であるかにかかわらず、被験者を患者、個体、動物、宿主、またはレシピエントと称することがある。
【００７８】
注射の用途に好適な医薬組成物は、無菌水溶液（水溶性）、または無菌注射剤または無菌分散剤の即時調製用の分散剤および無菌粉末を含む。静脈内投与に好適なキャリアは、生理食塩水、静菌水溶液、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（BASF, Parsippany, N.J.社）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。すべての場合において、前記組成物は、無菌および容易に注射可能できる程度の溶液でなければならない。また、製造および保存の状態で安定であり、細菌および真菌などの微生物の汚染の作用から保護されなければならない。前記キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの安定な混合物を含む溶媒または分散媒でありうる。好適な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティング剤の使用によって、分散剤の場合には必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持されうる。微生物の作用は、さまざまな抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールアスコルビン酸、チメロサールなどによって防止されうる。多くの場合において、等張化剤、例えば、糖、またはマンニトール、ソルビトール、もしくは塩化ナトリウムなどのポリアルコールを組成物中に含むことが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、組成物中に吸収を遅延させる添加剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含ませることによって実現されうる。
【００７９】
無菌注射剤は、必要に応じて上記列挙された成分の１または組み合わせを含む好適な溶媒に、必要量の活性化合物を添加し、次いでろ過滅菌することによって調製されうる。通常、分散剤は、基礎分散媒体および上記列挙された他の必要な成分を含む無菌ビヒクル中に活性化合物を組み込むことによって調製される。無菌注射剤を調製するための無菌粉末の場合には、調製方法は真空乾燥および凍結乾燥を含み、あらかじめ無菌ろ過した溶液から活性成分に任意の必要な追加の成分を加えた活性成分の粉末が得られる。
【００８０】
経口用組成物は、通常、不活性希釈剤または食用キャリアを含む。治療的経口投与を目的として、活性化合物は、賦形剤に混和され、錠剤、トローチ剤、または、ゼラチンカプセルのようなカプセル剤の形態で使用される。経口用組成物はまた、口内洗浄液として使用するために、分散媒を用いて調製されうる。薬学的に混和可能な結合剤、またはアジュバント物質は、組成物の一部として含みうる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは任意の下記の成分、または同等の性質の化合物を含みうる：微結晶性セルロース、トラガカントゴム、またはゼラチンなどの結合剤；デンプン、乳糖などの賦形剤;アルギン酸、プリモゲル、もしくはコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはステロテス（sterotes）などの滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；スクロースもしくはサッカリンなどの嬌味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ芳香剤などの芳香剤。
【００８１】
吸入投与に対しては、化合物は、好適な推進剤、例えば二酸化炭素などの気体、または噴射器を含む加圧容器またはディスペンサーから、エアロゾルの形態で供給される。
【００８２】
また、全身投与は、経粘膜投与または経皮投与でありうる。経粘膜投与または経皮投与に対しては、バリアを通過するのに好適な浸透剤が製剤において使用される。このような浸透剤は当該技術分野において周知であり、例えば、経粘膜投与においては、洗浄剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は鼻腔用スプレーまたは坐剤の使用によって行われうる。経皮投与においては、活性化合物は、当該技術分野において周知の軟膏剤、ゲル化剤、またはクリーム剤に製剤化される。化合物はまた、直腸への供給のため、坐剤（例えば、ココアバターおよび他のグリセリン坐剤などの従来の坐剤の基材を含む）または停留かん腸の形態で調製されうる。
【００８３】
実施によると、活性化合物はキャリアを含んで調製され、植え込み型送達システムおよびマイクロカプセル型送達システムを含む、放出制御製剤などの体内からの迅速な除去を防ぐ。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルト酸エステル、およびポリ乳酸などの生分解性、生体適合ポリマーが用いられうる。製剤化などの調製方法は、当業者にとって明らかでありうる。また、原料はアルザコーポレーションおよびノバファーマシューティカルズ社の市販品から得られうる。リポソーム懸濁化剤（モノクローナル抗体を用いた感染細胞への細胞特異抗原にターゲティングしたリポソームを含む）もまた、薬学的に許容されるキャリアとして使用されうる。これらは、当業者に公知の方法、例えば、本明細書に参照により組み込まれる、米国特許第４，５２２，８１１号明細書に記載された方法に従い調製されうる。
【００８４】
投与容易な用量単位形態および均一な用量とした経口組成物または非経口組成物に設計することが好ましい。本明細書中で用いられる用量単位形態は、治療される被験者に統一された用量として適する身体的に個別の単位を意味し、各単位は、必要とする薬学的キャリアと関連して、望みの治療効果が得られるように計算された活性化合物の所定量を含む。
【００８５】
化合物などの毒性および治療効果、例えばＬＤ５０（集団の５０％の致死量）およびＥＤ５０（集団の５０％の治療有効量）は、細胞培養または動物実験における標準的な手順によって決定されうる。毒性および治療の有効性の間の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表されうる。高い治療指数を示す化合物が調製される。有害副作用を示す化合物は用いられうるが、非感染細胞への損傷の可能性を最小限にするように、感染部位に対する化合物などの標的とする輸送システムをデザインするような注意を要し、これによって副作用が少なくなる。
【００８６】
細胞培養アッセイおよび動物実験により得られるデータは、ヒトにおける使用する用量の範囲の決定に用いられうる。化合物などの用量は、好ましくは、ＥＤ５０を含み、低毒性または非毒性の血中濃度の範囲内とする。用量は、用いられる剤形および利用する投与経路に応じて、前記範囲内で変化しうる。本開示に係る方法において使用される任意の化合物に対し、治療有効量は、始めは細胞培養アッセイから評価されうる。用量は、動物モデルにおいて、細胞培養で決定されるＩＣ５０（例えば、試験化合物の症状を最大抑制する半分の濃度）を含む、循環血漿濃度の範囲で決定されうる。このような情報は、ヒトにおける、より的確な有効量の決定に用いられうる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィによって測定されうる。
【００８７】
本明細書に定義されるように、活性化合物の治療有効量（例えば、有効量）は約０．００１〜１００ｇ／ｋｇ体重の範囲、または過度の実験なく、専門化によって明らかであり、理解されうる他の範囲でありうる。専門家は、被験者の有効な治療に必要とされる用量および時間について、特に限定されないが、病気または疾病の重症度、既往歴、被験者の全体的な健康状態および年齢、および他の症状を含む一定の要因が影響を及ぼすことを理解している。
【００８８】
他の実施態様によると、１またはそれ以上の一部のキットが、当業者によって想定され、本明細書中に開示される方法の少なくとも１つを実施するためのものである前記キットの一部は、２またはそれ以上の組成物を含み、前記組成物は、上述の方法の少なくとも１つに従い、本明細書中に開示された組成物の有効量を単独または組み合わせて含みうる。
【００８９】
前記キットはまた、場合によっては、活性化剤、生物学的反応の識別子、または本開示に接した当業者によって識別可能な他の化合物を含有する組成物を含む。前記キットはまた、少なくとも１つの本明細書中に開示された組成物の有効量または細胞株を含有する組成物を含む。使用されるキットの一部の前記組成物および細胞株は、当業者に理解される手順に従い、本明細書中に開示される少なくとも１つの方法を実施するために用いられうる。
【００９０】
本明細書中で用いられる用語「ポリペプチド」は、任意のアミノ酸残基の多量体またはポリマーを意味する。ポリペプチドは、２またはそれ以上のポリペプチド鎖から構成されうる。ポリペプチドは、タンパク質、ペプチド、およびオリゴペプチドを含む。ポリペプチドは直鎖または分岐鎖でありうる。ポリペプチドは、修飾アミノ酸残基、アミノ酸アナログ、または非天然アミノ酸残基を含み、非アミノ酸残基に組み込まれうる。天然または人工的な修飾、例えば、ジスルフィド結合、グリコシル化、脂質化、メチル化、アセチル化、リン酸化、または標識化合物への結合のような操作であるかを問わず、修飾されたアミノ酸ポリマーは、前記定義の範囲内である。
【００９１】
本明細書中で用いられる用語「特異的結合」は、結合対（例えば、抗体および抗原）間の相互作用を意味する。さまざまな例において、特異的結合は、約１０６モル／リットル、約１０７モル／リットル、もしくは約１０８モル／リットル、またはそれ以下の親和性定数で示されうる。
【００９２】
本発明に係るがんワクチン
本発明に係る一実施形態は、Ｇｌｏｂｏ Ｈまたはそのフラグメント（例えば、胚発生段階特異抗原−３（ＳＳＥＡ−３、Ｇｂ５としても知られている）またはＳＳＥＡ−４）のいずれか一方、およびアジュバントを含む免疫組成物を、必要に応じて被験者に投与するがんの治療方法である。標的のがんのタイプは、限定されないが、乳癌（ステージ１−４を含む）、肺癌（例えば、小細胞肺癌）、肝癌（例えば、肝細胞癌）、口腔癌、胃癌（Ｔ１−Ｔ４を含む）、大腸癌、鼻咽頭癌、皮膚癌、腎癌、脳腫瘍（例えば、星状細胞腫、多形性膠芽腫、および髄膜腫）、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、膀胱癌、および子宮内膜、横紋筋肉腫、骨肉腫、平滑筋肉腫、並びに消化管間質腫瘍を含む。
【００９３】
部位により分類されたがんは、口腔癌および咽頭癌（唇、舌、唾液腺、口腔底部、歯茎および他の口腔、鼻咽頭、扁桃腺、中咽頭、下咽頭、他の口腔／咽頭）；消化器癌（食道；胃；小腸；大腸および直腸；肛門、肛門管、および肛門直腸；肝臓；肝内胆管；胆嚢；他の胆管；膵臓；後腹膜；腹膜、網、および腸間膜；他の消化器）；呼吸器癌（鼻腔、中耳、および洞；喉頭；肺および気管支；胸膜；気管、縦隔、および他の呼吸器）；中皮腫の癌；骨および滑膜；心臓を含む軟組織；黒色腫および非上皮性皮膚癌を含む皮膚癌；カポジ肉腫および乳癌；女性生殖器系癌（子宮頸；子宮体；子宮、ＮＯＳ；卵巣；膣；外陰部；および他の女性生殖器）；男性生殖器系癌（前立腺；精巣；陰茎；および他の男性生殖器）；泌尿器系癌（膀胱；腎臓および腎盂；尿管；および他の泌尿器）；眼および眼窩の癌；脳および神経系癌（脳；および他の神経系癌）；内分泌系癌（甲状腺および胸腺を含む他の内分泌腺）；リンパ腫（ホジキン病および非ホジキンリンパ腫）、多発性骨髄腫、白血病（リンパ性白血病；骨髄性白血病；単球性白血病；および他の白血病）を含む。
【００９４】
本発明による癌ワクチンの好適な標的となりうる、組織型によって分類された他の癌は、限定されないが、腫瘍、悪性；癌、ＮＯＳ；癌、未分化、ＮＯＳ；巨細胞および紡錘細胞癌、ＮＯＳ；小細胞癌、ＮＯＳ；乳頭癌、ＮＯＳ；扁平上皮癌、ＮＯＳ；リンパ上皮癌；基底細胞癌、ＮＯＳ；毛母癌；移行上皮癌、ＮＯＳ；乳頭移行上皮癌；腺癌、ＮＯＳ；タストリノーマ、悪性；胆管癌：肝細胞癌、ＮＯＳ；肝細胞癌および胆管癌の合併；索状腺癌；腺様嚢胞癌；腺腫性ポリープにおける腺癌；腺癌、家族性大腸ポリポーシス;固形癌、ＮＯＳ；カルチノイド腫瘍、悪性；細気管支肺胞癌；乳頭腺癌、ＮＯＳ；嫌色素癌；好酸性癌；好酸性腺癌；好塩基性癌；透明細胞腺癌、ＮＯＳ；顆粒細胞癌；濾胞状腺癌、ＮＯＳ；乳頭腺癌および濾胞状腺癌；非被嚢性硬化性癌；副腎皮質細胞癌；類内膜癌；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳垢腺癌；粘膜表皮癌；嚢胞腺癌、ＮＯＳ；乳頭状嚢胞腺癌、ＮＯＳ；乳頭漿液性嚢胞腺；ムチン性嚢胞腺癌；粘液腺癌；印環細胞癌；浸潤性導管癌；髄様癌、ＮＯＳ；小葉癌；炎症性乳癌；パジェット病、乳房；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；腺癌ｗ／扁平上皮化生；胸腺腫、悪性；卵巣間質性腫瘍、悪性；卵胞膜細胞腫、悪性；顆粒膜細胞腫、悪性；セルトリ・間質細胞腫瘍、悪性；セルトリ細胞癌；ライディッヒ細胞腫、悪性；脂質細胞腫瘍、悪性；傍神経節腫、悪性；乳房外傍神経節腫、悪性；褐色細胞腫；グロームス腫瘍；悪性黒色腫、ＮＯＳ；メラニン欠乏性黒色腫；表在拡大型黒色腫；巨大色素性母斑における悪性黒色腫；類上皮細胞黒色腫；青色母斑、悪性；肉腫、悪性；線維肉腫、ＮＯＳ；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫、ＮＯＳ；平滑筋肉腫、ＮＯＳ；横紋筋肉腫、ＮＯＳ；胎児性横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質肉腫、ＮＯＳ；混合腫瘍、悪性、ＮＯＳ；ミュラー管混合腫瘍；腎芽細胞腫；肝芽腫；癌肉腫、ＮＯＳ；間葉腫、悪性；ブレンナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫、ＮＯＳ；中皮腫、悪性；未分化胚細胞腫；胚性癌腫、ＮＯＳ；奇形腫、悪性、ＮＯＳ；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛癌；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管周囲細胞腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫、ＮＯＳ；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫、ＮＯＳ；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉性軟骨肉腫；骨巨細胞腫；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍、悪性；エナメル上皮肉腫；エナメル上皮腫、悪性；エナメル上皮線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；神経膠腫、悪性；上衣腫、ＮＯＳ；星状細胞腫、ＮＯＳ；原形質性星状細胞腫；線維性星状細胞腫；星状芽細胞腫；膠芽細胞腫、ＮＯＳ；乏突起膠腫、ＮＯＳ；希突起グリオーマ；未分化神経外胚葉性腫瘍；小脳肉腫、ＮＯＳ；神経節芽細胞腫；神経芽細胞腫、ＮＯＳ；網膜芽腫、ＮＯＳ；嗅神経原性腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫、悪性；顆粒細胞腫、悪性；悪性リンパ腫、ＮＯＳ；ホジキン病、ＮＯＳ；ホジキン傍肉芽腫、ＮＯＳ；悪性リンパ腫、小リンパ球性；悪性リンパ腫、大細胞、びまん性；悪性リンパ腫、濾胞性、ＮＯＳ；菌状息肉腫；その他の特定の非ホジキンリンパ腫；悪性組織球増殖症；多発性骨髄腫；肥満細胞腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病、ＮＯＳ；リンパ性白血病、ＮＯＳ；形質細胞白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞性白血病；骨髄性白血病、ＮＯＳ；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病、ＮＯＳ；肥満細胞性白血病；巨核芽球性白血病；骨髄性肉腫；および有毛細胞白血病を含む。
【００９５】
本明細書中で用いられる用語「治療」は、がん、がんの症状、またはがんの素因の治療、治癒、緩和、軽減、変化、是正、改善、好転または影響を目的として、がん、がんの症状、またはがんの素因を有する被験者への１またはそれ以上の活性化剤を含む組成物の適用または投与を意味する。本明細書中で用いられる「有効量」は、被験者に治療効果を与えるのに必要な、１またはそれ以上の他の活性化剤を単独または組み合わせた、各活性化剤の量を意味する。有効量は、当業者に理解されるように、投与経路、用いる賦形剤、併用する他の活性化剤に応じて変化する。
【００９６】
上述の方法において用いられる免疫組成物は、Ｇｌｏｂｏ Ｈまたはそのフラグメントである糖鎖（例えば、糖部分を含む分子）およびアジュバントを含みうる。Ｇｌｏｂｏ Ｈは、６糖類のエピトープ（Fucα1→2Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glc）、および任意の非糖部分を含む糖鎖である。前記フラグメントは、６糖類のエピトープのフラグメント、および適用可能であれば非糖部分を含む糖鎖である。これらのオリゴ糖は、所定の方法によって調製されうる（Huang et al., Proc.Natl. Acad. Sci USA 103:15-20 (2006)を参照）。所望であれば、非糖部分と結合されうる。
【００９７】
米国特許出願第１２／４８５，５４６号は、（１）Ｇｌｏｂｏ Ｈの直接前駆体であるＳＳＥＡ−３が乳癌幹細胞において高レベルで発現し、乳癌治療に好適な標的として提供され、（２）α―ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）が、抗Ｇｌｏｂｏ Ｈおよび抗ＳＳＥＡ−３抗体の賛成を促進する有効なアジュバントであるという予想外の発見に基づくものである。
【００９８】
米国特許出願第１２／４８５，５４６号は、Ｇｌｏｂｏ Ｈまたはそのフラグメント（例えば、ＳＳＥＡ−３）、およびアジュバント（例えば、α−ＧａｌＣｅｒ）を含む免疫組成物を特徴とする。Ｇｌｏｂｏ Ｈまたはそのフラグメントは、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と共役しうる。被験者（例えば、ヒト）に投与した場合、この免疫組成物は、Ｇｌｏｂｏ Ｈまたはそのフラグメントを標的とした免疫応答（例えば、抗体産生）を引き起し、このためがん（例えば、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、および肺癌）の治療に有効である。
【００９９】
米国特許出願第１２／４８５，５４６号は、非ヒト哺乳動物（たとえば、マウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、またはウマ）に上述の免疫組成物を投与することによって、Ｇｌｏｂｏ Ｈまたはそのフラグメントに特異的な抗体を産生し、Ｇｌｏｂｏ Ｈまたはそのフラグメントと結合する抗体を哺乳動物から単離する方法に関する。
【０１００】
前記開示に記載されたＧｌｏｂｏ Ｈまたは他の糖鎖は、ＤＴ−ＣＲＭなどのタンパク質キャリアと共役している。Ｃ３４のようなアジュバントおよび任意の薬学的に許容されるキャリア（例えば、リン酸緩衝生理食塩水、または重炭酸塩溶液）にこれらを混合して、従来の方法により免疫組成物（例えば、ワクチン）を形成する。米国特許第４，６０１，９０３号明細書、４，５９９，２３１号明細書、および４，５９６，７９２号明細書を参照。前記組成物は、注射用として、溶液または懸濁液として調製され、前記キャリアは、投与方法および投与経路に基づき、および標準的な薬学の慣習に基づき選択される。好適な薬学的キャリアおよび希釈剤、並びに使用のための薬学的な必要な物は、レミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンスに記載されている。免疫組成物は、アジュバントとしてα−ＧａｌＣｅｒを含むことが好ましい。アジュバントの他の例は、限定されないが、コレラトキシン、大腸菌易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）、リポソーム、免疫刺激複合体（ＩＳＯＣＯＭ）、または免疫刺激配列オリゴデオキシヌクレオチドを含む。前記組成物はまた、ｉｎ ｖｉｖｏ供給を促進するポリマーを含みうる。Audran R. et al. Vaccine 21:1250-5, 2003；およびDenis-Mize et al. Cell Immunol., 225:12-20, 2003を参照。必要であれば、Ｇｌｏｂｏ Ｈまたはそのフラグメント中の糖部分に対する免疫応答を引き起こす組成物の能力を増強するために、さらに湿潤剤または乳化剤などの補助物質、またはｐＨ調整剤を含んでいてもよい。本明細書中に記載される免疫組成物は、非経口的に投与（例えば、静脈注射、皮下注射、または筋肉注射）されうる。また、坐剤および経口製剤を含む他の投与方法が好ましい場合もある。坐剤について、結合剤およびキャリアは、例えば、ポリアルケングリコールまたはトリグリセリドを含みうる。経口製剤は、例えば、サッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムなどの医薬品等級などの通常用いられる賦形剤を含みうる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤、または粉末剤の形態をとり、本明細書中に記載された免疫組成物の１０−９５％を含みうる。
【０１０１】
免疫組成物は製剤の調剤量と両立できる態様で、治療上、有効で、保護的で、かつ免疫原性の量で投与される。前記投与量は、治療する被験者の、例えば、個人の抗体産生能、および必要であれば細胞性免疫応答を誘導に依存する。投与を必要とする活性成分の正確な量は、医師の判断に依存する。しかしながら、好適な用量の範囲は、当業者によって容易に決定可能である。また、初回投与量および追加抗原投与量の好適な投与計画は変化するが、初回投与量、続く二回目投与量を含みうる。ワクチンの用量は、投与経路に依存し、宿主の大きさによって変化しうる。
【０１０２】
本発明に係る前記免疫組成物は、動物中の、がんの治療および診断に用いられうる抗体を産生するために用いられうる。動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、およびウマ）において、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、並びにそのフラグメントを作製する方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Harlow and Lane, (1988) Antibodies：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New Yorkを参照。用語「抗体」は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（一本鎖抗体）、およびｄＡｂ（抗体ドメイン；Ward, et. al. (1989) Nature, 341, 544）などの天然の免疫グロブリン分子、およびそのフラグメントを含む。
【０１０３】
Ｇｌｏｂｏ Ｈ−ＤＴ−ＣＲＭ１９７および関連ワクチン
Ｇｌｏｂｏ Ｈ（１）およびそのフラグメント２−１０は、本明細書中に記載される方法に従って合成される。共役タンパク質に関しては、図１４で示されるように、精製Ｇｌｏｂｏ Ｈハーフエステルをキャリアタンパク質とインキュベートさせる。
【０１０４】
前記Ｇｌｏｂｏ Ｈ−タンパク質共役体は、各キャリアタンパク質上のＧｌｏｂｏ Ｈ分子の数を決定するために、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析によって評価する。組み込まれたＧｌｏｂｏ Ｈの平均値を表１に示す。
【０１０５】
【表１】
【０１０６】
ａＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにおけるｍ／ｚピーク；Ｎ．Ｄ．：未決定；＊ＧＨ−ＫＬＨはＯｐｔｉｍｅｒ社から提供された
ＧＨ−ＫＬＨ共役体は、主により大きいサイズおよびＫＬＨのＬｙｓ残基数が多いという要因により、ＫＬＨのＧｌｏｂｏ Ｈ結合の最大数を示した。ｐ−ニトロフェニルリンカーを用いた同様のカップリング処理を、ウイルス膜に１００，０００以上のＬｙｓ残基を含む破傷風モザイクウイルスに適用した。しかしながら、４℃のリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７．２）中でのウイルスの反応性に対するウイルスの不安定性が、さらなる進展において大きな懸念であった。また、ＧＨ−ＢａＭＶ１６は、サイズが非常に大きいため、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析による検出が制限された。
【０１０７】
合成Ｇｌｏｂｏ Ｈおよび切断フラグメント（図１）は、還元末端にペンチルアミンリンカーで結合し、ＮＨＳがコートされたスライドガラス上に共有結合で固定された。１１個のオリゴ糖の９個が、マイクロアレイ上にプリントされるように選択された。それぞれのマイクロアレイスライドに、９個のＧｌｏｂｏ Ｈアナログ（ＳＳＥＡ−４、ＧＨ、Ｇｂ５、Ｇｂ４、Ｇｂ３、Ｇｂ２、ＢＢ４、ＢＢ３、およびＢＢ２）５０μＭをそれぞれ１２個ずつスポットした。
【０１０８】
マイクロアレイ上の炭化水素を検証するために、マウスモノクローナル抗体（ＧｌｏｂｏＨ用のＶＫ９およびＭｂｒｌ、並びに抗ＳＳＥＡ−３）を用いて、それぞれの二次抗体（ヤギ抗−マウスＩｇＧおよびＩｇＭ）を特異的結合の試験に用い、その結果を図２Ａ〜２Ｃに示す。前記データは、ＶＫ９およびＭｂｒｌの両方がＧｌｏｂｏ Ｈおよび４糖類であるＢＢ４の外面を認識し、ＭＢｒｌは、ＭＭ３もわずかに認識したことを示唆している。また、抗ＳＳＥＡ−３抗体は、交差反応を起こすことなく、特異的にＳＳＥＡ−３抗原（Ｇｂ５）を認識した。前記結果から、Ｇｌｏｂｏ Ｈマイクロアレイは、免疫付与されたマウスから得られるポリクローナル抗体の特異性および効力の分析に利用されうることを示している。
【０１０９】
すでに報告されているように、合成Ｇｌｏｂｏ Ｈワクチンおよび併用するＱＳ−２１を用いたマウスの免疫付与は、ヒト乳癌細胞に対する抗体を産生するが、マウス抗体は、いくつかの増強ワクチン接種の後であっても、主にＩｇＭである（Ragupathi G, et al. (1997) Angew Chem Int Ed 36:125-128）。
【０１１０】
マウスのグループに、糖脂質アジュバントであるα-ＧａｌＣｅｒ（Ｃ１）と共役した、または共役していない合成Ｇｌｏｂｏ Ｈを１μｇ皮下投与し、免疫付与した。その結果、ＩｇＭの誘導に最も有効な免疫原がＧＨ−ＫＬＨ、ＧＨ−ＤＨ、およびＧＨ−ＢＶ、次いでＧＨ−ＴＴ、ＧＨ−ＢＳＡであること（図３Ａに要約される）、並びにα−ＧａｌＣｅｒがＩｇＭ抗体を高いレベルに誘導する免疫応答を刺激できることが分かった。同様の傾向がマウスＩｇＧ抗体においても観測され（図３Ｂ）、ＩｇＧレベルはＩｇＭレベルよりも相対的に高かった。簡潔にいうと、合成複合糖質の炭化水素の密度がより低いにもかかわらず、ＧＨ−ＤＴは、ＧＨ−ＫＬＨと同様の免疫原性を示し、アジュバントであるα−ＧａｌＣｅｒは、免疫応答の増強を示した。
【０１１１】
α−ＧｌａＣｅｒは、ＧＨ−ＤＴに対するアジュバント効果を示したことから、Ｃ１よりもアジュバント活性の高い他の糖脂質を試験し、その結果を図４に示した。マウスのグループに、糖脂質を有する、または有さないＧＨ−ＤＴおよびＧＨ−ＢＶを用いて免疫付与した。血清を得て、糖鎖マイクロアレイ解析を行った。一般的に、マウス抗Ｇｌｏｂｏ Ｈ ＩｇＧ力価は、免疫付与が進行すると増強するが、ＩｇＭレベルは、ワクチン接種の時間にほとんど無関係である（図５）。ＧＨ−ＢＶをワクチン接種したグループのうち、糖脂質−ワクチン処理およびワクチンの単独処理の間で、ＩｇＭレベルに有意な差はなかった。前記結果は、糖脂質と一緒に用いたＧＨ−ＢＶは有効な免疫療法ではないことを示唆するが、弱い免疫原性は、ＢａＭＶが不安定であるという特徴によるものである可能性がある。それにもかかわらず、α−ＧａｌＣｅｒアナログ、特に７ＤＷ８−５は、ＧＨ−ＤＴとうまく協力して、マウスの免疫応答を誘導した。
【０１１２】
興味深いことに、マウスポリクローナルＩｇＧ抗体は、ＧＨ−ＤＴおよび様々な糖脂質アジュバントによって産生され、Ｇｌｏｂｏ Ｈを中和するだけでなく、Ｇｂ５、ＳＳＥＡ−４、およびＧｂ４と交差反応し、Ｃ３４は最も有効な糖脂質アジュバントであった（図６）。ＩｇＭよりも力価がより高いＩｇＧを誘導しうる新規ワクチン組成物を探索するために、Ｇｌｏｂｏ Ｈ−ＤＴ複合体および糖脂質Ｃ１もしくはＣ３４、市販のＡｌＰＯ４（リン酸アルミニウム）、またはＭＦ５９を試験した。
【０１１３】
驚くべきことに、糖脂質Ｃ３４を含むＧｌｏｂｏ Ｈ−ＤＴは、３回のワクチン投与後にほとんど独占的にＩｇＧ抗体を誘導する（図７）。要約すると、ＧＨ−ＤＴ複合体と組み合わせた新規糖脂質アジュバント７ＤＷ８−５は、抗Ｇｌｏｂｏ ＨのＩｇＧおよびＩｇＭの両方を増強することができ、ＧＨ−ＤＴと組み合わせた糖脂質アジュバントＣ３４は、ＩｇＭよりも抗体力価が高いＩｇＧを誘導しうる。これらは、Ｇｂ５抗原およびＳＳＥＡ−４抗原に対して異なる結合親和性を示し、ともに乳癌幹細胞の表面に発現する。
【０１１４】
Ｇｌｏｂｏ Ｈワクチンにおける異なる糖脂質アジュバントの効果をさらに比較するために、ＧＨ−ＫＬＨを有する７つのマウスのグループに免疫付与した。この結果、糖脂質
を含むマウスワクチンが、抗Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体を高いレベルで誘導することを示唆した（図８）。ＭＦ５９は、強力なアジュバントであるが、ＧＨ−ＫＬＨとは協力せずに、Ｇｌｏｂｏ Ｈに対する抗体を誘導した。ＡｌＰＯ４（リン酸アルミニウム）はまた、抗体の誘導に対して明らかな影響は示さなかった。一方、Ｃ３４とともに用いたＧＨ−ＫＬＨは、１回目および２回目ワクチン接種後において、優れた免疫原性を示したが、３回目ワクチン接種後は、Ｃ１と有意な差は見られなかった。全体として、これらの知見は、炭化水素ワクチンに対するアジュバントとして、新規な糖脂質誘導体の可能性を示唆するものである。
【０１１５】
細胞性および液性免疫応答の性質は、抗原および抗体の組み合わせだけでなく、キャリアおよび免疫付与の経路によって影響される。Sesardicおよび共同研究者が述べているように、毒性作用がない毒素変異体であるＤＴ−ＣＲＭ１９７が、抗原特異的Ｔ細胞増殖を誘導し、ＩＬ−２、ＩＮＦ−γ、およびＩＬ−６の脾細胞による産生を高めることが、Ｔｈ１を駆動する経路における役割であることを示唆している（Miyaji EN et al. (2001) Infect Immun 69:869-874; Godefroy S, et al. (2005) Infect Immun 73:4803-4809; Stickings P, et al. (2008) Infect Immun 76:1766-1773.）。サイトカインの特徴が主にＴｈ１であるという事実にもかかわらず、抗ＣＲＭ１９７抗体のサブクラスは、ＩｇＧ１であり、Ｔｈ１／Ｔｈ２の混合応答を示すＩｇＧ２ａを検出できない。これらの結果は、Ｇｌｏｂｏ Ｈワクチンの抗体アイソタイプの特性の評価を促進し、本研究が、糖脂質アジュバントと組み合わせたＧＨ−ＤＴまたはＧＨ−ＫＬＨが、微量のＩｇＧ２ａとともに、主としてＩｇＧ１抗体を誘導することを示した（図９）。
【０１１６】
糖脂質アジュバントを単独で静脈投与（ｉ．ｖ．）した場合、Ｔｈ１バイアスのサイトカイン分泌を増強するという事実にもかかわらず、抗体のクラススイッチ（ＩｇＧ２ａ）は観測されなかった。全体として、糖脂質は、細胞性および液性免疫応答を増強するという極めて重要な役割がある。
【０１１７】
Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４がんワクチン
ＤＴと共役したＳＳＥＡ−３（Ｇｂ５）およびＳＳＥＡ−４を合成し、試験した。３回目ワクチン接種の後、ＩｇＭおよびＩｇＧの抗体力価を比較し、ＳＳＥＡ−３−ＤＴおよびＳＳＥＡ−４−ＤＴが、ＩｇＭよりも高力価のＩｇＧを誘導することを見出した（図１０）。
【０１１８】
ＧＨ−ＤＴおよびＣ３４がＧｌｏｂｏ Ｈ、Ｇｂ５、およびＳＳＥＡ−４を認識する抗体を誘導するため、アジュバントの存在下、ＳＳＥＡ−３−ＤＴおよびＳＳＥＡ−４−ＤＴワクチンの特異性を、ＩｇＧの研究に集中して、２４個の糖鎖アレイを用いて試験した（図１１）。
【０１１９】
図１２Ａ〜１２Ｃに示すように、Ｇｌｏｂｏ ＨおよびＣ３４アジュバントで免疫付与されたマウスは、高い選択性でＧｌｏｂｏ Ｈ、Ｇｂ５、およびＳＳＥＡ−４を認識しうる抗体を誘導し、アジュバントＭＦ５９を有するＳＳＥＡ−３−ＤＴワクチンは低い選択性で高い免疫応答を誘導した。一方、アジュバントＣ３４と組み合わせたＳＳＥＡ−３−ＤＴは、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４に対する抗体のみ誘導した。
【０１２０】
興味深いことに、アジュバント存在下または非存在下、ＳＳＥＡ−４−ＤＴ（シアリル−Ｇｂ５）は、ＳＳＥＡ−４およびその切断構造（末端のラクトースが欠失したＳＳＥＡ−４）を特異的に認識するＩｇＧおよびＩｇＭ抗体を誘導した。理論に制約されることなく、シアル酸は免疫原性が高く、特異的免疫応答を高度に誘導すると仮定される。
【０１２１】
ＳＳＥＡ−３−ＤＴ−Ｃ３４を有するマウスの免疫付与は、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４と反応する抗体を誘導し、Ｇｌｏｂｏ Ｈワクチンが、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４を発現する腫瘍細胞および乳癌幹細胞の標的となりうることが示唆された。
【０１２２】
Ｇｌｏｂｏ Ｈ−ＤＴ−Ｃ３４を有するマウスの免疫付与は、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４と反応する抗体を誘導し、Ｇｌｏｂｏ Ｈワクチンが、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４を発現する腫瘍細胞および乳癌幹細胞の標的となりうることが示唆された。
【０１２３】
ＳＳＥＡ−４−ＤＴを有するマウスの免疫付与は、ＳＳＥＡ−４と反応する抗体を誘導し、ＳＳＥＡ−４−ＤＴワクチンが、ＳＳＥＡ−４を発現する腫瘍細胞および乳癌幹細胞の標的となりうることが示唆された。
【０１２４】
がんワクチンによる腫瘍サイズの縮小
合成複合糖質ワクチンの効果を直接評価するために、図１３に示すように、腫瘍サイズを１週間ごとに３回測定した。一般的に、Ｇｌｏｂｏ Ｈを有する乳癌細胞株に４Ｔ１を注入した後、腫瘍は２週間成長する。糖脂質アジュバントを有するワクチン接種したすべてのグループは、２４日間で、単独のＧＨ−ＤＴおよびＰＢＳのコントロールと比較して、相対的に腫瘍が小さいままであった。前記データは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＤＨ−ＤＴおよび糖脂質アジュバントを有するワクチンは、いくつかの腫瘍進行を遅延させることを示唆している。
【０１２５】
乳癌およびＢＣＳＣにおけるＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４の発現
ＢＣＳＣ中のＧｌｏｂｏ Ｈの発現は、非ＢＣＳＣよりも頻度が少ないが、乳癌およびＢＣＳＣにおいて、ＳＳＥＡ−３の発現はＧｌｏｂｏ Ｈの発現よりも頻度が高いことが示された（Chang W-W. et al., (2008) Proc Natl Acad Sci USA105(33):11667-11672、全体が参照により本明細書に組み込まれる。）。
【０１２６】
乳癌患者３５名のＳＳＥＡ−３またはＳＳＥＡ−４の発現範囲における臨床的特徴を評価し、表２に示した。平均年齢は４８歳であった（３１〜８２歳である）。これらのうち、１名がステージ０、１０名がステージＩ、１９名がステージＩＩ、および５名がステージＩＩＩであった。大部分の腫瘍試料は、５１．４％のＥＲ陽性および６７．５％の節転移陽性とともに、浸潤性管癌（８０．０％）の病変を有していた。表２において、ＳＳＥＡ−３またはＳＳＥＡ−４の発現の範囲は、総がん細胞中の陽性細胞の割合で表される。ＳＳＥＡ−３またはＳＳＥＡ−４発現と関連するＨＥＲ−２またはリンパ節転移の状態について統計分析が行われた。
ＨＥＲ−２の発現は、免疫組織化学的手法により決定された。腫瘍におけるＳＳＥＡ−３またはＳＳＥＡ−４の発現レベルと、ステージ（ＳＳＥＡ−４：Ｐ＝０．３４９８；ＳＳＥＡ−３：Ｐ＝０．９３１１）またはＨＥＲ−２（ＳＳＥＡ−４：Ｐ＝０．０１４２；ＳＳＥＡ−３：Ｐ＝０．０１２８）などの様々な臨床病変の要因との間に有意な相関はなかった（表２）。
【０１２７】
【表２】
【０１２８】
酵素消化によって被験者から単離された原発性腫瘍細胞を特異抗体で染色し、はじめにＣＤ４５、ＣＤ２４、ＣＤ４４、およびＣＤ４５＋細胞を白血球から除去した。ＢＣＳＣおよび非ＢＣＳＣ間のＳＳＥＡ−３またはＳＳＥＡ−４の発現を比較するために、表面マーカーの発現に基づき、ＣＤ４５−腫瘍細胞をさらにＢＣＳＣおよび非ＢＣＳＣに分離した。前記ＢＣＳＣをＣＤ４５−／ＣＤ２４−／ＣＤ４４＋と同定し、ＣＤ４５−集団は、非ＢＣＳＣであると推定された。
【０１２９】
この方法を用いて、ＢＣＳＣおよび非ＢＣＳＣ中のＳＳＥＡ−３またはＳＳＥＡ−４の発現を、３５の腫瘍試料で評価した。全体として、ＳＳＥＡ−４は腫瘍の３４／３５（９７．１％）で検出され、ＳＳＥＡ−３は２７／３５（７７．１％）で検出された（表３）。ＳＳＥＡ−４またはＳＳＥＡ３の発現は、フローサイトメトリーで決定した。ＢＣＳＣをＣＤ４５−ＣＤ２４−ＣＤ４４＋細胞として定義し、非ＢＣＳＣをＣＤ４５−細胞の残存集団として定義した。範囲は、総細胞中の陽性細胞の割合で計算した。
【０１３０】
表３を要約すると、２７／３５（７７．１％）のＳＳＥＡ−３を発現したサンプルのうち、陽性の割合は１．４％〜６６．４％の範囲であった。腫瘍の２７／３５から単離された非ＢＣＳＣは、陽性の割合が２４．３％〜７０．４％の範囲でＳＳＥＡ−３を発現した。相対的に、腫瘍の３５のうち２５のＢＣＳＣ（６５．７％）が、陽性の割合が５．０％〜５８．４％の範囲でＳＳＥＡ−３染色は陽性であった。
【０１３１】
ＳＳＥＡ−４を発現した３４／３５（９７．１％）のサンプルのうち、陽性細胞の割合は０．５％〜７７．１％の範囲であった。ＳＳＥＡ−４を発現した腫瘍の３２／３５から単離された非ＢＣＳＣは、陽性細胞の割合が２４．０％〜７８．１％の範囲であった。一方、ＳＳＥＡ−４の染色が陽性であった腫瘍の３５のうち３１のＢＣＳＣ（８８．６％）は、陽性細胞の割合が５．６％〜８３．６％の範囲であった。
【０１３２】
【表３】
【０１３３】
ＢＣＳＣにおけるＳＳＥＡ−４の発現
ＢＣＳＣおよび非ＢＣＳＣ間のＳＳＥＡ−４の発現を比較するために、表面マーカーの発現に基づき、ＣＤ４５−腫瘍細胞をさらにＢＣＳＣおよび非ＢＣＳＣに分離した。前記ＢＣＳＣをＣＤ４５−／ＣＤ２４−／ＣＤ４４＋と同定し、残りのＣＤ４５−集団は、非ＢＣＳＣであると推定された。図１５に示すように、これら２つの各集団内のＳＳＥＡ−４の発現は、腫瘍サンプル間で変化した。例えば、患者ＢＣ０２６４の腫瘍細胞から単離された総数の５．７％の割合を占めたＢＣＳＣは、ＳＳＥＡ−４に対して陰性であったが、６０．３％の割合を占めた非ＢＣＳＣは、ＳＳＥＡ−４を発現した。患者ＢＣ０２６６については、ＳＳＥＡ−４の発現は、非ＢＣＳＣの５９．４％，ＢＣＳＣの５５．７％で観測された。ＢＣ０３１３については、ＳＳＥＡ−４の発現は、非ＢＣＳＣの３２．４％，ＢＣＳＣの８３．６％で観測された。全体として、ＳＳＥＡ−４は、試験サンプルの３４／３５（９７．１％）、その陽性細胞の割合は０．５〜７７．１％の範囲で観測された（表３２）。
【０１３４】
正常細胞におけるＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４の発現
組織マイクロアレイを用いて、ＳＳＥＡ−４の発現について、異なる２０の臓器を免疫組織化学的染色により解析し、結果を表４に示す（Ｅ，上皮組織；Ｃ，結合組織）。
【０１３５】
【表４】
【０１３６】
ＳＳＥＡ−４は、乳房、大腸、消化管、腎、肺、卵巣、膵臓、大腸、胃、前立腺、胸腺、および子宮頸部などの、いくつかの腺組織の上皮細胞上で発現した（表４）。また、図１６に示すように、Ｇｌｏｂｏ ＨおよびＳＳＥＡ−３と同様の方法により（Chang W-W. et al., (2008) Proc Natl Acad Sci USA105(33):11667-11672）、ＳＳＥＡ−４の発現を、主として本質的に免疫応答に関与しない血清または上皮細胞の頂端表面に制限させた。
【０１３７】
比較すると、Ｇｌｏｂｏ Ｈは、乳房、消化管、膵臓、前立腺、および子宮頸部などのいくつかの腺組織の上皮細胞上で発現した。ＳＳＥＡ−３の分布は、正常乳房組織には存在せず、Ｇｌｏｂｏ Ｈ陰性であった腎、直腸、精巣、および胸腺に存在したことを除き、Ｇｌｏｂｏ Ｈと同様であった（Chang W-W. et al., (2008) Proc Natl Acad Sci USA105(33):11667-11672）。
【実施例】
【０１３８】
下記実施例は、本発明に係る好ましい実施形態の実施を含む。当業者にとっては当然のことであるが、本発明の実施において、以下の代表的な技術である実施例で十分に開示された技術は、発明者によって見出され、その実施に好ましい方法で構成されると考えられうる。しかしながら、当業者は、本開示を考慮すると、本発明の思想および技術的範囲を逸脱することなく、開示された特定の実施例において、多くの変形が構成され、類似または同様の結果が得られうる。
【０１３９】
一般的方法、物質、器具類
原料
市販の溶媒および試薬は、さらに精製することなくそのまま使用し、Sigma-Aldrich社、Acros社、Merck社、Echo chemical社、およびSenn Chemical社から購入した。モノクローナル抗体Ｍｂｒ１はALEXIS biochemicals社、Ｃｙ３共役抗マウスＩｇＧ（ＩｇＧ、ＩｇＧ１、およびＩｇＧ２ａ）およびＩｇＭ抗体はJackson Immuno Research社から購入した。ＤＴ−ＲＣＭ１９７タンパク質および破傷風トキソイドは、それぞれMerck社およびAdimmune社から購入した。リン酸アルミニウムゲルアジュバント（ＡｌＰＯ４）はBrenntag Biosector社から購入した。破傷風ウイルスおよびＶＫ９モノクローナル抗体は、それぞれLin博士およびYu博士の研究室で調製された。糖脂質誘導体は、合成およびWong博士の研究室から提供された。
【０１４０】
一般的方法
グリコシル化に用いられるモレキュラーシーブス（MS, AW-300）は、粉砕して使用前に活性化した。反応は、分析用のＴＬＣプレート（PLCシリカゲル-60, F254, 2mm, Merck社）で観測し、ＵＶ（254nm）またはｐ−アニスアルデヒドで視覚化させた。フラッシュカラムクロマトグラフィはシリカゲル（40-63μm）またはLiChroprep RP18（40-63μｍ）で行った。透析膜（セルロースエステル，MCCO=10,000）は、使用前にＨ２Ｏで洗浄した。
【０１４１】
器具類
プロトン核磁器共鳴（1H NMR）スペクトル、炭素核磁器共鳴（13H NMR）スペクトルは、Bruker Adbance 600 (600 MHz/150 MHz)ＮＭＲ分光装置で測定した。プロトンの化学シフトは、ｐｐｍで示し、テトラメチルシラン（δ＝０）を基準とした。カーボンの化学シフトも１００万分の１（ppm，δスケール）で示した。ＤＥＰＴ１３５（Distortion-less enhancement by polarization transfer）を用いて多重度を決定した。データを下記のように表す：化学シフト、多重度（s=１重項、d=２重項、t=３重項、q＝４重項、m=多重項、br=ブロード）、積分値、およびHzの結合定数（J）。高分解能質量スペクトルはBioTOF IIIにより、MALDI-TOF MSはUltraflex II TOF/TOF200により測定された。
【０１４２】
実施例１：異なるキャリアタンパク質と共役したＧｌｏｂｏ Ｈの合成
Ｇｌｏｂｏ Ｈ（１；図１１を参照）およびそのフラグメント２−１０は、プログラムで制御したワンポット戦略により合成した（Huang C-Y, et al. (2006) Proc Natl Acad Sci USA 103:15-20.）。１の反応は、無水ＤＭＦ中、室温で効率的同種二官能性リンカーを用いて行われた（Wu X, et al. (2004) Org Lett 6:4407-4410; Wu X, Bundle DR (2005) J Org Chem 70:7381-7388.）。前記反応は容易にＴＬＣで観測された。より大きいＲｆ値の生成物が生成し、遊離アミンが消失した時点で反応混合物を濃縮してＤＭＦを留去し、ジクロロメタンおよび水で洗浄して過剰量のリンカーを除去した。最後に、精製物を逆相（C18）カラムクロマトグラフィで精製し、１％の酢酸を含む水から含水４０％メタノールへと変更し、徐々に溶出させた。前記溶液を、凍結乾燥して淡黄色の生成物１２を得た。最終的に、タンパク質と共役するために、前記精製Ｇｌｏｂｏ Ｈハーフエステル１２（30-40 equiv）を個別のキャリアタンパク質とリン酸緩衝液（10mM，ｐH7.2）中、室温で２４時間インキュベートした（図１４）。重要なことは、リジン残基とＧｌｏｂｏ Ｈハーフエステルとのカップリングを最大化するために、タンパク質の濃度を〜５ｍｇ／ｍＬに調節しなければならないことである。２４時間後、複合糖質を希釈し、脱イオン水で透析して残ったｐ−ニトロフェニル基を除去した。次いで、前記溶液を凍結乾燥して白色粉末１３、１４、および１５を得た。
【０１４３】
前記Ｇｌｏｂｏ Ｈ−タンパク質共役体は、MALDI-TOF解析により各キャリアタンパク質上のＧｌｏｂｏ Ｈの数を決定した。前記組み込まれたＧｌｏｂｏ Ｈの数の平均値を上記の表１に記載されている。
【０１４４】
前記複合糖質１３、１４、および１５をｄｄＨ２Ｏに溶解し、最終濃度を約１ｐｍｏｌ／μＬとした。シナピン酸をマトリックスとして選択し、新たに調製したアセトニトリルおよび脱イオン水（1:1 v/v）と混合して、０．１％のＴＦＡを含む１０ｍｇ／ｍＬの濃度の最終マトリックスを調製した。各サンプルを線形の正イオンモードで検出し、ｍ／ｚスペクトルを得た。各複合糖質の分子量は、ｍ／ｚで決定した。複合糖質１４は、不均一性を示し、平均組み込みが２〜４を示した。ＧＨ−ＫＬＨ共役体は、主により大きいサイズおよびＫＬＨのより多いＬｙｓ残基のため、Ｇｌｏｂｏ Ｈの組み込みの最大値を示した。ｐ−ニトロフェニルリンカーを用いた同様のカップリング処理を、ウイルス膜に１００，０００以上のリジン残基を含む破傷風モザイクウイルスに適用した。しかしながら、４℃のリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７．２）中でのウイルスの反応性に対するウイルスの不安定性が、さらなる進展において大きな懸念であった。また、ＧＨ−ＢａＭＶ１６は、サイズが非常に大きいため、MALDI-TOF解析による検出が制限された。最終的に、凍結乾燥した複合糖質は、−３０℃で保存され、免疫付与前に滅菌水につけてもどされた。
【０１４５】
実施例２：糖鎖マイクロアレイの製造および検証
合成Ｇｌｏｂｏ Ｈおよび切断フラグメント（図１）は、還元末端にペンチルアミンリンカーで結合し、ＮＨＳがコートされたスライドガラス上に共有結合で固定された。１１個のオリゴ糖の９個が、マイクロアレイ上にプリントされるように選択された。一連のオリゴ糖の濃度（1, 5, 10, 20, 40, 50, 80, 100 μM）で結合親和性および蛍光強度を最適化するための試験を行った。それぞれのマイクロアレイスライドに、９個のＧｌｏｂｏ Ｈアナログ（SSEA-4、GH、Gb5、Gb4、Gb3、Gb2、BB4、BB3、およびBB2）５０μＭをそれぞれ１２個ずつスポットした。湿度８０％における反応後、使用前に前記スライドをデシケータ中、室温で保存した。
【０１４６】
マイクロアレイ上の炭化水素を検証するために、マウスモノクローナル抗体（Ｇｌｏｂｏ Ｈ用のＶＫ９およびＭｂｒｌ、並びに抗ＳＳＥＡ−３）を用いて、それぞれの二次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧおよびＩｇＭ）を特異的結合の試験に用い、その結果を図２Ａ〜２Ｃに示す。前記データは、ＶＫ９およびＭｂｒｌの両方がＧｌｏｂｏ Ｈおよび４糖類であるＢＢ４の外面を認識し、ＭＢｒｌは、ＭＭ３もわずかに認識したことを示唆している（Gilewski T el al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:3270-3275; Huang C-Y, et al. (2006) Proc Natl Acad Sci USA103:15-20.）。また、抗ＳＳＥＡ−３抗体は、交差反応を起こすことなく、特異的にＳＳＥＡ−３抗原（Ｇｂ５）を認識した。前記結果から、Ｇｌｏｂｏ Ｈマイクロアレイは、免疫付与されたマウスから得られるポリクローナル抗体の特異性および効力の分析に利用されうることを示している。
【０１４７】
実施例３：マウスへの免疫付与
本実験において、マウスのグループに、糖脂質アジュバントであるα-ＧａｌＣｅｒ（Ｃ１）と共役した、または共役していない合成Ｇｌｏｂｏ Ｈを１μｇ皮下投与し、免疫付与した。１週間ごとに３度のワクチン接種をした１０日後、マウス血清を収集し、次いで、抗体レベルを評価するために糖鎖マイクロアレイに導入した。図３Ａに要約されるように、ＩｇＭの誘導に最も有効な免疫原が、ＧＨ−ＫＬＨ、ＧＨ−ＤＨ、およびＧＨ−ＢＶ、次いでＧＨ−ＴＴ、ＧＨ−ＢＳＡであり、α−ＧａｌＣｅｒは、ＩｇＭ抗体を高いレベルに誘導する免疫応答を刺激できることが分かった。同様の傾向がマウスＩｇＧ抗体においても観測され（図３Ｂ）、ＩｇＧレベルはＩｇＭレベルよりも相対的に高かった。簡潔にいうと、合成複合糖質の炭化水素の密度がより低いにもかかわらず、ＧＨ−ＤＴは、ＧＨ−ＫＬＨと同様の免疫原性を示し、アジュバントであるα−ＧａｌＣｅｒは、免疫応答の増強を示した。
【０１４８】
α−ＧｌａＣｅｒは、ＧＨ−ＤＴに対するアジュバント効果を示したことから、Ｃ１よりもアジュバント活性の高い他の糖脂質を試験し、その結果を図４に示した（Fujio M, et al. (2006) J Am Chem Soc 128:9022-9023.）。
【０１４９】
マウスのグループに、２μｇの糖脂質を有する、または有さないＧＨ−ＤＴおよびＧＨ−ＢＶ１．６μｇを筋肉注射で１週間に２回免疫付与した。３回ワクチン接種をした２週間に血清を得て、糖鎖マイクロアレイ解析に導入した。一般的に、マウス抗Ｇｌｏｂｏ Ｈ ＩｇＧ力価は、免疫付与が進行すると増強するが、ＩｇＭレベルは、ワクチン接種の時間にほとんど無関係である（図５）。ＧＨ−ＢＶをワクチン接種したグループのうち、糖脂質−ワクチン処理およびワクチンの単独処理の間で、ＩｇＭレベルに有意な差はなかった。前記結果は、糖脂質と一緒に用いたＧＨ−ＢＶは有効な免疫療法ではないことを示唆するが、弱い免疫原性は、ＢａＭＶが不安定であるという特徴によるものである可能性がある。それにもかかわらず、α−ＧａｌＣｅｒアナログ、特に７ＤＷ８−５は、ＧＨ−ＤＴとうまく協力して、マウスの免疫応答を誘導した。
【０１５０】
興味深いことに、マウスポリクローナルＩｇＧ抗体は、ＧＨ−ＤＴおよび様々な糖脂質アジュバントによって産生され、Ｇｌｏｂｏ Ｈを中和するだけでなく、Ｇｂ５、ＳＳＥＡ−４、およびＧｂ４と交差反応し、Ｃ３４は最も有効な糖脂質アジュバントであった（図６）。ＩｇＭよりも力価がより高いＩｇＧを誘導しうる新規ワクチン組成物を探索するために、Ｇｌｏｂｏ Ｈ−ＤＴ複合体および糖脂質Ｃ１もしくはＣ３４、市販のＡｌＰＯ４（リン酸アルミニウム）、またはＭＦ５９を試験した。驚くべきことに、糖脂質Ｃ３４を含むＧｌｏｂｏ Ｈ−ＤＴは、３回のワクチン投与後にほとんど独占的にＩｇＧ抗体を誘導しうる（図７）。要約すると、ＧＨ−ＤＴ複合体と組み合わせた新規糖脂質アジュバント７ＤＷ８−５は、抗Ｇｌｏｂｏ ＨのＩｇＧおよびＩｇＭの両方を増強することができ、ＧＨ−ＤＴと組み合わせた糖脂質アジュバントＣ３４は、ＩｇＭよりも抗体力価が高いＩｇＧを誘導しうる。これらは、これらは、Ｇｂ５抗原およびＳＳＥＡ−４抗原に対して異なる結合親和性を示し、ともに乳癌幹細胞の表面に発現する。
【０１５１】
Ｇｌｏｂｏ Ｈワクチンにおける異なる糖脂質アジュバントの効果をさらに比較するために、ＧＨ−ＫＬＨを有する７つのマウスのグループに免疫付与した。この結果、糖脂質
を含むマウスワクチンが、抗Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体を高いレベルで誘導することを示唆した（図８）。ＭＦ５９は、強力なアジュバントであるが、ＧＨ−ＫＬＨとは協力せずに、Ｇｌｏｂｏ Ｈに対する抗体を誘導した。ＡｌＰＯ４（リン酸アルミニウム）はまた、抗体の誘導に対して明らかな影響は示さなかった。一方、Ｃ３４とともに用いたＧＨ−ＫＬＨは、１回目および２回目ワクチン接種後において、優れた免疫原性を示したが、３回目ワクチン接種後は、Ｃ１と有意な差は見られなかった。
【０１５２】
毒性作用がない毒素変異体であるＤＴ−ＣＲＭ１９７が、抗原特異的Ｔ細胞増殖を誘導し、ＩＬ−２、ＩＮＦ−γ、およびＩＬ−６の脾細胞による産生を高めることが、Ｔｈ１を駆動する経路における役割であることを示唆している（Miyaji EN et al. (2001) Infect Immun 69:869-874; Godefroy S, et al. (2005) Infect Immun 73:4803-4809; Stickings P, et al. (2008) Infect Immun 76:1766-1773.）。サイトカインの特徴が主にＴｈ１であるという事実にもかかわらず、抗ＣＲＭ１９７抗体のサブクラスは、ＩｇＧ１であり、Ｔｈ１／Ｔｈ２の混合応答を示すＩｇＧ２ａを検出できない。これらの結果は、Ｇｌｏｂｏ Ｈワクチンの抗体アイソタイプの特性の評価を促進し、本研究が、糖脂質アジュバントと組み合わせたＧＨ−ＤＴまたはＧＨ−ＫＬＨが、微量のＩｇＧ２ａとともに、主としてＩｇＧ１抗体を誘導することを示した（図９）。
【０１５３】
糖脂質アジュバントを単独で静脈投与（i.v.）した場合、Ｔｈ１バイアスのサイトカイン分泌を増強するという事実にもかかわらず、抗体のクラススイッチ（IgG2a）は観測されなかった。全体として、糖脂質は、細胞性および液性免疫応答を増強するという極めて重要な役割がある。
【０１５４】
ＤＴと共役したＧｂ５およびＳＳＥＡ−４を同様の戦略により合成した。３回目ワクチン接種の後、ＩｇＭおよびＩｇＧの抗体力価を比較し、Ｇｂ５−ＤＴおよびＳＳＥＡ−４−ＤＴが、ＩｇＭよりも高力価のＩｇＧを誘導することを見出した（図１０）。
【０１５５】
実施例４：異なるワクチン組成物によって誘導される抗体の特異性研究
ＧＨ−ＤＴおよびＣ３４がＧｌｏｂｏ Ｈ、Ｇｂ５（SSEA-3）、およびＳＳＥＡ−４を認識する抗体を誘導したことから、次に、アジュバントの存在下、ＩｇＧの研究に集中して、ＳＳＥＡ−３−ＤＴおよびＳＳＥＡ−４−ＤＴワクチンの特異性を２４個の糖鎖アレイを用いて試験した（図１１）。
【０１５６】
図１２Ａ〜１２Ｃに示すように、Ｇｌｏｂｏ Ｈ−ＤＴおよびＣ３４アジュバントで免疫付与されたマウスは、高い選択性でＧｌｏｂｏ Ｈ、Ｇｂ５、およびＳＳＥＡ−４を認識しうる抗体を誘導し、アジュバントＭＦ５９を有するＳＳＥＡ−３−ＤＴワクチンは低い選択性で高い免疫応答を誘導した。一方、アジュバントＣ３４と組み合わせたＳＳＥＡ−３−ＤＴは、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４に対する抗体のみ誘導した。
【０１５７】
興味深いことに、アジュバント存在下または非存在下、ＳＳＥＡ−４−ＤＴは、ＳＳＥＡ−４およびその切断構造（末端のラクトースが欠失したＳＳＥＡ−４）を特異的に認識するＩｇＧおよびＩｇＭ抗体を誘導した。しかしながら、前記選択性の原因は明らかではない。
【０１５８】
合成複合糖質ワクチンの効果を直接評価するために、図１３に示すように、腫瘍サイズを１週間ごとに３度測定した。一般的に、Ｇｌｏｂｏ Ｈを有する乳癌細胞株に４Ｔ１を注入した後、腫瘍は２週間成長する。糖脂質アジュバントを有するワクチン接種したすべてのグループは、２４日間で、単独のＧＨ−ＤＴおよびＰＢＳのコントロールと比較して、相対的に腫瘍が小さいままであった。前記予備データは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＤＨ−ＤＴおよび糖脂質アジュバントを有するワクチンは、いくつかの腫瘍進行を遅延させることを示唆している。
【０１５９】
実施例５：Ｇｌｏｂｏ Ｈハーフエステルの調製
Ｇｌｏｂｏ Ｈハーフエステルは以下のように調製した：
【０１６０】
【化３】
【０１６１】
Ｇｌｏｂｏ Ｈアミン１（5.5 mg, 4.54 μmol）を無水ＤＭＦ溶液に溶解し、次いでｐ−ニトロエステルリンカー（8.8 mg, 22.7 μmol）を添加して室温で１〜３時間撹拌した。反応は、ＴＬＣ（１％酢酸のメタノール溶液）およびニンヒドリン試験で観測した。より大きいＲｆ値を有する生成物の生成および遊離アミンの消失が反応の完結を示す。反応混合物を減圧下、加熱せずに濃縮してＤＭＦを留去し、次いでＣＨ２Ｃｌ２および１％の酢酸を含む水で２度抽出した。前記水溶液を濃縮し、逆相（Ｃ１８）カラムクロマトグラフィで精製し、１％の酢酸を含む水からＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝４：６へと変更し、徐々に溶出させた。次に溶液を凍結乾燥して淡黄色固体の生成物１２（5.4 mg, 収率88%）を得た。1H NMR (600 MHz, D2O) δ 8.25 (d, 2H, J = 9.0 Hz), 7.28 (d, 2H, J = 9.0 Hz), 5.12 (d, 1H, J = 3.9 Hz), 4.79 (d, 1H, J = 3.7 Hz), 4.51 (d, 1H, J = 7.7 Hz), 4.44 (d, 1H, J = 7.7 Hz), 4.39 (d, 1H, J = 7.7 Hz), 4.31-4.28 (t, 2H, J = 7.7 Hz), 4.15-4.1 1 (m, 2H), 3.99 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 3.92 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 3.89-3.44 (m, 33H), 3.16 (t, 1H, J = 8.6 Hz), 3.10 (t, 2H, J = 6.7 Hz), 2.62 (t, 2H, J = 6.9 Hz), 2.20 (t, 2H, J = 6.6 Hz), 1.93 (s, 3H), 1.62-1.49 (m, 4H) 1.54- 1.48 (m, 2H), 1.45-1.40 (m, 2H), 1.30-1.24 (m, 2H), 1.11 (d, 3H, J = 6.5 Hz) 13C NMR (150 MHz, D2O ) δ 178.0, 176.1, 176.0, 156.9, 147.1, 127.3, 124.5, 105.7, 105.0, 103.7, 103.6, 102.2, 101.0, 80.5, 80.0, 78.9, 78.0, 77.8, 77.1, 76.7, 76.4, 76.3, 76.2, 75.2, 74.6, 73.8, 73.5, 72.5, 72.1, 71.8, 71.2, 70.9, 70.8, 70.1, 69.7, 69.5, 68.5, 62.6, 62.6, 62.0, 62.0, 61.7, 53.3, 40.8, 37.1, 35.0, 30.0, 29.7, 26.4, 25.0, 24.1, 23.9, 17.0 HRMS: C55H87N3O35Na [M+Na]+ 計算値: 1372.5018; 実測値: 1372.5016.
実施例６：複合糖質を生産させる基本手順
複合糖質は以下のように調製した：
【０１６２】
【化４】
【０１６３】
ＢＳＡ、ＤＴ−ＣＲＭ１９７、および破傷風トキソイド（Adimmune社、台湾）をｐＨ７．２の１００ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、３０〜４０当量のＧｌｏｂｏ Ｈハーフエステル３５を添加した。次に、前記混合物を脱イオン水で希釈し、脱イオン水を５回取り換ながら透析した。前記溶液を凍結乾燥して白色粉末とした。得られたＧｌｏｂｏ Ｈ−タンパク質共役体を、MALDI-TOF解析で特性評価し、炭化水素組み込み率を決定した。４１（GH-BSA）はMALDI-TOFで76029に観測され、４２（GH-DT-CRM197）は162902に観測され、４４（GH-BaMV）は決定されなかった。
【０１６４】
実施例７：複合糖質のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析
複合糖質４１、４２、４３、および一次キャリアタンパク質をｄｄＨ２Ｏ（〜1 μg/μl）でもどした。マトリックスであるシナピン酸を、アセトニトリルおよび脱イオン水１：１で新たに調製し、最終マトリックスを０．１％のＴＦＡを含む１０ｍｇ／ｍＬの濃度とした。徐々にロードし、マトリックスおよび複合糖質を混合して、プレートを乾燥させた。測定前にウシ血清アルブミンを用いた検定は厳密であった。各複合糖質および一次タンパク質サンプルを線形の正イオンモードで検出した。平均分子量は、キャリアタンパク質上の炭化水素の組み込みの平均値で計算した。
【０１６５】
実施例８：糖鎖マイクロアレイの製造
９６ウェルからＮＨＳでコートされたスライドガラスに、様々な濃度のプリント緩衝液（0.005%のTween20を含む300mMリン酸緩衝液、pH8.5）においてアミン含有糖鎖の〜０．７μＬの沈殿物を、ロボットピン（SMP3、TeleChem International社、米国）でマイクロアレイにプリントした（BioDot、Cartesian Technologies社、米国）。それぞれのマイクロアレイスライドに、９個のＧｌｏｂｏ Ｈアナログ（SSEA-4、GH、Gb5、Gb4、Gb3、Gb2、BB4、BB3、およびBB2）５０μＭをそれぞれ１２個ずつスポットした。プリントしたスライドを湿度８０％で１時間反応させ、次いで、終夜乾燥した。これらのスライドは、使用まで、デシケータ中室温で保存した。
【０１６６】
実施例９：血清学的アッセイ（糖鎖マイクロアレイ）
マウス血清を予備のスクリーニングとして、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む３％ＢＳＡ／ＰＢＳ緩衝液（pH7.4）で１：６０に希釈した。糖鎖マイクロアレイを５０ｍＭエタノールアミンで１時間ブロックし、使用前にｄｄＨ２ＯおよびＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した。前記血清希釈液は、次にＧｌｏｂｏ Ｈマイクロアレイに導入し、室温で１時間インキュベートした。マイクロアレイスライドを、それぞれＰＢＳＴ（0.05％Tween20のPBS緩衝液）およびＰＢＳ緩衝液でさらに３回洗浄した。次に、Ｃｙ３−ａｆｆｉｎｉＰｕｒｅウシ抗マウスＩｇＧ（H＋L）、ＩｇＧ1、ＩｇＧ２ａ、または抗マウスＩｇＭをマイクロアレイスライドに添加し、密封して１時間インキュベートした。最後に、前記スライドをＰＢＳＴ、ＰＢＳ、およびｄｄＨ２Ｏで順に３回洗浄したマイクロアレイスライドを乾燥させ、マイクロアレイ蛍光チップリーダー（Genepix 4000B）を用いて、５３２ｎｍで解析した。データをソフトウェアGenePix Pro 6.0（Axon Instruments、米国、カリフォルニア州、ユニオンシティー）で解析した。正確な測定を行うため、ＰＭＴゲインを蛍光の飽和を回避する４００ｎｍに調節した。部分的なバックグラウンドは、各糖鎖スポットのシグナルから差し引いた。明らかな欠陥または検出できないスポットは省略した。極大蛍光強度は、複数のスポットから「F532nm-B532nmの平均値」の平均と定義した。
【０１６７】
実施例１０：血清学的アッセイ（酵素結合免疫吸着法）
炭酸重炭酸緩衝液（pH 10）１００μｌのＧｌｏｂｏ Ｈセラミド０．２μｇを９６ウェルプレート（NUNC）に４℃で終夜コートした。ＰＢＳで洗浄し、３％ウシ血清アルブミンを用いて、室温で３０分間ブロックした。マウス血清の連続希釈液を各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートし、次いでＤＰＢＳＴ（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、0.05% Tween20）で洗浄した。ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＡＰ（1:200、Southern Biotech社、米国）を添加し、室温で４５分間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、次いでアルカリリン酸基質であるｐ−二トロフェニルリン酸（Sigma社）とともに３７℃で８時間インキュベートした。インキュベート後、３Ｍ ＮａＯＨ溶液を添加して反応を停止させ、４０５ｎｍでＥＬＩＳＡリーダー（SpectraMax、Molecular Devices社）上のプレートを読み取った。力価は、０．１より大きい光学密度が得られる最大の希釈度と定義した。
【０１６８】
実施例１１：用量および免疫付与
（１）３つのマウスのグループ（生後６週間のメスC57BL/6マウス、BioLASCO社、台湾）の腹部に、糖脂質であるＣ１または７ＤＷ８−５を含む、または含まないＧＨ−ＫＬＨ（Optimer社）、ＧＨ−ＢＳＡ、ＧＨ−ＴＴ、ＧＨ−ＣＲＭ１９７、およびＧＨ−ＢａＭＶを、１週間の間隔で３回皮下投与した。各ワクチン接種には、１μｇのＧｌｏｂｏ Ｈを含み、２μｇの糖脂質アジュバントを含む、または含まなかった。コントロールのマウスにはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）のみを投与した。最初の免疫付与前（pre-immune）および３回目ワクチン接種の１０日後にマウスを採血した。（２）３つのマウスのグループ（生後８週間のメスBalb/cマウス、BioLASCO社、台湾）に、Ｃ１、Ｃ２３、または７ＤＷ８−５をそれぞれ含む、または含まないＧＨ−ＢａＭＶまたはＧＨ−ＣＲＭ１９７を２週間の間隔で３回筋肉投与した。各ワクチン接種には、１μｇのＧｌｏｂｏ Ｈを含み、２μｇの糖脂質アジュバントを含む、または含まなかった。コントロールのマウスにはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）のみを投与した。免疫付与前および各ワクチン接種の２週間後にマウスを採血した。（３）３つのマウスのグループ（生後８週間のメスBalb/cマウス、BioLASCO社、台湾）に、Ｃ１、Ｃ１７、７ＤＷ８−５、Ｃ３０、ＡｌＰＯ４、ＭＦ５９（1:1混合物）を含む、または含まないＧＨ−ＣＲＭ１９７またはＧＨ−ＫＬＨを、（２）に示すように免疫付与した。４０００ｇで１０分間遠心分離して全血清を得た。血清学的反応を、糖鎖マイクロアレイまたは先のＥＬＩＳＡアッセイと比較することによって解析した。
【０１６９】
実施例１２：異種移植モデル
（１）免疫付与されたメスBalb/cマウス（PBS、GH-CRM197単独またはC1、C23、および7DW8-5をそれぞれ含む）の５つのグループに、２×１０５の転移性マウス乳癌細胞株である4T１（無菌PBS中）を、最終ワクチン接種した８週間後に皮下注射した。（２）免疫付与されたメスBalb/cマウス（GH-KLH単独またはC1、C17、8-5、C30、AlPO4、およびMF59をそれぞれ含む）の７つのグループに、２×１０５の転移性マウス乳癌細胞株である４Ｔ１（無菌PBS中）を、最終ワクチン接種した６週間後に皮下注射した。腫瘍異種移植の前後におけるマウス抗Ｇｌｏｂｏ Ｈ血清をモニターした。マウス腫瘍サイズは、ノギスで１週間ごとに３回測定し、（長さ×高さ×幅）／２（ｍｍ３）として定義した。
【０１７０】
実施例１３：ヒト乳癌検体からの原発性腫瘍細胞の単離
ヒト乳癌検体は、Tri-Service General Hospital（台北、台湾）で最初の手術を受けた患者から得た。サンプルは、患者の秘密保護のため完全に暗号化し、台湾、台北のアカデミア シニカのヒトを対象とした研究の倫理審査委員会の治験審査委員会によって承認されたプロトコルが用いられた。腫瘍検体は、１ｍｍの四角形のフラグメントにスライスし、コラゲナーゼ（1,000 U/ml）、ヒアルロニダーゼ（300 U/ml）およびＤＮａｓｅ Ｉ（100 μg/ml）を含むＲＰＭＩ１６４０倍地に３７℃で２時間インキュベートすることによって酵素消化した。原発性乳房腫瘍細胞は、１００−μｍのcell strainer（BD Biosciences社）を通してろ過して収集し、５％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０倍地に再懸濁させた。
【０１７１】
実施例１４：フローサイトメトリー解析
原発性乳癌細胞を、２％ＦＢＳおよび０．１％ＮａＮ３含有ＰＢＳの５０μｌ中に１×１０５の細胞として調製した。抗ＣＤ２４−ＰＥ、抗ＣＤ４４−ＡＰＣ、および抗ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５抗体混合物（各１μｌ）で細胞を標識した。Ａｌｅｘａ４８８と共役したモノクローナル抗Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体（VK-9）で染色してＧｌｏｂｏ Ｈの発現を検出した。FACSCantoフローサイトメーター（Becton Dickinson社）で解析を行った。ＢＣＳＣは、ＣＤ４５−／ＣＤ２４−／ＣＤ４４＋細胞として定義し、非ＢＣＳＣは、その他のＣＤ４５−細胞集団として定義した。Ｇｌｏｂｏ Ｈの発現は、さらにゲート部位で解析された。
【０１７２】
実施例１５：細胞選別
マウスにおけるヒト乳癌腫瘍移植片から採取された細胞は、抗ＣＤ２４−ＰＥ、抗ＣＤ４４−ＡＰＣ、および抗Ｈ２Ｋｄ−ＦＩＴＣ抗体混合物（BD Biosciences社）で染色した。抗体で標識された細胞の蛍光活性の選別は、FACSAria cell sorter（Becton Dickinson社）で行われた。Ｈ２Ｋｄ−／ＣＤ２４−／ＣＤ４４＋細胞はＢＣＳＣと分類され、その他のＨ２Ｋｄ−細胞は非ＢＣＳＣと分類された。ＢＣＳＣおよび非ＢＣＳＣの標準的な純度は、それぞれ＞８５％および＞９０％であった。
【０１７３】
実施例１６：免疫組織化学
正常細胞におけるＳＳＥＡ−４発現については、５の個体から提供される異なる２０の臓器を含む、組織マイクロアレイスライド（Biomax社）が用いられた。スライドは、標準的免疫組織学的手順に従い、５６℃で終夜乾燥させ、キシレン中で脱ろうさせ、および再水和し、次いでｐＨ９．０のAR-10（BioGenex Laboratories社）で抗原検索を行った。ＳＳＥＡ−４の発現は、抗ＳＳＥＡ−４抗体（eBioscience社）を使用することにより決定した。二次抗体として抗ラットＩｇＭを用いた染色によりＳＳＥＡ−４を検出し、ＤＡＢ基質によって発展させた。スライドをヘマトキシリンで対比染色した。原発性乳房腫瘍ＢＣＯ１４５およびＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスからの腫瘍異種移植片を１０％リン酸緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに埋め込んだ。パラフィン切片を２μＭの厚さにカットし、SuperFrost Plus顕微鏡スライド（Menzel-Glaser社）上にマウントし、および５５℃で終夜乾燥した。前記切片を、標準的な免疫組織学的手順に従い、キシレンで脱ろうおよび再水和し、次いでヘマトキシリンおよびエオシン（H&E）で染色した。免疫染色の前に、スライドをはじめ１０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝溶液（ｐH6.0）中に入れ、１５分間マイクロウェーブをかけた。前記スライドを次に、抗ＥＲ抗体、または抗ＰＲ抗体とともに終夜インキュベートした。Super Sensitive Polymer-HRP IHC Detection System（BioGenex社）を用いて、免疫検出を行った。
【０１７４】
本明細書中に引用されるすべての刊行物および特許出願は、それぞれ個別の刊行物または特許出願が具体的に、および単独に参照により引用されるように表示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７５】
上述の発明は、理解を明瞭にする目的で、例示および実施例によりいくつか詳細に記載されているが、特定の変更および修飾が添付の特許請求の範囲の思想および技術的範囲に逸脱しない範囲で構成されうることが、本発明の教示から当業者には明らかである。
【０１７６】
要約書は、読者に迅速な技術開示の本質および趣旨の理解を与えるため、37 C. F. R §1.72 (b)に従い、提供される。前記要約書は、特許請求項の技術的範囲または意義を解釈または制限するために用いられるものではないことを理解して、提出されている。
【技術分野】
【０００１】
関連出願のクロスリファレンス
本出願は、２００８年６月１６日に出願された米国仮特許出願第６１／０６１９６８号に基づく優先権を主張し、「Ｇｌｏｂｏ ＨおよびＳＳＥＡ−３への特異的な免疫応答誘導組成物、およびそのがん治療のおける使用」の名称で２００９年６月１６日に出願された、同時継続の米国特許出願第１２／４８５５４６号の一部継続出願である。本出願の内容は、その全体の内容が参照により引用される。
【０００２】
本発明の技術分野
本発明は、がんワクチン分野に関する。具体的には、本出願は、免疫原性キャリアであるＤＴ−ＣＲＭ１９７と共役する、Ｂ細胞エピトープ、Ｇｌｏｂｏ Ｈ含有ワクチンに基づく糖鎖に関する。より具体的には、本発明は、Ｃ３４のような新規糖脂質アジュバントとともに投与される、抗がんＧｌｏｂｏ Ｈ−ＤＴワクチンを目的とする。
【背景技術】
【０００３】
抗がん治療を設計するため、正常細胞のないがん細胞またはがん幹細胞を標的とする分子を探索することが望まれている。異常グリコシル化は、しばしば腫瘍進行と関係があり、１９６９年にMeezanらによってがんの糖鎖が正常細胞と異なることが示された(Meezan E, et al. (1969) Biochemistry 8:2518-2524.)。異常グリコシル化は、特定構造の欠損または過剰発現、不完全構造の持続、および新規構造の発生を含む。前記構造の違いは、レクチン染色を用いた、正常組織および悪性組織の比較による多くの組織学的証拠によって、その後に支持された(Turner GA (1992) Clin Chim Acta 208:149-171; Gabius HJ (2000) Naturwissenschaften 87:108-121.)。
【０００４】
ごく最近、糖鎖抗原に関連する腫瘍がモノクローナル抗体および質量分析法により同定された（Shriver Z, et al. (2004) Nat Rev Drug Disc 3:863-873; Pacino G, et al. (1991) Br J Cancer 63:390-398.）。このデータにより、糖脂質または糖タンパク質の形成において、がん細胞で発現される抗原と関連する多くのがんが特徴付けられ、がんの特定のタイプと関連付けられている（Bertozzi CR, Dube DH (2005) Nat Rev Drug Discovery 4:477-488.）。悪性細胞における糖鎖表面の役割については比較的にあまり知られていないが、これらの抗原に対する受動的に投与された抗体またはワクチン誘導抗体が予後の改善と関連している。
【０００５】
糖鎖関連腫瘍の報告では、１９８４年に箱守らによって、乳癌ＭＣＦ−７細胞から糖脂質抗原Ｇｌｏｂｏ Ｈ（Fucα1→2Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glc）が初めて単離、同定された（Bremer EG, et al. (1984) J Biol Chem 259:14773-14777.）。抗Ｇｌｏｂｏモノクローナル抗体のさらなる研究により、Ｇｌｏｂｏ Ｈは、前立腺癌、胃癌、膵臓癌、肺癌、卵巣癌および大腸癌を含む他の多くのがんにおいても存在し、並びに容易に免疫系と関与しない正常分泌組織腔表面上にはほとんど発現しないことが示された（Ragupathi G, et al. (1997) Angew Chem Int Ed 36:125-128.）。また、乳癌患者の血清に高レベルの抗Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体が含まれることが証明され（Gilewski T el al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:3270-3275; Huang C-Y, et al. (2006) Proc Natl Acad Sd USA 103:15-20; Wang C-C, et al. (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105(33):11661-11666）、Ｇｌｏｂｏ Ｈ陽性の腫瘍を有する患者は、Ｇｌｏｂｏ Ｈ陰性の腫瘍を有する患者と比較して、生存期間が短いことも示された(Chang, Y-J, et al. (2007) Proc Natl Acad Sci USA 104(25):10299-10304.)。これらの知見は、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、６糖類のエピトープ、魅力的な腫瘍マーカー、および実現可能ながんワクチンの開発のための標的を提供する。
【０００６】
Ｇｌｏｂｏ Ｈはさまざまな上皮がんにおいて過剰に発現するがん抗原である。この抗原は、がん免疫療法の標的として有効でありうることが示唆されている。Ｇｌｏｂｏ Ｈに対する抗体を産生させるためのワクチンが開発されてきたが、Ｇｌｏｂｏ Ｈの抗原性が低いため、これらワクチンの抗がん活性は満足できるものではなかった。高いレベルでＧｌｏｂｏ Ｈを標的とする免疫応答を生じさせることができる新規なワクチンが必要である。
【０００７】
幹細胞は、自己複製能並びに異なる細胞および組織へ分化能を有する細胞群として定義される（Reya T et al., (2001) Nature 414:105-111.）。悪性腫瘍および正常細胞の両方で不均一な細胞集団を含むように、がん幹細胞は、不均一な腫瘍成長および腫瘍の維持に重要な役割を果たしている可能性がある。がん幹細胞は、脳腫瘍、乳癌、大腸癌、および前立腺癌などの多様な固形がんから同定されている。乳癌幹細胞（ＢＣＳＣ）は、乳癌のＣＤ２４−ＣＤ４４＋亜集団に存在することが、Al-HajjらによるＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへの異種移植における表現型の多様性を有する腫瘍の産生能に基づき、初めて示された（Al-Hajj M, et al., (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100:3983-3988）。ＣＤ２４−ＣＤ４４＋の表現型で表される乳癌患者のがん細胞の大部分は早期に骨髄中に広まることから（Balic M et al., (2006) Clin Cancer Res 12:5615-5621）、ＢＣＳＣには転移能があることが示唆される。成長能、分化能、転移能、および放射線抵抗性から、ＢＣＳＣは乳癌治療の主要は標的となっている（Tang C. et al., (2007) FASEB J. 21:1-9）。
【０００８】
乳癌において、Ｇｌｏｂｏ Ｈの発現は、腺管癌、小葉癌、および管状腺癌の６０％以上で観測されるが、非上皮性乳癌においては観測されない（Mariani-Constantini R et al., (1984) Am. J. Pathol. 115:47-56）。内腔境界の頂側膜上皮細胞における弱い発現を除き、正常細胞の免疫系に関与しないことが明らかな部位ではＧｌｏｂｏ Ｈは発現しない（Id.; Zhang S. et al., (1997) Int. J. Cancer 73:42-49）。
【０００９】
また、Ｇｌｏｂｏ Ｈは、乳癌幹細胞（ＢＣＳＣ）で発現する。フローサイトメトリーによって、Ｇｌｏｂｏ Ｈは乳癌検体において２５／４１（６１．０％）で発現することが明らかにされた。Ｇｌｏｂｏ Ｈは２５／２５の非ＢＣＳＣおよび８／４０のＢＣＳＣ（２０％）で発現された。Ｇｌｏｂｏ Ｈの６糖類の前駆体である胚発生段階特異抗原−３（ＳＳＥＡ−３）は、腫瘍の３１／４０で発現される。ＳＳＥＡ−３は２９／３１の非ＢＣＳＣおよび２５／４０のＢＣＳＣ（６２．５％）で発現される（Chang W-W. et al., (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105(33):11667-11672.）。
【００１０】
DanishefskyおよびLivingstonは、以前、さまざまながんに対するＧｌｏｂｏ Ｈ−ＫＬＦワクチン（Gilewski T el al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:3270-3275; Ragupathi G, et al. (1997) Angew Chem Int Ed 36:125-128; Kudryashov V, et al. (1998) Glycoconj J. 15:243-249; Slovin SF et al (1997) Proc Natl Acad Sci USA 96:5710-5715）、および７価ワクチン（それぞれＫＬＨと共役するＧＭ２、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、Ｔｎ、ＳＴｎ、ＴＦ、およびＴｎ−ＭＵＣｌを含有する；Sabbatini PJ et al (2007) Clin Cancer Res 13:4170-4177）を報告している。しかしながら、７価ワクチンを接種した患者は、７つの抗原のうち、ＧＭ２抗体およびＬｅｗｉｓ Ｙ抗体を除く５つの抗体が誘導されるのみである。ＧＭ２のように抗原が偏在的に発現されることよりも、Ｇｌｏｂｏ Ｈが正常分泌組織の最小レベルのみを有する腫瘍細胞で特別に発現されることは、ワクチン開発の標的として魅力的なものである。これらの研究において、Ｇｌｏｂｏ Ｈをオゾン分解、次いでＫＬＨキャリアタンパク質を用いた還元的アミノ化反応により、１つのタンパク質から約１５０の糖鎖ユニットが生成される（Ragupathi G, et al. (1997) Angew Chem lnt Ed 36:125-128.）。ＭＭＣＣＨリンカーを用いるさらなる精製により、約７２０：１の共役比で炭化水素が増加した（Wang S-K, et al. (2008). Proc Natl Acad Sci USA105:3690-3695.）。しかしながら、正確に複合糖質を特徴づけることは困難であった。また、免疫学的アジュバントＱＳ−２１と組み合わせた合成ワクチンは、前立腺癌および転移性乳癌患者の両方で主にＩｇＭ抗体を誘導し、ＩｇＧ抗体の量が少なくなった。フェーズ１の臨床試験において、ワクチン接種部位で一過性の局所皮膚反応を有する最小毒性も見られた（Gilewski T el al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:3270-3275; Ragupathi G, et al. (1997) Angew Chem lnt Ed 36:125-128; Slovin SF et al (1997) Proc Natl Acad Sci USA 96:5710-5715.）。いくつかの患者で観測された軽度のインフルエンザ様症状は、おそらくＱＳ−２１の副作用と関連がある。マレイミド修飾キャリアタンパク質ＫＬＨと共役する、前立腺癌および乳癌と関連がある糖鎖抗原――Ｇｌｏｂｏ−Ｈ、ＧＭ２、ＳＴｎ、ＴＦ、およびＴｎ−―含有５価ワクチンは、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ＩｇＭ力価よりも高いＩｇＧ力価を有する抗Ｇｌｏｂｏ−Ｈ血清を産生することが報告されている（Zhu J. et al. (2009) J. Am. Chem. Soc. 131(26):9298-9303）。
【００１１】
したがって、Ｇｌｏｂｏ Ｈと反応する抗体、特に高い力価のＩｇＧを増加させる代わりのキャリアおよびアジュバントの同定、並びに副作用が最小限であるワクチンの効果の向上が望まれている。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、ｐ−ニトロフェニルリンカーを通じて、ジフテリア毒素交差反応物質１９７（ＤＴ−ＣＲＭ１９７）（Ｔｈエピトープ）である免疫原性キャリアと化学的に共役した、Ｇｌｏｂｏ Ｈ（Ｂ細胞エピトープ）含有ワクチンに基づく糖鎖に関する。前記合成ワクチンは、糖脂質アジュバントと組み合わせて、ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＭ抗体を誘導し、乳癌モデルにおいて極めて優れた免疫原性を提供し、異種移植研究において腫瘍形成の遅延を示す。Ｇｌｏｂｏ Ｈ−ＤＴおよび糖脂質Ｃ３４によって誘導された抗体の糖鎖アレイ解析によって、前記抗体がＧｌｏｂｏ Ｈだけでなく、ＳＳＥＡ−３（Ｇｂ５）およびＳＳＥＡ−４（シアリルＧｂ５）糖鎖（これらはすべてのがん細胞およびがん幹細胞に対して特異的である）を認識することが示された。
【００１３】
本発明は、（ａ）Ｇｌｏｂｏ Ｈまたはその免疫原性フラグメントから本質的に構成され、リンカーを通じてキャリアタンパク質と共役する糖鎖、および（ｂ）樹状細胞上のＣＤ１ｄ分子と結合できる糖脂質を含むアジュバントを含み、この際、ＩｇＭアイソタイプ抗体と比較して、ＩｇＧアイソタイプ抗体を相対的に高いレベルで誘導する免疫応答を誘導する免疫原性組成物に関する。
【００１４】
いくつかの実施態様において、前記キャリアタンパク質はジフテリア毒素交差反応物質１９７（ＤＴ−ＣＲＭ１９７）である。いくつかの実施態様において、前記リンカーはｐ−ニトロフェニルリンカーである。
【００１５】
いくつかの実施態様において、前記アジュバントはα−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）の合成アナログである。いくつかの実施形態において、前記アジュバントはＣ３４であり、この際、Ｃ３４は下記構造を含む。
【００１６】
【化１】
【００１７】
いくつかの実施態様において、免疫応答は、好ましくはＩｇＧアイソタイプ抗体の産生を目的とする。いくつかの実施態様において、免疫原性組成物は、液性および細胞性免疫応答を誘導できる少なくとも１つのアジュバントを含む。
【００１８】
いくつかの実施態様において、免疫応答によって産生した抗体は、がん細胞またはがん幹細胞で発現する抗原を中和する。いくつかの実施形態において、前記免疫応答によって産生した抗体は、Ｇｂ４抗原、胚発生段階特異抗原−３（ＳＳＥＡ−３）、および胚発生段階特異抗原−４（ＳＳＥＡ−４）の少なくとも１つを中和する。いくつかの実施形態において、Ｇｂ４抗原、胚発生段階特異抗原−３（ＳＳＥＡ−３）、および胚発生段階特異抗原−４（ＳＳＥＡ−４）の少なくとも１つを中和する抗体は、ＩｇＭアイソタイプ抗体と比較して、ＩｇＧアイソタイプ抗体を相対的に高いレベルで含む。
【００１９】
本発明は、被験者の抗がん免疫応答を誘導できる免疫原性組成物を含むがんワクチンに関する。いくつかの実施態様において、前記がんワクチンは、乳癌、肺癌、肝癌、口腔癌、胃癌、大腸癌、上咽頭癌、皮膚癌、腎癌、脳腫瘍、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、および膀胱癌からなる群から選択されるがんの治療に適する。
【００２０】
いくつかの実施態様において、前記がん組織は、細胞表面にＧｌｏｂｏ Ｈ抗原を発現する。いくつかの実施態様において、前記Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗原は、乳房の腫瘍上皮細胞で発現する。
【００２１】
いくつかの実施形態において、前記がんワクチンは、Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗原、Ｇｂ４、胚発生段階特異抗原−３（ＳＳＥＡ−３）、および胚発生段階特異抗原−４（ＳＳＥＡ−４）の少なくとも１つを中和する。いくつかの実施態様において、前記抗原は、乳癌幹細胞で発現する。
【００２２】
本発明は、腫瘍成長の抑制を含み、（ａ）Ｇｌｏｂｏ Ｈまたはその免疫原性フラグメントから本質的に構成され、リンカーを通じてキャリアタンパク質と共役する糖鎖、および樹状細胞上のＣＤ１ｄ分子と結合できる糖脂質を含むアジュバントを含む免疫原性組成物を、必要に応じて被験者に投与すること、並びに（ｂ）ＩｇＭアイソタイプ抗体と比較して、ＩｇＧアイソタイプ抗体を相対的に高い量で誘導する免疫応答を誘導することを含む方法に関する。
【００２３】
前記方法のいくつかの実施形態において、前記リンカーはｐ−ニトロフェノールであり、前記キャリアタンパク質はジフテリア毒素交差反応物質１９７（ＤＴ−ＣＲＭ１９７）であり、および前記アジュバントはα−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）の合成アナログである。一実施形態において、前記アジュバントはＣ３４である。
【００２４】
前記方法のいくつかの実施形態において、前記免疫原性組成物はがんワクチンをさらに含み、さらにこの際、前記がんワクチンの有効量を用いる１またはそれ以上の治療法は、腫瘍成長を抑制する。いくつかの実施形態において、前記がんワクチンの投与によって腫瘍サイズが小さくなる。
【００２５】
前記方法のいくつかの実施形態において、免疫応答反応が、好ましくはＧｌｏｂｏ Ｈ抗原、Ｇｂ４、胚発生段階特異抗原−３（ＳＳＥＡ−３）、および胚発生段階特異抗原−４（ＳＳＥＡ−４）の少なくとも１つを中和するＩｇＧアイソタイプ抗体の産生を目的とする。いくつかの実施態様おいて、Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗原、胚発生段階特異抗原−３（ＳＳＥＡ−３）、および胚発生段階特異抗原−４（ＳＳＥＡ−４）の少なくとも１つが、乳癌幹細胞で発現する。いくつかの実施態様おいて、前記Ｇｌｏｂｏ Ｈは乳房の腫瘍上皮細胞で発現する。
【００２６】
本発明は、（ａ）Ｇｌｏｂｏ Ｈまたはその免疫原性フラグメントから本質的に構成され、リンカーを通じてキャリアタンパク質と共役する糖鎖、および樹状細胞上のＣＤ１ｄ分子と結合できる糖脂質を含むアジュバントを含み、この際、前記免疫原性組成物がＩｇＭアイソタイプ抗体と比較して、ＩｇＧアイソタイプ抗体を相対的に高いレベルで誘導する免疫応答を誘導する免疫原性組成物、並びに（ｂ）薬学的に許容される賦形剤を含むがんワクチンに関する。
【００２７】
いくつかの実施態様において、前記がんワクチンは、前記免疫原性組成物の前記リンカーがｐ−ニトロフェノールであり、前記キャリアタンパク質がジフテリア毒素交差反応物質１９７（ＤＴ−ＣＲＭ１９７）であり、および前記アジュバントがα−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）の合成アナログであることを含む。一実施形態において、前記アジュバントはＣ３４である。
【００２８】
いくつかの実施態様において、前記がんワクチンはがんの治療に用いられ、この際、前記がんワクチンの有効量を用いる１またはそれ以上の治療法は、腫瘍成長を抑制する。いくつかの実施形態において、前記がんワクチンの投与によって腫瘍サイズが小さくなる。いくつかの実施態様において、前記がんは、乳癌、肺癌、肝癌、口腔癌、胃癌、大腸癌、上咽頭癌、皮膚癌、腎癌、脳腫瘍、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、および膀胱癌からなる群から選択される。
【００２９】
本発明は、（ａ）Ｇｌｏｂｏ Ｈ関連糖鎖またはその免疫原性フラグメントから本質的に構成され、リンカーを通じてキャリアタンパク質と共役する糖鎖、および（ｂ）樹状細胞上のＣＤ１ｄ分子と結合できる糖脂質を含むアジュバントを含み、この際、前記Ｇｌｏｂｏ Ｈ関連糖鎖が、ＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４からなる群から選択され、ＩｇＭアイソタイプ抗体と比較して、ＩｇＧアイソタイプ抗体を相対的に高いレベルで誘導する免疫応答を誘導する免疫原性組成物に関する。前記キャリアタンパク質はジフテリア毒素交差反応物質１９７（ＤＴ−ＣＲＭ１９７）であり、前記アジュバントはα−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）の合成アナログであり、および前記リンカーはｐ−ニトロフェニルリンカーである。一実施形態において、前記アジュバントはＣ３４である。
【００３０】
本発明は、ｐ−ニトロフェニルリンカーを通じてジフテリア毒素交差反応物質１９７（ＤＴ−ＣＲＭ１９７）キャリアタンパク質と結合するＧｌｏｂｏ Ｈ、および樹状細胞上のＣＤ１ｄ分子と結合できる糖脂質を含むアジュバントを含む、乳癌幹細胞に対する治療剤に関する。前記治療剤のいくつかの実施形態において、前記アジュバントはＣ３４である。
【００３１】
本発明は、ｐ−ニトロフェニルリンカーを通じてジフテリア毒素交差反応物質１９７（ＤＴ−ＣＲＭ１９７）キャリアタンパク質と共役するＳＳＥＡ−３、および樹状細胞上のＣＤ１ｄ分子と結合できる糖脂質Ｃ３４を含むアジュバントを含む、乳癌幹細胞に対する治療剤に関する。
【００３２】
本発明は、ｐ−ニトロフェニルリンカーを通じてジフテリア毒素交差反応物質１９７（ＤＴ−ＣＲＭ１９７）キャリアタンパク質と共役するＳＳＥＡ−４を含む、乳癌幹細胞に対する治療剤に関する。いくつかの実施形態において、前記治療剤は、樹状細胞上のＣＤ１ｄ分子と結合できる糖脂質Ｃ３４を含むアジュバントをさらに含む。
【００３３】
被験者への本発明に係る治療剤の投与は、乳癌幹細胞（ＢＣＳＣ）で発現する抗原を認識する抗体の産生を誘導し、この際、前記抗原は、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４からなる群から選択される。本発明は、本発明に係る治療剤を投与することを含む、乳癌の治療方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、発明の開示のいくつかの実施態様をさらに説明するためのものであり、１またはそれ以上の図面は、本明細書中の特定の実施形態の発明の詳細な説明と組み合わせて参照されることにより、本発明がより理解されうる。特許または出願は、少なくとも１つのカラーの図面を含む。カラーの図面を有する本特許権または特許出願公報のコピーは、請求により有料で庁から提供されうる。
【図１】図１は、Ｇｌｏｂｏ Ｈおよび切断型誘導体の構造を示す。
【図２】図２Ａ〜２Ｃは、それぞれモノクローナル抗体ＶＫ９およびＭｂｒｌ（Ｇｌｏｂｏ Ｈとの特異的結合）、並びに抗ＳＳＥＡ−３の特異的結合を示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｂは、Ｇｌｏｂｏ Ｈ複合体およびα−ＧａｌＣｅｒを接種したマウスの血清学的応答を示す。３匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの群は、１μｇの合成複合糖質を２μｇの複合糖質とともに用いて／用いないで皮下投与で接種させた。マウス血清は、ＩｇＭ（図３Ａ）およびＩｇＧ（図３Ｂ）抗体分析用にそれぞれ１：６０および１：２４０でそれぞれ希釈した。Ｃｙ３−抗マウスＩｇＧまたはＩｇＭ二次抗体を、ＰＭＴ５００で５３２ｎｍにおける蛍光検出に用いた。前記データは、３匹のマウス±ＳＥＭの平均蛍光強度で示す。
【図４】図４は、α−ＧＡｌＣｅｒおよびアナログを示す。
【図５】図５は、共役Ｇｌｏｂｏ Ｈおよびα―ＧａｌＣｅｒ誘導体をワクチン接種されたマウスのＩｇＭレベルを示す。図に示されるように、マウス血清は第２および第３ワクチン接種後に収集および分析した。Ｃｙ３第２抗−マウスＩｇＭは、ＰＭＴ４００、５３２ｎｍの条件で検出した。その結果を、３匹のマウス±ＳＥＭの平均蛍光強度で示す。
【図６】図６は、ワクチン接種後のマウスポリクローナル抗体（抗Ｇｌｏｂｏ Ｈ、抗Ｇｂ５、抗ＳＳＥＡ−４、および抗Ｇｂ４）の反応特異性を示す。マウス血清は、２μｇのアジュバントとともに用いて／用いないで、１．６μｇのＧＨ−ＤＴの第３のワクチン接種２週間後に得た（メス、Ｂａｌｂ／ｃ、筋肉注射）。前記ＩｇＧ力価は、糖鎖マイクロアレイで分析し、ＰＭＴ４００で、１０００（バッククラウンドの１０倍）以上のＭＦＩの最大希釈収率で定義した。各スポットは、マウスごとの力価を示す。
【図７】図７は、異なるアジュバントを用いた場合のＩｇＧ抗体対ＩｇＭ抗体の抗体力価を示す。
【図８】図８は、ＧＨ−ＫＬＨワクチンのアジュバント活性評価を示す。メスＢａｌｂ／ｃマウスに筋肉注射で１．６μｇのＧＨ−ＫＬＨおよび２μｇのアジュバントをワクチン接種し、ワクチン接種後、２週間ごとに採血した。前記血清を希釈し、マイクロアレイ分析した。
【図９】図９は、免疫付与後の抗体アイソタイプ特性を示す。マウスを上述のようにワクチン接種した。血清（１：６０で希釈）は、マイクロアレイ抗体サブクラス分析した（５３２ｎｍ、ＰＭＴ３００）。前記データは、３匹のマウス±ＳＥＭの平均蛍光強度で示す。
【図１０】図１０は、糖脂質アジュバントと異なる種類のＳＳＥＡ−３−ＤＴまたはＳＳＥＡ−４−ＤＴによって生じるＩｇＭ抗体対ＩｇＧ抗体の抗体力価を示す。
【図１１】図１１は、細胞表面の２４の糖鎖構造を示す。
【図１２Ａ】図１２Ａは、異なるワクチンで誘導されるＩｇＧの交差反応性実験を示す。図１２Ａ：Ｇｌｏｂｏ Ｈ−ＤＴおよびＣ１アジュバントによって誘導された抗Ｇｌｏｂｏ Ｈ ＩｇＧ。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、異なるワクチンで誘導されるＩｇＧの交差反応性実験を示す。図１２Ｂ：Ｇｂ５−ＤＴおよびＣ１アジュバントによって誘導された抗Ｇｂ５ ＩｇＧ。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、異なるワクチンで誘導されるＩｇＧの交差反応性実験を示す。図１２Ｃ：ＳＳＥＡ−４−ＤＴおよびＣ１アジュバントによって誘導された抗ＳＳＥＡ−４ ＩｇＧ。
【図１３】図１３は、マウス異種移植モデルを示す。２×１０５の４Ｔ１マウス転移性乳癌細胞を無菌ＰＢＳおよび調製し、ワクチン接種を受けたＢａｌｂ／ｃマウスに皮下投与した。マウスの腫瘍サイズはノギスで測定し、（長さ×高さ×幅）／２（ｍｍ３）で定義した。
【図１４】図１４は、Ｇｌｏｂｏ Ｈハーフエステルおよび複合糖質の合成スキームを示す。
【図１５】図１５は、原発性乳癌幹細胞におけるＳＳＥＡ−４発現のフローサイトメトリー分析を示す。ＢＣＳＣおよび非ＢＣＳＣ表面のＳＳＥＡ−４の発現は、４色の免疫蛍光染色、続くフローサイトメトリー分析によって評価した。左のパネルに示されるように、ＢＣＳＣは、ＣＤ４５−／ＣＤ２４−／ＣＤ４４＋細胞として定義し、非ＢＣＳＣは、その他のＣＤ４５−細胞集団として定義した。ＢＣＳＣおよび非ＢＣＳＣの目的の抗原の発現は、それぞれ中央および右のパネルに示されている。点線はアイソタイプの対照群を示し、数値は陽性細胞の割合を示す。
【図１６】図１６は、正常組織におけるＳＳＥＡ−４の発現の制限を示す。正常組織配列の免疫組織化学的染色により、乳房、小腸、および直腸のＳＳＥＡ−４の発現が分析された。ＳＳＥＡ−４のポジティブ染色では、頂側膜上皮細胞に制限される。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明は、ＤＴ−ＣＲＭ１９７が数十年間ジフテリアに対するワクチンとしてヒトに広く用いられてきただけでなく、高い免疫原性を有するため、Ｇｌｏｂｏ ＨおよびＳＳＥＡ−４のキャリアタンパク質に有用であるという驚くべき知見に関するものである。最も重要なことは、さまざまな複合糖質ワクチンが、ＦＤＡに承認されていることである。ジフテリア毒素交差反応物質１９７（ＤＴ−ＣＲＭ１９７）は、ＤＴの非毒性突然変異体であり、前記ＤＴは、正常分子の免疫原性と、ヘパリン結合性上皮成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）との結合能を共有する。ＤＴに対する特異的な細胞膜受容体は、しばしばがんで過剰発現する（Buzzi S. et al., Cancer Immunology, Immunotherapy (2004), 53(11):1041-1048）。
【００３６】
アジュバントとしてＣ３４を用いると、ＧＨ−ＤＴおよびＳＳＥＡ−４−ＤＴの両方が腫瘍抗原に対するＩｇＧ抗体をＩｇＭ抗体よりも多く誘導する免疫応答を最も効果的に示す。Ｃ３４と組み合わせたＧＨ−ＤＴは、Ｇｌｏｂｏ Ｈだけでなく、ＳＳＥＡ−３（Ｇｂ５）およびＳＳＥＡ−４をも中和する抗体を誘導し、この際、前記Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４は、乳癌細胞およびがん幹細胞に特異的である。
【００３７】
さらに、糖鎖マイクロアレイの開示は、抗体特異性試験について強力な基礎となり、ワクチン試験のための患者の同定および免疫付与後の免疫応答のモニタリングに有用である。
【００３８】
下記発明の詳細な説明において、実施されうる特定の実施形態を説明する方法として示される一部を形成する図面とともに説明する。これらの実施形態は、当業者が本発明を実施できるように詳細に記載され、その他の実施形態も実施可能であることが理解され、並びに本発明の技術的思想を逸脱することなく、その構造的、論理的、および電気的変更がされうる。したがって、下記実施形態の説明は、狭義に限定されるものではなく、本発明の技術的範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義される。
【００３９】
別途定義がない限り、すべての技術的および化学的用語は、本発明が属する分野における当業者に共通に理解されるものとして、同様の意味を有するものが使用されている。本明細書中に記載されたものと同等または等価の方法および物質は本発明の実施または試験に用いられうるが、好ましい方法および方法および物質が説明される。本明細書中で具体的に言及したすべての刊行物および特許文献は、本発明と関連して用いられうる刊行物に記載された、化学物質、細胞株、ベクター、動物、装置、統計的分析、および手法を含むすべての目的において参照により組み込まれる。本明細書中で引用したすべての刊行物は、当該技術分野における技能レベルの指標としてみなされる。本明細書の記載事項はいずれも、本発明が先発明についての開示に先行するものではないとの自認として解釈されるべきではない。
【００４０】
本発明に係る物質および方法を記載する前に、本発明は、記載される特定の方法、プロトコル、物質、および試薬に限定されず、多様なものでありうることが理解される。また、本明細書中で用いられる専門用語は、特定の実施形態を示すことのみを目的としているだけであり、本発明の技術的範囲を制限するものではない（添付の特許請求の範囲によってのみ制限される）ことが理解される。
【００４１】
定義
本明細書および添付の特許請求の範囲に用いられる、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、別に明確な記載が本文中にない限り、複数の引用を含むものであることに留意しなければならない。同様に、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１またはそれ以上」、および「少なくとも１つ」は、本明細書中で交互に用いられうる。また、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」、および「ｈａｖｉｎｇ」も交互に用いられうることに留意する。
【００４２】
本発明の実施は、別に規定がない限り、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学における当該技術分野の技術の範囲内の従来技術が利用されうる。当該技術は、文献において十分に説明される。例えば、Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, VoIs. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Antibodies: A Laboratory Manual, by Harlow and Lane s (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988); およびHandbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986)を参照。
【００４３】
本明細書中で用いられる用語「脂質」は、細胞シグナル経路に関与する任意の脂溶性（lipophilic）分子を意味する。
【００４４】
本明細書中で用いられる用語「糖脂質」は、細胞認識の標識としての機能を有する、脂質が結合した糖を意味する。
【００４５】
本明細書中で用いられる用語「アルファ−ガラクトシルセラミド」および「α−ＧａｌＣｅｒ」は、ナチュラルキラーＴ細胞を刺激してヘルパーＴ（ＴＨ）１およびＴＨ２サイトカインをともに産生する糖脂質を意味する。本明細書中で用いられる前記糖脂質誘導体Ｃ３４は、下記の構造を有する。
【００４６】
【化２】
【００４７】
本発明に係る前記α−ＧａｌＣｅｒアナログは、細胞起源のα−ＧａｌＣｅｒアナログ（グループＩ：Ｃ２、Ｃ３、およびＣ１４）、スルホン化により修飾されたα−ＧａｌＣｅｒアナログ（グループＩＩ：Ｃ４、Ｃ５、およびＣ９）、フェニルアルキル鎖のα−ＧａｌＣｅｒアナログ（グループＩＩＩ：Ｃ６−Ｃ８、Ｃ１０−Ｃ１１、Ｃ１５−Ｃ１６、Ｃ１８−Ｃ３４、Ｃ８−５、およびＣ８−６）、およびα−ＧａｌＣｅｒアナログが切断されたフィトスフィンゴシンを含む。Ｃ３４および他のアルファ−ガラクトシルセラミドアナログの構造、並びにそのアジュバントとしての用途は、その詳細が２００８年４月１４日に出願された、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６０２７５に開示されている。
【００４８】
Ｃ３４を含む合成α−ＧａｌＣｅｒアナログは、ＣＤ１ｄ分子と複合体を形成できる。合成α−ＧａｌＣｅｒアナログは、ＮＫＴのＴ細胞受容体に認識されうる。合成α−ＧａｌＣｅｒアナログは、ＴＨ１型応答、ＴＨ２型応答、もしくはＴＨ１型応答、およびＴＨ２型応答を起こしうる。前記α−ＧａｌＣｅｒアナログは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＮＫＴを活性化させうる。前記α−ＧａｌＣｅｒアナログは、ｉｎ ｖｉｖｏでＮＫＴを活性化させうる。
【００４９】
本明細書中で用いられる用語「糖鎖（glycan）」は、多糖またはオリゴ糖を意味する。本明細書中で用いられる糖鎖はまた、糖タンパク質、糖脂質、糖ペプチド、糖プロテオーム、ペプチドグリカン、リポ多糖、またはプロテオグリカンなどの複合糖質の糖質部分を意味する。糖鎖は、通常、単糖間における単一のＯ−グリコシド結合からなる。例えば、セルロースは、β―１，４結合したＤ−グルコースから構成される糖鎖（より具体的には、グルカン）であり、キチンは、β―１，４結合したＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンから構成される糖鎖である。糖鎖は、単糖残基のホモまたはヘテロ重合体であり、直鎖または分岐鎖でありうる。糖鎖は、糖タンバク質およびプロテオグリカンなどのタンパク質に結合して存在しうる。前記糖鎖は、一般的に、細胞の外面上に見られる。Ｏ−およびＮ−結合糖鎖は、真核生物において非常によく見られ、原核生物においても少数であるが見られうる。Ｎ−結合糖鎖は、シークオン配列におけるアスパラギンのＲ基の窒素（Ｎ）に結合して存在する。前記シークオンは、Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ配列であり、この際、Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸である。
【００５０】
本明細書中で用いられる用語「糖タンパク質」は、糖鎖を共有結合で修飾させたタンパク質を意味する。前記糖タンパク質には、下記４つのタイプがある：（１）Ｎ−結合糖タンパク質、（２）Ｏ−結合糖タンパク質（ムチン）、（３）グルコサミノグリカン（ＧＡＧ、プロテオグリカンとも呼ばれる）、（４）ＧＰＩアンカー。大抵の糖タンパク質は、構造的な微小不均一性（同一のグリコシル化部位に複数の異なる糖鎖構造が結合する）、および構造的な巨大不均一性（複数の部位および複数の糖鎖タイプの結合）を有する。
【００５１】
本明細書中で用いられる用語「抗原」は、免疫応答を起こすことができる任意の基質と定義される。
【００５２】
本明細書中で用いられる用語「免疫原」は、抗原またはＤＮＡワクチンのような抗原の産生を誘導できる基質を意味する。
【００５３】
本明細書中で用いられる用語「免疫原性」は、免疫応答を刺激する免疫原、抗原、またはワクチンの活性を意味する。
【００５４】
本明細書中で用いられる用語「免疫療法」は、予防目的／治療目的を達成するための、免疫応答を調節する概念に基づく多くの治療戦略を意味する。
【００５５】
本明細書中で用いられる用語「ＣＤ１ｄ」は、さまざまなヒト抗原提示細胞の表面に発現するタンパク質のＣＤ１（分化１群）ファミリーのメンバーを意味する。ＣＤ１ｄは脂質抗原活性ナチュラルキラーＴ細胞に提示される。ＣＤ１ｄは、糖脂質抗原結合中に深抗原結合溝を有する。樹状細胞上に発現するＣＤ１ｄ分子は、Ｃ３４等のα−ＧａｌＣｅｒアナログを含む糖脂質に結合して存在している。
【００５６】
本明細書中で用いられる用語「適応免疫系」は、高度に専門化された、全身性の細胞および病原性の抗原を除去する経路を意味する。前記適応免疫系の細胞は、白血球の一種であり、リンパ球と呼ばれている。Ｂ細胞およびＴ細胞は、リンパ球の主要な一例である。
【００５７】
本明細書中で用いられる用語「Ｔ細胞」および「Ｔｓ」は、細胞性免疫に主要な役割を果たす、リンパ球として知られている白血球群を意味する。Ｔ細胞は、細胞表面の存在するＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）と呼ばれる特有の受容体の存在によって、Ｂ細胞およびＮＫｓ等の他のリンパ球型と識別されうる。いくつかのＴ細胞のサブセットの相違は、それぞれ異なる機能を示す。ヘルパーＴ細胞（ＴＨ）は、適応免疫系の「仲介役」である。１度活性化されると、急速に分裂し、免疫応答を調節する、または「助ける」、サイトカインと呼ばれる低分子量タンパク質を分泌する。サイトカインのシグナルを受け取ることによって、これらの細胞は、異なるサイトカインを分泌するＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ１７、または他のサブセットの１つに分化する。
【００５８】
本明細書中で用いられる用語「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）は、細胞表面で主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）と複合体を形成する外部抗原を示す細胞を意味する。Ｔ細胞は、ＴＣＲによりこの複合体を認識しうる。ＡＰＣは、専門的または非専門的の２つのカテゴリーに分類される。樹状細胞（ＤＣ）は、専門的なカテゴリーに該当され、ＣＤ１と関連してＴ細胞に抗原提示能がある。典型的な実施において、本開示の方法を用いたＤＣは、ある実施におけるリンパ、または別の実施における骨髄性骨髄前駆細胞から分化した、いくつかのＤＣサブセットでありうる。
【００５９】
本明細書中で用いられる用語「未感作細胞」は、未分化の免疫細胞、例えば、未だ特異的病原体を認識するように分化されていないＣＤ４Ｔ細胞を意味する。
【００６０】
本明細書中で用いられる用語「ナチュラルキラー細胞」は、ウイルスまたは細胞内病原体に対する自然宿主の防御に寄与するインターフェロンで活性化された、リンパ系細胞のクラスを意味する。
【００６１】
本明細書中で用いられる用語「ナチュラルキラーＴ細胞」は、通常のＴｓおよびＮＫｓをともに有する性質／受容体を持つ、Ｔ細胞のサブセットを意味する。これらの細胞の多くは、非多形性ＣＤ１ｄ分子、自己および外部脂質と結合する抗原提示細胞、並びに糖脂質を認識する。ＮＫｓのＴＣＲは、ＣＤ１ｄ分子によって提示された糖脂質抗原（シャペロン）を認識できる。ＮＫＴｓの主要な応答は、刺激後の急速なＩＬ−４、ＩＦＮ−γ、およびＩＬ−１０を含むサイトカインの分泌、並びにそれによって影響が及ぼされる多様な免疫応答および発病過程である。ＮＫＴｓは、均一集団または不均一集団でありうる。一つの典型的な実施において、前記集団は、ヒトおよびマウス骨髄、並びにヒト肝Ｔ細胞集団、例えば、さまざまなＴＣＲｓで発現し、多量のＩＬ−４およびＩＮＦ−γを生産しうる、ＣＤ１ｄ反応性非インバリアントＴ細胞を含む、「非インバリアントＮＫＴｓ」でありうる。ＣＤ１ｄ依存性ＮＫＴｓの最も知られたサブセットは、インバリエントＴＣＲ−アルファ（ＴＣＲ−α）鎖を発現する。これらは、Ｉ型またはインバリエントＮＫＴｓ（ｉＮＫＴｓ）と呼ばれる。これらの細胞は、ヒト（Ｖα２１ｉＮＫＴｓ）およびマウス（Ｖα１４ＮｉＫＴｓ）間で維持され、多くの免疫学的過程に関連がある。
【００６２】
本明細書中で用いられる用語「サイトカイン」は、前駆細胞が異なる特異的な細胞タイプとなることによって変化する、遺伝子発現に通常関与する免疫細胞の分化過程の影響によって、免疫応答の強度および持続を調節する、任意の多数の小さい分泌タンパク質を意味する。サイトカインは、推定される機能、分泌細胞、または作用標的に基づき、リンホカイン、インターロイキン、およびケモカインとさまざまな命名がなされている。例えば、いくつかの共通するインターロイキンは、限定されないが、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２、ＩＮＦ−γ、ＴＮＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−２１、およびＴＧＦ−βを含む。
【００６３】
本明細書中で用いられる用語「ケモカイン」は、リンパ球の可動および活性化の手段を与える感染部位から放出される、任意のさまざまな小さい遊走性のサイトカインを意味する。ケモカインは、白血球を感染部位に引き付ける。ケモカインは、ケモカインを４つのグループに分類できる保存システイン残基を有する。前記グループとその代表的なケモカインは、Ｃ−Ｃケモカイン（ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ１α、およびＭＩＰ−１β）、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン（ＩＬ−８）、Ｃケモカイン（リンホタクチン）、並びにＣＸＸＸＣケモカイン（フラクタルカイン）である。
【００６４】
本明細書中で用いられる用語「ＴＨ２型応答」は、サイトカイン、インターフェロン、ケモカインの特定のタイプが産生される等のサイトカイン発現のパターンを意味する。典型的なＴＨ２サイトカインは、限定されないが、ＩＬ−４．ＩＬ−５、ＩＬ−６、およびＩＬ−１０を含む。
【００６５】
本明細書中で用いられる用語「ＴＨ１型応答」は、サイトカイン、インターフェロン、ケモカインの特定のタイプが産生される等のサイトカイン発現のパターンを意味する。典型的なＴＨ１サイトカインは、限定されないが、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＧＭＣＳＦ、およびＴＮＦ−βを含む。
【００６６】
本明細書中で用いられる用語「ＴＨ１バイアス」は、免疫原性応答を意味し、この際、ＴＨ１サイトカインおよび／またはケモカインの産生は、ＴＨ２サイトカインおよび／またはケモカインの産生よりも大きく増加する。
【００６７】
本明細書中で用いられる用語「エピトープ」は、抗体またはＴ細胞レセプターの抗原結合部位と接触する抗原分子の一部として定義される。
【００６８】
本明細書中で用いられる用語「ワクチン」は、全病原微生物（死滅または弱毒化）またはタンパク質、ペプチド、または多糖などの微生物の成分からなる抗原、すなわち、微生物が引き起こす疾病に対する免疫を付与する抗原を含む製剤を意味する。ワクチン製剤は天然または組換えＤＮＡ技術によって合成もしくは誘導させたものでありうる。
【００６９】
本明細書中で用いられる用語「免疫学的アジュバント」は、免疫原とともに用いられる、免疫原に対する免疫応答を増強または改善する物質を意味する。本開示に係るα―ＧａｌＣｅｒアナログは、より強力にワクチンに応答するように、ワクチンを投与した患者の免疫系を刺激することによって、ワクチンの効果を改善または増強するための、免疫学的アジュバントとして用いられる。一つの典型的な実施において、Ｃ３４アナログはアジュバントとして用いられる。
【００７０】
本明細書中で用いられる用語「ミョウバンアジュバント」は、免疫アジュバント活性を有するアルミニウム塩を意味する。この物質は、溶液中においてタンパク質抗原を吸収および沈殿させ、当該沈殿物は、接種部位において形成された貯蔵ワクチンから抗原の持続的な放出を促進することによって、ワクチンの免疫原性を向上する。
【００７１】
本明細書中で用いられる用語「抗がん免疫治療活性剤」は、腫瘍を阻害、減少および／または除去する、本開示に係るワクチンによって発生した抗体を意味する。
【００７２】
本明細書中で用いられる用語「抗原特異的」は、特定抗原の供給、または抗原フラグメントの供給、その結果生じる特異的細胞増殖のような細胞集団の性質を意味する。
【００７３】
本明細書中で用いられる用語「フローサイトメトリー」または「ＦＡＣＳ」は、流体の流れの中の懸濁化した粒子または細胞の物理的または化学的性質を、光学的または電子的検出装置を通して分析する技術を意味する。
【００７４】
後述するペプチド中のアミノ酸残基は、以下のように省略する：フェニルアラニンはＰｈｅまたはＦ；ロイシンはＬｅｕまたはＬ；イソロイシンはＩｌｅまたはＩ；メチオニンはＭｅｔまたはＭ；バリンはＶａｌまたはＶ；セリンはＳｅｒまたはＳ；プロリンはＰｒｏまたはＰ；トレオニンはＴｈｒまたはＴ；アラニンはＡｌａまたはＡ；チロシンはＴｙｒまたはＹ；ヒスチジンはＨｉｓまたはＨ；グルタミンはＧｌｎまたはＱ；アスパラギンはＡｓｎまたはＮ；リジンはＬｙｓまたはＫ；アスパラギン酸はＡｓｐまたはＤ；グルタミン酸はＧｌｕまたはＥ；システインはＣｙｓまたはＣ；トリプトファンはＴｒｐまたはＷ；アルギニンはＡｒｇまたはＲ；およびグリシンはＧｌｙまたはＧである。アミノ酸のさらなる記述に対しては、Proteins: Structure and Molecular Properties by Creighton, T. E., W. H. Freeman & Co., New York1983を参照。
【００７５】
本明細書中に開示される組成物は、本開示に接した当業者によって特定可能な追加の活性化剤、キャリア、ビヒクル、賦形剤、または助剤とともに含む、医薬組成物または栄養補助組成物を含みうる。
【００７６】
前記医薬組成物または栄養補助組成物は好ましくは、少なくとも１つの薬学的に許容されるキャリアを含む。このような医薬組成物において、本明細書中に開示された組成物は、「活性化合物」を形成し、「活性剤」として参照される。本明細書中で用いられる用語「薬学的に許容されるキャリア」は、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などの、投与薬剤と相溶性が高いものを含む。補足的な活性化合物も組成物中に組み込まれうる。医薬組成物は、目的とする投与経路に適するように製剤化される。投与経路の例として、例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与などの非経口投与、経口投与（例えば、吸入投与）、経皮投与（局所投与）、経粘膜投与、および直腸投与を含む。非経口投与、皮内投与、または皮下投与に適用するために用いられる溶液または懸濁液は、以下の成分を含みうる：注射用蒸留水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒などの無菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤；エチレンジアミンテトラ酢酸等のキレート剤；酢酸、クエン酸、またはリン酸等の緩衝剤；および塩化ナトリウムまたはＤグルコース等の等張化剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムの等の酸または塩基を用いて調製されうる。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチックで製造されたアンプル、使い捨てシリンジ、または多用量バイアルに封入されうる。
【００７７】
本明細書中で用いられる被験者は、ヒトおよびヒト以外の霊長類（例えば、ゴリラ、マカク、マーモセット）、家畜動物（例えば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、およびブタ）、ペット（例えば、犬、猫）、実験室試験の動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター）、捕獲野生動物（例えば、キツネ、シカ）、並びに本開示に係る抗原から恩恵を受けうる他の任意の動物を意味する。本開示の抗原から恩恵を受けうる動物のタイプには制限はない。ヒトであるかヒト以外の生物であるかにかかわらず、被験者を患者、個体、動物、宿主、またはレシピエントと称することがある。
【００７８】
注射の用途に好適な医薬組成物は、無菌水溶液（水溶性）、または無菌注射剤または無菌分散剤の即時調製用の分散剤および無菌粉末を含む。静脈内投与に好適なキャリアは、生理食塩水、静菌水溶液、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（BASF, Parsippany, N.J.社）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。すべての場合において、前記組成物は、無菌および容易に注射可能できる程度の溶液でなければならない。また、製造および保存の状態で安定であり、細菌および真菌などの微生物の汚染の作用から保護されなければならない。前記キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの安定な混合物を含む溶媒または分散媒でありうる。好適な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティング剤の使用によって、分散剤の場合には必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持されうる。微生物の作用は、さまざまな抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールアスコルビン酸、チメロサールなどによって防止されうる。多くの場合において、等張化剤、例えば、糖、またはマンニトール、ソルビトール、もしくは塩化ナトリウムなどのポリアルコールを組成物中に含むことが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、組成物中に吸収を遅延させる添加剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含ませることによって実現されうる。
【００７９】
無菌注射剤は、必要に応じて上記列挙された成分の１または組み合わせを含む好適な溶媒に、必要量の活性化合物を添加し、次いでろ過滅菌することによって調製されうる。通常、分散剤は、基礎分散媒体および上記列挙された他の必要な成分を含む無菌ビヒクル中に活性化合物を組み込むことによって調製される。無菌注射剤を調製するための無菌粉末の場合には、調製方法は真空乾燥および凍結乾燥を含み、あらかじめ無菌ろ過した溶液から活性成分に任意の必要な追加の成分を加えた活性成分の粉末が得られる。
【００８０】
経口用組成物は、通常、不活性希釈剤または食用キャリアを含む。治療的経口投与を目的として、活性化合物は、賦形剤に混和され、錠剤、トローチ剤、または、ゼラチンカプセルのようなカプセル剤の形態で使用される。経口用組成物はまた、口内洗浄液として使用するために、分散媒を用いて調製されうる。薬学的に混和可能な結合剤、またはアジュバント物質は、組成物の一部として含みうる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは任意の下記の成分、または同等の性質の化合物を含みうる：微結晶性セルロース、トラガカントゴム、またはゼラチンなどの結合剤；デンプン、乳糖などの賦形剤;アルギン酸、プリモゲル、もしくはコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはステロテス（sterotes）などの滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；スクロースもしくはサッカリンなどの嬌味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ芳香剤などの芳香剤。
【００８１】
吸入投与に対しては、化合物は、好適な推進剤、例えば二酸化炭素などの気体、または噴射器を含む加圧容器またはディスペンサーから、エアロゾルの形態で供給される。
【００８２】
また、全身投与は、経粘膜投与または経皮投与でありうる。経粘膜投与または経皮投与に対しては、バリアを通過するのに好適な浸透剤が製剤において使用される。このような浸透剤は当該技術分野において周知であり、例えば、経粘膜投与においては、洗浄剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は鼻腔用スプレーまたは坐剤の使用によって行われうる。経皮投与においては、活性化合物は、当該技術分野において周知の軟膏剤、ゲル化剤、またはクリーム剤に製剤化される。化合物はまた、直腸への供給のため、坐剤（例えば、ココアバターおよび他のグリセリン坐剤などの従来の坐剤の基材を含む）または停留かん腸の形態で調製されうる。
【００８３】
実施によると、活性化合物はキャリアを含んで調製され、植え込み型送達システムおよびマイクロカプセル型送達システムを含む、放出制御製剤などの体内からの迅速な除去を防ぐ。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルト酸エステル、およびポリ乳酸などの生分解性、生体適合ポリマーが用いられうる。製剤化などの調製方法は、当業者にとって明らかでありうる。また、原料はアルザコーポレーションおよびノバファーマシューティカルズ社の市販品から得られうる。リポソーム懸濁化剤（モノクローナル抗体を用いた感染細胞への細胞特異抗原にターゲティングしたリポソームを含む）もまた、薬学的に許容されるキャリアとして使用されうる。これらは、当業者に公知の方法、例えば、本明細書に参照により組み込まれる、米国特許第４，５２２，８１１号明細書に記載された方法に従い調製されうる。
【００８４】
投与容易な用量単位形態および均一な用量とした経口組成物または非経口組成物に設計することが好ましい。本明細書中で用いられる用量単位形態は、治療される被験者に統一された用量として適する身体的に個別の単位を意味し、各単位は、必要とする薬学的キャリアと関連して、望みの治療効果が得られるように計算された活性化合物の所定量を含む。
【００８５】
化合物などの毒性および治療効果、例えばＬＤ５０（集団の５０％の致死量）およびＥＤ５０（集団の５０％の治療有効量）は、細胞培養または動物実験における標準的な手順によって決定されうる。毒性および治療の有効性の間の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表されうる。高い治療指数を示す化合物が調製される。有害副作用を示す化合物は用いられうるが、非感染細胞への損傷の可能性を最小限にするように、感染部位に対する化合物などの標的とする輸送システムをデザインするような注意を要し、これによって副作用が少なくなる。
【００８６】
細胞培養アッセイおよび動物実験により得られるデータは、ヒトにおける使用する用量の範囲の決定に用いられうる。化合物などの用量は、好ましくは、ＥＤ５０を含み、低毒性または非毒性の血中濃度の範囲内とする。用量は、用いられる剤形および利用する投与経路に応じて、前記範囲内で変化しうる。本開示に係る方法において使用される任意の化合物に対し、治療有効量は、始めは細胞培養アッセイから評価されうる。用量は、動物モデルにおいて、細胞培養で決定されるＩＣ５０（例えば、試験化合物の症状を最大抑制する半分の濃度）を含む、循環血漿濃度の範囲で決定されうる。このような情報は、ヒトにおける、より的確な有効量の決定に用いられうる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィによって測定されうる。
【００８７】
本明細書に定義されるように、活性化合物の治療有効量（例えば、有効量）は約０．００１〜１００ｇ／ｋｇ体重の範囲、または過度の実験なく、専門化によって明らかであり、理解されうる他の範囲でありうる。専門家は、被験者の有効な治療に必要とされる用量および時間について、特に限定されないが、病気または疾病の重症度、既往歴、被験者の全体的な健康状態および年齢、および他の症状を含む一定の要因が影響を及ぼすことを理解している。
【００８８】
他の実施態様によると、１またはそれ以上の一部のキットが、当業者によって想定され、本明細書中に開示される方法の少なくとも１つを実施するためのものである前記キットの一部は、２またはそれ以上の組成物を含み、前記組成物は、上述の方法の少なくとも１つに従い、本明細書中に開示された組成物の有効量を単独または組み合わせて含みうる。
【００８９】
前記キットはまた、場合によっては、活性化剤、生物学的反応の識別子、または本開示に接した当業者によって識別可能な他の化合物を含有する組成物を含む。前記キットはまた、少なくとも１つの本明細書中に開示された組成物の有効量または細胞株を含有する組成物を含む。使用されるキットの一部の前記組成物および細胞株は、当業者に理解される手順に従い、本明細書中に開示される少なくとも１つの方法を実施するために用いられうる。
【００９０】
本明細書中で用いられる用語「ポリペプチド」は、任意のアミノ酸残基の多量体またはポリマーを意味する。ポリペプチドは、２またはそれ以上のポリペプチド鎖から構成されうる。ポリペプチドは、タンパク質、ペプチド、およびオリゴペプチドを含む。ポリペプチドは直鎖または分岐鎖でありうる。ポリペプチドは、修飾アミノ酸残基、アミノ酸アナログ、または非天然アミノ酸残基を含み、非アミノ酸残基に組み込まれうる。天然または人工的な修飾、例えば、ジスルフィド結合、グリコシル化、脂質化、メチル化、アセチル化、リン酸化、または標識化合物への結合のような操作であるかを問わず、修飾されたアミノ酸ポリマーは、前記定義の範囲内である。
【００９１】
本明細書中で用いられる用語「特異的結合」は、結合対（例えば、抗体および抗原）間の相互作用を意味する。さまざまな例において、特異的結合は、約１０６モル／リットル、約１０７モル／リットル、もしくは約１０８モル／リットル、またはそれ以下の親和性定数で示されうる。
【００９２】
本発明に係るがんワクチン
本発明に係る一実施形態は、Ｇｌｏｂｏ Ｈまたはそのフラグメント（例えば、胚発生段階特異抗原−３（ＳＳＥＡ−３、Ｇｂ５としても知られている）またはＳＳＥＡ−４）のいずれか一方、およびアジュバントを含む免疫組成物を、必要に応じて被験者に投与するがんの治療方法である。標的のがんのタイプは、限定されないが、乳癌（ステージ１−４を含む）、肺癌（例えば、小細胞肺癌）、肝癌（例えば、肝細胞癌）、口腔癌、胃癌（Ｔ１−Ｔ４を含む）、大腸癌、鼻咽頭癌、皮膚癌、腎癌、脳腫瘍（例えば、星状細胞腫、多形性膠芽腫、および髄膜腫）、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、膀胱癌、および子宮内膜、横紋筋肉腫、骨肉腫、平滑筋肉腫、並びに消化管間質腫瘍を含む。
【００９３】
部位により分類されたがんは、口腔癌および咽頭癌（唇、舌、唾液腺、口腔底部、歯茎および他の口腔、鼻咽頭、扁桃腺、中咽頭、下咽頭、他の口腔／咽頭）；消化器癌（食道；胃；小腸；大腸および直腸；肛門、肛門管、および肛門直腸；肝臓；肝内胆管；胆嚢；他の胆管；膵臓；後腹膜；腹膜、網、および腸間膜；他の消化器）；呼吸器癌（鼻腔、中耳、および洞；喉頭；肺および気管支；胸膜；気管、縦隔、および他の呼吸器）；中皮腫の癌；骨および滑膜；心臓を含む軟組織；黒色腫および非上皮性皮膚癌を含む皮膚癌；カポジ肉腫および乳癌；女性生殖器系癌（子宮頸；子宮体；子宮、ＮＯＳ；卵巣；膣；外陰部；および他の女性生殖器）；男性生殖器系癌（前立腺；精巣；陰茎；および他の男性生殖器）；泌尿器系癌（膀胱；腎臓および腎盂；尿管；および他の泌尿器）；眼および眼窩の癌；脳および神経系癌（脳；および他の神経系癌）；内分泌系癌（甲状腺および胸腺を含む他の内分泌腺）；リンパ腫（ホジキン病および非ホジキンリンパ腫）、多発性骨髄腫、白血病（リンパ性白血病；骨髄性白血病；単球性白血病；および他の白血病）を含む。
【００９４】
本発明による癌ワクチンの好適な標的となりうる、組織型によって分類された他の癌は、限定されないが、腫瘍、悪性；癌、ＮＯＳ；癌、未分化、ＮＯＳ；巨細胞および紡錘細胞癌、ＮＯＳ；小細胞癌、ＮＯＳ；乳頭癌、ＮＯＳ；扁平上皮癌、ＮＯＳ；リンパ上皮癌；基底細胞癌、ＮＯＳ；毛母癌；移行上皮癌、ＮＯＳ；乳頭移行上皮癌；腺癌、ＮＯＳ；タストリノーマ、悪性；胆管癌：肝細胞癌、ＮＯＳ；肝細胞癌および胆管癌の合併；索状腺癌；腺様嚢胞癌；腺腫性ポリープにおける腺癌；腺癌、家族性大腸ポリポーシス;固形癌、ＮＯＳ；カルチノイド腫瘍、悪性；細気管支肺胞癌；乳頭腺癌、ＮＯＳ；嫌色素癌；好酸性癌；好酸性腺癌；好塩基性癌；透明細胞腺癌、ＮＯＳ；顆粒細胞癌；濾胞状腺癌、ＮＯＳ；乳頭腺癌および濾胞状腺癌；非被嚢性硬化性癌；副腎皮質細胞癌；類内膜癌；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳垢腺癌；粘膜表皮癌；嚢胞腺癌、ＮＯＳ；乳頭状嚢胞腺癌、ＮＯＳ；乳頭漿液性嚢胞腺；ムチン性嚢胞腺癌；粘液腺癌；印環細胞癌；浸潤性導管癌；髄様癌、ＮＯＳ；小葉癌；炎症性乳癌；パジェット病、乳房；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；腺癌ｗ／扁平上皮化生；胸腺腫、悪性；卵巣間質性腫瘍、悪性；卵胞膜細胞腫、悪性；顆粒膜細胞腫、悪性；セルトリ・間質細胞腫瘍、悪性；セルトリ細胞癌；ライディッヒ細胞腫、悪性；脂質細胞腫瘍、悪性；傍神経節腫、悪性；乳房外傍神経節腫、悪性；褐色細胞腫；グロームス腫瘍；悪性黒色腫、ＮＯＳ；メラニン欠乏性黒色腫；表在拡大型黒色腫；巨大色素性母斑における悪性黒色腫；類上皮細胞黒色腫；青色母斑、悪性；肉腫、悪性；線維肉腫、ＮＯＳ；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫、ＮＯＳ；平滑筋肉腫、ＮＯＳ；横紋筋肉腫、ＮＯＳ；胎児性横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質肉腫、ＮＯＳ；混合腫瘍、悪性、ＮＯＳ；ミュラー管混合腫瘍；腎芽細胞腫；肝芽腫；癌肉腫、ＮＯＳ；間葉腫、悪性；ブレンナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫、ＮＯＳ；中皮腫、悪性；未分化胚細胞腫；胚性癌腫、ＮＯＳ；奇形腫、悪性、ＮＯＳ；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛癌；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管周囲細胞腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫、ＮＯＳ；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫、ＮＯＳ；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉性軟骨肉腫；骨巨細胞腫；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍、悪性；エナメル上皮肉腫；エナメル上皮腫、悪性；エナメル上皮線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；神経膠腫、悪性；上衣腫、ＮＯＳ；星状細胞腫、ＮＯＳ；原形質性星状細胞腫；線維性星状細胞腫；星状芽細胞腫；膠芽細胞腫、ＮＯＳ；乏突起膠腫、ＮＯＳ；希突起グリオーマ；未分化神経外胚葉性腫瘍；小脳肉腫、ＮＯＳ；神経節芽細胞腫；神経芽細胞腫、ＮＯＳ；網膜芽腫、ＮＯＳ；嗅神経原性腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫、悪性；顆粒細胞腫、悪性；悪性リンパ腫、ＮＯＳ；ホジキン病、ＮＯＳ；ホジキン傍肉芽腫、ＮＯＳ；悪性リンパ腫、小リンパ球性；悪性リンパ腫、大細胞、びまん性；悪性リンパ腫、濾胞性、ＮＯＳ；菌状息肉腫；その他の特定の非ホジキンリンパ腫；悪性組織球増殖症；多発性骨髄腫；肥満細胞腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病、ＮＯＳ；リンパ性白血病、ＮＯＳ；形質細胞白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞性白血病；骨髄性白血病、ＮＯＳ；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病、ＮＯＳ；肥満細胞性白血病；巨核芽球性白血病；骨髄性肉腫；および有毛細胞白血病を含む。
【００９５】
本明細書中で用いられる用語「治療」は、がん、がんの症状、またはがんの素因の治療、治癒、緩和、軽減、変化、是正、改善、好転または影響を目的として、がん、がんの症状、またはがんの素因を有する被験者への１またはそれ以上の活性化剤を含む組成物の適用または投与を意味する。本明細書中で用いられる「有効量」は、被験者に治療効果を与えるのに必要な、１またはそれ以上の他の活性化剤を単独または組み合わせた、各活性化剤の量を意味する。有効量は、当業者に理解されるように、投与経路、用いる賦形剤、併用する他の活性化剤に応じて変化する。
【００９６】
上述の方法において用いられる免疫組成物は、Ｇｌｏｂｏ Ｈまたはそのフラグメントである糖鎖（例えば、糖部分を含む分子）およびアジュバントを含みうる。Ｇｌｏｂｏ Ｈは、６糖類のエピトープ（Fucα1→2Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glc）、および任意の非糖部分を含む糖鎖である。前記フラグメントは、６糖類のエピトープのフラグメント、および適用可能であれば非糖部分を含む糖鎖である。これらのオリゴ糖は、所定の方法によって調製されうる（Huang et al., Proc.Natl. Acad. Sci USA 103:15-20 (2006)を参照）。所望であれば、非糖部分と結合されうる。
【００９７】
米国特許出願第１２／４８５，５４６号は、（１）Ｇｌｏｂｏ Ｈの直接前駆体であるＳＳＥＡ−３が乳癌幹細胞において高レベルで発現し、乳癌治療に好適な標的として提供され、（２）α―ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）が、抗Ｇｌｏｂｏ Ｈおよび抗ＳＳＥＡ−３抗体の賛成を促進する有効なアジュバントであるという予想外の発見に基づくものである。
【００９８】
米国特許出願第１２／４８５，５４６号は、Ｇｌｏｂｏ Ｈまたはそのフラグメント（例えば、ＳＳＥＡ−３）、およびアジュバント（例えば、α−ＧａｌＣｅｒ）を含む免疫組成物を特徴とする。Ｇｌｏｂｏ Ｈまたはそのフラグメントは、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と共役しうる。被験者（例えば、ヒト）に投与した場合、この免疫組成物は、Ｇｌｏｂｏ Ｈまたはそのフラグメントを標的とした免疫応答（例えば、抗体産生）を引き起し、このためがん（例えば、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、および肺癌）の治療に有効である。
【００９９】
米国特許出願第１２／４８５，５４６号は、非ヒト哺乳動物（たとえば、マウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、またはウマ）に上述の免疫組成物を投与することによって、Ｇｌｏｂｏ Ｈまたはそのフラグメントに特異的な抗体を産生し、Ｇｌｏｂｏ Ｈまたはそのフラグメントと結合する抗体を哺乳動物から単離する方法に関する。
【０１００】
前記開示に記載されたＧｌｏｂｏ Ｈまたは他の糖鎖は、ＤＴ−ＣＲＭなどのタンパク質キャリアと共役している。Ｃ３４のようなアジュバントおよび任意の薬学的に許容されるキャリア（例えば、リン酸緩衝生理食塩水、または重炭酸塩溶液）にこれらを混合して、従来の方法により免疫組成物（例えば、ワクチン）を形成する。米国特許第４，６０１，９０３号明細書、４，５９９，２３１号明細書、および４，５９６，７９２号明細書を参照。前記組成物は、注射用として、溶液または懸濁液として調製され、前記キャリアは、投与方法および投与経路に基づき、および標準的な薬学の慣習に基づき選択される。好適な薬学的キャリアおよび希釈剤、並びに使用のための薬学的な必要な物は、レミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンスに記載されている。免疫組成物は、アジュバントとしてα−ＧａｌＣｅｒを含むことが好ましい。アジュバントの他の例は、限定されないが、コレラトキシン、大腸菌易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）、リポソーム、免疫刺激複合体（ＩＳＯＣＯＭ）、または免疫刺激配列オリゴデオキシヌクレオチドを含む。前記組成物はまた、ｉｎ ｖｉｖｏ供給を促進するポリマーを含みうる。Audran R. et al. Vaccine 21:1250-5, 2003；およびDenis-Mize et al. Cell Immunol., 225:12-20, 2003を参照。必要であれば、Ｇｌｏｂｏ Ｈまたはそのフラグメント中の糖部分に対する免疫応答を引き起こす組成物の能力を増強するために、さらに湿潤剤または乳化剤などの補助物質、またはｐＨ調整剤を含んでいてもよい。本明細書中に記載される免疫組成物は、非経口的に投与（例えば、静脈注射、皮下注射、または筋肉注射）されうる。また、坐剤および経口製剤を含む他の投与方法が好ましい場合もある。坐剤について、結合剤およびキャリアは、例えば、ポリアルケングリコールまたはトリグリセリドを含みうる。経口製剤は、例えば、サッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムなどの医薬品等級などの通常用いられる賦形剤を含みうる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤、または粉末剤の形態をとり、本明細書中に記載された免疫組成物の１０−９５％を含みうる。
【０１０１】
免疫組成物は製剤の調剤量と両立できる態様で、治療上、有効で、保護的で、かつ免疫原性の量で投与される。前記投与量は、治療する被験者の、例えば、個人の抗体産生能、および必要であれば細胞性免疫応答を誘導に依存する。投与を必要とする活性成分の正確な量は、医師の判断に依存する。しかしながら、好適な用量の範囲は、当業者によって容易に決定可能である。また、初回投与量および追加抗原投与量の好適な投与計画は変化するが、初回投与量、続く二回目投与量を含みうる。ワクチンの用量は、投与経路に依存し、宿主の大きさによって変化しうる。
【０１０２】
本発明に係る前記免疫組成物は、動物中の、がんの治療および診断に用いられうる抗体を産生するために用いられうる。動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、およびウマ）において、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、並びにそのフラグメントを作製する方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Harlow and Lane, (1988) Antibodies：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New Yorkを参照。用語「抗体」は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（一本鎖抗体）、およびｄＡｂ（抗体ドメイン；Ward, et. al. (1989) Nature, 341, 544）などの天然の免疫グロブリン分子、およびそのフラグメントを含む。
【０１０３】
Ｇｌｏｂｏ Ｈ−ＤＴ−ＣＲＭ１９７および関連ワクチン
Ｇｌｏｂｏ Ｈ（１）およびそのフラグメント２−１０は、本明細書中に記載される方法に従って合成される。共役タンパク質に関しては、図１４で示されるように、精製Ｇｌｏｂｏ Ｈハーフエステルをキャリアタンパク質とインキュベートさせる。
【０１０４】
前記Ｇｌｏｂｏ Ｈ−タンパク質共役体は、各キャリアタンパク質上のＧｌｏｂｏ Ｈ分子の数を決定するために、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析によって評価する。組み込まれたＧｌｏｂｏ Ｈの平均値を表１に示す。
【０１０５】
【表１】
【０１０６】
ａＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにおけるｍ／ｚピーク；Ｎ．Ｄ．：未決定；＊ＧＨ−ＫＬＨはＯｐｔｉｍｅｒ社から提供された
ＧＨ−ＫＬＨ共役体は、主により大きいサイズおよびＫＬＨのＬｙｓ残基数が多いという要因により、ＫＬＨのＧｌｏｂｏ Ｈ結合の最大数を示した。ｐ−ニトロフェニルリンカーを用いた同様のカップリング処理を、ウイルス膜に１００，０００以上のＬｙｓ残基を含む破傷風モザイクウイルスに適用した。しかしながら、４℃のリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７．２）中でのウイルスの反応性に対するウイルスの不安定性が、さらなる進展において大きな懸念であった。また、ＧＨ−ＢａＭＶ１６は、サイズが非常に大きいため、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析による検出が制限された。
【０１０７】
合成Ｇｌｏｂｏ Ｈおよび切断フラグメント（図１）は、還元末端にペンチルアミンリンカーで結合し、ＮＨＳがコートされたスライドガラス上に共有結合で固定された。１１個のオリゴ糖の９個が、マイクロアレイ上にプリントされるように選択された。それぞれのマイクロアレイスライドに、９個のＧｌｏｂｏ Ｈアナログ（ＳＳＥＡ−４、ＧＨ、Ｇｂ５、Ｇｂ４、Ｇｂ３、Ｇｂ２、ＢＢ４、ＢＢ３、およびＢＢ２）５０μＭをそれぞれ１２個ずつスポットした。
【０１０８】
マイクロアレイ上の炭化水素を検証するために、マウスモノクローナル抗体（ＧｌｏｂｏＨ用のＶＫ９およびＭｂｒｌ、並びに抗ＳＳＥＡ−３）を用いて、それぞれの二次抗体（ヤギ抗−マウスＩｇＧおよびＩｇＭ）を特異的結合の試験に用い、その結果を図２Ａ〜２Ｃに示す。前記データは、ＶＫ９およびＭｂｒｌの両方がＧｌｏｂｏ Ｈおよび４糖類であるＢＢ４の外面を認識し、ＭＢｒｌは、ＭＭ３もわずかに認識したことを示唆している。また、抗ＳＳＥＡ−３抗体は、交差反応を起こすことなく、特異的にＳＳＥＡ−３抗原（Ｇｂ５）を認識した。前記結果から、Ｇｌｏｂｏ Ｈマイクロアレイは、免疫付与されたマウスから得られるポリクローナル抗体の特異性および効力の分析に利用されうることを示している。
【０１０９】
すでに報告されているように、合成Ｇｌｏｂｏ Ｈワクチンおよび併用するＱＳ−２１を用いたマウスの免疫付与は、ヒト乳癌細胞に対する抗体を産生するが、マウス抗体は、いくつかの増強ワクチン接種の後であっても、主にＩｇＭである（Ragupathi G, et al. (1997) Angew Chem Int Ed 36:125-128）。
【０１１０】
マウスのグループに、糖脂質アジュバントであるα-ＧａｌＣｅｒ（Ｃ１）と共役した、または共役していない合成Ｇｌｏｂｏ Ｈを１μｇ皮下投与し、免疫付与した。その結果、ＩｇＭの誘導に最も有効な免疫原がＧＨ−ＫＬＨ、ＧＨ−ＤＨ、およびＧＨ−ＢＶ、次いでＧＨ−ＴＴ、ＧＨ−ＢＳＡであること（図３Ａに要約される）、並びにα−ＧａｌＣｅｒがＩｇＭ抗体を高いレベルに誘導する免疫応答を刺激できることが分かった。同様の傾向がマウスＩｇＧ抗体においても観測され（図３Ｂ）、ＩｇＧレベルはＩｇＭレベルよりも相対的に高かった。簡潔にいうと、合成複合糖質の炭化水素の密度がより低いにもかかわらず、ＧＨ−ＤＴは、ＧＨ−ＫＬＨと同様の免疫原性を示し、アジュバントであるα−ＧａｌＣｅｒは、免疫応答の増強を示した。
【０１１１】
α−ＧｌａＣｅｒは、ＧＨ−ＤＴに対するアジュバント効果を示したことから、Ｃ１よりもアジュバント活性の高い他の糖脂質を試験し、その結果を図４に示した。マウスのグループに、糖脂質を有する、または有さないＧＨ−ＤＴおよびＧＨ−ＢＶを用いて免疫付与した。血清を得て、糖鎖マイクロアレイ解析を行った。一般的に、マウス抗Ｇｌｏｂｏ Ｈ ＩｇＧ力価は、免疫付与が進行すると増強するが、ＩｇＭレベルは、ワクチン接種の時間にほとんど無関係である（図５）。ＧＨ−ＢＶをワクチン接種したグループのうち、糖脂質−ワクチン処理およびワクチンの単独処理の間で、ＩｇＭレベルに有意な差はなかった。前記結果は、糖脂質と一緒に用いたＧＨ−ＢＶは有効な免疫療法ではないことを示唆するが、弱い免疫原性は、ＢａＭＶが不安定であるという特徴によるものである可能性がある。それにもかかわらず、α−ＧａｌＣｅｒアナログ、特に７ＤＷ８−５は、ＧＨ−ＤＴとうまく協力して、マウスの免疫応答を誘導した。
【０１１２】
興味深いことに、マウスポリクローナルＩｇＧ抗体は、ＧＨ−ＤＴおよび様々な糖脂質アジュバントによって産生され、Ｇｌｏｂｏ Ｈを中和するだけでなく、Ｇｂ５、ＳＳＥＡ−４、およびＧｂ４と交差反応し、Ｃ３４は最も有効な糖脂質アジュバントであった（図６）。ＩｇＭよりも力価がより高いＩｇＧを誘導しうる新規ワクチン組成物を探索するために、Ｇｌｏｂｏ Ｈ−ＤＴ複合体および糖脂質Ｃ１もしくはＣ３４、市販のＡｌＰＯ４（リン酸アルミニウム）、またはＭＦ５９を試験した。
【０１１３】
驚くべきことに、糖脂質Ｃ３４を含むＧｌｏｂｏ Ｈ−ＤＴは、３回のワクチン投与後にほとんど独占的にＩｇＧ抗体を誘導する（図７）。要約すると、ＧＨ−ＤＴ複合体と組み合わせた新規糖脂質アジュバント７ＤＷ８−５は、抗Ｇｌｏｂｏ ＨのＩｇＧおよびＩｇＭの両方を増強することができ、ＧＨ−ＤＴと組み合わせた糖脂質アジュバントＣ３４は、ＩｇＭよりも抗体力価が高いＩｇＧを誘導しうる。これらは、Ｇｂ５抗原およびＳＳＥＡ−４抗原に対して異なる結合親和性を示し、ともに乳癌幹細胞の表面に発現する。
【０１１４】
Ｇｌｏｂｏ Ｈワクチンにおける異なる糖脂質アジュバントの効果をさらに比較するために、ＧＨ−ＫＬＨを有する７つのマウスのグループに免疫付与した。この結果、糖脂質
を含むマウスワクチンが、抗Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体を高いレベルで誘導することを示唆した（図８）。ＭＦ５９は、強力なアジュバントであるが、ＧＨ−ＫＬＨとは協力せずに、Ｇｌｏｂｏ Ｈに対する抗体を誘導した。ＡｌＰＯ４（リン酸アルミニウム）はまた、抗体の誘導に対して明らかな影響は示さなかった。一方、Ｃ３４とともに用いたＧＨ−ＫＬＨは、１回目および２回目ワクチン接種後において、優れた免疫原性を示したが、３回目ワクチン接種後は、Ｃ１と有意な差は見られなかった。全体として、これらの知見は、炭化水素ワクチンに対するアジュバントとして、新規な糖脂質誘導体の可能性を示唆するものである。
【０１１５】
細胞性および液性免疫応答の性質は、抗原および抗体の組み合わせだけでなく、キャリアおよび免疫付与の経路によって影響される。Sesardicおよび共同研究者が述べているように、毒性作用がない毒素変異体であるＤＴ−ＣＲＭ１９７が、抗原特異的Ｔ細胞増殖を誘導し、ＩＬ−２、ＩＮＦ−γ、およびＩＬ−６の脾細胞による産生を高めることが、Ｔｈ１を駆動する経路における役割であることを示唆している（Miyaji EN et al. (2001) Infect Immun 69:869-874; Godefroy S, et al. (2005) Infect Immun 73:4803-4809; Stickings P, et al. (2008) Infect Immun 76:1766-1773.）。サイトカインの特徴が主にＴｈ１であるという事実にもかかわらず、抗ＣＲＭ１９７抗体のサブクラスは、ＩｇＧ１であり、Ｔｈ１／Ｔｈ２の混合応答を示すＩｇＧ２ａを検出できない。これらの結果は、Ｇｌｏｂｏ Ｈワクチンの抗体アイソタイプの特性の評価を促進し、本研究が、糖脂質アジュバントと組み合わせたＧＨ−ＤＴまたはＧＨ−ＫＬＨが、微量のＩｇＧ２ａとともに、主としてＩｇＧ１抗体を誘導することを示した（図９）。
【０１１６】
糖脂質アジュバントを単独で静脈投与（ｉ．ｖ．）した場合、Ｔｈ１バイアスのサイトカイン分泌を増強するという事実にもかかわらず、抗体のクラススイッチ（ＩｇＧ２ａ）は観測されなかった。全体として、糖脂質は、細胞性および液性免疫応答を増強するという極めて重要な役割がある。
【０１１７】
Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４がんワクチン
ＤＴと共役したＳＳＥＡ−３（Ｇｂ５）およびＳＳＥＡ−４を合成し、試験した。３回目ワクチン接種の後、ＩｇＭおよびＩｇＧの抗体力価を比較し、ＳＳＥＡ−３−ＤＴおよびＳＳＥＡ−４−ＤＴが、ＩｇＭよりも高力価のＩｇＧを誘導することを見出した（図１０）。
【０１１８】
ＧＨ−ＤＴおよびＣ３４がＧｌｏｂｏ Ｈ、Ｇｂ５、およびＳＳＥＡ−４を認識する抗体を誘導するため、アジュバントの存在下、ＳＳＥＡ−３−ＤＴおよびＳＳＥＡ−４−ＤＴワクチンの特異性を、ＩｇＧの研究に集中して、２４個の糖鎖アレイを用いて試験した（図１１）。
【０１１９】
図１２Ａ〜１２Ｃに示すように、Ｇｌｏｂｏ ＨおよびＣ３４アジュバントで免疫付与されたマウスは、高い選択性でＧｌｏｂｏ Ｈ、Ｇｂ５、およびＳＳＥＡ−４を認識しうる抗体を誘導し、アジュバントＭＦ５９を有するＳＳＥＡ−３−ＤＴワクチンは低い選択性で高い免疫応答を誘導した。一方、アジュバントＣ３４と組み合わせたＳＳＥＡ−３−ＤＴは、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４に対する抗体のみ誘導した。
【０１２０】
興味深いことに、アジュバント存在下または非存在下、ＳＳＥＡ−４−ＤＴ（シアリル−Ｇｂ５）は、ＳＳＥＡ−４およびその切断構造（末端のラクトースが欠失したＳＳＥＡ−４）を特異的に認識するＩｇＧおよびＩｇＭ抗体を誘導した。理論に制約されることなく、シアル酸は免疫原性が高く、特異的免疫応答を高度に誘導すると仮定される。
【０１２１】
ＳＳＥＡ−３−ＤＴ−Ｃ３４を有するマウスの免疫付与は、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４と反応する抗体を誘導し、Ｇｌｏｂｏ Ｈワクチンが、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４を発現する腫瘍細胞および乳癌幹細胞の標的となりうることが示唆された。
【０１２２】
Ｇｌｏｂｏ Ｈ−ＤＴ−Ｃ３４を有するマウスの免疫付与は、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４と反応する抗体を誘導し、Ｇｌｏｂｏ Ｈワクチンが、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４を発現する腫瘍細胞および乳癌幹細胞の標的となりうることが示唆された。
【０１２３】
ＳＳＥＡ−４−ＤＴを有するマウスの免疫付与は、ＳＳＥＡ−４と反応する抗体を誘導し、ＳＳＥＡ−４−ＤＴワクチンが、ＳＳＥＡ−４を発現する腫瘍細胞および乳癌幹細胞の標的となりうることが示唆された。
【０１２４】
がんワクチンによる腫瘍サイズの縮小
合成複合糖質ワクチンの効果を直接評価するために、図１３に示すように、腫瘍サイズを１週間ごとに３回測定した。一般的に、Ｇｌｏｂｏ Ｈを有する乳癌細胞株に４Ｔ１を注入した後、腫瘍は２週間成長する。糖脂質アジュバントを有するワクチン接種したすべてのグループは、２４日間で、単独のＧＨ−ＤＴおよびＰＢＳのコントロールと比較して、相対的に腫瘍が小さいままであった。前記データは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＤＨ−ＤＴおよび糖脂質アジュバントを有するワクチンは、いくつかの腫瘍進行を遅延させることを示唆している。
【０１２５】
乳癌およびＢＣＳＣにおけるＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４の発現
ＢＣＳＣ中のＧｌｏｂｏ Ｈの発現は、非ＢＣＳＣよりも頻度が少ないが、乳癌およびＢＣＳＣにおいて、ＳＳＥＡ−３の発現はＧｌｏｂｏ Ｈの発現よりも頻度が高いことが示された（Chang W-W. et al., (2008) Proc Natl Acad Sci USA105(33):11667-11672、全体が参照により本明細書に組み込まれる。）。
【０１２６】
乳癌患者３５名のＳＳＥＡ−３またはＳＳＥＡ−４の発現範囲における臨床的特徴を評価し、表２に示した。平均年齢は４８歳であった（３１〜８２歳である）。これらのうち、１名がステージ０、１０名がステージＩ、１９名がステージＩＩ、および５名がステージＩＩＩであった。大部分の腫瘍試料は、５１．４％のＥＲ陽性および６７．５％の節転移陽性とともに、浸潤性管癌（８０．０％）の病変を有していた。表２において、ＳＳＥＡ−３またはＳＳＥＡ−４の発現の範囲は、総がん細胞中の陽性細胞の割合で表される。ＳＳＥＡ−３またはＳＳＥＡ−４発現と関連するＨＥＲ−２またはリンパ節転移の状態について統計分析が行われた。
ＨＥＲ−２の発現は、免疫組織化学的手法により決定された。腫瘍におけるＳＳＥＡ−３またはＳＳＥＡ−４の発現レベルと、ステージ（ＳＳＥＡ−４：Ｐ＝０．３４９８；ＳＳＥＡ−３：Ｐ＝０．９３１１）またはＨＥＲ−２（ＳＳＥＡ−４：Ｐ＝０．０１４２；ＳＳＥＡ−３：Ｐ＝０．０１２８）などの様々な臨床病変の要因との間に有意な相関はなかった（表２）。
【０１２７】
【表２】
【０１２８】
酵素消化によって被験者から単離された原発性腫瘍細胞を特異抗体で染色し、はじめにＣＤ４５、ＣＤ２４、ＣＤ４４、およびＣＤ４５＋細胞を白血球から除去した。ＢＣＳＣおよび非ＢＣＳＣ間のＳＳＥＡ−３またはＳＳＥＡ−４の発現を比較するために、表面マーカーの発現に基づき、ＣＤ４５−腫瘍細胞をさらにＢＣＳＣおよび非ＢＣＳＣに分離した。前記ＢＣＳＣをＣＤ４５−／ＣＤ２４−／ＣＤ４４＋と同定し、ＣＤ４５−集団は、非ＢＣＳＣであると推定された。
【０１２９】
この方法を用いて、ＢＣＳＣおよび非ＢＣＳＣ中のＳＳＥＡ−３またはＳＳＥＡ−４の発現を、３５の腫瘍試料で評価した。全体として、ＳＳＥＡ−４は腫瘍の３４／３５（９７．１％）で検出され、ＳＳＥＡ−３は２７／３５（７７．１％）で検出された（表３）。ＳＳＥＡ−４またはＳＳＥＡ３の発現は、フローサイトメトリーで決定した。ＢＣＳＣをＣＤ４５−ＣＤ２４−ＣＤ４４＋細胞として定義し、非ＢＣＳＣをＣＤ４５−細胞の残存集団として定義した。範囲は、総細胞中の陽性細胞の割合で計算した。
【０１３０】
表３を要約すると、２７／３５（７７．１％）のＳＳＥＡ−３を発現したサンプルのうち、陽性の割合は１．４％〜６６．４％の範囲であった。腫瘍の２７／３５から単離された非ＢＣＳＣは、陽性の割合が２４．３％〜７０．４％の範囲でＳＳＥＡ−３を発現した。相対的に、腫瘍の３５のうち２５のＢＣＳＣ（６５．７％）が、陽性の割合が５．０％〜５８．４％の範囲でＳＳＥＡ−３染色は陽性であった。
【０１３１】
ＳＳＥＡ−４を発現した３４／３５（９７．１％）のサンプルのうち、陽性細胞の割合は０．５％〜７７．１％の範囲であった。ＳＳＥＡ−４を発現した腫瘍の３２／３５から単離された非ＢＣＳＣは、陽性細胞の割合が２４．０％〜７８．１％の範囲であった。一方、ＳＳＥＡ−４の染色が陽性であった腫瘍の３５のうち３１のＢＣＳＣ（８８．６％）は、陽性細胞の割合が５．６％〜８３．６％の範囲であった。
【０１３２】
【表３】
【０１３３】
ＢＣＳＣにおけるＳＳＥＡ−４の発現
ＢＣＳＣおよび非ＢＣＳＣ間のＳＳＥＡ−４の発現を比較するために、表面マーカーの発現に基づき、ＣＤ４５−腫瘍細胞をさらにＢＣＳＣおよび非ＢＣＳＣに分離した。前記ＢＣＳＣをＣＤ４５−／ＣＤ２４−／ＣＤ４４＋と同定し、残りのＣＤ４５−集団は、非ＢＣＳＣであると推定された。図１５に示すように、これら２つの各集団内のＳＳＥＡ−４の発現は、腫瘍サンプル間で変化した。例えば、患者ＢＣ０２６４の腫瘍細胞から単離された総数の５．７％の割合を占めたＢＣＳＣは、ＳＳＥＡ−４に対して陰性であったが、６０．３％の割合を占めた非ＢＣＳＣは、ＳＳＥＡ−４を発現した。患者ＢＣ０２６６については、ＳＳＥＡ−４の発現は、非ＢＣＳＣの５９．４％，ＢＣＳＣの５５．７％で観測された。ＢＣ０３１３については、ＳＳＥＡ−４の発現は、非ＢＣＳＣの３２．４％，ＢＣＳＣの８３．６％で観測された。全体として、ＳＳＥＡ−４は、試験サンプルの３４／３５（９７．１％）、その陽性細胞の割合は０．５〜７７．１％の範囲で観測された（表３２）。
【０１３４】
正常細胞におけるＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４の発現
組織マイクロアレイを用いて、ＳＳＥＡ−４の発現について、異なる２０の臓器を免疫組織化学的染色により解析し、結果を表４に示す（Ｅ，上皮組織；Ｃ，結合組織）。
【０１３５】
【表４】
【０１３６】
ＳＳＥＡ−４は、乳房、大腸、消化管、腎、肺、卵巣、膵臓、大腸、胃、前立腺、胸腺、および子宮頸部などの、いくつかの腺組織の上皮細胞上で発現した（表４）。また、図１６に示すように、Ｇｌｏｂｏ ＨおよびＳＳＥＡ−３と同様の方法により（Chang W-W. et al., (2008) Proc Natl Acad Sci USA105(33):11667-11672）、ＳＳＥＡ−４の発現を、主として本質的に免疫応答に関与しない血清または上皮細胞の頂端表面に制限させた。
【０１３７】
比較すると、Ｇｌｏｂｏ Ｈは、乳房、消化管、膵臓、前立腺、および子宮頸部などのいくつかの腺組織の上皮細胞上で発現した。ＳＳＥＡ−３の分布は、正常乳房組織には存在せず、Ｇｌｏｂｏ Ｈ陰性であった腎、直腸、精巣、および胸腺に存在したことを除き、Ｇｌｏｂｏ Ｈと同様であった（Chang W-W. et al., (2008) Proc Natl Acad Sci USA105(33):11667-11672）。
【実施例】
【０１３８】
下記実施例は、本発明に係る好ましい実施形態の実施を含む。当業者にとっては当然のことであるが、本発明の実施において、以下の代表的な技術である実施例で十分に開示された技術は、発明者によって見出され、その実施に好ましい方法で構成されると考えられうる。しかしながら、当業者は、本開示を考慮すると、本発明の思想および技術的範囲を逸脱することなく、開示された特定の実施例において、多くの変形が構成され、類似または同様の結果が得られうる。
【０１３９】
一般的方法、物質、器具類
原料
市販の溶媒および試薬は、さらに精製することなくそのまま使用し、Sigma-Aldrich社、Acros社、Merck社、Echo chemical社、およびSenn Chemical社から購入した。モノクローナル抗体Ｍｂｒ１はALEXIS biochemicals社、Ｃｙ３共役抗マウスＩｇＧ（ＩｇＧ、ＩｇＧ１、およびＩｇＧ２ａ）およびＩｇＭ抗体はJackson Immuno Research社から購入した。ＤＴ−ＲＣＭ１９７タンパク質および破傷風トキソイドは、それぞれMerck社およびAdimmune社から購入した。リン酸アルミニウムゲルアジュバント（ＡｌＰＯ４）はBrenntag Biosector社から購入した。破傷風ウイルスおよびＶＫ９モノクローナル抗体は、それぞれLin博士およびYu博士の研究室で調製された。糖脂質誘導体は、合成およびWong博士の研究室から提供された。
【０１４０】
一般的方法
グリコシル化に用いられるモレキュラーシーブス（MS, AW-300）は、粉砕して使用前に活性化した。反応は、分析用のＴＬＣプレート（PLCシリカゲル-60, F254, 2mm, Merck社）で観測し、ＵＶ（254nm）またはｐ−アニスアルデヒドで視覚化させた。フラッシュカラムクロマトグラフィはシリカゲル（40-63μm）またはLiChroprep RP18（40-63μｍ）で行った。透析膜（セルロースエステル，MCCO=10,000）は、使用前にＨ２Ｏで洗浄した。
【０１４１】
器具類
プロトン核磁器共鳴（1H NMR）スペクトル、炭素核磁器共鳴（13H NMR）スペクトルは、Bruker Adbance 600 (600 MHz/150 MHz)ＮＭＲ分光装置で測定した。プロトンの化学シフトは、ｐｐｍで示し、テトラメチルシラン（δ＝０）を基準とした。カーボンの化学シフトも１００万分の１（ppm，δスケール）で示した。ＤＥＰＴ１３５（Distortion-less enhancement by polarization transfer）を用いて多重度を決定した。データを下記のように表す：化学シフト、多重度（s=１重項、d=２重項、t=３重項、q＝４重項、m=多重項、br=ブロード）、積分値、およびHzの結合定数（J）。高分解能質量スペクトルはBioTOF IIIにより、MALDI-TOF MSはUltraflex II TOF/TOF200により測定された。
【０１４２】
実施例１：異なるキャリアタンパク質と共役したＧｌｏｂｏ Ｈの合成
Ｇｌｏｂｏ Ｈ（１；図１１を参照）およびそのフラグメント２−１０は、プログラムで制御したワンポット戦略により合成した（Huang C-Y, et al. (2006) Proc Natl Acad Sci USA 103:15-20.）。１の反応は、無水ＤＭＦ中、室温で効率的同種二官能性リンカーを用いて行われた（Wu X, et al. (2004) Org Lett 6:4407-4410; Wu X, Bundle DR (2005) J Org Chem 70:7381-7388.）。前記反応は容易にＴＬＣで観測された。より大きいＲｆ値の生成物が生成し、遊離アミンが消失した時点で反応混合物を濃縮してＤＭＦを留去し、ジクロロメタンおよび水で洗浄して過剰量のリンカーを除去した。最後に、精製物を逆相（C18）カラムクロマトグラフィで精製し、１％の酢酸を含む水から含水４０％メタノールへと変更し、徐々に溶出させた。前記溶液を、凍結乾燥して淡黄色の生成物１２を得た。最終的に、タンパク質と共役するために、前記精製Ｇｌｏｂｏ Ｈハーフエステル１２（30-40 equiv）を個別のキャリアタンパク質とリン酸緩衝液（10mM，ｐH7.2）中、室温で２４時間インキュベートした（図１４）。重要なことは、リジン残基とＧｌｏｂｏ Ｈハーフエステルとのカップリングを最大化するために、タンパク質の濃度を〜５ｍｇ／ｍＬに調節しなければならないことである。２４時間後、複合糖質を希釈し、脱イオン水で透析して残ったｐ−ニトロフェニル基を除去した。次いで、前記溶液を凍結乾燥して白色粉末１３、１４、および１５を得た。
【０１４３】
前記Ｇｌｏｂｏ Ｈ−タンパク質共役体は、MALDI-TOF解析により各キャリアタンパク質上のＧｌｏｂｏ Ｈの数を決定した。前記組み込まれたＧｌｏｂｏ Ｈの数の平均値を上記の表１に記載されている。
【０１４４】
前記複合糖質１３、１４、および１５をｄｄＨ２Ｏに溶解し、最終濃度を約１ｐｍｏｌ／μＬとした。シナピン酸をマトリックスとして選択し、新たに調製したアセトニトリルおよび脱イオン水（1:1 v/v）と混合して、０．１％のＴＦＡを含む１０ｍｇ／ｍＬの濃度の最終マトリックスを調製した。各サンプルを線形の正イオンモードで検出し、ｍ／ｚスペクトルを得た。各複合糖質の分子量は、ｍ／ｚで決定した。複合糖質１４は、不均一性を示し、平均組み込みが２〜４を示した。ＧＨ−ＫＬＨ共役体は、主により大きいサイズおよびＫＬＨのより多いＬｙｓ残基のため、Ｇｌｏｂｏ Ｈの組み込みの最大値を示した。ｐ−ニトロフェニルリンカーを用いた同様のカップリング処理を、ウイルス膜に１００，０００以上のリジン残基を含む破傷風モザイクウイルスに適用した。しかしながら、４℃のリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７．２）中でのウイルスの反応性に対するウイルスの不安定性が、さらなる進展において大きな懸念であった。また、ＧＨ−ＢａＭＶ１６は、サイズが非常に大きいため、MALDI-TOF解析による検出が制限された。最終的に、凍結乾燥した複合糖質は、−３０℃で保存され、免疫付与前に滅菌水につけてもどされた。
【０１４５】
実施例２：糖鎖マイクロアレイの製造および検証
合成Ｇｌｏｂｏ Ｈおよび切断フラグメント（図１）は、還元末端にペンチルアミンリンカーで結合し、ＮＨＳがコートされたスライドガラス上に共有結合で固定された。１１個のオリゴ糖の９個が、マイクロアレイ上にプリントされるように選択された。一連のオリゴ糖の濃度（1, 5, 10, 20, 40, 50, 80, 100 μM）で結合親和性および蛍光強度を最適化するための試験を行った。それぞれのマイクロアレイスライドに、９個のＧｌｏｂｏ Ｈアナログ（SSEA-4、GH、Gb5、Gb4、Gb3、Gb2、BB4、BB3、およびBB2）５０μＭをそれぞれ１２個ずつスポットした。湿度８０％における反応後、使用前に前記スライドをデシケータ中、室温で保存した。
【０１４６】
マイクロアレイ上の炭化水素を検証するために、マウスモノクローナル抗体（Ｇｌｏｂｏ Ｈ用のＶＫ９およびＭｂｒｌ、並びに抗ＳＳＥＡ−３）を用いて、それぞれの二次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧおよびＩｇＭ）を特異的結合の試験に用い、その結果を図２Ａ〜２Ｃに示す。前記データは、ＶＫ９およびＭｂｒｌの両方がＧｌｏｂｏ Ｈおよび４糖類であるＢＢ４の外面を認識し、ＭＢｒｌは、ＭＭ３もわずかに認識したことを示唆している（Gilewski T el al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:3270-3275; Huang C-Y, et al. (2006) Proc Natl Acad Sci USA103:15-20.）。また、抗ＳＳＥＡ−３抗体は、交差反応を起こすことなく、特異的にＳＳＥＡ−３抗原（Ｇｂ５）を認識した。前記結果から、Ｇｌｏｂｏ Ｈマイクロアレイは、免疫付与されたマウスから得られるポリクローナル抗体の特異性および効力の分析に利用されうることを示している。
【０１４７】
実施例３：マウスへの免疫付与
本実験において、マウスのグループに、糖脂質アジュバントであるα-ＧａｌＣｅｒ（Ｃ１）と共役した、または共役していない合成Ｇｌｏｂｏ Ｈを１μｇ皮下投与し、免疫付与した。１週間ごとに３度のワクチン接種をした１０日後、マウス血清を収集し、次いで、抗体レベルを評価するために糖鎖マイクロアレイに導入した。図３Ａに要約されるように、ＩｇＭの誘導に最も有効な免疫原が、ＧＨ−ＫＬＨ、ＧＨ−ＤＨ、およびＧＨ−ＢＶ、次いでＧＨ−ＴＴ、ＧＨ−ＢＳＡであり、α−ＧａｌＣｅｒは、ＩｇＭ抗体を高いレベルに誘導する免疫応答を刺激できることが分かった。同様の傾向がマウスＩｇＧ抗体においても観測され（図３Ｂ）、ＩｇＧレベルはＩｇＭレベルよりも相対的に高かった。簡潔にいうと、合成複合糖質の炭化水素の密度がより低いにもかかわらず、ＧＨ−ＤＴは、ＧＨ−ＫＬＨと同様の免疫原性を示し、アジュバントであるα−ＧａｌＣｅｒは、免疫応答の増強を示した。
【０１４８】
α−ＧｌａＣｅｒは、ＧＨ−ＤＴに対するアジュバント効果を示したことから、Ｃ１よりもアジュバント活性の高い他の糖脂質を試験し、その結果を図４に示した（Fujio M, et al. (2006) J Am Chem Soc 128:9022-9023.）。
【０１４９】
マウスのグループに、２μｇの糖脂質を有する、または有さないＧＨ−ＤＴおよびＧＨ−ＢＶ１．６μｇを筋肉注射で１週間に２回免疫付与した。３回ワクチン接種をした２週間に血清を得て、糖鎖マイクロアレイ解析に導入した。一般的に、マウス抗Ｇｌｏｂｏ Ｈ ＩｇＧ力価は、免疫付与が進行すると増強するが、ＩｇＭレベルは、ワクチン接種の時間にほとんど無関係である（図５）。ＧＨ−ＢＶをワクチン接種したグループのうち、糖脂質−ワクチン処理およびワクチンの単独処理の間で、ＩｇＭレベルに有意な差はなかった。前記結果は、糖脂質と一緒に用いたＧＨ−ＢＶは有効な免疫療法ではないことを示唆するが、弱い免疫原性は、ＢａＭＶが不安定であるという特徴によるものである可能性がある。それにもかかわらず、α−ＧａｌＣｅｒアナログ、特に７ＤＷ８−５は、ＧＨ−ＤＴとうまく協力して、マウスの免疫応答を誘導した。
【０１５０】
興味深いことに、マウスポリクローナルＩｇＧ抗体は、ＧＨ−ＤＴおよび様々な糖脂質アジュバントによって産生され、Ｇｌｏｂｏ Ｈを中和するだけでなく、Ｇｂ５、ＳＳＥＡ−４、およびＧｂ４と交差反応し、Ｃ３４は最も有効な糖脂質アジュバントであった（図６）。ＩｇＭよりも力価がより高いＩｇＧを誘導しうる新規ワクチン組成物を探索するために、Ｇｌｏｂｏ Ｈ−ＤＴ複合体および糖脂質Ｃ１もしくはＣ３４、市販のＡｌＰＯ４（リン酸アルミニウム）、またはＭＦ５９を試験した。驚くべきことに、糖脂質Ｃ３４を含むＧｌｏｂｏ Ｈ−ＤＴは、３回のワクチン投与後にほとんど独占的にＩｇＧ抗体を誘導しうる（図７）。要約すると、ＧＨ−ＤＴ複合体と組み合わせた新規糖脂質アジュバント７ＤＷ８−５は、抗Ｇｌｏｂｏ ＨのＩｇＧおよびＩｇＭの両方を増強することができ、ＧＨ−ＤＴと組み合わせた糖脂質アジュバントＣ３４は、ＩｇＭよりも抗体力価が高いＩｇＧを誘導しうる。これらは、これらは、Ｇｂ５抗原およびＳＳＥＡ−４抗原に対して異なる結合親和性を示し、ともに乳癌幹細胞の表面に発現する。
【０１５１】
Ｇｌｏｂｏ Ｈワクチンにおける異なる糖脂質アジュバントの効果をさらに比較するために、ＧＨ−ＫＬＨを有する７つのマウスのグループに免疫付与した。この結果、糖脂質
を含むマウスワクチンが、抗Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体を高いレベルで誘導することを示唆した（図８）。ＭＦ５９は、強力なアジュバントであるが、ＧＨ−ＫＬＨとは協力せずに、Ｇｌｏｂｏ Ｈに対する抗体を誘導した。ＡｌＰＯ４（リン酸アルミニウム）はまた、抗体の誘導に対して明らかな影響は示さなかった。一方、Ｃ３４とともに用いたＧＨ−ＫＬＨは、１回目および２回目ワクチン接種後において、優れた免疫原性を示したが、３回目ワクチン接種後は、Ｃ１と有意な差は見られなかった。
【０１５２】
毒性作用がない毒素変異体であるＤＴ−ＣＲＭ１９７が、抗原特異的Ｔ細胞増殖を誘導し、ＩＬ−２、ＩＮＦ−γ、およびＩＬ−６の脾細胞による産生を高めることが、Ｔｈ１を駆動する経路における役割であることを示唆している（Miyaji EN et al. (2001) Infect Immun 69:869-874; Godefroy S, et al. (2005) Infect Immun 73:4803-4809; Stickings P, et al. (2008) Infect Immun 76:1766-1773.）。サイトカインの特徴が主にＴｈ１であるという事実にもかかわらず、抗ＣＲＭ１９７抗体のサブクラスは、ＩｇＧ１であり、Ｔｈ１／Ｔｈ２の混合応答を示すＩｇＧ２ａを検出できない。これらの結果は、Ｇｌｏｂｏ Ｈワクチンの抗体アイソタイプの特性の評価を促進し、本研究が、糖脂質アジュバントと組み合わせたＧＨ−ＤＴまたはＧＨ−ＫＬＨが、微量のＩｇＧ２ａとともに、主としてＩｇＧ１抗体を誘導することを示した（図９）。
【０１５３】
糖脂質アジュバントを単独で静脈投与（i.v.）した場合、Ｔｈ１バイアスのサイトカイン分泌を増強するという事実にもかかわらず、抗体のクラススイッチ（IgG2a）は観測されなかった。全体として、糖脂質は、細胞性および液性免疫応答を増強するという極めて重要な役割がある。
【０１５４】
ＤＴと共役したＧｂ５およびＳＳＥＡ−４を同様の戦略により合成した。３回目ワクチン接種の後、ＩｇＭおよびＩｇＧの抗体力価を比較し、Ｇｂ５−ＤＴおよびＳＳＥＡ−４−ＤＴが、ＩｇＭよりも高力価のＩｇＧを誘導することを見出した（図１０）。
【０１５５】
実施例４：異なるワクチン組成物によって誘導される抗体の特異性研究
ＧＨ−ＤＴおよびＣ３４がＧｌｏｂｏ Ｈ、Ｇｂ５（SSEA-3）、およびＳＳＥＡ−４を認識する抗体を誘導したことから、次に、アジュバントの存在下、ＩｇＧの研究に集中して、ＳＳＥＡ−３−ＤＴおよびＳＳＥＡ−４−ＤＴワクチンの特異性を２４個の糖鎖アレイを用いて試験した（図１１）。
【０１５６】
図１２Ａ〜１２Ｃに示すように、Ｇｌｏｂｏ Ｈ−ＤＴおよびＣ３４アジュバントで免疫付与されたマウスは、高い選択性でＧｌｏｂｏ Ｈ、Ｇｂ５、およびＳＳＥＡ−４を認識しうる抗体を誘導し、アジュバントＭＦ５９を有するＳＳＥＡ−３−ＤＴワクチンは低い選択性で高い免疫応答を誘導した。一方、アジュバントＣ３４と組み合わせたＳＳＥＡ−３−ＤＴは、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４に対する抗体のみ誘導した。
【０１５７】
興味深いことに、アジュバント存在下または非存在下、ＳＳＥＡ−４−ＤＴは、ＳＳＥＡ−４およびその切断構造（末端のラクトースが欠失したＳＳＥＡ−４）を特異的に認識するＩｇＧおよびＩｇＭ抗体を誘導した。しかしながら、前記選択性の原因は明らかではない。
【０１５８】
合成複合糖質ワクチンの効果を直接評価するために、図１３に示すように、腫瘍サイズを１週間ごとに３度測定した。一般的に、Ｇｌｏｂｏ Ｈを有する乳癌細胞株に４Ｔ１を注入した後、腫瘍は２週間成長する。糖脂質アジュバントを有するワクチン接種したすべてのグループは、２４日間で、単独のＧＨ−ＤＴおよびＰＢＳのコントロールと比較して、相対的に腫瘍が小さいままであった。前記予備データは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＤＨ−ＤＴおよび糖脂質アジュバントを有するワクチンは、いくつかの腫瘍進行を遅延させることを示唆している。
【０１５９】
実施例５：Ｇｌｏｂｏ Ｈハーフエステルの調製
Ｇｌｏｂｏ Ｈハーフエステルは以下のように調製した：
【０１６０】
【化３】
【０１６１】
Ｇｌｏｂｏ Ｈアミン１（5.5 mg, 4.54 μmol）を無水ＤＭＦ溶液に溶解し、次いでｐ−ニトロエステルリンカー（8.8 mg, 22.7 μmol）を添加して室温で１〜３時間撹拌した。反応は、ＴＬＣ（１％酢酸のメタノール溶液）およびニンヒドリン試験で観測した。より大きいＲｆ値を有する生成物の生成および遊離アミンの消失が反応の完結を示す。反応混合物を減圧下、加熱せずに濃縮してＤＭＦを留去し、次いでＣＨ２Ｃｌ２および１％の酢酸を含む水で２度抽出した。前記水溶液を濃縮し、逆相（Ｃ１８）カラムクロマトグラフィで精製し、１％の酢酸を含む水からＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝４：６へと変更し、徐々に溶出させた。次に溶液を凍結乾燥して淡黄色固体の生成物１２（5.4 mg, 収率88%）を得た。1H NMR (600 MHz, D2O) δ 8.25 (d, 2H, J = 9.0 Hz), 7.28 (d, 2H, J = 9.0 Hz), 5.12 (d, 1H, J = 3.9 Hz), 4.79 (d, 1H, J = 3.7 Hz), 4.51 (d, 1H, J = 7.7 Hz), 4.44 (d, 1H, J = 7.7 Hz), 4.39 (d, 1H, J = 7.7 Hz), 4.31-4.28 (t, 2H, J = 7.7 Hz), 4.15-4.1 1 (m, 2H), 3.99 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 3.92 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 3.89-3.44 (m, 33H), 3.16 (t, 1H, J = 8.6 Hz), 3.10 (t, 2H, J = 6.7 Hz), 2.62 (t, 2H, J = 6.9 Hz), 2.20 (t, 2H, J = 6.6 Hz), 1.93 (s, 3H), 1.62-1.49 (m, 4H) 1.54- 1.48 (m, 2H), 1.45-1.40 (m, 2H), 1.30-1.24 (m, 2H), 1.11 (d, 3H, J = 6.5 Hz) 13C NMR (150 MHz, D2O ) δ 178.0, 176.1, 176.0, 156.9, 147.1, 127.3, 124.5, 105.7, 105.0, 103.7, 103.6, 102.2, 101.0, 80.5, 80.0, 78.9, 78.0, 77.8, 77.1, 76.7, 76.4, 76.3, 76.2, 75.2, 74.6, 73.8, 73.5, 72.5, 72.1, 71.8, 71.2, 70.9, 70.8, 70.1, 69.7, 69.5, 68.5, 62.6, 62.6, 62.0, 62.0, 61.7, 53.3, 40.8, 37.1, 35.0, 30.0, 29.7, 26.4, 25.0, 24.1, 23.9, 17.0 HRMS: C55H87N3O35Na [M+Na]+ 計算値: 1372.5018; 実測値: 1372.5016.
実施例６：複合糖質を生産させる基本手順
複合糖質は以下のように調製した：
【０１６２】
【化４】
【０１６３】
ＢＳＡ、ＤＴ−ＣＲＭ１９７、および破傷風トキソイド（Adimmune社、台湾）をｐＨ７．２の１００ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、３０〜４０当量のＧｌｏｂｏ Ｈハーフエステル３５を添加した。次に、前記混合物を脱イオン水で希釈し、脱イオン水を５回取り換ながら透析した。前記溶液を凍結乾燥して白色粉末とした。得られたＧｌｏｂｏ Ｈ−タンパク質共役体を、MALDI-TOF解析で特性評価し、炭化水素組み込み率を決定した。４１（GH-BSA）はMALDI-TOFで76029に観測され、４２（GH-DT-CRM197）は162902に観測され、４４（GH-BaMV）は決定されなかった。
【０１６４】
実施例７：複合糖質のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析
複合糖質４１、４２、４３、および一次キャリアタンパク質をｄｄＨ２Ｏ（〜1 μg/μl）でもどした。マトリックスであるシナピン酸を、アセトニトリルおよび脱イオン水１：１で新たに調製し、最終マトリックスを０．１％のＴＦＡを含む１０ｍｇ／ｍＬの濃度とした。徐々にロードし、マトリックスおよび複合糖質を混合して、プレートを乾燥させた。測定前にウシ血清アルブミンを用いた検定は厳密であった。各複合糖質および一次タンパク質サンプルを線形の正イオンモードで検出した。平均分子量は、キャリアタンパク質上の炭化水素の組み込みの平均値で計算した。
【０１６５】
実施例８：糖鎖マイクロアレイの製造
９６ウェルからＮＨＳでコートされたスライドガラスに、様々な濃度のプリント緩衝液（0.005%のTween20を含む300mMリン酸緩衝液、pH8.5）においてアミン含有糖鎖の〜０．７μＬの沈殿物を、ロボットピン（SMP3、TeleChem International社、米国）でマイクロアレイにプリントした（BioDot、Cartesian Technologies社、米国）。それぞれのマイクロアレイスライドに、９個のＧｌｏｂｏ Ｈアナログ（SSEA-4、GH、Gb5、Gb4、Gb3、Gb2、BB4、BB3、およびBB2）５０μＭをそれぞれ１２個ずつスポットした。プリントしたスライドを湿度８０％で１時間反応させ、次いで、終夜乾燥した。これらのスライドは、使用まで、デシケータ中室温で保存した。
【０１６６】
実施例９：血清学的アッセイ（糖鎖マイクロアレイ）
マウス血清を予備のスクリーニングとして、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む３％ＢＳＡ／ＰＢＳ緩衝液（pH7.4）で１：６０に希釈した。糖鎖マイクロアレイを５０ｍＭエタノールアミンで１時間ブロックし、使用前にｄｄＨ２ＯおよびＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した。前記血清希釈液は、次にＧｌｏｂｏ Ｈマイクロアレイに導入し、室温で１時間インキュベートした。マイクロアレイスライドを、それぞれＰＢＳＴ（0.05％Tween20のPBS緩衝液）およびＰＢＳ緩衝液でさらに３回洗浄した。次に、Ｃｙ３−ａｆｆｉｎｉＰｕｒｅウシ抗マウスＩｇＧ（H＋L）、ＩｇＧ1、ＩｇＧ２ａ、または抗マウスＩｇＭをマイクロアレイスライドに添加し、密封して１時間インキュベートした。最後に、前記スライドをＰＢＳＴ、ＰＢＳ、およびｄｄＨ２Ｏで順に３回洗浄したマイクロアレイスライドを乾燥させ、マイクロアレイ蛍光チップリーダー（Genepix 4000B）を用いて、５３２ｎｍで解析した。データをソフトウェアGenePix Pro 6.0（Axon Instruments、米国、カリフォルニア州、ユニオンシティー）で解析した。正確な測定を行うため、ＰＭＴゲインを蛍光の飽和を回避する４００ｎｍに調節した。部分的なバックグラウンドは、各糖鎖スポットのシグナルから差し引いた。明らかな欠陥または検出できないスポットは省略した。極大蛍光強度は、複数のスポットから「F532nm-B532nmの平均値」の平均と定義した。
【０１６７】
実施例１０：血清学的アッセイ（酵素結合免疫吸着法）
炭酸重炭酸緩衝液（pH 10）１００μｌのＧｌｏｂｏ Ｈセラミド０．２μｇを９６ウェルプレート（NUNC）に４℃で終夜コートした。ＰＢＳで洗浄し、３％ウシ血清アルブミンを用いて、室温で３０分間ブロックした。マウス血清の連続希釈液を各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートし、次いでＤＰＢＳＴ（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、0.05% Tween20）で洗浄した。ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＡＰ（1:200、Southern Biotech社、米国）を添加し、室温で４５分間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、次いでアルカリリン酸基質であるｐ−二トロフェニルリン酸（Sigma社）とともに３７℃で８時間インキュベートした。インキュベート後、３Ｍ ＮａＯＨ溶液を添加して反応を停止させ、４０５ｎｍでＥＬＩＳＡリーダー（SpectraMax、Molecular Devices社）上のプレートを読み取った。力価は、０．１より大きい光学密度が得られる最大の希釈度と定義した。
【０１６８】
実施例１１：用量および免疫付与
（１）３つのマウスのグループ（生後６週間のメスC57BL/6マウス、BioLASCO社、台湾）の腹部に、糖脂質であるＣ１または７ＤＷ８−５を含む、または含まないＧＨ−ＫＬＨ（Optimer社）、ＧＨ−ＢＳＡ、ＧＨ−ＴＴ、ＧＨ−ＣＲＭ１９７、およびＧＨ−ＢａＭＶを、１週間の間隔で３回皮下投与した。各ワクチン接種には、１μｇのＧｌｏｂｏ Ｈを含み、２μｇの糖脂質アジュバントを含む、または含まなかった。コントロールのマウスにはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）のみを投与した。最初の免疫付与前（pre-immune）および３回目ワクチン接種の１０日後にマウスを採血した。（２）３つのマウスのグループ（生後８週間のメスBalb/cマウス、BioLASCO社、台湾）に、Ｃ１、Ｃ２３、または７ＤＷ８−５をそれぞれ含む、または含まないＧＨ−ＢａＭＶまたはＧＨ−ＣＲＭ１９７を２週間の間隔で３回筋肉投与した。各ワクチン接種には、１μｇのＧｌｏｂｏ Ｈを含み、２μｇの糖脂質アジュバントを含む、または含まなかった。コントロールのマウスにはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）のみを投与した。免疫付与前および各ワクチン接種の２週間後にマウスを採血した。（３）３つのマウスのグループ（生後８週間のメスBalb/cマウス、BioLASCO社、台湾）に、Ｃ１、Ｃ１７、７ＤＷ８−５、Ｃ３０、ＡｌＰＯ４、ＭＦ５９（1:1混合物）を含む、または含まないＧＨ−ＣＲＭ１９７またはＧＨ−ＫＬＨを、（２）に示すように免疫付与した。４０００ｇで１０分間遠心分離して全血清を得た。血清学的反応を、糖鎖マイクロアレイまたは先のＥＬＩＳＡアッセイと比較することによって解析した。
【０１６９】
実施例１２：異種移植モデル
（１）免疫付与されたメスBalb/cマウス（PBS、GH-CRM197単独またはC1、C23、および7DW8-5をそれぞれ含む）の５つのグループに、２×１０５の転移性マウス乳癌細胞株である4T１（無菌PBS中）を、最終ワクチン接種した８週間後に皮下注射した。（２）免疫付与されたメスBalb/cマウス（GH-KLH単独またはC1、C17、8-5、C30、AlPO4、およびMF59をそれぞれ含む）の７つのグループに、２×１０５の転移性マウス乳癌細胞株である４Ｔ１（無菌PBS中）を、最終ワクチン接種した６週間後に皮下注射した。腫瘍異種移植の前後におけるマウス抗Ｇｌｏｂｏ Ｈ血清をモニターした。マウス腫瘍サイズは、ノギスで１週間ごとに３回測定し、（長さ×高さ×幅）／２（ｍｍ３）として定義した。
【０１７０】
実施例１３：ヒト乳癌検体からの原発性腫瘍細胞の単離
ヒト乳癌検体は、Tri-Service General Hospital（台北、台湾）で最初の手術を受けた患者から得た。サンプルは、患者の秘密保護のため完全に暗号化し、台湾、台北のアカデミア シニカのヒトを対象とした研究の倫理審査委員会の治験審査委員会によって承認されたプロトコルが用いられた。腫瘍検体は、１ｍｍの四角形のフラグメントにスライスし、コラゲナーゼ（1,000 U/ml）、ヒアルロニダーゼ（300 U/ml）およびＤＮａｓｅ Ｉ（100 μg/ml）を含むＲＰＭＩ１６４０倍地に３７℃で２時間インキュベートすることによって酵素消化した。原発性乳房腫瘍細胞は、１００−μｍのcell strainer（BD Biosciences社）を通してろ過して収集し、５％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０倍地に再懸濁させた。
【０１７１】
実施例１４：フローサイトメトリー解析
原発性乳癌細胞を、２％ＦＢＳおよび０．１％ＮａＮ３含有ＰＢＳの５０μｌ中に１×１０５の細胞として調製した。抗ＣＤ２４−ＰＥ、抗ＣＤ４４−ＡＰＣ、および抗ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５抗体混合物（各１μｌ）で細胞を標識した。Ａｌｅｘａ４８８と共役したモノクローナル抗Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体（VK-9）で染色してＧｌｏｂｏ Ｈの発現を検出した。FACSCantoフローサイトメーター（Becton Dickinson社）で解析を行った。ＢＣＳＣは、ＣＤ４５−／ＣＤ２４−／ＣＤ４４＋細胞として定義し、非ＢＣＳＣは、その他のＣＤ４５−細胞集団として定義した。Ｇｌｏｂｏ Ｈの発現は、さらにゲート部位で解析された。
【０１７２】
実施例１５：細胞選別
マウスにおけるヒト乳癌腫瘍移植片から採取された細胞は、抗ＣＤ２４−ＰＥ、抗ＣＤ４４−ＡＰＣ、および抗Ｈ２Ｋｄ−ＦＩＴＣ抗体混合物（BD Biosciences社）で染色した。抗体で標識された細胞の蛍光活性の選別は、FACSAria cell sorter（Becton Dickinson社）で行われた。Ｈ２Ｋｄ−／ＣＤ２４−／ＣＤ４４＋細胞はＢＣＳＣと分類され、その他のＨ２Ｋｄ−細胞は非ＢＣＳＣと分類された。ＢＣＳＣおよび非ＢＣＳＣの標準的な純度は、それぞれ＞８５％および＞９０％であった。
【０１７３】
実施例１６：免疫組織化学
正常細胞におけるＳＳＥＡ−４発現については、５の個体から提供される異なる２０の臓器を含む、組織マイクロアレイスライド（Biomax社）が用いられた。スライドは、標準的免疫組織学的手順に従い、５６℃で終夜乾燥させ、キシレン中で脱ろうさせ、および再水和し、次いでｐＨ９．０のAR-10（BioGenex Laboratories社）で抗原検索を行った。ＳＳＥＡ−４の発現は、抗ＳＳＥＡ−４抗体（eBioscience社）を使用することにより決定した。二次抗体として抗ラットＩｇＭを用いた染色によりＳＳＥＡ−４を検出し、ＤＡＢ基質によって発展させた。スライドをヘマトキシリンで対比染色した。原発性乳房腫瘍ＢＣＯ１４５およびＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスからの腫瘍異種移植片を１０％リン酸緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに埋め込んだ。パラフィン切片を２μＭの厚さにカットし、SuperFrost Plus顕微鏡スライド（Menzel-Glaser社）上にマウントし、および５５℃で終夜乾燥した。前記切片を、標準的な免疫組織学的手順に従い、キシレンで脱ろうおよび再水和し、次いでヘマトキシリンおよびエオシン（H&E）で染色した。免疫染色の前に、スライドをはじめ１０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝溶液（ｐH6.0）中に入れ、１５分間マイクロウェーブをかけた。前記スライドを次に、抗ＥＲ抗体、または抗ＰＲ抗体とともに終夜インキュベートした。Super Sensitive Polymer-HRP IHC Detection System（BioGenex社）を用いて、免疫検出を行った。
【０１７４】
本明細書中に引用されるすべての刊行物および特許出願は、それぞれ個別の刊行物または特許出願が具体的に、および単独に参照により引用されるように表示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７５】
上述の発明は、理解を明瞭にする目的で、例示および実施例によりいくつか詳細に記載されているが、特定の変更および修飾が添付の特許請求の範囲の思想および技術的範囲に逸脱しない範囲で構成されうることが、本発明の教示から当業者には明らかである。
【０１７６】
要約書は、読者に迅速な技術開示の本質および趣旨の理解を与えるため、37 C. F. R §1.72 (b)に従い、提供される。前記要約書は、特許請求項の技術的範囲または意義を解釈または制限するために用いられるものではないことを理解して、提出されている。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）Ｇｌｏｂｏ Ｈまたはその免疫原性フラグメントから本質的に構成され、リンカーを通じてキャリアタンパク質と共役する糖鎖；および
（ｂ）樹状細胞上のＣＤ１ｄ分子と結合できる糖脂質を含むアジュバント、
を含む、免疫原性組成物であって、ＩｇＭアイソタイプ抗体と比較して、ＩｇＧアイソタイプ抗体を相対的に高いレベルで誘導する免疫応答を誘導する、免疫原性組成物。
【請求項２】
前記キャリアタンパク質が、ジフテリア毒素交差反応物質１９７（ＤＴ−ＣＲＭ１９７）である、請求項１に記載の免疫原性組成物、
【請求項３】
前記アジュバントが、α−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）の合成アナログである、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
前記アジュバントが下記構造を含むＣ３４である、請求項３に記載の免疫原性組成物。
【化１】
【請求項５】
前記リンカーがｐ−ニトロフェニルリンカーである、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記リンカーがｐ−ニトロフェニルであり、前記キャリアタンパク質がジフテリア毒素交差反応物質１９７（ＤＴ−ＣＲＭ１９７）であり、および前記アジュバントがＣ３４である、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
前記免疫応答が、好ましくはＩｇＧアイソタイプ抗体の産生を目的とする、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
前記キャリアタンパク質がジフテリア毒素交差反応物質１９７（ＤＴ−ＣＲＭ１９７）であり、前記アジュバントがＣ３４である、請求項７に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
少なくとも１つのアジュバントが、液性および細胞性免疫応答を誘導できることを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
前記免疫応答によって産生した抗体が、がん細胞またはがん幹細胞で発現する抗原を中和する、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
前記免疫応答によって産生した抗体が、Ｇｂ４抗原、胚発生段階特異抗原−３（ＳＳＥＡ−３）、および胚発生段階特異抗原−４（ＳＳＥＡ−４）の少なくとも１つを中和する、請求項１０に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
Ｇｂ４抗原、胚発生段階特異抗原−３（ＳＳＥＡ−３）、および胚発生段階特異抗原−４（ＳＳＥＡ−４）の少なくとも１つを中和する抗体が、ＩｇＭアイソタイプ抗体と比較して、ＩｇＧアイソタイプ抗体を相対的に高いレベルで含む、請求項１１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
前記キャリアタンパク質がジフテリア毒素交差反応物質１９７（ＤＴ−ＣＲＭ１９７）であり、前記アジュバントがＣ３４である、請求項１１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
被験者の抗がん免疫応答を誘導できるがんワクチン組成物をさらに含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
前記がんワクチンが、乳癌、肺癌、肝癌、口腔癌、胃癌、大腸癌、上咽頭癌、皮膚癌、腎癌、脳腫瘍、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、および膀胱癌からなる群から選択されるがんの治療に適する、請求項１４に記載のがんワクチン。
【請求項１６】
前記がんの組織が、細胞表面にＧｌｏｂｏ Ｈ抗原を発現する、請求項１５に記載のがんワクチン。
【請求項１７】
前記Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗原が、乳房の腫瘍上皮細胞で発現する、請求項１５に記載のがんワクチン。
【請求項１８】
前記免疫応答によって産生した抗体が、Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗原、Ｇｂ４、胚発生段階特異抗原−３（ＳＳＥＡ−３）、および胚発生段階特異抗原−４（ＳＳＥＡ−４）の少なくとも１つを中和する、請求項１４に記載のがんワクチン。
【請求項１９】
Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗原、胚発生段階特異抗原−３（ＳＳＥＡ−３）、および胚発生段階特異抗原−４（ＳＳＥＡ−４）の少なくとも１つが、乳癌幹細胞で発現する、請求項１４に記載のがんワクチン。
【請求項２０】
腫瘍成長の抑制を含む治療方法であって、
（ａ）Ｇｌｏｂｏ Ｈまたはその免疫原性フラグメントから本質的に構成され、リンカーを通じてキャリアタンパク質と共役する糖鎖、および樹状細胞上のＣＤ１ｄ分子と結合できる糖脂質を含むアジュバントを含む免疫原性組成物を、必要に応じて被験者に投与すること；並びに
（ｂ）ＩｇＭアイソタイプ抗体と比較して、ＩｇＧアイソタイプ抗体を相対的に高い量で誘導する免疫応答を誘導すること：
を含む、方法。
【請求項２１】
前記免疫原性組成物の前記リンカーがｐ−ニトロフェノールであり、前記キャリアタンパク質がジフテリア毒素交差反応物質１９７（ＤＴ−ＣＲＭ１９７）であり、および前記アジュバントがα−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）の合成アナログである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記アジュバントがＣ３４である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記免疫原性組成物ががんワクチンをさらに含み、さらにこの際、前記がんワクチンの有効量を用いる１またはそれ以上の治療法が、腫瘍成長を抑制する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記がんワクチンの投与によって腫瘍サイズを小さくする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記がんが、乳癌、肺癌、肝癌、口腔癌、胃癌、大腸癌、上咽頭癌、皮膚癌、腎癌、脳腫瘍、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、および膀胱癌からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記免疫応答が、好ましくはＩｇＧアイソタイプ抗体の産生を目的とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記免疫応答によって産生した抗体が、Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗原、Ｇｂ４、胚発生段階特異抗原−３（ＳＳＥＡ−３）、および胚発生段階特異抗原−４（ＳＳＥＡ−４）の少なくとも１つを中和する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗原、胚発生段階特異抗原−３（ＳＳＥＡ−３）、および胚発生段階特異抗原−４（ＳＳＥＡ−４）の少なくとも１つが、乳癌幹細胞で発現する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗原が、乳房の腫瘍上皮細胞で発現する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
Ｇｂ４抗原、胚発生段階特異抗原−３（ＳＳＥＡ−３）、および胚発生段階特異抗原−４（ＳＳＥＡ−４）の少なくとも１つを中和する抗体が、ＩｇＭアイソタイプ抗体と比較して、ＩｇＧアイソタイプ抗体を相対的に高いレベルで含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
（ａ）Ｇｌｏｂｏ Ｈまたはその免疫原性フラグメントから本質的に構成され、リンカーを通じてキャリアタンパク質と共役する糖鎖、および樹状細胞上のＣＤ１ｄ分子と結合できる糖脂質を含むアジュバントを含み、前記免疫原性組成物がＩｇＭアイソタイプ抗体と比較して、ＩｇＧアイソタイプ抗体を相対的に高いレベルで誘導する免疫応答を誘導する、免疫原性組成物；並びに
（ｂ）薬学的に許容される賦形剤：
を含む、がんワクチン。
【請求項３２】
前記免疫原性組成物の前記リンカーがｐ−ニトロフェノールであり、前記キャリアタンパク質がジフテリア毒素交差反応物質１９７（ＤＴ−ＣＲＭ１９７）であり、および前記アジュバントがα−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）の合成アナログである、請求項３１に記載のがんワクチン。
【請求項３３】
前記アジュバントがＣ３４である、請求項３２に記載のがんワクチン。
【請求項３４】
前記がんが乳癌であり、Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗原が、乳房の腫瘍上皮細胞で発現する、請求項３２に記載のがんワクチン。
【請求項３５】
前記免疫応答によって産生した抗体が、Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗原、Ｇｂ４、胚発生段階特異抗原−３（ＳＳＥＡ−３）、および胚発生段階特異抗原−４（ＳＳＥＡ−４）の少なくとも１つを中和する、請求項３２に記載のがんワクチン。
【請求項３６】
前記がんが乳癌であり、Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗原、胚発生段階特異抗原−３（ＳＳＥＡ−３）、および胚発生段階特異抗原−４（ＳＳＥＡ−４）の少なくとも１つが、乳癌幹細胞で発現する、請求項３２に記載のがんワクチン。
【請求項３７】
（ａ）Ｇｌｏｂｏ Ｈ関連糖鎖またはその免疫原性フラグメントから本質的に構成され、リンカーを通じてキャリアタンパク質と共役する糖鎖；および
（ｂ）樹状細胞上のＣＤ１ｄ分子と結合できる糖脂質を含むアジュバント、
を含む、免疫原性組成物であって、前記Ｇｌｏｂｏ Ｈ関連糖鎖が、ＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４からなる群から選択され、ＩｇＭアイソタイプ抗体と比較して、ＩｇＧアイソタイプ抗体を相対的に高いレベルで誘導する免疫応答を誘導する、免疫原性組成物。
【請求項３８】
前記キャリアタンパク質が、ジフテリア毒素交差反応物質１９７（ＤＴ−ＣＲＭ１９７）である、請求項３７に記載の免疫原性組成物。
【請求項３９】
前記アジュバントが、α−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）の合成アナログである、請求項３７に記載の免疫原性組成物。
【請求項４０】
前記アジュバントが下記構造を含むＣ３４である、請求項３９に記載の免疫原性組成物。
【化２】
【請求項４１】
前記リンカーがｐ−ニトロフェニルリンカーである、請求項３７に記載の免疫原性組成物。
【請求項４２】
前記リンカーがｐ−ニトロフェニルであり、前記キャリアタンパク質がジフテリア毒素交差反応物質１９７（ＤＴ−ＣＲＭ１９７）であり、および前記アジュバントがＣ３４である、請求項３７に記載の免疫原性組成物。
【請求項４３】
ｐ−ニトロフェニルリンカーを通じてジフテリア毒素交差反応物質１９７（ＤＴ−ＣＲＭ１９７）キャリアタンパク質と共役するＧｌｏｂｏ Ｈ、および樹状細胞上のＣＤ１ｄ分子と結合できる糖脂質を含むアジュバントを含む、乳癌幹細胞に対する治療剤。
【請求項４４】
前記アジュバントがＣ３４である、請求項４３に記載の治療剤。
【請求項４５】
被験者への前記治療剤の投与が、乳癌幹細胞（ＢＣＳＣ）で発現する抗原を認識する抗体の産生を誘導する、請求項４３に記載の治療剤。
【請求項４６】
抗原の少なくとも１つが、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４からなる群から選択される、請求項４４に記載の治療剤。
【請求項４７】
ｐ−ニトロフェニルリンカーを通じてジフテリア毒素交差反応物質１９７（ＤＴ−ＣＲＭ１９７）キャリアタンパク質と共役するＳＳＥＡ−３、および樹状細胞上のＣＤ１ｄ分子と結合できる糖脂質Ｃ３４を含むアジュバントを含む、乳癌幹細胞に対する治療剤。
【請求項４８】
被験者への前記治療剤の投与が、乳癌幹細胞（ＢＣＳＣ）で発現する抗原を認識する抗体の産生を誘導する、請求項４７に記載の治療剤。
【請求項４９】
抗原の少なくとも１つが、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４からなる群から選択される、請求項４８に記載の治療剤。
【請求項５０】
ｐ−ニトロフェニルリンカーを通じてジフテリア毒素交差反応物質１９７（ＤＴ−ＣＲＭ１９７）キャリアタンパク質と共役するＳＳＥＡ−４を含む、乳癌幹細胞に対する治療剤。
【請求項５１】
樹状細胞上のＣＤ１ｄ分子と結合できる糖脂質Ｃ３４を含むアジュバントをさらに含む、請求項５０に記載の治療剤。
【請求項５２】
前記アジュバントがＣ３４である、請求項５１に記載の治療剤。
【請求項５３】
被験者への前記治療剤の投与が、乳癌幹細胞（ＢＣＳＣ）で発現するＳＳＥＡ−４またはその切断構造を認識する抗体の産生を誘導する、請求項５０に記載の治療剤。
【請求項５４】
請求項４３に記載の治療剤組成物を、必要に応じて被験者に投与することを含む、乳癌の治療方法。
【請求項５５】
請求項４７に記載の治療剤組成物を、必要に応じて被験者に投与することを含む、乳癌の治療方法。
【請求項５６】
請求項５０に記載の治療剤を、必要に応じて被験者に投与することを含む、乳癌の治療方法。
【請求項５７】
請求項４３〜５２のいずれか１項に記載の治療剤を、必要に応じて被験者に投与することを含む、乳癌の治療方法。
【請求項１】
（ａ）Ｇｌｏｂｏ Ｈまたはその免疫原性フラグメントから本質的に構成され、リンカーを通じてキャリアタンパク質と共役する糖鎖；および
（ｂ）樹状細胞上のＣＤ１ｄ分子と結合できる糖脂質を含むアジュバント、
を含む、免疫原性組成物であって、ＩｇＭアイソタイプ抗体と比較して、ＩｇＧアイソタイプ抗体を相対的に高いレベルで誘導する免疫応答を誘導する、免疫原性組成物。
【請求項２】
前記キャリアタンパク質が、ジフテリア毒素交差反応物質１９７（ＤＴ−ＣＲＭ１９７）である、請求項１に記載の免疫原性組成物、
【請求項３】
前記アジュバントが、α−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）の合成アナログである、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
前記アジュバントが下記構造を含むＣ３４である、請求項３に記載の免疫原性組成物。
【化１】
【請求項５】
前記リンカーがｐ−ニトロフェニルリンカーである、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記リンカーがｐ−ニトロフェニルであり、前記キャリアタンパク質がジフテリア毒素交差反応物質１９７（ＤＴ−ＣＲＭ１９７）であり、および前記アジュバントがＣ３４である、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
前記免疫応答が、好ましくはＩｇＧアイソタイプ抗体の産生を目的とする、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
前記キャリアタンパク質がジフテリア毒素交差反応物質１９７（ＤＴ−ＣＲＭ１９７）であり、前記アジュバントがＣ３４である、請求項７に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
少なくとも１つのアジュバントが、液性および細胞性免疫応答を誘導できることを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
前記免疫応答によって産生した抗体が、がん細胞またはがん幹細胞で発現する抗原を中和する、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
前記免疫応答によって産生した抗体が、Ｇｂ４抗原、胚発生段階特異抗原−３（ＳＳＥＡ−３）、および胚発生段階特異抗原−４（ＳＳＥＡ−４）の少なくとも１つを中和する、請求項１０に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
Ｇｂ４抗原、胚発生段階特異抗原−３（ＳＳＥＡ−３）、および胚発生段階特異抗原−４（ＳＳＥＡ−４）の少なくとも１つを中和する抗体が、ＩｇＭアイソタイプ抗体と比較して、ＩｇＧアイソタイプ抗体を相対的に高いレベルで含む、請求項１１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
前記キャリアタンパク質がジフテリア毒素交差反応物質１９７（ＤＴ−ＣＲＭ１９７）であり、前記アジュバントがＣ３４である、請求項１１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
被験者の抗がん免疫応答を誘導できるがんワクチン組成物をさらに含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
前記がんワクチンが、乳癌、肺癌、肝癌、口腔癌、胃癌、大腸癌、上咽頭癌、皮膚癌、腎癌、脳腫瘍、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、および膀胱癌からなる群から選択されるがんの治療に適する、請求項１４に記載のがんワクチン。
【請求項１６】
前記がんの組織が、細胞表面にＧｌｏｂｏ Ｈ抗原を発現する、請求項１５に記載のがんワクチン。
【請求項１７】
前記Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗原が、乳房の腫瘍上皮細胞で発現する、請求項１５に記載のがんワクチン。
【請求項１８】
前記免疫応答によって産生した抗体が、Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗原、Ｇｂ４、胚発生段階特異抗原−３（ＳＳＥＡ−３）、および胚発生段階特異抗原−４（ＳＳＥＡ−４）の少なくとも１つを中和する、請求項１４に記載のがんワクチン。
【請求項１９】
Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗原、胚発生段階特異抗原−３（ＳＳＥＡ−３）、および胚発生段階特異抗原−４（ＳＳＥＡ−４）の少なくとも１つが、乳癌幹細胞で発現する、請求項１４に記載のがんワクチン。
【請求項２０】
腫瘍成長の抑制を含む治療方法であって、
（ａ）Ｇｌｏｂｏ Ｈまたはその免疫原性フラグメントから本質的に構成され、リンカーを通じてキャリアタンパク質と共役する糖鎖、および樹状細胞上のＣＤ１ｄ分子と結合できる糖脂質を含むアジュバントを含む免疫原性組成物を、必要に応じて被験者に投与すること；並びに
（ｂ）ＩｇＭアイソタイプ抗体と比較して、ＩｇＧアイソタイプ抗体を相対的に高い量で誘導する免疫応答を誘導すること：
を含む、方法。
【請求項２１】
前記免疫原性組成物の前記リンカーがｐ−ニトロフェノールであり、前記キャリアタンパク質がジフテリア毒素交差反応物質１９７（ＤＴ−ＣＲＭ１９７）であり、および前記アジュバントがα−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）の合成アナログである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記アジュバントがＣ３４である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記免疫原性組成物ががんワクチンをさらに含み、さらにこの際、前記がんワクチンの有効量を用いる１またはそれ以上の治療法が、腫瘍成長を抑制する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記がんワクチンの投与によって腫瘍サイズを小さくする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記がんが、乳癌、肺癌、肝癌、口腔癌、胃癌、大腸癌、上咽頭癌、皮膚癌、腎癌、脳腫瘍、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、および膀胱癌からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記免疫応答が、好ましくはＩｇＧアイソタイプ抗体の産生を目的とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記免疫応答によって産生した抗体が、Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗原、Ｇｂ４、胚発生段階特異抗原−３（ＳＳＥＡ−３）、および胚発生段階特異抗原−４（ＳＳＥＡ−４）の少なくとも１つを中和する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗原、胚発生段階特異抗原−３（ＳＳＥＡ−３）、および胚発生段階特異抗原−４（ＳＳＥＡ−４）の少なくとも１つが、乳癌幹細胞で発現する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗原が、乳房の腫瘍上皮細胞で発現する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
Ｇｂ４抗原、胚発生段階特異抗原−３（ＳＳＥＡ−３）、および胚発生段階特異抗原−４（ＳＳＥＡ−４）の少なくとも１つを中和する抗体が、ＩｇＭアイソタイプ抗体と比較して、ＩｇＧアイソタイプ抗体を相対的に高いレベルで含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
（ａ）Ｇｌｏｂｏ Ｈまたはその免疫原性フラグメントから本質的に構成され、リンカーを通じてキャリアタンパク質と共役する糖鎖、および樹状細胞上のＣＤ１ｄ分子と結合できる糖脂質を含むアジュバントを含み、前記免疫原性組成物がＩｇＭアイソタイプ抗体と比較して、ＩｇＧアイソタイプ抗体を相対的に高いレベルで誘導する免疫応答を誘導する、免疫原性組成物；並びに
（ｂ）薬学的に許容される賦形剤：
を含む、がんワクチン。
【請求項３２】
前記免疫原性組成物の前記リンカーがｐ−ニトロフェノールであり、前記キャリアタンパク質がジフテリア毒素交差反応物質１９７（ＤＴ−ＣＲＭ１９７）であり、および前記アジュバントがα−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）の合成アナログである、請求項３１に記載のがんワクチン。
【請求項３３】
前記アジュバントがＣ３４である、請求項３２に記載のがんワクチン。
【請求項３４】
前記がんが乳癌であり、Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗原が、乳房の腫瘍上皮細胞で発現する、請求項３２に記載のがんワクチン。
【請求項３５】
前記免疫応答によって産生した抗体が、Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗原、Ｇｂ４、胚発生段階特異抗原−３（ＳＳＥＡ−３）、および胚発生段階特異抗原−４（ＳＳＥＡ−４）の少なくとも１つを中和する、請求項３２に記載のがんワクチン。
【請求項３６】
前記がんが乳癌であり、Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗原、胚発生段階特異抗原−３（ＳＳＥＡ−３）、および胚発生段階特異抗原−４（ＳＳＥＡ−４）の少なくとも１つが、乳癌幹細胞で発現する、請求項３２に記載のがんワクチン。
【請求項３７】
（ａ）Ｇｌｏｂｏ Ｈ関連糖鎖またはその免疫原性フラグメントから本質的に構成され、リンカーを通じてキャリアタンパク質と共役する糖鎖；および
（ｂ）樹状細胞上のＣＤ１ｄ分子と結合できる糖脂質を含むアジュバント、
を含む、免疫原性組成物であって、前記Ｇｌｏｂｏ Ｈ関連糖鎖が、ＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４からなる群から選択され、ＩｇＭアイソタイプ抗体と比較して、ＩｇＧアイソタイプ抗体を相対的に高いレベルで誘導する免疫応答を誘導する、免疫原性組成物。
【請求項３８】
前記キャリアタンパク質が、ジフテリア毒素交差反応物質１９７（ＤＴ−ＣＲＭ１９７）である、請求項３７に記載の免疫原性組成物。
【請求項３９】
前記アジュバントが、α−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）の合成アナログである、請求項３７に記載の免疫原性組成物。
【請求項４０】
前記アジュバントが下記構造を含むＣ３４である、請求項３９に記載の免疫原性組成物。
【化２】
【請求項４１】
前記リンカーがｐ−ニトロフェニルリンカーである、請求項３７に記載の免疫原性組成物。
【請求項４２】
前記リンカーがｐ−ニトロフェニルであり、前記キャリアタンパク質がジフテリア毒素交差反応物質１９７（ＤＴ−ＣＲＭ１９７）であり、および前記アジュバントがＣ３４である、請求項３７に記載の免疫原性組成物。
【請求項４３】
ｐ−ニトロフェニルリンカーを通じてジフテリア毒素交差反応物質１９７（ＤＴ−ＣＲＭ１９７）キャリアタンパク質と共役するＧｌｏｂｏ Ｈ、および樹状細胞上のＣＤ１ｄ分子と結合できる糖脂質を含むアジュバントを含む、乳癌幹細胞に対する治療剤。
【請求項４４】
前記アジュバントがＣ３４である、請求項４３に記載の治療剤。
【請求項４５】
被験者への前記治療剤の投与が、乳癌幹細胞（ＢＣＳＣ）で発現する抗原を認識する抗体の産生を誘導する、請求項４３に記載の治療剤。
【請求項４６】
抗原の少なくとも１つが、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４からなる群から選択される、請求項４４に記載の治療剤。
【請求項４７】
ｐ−ニトロフェニルリンカーを通じてジフテリア毒素交差反応物質１９７（ＤＴ−ＣＲＭ１９７）キャリアタンパク質と共役するＳＳＥＡ−３、および樹状細胞上のＣＤ１ｄ分子と結合できる糖脂質Ｃ３４を含むアジュバントを含む、乳癌幹細胞に対する治療剤。
【請求項４８】
被験者への前記治療剤の投与が、乳癌幹細胞（ＢＣＳＣ）で発現する抗原を認識する抗体の産生を誘導する、請求項４７に記載の治療剤。
【請求項４９】
抗原の少なくとも１つが、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４からなる群から選択される、請求項４８に記載の治療剤。
【請求項５０】
ｐ−ニトロフェニルリンカーを通じてジフテリア毒素交差反応物質１９７（ＤＴ−ＣＲＭ１９７）キャリアタンパク質と共役するＳＳＥＡ−４を含む、乳癌幹細胞に対する治療剤。
【請求項５１】
樹状細胞上のＣＤ１ｄ分子と結合できる糖脂質Ｃ３４を含むアジュバントをさらに含む、請求項５０に記載の治療剤。
【請求項５２】
前記アジュバントがＣ３４である、請求項５１に記載の治療剤。
【請求項５３】
被験者への前記治療剤の投与が、乳癌幹細胞（ＢＣＳＣ）で発現するＳＳＥＡ−４またはその切断構造を認識する抗体の産生を誘導する、請求項５０に記載の治療剤。
【請求項５４】
請求項４３に記載の治療剤組成物を、必要に応じて被験者に投与することを含む、乳癌の治療方法。
【請求項５５】
請求項４７に記載の治療剤組成物を、必要に応じて被験者に投与することを含む、乳癌の治療方法。
【請求項５６】
請求項５０に記載の治療剤を、必要に応じて被験者に投与することを含む、乳癌の治療方法。
【請求項５７】
請求項４３〜５２のいずれか１項に記載の治療剤を、必要に応じて被験者に投与することを含む、乳癌の治療方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公表番号】特表２０１１−５２４４１７（Ｐ２０１１−５２４４１７Ａ）
【公表日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１４６３３（Ｐ２０１１−５１４６３３）
【出願日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００４５１９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／００５５９８
【国際公開日】平成２２年１月１４日（２０１０．１．１４）
【出願人】（５９６１１８４９３）アカデミア シニカ (33)
【氏名又は名称原語表記】ＡＣＡＤＥＭＩＡ ＳＩＮＩＣＡ
【住所又は居所原語表記】１２８ Ｓｅｃ ２，Ａｃａｄｅｍｉａ Ｒｏａｄ，Ｎａｎｋａｎｇ，Ｔａｉｐｅｉ １１５２９ ＴＷ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００４５１９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／００５５９８
【国際公開日】平成２２年１月１４日（２０１０．１．１４）
【出願人】（５９６１１８４９３）アカデミア シニカ (33)
【氏名又は名称原語表記】ＡＣＡＤＥＭＩＡ ＳＩＮＩＣＡ
【住所又は居所原語表記】１２８ Ｓｅｃ ２，Ａｃａｄｅｍｉａ Ｒｏａｄ，Ｎａｎｋａｎｇ，Ｔａｉｐｅｉ １１５２９ ＴＷ
【Ｆターム（参考）】
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